JPH06510191A - Ｎｓ１に対する組換え抗原を利用したｃ型肝炎アッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＮＳＩに対する組換え抗原を利用したＣ型肝炎アッセイ本出願は、１０００年８ 月２４日に出願された米国特許出願第０７７５７２、８２２号及び１９９０年１ １月　７日に出願された米国特許出願第０７／６１４．０６９号の一部継続出願 であり、上記米国特許出願は、同−所有権者を享受しており、ともに本明細書に 参考として組入れる。本出願はまた、ｒ　ＮＳ５領域由来の組換え抗原を利用し たＣ型肝炎アッセイ」　（米国特許出願第７４８．５６５号）、及びｒｅ−１０ ０領域に対する組換え抗原を利用したＣ型肝炎アッセイ」（米国特許出願第７４ ８．５６６号）という名称で同時出願された特許出願にも関連しており、上記米 国特許出願は同−所有権者を享受しており、ともに本明細書に参考として組入れ る。

一般的に、本発明はＣ型肝炎ウィルスと免疫学的に反応する抗体の存在をサンプ ル中に同定するアッセイ、具体的には、１（ＣＶゲノムの明瞭な領域を示す組換 え抗原と抗体との複合体を検出するアッセイに関する。１ｌＣＶゲノムの明瞭な 抗原性領域を示す合成りＮＡ配列の、分子クローニング及び異種発現系での発現 に由来する組換え抗原は、Ｃ型肝炎ウィルス（ＩＩｃＶＩ　と接触のあった個体 の体液中に、抗体及び抗原を検出するための試薬として使用することができる。

発明の背景 急性ウィルス性肝炎は、黄痘、肝臓圧痛、及びアラニン・アミノトランスフェラ ーゼ（ＡＬＴ）とアスパルテート・アミノトランスフェラーゼの血清レベルでの 上昇を含む、明確に定義された患者の症状の組合せによって、臨床学的に診断さ れる。原因である特定のウィルスの型を診断するのには、一般に、更に他の血清 学的イムノアッセイが実施される。歴史的には、臨床的に肝炎の症状を示す患者 で、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、エプスタインバー、又はサイトメガロウィルスに感染 していない場合、除外法によって、非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＩＩＢ）Ｉ）に罹患し ていると、臨床学的に診断された。この疾患から、慢性肝臓障害に至ることもあ る。

Ａ型肝炎つィルスｆＩＩＡＶ）　、Ｂ型肝炎つィルスｔｌｌＢＶ）　、及びＤ型 肝炎ウィルス０ＩＤＶ）は、肝炎誘発ウィルスとして良く知られており、各々、 免疫学的に特徴があって、別科のウィルスに属し、独自のウィルス構成、タンパ ク質構造、そして複製機構を持っている。

ＮＡにＢ）Ｉウィルスを、既知の肝炎ウィルスのいずれかとのゲノムの類似性に よって同定しようとした試みが、失敗したことからＮＡＮＢＩＩが独自の構成、 構造を持つことが示唆された。

［Ｆ＋ｖｌｅｒ、　ｅｌ　ｔｌ、、　１．１ｌｅｄ、　Ｖｉｏｌ、、１２：２０ ５−２Ｈ（１９８３）及びＷｅｉｎｅｒ、ｅｌ　＊１．、　１．Ｍｅｄ、　Ｖｉ ｏｌ、、　２１：　２３９−２４７　（１９８７）］。

１１ＡＩＩＢＩＩに関連する抗原を正確に同定することの雛しさが、ＮＡＮＢＨ に対する特異的抗体を検出するアッセイを開発する上での著しい障害であった。

例えば、Ｗｓ＋ｄｒ、Ｉ　、ｅｌ　ｓｌ　、米国特許第４．１１７０．０７６号 、Ｗ＊ａｄＩ、ｅｌ　ｓｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎ自ｔ’１．　Ａｃ５ｄ、Ｓｃｉ、。

Ｍｒｄ、Ｖｉｔａｌ、　２０：４３−５６　（１９０）、５ｔｔｏ、　Ｂ、、　 ｅｌ　ｓｌ、、米国特許出願第０７／２３４．６４１号（Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐｓｒ ｌ＋＋＠＋ｔ　ｏ！　Ｃｏｍｍｅｎｃｅ　Ｎ畠１ｉｏａｔｌＴｅｃｂｎｉｃｉｌ 　ｌ＋ｔｏ＋ｍｔｌｉｏｎ　５ｓｒｖｉｃｅ、　Ｓｐ＋１ａ（Ｉｉｅｌｄ、　Ｖ ｉ＋ｇｉｅｉｓＮｏ、　８９Ｎ８１６８より入手可）　、１９９８年１１月３０ 日公開のＴｓｋｘｈｓｔｈｉ。

に、、ｅｌ　烏１．．　ヨーロッパ特許出願第０２９３２７４号、及び５ｅｅｌ ｉＨ。

ｃｌ　＊１．、　のＰＣＴ出願ｐｒｃ／ＥＰＨ１００１２３を参照されたい。

近年、また別の肝炎誘発ウィルスが、　＋１ｏＢｂｌｏｎらにより、１１１．ヨ ーロッパ特許出願公開第ａ　３１も２１も号、１９８９年５月３Ｘ日）。このウ ィルスを記載した関連文献としては、Ｋｕｏ、　Ｇ、。

ｅｌ　ｓｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２４４：３５９−３６１（１９８９）　、及び Ｃｂｏｏ、　Ｑ、、ｅｌｌｌ、、５ｃｉｓａｃｅ、２４４＋３６２−３６４　（ １９１１９）等がある。ＲｏＢｈｌｏｎらは、ＭＡＮ口罹患患者の持つ抗体と免 疫学的に反応する抗原をコードしたＨＣＶ由来ζＤＩＩＡ配列を単離したと報告 し、これによりにＣｖが、ＮＡＮＢＨを引起こす原因ウィルスの一つであること を確定した。

ＨＣｖに関連するＣＤＮＡ配列は、慢性ＨＣｖ感染チンパンジーの血清をプール して得られたＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーから分離された。ｃＤＮ Ａライブラリーは、平均して約２００塩基対からなるｃＤＮＡ配列を含んでいた 。ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、コードされたエピトープがクロ ーン中に発現され、ＮＡＮＢＩＩ歴のある患者の血清中の抗体と結合するものが 選択された。

前記ヨーロッパ特許出願の中で、ＭｏｔｂＩｏｎ、　１１らはまた、幾つかの、 スーパーオキシドジスムターゼ融合ポリペプチド（ＳＯＤ）の製造、及びＩＩｃ Ｖスクリーニングアッセイを開発する上での、これらＳＯＤ融合ポリペプチドの 使用を記述した。ヨーロッパ特許出願に記載されたＳＯＤ融合ポリペプチドの内 、最も複雑なものはｃｌＯＤ−３と称され、アミノ末端にヒトＳＯＤのアミノ酸 １５４個、制限部位ＥｅｏＲ１を含む、合成［ＩＮ＾アダプターの発現に由来す るアミノ酸残基５ 個、クローン化されたＲＣＶ　ｅＤＮＡフラグメントの発現に由来するアミノ酸 ３６３個、そして、　ＭＳ２クローニング・ベクターのヌクレオチド配列由来の カルボキシ末端アミノ酸５個を持つと、記載されている。このポリペプチドをコ ードするＩＩＮ＾配列は、プラスミドを用いて、酵母細胞に形質転換された。形 質転換した細胞を培養し、発現した分子量５４．　ＯＮのポリペプチドは、分別 抽出法により、およそ８０％の純度にまで精製された。

３０１１−１１ＡＮａ　及び５ＱＩＩ−ＮＡ１１８８．と称されルソノ他（Ｄ　 ＳＯＤ融合ポリペプチドは、組換えバクテリア内で発現された。大腸菌融合ポリ ペプチドは、分別抽出法、また陰イオン及び陽イオン交換カラムを用いる、クロ マトグラフィーにより、精製された。

この精製法により、純度約８０％の５００−ＮＡＮＢ　、純度約５０％の５ＯＤ −ＮＡＮｏ、８が製造できた。

ＦＩｏＢＮｏｅ、　Ｍ、らによって記述された、組換えＳＯＤ融合ポリペプチド は、マイクロタイター・ウェルまたはポリスチレン・ビーズにコーティングされ て、血清サンプルのアッセイに用いられた。簡潔に言えば、コーティングしたマ イクロタイター・ウェルは、希釈サンプルと共にインキュベートされた。インキ ュベーシツン後、マイクロタイター・ウェルを洗浄して、放射性同位体で標識し たヒツジ抗ヒト抗体か、またはマウス抗ヒト１πＧ−ＩＩＲＰ　（西洋ワサビペ ルオキシダーゼ）結合体を用いて、発色／現像した。これらのアッセイは、後急 性期及び慢性期双方の、ＨＣｖ感染を検出するために用いられた。

抗原の調製が前述の如くであるため、アッセイでは、サンプルに酵母菌又は大腸 菌抽出物を添加して、サンプル中に存在する酵母菌又は大腸菌抗体との望ましく ない免疫学的反応を防ぐことが特に必要であった。

０＋ｔｈａ　Ｄｉｓｇｅｏｓｌｉｃ　Ｓ７ｇｌｅｍ　Ｉｎｃ、は、ＨＣＶ抗原に 対する抗体を検出する酵素免疫アッセイを開発した。０ｒｔｈｅアツセイ法は三 段階からなり、組換え酵母／Ｃ型肝炎ウィルスＳＯ［ｌ融合ポリペプチドｃｌｏ ｏ−３でコーティングしたマイクルウエル中で行なわれる血清／血漿検査である 。

第一段階では、被検物は、直接テスト・ウェル中で希釈され、一定時間インキュ ベートされる。もし被験物中に、ＩＩｃＶ抗原に対する抗体が存在する場合、マ イクロウェルの表面に抗原−抗体複合体が形成される。抗体が存在しない場合は 、複合体は形成されず、結合しない血漿、血清タンパクは洗浄段階で除去される 。

第二段階では、抗ヒト１．Ｇマウスモノクロナール抗体西洋ワサビペルオキシダ ーゼ結合体を、マイクロウェルに加える。結合体は、抗原−抗体複合体の抗体部 分に特異的に結合する。抗原−抗体複合体が存在しなければ、結合しなかった結 合体は、洗浄段階で除去される。

第三段階では、オルソ−フェニレンジアミン２１１ＣＬ　（ＯＰＤ）と過酸化水 素からなる酵素検出系が、テスト・ウェルに添加される。

結着した結合体が存在すれば、ＯＰＤは酸化されて、着色した最終生成物が出来 る。着色した最終生成物の形成後、希釈硫酸をマイクロウェルに添加、色素形成 検出反応を停止させる。

最終生成物の着色の程度は、マイクロウェル・リーダーで測定される。このアッ セイで、患者の血清及び血漿をスクリーニングすることができる。

ＨＣＹが汚染された血液または血液製剤によって伝染する事があるのは確定して いる。輸血を受けた患者が、輸血後肝炎にかかる率は１０％に達する。この内約 ９０％が、ＩＩｃＶと診断される感染症の結果である。血液および血液製剤によ るＨＣＶ感染を防ぐには、ＨＣＹキャリア、また汚染された血液や血液製剤を識 別する、信頼性が高く感度のよい、特異性のある診断、及び予後のツールが必要 である。それゆえ、サンプル中に、ｉｃｙ抗体の存在を正確に検知する、信頼性 が高く効果的な試薬並びに手法を用いたｔｔｃｖアッセイの必要性がここにある 。

発明の概要 本発明は、ＨＣｖゲノムの明瞭な（６口１ｉＩｌｃｔ）抗原性領域を示す組換え タンパク賀少なくとも一つを、サンプルと接触させることにより、ＨＣｖ抗原に 対する抗体の存在を、サンプル中に検出する改良アッセイを提供する。

合成りＮＡ配列の、分子クローニング及び異種宿主内での発現に由来する組換え 抗原が提供される。簡潔に述べると、ＨＣＶゲノムの明瞭な抗原性領域を示す望 ましいタンパク質をコードした合成りＮＡ配列を、特異的コドン選択によって、 大腸菌での発現のために最適化した。具体的には、ＨＣｖゲノムのＮＳＩの明瞭 な抗原性領域５つを表わす組換えタンパク質について説明する。

タンパク質は、大腸菌ＣＭＰ−にＤＯシンテターゼ（ＣＫＳ）遺伝子とのキメラ 融合体として発現する。プラスミドｐＨｃＶ−７７によって発現される、第一の タンパク質（配列番号１として識別する）は、１（ＣＶのＮＳｌのアミノ酸配列 ３５９−５７９を表わし、他のワサビウイルスのゲノム構成との類似性から、Ｈ ＣＶ　ｃｘｓ−Ｎｓｔｓｉと命名した。

ｐｉ（ＣＶ−７７なる用語はまた、融合タンパク質それ自体を指すのにも用いら れ、その他の組換えあるいは合成手法を使って作られた１ＩＣｖ配列のアミノ酸 ３６５−５７９近辺の、ＮＳ１領域を示すポリペプチドには、ｐＨｃＶ−７７’ という名称を用いることに注意されたい。

その他の組換え手法には、異なる発現系を用いた、ｐＨｃＶ−７７’の作成が含 まれる。ＩＩｃＶの合成ペプチドを作成する手法は、１９８９年１２月２２日に 出願された米国特許出願第４５６．１６２号、及び１９９０年１１月　７日に出 願された米国特許出願第６１０．１８０号に記載されている。これらの米国特許 出願は同−所有権者を享受しており、ともに本明細書中に参考として組入れる。

その次のタンパク質は、プラスミドｐＨＣマー６５によって発現され、　ＲＣＶ ゲノムのＮＳＩ領域のアミノ酸５６５−７３１を表わし、配列番号２として識別 され６、　ｐｌ’１ｃｌ−６５１！ＲＣＶ　ＣＫＳ−ＭＳＩ３２と命名され、プ ラスミドｐｕｃｖ−６５によって発現される。融合タンパク質それ自体もまた、 ｐＨｃｖ−６５と称され、ｐＨＣＹ−６５’は、その他の組換え又は合成手法を 用いて作成されたＨＣｖ配列のアミノ酸５６５−７３１付近を示す、ｌｌ！ｉ− １領域由来のポリペプチドの名称として用いる。その次の組換え抗原（配列番号 ３として識別される）は、ＨＣマ配列のＮＳＩ領域のアミノ酸７１７−８４７を 表わし、プラスミド−１１ｃマー７８によって発現される。融合タンパクはｐＦ ｌｃＶ−７８と称され、ｐｉｃｖ−ｏ’は、その他の組換え又は合成手法を用い て作成されたＨＣＹ配列のアミノ酸７１７−８４７付近を示す、８８−１領域由 来のポリペプチドの名称として用いる。これは、その構築に用いた戦略に基づい て、りｏ　−：／　ＨＣＶ　Ｃ［５−Ｎ５ＩＳ３と命名されり。図４４は、ｉｃ ｙゲノムノ８Ｓ１領域におケルｐＨｃＶ−７７、ｐＨｃＶ−６５、及び−＋１ｃ マー７８）位置を示している。ｐＨｃＶ−８０によって作られる組換え抗原は、 配列番号４とＬｒ識別＊ｔＬ、ＩＩＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳＩＳＩ−ＮＳＩＳＩと命 名される。融合タンパク質それ自体もまたｐＨｃＶ−８０と称され、９１１ＣＹ −８０’は、種々の組換え手法を用いて作成されたＩＣマゲノムのアミノ酸３６ ５−７３１を示すＨＣｖのＮＳ１領域に位置するポリペプチドを指す。

図４５は、ＨＣｖゲノム内におけるｐｔ＋ｃｖ−ｇｏの位置を示している。

＋１ＣＶ　ＣＫＳ−全長ＮＳＩは、組換えタンパク質ｐｌ’１ｃＶ−Ｂ　（配列 番号５）の名称である。これは、ＩＩＣＶゲノムのアミノ酸３６５−！１４７を 表わす。その融合タンパク質はｐＨｃＶ−９２と称し、ｐｉｔｃｈ−９２’は、 その他の組換え又は合成手法を用いて作成されたＨＣマ配列のアミノ酸３６５− ８４７を表わすＮＳＩ領域由来のポリペプチドの名称として用いる。図４６は、 ＨＣＶゲノム内におけるｐＨＣマー９２の位置を示している。これらの抗原は、 サンプル中の■Ｃｖ抗体の存在を検出する、進歩的なイムノアッセイに用いられ る。

本発明のアッセイ方式の一つは、ＲＣＶ抗原と免疫学的に反応する抗体の存在を 同定するためのスクリーニング・アッセイである。簡潔にいえば、液体サンプル を、常法にて結合させた組的には、抗体−抗原複合体を検出する。スクリーニン グ・アッセイの変法では、固相担体に、更に組換えポリペプチドｃｌＧｏ−３が 含まれる。

別のアッセイ方式は、ＨＣｖ抗原と免疫学的に反応する抗体の存在を明確に同定 するための確認アッセイ（Ｃｏａｌｉｔ■５ｊｏｒ７＊ｓｓ＊７）である。確認 アッセイは、スクリーニング・アッセイで説明した、組換えタンパク質によって 表わされる領域と同じである、ＩＩＣＶゲノムのＮＳＩ領域の内包するエピトー プ類を示す、合成ペプチド又は組換え抗体を含んでいる。これらはｐＨｃＶ−７ ７，９ＨＣＶ−６５、ｐｉｔｃｈ−７８、ｐＨｃＶ−８０及びｐｉｔｃｈ−Ｈ’ ｔ’ある。確認アッセイに用いる組換えタンパク質は、−次スクリーニング・ア ッセイに用いたのとは、異種の起源の抗原でなければならない（即ち、大腸菌に よって誘導される組換え抗原や、一部ＣＫＳ配列からなる組換え抗原であっては ならない）。簡潔にいうと、−次スクリーニング・アッセイで繰返し陽性であっ た被検体が、確認アッセイで再検査される。同一量の被検体を含むアリコートを 、別々に固相担体上にコーティングした合成ペプチドまたは組換え抗原と接触さ せる。最終的には、抗体−抗原複合体を検出する。ポリペプチド、また組換えタ ンパク質は、指示した如く使用出来るし、あるいは、本明細書に、又は「Ｃ型肝 炎アッセイ」という名称で１９８９年【２月２２日に出願された、米国特許出願 第４５６．１６２号に記載されたその他のポリペプチドや組換えタンパクと組合 せて使用できる。この米国特許出願は、同−所有権者を享受しており、本明細書 中に参考として組入れる。

別のアッセイ方式は、陽性結果が誤認でないことを確認するために、サンプルを 用いて第−及び第二の免疫学的に同一のアリコートを作成した液体サンプル中に 、ＨＣＶ抗原と免疫学的に反応する抗体の存在を同定する、競合アッセイ又は中 和アッセ体−ポリペプチド複合体を形成するのに適した条件下、ＲＣＶ抗原のエ ピトープを少なくとも一つ含有する結合ポリペプチドを含む固相担体に接触させ 、また第二のアリコートは、最初に、結合ポリペプチドを含む同じ固相担体に接 触させる。好まし１．１組換えポリペプチドニハ、ｐＨｃＶ−７７、ｐｉｔｃｈ −６５、ｐＨｃＶ−７８、ｐＨｃＶ−８０及びｐｉｔｃｈ−９２カ含マレル。

別のアッセイ方式は、抗体と、少なくとも一つのポリペプチドが、複合体形成す るのに適した条件下、サンプルを、各々ＨＣＶ抗原の明瞭なエピトープを含む組 換えポリペプチドと同時に接触させた後、複合体と発色剤を反応させて、抗体ポ リペプチド複合体を検出することによって、ＢＣＶ抗原と免疫学的に反応する抗 体の存在を同定するイムノドツト・アッセイである。

好ましい組換えポリペプチドとしては、例えば９１１ＣＶ−７？　、ｐＨｃＶ− ６５、ｐＨｃＶ−７８、ｐＨｃＶ−８０及びｐｉｔｃｈ−９２由来の組換えポリ ペプチドが使用された。

全てのアッセイでは、固相担体に吸着されたポリペプチドに、接触する前に、サ ンプルを希釈しておくことが望ましい。サンプルは、全血、血清、血漿、脳を髄 液、またリンパ球や細胞の培養液上清の様な、種々の生物学的サンプルから得る ことができる。固相担体の材質としては、紙やニトロセルロースの様なセルロー ス素材、またポリアクリルアミド、ポリスチレン及び綿の様な天然又は人造高分 子材料、あるいはシリカゲル、アガロース、デキストラン、ゼラチンの様な多孔 質ゲル、並びに不活性化アルミナ、硫酸マグネシウム、及びガラスのような無機 物が利用できる。好適な固相担体材料は、マイクロタイター・ウェル、試験管、 ビーズ、ストリップ、膜、及び極微粒子のような周知の種々の物理的形状で、ア ッセイに使用できる。イムノドツト以外のアッセイでは、ポリスチレン・ビーズ を固相担体として用いることが好ましい。イムノドツト・アッセイでは、ニトロ セルロースを固相担体として用いることが好ましい。

本発明のアッセイにおいて、抗体−抗原複合体を検出する手法及び試薬として適 当なものは、市販されているか、あるいは関連技術として知られている。代表的 手法としては、酵素、放射性同位体、蛍光試薬、発光試薬、あるいは化学発光試 薬の様な検出試薬を用いることができる。これらの試薬は、既知の手順に従って ハプテン標識抗ハプテン検出系の作成に使用でき、例えば、ビオチン標識抗ビオ チン系は、抗体−抗原複合体の検出に使用できる。

本発明はまた、固相担体に結合した、ＩＩＣマ抗原のエピトープを少なくとも一 つ含有しているポリペプチド、及び必須のサンプル調製試薬、洗浄剤、検出試薬 、そしてシグナル生成試薬を含む、アッセイ・キットも包括している。

