JP3335351B2 - 推定上のｈｃｖ ｅ２／ｎｓ１蛋白に対するモノクローナル抗体およびその使用方法 - Google Patents

推定上のｈｃｖ ｅ２／ｎｓ１蛋白に対するモノクローナル抗体およびその使用方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｃ型肝炎分析と題する本出題人の米国特許
出願No,07/456,162および07/610,180に関連しており、
これらの出願を参考文献として本明細書に添付する。
本発明は、一般的には、Ｃ型肝炎ウィルス（HCV）に
特異的に結合する抗体に関し、特に、HCV蛋白と推定さ
れるE2/NS1に対して特異的に結合するモノクローナル抗
体を分泌する新規ハイブリドーマ細胞系およびこれらの
モノクローナル抗体の使用方法に関する。
肝炎が黄疸を招来する特徴は昔から知られている。現
在、ウィルス性肝炎は、特有のウィルス機構の蛋白構造
および複製様式を有する一群のウィルス性物質を含み、
種々の感染ルートにより、肝臓障害の程度が異なる肝炎
を引き起こすことが知られている。急性のウィルス性肝
炎は、臨床的には、黄疸、肝臓の圧痛および高められた
レベルの肝臓トランスアミナーゼ（アスパラギン酸トラ
ンスアミナーゼおよびアラニントランスアミナーゼな
ど）などの患者のはっきりした症状により診断される。
現在は、血清学的分析を使用してＡ型肝炎とＢ型肝炎
をさらに区別している。非Ａ非Ｂ肝炎（NANBH）は1975
年に初めて使用された用語であり、Ａ型肝炎ウィルスま
たはＢ型肝炎ウィルスのいずれによっても引き起こされ
ない輸血後肝炎の例が記載された（Feinstone et al.,N
ew Engl.J.Med.292:454−457（1975））。NANBHの診断
は主に、Ａ型肝炎およびＢ型肝炎の有無に関する血清学
的分析に基づいて除外していくことにより行われてい
る。NANBHは輸血後肝炎の原因の約90％を占めている（H
ollinger et al.in N.R.Rose et al.,eds.,Manual of C
linical Immunology,American Society for Microbiolo
gy,Washington,D.C.,558−572（1986））。
NANBHウィルスの同定を既知肝炎ウィルスの一つとの
ゲノム類似性により行う試みは、今のところ失敗してい
る。このことは、NANBHウィルスが特有のゲノム機構お
よび構造を有することを示唆している（Fowler et al.,
J.Med.Virol.12:205−213（1983）およびWeiner er a
l.,J.Med.Virol.21:239−247（1987））。NANBHに対し
て特異的な抗体を検出するための分析法の開発は、その
ウィルスに関連する抗原を同定することが困難であるた
め、その進展が阻まれている（Wards et al.,U.S.Paten
t No.4,870,076;Wards et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.83:
6608−6612（1986）;Ohori et al.,J.Med.Virol.12:161
−178（1983）;Bradley et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.8
4:6277−6281（1987）;Akatsuka et al.,J.Med.Virol.2
0:43−56（1986））。
1988年５月、Chiron CorporationとCenters for Dise
ase Controlとの共同研究により、推定上のNANB物質で
あるＣ型肝炎ウィルス（HCV）が同定された。M.Houghto
n et al.は、チンパンジーの感染プラズマから得たNANB
物質を大腸菌でクローン化し、発現した（Kuo et al.,S
cience 244:359−361（1989）;Choo et al.,Science 24
4:362−364（1989））。HCV由来のcDNA（複写DNA）配列
は、臨床的にNANBHであると診断されたほとんどの患者
に存在する抗体と免疫学的に反応する抗原をコードする
ことが確認された。利用可能な情報およびHCVの分子構
造に基づくと、そのウィルスの遺伝子組立ては、分子量
約9.5kbの一本鎖（＋）RNAから成り、一つの連続した翻
訳読み取り枠を有する（J.A.Cuthbert,Amer.J.Med.Sci.
299:346−355（1990））。それはエンベロープを有する
小さなウィルスで、フラビウィルス属に似ている。研究
者らは、感染した人の肝細胞における超微細構造の変化
によりNANB物質を同定することを試みた（H.Gupta,Live
r 8:111−115（1988）;D.W.Bradley,J.Virol.Methods 1
0:307−319（1985））。肝細胞およびPCR増幅したHCV
RNA配列における同様の超微細構造の変化をNANBH患者と
ともに感染HCVプラズマで実験的に感染させたチンパン
ジーにおいて検出した（T.Shimizu et al.,Proc.Natl.A
cad.Sci.87:6441−6444（1990））。
HCVを輸血後NANBHの病因物質として関連づけるための
重要な血清学的証拠が見出された（H.Alter et al.,N.E
ng.J.Med.321:1494−1500（1989）;Estaben et al.,The
Lancet:Aug.5:294−296（1989）;C.Van Der poel et a
l.,The Lancet Aug.5:297−298;G.Sbolli,J,Med.Virol.
30:230−232（1990）;M.Makris et al.,The Lancet 33
5:1117−1119（1990））。HCV抗体の検出により、血液
供給システムからNANBH感染血液の70〜80％を防止可能
と推定されるが、その病気の慢性状態にある場合はその
抗体が明らかに容易に検出されるものの、急性NANBHの
段階にある試料の場合はほんの60％がHCV抗体陽性であ
るに過ぎない（H.Alter et al.,New Eng.J.Med.321:149
4−1500（1989））。これらのデータから、HCV感染の有
効な血清学的診断のために、さらに他のHCV蛋白を同定
する必要があることがはっきり示された。構造蛋白コア
および33Cのクローン化および発現の後、NANB患者にお
いてHCVに対する抗体を検出するためにＣ−100の他にHC
Vコアおよび33Cを用いる第二世代抗体分析法が開発され
た。第二世代分析法により検出感度はかなり高くなった
が、NANBH感染中の抗体陰性期における患者の感染状態
に関して、HCV感染と抗体検出との間のインターバルが
長く、種々の構造および非構造蛋白に対する免疫応答の
プロフィールに関する充分な情報が欠けているという問
題が持ち上がっている。従って、HCVの急性感染およびH
CVの有無を同定するための分析システムを開発する必要
がある。
本発明は、HCVと推定されるE2/NS1抗原の検出に使用
できる高度に特異的で新規なモノクローナル抗体を提供
する。そのモノクローナル抗体は、HCVと推定されるE2/
NS1遺伝子由来の蛋白配列に特異的に結合する。これら
のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、次
のように表示される：ハイブリドーマH13C113（ATCC寄
託No.HB10857）およびハイブリドーマH23C163（ATCC寄
託No.HB10856）。
これらのモノクローナル抗体の特異性により、推定E2
/NS1領域におけるHCV抗原を有利に同定することがで
き、その同定は、研究ならびにHCV（NANB）感染の診断
および評価において有用になりうる。
好ましい態様の分析法では、HCV抗原を含む可能性の
ある試験サンプルを、ポリクローナルもしくはモノクロ
ーナル抗HCV E2/NS1抗体またはそのフラグメントを結
合させた固相と接触させて混合物を生成する。この混合
物を、抗原／抗体複合体を生成させるのに充分な時間お
よび条件下でインキュベートする。次いで、こうして生
成した複合体、シグナル発生化合物に結合させたHCV抗
原に対して特異的なモノクローナルもしくはポリクロー
ナル抗体またはそのフラグメントを含む指示薬と接触さ
せて第二の混合物を生成する。この第二の混合物を、抗
体／抗原／抗体複合体を生成させるのに充分な時間およ
び条件下で反応させる。HCV抗原の存在は、生じた測定
可能なシグナルを検出することにより測定する。試験サ
ンプルに存在するHCVの量、すなわち固相上に捕獲され
たHCV抗原の量は、生じたシグナルの量に対応する。
あるいは、HCV E2/NS1抗原に対して特異的なモノク
ローナルもしくはポリクローナル抗体またはそのフラグ
メントおよびシグナル発生化合物を含む指示薬を、固相
上に被覆したポリクローナルもしくはモノクローナル抗
HCV抗体またはそのフラグメントおよび試験サンプルに
添加して混合物を生成する。この混合物を、抗体／抗原
／抗体複合体を生成させるのに充分な時間および条件下
でインキュベートする。試験サンプル中のHCVの存在お
よび量、すなわち固相上に捕獲されたHCV抗原の量は、
測定可能なシグナルを検出することにより測定する。試
験サンプルに存在するHCVの量は、生じたシグナルの量
に対応する。
別の分析法では、本発明のモノクローナル抗体の１個
または２個以上の組み合わせを競合プローブとして使用
してHCV E2/NS1抗原に対する抗体を検出することがで
きる。例えば、HCV E2/NS1抗原は単独または組み合わ
せて固相上に被覆することができる。次いでHCV E2/NS
