JP3483555B2

JP3483555B2 - 推定ｈｃｖエンベロープ領域に対するモノクローナル抗体およびその使用方法

Info

Publication number: JP3483555B2
Application number: JP50626492A
Authority: JP
Inventors: ギバドロ、マリー・エス; タイナー、ジョーン・ディー; ミムズ、ラリー・ティー; ヴァラリ、デイビッド・エス
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1991-01-31
Filing date: 1992-01-30
Publication date: 2004-01-06
Anticipated expiration: 2019-01-06
Also published as: EP0569537A1; CA2101534A1; AU662517B2; EP0569537A4; AU1362792A; KR930703361A; JPH06505389A; WO1992013892A1; DE69225960D1; EP0569537B1; ATE167522T1; CA2101534C; DK0569537T3; ES2118129T3; DE69225960T2; HK1012838A1

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景：この発明は、一般にＣ型肝炎ウイルス（HCV）に特異
的に結合する抗体に関し、さらに詳しくは、推定HCVエ
ンベロープ領域に対するモノクローナル抗体を分泌する
新規ハイブリドーマ細胞株のパネル、およびこれらモノ
クローナル抗体の使用方法に関する。

黄疸を引き起こす肝炎疾患の記載は、古代より人類に
知られている。現在、ウイルス性肝炎は、異なる伝達経
路による異なる程度の重篤度の肝臓損傷を伴う肝炎を引
き起こす、特有のウイルス構成タンパク質構造および複
製様式を有する一群のウイルス因子を含むことが知られ
ている。急性ウイルス性肝炎は、黄疸、肝臓の圧痛並び
にアスパラギン酸トランスアミナーゼおよびアラニント
ランスアミナーゼなどの肝臓トランスアミナーゼの上昇
レベルを含む所定の患者兆候により臨床的に診断され
る。

Ａ型肝炎とＢ型肝炎とをさらに識別するため、血清学
的アッセイが現在用いられている。非Ａ非Ｂ型肝炎（NA
NBH）は、Ａ型肝炎ウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスの
いずれによっても引き起こされない輸血後肝炎を引き起
こす症例として記載された1975年に最初に用いられた術
語である。フェインストーン（Feinstone）ら、New Eng
l.J.Med.292:454〜457（1975）。NANBHの診断は、主と
してＡ型肝炎およびＢ型肝炎の存在の血清学的分析に基
づいた除外法によりなされてきた。NANBHは、輸血後肝
炎の症例の約90％を占めている。ホリンガー（Hollinge
r）ら、マニュアル・オブ・クリニカル・イミュノロジ
ー（Manual of Clinical Immunology）、アメリカン・
ソサイエティー・フォア・マイクロバイオロジー、ワシ
ントン、D.C.、558〜572（1986）、ローズ（N.R.Rose）
ら編。

公知肝炎ウイルスの一つとのゲノム類似性によりNANB
Hウイルスを同定しようとする試みはこれまで失敗に終
わっており、NANBHウイルスが別個のゲノム構成および
構造を有することが示唆された。ファウラー（Fowler）
ら、J.Med.Virol.12:205〜213（1983）、およびウエイ
ナー（Weiner）ら、J.Med.Virol.21:239〜247（198
7）。NANBHに特異的な抗体を検出するためのアッセイの
開発における進歩は、該ウイルスに付随する抗原を同定
する際に直面する困難さによって遅れている。ウオーズ
（Wards）ら、米国特許第4,870,076号；ウオーズら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.83:6608〜6612（1986）；オーホリ
（Ohori）ら、J.Med.Virol.12:161〜178（1983）；ブラ
ッドリー（Bradly）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.84:6277〜
6281（1987）；アカツカ（Akatsuka）ら、J.Med.Virol.
20:43〜56（1986）。

1988年５月にカイロン・コーポレーション（Chiron C
orporation）とセンターズ・フォア・ディジーズ・コン
トロール（Centers for Disease Control）の共同研究
の努力の結果、推定NANB因子、Ｃ型肝炎ウイルス（HC
V）が同定された。ヒュートン（Houghton）らは、チン
パンジーの感染血漿から得たNANB因子をクローニングし
大腸菌中で発現せさた。クオ（Kuo）ら、Science244:35
9〜361（1989）；チュー（Choo）ら、Science244:362〜
364（1989）。臨床的にNANBHと診断された患者の大部分
に存在する抗体と免疫学的に反応する抗原をコードする
HCVからのcDNA（コピーDNA）配列が同定された。利用で
きる情報およびHCVの分子構造に基づき、該ウイルスの
遺伝子構成は分子量が約9.5kbの一本鎖直線状RNA（ポジ
鎖）からなり、一つの連続的な転写解読枠を有する。カ
スバート（J.A.Cuthbert）、Ameri.J.Med.Sci.299:346
〜355（1990）。それは、フラビウイルスに類似するエ
ンベロープを有する小さなウイルスである。研究者ら
は、感染個体の肝細胞の超微細構造における変化によっ
てNANB因子を同定しようと試みてきた。グプタ（H.Gupt
a）、Liver81:111〜115（1988）；ブラッドリー、J.Vir
ol.Methods10:307〜319（1985）。肝細胞並びにPCR増幅
HCV RNA配列における同様の超微細構造変化が、NANBH患
者並びに感染HCV血漿で実験的に感染させたチンパンジ
ーにおいて検出されている。シミズ（T.Shimizu）ら、P
roc.Natl.Acad.Sci.87:6441〜6444（1990）。

輸血後NANBHの病因としてのHCVを示すものとして、か
なりの血清学的証拠が挙がっている。オールター（H.Al
ter）ら、N.Eng.J.Med.321:1494〜1500（1989）；エス
タベン（Estaben）ら、The Lancet:8月、5:294〜296（1
989）；バン・デル・ポエル（C.Van Der Poel）ら、The
Lancet 8月、5:297〜298（1989）；スボリ（G.Sboll
i）、J.Med.Virol.30:230〜232（1990）；マクリス（M.
Makris）ら、The Lancet335:1117〜1119（1990）。HCV
抗体の検出により血液供給システムから70〜80％のNANB
H感染血液が除かれるが、これら抗体は明らかに該疾患
の慢性状態において容易に検出されるものであって、急
性のNANBH段階からの試料ではわずかに60％がHCV抗体陽
性であるにすぎない。オールターら、New Eng.J.Med.3
21:1994〜1500（1989）。HCVへの暴露と抗体検出との間
の長い期間、および種々の構造タンパク質および非構造
タンパク質に対する免疫応答プロフィルに関する適切な
情報の欠如が、NANBH感染の間の抗体陰性相における患
者の感染状態に関して疑問を投げかけている。それゆ
え、HCVへの急性感染およびHCVの存在を同定するアッセ
イシステムの開発に対する必要性が存在する。

