DE69531235T2

DE69531235T2 - Säugetier - Expressionssysteme für Hüllenprotingene des Hepatitit - C - Virus

Info

Publication number: DE69531235T2
Application number: DE69531235T
Authority: DE
Inventors: Shinichi Watanabe; Julie Yamaguchi; M. Suresh DESAI; G. Sushil DEVARE
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1994-01-28
Filing date: 1995-01-27
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2015-01-28
Also published as: WO1995020664A2; EP0741787B1; CA2182170A1; EP0741787A1; US5610009A; AU1692595A; ES2207645T3; DE69531235D1; ATE244762T1; JPH09509052A; WO1995020664A3

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf Säugetier-Expressionssysteme, und bezieht sich genauer auf Säugetier-Expressionssysteme, die in der Lage sind, Hepatitis-C-Virus (HCV) Hüllproteine zu erzeugen, und auf die Verwendung von diesen Proteinen. Diese HCV-Hüllproteine, bezeichnet als E1 und E2, werden fusioniert durch Entfernen einer Abspaltungsstelle, die anders ist, als die üblicherweise beobachtete Stelle. Diese Proteine werden in Kulturmedium ebenso wie in Säugetier-Zellen exprimiert.
Hepatitis ist eine der wichtigsten Erkrankungen, die durch Bluttransfusion oder Blutprodukte, durch die Transplantation von Organen und durch Hämodialyse von einem Donor auf einen Empfänger übertragen wird. Von viraler Hepatitis ist nun bekannt, dass sie eine Gruppe von viralen Wirkstoffen einschließt mit unterschiedlichen viralen Genen und Replikationsarten, die Hepatitis bewirken mit unterschiedlichen Schweregraden von Leberschädigung durch verschiedene Übertragungswege. Die akute virale Hepatitis wird klinisch diagnostiziert durch wohl definierte Patientensymptome einschließlich Gelbssucht, Druckschmerzhaftigkeit der Leber und einem erhöhten Spiegel an Lebertransaminasen, wie zum Beispiel Aspartat-Transaminase (AST) und Alanin-Transaminase (ALT).
Non-A Non-B-Hepatitis (NANBH) ist eine Begriff, der zuerst 1975 verwendet wurde, der die Fälle von Post-Transfusions-Hepatitis beschrieb, die weder durch Hepatitis-A-Virus noch durch Hepatitis-B-Virus verursacht waren. Feinstone et al., New Engl. J. Med. 292: 454–457 (1975). Die Diagnose von NANBH wurde in erster Linie durch den Ausschluss gestellt, auf der Basis von serologischer Analyse für die Anwesenheit von Hepatitis A und Hepatitis B. Zur Zeit ist NANBH verantwortlich für über 90% der Fälle von Post-Transfusions-Hepatitis. Hollinger et al., in N. R. Rose et al., eds., Manual of Clinical Immunology, American Society for Microbiology, Washington, D. C., 558–572 (1986).
Die Identifikation eines vermeintlichen non-A non-B-Wirkstoffes (NANB), Hepatitis-C-Virus (HCV), wurde gemacht. Kuo et al., Science 244: 359–361 (1989); Choo et al., Science 244: 362–364 (1989). Die Klonierung und Sequenzierung von HCV, jetzt erkannt als den primären Wirkstoff von parenteral übertragener NANBH, hat das Interesse und Studien in der Epidemiologie, Pathogenese und natürlichen Geschichte dieser Krankheit gefördert. Kuo et al., Science 244: 362–364 (1989).
Sequenzen von HCV wurden identifiziert, welche Antigene kodieren, die immunologisch mit Antikörpern reagieren, welche bei einer Vielzahl von Patienten anwesend sind, die klinisch mit NANBH diagnostiziert wurden. Basierend auf der Information, die verfügbar ist und auf der molekularen Struktur von HCV besteht der allgemeine Aufbau des Virus aus einer einzelsträngigen linearen RNA (positiver Strang) von ungefähr 9,5 kb und aus einem kontinuierlichen translationalen Open-Reading-Frame (ORF), der einen Polyprotein-Precurser von ungefähr 3000 Aminosäuren kodiert. Diese Precurser-Protein durchläuft eine kotranslationale und post-translationale Verarbeitung, einschließlich Abspaltung und Glykosylierung, zu den endgültigen strukturellen und nicht-strukturellen Proteinen. Houghton e al., Hepatology 14: 381–388 (1991). Strukturelle Proteine werden identifiziert als Kern-Protein und hoch-glykosylierte Hüllproteine E1 mit einem Molekulargewicht von 33.000 und E2 mir einem Molekulargewicht von 72.000. Hijitaka et al., Gene 88: 5547–5551 (1990. Die Replikation von HCV geschieht früh nach der HCV-Infektion in Schimpansen und ein langer Viremi-Zeitraum kann auftreten vor dem Erscheinen von Antikörpern gegen HCV-Proteine. Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3392-6444 (1990); Farci et al., New Eng. J. Med. 325: 98–104 (1991).
Von einer HCV-Infektion wurde auch in der Entwicklung von chronischer Hepatitis, Cirrhose HCC berichtet. Genesca et al., Semin Liver Dis 11: 147–164 (1991). Das Fehlen von einer effektiven neutralisierenden humoralen Immunantwort gegen HCV kann mit der Virus-Persistenz und der Krankheits-Progression zusammenhängen. Farci et al., Science 258: 135–140 (1992).
Die Verfügbarkeit von Labortests für die serologische Diagnose von einer viralen Hepatitis-C-Infektion hat zur Klärung der Rolle von HCV in der Ätiologie von Hepatitis in Patienten beigetragen, die Blut oder Blutprodukte erhalten haben oder die sich einer Transplantation und Hämodialyse unterzogen haben. Der Nachweis von HCV-Antikörpern in Donor-Proben eliminiert 70–80% von NANBH infiziertem Blut aus dem Blutversorgungssystem. Es sind jedoch, während die Antikörper scheinbar leicht detektierbar sind, während des chronischen Stadiums der Krankheit, nur 60% der Proben aus dem akuten NANBH-Stadium HCV-Antikörper positiv. H. Alter et al., New Eng. J. Med. 321: 1994-1500 (1989).
Obwohl Assay-Reagenzien und Verfahren verfügbar sind, um die Anwesenheit von entweder HCV-Antikörpern und/oder HCV-RNA zu detektieren, werden einige Individuen, die seropositiv für HCV-Antikörper sind, ebenso wie einige Individuen, die mit dem HCV-Virus infiziert sind, nicht mit HCV durch diese verfügbaren Assay-Reagenzien und Verfahren diagnostiziert. Beispielsweise ist bekannt, dass die Prävalenz von einer HCV-Infektion hoch ist, bei Nierentransplantat-Empfängern; es wird angenommen, dass eine aktive HCV-Replikation in der Abwesenheit von HCV-Antikörpern vorkommen kann, die mit den gängigen Kits detektierbar sind. Lau et al., Hepatology 18: 1027–1031 (1993). Weiterhin wurden, wenn potenzielle Blutspender mit einem hohen Risiko für eine HCV-Infektion ursprünglich mit empfindlichen serologischen Screening-Assays getestet wurden, 13 von 19 getesteten durch diese Verfahren detektiert (68%) verglichen mit allen 19 Blutspendern, die positiv getestet wurden auf HCV-RNA, durch polymerase Kettenreaktion (PCR). Sugitani et al. The Lancer 339: 1018–1019 (1992).
Es besteht daher ein Bedürfnis nach der Entwicklung von zusätzlichen Assay-Reagenzien und Assaysystemen, um eine akute Infektion und Virämie zu identifizieren, die anwesend sein kann und die zur Zeit nicht durch kommerziell erhältliche Screening-Assays nachgewiesen werden kann. Diese Reagenzien und Assay-Systeme werden gebraucht, um zwischen denjenigen Individuen mit akuter und persistenter, beginnender und/oder chronischer Infektion und denjenigen Individuen, deren HCV-Infektionen. voraussichtlich aufgelöst werden, zu unterscheiden, und um den prognostischen Weg der NANB-Hepatitis-Infektion zu definieren, um präventive und/oder therapeutische Strategien zu entwickeln. Ausserdem wären die Expressionssysteme, die die Sekretion dieser glykosylierten Antigene erlauben, hilfreich, um diagnostische und therapeutische Reagenzien zu reinigen und herzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung liefert neue Säugetier-Expressionssysteme, die in der Lage sind, hohe Spiegel von exprimierten HCV-Proteinen zu erzeugen. Insbesondere stellt die Erfindung die Konstruktion von Fusionsproteinen bereit, die ein Amyloid-Precurser-Protein (APP) und HCV E1 und E2 umfassen, welche nützlich sind, um hohe Expressionsspiegel in Säugetierellen zu erzeugen. Diese Konstrukte können Deletionen in HCV E1 und E2 Genen enthalten, welche die Produktion von sezernierbaren Fusionsproteinen von APP-HCV E1-E2 erlauben. Diese einzigartiger. Expressionssysteme erlauben die Produktion von hohen Spiegeln an. HCV-Proteinen, erlauben eine geeignete Verarbeitung, Glykosylierung und Zusammenlegung der viralen Protein(e) in dem System. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung die Plasmide pHCV-176, pHCV-172, pHCV-351 und pHCV-425 bereit. Eine kleine Deletion, eingeführt in das HCV E1 Gen und fusioniert mir abgestumpftem HCV E2, produziert ein unspaltbares Fusionsprotein in dem offenbarten Säugetier-Expressionssystem. Das APP-HCV E1-E2 Fusionsprotein exprimiert aus pHCV-425 in dem Säugetier-Expressionssystem der Erfindung, kann sowohl in extra-zellulärer Weise wie auch in intra-zellulärer Weise gewonnen werden.