1抗原に対する抗体を含んでいる疑いのある試験サンプ
ルを、シグナル発生化合物および本発明のモノクローナ
ル抗体を含む指示薬とともに、試験サンプルおよび固相
に結合した指示薬または固相に結合した指示薬の抗原／
抗体複合体を生成させるのに充分な時間および条件下で
インキュベートする。モノクローナル抗体の固相への結
合の減少は定量的に測定することができる。確実にNANB
H陰性である試験サンプルにより生じたシグナルと比較
した場合の測定可能なシグナルの減少は、試験サンプル
に抗HCV E2/NS1抗体が存在することを示す。
さらに他の分析法では、試験サンプルを、HCV E2/NS
1蛋白を結合させた固相およびHCV E2/NS1に対して特異
的なモノクローナル抗体またはそのフラグメントをシグ
ナル発生化合物に結合させて含む指示薬と接触させて混
合物を生成する。その混合物の抗体／抗原複合体を生成
させるのに充分な時間および条件下でインキュベートす
る。試験サンプル中の抗HCVの存在は、生じた測定可能
なシグナルを検出し、そのシグナルを既知の陰性サンプ
ルにより生じた測定可能なシグナルと比較することによ
り決定する。既知の陰性サンプルのシグナルと比較した
場合の試験サンプルの測定可能なシグナルの減少は、抗
HCV抗体の存在を示す。溶液中に遊離した抗原を使用し
て抗HCV抗体検出の競合分析を行うこともできる。
HCV E2/NS1抗原の存在は、組織サンプルを、HCV E2
/NS1抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体または
そのフラグメントに結合させたシグナル発生化合物を含
む指示薬と接触させて混合物を生成することにより組織
サンプル中で検出することができる。この混合物は、抗
原／抗体複合体を生成させるのに充分な時間および条件
下でインキュベートする。組織サンプル中のHCV E2/NS
1抗原の存在は、発生するシグナルを検出することによ
り測定する。
また、本発明のモノクローナル抗体を含み、試験サン
プル中のHCV E2/NS1抗原または抗体の存在を測定する
のに有用なキットも提供する。
本発明は、HCV蛋白と推定されるE2/NS1に対する新規
モノクローナル抗体、該モノクローナル抗体の使用方法
およびこれらのモノクローナル抗体を含むキットを提供
する。
本発明のモノクローナル抗体は、試験サンプル中のHC
V E2/NS1蛋白の有無を測定するための種々の分析系で
使用することができる。これらのモノクローナル抗体の
フラグメントも使用できる。例えば、第一の分析法で
は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗HCV E2/
NS1抗体またはそのフラグメント、あるいはこれらの抗
体を組み合わせたものを固相上に被覆させておき、これ
をHCV E2/NS1蛋白を含む可能性のある試験サンプルと
接触させて混合物を生成する。この混合物を抗原／抗体
複合体を生成させるのに充分な時間および条件下でイン
キュベートする。次いで、HCV E2/NS1領域と特異的に
結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体ま
たはそのフラグメント、あるいはこれらの抗体を組み合
わせたものにシグナル発生化合物を結合させておき、こ
れをその抗原／抗体複合体と接触させて第二の混合物を
生成する。次いで、この第二の混合物を抗体／抗原／抗
体複合体を生成させるのに充分な時間および条件下でイ
ンキュベートする。試験サンプル中に存在し、固相上に
捕獲されたHCV E2/NS1抗原を、シグナル発生化合物に
よって生じる測定可能なシグナルを検出することにより
測定する。試験サンプル中に存在するHCVE2/NS1抗原の
量は、発生するシグナルに対応する。
あるいは、固体支持体に結合させたポリクローナルも
しくはモノクローナル抗HCV E2/NS1抗体またはそのフ
ラグメント、あるいはこれらの抗体を組み合わせたも
の、試験サンプル、およびシグナル発生化合物を結合し
た、HCV E2/NS1抗原に特異的に結合するモノクローナ
ルもしくはポリクローナル抗体またはそのフラグメン
ト、あるいはこれらの抗体を組み合わせたものを含む指
示薬を接触させて混合物を生成する。この混合物を抗体
／抗原／抗体複合体を生成させるのに充分な時間および
条件下でインキュベートする。試験サンプル中に存在
し、固相上に捕獲されたHCV E2/NS1蛋白があれば、シ
グナル発生化合物によって生じる測定可能なシグナルを
検出することにより測定する。試験サンプル中に存在す
るHCV蛋白の量は、発生するシグナルに対応する。
別の分析法では、本発明のモノクローナル抗体を１個
または２個以上組み合わせて、HCV蛋白に対する抗体を
検出するための競合プローブとして使用することができ
る。例えば、HCV蛋白を単独または組み合わせて固相上
に被覆することができる。次いで、HCV E2/NS1抗原に
対する抗体を含む疑いのある試験サンプルを、シグナル
発生化合物および本発明の少なくとも１個のモノクロー
ナル抗体を含む指示薬とともに、試験サンプルおよび固
相に結合した指示薬または固相に結合した指示薬の抗原
／抗体複合体を生成させるのに充分な時間および条件下
でインキュベートする。モノクローナル抗体の固相への
結合の減少は定量的に測定することができる。確実にNA
NBH陰性である試験サンプルにより生じるシグナルと比
較した場合の測定可能なシグナルの減少は、試験サンプ
ルの抗HCV E2/NS1抗体の存在を示す。
さらに他の分析法では、本発明の各々のモノクローナ
ル抗体を、固定した組織部分および免疫組織化学分析に
よる固定細胞におけるHCV抗原の検出に使用することが
できる。
さらに、これらのモノクローナル抗体は、CNBr−活性
化セファロースと同様のマトリックスに結合させて、細
胞培養または生物組織（血液および肝臓など）から得ら
れる特異的HCV蛋白の親和精製に使用することができ
る。
また、本発明のモノクローナル抗体は、治療用途また
は他の類似用途のためのキメラ抗体の生成に使用するこ
とができる。
モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、HCV
E2/NS1抗原を検出するために個々に提供することがで
きる。また、本明細書で提供するモノクローナル抗体
（およびそのフラグメント）の組み合わせも、各々異な
る結合特異性を有する本発明の少なくとも１個の抗HCV
E2/NS1抗体と他のHCV領域に対する抗体との混合物ま
たは「カクテル」の成分としてともに使用することがで
きると予想される。すなわち、このカクテルは、HCV E
2/NS1蛋白に対する本発明のモノクローナル抗体およびH
CVゲノムの他の抗原決定基に対する他のモノクローナル
抗体を含むことができる。これらの予想されるカクテル
に有用な他のモノクローナル抗体の例としては、HCV
Ｃ−100、HCV 33C、HCV コア、HCV NS5および／また
はHCV推定ENVに対するものが挙げられ、それらは、例え
ば、米国特許出願No.07/610,175（発明の名称:C型肝炎
ウィルスに対するモノクローナル抗体およびその使用方
法）、同No.07/610,175（発明の名称:HCV 33C蛋白に対
するモノクローナル抗体およびその使用方法）、同No.0
7/648,475（発明の名称:HCVエンベロープ推定領域に対
するモノクローナル抗体およびその使用方法）同No.07/
648,473（発明の名称:HCV コア蛋白に対するモノクロ
ーナル抗体およびその使用方法）および同時出願の特許
出願（発明の名称:HCV NS5蛋白に対するモノクローナ
ル抗体およびその使用方法；米国特許出願No.07/748,56
3）に開示されている。以上の出願は全て本出願人によ
るもので、参考文献として本明細書に添付する。本明細
書に記載するモノクローナル抗体のカクテルは本明細書
で詳述する分析法においてHCVE2/NS1に対するモノクロ
ーナル抗体の代わりに使用され、E2/NS1および他のHCV
抗原を検出することができる。
本発明の分析法で使用できるポリクローナル抗体また
はそのフラグメントは、HCV E2/NS1推定領域またはそ
の分析法で使用する他のHCV蛋白（HCV Ｃ−100蛋白、H
CV 33C蛋白、HCV コア、HCV ENVまたはNCVNS5蛋白な
ど）に対して特異的に結合しなければならない。好まし
く使用されるポリクローナル抗体は哺乳類起源のもので
あり、ヒト、ヤギ、ウサギまたはヒツジ抗HCVポリクロ
ーナル抗体を使用することができる。最も好ましくは、
ポリクローナル抗体はウサギポリクローナル抗HCV抗体
である。本発明の分析法で使用するポリクローナル抗体
は、単独またはポリクローナル抗体のカクテルとして使
用できる。本発明の分析法で使用するカクテルは、種々
のHCV特異性を有するモノクローナル抗体またはポリク
ローナル抗体を含むので、HCV感染の診断、評価および
予後ならびにHCV蛋白の変異および特異性の研究に有用
である。
本明細書に記載する本発明方法によって試験すること
のできる試験サンプルとしては、ヒトおよび動物の体液
（全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿など）、生物学的液
体（細胞培養上澄液など）、固定組織検体および固定細
胞検体が挙げられる。
「固相」は限定されるものではなく、当業者が選択す
ることができる。すなわち、例えば、ラテックス粒子、
微粒子、磁性または非磁性ビーズ、膜、プラスチックチ
ューブ、マイクロタイターの窪みの壁、ガラスまたはシ
リコンチップおよびヒツジの赤血球は全て適する例であ
る。ペプチドを固相に固定化するのに適した方法として
は、イオン的、疎水的、共有的相互作用などが挙げられ