発明の要約本発明は、推定HCVエンベロープ領域の検出に用いる
ことのできる高度に特異的で新規なモノクローナル抗体
のパネルを提供する。これらモノクローナル抗体は、推
定HCVエンベロープ（ENV）遺伝子に由来するペプチドに
特異的に結合する。これらモノクローナル抗体を分泌す
るハイブリドーマは以下のように同定される：ハイブリ
ドーマ細胞株16−407−209（A.T.C.C.受託番号HB1060
1、モノクローナル抗体16−407−209を分泌）、および
ハイブリドーマ細胞株16−803−174（A.T.C.C.受託番号
HB10605、モノクローナル抗体16−803−174を分泌）。
これらモノクローナル抗体の特異性により推定HCVエン
ベロープ領域の有利な同定が可能となり、この同定は識
別研究並びにHCV（NANB）感染の診断および評価に有用
であり得る。

好ましいアッセイ態様において、HCV抗原を含有する
かもしれない試験試料を、ポリクローナルまたはモノク
ローナルの抗HCVエンベロープ領域抗体またはその断片
を結合させた固相と接触させて混合物を生成させる。こ
の混合物を抗原／抗体複合体を生成するのに充分な時間
および条件下でインキュベートする。ついで、かくして
生成した複合体を、シグナル生成化合物に結合したHCV
抗原に特異的なモノクローナルまたはポリクローナルの
抗体またはその断片からなる指示試薬と接触させて第二
の混合物を生成させる。この第二の混合物を抗体／抗原
／抗体複合体を生成するのに充分な時間および条件下で
反応させる。HCV抗原の存在を、生成した測定可能なシ
グナルを検出することにより決定する。試験試料中に存
在するHCVの量、それゆえ固相上に捕捉されたHCV抗原の
量は、生成したシグナルの量に正比例する。

別法として、HCVエンベロープ領域に特異的なモノク
ローナルまたはポリクローナルの抗体またはその断片と
シグナル生成化合物とからなる指示試薬を、固相上にコ
ーティングしたポリクローナルまたはモノクローナルの
抗体またはその断片および試験試料に加えて混合物を生
成させる。この混合物を抗体／抗原／抗体複合体を生成
するのに充分な時間および条件下でインキュベートす
る。試験試料中のHCVの存在および量、それゆえ固相上
に捕捉されたHCV抗原の量を、測定可能なシグナルを検
出することにより決定する。試験試料中に存在するHCV
の量は生成したシグナルの量に正比例する。

他の別のアッセイ態様において、本発明のモノクロー
ナル抗体の１または２以上の組合せを推定HCVエンベロ
ープ領域に対する抗体の検出のための競合プローブとし
て用いることができる。たとえば、HCVエンベロープ領
域タンパク質を単独または組合せて固相上にコーティン
グすることができる。ついで、HCVエンベロープ領域に
対する抗体を含有すると思われる試験試料を、シグナル
生成化合物と本発明のモノクローナル抗体とからなる指
示試薬とともに、試験試料および指示試薬→固相かまた
は指示試薬→固相のいずれかの抗原／抗体複合体を生成
するのに充分な時間および条件下でインキュベートす
る。モノクローナル抗体の固相への結合の減少を定量的
に測定することができる。確認された陰性NANBH試験試
料から生成するシグナルと比較してシグナルの測定可能
な減少は、試験試料中の抗HCVエンベロープ抗体の存在
を示す。

さらに別のアッセイ態様において、試験試料を、HCV
タンパク質を結合させた固相、およびシグナル生成化合
物に結合させたHCV特異的なモノクローナル抗体または
その断片からなる指示試薬と接触させて混合物を生成さ
せる。この混合物を抗体／抗原複合体を生成するのに充
分な時間および条件下でインキュベートする。試験試料
中の抗HCV抗体の存在は、生成した測定可能なシグナル
を検出し、このシグナルを既知の陰性試料から生成した
測定シグナルと比較することによって決定する。既知の
陰性試料のシグナルと比較して試験試料のシグナルの測
定可能な減少は、抗HCV抗体の存在を示す。溶液中の遊
離の抗原を用いた抗HCV抗体の検出のための競合アッセ
イも行うことができる。

推定HCVエンベロープ領域の存在は、HCVエンベロープ
領域に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその
断片に結合させたシグナル生成化合物からなる指示試薬
に該組織試料を接触させて混合物を生成させることによ
って組織試料中で検出することができる。この混合物を
抗原／抗体複合体を生成するのに充分な時間および条件
下でインキュベートする。組織試料中のHCVエンベロー
プ領域の存在は、生成したシグナルを検出することによ
って決定する。

本発明のモノクローナル抗体を用いたキットも提供さ
れる。

図面の簡単な記載図１は、非構造（NS）遺伝子および構造遺伝子、コア
（Ｃ）およびエンベロープ（Ｅ）を表すHCVゲノムの地
図である。

図２〜13は、本発明のモノクローナル抗体の反応性を
示すウエスタンブロットの写真であり、レーン１〜３にはHCV33Cタンパク質に対するモノクロ
ーナル抗体が含まれ（レーン１は６−296−534、レーン
２は６−914−518、およびレーン３は６−1070−110で
ある）；レーン４〜６にはHCVコアに対するモノクローナル抗
体が含まれ（レーン４は13−975−157、レーン５は14−
153−234、およびレーン６は14−1350−210である）；レーン７および８には推定HCV ENV領域に対するモノ
クローナル抗体が含まれ（レーン７は16−407−209、お
よびレーン８は16−803−174である）；レーン９〜10にはHCV C−100に対するモノクローナル
抗体が含まれ（レーン９は25−1518−105、レーン10は2
8−735−355である）；レーン11にはCKSに対するモノクローナル抗体が含ま
れ（レーン11中に29−121−236）；レーン12には正常マウス血清コントロールが含まれ；
およびレーン13には抗体希釈の陰性コントロールが含まれ
る。