Die vorliegende Erfindung liefert ebenfalls ein Verfahren zur Detektion eines HCV-Antigens oder Antikörpers in einer Testprobe., von der vermutet wird, dass sie HCV-Antigene oder Antikörper enthält, worin die Verbesserung das in Kontakt bringen der Testprobe mit einem glykosylierten HCV-Antigen umfasst, dass in einem Säugetier-Expressionssystem produziert wurde. Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Detektion von HCV-Antigenen oder Antikörpern in einer Testprobe, von der vermutet wird, dass sie HCV-Antigene oder Antikörper enthält, worin die Verbesserung das in Kontakt bringen der Testprobe mit einem Antikörper umfasst, der durch die Verwendung eines glykosylierten HCV-Antigens produziert wurde, hergestellt in einem Säugetier-Expressionssystem. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin einen Testkit zum Nachweis der Anwesenheit von HCV-Antigen oder HCV-Antikörper in einer Testprobe, von der vermutet wird, dass sie das HCV-Antigen oder Antikörper enthält, wobei der Testkit einen Behälter umfasst, der ein glykosyliertes HCV-Antigen enthält, das in einem Säugetier-Expressionssystem produziert wurde. Der Testkit kann ebenfalls einen Behälter einschließen, der einen Antikörper enthält, der durch die Verwendung eines glykosylierten HCV-Antigens produziert wurde, hergestellt in einem Säugetier-Expressionssystem. Der Antikörper, der durch die Testkits bereitgestellt wird, kann monoklonal oder polyklonal sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine schematische Darstellung des Säugetier-Expressions-Vektors pRc/CMV.
2 zeigt eine schematische Darstellung des Ortes der Aminosäuren von den APP-HCV E2 und APP-HCV E1 Fusionsproteinen, die durch die Säugetier-Expressions-Vektoren pHCV351, PHCV172, pHCV415 und pHCV416 exprimiert werden.
3 zeigt Radioimmunopräzipitations-Assay(RIPA)Ergebnisse, die für APP-HCV E1 Fusionsproteine erhalten wurden, exprimiert durch pHCV172, pHCV415 und pHCV416 in HEK-293-Zellen unter Verwendung von HCV positiven menschlichen Seren.
4 zeigt eine schematische Darstellung des Ortes von Aminosäuren von den APP-HCV E1-E2 Fusionsproteinen, die durch die Säugetier-Expressions-Vektoren pHCV418, pHCV419, pHCV420, pHCV421 und pHCV422 exprimiert werden.
5 zeigt RIPA-Ergebnisse, erhalten für APP-HCV E1-E2 Fusionsproteine, die durch pHCV418, pHCV419, pHCV420, pHCV421 und pHCV422 in HEK-293-Zellen exprimiert wurden, unter Verwendung von menschlichen HCV Patienten Seren.
6 zeigt eine schematische Darstellung des Ortes von Aminosäuren von den APP-HCV E1-E2 Fusionsproteinen, die durch die Säugetier-Expressions-Vektoren pHCV423, pHCV424, pHCV425 und pHCV429 exprimiert wurden.
7 zeigt RIPA-Ergebnisse, erhalten für APP-HCV E1-E2 Fusionsproteine, die durch pHCV423, pHCV424, pHCV425 und pHCV429 in HEK-293-Zellen exprimiert wurden, unter Verwendung von menschlichen HCV Patienten Seren.
8 zeigt die HCV-Sequenz, die essentiell ist für die Abspaltung von HCV E1-E2 und für das E1 Epitop.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Wege bereit, um glykosylierte HCV E1 und E2 oder E1-E2 Fusionsproteine, die in Säugetier-Expressionssystemen exprimiert werden, zu produzieren. Diese glykosylierten Proteine haben eine diagnostische Nützlichkeit in einer Vielzahl von Aspekten, einschließlich beispielsweise Assaysystemen für Screening und prognostische Anwendungen. Diese HCV viralen Hüllproteine, die in Säugetierzellen exprimiert werden, erlauben ebenfalls Inhibitor-Studien, einschließlich der Aufklärung von spezifischen viralen Anheftungsstellen oder Sequenzen und/oder viralen Rezeptoren auf empfindlichen Zelltypen, zum Beispiel Leberzellen und dergleichen.
Die Beschaffung von spezifischen Expressions-Klonen, entwickelt wie hierin beschrieben, in Säugetier-Expressionssystemen, liefert Antigene für diagnostische Assays, welche bei der Bestimmung des Stadiums der HCV-Infektion hilfreich sein können, wie zum Beispiel akuten gegenüber andauernden oder persistierenden Infektionen und/oder einer neuen Infektion gegenüber einer vergangenen Exposition. Diese spezifischen Expressions-Klone stellen ebenfalls prognostische Marker bereit für die Lösung der Krankheit wie zum Beispiel um die Lösung der Krankheit von chronischer Hepatitis zu unterscheiden, die durch HCV ausgelöst wird. Es wird in Erwägung gezogen, dass eine frühere Serokonversion zu glykosylierten strukturellen Antigenen detektierbar sein kann, durch die Verwendung von Proteinen, die in diesen Säugetier-Expressionssystemen produziert werden. Antikörper, sowohl monoklonale als auch polyklonale können ebenfalls aus den Proteinen produziert werden, die aus diesen Säugetier-Expressionssystemen abgeleitet sind, welche dann umgekehrt für die diagnostische, prognostische und therapeutische Anwendungen verwendet werden können.
Proteine, die von diesen Säugetier-Expressionssystemen produziert werden, ebenso wie Reagenzien, die von diesen Proteinen produziert werden, können in der Form eines Kits bereitgestellt werden mit einem oder mehreren Behältern, wie zum Beispiel Glasfläschchen oder Flaschen, wobei jeder Behälter ein separates Reagenz enthält, wie zum Beispiel einen monoklonalen Antikörper oder einen Cocktail von monoklonalen Antikörpern oder rekombinantes Polypeptid, verpackt als Testkits zur Bequemlichkeit bei der Durchführung von Assays. Andere Aspekte der vorliegenden Erfindung schließen ein Polypeptid ein, dass ein HCV Epitop umfasst, dass an eine feste Phase angeheftet ist und einen Antikörper für ein HCV Epitop, dass an eine feste Phase angeheftet ist. Ebenfalls eingeschlossen sind Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, das ein HCV Epitop enthält, durch Inkubieren von Wirtszellen, die mit einem Säugetier-Expressions-Vektor transformiert wurden, der eine Sequenz enthält, die ein Polypeptid kodiert, dass ein HCV Epitop enthält, unter Bedingungen, welche die Expressions des Polypeptids erlauben und ein Polypeptid, das ein HCV Epitop enthält, hergestellt durch dieses Verfahren.
Die vorliegende Erfindung stellt Assays bereit, welche die rekombinanten Proteine, die durch die Erfindung bereitgestellt werden, verwenden, ebenso wie die Antikörper, die hierin in verschiedenen Formaten beschrieben sind, wobei jeder eine signalerzeugende Verbindung verwenden kann, welche ein messbares Signal in dem Assay erzeugt. Assays, welche keine signalerzeugende Verbindung verwenden, um ein Mittel zur Detektion bereitzustellen, werden ebenfalls bereitgestellt. Alle der beschrieben Assays detektieren im Allgemeinen entweder ein Antigen oder einen Antikörper oder beides und schließen das Mischen einer Testprobe mit mindestens einem Reagenz ein, das hierin bereitgestellt wird, um mindestens einen Antigen/Antikörper-Komplex zu bilden und das Detektieren der Anwesenheit des Komplexes. Diese Assays sind hierin im Detail beschrieben.
Impfstoffe zur Behandlung einer HCV-Infektion, die ein immunogenes Peptid umfassen, das aus einem Säugetier-Expressionssystem erhalten wird, das Hüllgene von HCV enthält wie hierin beschrieben, sind in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Ebenfalls eingeschlossen in der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Antiköropern für HCV, dass das Verabreichen eines isolierten imunogenen Polypeptids an ein Individuum umfasst, wobei das Polypeptid ein HCV Epitop enthält in einer Menge, die ausreichend ist, um eine Immunantwort in dem inokulierten Individuum zu erzeugen.
Der Ausdruck „Antikörper enthaltende Körperkomponente" (oder Testprobe) bezieht sich auf eine Komponente von einem Körper eines Individuums, welche die Quelle ist für die Antikörper von Interesse. Diese Komponenten sind im Fachgebie wohl bekannt. Diese Testproben schließen biologische Proben ein, welche durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung, hierin beschrieben, getestet werden können und schließen menschliche und tierische Körperflüssigkeiten ein, wie zum Beispiel Vollblut, Serum, Plasma, Cerebrospinalflüssigkeit, Urin, Lymphflüssigkeiten und verschiedene externe Abschnitte des Respirations-, Intestinal- und Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, weiße Blutkörperchen, Myelome und dergleichen, biologische Flüssigkeiten wie zum Beispiel Zellkulturüberstände, fixierte Gewebeproben und fixierte Zellproben.
