DE69934810T2

DE69934810T2 - Neues hepatitis c viruspeptid und seine verwendung

Info

Publication number: DE69934810T2
Application number: DE69934810T
Authority: DE
Inventors: Andrea D. New York Branch; Jose L. New York Walewski; Decherd D. New York Stump
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-06-09
Filing date: 1999-06-09
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2019-06-10
Also published as: ES2281179T3; WO1999063941A3; WO1999063941A2; EP1113777A4; DE69934810D1; EP1113777B1; AU4554899A; EP1113777A2

Description

Förderung durch die Regierung
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die NIH-Zuschüsse DK 50795 und DK 52071 gefördert. Die Regierung kann daher bestimmte Rechte an dieser Erfindung besitzen.
Hintergrund der Erfindung
Hepatitis C-Virus (HCV) ist sowohl mit den Pestivirus- als auch mit den Flavivirus-Gattungen der Flaviviridae-Familie eng verwandt. HCV ist ein einzelsträngiges RNA-Virus; das virale Genom beträgt etwa 9,5 kb. HCV RNA hat positive Orientierung und hat einen einzigen offenen Leserahmen, der für ein einzelnes Polyprotein kodiert (Clarke. 1997. J. Gen. Virol. 78: 2397). Das Polyprotein wird proteolytisch prozessiert, um die reifen viralen Proteine zu ergeben, die Nucleocapsid, Hüllprotein 1, Hüllprotein 2, Metalloprotease, Serinprotease, RNA-Helikase, Cofaktor und RNA-Polymerase umfassen.
HCV ist ein humanes Hauptpathogen. Es wurde gefunden, dass das Virus die Ursache der meisten Fälle von Hepatitis ist, die nicht Hepatitis A, Hepatitis B oder Hepatitis Delta Virus zugeschrieben werden können (Clarke, oben). Über 50 Prozent der Patienten mit dem Hepatitis C-Virus (HCV) werden zu chronischen Trägern des Virus; es gibt möglicherweise nicht weniger als 500 Millionen chronische Träger weltweit (Dhillon und Ducheiko. 1995. Histopathology 26: 297). Ständige Infektion mit dem Virus führt zu chronischer Hepatitis und kann letztlich zu Zirrhose und/oder Krebs führen (Kuo et al. 1989. Science 244: 362). Momentane Therapien gegen HCV sind uneffektiv, daher gibt es Bedarf für neue Ansätze, HCV-Infektion zu behandeln.
WO-A-96/05315 offenbart die Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenzen von cDNAs, die für die Hüllprotein (1)-Gene und Kapsid-Gene von Isolaten des Hepatitis C-Virus (HCV) kodieren, und die Verwendung des Oligonukleotids, der Peptide, der rekombinanten Hüllprotein (1)- und Kapsid-Proteine in diagnostischen Verfahren und Impfstoffen.
US-A-5443965 offenbart Peptidantigene die immunreaktiv sind mit Seren von Individuen, die mit dem Hepatitis C-Virus (HCV) infiziert sind. Mehrere dieser Antigene sind immunologisch reaktiv mit Antikörpern, die in Individuen vorhanden sind, die als chronische und akute HCV-Infektion aufweisend identifiziert worden sind. Die Antigene sind nützlich in diagnostischen Verfahren zur Detektion von HCV-Infektion in Menschen. Ebenfalls offenbart sind entsprechende Klone aus genomischen Fragmenten, die Polynukleotide enthalten, die für die Sequenzen des offenen Leserahmens für die antigenischen Peptide kodieren.
J. Mol. Evol. (1994) 38: 50-56 (Ina Y. et al.) offenbart die Reduktion von synonymen Substitutionen im Kapsidproteingen des Hepatitis C-Virus.
Zusammenfassung
Die Erfindung betrifft ein Polypeptid gemäß Anspruch 1, 2, 7, 8 oder 9, bevorzugte Merkmale des Polypeptids werden in den Ansprüchen 3, 4, 5, 6 oder 10 beansprucht.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung einen Impfstoff gemäß Anspruch 11, bevorzugte Merkmale des Impfstoffs werden in den Ansprüchen 12, 13 oder 14 beansprucht.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung einen Antikörper gemäß Anspruch 15, bevorzugte Merkmale des Antikörpers werden in den Ansprüchen 16-19 beansprucht.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung einen Kit gemäß Anspruch 20 oder 21.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung die Verwendung gemäß den Ansprüchen 22, 23 oder 25, bevorzugte Merkmale der Verwendung werden in den Ansprüchen 24 oder 26-35 beansprucht.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung das Verfahren gemäß Anspruch 36, bevorzugte Merkmale des Verfahrens werden in den Ansprüchen 37 oder 38 beansprucht.
Die vorliegende Erfindung ist ein bedeutender Fortschritt im Kampf gegen Hepatitis C. Es konnte gezeigt werden, dass die neuen Peptide der Erfindung, die nicht durch den gewöhnlichen offenen Leserahmen des HCV-Polyproteins kodiert werden, eine Immunantwort in Patienten, die mit HCV infiziert sind, auslösen, und daher während der HCV-Infektion produziert werden. Dementsprechend stellt die Erfindung neue HCV-Polypeptide zur Verfügung, die nicht vom HCV-Polyprotein abgeleitet sind sowie Verfahren zu ihrer Verwendung.
Unter einem Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein isoliertes oder rekombinantes Polypeptid oder Fragment davon, das durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das von einem Hepatitis C-Virus abgeleitet ist, wobei das Polypeptid wenigstens eine der folgenden Eigenschaften aufweist:

1) wenigstens ein Teil des Polypeptids wird durch einen Leserahmen +1 relativ zu dem gewöhnlichen offenen Leserahmen des Hepatitis C-Virus kodiert;
2) wenigstens ein Teil des Polypeptids wird durch einen Leserahmen kodiert, der dem Leserahmen von SEQ ID NO: 1 entspricht, wobei das erste Nukleotid von SEQ ID NO: 1 das erste Nukleotid eines Kodons ist;
3) wenigstens ein Teil des Polypeptids umfasst eine Aminosäuresequenz, die zu wenigstens 80% identisch zu der Aminosäuresequenz ist, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist; und
4) wenigstens ein Teil des Polypeptids umfasst eine Aminosäuresequenz, die durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das unter hoher Stringenz mit der Nukleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, hybridisiert.

In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung weisen die neuen HCV-Polypeptide oder ein Teil davon gemäß Anspruch 1 eine Länge von wenigstens etwa 8 Aminosäuren bis wenigstens etwa 100 Aminosäuren auf. In anderen Ausführungsformen weisen die Polypeptide oder Teile davon eine Länge von wenigstens etwa 14 Aminosäuren bis wenigstens etwa 30 Aminosäuren auf.
In einer Ausführungsform werden die neuen HCV-Polypeptide oder Teile davon von einem Leserahmen +1 zu dem gewöhnlichen Leserahmen von Hepatitis C kodiert. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Polypeptide durch einen Leserahmen kodiert, der dem Leserahmen von SEQ ID NO: 1 entspricht, wobei das erste Nukleotid von SEQ ID NO: 1 das erste Nukleotid eines Kodons ist. In anderen bevorzugten Ausführungsformen werden die Polypeptide zum Teil durch das Nukleinsäuremolekül von SEQ ID NO: 1 kodiert und lösen eine Immunantwort in einem Subjekt aus.
In weiteren Ausführungsformen umfassen die neuen HCV-Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die zu wenigstens 80% identisch zu der Aminosäuresequenz ist, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, und eine Immunantwort in einem Subjekt auslöst. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die neuen HCV-Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die zu wenigstens 90% identisch zu der Aminosäuresequenz ist, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, und eine Immunantwort in einem Subjekt auslöst. In anderen bevorzugten Ausführungsformen umfassen die neuen HCV-Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, und eine Immunantwort in einem Subjekt auslöst.
In anderen Ausführungsformen umfassen die neuen HCV-Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das unter hoher Stringenz mit der Nukleotidsequenz hybridisiert, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist.
In anderen Ausführungsformen umfassen die neuen HCV-Polypeptide wenigstens einen Teil einer Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 besteht, und eine Immunantwort in einem Subjekt auslöst.
In noch weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung isolierte oder rekombinante Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus LNLKEKP(X1)(X2)TPT(X3) und AAHRT(X4)SSR(X5)(X6)VR besteht, wobei X1 N oder K ist, X2 V oder E ist, X3 A oder V ist, X4 L oder S ist, X5 A oder V ist und X6 A oder V ist. In noch weiteren Ausführungsformen bestehen die neuen HCV-Polypeptide aus einer Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus LNLKEKPNVTPTAC und AAHRTSSSRAVVRC besteht.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung eine Impfstoff-Zusammensetzung zur Verhinderung einer Hepatitis C-Infektion in einem Subjekt. In einer Ausführungsform umfasst ein solcher Impfstoff ein neues HCV-Polypeptid. In einer anderen Ausführungsform umfasst ein solcher Impfstoff eine Nukleinsäure, die für ein neues HCV-Polypeptid kodiert.
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung einen Antikörper, der an ein neues HCV-Polypeptid bindet.
Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung einen Kit zur Detektion einer Hepatitis C-Infektion. In einer Ausführungsform umfasst ein solcher Kit ein neues HCV-Polypeptid. Unter einem anderen Gesichtspunkt umfasst der Kit einen Antikörper, der an ein neues HCV-Polypeptid bindet.
Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung vor einer HCV-Infektion, bei dem man einem Subjekt ein neues HCV-Polypeptid verabreicht oder bei dem man sie Synthese des Polypeptids in einem Subjekt vor einer HCV-Infektion bewirkt, so dass eine HCV-Infektion verhindert wird.
Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Diagnose einer HCV-Infektion. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Detektion der Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörpern, die mit einem neuen HCV-Polypeptid in der Körperflüssigkeit eines Subjekts reagieren, wobei die Gegenwart von Antikörpern, die das Polypeptid binden, indikativ für eine Infektion mit HCV ist. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren die Detektion der Gegenwart oder Abwesenheit eines neuen HCV-Polypeptids in der Körperflüssigkeit oder dem Gewebe eines Subjekts, wobei die Gegenwart eines HCV-Polypeptids indikativ für eine Infektion mit HCV ist.
Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, die mit einem neuen HCV-Polypeptid interagiert, bei dem man das Polypeptid mit einer Verbindung in einem zellfreien System unter Bedingungen in Kontakt bringt, die eine Interaktion der Verbindung mit dem Polypeptid gestatten, so dass ein Komplex gebildet wird; die Verbindungen, die keine Komplexe mit einem HCV-Polypeptid bilden, von denjenigen trennt, die Komplexe mit einem HCV-Polypeptid bil den; und die Verbindungen, die Komplexe mit einem HCV-Polypeptid bilden, isoliert und identifiziert, um eine Verbindung zu identifizieren, die mit einem neuen HCV-Polypeptid interagiert.
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung ist ein wichtiger Schritt voran zur Verhinderung einer Hepatitis C (HCV) Infektion, zur Behandlung andauernder Infektion und zur Verbesserung bestehender Diagnosetechniken. Die Erfindung basiert zum Teil auf der Identifizierung neuer Polypeptide, die durch das virale Genom von Hepatitis C kodiert werden. Diese neuen Polypeptide werden nicht durch den gewöhnlichen Leserahmen des HCV-Polyproteins kodiert.
Vor der weiteren Beschreibung der Erfindung werden hier bestimmte Begriffe gesammelt, die in der Beschreibung, den Beispielen und den beigefügten Ansprüchen verwendet werden.
I. Definitionen
Hierin verwendet umfasst der Ausdruck "isoliertes oder rekombinantes Polypeptid" ein Polypeptid, das im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder Kulturmedium ist, wenn es durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt wird, oder von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien ist, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Hierin verwendet umfasst der Begriff "Polypeptid oder Fragment davon" Polypeptidmoleküle von ganzer Lange (von der ersten Aminosäure der Initiation der Translation bis zur letzten Aminosäure vor der Termination der Translation) und Peptidteile solcher Moleküle. Vorzugsweise weisen die neuen HCV-Polypeptide oder Fragmente davon eine Lange von wenigstens etwa 8 Aminosäuren bis wenigstens etwa 100 Aminosäuren auf. Bevorzugter weisen die Polypeptide oder Fragmente davon eine Länge von wenigstens etwa 14 Aminosäuren bis wenigstens etwa 30 Aminosäuren auf. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die neuen HCV-Polypeptide der Erfindung eine Aminosäuresequenz, die unter verschiedenen HCV-Isolaten konserviert ist. Solch eine konservierte Sequenz kann ohne weiteres unter Verwendung eines Abgleichs, wie er in Tabelle 1 bereitgestellt wird, bestimmt werden. In anderen Ausführungsformen umfassen die neuen HCV-Polypeptide einen Teil einer neuen HCV-Aminosäuresequenz, die distal (carboxyterminal) zu einem Stoppcodon im +1 Leserahmen (relativ zum Haupt-ORF) ist, der das "UG" des "AUG" umfasst, das das Initiatorcodon des Haupt-ORF ist. In einer bevorzugteren Ausführungsform lösen die Polypeptide oder Fragmente davon eine Immunantwort in einem Subjekt aus.
Hierin verwendet soll der Ausdruck "Nukleinsäuremolekül" DNA-Moleküle (z. B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z. B. genomische virale RNA oder mRNA) umfassen. Die Nukleinsäuremoleküle können einzelsträngig oder doppelsträngig sein.