図２は、CKS−コアに対して行ったこれらモノクロー
ナル抗体の電気泳動ブロットである；図３は、λPL−コアに対して行ったこれらモノクロー
ナル抗体の電気泳動ブロットである；図４は、λPL−33C−コアに対して行ったこれらモノ
クローナル抗体の電気泳動ブロットである；図５は、CKS−33Cに対して行ったこれらモノクローナ
ル抗体の電気泳動ブロットである；図６は、CKS−33C−BCDに対して行ったこれらモノク
ローナル抗体の電気泳動ブロットである；図７は、CKS−BCDに対して行ったこれらモノクローナ
ル抗体の電気泳動ブロットである；図８は、CKS−Ｂに対して行ったこれらモノクローナ
ル抗体の電気泳動ブロットである；図９は、CKS−Ｅに対して行ったこれらモノクローナ
ル抗体の電気泳動ブロットである；図10は、CKSに対して行ったこれらモノクローナル抗
体の電気泳動ブロットである；図11は、SOD−100に対して行ったこれらモノクローナ
ル抗体の電気泳動ブロットである；図12は、CKS−A'BCDに対して行ったこれらモノクロー
ナル抗体の電気泳動ブロットである；および図13は、CKS−Ａ″BCDに対して行ったこれらモノクロ
ーナル抗体の電気泳動ブロットである。

図14は、HCVゲノム380〜436の推定ENVドメインのアミ
ノ酸配列である。

発明の詳細な記載本発明は、推定HCVエンベロープ領域に対する新規モ
ノクローナル抗体、該モノクローナル抗体の使用方法、
およびこれらモノクローナル抗体を含有するキットを提
供する。

本発明のモノクローナル抗体は、試験試料中の推定HC
Vエンベロープ領域タンパク質の存在（もし存在するな
ら）を決定するために種々のアッセイシステムにおいて
用いることができる。これら提供されるモノクローナル
抗体の断片をも用いることができる。たとえば、第一の
アッセイ態様において、固相上にコーティングした、ポ
リクローナルまたはモノクローナルの抗HCVエンベロー
プ領域抗体またはその断片またはこれら抗体の組合せ
を、推定HCVエンベロープ領域タンパク質を含有してい
るかもしれない試験試料と接触させて混合物を生成させ
る。この混合物を、抗原／抗体複合体を生成するのに充
分な時間および条件下でインキュベートする。ついで、
シグナル生成化合物を結合させた、推定HCVエンベロー
プ領域に特異的に結合するモノクローナルまたはポリク
ローナルの抗体またはその断片またはこれら抗体の組合
せからなる指示試薬を該抗原／抗体複合体に接触させて
第二の混合物を生成させる。ついで、この第二の混合物
を、抗体／抗原／抗体複合体を生成するのに充分な時間
および条件下でインキュベートする。試験試料中に存在
し固相上に捕捉された推定HCVエンベロープ領域の存在
（もし存在するなら）は、該シグナル生成化合物によっ
て生成した測定可能なシグナルを検出することによって
決定する。試験試料中に存在する推定HCVエンベロープ
領域の量は、生成したシグナルに正比例する。

別法として、固相支持体に結合させた、ポリクローナ
ルまたはモノクローナルの抗HCVエンベロープ領域抗体
またはその断片、またはこれら抗体の組合せ、試験試
料、およびシグナル生成化合物を結合させた、推定HCV
エンベロープ領域に特異的に結合するモノクローナルま
たはポリクローナルの抗体またはその断片またはこれら
抗体の組合せからなる指示試薬、を接触させて混合物を
生成させる。この混合物を抗体／抗原／抗体複合体を生
成するのに充分な時間および条件下でインキュベートす
る。試験試料中に存在し固相上に捕捉された推定HCVエ
ンベロープ領域タンパク質の存在（もし存在するなら）
は、該シグナル生成化合物によって生成する測定可能な
シグナルを検出することによって決定する。試験試料中
に存在するHCVタンパク質の量は、生成したシグナルに
正比例する。

他の別のアッセイ態様において、推定HCVエンベロー
プ領域に対する抗体の検出のための競合プローブとし
て、本発明の１のモノクローナル抗体または１もしくは
２以上のモノクローナル抗体の組合せを用いることがで
きる。たとえば、推定HCVエンベロープ領域タンパク質
を単独または組合せのいずれかで固相上にコーティング
することができる。ついで、推定HCVエンベロープ領域
に対する抗体を含有していると思われる試験試料を、シ
グナル生成化合物と本発明の少なくとも１のモノクロー
ナル抗体とからなる指示試薬とともに、試験試料および
指示試薬→固相かまたは指示試薬→固相のいずれかの抗
原／抗体複合体を生成するのに充分な時間および条件下
でインキュベートする。モノクローナル抗体の固相への
結合の減少を定量的に測定することができる。確認され
た陰性NANBH試験試料から生成したシグナルと比較して
シグナルの測定可能な減少は、試験試料中の抗HCVエン
ベロープ抗体の存在を示す。

さらに別の検出方法において、本発明の各モノクロー
ナル抗体を免疫組織化学的分析による固定化組織切片並
びに固定化細胞中のHCV抗原の検出に用いることができ
る。

加えて、これらモノクローナル抗体はCNBr活性化セフ
ァロースに類似のマトリックスに結合することができ、
細胞培養液または血液や肝臓などの生物学的組織からの
特定HCVタンパク質のアフィニテイー精製に用いること
ができる。

本発明のモノクローナル抗体はまた、治療的な使用や
他の同様の適用のためにキメラ抗体の生成に用いること
もできる。

該モノクローナル抗体またはその断片は、推定HCVエ
ンベロープ領域を検出するために別個に提供することが
できる。該モノクローナル抗体（およびその断片）の組
合せもまた、抗HCVエンベロープ領域抗体と他のHCV領域
に対する抗体（それぞれ異なる結合特異性を有する）と
の混合物または「カクテル」中の成分として一緒に用い
ることもできる。それゆえ、このカクテルには、推定HC
Vエンベロープ領域タンパク質に向けられた本発明のモ
ノクローナル抗体およびHCVゲノムの他の抗原決定基に
対する他のモノクローナル抗体の両方が含まれていてよ
い。これら考えられるカクテルに有用な他のモノクロー
ナル抗体の例としては、HCV C−100、HCV 33Cおよび／
またはHCVコアに対するモノクローナル抗体（米国特許
出願第07/610,175号（発明の名称:C型肝炎ウイルスに対
するモノクローナル抗体およびその使用方法）に開
示）、および米国特許出願第07/610,175号の一部継続出
願（発明の名称:HCVコアタンパク質に対するモノクロー
ナル抗体およびその使用方法（米国特許出願第648,473
号）、および発明の名称:HCV 33Cタンパク質に対するモ
ノクローナル抗体およびその使用方法（米国特許出願第
648,477号））（これら出願は共通の出願人のものであ
り、参照のため本明細書中に引用する）に開示されてい
るモノクローナル抗体が挙げられる。

