KR20000064637A - 비(b)형 간염의 감염 결과를 예측하는 방법 - Google Patents

비(b)형 간염의 감염 결과를 예측하는 방법 Download PDF

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빌헬미나 페트로넬라 파우리즈
루스마렌 마르쿠스 헨드리쿠스 반
루돌프 아놀드 헤이즈틴크
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에프.지.엠. 헤르만스
악조 노벨 엔.브이.
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Abstract

본 발명은 B형 간염 감염의 진전의 예후에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 또한 알파-인터페론같은 항바이러스 화합물을 이용한 항바이러스 치료를 모니터하기 위해 이용될 수도 있다. 본 발명은 HBeAg와 복합체를 형성할 수 있는 특이적 생체분자의 존재가 급성 B형 간염 감염의 진전에 대한 예후 표식이라는 발견에 기초한다. 감염의 급성 단계동안 상기 특이적 생체분자 또는 상기 생체분자와 HBeAg의 복합체의 유무에 기초하여, 환자가 회복되고 급성 감염후 바이러스를 제거할 것인 지 또는 만성 감염으로 진전될 것인지를 예측할 수 있다. 그래서 본 발명은 급성 HBV 감염 환자에서 감염 과정을 예측하는 방법에서 HBeAg에 결합된 특이적 생체분자를 포함하는 순환 복합체의 검출을 위한 분석의 이용에 관련된다. 본 발명은 항바이러스 제제를 이용한 치료를 모니터하고 그러한 치료의 효과를 나타내기 위해 이용될 수 있는, B형 간염 감염의 진전의 예후를 위한 새로운 방법을 제공한다.

Description

비(Ｂ)형 간염의 감염 결과를 예측하는 방법
B형 간염 바이러스(HBV)는 인체에서 급성 및 만성 감염을 일으킨다. 그러한 감염은 증상이 없을수도 있고, 최소의 또는 심각한 급성 간염을 일으킬 수도 있고, 간경변과 초기 간암으로 이끄는 만성 감염으로 발전할 수도 있다.
B형 간염 바이러스(HBV)는 지질로 된 엔벨로프(envelope) 및 바이러스 게놈과 DNA 폴리머라제를 함유한 내부 코어(core)로 이루어진 작은 DNA 바이러스이다. HBV 코어 유전자(뉴클레오티드 1814-2449)는 각각 29코돈과 183코돈으로 이루어진, 프리-코어(pre-core) 및 코어 영역으로 나누어진다. HBV 코어 유전자는 기능이 상이한 두 개의 단백질을 암호하는 바, 감염된 세포의 세포질에서 조립되어 뉴클레오캡시드 입자(HBcAg)를 형성하는 21.5kDa 단백질 및 소포체로 가서 N-말단과 C-말단의 프로세싱(processing)을 거쳐 e-항원(HBeAg)으로 분비되는 프리-코어 단백질이 그들이다.
HBeAg는 1972년에 처음 동정되었다. 이것은 HBV 감염 환자의 혈청에 비입자 상태로 존재한다. HBeAg의 존재는 일반적으로, 감염된 숙주에서 바이러스의 복제가 일어나고 있음을 나타내는 것으로 생각된다. 여러 실험들의 결과는 HBeAg가 항원들의 복합체일 수도 있음을 나타내며, 환자 혈청에서의 아가젤(agar gel) 확산에 의해, e1, e2, e3로 표시되는 최대 세 개의 침강 항체 선이 검출되었다. 약 300kDa의 분자 크기를 갖는, IgG-결합된 HBeAg와 약 16kDa의 분자량을 갖는 더 작은 HBeAg가 HBV-감염된 환자의 혈청에서 검출되었다. HBcAg는 변성 및/또는 제한된 단백질분해시 HBeAg로 전환될 수 있다는 사실에 기초할 때 HBeAg와 관련이 있다. HBcAg와 HBeAg사이의 면역학적 구별은 둘 중 어느 한 항원에 특이적인 단일클론 항체의 도입으로 가능해졌다. HBcAg는 하나의 주된 불연속 에피토프를 가지는 것으로 제안되었으나 선형 HBcAg 결정인자와 내부 결정인자의 존재 또한 제안되었다.
상이한 쥐 단일클론 항체를 이용하여, HBeAg상의 두 개의 다른 B-세포 에피토프를 검출했다. HBe/알파, 즉 HBe1은 선형 결정인자이며 아미노산 서열 (76)L-E-D-P-A-S-R-D-L-V-V-S-Y(89)에 존재한다. HBe1 결정인자는 입체 구조 HBc 결정인자와 겹치며 또한 HBe 입체 구조에서 코어 입자 표면상에 노출되는 것으로 보인다(Salfeld et al., J.Virol., 63, 798-808, 1989).
HBe/베타, 즉 HBe2는 불연속 결정인자이며, 정확한 입체구조를 위해 아미노산 138주위에서 끝나는 아미노산 서열 및 아미노말단 아미노산 서열의 직,간접적 분자내 참여를 요구한다. HBe2 결정인자는 코어 입자 표면상에 존재하지 않거나 접근할 수 없다(Salfeld et al., 1989). Sallberg et al.(Mol.Immunol., 28, 719-726, 1991)에 의하면, 쥐의 단일클론 항체와 사람 혈청은 HBe2 에피토프를 아미노산 130주위에 존재하는 선형 결정인자로 인지할 수도 있다. 두 개의 항-HBe2 단일클론 항체가 잔기 128-133의 아미노산 서열 T-P-P-A-Y-R을 인지하는 것으로 밝혀졌다. 치환 합성에 의해, 두 단일클론 항체에 의한 인지를 위해서는 PP가 필수적인 것으로 나타났다. 선형 HBe2 에피토프를 함유하는 펩티드를 단일 피크로 인지한 단일클론 항체는 항-HBe RIA에서 가장 효율적인 억제 활성을 갖는 것들이었다. HBe2 에피토프 함유 펩티드에 대한 반응성은 항-HBe RIA에서 강한 억제(95%)를 나타낸 환자 혈청에서 주로 발견되었다.
HBeAg의 기능은 명확하지 않으나 감염동안 세포독성 T-세포를 차단하여 바이러스 감염된 간세포를 보호할 수도 있다. 1990년에 Milich et al.(Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 87, 6599-6603)은 HBeAg가 자궁내의 면역학적 내성을 야기할 수도 있음을 제안했다. HBeAg의 발현은 분만기 감염후 존속을 보장하기 위한 바이러스의 전략을 나타낼 수도 있다.
환자가 항-HBe로의 혈청변환에 근접할 때 그들은 감염으로부터 회복하고 항바이러스 치료에 반응하기가 더 쉽다.
감염 과정을 결정하는 기작과 인자들에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 만성 HBV 감염된 환자의 치료는 대개 인터페론 치료에 관련된다. 하지만, 단지 한정된 수의 환자만이 인터페론 치료에 의해 바이러스가 완전히 제거된다. 감염이 자기한정성일지 만성일지, 그리고 어느 환자가 인터페론 치료에 반응할지를 예측하는 것은 어렵다. 그래서 신뢰할만한 B형 간염 예후 방법이 필요하다. 만일 그러한 방법이 있으면, 환자가 항-바이러스 제제로 치료되어야 할지가 결정될 수 있으며, 그러한 치료의 효과가 예측되거나 모니터될 수 있다.
본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염의 과정을 예측하고 모니터하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 그러한 방법에 이용될 수 있는 항체와 아미노산 서열에 관한 것이다.