目下好適な実施態様において本発明を説明する以下の詳細な説明を考慮すれば、 本発明のその他の態様及び利点は、当業者には一目瞭然であろう。

本発明の構築物に有用なプラスミドを含んだ大腸菌株類は、Ａｓ＠＋ｉｃ＊ｓ　 τ１ｐ＊　Ｃ＊ｌｔ＋ｒｅ　Ｃａ１ｌｅｅｔｉｏｓ、　Ｒｏｃｋｗｉｌｌ！、　 Ｍｓｒ７１　■ｄに１９９０年８月１０日１．：寄託され、ＡＴＣＣ６１１３１ ０（ｐＨｃＹ−２３）、ＡＴＣＣ６０８１（ｐｌ’１ｃＶ−２９１、ＡＴＣＣ６ ８３８２（ｐＨｃＹ−３１１、ＡＴＣＣ６１１３ｇ３（ｐＨｃマー３４）の受託 番号を得、また構築物に有用なプラスミドを含んだ大腸菌株類は、１９９０年１ １月　６日に寄託され、ＡＴＣＣ６１１４５８（ｐＲｃＹ−５０）、ＡＴＣＣ６ ８４５９（ｐＨｃＶ−５７）、ＡＴＣＣ６８４６０（ｐＨｃＶ−１０３１、ＡＴ ＣＣ６８４６１（ｐＨｃＹ−１０２）、ＡＴＣＣ６８４６２（ｐＨｃＹ−５１） 、ＡＴＣＣ６８４６３（ｐＨｃＶ−１０５）、ＡＴＣＣ０４６４（ｐＲＣマー１ ０７１　、ＡＴＣＣ６８４６５（ｐＨｃＶ−１０４）、ＡＴＣＣ６８４６６（ｐ ＨｃＶ−４５）、ＡＴＣＣ６８４６？　（ｐＨｃＶ−４８）、ＡＴＣＣ６ｇ４６ ８　（ｐＨｃＶ−４９）、ＡＴＣＣＮ４６９　（ｐＨｃＶ−５８）、及びＡＴＣ Ｃ６ｇ４７６　（ｐＨｃＶ−１０１）の受託番号を得た。本発明の構築物に有用 なプラスミドを含んだ大腸菌株類は、１９９１年９月２６日ニ＾、Ｔ、Ｃ，Ｃ， １，ｍＷ託すｔ’Ｌ、ＡＴＣＣ６８６９０ｆｐＨｃＹ−７７）、ＡＴＣＣ６８６ ９６（ｐＨｃＶ−６５）　、　ＡＴＣＣ６８６８９（ｐｌ’１ｃＶ−７８）、Ａ ＴＣＣ６８６８８ｆｐＨｃＶ−８０）、及びＡＴＣＣ６８６９５（ｐ）ＩＣＶ− ９２）ノ受託番号を得た。

図面の簡単な説明 図１は、ＩＩＣｖゲノムを示す。

図２は、ＨＣｖ接種チンパンジーにおける抗体の存在を同定するための、組換え ポリペプチドの使用を示す。

図３は、ｐＨｃＶ−３４及びｐＩＣＶ−３１抗原を用いてスクリーニング・アッ セイを行った場合の、感度及び特異性の向上を示す。

図４は、プラスミドｐＨｃＶ−３４の構築を示す。

図５は、融合タンパク質ｐＨｃＶ−３４を示す。

図６は、大腸菌中でのｐＨｃＹ−３４の発現を示す。

図７は、プラスミドｐＨｃＹ−２３の構築を示す。

図８は、プラスミドｐＨｃＶ−２９の構築を示す。

図９は、プラスミドＰＩＩＣＶ−３１の構築を示す。

図１０は、融合タンパク質ｐＨｃＶ−３１を示す。

図１１は、大腸菌中でのｐＨｃＹ−２９の発現を示す。

図１２は、大腸菌中でのｐＨｃＶ−２３の発現を示す。

図１３は、大腸菌中でのｐＨｃＶ−３１の発現を示す。

図１４は、ｐＨｃＶ−３４を用いてスクリーニング・アッセイを行った場合の、 感度の向上を示す。

図１５ハ、ｐＨｃｙ−ａ４及びｐＨｃＶ−３１’ｆｔＪＩＨ’テスク’Ｊ−ニン ク・アッセイを行った場合の、特異性の向上を示す。

図１６は、血液透析患者における、スクリーニング及び確認アッセイの結果を示 す。

図１７は、スクリーニング・アッセイを行った場合の、血液透析患者におけるＩ ＩｃＶのより早期の検出を示す。

図１８は、急性）ＩＡＮＢＩＩ罹患個体からのサンプルを、ｐＨｃＶ−３４及び ｐＨＣマー３１を用いてスクリーニング・アッセイした結果を示す。

図１９は、図１８と同じ被験群における確認アッセイの結果を示す。

図２０は、慢性１１ＡＮＢｌ’ｌ感染個体におけるスクリーニング及び確認アッ セイの結果を示す。

図２１は、Ｉ（ＣＶイムノドツト・アッセイのための、好適な緩衝液、１ｌｌＩ 条件、及びスポツティング濃度を示す。

図２２は、ＩＩＣマイムノドット・アッセイの結果を示す。

図２３は、融合タンパク質ｐｆｌｃＶ−４５を示す。

図２４は、大腸菌におけるｐＦＩｃＶ−４５の発現を示す。

図２５は、融合タンパク質ｐＨｃＶ−４８を示す。

図２６は、大腸菌における。ＩＩｃＶ−４８の発現を示す。

図２７は、融合タンパク質ｐＨｃＹ−５１を示す。

図２８は、大腸菌におけるｐＨｃＶ−５１の発現を示す。

図２９は、融合タンパク質ｐＨｃＶ−５４を示す。

図３０は、大腸菌におけるｐＨｃＹ−５０の発現を示す。

図３１は、融合タンパク質ｐＨｃＹ−４９を示す。

図３２は、大腸菌におけるｐ［ｌｃマー４ｇの発現を示す。

図３３ハ、ｐＨｃＶ−２３、ｐＨｃＶ−４５、ｐＨｃＶ−４８、ｐＨｃＹ−５１ 。

ＩＨｃＶ−５０及びｐＨｃＶ−４９のイムノプロットを示す。

図３４は、融合タンパク質ｐＨｃＶＪ４　、ｐＨｃＶ−５？　、ｐＨｃＶ−５８ ’ｆｔ示す。

図３５は、大腸菌におけルｐＨＣＶ−２４、ｐＨｃＹ−５７及びｐ＋＋ｃｖ−ｓ ｓ　（７）発現を示す。

図３６は、融合タンパク質、ＨＣＶ−１０５を示す。

図３７は、大腸菌におけるｐＨｃＶ−１０５の発現を示す。

図３８は、融合タンパク質ｐＨｃＶ−１０３を示す。

図３９は、融合タンパク質＋１＋１ｃＶ−１０１を示す。

図４０は、融合タンパク質ｐＨｃＶ−１０２を示す。

図４１は、大腸菌におけるｐＨｃＶ１０２の発現を示す。

図４２は、融合タンパク質ｐｌ（ＣＶ−１０７を示す。

図４３は、融合タンパク質９１１ＣＶ−１０４を示す。

図４４ハ、ＦＩＣＶ　’ｆ／　Ａ１７）ＮＳｌ領域、特ｉ、：ｐＨＣＶ−７７、 ｐＨｃＶ−６５及びｐＨｃＶ−７８の位置を示す。

図４５は、ＩＩＣＶゲノムのＮＳｌ領域、特にｐＨｃマー８０の位置を示す。

図４６は、ＩＩＣマゲノムのＮＳｌ領域、特にｐＨｃＶ−９２の位置を示す。

図４７Ａは、大腸菌におけるｐｅｃｖ−７７の発現を示し、また図４７Ｂは、大 腸菌におけるｐｉＩｃｙ−ｙｙのイムノプロットを示す。

図４８Ａは、大腸菌におけるｐＨｃＹ−６５の発現を示し、また図４８Ｂは、大 腸菌におけるｐＨｃＶ−６５のイムノプロットを示す。

図４９Ａは、大腸菌におけるｐＨｃｖ−ｉｎの発現を示し、また図４９Ｂは、大 腸菌におけるｐＨｃｖ−［１Ｇのイムノプロットを示す。

発明の詳細な説明 本発明は、サンプル中で、ＩＩｃＶ抗原に対する抗体を検出するためのアッセイ に関する。ヒト血清または血漿は、望ましくはサンプル希釈液で希釈され、ＩＩ ＣＶゲノムの明瞭な抗原性領域を示す組換えポリペプチドでコーティングされた ポリスチレン・ビーズと共にインキュベートされる。もしサンプル中に抗体が存 在する場合、それらは、抗原性ポリペプチドと共に複合体を形成し、ポリスチレ ン・ビーズに結合される。複合体形成後、結合しない物質及び試薬は、ビーズの 洗浄により除去され、ビーズ−抗原−抗体複合体は、西洋ワサビペルオキシダー ゼで標識した、ヒト抗体に対するヤギ抗体を含んだ溶液と反応させられる。次い で、このペルオキシダーゼ酵素は、すでにビーズに固定された抗原−抗体複合体 に結合する。最終反応では、西洋ワサビペルオキシダーゼは、オルソ−フェニレ ンジアミン及び過酸化水素と接触し、黄橙色に発色する。色の濃さは、最初にビ ーズに固定した抗原と結合する抗体の量に比例する。

ＨＣｖの抗原性エピトープを持つ、望ましい組換えポリペプチドは、免疫学的に 反応性のある他の既知物質と類似のアミノ酸配列を有し、且つ、免疫学的に何ら かの反応性を持つと同定されたポリペプチドをコードするＩＩｃＶゲノムの一部 より選択された。（ポリペプチドの免疫学的反応性は、最初に、ＨＣｖゲノムの ｃＤＮ、Ａフラグメントで形質転換させた大腸菌クローンの細胞抽出物と、ＩＩ ｃＶ感染血清とを反応させて確定した。ｅＤＮ＾を取込んだクローンによって発 現されたポリペプチドは、ＩＩＣＶ抗原に対する抗体を含んでいることが分って いる血清と免疫学的に反応した。）しかし、所与のアミノ酸配列の分析からは、 免疫学的反応性を予知する上での大まかな手掛かりしか得られない。所与のアミ ノ酸配列を作成し、アッセイ中でその疑わしい配列をテストする以外には、免疫 学的反応性を確定する一定不変の予想法は無い。

１１ＣＶ抗原に対する抗体の存在を検出するための、ＩＩＣＶゲノムの明瞭な抗 原性領域を表わす組換えポリペプチドの使用は、図２に示されている。チンパン ジー？ｎのＩＩＣｖ感染の経過は、組換えポリペプチドｃｌＧＯ−３を使った１ つのアッセイ、及びプラスミド９ＨＣＶ−３４とｐｉｃｖ−ｓ＋によって各々発 現される２つの組換え抗原ＣＫＳ−Ｃｏｒｅ　（ｐＨｃＹ−３４）　（配列番号 ６及び７）及びｐＨＣＶ−３３ｃｍ１１ＣＤ（ｐＨＣＶ−３１１（配列番号８及 び９）を用いた改良アッセイによってフォローされた。組換えタンパク質ｐ１１ ｃＶ−３４とｐＨｃＹ−３１を用いたアッセイでは、ｃｌｏｏ−３を使ったアッ セイによる抗体検出の３週間前に、血漿中の抗体が検出された。

Ｐ■及び他の６匹のチンパンジーにおけるＩＩｃＶ惑染の経過を、上記二つのア ッセイを用いてたどった研究結果は、図３に要約されている。両アッセイとも接 種前は、結果は陰性であり、また実験動物がＩＩｃＶに感染した後は、両アッセ イともに抗体の存在を検知した。しかしながら、２つのアッセイを比較すると、 ７匹のチンパンジー中６匹で、ｐＨｃＶ−３４とｐＨｃＶ−３１を用いた改良ス クリーニングが、ＨＣｖ抗原に対する血清転換（＊ｅｒｏｃｏａマｅロ１ｏｉ） を、より早い時期か、同様の採血臼に検出した。これらチンパンジーにおける研 究データは、ｐＨｃＶ−３４と９８ＣＶ−３１タンパク質を用いたアッセイによ って、ＩＩＣＶ抗体の全般にわたる検出が大きく向上することをはっきり実証し ている。

このテストの感度は充分に高く、ＡＬＴレベルの上昇で定義される、この疾患の 急性期における血清転換を、はとんどの動物で検出できる。同様に重要なことは 、接種前の検体が反応性を全く示さなかったという、テストの特異性の高さであ る。

本発明の実施に有用なポリペプチドは、組換え技術を用いて作製される。所望の ポリペプチドをコードしたＤＮＡ配列は、完全な所望配列のフラグメントから組 立てられることが望ましい。

ＨＣｖゲノムの合成りＮＡフラグメントは、対応するアミノ酸配列に基づいて合 成できる。ひとたびアミノ酸配列が選択されると、選択した系での発現を容易に するのに最適なコドンを用いて、相補ＤＮＡ配列を決定するために、そのアミノ 酸配列を逆翻訳する。一般に、フラグメントは、良く知られた自動的方法及び装 置を用いて作成される。完全な配列が形成された後、求む配列は、発現ベクター に取込まれ、それは宿主細胞に形質転換される。次いでＤＮＡ配列は、宿主細胞 によって発現されて請求むポリペプチドが形成され、それは宿主細胞から、ある いは宿主細胞の培養液から採集できる。組換え技術を用いて、より小さなペプチ ドを作る場合、求むポリペプチドの、幾つかのコピーをコードした、鎖状に繋が った単一のＤＮＡ配列を作成したほうが好都合なこともある。次いで、長い鎖を 単離して、より短い所望の配列に切断する。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の手法を用いて、　Ｈｃｖゲノムのあらゆる部 分から、ｐｃ＋＋増幅遺伝子を得ることも可能である。

増幅遺伝子は、次いでクローン化して、合成遺伝子と同様の仕方で、発現させる ことができる。

ベクター系として使用できるものは、例えば植物、細菌、酵母菌、昆虫、及び哺 乳類の発現系である。コドンは、使用する系での発現のために最適化されること が望ましい。

望ましい発現系では、組換えＨＣＶタンパク質が、大腸菌酵素ジル・トランスフ ェラーゼ、又はＣ１１Ｐ４ＤＯシンテターゼ）の融合タンパク質として発現され る融合系のためにキャリアー遺伝子が利用される。タンパク質合成のＣＫＳ法は 、Ｒｏｌｌｉｎｇ（ＥＰ０８９１０２Ｎ８２）によって、１９８８年３月１１日 に出願された米国特許出願第１６７、０６７号、及び１９８８年１１月２３日に 出願された同第２７６、２６３号に開示されている。これらは同−所有権者を享 受しており、本明細書中に参考として組入れる。

利用できる他の発現系としては、強力なラムダＩ’Ｌプロモーター、強力な３− フレーム翻訳ターミネータ−ｒ＋ｎＢ１１、及びＡＴＧコドンでの翻訳開始を含 むことを特徴とする、ラムダＰＬベクター系が挙げられる。

本発明では、問題の組換え）ＩＣＹ抗原をコードするアミノ酸配列は、大腸菌で の高い発現レベルを容易にするように最適化したコドンを用いて、逆翻訳される 。個々のオリゴヌクレオチドは、ＬＩｌｄｅｃｋｉ　（ＥＰＯ８？！０９３５７ ．　ｌ）によって、１９８６年　７月　８日ζこ出願された米国特許出願第８８ ３．２４２号に開示された、オリゴヌクレオチド特異的二本鎖切断修復法（ｏｌ ｉｌｏｌＩｗｃｌｅｏｔｔｄｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄｄｏｌｂｌｅ−＋Ｉ＋ｇｎｄ ｅｄ　ｂ＋ｅｓｋ　＋ｅｐｉｉ＋）によって合成される。この米国特許出願は、 同−所有権者を享受しており、本明細書中に参考として組入れる。あるいは、個 々のオリゴヌクレオチドは、＾ｐｐｌｉｅ＋ｌ　Ｂｉｏｓｙ＋ｌｅｍ　３８０Ａ 　ＤＮＡ合成機により、製造元の勧める手法と試薬を用いて合成することもでき る。個々のオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は、Ｓ思ロｇｅ＋ジデオキシ鎖終結 法（Ｓｔｅｇｅｒ　ｅｌｌｌ、、］、　Ｍｏ１ｅ、Ｒｉｏｔ、、１６２４２９　 ｆ１９Ｂ２）　）により確認された。

これら個々の遺伝子フラグメントは、次いでアニール及び連結されて、ＣＫＳ融 合ベクターｐ＋０２００において、ＥｅｅＲＩ−ＢｘｍＲＩサブフラグメントと してクローニングされる。次いで、生じたＤＮＡ配列を５ｓＢｅ＋ジデオキシ鎖 終結法により確認した後、サブワラベクター９１０２００内に番嚇キ樗、Ｅｃｏ Ｒｌ−ｈｓ）Ｉｆフラグメントとしてクローニングした。得られたクローンは、 ＣＫＳ　（ＣＭＰ−ＫＤＯシンテターゼ）遺伝子の３′末端に挿入されたＥｃｏ ＲＩ−Ｂｓｓｌｌｌフラグメントから成るハイブリッド遺伝子を同定するために 、マツピングされた。ｌｅｅプロモーターの調節下、生成した融合タンパク質は 、ＩＩｃＶの様々な領域に融合したＣＫＳタンパク質のアミノ酸２３９個より構 成される。

組換えポリペプチドの合成、クローニング及び性状確認、並びにこれらポリペプ チドを用いたアッセイの好ましい方式は、以下の実施例に示されている。実施例 １及び２は、各々、　ＣＸ５−Ｃｏｒｅ及びＣｌＳ−３３−ＢＣＤの合成とクロ ーニングについて説明している。実施例３は、スクリーニング・アッセイの説明 、実施例４は、確認アッセイの説明である。実施例５は、競合アッセイの説明で ある。実施例６は、イムノドツト・アッセイの説明であ６、実施例７　＋ｌＣＶ 　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｅ％Ｃ［Ｓ−１１ｓｓＦ、　ＣｌＳ−１１３５Ｇ、　ＣＫＳ− ＮＳＳＩＩ及びＣＫＳ−ＮＳ５１の合成とクローニングを説明している。実施例 ８はｉｃｖ　ｃｘｓ−ｃｔｏｏベクターの調製の説明である。実施例９は、ＩＣ マＰＣＩ誘導の発現ベクターの調製を説明する。実施例【０は、ＮＳＩのｐＨＣ マー７７の合成と特性分析の説明である。実施例１１はＮｉｌのｐＨｃＶ−６５ の合成と特性分析の説明である。実施例１２はＮＳＩのｐＨｃＶ−７８の合成と 特性分析の説明である。実施例１３はＮＳＩのｐｆｌｃＶ−１１０の合成と特性 分析の説明である。実施例１４はＮＳＩのＩＩＦＩｃマー９２の合成と特性分析 の説明である。

試薬及び酵素 Ｌｓｒｉｓ−Ｂｓｒｌｓｍｉ　（ＢＬ）、及びＳｗｐｓｒｂｒｏｌｌ＋ＩＩ　（ ひｒｉ　Ｆｅｒ＋＋ｌ　の様な培地は、Ｇｉｂｅｓ　Ｌｓｂｏｒｓｌｏｒｉｅｓ 　Ｌｉ１ｅ　ＴｅｃｈａｏｌｏｌｉｅＩ、Ｉ＋ｃ、。

１ｌｌｓｄ＋ｓｏｅ　Ｗ＋ｔｃｏ■＋ａより入手した。制限酵素、ＤＮＡポリメ ラーゼ■のフレノウフラグメント、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチ ドキナーゼ、核酸分子量スタンダード、ＭＵ塩基配列決定システム、Ｉ−ｒｔｌ （５−ブロモ−４−クロロ−３−インドニル−ベーターローガラクトシド）　、 ＩＰＴＧ　（イソプロピル−ベーターローチオガラクトシド）、グリセロール、 ジチオスレイトール、４−クロロ−１−ナフトールは、Ｂｏｅｂｒｔａｌｅｒ　 ｌ１ｘｉａｈｓ＋ａＢｉｏｅｂｅｓｉｃｓｌｓ、Ｉ＋ｄ目ｍ＊ｐａｌｉｔ、Ｉｎ ｄｉｓ＋＋＊　Ｎｅｗ　Ｅｓ（ｌｓａｄ　Ｂｉｏｌ＊ｂｔ。

ｌｌ１ｃ、、　Ｂ＊ｙｅｒｌｙ、　Ｍｘ＊ｓ＊ｃｈＩｓｅ目１、またはＢｓｔｋ ｅｇｄｓ　ＬＩｅ＊＋ｃｂＬｘｂｏｒｓｌｏｔｉｅｓ　Ｌ百ｅ　ＴｅｃｂＩｌｏ ｌｏＨｉｅ３　！＋ｃ、、　Ｇ畠１ｔｋｅｒｔｂ＊ｒＨ。

Ｍｓｒ７１＊ａｄより購入した。前染色タンパク質分子量スタンダード、アクリ ルアミド（結晶、電気泳動等級９９％以上）、Ｎ、Ｎ’−メチレン−ビス−アク リルアミド（ＢＩＳ）　、Ｎ、　Ｎ、　Ｎ’、　Ｎ’　−ｆ　ト５　／チレンジ アミン（ＴＥＩＩＥＤ）　、及びドデシル硫酸ナトリウムは、ＢｉｏＲ＊ｄ　Ｌ ｓｂｏｒＩｌｏ＋ｉｓｔ、ＲｉｅｈｍｏＩｌｄ、Ｃｓ１ｆｏ＋ｓｉ＊より購入し た。リソチーム及ヒアンヒシリンハ、５ｔ１ｓｒｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 、　５１゜Ｌｏｗ目１Ｍｉｓｔｏｗｒｉより入手した。西洋ワサビペルオキシダ ーゼ（ＦＩＲＰＯ）標識二次抗体はＫｉｔｋｅＨｓｒｄ　＆　Ｐｅ＋ｒ７　Ｌｓ ｂｏｒ＊ｌ＋ｔｉｓｓ。

Ｉａｃ、、　Ｇｅ山、山川１Ｍ１．山、ｄより入手した。Ｓ、山ｑａｅ■アガロ ース（低融点アガロース）は、ＦＭＣＢｉｏｐｒｏＬａｅｌｓ。

Ｒｏｃｋｌ＊ｍｄ、Ｍｔｉａｓより購入した。

７５０Ｅ１Ｇは、５０５Ｍのトリス（Ｔｈ口）、ｐＨ８，０ｓ　及びＩＧｓＭの ＥＤＴ＾を含有する。ＩＸＴＧは、ｌｏｏｍＭのトリス、ｐＨ７、５及び１０％ グリセロールを含む。２ｘ　ＳＤＳ／ＰＡＧＥローディング緩衝液は、１５％の グリセロール、　５％のＳＯ５、ｌｏｏｓＭのトリス塩基、１Ｍのベーターメル カプトエタノール及び０．８％のブロモフェノール・ブルー染料からなる。ＴＢ Ｓは５０■ＶのトリスｐＲ８，０，及び１５１１ｉＭの塩化ナトリウムを含む。