る。本明細書で使用する「固相」は、不溶性または後の
反応で不溶性にすることができる全ての物質を意味す
る。固相は、捕獲試薬を引きつけ、固定化する固有能力
によって選択することができる。あるいは、固相に、捕
獲試薬を引きつけ、固定化する能力を有する別の受容体
を保持させることができる。別の受容体としては、捕獲
試薬自体または捕獲試薬に結合した帯電物質に関して反
対に荷電した帯電物質を挙げることができる。あるい
は、受容体分子が、固相に（結合して）固定化され、特
異的結合反応により捕獲試薬を固定化させる能力を有す
るどんな特異的結合要素であってもよい。その受容体分
子は、分析を行う前または分析中に、捕獲試薬を固相物
質に間接的に結合させることができる。すなわち、固相
は、表面がプラスチック製、誘導プラスチック製、磁性
または非磁性金属製、ガラスまたはシリコン製の試験
管、マイクロタイター窪み、シート、ビーズ、微粒子、
チップおよび当業者には周知の他の形状であってもよ
い。
固相はまた、検出抗体を近づけさせるのに充分な多孔
性および抗原を結合させるのに適切な表面親和性を有す
る適当な多孔性物質を含むことができると意図され、こ
れは本発明の範囲内である。一般に、マイクロポーラス
構造が好ましいが、水和状態のゲル構造を有する物質も
同様に使用できる。そのような有用な固体支持体として
は、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換および架
橋グアーゴム、サルロースエステル（特に硝酸およびカ
ルボン酸とのエステル）、混合セルロースエステルおよ
びセルロースエーテルなどの天然のポリマー状炭水化物
およびその合成による修飾、架橋または置換誘導体；蛋
白および誘導体（架橋または修飾ゼラチンなど）などの
窒素含有天然ポリマー；ラテックスおよびゴムなどの天
然炭化水素ポリマー；ビニルポリマー（ポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ
酢酸ビニルおよびその部分加水分解誘導体、ポリアクリ
ルアミド、ポリメタクリレートなど）、上記重縮合物の
コポリマーおよび三元ポリマー（ポリエステル、ポリア
ミドなど）ならびに他のポリマー（ポリウレタンまたは
ポリエポキシドなど）などの適切な多孔性構造を有して
合成できる合成ポリマー；アルカリ土類金属およびマグ
ネシウムの硫酸塩または炭酸塩（硫酸バリウム、硫酸カ
ルシウム、炭酸カルシウムなど）、アルカリ金属、アル
カリ土類金属、アルミニウムおよびマグネシウムのケイ
酸塩、ならびにアルミニウムまたはケイ素の酸化物また
は水和物（粘土、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオラ
イン、シリカゲルまたはガラスなどで、これらの物質は
上記ポリマー状物質とともにフィルターとして使用でき
る。）などの多孔性無機物質；および上記種類の混合物
またはコポリマー（先在する天然ポリマー上で合成ポリ
マーの重合を開始することにより得られるグラフトコポ
リマーなど）が挙げられる。これらの物質は全て、フィ
ルム、シートまたはプレートなどの適切な形状で使用す
ることができ、あるいは、紙、ガラス、プラスチックフ
ィルムまたは繊維などの適切な不活性担体に被覆した
り、結合または積層してもよい。
ニトロセルロースの多孔性構造は、モノクローナル抗
体を含む広範囲の試薬に対して優れた吸収性および吸着
性を有する。ナイロンも同様の特性を有し、同様に適切
である。
上記の多孔性固体支持体は、厚さが約0.01〜0.5mm、
好ましくは約0.1mmのシート状であるのが好ましいと予
想される。孔の大きさは広範囲で変えることができ、好
ましくは約0.025〜15ミクロン、特に約0.15〜15ミクロ
ンである。そのような支持体の表面は化学的方法により
活性化させて、抗原または抗体を支持体に共有結合させ
てもよい。しかし、一般に、抗原または抗原は、十分に
理解されていない疎水力により多孔性物質に吸着するこ
とにより、非可逆的に結合する。適切な固体支持体は、
米国特許出願No.227,272にも記載されている。
指示薬は、HCVの特異的結合要素に結合した外部手段
によって検出できる測定可能なシグナルを発生させるこ
とが可能なシグナル発生化合物（ラベル）を含む。本明
細書で使用する「特異的結合要素」は、特異的結合対の
要素を意味する。すなわち、異なった２個の分子であっ
て、一方の分子は、化学的または物理的手段によって他
方の分子に特異的に結合する。指示薬はまた、HCVの特
異的結合対の抗体要素であることの他に、ビオチンまた
は抗ビオチン、アビジンまたはビオチン、炭水化物また
はレシチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターま
たは受容体分子、酵素補因子および酵素、酵素阻害物質
または酵素などの、ハプテン−抗ハプテン系を含むどん
な特異的結合対の要素であってもよい。免疫反応による
特異的結合要素は、HCV（サンドイッチアッセイの場合
など）、捕獲試薬（競合アッセイの場合など）または補
助の特異的結合要素（間接アッセイの場合など）のいず
れかに結合可能な抗体、抗原または抗体／抗原複合体で
あってもよい。
意図する種々のシグナル発生化合物（ラベル）として
は、色素産生バクテリア；酵素などの触媒；フルオレセ
ンおよびローダミンなどの発光化合物；アクリジニウ
ム、フェナントリジニウムおよびジオキセタン化合物な
どの化学発光化合物；放射性元素；ならびに直接視認可
能ラベルが挙げられる。酵素の例としては、アルカリホ
スファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、
β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。個々のラベル
の選択は限定されないが、それ自体または１個以上の他
の物質と結合してシグナルを生じることができるもので
ある。
他の種々の固相を利用する他の態様も考えられ、これ
も本発明の範囲内である。例えば、固定化可能な反応複
合体を負に帯電したポリマーにより固定化するイオン捕
獲法〔本出願人の米国特許出願No.150,278（欧州特許出
願公開No.0326100に対応）および同No.375,029（欧州特
許出願公開No.0406473）に記載されており、共に参考文
献として本明細書に添付する。〕は、本発明に従って使
用することにより液相免疫化学反応を速く行うことがで
きる。固定化可能な免疫複合体は、負に帯電したポリア
ニオン／免疫複合体と前処理して正に帯電した多孔性マ
トリックスとの間のイオン相互作用により反応混合物の
残りから分離され、前述した種々のシグナル発生系、例
えば、参考文献として本明細書に添付する、本出願人の
米国特許出願No.921,979（欧州特許出願公開No.0273115
に対応）に記載した化学発光シグナル測定で述べたもの
を使用して検出される。
また、本発明方法は、固相が微粒子を含む微粒子法
（自動および半自動システムを含む）を利用する系での
使用に適用することができる。そのような系としては、
参考文献として本明細書に添付する、係属中の米国特許
出願No.425,651および同No.425,643（各々、欧州特許出
願公開No.0425633および同No.0424634に対応）に記載さ
れたものが挙げられる。
また、走査型プローブ顕微鏡（SPM）を使用する免疫
測定法は、本発明のモノクローナル抗体が容易に適応で
きる方法である。走査型プローブ顕微鏡、特に原子力顕
微鏡では、捕獲相、例えば本発明の少なくとも１個のモ
ノクローナル抗体を固相に付着し、走査型プローブ顕微
鏡を使用して、固相表面に存在する可能性がある抗原／
抗体複合体を検出する。走査型トンネル顕微鏡を使用す
ると、多くの免疫測定法では抗原／抗体複合体を検出す
るために通常に使用しなければならないラベルの必要性
がなくなる。そのような系は、参考文献として本明細書
に添付する、本出願人の米国特許出願No.662,147に記載
されている。
特異的結合反応をモニターするためのSPMの使用に
は、多くの手法がある。一態様では、一要素の特異的結
合相手（分析物に特異的な物質で、本発明のモノクロー
ナル抗体である。）を走査に適する表面に付着させる。
分析物に特異的な物質の結合は、当業者には周知の方法
に従って、プラスチックまたは金属表面の固相を含む試
験片に吸着させることにより行うことができる。あるい
は、誘導プラスチック、金属、シリコンまたはガラスの
固相を含む試験片に特異的結合相手（分析物に特異的な
物質）を共有的に結合させる方法を使用してもよい。共
有的結合法は当業者には周知であり、特異的結合相手を
試験片に不可逆的に結合させるための種々の方法が挙げ
られる。試験片がシリコンまたはガラスの固相を含む場
合、その表面は、特異的結合相手を結合させる前に活性
化しなければならない。活性化されたシラン化合物、例
えばトリエトキシアミノプロピルシラン（Sigma Chemic
l Co.（St.Louis,MO）製）、トリエトキシビニルシラン
（Aldrich Chemical Co.（Milwaukee,WI）製）および
（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（Sigm
a Chemicl Co.（St.Louis,MO）製）を使用すると、各
々、アミノ基、ビニル基およびチオール基などの反応基
を導入することができる。そのように活性化した表面を
使用すると、結合相手を直接結合することができ（アミ
ノまたはチオールの場合）、あるいは、活性化した表面
をグルタルアルデヒド、スベリン酸ビス（スクシンイミ
ジル）、SPPD（３−〔２−ピリジルチオ〕プロピオン酸