도1:
A)Abbott HBeAg EIA. 진료 시설에서 우연히 HBV로 감염된 공여자로부터의 여덟 개의 혈청(번호 162, 216, 255, 336, 181, 343, 098, 228)의 반응성. 시료는 감염의 급성 단계동안 취해졌다. 모든 시료는 시험 결과 HBeAg 양성이었다. 만성 감염이 된 환자에서 얻은 혈청은 감염후 6개월(회복) 또는 9개월(늦은 회복)사이에 회복한 환자에서 얻은 혈청과 구별되지 않았다.
B)HBeMAB 분석. 도1A에서 언급된 혈청의 반응성. 모든 시료는 시험 결과 HBeAg양성이었다. 만성 감염이 된 환자로부터 얻은 혈청은 감염후 6개월(회복) 또는 9개월(늦은 회복)사이에 회복한 환자에서 얻은 혈청과 구별되지 않았다.
C)HBe 선별 분석. 도1A와 B에서 언급된 혈청의 반응성. 감염후 6개월내에 바이러스를 제거한 환자로부터의 혈청(음성=A450nm<0.2 또는 S/CO<0.9)은 만성 감염이 된 환자 또는 늦은 회복을 보여주는 환자로부터 얻은 혈청(양성=A450nm>0.3 또는 S/C0>2.3)과 구별될 수 있었다.
도2:
A)Abbott HBeAg EIA와 HBe 선별 분석에서 시험된, HBV 감염된 공여자로부터 얻은 혈청. 정상 인체 혈청(NHS)을 음성 대조군으로 사용했다. 양성 대조군(PS)은 감염의 급성 단계동안 환자에서 얻어졌다. 이 혈청 시료는 두 분석 모두에서 양성이었다. 혈청 343b는 감염 후 4년된 HBV 감염 공여자로부터 얻었다. 혈청 162a는 6개월내에 바이러스를 제거한 공여자로부터 감염의 급성 단계동안 얻었다. 혈청 162b는 초기 감염 후 10개월째에 바이러스 제거후 혈청 162a와 동일한 공여자로부터 얻었다.
B) 정상 인체 혈청(NHS), 혈청 343b, 162a 및 162b와 배양한 후 도2A에서 언급된 양성 대조군(PS)의 반응성. NHS를 제외한 나머지 상기 혈청중의 하나를 첨가한 후 원래의 신호는 감소한다.
도3. HBe MAB 분석과 HBe 선별 분석을 이용한, HBe-S 타입과 HBe-N 타입의 결정. 흡광도 1000에 연관된 임의의 단위(1 임의 단위=희석도의 역수 값)의 총량을 두 분석 모두에서 각 혈청에 대해 결정했다(AU1000). HBe MAB 분석에서 결정된 AU1000을 HBe 선별 분석에서 결정된 AU1000으로 나눈다(y-ax). 0.03 이하의 비율은 HBe-S 타입을 나타낸다. 0.13 이상의 비율은 HBe-N 타입을 나타낸다. S와 N 타입은 완전한 HBeAg DNA서열의 결정으로 확인했다.
본 발명은 B형 간염 감염의 진전의 예후에 관련된다. 본 발명의 방법은 또한 예를 들어 알파-인터페론과 같은 항바이러스 화합물을 이용한 항바이러스 치료를 모니터하기 위해 이용될 수도 있다.
B형 간염의 예후에 관련된 일부 방법들이 이미 개시되었다.
WO91/1478에는, B형 간염 감염의 결과를 예측하는 것을 돕기 위해 프리-코어 돌연변이 유무에 대해 환자 시료를 시험하는 방법이 개시되어 있다. 하지만, 다른 연구들(Guenther et al. Virology 187(1), 271-279, 1992)은 프리-C 영역에서의 돌연변이의 유무가 바이러스 제거와 무관함을 보여주었다. 항-HBS IgG와 IgM의 비율(IgG/IgM)이 만성 B형 간염의 진전을 예측하기 위해 이용되는 B형 간염 감염의 예후 방법이 SU1751680에 개시되어 있다. 많은 연구자들은 급성과 만성 B형 간염 감염사이의 구별에 초점을 맞추었다. 급성과 만성 HBV 감염사이의 구별은 예후와 가능한 치료 양식의 관점에서 중요하다. HBV X항원에 대한 항체는 만성 HBV감염에서 주로 생성되는 것으로 보고되었다(Moriaty et al., Science, 227, 429-433, 1985).
또한, 만성 감염과 비교할 때 일반적으로 더 고농도의 IgM 항-HBc가 급성 단계동안 생성됨이 개시되었으며, 이러한 양적인 차이는 만성 감염의 급성 상승과 급성 HBV 감염을 구별하는 유일한 혈청학적 수단이 되었다(Gerlich et al., J.Clin.Microbiol., 2, 228-293, 1986). 부가적으로, 분자량에 의해 IgM 항-HBe를 분리하는 것이 급성 HBV와 만성 B형 간염 감염을 구별하는 데 유용함이 알려졌다(Tsuda et al., Gastroenterology, 87, 159-164, 1984). 급성 HBV 감염과 만성 HBV 감염의 구별에서 IgM 항-HBc 분석의 유용성 또한 연구되었다. 하지만 모든 이러한 방법들은 감염과정을 예측할 가능성을 제공하지 못한다.
감염의 만성 단계동안, 순환하는 HBeAg 면역 복합체의 존재를 조사한 Maruyama et al.의 경우도 그러하다. Maruyama et al.(J. Immunol.Meth., 155, 65-75, 1992)은 만성 HBV 감염 환자의 혈청에서 순환하는 면역 복합체를 검출하는 분석법을 개발했다. 이 분석법은 HBe73-87:GVNLEDPASRDLVVSC로 표시되는 아미노산73-87(프리코어 서열 제외)을 포함하는, HBeAg/ayw 유래된 펩티드에 대해 생성된 항체로 피복된 고체 상으로 이루어진다. Maruyama et al.에 의하면, 상기 항-펩티드 항체는 천연 HBeAg에 대해 생성된 항체와 경쟁하지 않는다. 항체 경쟁 실험은 양 방향으로 실시되었으며 동일한 결과를 낳았다. 그래서 경쟁의 부재는 항-펩티드 항체와 천연 단백질에 대해 생성된 항체 사이의 항체 결합성의 차이에 의해 야기되지 않는 것으로 결론내려졌다. Maruyama et al.에 의하면, 선별된 항-펩티드 항체는 천연 단백질에 대해 생성된 항체에 의한 동시 결합을 크게 방해하지 않는 특정 부위에 결합한다. 면역복합체의 검출을 위한 분석법은 또한 WO94/08597에 개시된다. 동일한 저자에 의한 추가의 논문(Maruyama et al., Gastroenterology, 105, 1141-1151, 1993)에서 이러한 분석법의 최적화가 개시된다; 항-펩티드 항체는 혈청 항-HBe 항체에 동시에 결합되는 천연 HBeAg에 효과적으로 결합하는 단일클론 항체로 치환되었다. 이 분석법은 만성 HBV 감염 환자에서 잠재 면역 반응을 검출하는 데 이용되었다. 1994년에 Maruyama et al.(Gastroenterology, 106, 1006-1015, 1994)은 완전히 병이 회복된 급성 HBV 환자와 1년 이상 계속 HBeAg 및 HBsAg에 대해 양성인 만성 HBV환자를 포함하는 연구를 발표했다. 추정되는 항-HBe 항체, HBeAg/항-HBe 복합체 및 HBsAg/항-HBs 복합체의 혈청 농도는 급성 HBV 환자와 비교하여 만성 HBV환자에서 증가됨이 관찰되었다.