Nach Herstellen der rekombinanten Proteine wie beschrieben durch die vorliegende Erfindung, können diese rekombinanten Proteine verwendet werden, um einzigartige Assays wie hierin beschrieben zu entwickeln, um entweder die Anwesenheit von Antigen oder Antikörper für HCV nachzuweisen. Diese Zusammensetzungen können ebenfalls verwendet werden, um monoklonale und/oder polyklonale Antikörper zu entwickeln, mit einem spezifischen rekombinanten Protein, welches spezifisch an das immunologische Epitop von HCV bindet. Ebenfalls wird in Erwägung gezogen, dass mindestens ein rekombinantes Protein der Erfindung verwendet werden kann, um Impfstoffe zu entwickeln, durch folgen der Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind.
Typischerweise werden solche Impfstoffe hergestellt als Injektabilia, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; feste Formen, die geeignet sind zur Auflösung oder Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion können ebenfalls hergestellt werden. Die Zubereitung kann emulgiert sein oder das Protein kann in Liposomen eingekapselt sein. Die aktiven immunogenen Inhaltsstoffe werden oft mit pharmakologisch verträglichen Bindemitteln gemischt, welche kompatibel sind mit dem aktiven Inhaltsstoff. Geeignete Bindemittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol und desgleichen; Kombinationen dieser Bindemittel in verschiedenen Mengen können ebenfalls verwendet werden. Der Impfstoff kann auch kleine Mengen von Hilfssubstanzen enthalten, wie zum Beispiel befeuchtende Reagenzien oder emulgierende Reagenzien, pH-Puffer-Substanzen und/oder Hilfsstoffe, welche die Wirksamkeit des Impfstoffes erhöhen. Solche Hilfsstoffe können zum Beispiel Aluminiumhydroxid, N-Acetyl-muramyl-Lthreonyl-D-isoglutamin (thr-DMP), N-Acetyl-nornuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (CGP 11687, ebenfalls bezeichnet als nor-MDP), N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'2'dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (CGP 19835A, ebenfalls bezeichnet als MTP-PE) und RIBI (MPL + TDM + CWS) in einer 2% Squalen/Tween-80^R Emulsion einschließen. Die Wirksamkeit eines Hilfsstoffes kann bestimmt werden durch Messen der Menge an Antikörpern, die gegen ein immunogenes Polypeptid gerichtet sind, das eine HCV antigene Sequenz enthält, resultierend von der Verabreichung dieses Polypeptids in Impfstoffen, welche ebenfalls verschiedene Hilfsstoffe umfassen.
Die Impfstoffe werden üblicherweise durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion verabreicht. Zusätzliche Formulierungen, welche geeignet sind für andere Verabreichungsarten schließen Suppositorien und in einigen Fällen orale Formulierungen ein. Für Suppositorien können traditionelle Eindemittel und Träger Polyalkylenglycole oder Triglyceride einschließen, sind aber nicht beschränkt darauf. Solche Suppositorien können gebildet werden aus Mischungen, die den aktiven Inhaltsstoff im Bereich von ungefähr 0,5% bis ungefähr 10% vorzugsweise ungefähr 1% bis ungefähr 2% enthalten. Orale Formulierungen schließen solche üblicherweise verwendeten Bindemittel ein, wie zum Beispiel pharmazeutische Sorten von Mannitol, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Zellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder Pulver haben und enthalten ungefähr 10% bis ungefähr 95% an aktivem Inhaltsstoff, vorzugsweise ungefähr 25% bis ungefähr 70%.
Die Proteine, die in dem Impfstoff verwendet werden, können in dem Impfstoff als neutrale oder als Salz-Formen formuliert sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze, wie zum Beispiel Säure-Additions-Salze (gebildet mit freien Aminogruppen des Peptides) und die gebildet werden mit anorganischen Säuren, wie zum Beispiel Salze- oder Phosphorsäuren oder solchen organischen Säuren, wie zum Beispiel Essig-, Oxal-, Wein-, Maleinsäure und anderen, sind denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können ebenso abgeleitet sein, von anorganischen Basen, wie zum Beispiel Natrium, Kalium, Amonium, Kalzium oder Eisenhydroxiden und dergleichen und solchen organischen Basen, wie zum Beispiel Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidinprocain und anderen, die denen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind.
Impfstoffe werden verabreicht in einem Weg, der kompatibel ist mit der Dosis-Formulierung und in solchen Mengen, wie sie prophylaktisch und/oder therapeutisch wirksam sein werden. Die zu verabreichende Menge liegt im Allgemeinen im Bereich von ungefähr 5 μg bis ungefähr 250 μg an Antigen pro Dosis und hängt ab, vom zu dosierenden Patienten, von der Kapazität des Immunsystems des Patienten, Antikörper zu synthetisieren und vom Grad des gewünschten Schutzes. Präzise Mengen an aktiven Inhaltsstoff, die erforderlich sind zu verabreichen, können auch von der Einschätzung des behandelnden Arztes abhängen und können einzigartig sein, bei jedem Patienten. Der Impfstoff kann in einem einzelnen oder multiplen Dosis-Schema gegeben werden. Eine multiple Dosis ist eine, in welcher ein primärer Impfungs-Verlauf mit ein bis zehn separaten Dosierungen sein kann, gefolgt von anderen Dosierungen, die in nachfolgenden Zeitintervallen gegeben werden, die erforderlich sind, um Immunantwort aufrecht zu erhalten und/oder zu verstärken, beispielsweise an einem bis vier Monaten für eine zweite Dosierung und wenn es der Patient erfordert, eine nachfolgende Dosierung (Dosierungen) nach einigen Monaten. Das Dosierungsschema kann auch bestimmt werden, zumindest teilweise, durch das Bedürfnis des Patienten und kann abhängig sein von der Beurteilung des behandelnden Arztes. Es wird in Erwägung gezogen, dass der Impfstoff, der die immunogenen HCV-Hüll-Antigen(e) enthält, verabreicht werden kann in Verbindung mit anderen immuno-regulatorischen Wirkstoffen, zum Beispiel mit Immunglobulinen.
Es wird in Erwägung gezogen, dass das verwendete Reagenz für den Assay in der Form eines Kits bereitgestellt werden kann, mit einem oder mehreren Behältern, wie zum Beispiel Glasfläschchen oder Flaschen, wobei jeder Behälter ein separates Reagenz enthält, wie zum Beispiel einen monoklonalen Antikörper oder einen Cocktail von monoklonalen Antikörpern oder ein Polypeptid (entweder rekombinant oder synthetisch), das in dem Assay verwendet wird.
„Feste Phasen" („feste Träger") sind denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt, aber nicht entscheidend und schließen ein, die Wände von Vertiefungen auf einer Reaktionsplatte, Teströhrchen, Polystyrolkügelchen, magnetische oder nicht-magnetische Kügelchen, Nitrozellulose-Streifen, Membranen, Mikropartikel, wie zum Beispiel Latex-Partikel, Plastikröhrchen, Glas- oder Silikon-Chips und rote Blutkörperchen vom Schaf, welche alle geeignete Beispiele sind und andere. Geeignete Verfahren zur Immobilisierung von Peptiden auf festen Phasen schließen ionische, hydrophobe, kovalente Interaktionen und dergleichen ein. Eine „feste Phase", wie hierin verwendet, bezieht sich auf jedes Material, welches unlöslich ist oder welches unlöslich gemacht werden kann, durch eine nachfolgende Reaktion. Die feste Phase kann gewählt werden für ihre intrinsische Fähigkeit, dass Einfang-Reagenz anzuziehen und zu immobilisieren. Alternativ kann die feste Phase einen zusätzlichen Rezeptor einbehalten, der die Fähigkeit hat, das Einfang-Reagenz anzuziehen und zu immobilisieren. Der zusätzliche Rezeptor kann eine geladene Substanz einschließen, die gegenteilig geladen ist, in Bezug auf das Einfang-Reagenz selbst oder in Bezug auf eine geladene Substanz, die mit dem Einfang-Reagenz konjugiert ist. Als wiederum eine andere Alternative kann das Rezeptor-Molekül irgend ein spezifisches Bindeglied sein, welches an die feste Phase angeheftet ist und welches die Fähigkeit besitzt, das Einfang-Reagenz zu immobilisieren, durch eine spezifische Bindungs-Reaktion. Das Rezeptor-Molekül ermöglicht die indirekte Bindung des Einfang-Reagenzes an ein festes Phasen-Material, vor der Durchführung des Assay oder während der Durchführung des Assay.