ブロッキング溶液は、Ｃ，５ｔｎｓ目ｏｎ無脂肪粉ミルクの丁１１Ｓ中５％溶液 である。

宿主細胞培養物、ＤＮＡ供給源及びベクター大腸菌ＪＭ１０３細胞、クローニン グ・ベク９−　ｐｃＵ８、ｐＨｃ１Ｂ、ｐＵｃ１９及びＭＩ３は、Ｐ１ｒｍ＊ｃ ｉＩＬＫＢ　ＢｉｏｊｓｃｈａｏｌｏＢ、Ｉｎｃ、。

Ｐｉｓｃｓｌ＊ｖｓｙ、　Ｎｅｗ　Ｊ＊＋ｓＢより購入した。Ｃｏ５ｐ＊ｊｓｓ ｌＥｐ＋ｃ＋＋ｚｓａＴＭ大腸菌株、ＩＬＩ−Ｂｌｗｅ及び１１１１０９は、Ｓ 山ｌＢ＊ｎｅＣＩｏｓｉＢ　Ｓ７ｔ＋ｅｓ３　Ｌ＊１ｏｌｌｓ、　Ｃ＊Ｉｉ篩ｒ ａｉ１より購入した。ＩＩＲＩ細胞は、Ｃｏ１１　Ｇｅｎ＠１ｉＣ５ｔｏｃｋ　 Ｃｅ＋ｊｅｒ、マ＊Ｉｓ　Ｕａｉｗｅ＋’ｔｉ＋７．　ＮｅｗＨｓｗ＜３　Ｃｏ ＋＋ａｅｃｌｉｃｓｔより、大腸菌ＣＡＧ４５６細胞は、Ｕｍｉｔ＊ｔｓ目ｙｏ Ｉ　Ｗ口ｃｏａｓ＋ａ、ＭＩｄ＋ｓｏｎ、Ｗ目ｃｏａＳ＋ａのＤ＋、Ｃｅｔｏｌ 　Ｇｒｏｓｓより入手した。ベクター＋１ＲＫ２４Ｂ、ｅｌｌｓは、Ｕｎｉｗｅ ｒｓｉｊＦｏｌ　Ｃ・１ｉｌｏｔａｉｉ。

Ｓｇｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃｓｌ目ｏ＋ａｉｇのＤｒ、Ｄｏｎｓｌｄ　Ｒ，Ｒｅ１ｉ ■ｋｉより入手した。

一般的手法 制限酵素による消化はすべて、メーカーの指示に従って行った。ＤＮＡ１マイク ログラム当たり、最低５単位の酵素を使用し、ＤＮＡを完全に消化するまで、充 分にインキュベートした。ミニセル溶解物（ｓｉＩｌｉｃｅｌｌ　１７ｔ＊ｔｅ ）ＤＮＡ調製物、フェノール−クロロホルム抽出、ＤＮＡのエタノール沈澱、Ｄ ＮＡのアガロース上での制限分析、ＤＩＩＡフラグメントの低融点アガロース− ゲル精製は、１９Ｈ］　）。大腸菌株からのプラスミドの単離には、アルカリ溶 解法と、塩化セシウム−エチジウム−ブロマイド密度勾配法（Ｍｓｍｉｓ目Ｉｅ ｌ　ｓｌ、上掲）を用いた。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼとＴ４ポリヌクレオチドキナ ーゼには、標準の緩衝液を用いた（Ｍｓｍｉｓｌｉｓ＊Ｉｚ１　上掲）。

実施例１．　ＣＫＳ−ＣＯＲＥ クローニング・ベクターｐＪＯ２０Ｇは、組換えタンパク質をＣＫＳタンパク質 に融合させる。このプラスミドは、改変された１１ｅプロモーターが（ＣＫＳタ ンパク質の大腸ｍ　ＣＭＰ−Ｋｉｌｏシンテターゼの全アミノ酸２４８個の内、 最初の２３９個をコードする）　ＫｄｓＢ遺伝子フラグメントに融合したプラス ミドｐ８Ｒ３２２、及びＫｄ＋８遺伝子フラグメント末端に融合した合成リンカ −より構成されている。クローニング・ベクターｐＪ０２００はベクターｐＴ８ ２１０の改変体である。合成リンカ−には、遺伝子挿入のための多重制限部位、 翻訳停止シグナル、そして１ｒｐＡ　ｒｈｏ−非依存性転写ターミネータ−が含 まれる。ＣＫＳ法によるタンパク質合成、及びｐＴＢ２１０を含むＣＫＳベクタ ーは、Ｒｏｌｌｉｎｇ（ＥＰｏ　８９１０２９２８２）により、１９８８年３月 １１日に出願された米国特許出願第１６７、０６７号、及び１９８８年１１月２ ３日に出願された同第２７６、２６３号に開示されている。

これらの米国特許出願は、同−所有権者を享受しており、本明細書中に参考とし て組入れる。

Ｂ、　ｌ’ｌｃＶ　ＣＫＳ−Ｃｏｒｅ発現ベクターの調製１１ｃＶゲノムのアミ ノ酸１−１５０を表わす独立した６個のヌクレオチドは共に連結され、図４に示 した様に、ＣＫＳ融合ベクター９１０２００中に、ＥｃｏＲＩ−Ｂ＊ｓＨＩフラ グメントの４６６の塩基対としてクローニングされた。ｐＨｃＹ−３４と命名さ れた、このプラスミドの完全なりＮＡ配列、及び産生された組換え抗原ｐｌＴｃ Ｖ−３４の全アミノ酸配列は、配列番号６と７に示した。その結果生じた融合タ ンパク質ＨＣＶ　ＣＫＳ−Ｃｏｔｅは、図５に示した様に、ＣｘＳのアミノ酸２ ３９個と、リンカ−ＤＮＡ配列起源のアミノ酸７個、及びＲＣＹの最初のアミノ 酸１５０個から構成される。

プラスミドｐＨｃＶ−３４、及びＣＫＳプラスミド、Ｔ８２１０は、塩化カルシ ウム法によって、受容能を持たせた大腸菌に一１２株の！Ｌ−ＩｆｒｅｅＡＩ、 　ｅｎｄＡｌ、　１７＋＾９６．　ｊｂｉ−１，ｂ＋ｄ　ＲＩ７．　ｓｗｐＥ４ ４．　ｒｅｔ＾Ｉ、　ｌｓｃ／Ｆ’。

ｐｒｏ　ＡＢ、　Ｉ＊ｃｌｑ！ＤＭＩ５．　ＴＮＩＯＩ細胞に、形質転換された 。これらの構築過程で、ＣＫＳ融合タンパク質の発現は、１８ｃプロモーターの 調節下にあり、ＩＰＴＧの添加によって誘発される。これらプラスミドは、独立 した要素として複製され、不動化可能であり、１細胞当たり約１０−３０コピー の割合で保持された。

Ｃ１組換え）ＩＣＹ−Ｃｏｔｅの特性分析クローンｐＨｃＶ−３４が、唯一のＩ ＩＣマーＣＫＳ　Ｃｏｒｅタンパク賀を発現していることを確定するため、ｐＨ ｃＹ−３４／ＩＬ−１培養株を、酵母抽出物、チロシン、リン酸塩、グルコース 、及びアンピシリンからなる成長培地中、３７℃で一晩培養した。培養液が、Ｏ ［１６００で１．０に達したところで、発現を誘導するために、ＩＰＴＧを最終 濃度で１冒−になるように添加した。サンプルｆ１．５ｍ１）を、１時間間隔で 採取し、細胞をペレット状にした後、２ｘ　ＳＤＳ／ＰＡＧＥローディング緩衝 液中に、０Ｄ６０Ｇが　１．０になるように再懸濁した。

調製サンプルのアリコート（１５ｔ１１）を、二重にセットした１２．５％ＳＤ Ｓ／ＰＡＧＥゲル上で分離した。

ゲルの一つを、室温で２０分間、５０％メタノール／１０％酢酸の溶液にて固定 した後、５０％メタノール／１０％酢酸溶液中０．２５％クマシー・ブルー染料 を用いて３０分間、染色した。脱色は、ｌＯ％メタノール／７％酢酸溶液を用い て３−４時間、又は背景が透明になるまで行った。

図６は、大腸菌におけるｐｉ（ＣＭ−３４タンパク質の発現を示す。

分子量標準は、レーンＭにて泳動した。レーン１には、Ｉ（ＣＶ配列を含まない ＣＫＳベクター、ｐ１０２００プラスミドが含まれている。

左の矢印は、上から下に、１１０．００１１．　８４．０００．　４７，０００ ．　３３．ＧＯＯ。

２４、　ｆｌｏｅ、及び１６．０００ダルトンの分子量マーカーの移動度を示し ている。右の矢印は、組換え１（Ｃ４タンパク質の移動度を示している。レーン ２には誘導前の、そしてレーン３には誘導３時間後の、ＣＫＳ−Ｃｏｒｅ　（ア ミノ酸１−１５０　）を発現する９１１ＣＶ−３４を含有する大腸菌溶解物が含 まれている。その結果、組換えタンパク質ＰＨＣＶ−３４は、分子量４８．００ ０ダルトンに相当する、見かけの移動度を有していた。これは、予想された分子 量４３．７５０ダルトン七比較できる許容可能な値である。

もう一つの１２．５％ＳＯ５／ＰＡＧＥゲルからのタンパク質は、イムノプロッ ト用に、電気泳動的にニトロセルロースに転写した。

その転写タンパク質を含んだニトロセルロース紙を、ブロッキング溶液と共に１ 時間インキュベートし、そして大腸菌に一１２株ＸＬ−１溶解物を含むＴｌｌ５ で希釈したＩＩｃＶ患者血清と共に、４℃で一晩インキユベートした。ニトロセ ルロース紙を、ＴＢＳ中で三日洗浄した後、１０％ウシ胎仔血清を含むＴＢＳで 希釈されたＩＩＲＰＯ標識ヤギ標識ヤギ抗ヒト１仁Ｇンキュベートした。ニトロ セルロースは、ＴＢＳで三日洗浄した後、２■／　ｍｌ　４−クロロ−１−ナプ トール、０．０２％過酸化水素水、及び１７％メタノールを含んだＴＢＳで発色 させた。クローンＩ’１ｌ−３４は、４８，０００ダルトンの位置に、ＩＩｃＶ 患者の血清と、免疫学的に強く反応するバンドを示した。ゆえに、クマシー染色 タンパク質ゲル中の主要なタンパク質は、免疫学的反応性を有した。正常ヒト血 清は、９ＨＣＶ−４４の、どの成分とも反応しなかった。

実施ｆ！４２．　ＨＣ’ｌ　ＣＫＳ−３３Ｃ−ＨＣＤＡ、　ＩＩＣＶ　ＣＫＳ− ３３ｃｍＢＣＤ発現ベクターノ調製１１ＣＶ　ＣｌＳ−３３−ＢＣＤ抗体を発現 するこの組換えクローンは、以下に説明する三段階で構築された。最初に、ＩＩ ｃＶ　ＣＫＳ−ＢＣＤ抗原を発現するクローンを構築し、ｐｉｔｃｈ−２３と命 名した。次に、ＩＩＣＶＣＫＳ−３３抗原を発現するクローンを構築し、ｐ）Ｉ ｃＶ−２９と命名した。

最後に、ｐＩＩＣＶ−２３カラＩＩＣＶ　ＢＣＤ領域を切除して、ｐｉｔｃｈ− ２９ニ挿入シ、ＩＩＣＶ　ＣＫＳ−３３−ＢＣ［ｌ抗原ヲ発現すルｐＨｃＶ−３ １と称するクローンを構築した（配列番号８及び９）。

プラスミドｐＨｃＶ−２３を構築するために、ＩＩＣＹゲノムのアミノ酸１６７ ６−１９３１を表わす１３個の個々のオリゴヌクレオチドを、−緒に連結し、Ｃ ＫＳ融合ベクターｐＪＯ２００内に、３個の別個のＥｅｏＲＩ−！ｌ＊ｍＲＩサ ブフラグメントとしてクローニングした。続いてＤＮＡ配列を確認した後、Ｂ、 Ｃ及びＤとそれぞれ命名した３個のサブフラグメントを、適当な制限酵素で消化 して、ゲル精製後、共に連結し、図７に示した如＜、ＣＫＳ融合ベクター９１０ ２００中に、７８１塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢｓｓＨＩフラグメントとしてクローニ ングした。その結果生じたプラスミドは、ｐｉｔｃｈ−２３と命名され、Ｉｃｅ プロモーターの調節下、［ＩＣＶ　ＣＫＳ−ＢＣ［ｌ抗原を発現スル。ＨＣＶ　 ＣＫＳ−ＢＣＴＪ抗原は、ＣＫＳ（Ｄ７ミノＭ　２３９個、リンカ−ＤＮＡ配列 起源のアミノ酸７個、１ＩＣｖのＮＳ４領域由来のアミノ酸２５６個（アミノ酸 １６］６−１９３１　”）　、及びリンカ−１ＩＮＡ配列起源の付加的アミノ酸 １０個より構成される。

プラスミドｐＨｃＶ−２９を構築するために、ｎｃｖゲノムのアミノ酸１１９２ −１４５７を表わす１２個の個々のオリゴヌクレオチドを一緒に連結し、ＣＫＦ 融合ベクター、３０２００中に、２つの別個のＥｃｏＲｌ−Ｂ＊＠ＲＩサブフラ グメントとしてクローニングした。続いてｌ１ＮＡ配列を確認した後、２個のサ ブフラグメントを適当な＃限酵素で消化し、ゲル精製し、−緒に連結し、図８に 示した如く、ＣＫＳ融合ベクターｐＪ０２００中に、８１６塩基対ＥｃｏＲＩ− ＢｓａＨＩ　７　ラグメントとして、再度、クローニングした。その結果生じた プラスミドは、ｐＨｃＶ−２９と命名され、１ｃプロモーターの調節下、ＣＫＳ −３３抗原を発現する。ＩＩｃＶ　Ｃｐｓ−３３抗［ハ、ｃＫｓノアミノ酸２３ ９個、リンカ−ｔｌＮ＾配列起源のアミノ酸８個、及びＩＩｃＶのＮＳ３領域の アミノ酸２６６個（アミノ酸１．１９２−１４５７）より構成される。

プラスミドｐＨＣＶ−３１を構築するために、ＩＩｃＶ　−ＢＣ１ｌｆｉ域を表 わす、ｐｌ’１ｃＶ−２３からの７８１塩基対ＥｃｏＲＩ−Ｂ＊ｍｌｌ＋　７ラ グメントを、Ｃｌ１ｌ−ＩＦ醜旧フラグメントを作製するために、リンカ−適合 （Ｉｉａｔ＠＋−ｇｄｓｐｌｅｄｌさせたｏ　ＣＩｇｌ−Ｂ＊ｍ５１を、次いで ゲル精製し、図９に示した如＜　Ｃ１１ｌ−ＢｌｌＨ１部位でｐｉｔｃｈ−２９ 中に連結した。その結果生じたプラスミドは、ｐｌ’１ｃＶ−３１と命名され、 ｌｉｅプロモーターの調節下、ｐＨｃマー３１抗原を発現する。９ＲＣＶ−３１ の完全なりＮＡ配列、及び産生されたＨＣＶ　ＣＫＳ−３３−ＢＣＤ組換え抗原 の全アミノ酸配列は、配列番号８及び９に示した。ＨＣＶ　ＣＫＳ−３３−ＢＣ Ｄ抗原は、ＣＸＳのアミノ酸２３９個、リンカ−ＤＮＡ配列起源のアミノ酸８個 、ｎｃｖの１１３３領域からの２６６個のアミノ酸（アミノ酸１１９２−１４５ ７　）　、リンカ−ＤＮＡ配列配列起源ノアミノ側２個ＩＣＶ　ノＮＳ４領域か らの　２５６個のアミノ酸（アミノ酸＋６７６−１９３１）　、及びリンカ−Ｄ ＮＡ配列起源の付加的アミノ酸１０個から構成されている。

図１２は、ｐＲｃＹ−３１抗原の模式図である。

ｐｉｔｃｈ−３１ブーｙｘミドは、実施例１０）　ｐＨｃＶ−３４及びＣＫＳ− ｐ丁Ｂ２１０プラスミドと同様の仕方で、大腸菌１１２株の！Ｌ−１に形質転換 された。

Ｂ、　１１１換ＬＨＣＶ　ＣＫＳ−３３−ＢＣＤ（Ｄ特性分析ｐＨｃＶ　ＣＫＳ −３３−ＢＣＤ　）特性は、実施例１　（Ｄ　ｐＲｃＶ　ＣＨ８−Ｃｏｔｓ　ト 同様にして調べた。組換え融合タンパク質ＣＩ［Ｓ−３３ｃ　、　ＣＫＳ−ｆｌ ｃＤ及びＣＫＳ−３３−ＢＣｌｌをそれぞれ発現するプラスミドｌｌｌＩｃマー ２９（図１１）、ｐｉｔｃｈ−２３（図１２）及びｐＲｃｖ−Ｈ（図１３）を含 んだ大腸菌溶解物を、ｐＨｃＶ−２３，ｐＨｃＶ　ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで電気 泳動した。３つの図の各々で、分子量標準をレーンＭにて泳動し、左の矢印は、 上から下に、１１０，０００．８４，０００．４７，０００．３３．０００．２ ４．Ｈｅ、及び１６、　（１１１１１ダルトンの分子量マーカーの移動度を示し ている。図１１のレーン１は誘導前の、そしてレーン２は、誘導４時間後の、Ｔ ＩＣＶ　ＣＫＳ−３３ｃ　（７ミ／酸１１９２−［４５７）を発現すルｐＨｃＶ −２９を含んだ大腸菌溶解物である。これらの結果から、組換えｐ■Ｃマー２９ 融合タンパク質は、分子量Ｇｏ、　０００ダルトンに相当する、見かけの移動度 を有していた。これは、予想された分子量５４，９１１ダルトンと比較できる許 容可能な値である。

！！！１１２で、レーン１は、ＩＩＣＶ配列を含有しないＣＫＳベクター、ｐＪ Ｏ！ｆｌＯを含んだ大腸菌の溶解物である。レーン２は、ＦＩＣ’ｌ　ＣＫＳ− ８（アミノ酸＋６７６−１７９０）を発現するｐｎｃマー２０を含む。レーン３ は融合タンパク質ｐＨｃＶ−２３（７ミ／酸１６７！−１９３１）を含む。

これらの結果から、組換えｐ）ＩＣＶ−２３融合タンパク質は、分子量５５．０ ００ダルトンに相当する、見かけの移動度を有していた。これは、予想された分 子量５５．０７０ダルトンと比較できる許容可能な値である。

図１３のレーン１は、ＲＣＶ配列を含有しないＣＫＳベクター、ｐ１０２００を 含んだ大腸菌の溶解物である。レーン２は、誘導前の、そしてレーン３は誘導２ 時間後の、ＣＫＳ−３３ｅ−ＢＣＤ融合タンパク質（アミノ酸＋１９２−１４４ ７、及び＋６７６−１９３１．）を発現す６　ｐＨｃＶ−３１である。これらの 結果から、組換えｐＨｃＶ−３１ｆＣＫＳ−３３ｅ−［ＩＣＤ）融合タンパク質 は、分子量９０．０００ダルトンに相当する、見かけの移動度を有していた。こ れは、予想された分子量８２，９９５ダルトンと比較できる許容可能な値である 。

ｐＨｃＶ−３１／Ｈ−１培養物からノＳＤＳ／ＰＡＧＥケルノ一ツテハ、イムノ プロットも行った。ＨＣｖに接触のあった個人からのヒト血清は、９０．０００ ダルトンの所にある主要なｐｉ（ＣＶ−３１バンドと強く反応した。正常なヒト 血清は、ｐｌｌｃＶ−３１（ＣＫＳ−３３−ＢＣＤ）調製物の、いかなる成分と も反応しなかった。

実施例３．スクリーニング・アッセイ ＣｌＮ−３の中にあるエピトープとＨＣｖゲノム由来の他の抗原性領域からのエ ピトープとを含んだ組換えポリペプチドを使用すれば、ｅｌＧＯ−３内のエピト ープのみを使ったｌ’ｌｃＶ免疫学的アッセイに比べて、より高感度で、また高 特異性の可能性もある、免疫学的アッセイが提供される。

目下好適なスクリーニング・アッセイでは、大腸菌によって発現され、ＩＩｃマ ゲノムの明瞭な３つの領域を表わす、２つの組換えタンパク質ＣＫＳ−Ｃｏｒｅ 　（ｐｌｌｃＶ−３４）及びＣＫＳ−３３−！ＩｃＩＩ　（ｐＴｉＣマー３１） が用いられる。これらの組換えポリペプチドは、上記の手法によって作成される 。スクリーニング・アッセイにおいては、両組換え抗原を共に、同じポリスチレ ン・ビーズの上にコーティングする。スクリーニング・アッセイの変法としては 、ポリスチレン・ビーズを、ＳＯＤ融合ポリペプチドｅｌＧＯ−３でコーティン グしてもよい。

ポリスチレン・ビーズは、まず蒸溜水とプロパツールで洗浄し、次いで、Ｏ，Ｆ ｉｌ　ＮｔＣｌ及び０．１１０２２％トリトン（Ｔ＋ｔｔｅ＠１　！−１００を 含んだＯ，ＩＭ　ｌ１ｓＨＰＯ拳ＲＯ（ｐＨｆｉ、５）で、０．５から　２．０ Ｊ１９／ｍｌに希釈したｐＨｃＶ−３１、及び０．１から０．５埒／ｍｌに希釈 したｐＨｃＶ−３４を含む溶液と共に、インキュベートする。ビーズを、抗原溶 液中で２時間（プラス・マイナス１０分間）、３１１−４２℃でインキュベート した後、ＰＢＳで洗浄し、０１％ｆｔ／マ）トリトン！−ＩＮを含んだＰＢＳに ６０分間、３ｇ−４２℃にて浸す。ビーズは、次いでリン酸緩衝塩水（ＰＢＳＩ 　中で三日洗浄し、５．０％（ｖ／マ）ウシ血清アルブミン（８３＾）を含んだ ＰＢＳ溶液で６０分間、３８−４２℃でオーバーコーテイングした後、ＰＢＳで 一度洗浄する。最後に、ビーズを、５％（Ｗ／マ）ショ糖含有のＰＢＳで、オー バーコーテイングしてから、窒素または空気中で乾燥する。