면역복합체가 감염의 만성 단계동안 검출되는 전술한 발견들과는 대조적으로, 본 발명은 HBeAg와 복합체를 형성할 수 있는 특이적 생체분자의 존재가 급성 B형 간염 감염의 진전에 대한 예후 표식이라는 발견에 기초한다. 감염의 급성 단계동안 상기 특이적 생체분자 또는 상기 생체분자와 HBeAg의 복합체의 유무에 기초하여, 환자가 급성 감염 후 회복하고 바이러스를 제거할 것인지 또는 만성 감염으로 진전될 것인지를 예측할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그래서 본 발명은 급성 HBV 감염 환자에서 감염 과정을 예측하는 방법에서, HBeAg에 결합된 특이적 생체분자를 포함하는 순환 복합체의 검출을 위한 분석을 이용하는 것에 관련된다. 동일한 공급원에서 얻은 동일한 바이러스 균주로 감염되고, 시판되는 진단 시험(Abbott HBeAg EIA; Organon Teknika Hepanostika HBeAg/anti-HBe)에서 HBeAg양성인 일군의 환자들을 감염후 3개월째에 상기 생체분자의 존재를 시험했다. 이들 환자들의 감염 과정을 모니터한 결과, 감염의 급성 단계에서 상기 분자에 대해 양성인 환자들은 바이러스를 제거한 반면, 상기 분자에 대해 음성인 환자들은 늦은 혈청변환 또는 만성 감염을 진행했다.
이러한 발견에 기초하여 본 발명은 항바이러스 제제를 이용한 치료를 모니터하고 그러한 치료 효과를 나타내기 위해 이용될 수 있는, B형 간염 감염의 진전의 예후를 위한 신규의 방법을 제공한다.
본 발명의 방법으로 검출되는 생체분자(이 분자의 존재는 감염의 이후 과정에 대한 표식임)는 IgG 유형의 항체일 것이다. 상기 생체분자는 완전한 HBeAg 아미노산 서열의 아미노산 85-109(번호가 HBeAg 서열의 시작부분에서 시작됨)를 포함하는 영역에 위치한 HBeAg상의 에피토프를 차단할 수 있다. 차단한다는 것은, 생체분자가 HBeAg와 복합체를 형성했을 경우, 정상적으로는 상기 에피토프를 인지하는 일부 항체가 생체분자와 복합체로 존재하는 HBeAg에 결합하지 못하는 것을 의미한다.
본 발명에 의한 방법은 여러 가지 방식으로 수행될 수 있다.
생체분자의 유무는 여러 가지 방식으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 복합체(HBeAg에 결합된 생체분자)의 존재를 결정함으로써 결정될 수 있다. 분석은 생체분자가 상기 에피토프에 특이적인 항체의 결합에 대해 HBeAg상의 항체를 차단하는 능력에 기초할 수 있다. 상기 항체는 생체분자가 없는 경우에만 HBeAg에 결합할 수 있을 것이다. 생체분자가 HBeAg에 결합하는 경우 항체는 그들의 에피토프에 결합할 수 없을 것이다. 따라서, HBeAg가 상기 항체에 결합할 것인지를 검출함으로써 생체분자의 유무를 결정할 수 있다.
이용되는 항체는 단일클론 항체가 바람직하다. 본 발명 방법에 이용되는 항체는 HBeAg에 선택적으로 결합되는 생체분자의 친화도에 비하여 시료내에 존재하는 HBeAg에 대해 낮은 친화도를 갖는 항체가 바람직하다. HBeAg에 대한 낮은 친화도로 인해, 항체는 그들의 에피토프를 차단할 수 있는 생체분자가 없을 때만 HBeAg에 결합한다. 예를 들어, 항체는 고체 지지체상에 피복되어 이용될 수 있다. 고체 상에 형성된 면역 복합체는 예를 들어, 모든 형태의 HBeAg를 인지하는 다른 항-HBe 항체 또는 항-인체 항체를 이용하여 검출될 수도 있다. 이 두 번째 항체는 임의의 표지에 접합될 수도 있다.
그러한 분석에서 음성 반응은 HBeAg가 시료에 복합체로 존재하며 따라서 고체 상에 존재하는 항체에 결합할 수 없음을 나타낼 것이다. (물론, HBeAg를 검출하는 분석을 이용한 스크리닝 과정에 의해, 조사중인 시료에서 HBeAg의 존재가 확인된 경우는 모두 양성이다. 예를 들어, Abbott HBeAg EIA, Organon Teknika Hepanostika HBeAg/anti-HBe 또는 HBe MAB 분석(실시예2 참고) 또는 SDS-page 또는 면역블롯팅같은 다른 기법을 이용.) 분석에서 양성 반응은 시료가 HBeAg 양성이며 HBeAg 에피토프에 항체가 접근할 수 있음을 나타낼 것이다. 명백히, HBeAg는 비-복합체 형태로 존재하거나 또는 항체에 의해 인지되는 에피토프가 차단되지 않은 복합체로 존재한다.
HBeAg에 결합된 생체분자의 유무를 검출하기 위한 본 발명의 방법에 이용되는 항체는 HBeAg에 대해, ECACC에 기탁번호 95090611로 기탁된 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체와 동일한 반응성을 갖는 단일클론 항체가 바람직하다. ECACC에 기탁번호 95090611로 기탁된 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체(HB.OT95A)는 서열 RDLVVNYVNTN 부분에 위치한, HBeAg상의 에피토프를 인지한다. 이 에피토프는 Salfeld et al.(J.Virol., 63(2), 798-808, 1989)에 의해 HBe1로 정의된 서열과 겹친다. HBe1 서열과 비교할 때, HB.OT95A 항체의 항원인 재조합 HBeAg의 서열은 Salfeld et al.에 의해 개시된 HBe1 서열에서 87번 위치의 세린(S) 잔기가 아스파라긴(N)으로 치환되었다. (Salfeld et al.에 의해 붙여진 번호는 HBcAg서열의 시작 부분에서 시작한다. 문헌 전반에 걸쳐 다른 번호매김이 이용된다. 번호가 완전한 HBeAg 서열의 시작부분에서 시작할 경우, 10개의 부가의 아미노산이 N-말단에 존재할 것이며 (Salfeld에 의할때)87번 아미노산은 97번이 될 것이다. 완전한 HBeAg 서열의 시작 부분에서 시작하는 번호매김이 본원의 실시예와 청구항에서 이용되는 번호매김이다.) 본원 전반에 걸쳐, 97번에 세린(S)을 포함하는 HBeAg는 "S-타입"HBeAg로 칭하며 97번에 아스파라긴(N)을 갖는 HBeAg는 "N-타입"HBeAg로 칭할 것이다.
HB.OT95A 항체는 N-타입 HBeAg에 대해 생성되었기 때문에, 97번에 S-잔기를 갖는 HBeAg(S-타입 HBeAg)에 대한 그들의 친화도는 그 위치에 N잔기를 가진 HBeAg에 대한 그들의 친화도보다 낮을 것이다. 이것이, N-타입 HBeAg에 대해 생성된 항체가 생체분자 존재시 S-타입 HBeAg의 동일 영역에 결합할 수 없는 이유이다. 아마도, S-타입 HBeAg에 대한 그들의 낮은 친화도 때문에, N-타입에 대해 생성된 항체는 S-타입의 HBeAg에 결합된 생체분자와 경쟁할 수 없다.
같은 방식으로, 예를 들어 "S-타입"의 HBeAg에 대해서는 높고 "N-타입"에 대해서는 낮은 친화도를 갖는 다른 단일클론 항체가 생성될 수 있다.