スクシンイミジル）、SMCC（４−〔Ｎ−マレイミドメチ
ル〕シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジ
ル）、SIAB（〔４−ヨードアセチル〕アミノ安息香酸ス
クシンイミジル）およびSMPB（４−〔１−マレイミドフ
ェニル〕酪酸スクシンイミジル）などのリンカーとさら
に反応させると表面から結合相手を分離することができ
る。ビニル基は酸化することにより共有的結合のための
手段とすることができる。また、ポリアクリル酸などの
種々のポリマーを重合用アンカーとして使用することも
でき、その結果、特異的結合相手に対して複数結合点を
付与することができる。アミノ基表面は、種々の分子量
の酸化デキストランと反応させることにより、大きさお
よび容量が異なる親水性リンカーとすることができる。
酸化可能なデキストランの例としては、デキストランＴ
−40（分子量:40,000ダルトン）、デキストランＴ−110
（分子量:110,000ダルトン）、デキストランＴ−500
（分子量:500,000ダルトン）デキストランＴ−2M（分子
量:2,000,000ダルトン）（以上、Pharmacia（Piscatawa
y,N.J.）製）またはFicoll（分子量:70,000ダルトン;Si
gma Chemical Co.,（St.Louis,MO）製）が挙げられる。
また、高分子電解質の相互作用を使用すると、係属中の
本出願人の米国特許出願No.150,278（1988年１月29日出
願）および同No.375,029（1989年７月７日出願）に記載
された方法および化学作用を使用することにより特異的
結合相手を試験片の表面に固定化することもできる。な
お、上記米国出願は各々、参考文献として本明細書に添
付する。好ましい結合方法は、共有的手段によるのもで
ある。特異的結合要素を結合した後、表面をさらに血
清、蛋白または他の阻止物質などの物質で処理すること
により、非特異的結合を最小にしてもよい。また、製造
場所または使用の段階で表面を走査して、測定の目的に
適するようにすることもできる。走査工程により試験片
の特異的結合特性が変化する心配はない。
本発明では固相の使用を優先して開示しているが、本
発明のモノクローナル抗体は非固相測定系でも使用でき
ると考えられる。これらの測定系は当業者には周知であ
り、本発明の範囲内であるものとする。
測定で使用する試薬は、１個以上の容器（バイアルま
たはボトルなど）を有し、各容器が測定で使用するモノ
クローナル抗体またはモノクローナル抗体のカクテル、
検出試薬および洗浄試薬などの試薬を個々に含むキット
型で提供することができるものとする。
下記実施例では、HCVの血清学的診断に対する本発明
の利点および有用性を、これらのモノクローナル抗体の
作製方法、構造解析、エピトープ地図作製および臨床上
の有用性を記載することにより説明する。モノクローナ
ル抗体の作製に使用する方法は、Kohler and Milstein,
Nature 256:494（1975）で詳述され、J.G.R.Hurrel,e
d.,Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and
Applications,CRC Press,Inc.,Boco Ratan,FL（1982）
に総説された公知の方法に従う。Kohler and Milstein
法に基づいたモノクローナル抗体の別の作製法は、L.T.
Mimms et al.,Virology 176:604−619（1990）の方法で
あり、該文献は参考文献として本明細書に添付する。こ
れらの実施例は説明するためのものであり、本発明の精
神および範囲を限定するものではない。
実施例1:配列番号６によるマウスの免疫感作 HCV E2/NS1領域に対するモノクローナル抗体を作製す
るための合成ペプチドの選択 アミノ酸600〜720（配列番号１）を包含するHCVゲノ
ムのE2/NS1領域の免疫原性ドメインをPEPSCAN分析によ
りマッピングした。PEPSCANキットはCambridge Researc
h Bioscience（Valley Stream,New York,U.S.A）から購
入し、その製造者が用意する誘導ポリプロピレンのピン
上で、HCVアミノ酸600〜720（配列番号１）に包含され
る一連の重複したヘキサマーペプチド（５個のアミノ酸
が重複）を合成した。これらのペプチド合成は、キット
に用意された合成プロトコルに正確に従って行った。簡
単に述べると、末端アミノ酸としてＦ−moc β−アラ
ニンを含むポリプロピレンのピンを20％（v/v）のピペ
リジン／ジメチルホルムアミド（DMF）により30分間、
脱保護した。ピンをDMF（１×５分）、メタノール（４
×２分）、次いで最後にDMF（１×５分）で洗浄した。
アミノ酸のＦ−moc活性エステルを、１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール（HOBt）/DMF中、30mM濃度で調製し
た。それらのアミノ酸を、キットに用意された96ウェル
マイクロタイタープレートの窪みに、カルボキシ末端か
ら始めて所望の配列順序で加えた（175μ）。脱保護
されたピンをアミノ酸溶液中に下ろし、室温（RT）で一
夜インキュベートした。上述したDMF/メタノール洗浄の
後、脱保護、洗浄および結合工程を繰り返し、各ペプチ
ド配列の全てのアミノ酸を結合させた。最後の脱保護工
程の後は、ピンをDMF/無水酢酸／トリエチルアミン（5:
2:1（v/v/v））とともに室温で90分間インキュベートす
ることにより末端アミノ酸をアセチル化した。DMF/メタ
ノール洗浄の後、ピンを風乾した。血清学的分析を行う
前に、最後の側鎖の脱保護および中和を、ピンをトリフ
ルオロ酢酸／フェノール／エタンジチオール（95:2.5:
2.5（v/w/v）で処理することにより行った。ピンをジク
ロロメタン（２×２分）、５％ジイソプロピルエチルア
ミン／ジクロロメタン（１×５分）およびジクロロメタ
ン（１×５分）で洗浄した。最後に、ピンを風乾し、水
で洗浄し、メタノールに18時間浸漬して、冷蔵室で脱水
・乾燥保存した。
HCV蛋白に対する抗体がセロポジティブな人の血清か
ら精製したIgGのFAB二量体を、製造者が勧めるEIA法を
使用するこれらのペプチドの血清学的分析のための一次
抗体として使用した。簡単に述べると、その一次抗体
を、0.1％のTween−20（Bio−Rad,Richmond,CA）、１％
のオボアルブミン（Sigma（St.Louis,MO）製）および１
％の牛血清アルブミン（Sigma製）を含むリン酸塩緩衝
塩水（PBS）で適当な濃度に希釈した。ペプチドピンを
一次抗体とともに４℃で一夜インキュベートした。PBS/
Tween−20で数回洗浄した後、ピンを、適当に希釈した
ヤギ抗マウスHRPOとともに室温で１時間インキュベート
した。過酸化水素を含むリン酸塩−クエン酸塩緩衝液に
溶解したアジド−ジ−３−エチルベンズチアゾジンスル
ホネートを発色剤として使用した。ピンを発色剤ととも
に15〜20分インキュベートした後、発色の光学密度を40
5nmで測定した。これらの血清のEIAでの反応性に基づい
て、４個のアミノ酸配列（アミノ酸607〜627（配列番号
２）、アミノ酸643〜663（配列番号３）、アミノ酸666
〜683（配列番号４）およびアミノ酸671〜691（配列番
号５）を、先に参考文献として本明細書に添付した米国
特許出願No.610,180に開示したように、免疫原性ドメイ
ンとして同定した。これらの４個の配列および別の配列
（２個の最も免疫原性の高い配列の結合（アミノ酸643
〜683）（配列番号６））の各々を、E.Gross and T.Hei
nhofer,eds.Barany and Merrifield,The Peptides,2:12
84,Academic Press,New York,New Yorkに記載された方
法と同様にして、順次固相合成法によりカルボキシ末端
から合成した。先に参考文献として本明細書に添付した
米国特許出願NO.610,180に開示したように、HCV陽性血
清パネルのEIA反応性に基づいて、ペプチド643〜683
（配列番号６）をHCV NS1に対するモノクローナル抗体
作製のための免疫原として選択した。図１は、HCVゲノ
ム上でのこれらのペプチドの位置を示す。
マウスの免疫感作 雌のBalb/cマウスを、RIBIアジュバント系（RIBI Imm
unochemicals Res.,U.S.A.）を使用して、約50μｇの粗
ペプチド643〜683（HCVアミノ酸643〜683,配列番号６）
により免疫感作した。１日目に、製造者の指示に従って
調製した緩衝エマルジョンにおける各々50μｇのトレハ
ロースジミコール酸（TDM）およびM.Phleiを含む50μｇ
のペプチドをマウスに与えた。続いて、18、34、42およ
び63日目に免疫感作を行った。25および77日目にマウス
を出血させ、免疫原を被覆したマイクロタイタープレー
トを使用してEIAにより免疫応答を評価した。融合の前
少なくとも８週間はマウスを休ませた。
酵素結合イムノアッセイ（EIA） 免疫感作抗原に対する免疫応答をマイクロタイターEI
Aにより評価した。マイクロタイタープレートの窪み
に、100μの精製した合成ペプチド（アミノ酸643〜68
3,配列番号６）/0.1M重炭酸塩緩衝液（pH9.5）で被覆し
た。0.01％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）および0.0
5％のTween−20（Bio−Rad Laboratories（Richmond,C
A）製）を含むリン酸塩緩衝塩水（PBS）により洗浄した
後、空いている箇所は、１％BSA/重炭酸塩緩衝液（pH9.