ｐＨｃＶ−３１及びｐｌｌｃＶ−３４でコーティングしたポリスチレンビーズは 、抗体捕捉方式で使用する。サンプル１０μを、希釈サンプル４００１１１、及 び組換えタンパク質でコーティングしたビーズと共に、反応トレーのウェルに添 加する。希釈サンプルは、１０％（マ／ｙｌ　ウシ血清及び２０％（！／マ）ヤ ギ血清の、２０５Ｍトリスリン酸緩衝液溶液からなり、これには、０１５％（マ ／マ）　トリトンｘ−ｉｏｏ、１％（ｖ、＃）　ＢＳＡ、　１％大腸菌溶解物、 及び５００埒／　ｍｌ以下のＣＫＳ溶解物が含有される。組換え酵母Ｃ１，０Ｇ 　−３ポリペプチドを使う場合、サンプル中に存在するかも知れない酵母抗原に 対する抗体は、希釈サンプルに添加した酵母抽出物（通常的２　Ｑ　０ＪＱＦ　 ／　ｍｌ　）と反応する。酵母抽出物の希釈サンプルへの添加は、偽陽性を防ぐ ために行なわれる。最終生成物は、除菌濾過後、プラスチック瓶に詰め、０１％ アジ化ナトリウムを加えて保存される。

４Ｇ℃で１時間インキュベートした後、ビーズを洗浄して、２００ｕ１ノ結合体 を、反応トレーのウェルに添加する。

望ましい結合体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体である 。結合体の濃縮液は、作業濃度を決定するために力価測定する。次いで、結合体 濃縮液を、作業濃度の２０倍の濃度になるまで、希釈剤にて希釈する。２０×濃 縮液は、除菌濾過後、プラスチック瓶中で保存する。

希釈結合体は、１０％（マ／マ）ウシ血清、１０％（マ／マ）ヤギ血清、及び０ ．１５％トリトン−ＨｏＧ　（Ｄ　２０ｗＭ　ト’１７　ス緩衝液（ｐＨ７，５ ）溶液に、０．０１％硫酸ゲンタマイシン、０．０１％チメロサル（ｔｈｉｓｓ ｒｏ＋ｓｌ）、及び赤色顔料を添加したものよりなる。結合体は、除菌濾過後、 プラスチック瓶中で保存する。

抗ＲＣＹ陽性コントロールは、ｉｃｙ抗体に陽性の血漿ユニットを用いて調製す る。使用したユニットのプールには１．！ＩＣＶ−３１及びｐｌｌｃＶ−３４に 反応する抗体を持つ血漿が含まれる。血漿ユニットは、再石灰化した後、５１− ６１℃で１２時間、一定に攪拌して加熱失活させる。そのプールは分割して、− ２０℃あるいは２−８℃にて保存する。陽性コントロールの各ロットについては 、０．１％アジ化ナトリウムを保存料として含む陰性コントロールで、保存溶液 を希釈する。最終生成物は、除菌濾過後、プラスチック瓶に詰める。

抗８Ｃマ陰性コントロールは、Ｈｃｖ　ノｐｔｉｃマ−コｌ及びｐｉｔｃｈ−３ ４９ンパク質に対する抗体に対して陰性のヒト血漿を再石灰化したものから調製 する。血漿は、ヒト免疫不全ウィルス（ＲＩＶＩ　抗体に対しても陰性であり、 またＢ型肝炎つィルス表面抗原ｆｌ’ｌＢｓＡｇ）に対しても陰性である。ユニ ットをプールして、０．１％アジ化ナトリウムを保存料として添加する。最終生 成物は、除菌濾過後、プラスチック瓶に詰める。

結合体との、４０℃で１時間のインキュベーションの後、ビーズを洗浄し、ＯＰ Ｄ基質に３０分間、室温で接触させた後、１１２Ｓｏ４を添加して反応を停止さ せる。吸光度は４９２＋＋ｍで読み取る。

許容し得る特異性を維持するためには、アッセイのカットオフ（ｃｓｌｏｌＬｌ 値は、正常母集団の平均の吸光度値より少なくとも　５−７標準偏差、高くなけ ればならない。加えて、母集団の平均がサンプル対カットオフ値（Ｓ／Ｃｏ）　 ０．２５以下のところにある場合に、許容可能な特異性が得られることが一般に 観察されている。これらの基準にそって、推定されるほとんどの「真の陰性」を 、「真の陽性」検体から明瞭に区別する［前臨床の（ｐｒｅｃｌｉｍｉｃ暑Ｉ） 　Ｊカットオフ値が、スクリーニング・アッセイのために選ばれた。カットオフ 値は、陽性コントロールの平均吸光度値を０．２５倍した値と、陰性コントロー ルの平均吸光度値との和として算出される。カットオフ値は代数学的に、次の式 ％式％ カットオフ値＝　０．２５　ＰＣ！＋　ＮＣ！テストは、アッセイにおいて最終 的な発色を測定するための、自動化の程度及びメカニズムが基本的に違う二つの 手法で行うことができる。手法の一つは、４２９＋＋ｍで吸光度を測定するのに 、Ｑｗｓ＋＋ｊｓ＠又はＱｓｓａｌｓｍｓ口Ｃを用いる所から、マニュアル又は Ｑｗｔａ１ｗｓＴＭ法と呼ばれる。この方法はまた、サンプルのピペッティング 、洗浄、及び試薬の添加が、通常テクニシャンにより、適切に検量されたピペッ ト、ディスペンサー及び洗浄用器具を用いて、手動で行なわれる所から、マニュ アル法とも呼ばれる。もう一つの手法は、ＰＰＣ法と呼ばれ、自動化されたＡｂ ｂｏｌｌ　Ｃ＋＠ｓ■ｄｅｒ■システムを用いる。同システムはＥ、　Ｐ、　０ ．出願公開第０１１４０７２．１に開示された、サンプル・マネージメント儂セ ンター（ＳＭＣ）　と呼ばれるピペッティング装置、及びパラレル・プロセッシ ング・センター（ＰＰＣＩ　と呼ばれる、洗浄・ディスペンス・読取り装置を用 いている。ＰＰＣで用いる光学的読み取り機は、二重波長読取り能力を有し、サ ンプル・ウェルから、示差吸光度（ピークバンドとサイドバンド）を測定できる 。これらの測定値は、プロセッサーのコントロール・センターで結果に変換され る。

先に説明した様に、表１は７匹のチンパンジーにおけるＩＩｃＶ感染の経過を、 ポリペプチドｃｌＧｏ−３を使ったスクリーニング・アッセイ、及びｐ８Ｃマー ３１とｐｉｔｃｈ−３４を使ったスクリーニング・アッセイで調べた結果である 。両アッセイとも接種前は、結果は陰性であり、また実験動物がＨＣＶに感染し た後は、両アッセイともに抗体の存在を検知した。しかしながら、二つのアッセ イを比較すると、７匹のチンパンジー９６匹で、ｐｉｔｃｈ−３１及びｐＲｃＶ −３４を用いたアッセイが、ＩＩＣＶ抗原に対する血清転換を、より早い時期か 同様の採血臼に検出している。これらのチンパンジーにおける実験データは、ｐ ＨｃＶ−３１とｐｉｔｃｈ−３４タンパク質を用いたアッセイによって、ＨＣＶ 抗体の全般にわたる検出が大きく向上することをはっきり実証している。このテ ストは感度が充分に高（、ＡＬＴレベルの上昇で定義される、本疾患の急性期に おける血清転換を、はとんどの実験動物において検出できる。同様に重要なのは 、接種前の検体が、反応性を全く示さなかったという、テストの特異性の高さで ある。

２、非Ａ非ＢパネルＩｔ　（Ｈ，Ａｌｔｅｒ、　ＮＩＢ）Ｄｒ、Ｈ，＾Ｎｅｔ、 　Ｎ１１ｌ、Ｂｓ１ｈｅｓｄｔ、　ＭＤ、より入手した、感染性■Ｃｖ血清、陰 性血清、及びその他の疾患コントロールを含んだ、血統的に純粋性の高いヒト血 清のパネルを検査した。パネルには、全部で４４の検体が存在した。

チンパンジーにおいて、［証明された感染性（ｐｒｏマｅｌｌｉ＊ｆｅｃｊｉｏ ｉｔ）　Ｊ有り、とされた血清７検体の内６検体は、ポリペプチドｃ１０Ｇ−３ を使ったスクリーニング・アッセイ、及び組換えタンパク質ｐｌ（Ｃマー３１と ｐｉｔｃｈ−３４を使ったスクリーニング・アッセイの両方で、陽性であった。

これら反応性のある６検体は、慢性肝炎に罹った個体より得られた。反応性検体 は、６検体とも全て陽性であることが、合成ペプチド１６７を用いて確認された 。輸血後ＮＡＮＢ肝炎の急性期に得られた１検体は、両スクリーニング・アッセ イにおいて反応性を示さなかった。

このグループの内、「感染性可能性あり（ｐｒ５ｂ＊ｂｌｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕ ｓ）　Ｊどラベルされたものは、同一の輸血後肝炎叡者から採取された３検体で あった。急性期の最初の２サンプルは、両アッセイで陰性であったが、３番目の サンプルは、両アッセイで反応性を示した。疾病コントロール・サンプル、及び 血統の明らかな（ｐｅｄｉ（＋！！ｄ）陰性コントロールは、一様に陰性であっ た。

両スクリーニング・アッセイで陽性として検出された１６のサンプルは、全てＳ ｐＨ７確認アッセイで、確認された（図１４）。

更に、検体１Ｇト２９１！、組換えｐＨｃＶ−３１トｐＨｃＬ３４抗原ヲ使ツタ スクリーニング・アッセイで、新たに陽性が検出され、１ｐ７５確認アツセイで も反応性を示した。検体３９は、ｐｉｔｃｈ−３４と　ｐＨＣＶ−３１を使った スクリーニング・テストで、最初は反応性であったが、再テストでは陰性を示し 、確認アッセイでも確認できなかった。

要約すれば、両スクリーニング・テストとも、慢性１ｔＡＮＢｌ（ギヤ９フ６人 中６人を、そして、急性ＮＡＮＢＩ（４サンプル中の１つを、確定した。感染の 疑いがあるドナーからの、ペアにした検体は、ＣＬＯＧ−３を用いたスクリーニ ング・テストでは反応しなかったが１、ＩＩＣＶ−３１及びｐｉｔｃｈ−３４使 用のスクリーニング・テストでは反応した。したがって、組換え抗原ｐＨｃＶ− ３１及びｐＨｃＶ−３４を用いたスクリーニング・テスＩ・は、ｃｌｏＧ−３を 使用したスクリーニング・アッセイに比較して、より感度が高い様である。疾病 コントロール検体、及び血統の明らかな陰性コントロール検体は、いずれも両ス クリーニング・アッセイでは反応しなかった。

３、　ＣＢＥＲレファレンス・パネル Ｃ型肝炎に対する抗体のレファレンス・パネル（ｒｅｌｔｒｅａｃｅｐｘｎｅｌ ｌ　は、Ｃｅｎ１ｅ＋　ｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃｓ　Ｅｙｔｌｍｔｌｉｏｓ　■ ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（ＣＢＦ、Ｒ）より入手した。この１０構成員からなるパ ネルには、Ｈｃｖ抗体に対して陰性の正常ヒト血清で希釈した反応性のある８サ ンプル、及び検出できるＲＣＹ抗体を含まない２血清が含まれる。

このパネルは、Ｃ１００−３を使用したスクリーニング・アッセイ、０＋Ｔｏｏ 第一世代１１ｃＹエンザイム１イムノアッセイ（ＥＩＡ）　、及ヒｐＨｃＹ−３ １とｐＲＣＶ−３４を用いたスクリーニング・アッセイにかけられた。アッセイ 結果は、図１５に示した。

９１１ｃＶ−３１とｐｉｔｃｈ−３４を用いたスクリーニング・アッセイでは、 ＨＣｖ陽性又はボーダーライン・サンプルの希釈液、６サンプル全てが検出され た。２つの非反応性サンプル希釈液（７０９及び７！０）は、両スクリーニング ・アッセイの抗体検知能の限界を越えて希釈されている様だった。ＣｌＮ−３を 用いたスクリーニング・アッセイ又は０＋ｌｈｏ第一世代テストに比べて、ｐＨ ｃｔ’−３１とｐＨＣ，Ｖ　−３４を用いたスクリーニング・アッセイでは、３ つの構成員でカットオフ値の著しい増加が見られた。繰返し反応性を示す検体は すべて確認された。

実施例４．確認アッセイ 確認アッセイは、ＲＣＶ抗原と免疫学的に反応する抗体の存在を明確に同定する 手段を提供する。確認アッセイには、スクリーニング・アッセイで説明した２つ の組換え抗原が示す領域と同一の、ＨＣＶゲノムの明瞭な３領域が内包する主要 エピトープを表わす合成ペプチドあるいは組換え抗体が含まれている。確認アッ セイに用いる組換えタンパク質は、−次スクリーニング・アッセイに用いたのと は異種の抗原起源でなければならない（即ち、大腸菌由来の組換え抗原や、ＣＫ Ｓ配列の一部からなる組換え抗原であってはならない）。−次スクリーニング・ アッセイで、繰返し反応性であった検体は、確認アッセイで再検査される。同一 量の検体を含むアリコートを、別々にポリスチレン・ビーズ上にコーティングし た合成ペプチドまたは組換え抗原に接触させる。ＩＩ　Ｃ’ｆゲノムのｅｌｏＧ −３領域内にあるエピトープに対する血清反応性（＋　ｅ　ｔ　ｏ　ｒ　ｒ　ａ 　ｃ　ｌ　ｉ　ｙ　ｉ　ｌ　７）は、合成ペプチド＋ｐ６７及び＋ｐ６５を用い て確認される。ｃｌＯＱ−３領域との血清反応性は、合成ペプチド＋ａｌ１７を 用いても確認できる。ＨＣｖの推定上のコア領域内のＩＩｃＶエピトープに対す る血清反応性は、合成ペプチド＋ｐ７５を用いて確認される。ＩＩｃＶの３３ｃ 領域内にあるＩＩｃＶエピトープに対する血清反応性を確認するには、酵母菌に おいて、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）　とのキメラタンパク質とし て発現する組換え抗原が用いられる。最終的に、抗体−抗原複合体が検出される 。

アッセイのプロトコールは、上記の実施例３にて説明したのと同様であった。ペ プチドは、別々にポリスチレンビーズにコーティングされ、スクリーニング・ア ッセイで説明したのと同様の抗体捕捉方式で使用される。検体１０成を、希釈検 体４００Ｉｉ１、及びペプチドでコーティングしたビーズと共に、反応トレーの ウェルに入れる。４０℃で１時間インキュベートした後、ビーズを洗浄し、（実 施例３で説明したのと同一の）結合体２００１１！を、反応トレーのウェルに添 加する。４０℃で１時間インキュベートした後、ビーズを洗浄し、ＯＰＤ基質に ３０分間、室温で接触させた後、ＩＮ　Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止させる 。吸光度は４９２Ｉで読み取る。ペプチド・アッセイのカットオフ値は、陰性コ ントロールの吸光度値の平均値の４倍である。

１、ＲＣＶ感染の「危険性のある（＊＋ｒ口ｋ）　Ｊ検体を含むパネル臨床学的 に全員ＮＡＩＩＩＩＨと診断された血液透析患者２３人から採取した　２３３検 体からなるグループは、Ｕｓｉｖｅｒ＊ｉ１７　ｏｒＣｔｌ百ｏｒｅｉ麿、Ｌｏ ｓ　Ａｍ（ｅｌｅ＋　Ｃｒａｔｅｒ　ｔａｒ　ｔｂ＊　ＨｅｔｌＴｏ　５ｃｉｅ ｎｃｅｓのＧｌｔＩ　Ｇ１１ａｉｃｋ、　ＬＤ、より供与された。ＣＩＧＯ−３ を用いたスクリーニング・アッセイでテストされたサンプルは、次いで９ＨＣＶ −３１とｐｌｃｖ−Ｈを用いたスクリーニング・アッセイにかけられた。

総計２３人中７患者（３０，４４％）が、ＣＩＧＯ−３を用いたスクリーニング ・アッセイで、反復的に反応性を示す総計３６検体と反応した。

２３人中！Ｏ患者（４３，４８％）が、ｐｌ’１ｃＶ−３１とｐＨｃＶ−３４を 用イタスフ゛　リーニング・アッセイで、入手出来た検体中反復的に反応性を示 す総計７０検体と反応したく図１６）。２検体はテストに使用出来なかった。Ｃ １００−３を用いたスクリーニング・アッセイで繰返し反応性を示した３６検体 の全部が、合成ペプチド確認アッセイで確認された。これら３６検体中、総計３ ４が９）１ｃＶ−３１とｐＲｃＶ−３４を用いたＩＩｃＶエンザイム・イムノア ッセイで繰返し反応性を示した。２検体は、テストに使用出来なかった。ｐＨｃ Ｖ−３１とｐＨＣマー３４を用いたスクリーニング−アッセイで新たに検知され た３６検体の内、９検体はｅｅｌ！ペプチド確認アッセイ（ｓｐ７５１で確認さ れ、２７検体は５ＯＤ−３３ｅ確認アツセイで確認された。

要約スルト、コレラノテータカラ、ＰＨＣＶ−３４とｐＨｃＶ−３１を使用した スクリーニング・アッセイによる抗ＨＣＶ抗体の検出は、ｅｌｏｏ−３スクリー ニング・アッセイに比べて、同じ採血臼に起こるか、あるいは、９ケ月以上も早 い可能性があることが示唆される。図１７は、血液透析患者テノ１．ＩＩＣＶ− ３４とｐＨｃＶ−３１を用イたスクリーニング・アッセイによる早期検出を示す 。

５、急性／慢性非Ａ非Ｂ型肝炎 検体群は、急性又は慢性ＮＡＮＢＩＩと診断された個体から同定された。急性症 例のＮＡＮＢＨ個体より採取された検体は、Ｕａｉｙｅｔｓ目７　ｏｊ　Ｃ＊１ ｉｌｏｒ＋ｉｓ、Ｌｏｔ　ＡＢｓｌｅｇ　Ｃｅｌ１ｌｓｒ　１ｏＩｔｈｅＨｅｓ ｌｊｌ＋　５ｅｉｓａｅ＠ｓのＧｒｒ７　Ｇ１１ｅｉｅｋ、　Ｍ、Ｄより供与さ れた。急性肝炎の診断は、最低２つの血清サンプルにおいて、６力月未満の期間 に亘り、細胞溶解性症候群（正常上限の２倍以上のＡＬＴレベル）が存在するこ とに基づいており、他の生物学的異常や臨床上の症状は伴っても、伴わなくても よい。全検体とも市販のテストで検査した時、Ａ型肝炎ウィルス（ＢＡＶ）に対 するＩｇＭ抗体とは陰性であり、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原に対しても陰性であ った。慢性ＮＡＮＢＨ症例からの検体は、２ケ所の臨床現場より得られた。慢性 ＮＡＮＢＩＩ罹患個体の診断は、以下の基準によって行なわれた：　ＡＬＴレベ ルの持続的上昇、肝臓生検結果、及び／又は検知可能なり型肝炎ウィルス表面抗 原ｆＲＢｓＡｇｌ　の不在である。生検結果のある検体は、更に活動性慢性ＮＡ ＩＩＢＩ（、持続性慢性ＮＡＮＢＩＩ　、あるいは肝硬変を伴う慢性ＮＡＩＩＢ ＩＩＡに分類された。

これらの検体は、ＣＩＧＯ−３スクリーニング・アッセイ、及びｐＨｃＶ−３４ とｐＨｃＶ−３１を用いたスクリーニング・アッセイの両方でテストされた。後 者のテストは、Ｑｌｌｌｌｌｌｌｌ法とＰＰＣ法の両方を用い、２つの複製物で 行った。

流行性ｆｃｏｍｍｗａｉ１７　身ｃｑｉｉ＋５ｄ）ＮＡＮＢＨ（急性）ｅｌｏｏ −３スクリーニング・アッセイにおいては、１Ｇ検体中２検体（２０，００％） が、繰返し反応性ありと検知され、２検体とも確認された。ｐＨｃＶ−３４とｐ ＨＣＶ−３１を用いたスクリーニング・アッセイでは、この２検体に加えて、新 たに２検体が検知された（図１８）。これら２検体は、１１１７５によって確認 された（図１９参照）。

ｅｌＧｏ−３スクリーニング・アッセイにおいては、３２検体中４検体ｆ１２． ５０％）が、繰返し反応性ありと検知され、全部が確認された。ｐＨｃＶ−３４ とｐＨｃＶ−３１を用いたスクリーニング−アッセイでは、これら４検体中３検 体　（７５％）が反応性ありと検知された。見逃された１サンプルは、後のスク リーニング・テストにおいて、Ｓ／ＣＯが０．９５であった。同サンプルは、Ｉ ｐ６？ペプチドによッテ確認された（図１８）　、更に、ｐＨｃＶ−３４＋！： 　９８ＣＹ−Ｎ　Ｇ用イたスクリーニング・アッセイでは、ｃｌＧＯ−３スクリ ーニング・アッセイでは反応性を示さなかった１１検体が検知された。確認のた めに入手できた９検体中、８検体が＋ｐ７５によって確認され、１検体は確認さ れなかったものの、＋ｐ６５確認テストでのＳ／ＣＯは、０．９０であった（図 １９参照）。

慢性ＮＡＮＢＨ この群からの結果は、図２０にまとめである。全体では、１６４の慢性ＮＡＮＢ Ｈｆンプル中１５５（９４，５％ｌ　カ、ｐＨｃＶ−３４トｐＨｃＶ−３１を用 いた、ＱｓｇｎｌａｍあるいはＰＰＣ法によるスクリーニング・アッセイで検知 された。１５５の反応性サンプルの全部が、ＩＩＣＶゲツムのＣ１ｆｌＯ，３３ Ｃ，あるいはｃｏｒｅ領域からの配列に基づく合成ペプチドを用いた別のアッセ イで確認された。それに反して、ｃｌ（１０−３アツセイでは、　１６４検体中 、わずか　１３８検体＋！１４．１％）のみが、陽性であった。　１３８個のｃ Ｈｏ−３サンプルの内１つを除く全部が、ｐｌ（ＣＶ−３１とｐ［１ｃＬ３４を 用いたスクリーニングアッセイで陽性として検出された。不一致サンプルの一つ は、合成あるいは中和アッセイのどちらにても確認されなか７た。反対に、確認 された内の１７サンプルが、ｐＨｃＶ−３４とｐＨｃＶ−３！を用いたスクリー ニング・アッセイのみで、陽性を示した。