어떤 환자가 HBeAg의 97번 위치에 N 또는 S 잔기중 어느 잔기를 포함하는 HBV로 감염되었는지 여부는 여러 방식으로 확인할 수 있다. 예를 들어, 시료에 존재하는 HBeAg의, 다른 "서브-타입"(S- 또는 N-타입 HBeAg)에 대한 다른 친화도를 갖는 항체와의 반응성을 비교할 수 있다. 더욱이 HB.OT95A같은 항체와 시료의 반응성과 HBeAg 검출을 위한 통상의 시판되는 분석에 존재하는 항-HBeAg 항체와 시료내의 HBeAg의 반응성의 비교 또한 어느 타입의 HBeAg가 시료에 존재하는지를 나타낸다. "S-타입" HBeAg와 "N-타입" HBeAg를 구별하는 방법 역시 본 발명의 일부이다. 이 방법은 (a)HBeAg에 대해, ECACC에 기탁번호 95090611로 기탁된 세포주로부터 생성된 단일클론 항체와 동일한 반응성을 갖는 항체로 피복된 고체 상을 HBeAg를 함유한 시료의 일부와 접촉시키고 고체 상에 형성된 면역 복합체를 검출하는 단계, (b)N-타입 HBeAg와 S-타입 HBeAg에 대해 동일한 반응성을 가진 항-HBeAg 항체로 피복된 고체 상과 시료 일부를 접촉시키고 고체 상에 형성된 면역 복합체를 검출하는 단계, 및 (c) 단계(a)와 단계(b)에서 얻어진 신호 사이의 비율로부터 시료에 존재하는 HBeAg가 N-타입인지, S-타입인지를 결정하는 단계를 포함한다. "S-타입" HBeAg를 함유한 혈청 시료는 단계(a)에서 "N-타입" HBeAg를 함유한 혈청 시료보다 낮은 신호를 생성할 것이다. 따라서, 단계 (a)와 (b)에서 얻어진 신호 사이의 비율은 "N-타입" HBeAg를 함유한 시료의 경우 더 높을 것이다. S- 및 N-타입 HBeAg에 대해 특징적인 비율의 정확한 값은 이용되는 분석 시스템의 형식에 의존할 것이다.
(물론 특정 바이러스의 HBeAg 유전자의 특정 부분의 핵산 서열 역시, 시료에 존재하는 HBeAg가 "N-타입"인지 "S-타입"인지를 확인하기 위해 결정될 수 있다.)
본 발명에 의해 감염의 과정의 표식인 생체분자의 존재를 나타내는 다른 방법은 하기를 포함한다: 생체분자는 생체분자가 결합하는 에피토프의 적어도 최소한의 서열을 모방하는 펩티드, 재조합 단백질 또는 기타 생체물질로 피복된 고체 지지체와 혈청을 접촉시켜 결정될 수 있다. 생체분자는 분리된 HBeAg 복합체, 항-HBe 양성 혈청 또는 HBV 감염된 환자에서 바이러스 제거후 얻어진 혈청으로부터 유도될 수도 있다. 고체 상에 피복된 펩티드와 혈청에 존재하는 생체분자 사이에 형성된 복합체는 진단 분석 분야의 당업자에게 공지된 다른 방법으로 가시화될 수 있다.
생체분자는 또한 억제 분석에 의하여 검출될 수 있다. 이 경우, 생체분자가 존재하지 않는 HBeAg 양성 혈청, 또는 재조합 HBeAg같은 다른 형태의 HBeAg가 양성 시료로 이용될 수 있다. 이 시료는 에피토프 차단 생체분자를 포함하는 미지의 시료로 선배양될 수 있다. 예를 들어 HB.OT95A같은 항체에 기초한 HBeAg 분석에서 신호의 억제는 시료에 차단 생체분자가 존재함을 나타낸다.
HBV 감염의 임상 결과에 관계될 수 있는 HBeAg와 복합체를 형성하는 생체분자는 예를 들어 친화도 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 이어서, 이 분자들은 HBeAg 분석에서 시약으로 이용될 수 있다. 이 분자들은 단지 복합체를 형성하지 않은 HBeAg와만 반응하며 따라서 또한 급성 HBV 감염 환자의 시료에서 복합체의 유무를 검출하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 방법에 이용될 수 있는 고체 지지체는 당업계에 공지되어 있으며, 마이크로테스트 웰 또는 큐벳의 내벽, 튜브 또는 모세관, 막, 필터, 시험 스트립또는 라텍스 입자같은 입자의 표면, 적혈구, 염료 졸, 금속 졸 또는 졸 입자같은 금속 화합물, BSA 또는 KLH같은 담체 단백질 등이 그 예이다.
이용될 수 있는 표지 물질은 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소, 염료졸, 금속 졸 또는 졸 입자같은 금속 화합물이 있다. 이용되는 분석 방법의 특성에 따라, 일어나는 면역화학 반응은 샌드위치 반응, 응집 반응, 경쟁 반응 또는 억제 반응이다.
본 발명의 방법에 이용될 수 있는 단일클론 항체 또한 본 발명의 일부이다. 본 발명에 따른 단일클론 항체는 HBeAg에 대해, ECACC에 기탁번호 95090611로 기탁된 세포주로부터 유래된 단일클론 항체와 동일한 반응성을 갖는 단일클론 항체이다.
본 발명의 단일클론 항체를 분비할 수 있는 무한증식 세포주 또한 본 발명의 일부이다.
단일클론 항체를 생성하는 세포주의 제조는 예를 들어, Kohler and Milstein 기법(Kohler and Milstein은 단일클론 항체-생성 하이브리도마를 형성하는 기법을 고안했다(G.Kohler and C.Milstein, 1975, Nature 256:495-497; 1976, Eur.J.Immunol. 6:511-519)), Epstain-Barr 바이러스를 이용한 형질전환, 또는 종양원성 DNA를 이용한 B-임파구의 직접 형질전환 기법, 또는 인체 또는 마우스-인체 하이브리드 골수종 세포주인 융합 파트너와 인체 B-임파구의 직접 융합, 또는 상기 골수종 세포주와 EBV-형질전환된 B 세포주의 직접 융합에 의해 일어날 수 있다.
본 발명의 세포주는 European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down(UK)에 기탁번호 95090611로 기탁된 세포주가 바람직하다. 이 하이브리도마 세포주는 이.콜라이로부터 얻은 재조합 HBeAg로 이전에 접종된 마우스에서 유래된 비장 임파구와 마우스 골수종 세포의 융합에 의해 생성되었다.
실시예 1
본 실시예는 본 발명의 항체가 어떻게 생성되며 상응하는 에피토프가 어떻게 지도화되는지를 보여준다.
쥐의 단일클론 항체 HB.OT95A
프로인트 완전 보조액중의, E.coli-유래 재조합 HBeAg 또는 HBcAg로 Balb/c마우스를 주사하여 쥐의 단일클론 항체를 생성시켰다. 2개월 후, 프로인트 불완전 보조액에 혼합된 항원으로 마우스를 추가 자극하고, 2주후에 이를 반복했다. 가장 잘 반응하는 마우스에 PBS에 용해된 재조합 항원을 정맥 투여했다. 3일 후 비장을 제거하여 비장 임파구를 표준방법에 따라 폴리에틸렌 글리콜1000을 사용하여 P3x63Ag8.6.5.3 마우스 골수종 세포와 융합시켰다. 인체 혈청 및/또는 재조합 항원을 이용하여 HBeAg 또는 HBcAg 특이적 항체의 생성에 대해 하이브리도마 세포를 검사했다. 반응이 나타난 클론을 단일 세포 클로닝 기법으로 100% 클론형성능까지 다시 클로닝하였다.