Hierin verwendet ist der Ausdruck "der gewöhnliche offene Leserahmen des Hepatitis C-Virus" der offene Leserahmen (open reading frame, ORF) der viralen RNA, die für das gut bekannte HCV-Polyprotein kodiert. Der gewöhnliche ORF stellt den größten ORF im viralen Genom dar. Im infektiösen Klon (GenBank-Zugangsnummer AF011751) verwendet der gewöhnliche ORF Nukleotid 342 als das erste Nukleotid eines Codons und setzt sich bis Nukleotid 9377 fort. In verschiedenen HCV-Isolaten kann das Nukleotid, das ein erstes Nukleotid eines Codons des gewöhnlichen ORF ist, an einer leicht veränderten Position sein. Das Nukleotid, das ein erstes Nukleotid eines Codons für irgendeinen Isolaten ist, kann leicht erhalten werden, um den gewöhnlichen HCV-ORF zu ergeben. Beispielsweise kann im Fall von bekannten Isolaten auf GenBank (oder eine andere Datenbank, die die Nukleotidsequenz-Information für den Isolaten enthält) zugegriffen und die Information für die kodierende Sequenz (CDS) erhalten werden. Alternativ kann zur Bestimmung des gewöhnlichen ORF eines bekannten oder neuen Isolaten die Nukleinsäuresequenz des bekannten oder neuen Isolaten mit einer bestimmten Sequenz abgeglichen werden, um die höchste Homologie zu ergeben (z. B. unter Verwendung eines Programms wie BLAST). Eine beispielhafte BLAST-Suche kann z. B. unter Verwendung der Sequenz, die in Gen-Bank-Zugangsnummer AF011751 gefunden wird, als Abfragesequenz durchgeführt werden. Bei dieser Suche wurden die Nukleotide 342-940 von AF011751 verwendet, um die nicht redundante Sequenz-Datenbank zu durchsuchen. Der ORF anderer HCV-Isolate, der dem gewöhnlichen HCV-ORF von AF011751 (in dem das Initiatorcodon an Position 342 ist, die als Position 1 der Abfragesequenz gelesen wird) entspricht, kann von dem BLAST-Abgleich abgelesen werden. Zum Beispiel ist das entsprechende erste Nukleotid eines Codons für GenBank-Zugangsnummer HPCCGAA 342. Ein anderer Weg zum Auffinden des gewöhnlichen ORF wäre es, ein Programm, wie Edit Seq. (DNASTAR) zu verwenden, das dafür konzipiert ist, ORFs unter Verwendung des AUG, das mit Position 342 von AF011751 abgeglichen ist, als Startcodon zu identifizieren.
Der Begriff "prozentuale (%) Identität" bezieht sich, wenn er im Zusammenhang mit Nukleotid – und Aminosäuresequenzen verwendet wird (z. B. wenn beschrieben wird, dass eine Aminosäure zu X% identisch ist zu einer anderen Aminosäuresequenz), auf den prozentualen Anteil von identischen Resten, die von den zwei Sequenzen geteilt werden, wenn sie optimal abgeglichen sind. Um die prozentuale Identität von zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen zu bestimmen, werden die Sequenzen für optimale Vergleichszwecke abgeglichen (z. B. können Lücken in eine Sequenz zum optimalen Abgleich mit der anderen Sequenz eingeführt werden). Die Reste an den entsprechenden Positionen werden dann verglichen und wenn dann eine Position in einer Sequenz vom selben Rest an der entsprechenden Position in der anderen Sequenz besetzt ist, sind die Moleküle an dieser Position identisch. Die prozentuale Identität zwischen zwei Sequenzen ist daher eine Funktion der Anzahl an identischen Positionen, die von zwei Sequenzen geteilt werden (d. h. prozentuale Identität = Anzahl an identischen Positionen/Gesamtanzahl an Positionen x 100).
Im Stand der Technik bekannte Computer-Algorithmen können verwendet werden, um zwei Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen optimal abzugleichen und zu vergleichen, um die prozentuale Identität zwischen zwei Sequenzen zu definieren. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der zum Vergleich von zwei Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, modifiziert wie in Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77. Solch ein Algorithmus ist die NBLAST- und XBLAST-Programme von Altschul, et al. (1990)J. Mol. Biol. 215: 403-10 eingefügt. Um optimale, mit Lücken versehene Abgleiche zu Vergleichszwecken zu erhalten, kann Gapped BLAST, wie in Altschul et al., (1997) Nucleic Acid Research 25 (17): 3389-3402 beschrieben, verwendet werden. Wenn die BLAST- und Gapped BLAST-Programme verwendet werden, können die Standardparameter der entsprechenden Programme (z. B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Bin weiteres bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für einen mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller, CABIOS (1989). Solch ein Algorithmus ist in das ALIGN-Programm (Version 2.0) einbezogen, das Teil des "GCG sequence alignment" Softwarepakets ist. Wenn das ALIGN-Programm zum Vergleich von Aminosäuresequenzen verwendet wird, kann ein "PAM120 weight residue table", ein "gap length penalty" von 12 und ein "gap penalty" von 4 verwendet werden. Wenn mehrere Programme zum Vergleichen von Sequenzen verwendet werden, dann wird das Programm, das optimalen Abgleich vorsieht (d. h. die höchste prozentuale Identität zwischen zwei Sequenzen) für Vergleichszwecke verwendet.
Hierin verwendet umfasst der Ausdruck "+1 relativ zum gewöhnlichen offenen Leserahmen des Hepatitis C-Virus" Leserahmen, bei denen ein erstes Nukleotid eines Codons +1 Nukleotid relativ zum gewöhnlichen OF verschoben ist. Die Leserahmen, die für die neuen Polypeptide kodieren, enthalten nicht notwendigerweise ein im Rahmen liegendes Startcodon.
Hierin verwendet bedeutet der Ausdruck "der Leserahmen von SEQ ID NO: 1", dass die ersten drei Nukleotide der Sequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, die ersten, zweiten und dritten Nukleotide eines Codons zur Translation in eine Aminosäure eines Polypeptids sind. Der Leserahmen von SEQ ID NO: 1 liegt +1 relativ zum gewöhnlichen HCV-ORF. Der Ausdruck "ein Leserahmen, der dem Leserahmen von SEQ ID NO: 1 entspricht" bedeutet, dass wenn eine Sequenz eines anderen HCV-Isolaten als des AF011751-Isolaten, der in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1 abgeglichen wird, um die höchste Homologie zu ergeben, z. B. unter Verwendung des BLAST-Programms, dann wird sie im selben Leserahmen wie SEQ ID NO: 1 gelesen, um den Leserahmen zu ergeben, der dem Leserahmen von SEQ ID NO: 1 entspricht. Die Nukleotidposition eines ersten Nukleotids eines Codons von einem HCV-Isolaten, das dem von SEQ ID NO: 1 entspricht, kann von Isolat zu Isolat variieren. Eine beispielhafte BLAST-Suche, die dieses Prinzip veranschaulicht, wird als Anhang B bereitgestellt. Beispielsweise ist für GenBank-Zugangsnummer AF009606 ein erstes Nukleotid eines Codons in einem Leserahmen, der dem Leserahmen von SEQ ID NO: 1 entspricht, Nukleotid 346.
Hierin verwendet soll der Begriff "hybridisiert unter hoher Stringenz" Bedingungen für die Hybridisierung und das Waschen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die zu wenigstens 70% homolog zueinander sind, normalerweise miteinander hybridisiert blei ben. Bevorzugt sind diese Bedingungen so, dass Sequenzen, die zu wenigstens 75%, 85% oder 95% identisch zueinander sind, miteinander hybridisiert bleiben. Solche stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und können in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 gefunden werden. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung in 6 X Natriumchlorid/Natriumzitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einer oder meheren Waschungen in 0,2 X SSC, 0,1% SDS bei 50-65°C.
Hierin verwendet soll der Begriff "Antikörper" Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen umfassen, d. h. Moleküle, die eine Antigen bindende Stelle enthalten, die spezifisch ein Antigen bindet (mit diesem immunreagiert), wie z. B. Fab- und F(ab')₂-Fragmente. Die Begriffe "monoklonale Antikörper" und "monoklonale Antikörperzusammensetzung", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf eine Population von Antikörpermolekülen, die nur eine Spezies einer antigenbindenden Stelle enthalten, die in der Lage ist, mit einem bestimmten Epitop eines Antigens eine Immunreaktion einzugehen, wohingegen sich der Begriff "polyklonale Antikörper" und "polyklonale Antikörperzusammensetzung" auf eine Population von Antikörpermolekülen bezieht, die mehrere Spezies von antigenbindenden Stellen enthält, die in der Lage sind, mit einem bestimmten Antigen zu interagieren. Monoklonale Antikörperzusammensetzungen zeigen daher typischerweise eine individuelle Bindungsaffinität für ein bestimmtes Antigen, mit dem sie eine Immunreaktion eingehen.
Hierin verwendet umfasst der Begriff "Adjuvans" Mittel, die die Immunantwort gegenüber einem Antigen ermöglichen. Adjuvantien können in Verbindung mit den betreffenden Polypeptiden verabreicht werden, um zusätzlich die Immunantwort zu verbessern.
Hierin verwendet umfasst der Begriff "verstärken einer Immunantwort" die Steigerung der T- und/oder B-Zell-Antworten, d. h. zelluläre und/oder humorale Immunantworten, durch die Behandlung eines Subjekts unter Verwendung der beanspruchten Verfahren. In einer Ausführungsform können die beanspruchten Verfahren verwendet werden, um die T-Helfer-Zell-Antwort zu verstärken. In einer weiteren Ausführungsform können die beanspruchten Verfahren verwendet werden, um cytotoxischen T-Zell-Antworten zu verstärken. Die beanspruchten Verfahren können verwendet werden, um sowohl die primären als auch die sekundären Immunantworten zu verstärken. Bevorzugt wird die Immunantwort verglichen mit der Antwort von Immunzellen gegenüber dem Antigen bei Abwesenheit der Behandlung mit den beanspruchten Verfahren verstärkt. Die Immunantwort eines Subjekts kann beispielsweise durch die Untersuchung der Antikörperproduktion, der Immunzellproliferation, der Cytokinfreisetzung, der Expression von Zelloberflächenmarkern, der Cytotoxizität, der verstärkten Fähigkeit, eine Infektion mit HCV zu beseitigen, etc. bestimmt werden.
II. Neue HCV-Polypeptide
Die neuen HCV-Polypeptide der Erfindung sind nicht von einem HCV-Polyprotein abgeleitet, d. h. die Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden nicht durch den gewöhnlichen HCV-ORF kodiert. Die Polypeptide dieses alternativen Leserahmens werden von einem Leserahmen translatiert (oder auf dessen Basis synthetisiert), der +1 zum gewöhnlichen HCV-ORF ist. Die Position des ersten Nukleotids eines ORF, in dem diese Polypeptide translatiert werden, wird leicht in Abhängigkeit von dem untersuchten Isolaten variieren. Zum Beispiel ist für den infektiösen Klon (GenBank-Zugangsnummer AF011751) das erste Nukleotid des ORF, in dem die neuen HCV-Polypeptide translatiert werden, das Nukleotid 346, das +5 relativ zum gewöhnlichen HCV-ORF liegt. Das erste Nukleotid eines Codons anderer bekannter oder neuer Isolate, das einen Leserahmen zur Folge hat, der dem Leserahmen von SEQ ID NO: 1 entspricht, kann z. B. bestimmt werden, indem man eine BLAST-Suche unter Verwendung der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 1 als Abfragesequenz, wie oben beschrieben, durchführt.
Die Translation der neuen HCV-Polypeptide der Erfindung muss nicht notwendigerweise mit einem AUG-Startcodon beginnen. Beispielsweise wurde in vorangegangenen Arbeiten gezeigt, dass das Start-AUG von HCV mit geringer Auswirkung auf die Translationseffizienz zu AUU oder CUG mutiert sein konnte (Clarke, oben). Alternativ könnte RNA-Editing an der Erzeugung eines Initiatorcodons beteiligt sein. Die Translation der neuen HCV-Polypeptide kann auch an der Initiationsstelle des gewöhnlichen HCV-ORF mit einer Leserahmenverschiebung in einen anderen Leserahmen beginnen. Schließlich kann die Translation 5' vom AUG-Startcodon des gewöhnlichen ORF in irgendeinem der drei Leserahmen initiiert werden, aber in den +1 Leserahmen (relativ zum gewöhnlichen ORF) verschoben sein, um die Produktion von Peptiden zu ergeben, die zum Teil 80% identisch zu einem Teil von SEQ ID NO: 2 sind. Die interne Ribosomeneingangsstelle (internal ribo some entry site, IRES) ist ein komplexes RNA-Strukturelement, das einen Teil des 5' nicht translatierten Bereichs von HCV-RNA und einen Teil des benachbarten kodierenden Bereichs umfasst. Durch sie oder translational durch Auslassen könnte eine Leserahmenverschiebung hervorgerufen werden.
In bevorzugten Ausführungsformen werden die Polypeptide durch einen Leserahmen kodiert, der dem Leserahmen von SEQ ID NO: 1 entspricht, in dem das erste Nukleotid von SEQ ID NO: 1 das erste Nukleotid eines Codons ist. Dieser Leserahmen kann für ein Polypeptid mit einer Länge von wenigstens etwa 126 Aminosäuren kodieren bevor ein Terminationscodon erreicht wird. Tabelle 1 stellt einen Abgleich von neuen HCV-Polypeptiden dar, die in diesem Leserahmen von verschieden HCV-Isolaten kodiert werden, zusammen mit einer Majoritätssequenz, die unter Verwendung des Clustal-Verfahrens für den Sequenzabgleich abgeleitet wurde. Stopcodons erscheinen in bestimmten dieser Isolate nach Aminosäure 126. Jedoch kann die Translation über diese Stopcodons hinaus fortschreiten. Zum Beispiel könnten diese Stopcodons in bestimmten Fällen Sequenzierfehler sein. Alternativ kann das Überlesen durch Mutation, veränderte Transkription, RNA-Editing, Leserahmenverschiebung oder Ribosomen-Slippage geschehen. Daher kann in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung auch in den Polypeptiden, in denen ein Stopcodon erscheint, das neue HCV-Polypeptid länger sein, d. h. die Translation kann über ein Terminationscodon hinaus fortschreiten. Daher könnte z. B. im Fall des infektiösen Klons AF011751 die Translation des Polypeptids beispielsweise an Position 163 oder 186 von SEQ ID NO: 2 enden. Wenn die neuen HCV-Polypeptide der Erfindung synthetisiert werden, könnten diese Stopcodons ignoriert werden.