5）のオーバーコートを施した。最後の洗浄の後、プレ
ートを４℃で保管した。天然または免疫感作したマウス
の血清を、保存剤としてアジ化ナトリウムを用い（pH6.
8）、20mMのリン酸ナトリウム（pH7.4）、0.15MのNaC
l、20％の正常なヤギ血清、10％の胎児の牛血清、5mMの
EDTA、10mMのEGTA、50mMのトリス、0.2％のTween−20を
含む100μの希釈緩衝液で順次希釈した。希釈した血
清を37℃で３時間、抗原と反応させた。プレートを洗浄
し、適切に希釈した100μのヤギ抗マウスIgG（Ｈ重鎖
およびＬ軽鎖）ホースラディッシュペルオキシダーゼ
（HRPO）複合抗体（Jackson Immunochemicals,West Gro
ve,PA）を添加した。プレートを37℃で２時間インキュ
ベートした。最後の洗浄の後、100μのｏ−フェニレ
ンジアミン・2HCl（OPD）発色試薬を添加した。反応を
室温で10〜30分間行った後、1mの1N H2SO4を添加す
ることにより停止した。492/600nmでの吸光度を記録し
たが、これは、抗原に結合した特異的抗体の量に直接関
連することがわかっている。
実施例２ 細胞融合 免疫感作したマウスの血清中に特異的抗HCV抗体が適
度の感度で存在することが示されたら、抗原の前融合追
加の前にマウスを少なくとも８週間休ませた。次いで、
抗原の前融合追加を、約40μｇの各々精製したHCV合成
ペプチド（配列番号６）を尾部静脈内（IV）注射するこ
とにより行った。３日後、マウスを犠牲にして、抗HCV
抗体産生細胞を含む脾臓をすりつぶして単細胞にした。
これらの単細胞の懸濁物を0.83％のNH4Clで処理した赤
血球を除去した後、これらの懸濁物をSP2/0細胞と10:1
（SP2/0:脾臓細胞）の割合で混合した。混合した細胞を
遠心分離し、血清を含まない媒体で１回洗浄して、再び
遠心分離した。fusogenポリエチレングリコール（PEG）
を使用して免疫ドナーの脾臓細胞とミエローマ細胞系SP
2/0（HRPT陰性）とのハイブリッドを形成した（Kohler
and Milstein,Nature,356:494（1975）；総説として
は、J.G.R.Hurrel,ed.,Monoclonal Hybridoma Antibodi
es:Techniques and Applications,CRC Press,Inc.,Boco
Ratan,FL（1982））。簡単に述べると、脾臓とSP2/0細
胞との融合は、血清を含まないIscoeの改良ダルベッコ
培地（IMDM）中で２分間、ペレットを40％PEG（ATCC、M
W1300〜1600）に暴露することにより行った。PEGおよび
細胞の懸濁物は、５分かけて血清を含まない20mのIMD
Mをゆっくり添加することにより希釈し、次いで遠心分
離により細胞を集めた。上澄をデカントし、HAT（ヒポ
キサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）培地とと
もに20％の胎児の牛血清（FBS）（Hyclone Laboratorie
s,Logan,Utah）を含む30mのIMDMで置き換え、ハイブ
リドーマ用の選択を行った。１匹の非免疫BABB/cマウス
の脾臓細胞も支持細胞層として添加した。細胞を、３枚
の96ウェル組織培養プレートに窪み１個につき0.1mの
量で加えた。３日後、さらに0.1mのHAT培地を各窪み
に添加した。その後１週間して、培地の半分をHT（ヒポ
キサンチンおよびチミジン）とともに20％のFBSを含むI
MDMで置き換え、さらに７〜14日間、ハイブリッドを成
長させた。
ハイブリッドのいくつかは、HCVに対する抗体を産生
する脾臓細胞がSP2/0細胞と融合して成ることがわかっ
た。簡単に述べると、fusogenが脾臓細胞膜とSP2/0細胞
膜との融合を促進し、両方の細胞の核を含むヘテロカリ
オンを生成した。最終的には、異種の核が融合して、同
調有糸分裂可能な単一核が得られた。融合細胞が分裂す
ると、ハイブリッドは、各々の核の染色体を失って安定
化した。融合細胞は、窪み１個につき105〜106個ずつを
複数の96ウェルプレートに入れた。SP2/0:脾臓細胞融合
から生成したハイブリッド細胞は、HAT培地で培養する
ことにより選択的に増殖させた。使用しないSP2/0また
はSP2/0:SP2/0融合細胞は全て、成長アミノプテリンか
ら除去し、脾臓：脾臓融合細胞上の融合していない脾臓
細胞は、培養中に死滅した。SP2/0:脾臓細胞ハイブリッ
ドのみがHAT選択培地中で成長した。
実施例３ モノクローナル抗体のスクリーニングおよびクローン化 10〜14日後、ハイブリドーマ細胞増殖を含む窪みの培
養液から、単一特異性抗体を有するものを次のようにし
てスクリーニングした。NS1融合による各ハイブリドー
マの上澄みを、固相に被覆した合成ペプチドアミノ酸64
3〜683（配列番号６）を使用して実施例１に記載したEI
A法により試験した。免疫原、すなわちHCV蛋白配列番号
６に特異的に反応するハイブリドーマ培養液を選択し、
J.W.Goding,Monoclonal Antibodies;Principles and Pr
actices,Academic Press,New York（1983）で概説され
ているガイドラインを使用して限界希釈法によりクロー
ン化した。クローン化したサンプルの培養上澄みを再
び、上記実施例１に記載した免疫原を使用してEIAによ
り試験し、HCV蛋白配列に対する単一特異的反応性を確
認した。合成ペプチドに対して最も強い反応特異性を有
するクローンを増殖およびさらに分析するために選択し
た。
実施例４ 腹水法による抗体収量の増幅 多量のモノクローナル抗体を得るために、所望のハイ
ブリドーマ細胞系のクローン化した10〜20百万個の細胞
を、予め、J.G.R.Hurrel,ed.,Monoclonal Hybridoma An
tibodies:Techniques and Applications,CRC Press,In
c.,Boco Ratan.FL（1982）に概説された方法により、0.