인체 단일클론 항체 HBe.OTHu03
만성 HBsAg 보유 인체로부터 말초 혈액을 취했다. 100ml 혈액 시료에 10.9ml 덱스트란(MW200000), 염화나트륨 용액(0.27g/ml) 0.37ml 및 헤파린 용액(510IU/ml) 1ml을 첨가했다. 혼합액을 상온에서 1시간동안 배양하여 적혈구를 침전시켰다. 백혈구를 함유한 상층을 분리하여 2000N/kg에서 10분동안 회전시켰다. 세포 침전물을 10% 디메틸설폭시드(DMSO)가 보충된 완전 배양 배지(Dulbecco's modified Eagles medium(DMEM) 10%태아 소 혈청)에 재현탁시키고, 동결시켜 액체 질소에서 저장했다. 형질전환을 위해 백혈구를 녹이고, 완전 배양 배지로 한 번 세척하고 2X106세포/ml까지 재현탁했다. 마모셋(Marmoset)B95.8 세포주에서 얻은, 엡스타인-바 바이러스(EBV) 함유 상층액을 첨가하고 현탁액을 24-웰 배양 디쉬(Costar)에 분배했다. 37℃에서 16-24시간 배양한 후, 5% CO2하에서 1X108개의 활성 임파구를 분리하여 배양 배지에서 1X104세포/ml로 희석하고, 공급 세포로서 인체 섬유아세포를 함유한 10개의 96-웰 크러스트 디쉬에 분배했다. 이어서 배양액을 4-6주동안 배양했다: 배지를 매주 두 번씩 갈았다. 현미경으로 관찰가능한 형질전환된 임파구 클론을 함유한 웰로부터, 상층액을 수거하여 천연 HBeAg에 대한 특이적 항체의 존재를 시험했다. 7일 후 양성 결과를 확인했다. 배양을 계속하여 액체 질소에서 동결시켰다.
아미드화된 펩티드의 합성과 정제
아미노산과 펩티드의 약자와 부호는 IUPAC-IUB joint Commision on Biochemical Nomenclature(JCBN), Eur.J.Biochem.(1984),138:9-37에서 정해진 IUPAC-IUB joint Commision on Biochemical Nomenclature의 추천에 따른다. 기타 약자는 다음과 같다: NMP, N-메틸-피롤리돈; Fmoc, N-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐; PS, 폴리스티렌.
Ono et al.에 의해 1983년에 발표된 HBeAg 서열에 기초해(adw) 완전한 유전자를 포함하는 25-머를 제작했다. 하기 펩티드가 만들어졌다:
1)......:H-SKLCL GWLWG MDIDP YKEFG ATVEL-NH2
2)......:H-LWGMD IDPYK EFGAT VELLS FLPSD-NH2
3)......:H-PYKEF GATVE LLSFL PSDFF PSVRD-NH2
4)......:H-TVELL SFLPS DFFPS VRDLL DTASA-NH2
5)......:H-LPSDF FPSVR DLLDT ASALY REALE-NH2
6)......:H-SVRDL LDTAS ALYRE ALESP EHCSP-NH2
7)......:H-TASAL YREAL ESPEH CSPHH TALRQ-NH2
8)......:H-EALES PEHCS PHHTA LRQAI LCWGE-NH2
9)......:H-HCSPH HTALR QAILC WGELM TLATW-NH2
10).....:H-ALRQA ILCWG ELMTL ATWVG NNLED-NH2
11).....:H-CWGEL MILAT WVGNN LEDPA SRDLV-NH2
12).....:H-LATWV GNNLE DPASR DLVVN YVNTN-NH2
13).....:H-NLEDP ASRDL VVNYV NTNMG LKIRQ-NH2
14).....:H-RDLVV NYVNT NMGLK IRQLL WFHIS-NH2
15).....:H-VNTNM GLKIR QLLWF HISCL TFGRE-NH2
16).....:H-KIRQL LWFHI SCLTF GRETV LEYLV-NH2
17).....:H-FHISC LTFGR ETVLE YLVSF GVWIR-NH2
18).....:H-FGRET VLEYL VSFGV WIRTP PAYRP-NH2
19).....:H-EYLVS FGVWI RTPPA YRPPN APILS-NH2
20).....:H-WIRTP PAYRP PNAPI LSTLP ETTVV-NH2
펩티드의 고체 상 합성을 반-자동화된 방식으로 수행했다. Fmoc 아미노산 유도체는 Bachem(Bubendorf, Switzerland)로부터 입수했다. 펩티드는 Fmoc/tBu 화학을 통해 TentaGel S RAM Fmoc 수지(RAPP Polymere, Tubingen, Germany)에서 합성했다. 링커는 Rink-아미드 타입으로 자동적으로 C-말단 아미드화된 펩티드를 생성한다. 고체상 펩티드 합성동안 아미노산 측쇄는 산에 불안정한 보호기로 보호했다:라이신의 입실론-아미노기는 Boc으로, 아르기닌의 델타-구아니디노기는 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐(Pmc)로, 글루탐산의 감마-카르복실기와 아스파탐산의 베타-카르복실기는 OtBu로, 글루타민의 감마-아미드기와 아스파라긴의 베타-아미드기는 트리틸(Trt)로, 히스티딘과 시스테인은 Trt로, 세린과 트레오닌의 베타-히드록시기는 tBu로, 그리고 티로신은 tBu로 보호했다. 모든 반응물은 NMP에 녹였다. 6분의 3회연속 사이클동안 NMP중의 25%(V/V)피페리딘으로 Fmoc기의 절단을 수행했다. 첫 번째 Fmoc아미노산 유도체(Fmoc-Aaa-OH, 2.5eq.)의 결합은 디이소프로필카르보디이미드(DIC, 2.5eq.)와 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt, 2.6eq.)를 이용한 인 시추(in situ) 활성화에 의해 수행했다. 아실화 반응은 브로모페놀블루에 의해 모니터했다(아실화 반응이 끝나는 시기는 노란색이 도는-그린 색으로 표시된다). 아실화 반응에 이어 NMP중의 무수 아세트산을 이용한 캡형성 단계를 수행했다. 질소하 상온에서 트리플루오로아세트산(87.5% V/V)중의 5%티오아니솔(V/V), 3%에탄디티올(V/V), 2.5%물(V/V) 및 2%아니솔(V/V)과의 2시간 반응동안, 완전히 보호된 펩티드를 수지로부터 절단했다. 정제되지 않은 펩티드를 디에틸에테르로 두 번 세척하고, 공기 건조시키고, 물/아세토니트릴(3:1)에 용해시키고 동결 건조시켰다.
HPLC분석과 정제(필요시)를 Beckman Gold HPLC 시스템에서 수행했다. HPLC분석은 아세토니트릴중의 0.1%트리플루오로아세트산으로 3분 등용매용리하고 이어서 물(100%)에서부터 75%인, 아세토니트릴중의 0.1%트리플루오로아세트산의 30분 선형 구배를 이용하여 1ml/min의 유속으로 RP-C2/C18 칼럼(Superpack prepS, 4X250 mm, Pharmacia)에서 수행했다. 206nm에서 UV측정에 의해 펩티드를 검출했다.
아미드화된 펩티드 OTP-145와 OTP-146의 합성과 정제
아미노산과 펩티드의 약자와 부호는 IUPAC-IUB joint Commision on Biochemical Nomenclature(JCBN), Eur.J.Biochem.(1984),138:9-37에서 정해진 IUPAC-IUB joint Commision on Biochemical Nomenclature의 추천에 따른다. 기타 약자는 다음과 같다: NMP, N-메틸피롤리돈; Fmoc, N-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐; PS, 폴리스티렌.