Es wird in Erwägung gezogen und ist innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung, dass die feste Phase auch jedes geeignete poröse Material mit ausreichender Porosität umfassen kann, um eine Zugang durch die Detektion von Antikörpern zu erlauben, und mit einer geeigneten Oberflächen-Affinität, um Antigene zu binden. Mikro-poröse Strukturen sind im Allgemeinen bevorzugt, aber Materialien mit Gel-Struktur im hydrierten Stadium können ebenfalls verwendet werden. Solche nützlichen festen Träger schließen ein: natürliche polymere Kohlenhydrate und deren synthetisch modifizierte quervernetzte oder substituierte Derivate, wie zum Beispiel Agar, Agarose, quervernetzte Alginsäure, substituierte und quervernetzte Guar-Gummis, Zellulose-Ester, insbesondere mit Salpetersäure und Carbonsäuren, gemischte Zellulose-Ester und Zellulose-Ether; natürliche Polymere, die Stickstoff enthalten, wie zum Beispiel Proteine und Derivate, einschließlich quervernetzter und modifizierter Gelatine; natürliche Kohlenwasserstoffpolymere, wie zum Beispiel Latex und Kautschuk; synthetische Polymere, welche hergestellt werden können mit geeigneten porösen Strukturen, wie zum Beispiel Vinylpolymere, einschließlich Polyethylen, Polypropylen, Polystyren, Polyvinylchlorid, Polyvinylacetat und ihre partiell hydrolysierten Derivate, Polyacrylamide, Polymethacrylate, Copolymere und Terpolymere der obigen Polykondensate, wie zum Beispiel Polyester, Polyamide und andere Polymere, wie zum Beispiel Polyurethane oder Polyepoxide; poröse anorganische Materialien, wie zum Beispiel Sulfate oder Karbonate von Erdalkalimetallen und Magnesium, einschließlich Bariumsulfat, Kalziumsulfat, Kalziumcarbonat, Silikaten von Alkali- und Erdalkalimetallen, Alluminium und Magnesium; und Alluminium oder Siliziumoxide oder Hydrate, wie zum Beispiel Ton, Alumna, Talkum, Kaolin, Zeolit, Silikagel oder Glas (diese Materialien können als Filter verwendet werden, mit den oben genannten polymeren Materialien); und Mischungen oder Ko-Polymere der oben genannten Klassen, wie zum Beispiel Pfropf-Ko-Polymere, die erhalten werden, durch Beginnen der Polymerisation von synthetischen Polymeren auf einem vor-existierenden natürlichen Polymer. Alle dieser Materialien können verwendet werden in geeigneten Formen, wie zum Beispiel Filmen, Blättern oder Platten oder sie können aufgeschichtet werden oder gebunden oder laminiert an geeignete inerte Träger, wie zum Beispiel Papier, Glas, Plastikfilme oder Stoffe.
Die poröse Struktur von Nitrozellulose hat exzellente Absorptions- und Adsorbtions-Qualitäten für eine große Vielzahl an Reagenzien, einschließlich monoklonalen Antikörpern. Nylon besitzt ebenfalls ähnliche Charakteristika und ist ebenfalls geeignet. Es wird in Erwägung gezogen, dass solche porösen festen Träger, die hierin oben beschrieben sind, vorzugsweise in der Form von Blättern mit einer Dicke von ungefähr 0,01 bis 0,5 mm, vorzugsweise ungefähr 0,1 mm vorliegen. Die Porengröße kann variieren innerhalb großer Begrenzungen und liegt vorzugsweise von ungefähr 0,025 bis 15 μm, insbesondere von ungefähr 0,15 bis 15 μm. Die Oberflächen von solchen Trägern können aktiviert werden, durch chemische Prozesse, welche eine kovalente Verbindung des Antigens oder Antikörpers mit dem Träger bewirken. Die irreversible Bindung des Antigens oder Antikörpers wird jedoch im Allgemeinen durch Absorption auf dem porösen Material durch wenig verstandene hydrophobe Kräfte erzielt.
Das „Indikator-Reagenz" umfasst eine „signalerzeugende Verbindung" (Marker), welche in der Lage ist zu erzeugen und welche erzeugt, ein messbares Signal, das durch externe Mittel detektierbar ist, die an ein spezifisches Bindungsglied für HCV konjugiert sind. „Spezifisches Bindungsglied", wie hierin verwendet, bedeutet ein Glied eines spezifisches Bindungspaares. Das heißt, zwei unterschiedliche Moleküle, worin eines der Moleküle durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Zusätzlich dazu, dass das Indikator-Reagenz ein Antikörperglied eines spezifischen Bindungspaares für HCV ist, kann es auch ein Glied von irgendeinem spezifischen Bindungspaar sein, einschließlich jeweils Hapten-Anti-Hapten-Systemen, wie zum Beispiel Biotin oder Antibiotin, Avidin oder Biotin, ein Kohlenhydrat oder ein Lectin, eine komplementäre Nukleotidsequenz, ein Effektor- oder ein Rezeptor-Molekül, ein Enzym-Ko-Faktor und ein Enzym, ein Enzym-Inhibitor oder ein Einzym und dergleichen. Ein immuno-reaktives spezifisches Bindungsglied kann ein Antikörper sein, ein Antigen oder ein Antikörper-Antigen-Komplex, der in der Lage ist, entweder an HCV zu binden, wie in einem Sandwich-Assay, an das Einfang-Reagenz, wie in einem kompetitiven Assay oder an das hilfsweise spezifische Bindungsglied, wie in einem indirekten Assay.
Die verschiedenen „signalerzeugenden Verbindungen" (Marker), die genannt sind, schließen Chromogene, Katalysatoren, wie zum Beispiel Enzyme, Luminescente-Verbindungen, wie zum Beispiel Fluorescein und Rodamin, chemilumineszente Verbindungen, wie zum Beispiel Acridinium, Phenanthridinium und Dioxetan-Verbindungen, radioaktive Elemente und direkte visuelle Marker ein. Beispiel bon Enzymen schließen alkalische Phosphatase, Merettisch-Peroxidase, β-Galactosidase und dergleichen ein. Die Auswahl eines speziellen Markers ist nicht entscheidend, aber er wird in der Lage sein, ein Signal zu produzieren, entweder selbst oder in Verbindung mit einer oder mehreren zusätzlichen Substanzen.
Andere Ausführungsformen, welche unterschiedliche feste Phasen verwenden, sind ebenfalls beabsichtigt und liegen innerhalb des Schutzumfanges dieser Erfindung. Zum Beispiel können Ionen-Einfang-Verfahren zum Abtrennen eines immobilisierbaren Reaktionskomplexes mit einem negativ geladenen Polymer, beschrieben in EP Veröffentlichung 0326100 und EP Veröffentlichungsnummer 0406473, die jeweils in gemeinsamen Besitz sind, verwendet werden, gemäß der vorliegenden Erfindung, um eine schnelle immunochemische Reaktion der Lösungsphase zu erzielen. Ein immobilisierbarer Immunkomplex wird vom Rest der Reaktionsmischung abgetrennt, durch ionische Wechselwirkungen zwischen dem negativ geladenen Poly-Anion/Immunkomplex und der zuvor behandelten, positiv geladenen porösen Matrix und detektiert durch die Verwendung von verschiedenen signalerzeugenden Systemen, die vorher beschrieben wurden, einschließlich derer, die in chemilumineszenten Signal-Messungen beschrieben sind, wie beschrieben in EPO Veröffentlichungsnummer 0273115; welches gemeinsames Eigentum ist.
Ebenfalls gönnen die Verfahren der vorliegenden Erfindung angepasst werden, zur Verwendung in Systemen, welche die Mikropartikel-Technologie verwenden, einschließlich in automatisierten und semi-automatisierten Systemen, worin die feste Phase einen Mikropartikel umfasst. Solche Systeme schließen diejenigen ein, die in EPO Anmeldungsnummern EP 0 425 633 und EP 0 424 634 beschrieben sind.
Die Verwendung der Scanning Probe Microscopy (SPM) für Immuno-Assays ist ebenfalls eine Technologie, an welche die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung leicht anpassbar sind. Bei der Scanning Probe Microscopy, insbesondere bei der Atomkraft-Mikroskopie, wird die Einfang-Phase, zum Beispiel mindestens einer der monoklonalen Antikörper der Erfindung, an eine feste Phase angeheftet und ein Scanning Probe Mikroskop wird verwendet, um Antigen/Antikörper-Komplexe zu detektieren, die auf der Oberfläche der festen Phase anwesend sein können. Die Verwendung von Scanning Tunneling Microscopy eliminiert die Notwendigkeit für Marker, welche normalerweise in vielen Immuno-Assaysystemen verwendet werdet müssen, um Antigen/Antikörper-Komplexe zu detektieren.