5mのプリスタン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデ
カン）で腹腔内処理したBALB/cマウスに接種した。プリ
スタン処理により、マウス腹腔内でのマウスミエローマ
雑種細胞の増殖が高められ、生成した腹水液は、雑種細
胞により分泌されるモノクローナル抗体に富んでいた。
充分な腹水液が生成した後（約７日）、マウスを犠牲に
して腹水を腹腔から回収し、遠心分離により不純物を取
り除いて−20℃で保管した。腹水液から得たモノクロー
ナル抗体を（J.G.R.Hurrel,ed.,前出に従って）プロテ
インＡセファロースを使用して精製した。培養上澄み、
腹水液またはプロテインＡ精製IgGのいずれかについ
て、本明細書に記載した全ての解析を行った。
実施例５ モノクローナル抗体の解析 EIA モノクローナル抗体の精製IgGを、免疫原（ペプチド6
43〜683,配列番号６）で被覆したマイクロタイタープレ
ート上および精製した組換えHCV E2/NS1蛋白pHCV80
（アミノ酸365〜731,配列番号７）で被覆したプレート
上で、実施例１に記載したEIAプロトコルにより解析し
た。HCV80のクローン化および発現の詳細な説明は実施
例６に記載する。本発明のモノクローナル抗体の免疫原
および組換えHCV E2/NS1蛋白に対するEIA反応性を表１
に示す。
ウェスタンブロット分析 約300μｇのHCV蛋白pHCV80（アミノ酸365〜731,配列
番号７）を95℃で、SDSおよび２−メルカプトエタノー
ルにより処理し、12％ポリアクリルアミド−SDSゲル中
で電気泳動を行った（Laemmli et al.,Nature 227:680
−685（1970））。蛋白は、25mMのトリス〔（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン〕、192mMのグリシンおよび2.0
％のメタノールを含む標準移動緩衝液（pH8.3）におい
て、100ミリアンペアでの電気泳動により一夜、ゲルか
らニトロセルロースへ移動させ、あるいは1.0アンペア
で１〜２時間移動させた（Towbin et al.,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.73:4350−4354（1979））。蛋白を移動させ、ニ
トロセルロースを５％のドライミルク/PBSでブロックし
た後、そのニトロセルロースを切断して細片にし（各細
片は約５μｇの蛋白を含む）、次いで試験血清（または
他のサンプル）中の抗HCV抗体の有無を測定するために
使用した。反応混合物は、ニトロセルロース片を2.0m
の緩衝液（20mMのトリス、1mMのEDTA、0.2MのNaCl、0.3
％のTriton X−100および2mg/mの牛血清アルブミン
（BSA）;pH7.5）における適量の試験サンプル、５％の
大腸菌溶解物および３％のCKS溶解物と、４℃で一夜、
インキュベートさせたものであった。その細片を緩衝洗
浄液（0.1％のSDSおよび0.5％のTriton X−100を含む10
mMのリン酸塩緩衝塩水（PBS）（pH7.5））で洗浄した
後、HRPOに結合させたヤギ抗マウスIgG抗体を添加し
た。細片を室温で１〜２時間インキュベートした後、緩
衝洗浄液で洗浄した。最後に、蛋白に結合した抗体を、
新たに調製したHRP発色試薬（Bio−Rad Laboratories,R
ichmand CA）（120mgを40mの氷冷メタノールに溶解し
た後、120μの30％過酸化水素を含む200mのトリス
緩衝塩水（TBS）（pH7.8）に希釈する。）を添加した可
視化した。図２は、本発明のモノクローナル抗体のHCV
E2/NS1蛋白に対する特異的反応性を示す。
免疫ヒト血清との競合 各々のモノクローナル抗体が、ヒトにおいて免疫性を
有するエピトープを認識するかどうかを確かめるため
に。次のように競合アッセイを行った。モノクローナル
抗体と該抗原との結合をE2/NS1（配列番号１）に対する
抗体に対してセロポジティブであるヒト血清と競合させ
るアッセイにおいて試験した。簡単に述べると、NANBH
に感染し、HCVのE2/NS1蛋白に対する抗体に対してかな
りセロポジティブである人から得たヒト血清を各モノク
ローナル抗体との反応混合物（最終濃度は10％）中でイ
ンキュベートした。実施例１に記載したようにマイクロ
タイターEIAを行った。モノクローナル抗体の各蛋白に
対する結合が免疫ヒト血清により50％以上阻害された場
合を競合したと考えた（データを表１に示す。）。モノ
クローナル抗体H13C113およびH23C163は、HCV E2/NS1
に対する抗体に対してセロポジティブである人の血清に
よりあまり阻害されなかった。
イソタイプ 各モノクローナル抗体のイソタイプを、イソタイプ決
定キット（Amersham,Arlington Heights,IL）を使用
し、そのキットに入っている指示に従って決定した。簡
単に述べると、各モノクローナル抗体の組織培養上澄み
および適当なコントロールを1:5に希釈して、上記キッ
トに用意された特定の抗イソタイプ抗体で被覆した細片
と反応させた。アッセイプロトコルは、製造者の指示に
確実に従った。本発明の各モノクローナル抗体のイソタ
イプを表１に示す。
実施例６ エピトープの地図作製 合成ペプチド（配列番号６）に対して得られたモノク
ローナル対体のHCV E2/NS1蛋白の特定領域に対する地
図作製を、実施例１に記載した方法を使用するマイクロ
タイターEIAによって、（ａ）各モノクローナル抗体とH
CV E2/NS1蛋白のサブフラグメントとのウェスタンブロ
ット反応性および（ｂ）各蛋白配列に対して選択された
いくつかの合成ペプチドとの反応性により行った。
組換えHCV NS1蛋白の種々のサブフラグメントに対する
モノクローナル抗体の反応性 簡単に述べると、HCVゲノムのアミノ酸365〜731を表
すいくつかの個々のオリゴヌクレオチドを連結し、CKS
融合ベクターpJ0200中で３個の別々のEcoR I−BamH Iサ
ブフラグメントとしてクローン化した。これら３個のサ
ブフラグメントは、図１に示したように、pHCV80（アミ
ノ酸365〜731）（配列番号７）、pHCV77（アミノ酸365
〜579）（配列番号８）およびpHCV65（アミノ酸565〜73
1）（配列番号９）と名付けた。CKS融合蛋白のクローン
化および発現の詳細な方法は、参考文献として本明細書
に添付する本出願人の米国特許出願No.07/610,180およ
び同No.07/572,822に開示されている。これらのクロー
ンの細胞溶解物を、抗NS1モノクローナル抗体の予備の
エピトープ地図作製のために実施例５に記載したプロト
コルを使用するウェスタンブロット分析での抗原として
使用した。図２は、モノクローナル抗体H13C113およびH
23C163の組換えHCV E2/NS1蛋白サブフラグメントに対
する結合を示す。なお、レーン１（正常なヒト血清）、
レーン２（HCV免疫ヒト血清）およびレーン３（正常な
マウス血清）をコントロールとして加えた。レーン４
は、H13C113をクローン化したハイブリッド上澄みを含
み、レーン６はモノクローナル抗体H13C113（H13C44）
を含み、レーン10はモノクローナル抗体H23C163を含
み、一方、レーン８および９はモノクローナル抗体H23C
163の姉妹クローン（各々H23C41およびH23C41）を含
む。これらのサブフラグメントによるエピトープ地図作
製のデータを図１に示す。モノクローナル抗体H13C113
およびH23C163は、pHCV80（配列番号７）およびpHCV65
（配列番号９）との反応性を示したが、これは、HCVア
ミノ酸565〜731（配列番号９）との反応性を示す。
合成ペプチドとの反応性 いくつかのアミノ酸配列を、実施例１に記載したPEPS
CAN分析に基づいてHCV蛋白NS1の種々の領域から選択し
た。これらのモノクローナル抗体のエピトープ地図作製
に使用したペプチドのリストを下記表２に示す。
これらのペプチドの各々を、カルボキシ末端残基から
始めて順次固相合成により支持体樹脂上で組み立てた。
方法は、E.Gross and T.Heinehofer,eds.,Barary and M
errifield,The Peptides 2:1284,Academic Press,New Y
ork,New York（1980）に記載された方法と同様のものを
用い、Applied Biosystems Synthesizer Model 430Aの
反応容器を使用した。樹脂からペプチドを切離した後、
そのペプチドをジエチルエーテルで洗浄し、40％の酢酸
水溶液で抽出した。水溶液を凍結乾燥して得られた粗ペ
プチドをエピトープ地図作製実験の抗原標的として使用
した。簡単に述べると、試験する各ペプチドを重炭酸塩
緩衝液（pH9.5）中に10μg/mの濃縮でマイクロタイタ
ーの窪みに被覆した。EIAを実施例１に記載した方法と
同様に行った。陰性コントロールの４倍の反応性を示す
モノクローナル抗体は陽性であると考えた。
さらに、HCV NS1に対するモノクローナル抗体の地図
作製も、実施例１に記載したPEPSCAN分析により行っ
た。HCV NS1に対する各モノクローナル抗体について、
実施例１で概説した方法と同様にEIAを行った。なお、H
CVゲノムのアミノ酸600〜720（配列番号１）を包含する
重複ヘキサマーペプチドとともに、モノクローナル抗体
の組織培養上澄みを一次抗体として、ヤギ抗マウスHRPO
を二次抗体として使用した。データを図３および４に示
す。モノクローナル抗体H13C113およびH23C163は、HCV