In anderen Ausführungsformen weisen die Polypeptide der Erfindung eine gewisse prozentuale Identität zu der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Sequenz auf. Die prozentuale Identität zwischen zwei Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen kann einfach berechnet werden, indem man die Anzahl der identischen Basen oder Aminosäuren durch die Gesamtzahl an Basen oder Aminosäuren teilt. Die Sequenzen werden abgeglichen, um die höchste prozentuale Identität zu ergeben, und noch einen Abgleich zu liefern, der biologisch sinnvoll ist. Die Sequenzen können manuell oder bevorzugt unter Verwendung eines Algorithmus abgeglichen werden. Beispielsweise kann im Fall von Aminosäuresequenzen eine FASTA-Suche der Swiss Protein Datenbank unter Verwendung der Biosum50.Cmp (Treffermatrix) durchgeführt werden. Das "gap creation penalty" kann z. B. auf 12 und das "extension penalty" z. B. auf 2 gesetzt werden. Der "joining threshold" kann z. B. auf 36; der "optimization threshold" auf 24; und die "optimization width" Z. B. auf 16 gesetzt werden.
In bestimmten Ausführungsformen umfassen die neuen HCV-Polypeptide eine Aminosäuresequenz die zu wenigstens etwa 80-90% identisch ist zu der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die neuen HCV-Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
In bevorzugten Ausführungsformen weisen die Polypeptide der Erfindung die beschriebene prozentuale Identität über eine Länge von wenigstens etwa 10 Aminosäuren auf. In bevorzugteren Ausführungsformen erstreckt sich die prozentuale Identität der Polypeptide über eine Lange von wenigstens etwa 20-30 Aminosäuren. In bevorzugteren Ausführungsformen erstreckt sich die prozentuale Identität der Polypeptide über eine Länge von wenigstens etwa 30-40 Aminosäuren. In einer bevorzugteren Ausführungsform erstreckt sich die prozentuale Identität der Polypeptide über eine Länge von wenigstens etwa 40-50 Aminosäuren. In einer weiteren bevorzugteren Ausführungsform erstreckt sich die prozentuale Identität der Polypeptide über eine Lange von mehr als 50 Aminosäuren. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen erstreckt sich die prozentuale Identität der Polypeptide über eine Lange von mehr als 100 Aminosäuren.
In weiteren Ausführungsformen umfassen die neuen HCV-Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das eine gewisse prozentuale Identität zum Nukleinsäuremolekül aufweist, das in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist. In bevorzugten Ausführungsformen umfassen die neuen HCV-Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das zu wenigstens 80% identisch zu der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz ist, wobei das Polypeptid durch den in SEQ ID NO: 1 gezeigten Leserahmen kodiert wird. In bevorzugteren Ausführungsformen umfassen die neuen HCV-Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das zu wenigstens 90% identisch ist zu der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Sequenz, wobei das Polypeptid durch den in SEQ ID NO: 1 gezeigten Leserahmen kodiert wird. In anderen Ausführungsformen umfassen die neuen HCV-Polypeptide eine Aminosäuresequenz, die durch ein in SEQ ID NO: 1 gezeigtes Nukleinsäuremolekül kodiert wird, wobei das Polypeptid durch den in SEQ ID NO: 1 gezeigten Leserahmen kodiert wird.
In bestimmten Ausführungsformen werden die neuen HCV-Polypeptide der Erfindung durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nukleinsäuresequenz hybridisiert. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind im Stand der Technik bekannt. In bevorzugten Ausführungsformen werden solche Polypeptide von einem Nukleinsäuremolekül kodiert, das unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül von irgendeinem HCV-Isolaten hybridisiert, die jedoch im Leserahmen von SEQ ID NO: 1 gelesen oder so synthetisiert werden, als ob sie im Leserahmen von SEQ ID NO: 1 gelesen werden.
In anderen Ausführungsformen umfassen die neuen HCV-Polypeptide wenigstens einen Teil einer Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 besteht und eine Immunantwort in einem Subjekt auslöst. Andere neue HCV-Polypeptide können mittels einer HCV-Nukleinsäuresequenz und Bestimmung der im +1 Leserahmen kodierten Aminosäuren identifiziert werden. Polypeptide, die diese Sequenzen umfassen, können hergestellt und auf Reaktivität mit Antikörpern von infizierten Subjekten getestet werden. Derartige Polypeptide, die an Antikörper binden, d. h. die eine Immunantwort in infizierten Subjekten ausgelöst haben, werden vom Virus im Verlauf der Infektion hergestellt und stellen bevorzugte neue HCV-Polypeptide dar.
In noch weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung isolierte oder rekombinante Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus LNLKEKP(X1)(X2)TPT(X3) und AAHRT(X4)SSR(X5)(X6)VR besteht, wobei X1 N oder K ist, X2 V oder E ist, X3 A oder V ist, X4 L oder S ist, X5 A oder V ist und X6 A oder V ist. In noch weiteren Ausführungsformen bestehen die neuen HCV-Polypeptide aus einer Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus LNLKEKPNVTPTAC und AAHRTSSSRAVVRC besteht.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung weisen die neuen HCV-Polypeptide der Erfindung eine Länge von wenigstens etwa 8 Aminosäuren bis wenigstens etwa 100 Aminosäuren auf. In anderen Ausführungsformen weisen die Polypeptide der Erfindung eine Lange von wenigstens etwa 10 Aminosäuren bis wenigstens etwa 50 Aminosäuren auf. In anderen Ausführungsformen weisen die Polypeptide der Erfindung eine Länge von wenigstens etwa 14 bis wenigstens etwa 25 Aminosäuren auf.
In bevorzugten Ausführungsformen weisen die neuen HCV-Polypeptide eine Länge auf, die ausreicht, um in einem Subjekt eine Immunantwort auszulösen. Solch eine Immunantwort kann unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken gemessen werden. Beispielsweise kann die von den HCV-Polypeptiden der Erfindung hervorgerufene Immunantwort eine T-Zell vermittelte Antwort sein, die z. B. durch die Cytokinproduktion und/oder zelluläre Proliferation oder zelluläre Toxizität gemessen werden kann, und/oder eine B-Zell vermittelte Antwort, die z. B. durch die Antikörperproduktion gemessen werden kann.
In bestimmten Ausführungsformen werden die neuen HCV-Polypeptide der Erfindung als Fusionsproteine hergestellt. Zusätzlich zur Verwendung von Fusionsproteinen zur Verstärkung der Immunogenizität können Fusionsproteine auch die Expression von Proteinen, darunter die Polypeptide der vorliegenden Erfindung, ermöglichen. Zum Beispiel kann ein neues HCV-Polypeptid als ein Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsprotein erzeugt werden. Derartige GST-Fusionsproteine können die leichte Aufreinigung des neuen HCV-Polypeptids ermöglichen, beispielsweise durch die Verwendung von glutathionderivatisierten Matrixes (siehe zum Beispiel, Current Protocols in Molecular Biology, Herausgeber Ausubel et al. (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)). In einer weiteren Ausführungsform kann ein Fusionsgen, das für eine Leadersequenz für die Aufreinigung kodiert, wie z. B. eine Poly-(His)/Enterokinase-Schnittstellensequenz, mit einem neuen HCV-Polypeptid fusioniert werden, um die Aufreinigung des Polypeptids aus Poly(His) und dem neuen HCV-Polypeptid durch Affinitätschromatographie mittels eines Ni²⁺-Metallharzes zu ermöglichen. Die Leadersequenz für die Aufreinigung kann anschließend durch Behandlung mit Enterokinase entfernt werden (siehe z. B. Hochuli et al. (1987)J. Chromatography 411: 177 und Janknecht et al. PNAS 88: 8972).
Techniken zur Herstellung von Fusionsgenen sind dem Fachmann bekannt. Im Wesentlichen wird die Verknüpfung von verschiedenen DNA-Fragmenten, die für unterschiedliche Polypeptidsequenzen kodieren, gemäß herkömmlichen Techniken durchgeführt, wobei von Termini mit einem stumpfen Ende oder einem klebrigen Ende für die Ligation, dem Verdau mit Restriktionsenzymen zur Bereitstellung von geeigneten Termini, dem Auffüllen von kohesiven Enden falls angebracht, der Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Verhinderung von unerwünschter Verknüpfung und der enzymatischen Ligation Gebrauch gemacht wird. In einer weiteren Ausführungsform kann das Fusionsgen durch herkömmliche Techniken, die automatisierte DNA-Syntheseapparate einschließen, synthetisiert werden. Alternativ kann die PCR-Amplifikation von Genfragmenten unter Verwendung von Ankerprimern durchgeführt werden, die komplementäre Überhänge zwischen zwei aufeinanderfolgenden Genfragmenten verursachen, die dann annealed werden können, um eine chimäre Gensequenz zu erzeugen (siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology, Herausgeber Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992).
Es versteht sich, dass sich die vorstehenden Eigenschaften von HCV-Polypeptiden nicht gegenseitig ausschließen.
III. Herstellung von neuen HCV-Polypeptiden
Neue HCV-Polypeptide können durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden. Beispielsweise wird ein Nukleinsäuremolekül, das für ein derartiges Polypeptid kodiert, in einen Expressionsvektor kloniert, der Expressionsvektor in eine Wirtszelle eingebracht und das neue HCV-Polypeptid in der Wirtszelle exprimiert. Das neue HCV-Polypeptid kann dann aus den Zellen durch ein geeignetes Aufreinigungsschema mittels gewöhnlicher Proteinaufreinigungs-Techniken isoliert werden. Als Alternative zur rekombinanten Expression kann ein neues HCV-Polypeptid chemisch unter Verwendung gewöhnlicher Peptidsynthesetechniken synthetisiert oder kommerziell erworben werden. Ferner können native neue HCV-Polypeptide aus Zellen (z. B. mit HCV infizierten, kultivierten humanen Zellen) zum Beispiel mittels einem Antikörper isoliert werden.
A. Rekombinante Herstellung von neuen HCV-Polypeptiden
In bestimmten Ausführungsformen werden die neuen HCV-Polypeptide von einem natürlich vorkommenden HCV-Nukleinsäuremolekül kodiert. Hierin verwendet bezieht sich "natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül auf ein RNA-Molekül (oder ein davon abgeleitetes DNA-Molekül), das eine in der Natur vorkommende Nukleotidsequenz aufweist (z. B. für ein Protein kodiert, das von einem natürlich vorkommenden HCV-Isolaten produziert wird).
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Isolaten der neuen HCV-Polypeptide wird der Fachmann ferner einsehen, dass Änderungen durch Mutation eingeführt werden können, Z. B. in eine HCV-Nukleotidsequenz, was zu Änderungen in der Aminosäuresequenz des kodierten HCV-Polypeptids führt.
Zum Beispiel kann ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein neues HCV-Polypeptid kodiert, das homolog zu dem Polypeptid von SEQ ID NO: 2 ist, d. h. eine bestimmte prozentuale Identität zum Polypeptid von SEQ ID NO: 2 aufweist, dadurch geschaffen werden, indem man eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, Additionen oder Deletionen in die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 einführt, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Additionen oder Deletionen in das kodierte Polypeptid eingeführt werden. Mutationen können in SEQ ID NO: 1 durch Standardtechniken, wie ortsgerichtete Mutagenese und PCR-gerichtete Mutagenese, eingeführt werden. Alternativ kann solch ein Polypeptid chemisch synthetisiert werden, um ein Polypeptid mit einer Änderung in der Aminosäuresequenz gegenüber der im natürlich vorkommenden Polypeptid zu ergeben.
Vorzugsweise werden keine Substitutionen oder konservative Aminosäuresubstitutionen durchgeführt, wo es hohe Homologie oder Identität hinsichtlich der Aminosäurereste unter den verschiedenen Isolaten gibt. Eine "konservative Aminosäuresubstitution" ist eine solche, bei der der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ersetzt wird. Familien von Aminosäureresten, die ähnliche Seitenketten aufweisen, sind im Stand der Technik definiert, darunter basische Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), saure Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladene polare Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolare Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigte Seitenketten (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatische Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin).
Alternativ können in einer anderen Ausführungsform Mutationen willkürlich entlang dem ganzen oder einem Teil der kodierenden Sequenz für ein neues HCV-Polypeptid eingeführt werden, wie z. B. durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können überprüft werden, z. B. indem man sie auf Reaktivität mit Antikörpern von einem Individuum mit einer früheren oder gegenwärtigen HCV-Infektion testet.