この結果から、慢性ＮＡＮＢ）Ｉ罹患集団においてＨＣＶ陽性個体を検出する際 には、ｐＨｃＶ−３４とｐＨｃＹ−３１を用いたスクリーニング・アッセイの方 が、現行のテストよりも感度が高いことが示さ抗原性１１（４エピトープを含む 組換えポリペプチドは、競合アッセイにおいて有用である。中和アッセイを行う には、例えばｅｌ（１０−３Ｑｉ域にあるＣＫＳ−ＢＣＤのようなエピトープを 表わす組換えペプチド（ｐＨｃＹ−２３１を可溶化して、サンプル希釈液と、最 終濃度が０．５−５０４　／　ｍｌになるように混合する。検体あるいは希釈検 体１．Ｏｄを反応ウェルに入れ、組換えポリペプチドを含む希釈検体４００ｕ１ を加えて、望むなら、約１５分から２時間、プレインキュベー・トしてもよい。

次いで反応ウェルに、ｅｌ、ｏＯ−３抗原でコーティングしたビーズを加えて、 ４０℃で１時間インキュベートする。洗浄後、結合体希釈剤中のペルオキシダー ゼ標識ヤギ抗ヒト１１Ｇ　２００Ｊ１１を添加して、４０℃で１時間インキュベ ートする。

洗浄後、ＯＰＤ基買を加えて、３０分間、室温でインキュベートする。ＩＮの硫 酸を添加して反応を停止させ、吸光度を４９２１で測定する。

ｃｌ、ＧＯ−３抗原に対する抗体を含んだサンプルは、溶液中にあるこれら抗体 に対するペプチドの競合的結合によって、シグナルの低下を起こす。競合結合率 ％は、組換えポリペプチド存在下でのサンプルの吸光度と、組換えポリペプチド なしでアッセイされたサンプルの吸光度とを、同一濃度で比較して計算できる。

実施例６．イムノドツト・アッセイ イムノドツト・アセイでは、ニトロ・セルロース固相担体の上に並置した精製組 換えポリペプチドからなるパネルを用いる。

調製された固相担体はサンプルと接触させて、ＩＩｃＶ抗原に対する特異抗体を 捕捉する。捕捉された抗体は、結合体特異的反応によって検出される。結合体特 異的反応は、１９８８年８月　２日に出願された米国特許出願筒０７／２２７． ４０８号に記載された装置内の反射光学的アセンブリを用いて定量測定すること が望ましい。

関連した米国特許出願筒０７／２２７．２７２号、第０７／２２７．５８６号、 及び第０７／２２７．５９０号には、イムノツト・アッセイを行う上で有用な特 定の手法や装置について記載されている。このアッセイはまた、１９９０年６月 　６日に出願された米国特許出願筒ＧＶ１５３２．４８９号でも説明されている 。簡潔にいうと、ニトロセルロース基材のテスト・カートリッジが、多数の抗原 性ポリペプチドで処理される。ポリペプチドは、テスト・カートリッジの特異的 反応帯に、それぞれ含有される。全ての抗原性ポリペプチドをニトロセルロース 上に置いた後、ニトロセルロース上の余分な結合部位をブロックする。次いでテ スト・カートリッジをサンプルと接触させ、これによって、サンプルが適当な抗 体を含んでいる場合、それぞれの反応帯にある抗原性ポリペプチドが反応する。

反応後、テスト・カートリッジを洗浄し、抗原−抗体反応は、適当な既知の試薬 を用いて同定される。

上記特許出願で説明されている様に、全工程を容易に自動化することができる。

イムノドツト・アッセイ実施の手法、装置に関連したこれら特許出願の明細を本 明細書中に参考として組み入れる。

望ましいイムノドツト・アッセイでは、図２１にまとめた様に、組換エポリヘブ チ）’９１１ＣＶ−２３，９１１ＣＶ−２９、ｐＩ（ＣＶ−３４、及びＣＩＧＯ ＝３を好適緩衝液、ｐＨ条件、及びスポツティング濃度に希釈して、事前組立て したニトロセルロース・テスト・カートリジに塗布した。カートリッジを、−晩 、室温３７℃にて乾燥した後、ニトロセルロースの非特異性結合能をブロックし た。ブロッキング液には、１％豚ゼラチン、１％酵素加水分解カゼイン、５％Ｔ ｗｅｅｎ−２０、０，１％アジ化ナトリウム、ｉｔ、　５Ｍ塩化ナトリウム、及 び２０ｍＭ）リスｐＨ７，５が含まれた。

４０人の正常ドナーが、上記手法にてアッセイされた。次いで、平均反射密度（ ｍｅｔｆｉ＋ｅｌｌｅｃｊｔａｃｅ　ｄｅｎｓ目りが、それぞれの組換えタンパ クについてめられた。カットオフ値は、陰性平均値に６平均偏差を加えて計算さ れた。テスト・カートリッジは、サンプル＾００６４２及び４２３と共にインキ ュベートされた（図２２参照）。非Ａ非Ｂ型肝炎回復期の患者より得たサンプル 、＾００６４２は、陰性ヒト血漿にて、ｌ：１００から１・１２ＨＯに希釈され た。もう一つのサンプル、４２３は、組換えｃｌＧｏ−３ポリペプチドを用いた アッセイで、陽性と判断された有料血漿ドナーからのサンプルであり、陰性ヒト 血漿にて、＋＋４０から１＋２５６０に希釈された。

サンプルのインキュベージタン後、続く、ビオチン結合ヤギ抗ヒトイムノグロブ リン特異抗体、アルカリホスファターゼ結合ウサギ抗ビオチン特異抗体、及び５ −ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェートとのインキュベージタン で、反応部位に有色生成物が形成される。サンプル対カットオフ値（Ｓ／Ｃｏ） が、全てのＩＩｃＶ組換えタンパク質について決定された。

Ｓ／Ｃｏ値が１．０以上ある場合は、反応性ありと判断した。限界希釈率は、　 Ｓ／Ｃｏが１．０以上になる最低の希釈率と定義された。図２２に見られる様に 、サンプルのそれぞれが、あらゆるＩＩｃＶ組換えタンパク質に対して陽性であ った。このデータは、サンプルＡＯＯ６４２に対する反応性がｐＨｃＶ−２９を 用いた場合最大であり、また、ソノｆｌｋノ抗原ＰＨＣＶ−２３、ｅｌｏｏ−３ 及びｐＨｃＹ−３４（７）場合には減少したことを示している。サンプル４２３ は１．ＩＩｃＶ−２９及びｐＨｃＶ−３４を発現する組換えタンパク質と最も強 く反応し、ｐＨｃＶ−２３及びｃｌｔｌＯ−３とは、それよりも弱く反応した。

案施例７．　ＩＩｃＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５発現ヘクター＋ＩＣＶゲノムのアミノ酸 １９０−２１９１を表わす８個の別個のオリゴヌクレオチドを一緒に連結し、Ｃ ＫＳ融合ベクターｐＪｏ！Ｇｏ中に、７９３塩基対ＥｅｏＲＩ−ＢｉａＨｌフラ グメントとして、クローニングした。その結果生じたｐＲｃＶ−４５と命名した プラスミド（配列番号８）は、Ｉｓｃプロモーターの調節下に、ＦＩＣＶ　ＣＫ Ｓ−１１８５！抗原を発現スル、　ＩＩＣＶ　ＣＫＳ−１１３５ε抗原は、ＣＫ Ｓ（Ｄアミノ酸２３９個と、リンカ−ＤＮＡ　配列起１［＋７）７　ミ／酸９ｍ 、及ヒ１ｌＣＶ　１ｌｓ４／ＮＳ５領域（アミノ酸１９３２−２１９１１からの アミノ酸２６０個により構成される。図２３は、ｐＨｃＶ−４５により発現され る、組換え抗原の模式図である。

配列番号！０及びＩｔは、ｐ　ＨＣＶ　−４５ニよッテ作らｔＬ６１１ｃＶ　Ｃ ｌ５−Ｎ５ＳＥ組換え抗原のＤＮＡ及びアミノ酸配列を表わす。図２４は、大腸 菌におけるｐＨｃＹ−４５タンパク質の発現を示す。レーン１には誘導前の、そ してレーン２には誘導２時間後、レーン３には誘導４時間後）、ＨＣＶ　Ｃｌ５ −Ｎ５ＳＥ抗原（アミノ酸１９３２−２１９１　）を発現する。ＩＩｃＶ−４５ を含有する大腸菌溶解物が含まれている。その結果、融合タンパク質−ｆｌｃＶ −４３は、分子量５５．　Ｇｏｏダルトンに相当する見かけの移動度を有してい た。これは、予想された分子量５７、５９７ダルトンと比較できる許容可能な値 である。

Ｂ、ＩＩｃＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｆノ調製ＨＣｖゲノムのアミノ酸２１８ｇ−２４ ８１を表わす１１個の別個のオリゴヌクレオチドを一緒に連結し、ＣＫＳ融合ベ クターｐ１０２００中に、８９５塩基対ＥｃｏＲ１−ｈｓＨＩフラグメントとし て、クローニングした。結果的に生じたｐＨｃＶ−４８と命名されたプラスミド は、ｌｚｃプロモーターの調節下に、ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｆ抗原を発現する 。ＨＣｖＣＫＳ−ＮＳ５Ｆ抗原は、ＣＫＳのアミノ酸２３９個、リンカ−ＤＮＡ 配列起ｊｌノ７ミ／酸８４１、及びＲＣＶ　１１３５領域（アミノ酸ＨＨ１４８ １）からのアミノ酸２９４個により構成される。図２５は、ｐＨｃＶ−４８によ り発現される組換え抗原の模式図である。配列番号Ｉ２及び１３は、ｐＨｃＶ− ４８１：　ヨッテ作られルＩＩＣＶ　ＣＫＳ−１１ｓｓＦ組換え抗原＋７）　Ｄ ＮＡ及びアミノ酸配列を表わす。図２６は、大腸菌におけるｐＨｃマー４８タン パク質の発現を示す。レーン１には誘導前の、そしてレーン２には誘導２時間後 の、レーン３には誘導４時間後の、ＩＩＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｆ抗原（アミノ酸 ２１８ｇ−２４１１１）　ｔ−発現スルｐＨｃＶ−４８ヲ含有する大腸菌溶解物 が含まれている。その結果、融合タンパク質ＰＨＣＶ−４８は、分子量６５．０ ００ダルトンに相当する見かけの移動度を有していた。これは、予想された分子 量５８，９８５ダルトンと比較できる許容可能な値である。

Ｃ，ＩＩｃＶ　ＣＫＳ−ＮＳＳＧノ調製１１ｃＶゲノムのアミノ酸２４８０−２ ７２９を表わす７個の別個のオリゴヌクレオチドを一緒に連結し、ＣＸＳ融合ベ クター、１０２０Ｇ中に、７６９塩基対ＥｃａＲＩ−Ｂｓ鵬旧フラグメントとし て、クローニングした。結果的に生じたｐＨｃＶ−５１と命名されたプラスミド （配列番号ＩＱ）は、１１Ｃプロモーターの調節下に、ＨＣＹ　ＣＫＳ−１１Ｓ ＳＧ抗原を発現すル。）ＩＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｇ抗原は、ＣＫＳノアミノ酸２ Ｈ個、リンカ−ＤＮＡ配列起源のアミノ酸８８１．及びＩＩＣＶ　ＮＳ５領域（ アミノ酸２４８０−２７２９）からのアミノ酸２５０個により構成される。図２ ７は、ｐＨｃＶ−５１により発現される組換え抗原の模式図である。配列番号１ ４及び１５ハ、ＩＩＨｃＹ　−５１ニーｋ　ｑ　テ作られルＩＴＣＶ　Ｃ［５− Ｎ５ＳＧ組換え抗原のＤＮＡ及びアミノ酸配列を表わす。図２８は、大腸菌にお けるｐＨｃＶ−５１タンパク質の発現を示す。レーン１には誘導前の、そしてレ ーン２には誘導２時間後、レーン３には誘導４時間後の、ＩＩＣＶ　ＣＫＳ−Ｎ Ｓ５Ｇ抗原（アミノ酸２４８０−２７２９　）を発現するｐＨｃＶ−５１を含有 する大腸菌溶解物が含まれている。その結果、融合タンパク質ｐＨｃＶ−５１は 、分子量５５．０００ダルトンに相当する見かけの移動度を有していた。これは 、予想された分子量５４、７２ｆｌダルトンと比較できる許容可能な値である。

Ｄ、ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｅ（Ｄ調製ＲＣＶゲノムのアミノ酸２１２Ｂ−２８ ６１を表わす６個の別個のオリゴヌクレオチドを一緒に連結し、ＣＫＳ融合ベク ターｐ１０２００中に、４３ｇ塩基対ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨｌフラグメントとし て、クローニングした。結果的に生じたｐＨｃＶ−５０と命名されたプラスミド （配列番号１１）ハ、ｌｊｃプロモーターノ調節下に、ｉｃｙ　ｃｘｓ−ｓｓｓ ｕ抗原を発現する。ＩＩＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳＳＩ（抗原は、ＣＫＳ（Ｄ７ミ／酸 ２３９個、リンカ−ＤＮＡ配列起源のアミノ酸８個、及びＩＩＣＶ　１１３５領 域（アミノ酸２７Ｎ−２８６７）からのアミノ酸１４０個により構成される。図 ２９は、ｐｆｌｃＶ−５ｏにより発現される組換え抗原の模式図である。配列番 号ＩＳ及び１７は、ｐ　ＲＣ”ｉ　−５１！　ｌ：よッテ作らｔｌ、６）ＩＣＹ 　ＣＫＳ−ＮＳ５１１組換え抗原のＤＮＡ及びアミノ酸配列を表わす。図３０は 、大腸菌におけるｐＨｃＹ−５０タンパク質の発現を示す。レーン１には誘導前 の、そしてレーン２には誘導２時間後の、レーン３には誘導４時間後の、ＨＣＹ 　ＣＫＳ−ＭＳ５ＦＩ抗原（アミノ酸２７２ｇ−２８６７）を発現するｐＨｃＹ −５ｏを含有する大腸菌溶解物が含まれている。その結果、融合タンパク質ｐ１ （ＣＶ−５０は、分子量４５，０００ダルトンに相当する見かけの移動度を有し ていた。これは、予想された分子量４２、７８３ダルトンと比較できる許容可能 な値である。

Ｅ、ｌｌ（：Ｖ　ＣＫＳ−８５５１の調製）ＩＣＶゲノムのアミノ酸２８６ｇ− ３０１１を表わす６個の別個のオリゴヌクレオチドを一緒に連結し、ＣＫＳ融合 ベクターｐ１０２［１Ｇ中に、４６０塩基対ＥｃｏＲ１−ＢｉｍＨｌフラグメン トとして、クローニングした。結果的に生じたｐ）ＩＣＶ−４９と命名されたプ ラスミド（配列番号１２）は、ｌｉｅプロモーターの調節下に、［ＩＣＶ　ＣＫ Ｓ−ＮＳ５１抗原を発現する。ＩＩＣＶ　ＣＫＳ−Ｎ３５１抗原は、ＣＫＳのア ミノ酸２３９個、リンカ−ＩＩＮＡ配列起源のアミノ酸８個、及びＨＣＶ　１１ ３５領域（アミノ酸２８６６−３０１１）からのアミノ酸１４６個により構成さ れる。図３１は、ｐ）ＩＣＶ−４９により発現される組換え抗原の模式図である 。配列番号１８及び１９は、ｐｆｌｃＶ　−４９ニよって作られルＩＩＣＶ　Ｃ ｌｌ５−Ｎ５５１組換え抗原のＤＮＡ及びアミノ酸配列を表わす。図３２は、大 腸菌におけるｐＨｃＶ−４９タンパク質の発現を示す。レーン１には誘導前の、 そしてレーン２には誘導２時間後の、レーン３には誘導４時間後ノ、ＩＩｃＶ　 ＣＫＳ−ＮＳ５ｉ抗原（アミノ酸２８６Ｇ−３０１１）を発現するｐＨｃＶ−４ ９を含有する大腸菌溶解物が含まれている。その結果、融合タンパク質ｐ１（Ｃ Ｖ−４９は、分子量４２．６ＧＯダルトンに相当する見かけの移動度を有してい た。これは、予想された分子量４３．４９７ダルトンと比較できる許容可能な値 である。

Ｆ、　ＢＣ４ＣＫＳ−ＮＳ５抗原のイムツブａ−）トｐＨｃＶ−２３，９ＨＣＶ −４５、ｐｆｌｃＶ−４８、ｐｌ（ＣＶ−５１、ｐＨｃＶ−５０及びｐｆｌｃＶ −４９を含んだ誘導大腸菌溶解物のそれぞれを、調製用ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上 で電気泳動して、種、ＭＤＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５又１！ＨＣＪ　ＣＫＳ−ＢＣ ０組換え抗原を、その他の大腸菌タンパク質の大部分からアッセイ用に分離した 。分離したそれぞれのＩ（ＣＹ　ＣＫＳ−ＮＳ５あるいはＨｃｙ　ｃｒｓ−ａｃ Ｄ組換え抗原を含んだゲル片は、電気泳動的にニトロセルロースに転写し、次い で二トルセルロース紙を帯状に切断した。図４０は、これらのニトロセルロース 片を用いて、種々の血清また血漿サンプルをウェスタン・プロット分析した結果 テアル。右〕矢印ハ、ＩＩｃＹ　ＣＫＳ−ＢＣ［ｌ　又ハ）ＩＣＹ　ＣＫＳ−１ １ｓ５組換え抗原のそれぞれの位置を示している。上から下に、ｐＲｃＶ−２３ （ＨＣＶ　ＣＩＴＳ−ＢＣＤｌ、　ｐＨｃＹ−４５（ＲＣＹ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｅ ）、　ｐ）ＩｃＶ　−４８（［ｌＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｆ１．　ｐＨｃＶ−５ｔ 　（ＨＣＹ　ＣＫＳ−ＮＳＳＧ）、ｐＨｃＹ−５０（ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｈ ）。

ｐＨｃＶ−４９（ＨＣＹ　ＣＫＳ−ＮＳ５１）　、及びｐ１０２０１１　（ＣＫ ＳＩ　の順である。パネルＡには５つの正常ヒト血漿が、パネルＢには５つの正 常ヒト血清が、パネルＣには、Ａｂｂｏｌｔ　ＨＣＶ　ＥＩＡテストで陽性だっ た２０のヒト血清が、パネルＤには、２つの抗ＣＫＳマウス血清が、パネルＥに は、２つの正常マウス血清が含まれた。ｐｆｌｃＶ−４５によって発現されたｌ ’ｌｃＹ　ＣＫＳ−ＮＳ５Ｅ抗原、ｐＨｃマー４８によって発現されたＩＩｃＹ 　ＣＫＳ−ＭＳＳＦ抗原の両者とも、［ｌＣＶ抗体を含んだヒト血清サンプルで スクリーニングしたところ、免疫学的反応性を示した。

１（ＣＹゲノムのアミノ酸１５６９−１９３１を表わす１８個の別個のオリゴヌ クレオチドを一緒に連結し、ＣＫＳ融合ベクター、１０２０Ｇ中に、４つの別々 のＥｅｏＲＩ−ＢｓｓｌＴＩサブフラグメントとしてクローニングした。続いて 、ＤＮＡ配列を確認した後、４個のサブフラグメントを適当な制限酵素で消化し 、ゲル精製し、−緒に連結し、ＣＫＳ融合ベクター９１０２ＧＯ中に、１１０２ 塩基対ＫｃｏＲＩ−Ｂ＊ｔＲＩフラグメントとして、クローニングした。結果と して生じたプラスミドは、ｐＨｃｙ−２４と命名され、Ｉ籠Ｃプロモーターの調 節下、ＩＩｃＹＣＫＳ−ｅｌＧＯ抗原を発現する。ＨＣＶ　ＣＫＳ−ｅ１００抗 原は、ＣｘＳのアミノ酸２３９個、リンカ−ＤＮＡ配列起源のアミノ酸８個、及 びＲＣＶの１１３４領域由来のアミノ酸３６３（ｉｉ　（アミノ酸＋５６９−１ ９３１）　、及びリンカ−ＤＮＡ配列起源の付加的アミノ酸１０個より、構成さ れる。

！ＩＣＹ　ＣＫＳ−ｃｌＧｏ抗原は、ｐｔｌｃＶ−２４１：　、ｋ　ッテ非常１ ．：低レヘｈ　テｉｍされた。

このＩＩＣマＣｌ５−ｃｌｔｌｏ組換え抗原の発現レベルの不良性は、ＩＩＣＶ ｃｌｏｏ領域の７ミノ最終末端の欠失を含む２つの追加的クローンを構築するこ とで解消された。第１のクローンは、９１１ＣＹ−５７（配列番号２０及び２１ ）と命名され、２３個のアミノ酸ｆｌｌｃＶアミノ酸１５７５−１５９７）の欠 失を含み、６９塩基対Ｄｄｅｌ制限酵素フラグメントの欠失によって構築された 。二つめのクローンは、ｐＨＣＶ−５８（配列番号２２及び２３）と命名され、 ２１個のアミノ酸（１’ｌｃＶアミノ酸１６０１１−１８０）の欠失を含み、６ ３塩基対ＮＩ＊ＩＶ−Ｒｓ＊ｌＩＩｓｓ酵素フラグメントの欠失によって構築さ れた。図３４は、ｐｔｌｃＶ−２４、ＰＩＩＣマー５７、及びｐＨｃマー５８に より発現される組換え抗原の模式図テアル。配列番号１３ハ、ｐＨｃＶ　−５７ １：　、Ｊ、　ッテ作られルＨＣＶ−Ｃ１００ＩＩＩ組換え抗原のＤＮＡ及びア ミノ酸配列を表わす。配列番号１４は、ｐｔｌｃＶ　−５１１１，：　ヨッテ作 られルＨＣＶ−Ｃ１００［１２組換え抗原）ＤＮＡ及びアミノ酸配列を表わす。