Die Verwendung von SPM zur Überwachung von spezifischen Bindungsreaktionen kann in vielen Arten auftreten. In einer Ausführungsform wird ein Glied eines spezifischen Bindungspartners (Analyt-spezifische Substanz, welche der monoklonale Antikörper der Erfindung ist) an eine Oberfläche angeheftet, die geeignet ist für das Scanning. Das Anheften der Analyt-Spezifischen Substanz kann durch Adsorption an ein Teststück erfolgen, welches eine feste Phase einer Plastik- oder Metalloberfläche umfasst, gemäß den Verfahren, die denjenigen von durchschnittlichem Fachwissen bekannt sind. Oder die kovalente Anheftung eines spezifischen Bindungspartners (Analytspezifische Substanz) an ein Teststück kann verwendet werden, wobei das Teststück eine feste Phase von derivatisiertem Plastik, Metall, Silikon oder Glas umfasst. Kovalente Anheftungsverfahren sind denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt und schließen eine Vielzahl an Mitteln ein, um spezifische Bindungspartner irreversibel an das Teststück zu knüpfen. Wenn das Teststück Silikon oder Glas ist, muss die Oberfläche vor dem Anheften des spezifischen Bindungspartners aktiviert werden. Aktivierte Silan-Verbindungen wie zum Beispiel Triethoxyaminopropylsilan (erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), Triethoxyvinylsilan (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) und (3-Merkaptopropyl)-trimethoxysilan (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) können verwendet werden, um reaktive Gruppen, wie zum Beispiel Amino-, Vinyl- bzw. Thiol einzuführen. Solche aktivierten Oberflächen können verwendet werden, um die Bindungspartner direkt zu verknüpfen (in den Fällen von Amino oder Diol) oder die aktivierte Oberfläche kann weiterhin mit Verknüpfungsmitteln, wie zum Beispiel Glutaraldehyd, bis(Succinimidyl)subertat, SPPD 9 Succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]propionat), SMCC (Succinimidyl-4-[Nmaleimidomethyl]cyclohexan-1-carboxylat), SIAB (succinimidyl [4-iodacetyl]aminobenzoat) und SMPB (Succinimidyl 4-[maleimidophenyl]butyrat) reagiert werden, um den Bindungspartner von der Oberfläche abzutrennen. Die Vinylgruppe kann oxidiert werden, um ein Mittel für die kovalente Anheftung bereitzustellen. Sie kann ebenfalls verwendet werden als ein Anker für die Polymerisation von verschiedenen Polymeren, wie zum Beispiel Polyacrylsäure, welche multiple Anheftungspunkte bereitstellen kann für spezifische Bindungspartner. Die Amino-Oberfläche kann reagiert werden mit oxidierten Dextranen von verschiedenen Molekulargewichten, um hydrophile Linker von unterschiedlicher Größe und Kapazität bereitzustellen. Beispiele von oxidierbaren Dextranen schließen Dextran T-40 (Molekulargewicht 40.000), Dextran T-110 (Molekulargewicht 110.000), Dextran T-500 (Molekulargewicht 500.000), Dextran T-2M (Molekulargewicht 2.000.000) ein (wobei alle erhältlich sind von Pharmacia, Piscataway, NJ) oder Ficoll (Molekulargewicht 70.000 (erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)). Ebenfalls können Polyelektrolyt-Wechselwirkungen verwendet werden, um einen spezifischen Bindungspartner auf einer Oberfläche eines Teststücks zu immobilisieren. Das bevorzugte Verfahren zur Anheftung ist durch kovalente Mittel. Nach dem Anheften eines spezifischen Bindungsglieds kann die Oberfläche weiter behandelt werden mit Materialien, wie zum Beispiel Serum, Proteinen oder anderen blockierenden Wirkstoffen, um die nicht-spezifische Bindung zu minimieren. Die Oberfläche kann auch gescannt werden, entweder an der Stelle der Herstellung oder dem Punkt der Verwendung, um seine Geeignetheit für Assay-Zwecke zu verivizieren. Das Scanning-Verfahren wird nicht beeinträchtigt, um die spezifischen Bindungseigenschaften des Teststücks zu verändern.
Rekombinante Proteine können verwendet werden, um die Anwesenheit von Anti-HCV in Testproben zu detektieren. Beispielsweise wird eine Testprobe mit einer festen Phase inkubiert, an welche mindestens ein rekombinantes Protein angeheftet wurde. Dieses wird für einen Zeitraum und unter Bedingungen reagiert, die ausreichend sind, um Antigen/Antikörper-Komplexe zu bilden. Nach der Inkubation wird der Antigen/Antikörper-Komplex detektiert. Indikator-Reagenzien können verwendet werden, um die Detektion zu erleichtern, abhängig von dem gewählten Assay-System. In einem anderen Assys-Format wird eine Testprobe mit einer festen Phase in Kontakt gebracht, an welche ein rekombinantes Protein angeheftet ist, dass wie hierin beschrieben produziert wurde und wird ebenfalls mit einem monoklonalen oder polyklonalen Antikörper in Kontakt gebracht, der spezifisch ist für das Protein, welcher vorzugsweise mit einem Indikator-Reagenz markiert wurde. Nach der Inkubation für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind für die Bildung von Antiköper/Antigen-Komplexen, wird die feste Phase von der freien Phase abgetrennt und der Marker wird entweder in der festen oder der freien Phase als eine Indikation der Anwesenheit von HCV-Antikörper detektiert. Andere Assay-Formate, die die Proteine der vorliegenden Erfindung verwenden, sind beabsichtigt. Diese schließen das in Kontakt bringen einer Testprobe mit einer festen Phase ein, an welche mindestens ein rekombinantes Frotein angeheftet wurde, das in dem Säugetier-Expressionssystem produziert wurde, das Inkubieren der festen Phase und der Testprobe für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um Antigen/Antikörper-Komplexe zu bilden und dann das in Kontakt bringen der festen Phase mit einem markierten rekombinanten Antigen.
Es ist innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung, dass Antikörper, sowohl monoklonale als auch polyklonale, erzeugt. werden können, unter Verwendung der Fusionsproteine der Erfindung als Immunogene. Die monoklonalen Antikörper oder Fragmente davon können individuell bereitgestellt werden, um HCV-Anrigene zu detektieren. Kombinationen der monoklonalen Antikörper (und Fragmenten davon), die hierin bereitgestellt werden, können auch zusammen als Komponenten in einer Mischung oder einem „Cocktail" von mindestens einem Anti-HCV-Antikörper der Erfindung mit Antikörpern für andere HCV-Regionen, die jeweils unterschiedliche Bindungsspezifitäten haben, verwendet werden. Daher kann dieser Cocktail monoklonale Antikörper einschließen, welche auf HCV-Hüllproteine gerichtet sind und andere monoklonale Antikörper für andere Antigene Determinanten des HCV-Genoms. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern sind im Fachgebiet wohl bekannt. Siehe beispielsweise Kohler und Milstein, Nature 256: 494 (1975); J. G. R. Hurrel, ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Technigues und Applications, CRC Press, Inc., Boco Raton, FL (1982); und L. T. Mimms et al., Virology 176: 604–619 (1990).
Der polyklonale Antikörper oder das Fragment davon, welcher in den Assay-Formaten verwendet werden kann, sollte spezifisch an eine spezifische HCV-Region oder andere HCV-Proteine, die in dem Assay verwendet werden, binden. Der polyklonale Antikörper, der vorzugsweise verwendet wird, hat einen Säugetier-Ursprung; polyklonale Anti-HCV-Antikörper von Menschen, Ziegen, Hase oder Schaf können verwendet werden. Am meisten bevorzugt ist der polyklonale Antikörper ein polyklonaler Anti-HCV-Antikörper vom Hasen. Die polyklonalen Antikörper, die in den Assays verwendet werden, können entweder allein oder als ein Cocktail von polyklonalen Antikörpern verwendet werden. Da die Cocktails, die in den Assay-Formaten verwendet werden, entweder aus monoklonalen Antikörpern oder polyklonalen Antikörpern zusammengesetzt sind, die unterschiedliche HCV-Spezifität haben, währen sie nützlich für die Diagnose, die Bewertung und die Prognose von einer HCV-Infektion, ebenso wie für die Untersuchung der HCV-Protein-Differenzierung und Spezifität.
In einem anderen Assay-Format kann die Anwesenheit von Antikörper und/oder Antigen für HCV in einem simultanen Assay wie folgt detektiert werden. Eine Testprobe wird gleichzeitig mit einem Einfang-Reagenz eines ersten Analyten in Kontakt gebracht, worin das Einfang-Reagenz ein erstes Bindungsglied umfasst, das spezifisch ist für einen ersten Analyten, der an eine feste Phase angeheftet ist und einem Einfang-Reagenz für einen zweiten Analyten, worin das Einfang-Reagenz ein erstes Bindungsglied für einen zweiten Analyten umfasst, der angeheftet ist an eine zweite feste Phase, um dabei eine Mischung zu bilden. Diese Mischung wird inkubiert für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um Einfang-Reagenz/erster Analyt und Einfang-Reagenz/zweiter Analyt-Komplexe zu bilden. Diese so gebildeten Komplexe werden dann mit einem Indikator-Reagenz in Kontakt gebracht, das ein Glied eines Bindungspaares umfasst, das spezifisch ist für den ersten Analyten, der mit einen signalerzeugenden Verbindung markiert ist und einem Indikator-Reagenz, das ein Glied eines Bindungspaares umfasst, das spezifisch ist für den zweiten Analyten, der mit einer signalerzeugenden Verbindung markiert ist, um eine zweite Mischung zu bilden. Diese zweite Mischung wird inkubiert für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um Einfang-Reagenz/erster Analyt/Indikator-Reagenz-Komplexe und Einfang-Reagenz/zweiter Analyt/Indikator-Reagenz-Komplexe zu bilden. Die Anwesenheit von einem oder mehreren Analyten wird bestimmt durch detektieren eines Signals, das in Zusammenhang mit den Komplexen erzeugt wird, die entweder auf einer oder beiden festen Phasen gebildet wurden, als eine Indikation der Anwesenheit von einem oder mehreren Analyten in der Testprobe. In diesem Assay-Format können Proteine, die von humanen Expressionssystemen abgeleitet sind, ebenso verwendet werden, wie monoklonale Antikörper, die aus den Proteinen hergestellt werden, die aus den Säugetier-Expressionssystemen abgeleitet sind, wie hierin offenbart.