B. Expressionsvektoren und Wirtszellen
Die hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle können in einem Expressionsvektor exprimiert werden, um ein neues HCV-Polypeptid zu produzieren. Hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Vektor" auf ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure, mit der es verknüpft wurde, zu transportieren. Ein Typ eines Vektors ist ein "Plasmid", das sich auf eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife bezieht, in die zusätzliche DNA-Abschnitte ligiert werden können. Ein anderer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Abschnitte in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle, in die sie eingeführt werden, befähigt (z. B. bakterielle Vektoren, die einen bakteriellen Replikationsorigin aufweisen, und episomale Säugervektoren). Andere Vektoren (z. B. nicht episomale Säugervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle nach der Einführung in die Wirtszelle integriert und dabei zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Ferner sind bestimmte Vektoren in der Lage, die Expression von Genen, mit denen sie operativ verknüpft sind, zu steuern. Derartige Vektoren werden hierin als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen besitzen Expressionsvektoren zur Verwendung in rekombinanten DNA-Techniken oft die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" synonym als das Plasmid in der gewöhnlichsten Form eines Vektors verwendet werden. Allerdings soll die Erfindung derartige andere Formen von Expressionsvektoren, wie z B. virale Vektoren (z. B. replikationsdefektive Retroviren), Adenviren und adenassoziierte Viren) umfassen, die äquivalente Funktionen erfüllen.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung umfassen ein Nukleinsäuremolekül, wie es hierin beschrieben ist, in einer Form, die für die Expression der Nukleinsäure geeignet ist, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen umfassen, die auf der Grundlage der für die Expression verwendeten Wirtszelle ausgewählt werden, und die operativ mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind. Innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektors soll "operativ verknüpft" bedeuten, dass die Nukleotidsequenz von Interesse mit der (den) regulatorische(n) Sequenz(en) auf eine Weise verknüpft ist, die die Expression der Nukleotidsequenz gestattet (z. B. in einem in vitro-Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht ist). Der Begriff "regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Steuerungselemente für die Expression (z. B. Polyadenylierungssignale) umfassen. Derartige regulatorische Sequenzen sind zum Beispiel beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulatorische Sequenzen umfassen solche, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Arten von Wirtszellen steuern, und solche, die die Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen steuern (z. B. gewebsspezifische regulatorische Sequenzen). Der Fachmann ist sich bewusst, dass die Ausgestaltung des Expressionsvektors von solchen Faktoren, wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, der Expressionsmenge des gewünschten Proteins, etc. abhängen kann. Die Expressionsvektoren der Erfindung können in Wirtszellen eingeführt werden, um dadurch neue HCV-Polypeptide zu produzieren, einschließlich Fusionsproteine, die solche Polypeptide umfassen.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können für die Expression von neuen HCV-Polypeptiden in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen entworfen werden. Beispielsweise können die neuen HCV-Polypeptide in bakteriellen Zellen, wie E. coli, Insektenzellen (mittels Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen oder Säugerzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden ferner in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), diskutiert. Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert werden, zum Beispiel mittels den regulatorischer Sequenzen des T7-Promotors und der T7-Polymerase. Die Expression von Proteinen in Prokaryonten wird meistens in E. coli mit Vektoren durchgeführt, die konstitutive oder induzierbare Promoter enthalten, die die Expression von Fusion- oder Nichtfusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren addieren an ein darin kodiertes Protein, üblicherweise an den Aminoterminus des rekombinanten Proteins, eine Anzahl an Aminosäuren. Solche Fusionsvektoren dienen typischerweise dreierlei Zwecken: 1.) die Expression von rekombinantem Protein zu steigern; 2.) die Löslichkeit des rekombinanten Proteins zu erhöhen, und 3.) die Aufreinigung des rekombinanten Proteins durch die Funktion als Ligand bei der Affinitätsaufreinigung zu unterstützen. Oft wird in Fusionsexpressionsvektoren eine proteolytische Spaltstelle an der Verbindung des Fusionsrestes und des rekombinanten Proteins eingeführt, um die Trennung des rekombinanten Proteins vom Fusionsrest nach der Aufreinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Solche Enzyme und ihre verwandten Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase. Typische Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), die Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E bindendes Protein bzw. Protein A mit dem rekombinanten Zielprotein fusionieren.
Beispiele für geeignete induzierbare Nichtfusions-Expressionsvektoren für E. coli umfassen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) und pET 11d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89). Die Expression des Targetgens vom pTrc-Vektor beruht auf der Transkription der RNA-Polymerase des Wirts von einem trp-lac-Hybrid-Fusionspromotor. Die Expression des Targetgens vom pET 11d-Vektor hängt von der Transkription von einem T7 gn10-lac Fusionspromotor ab, die durch eine coexprimierte virale RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird durch die Wirtstämme BL21(DE3) oder HMS174(DE3) von einem residenten λ-Prophagen zur Verfügung gestellt, der ein T7 gn1-Gen unter der transkriptionellen Kontrolle des lacUV 5-Promotors beherbergt.
Eine Strategie zur Maximierung der Expression von rekombinantem Protein in E. coli besteht darin, das Protein in einem Wirtsbakterium mit einer beeinträchtigten Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins zu exprimieren (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press San Diego, Kalifornien (1990) 119-128). Eine weitere Strategie besteht darin, die Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor zu insertierenden Nukleinsäure zu ändern, so dass die einzelnen Codons für jede Aminosäure diejenigen sind, die bevorzugt in E. coli verwendet werden (Wada et al., (1992) Nuc. Acids Res. 20: 2111-2118). Eine solche Änderungen der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung kann mittels gewöhnlicher DNA-Synthesetechniken durchgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform ist der Expressionsvektor für die neuen HCV-Polypeptide ein Hefeexpressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYepSec1 (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
Alternativ können die neuen HCV-Polypeptide in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirusvektoren, die für die Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (z. B. Sf 9-Zellen) zur Verfügung stehen, umfassen die pAc-Serien (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) und die pVL-Serien (Lucklow, V.A. und Summers, M.D., (1989) Virology 170: 31-39).
In noch einer weiteren Ausführungsform wird ein Nukleinsäuremolekül, das für die neuen HCV-Polypeptide der Erfindung kodiert, in Säugerzellen unter Verwendung eines Säugerexpressionsvektors exprimiert. Beispiele für Säugerexpressionsvektoren umfassen pCDM8 (Seed, B., (1987) Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6: 187-195). Wenn er in Säugerzellen verwendet wird, dann werden die Steuerungsfunktionen des Expressionsvektors oft durch virale regulatorische Elemente bereitgestellt. Zum Beispiel sind üblicherweise verwendete Promotoren, von Polyoma, Adenvirus 2, Cytomegalovirus und Simian Virus 40 abgeleitet.
In einer weiteren Ausführungsform ist der rekombinante Säugerexpressionsvektor in der Lage, die Expression der Nukleinsäure bevorzugt in einem bestimmten Zelltyp zu steuern (z. B. werden gewebsspezifische regulatorische Elemente verwendet, um die Nukleinsäure zu exprimieren). Gewebsspezifische regulatorische Elemente sind aus dem Stand der Technik bekannt. Nicht einschränkende Beispiele für geeignete gewebsspezifische Promotoren umfassen den Albuminpromotor (leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), lymphoidspezifische Promotoren (Calame und Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), insbesondere Promotoren von T-Zell-Rezeptoren (Winoto und Baltimore (1989) EMBO J 8: 729-733) und Immunglobulinen (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen und Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), neuronspezifische Promotoren (z. B. den Neurofilamentpromotor; Byrne und Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al. (1985) Science 230: 912-916), säugerdrüsenspezifische Promotoren (z. B. Milchserumpromotor; US-Patent-Nr. 4,873,316 und Veröffentlichung der europäischen Anmeldung Nr. 264,166). Entwicklungsregulierte Promotoren werden ebenfalls umfasst, zum Beispiel die murinen hox-Promotoren (Kessel und Gruss (1990) Science 249: 374-379) und der α-Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537-546).
Ein rekombinanter Expressionsvektor wird in eine geeignete Wirtszelle eingeführt. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hierin synonym verwendet. Es versteht sich, dass sich solche Begriffe nicht nur auf die bestimmte betroffene Zelle beziehen, sondern auch auf Nachkommen oder mögliche Nachkommen einer solchen Zelle. Da bestimmte Modifikationen in nachfolgenden Generationen entweder aufgrund von Mutationen oder Umwelteinflüssen vorkommen können, müssen solche Nachkommen nicht tatsächlich identisch zur Elternzelle sein, sind aber trotzdem vom Umfang des Begriffes, wie er hierin verwendet wird, umfasst.
Eine Wirtszelle kann irgendeine prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein. Beispielsweise können neue HCV-Polypeptide in Bakterienzellen, wie E. coli, Insektenzellen, Hefe- oder Säugerzellen (wie z. B. Ovarienzellen vom chinesischen Hamster (CHO) oder COS-Zellen) exprimiert werden. Dem Fachmann sind weitere geeignete Wirtszellen bekannt.
Vektor-DNA kann in prokaryontische oder eukaryontische Zellen mittels herkömmlicher Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt werden. Hierin verwendet sollen sich die Begriffe "Transformation" und "Transfektion" auf eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Techniken zum Einbringen von fremder Nukleinsäure (z. B. DNA) in eine Wirtszelle beziehen, darunter Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, Lipofection oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen können in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)) und weiteren Laborhandbüchern gefunden werden.
Es ist bekannt, dass zur stabilen Transfektion von Säugerzellen in Abhängigkeit vom verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik nur ein geringer Anteil der Zellen die Fremd-DNA in ihr Genom integrieren kann. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren wird im Allgemeinen ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert (z. B. Resistenz gegenüber Antibiotika), in die Wirtszelle zusammen mit dem Gen von Interesse eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen solche, die Resistenz gegenüber Medikamenten, wie z. B. G418, Hygromycin und Methotrexat, verleihen. Eine Nukleinsäure, die für einen selektierbaren Marker kodiert, kann in eine Wirtszelle auf demselben Vektor, der für das Polypeptid kodiert, oder auf einem separaten Vektor eingeführt werden. Die mit der eingeführten Nukleinsäure stabil transfizierten Zellen können mittels Selektion mit Medikamenten identifiziert werden (z. B. werden Zellen, die das selektierbare Markergen aufgenommen haben, überleben, während die anderen Zellen sterben werden.
Eine Wirtszelle der Erfindung, wie z. B. eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle in Kultur, kann verwendet werden, um neue HCV-Polypeptide zu produzieren (d. h. zu exprimieren). Dementsprechend stellt die Erfindung ferner Verfahren zur Herstellung neuer HCV-Polypeptide unter Verwendung dieser Wirtszellen zur Verfügung. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Kultivierung der Wirtszelle der Erfindung (in die ein rekombinanter Expressionsvektor, der für die neuen HCV-Polypeptide kodiert, eingeführt worden ist) in einem geeigneten Medium bis ein neues HCV-Polypeptid produziert wird. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner die Isolierung der neuen HCV-Polypeptide aus dem Medium oder der Wirtszelle.
C. Chemische Synthese neuer HCV-Polypeptide
Die neuen HCV-Polypeptide können chemisch synthetisiert werden, wie dies aus dem Stand der Technik gut bekannt ist. Ferner kann das Peptid substituiert und/oder derivatisiert sein, um die Stabilität zu optimieren. Die betreffenden Polypeptide können auch als verzweigte Polypeptide, insbesondere für Impfstoffanwendungen, synthetisiert werden, wie dies aus dem Stand der Technik bekannt ist (siehe z. B. Peptides. Herausgegeben von Bernd Gutte Academic Press 1995. S. 456-493).
IV. Antikörper, die mit den neuen HCV-Polypeptiden reagieren
Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung einen Antikörper, der an ein neues HCV-Polypeptid bindet. Ein neues HCV-Polypeptid oder ein Fragment davon kann als Immunogen verwendet werden, um mittels Standardtechniken zur Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern Antikörper zu erzeugen, die solch ein Polypeptid binden. Die Erfindung stellt zahlreiche antigenische Perptidfragmente von neuen HCV-Polypeptiden zur Verwendung als Immunogene zur Verfügung. Vorzugsweise umfasst ein antigenisches Peptid eines solchen Polypeptids wenigstens 8 Aminosäurereste der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 oder den ARF #1-Polypeptid- oder ARF#2- Polypeptid-Konsensussequenzen gezeigt ist. Vorzugsweise umfasst das antigenische Peptid wenigstens 10 Aminosäurereste, bevorzugter wenigstens 14 Aminosäurereste, noch bevorzugter wenigstens 18 Aminosäurereste. Bevorzugte Polypeptide umfassen die ARF #1-Konsensussequenz: LNLKEKP(X1)(X2)TPT(X3) oder die ARF #2-Konsensussequenz AAHRT(X4)SSR(X5)(X6)VR, wobei X1 N oder K ist, X2 V oder E ist, X3 A oder V ist, X4 L oder S ist, X5 A oder V ist und X6 A oder V ist. Weitere bevorzugte HCV-Polypeptide umfassen oder bestehen aus der Sequenz LNLKEKPNVTPTAC oder AAHRTSSSRAVVRC.
Die betreffenden HCV-Polypeptide werden verwendet, um Antikörper durch Immunisierung eines geeigneten Subjekts (z. B. Kaninchen, Ziege, Maus oder ein anderer Säuger) mit dem Immunogen herzustellen. Eine geeignete Immunogene Zubereitung kann beispielsweise rekombinant exprimierte neue HCV-Polypeptide enthalten, oder es kann ein chemisch synthetisiertes neues HCV-Polypeptid verwendet werden. Die Zubereitung kann ferner ein Adjuvans, wie z. B. das komplette oder inkomplette Freundsche Adjuvans, oder ähnliche immunstimulatorische Mittel umfassen. Die Immunisierung eines geeigneten Subjekts mit einer immunogenen HCV-Polypeptidzubereitung ruft eine polyklonale HCV-Polypeptid-Antikörperantwort hervor.
Dementsprechend betrifft ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung Antikörper, die mit den neuen HCV-Polypeptiden reagieren. Hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Antikörper" auf Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen, d. h. auf Moleküle, die eine antigenbindende Stelle aufweisen, die spezifisch ein HCV-Polypeptid binden (mit diesem reagieren). Die Erfindung stellt polyklonale und monoklonale Antikörper zur Verfügung, die die HCV-Polypeptide binden. Der Begriff "monoklonaler Antikörper" oder "monoklonale Antikörperzusammensetzung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Population von Antikörpermolekülen, die nur eine Spezies einer antigenbindenden Stelle enthält, die in der Lage ist, mit einem bestimmten Epitop eines neuen HCV-Polypeptids eine Immunreaktion einzugehen. Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung zeigt daher eine individuelle Bindungsaffinität für ein bestimmtes HCV-Polypeptid, mit dem sie eine Immunreaktion eingeht.