これらアッセイ態様に用いることのできるポリクロー
ナル抗体またはその断片は、推定HCVエンベロープ領域
またはアッセイに用いた他のHCVタンパク質、たとえばH
CV C−100タンパク質、HCV 33Cタンパク質またはHCVコ
アタンパク質に特異的に結合すべきである。使用するポ
リクローナル抗体は、好ましくは哺乳動物起源のもので
あり；ヒト、ヤギ、ウサギまたはヒツジ抗HCVポリクロ
ーナル抗体を用いることができる。最も好ましくは、ポ
リクローナル抗体はウサギポリクローナル抗HCV抗体で
ある。これらアッセイに用いるポリクローナル抗体は、
単独かまたはポリクローナル抗体のカクテルとしてのい
ずれかで用いることができる。これらアッセイ態様に用
いるカクテルは異なるHCV特異性を有するモノクローナ
ル抗体またはポリクローナル抗体からなるので、これら
カクテルはHCV感染の診断、評価およびおそらく予防並
びにHCVタンパク質の識別および特異性を研究するのに
有用である。

本明細書に記載する本発明の方法により試験すること
のできる試験試料としては、全血、血清、血漿、脳脊髄
液、尿などのヒトおよび動物の体液、細胞培養上澄み液
などの生物学的流体、固定化組織試料および固定化細胞
試料が挙げられる。固相支持体は当該技術分野で知られ
ており、反応トレイのウエルの壁、試験管、ポリスチレ
ンビーズ、マグネチックビーズ、ニトロセルローススト
リップ、膜、ラテックス粒子などの微細粒子、その他が
挙げられる。

指示試薬は、HCVに対する特異的結合成員に結合（付
着）した、外部手段によって検出可能な測定可能なシグ
ナルを生成し得るシグナル生成化合物（標識）からな
る。本明細書において使用する「特異的結合成員」と
は、特異的結合ペアの成員を意味する。すなわち、一方
の分子が第二の分子に化学的または物理的手段によって
特異的に結合する２つの異なる分子である。HCVに対す
る特異的結合ペアの抗体成員であることに加えて、指示
試薬はまた、ビオチンまたは抗ビオチン、アビジンまた
はビオチン、炭水化物またはレクチン、相補的ヌクレオ
チド配列、エフェクター分子またはレセプター分子、酵
素補助因子と酵素、酵素インヒビターまたは酵素などの
ハプテン−抗ハプテン系を含む、いかなる特異的結合ペ
アの成員であってもよい。免疫反応性の特異的結合成員
は、抗体、抗原、または抗体／抗原複合体（サンドイッ
チアッセイにおけるようにHCVに結合し得る、競合アッ
セイにおけるように捕捉試薬に結合し得る、または間接
アッセイにおけるように補助特異的結合成員に結合し得
る）であってよい。

考えられる種々のシグナル生成化合物（標識）として
は、色原体、酵素などの触媒、フルオレセインおよびロ
ーダミンなどの発光化合物、化学ルミネッセンス化合
物、放射性元素、および直接的な視覚標識が挙げられ
る。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、西洋
ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼな
どが挙げられる。特定の標識の選択は重要ではないが、
それ自体かまたは１または２以上の別の基質とともにシ
グナルを生成することができる。

このアッセイに用いる試薬は、バイアルやびんなどの
１または２以上の容器（各容器には該アッセイに用いる
モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体のカク
テルなどの別個の試薬を入れてある）を有するキットの
形態にて提供することができる。

材料および方法組換えHCV抗原および免疫原の製造 HCVゲノムの推定ENVドメイン内の領域に対応する合成
ペプチドを自動ペプチド合成機により製造した。当該技
術分野で知られた標準法を用い、下記ペプチドを構築し
た： ENV 380〜436 405〜436 これらペプチドは、継続中の米国特許出願第07/610,1
80号（発明の名称:C型肝炎アッセイ）（共通の出願人の
ものであり、参照のため本明細書中に引用する）に記載
されている。図１はHCVゲノムおよびHCV領域のおよその
位置の地図である。HCVゲノムの推定ENVドメイン（p380
〜436）のアミノ酸配列は図14に示してある。

マウスの免疫 BALB/cマウス（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ
（Charles River Laboratories）、チャールズリバー、
ニューヨーク州）（６〜８週齢）を、最初にフロイント
の完全アジュバント（ジフコ、デトロイト、ミシガン
州）（100μｌ）中の推定エンベロープ領域p380〜436に
対するHCVペプチド（50μｇ）で皮下および腹腔内にて
免疫した。15日目に免疫原（50μｇ）をリン酸緩衝食塩
水（PBS）（pH7.2）（100μｌ）中に希釈し、尾静脈中
に静脈内注射した（ゴーディング（J.Goding）、モノク
ローナル・アンタイボディーズ：プリンシプルズ・アン
ド・プラクティス（Monoclonal Antibodies:Principles
and Practice）［ニューヨーク；アカデミックプレ
ス、1986］）。血清力価は評価しなかった。

融合 18日目にマウスを屠殺し、公知の通常の方法［コーラ
ーおよびミルシュテイン、Nature（1975）256:495〜49
7;ゴーディング、上記］に従って脾臓細胞をSP2/0ミエ
ローマ株と1:1の比で融合させた。細胞融合ペレットを5
0％ポリエチレングリコール（PEG）（アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション、MW1450）（1ml）で分
散させ、イスコーブの（Iscove's）修飾ダルベッコ培地
（IMDM）（ギブコ、グランドアイランド、ニューヨーク
州）中で遠心分離した。細胞を10％ウシ胎仔血清（FB
S）を含有するHAT（ヒポキサンチン−アミノプテリン−
チミジン）選択IMDM（ハイクローン・ラボラトリーズ
（Hyclone Laboratories）、ローガン、ユタ州）中に再
懸濁し、96ウエル組織培養プレート当たり３×10⁵細胞
にてプレーティングした。HAT培地中に含まれる増殖促
進剤は0.5％STM（RIBIイムノケム・リサーチ（RIBI Imm
unochem Research,Inc.）、ハミルトン、モンタナ州）
および１％オリゲンハイブリドーマクローニングファク
ター（Origen Hybridoma Cloning Factor）（イゲン（I
gen）、ロックビル、メリーランド州）であった。融合
後の５日目および７日目に10％FBSを含有するHT（ヒポ
キサンチン−チミジン）添加IMDMを用いて増殖培地を培
養ウエル中で置換した。