In wiederum einem anderen Detektionsverfahren können monoklonale Antikörper, die durch die Verwendung der Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, bei der Detektion von HCV-Antigenen in fixierten Gewebe-Abschnitten ebenso wie fixierten Zellen durch immunohistochemische Analyse verwendet werden. Zusätzlich können diese monoklonalen Antikörper an Matrizen gebunden sein, ähnlich wie CNBr-aktivierte Sepharose und verwendet werden für die Affinitäts-Reinigung von spezifischen HCV-Proteinen aus Zellkulturen oder biologischen Geweben, wie zum Beispiel Blut und Leber. Die monoklonalen Antikörper können weiterhin verwendet werden für die Erzeugung von schimären Antikörpern zur therapeutischen Verwendung oder anderen ähnlichen Anwendungen.
In einem anderen alternativen Assay-Format können einer oder eine Kombination von einem oder mehreren monoklonalen Antikörpern, hergestellt durch die Verwendung der Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung, verwendet werden als eine kompetitive Sonde für die Detektion von Antikörpern gegen HCV-Protein. Beispielsweise können HCV-Proteine entweder allein oder in Kombination auf eine feste Phase geschichtet werden. Eine Testprobe, von der vermutet wird, dass sie Antikörper gegen HCV-Antigen enthält, wird dann mit einem Indikatorreagenz inkubiert, das eine signalerzeugende Verbindung und mindestens einen monoklonalen Antikörper umfasst, für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichend sind, um Antigen/Antikörper-Komplexe von entweder der Testprobe und dem Indikatorreagenz an die feste Phase oder dem Indikatorreagenz an die feste Phase zu bilden. Die Reduktion der Bindung des monoklonalen Antikörpers an die feste Phase kann quantitativ gemessen werden. Eine messbare Reduktion in dem Signal, verglichen mit dem Signal, das aus einer bestätigten negativen NANB Hepatitis-Testprobe erzeugt wird, zeigt die Anwesenheit von Anti-HCV-Antikörper in der Testprobe an.
Während die vorliegende Erfindung den Vorzug für die Verwendung von festen Phasen offenbart, ist es beabsichtigt, dass die Proteine der vorliegenden Erfindung in nicht Fest-Phasen-Assaysystemen verwendet werden können. Diese Assaysysteme sind denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt und sollen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch Beispiele beschrieben werden, welche veranschaulichen, aber nicht den Geist und den Schutzumfang der Erfindung einschränken sollen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Erzeugung von APP-HCV-E1, APP-HCV E2 und APP-HCV-E1-E2 Fusionsklonen
Alle Säugetier-Expressions-Konstrukte wurden hergestellt in dem Vektor pRc/CMV (erhältlich von Invitrogen, San Diego, CA), wie in 1 gezeigt. Jedoch ist beabsichtigt, dass andere Expressions-Vektoren verwendet werden können für dieses und andere Konstrukte, die hierin unten beschrieben sind, durch Befolgen von Standardverfahren, die im Fachgebiet bekannt sind.
Der Klon pHCV172 (Sequenzidentifikationsnummer 2) wurde konstruiert durch Kombinieren einer Amyloid-Precurser-Protein (APP) Sequenz, zuvor beschrieben durch Kang et al., Nature 325: 733–736 (1987), anstatt der humanen Wachstums-Hormon-Signal-Sequenz von pHCVl68 (die Nukleinsäure-Sequenz von pHCVl68 wird präsentiert als Sequenzidentifikationsnummer 3 und die Aminosäuresequenz von pHCVl68 wird präsentiert als Sequenzidentifikationsnummer 4) und der gesamten Länge von HCV E1, wie in 2 gezeigt. Ein HindIII-KpnI-Fragment der APP-Sequenz wurde anfangs in HindIII und KpnI-Stellen von pUC19 subkloniert. Ein HindIII-EcoRl-Fragment von diesem Klon wurde mit einem EcoRI-XbaI-Fragment von pHCVl68 an HindIII und XbaI-Stellen von pRc/CMV ligiert, resultierend in pHCV172 (Sequenzidentifikationsnummer 2).
Der Klon pHCV415 (Sequenzidentifikationsnummer 5), der eine Deletion der C-terminalen hydrophoben Region besitzt, wurde wie folgt konstruiert: pHCV172 (Sequenzidentifikationsnummer 2) wurde mit PvuII und HindIII und einem Fragment, das APP enthielt, verdaut und der größte Teil von E1 wurde in HindIII und XbaI-Stellen von dem pRc/CMV, wie in 2 gezeigt, kloniert. Der Klon pHCV415 (Sequenzidentifikationsnummer 5) hat eine Deletion von Aminosäure 337 bis 383 von HCV E1.
Der Klon pHCV416 (Sequenzidentifikationsnummer 6)wurde abgeleitet aus pHCV415 (Sequenzidentifikationsnummer 5), durch Entfernen eines AcyI-AcyI-Fragments, welches die interne hydrophobe Aminosäuresequenz 260 bis 296 von E1 enthielt, wie in 2 gezeigt. Der Klon pHCV416 (Sequenzidentifikationsnummer 6) enthält HCV-Aminosäuresequenz von 192 bis 259 und 297 bis 363 von HCV.
Der Klon pHCV351 (Sequenzidentifikationsnummer 7) wurde abgeleitet von pHCVl67 (die Nukleinsäure-Sequenz von pHCVl67 wird präsentiert als Sequenzidentifikationsnummer 8 und die Aminosäure-Sequenz von pHCVl67 wird präsentiert als Sequenzidentifikationsnummer 9). pHCVl67 wurde vorher beschrieben in der US-Patentanmeldung Serial No. 08/144,099. pHCV351 (Sequenzidentifikationsnummer 7) wurde kloniert durch Einfügen eines Terminations-Codons nach Aminosäure 654 von HCV E2, wie in 2 gezeigt. Daher fehlen diesem Klon C-terminale hydrophobe Reste.
Der Klon pHCV518 (Sequenzidentifikationsnummer 10) wurde wie folgt konstruiert: pHCV172 (Sequenzidentifikationsnummer 2) wurde mit HindIII und PvuII verdaut und ein Fragment, das APP und E1-Sequenz (von Aminosäure 192 bis 336) enthielt, wurde isoliert. Der Klon pHCV351 (Sequenzidentifikationsnummer 7) wurde ebenfalls mit NaeI und XbaI verdaut und ein Fragment, das Aminosäure 396 bis 654 von E2 enthielt, wurde isoliert. Diese Fragmente wurden zwischen HindIII und XbaI-Stellen von pRc/CMV, wie in 4 gezeigt, kloniert.
Der Klon pHCV419 (Sequenzidentifikationsnummer 11) wurde konstruiert durch Entfernen einer internen hydrophoben Region, die sich auf einem AcyI-AcyI-Fragment von Klon pHCV418 (Sequenzidentifikationsnummer 10) befand, wie in 4 gezeigt. Daher enthält pHCV419 (Sequenzidentifikationsnummer 11) die HCV-Aminosäure-Sequenz von 192 bis 259, 297 bis 336 und 393 bis 654.
Der Klon pHCV176 (Sequenzidentifikationsnummer 12) enthält 5' halbe 5281 Basen-Paare von der HCV-Sequenz, identifiziert als Sequenzidentifikationsnummer 1. Kurz gesagt, wurde RNA, die aus dem Serum oder Plasma eines Schimpansen (bezeichnet als „CO") isoliert wurde, der experimentell mit HCV infiziert wurde, auf die cDNA transkribiert unter Verwendung von reverser Transkriptase, die entweder zufällige Hexamer-Primer oder spezifische Anti-Sense-Primer, abgeleitet von der Prototyp HCV-1-Sequenz, verwendete. von der Sequenz wurde berichtet durch Choo et al. (Choo et al., Proc. Nat'1. Acad. Sci. USA 88: 2451-2455 [1991] und ist erhältlich durch GenBank data base, Accession No. M62321). Diese cDNA wurde dann amplifiziert unter Verwendung von PCR und AmpliTaq^®DNA Polymerase, unter Verwendung von entweder einem zweiten Sense-Primer, der ungefähr 1.000 bis 2.000 Nukleotide stromaufwärts von dem spezifischen Anti-Sense-Primer angeordnet ist oder einem Paar von Sense und Anti-Sense-Primern, die neben einem 1.000 bis 2.000 Nukleotid-Fragment von HCV angeordnet sind. Nach 25 bis 35 Amplifikations-Zyklen gemäß Standartverfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, wurde ein Aliquot dieser Reaktionsmischung einer verschachtelten PCR (oder „PCR-2") unterworfen, worin ein Paar von Sense- und Anti-Sense-Primern verwendet wurde, die intern an dem originalen Paar von PCR-Primern angeordnet sind, um weiterhin HCV-Gen-Segmente in Mengen zu amplifizieren, die ausreichend sind für die Analyse und die Sub-Klonierung, unter Verwendung von Endonuklease-Erkennungs-Sequenzen, die in dem zweiten Set von PCR-Primern anwesend sind. Auf diese Weise wurden sieben angrenzende HCV-DNA-Fragmente erzeugt, welche dann angeordnet werden konnten, unter Verwendung der allgemeinen Klonierungs-Strategie. Nach der Anordnung wurde die DNA-Sequenz von jedem der einzelnen Fragmente bestimmt und in die genomischen Aminosäure-Sequenzen translatiert, die in Sequenzidentifikationsnummer 1 präsentiert sind. Zwei Fragmente (EcoRi-BgIII 3231bp und BgIII-XbaI 2050bp-Fragmente) aus zwei Klonen (pHCV141 [Sequenzidentifikationsnummer 13] und pHCV150 [Sequenzidentifikationsnummer 14]) wurden kombiniert, um pHCV176 (Sequenzidentifikationsnummer 12) zu erzeugen. Dieses Verfahren wurde beschrieben in U. S. S. N. 08/144,099, welches vorher hierin durch Bezugnahme aufgenommen wurde.