Polyklonale anti-HCV-Polypeptid-Antikörper können wie vorstehend beschrieben durch Immunisierung eines geeigneten Subjekts mit einem HCV-Polypeptid-Immunogen oder einem abgeschwächten HCV-Virus hergestellt oder von einem infizierten Individuum erhalten werden. Der Titer des anti-HCV-Polypeptid-Antikörpers in dem immunisierten Subjekt kann im Zeitablauf mittels Standardtechniken, wie z. B. mit dem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) unter Verwendung von immobilisierten HCV-Polypeptiden überwacht werden. Falls gewünscht, können die gegen das HCV-Polypeptid gerichteten Antikörpermoleküle aus dem Tier isoliert (z. B. aus dem Blut) und weiter mittels gut bekannter Techniken, wie Protein A-Chromatographie, aufgereinigt werden, um die IgG-Fraktion zu erhalten. Nach einer geeigneten Zeit nach der Immunisierung, z. B. wenn die Antikörpertiter am höchsten sind, können die antikörperproduzierenden Zellen von dem Subjekt erhalten und verwendet werden, um monoklonale Antikörper durch Standardtechniken, wie die Hybridomatechnik, die ursprünglich von Kohler und Milstein (1975, Nature 256: 495-497) beschrieben wurde (siehe auch Brown et al. (1981) J. Immunol. 127: 539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255: 4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76: 2927-31; und Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29: 269-75), die neuere humane B-Zell-Hybridomatechnik (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4: 72), die EBV-Hybridomatechnik (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. S. 77-96) oder Triomatechniken, herzustellen. Die Technologie für die Herstellung von monoklonalen Antikörperhybridomas ist gut bekannt (siehe allgemein R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale I Biol. Med., 54: 387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3: 231-36). Kurz gesagt wird eine immortale Zelllinie (typischerweise eine Myeloma) mit Lymphozyten (typischerweise Splenozyten) von einem Säuger fusioniert, der, wie vorstehend beschrieben, mit einem HCV-Polypeptidimmunogen immunisiert worden ist, und werden die Kulturüberstände der resultierenden Hybridomazellen überprüft, um einen Hybridoma zu identifizieren, der einen monoklonalen Antikörper produziert, der das HCV-Polypeptid bindet.
Irgendeine der vielen gut bekannten Vorschriften, die zur Fusion von Lymphozyten mit immortalisierten Zelllinien verwendet werden, kann zum Zweck der Erzeugung eines monoklonalen anti-HCV-Polypeptid-Antikörpers angewandt werden (siehe Z. B. G. Galfre et al. (1977) Nature 266: 55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., vorstehend zitiert; Lerner, Yale J. Biol. Med., vorstehend zitiert; Kenneth, Monoclonal Antibodies, vorstehend zitiert). Ferner versteht der Fachmann, dass es viele Abwandlungen derartiger Verfahren gibt, die ebenfalls nützlich wären. Üblicherweise stammt die immortale Zelllinie (z. B. eine Mye lomazelllinie) von derselben Säugerspezies wie die Lymphozyten. Beispielsweise können murine Hybridomas durch die Fusion von Lymphozyten aus einer Maus, die mit einer immunogenen Zubereitung der vorliegenden Erfindung immunisiert wurde, mit einer immortalisierten Mauszelllinie hergestellt werden. Bevorzugte immortale Zelllinien sind Maus-Myelomazelllinien, die sensitiv gegenüber Kulturmedium sind, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT-Medium") enthält. Irgendeine aus einer Anzahl an Myelomazelllinien kann als Fusionspartner gemäß Standardtechniken verwendet werden, z. B. die P3-NS1/1-Ag4-1-, P3-x63-Ag8.653- oder Sp2/O-Ag14-Myelomalinien. Diese Myelomalinien sind von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md, erhältlich. Üblicherweise werden HAT-sensitive Maus-Myelomazellen mit Maus-Splenozyten mittels Polyethylenglycol ("PEG") fusioniert. Hybridomazellen, die aus der Fusion resultieren, werden dann unter Verwendung von HAT-Medium selektiert, das nicht fusionierte und unproduktiv fusionierte Myelomazellen abtötet (nicht fusionierte Splenozyten sterben nach mehreren Tagen ab, da sie nicht transformiert sind).
Hybridomazellen, die einen monoklonalen Antikörper der Erfindung produzieren, werden durch ein Screening des Hybridoma-Kulturtiberstands nach Antikörpern, die HCV-Polypeptide binden, z. B. mittels eines gewöhnlichen ELISA-Assays, detektiert.
Alternativ zur Herstellung von monoklonale Antikörper ausscheidenden Hybridomas kann ein monoklonaler anti-HCV-Polypeptid-Antikörper durch Screening einer rekombinanten kombinatorischen Immunglobulin-Bibliothek (z. B. eine Antikörper-Phagedisplay-Bibliothek) mit HCV-Polypeptiden identifiziert und isoliert werden, um Mitglieder der Immunglobulin-Bibliothek zu isolieren, die HCV-Polypeptide binden. Kits zur Erzeugung und zum Screening von Phagedisplay-Bibliotheken sind kommerziell erhältlich (z. B. das Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Katalognr. 27-9400-01; und der Stratagene SurfZAP^TM Phage Display Kit, Katalognr. 240612). Darüber hinaus können Beispiele für Verfahren und Reagenzien, die besonders zugänglich für die Verwendung bei der Erzeugung und dem Screening von Antikörper-Display-Bibliotheken sind, zum Beispiel gefunden werden in Ladner et al. US-Patent-Nr. 5,223,409; Kang et al. Internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/18619; Dower et al. Internationale Veröffentlichung Nr. WO 91/17271; Winter et al. Internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/20791; Markland et al. Internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/15679; Breitling et al. Internationale Veröffentlichung WO 93/01288; McCafferty et al. Internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/01047; Garrard et al. Internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/09690; Ladner et al. Internationale Veröffentlichung Nr. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89 : 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19: 4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982; und McCafferty et al. Nature (1990) 348: 552-554.
Des Weiteren liegen rekombinante anti-HCV-Polypeptid-Antikörper, wie z. B. chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper, umfassend sowohl humane als auch nicht humane Teile, die unter Verwendung von gewöhnlichen rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden können, im Rahmen der Erfindung. Derartige chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper können durch im Stand der Technik bekannte rekombinante DNA-Techniken produziert werden, zum Beispiel unter Verwendung von Verfahren, die beschrieben sind in Robinson et al. Internationale Patentveröffentlichung PCT/US86/02269; Akira et al. Europäische Patentanmeldung 184,187; Taniguchi, M. Europäische Patentanmeldung 171, 496; Morrison et al. Europäische Patentanmeldung 173,494; Neuberger et al. PCT-Anmeldung WO 86/01533; Cabilly et al. US-Patent Nr. 4,816,567; Cabilly et al. Europäische Patentanmeldung 125,023; Retter et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) PNAS 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; und Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80 : 1553-1559), Morrison, S. L. (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214; Winter US-Patent 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; und Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141: 4053-4060.
Ein anti-HCV-Polypeptid-Antikörper (z. B. ein monoklonaler Antikörper) kann verwendet werden, um HCV-Polypeptide durch Standardtechniken, wie Affinitätschromatographie, Immunprizipitation, ELISA oder RIA, zu isolieren oder zu detektieren, wie dies aus dem Stand der Technik gut bekannt ist. Ein anti-HCV-Polypeptid-Antikörper kann die Aufreinigung von natürlichem HCV-Polypeptid aus Zellen und von in Wirtszellen exprimierten, rekombinant hergestellten HCV-Polypeptiden ermöglichen. Außerdem kann ein anti- HCV-Polypeptid-Antikörper verwendet werden, um HCV-Polypeptide aus einer Körperflüssigkeit eines Subjekts zu detektieren, das im Verdacht steht, eine HCV-Infektion aufzuweisen. Die Detektion kann durch Koppeln (d. h. physisches Verknüpfen) des Antikörpers an eine detektierbare Substanz ermöglicht werden. Beispiele für detektierbare Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende Materialien, lumineszierende Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele für geeignete Enzyme umfassen Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Acetylcholinesterase; Beispiele für geeignete Komplexe aus prosthetischen Gruppen umfassen Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; Beispiele für geeignete fluoreszierende Materialien umfassen Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinyalaminfluorescein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin; ein Beispiel für ein lumineszierendes Material umfasst Luminol; und Beispiele für geeignete radioaktive Materialien umfassen ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S oder ³H.
Derartige Antikörper können in diagnostischen Kits enthalten sein und sind ebenfalls verwendbar bei der passiven Immunisierung gegen HCV in Patienten, die eine aktive HCV-Infektion aufweisen oder wahrscheinlich HCV ausgesetzt sind.
IV. Verwendungen von neuen HCV-Polypeptiden
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung eine Impfstoffzusammensetzung, die einem Subjekt vor dem Kontakt mit HCV verabreicht wird, um eine Hepatitis C-Infektion in dem Subjekt zu verhindern. In einer Ausführungsform umfasst der Impfstoff ein neues HCV-Polypeptid der Erfindung. In einer weiteren Ausführungsform ruft der Impfstoff die Synthese eines neuen HCV-Polypeptids der Erfindung in einem Subjekt hervor.
A. Impfstoffe
Neue HCV-Polypeptidsequenzen, die für die Verwendung in Impfstoffzusammensetzungen zur Vorbeugung vor HCV in einem Subjekt geeignet sind, können leicht bestimmt werden. Zum Beispiel können Epitope, die eine Immunantwort auslösen, durch Screening in einem Immunassay gegen Seren von Patienten mit einer früheren oder fortdauernden HCV-Infektion identifiziert werden. Alternativ können immunogene Polypeptide mittels Computeranalyse identifiziert werden, um immunogene Epitope zu identifizieren. Schließlich könnte das neue Polypeptid in voller Lange in einem Impfstoff eingesetzt werden.
In einer weiteren Ausführungsform können Mittel, die bekannte Adjuvantien sind, mit den betreffenden Polypeptiden verabreicht werden. Derzeit ist das einzige Adjuvans, das verbreitet in Menschen verwendet wird, Alum (Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid). Saponin und sein aufgereinigter Bestandteil Quil A, Freunds komplettes Adjuvans und andere Adjuvantien, die in der Forschung und veterinären Anwendungen zum Einsatz kommen, haben das Potential zur Verwendung in humanen Impfstoffen. Allerdings können auch neue chemisch definierte Zubereitungen, wie Muramyldipeptid, Monophosphoryllipid A, Phospholipidkonjugate, wie diejenigen, die von Goodman-Snitkoff et al. J. Immunol. 147: 410-415 (1991) beschrieben sind, Resorcinole, nichtionische Tenside, wie Polyoxyethylenoleylether und n-Hexadecylpolyethylenether, Enzyminhibitoren, einschließlich dem pankreatischen Trypsininhibitor, Diisopropylfluorphosphat (DEP) und Trasylol verwendet werden. In Ausführungsformen, bei denen Antigen verabreicht wird, kann das Antigen z. B. in einem Proteoliposom, wie von Miller et al., J. Exp. Med. 176: 1739-1744 (1992) beschrieben, oder in Lipidvesikel, wie Novasome^TM Lipidvesikel (Micro Vescular Systems, Inc., Nashua, N. H.) eingekapselt werden, um die Immunantwort weiter zu verstärken.
In noch weiteren Ausführungsformen kann, als Alternative zur Verabreichung des neuen HCV-Polypeptids, das Polypeptid von dem Subjekt synthetisiert werden. Dies kann dadurch geschehen, dass man ein Plasmid-DNA-Konstrukt verwendet, das ähnlich denen ist, die für die Abgabe von Reportergenen oder therapeutischen Genen verwendet werden. Solch ein Konstrukt umfasst vorzugsweise einen bakteriellen Replikationsorigin, der die Amplifizierung großer Mengen der Plasmid-DNA erlaubt; ein prokaryontisches, selektierbares Markergen; eine Nukleinsäuresequenz, die für ein neues HCV-Polypeptid oder einen Teil davon kodiert; eukaryontische Transkriptionsregulationselemente zur Steuerung der Genexpression in der Wirtszelle; und eine Polyadenylierungssequenz, um die richtige Termination der exprimierten mRNA zu gewährleisten (Davis. 1997. Curr. Opin. Biotechnol. 8: 635). Vektoren, die für die DNA-Immunisierung verwendet werden, können gegebenenfalls eine Signalsequenz umfassen (Michel et al. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 5307; Donnelly et al. 1996. J. Infect. Dis. 173: 314). DNA-Impfstoffe können auf eine Vielzahl von Wegen verabreicht werden, zum Beispiel durch Injektion (z. B. intramusku lär, intradermal oder durch biolistische Injektion von mit DNA beschichteten Goldpartikeln in die Epidermis mit einer Genkanone, die einen Partikelbeschleuniger oder ein komprimiertes Gas zur Injektion der Partikel in die Haut verwendet (Haynes et al. 1996. J. Biotechnol. 44: 37)). Alternativ können DNA-Impfstoffe auf nicht invasiven Wegen verabreicht werden. Beispielsweise kann nackte oder lipidformulierte DNA an das Atemsystem abgegeben oder an eine andere Stelle, z. B. die Peyerschen Platten durch orale Abgabe von DNA (Schubbert. 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 961), gesteuert werden. Abgeschwächte Mikroorganismen können zur Abgabe an mukosale Oberflächen verwendet werden (Sizemore et al. 1995. Science. 270: 29). Jede der vorliegenden Impfstoffzusammensetzungen kann eine oder mehrere Epitope eines neuen HCV-Polypeptids umfassen (oder dafür kodieren). Derartige Zubereitungen können ferner Polypeptidsequenzen umfassen, die von einer HCV-Polyproteinsequenz abgeleitet sind. In anderen Ausführungsformen kann solch eine Impfstoffzusammensetzung ferner eine Verbindung umfassen, die die immunologische Reaktivität des neuen HCV-Polypeptidepitops verstärken wird. Zum Beispiel kann die Immunogenizität der neuen HCV-Polypeptide dadurch verstärkt werden, dass man ein Fusionsprotein ein neues HCV-Polypeptid, fusioniert mit einem anderen Polypeptid, d. h. nicht ein neues HCV-Polypeptid, enthalten lässt. Techniken zur Herstellung solcher Fusionsproteine sind aus dem Stand der Technik bekannt. Alternativ kann ein Impfstoff ein immunregulatorisches Molekül, wie z. B. ein Cytokin, umfassen. Beispielsweise können in einer Ausführungsform Plasmide zur DNA-Impfung ein einzelnes Immungen exprimieren, oder zwei Sequenzen können coexprimiert werden. In einer Ausführungsform können die zusätzlichen Sequenzen zusätzliche Immunogene sein (neue HCV-Polypeptide oder HCV-Polyprotein-Polypeptide oder andere Polypeptide) oder für Modulatoren von Immunantworten kodieren, wie z. B. Lymphokingene oder costimulatorische Moleküle (Iwasaki et al. 1997. J. Immunol. 158: 4591).