エンザイムイムノアッセイ（EIA）融合後10日間に免疫抗原に対して培養上澄み液をEIA
スクリーニングして、HCV特異的な抗体を分泌するハイ
ブリッドおよび非特異的なタンパク質を分泌するハイブ
リッドを検出して偽陽性を除いた（ランゴン＆バン・バ
ナキス（Langone＆Van Vunakis）編、メソッズ・イン・
エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、92:168
〜174、アカデミックプレス［1983］）。ポリスチレン9
6−ウエルマイクロタイタープレートを、PBS中のHCVペ
プチドアミノ酸380〜436（１μg/ml、ウエル当たり50μ
ｌ）で室温にて一夜コーティングした。ポリスチレンウ
エル上の残留する結合部位を、PBS中の３％ウシ血清ア
ルブミン（BSA）（インタージェン（Intergen）、パー
チェス、ニューヨーク州）で室温にて30分間ブロッキン
グした。プレートを蒸留水で３回洗浄した。ハイブリド
ーマ組織培養上澄み液（50μｌ）をウエル中で室温にて
１時間インキュベートし、ウエルを蒸留水で３回洗浄し
た。抗原に結合した抗体をブロック溶液中に1:1000の濃
度に希釈したヤギ抗マウスIgG＋Ｍ−西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（HRPO）（キルケガール−ペリー・ラボラト
リーズ（Kirkegaard−Perry Laboratories［KPL］、ガ
イセルスブルク、メリーランド州））を用いて検出し、
室温で30分間インキュベートした。プレートを蒸留水で
洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン基質（OPD;アボット・
ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州）を色原
体として用いた。プレートを492nmで読み取った。光学
密度（OD）が陰性コントロール（NC）の３倍であり、無
関係の抗原をコーティングしたプレートへの抗体の結合
に比べてHCV抗原プレートに対して有意な選択性が観察
される場合に（すなわち、前者に対して＞0.2 ODの相
違、および＜0.2 ODシグナル）、ハイブリッド培養液は
HCV抗体陽性の可能性があるとみなした。

ウエスタンブロットハイブリッド抗体の特異性をウエスタンブロット分析
（トウビン＆ゴードン（Towbin＆Gordon）、J.Immunol.
Methods、72:313〜340［1984］）で確認した。製造業者
の教示に従い（シュライヒャー＆シュエル（Schleicher
＆Schuell）、キーン、ニューハンプシャー州；バイオ
−ラド、リッチモンド、カリフォルニア州）、HCV組換
えタンパク質および無関係のタンパク質をドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−P
AGE）により電気泳動にかけ、ついでニトロセルロース
に移した。これらニトロセルロースストリップをPBS中
の１％ウシヘモグロビン（シグマ・ケミカル、セントル
イス、ミズーリ州）および0.5％ツイーン−20（フィッ
シャー・サイエンティフィック（Fisher Scientifi
c）、ピッツバーグ、ペンシルベニア州）で室温にて30
分間ブロッキングし、ついでストリップをハイブリッド
組織培養上澄み液とともにインキュベートした。つい
で、ストリップをPBS中で洗浄し、ヤギ抗マウスIgG＋Ｍ
−HRPO（KPL）を30分間かけて加えた。HCV抗原への抗体
結合を、色原体基質としての４−クロロ−１−ナフトー
ル（シグマ）で視覚化した。ハイブリッド培養液をクロ
ーニングし、HCV抗体特異性が示されたならば凍結保存
中に置いた。

クローンの確立 HCV特異的ハイブリッドを限界希釈法（ゴーディン
グ、モノクローナル・アンタイボディーズ：プリンシプ
ルズ・アンド・プラクティス、第２版、アカデミックプ
レス、ニューヨーク［1986］）によりクローニングし
た。変更した部分としては、log₁₀希釈系列中に培養液
をプレーティングすること、およびプレートからの拡張
について陽性クローン（96ウエル組織培養プレート当た
り＜20％の増殖を示した）を選択することが含まれてい
た。培養上澄み液を上記EIA法およびウエスタンブロッ
ト法を用いて10日後に試験した。選択したクローンをさ
らに評価するために拡張し、10％FBS（ハイクローン）
および10％DMSO（シグマ）を含有する80％IMDM中に凍結
保存した。

モノクローナル抗体イソタイプ SBAクロノタイピングシステムIII（SBA Clonotyping
System III）キット（サザーン・バイオテクノロジー・
アソシエーツ（Southern Biotechnology Associates,In
c.）、バーミンガム、アラバマ州）に変更を加えてモノ
クローナル抗体のイソタイプを決定した。EIA96−ウエ
ルマイクロタイタープレートをヤギ抗マウスIgG＋Ｍ
（Ｈ＋Ｌ）（KPL）の1:1000希釈（100μl/ウエル）で室
温にて一夜コーティングした。プレートをPBS中の３％B
SAで30分間ブロッキングし、水洗した。培養試料をウエ
ルに加え、１時間インキュベートし、水洗した。キット
のヤギ抗マウスサブタイプ特異的結合体を30分間のイン
キュベーション期間加えた。水洗後、OPD基質で色を同
定した。マウス免疫グロブリンに結合し492nmで＞0.1OD
を示したヤギ抗マウスイソタイプ特異的結合体は、サブ
タイプを表示した。

モノクローナル抗体の産生さらに評価するために選択したクローンを組織培養Ｔ
型フラスコ中でスケールアップし、前以てプリスタン処
理したBALB/cマウス（チャールズ・リバー・バイオテク
ニカル・サービスィズ、ウイルミントン、マサチューセ
ッツ州）（ハレル、上記参照）の腹腔内に10⁶細胞を注
射した。得られた腹水を注射後７〜10日に回収し、遠心
分離にかけ、−20℃で貯蔵した。自動OROS精製システム
モデル100（基本的な原理についてはゴーディング、上
記参照）を用い、IgG抗体をプロテインＡ（ファルマシ
ア−LKB・バイオテクノロジーズ（Pharmacia−LKB Biot
echnologies）、ピスカタウエイ、ニュージャージー
州）上でアフィニティー精製した。IgM抗体をＳ−300カ
ラム（ファルマシア−LKB）上のモレキュラーサイジン
グにより精製した。