Der Klon pHCV420 (Sequenzidentifikationsnummer 15) wurde konstruiert, durch Kombinieren von drei Fragmenten: einem PvuI-BamHI-Fragment aus pHCV172 (Sequenzidentifikationsnummer 2), das 5' halb von einem Ampizilin-Resistenz-Gen (PvuI-Stelle) enthielt zu APP und E1 (BamHI-Stelle), einem PvuI-SalI-Fragment aus pHCV351 (sequenzidentifikationsnummer 7), das 3' halb von einem Ampizilin-Resistenz-Gen (PvuI-Stelle) enthielt zu 3' Ende von E2 (SalI-Stelle) und einem BamHI-SalI-Fragment von pHCV176 (sequenzidentifikationsnummer 12), das 3' halb von E1 und 5' halb von E2 enthielt, 4. Daher enthält pHCV420 (sequenzidentifikationsnummer 15) HCV-Aminosäure-Sequenz 192 bis 654.
Der Klon pHCV421 (Sequenzidentifikationsnummer 16) wurde abgeleitet von pHCV420 (Sequenzidentifikationsnummer 15), durch Entfernen einer internen hydrophoben Region, die sich auf einem AcyI-AcyI-Fragment, wie in 4 gezeigt, befindet.
Der Klon pHCV422 (Sequenzidentifikationsnummer 17) wurde abgeleitet, durch ligieren von 3 Fragmenten: einem HindIII-AvaII-Fragment, das APP und Aminosäure 192 bis 279 von pHCV420 (Sequenzidentifikationsnummer 15) von E1-Sequenz enthielt, einem NaeI-XbaI-Fragment, das Aminosäure-Sequenz 393 bis 654 von E2 aus pHCV351 (Sequenzidentifikationsnummer 7) enthielt und einem HindIII-XbaI-Fragment von pRc/CMV, wie in 4 gezeigt.
Die Klone pHCV423 (Sequenzidentifikationsnummer 18) und pHCV424 (Sequenzidentifikationsnummer 19) wurden wie folgt konstruiert: pHCV421 (Sequenzidentifikationsnummer 16) wurde verdaut mit AvaII und NaeI, um Aminosäure-Sequenz 337 bis 379 von E1 zu entfernen oder wurde mit PvuII und NcoI verdaut, um Aminosäure-Sequenz 337 bis 363 von E1 zu entfernen, wie in 6 gezeigt.
Der Klon pHCV425 (Sequenzidentifikationsnummer 20) wurde angeordnet aus Fragmenten: einem HindIII-PvuII aus pHCV172 (Sequenzidentifikationsnummer 2), das APP und E1 bis zu Aminosäure-Sequenz 336 enthielt, einem NaeI-XbaI-Fragment aus pHCV420 (Sequenzidentifikationsnummer 15), das Aminosäure 380 bis 383 von E1 und 384 bis 654 von E2 enthielt und einem HindIII-XbaI-Fragment aus pRc/CMV, wie in 6 gezeigt. Daher enthält pHCV425 (Sequenzidentifikationsnummer 20) HCV-Aminosäure-Sequenz 192 bis 336 und 380 bis 654.
Der Klon pHCV429 (Sequenzidentifikationsnummer 21) wurde erzeugt, durch Entfernen eines Fragments, dass Aminosäure-Frequenz 328 bis 339 enthielt, das sich auf einem AvaII-BamHI-Fragment von pHCV421 (Sequenzidentifikationsnummer 16) befindet, wie in 6 gezeigt.
Beispiel 2: Detektion von HCV-Antigenen durch RIPA
Eine primäre humane embrionale Nieren (HEK)Zellinie, die mit humanem Adenovirus Typ 5 transformiert wurde, bezeichnet als HEK-293 (erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, MD), wurde verwendet für alle Transfektionen und Expressionsanalysen. HEK-293 Zellen wurden in Minimum Essential Medium (MEM) gehalten, welches mit 10% fötalem Rinder-Serum (FBS), Penicillin, Streptomycin und Fungizon vervollständigt wurde.
Ungefähr 30 μg von gereinigter DNA wurde wurde in HEK-293 Zellen transfiziert unter Verwendung des modifizierten Kalziumphosphat-Protokolls, wie berichtet durch Chen et al., Molecular and Cellular Biology 7(8): 2745–2752 (1987). Die Kalziumphosphat-DNA-Lösung wurde auf den HEK-293 Zellen für ungefähr 4 bis 6 Stunden inkubiert. Die Lösung wurde entfernt und die Zellen wurden in MEM für zusätzliche 24 bis 28 Stunden inkubiert. Um die Protein-Expressions zu analysieren, wurden die transfizierten Zellen metabolisch markiert mit 100 μCi/ml von jeweils 5–35 markiertem Methionin und Cycteine für 8 bis 14 Stunden. Die Kulturmedien wurden entfernt und gelagert und die Zellen wurden zuerst in MEM gewaschen und dann in Phosohatgepufferter Salzlösung (PBS) lysiert, die 1% Triton^TM X-100^® (erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 0,1% Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) und 0,5% Deoxychloat, bezeichne als PBS-TDS, enthielt. Diese Zell-Lysate wurden auf Eis gelassen für 10 bis 15 Minuten und dann durch Zentrifugation bei 12.000x g für 45 Minuten bei 4°C geklärt. Standart-Radio-Immuno-Ppräzipitations-Assays (RIPAs) wurden dann auf diesen markierten Zell-Lysaten und/oder im Kulturmedium durchgeführt. Kurz gesagt, wurden markierte Zell-Lysate (150 μ1) und/oder Kulturmedium (400 μl) mit 3 μl von HCV-Patienten-Seren, bezeichnet als J728, bei 4°C für eine Stunde inkubiert. Protein-A-Sepharose, zuvor behandelt mit kaltem HEK-293 Zellysat wurde dann hinzugefügt und die Mischungen wurden weiter für eine Stunde bei 4°C unter Bewegung inkubiert. Die Proben wurden dann zentrifugiert und die Pellets wurden 3 mal mit PBS-TDS-Puffern gewaschen. Die durch Immuno-Präzipitation gewonnenen Proteine wurden eluiert durch Erhitzen in einem Elektrophorese-Proben-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM Dithiothreitol [DTT], 2% SDS, 0,1% Bromphenol blau und 10% Glycerol) für sechs Minuten in kochendem Wasser. Die eluierten Proteine mit Kohlenstoff-l4-markierten-Molekulargewicht-Standart (erhalten von Amersham, Arlington Heights, IL) wurden abgetrennt, durch 13,5% Polyacrylamid-SDS-Gele, welche nacheinander behandelt wurden mit einem fluorographischen Reagenz, wie zum Beispiel Enlightening^® (erhältlich von NEN [DuPont], Boston, MA) unter Vakuum getrocknet und einem Röntgenfilm bei –70°C mit intensivierenden Schirmen ausgesetzt.
3 zeigt, dass HCV E1 als Gesamtlänge oder Deletion von C-terminaler hydrophober Region mit APP [pHCVl72 (Sequenzidentifikationsnummer 2] oder pHCV415 [Sequenzidentifikationsnummer 5] in 2) nicht in der Lage war, ihr Produkt zu sezernieren. Das Entfernen einer internen ebenso wie einer C-terminalen hydrophoben Region war nicht ausreichend, um E1 durch APP-Signal-Sequenz (pHCV416 [Sequenzidentifikationsnummer 6] in 2) zu sezernieren. Daher wurden Konstrukte aus der Fusion von HCV E1-E2 mit APP auf mögliche Wege getestet, um effizient E1 zu sezernieren. 5 zeigt, dass E2 mit einer C-terminalen Deletion in der Lage war, sein Produkt effizient in Medium zu sezernieren, unter Verwendung der APP-Signal-Sequenz (pHCV351 [Sequenzidentifikationsnummer 7] in 2).
Zuerst wurden pHCV418 (Sequenzidentifikationsnummer 10), pHCV419 (Sequenzidentifikationsnummer 11) und pHCV422 (Sequenzidentifikationsnummer 17) (4), denen allen die Abspaltungsstelle von HCV E1 und E2 bei Aminosäuresequenz 383/384 fehlte (Hijikata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5547–5551 [1991]) auf die Sekretion von E1-E2-Fusionsprotein getestet. 5 zeigt, dass E1-E2 in dem Kulturmedium ebenso wie in Zellen exprimiert werden konnte. Weiterhin schienen die sezernierten Materialien weiter glycosyliert zu sein, verglichen mit den Materialien, die in Zell-Lysaten exprimiert wurden. Ein zweiter Satz von Konstrukten (pHCV420 [Sequenzidentifikationsnummer 15] und pHCV421 [Sequenzidentifikationsnummer 16], 4) enthielt keine Deletion an der Abspaltungsstelle von E1 und E2 bei Aminosäuresequenz 383/384. Der RIPA in 5 zeigt, dass E1 und E2 gespalten wurden und das nur E2 in das Medium sezerniert werden konnte. 5 zeigt ebenfalls, dass die Expression von E1 sehr viel effizienter ist aus pHCV420 (Sequenzidentifikationsnummer 5) oder pHCV421 (Sequenzidentifikationsnummer 6), verglichen mit der Expression aus pHCV172, welches nicht E2 an der 3'-Stelle von E1 enthält.