Typischerweise werden die Impfstoffzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung als Injektionen, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, hergestellt. Feste Formen, die zur Lösung oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Die Zusammensetzung kann auch emulgiert oder das Polypeptid in Liposomen eingekapselt sein. Das Polypeptid kann mit pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoffen, zum Beispiel Wasser, Salzlösung, Traubenzucker, Glycerin, Ethanol oder ähnlichem, vermischt sein. Die Zusammensetzung kann auch kleinere Mengen an zum Beispiel Benetzungsmitteln, Mitteln zur pH-Pufferung und/oder Adjuvantien, wie Z. B. Aluminiumhydroxid, N-Acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetylnor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (CGP 11637 oder nor-MDP), N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycerin-3-hydroxyphosphoryloxy)ethylamin (CGP 19835A oder MTP-PE), oder bakterielle Bestandteile umfassen.
Solche Impfstoffzusammensetzungen werden im Allgemeinen parenteral durch Injektion verabreicht, üblicherweise entweder subkutan oder intramuskulär. Andere Formulierungen können oral durch Inhalation oder als Suppositorien verabreicht werden.
Die Polypeptide können in den Impfstoff in neutraler Form oder in Form eines Salzes einbezogen werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze umfassen die Salze nach Säurezugabe (gebildet mit den freien Aminogruppen des Polypeptids), die mit anorganischen Säuren, wie zum Beispiel Salzsäure oder Phosphorsäure, oder solchen organischen Säuren, wie Essig-, Oxal-, Wein-, Maleinsäure oder ähnlichen, gebildet werden. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen, wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)-Hydroxiden, und solchen organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain oder ähnlichen, abgeleitet sein.
Die Impfstoffe werden so verabreicht, dass dies mit der Darreichungsform vereinbar ist, und in solch einer Menge, die prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksam sein wird. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Subjekt, der Leistungsfähigkeit des Immunsystems des Subjekts, eine Immunantwort gegenüber dem Impfstoff aufzubauen, und dem Grad des gewünschten Schutzes ab. Der Bereich von 5 μg bis 250 μg Antigen pro Dosis ist jedoch oft angemessen. Die Impfstoffzusammensetzungen können in einer Einzeldosis oder in mehreren Dosen gegeben werden. Die Bestimmung geeigneter Dosen gehört zum Können des Fachmanns und erfordert keinen übermäßigen experimentellen Aufwand. In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung vor HCV in einem Subjekt durch die Verabreichung eines neuen HCV-Polypeptids an ein Subjekt oder dadurch, dass man ein neues HCV-Polypeptid in einem Subjekt exprimieren lässt.
B. Diagnostische Kits
Unter einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung werden Verfahren zur Diagnose einer HCV-Infektion, z. B. entweder einer früheren oder bestehenden Infektion, und diagnostische Kits zur Detektion einer Infektion mit HCV bereitgestellt.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer HCV-Infektion durch Detektion der Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörpern, die an ein neues HCV-Polypeptid binden, in der Körperflüssigkeit eines Subjekts zur Verfügung. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Inkubation einer Testprobe unter Bedingungen, die das Binden eines neuen HCV-Polypeptids und eines Antikörpers in der Testprobe aus Körperflüssigkeit ermöglicht, und die Detektion der Bindung von Polypeptid und Antikörper.
Testproben können aus irgendeiner geeigneten Körperflüssigkeit oder Gewebepräparation, zum Beispiel Blut, Plasma, Serum, Spinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Tränen, Speichel, Milch, oder Lebergewebepräparationen gewonnen werden.
Die Detektion der Bindung zwischen einem neuen HCV-Polypeptid der Erfindung und einem Antikörper kann unter Verwendung irgendeiner Technik, die aus dem Stand der Technik bekannt ist, erreicht und mittels Antikörpern, die wie vorstehend beschrieben markiert sind, ermöglicht werden.
Antikörper, die an das neue HCV-Polypeptide binden, können mittels einer Anzahl an unterschiedlichen Screeningassays, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie z. B. einem enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), einem Radioimmunassay (RIA) oder einem Western Blot Assay, detektiert werden. Generell detektiert jeder Assay die Gegenwart von Protein-Antikörper-Komplexen von spezifischem Interesse durch den Einsatz eines markierten Reagenzes (z. B. einem Antikörper), das spezifisch für den Komplex von Interesse ist. Dementsprechend werden diese Assays bei der vorliegenden Erfindung verwendet, um Komplexe aus neuem HCV-Polypeptid und Antikörper, die zwischen Immunglobulinen (z. B. humanem IgG, IgM und IgA), die in einer biologischen Probe enthalten sind, und einem neuen HCV-Polypeptid gebildet werden, zu detektieren. Wie nachstehend beschrieben wird, werden diese Protein-Antikörper-Komplexe bevorzugt unter Verwendung eines mit einem Enzym verbundenen Antikörpers oder Antikörperfragments (z. B. eines monoklonalen Antikörpers oder Fragments davon) detektiert, der bzw. das die Polypeptid-Antikörper-Komplexe erkennt und spezifisch bindet.
In einer Ausführungsform des Verfahrens wird ein Sandwich-ELISA-Assay verwendet. Beispielsweise wird ein neues HCV-Polypeptid, mit oder ohne Konjugation mit einem Träger, wie z. B. aktiviertes BSA, auf einer Platte immobilisiert. Eine Körperflüssigkeitsprobe von einem Individuum wird mit einem neuen HCV-Polypeptid unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die das Binden der Antikörper in der Probe an die Polypeptide gestatten. Die Probe wird anschließend entfernt und ein Antikörper, der an das HCV-Polypeptid gebunden hat, wird dadurch detektiert, dass man die Probe mit einem markierten sekundären Antikörper oder Antikörperfragment in Kontakt bringt, der bzw. das an einen Antikörper, der möglicherweise in der Probe des Subjekts anwesend ist, z. B. einen anti-human-Antikörper, bindet. Der ungebundene sekundäre Antikörper wird entfernt und die Gegenwart von sekundärem Antikörper, der gebunden bleibt, wird detektiert, Z. B. unter Verwendung einer wie vorstehend beschriebenen Markierung. Mögliche Kontrollen zur Verwendung in dem Verfahren umfassen Körperflüssigkeiten von nicht infizierten Subjekten und Polypeptide, die keine neuen HCV-Polypeptide sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung lässt die Gegenwart eines solchen Antikörpers auf eine Infektion mit HCV schließen.
In einer anderen Ausführungsform des Assays kann die Testprobe auf die Gegenwart von neuen HCV-Polypeptiden hin mittels bekannten Antikörpern getestet werden. In diesen Ausführungsformen werden Antikörper, die an neue HCV-Polypeptide binden, verwendet, um die Gegenwart von neuen HCV-Polypeptiden in der Körperflüssigkeit eines Subjekts oder in einer Zelle eines Subjekts, zu detektieren. Bei der Durchführung eines solchen Assays werden die Antikörper, die an ein neues HCV-Polypeptid binden, mit einer Zelle oder Körperflüssigkeit eines Subjekts unter Bedingungen in Kontakt gebracht, unter denen ein neues HCV-Polypeptid in der Probe des Subjekts an den Antikörper binden kann. Ungebundener Antikörper wird entfernt und gebundener Antikörper wird detektiert. Irgendeiner der vorstehend beschriebenen Antikörper kann bei der Ausübung dieses Verfahrens verwendet werden. Bevorzugte Antikörper zur Verwendung in den Verfahren dieser Ausführungsform sind hochspezifisch, einschließlich monospezifisch, und bevorzugter monoklonale Antikörper oder Fragmente davon. In bevorzugten Ausführungsformen sind derartige Antikörper markiert. In anderen Ausführungsformen werden solche Antikörper durch den Einsatz eines sekundären Antikörpers, der an sie und nicht an die Testprobe von einem Subjekt bindet, detektiert. Die Gegenwart eines neuen HCV-Polypeptids in der Probe eines Subjekts lässt auf eine Infektion mit HCV schließen.
Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung einen Assaykit zur Diagnose einer HCV-Infektion in einem Subjekt zur Verfügung. Der Kit enthält vorzugsweise einen festen Träger (z. B. eine ELISA-Platte), der in der Lage ist, Immunglobulin (z. B. IgG, IgM und IgA) von einer Probe eines Subjekts (vorzugsweise eine humane biologische Probe, wie z. B. eine Körperflüssigkeit) und einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon, der bzw. das spezifisch für ein neues HCV-Polypeptid ist, zu adsorbieren. In einer weiteren Ausführungsform kann der feste Träger aus dem Kit weggelassen werden. In einer anderen Ausführungsform enthält der Kit einen festen Träger (z. B. eine ELISA-Platte oder einen Objektträger) und einen monoklonalen Antikörper oder ein Fragment davon, der bzw. das spezifisch für ein neues HCV-Polypeptid ist. In anderen Ausführungsformen kann der feste Träger aus dem Kit weggelassen werden. Der Assaykit kann gegebenenfalls Anweisungen oder zusätzliche Reagenzien, wie z. B. eine Lösung zum Waschen von ungebundenen Proteinen vom festen Träger, und Materialien, die zur Durchführung eines Detektionsassays benötigt werden, enthalten.
C. Targets für die therapeutische Intervention
Die neuen HCV-Polypeptide der Erfindung sind auch Targets für eine Anti-HCV-Therapie. Die Erfindung stellt als solche Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen zur Verfügung, die mit einem neuen HCV-Polypeptid interagieren und daher wahrscheinlich die Infektion beeinträchtigen. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Kontaktieren des Polypeptids mit einer Verbindung in einem zellfreien System unter Bedingungen, die eine Interaktion der Verbindung mit dem Polypeptid gestatten, so dass sich ein Komplex bildet. Die Komplexe aus Polypeptid und Verbindung können dann von den Verbindungen, die nicht an das HCV-Polypeptid binden, getrennt werden, die Verbindungen, die an die HCV-Polypeptide binden, können dann isoliert und identifiziert werden. Beispielhafte Verbindungen, die nach Aktivität in den betreffenden Assays gescreent werden können, umfassen Peptide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, kleine organische Moleküle und Bibliotheken aus Extrakten von natürlichen Produkten, sind aber nicht darauf beschränkt. Der Begriff "nicht-peptidische Verbindung" soll Verbindungen umfassen, die wenigstens zum Teil von molekularen Strukturen umfasst sind, die sich von natürlich vorkommenden L-Aminosäureresten, die durch natürliche Peptidbindungen verknüpft sind, unterscheiden. Allerdings sollen "nicht-peptidische Verbindungen" Verbindungen umfassen, die sich im Ganzen oder zum Teil aus peptidomimetischen Strukturen, wie D-Aminosäuren, nicht natürlich vorkommenden L-Aminosäuren, modifizierten Peptidrückgraten und ähnlichem zusammensetzen, sowie Verbindungen, die im Ganzen oder zum Teil aus molekularen Strukturen zusammengesetzt sind, die nicht mit natürlich vorkommenden L-Aminosäureresten verwandt sind, die durch natürliche Peptidbindungen verknüpft sind. "Nicht-peptidische Verbindungen" sollen auch natürliche Produkte umfassen.
Ein neuer Trend in der medizinischen Chemie umfasst die Herstellung von Mischungen von Verbindungen, die als Bibliotheken bezeichnet werden. Während die Verwendung von Bibliotheken aus Peptiden in der Fachwelt gut etabliert ist, wurden neue Techniken entwickelt, die die Herstellung von Mischungen aus anderen Verbindungen, wie Benzodiazepinen (Bunin et al. 1992. J. Am. Chem. Soc. 114: 10987; DeWitt et al. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909), Peptoiden (Zuckerman. 1994. J. Med. Chem. 37: 2678), Oligocarbamaten (Cho et al. 1993. Science. 261: 1303) und Hydantoinen (DeWitt et al., oben) ermöglicht haben. Rebek et al. haben einen Ansatz für die Synthese von molekularen Bibliotheken aus kleinen organischen Molekülen mit einer Diversität von 104-105 beschrieben (Carell et al. 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994. 33: 2061).
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können mittels irgendeinem der zahlreichen Ansätze zu den aus dem Stand der Technik bekannten kombinatorischen Bibliothekverfahren erhalten werden, darunter: Biologische Bibliotheken; räumlich ansteuerbare parallele Festphasen- oder Lösungsphasenbibliotheken ("spatially addressable parallel solid phase or solution Phase libraries"); synthetische Bibliothekverfahren, die Dekonvolution erfordern, das "One-bead one-compound"-Bibliothekverfahren, und synthetische Bibliothekverfahren, die Selektion durch Affinitätschromatographie verwenden. Der biologische Bibliothekansatz ist auf Peptidbibliotheken beschränkt, während die anderen vier Ansätze auf Peptid-, Nichtpeptid-Oligomer- oder Kleinmolekül-Bibliotheken von Verbindungen anwendbar sind (Lam, K.S. Anticancer Drug Des. 1997. 12: 145).
In einer Ausführungsform ist die Testverbindung ein Peptid oder Peptidomimetikum. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Verbindungen kleine organische nicht-peptidische Verbindungen.
Weitere beispielhafte Verfahren zur Synthese von molekularen Bibliotheken können im Stand der Technik gefunden werden, zum Beispiel in: Erb et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Horwell et al. 1996. Immunopharmacology 33: 68; und in Gallop et al. 1994. J Med. Chem. 37: 1233.
Bibliotheken von Verbindungen können in Lösung (z. B. Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421) oder auf Beads (Lam (1991) Nature 354: 82-84), Chips (Fodor (1993) Nature 364: 555-556), Bakterien (Ladner USP 5,223,409), Sporen (Ladner USP '409), Plasmiden (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869) oder auf Phagen (Scott und Smith (1990) Science 249: 386-390); (Devlin (1990) Science 249: 404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-310); (Ladner, oben) dargeboten werden.