ゲノムのペプチド配列GDRCDLE（アミノ酸649〜655）
（配列番号10）と特異的に反応した。
実施例７ 生理試料においてHCV蛋白を検定するためのEIA HCV E2/NS1領域に対するウサギポリクローナル抗体の
調製 若いウサギ（３〜４月齢、体重約２〜3kg）（Hazelto
n Labs,Denver PA）に、100〜150μｇの高度に精製した
HCV E2/NS1合成ペプチドまたは実施例１に記載したよ
うに真核生物または原核生物系でクローン化および発現
させたE2/NS1組換え蛋白を完全フロイントアジュバント
に懸濁させて４か所で筋肉内注射することにより免疫感
作する。次いで、不完全フロイントアジュバントによる
同様の免疫感作を２週間間隔で２回行う。ウサギの免疫
応答をEIAおよびウェスタンブロット分析によりモニタ
ーする。蛋白に対する相当の免疫応答が得られたら。ウ
サギを出血させる。免疫ウサギ血清から得られるIgG
を、当業者には周知の方法で、タンパクＡセファロース
アフィニティークロマトグラフィーにより精製する。
固相の被覆 ウサギIgGを上記のように調製した後、試験サンプル
中のE2/NS1抗原を捕獲するために、固体支持体としての
ポリスチレンビーズに被覆する。ポリスチレンビーズを
蒸留水で洗浄し、５〜10μg/mの精製HCV E2/NS1合成
ペプチドウサギIgG/緩衝液（0.1Mのトリス、0.5MのNaC
l、0.0022％のTriton X−100、pH8.5）とともに40℃で
２時間インキュベートする。ビーズをPBSで１回洗浄し
た後、40℃で約１時間、0.1％のTriton X−100/PBSに浸
漬する。PBSで２回洗浄した後、ビーズに、40℃で約１
時間、３％牛血清アルブミン（BSA）/PBSのオーバーコ
ートを施す。最後に、ビーズを、PVSにおけるショ糖の
５％溶液でオーバーコートし、窒素下で乾燥する。E2/N
S1に対するHCV抗体に対してセロポジティブな人の血清
から精製した抗HCVヒトポリクローナルIgGも同様にして
被覆する。
EIA HCV E2/NS1に対して特異的なモノクローナル抗体
を、試験サンプル中のHCV蛋白をEIAにより検出するため
のプローブとして使用するためにスクリーニングを行
う。簡単に述べると、各モノクローナル抗体を、抗HCV
ウサギポリクローナルIgGで被覆したポリスチレンビー
ズの存在下で、E2/NS1抗原とともにインキュベートす
る。EIAのプロトコルは下記に記載するものと同じであ
る。
HCV E2/NS1蛋白に対する抗原を含む疑いのある試験
検体200μを、50μの本発明モノクローナル抗体（2
0mMのトリス、0.1MのNaCl、1mMのEDTA、3.0％のBSA、0.
3％のTween−20および10％のFBSを含むpH7.5の緩衝液に
希釈した最後蛋白濃度は約５〜10μg/m）およびHCVウ
サギIgG（上記したように調製したもの）で被覆したビ
ーズとともに反応トレイ中でインキュベートする。室温
で一夜インキュベートした後、ビーズを蒸留水で洗浄
し、200μｌの適度に希釈したホースラディッシュペル
オキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG（ＨおよびＬ）（Jac
kson Immunoresearch,West Grove,PA）を添加する。標
識プローブとともに約40℃で約２時間インキュベートす
る。ビーズを洗浄し、300μのｏ−フェニレンジアミ
ン（OPD）発色試薬を含む反応管に移す。反応を、室温
で約30分間、暗室で行い、1NのH2SO4を1m添加するこ
とにより反応を停止する。492/600nmでの吸光度を記録
する。予めスクリーニングし、NANBH感染に対して陰性
であることが確認されている陰性コントロールを実験に
加える。陽性コントロールは、E2/NS1に対する合成ペプ
チドの上記緩衝液における溶液から成る。陽性および陰
性の両コントロールを３試料、各組の実験に含める。
サンプル中のHCV E2/NS1を検出するための抗原捕獲
アッセイの効率を測定するために、100ngペプチド/m
から100pgペプチド/mの種々の濃度の組換えHCV E2/N
S1合成ペプチドを上記緩衝液に希釈する。希釈したパネ
ル要素の各々について上記EIAの操作を行う。比較のた
めに、各パネル要素を、（ａ）固相上の抗HCVウサギポ
リクローナル抗体および（ｂ）固相上の抗HCVヒトポリ
クローナル抗体を使用して試験する。次いで、得られた
データを評価することにより、アッセイの効率を求め
る。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを、モノクローナル抗体H13C113を産生するハイブリ
ドーマH13C113およびモノクローナル抗体H23C163を産生
するハイブリドーマH23C163と表示する。ハイブリドー
マH13C113およびH23C163は、1991年８月20日付で12301
Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852のAmerican
Type Culture Collection（ATCC）に寄託し、下記寄託
番号で受託された。ハイブリドーマH13C113のATCC寄託
番号:HB10857;およびハイブリドーマH23C163のATCC寄託
番号:HB10856。
このように、本発明の新規モノクローナル抗体は、種
々の方法で使用することができる。これらのモノクロー
ナル抗体は、増幅産物の免疫析出および抗HCVモノクロ
ーナル抗体で被覆したHCV核酸微粒子または担体の検出
に使用してHCV RNA関連ウィルスまたはウィルス性蛋白
を捕獲することができる。その際、RNAの検出方法を使
用することができる。この種の分析法の例は、参考文献
として本明細書に添付する係属中の本出願人の米国特許
出願No.07/568,663（発明の名称：標的核酸酸列の増幅
および検出方法）に開示されている。
また、これらのモノクローナル抗体は、直接標識化
（蛍光、コロイド状金など）したHCVモノクローナル抗
体を使用して、または二次的標識抗マウス抗体を使用し
て細胞内にHCV抗原を局在化するために使用することが
できる。病気の組織病理学を追跡することもできる。さ
らに、血清、組織、細胞、培養培地または体液中の天然
または組換えHCV抗原の検出も、個々のモノクローナル
抗体をサンドイッチ構造にして、または固相上および検
出系におけるモノクローナル抗体のカクテルにして使用
することにより行うことができる。
重複していないエピトープに対するモノクローナル抗
体を使用する一段抗原アッセイを行うこともできる。い
くつかのモノクローナル抗体は、感染した人には認めら
れない抗原性エピトープを認めることができ、従って、
遊離およびヒト抗体に結合した血清Agを認めることがで
きる可能性がある。さらに、検体を洗浄剤または還元剤
またはその両方により処理すると、「隠れた」抗原また
は抗原決定基から覆いを取り除くことができる。例え
ば、コア抗原はウィルスエンベロープで覆われたキャプ
シド型で存在する可能性がある。そのエンベロープを洗
浄剤により取り除くと、コア抗原が露出するはずであ
る。また、モノクローナル抗体は、タイターの高いポリ
クローナル抗体に対して、分析感度の上昇、またはイン
キュベーション時間の短縮という点で、実際的な利点を
付与することができる。
さらに、限定数の抗原部位に対する結合に対して抗HC
Vを標識抗HCVモノクローナル抗体と競合させる一段また
は二段競合アッセイの抗体免疫アッセイが開発された。
HCV AgサンドイッチアッセイにおけるHCV Ag結合を阻
害する溶液中でヒト抗HCVがHCV Agに結合するという、
より感度の高い競合アッセイが開発される可能性があ
る。モノクローナル抗体を使用する競合アッセイによれ
ば、ヒト抗体エピトープの地図作製をより正確に行うこ
とができ、また、抗体エピトープを中和するウィルスの
決定に有用である可能性がある。いくつかのモノクロー
ナル抗体は、ウィルス中和活性を有する可能性がある。
最後に、モノクローナル抗体は、天然ウィルス性および
組換えのHCV抗原および蛋白の免疫アフィニティー精製
に有用であるはずである。
本明細書に記載したこれら特有のモノクローナル抗体
の用途の他の種々の応用としては、PCR、LCRまたは直接
ハイブリッド形成による、免疫複合体のHCV、あるいは
潜状および／または隠れた抗原、および／または核酸の
検出のためのウィルス性核酸に関連した抗原の検出が挙
げられる。本明細書で述べた本発明の特定の態様の他の
変形および改良は、当業者には明らかであろう。従っ
て、本発明は、添付した請求の範囲にのみ限定される。
図面の簡単な説明 図１は、モノクローナル抗体作製またはその解析のた
めの免疫原として使用した組換えHCV蛋白のHCVゲノム上
での位置を示す図である。
図２は、モノクローナル抗体H13C113およびH23C163の
HCVNS1に対する特異的結合を示すウェスタンブロット分
析である。
図３は、モノクローナル抗体H13C113の重複したヘキ
サマーペプチド（HCVのアミノ酸600〜720）に対するPEP
SCAN分析のプロフィールであり、H13C13のHCVアミノ酸6
49〜655に対してエピトープ特異性を示す。
図４は、モノクローナル抗体H23C163の重複したヘキ
サマーペプチド（HCVのアミノ酸600〜720）に対するPEP
SCAN分析のプロフィールであり、H13C113のHCVアミノ酸
649〜655に対してエピトープ特異性を示す。