下記すべての特性情報を精製モノクローナル抗体を用
いて行った。

等電点電気泳動（IEF）凍結ロットの一貫性を確保するための細胞株の品質制
御として、IEFゲル装置（バイオ−ラド）（正味の電荷
に基づいてタンパク質を分離する）上で抗体のpI点を測
定することが含まれていた。簡単に説明すると、ビス−
アクリルアミド−リボフラビン溶液をアクリルアミドゲ
ルに負荷し、蛍光照明に１時間暴露し、ついで４℃にて
一夜貯蔵した。モノクローナル抗体の１μｇ試料および
標準をゲル上に重層し、１〜２時間電気泳動にかけた。
一連の固定化および洗浄の後、ゲルを銀染色した（バイ
オ−ラド）。ゲル中の移動距離からモノクローナル抗体
のpI値を計算し、pI値のわかっているタンパク質標準の
移動距離と直接比較した。識別フィンガープリントバン
ドパターンは、独立に産生した抗体のロット間でのpIの
ミクロの不均一性（microheterogeneity）を反映してい
た（ハミルトン（Hamilton,R.G.）、レイマー（Reimer,
C.B.）、ロドキー（Rodkey,L.S.）（1987）クオリティ
ー・コントロール・オブ・ムリン・モノクローナル・ア
ンタイボディーズ・ユージング・イソエレクトリック・
フォーカシング・アフィニティー・イムノブロット・ア
ナリシス（Quality control of murine monoclonal ant
ibodies using isoelectric focusing affinity immuno
blotanalysis）、Hybridoma6:205〜217）。

モノクローナル抗体のEIAおよびウエスタンブロット特
異性米国特許出願第07/572,822号（発明の名称：組換えタ
ンパク質を利用したＣ型肝炎アッセイ）（共通の出願人
のものであり、参照のため本明細書中に引用する）に開
示されているように、利用できる組換えHCV抗原の分類
に基づいて本明細書に記載するすべてのモノクローナル
抗体をスクリーニングした。手順は上記に示した通りで
あった。複数抗原スクリーニング法によりHCV特異性が
確認され、該モノクローナル抗体のHCV非特異的なCKS、
λPLまたはリンカーアーム反応性を排除した。

EIAエピトープ競合研究特異性および抗原結合識別を調べるため、ビオチン標
識モノクローナル抗体および非標識モノクローナル抗体
を用いてエピトープグループ化実験を行った（ランゴン
＆バン・バナキス、メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー、92:242〜253、アカデミックプレス［1983］）。簡
単に説明すると、製造業者の教示に従って抗体をNHS−L
C−ビオチン（ピアス・ケミカル（Pierce Chemical C
o.）、ロックフォード、イリノイ州）で標識した。マイ
クロタイターウエルを上記のようにして免疫原でコーテ
ィングした。まず、非標識抗体のlog₂希釈液をウエル中
で15分間プレインキュベートし、ついで所定量のビオチ
ン化抗体（最大吸光度値の50％の値を与える、ビオチン
化抗体単独の直接EIA中の希釈液）を加え、20分間イン
キュベートした。プレートを３回水洗した。希釈したス
トレプトアビジン−HRPO（ザイムド（Zymed）、サウス
サンフランシスコ、カリフォルニア州）をウエルに加
え、30分間インキュベートした。プレートを再び洗浄
し、OPDを上記と同様にして発色させた。吸光度を492nm
で読み取った。同じまたは関係するエピトープの抗体
は、シグナルがブロックされるかまたは＞50％抑制され
た。特異性の区別される抗体では抑制は観察されなかっ
た。このことは、ENV領域で産生された抗体について相
互に行った。

ペプチド抑制アッセイ HCVアミノ酸配列385〜436および405〜436についてす
でに記載したのと同様にして合成ペプチドを合成した。
これらペプチドを、非標識抗体の代わりにこれらペプチ
ドの系列希釈を用いることにより、すでに記載した手順
に従って競合アッセイに用いた。50μｌの標識抗体（50
％最大吸光度値）をこれらペプチドとともに別の96−ウ
エル組織培養皿中で15分間プレインキュベートした。つ
いで、ペプチドと標識モノクローナル抗体との混合物
（50μｌ）を、前以てブロッキングした抗原コーティン
グEIAプレートに加え、20分間インキュベートした。生
成した免疫複合体を検出するためにストレプトアビジン
−HRPOヤギ抗マウス結合体（ザイムド）を用いた。

RIA相互競合適当な抗原またはペプチドをコーティングしたビーズ
を、１〜20μg/mlのモノクローナル抗体濃度で再石灰化
（recalcified）陰性ヒト血漿（NHP、抗HCV、抗HIVおよ
びHBsAgに対して陰性と試験されたもの）中に希釈した
非標識モノクローナル抗体（100μｌ）とともにインキ
ュベートした。HTLV Iキット試料希釈液（界面活性剤、
動物血清、緩衝液を含有、アボット・ラボラトリーズ、
アボットパーク、イリノイ州より入手可能）中に希釈し
た１〜４μCi/mlの放射性標識抗体（100μｌ）を上記ビ
ーズとともに45℃にて２時間または20〜25℃にて18〜20
時間インキュベートした。ビーズを洗浄し、放射能をカ
ウントした。

HCV抗原アッセイ抗HCVモノクローナル抗体の一つまたはカクテルをコ
ーティングしたビーズを試料（200μｌ）とともに40〜4
5℃にて２時間または20〜25℃にて18〜20時間インキュ
ベートした。ビーズを蒸留水で洗浄し、ついで放射性標
識抗HCVモノクローナル抗体（１または２以上）（200μ
ｌ）とともに45℃にて２時間インキュベートした。ビー
ズを洗浄し、ガンマカウンターでカクントした。

モノクローナル抗体の特徴付け HCV ENVドメイン（380〜436）AND（405〜436）に対す
るモノクローナル抗体を表１および２に特徴付けてあ
る。図２〜13を参照すると、下記表１中にまとめた反応
性はレーン７および８に示されている。レーン１〜３は
HCV 33Cタンパク質に対するモノクローナル抗体を含む
（レーン１には６−296−534、レーン２には６−914−5
18、およびレーン３には６−1070−110）；レーン４〜
６はHCVコアに対するモノクローナル抗体を含む（レー
ン４には13−975−157、レーン５には14−153−234、お
よびレーン６には14−1350−210）；レーン７および８
は推定HCV ENV領域に対するモノクローナル抗体を含む
（レーン７には16−407−209、およびレーン８には16−
803−174）；レーン９〜11はHCV C−100に対するモノク
ローナル抗体を含む（レーン９には25−1518−105、レ
ーン10には28−735−355;レーン11にはCKSコントロール
モノクローナル抗体29−121−236）；レーン12は正常マ
ウス血清コントロールを含む；およびレーン13は陰性コ
ントロールを含む。