OTP-145의 서열:H-NLEDPASRDLVV N YVNTNMGLKIRG-NH2
OTP-146의 서열:H-NLEDPASRDLVV S YVNTNMGLKIRG-NH2
펩티드의 합성은 Perkin Elmer/Applied Biosystems Inc. 433A 펩티드 합성기에서 UV-모니터링과 피이드백 선택을 가지고 표준 FastMoc 0.25mmol과정을 이용하여 수행했다. Fmoc 아미노산 유도체를 Bachem(Bubendorf, Switzerland)에서 입수했다. 펩티드를 Fmoc/tBu 화학을 통해 TentaGel S RAM Fmoc 수지(RAPP Polymere, Tubingen, Germany)에서 합성했다. 링커는 Rink-아미드 타입이며 자동적으로 C-말단 아미드화된 펩티드를 생성한다. 고체상 펩티드 합성동안 아미노산 측쇄는 산에 불안정한 보호기로 보호했다:라이신의 입실론-아미노기는 Boc로, 아르기닌의 델타-구아니디노기는 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐(Pmc)로, 글루탐산의 감마-카르복실기와 아스파탐산의 베타-카르복실기는 OtBu로, 글루타민의 감마-아미드기와 아스파라긴의 베타-아미드기는 트리틸(Trt)로, 히스티딘과 시스테인은 Trt로, 세린과 트레오닌의 베타-히드록시기는 tBu로, 그리고 티로신은 tBu로 보호했다. 모든 반응물은 NMP에 녹였다. 1.5분의 2회 이상의 연속 사이클동안 NMP중의 25%(V/V)피페리딘으로 Fmoc기의 절단을 수행했다. 첫 번째 Fmoc 아미노산 유도체(Fmoc-Aaa-OH, 4eq.1mmol)의 결합은 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU), 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt, 4eq., 1mmol) 및 디이소프로필에틸아민(DIPEA)를 이용한 인 시추 활성화에 의해 수행했다. 각 아미노산 유도체의 결합후(적어도 20분) 아실화 반응의 완결은 확인하지 않았다. 아실화 반응에 이어 NMP중의 무수 아세트산을 이용한 캡형성 단계를 수행했다. 질소하 상온에서 트리플루오로아세트산(87.5% V/V)중의 5%티오아니솔(V/V), 3%에탄디티올(V/V), 2.5%물(V/V) 및 2%아니솔(V/V)과의 2시간 반응동안, 완전히 보호된 펩티드를 수지로부터 절단했다. 정제되지 않은 펩티드를 디에틸에테르로 두 번 세척하고, 공기 건조시키고, 물/아세토니트릴(3:1)에 용해시키고 동결 건조시켰다.
HPLC분석과 정제(필요시)를 Beckman Gold HPLC 시스템에서 수행했다. HPLC분석은 아세토니트릴중의 0.1%트리플루오로아세트산으로 3분 등용매용리하고 이어서 물(100%)에서부터 아세토니트릴중의 0.1%트리플루오로아세트산 75%까지의 30분 선형 구배를 이용하여 1ml/min의 유속으로 RP-C2/C18 칼럼(Superpack prepS, 4X250 mm, Pharmacia)에서 수행했다. 206nm에서 UV측정에 의해 펩티드를 검출했다.
HB.OT95A의 에피토프 지도화
펩티드를 DMSO(최소 농도 0.5mg/ml)에 용해시키고 최종 농도 5㎍/ml까지 0.05M Na2CO3(pH9.6)에 희석했다. 희석된 펩티드를 밤새 상온에서 마이크로타이터플레이트(96웰)에 피복했다. 0.2%카제인을 함유한 0.05M TRIS/HCl을 이용하여 30분동안 각 웰을 후-피복시켰다. MAB HB.OT95A를 pH7.4 PBS중의 20% 정상 염소 혈청과 1% 트리톤에 희석시켰다. 각각의 희석된 시료 100㎕를 각 웰에 첨가하여 1:500 내지 1:16,000사이의 희석 연속물을 시험했다. 37℃에서 1시간동안 배양한 후 4번의 광범위한 세척 단계후 토끼 항-마우스 접합체(DAKO P0260)로 시료를 치환했다. 접합체를 전술한 대로 1:1000으로 희석했다. 펩티드의 반응성을 가시화하기 위해 Organon Teknika UniForm의 바로 사용할 수 있게 준비된 TMB 기질을 이용했다. 20분후 1M H2SO4를 이용하여 반응을 종결시키고 450nm에서 흡광도를 측정했다.
결과는 HB.OT95A가 펩티드 12와 13에 대해 높은 친화도를 보여줌을 나타냈다(두 경우의 S/CO비율은 30임). 펩티드 14의 S/CO 비율은 16이었다. 그외 다른 펩티드는 1이하의 S/CO비율을 나타냈다. 이러한 결과로부터 HB.OT95A의 에피토프는 서열 LATWV GNNLE DPASR DLVVN VVNTN TNMGL KIRQR부분에 위치하는 것으로 결론내려졌다. 이 서열은 Salfeld et al.에 의해 개시된 HBe1 에피토프를 포함한다.
동일한 실험에서 펩티드 OTP-145, OTP-146과 펩티드 13을 동시에 시험했다. 펩티드 OTP-145(아미노말단 아미노산=글리신)와 펩티드 13(아미노 말단 아미노산=글루타민)은 HB.OT95A와의 반응성에서 차이를 보이지 않았다. 따라서 펩티드의 아미노말단 아미노산은 HB.OT95A와의 반응성에 필수적이지 않으며 Q 또는 G에 의해 치환될 수 있는 것으로 결론지어져야 한다. 반대로 펩티드 OTP-145와 OTP-146을 이용한 후에는 반응성에서 큰 차이를 보였다(HB.OT95A 농도 1:4000; OTP-145 S/CO 14; OTP-146 S/CO 5.5). 아미노산 97(S 또는 N)은 펩티드의 반응성에 상당히 영향을 주는 것으로 결론지었다. HB.OT95A는 97번 위치에 S를 갖는 펩티드 OTP-146에 대해서는 낮은 친화도를 보인다.
실시예2
본 실시예는 실시예1에서 기술된 대로 생성된 항체에 기초하여, "HBe 선별 분석"으로 칭해질 면역분석법이 어떻게 이루어지는 지를 보여준다. 두 번째 분석은 시료의 HBeAg 양성을 확인하기 위해 구성되었다(HBe MAB 분석법으로 칭함).
HBe 선별 분석
이 분석은 두 개의 단일클론 항체에 기초한다. MAB HBe.OTHu03-HRP(HRP=서양고추냉이 퍼옥시다제)를 1:8000 희석률의 접합체로 이용한다. HRP는 SPDP 접합 과정(Pharmacia)에 따라 IgG에 접합된다. 요약하면, HBe.OTHu03을 PD-10 크로마토그래피(Pharmacia)를 이용하여 탈염시켰다. 탈염된 MAB HBe.OTHu03에 0.040M SPDP(에탄올에 희석됨)를 첨가하여 MAB-PDP를 제조했다(MAB-IgG:SPDP 몰비=1:13). 30분후 혼합물을 전술한 대로 탈염시켰다. HRP에 0.040M SPDP를 첨가하고 탈염전에 30분동안 배양하여 HRP-PDP를 제조했다(SPDP:HRP 몰비=1.6:1). HRP-PDP, 1M HAC pH4.3 및 1.6M DTT를 25:2.5:1의 비율로 첨가하여 HRP-SH를 제조했다. 15분동안 배양한 후 혼합물을 전술한 대로 탈염했다. IgG-PDP와 HRP-SH를 13.4:1mol/mol의 비율로 혼합하고 상온에서 30분동안 배양하고 이어서 2-8℃에서 밤새 배양하여 결합시켰다. 필요할 때까지 -20℃에서 접합체를 저장했다.