In vielen Medikamentenscreening-Programmen, die Bibliotheken von Verbindungen und natürlichen Extrakten testen, sind Hochdurchsatzscreening-Assays wünschenswert, um die Anzahl an Verbindungen, die in einer gegebenen Zeitspanne durchgemustert werden, zu maximieren. Assays, die in zellfreien Systemen, wie die, die z. B. von aufgereinigten oder teilweise aufgereinigten Proteinen stammen, durchgeführt werden, sind oft als "primäre" Screens bevorzugt, da sie erstellt werden können, um eine schnelle Entwicklung und eine relativ einfache Detektion einer Änderung in einem molekularen Target zu erlauben, die von einer Testverbindung vermittelt wird. Demgemäß wird die Verbindung von Interesse in einem beispielhaften Screeningassay der vorliegenden Erfindung mit einem neuen HCV-Polypeptid in Kontakt gebracht. Die Detektion und Quantifizierung von Komplexen aus dem neuen HCV-Polypeptid und der Verbindung identifiziert die Verbindung als einen potentiellen Modulator eines neuen HCV-Polypeptids. Die Wirksamkeit der Verbindung kann durch die Erstellung einer Dosis-Wirkungs-Kurve aus Daten, die unter Einsatz von verschiedenen Konzentrationen der Testverbindung erhalten werden, bestimmt werden. Ferner kann auch eine Kontrolle, z. B. unter Verwendung eines anderen Polypeptids, durchgeführt werden, um eine Basislinie zum Vergleich zu bilden.
Die Komplexbildung zwischen dem neuen HCV-Polypeptid und einer Verbindung kann mittels einer Vielzahl an Techniken detektiert werden. Zum Beispiel kann die Modulation der Bildung von Komplexen unter Verwendung von zum Beispiel detektierbar markierten Proteinen, wie radioaktiv markierten, fluoreszenzmarkierten oder enzymatisch markierten neuen HCV-Polypeptiden, mittels Immunassay oder chromatographischer Detektion quantifiziert werden.
Üblicherweise wird es wünschenswert sein, entweder das neue HCV-Polypeptid oder die Verbindung oder beides zu immobilisieren, um die Trennung der Komplexe aus der Verbindung und dem neuen HCV von nicht komplexierten Formen zu ermöglichen, sowie die Automatisierung des Assays zu gewährleisten. In einer Ausführungsform kann ein Fusionsprotein zur Verfügung gestellt werden, dass eine Domäne anhängt, die das Binden des Polypeptids an eine Matrix ermöglicht. Beispielsweise können Glutathion-S-Transferase/Rezeptor (GST/Rezeptor)-Fusionsproteinformen der neuen Polypeptide auf Glutathion-Sepharose-Beads (Sigma Chemical, St. Louis, MO) oder mit Glutathion derivatisierten Mikrotiterplatten adsorbiert werden, die dann mit der an Beads gebundenen Testverbindung vereinigt und unter Bedingungen inkubiert werden, die der Komplexbildung zuträglich sind, z. B. bei physiologischen Bedingungen für Salz und pH-Wert, obwohl leicht stringentere Bedingungen wünschenswert sein können, z. B. bei 4°C in einem Puffer, der 0,6 M NaCl oder ein Detergenz, wie 0,1% Triton X-100, enthält. Im Anschluss an die Inkubation werden die nicht komplexierten Formen durch Waschen entfernt und Verbindungen, die an neue HCV-Polypeptide binden, identifiziert.
Weitere Techniken zur Immobilisierung von Proteinen auf Matrixes für die Verwendung in dem betreffenden Assay stehen ebenfalls zur Verfügung. Zum Beispiel können die neuen HCV-Polypeptide mittels Konjugation von Biotin und Streptavidin immobilisiert werden. Beispielsweise können biotinylierte neue HCV-Polypeptide aus Biotin-NHS (N-Hydroxy-succinimid) unter Verwendung von aus dem Stand der Technik gut bekannten Techniken (z. B. Biotinylierungs-Kit, Pierce Chemicals, Rockford, IL) hergestellt und in den Vertiefungen von mit Streptavidin beschichteten 96-Well-Platten (Pierce Chemical) immobilisiert werden. Alternativ können Antikörper, die mit den neuen HCV-Polypeptiden reaktiv sind, an Vertiefungen der Platte derivatisiert und die neuen HCV-Polypeptide in den Vertiefungen durch Antikörper-Konjugation eingefangen werden. Wie vorstehend beschrieben werden Ansätze aus einem neuen HCV-Polypeptid und einer Test verbindung in den Vertiefungen der Platte inkubiert und die Menge an dem in der Vertiefung eingefangenen Komplex aus den neuen HCV-Polypeptiden und der Verbindung kann quantifiziert werden.
Weitere beispielhafte Verfahren zur Detektion solcher Komplexe, neben denjenigen, die vorstehend für die mit GST immobilisierten Komplexe beschrieben sind, umfassen die Immundetektion von Komplexen mittels Antikörpern, die mit dem neuen HCV-Polypeptid reaktiv sind oder die mit dem Rezeptorprotein reaktiv sind und mit dem neuen HCV-Polypeptid um die Bindung konkurrieren; sowie enzymverbundene Assays, die auf der Detektion einer enzymatischen Aktivität, die mit dem neuen HCV-Polypeptid assoziiert ist, beruhen. Im letztgenannten Fall kann das Enzym chemisch konjugiert oder als Fusionsprotein mit dem neuen HCV-Polypeptid bereitgestellt sein. Zur Veranschaulichung kann das neue HCV-Polypeptid mit alkalischer Phosphatase chemisch vernetzt oder genetisch fusioniert sein, und die Menge des in dem Komplex eingefangenen neuen HCV-Polypeptids kann mit einem chromogenen Substrat des Enzyms, z. B. Paranitrophenylphosphat, bestimmt werden. Ebenso kann ein Fusionsprotein, das das neue HCV-Polypeptid und Gutathion-S-Transferase umfasst, bereitgestellt und die Komplexbildung durch Detektion der GST-Aktivität mittels 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol quantifiziert werden (Habig et al. (1974)J. Biol. Chem. 249: 7130).
Für Verfahren, die auf der Immundetektion zur Quantifizierung eines der in den Komplexen eingefangenen Proteine beruhen, können Antikörper gegen das Protein, wie z. B. die hierin beschriebenen anti-neues HCV-Antikörper verwendet werden. Alternativ kann das in dem Komplex zu detektierende Protein "epitopmarkiert" in der Form eines Fusionsproteins sein, das zusätzlich zu dem neuen HCV-Polypeptid ein zweites Polypeptid umfasst, für das Antikörper leicht erhältlich sind (z. B. aus kommerziellen Quellen). Beispielsweise können die vorstehend beschriebenen GST-Fusionsproteine auch für die Quantifizierung der Bindung mittels Antikörpern gegen die GST-Einheit verwendet werden. Weitere nützliche Epitopmarkierungen umfassen myc-Epitope (siehe z. B. Ellison et al. (1991)J. Biol. Chem. 266: 21150-21157), die eine Sequenz aus 10 Resten von c-myc enthalten, sowie das pFLAG-System (International Biotechnologies, Inc.) oder das pEZZ-Protein A-System (Pharmacia, NJ).
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung wird, wenn nichts anderes angegeben ist, herkömmliche Techniken der Zellbiologie, Zellkultur, Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA und Immunologie verwenden, die im Bereich des fachmännischen Könnens liegen. Derartige Techniken werden in der Literatur vollständig erläutert. Siehe zum Beispiel Genetics; Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, herausgegeben von Sambrook, J. et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)); Short Protocols in Molecular Biology, 3. Ausgabe, herausgegeben von Ausubel, F. et al. (Wiley, NY (1995)); DNA Cloning, Bände I und II (herausgegeben von D. N. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (herausgegeben von M. J. Gait (1984)); Mullis et al. US-Patent Nr. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (herausgegeben von B. D. Hames & S. J. Higgins (1984)); die Abhandlung Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (herausgegeben von Mayer und Walker, Academic Press, London (1987)); Handbook Of Experimental Immunology, Bände I-IV (herausgegeben von D. M. Weir und C. C. Blackwell (1986)); und Miller, J. Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972)).
Die Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die nicht als weiter einschränkend ausgelegt werden sollen.
Beispiele
Beispiel 1. Die Detektion von Antikörpern gegen neue HCV-Polypeptide.
Konsensuspolypeptide wurden auf Basis der Sequenzhomologie zwischen neuen HCV-Polypeptiden, die in Tabelle 1 gezeigt sind, synthetisiert. Die folgenden Peptide wurden mittels herkömmlicher Techniken durch Biosynthesis Corp. (Lewisville, TX) hergestellt: LNLKEKPNVTPTAC und AAHRTSSSRAVVRC (Polypeptide 1 bzw. 2 mit alternativem Leserahmen (ARF)). Die folgenden Polypeptide, die vom HCV-CORE-Protein abgeleitet sind, wurden als Kontrollen verwendet: PTDPRRRSRNLGKVIDTC und GCATRKTSERSQPRGRRAPI. Die Peptide wurden mit aktiviertem Rinderserumalbumin konjugiert, um bis zu 4 Peptidmoleküle für jedes BSA-Molekül zu ergeben. Peptid-BSA-Konjugate wurden in einer Konzentration von etwa 0,5 mg/ml auf Eis in 3 ml phosphatgepufferter Salzlösung, 0,1 M, pH 7,4, versandt. Sie wurden aliquotiert und bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.
ELISAs wurden wie beschrieben von Kirkegaard und Perry Laboratories, Inc. (Gaithersburg, MD) durchgeführt. Zur Verwendung im ELISA wurden die Polypeptide in 1 X "Coating-Puffer" gelöst, um eine Peptid-BSA-Konzentration von 1 μg/ml zu ergeben; 100 μl wurden in 96 Well-Mikrotiterplatten (Falcon 3072, Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) gegeben und bei Raumtemperatur für 1 Stunde oder über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Coating-Lösung wurde entfernt und die Platten wurden anschließend durch Zugabe von 300 μl 1% BSA in phosphatgepufferter Salzlösung (wie von Kirkegaard und Perry hergestellt) blockiert und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Blockierlösung wurde entfernt und 100 μl 1% BSA (1 X) wurden hinzugefügt.
Seren wurden von Patienten erhalten, von denen bekannt war, dass sie eine HCV-Infektion haben oder früher hatten. Serumproben wurden 1:100 in 1 X BSA verdünnt und 100 μl wurden in die jeweils erste Vertiefung gegeben (ergibt insgesamt 200 μl). Serumproben wurden dann seriell verdünnt (zweifach in jedem Schritt). Die Kontrollvertiefungen enthielten nur BSA. Die Platten wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur bei leichtem Schütteln inkubiert, um das Binden zu ermöglichen. Die Platten wurden 5-mal mit 1 X Waschlösung (PBS und 0,02% Tween) gewaschen. Nach dem Waschen wurden sofort 100 μl des sekundären Antikörpers hinzugefügt und für 1 Stunde bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Der zweite Antikörper war entweder das Fab-Fragment von anti-human-IgG konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP) in einer Verdünnung von 1:1000 oder antihuman-IgG (in PBS mit 1% BSA). Die Platten wurden 5-mal mit 1 X Waschlösung gewaschen und anschließend wurden 100 μl Wasserstoffperoxid und TMP zugegeben und für 10 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Um die Reaktion abzustoppen wurden 100 μl 1 M Phosphorsäure zugegeben. Die Messungen der optischen Dichte wurden unter Verwendung eines Scanners für duale Wellenlängen erhalten: 450 nm-Werte-650 nm-Werte.
Ergebnisse von ELISA-Tests für Antikörper von HCV-spezifischen Polypeptiden
Beispiel 2: Entwicklung eines Western-Blot-Assays zur Detektion der Antikörperproduktion gegenüber Proteinen mit alternativem HCV-Leserahmen.
Fünf Mikrogramm von Konjugaten aus BSA und Peptiden mit einem alternativen Leserahmen und geeignete Kontrollen (gelöschtes BSA, BSA-BSA-Peptidkonjugate) wurden durch Inkubation in gewöhnlichem Lamelli-Beladungspuffer (mit beta-Mercaptoethanol und SDS) bei 100°C für drei Minuten inkubiert. Die Proben wurden dann gekühlt und vor der Beladung auf ein diskontinuierliches, 1,5 mm dickes SDS-PAGE-Gel (4% Sammelgel [pH 6,8] und 12,5% Trenngel [pH 8,4]) zentrifugiert. Der Laufpuffer war TRIS-Glycin/SDS (0,1%) mit einem nicht eingestellten pH von etwa 8,4.
Die Proben wurden durch das Sammelgel (1 cm) für etwa 45 Minuten bei 90 Volt laufen gelassen. Nachdem das Bromphenolblau (BB) in das Trenngel eintrat, wurde die Spannung auf 160 Volt erhöht. Die Gele wurden für etwa 1,5 Stunden oder bis das BB 2/3 des Wegs durch das Gel erreichte, laufen gelassen. Nachdem der Lauf gestoppt wurde, wurden die Gele entweder mit Coomassie Blau gefärbt oder für 15 Minuten mit dem Transferpuffer (1 X CAPS, pH 11,0, 10% MeOH) äquilibriert. PVDF-Membranen (Immobilon-P [Porengröße 0,45 Micrometer]) wurden in 100% MeOH für 1 Minute, anschließend in 50:50 Me-OH:zweifach destilliertem Wasser für 5 Minuten befeuchtet, und schließlich mit dem Transferpuffer äquilibriert. Der Transfer wurde in Transferpuffer aufgebaut (Filterpapier, Gel, PVDF-Membran, und Filterpapier) und in den BIO-RAD-Transferbehälter überführt. Der Transfer wurde bei 20 Volt, über Nacht (etwa 10 Stunden) unter Rühren laufen gelassen.
Nach dem Transfer wurde der Behälter auseinander genommen, die Membran wurde für eine Minute in 100% MeOH getränkt und im Anschluss an der Luft trocknen gelassen. Um die Transfereffizienz sichtbar zu machen, wurden die Membranen (nach dem nochmaligen Befeuchten in MeOH, anschließend Wasser) mit 1% des roten Farbstoffs Ponceau S inkubiert und mit doppelt destilliertem Wasser gespült. Nach der Aufnahme des Bildes wurde der Farbstoff in einer verdünnten NaOH-Lösung (1 ml gesättigtes NaOH in 100 ml doppelt destilliertem Wasser) entfernt.