Es wird angenommen, dass diese Typen von Fusionskonstrukten, E2 nach E1, ein guter Weg sein können, um die Expressions-Spiegel zu erhöhen und um E1 ebenso wie E2 in Medium zu sezernieren.
Die Klone pHCV423 (Sequenzidentifikationsnummer 18), pHCV424 (Sequenzidentifikationsnummer 19), pHCV425 (Sequenzidentifikationsnummer 20) und pHCV429 (Sequenzidentifikationsnummer 21) (6) wurden konstruiert, um die Sekretion von E1 ebenso wie von E2 aus dem selben Konstrukt zu testen, da sie die Abspaltungsstelle von E1-E2 (Aminosäure 383/384) enthielten. Es war überraschend und unerwartet, zu erkennen, dass zwei Konstrukte (pHCV423 [Sequenzidentifikationsnummer 18] und pHCV425 [Sequenzidentifikationsnummer 20]), die die Spaltungsstelle von E1 und E2 enthielten (4 Aminosäure am Ende von E1 und das selbe E2, wie pHCV420), nicht E1 und E2 abspalteten, wie in 7 gezeigt. Jedoch wurden ihre Produkte in das Medium als Fusionsproteine von E1-E2 (7) sezerniert. Die C-terminale Sequenz von E1 war in den Klonen pHCV424 (Sequenzidentifikationsnummer 19) und pHCV429 (Sequenzidentifikationsnummer 21) erhöht, verglichen mit pHCV423 (Sequenzidentifikationsnummer 18). Daher wurden verschiedene Mengen von C-terminaler hydrophober Sequenz und eine konstante Menge von interner hydrophober Sequenz entfernt, um die Sekretion von E1 und E2 aus dem selben Konstrukt zu testen. 7 zeigt, dass die 20 Aminosäuren am Ende von E1 mit E2 eine teilweise Abspaltung von E1 und E2 ergaben. Jedoch produzierte eine 44 Aminosäure-Sequenz (pHCV429 [Sequenzidentifikationsnummer 21]) eine vollständige Abspaltung von E1 und E2, beurteilt nach der Mobilität von E2 auf einem Gel. Obwohl E1, das aus pHCV429 (Sequenzidentifikationsnummer 21) exprimiert wurde, sogleich in dem Zell-Lysat detektiert wurde, wurde E1, das aus pHCV424 (Sequenzidentifikationsnummer 19) exprimiert wurde, niemals in weder dem Zellysat noch dem Medium detektiert. Des weiteren wurde E1 niemals aus irgendeinem der Konstrukte, die in der Serie von Klonen, die hierin beschrieben sind, getestet wurden, sezerniert. Diese Daten zeigen, dass HCV-Aminosequenz 340 bis 363 das E1-Epitop enthält. Daher war es unerwartet, dass das HCV E1-Antigen in einem Säugetier-Expressionssystem sezerniert werden konnte. Der Klon pHCV425 (Sequenzidentifikationsnummer 20), der die kleinste Deletion in dem C-Terminal von E1 enthielt (der Sequenz, die in 8 gezeigt ist (und gezeigt als Sequenzidentifikationsnummer 22) und der die vorgeschlagene Spaltungsstelle (Aminosäure 383/384) von E1-E2 enthielt, sezerniert E1 und E2 als ein Fusionsprotein, bestehend aus Aminosäuresequenz von HCV-Aminosäure 192 bis 336 und Aminosäure 383 bis 654.
Die Klone pHCV172 (Sequenzidentifikationsnummer 2), pHCV176 (Sequenzidentifikationsnummer 12), pHCV351 (Sequenzidentifikationsnummer 7) und pHCV425 (Sequenzidentifikationsnummer 20) wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 hinterlegt, wie vom 14. Januar 1994 unter den Bedingungen des Vertrags von Budapest und erhielten die folgenden ATCC-Zugriffs-Nummern: dem Klon pHCVl72 wurde die ATCC Hinterlegungsnummer 69533 gewährt, dem Klon pHCV176 wurde die ATCC Hinterlegungsnummer 69534 gewährt, dem Klon pHCV351 wurde die ATCC Hinterlegungsnummer 69535 gewährt und dem Klon pHCV425 wurde die ATCC Hinterlegungsnummer 69536 gewährt. Die angegebenen Hinterlegungen werden für einen Zeitraum von dreißig (30) Jahren vom Datum der Hinterlegung an gehalten oder für fünf (5) Jahre nach der letzten Anfrage für die Hinterlegung; oder für das durchsetzbare Leben des US Patents, jenachdem welches länger ist. Diese Hinterlegungen und andere hinterlegte Materialien, die hierin erwähnt sind, sollen nur der Bequemlichkeit dienen und sind nicht erforderlich, um die Erfindung in Bezug auf die Beschreibungen hierin auszuführen.
Andere Anwendungsvariationen der Verwendung der Proteine und Säugetier-Expressionssysteme, die hierin bereitgestellt sind, werden denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, ersichtlich sein. Dementsprechend soll die Erfindung nur in Übereinstimmung mit den angehängten Ansprüchen eingeschränkt sein.
SEQUENZLISTE

Claims

Plasmid pHCV-176 (hinterlegt als ATCC 69534 in E. Coli).
Plasmid pHCV-172 (hinterlegt als ATCC 69533 in E. Coli).
Plasmid pHCV-351 (hinterlegt als ATCC 69535 in E. Coli).
Plasmid pHCV-425 (hinterlegt als ATCC 69536 in E. Coli).
APP-HCV-E1 Fusionsprotein, das durch einen Säugetier-Expressions-Vektor pHCV-172 exprimiert wurde (hinterlegt als ATCC 69534 in E. Coli).
APP-HCV-E2 Fusionsprotein, das durch einen Säugetier-Expressions-Vektor pHCV-351 exprimiert wurde (hinterlegt als ATCC 69535 in E. Coli).
APP-HCV-E1-E2 Fusionsprotein, das durch einen Säugetier-Expressions-Vektor pHCV-425 exprimiert wurde (hinterlegt als ATCC 69535 in E. Coli).
Ein Verfahren zur Detektion von HCV-Antigenen oder Antikörpern in einer Testprobe, von der vermutet wird, dass sie HCV-Antigene oder Antikörper enthält, wobei das Verfahre: den Schritt in-Kontakt-bringen der Testprobe mit einem glycosylierten HCV-Envelope-Antigen-Fusionsprotein umfasst, das durch die Vektoren exprimiert wurde, die gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus pHCV-172, pHCV-351 und pHCV425, wie in Ansprüchen 2 bis 4 definiert, und worin das Fusionsprotein in einem Säugetier-Exoressionssystem hergestellt wird.
Ein Verfahren zur Detektion von HCV-Antigenen oder Antikörpern in einer Testprobe, von der vermutet wird, dass die HCV-Antigene oder Antikörper enthält, wobei das Verfahren den Schritt in-Kontakt-bringen der Testprobe mit einem Antikörper umfasst, der durch die Verwendung eines glycosylierten HCV-Envelope-Antigen-Fusionsproteins hergestellt wurde, das durch die Vektoren exprimiert wurde gewählt aus der Gruppe bestehend aus pHCV-172, pHCV-351 und pHCV425, wie in Ansprüchen 2 bis 4 definiert, und worin das Fusionsprotein in einem Säugetier-Expressionssystem hergestellt wird.
Ein Testkit zur Detektion der Anwesenheit von HCV-Antigenen oder HCV-Antikörpern in einer Testprobe, von der vermutet wird, dass sie das HCV-Antigen oder den HCV-Antikörper enthält, der folgendes umfasst: einen Behälter, der ein glycosyliertes HCV-Envelope-Antigen-Fusionsprotein enthält, dass durch die Vektoren exprimiert wurde gewählt aus der Gruppe bestehend aus pHCV-172, pHCV-351 und pHCV425, wie in Ansprüchen 2 bis 4 definiert und worin das Fusionsprotein in einem Säugetier-Expressionssystem hergestellt wird.
Ein Testkit von Anspruch 10, der weiterhin einen Behälter umfasst, der einen Antikörper enthält, der hergestellt wurde durch die Verwendung eines glycosylierten HCV-Envelope-Antigen-Fusionsproteins, exprimiert durch die Vektoren gewählt aus der Gruppe bestehend aus pHCV-172, pHCV-351 und pHCV425, wie in Ansprüchen 2 bis 4 definiert, und worin das Fusionsprotein in einem Säugetier-Expressionssystem hergestellt wird.
Ein Testkit zur Detektion der Anwesenheit eines HCV-Antigens oder eines HCV-Antikörpers in einer Testprobe, von der vermute wird, dass sie das HCV-Antigen oder den HCV-Antikörper enthält, der das Enthalten eines Antikörpers umfaßt, der durch die Verwendung eines glycosylierten HCV-Envelope-Antigen-Fusionsproteins hergestellt wurde, das durch die Vektoren gewählt aus der Gruppe bestehend aus pHCV-172, pHCV-351 und pHCV425, wie in Ansprüchen 2 bis 4 definiert, exprimiert wurde, und worin das Fusionsprotein in einem Säugetier-Expressionssystem hergestellt wird.