下記実施例は、これらモノクローナル抗体の臨床的有
用性のための方法を記載することにより、HCVの血清診
断のためのこの発明の利点および有用性を示す。これら
実施例は説明するためのものであり、本発明の趣旨およ
び範囲を制限することを意図するものではない。

実施例実施例１抗HCV ENV競合アッセイアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の上昇し
た血液銀行ドナーからの10の試料を、抗HCV ENVの検出
のために「RIA相互競合」について本明細書に記載した
競合１工程アッセイにおいて試験した。そのデータを表
３に示す。表３を参照すると、このアッセイにおいて＞
25％抑制を反応性であると考えるとすると、ALTの上昇
した10のヒト試験試料のうち一つが抗HCV ENVに対して
反応性であった。

実施例２ HCV ENV抗原アッセイ本明細書に「HCV抗原アッセイ」として記載したHCV抗
原アッセイを用いて抗原アッセイを行った。２工程ENV
抗原アッセイの結果を表４に示す。380〜436ENV合成ペ
プチドの検出のための最も感度の高いアッセイは、モノ
クローナル抗体16−407−209をコーティングしたビーズ
および16−803−174標識であった。合成ペプチドに対す
る感度は10μg/ml未満であった。

実施例３モノクローナル抗体のカクテルを用いたHCV抗体試験本明細書に「HCV抗原アッセイ」として記載したHCV抗
原アッセイを用いて抗原アッセイを行った。このアッセ
イの他の態様ではビーズ上のモノクローナル抗体のカク
テル（16−407、16−803および16−1291）およびカクテ
ル標識（16−407および16−803）を使用した。州際血液
銀行から得た36の試料のうちの一つの試料（13番と称す
る）がこのアッセイにおいて有意の反応性を示すことが
わかった。

それゆえ、本発明の新規モノクローナル抗体は種々の
仕方で用いることができる。これらモノクローナル抗体
は、増幅生成物の免疫沈降およびウイルスまたはHCV RN
Aに関連するタンパク質を捕捉するために用いる抗HCVモ
ノクローナル抗体をコーティングしたHCV核酸ミクロ粒
子または担体を検出するのに用いることができる。そこ
で、RNAの検出法を用いることができる。このタイプの
アッセイの例は継続中の米国特許出願第07/568,663号
（発明の名称：標的核酸配列の増幅および検出法、共通
する出願人のものであり、参照のための本明細書中に引
用する）に教示されている。これらモノクローナル抗体
はまた、直接標識した（蛍光、コロイド金など）HCVモ
ノクローナル抗体を用い、または第二の標識抗マウス抗
体を用い、細胞内にHCV抗原を局在化するのに用いるこ
ともできる。疾患の組織病理を追跡することができる。
さらに、サンドイッチ形態での個々のモノクローナル抗
体または固相上または検出系中でのモノクローナル抗体
のカクテルを用い、血清、組織、細胞、培地、または体
液中の天然または組換えHCV抗原を検出することができ
る。

非重複エピトープに対するモノクローナル抗体を用い
た１工程抗原アッセイを行うこともできる。幾つかのモ
ノクローナル抗体は、感染個体によっては認識されない
抗原エピトープを認識することができ、それゆえ遊離お
よびヒト抗体に結合した両方の血清Agを認識することが
できる。さらに、試料を界面活性剤または還元剤または
その両方で処理することにより、「隠れた」抗原または
抗原決定基を暴露することができる。たとえば、コア抗
原はウイルスエンベロープで覆われたカプシド形態中に
存在する。界面活性剤でエンベロープを剥ぎ取ることに
よりコア抗原が暴露される。モノクローナル抗体はま
た、アッセイに一層高い感度を与え、一層短いインキュ
ベーション時間を可能とする点で高力価のポリクローナ
ル抗体に比べて実際的な利点をも提供する。

さらに、限られた数の抗原部位に対して抗HCVが標識
抗HCVモノクローナル抗体と競合する、抗体イムノアッ
セイ、１または２工程競合アッセイを開発した。HCV Ag
サンドイッチアッセイにおいてHCV Ag結合をブロックま
たは抑制する溶液中のHCV Agにヒト抗HCVが結合する、
一層高感度の競合アッセイを開発することができる。モ
ノクローナル抗体を用いた競合アッセイによりヒト抗体
エピトープの一層正確なマッピングが可能となり、ウイ
ルス中和抗体エピトープの決定に有用である。幾つかの
モノクローナル抗体はウイルス中和活性を有する。最後
に、モノクローナル抗体は、天然ウイルスおよび組換え
HCVの抗原およびタンパク質のイムノアフィニティー精
製に有用である。

本発明のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドー
マ細胞株は、ハイブリドーマ細胞株16−407−209（モノ
クローナル抗体16−407−209を分泌する）およびハイブ
リドーマ細胞株16−803−174（モノクローナル抗体16−
803−174を分泌する）として同定される。これらハイブ
リドーマ細胞株はブダペスト条約下、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション、12301パークローンド
ライブ、ロックビル、メリーランド州20852に1990年11
月16日に寄託してあり、以下の受託番号を付与された：
ハイブリドーマ細胞株16−407−209はA.T.C.C.受託番号
HB10601を付与され、ハイブリドーマ細胞株16−803−17
4はA.T.C.C.受託番号HB10605を付与された。