図３５は、大腸菌におけるｐＲｃマー２４　、ｐＨｃｖ−５７、及びｐｎｃｖ− ｓｇタンパク質の発現を示す。レーン１には誘導前の、そしてレーン２には誘導 ２時間後の、レーン３には誘導４時間後の、ＨＣＶ　ＣＫＳ−ｃ１００抗原（ア ミノ酸１５＄９−１９３１）を発現するＩＩＨｃＶ−２４を含有する大腸菌溶解 物が含まれている。レーン４には誘導前の、そしてレーン５には誘導２時間後の 、レーン６には誘導４時間後の、ＩＩＣマーＣＫＳ−Ｃ１００ＤＩ抗原（アミノ 酸１５６９−１５７４及び１５９ｇ−１９３１）を発現すルｐｉｃｙ−ｓ７ヲ含 有する大腸菌溶解物が含まれている。レーン７には誘導前の、そしてレーン８に は誘導２時間後の、レーン９には誘導４時間後の、ＨＣｖＣＩＳ−Ｃ１００Ｄ２ 抗原（アミノ酸１５６９−１６９９及び１６２１−１９３１）を発現するｐ！Ｉ ＣＶ−Ｈを含有する大腸菌溶解物が含まれている。その結果、融合タンパク質ｐ ＨｃＶ−５７及びｐａｃｖ−ｓｓ　＋を共に、ｐＨｃマー２４融合タンパク質よ りも充分に高いレベルで発現されており、また融合タンハク質ｐＨｃＶ−５７及 びｐＨｃＶ−５１１１！　６５．０００　タル）　ンｌ：相当する見かけの移動 度を有していた。これは、予想されたｐｔｌｃＶ−５７ノ分子量６４．４５０ダ ルトン、及びｐＢｃＶ−５！ｌ　１７）分子量６４．４５８ダルトンと比較でき る値許容可能なである。

ＲＮＡは、ＲＣＶ感染チノパンツー及びヒト血清からの種々のサンプルを、まず プロティナーゼにとＳＤＳを用いて、摂氏３７度でかけて抽出した。次にＲＮＡ を、幾度かエタノール沈澱させて濃縮後、水中に再懸濁した。次いでＲＮＡサン プルを、特異的プライマーを用いて、製造業者の指示に従って、逆転写した。次 いで第二のプライマーを添加して、製造業者の指示に従って、ＰＣＲ増幅を行っ た。このＰＣＲ反応物の一部を、最初のプライマー・セット内部に位置するネス テッドプライマー（ｓｅｓｌｓｄｐｒｉｍｅ＋ｔ）を用いて、更にもう−ラウン ドのＰＣＩＩにかけた。通常、これらのプライマーには、その後のクローニング に用いられる制限エンドヌクレアーゼ認識配列も含まれている。この二度目のネ ステッドＰＣＲ反応物の一部を、アガロース・ゲル電気泳動及びサザーン・プロ ット分析して、ＰＣＩ反応の特異性を確認した。Ｐｃｔ反応物の残りは、適当な 制限酵素で消化して、目的の１１ｃＶ　ＤＮＡフラグメントのゲル精製後、適切 なりローン・ベクターに連結した。この連結生成物を大腸菌に形質転換した後、 単一コロニーを分離し、ＤＮＡ配列分析のために、プラスミドＤＮＡを調製した 。次に、目的の特異的ｉｃｙコード領域が無傷であることを確認するために、Ｄ ＮＡ配列を評価した。このようにした得られたＩＩｃＶ　ＤＮＡフラグメントは 、発現分析のために、適切なベクター中にクローン化した。

Ｂ、　ＩＩｃＶ　ＣＫＳ−ＮＳ３　（７）１１製上記した手法を用いて、ＨＣＶ の推定上のＮ３領域由来の４７４塩基対ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって 作製した。このフラグメントは、ＨＣＶアミノ酸＃　１４７３−１６０を示し、 プラント−エンド・ライゲーシヨンによって、ＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２０１ にクローン化された。結果的に生じた、ｐｔｌｃＶ−１０５と命名されたプラス ミドは、１虐Ｃプロモーターの調節下に、ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ３抗原を発現ス ル。ＩＩＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ３抗原は、ＣＫＳ（７）アミノ酸Ｈ９ｍ、リンカー ＤＮＡ配列起源のアミノ酸１２個、ＩＩｃＷ　ＮＳ３領域（アミノ酸１４７３− １６２９）からのアミノ酸１５７個、及びリンカ−ＤＮＡ配列起源のもう９個の アミノ酸により構成される。図３６は、ＩＩＩＩＣＶ−１０５抗原の模式図であ る。配列番号２４及び２５は、ｐＨＣマー１０５によって作られるＩＩＣＶ　Ｃ ＫＳ−８８３組換え抗原のＤＮＡ及びアミノ酸配列を表わす。図３７は、大腸菌 におけるｐＲｃＶ−１０５タンパク質の発現を示す。レーン１には誘導前の、そ してレーン２には誘導２時間後の、レーン３には誘導４時間後の、ＨＣＶ　ＣＫ Ｓ−１１３３抗原（アミノ酸１４７２−１６２９）を発現するｐＨＣマー１０５ を含有する大腸菌溶解物が含まれている。その結果、融合タンパク質ｐＲｃＶ− １０５は、分子量４３、０００ダルトンに相当する見かけの移動度を有していた 。これは、予想された分子量４６．４５４ダルトンと比較できる許容可能な値で ある。

Ｃ，）ＩｃＹ　ＣＫＳ−５’ＥｌｌＶ　ノｌｌ製上記にて説明した手法を用いて 、ｌ’ｌｃＹの推定上のエンベロープ領域由来の　４８９塩基対ＤＮＡフラグメ ントを、ＰＣＲによって作製した。このフラグメントは、）ＩＣＶアミノ酸＋１ ４−２７６を表わし、Ｅ！ｏＲ１−ＢｇｓＨＩ制限部位を用いて、ＣＫＳ発現ベ クターｐｊ０２１Ｊ２中にクローン化された。結果的に生じた、ｐｉ（ｃｖ−Ｉ Ｑ３と命名されたクローン（配列番号２６及び２７）は、ｌｓｃプロモーターの 調節下に、１１ｃＹ　ＣＫＳ−５’ＥＮＹ抗原を発現する。１ＩＣＶ　ＣＫＳ− ５’　ＥＮＶ抗原は、ＣＫＳのアミノ酸２３９個、リンカ−ＤＮＡ配列起源のア ミノ酸７個、ＩＩＣＹエンベロープ領域（アミノ酸＋１４−２７６）からのアミ ノ酸１６３個、及びリンカ−ＤＮＡ配列起源のもう１６個のアミノ酸により構成 される。図３８は、ｐＨｃＶ−１０３抗原の模式図である。配列番号２６及び２ ７は、ｐ）ＩＣＩ’−１０３ニよッテ作られル１（ＣＶ　ＣＫＳ−５’　Ｅ）Ｉ Ｖ　Ｉ換え抗原のＤＮＡ及びアミノ酸配列を表わす。図３７は、大腸菌における ｐｉｔｃｈ−１０３タンパク質の発現を示す。レーン１には誘導前の、そしてレ ーン５には誘導２時間後の、レーン６には誘導４時間後ノ、ＩＩｃＹ　ＣＫＳ− ５’Ｅ１１Ｖ抗原（アミノ酸＋１４−２７６）を発現するｐｔｌｃＹ−１０３を 含有する大腸菌溶解物が含まれている。その結果、融合タンパク質ｐＨｃＹ−１ ０３は、分子量４７．０００ダルトンに相当する見かけの移動度を有していた。

これは、予想された分子量４６、０９１ダルトンと比較できる許容可能な値であ る。

Ｄ、　ＨＣＶ　ＣＫＳ−３’ＥＮＶ　ノＩＩ製上記にて説明した手法を用いて、 ＨＣｖの推定上のエンベロープ領域由来の６２１塩基対［ＩＮ＾フラグメントを 、Ｐｃｔによって作製した。このフラグメントは、ＩＩｃＹアミノ酸２６３−４ ６９を表わし、ＥｅｏＲ１制限部位を用いて、ＣＫＳ発現ベクターｐ１０２０２ 中にクローン化された。結果的に生じた、ｐｉｔｃｈ−１ｏｔと命名されたクロ ーン（配列番号１７）は、ｌｔｃプロモーターの調節下に、ＩＩｃＶ　ＣＭＳ− ３’　ＥＮＶ抗原を発現する。ＩＩｃＹ　ＣＫＳ−３’ＥＮＹ抗原は、ＣＸＳの アミノ酸２３９個、リンカ−ＤＮＡ配列起源のアミノ酸７個、ＲＣマエンベロー ブ領域（アミノ酸２６３−４６９）からのアミノ酸２０７個、及びリンカ−ＤＮ Ａ配列起源のもう１５個のアミノ酸により構成される。

図３９は、９１１ｃＹ−１０１抗原の模式図である。配列番号２８及び２９は、 ｐＨｃＶ−１０１１＝よッテ作られルＨＣＶ　ＣＫＳ−３’ＥｘＶ　＋ｌｌ換、 を抗１［）ＤＮＡ　及びアミノ酸配列を表わす。図３７は、大腸菌におけるｐｉ ｔｃｈ−１０１タンパク質の発現を示す。レーン７には誘導前の、そしてレーン ８には誘導２時間後の、レーン９には誘導４時間後の、ＨＣｖＣＫＳ−３’　Ｅ ＮＶ抗原（アミノ酸２６３−４６９）を発現すルｐｔｌｃＹ−１０１を含有する 大腸菌溶解物が含まれている。その結果、融合タンパク質ｐＨｃＹ−１０＋は、 分子量４７．０００ダルトンに相当する見かけの移動度を有していた。これは予 想された分子量５［，１８１ダルトンと比較できる許容可能な値である。

Ｅ、　ＩＩｃＶ　ＣＫＳ−ＭＳ２　（１’）ｍｉｌｌｉ上記にて説明した手法を 用いて、ＨＣＹの推定上のＮＳ２領域由来の６３６塩基対ＤＮＡフラグメントが 、ＰＣＲによって作製された。

コノフラグメントは、ＩＩｃＹアミノ酸９９４−１２０５を表わし、ＥｃｏＲ１ 制限部位を用いて、ＣＫＳ発現ベクター９１０２０１中にクローン化された。結 果的に生じたｐＨｃＶ−１０２と命名されたプラスミドは、１１ｃプロモーター の調節下に、ＨＣＶ　ＣＫＳ−１１ｓ２抗原を発現する。

ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳ２抗原は、ＣＫＳのアミノ酸２３９個、リンカ−ＤＩＩＡ 配列起源のアミノ酸７個、ＨＣＹ　ＮＳ２領域（アミノ酸９９４−１２０５）か らのアミノ酸２１２個、及びもう１６個のリンカ−［ＩＮ＾配列起源のアミノ酸 により構成される。図４０は、ｐＨｃＶ−１０２抗原の模式図である。配列番号 ３０及び３１は、　ｐｉｔｃｈ−１０２によって作られるＩＩｃＶＣＫＳ−ＮＳ ２組換え抗原のＩｌＮ人及びアミノ酸配列を表わす。！！！！Ｉ４１は、大腸菌 におけるｐＲｃＹ−１０２タンパク質の発現を示す。レーン１には誘導前の、そ してレーン２には誘導２時間後の、レーン３には誘導４時間後の、Ｉ（ＣＶ　Ｃ ＫＳ−ＮＳ２抗原（アミノ酸９９４−１２０５）を発現するｐｉ（ＣＶ−１０２ を含有する大腸菌溶解物が含まれている。その結果、融合タンパクｊｒｐｔｌｃ Ｙ−１０２は、分子量５３．　Ｇｏｏダルトンに相当する見かけの移動度を有し ていた。これは、予想された分子量５１．２１３ダルトンと比較できる許容可能 な値である。

Ｆ、　ＩＩＣＹ　ＣＫＳ−１ｉｓｔ　（７）調製上記にて説明した手法を用いて 、ＲＣＶの推定上のＮＳＩ領域からの６５４塩基対ＤＮ＾フラグメントが、ＰＣ Ｒによって作製された。

このフラグメントは、ＨＣＶアミノ酸６１７−８３４を表わし、ＥｃｏＲＩ−Ｂ ＊５）ＩＩ制限部位を用いて、ＣＸＳ発現ベクターｐ１０２００中にクローン化 された。結果的に生じた、ＩＩＩＩＣＶ−１０７と命名されたプラスミドは、ｌ ｓｅブロモ−９−７７）調節下に、ｌ’ｌｃＹ　ＣＫＳ−１ｉｓｔ抗原を発現す る。ＩＩｃＶ　ＣＫＳ−１１ｓｔ抗原は、ＣＫＳノアミノ酸２３９個、リンカ− ＤＮＡ配列起源のアミノ酸１０個、及びＩＩｃＹ　ＮＳＩ領域（アミノ酸６１７ −８３４）からのアミノ酸２１８個により構成される。図４２は、ｐｌ＋ｃｖ− ＩＱ７抗原の模式図テアル。配列番号３２及び３３ハ、ｐｕｃｖ−ＩＱ７によっ て作られるＨｃｖ　ｃＫｓ−ＮＳｆ組換え抗原の［１ｌｌＡ及びアミノ酸配列を 表わす。

Ｇ、　ＨＣＹ　ＣＫＳ−ＥＮＶ　（７）ａｌ製上記にて説明した手法を用いて、 ＨＣＶの推定上のＥＩＩＶ領域由来の１０６８塩基対ＤＮＡフラグメントが、Ｐ ＣＲによって作製された。このフラグメントは、ＨＣｖアミノ酸＃　１１４−４ ６９を表わし、ＥｃｏＲＩ制限部位を用いて、ＵＳ発現ベクターｐ１０２０２中 にクローン化された。結果的に生じた、ｐＨｃＶ−ＩＯ２と命名されたプラスミ ドは、ｌｓｅプロモーターの調節下に、ＩＩＣＶ　ＣＫＳ−ＥＩＩＹ抗原を発現 ｔル、　ＩＩｃＶ　ＣＫＳ−ＥＮＶ抗原は、ＣＫＳｆ）アミノ酸２３９１Ｗ、リ ンカ−ＤＮＡ配列起源のアミノ酸７個、ＨＣｖエンベロープ領域（アミノ酸＋１ ４−４６９）からのアミノ酸３５６個、及びもう１５個のリンカ−１１１１Ａ配 列起源のアミノ酸により構成される。図４３は、１＋１ＩＣＶ−１０４抗原の模 式図である。配列番号３４及び３５は、ｐ［１ｃＶ−１０４によって作られるＩ ＩＣＶ　ＣＫＳ−ＥＮＶ組換え抗原のＤＮＡ及びアミノ酸配列を表ＨＣｖゲノム のアミノ酸３６５−５７９を表わす、８個の別個のオリゴヌクレオチドを一緒に 連結し、ＣＫＳ融合ベクターｐＪＯ２００中に、６４５塩基対ＥｃｏＲＩ／Ｂｓ ａＨＩフラグメントとしてクローニングした。

この抗原のアミノ酸配列を、ｐｎｃｖ−ｙｔ　（配列番号１）と命名した。その 結果生じた融合タンパク質ＲＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳＩＳＩは、ＣＫＳのアミノ酸２ ３９個と、リンカ−［１１１＾配列起源のアミノ酸７個、及びＩＩＣマゲノムの ＮＳＩ領域からのアミノ酸２１５個により構成される。

８０組換え抗原＋１ＣＶ−ＮＳＩＳＩの調製と特性分析９ＨＣＶ−７７は、大腸 菌に一１２株！Ｌ−１（ｒｅｃＡＩ、　ｅｓｄＡｌ、　Ｈｒ＾９６．　１ｈｉ− Ｉ、　ｂ＋ｄＲ１？、ＳｗｐＥ４４．　ｒｅｌＡｌ、ｌ＊ｃ、＃１．　ｐｌＯＡ Ｂ、ｌ＊ｃｌｌＡＤｋｌ１５゜ＴＮＩＯＩ細胞に形質転換された。組換えタンパ ク質の発現分析及び特性分析は、実施例１で説明した様に、ポリアクリルアミド ・ゲル電気泳動を用いて行った。クマシー染色でゲルを視覚化したところ、ｐＦ ＩｃＶ−７７抗原の見掛けの分子量は、推定された分子量５０．２２１１と同じ だった。ヒト血清を用いて、ウェスタン・プロット分析で判定したところ、この 組換え抗原は、確かに免疫学的反応性を有した。図４７Ａは、ｐＨｃＶ−７７の 大腸菌での発現を示す。図４７８は、大腸菌で発現されたｐＲＣマー７７抗原の イムノプロットを示す。レーン　ｌには誘導前の、そしてレーン２には誘導２時 間後の、レーン３１．：は誘導４時間後の、ＩＩＣＹ　ＣＫＳ−ＮＳＩＳＩ抗原 を発現するｐＨｃｖ−ｙｙを含有する大腸菌溶解物が含まれてい実施例１１．　 ＩＩＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳＩＳ２１１ｃＹゲノムのアミノ酸５６５−７３１を表わ す６個の別個のオリゴヌクレオチドを一緒に連結し、ＣＫＳ融合ベクターｐＪＯ ２０Ｇ中に、Ｓｏｌ塩基対ＥｅｏＲＩ／１ｌｔｓＨＩフラグメントとしてクロー ニングした。

この抗原の完全なアミノ酸配列は、ｐ［ＩｃＶ−６５（配列番号２）と命名され た。結果的に生じた、融合タンパク質１１ｃＶ　ＣＫＳ−ＮＳＩＳ２は、ＣＫＳ のアミノ酸２３９個、リンカ−ＤＮＡ配列起源のアミノ酸８個、及びＨＣｖゲノ ムのｌｌ５Ｉ領域からのアミノ酸１６７個により構成される。

Ｂ１組換え抗原ＨＣＶ−ＮＳＩＳ２の調製と特性分析ｐｎｃｖ−６ｓは、大腸菌 １１２株ＩＬ−［ｒｅｃＡＩ、ｅｓｄＡｌ、ＢｒＡ９６．　１ｂｉ−１，ｂｓｄ ＲＩ７．　ＳｇｐＥ４４．　ｒ＠ｌ＾ｌ、Ｉｓｃ／１１．　ｐｌＯＡＢ、Ｉｓｃ ｌｑＡＭＤ１５゜ＴＮＩＯ）細胞に形質転換された。組換えタンパク質の発現分 析及び特性分析は、実施例１で説明した様に、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳 動を用いて行った。クマシー染色でゲルを視覚化したところ、ｐＨｃＶ−６５抗 原の見掛けの分子量は、推定された分子量４６．２２３と同じだった。ヒト血清 を用いて、ウェスタン・プロット分析で判定したところ、この組換え抗原は、確 かに免疫学的反応性を有した。図４８Ａは、ｐＨｃｙ　−ａｓの大腸菌での発現 を示す。図４８８は、大腸菌で発現されたｐＩＩｃマー６５抗原のイムノプロッ トを示す。レーン１には誘導前の、そしてレーン２には誘導２時間後の、レーン ３には誘導４時間後の、ＩＩＣＶ［３−Ｎ５ＩＳ２抗原を発現するｐＨｃＶ　− ６５を含有する大腸菌溶解物が含まれている。

ＨＣＶゲノムのアミノ酸？！７−１１４７を表わす６個の別個のオリゴヌクレオ チドを一緒に連結し、ＣＫＳ融合ベクター、１０２００中に、３９３塩基対Ｅｃ ｅＲＩ／Ｂ＊ｍＨＩフラグメントとしてクローニングした。

この抗原の完全なアミノ酸配列は、ｐＨｃＶ　−７８（配列番号３）と命名され た。結果的に生じた、融合タンパクＩＩＣＶ　Ｃｌ５−Ｎ５ＩＳ３は、ＣＫＳの アミノ酸２３９個、リンカ−ＤＮＡ配列起源のアミノ酸８個、及びＩＩｃＶゲノ ムのＮＳＩ領域からのアミノ酸１３１個により構成される。

８０組換え抗ＲＩＩｃＶ−ＭＳＩ３３の調製と特性分析ｐＲｃＶ−７８は、大腸 菌に一１２株！Ｌ−１ｆ＋ｅｅＡｌ、ｅｎｄＡｌ、　！Ｂ＾９６．　１ｈｉ−１ ，ｈｇｄＲ１７，Ｓｅｐε４４．　ｒｓｌＡｌ、　ｌｔｃ／Ｉｆ、　ｐｌＯ＾Ｂ 、　ｌｓｃｌＱＡＤＭ１５゜ＴＮＩＯ）　ＩＩ胞に形質転換された。組換えタン パク質の発現分析及び特性分析は、実施例１で説明した様に、ポリアクリルアミ ド・ゲル電気泳動を用いて行った。クマシー染色ゲルの分析から、推定された分 子量４２．１１４１を持つタンパク質が、非常に低ｉノベルで発現している事が 示された。ウェスタン嗜プロット分析でも、免疫学的反応性は示されず、このＮ ＳＩ領域に特異的なヒト血清の同定は継続中である。

ｐＨｃ１８０　（Ｎ５ＩＳＩ−ＮＳＩＳ２）（７）構築は、ｐＨｃＹ−６５カラ ｃＤ　５ＡＣＩ／Ｂａ５ａｌ挿入体を用い、ｐ）ＩＣＹ−７７のＳｇｃｌ／Ｂｇ ｍｆｌｌベクター主鎖に、挿入体を連結して行なわれる。結果的に生じたＨＣｖ 遺伝子は、ＨＣＹゲノムのアミノ酸３６５−７３１を表わす。これは、更に＋１ ０１塩基対ＥｃｏＲ１／ＢｔｓＨｌ　フラグメントとして、ＣＫＳ融合ベクター ｐｊ０２００中にクローニングされた。この抗原の完全なアミノ酸配列は、ｐＨ ｃＶ−８Ｇ　（配列番号４）と命名された。結果的に生じた、融合タンパク質Ｈ ＣＶ　ＣＫＳ−ＮＳＩＳＩ−ＮＳＩＳ２は、ＣＫＳノアミノ酸２３９個、リンカ −ＤＮＡ配列起源のアミノ酸７１’ｌ、及びＨＣｖゲノムのＮＳＩ領域からのア ミノ酸３６７個により構成される。

８０組換え抗原１１ｃＶ　ＣＫＳ−ＮＳＩＳＩ−ＭＳＩＳ２　ノ調製と特性分析 ｐｈｃＶ−８０は、大腸菌に一１２株！Ｌ−ＨｒｅｃＡ１．　ｅＩｌｄＡｌ、　 Ｈｒ＾９６．　ｊｂｉ−１，ｈｓｄＲ１？、　ＳｗｐＥ４４．　ｒｓｌＡｌ、ｌ ｉｅ／１１．　ｐｌｆｌＡＢ、ｌ＊ｃｌｑＡＤＭＬ５゜ＴＮＩＧ＋細胞に形質転 換された。組換えタンパク質の発現分析及び特性分析は、実施例１で説明した様 に、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動を用いて行った。クマシー染色でゲルを 視覚化したところ、ｐ［１Ｃｖ−１１０抗原の見掛けの分子量は、推定された分 子量６８．４５４と同じだった。ヒト血清を用いて、ウェスタン・プロット分析 で判定したところ、この組換え抗原は、非常に高い免疫学的反応性を示した。図 ４９＾は１．Ｈｃｙ　−ｇｏの大腸菌での発現を示す。図４９８は、大腸菌で発 現されたｐＨｃＶ−８０抗原のイムノプロットを示す。レーン１には誘導前の、 そしてレーン２には誘導２時間後の、レーン３には誘導４時間後の、１ｌｃＶ　 ＣＫＳ−ＮＳＩＳＬ）ｌＳＩＳ２抗原を発現すルｐＨｃＹ　−８０を含有する大 ｍａ溶解ｓが含まれている。