［配列表］ 配列番号:1 配列の長さ:121 配列の型 ：アミノ酸 鎖 の 数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:2 配列の長さ:21 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:3 配列の長さ:21 配列の型 ：アミノ酸 鎖 の 数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:4 配列の長さ:18 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:5 配列の長さ:21 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:6 配列の長さ:41 配列の型 ：アミノ酸 鎖 の 数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:7 配列の長さ:621 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:8 配列の長さ:414 配列の型 ：アミノ酸 鎖 の 数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:9 配列の長さ:463 配列の型 ：アミノ酸 鎖 の 数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 配列番号:10 配列の長さ:7 配列の型 ：アミノ酸 鎖 の 数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 デイリー，ステイーブン・エイチ アメリカ合衆国、イリノイ・60061、バ ーノン・ヒルズ、タイラー・コート・ 472 (72)発明者 デイサイ，シユアシユ・エム アメリカ合衆国、イリノイ・60048、リ バテイビル、エイミー・レーン・1408 (72)発明者 デイベア，スーシル・ジー アメリカ合衆国、イリノイ・60062、ノ ースブルツク、フアーンズワース・レー ン・2492 審査官 光本 美奈子 (56)参考文献 特表 平２−500880（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開388232（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 16/10 C12N 15/00 - 15/90 C12N 5/12 - 5/28 C12P 21/08 G01N 33/53 - 33/577 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ATCC寄託番号HB10857により分泌されるモ
    ノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】ATCC寄託番号HB10856により分泌されるモ
    ノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】ATCC寄託番号HB10857のハイブリドーマ細
    胞系。
  4. 【請求項４】ATCC寄託番号HB10856のハイブリドーマ細
    胞系。
  5. 【請求項５】Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）を含む可能性が
    ある試験サンプル中のHCVの存在を測定する方法であっ
    て、 ａ） 試験サンプルを、固相に結合した少なくとも１つ
    の抗HCV E2/NS1抗体またはその断片に接触させて混合
    物を生成する工程（該抗体および断片は配列番号１に示
    すアミノ酸配列を有するHCV E2/NS1抗原に特異的に結
    合する）、 ｂ） 抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間およ
    び条件下で前記混合物をインキュベートする工程、 ｃ） 前記複合体を、抗HCV E2/NS1抗体またはHCV E2
    /NS1抗原に特異的に結合し得るその断片に結合した測定
    ・検出可能なシグナルを発生するシグナル発生化合物を
    含む指示薬と接触させて第二の混合物を生成する工程、 ｄ） 抗体／抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時
    間および条件下で前記第二の混合物をインキュベートす
    る工程、および ｅ） 測定可能な発生シグナルを検出することによって
    試験サンプル中のHCVの存在を測定する工程（試験サン
    プル中に存在するHCVの量は該測定可能なシグナルに比
    例し、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するHCV E2/
    NS1抗原に特異的な工程（ａ）または（ｂ）のいずれか
    の抗体が、ATCC寄託番号HB10857およびATCC寄託番号HB1
    0856から選択されるATCCハイブリドーマ細胞系によって
    分泌されるモノクローナル抗体である）から成る前記方
    法。
  6. 【請求項６】シグナル発生化合物が、発光化合物、化学
    発光化合物、酵素および放射性元素から成る群より選択
    される請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】固相に結合している抗HCV抗体がポリクロ
    ーナル抗体である請求項５に記載の方法。
  8. 【請求項８】固相に結合している抗HCV E2/NS1抗体が
    モノクローナル抗体である請求項５に記載の方法。
  9. 【請求項９】指示薬がポリクローナル抗体に結合してい
    るシグナル発生化合物を含む請求項５に記載の方法。
  10. 【請求項１０】指示薬がモノクローナル抗体に結合して
    いるシグナル発生化合物を含む請求項５に記載の方法。
  11. 【請求項１１】Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）を含む可能性
    がある試験サンプル中のHCVの存在を測定する方法であ
    って、 ａ）試験サンプルを、固相に結合した抗HCV E2/NS1ポ
    リクローナル抗体またはHCV E2/NS1抗原に特異的に結
    合し得るその断片および配列番号１に示すアミノ酸配列
    を有するHCV E2/NS1抗原に特異的に結合するモノクロ
    ーナル抗体若しくはモノクローナル抗体の断片と接触さ
    せて混合物を生成する工程（モノクローナル抗体または
    その断片は測定・検出可能なシグナルを発生するシグナ
    ル発生化合物に結合しており、モノクローナル抗体はAT
    CC寄託番号HB10856およびATCC寄託番号HB10857から成る
    群より選択されるATCCハイブリドーマ細胞系によって分
    泌されるモノクローナル抗体である）、 ｂ）前記混合物を抗原／抗体複合体を生成するのに十分
    な時間および条件下でインキュベートする工程、および ｃ）試験サンプル中におけるHCVの存在の指標として測
    定可能なシグナルを検出することにより、試験サンプル
    中のHCVの存在を測定する工程（試験サンプル中に存在
    するHCVの量は測定可能な発生シグナルに比例する）を
    含む前記方法。
  12. 【請求項１２】Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）を含む可能性
    がある試験サンプル中のHCVの存在を測定する方法であ
    って、 ａ）試験サンプルを、固相に結合した抗HCV E2/NS1モ
    ノクローナル抗体またはHCV E2/NS1抗原に特異的に結
    合し得るその断片および配列番号１に示すアミノ酸配列
    を有するHCV E2/NS1抗原に特異的に結合するポリクロ
    ーナル抗体若しくはポリクローナル抗体の断片と接触さ
    せて混合物を生成する工程（ポリクローナル抗体または
    その断片は測定・検出可能なシグナルを発生するシグナ
    ル発生化合物に結合しており、モノクローナル抗体はAT
    CC寄託番号HB10856およびATCC寄託番号HB10857から成る
    群より選択されるATCCハイブリドーマ細胞系によって分
    泌されるモノクローナル抗体である）、 ｂ）前記混合物を抗原／抗体複合体を生成するのに十分
    な時間および条件下でインキュベートする工程、および ｃ）試験サンプル中におけるHCVの存在の指標として測
    定可能なシグナルを検出することにより、試験サンプル
    中のHCVの存在を測定する工程（試験サンプル中に存在
    するHCVの量は測定可能な発生シグナルに比例する）を
    含む前記方法。
  13. 【請求項１３】試験サンプル中におけるHCV抗原の存在
    を測定するためのアッセイキットであって、配列番号１
    に示すアミノ酸配列を有するHCV E2/NS1抗原に特異的
    に結合する少なくとも１つのモノクローナル抗体若しく
    はモノクローナル抗体の断片を含む容器を含んでなり、
    該モノクローナル抗体がATCC寄託番号HB10856およびATC
    C寄託番号HB10857から成る群より選択されるATCCハイブ
    リドーマ細胞系によって分泌されるモノクローナル抗体
    である前記キット。
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