Die Membranen wurden dann in 3% NFDM (6 Gramm nicht fette, getrocknete Milch in 200 ml 1 X TBS [TRIS-gepufferte Salzlösung, pH 7,4]) für eine Stunde blockiert. Nach dem Blockieren wurden die Membranen in zwei Waschungen mit je 200 ml 1 X TBS gespült.
Die Membranen wurden im Anschluss mit der Primärantikörper-Lösung, 4 ml einer 1/200-Verdünnung von Patientenserum in 1% NFDM in 1 X TTBS (TBS mit 0,025% Tween-20), inkubiert. Die Inkubation dauerte eine Stunde bei 30°C in Glas bei leichter Rotation des Schlauchs oder Bechers. Nach dieser Inkubation wurden die Membranen dreimal in 200 ml 1 X TTBS gewaschen.
Die Sekundärantikörper-Lösung bestand aus 200 ml einer 1/3000-Verdünnung des Ziege anti-human-alkalische Phosphatase-Konjugats von BIO-RAD in 1% NFDM in 1 X TTBS. Diese Inkubation dauerte 1 Stunde bei 30°C bei vorsichtigem Schütteln.
Nach dieser Inkubation wurden die Membranen zweimal mit 200 ml 1 X TTBS (je 5 Minuten) und einmal mit 200 ml 1 X TBS gewaschen.
Die Banden wurden mit dem BIO-RAD AP-Substrat-Kit (insgesamt 200 ml) bei vorsichtigem, gelegentlichem Schütteln visualisiert. Nach der Visualisierung wurden die Membranen mehrere Male mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen, gefolgt von einer Waschung mit MeOH, danach luftgetrocknet und photographiert oder eingescannt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes, synthetisches oder rekombinantes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, wobei a) das isolierte, synthetische oder rekombinante Polypeptid immunreaktiv mit einem Antikörper ist, der spezifisch eine Aminosäuresequenz bindet, die von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das von HCV abgeleitet ist und in einem Leserahmen +1 zu dem gewöhnlichen Leserahmen von HCV translatiert wird, (b) die Aminosäuresequenz von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die wenigstens 80% identisch zu der ganzen Länge der Nukleotidsequenz ist, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, und wobei das Polypeptid in einem Leserahmen +1 zu dem gewöhnlichen Leserahmen von HCV translatiert wird, und (c) wobei das Polypeptid nicht von dem gewöhnlichen offenen Leserahmen von HCV abgeleitet ist.
Isoliertes, synthetisches oder rekombinantes Polypeptid wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Nukleotidsequenz wenigstens 90% identisch zu der ganzen Länge der Nukleotidsequenz ist, die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist.
Isoliertes, synthetisches oder rekombinantes Polypeptid wie in Anspruch 1 beansprucht, wobei die Aminosäuresequenz von einer in SEQ ID NO: 1 gezeigten Nukleotidsequenz kodiert wird, die in einem Leserahmen +1 zu dem gewöhnlichen Leserahmen von HCV translatiert wird.
Isoliertes, synthetisches oder rekombinantes Polypeptid wie in einem der vorangegangenen Ansprüche beansprucht, umfassend eine Aminosäuresequenz mit einer Länge von wenigstens 8 bis 100 Aminosäuren.
Isoliertes, synthetisches oder rekombinantes Polypeptid wie in einem der vorangegangenen Ansprüche beansprucht, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die unter Verwendung von FASTA-Alignment wenigstens 80-90% identisch zu der ganzen Länge der Aminosäuresequenz ist, die in SEQ ID NO: 2 dargestellt ist.
Isoliertes, synthetisches oder rekombinantes Polypeptid wie in einem der vorangegangenen Ansprüche beansprucht, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die unter Verwendung von FASTA-Alignment identisch zu der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Aminosäuresequenz ist.
Polypeptid von Anspruch 6, wobei die Aminosäuresequenz von einer Länge von wenigstens 14 bis wenigstens 30 Aminosäuren ist.
Isoliertes, synthetisches oder rekombinantes Polypeptid, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 besteht.
Isoliertes, synthetisches oder rekombinantes Polypeptid wie in Anspruch 8 beansprucht, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus LNLKEKP(X1)(X2)TPT(X3) und AAHRT(X4)SSR(X5)(X6)VR besteht, wobei X1 N oder K, X2 V oder E, X3 A oder V, X4 L oder S, X5 A oder V und X6 A oder V ist.
Isoliertes, synthetisches oder rekombinantes Polypeptid wie in Anspruch 9 beansprucht, wobei das Polypeptid wenigstens 8 Aminosäuren einer Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus AAHRTSSSRAVVRC besteht.
Polypeptid gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, das ein Fusionsprotein ist.
Impfstoffzusammensetzung zur Verhinderung einer HCV-Infektion in einem Subjekt, umfassend ein isoliertes, synthetisches oder rekombinantes Polypeptid, das ei ne Aminosäuresequenz umfasst, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die wenigstens 80% identisch zu der ganzen Länge der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 ist und in einem Leserahmen +1 zu dem gewöhnlichen Leserahmen von HCV translatiert wird, wobei: a) das Polypeptid nicht von dem gewöhnlichen HCV-Polyprotein abgeleitet ist; und b) das Polypeptid eine Immunantwort in dem Subjekt auslöst.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 12, wobei das Polypeptid ein Fusionsprotein ist.
Impfstoffzusammensetzung wie in Anspruch 12 oder 13 beansprucht, wobei die Nukleotidsequenz wenigstens 90% identisch ist zu der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1.
Impfstoffzusammensetzung wie in Anspruch 12 oder 13 beansprucht, wobei die Nukleotidsequenz identisch ist zu der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1.
Antikörper, der an ein Polypeptid bindet, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die zu wenigstens 80% mit der ganzen Länge der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 identisch ist und in einem Leserahmen +1 zu dem gewöhnlichen Leserahmen von HCV translatiert wird, wobei das Polypeptid nicht vom gewöhnlichen HCV-Polyprotein abgeleitet ist.
Antikörper wie in Anspruch 16 beansprucht, wobei die Nukleotidsequenz wenigstens 90% identisch ist zu der ganzen Lange der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1.
Antikörper wie in Anspruch 16 beansprucht, wobei die Nukleotidsequenz mit der ganzen Länge der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 identisch ist.
Antikörper gemäß einem der Ansprüche 16-18, wobei der Antikörper polyklonal ist.
Antikörper gemäß einem der Ansprüche 16-18, wobei der Antikörper monoklonal ist.
Kit zur Detektion einer HCV-Infektion, umfassend ein isoliertes, synthetisches oder rekombinantes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einer Nukleinsäure kodiert wird, die zu wenigstens 80% mit der ganzen Länge der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 identisch ist und in einem Leserahmen +1 zu dem Leserahmen von gewöhnlichem HCV translatiert wird, wobei: a) das Polypeptid nicht von dem gewöhnlichen HCV-Polyprotein abgeleitet ist und b) das Polypeptid immunreaktiv mit einem Antikörper ist, der spezifisch eine Aminosäuresequenz bindet, die von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, das von HCV abgeleitetet ist und in einem Lesrahmen +1 zu dem gewöhnlichen Leserahmen von HCV translatiert wird.
Kit zur Detektion einer HCV-Infektion, umfassend einen Antikörper, der spezifisch eine Aminosäuresequenz bindet, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die zu wenigstens 80% mit der ganzen Länge der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 identisch ist und in einem Leserahmen +1 zu dem gewöhnlichen Leserahmen von HCV translatiert wird.
Verwendung eines isolierten, synthetischen oder rekombinanten Polypeptids, umfassend eine Aminosäuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die zu wenigstens 80% identisch mit der ganzen Länge der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 ist und in einem Leserahmen +1 zu dem gewöhnlichen Leserahmen von HCV translatiert wird, wobei das Polypeptid nicht vom gewöhnlichen HCV-Polyprotein abgeleitet ist, für die Herstellung eines Medikamentes zur Verhinderung einer HCV-Infektion.
Isoliertes, synthetisches oder rekombinantes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die zu wenigstens 80% mit der ganzen Länge der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 identisch ist und in einem Leserahmen +1 zu dem gewöhnlichen Leserahmen von HCV translatiert wird, wobei das Polypeptid nicht vom gewöhnlichen HCV-Polyprotein abgeleitet ist, zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose von HCV-Infektion, wobei man bei dem Verfahren die Gegenwart oder Abwesenheit von an das Polypeptid bindenden Antikörpern in der Körperflüssigkeit eines Subjektes detektiert, und wobei die Gegenwart der Antikörper indikativ für eine Infektion mit HCV ist.
Isoliertes, synthetisches oder rekombinantes Polypeptid von Anspruch 24, wobei die Gegenwart oder Abwesenheit des Antikörpers dadurch detektiert wird, dass man eine Testprobe, die eine Körperflüssigkeit eines Subjektes enthält, mit einem isolierten, synthetischen oder rekombinanten Polypeptid in Kontakt bringt, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die zu wenigstens 80% mit der ganzen Länge der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 identisch ist und in einem Leserahmen +1 zu dem gewöhnlichen Leserahmen von HCV translatiert wird, wobei das Polypeptid nicht von dem gewöhnlichen HCV-Polyprotein abgeleitet ist, unter Bedingungen, die die Bindung des Polypeptids an den Antikörper gestatten, und wobei die Bindung des Polypeptids an einen Antikörper in der Probe die Gegenwart eines HCV-Polypeptids mit einem alternierenden Leserahmen anzeigt.
Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, die von einem Nukleinsäuremolekül kodiert wird, bestehend aus einer Nukleotidsequenz, die zu wenigstens 80% mit der ganzen Länge der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 identisch ist und in einem Leserahmen +1 zu dem gewöhnlichen Leserahmen von HCV translatiert wird, wobei das Polypeptid nicht vom gewöhnlichen HCV-Polyprotein abgeleitet ist, zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose von HCV-Infektion, wobei man bei dem Verfahren die Gegenwart oder Abwesenheit des Polypeptids in den Zellen oder der Körperflüssigkeit eines Subjektes detektiert, wobei die Gegenwart des Polypeptids indikativ für eine Infektion mit HCV ist.
Polypeptid von Anspruch 26, wobei die Gegenwart oder Abwesenheit des Polypeptids dadurch detektiert wird, dass man eine Testprobe, die eine Körperflüssigkeit oder Zellen von einem Subjekt umfasst, mit einem Antikörper in Kontakt bringt, der spezifisch an ein Polypeptid bindet, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die zu wenigstens 80% identisch mit der ganzen Lange der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 ist und in einem Lese rahmen +1 zu dem gewöhnlichen Leserahmen von HCV translatiert wird, wobei das Polypeptid nicht vom gewöhnlichen HCV-Polyprotein abgeleitet ist, unter Bedingungen, die die Bindung des Polypeptids an den Antikörper gestatten, und wobei die Bindung des Antikörpers an das Polypeptid in der Probe die Gegenwart eines HCV-Polypeptids mit einem alternierenden Leserahmen anzeigt.
Verwendung wie in Anspruch 23 beansprucht, wobei die Nukleotidsequenz zu wenigstens 90% identisch mit der ganzen Länge der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 ist.
Verwendung wie in Anspruch 23 beansprucht, wobei die Nukleotidsequenz identisch mit der ganzen Länge der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 ist.
Verwendung wie in Anspruch 23 beansprucht, wobei das Polypeptid von einer Lange von wenigstens 8 Aminosäuren bis wenigstens 100 Aminosäuren ist.
Verwendung wie in Anspruch 23 beansprucht, wobei das Polypeptid von einer Länge von wenigstens 14 Aminosäuren bis wenigstens 30 Aminosäuren ist.
Verwendung wie in Anspruch 23 beansprucht, wobei die Aminosäuresequenz unter Verwendung von FASTA-Alignment zu wenigstens 90% identisch mit der ganzen Lange der Aminosäuresequenz ist, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
Verwendung wie in Anspruch 23 beansprucht, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist, umfasst.
Verwendung wie in Anspruch 23 beansprucht, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 besteht.
Polypeptide, die in einem der Ansprüche 24-26 beansprucht werden, wobei das Polypeptid wenigstens 8 Aminosäuren einer Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus LNLKEKP(X1)(X2)TPT(X3) und AAHRT(X4)SSR(X5)(X6)VR besteht, wobei X1 N oder K, X2 V oder E, X3 A oder V, X4 L oder S, X5 A oder V und X6 A oder V ist.
Polypeptide, die in einem der Ansprüche 24-26 beansprucht werden, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus LNLKEKPNVTPTAC und AAHRTSSSRAVVRC besteht.
Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die mit einem Polypeptid interagiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die von einer Nukleotidsequenz kodiert wird, die zu wenigstens 80% identisch zu der ganzen Länge der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 ist und in einem Leserahmen +1 zu dem gewöhnlichen Leserahmen von HCV translatiert wird, wobei das Polypeptid nicht von dem gewöhnlichen HCV-Polyprotein abgeleitet ist, bei dem man das Polypeptid mit einer Verbindung in einem zellfreien System unter Bedingungen in Kontakt bringt, die eine Interaktion der Verbindung mit dem Polypeptid gestatten, so dass ein Komplex gebildet wird; die Verbindungen, die keine Komplexe mit dem Polypeptid bilden, von denjenigen trennt, die Komplexe mit dem Polypeptid bilden; und die Verbindungen, die Komplexe mit dem Polypeptid bilden, isoliert und identifiziert, um dadurch eine Verbindung zu identifizieren, die mit dem Polypeptid interagiert.
Verfahren von Anspruch 37, wobei die Nukleotidsequenz zu wenigstens 90% identisch mit der ganzen Länge der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 ist.
Verfahren von Anspruch 37, wobei die Nukleotidsequenz identisch mit der ganzen Länge der Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 ist.