実施例１４．　ＩＩｃＹ　ＣＫＳ−全長１ｉｓｔｐＨｃｖ−９２（配列番号５、 全長１ｉｓｔ　）　（Ｄ構築は、ｐＨｃＶ−７８（配列番号３　）　カラ０）　 Ｘｈｏｌ／Ｂ＊＊旧挿入体を用い、ｐＨｃＶ−８０＜配列番号４）のＸｂｏｌ／ Ｂ＊ｌＨＩベクター主鎖中に、挿入体を連結して行なわれる。結果的に生じた１ ｌＣｖ遺伝子は、ＨＣｖゲノムのアミノ酸３６５−８４７を表わす。これは更に １４４９塩基対ＥｃｏＲＩ／Ｂｅｍ！（Ｉフラグメントとして、ＣＫＳ融合ベク ターｐＪ０２００中にクローニングされた。この抗原の、完全なアミノ酸配列は 、９１（ＣＶ−９２（配列番号５）と命名された。結果的に生じた、融合タンパ ク質１１ＣＶ　ＣＫＳ−全長ＮＳＩは、ＣＫＳのアミノ酸２３９個、リンカ−Ｄ ＮＡ配列起源のアミノ酸７個、及びＨＣｖゲノムのＮＳ１領域からのアミノ酸４ ８３個により構成される。

８０組換え抗原ｐＨｃＶ−９２の調製と特性分析９１１ｃＹ−９２は、大腸菌に 一１２株ＫＬ−Ｈｒｅｅ＾１．　ｃａｄＡｌ、Ｄｒ＾９６．　ｔｈｉ−ｌ、　ｂ ＋ｄＲ１７，５ＱＰＥ４４．　ｒ＋ｌ＾Ｉ、ｌＩｃ／Ｉ１．　ｐｌ、ｏ＾８．　 ｌｔｃｌｑＡＤＭ１５゜ＴＮＩＯ）細胞に形質転換された。組換えタンパク質の 発現分析及び特性分析は、実施例１で説明した様に、ポリアクリルアミド・ゲル 電気泳動を用いて行った。クマシー染色でゲルを視覚化したところ、発現レベル は実質検知不能であり、ウェスタン・プロットは免疫学的反応性をまったく示さ なかった。ＩＩｃＶＨ３Ｉのこの領域を認識する血清は今も同定中である。

本発明は、ＨＣＶゲノムの明瞭な抗原性領域を表わす、今までに例を見ない組換 え抗原を提供し、この抗原は、ＩＩｃＹと接触のあった個体からのテスト・サン プル中で抗体及び抗原を検出及び／又は確認するための試薬として用いることが できる。ＮＳＩタンパク質は、非構造性膜糖タンパク質であると考えられ、致命 的なウィルス感染に対抗する防御的免疫反応を宿主中に誘起させ得る。

組換え抗原は、本明細書に記載し、実施例で説明したアッセイ・フォーマットに て、単独で、あるいは組合せて使用できる。

これら組換え抗原を使用して、ウィルス複製の特異的阻害剤を開発し、例えばワ クチンのような治療目的に利用することも可能である。これら抗原の使用及び本 明細書に記述した様な本発明の特定の具体例の他の応用や変形は、当業者には明 白であろう。したがって、本発明は、添附の請求項の範囲によってのみ制限され ることを意図している。

配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人　ＤＥＶＡＲＥ、Ｓ、　ＤＥＳＡｌ、Ｓ、　ＤＡＩＬＥＹ、５（ｉ ｉ）発明の名称：ＮＳ１領域由来のａＣＶ合成ペプチド（ｉｉｉ）配列の数：３ ５ （ｉｖ）宛先 （Ａ）宛名：　ＡＢＢＯＴＴ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ（Ｂ）通り・ＯＮＥ　 ＡＢＢＯＴＴ　ＰＡＲＫ　ＲＯＡＤ（Ｃ）市：　ＡＢＢＯＴＴ　ＰＡＲ区 （Ｄ）州：　ＩＬＬＩＮＯＩＳ （Ｅ）国：ＵＳ （Ｆ）　ＩＩ便番号：　６００６５−３５００ｈ）コンピューター読取り可蛯型 式： ％式％ （ｖｌ）現出願データ： （＾）出願番号 （８）出願日。

（Ｃ）分類 （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報・ （Ａ）氏名：　ＰＯＲＥＭＢＳＫｌ、　ＰＲＩＳＣＩＬＬＡ　Ｅ（Ｂ）登録番号 ・３３．２０７ （Ｃ）参照／事件番号：　４１１４３ＰＣ，０２（ｉｘ）通信情報 （＾）電話：　７０８−９３７−６３５３（Ｂ）ファックス：　７０１１−９３ ７−９５５６（２）配列番号：１ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝４６３ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 Ｏｆ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＱ：１：Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｐｈａ　Ｖａｌ　 Ｖａｔ　ＩＩｓ　ＩＩｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｓ＠ｒ　 Ｔｈｒ　＾ｒｇＬｓｕ＋　５　Ｔｏ　１５ Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｕ　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ａ！ｎ　Ｃｙｓ　Ａ ｓｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ（２）配列番号＝２ （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ：４１４ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：Ｖａｔ　Ｃｙｓ　Ｍｓｌ　Ｔｈｒ　 Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　 Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ＡｌｅＴｈｒ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｐ ｒｏ　Ｃｙｓ　Ｓｉｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ＾Ｉａ　Ｌｅ ｕ３５５　３６０　３錦 Ｓ＠ｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｓｕ　ＩＩｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＧｌｎ　Ａ ｓｎ　ｌｉｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　ＴｙｒＬｓｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌ ｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｓｓｒ　Ｉｔｓ　Ａｌａ　Ｓｔｙ　Ｔｒｐ　Ａｌ ａ　ｌｌｅ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ（２）配列番号・３ （］）配列の特徴 （八）配列の長さ・　３７８ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トボロノー、直鎖状 （ｉｉ）配列の種類　ペプチド （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３：Ｍｍ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　ｌ ｌｅ　ｌｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ　ＴＷ　Ａｌａ　５４１　Ｔｈｒ　閥Ｌ ｅｕ　Ｐｎ５１　５　１ＯＴ５ Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｑ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　 Ｇｌｕ　Ａｒｇ　ｌｌｅ　ＩＩｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ＴｈｒＡｓｐ　Ｈｉｓ　Ｇ ｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｒｇ＾ｌａ　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌ ａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ｖａｔＣｙｓ　Ｍａｌ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ 　Ａｓｐ　ｌ−１ｉｓ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌ ａｕ　Ａｌａ　Ｇ撃■ Ｔｇ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌ ｅｕ　Ｇｌｕ籍ｒ　Ｖａｔ　Ｇｌｙ＾ｓｐ　Ａｓｎ１６５　１７０　＋７５ Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｌｓｕ　Ｇｌｙ　ｌｌｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　 Ｔｙｒ　Ａｒｇ＾Ｉａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　ＩＩｓ　Ａｒｇｌｌｌｏ　１１３５　 １９０ Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ＩＩｓ　Ｈｔｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａ１Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇ ｌｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ入ｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｓｕ　ＡｓｐＳｅｒ　Ｌｓｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ 　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｐｈｓ 　Ｐｈｉ　ＣｙｓＰｈｅ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　 Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｉ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ３ｏ ５　３１０　３１５　３２０ （２）配列番号・４ （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ・　６２２ （Ｂ）配列の型、アミノ酸 （Ｃ）鎖の数−一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類二ペプチド （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：Ｍｓｌ　５ａＩＰｈｅ　Ｖａｔ　Ｖ ａｌ　ＩＩｓ　ＩＩｓ　Ｐｒｃ＾ｌａ　ＡＴＯＴｙｒ＾ｌａ　Ｓａ＋　Ｔｈｒ　 Ａｒｇ　ＬＩＩＬｌｌ　５　１０　１５ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＡＬａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌａｕ　 ＩＩｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　１ｒｐ２９０　２９５　３ ０Ｇ Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｉｒ　ＩＩｓ　Ａｌａ　Ｓｉｒ　 Ｔｒｐ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ（２）配列番号　５ （１）配列の特徴 （＾）配列の長さ＝７３８ （Ｂ）配列の型、アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　 Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｇ１７ｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ 　ｌｌｅ　Ｇｌｕ　Ｍｅ■ Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　 Ｖａｌ＾ｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ＬｅｕＡｓｐ　Ａｌａ　Ｔｈ ｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｒ ｐ　ｌｌｅ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ＡｒｇＱｌｎ　Ｘａａ （２）配列番号＝６ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数・−末鎖 （Ｄ）トポロジー：環状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ　（ゲノミック）（ｉｘ）配列の特徴： （＾）名称／特徴を表す記号・ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　１３０．、ＨＩ３ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＩ）　ＮＯ：６：３７０　３７５　３Ｈ２ Ｏ℃Ｇ９Ｇσ℃αゴα：ＴＧＤ３Ｃπス℃πテ℃αναχｍＩ℃ＣＣＴｒｆｉＣ ＣＣ１３Ａ　７Ｃσ℃π工ｎ２１１７ατｍ−α刀■α０９ＮＣＧ’ｌ”αｍゴ ゴＣＺ蟻ＴαゴＣに０ゴα入追ＴＡＴＣＴＣ超■３〃ＣＧＣＧＣＡＣＡＴｒ　３ 　ＧＴｆＧ　にσ口ＡＡＱＡ　ＡＡＣＣＡＴＴＡＴＴ　ＡＴＣＡＴＧＡＣＡＴ　 ４４３７ＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣ Ｔη℃ＧＴＣＴ　ＴＣＡＡ　４４８１（２）配列番号ニア （１）配列の特徴 （＾）配列の長さ・　３９６ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｆ）配列の種類；タンパク質 （Ｘ］）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　％Ｑニア：Ｍｅｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｉ　Ｖａｌ　 Ｖａｌ　ＩＩｓ　ｌｌｅ　ＰＩｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｔｙ＋＾ｌａ　！３ｅｒ　 Ｔｈｒ＾ｒｇＬａｕ＋　５　１０　１５ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＶａＩＡｓｐ　ＩＩｓ　Ａｓｎ　Ｇ ｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｍａｌ　ｌｌｅ　Ｖａｌ　ＨｉｓＶａｌ　Ｌａｕ　Ｇｌ ｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｓｓｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒ ｇ　Ｉｔｓ　１ｍ　Ｖａｌ　Ａ１ｍ丁ｈｒＡｓｐ　ｌ−１ｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ 　ＶａｌＡｌａ　ＡｒｇＡｌａ　ＶａｔＧＩＬＩＡｌａＡｌａ　ＧｌｙＧｌｙＧ ｌｕＧｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｉ ｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ＩＩｓ　Ｖａｌ　Ａａｎνａｔ　Ｇｌｎ 　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　１１１１　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈ ｒ　ｌｉｅ　ＩＩ＠　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｖｉ■ Ｔｏｏ　１０５　１１０ Ａｌｉ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　 Ｇｌｙ　Ｍａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＡＬａ　Ｖａ１Ｖａｌ　ＬＪＬＩ　 Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　 Ｓｉｒ　Ａｒｇ〜ａ　Ｔｈｒ　ＩＩｓ＋４５　１５０　１５５　１６０ Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ａｒｇ＾ｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｈａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｙ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ丁６５１７０１７５ Ａｓｎ　Ｐｈｉ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｔｙｒ　 Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　ｌｌ５１８０　１８５　１ ’ａＯ ＡｒｇＡｒｇＴｙｒνａｌＡｓｎＴｒｐＧｌｎＰｒｏＳａｒＰｒｏＬｅｕＧｌｕ ＨＩｓｌｉｅＧｌｕＭ＠電＋９５　２００　２０５ Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇ７　Ｖ ａｔ　Ａｓｐ　Ｔｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ＬａｕＡｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓａ ｒ　Ｔｈｒ　１ｍ　Ｓａｔ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ 　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＡｓｎ　Ｌｙｅ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　 Ａｓｎ　ＡｒＱ＾Ｉ’Ｑ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ入ｉｐ　Ｖａｔ　ＬｙＳρｈａ　Ｐｎ ｏ　ＧｌｙＧａｙ　Ｇａｙ　Ｇｉｎ　ＩＩｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ 　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　＃ｇ　Ｇａｙ　Ｐｒ。

Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ｖａｔ＾ｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｎｇ　Ｌｙｓ　Ｔ ｈｅ　Ｂｙ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｓａｔ　Ｇ１ｎＰｒ。

Ａｒ９Ｇ）ｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｒｔ　Ｐｒｏ　Ｉｔｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　 Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＡｒｇＴｈｒ　Ｔｒｐ　Ａ ｌａ　ＧＬｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔ ｙｒ　Ｇｌｙ＾ｓｎ　Ｇｌｕ　ＧｌｙＣｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ 　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ａｒｇ 　Ｐｒｏ　５ｉｒＴｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　 Ａｒｇ〜ｇｓｅｒＡｒｇ＾ｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａ１３５５　３６ ０　３ａ５ Ｉｔｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　 Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　ｌｉｅ　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　 Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｌａ（４）配列番号・８ （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）　ＭＡの数ニー末鎖 （Ｂ）存在位置・　１３０．　、２４７２（ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：８：ＧＡＡＴＴＡＡＴｒＣＣＱＡＴｒＡＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣＴ ＣＡＴｒＡＧＧｍｍにＣπ薗ＡＴ母下℃α３ＣＴＣＧＴＡ了−Ｗω−１Ｔひα乃 メハ嶋Ｗは江油ツｐに１囚α’Ｔ　Ｔｅ３　Ｇｒｒ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＣＡＧ　 ＣＴＧ　ＧＣｒ　ＧＣｒ　ＣＯ２Ｇ３Ｔ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＡＣＣＧＣＴＴｒＣ ２１３U Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｖａｔ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　 Ｐｒｏ　Ｇｒｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ＰｈａαｎπＴｈＡＧＣα ！　ｆｆ１ＡＡ　ＣＧＧＡＴｒＣＡＣＣ３ＴＴα−ｎ　３１９２πス虹π「℃α ℃Ｎ論ＡゴＧ　ＴＧＡＡＴα℃Ｃ呻人工ＡｌＩＣαゴπＣンＧＡＡ（メＴＡπｎ 虹α℃羽♀工工超ＴＴＡＡＴ心酊Ｇ０３ＣＡＭ田π口αひ１ｒχに工Ｍ閃ｍダダ ひ刀σａＣＧｒＣＧＴπＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴ（エラ刀７ツ刀鳩刀ＡＴ Ｃε℃ＪＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴ　４に３２ＧＴＣＴｒＣＡＡ　５６００ 下ｈｒＡｓｐ　ｌ−１ｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　ＡｌａＡｒｇ　Ａｌａ　 Ｖａｔ　ＧｌｕＡｌａ　ＡｌａＧｌｙ　ＧｌｙＧｌｕＶａｔ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　 Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｐ　）Ｉｉｓ　Ｇｌｎ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ 　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌａｕ＾１ａ６５　７０　７５　［１０ Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　ＰｈｅＳｉｒ　Ａ ｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ＩＩ＠　Ｖａｌ　Ａｓｎｇ５　９０　９５ Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｓ＠ｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　ｌ−１ｉｓ　Ｇｌ ｙ　ｌｌｅ　ＡＳＰ　Ｐｒｏ　メー！ｎｌｌ５　メｕｇ　コu１１「 ＩＩｓ　ＧｌｙＴｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ丁ｈ ｒＡｌａ　Ｇｌｙ　ＡｌａＡｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａ１Ｇｌｙ　Ｌａｕ＾ｌａ　Ｇｌ ｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｖａｔ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｇｌ ｙＬｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ（２）配列番号５１０ （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ：　１５４８塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー・環状 （ｉｉ）配列の種類＝ＤＮＡ　（ゲノミック）（Ｌｘ）配列の特徴。

（＾）名称／特徴を表す記号：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　１．．１５４ｇ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０：ＧＴＡＴＧＴＡＴＧＡＣＧＣＧＣ ＧＣＣＧＡＴＣＡＴＣＡＧＴＣＡＧＧＡＡＱＡＧＡＡＣＧＴＣｒＧ（Ｉｎ　２４ ０ＶａｌＣｙｓＭｅｔＴｈｒＡｒｇＡｌａＡｓｐＨｉｓＧｌｎＳａｒＧｌｙＴｈ ｒＧｌｕＡｒｇＬｅｕＡｌａＡＧＧＣＡＴＧＣＴＡＡＧ　１シ１ （２）配列番号・１１ （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ＝５１６ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類　タンパク質 （ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１：Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ 　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇ７　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　 ｌ−１ｉｓ　Ｖａｌ　Ａｌ■ Ｈｉｓ　ｌｉｅ　Ｔｔｖ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｕｇ　 Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｃｙｓｓｏｏ　ｓｏｓ　ｓ ＋。

（２）配列番号　１２ （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ　１６３２塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロノー　環状 （１１）配列の種類　ＤＮＡ　（ケノミノク）（１ｘ）配列の特徴 （＾）名称／特徴を表す記号・ＣＤ５ （Ｂ）存在位置　１．　、１６２３ （Ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２：（２）配列番号＋１３ （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ：５４１ （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤＮ０：Ｌ３：Ｖａｌ　Ｌｅｕ＾ｓｐ　Ａｌａ　Ｇ ｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｓａｒ＾ｒｇ　Ａｌ ａ　Ｔｈｒ　ｌｌｅ＋４５　１５０　１５５　１６０ ＰｒｏＴｒｐＡＩＰＭ　Ａｓｐ＾、ｒｇ　ＰｈｅＡｌａＧｌｕＧｌｙ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｕ　ＴｈｒＶａｌＧｌｙ＾ｓｐ＋６５　１７０　１７５ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｖａｔ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｓｉｒ　 Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｉｔｓ　Ｇｌｕ　Ｍ・ｔＶａｌ　Ａｌｉ　Ｇ ｉｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ＾ｓｐ　Ｔｈ ｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ＬｅｕＡｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ 　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓａｔ 　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　Ｖａｔ　Ａｌａ　Ｓｉｒ　Ｓｉｒ　Ｓｅｒ　Ａ１１ｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ 　Ｌｅｕ　Ｓ＠ｒ　Ｎｍ　Ｐｒｏ　Ｓｓｒ　ＩＪｕ　Ｌｙｓ（２）配列番号、１ ５ （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ　４９６ （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トボロノー、直鎖状 （１１）配列の種類　タンパク質 （ｘｌ）配列＋　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５：Ｑｌｕ　Ｖａｔ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ 　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｔａ　ＰｈｅＳｅｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　 ＩＩｓ　ｖａｔ　ＡｓｎＬｅｕρｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｇｌ ｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ工ｙｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。