쥐의 MAB HB.OT95A(선별자)를 고체상에 피복한다. 요약하면, HB.OT95A를 피복완충액(0.05M NaHCO3pH9.6)에 최종 농도 40㎍/ml로 희석한다. 혼합물을 상온에서 고체상(마이크로타이터 플레이트 그레이너 96-웰)과 함께 밤새 배양한다(135㎕/웰). 배양후 MAB 용액을 동일한 부피의 완충액(0.2M Tris/HCl, 0.2M NaCl, 0.05% Tween 20 pH7.4)으로 치환하고 10분동안 배양했다. 이어서 완충액을 Tween 20을 제외한 전술한 완충액, 0.2M NaCl pH7.4를 포함하는 0.2M TRIS/HCl완충액 및 0.05M TRIS/HCl pH7.4완충액으로 연속하여 치환했다. 마지막으로, 플레이트를 질소 기체를 이용하여 건조시켰다. 24시간 후, 플레이트를 냄새주머니에 싸서 4℃에서 저장했다.
EIA를 표준 과정에 따라 수행했다. 요약하면, 100㎕ 시료를 37℃에서 1시간동안 배양하고 이어서 PBS-Tween pH7.4를 이용하여 4번 세척한다. 세척 후, 100㎕ 접합체(PBS pH7.4중의 희석제 20%염소혈청과 1%TritonX100)를 첨가하고, 배양하여 전술한 대로 제거했다. 그후 바로 사용하도록 준비된 TMB 기질(Organon Teknika UniForm II 기질) 100㎕를 첨가하고 상온에서 30분동안 배양한다. 1M 황산(H2SO4)을 이용하여 반응을 종결시킨다. 450nm에서 흡광도를 측정한다.
HBe MAB 분석
이 분석은 두 개의 단일클론 항체에 기초한다. HBe 선별 분석법에서처럼 MAB HBeOT.Hu03-HRP를 1:8000희석률의 접합체로 이용한다. 소린 MAB 364C8을 고체 상에 피복한다(5㎍/ml). 단일클론 항체 364C8을 Sorin Biomedica company(Italy)로부터 직접 입수하여 이용했다. 선별 분석의 특이성이 HBOT95A 단일클론 항체에 기인한 것이며 접합체에 이용된 단일클론 항체에 기인한 것이 아님을 확인하기 위해 HBeOT.Hu03-HRP접합체를 포함한 분석이 필요했기 때문에 이 분석이 이루어졌다. 소린 단일클론 항체의 선택은 이러한 목적을 위한 분석을 수행하는 데 있어 필수적인 것은 아니다. 이 단일클론 항체는 HBeAg 복합체를 인식하는 임의의 항-HBeAg 단일클론 항체에 의해 대체될 수 있다.
EIA는 전술한 대로 표준 과정에 따라 수행된다.
실시예3
본 실시예는 HBe 선별 분석과 HBe MAB 분석을 이용하여 어떻게 HBeAg 양성 시료를 시험하는 지를 설명한다. 그 결과로부터, HBe 선별 분석을 이용하여 감염의 임상 결과를 급성 단계에서 예측할 수 있는 것으로 결론지을 수 있다.
HBeAg 양성 혈청.
1987년 11월에 일군의 여성들이 의료 시설에서 우연히 HBV바이러스로 감염되었다. 약 4개월 후 감염이 임상적으로 나타났으며 첫 번째 혈액 시료가 채취되었다. 총 8명의 여성을 대상으로 연구를 수행했다. HBe 영역의 서열 분석은 모든 경우에서 HBeAg가 동일함을 밝혔다. 바이러스는 HBeAg의 97번 위치에 세린(S) 잔기를 갖는 HBeAg를 암호했다. HBsAg 서브타입(ayw2)의 정의를 위해 HBsAg의 선별된 게놈 영역을 증폭시켜 Norder et al., 1992(J.Gen.Virol.73:3141-3145)에 따라 서열 분석했다. HBeAg의 서열 분석은 하기와 같이 수행되었다.
HBe PCR 단편의 서열 결정
모든 혈액 시료로부터 완전한 HBe 서열을 결정하여 바이러스 균주 및/또는 HBe 이종성을 결정했다. DNA를 Boom 프로토콜(Boom et al., J.Clin.Microbiol., 28, 495-503, 1990)에 따라 분리했다. 요약하면, 세포 용해 완충액 9부피에 혈청 1부피를 첨가했다(각각 225㎕와 25㎕). 이 혼합물에 실리카 현탁액 70㎕를 첨가했다. 이 용액을 상온에서 10분동안 배양하고 규칙적으로 볼텍스했다. 배양후 최고속에서 15초 이상 원심분리하여 실리카를 회전 침전시켰다.상등액을 제거했다. 침전물을 1ml의 L2 세척 완충액(0.05M Tris/HCl pH6.4, 5M GuSCH)에 용해시켰다. 실리카를 다시 회전 침전시키고 침전물을 1ml의 L2 세척 완충액으로 한 번 더 세척했다. 상등액을 제거한 후 침전물을 70%에탄올로 두 번 세척하고 아세톤으로 한 번 세척했다(이전 단계와 동일한 방식). 침전물을 56℃에서 10분동안 가열블록에서 건조시켰다. 물 100㎕를 첨가하여 핵산을 용출시키고 56℃에서 10분동안 배양했다(5분후 한 번 볼텍스함). 10000g에서 2분간 원심분리한 후 +/-80㎕핵산 용액을 새 에펜돌프 튜브로 옮겼다. 모든 실리카를 제거하기 위한 또 다른 원심분리 단계 후, +/-70㎕핵산을 새 튜브로 옮기고 -20℃에서 저장했다.
일반적인 PCR 방법에 따라 PCR을 수행했다(총 부피 50㎕). 이용된 DNA 양은 분리된 분획 2㎕였다. PCR후 생성물이 없으면 DNA양을 늘려 다시 PCR을 수행했다. PCR을 위한 프라이머는 M13 포워드(forward)서열 또는 M13 리버스(reverse)서열로 신장된 특이적 HBe 서열이 존재하는 프라이머였다.
4)프라이머 서열:
HBe M13 포워드 5'CGA CGT TGT AAA ACG GCC AGT AGG AGG CTG TAG GCA TAA AT3'
HBe M13 리버스 5'CAG GAA ACA GCT ATG ACC TTC TGC GAC GCG GCG ATT GA3'
PCR이 끝난후 생성물 2㎕를 2% TAE 아가로즈젤에서 정량적으로 확인했다. 총 생성물(50㎕)을 2% 아가로즈젤에 가했다. 옳은 단편(698bp)을 잘라내어 Qiagen의 Qiaex 방법에 따라 정제했다. 정제후 정제된 단편의 1/10을 2% 아가로즈젤에 가해 정제 정도를 확인했다. 정제가 정확하게 수행된 경우, 서열을 결정했다.
서열 분석은 Sequitherm long read cycle sequencing kit(Epicentre Technologies, Madison USA)에 따라 수행했다. 약 300 내지 500ng의 정제된 PCR 단편을 DNA 반응물로 이용했다. 서열 분석을 위한 프라이머로 M13포워드와 M13리버스를 이용했다. 반응은 표준 방법에 따라 A.L.F.DNA 시퀀서(Pharmacia Biotech)에서 수행했다.
결과
결과는, 감염의 급성 단계동안 모든 시료는 Abbott HBeAg EIA, Organon Teknika Hepanostika HBeAg/anti-HBe와 모든 형태의 HBeAg의 검출에 적합한 새로 개발된 MAB HBe 분석에서 양성이었다. 결과는 도1A와 B에 주어진다. HBeAg 선별 분석을 이용할 경우 다른 결과가 얻어졌다. 감염 후 6개월내에 바이러스를 제거한 환자 162, 216, 255 및 336의 혈청은 음성이었으며 만성 감염이 된 환자 343, 098 및 228의 혈청은 양성이었다. 항-HBe로의 늦은 혈청변환(9개월 이상 후)을 나타낸 환자로부터의 혈청181 또한 선별 분석에서 양성이었다(도1C). 결과는 HBV감염의 급성 단계에서 선별 분석이 만성 감염이 되거나 항-HBe로의 늦은 혈청변환을 나타내는 환자와 감염 후 6개월내에 항-HBe 혈청변환을 나타내는 환자를 구별할 수 있음을 보여준다. 이러한 구별은 기준 분석에 따라 모든 혈청에서 나타나는 HBeAg의 면역반응성에서의 변이에 기초한다. HBV HBeAg가 모든 경우에 동일한 서열을 가짐을 보여주기 때문에 임상 결과에서의 차이는 바이러스의 변이에 관계될 수 없다.