本明細書に開示した独特のモノクローナル抗体の使用
の応用の他の態様としては、免疫複合体中のHCV抗原の
検出、または潜伏したおよび／または隠れている抗原の
検出、および／またはPCR、LCRによりまたは直接ハイブ
リダイゼーションにより核酸を検出するためのウイルス
核酸と関連したHCV抗原の検出が挙げられる。本明細書
に開示した本発明の特定の態様のさらに他の変更および
修飾は、当業者には明らかであろう。従って、本発明は
添付の請求の範囲に従ってのみ限定されることを意図す
るものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） (72)発明者タイナー、ジョーン・ディーアメリカ合衆国60087−2208イリノイ州ビーチ・パーク、ノース・オーチャード・ロード37835番 (72)発明者ミムズ、ラリー・ティーアメリカ合衆国60046イリノイ州レイク・ビラ、ショショーニ・トレイル８番 (72)発明者ヴァラリ、デイビッド・エスアメリカ合衆国60030イリノイ州グレイスレイク、アシュレイ・ドライブ32941 番 (56)参考文献国際公開90／011089（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】HCVエンベロープ領域に特異的に結合し、
ハイブリドーマ細胞株A.T.C.C.受託番号HB10601によっ
て分泌されるモノクローナル抗体の結合特異性を有する
モノクローナル抗体。
【請求項２】HCVエンベロープ領域に特異的に結合し、
ハイブリドーマ細胞株A.T.C.C.受託番号HB10605によっ
て分泌されるモノクローナル抗体の結合特異性を有する
モノクローナル抗体。
【請求項３】ハイブリドーマ細胞株A.T.C.C.受託番号HB
10601により分泌されるモノクローナル抗体。
【請求項４】ハイブリドーマ細胞株A.T.C.C.受託番号HB
10605により分泌されるモノクローナル抗体。
【請求項５】HCVエンベロープ領域に特異的に結合する
モノクローナル抗体を分泌し、ハイブリドーマ細胞株A.
T.C.C.受託番号HB10601の同定特性をすべて有するハイ
ブリドーマ細胞株。
【請求項６】HCVエンベロープ領域に特異的に結合する
モノクローナル抗体を分泌し、ハイブリドーマ細胞株A.
T.C.C.受託番号HB10605の同定特性をすべて有するハイ
ブリドーマ細胞株。
【請求項７】ハイブリドーマ細胞株A.T.C.C.受託番号HB
10601。
【請求項８】ハイブリドーマ細胞株A.T.C.C.受託番号HB
10605。
【請求項９】HCVを含有しているかもしれない試験試料
中のHCVの存在を決定するサンドイッチアッセイ法であ
って、 a.該試験試料を、少なくとも、HCVエンベロープ領域に
特異的に結合する、固相に結合した抗HCVエンベロープ
領域抗体と接触させて混合物を生成させ、その際、該抗
体はハイブリドーマ細胞株A.T.C.C.受託番号HB10601ま
たはA.T.C.C.受託番号HB10605によって分泌されるモノ
クローナル抗体の結合特異性を有するモノクローナル抗
体であり； b.該混合物を抗原／抗体複合体を生成するに充分な時間
および条件下でインキュベートし； c.該複合体を、抗HCVエンベロープ領域抗体に結合した
測定可能な検出可能なシグナルを生成し得るシグナル生
成化合物からなる指示試薬と接触させて第二の混合物を
生成させ、その際、該抗体はハイブリドーマ細胞株A.T.
C.C.受託番号HB10601またはA.T.C.C.受託番号HB10605に
よって分泌されるモノクローナル抗体の結合特異性を有
するモノクローナル抗体であり； d.該第二の混合物を抗体／抗原／抗体複合体を生成する
に充分な時間および条件下でインキュベートし；ついで e.生成した測定可能なシグナルを検出することにより試
験試料中のHCVの存在を決定することを特徴とする方法。
【請求項１０】該試験試料中に存在するHCVの量が該測
定可能なシグナルに正比例する請求項９に記載の方法。
【請求項１１】該シグナル生成化合物が、発光化合物、
化学ルミネッセンス化合物、酵素および放射性元素より
なる群から選ばれたものである請求項10に記載の方法。
【請求項１２】該酵素が、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼおよびベータ−ガラクトシ
ダーゼよりなる群から選ばれたものである請求項11に記
載の方法。
【請求項１３】該酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼで
ある請求項12に記載の方法。
【請求項１４】試験試料中に存在するかもしれないHCV
の存在または量を決定するサンドイッチアッセイ法であ
って、 a.試験試料を、固相に結合したモノクローナル抗HCVエ
ンベロープ領域抗体、および測定可能な検出し得るシグ
ナルを生成し得るシグナル生成化合物に結合したHCVエ
ンベロープ領域に特異的に結合するモノクローナル抗体
からなる指示試薬と接触させて混合物を生成し、その
際、該モノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞株A.T.
C.C.受託番号HB10601またはA.T.C.C.受託番号HB10605に
よって分泌されるモノクローナル抗体の結合特異性を有
するモノクローナル抗体であり； b.該混合物を抗体／抗原／抗体複合体を生成するのに充
分な時間および条件下でインキュベートし；ついで c.該試験試料中のHCVの存在の指標として該測定可能な
シグナルを検出することによって該試験試料中のHCVの
存在を決定することを特徴とする方法。
【請求項１５】該試験試料中に存在するHCVの量が生成
した該測定可能なシグナルに正比例する請求項14に記載
の方法。
【請求項１６】試験試料中に存在するかもしれないHCV
抗体の存在および量を決定するための競合アッセイ法で
あって、 a.HCV抗体を含有すると思われる試験試料を、HCVエンベ
ロープタンパク質をコーティングした固相、およびシグ
ナル生成化合物とHCVエンベロープタンパク質に特異的
に結合するモノクローナル抗体とからなる指示試薬と、
試験試料と固相との、および／または指示試薬と固相と
の抗原／抗体複合体を生成するのに充分な時間および条
件下で接触させ、その際、該モノクローナル抗体はハイ
ブリドーマ細胞株A.T.C.C.受託番号HB10601またはA.T.
C.C.受託番号HB10605によって分泌されるモノクローナ
ル抗体の結合特異性を有するものであり； b.陰性試験試料から生成したシグナルに比べて指示試薬
の固相への結合における減少を検出して該試験試料中の
HCV抗体の存在を示すことにより、該試験試料中のHCV抗
体の存在を決定することを特徴とする方法。
【請求項１７】該シグナル生成化合物が、発光化合物、
化学ルミネッセンス化合物、酵素および放射性元素より
なる群から選ばれたものである請求項16に記載の方法。
【請求項１８】該酵素が、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ、アルカリホスファターゼおよびベータ−ガラクトシ
ダーゼよりなる群から選ばれたものである請求項17に記
載の方法。
【請求項１９】該酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼで
ある請求項18に記載の方法。
【請求項２０】HCVエンベロープ領域に特異的に結合す
る少なくとも一つのモノクローナル抗体を入れた容器を
含み、該モノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞株A.
T.C.C.受託番号HB10601またはA.T.C.C.受託番号HB10605
によって分泌されるモノクローナル抗体の結合特異性を
有するものであることを特徴とする、試験試料中のHCV
の存在を決定するためのアッセイキット。