（２）配列番号　１６ （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：　１１６１塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー、環状 （１１）配列の種類・ＤＮＡ　（ゲノミック）（ｉｘ）配列の特徴： （＾）名称／特徴を表す記号ＣＤ５ （Ｂ）存在位置　１．．１１６１ （ｘｉ）配列・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６α７　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＴＧ　ＣＧ Ｔ　ＧＣＴ　ＴｒＣＡＣＣＧＭ　ＧＣＴ　ＡＴＧ　ＡＣＣαｆＴＴＡＣＴ（ＴＧ ＣＴ　８６４Ａｌａ＾ｌａ　Ｓａｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｈ＠Ｔｈｒ　 Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｍ＠ｌ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｓａｒ　Ａ１ｍ（２）配列 番号＝１７ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：３８７ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類、タンパク質 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７：Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ 　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｇｌｎ　Ｓｉｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ ＾、ｒＱ　Ｌｌｕ　Ａｌａ１１ｅ　Ｍｅｔ　ＰｈｅＡｌａρｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌａ ｕ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　ｌｌｅ　Ｌｓｕ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　ｌ− １ｉｓ（２）配列番号：１８ （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ：　１１７９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｂ）存在位置：　１．．１１７９ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８：１１５１２ｏ１２５ ＡＩＩＡ　ＣＴＧ　ＡＣＣＣＣＧ　ＡＴＣＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　Ｇ３Ｔ　（ Ａ３　ＣＴＧＧＩＣＣＴＧππαππ℃　１（５）Ｌｙｉ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐ ｒｏ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　ＬａｕＡａｐ　Ｌｅ ｕ　Ｓ＆　Ｑｌｙ　Ｔｒｐ（２）配列番号・１９ （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・　３９３ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トボロノー　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９：Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ 　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　ＰｈｅＢａｒ　Ａｒｇ　 Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｉｌａ１８０　１巧　１９０ σｒＴＡＴＣＧＣｒＣＣＧＧＣｒＧｒＴＣＡ３ＮＸ−ＡＡＣＴＧＱＣ−ＫｓＭＡ （ＸＣＧＭｓＫＣＴＴｏ　１２４１１ｖａ目Ｉｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｉｍ　Ｖ ａｌ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔ ｈｒ　Ｐｈ５（２）配列番号−２１ （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ・　５９７ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：ｌ！鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （Ｘｌ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１：Ｍａｎ　Ｓｉｒ　Ｐｈｉ　ｖａｌ 　ｖａｔ　Ｉｔｓ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ａｉａ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　ＳＭ　 Ｔｈｒ　Ａｒｇ　ＬＪＬＩｊ　５　１０　１５ ＰｒｏＧｌｙＬｙａρｒｏＬｅｕＶａｔＡｓｐ１ｍＡｓｎＧｌｙＬｙｓＰｒｏＭ ｅｔ１ｍＶａｌＨ１ｓＶａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　＃ｇ　Ｇｌｕ 　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　ｌｉｅ　Ｖａｔ　ＡＬｓ Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｌａ　 Ｖａｌ　Ｇｌｕ　１ｍんａ　Ｇｌｙ　Ｇｔｙ　Ｇｌｕ５０５５　ω Ｖａｔ　Ｃｙｓ　Ｍａｔ　Ｔｈｒ＾勺＾１ａ　Ａｓｐ　Ｈｋ　Ｇｌｎ　ｆｉｓｔ 　ＧＩ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　ＬｅｕんａＧｌｕ　Ｖａｌ　ＶＩ　Ｇｌｕ　 Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｌｅ　Ｐｈｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　 ＩＩｓ　Ｖａｔ　Ａｉａ四　９０９５ ＶａｔＧｌｎＧｌｙＡｉｌ）ＧＩＬＩＰｒｏＭｓｌＩｌｅＰｒｏＡｌａＴｈｒＩ ＩｓＩＩｓＡｒｇＧｉｎＶａｔＴｏｏ　１０５　１１Ｇ ＡｌｌｌＡｓｐ＾ｓｎＬｅｕＡｌａＧｌｎＡｒＱＧｌｎＶａｌＧｌｙＭａｎＡｌ ａτｔｖＬＪＩＪＡｌｌｌＶｍＰｒｏ　ｌｌｅ　ｌ−１ｉｓ　Ａｓｎ　Ａｌａ　 Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌｅ　ＰＭｅ　Ａｓｎ　ＰｒｏんＩＪ’ｌ　ＡＩＪ　Ｖａｌ 　Ｌｙｓ　uａｔ ）／ａｌ　Ｌｓｕ　Ａｓｐ　Ａｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ＾ｌａ　Ｌｅｕ　 Ｔｙｒ　Ｐｈｓ　Ｓｓｒ＾ｒｇ　Ｎｍ　Ｔｈｒ　１ｌｅＰｒｏＴｒｐＡｓｐＡｒ ｇＡｓｐＡｒｇ　ＰｈｅＡｌａＧｌｕ　Ｇａｙ　ＬｅｕＧｌｕ丁ｈｒ　Ｖａｌ　 ＧＪ’ｆ　Ａｓｐｌ　６５　１７０　ｊ　７５ Ａｓｎ　Ｐｈｅ　ＬｅｕＡｒｇ　Ｈｉｓ　Ｌｓｕ　Ｇｌｙ　ｌｌｅ　Ｔｙｒ　Ｇ ｌｙＴｙｒＡｒｇ　ＡＪａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｓ　ｆｉｓｔ　８０　１１１５　１９ ０ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　ｖａｔ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｓｉｒ　 Ｐｒｏ　Ｌｌｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　ｌｉｅ　Ｇｌｕ　Ｍ＠１＋９５　２００　２ ０５ Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｌｓｕ　Ａｒｇ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ＩＩｓ　Ｈｉｓ　ＶａｔんａＶａｔ　Ａｌａ　Ｇｉｎ 　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇ１ｙＶａｌ＾ｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｕ入ψｊｕ２２５　Ｚ３０　２３５　２４０ Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｉｒ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　ｋＡａ＋　Ｔｒｐ　ＬｙＳ 　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　ＩＩｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ＰｒB 丁ｈｒ　ｌｊｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　 ＴｙｒＡｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ＾Ｊａ　Ｖａｌ　Ｇ１ｎ２７５　２８０　２ａ５ Ａｓｎ　Ｇｌｕ　ＩＩｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　 Ｔｈｒ　Ｌｙｉ　Ｔｙｒ　ＩＩｓ　Ｍ＠ｔ　Ｔｈｒ　ＣｙｓＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ａ ｌａ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａ ｌａ　１１＊　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ（２）配列番号　２２ （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１７９７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー・環状 （ｉ］）配列の種類　ＤＮＡ　（ゲノミック）（ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）名称／特徴を表す記号・ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　１．．１７９７ （ｘｉ）配列・ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２・１００　１０５　Ｎ。

σ汀απαπｒσＧαゴαπσＧαπαπＴにＴＧＣＣＴＧ　Ｔ迫ＡＣＣα訂　 １（９）Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　 Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　ＧＩｙ（２）配列 番号・２３ （１）配列の特徴 （＾）配列の長さ　５９９ （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）配列の種類：タンパク質 （ｘｌ）配列　ｓＥＱ　Ｉｏ　ＮＯ二２３：Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ　 Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　ｌＪｕ　Ｔｙｒρｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａ ｌａ　Ｔｈｅ　ｌｌｅ＋４５　１５０　１５５　１６０ Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｓｅ「Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａ ｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｍ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｓｉｒ　Ｌａｕ（２）配列番号：２４ （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ：　１２５１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー、環状 （ｉｉ）配列の種類＝ＤＮＡ　（ゲノミック）（ｉｘ）配列の特徴： （＾）名称／特徴を表す記号；ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：　１．．１２５１ （ｘｉ）配列：　ＳＥｏ　１０　ＭＯ：２４：ｆ：＆　ＣＣＧ　ＴＣＧ　ＡＣＴ 　ＣＧＡ　ＡＴＴ　ＣＱＡ　ＧＣＴ　ＣＧＧ　ＴＡＣＣＣＴ　ＧＡＧ　ＡＱＡ　 ＡＴＣＡＣＧσ了　７６８／Ｖｐ　Ｐｒｏｂ＠ｒ　ｒｈｒ　Ａｒｇ　ｕｓ＾ｒｇ 　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｔｙｒρｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　ＩＩｓ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ（ ２）配列番号＝２５ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝４１７ （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｄ）トポロノー：直鎖状 （１１）配列の種類　タンパク質 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：２５ＧＩＹＬｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ｌ ｌｅ　Ｔ’ｌｒ　ＡｒｇＰｈｅ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａ ｒｇＰｒｏ　５ｉｒ２７５　２８０　２ａ５ ｙｓ （２）配列番号：２６ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・１２７５塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二環状 （ｉｉ）配列の種類　ＤＮＡ　（ゲノミック）（ＩＸ）配列の特徴・ （＾）名称／特徴を表す記号：　ＣＤ５（Ｂ）存在位置：　１．．１２７５ （ｘｉ）配列　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６：ＧＴＴＣＴＴＧＭＣＧＣＧＣＧＣＧ ＴＧＡＡＴＱＡＧＧＴＧＣＣＱＡＧＣＧＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧＣＡ　１４４Ｖ ａｔ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｓｉｒ　Ｇｌｙ　Ａ ｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　ＩＩｓ　ＩＩｓ　Ｖａｌ　ＡＬａ（２）配列番号：２７ （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ：４２５ （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （１１）配列の種類・タンパク質 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７Ｍａｌ　Ｓｉｒ　Ｐｈｉ　Ｖａｔ　 Ｖａｔ　ｌｌｅ　ＩＩ＠　Ｐｒｏ　Ａｌａ＾ｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔ ｈｒ＾−ＩＪｕｌ　５　１０　１５ ＰｒｏＧｌｙＬｙｓＰｒｏＬａｕＶａｌＡｓｐＩＩｓＡｓｎＧｌｙＬｙｓＰｒｏ ＭｅｔＩＩｓＶａ１１−１ｉｓＶａｔ　Ｌｅｕ　Ｑｌｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒ ｇ　Ｇｌｕ　Ｓｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　ｌｌｓ　ｌｉｅ　Ｖａ ｔ　ＡｌａＴｈｒ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｒｇ 　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕん＊　Ａｌａ　Ｇｌｙ　（ｓｙ　ＱｌｕＶａｔ　Ｃｙ ｓ　Ｍａｔ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ＾Ｉａ　Ａｓｐ　ＨｉＩＩＧｌｎ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ 　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ＡｌａＬｉ　７０　７５　１３０ ＧｌｕＶａｌＶａｊＧｌｕＬｙｓＣｙｓＡｌａＰｈｅＳｉｒＡｓｐＡｓｐＴ１１ ｒＶａＪｌｉｅＶａｔ＾５ｎａｓ　ｓｏ　５ｓ Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｍ＠口ｌ＊　Ｐｒｏ　Ａｌ ａ　Ｔｈｒ　ｌｌｅ　ｌｉ＠Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｖａｌｌｏｏ　１０５　１１０ Ａｈａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　ＧＪｎ　Ｖａｌ　 Ｇｌｙ　Ｍａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａ１Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａ ｓｐ　ＡＬａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ＾Ｉａ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　ＰｈｅＳｅｒ 　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　１ｉｅＰｒｏＴｒｐ　ＡｓｐＡｒｇＡｓｐＡｒｇＰ ｈｓＡｌａＧｌｕ　０１　ＬｅｕＧｌｕ丁ｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｙ＾Ｓｐ＋　６５　 １７０　１７５ Ａｓｎ　Ｐｈｉ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　ＩＩｓ　Ｔｙｒ　 Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｐｈｉ　ｌ１ｅＡｒｇ＾ｒｇ　Ｔｙ ｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎτｒｐ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｓａｒρｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　 Ｈｉｓ　Ｉｔｓ　Ｇｌｕ　ＭａｔＶａｌＡｌａＧｌｎＧｌｕＶａｌＰｒｏＧｌｙ ＴｈｒＧｌｙＶａｌＡｓｐＴｈｒＰｒｏＧｌｕＡａｐＬａｕＡｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓ ｅｒ　Ｔｈｒ　ＡｆＱ　１ｍ　Ａｒｇ　ＡｒＱ　Ｂａｒ　ＡｒＱ　ＡＳｎ　Ｌａ ｕ　０１７　ＬｙＳ　ｖａｔ　ｌｌ５Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ 　Ｇｌｙ　Ｐｈｉ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｍａｌ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　ｌｉｅ 　Ｐｒｏ　ＬｅｕＡｒｇ　ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　 Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｑｙ（２ ）配列番号：２８ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：　１４０１塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー・環状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ　（ゲノミック）（ｉｘ）配列の特ａ： （＾）名称／特徴を表す記号：ＣＤ５ （Ｂ）　存在位ｆｌ　：　１．．１４０１（ｘＤ配列：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ： ２８：（２）配列番号　２９ （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ・　４６７ （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列＋　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９：）ｖｌｅ＋　Ｓ＠ｒ　Ｐｈｅ　Ｖ ａｌ　Ｖａｔ　ｌｌｅ　ＩＩｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　ＡＬａ　Ｆ ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　浮■ ＋　５　１０　１５ Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｌａ　 Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　１ｍ　Ｇｈｌ　Ｇｉ　ＧｌｕＶａｌ　Ｃｙｓ　Ｍｅｔ 　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｐ　ｌ−１ｔｓ　Ｇｌｒ＋　Ｓｉｒ　Ｇｌｙ　 Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌａｕ＾Pａ Ｐｒｏ　ｌｌｅ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　 Ａｓｎ　Ｐｒｏ　鳩Ａｌｅ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ　Ｖａ１Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｓｓｒ　 Ｔｈｒ　Ａｒｇ　ＩＩｓ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　 Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　５ａｒ２４５２父　２５５ （２）配列番号・３０ （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ：　１４２２塩基対 （Ｂ）配列の型、植成 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー　環状 （ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ　（ゲノミ・ツク）（１ｘ）配列の特徴 （＾）名称／特徴を表す記号・ＣＤ５ （Ｂ）存在位置＋　１．．１４２２ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０＋Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ 　Ｌａｕ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　ｌｌｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓρｒｏ　Ｍｓｌ　 ＩＩｓ　Ｖａｔ　Ｈｔｓｖａｔ　ＣｙＳｖａＩＴｈｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｐ 　ｌ−１ｉｓ　Ｇｌｎ　Ｓｉｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　ＡｒＱ　Ｌｌｌｕ　 Ａｌ■ Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ＶａｌＧｌｕ　Ｌｙｓ　ＣｙｓＡｌａ　Ｐｈｅ　５ｅｒＡｓｐ ＡｓｐＴｈｒＶａｌ　ｌｌ５Ｖａｌ＾５ｎｖａｔ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇ ｌｕ　Ｐｒｏ　Ｍａｔ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ＾Ｉａ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　ＩＩｓ　Ａｒ ｇ　Ｇｌｎ　Ｖａｌｌｏｏ　１０５　＋１０ Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌｓｕ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　 Ｇｌｙ　Ｍａｔ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｖａ１Ｐｒｏ　ＩＩｓ　Ｈ ａｓ　Ａｓｎ　Ａｌａ　ＧＩＬＩ　ＧＩＬＩ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ 　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｌｙｓ　Ｖ≠■ ＋３０　１３５　４４０ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｓｉｒρ ｒｏ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　ＩＩｓ　Ｑｌｕ　Ｍｅｔｌｓｓ　２００　２０ ５ ＬｙｓＡｓｎ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ｇｌｎ　Ｉ Ｉｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ＡｌａＧｌｎＧｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ 　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ 　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ｌｉｅ　Ｇ１ｎＭｅｔ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ＾５ｒＩＶａｌ　Ａ ｓｐ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐ ｒｏ　Ｇ１ｎＧｌｙ　Ａｌｌ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　ｕｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ 　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　ＧＩ　Ｂａｒ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　ＴｙｒＳｉｒ　Ａ ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓａｔ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｉｒρｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｉｔ ｓ　Ｓｓｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ＧｌｙＰｈｅ　Ａ「ｇ　Ａｌａ　Ａｌａ 　Ｖａｔ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｌａ 　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ（２）配列番号、３３ （ｉ）配列の特徴 （＾）配グＩＩの長さ、４６７ （Ｂ）配列の型；アミノ酸 （Ｄ）トボロノー　Ｉ！鎖状 （１１）配列の種類、タンパク質 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３：Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ 　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　ＩＩｓ 　ｌｌｅ　Ｖａｔ　ＡｌａＧｌｙ　Ｌａｕ　ｌｌｅ　ＨＩｓＬｓｕ　Ｈｉｓ　Ｇ ｌｎ　Ａｓｎ　ＩＩｓ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｌａｕ　Ｔ ｙｒ（２）配列番号・３４ （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−末鎖 （Ｂ）存在位置：　１．１８５１ （Ｘｌ）配列・ＳＥＱ　ＩＣＮＯ：３４σ口’ＣＴＴＧＡＡＣＧＣＧＣＧＣＧＴ ＧＭＴＣＡＧＧＴＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧ為１４４Ｖａｔ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｓｅ「Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ 　Ａｒｇ　ｌｌｐ　ＩＩｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ（２）配列番号・３５ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・　６１７ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉｆ）配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３５：Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ 　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　ｌｌｅ 　ｌｉｅ　Ｖａｌ　ＡｌａＰｒｏ　Ａｌａ　Ｓｉｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　 Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　５ｅｒＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ丁ｙｒ　Ｈｉｓ　Ｖａ １ＨＣＶ　ＣＫＳ−ＣＯＲＥ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ 員Ａ４　Ｑ −ＷＩＩ＆ Ｍｌ　２３ ＦＩＧ、　１２ ＦＩＧ、　７３ ＦＩＧ、　１４ ＦＩＧ、　／４　ＣＯＮＴ ＦＩＧ、　１６ ＦＩＧ、ｆ６Ａ ＦＩＧ、　１６Ｂ 蔚　Ｏり／Ｓ 反射密度の値　限界希釈率 抗原　陰性平均　カットオフ　哉匹≦　５コｃ１００−３　０．０２３　０．１ ２９　１６００　４０ｐＨＣＶ−２３０，０１１０，０５０３２００３２０ｐＨ ＣＶ−２９０，００５０，０３１１２８００２５６０ｐＨＣＶ−３４０，０２７ ０，１６６４００３２０ＦＩＧ、２２ ＦＩＧ、　２４ ＦＩＧ、２６ ＦＩＧ、　２８ １！！ｌｒｑ ＦＩＧ、　３Ｑ ｍｒ’− ＦＩＧ、　３５ ＦＩＧ、　３７ ＦＩＧ、　４ｆ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／６２ ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５７６　Ｚ　８３１０−２Ｊ ／／（Ｃ１２Ｎ　１５／６２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （７２）発明者　ディベア、サシル・ジ−アメリカ合衆国、イリノイ・６００６ ２、ノースプルツク、ファーンズワース・レーン・Ｉ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．配列番号１の組換え融合タンパク質。
2. ２．配列番号２の組換え融合タンパク質。
3. ３．配列番号３の組換え融合タンパク質。
4. ４．配列番号４の組換え融合タンパク質。
5. ５．配列番号５の組換え融合タンパク質。
6. ６．配列番号１のポリペプチド。
7. ７．配列番号２のポリペプチド。
8. ８．配列番号３のポリペプチド。
9. ９．配列番号４のポリペプチド。
10. １０．配列番号５のポリペプチド。
11. １１．液体試料においてＨＣＶ抗原に免疫学的反応性を示す抗体の存在を同定す るためのアッセイであって、前記試料を、組換え融合タンパク質配列番号１、配 列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５、並びに、ポリペプチド配列 番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群から選 択される少なくとも１種のポリペプチドと、前記抗体と該ポリペプチドとが複合 体形成するのに適した条件下に接触させ、次いで、前記抗体−ポリペプチドの複 合体を検出することからなるアッセイ。
12. １２．液体試料においてＨＣＶ抗原に免疫学的反応性を示す抗体の存在を同定す るための確認アッセイであって、前記試料を使用して免疫学的に等価の第１アリ コート及び第２アリコートを調製し、前記第１アリコートを、組換え融合タンパ ク質配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５、並びに 、ポリペプチド配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号 ５からなる群から選択される少なくとも１種のポリペプチドと、前記抗体と該ポ リペプチドとが複合体形成するのに適した条件下に接触させて第１の抗体−抗原 複合体を検出し、更に、 前記第２アリコートを、組換え融合タンパク質配列番号１、配列番号２、配列番 号３、配列番号４及び配列番号５、並びに、ポリペプチド配列番号１、配列番号 ２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択されるポリペプ チドと、第２の抗体−抗原複合体を形成するのに適した条件下に接触させ、次い で前記第２の抗体−抗原複合体を検出することからなり、前記第１アリコートに おいて選択されたポリペプチドが前記第２アリコートにおいて選択されたポリペ プチドと同じではない確認アッセイ。
13. １３．液体試料においてＨＣＶ抗原に免疫学的反応性を示す抗体の存在を同定す るイムノドットアッセイであって、前記試料を、各々がＨＣＶ抗原の別個のエピ トープを含み且つ固体支持体の別個の領域に個々に結合させた少なくとも２種の ポリペプチドと、前記抗体と該ポリペプチドとが複合体形成するのに適した条件 下で同時に接触させ、次いで抗体−ポリペプチド複合体を検出することからなり 、前記ポリペプチドを、組換え融合タンパク質配列番号１、配列番号２、配列番 号３、配列番号４及び配列番号５、並びに、ポリペプチド配列番号１、配列番号 ２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択するイムノドッ トアッセイ。
14. １４．液体試料においてＨＣＶ抗原に免疫学的反応性を示す抗体の存在を同定す るための競合アッセイであって、前記試料を使用して免疫学的に等価の第１アリ コート及び第２アリコートを調製し、前記第１アリコートを、固体支持体に結合 させたポリペプチドと、前記抗体と該ポリペプチドとが複合体形成するのに適し た条件下で接触させ、検出可能な抗体−ポリペプチド複合体を形成し、次いで前 記第２アリコートをまず未結合のポリペプチドと接触させ、次いで前記結合ポリ ペプチドと接触させることからなり、前記ポリペプチドを、組換え融合タンパク 質配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５、並びに、 ポリペプチド配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５ からなる群から選択する競合アッセイ。
15. １５．液体試料においてＨＣＶ抗原に免疫学的反応性を示す抗体の存在を同定す るための競合アッセイであって、前記試料を使用して免疫学的に等価の第１アリ コート及び第２アリコートを調製し、前記第１アリコートを、固体支持体に結合 させたポリペプチドと、前記抗体と該ポリペプチドとが複合体形成するのに適し た条件下で接触させ、検出可能な抗体−ポリペプチド複合体を形成し、更に、前 記第２アリコートをまず未結合のポリペプチドと接触させ、次いで前記結合ポリ ペプチドと接触させることからなり、前記ポリペプチドを、組換え融合タンパク 質配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５、並びに、 ポリペプチド配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５ からなる群から選択し、前記第２アリコートを未結合及び結合ポリペプチドと同 時に接触させる競合アッセイ。
16. １６．液体試料においてＨＣＶ抗原に免疫学的反応性を示す抗体の存在を同定す るための中和アッセイであって、前記試料を使用して免疫学的に等価の第１アリ コート及び第２アリコートを調製し、前記第１アリコートを、固体支持体に結合 させたポリペプチドと、前記抗体と該ポリペプチドとが複合体形成するのに適し た条件下で接触させ、検出可能な抗体−ポリペプチド複合体を形成し、ここで前 記結合ポリペプチドを、組換え融合タンパク質配列番号１、配列番号２、配列番 号３、配列番号４及び配列番号５、並びに、ポリペプチド配列番号１、配列番号 ２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択し、更に、前記 第２アリコートをまず未結合のポリペプチドと接触させ、次いで前記結合ポリペ プチドと接触させ、ここで前記未結合ポリペプチドを、組換え融合タンパク質配 列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５、並びに、ポリ ペプチド配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５から なる群から選択し、前記選択した結合ポリペプチドが前記選択した朱結合ポリペ プチドと同じではない中和アッセイ。
17. １７．液体試料においてＨＣＶ抗原に免疫学的反応性を示す抗体の存在を同定す るための中和アッセイであって、前記試料を使用して免疫学的に等価の第１アリ コート及び第２アリコートを調製し、前記第１アリコートを、固体支持体に結合 させたポリペプチドと、前記抗体と該ポリペプチドとが複合体形成するのに適し た条件下で接触させ、検出可能な抗体−ポリペプチド複合体を形成し、ここで前 記結合ポリペプチドを、組換え融合タンパク質配列番号１、配列番号２、配列番 号３、配列番号４及び配列番号５、並びに、ポリペプチド配列番号１、配列番号 ２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択し、更に、前記 第２アリコートをまず未結合のポリペプチドと接触させ、次いで前記結合ポリペ プチドと接触させ、ここで前記未結合ポリペプチドを、組換え融合タンパク質配 列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５、並びに、ポリ ペプチド配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５から なる群から選択し、 前記選択した結合ポリペプチドが前記選択した未結合ポリペプチドと同じではな く、 前記第２アリコートを未結合及び結合ポリペプチドと同時に接触させる中和アッ セイ。
18. １８．組換え融合タンパク質配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４ 及び配列番号５、並びに、ポリペプチド配列番号１、配列番号２、配列番号３、 配列番号４及び配列番号５からなる群から選択される少なくとも１種のＨＣＶ抗 原を含むポリペプチドと、１種以上の試料調製試薬と、 １種以上の検出及びシグナル生成試薬 とを含むイムノアッセイキット。
19. １９．前記ポリペプチドが固体支持体に結合されている請求項１８に記載のキッ ト。