실시예4
본 실시예는, 억제 분석을 이용하여, HB.OT95A의 에피토프를 차단할 수 있는 생체분자가 Hbe 선별 분석에서는 음성으로 그리고 다른 HBeAg 분석에서는 양성으로 나타난 시료에 존재하는 것을 어떻게 확인하는지 보여준다.
억제 분석.
연구에 참여한 모든 여성의 HBV HBe 유전자를 서열결정한 후, 그들이 동일한 바이러스 균주로 감염되었음이 명백해졌다. HBe서열은 감염 과정동안 전혀 변화를 나타내지 않았다. 그래서 HBeAg 면역반응성에서의 변이는 HBeAg 그자체에서의 변이에 의해 야기될 수 없었다. 혈청에 존재하는 하나 이상의 숙주-유래 인자가 중요한 역할을 한다는 것이 제안되었다. 이것을 억제 실험으로 조사했다.
환자 번호 343으로부터의 혈청을 감염의 급성 단계동안 얻었다(도2A). 이 시료를 양성 대조군(PS)으로 이용했다. 먼저 PS를 정상 인체 혈청을 이용하여 2/3배 희석했다. 이어서, 다른 혈청 343b, 162a/b 및 양성 대조군을 NHS로 1:1로 희석하고 Abbott HBe EIA와 HBe 선별 분석으로 측정했다. 결과는 도2A에 나타난다. 혈청 343b, 162a 및 PS는 Abbott HBeAg 분석에서 HBeAg 양성으로 나타났으며 단지 PS만이 선별 분석에서도 양성이었다. 시료 162b와 정상 인체 혈청은 두 분석 모두에서 음성이었다. 시료 343b와 PS를 동일한 환자로부터 얻었다. PS는 HBV감염의 급성 단계동안 취해졌고 혈청 343b는 감염 후 4년에 만성 단계동안 얻어졌다. 혈청 162a는 HBV감염의 급성 단계동안 환자로부터 얻었으나 환자162는 6개월내에 바이러스를 제거했다. 혈청162b는 초기 감염 후 10개월 회복 후에 얻어졌다.
두 번째 단계로서 60㎕ 양성 대조군(2/3 희석)에 다양한 혈청(100%) 60㎕를 첨가했다. 혼합물을 상온에서 8시간동안 배양하고 이어서 HBeAg를 선별 분석에서 검출했다. 결과(도2B)는 양성 대조군이 정상 인체 혈청과 배양한 후 높은 흡광도 값을 나타내지만 만일 선별 분석에서 음성이거나(생체분자가 HBeAg에 결합되었음을 나타냄) Abbott anti-HBe 분석에서 항-HBe 양성인 혈청이 대신 이용되면 신호가 감소함을 나타냈다. 이들 결과는 Abbott HBeAg EIA 또는 HBe MAB 분석에서 양성이지만 HBe 선별 분석에서 음성인 혈청이 HB.OT95A의 에피토프를 차단할 수 있는 생체물질을 함유함을 명확히 나타냈다. 162b같은 항-HBe 양성 혈청에 대해서도 동일한 결론이 내려진다.
실시예 5
본 실시예는 Abbott HBeAg EIA에서 HBeAg양성이나 선별 분석에서 음성인 혈청이 HBeAg와 생체분자의 복합체를 함유하며 이들 생체분자는 아마도 IgG타입의 항-HBeAg 항체임을 보여준다.
통상적인 과정에 따른 단백질A 크로마토그래피를 이용하여 HBeAg 양성 혈청으로부터 IgG분자와 IgM분자를 정제했다. 용출 분획의 HBeAg를 Organon Teknika Hepanostika HBeAg/anti-HBe분석을 이용하여 결정했다.
이어서 HBeAg에 결합된 IgG와 IgM분자를 적합한 EIA분석을 이용하여 검출했다. 이 분석에서, 소린에서 입수한 단일클론 항체 364C8을 고체상에 피복했다. HBeAg 양성 분획에 결합된 HBeAg-IgG를 1/30 또는 1/100배로 희석하고(희석 배지는 PBS(7.2)중의 20% 정상 염소 혈청과 1% Triton-X100) 시료 100㎕를 고체상과 접촉시켰다. 마우스 항-인체 IgG 또는 IgM HRP 접합체를 두 번째 항체로 이용했다. 두 번째 실험에서, 다른 HBV감염된 공여자로부터의 다양한 희석되지 않은 혈청을 전술한 정제 단계없이 EIA에서 각각 시험했다.
두 실험의 결과는 Abbott 또는 Organon Teknika HBeAg EIA에서는 양성이지만 선별 분석에서는 음성인 혈청은 항상 항-HBe에 결합된 HBeAg를 함유함을 나타냈다. HBeAg에 결합된 항-HBe는 단지 IgG 서브타입으로 관찰되었다.
실시예 6
본 실시예는 HBeAg복합체로부터 얻어진 생체물질(항-HBe 항체)이 선별 분석에서 HBeAg 반응성을 억제할 수 있음을 보여준다.
항-HBe 항체의 정제
HBeAg복합체를 친화도 크로마토그래피에 의해 정제했다. Pharmacia(Affinity Chromatography Principles and Methods: Methods for coupling ligands to CNBr- activated Sepharose 4B)에 의해 기술된 방법에 따라 MAB Sorin 364C8(5mg/ml 세파로즈)을 CNBr-세파로즈4B에 결합시켰다. HBeAg 양성 혈청(Organon Teknika Hepanostika HBeAg/anti-HBe분석(양성)과 선별 분석(음성)) 20ml을 MAB Sorin 364C8을 함유한 세파로즈 1ml에 첨가하여 HBeAg를 정제했다. 혼합물을 4℃에서 회전시키면서 밤새 배양했다. 배양후 결합되지 않은 분획을 젤물질로부터 분리하고 젤물질을 PBS/Tween pH7.2 세척완충액(Organon Teknika PBS 세척완충액)을 이용하여 세척했다. 결합된 분획은 5M NaSCN을 이용하여 용출했다(배치식으로 상온에서 5분간). 용출 분획을 젤여과에 의해 추가 정제했다(세파덱스 G75 0.5X14cm). 총 0.5ml 용출 분획을 TNE 완충액(pH7.4, 0.1M TRIS/HCl, 0.1M NaCl, 0.1M EDTA)을 이용하여 정제했다. 유속은 1ml/min이었다. 0.5ml간격으로 분획을 모았다. 용출된 첫 번째 단백질을 포함하는 세 번째 0.5ml 분획(분획3)을 추가 실험을 위해 이용했다.
억제 실험
분획3을 정상 인체 혈청에 희석(1:10)하거나 HBe 선별 분석에서 HBeAg 양성인 인체 혈청(예를 들어 혈청 번호 343, 실시예3)이나 정상 인체 혈청(양성 대조군)과 직접 1:1로 혼합했다. 혼합물을 상온에서 밤새 배양하고 전술한 대로 선별 분석에서 시험했다.
결과
결과는 분획3과 배양한 후 선별 분석에서 HBeAg 양성 혈청의 신호가 감소함을 보여주었다. 이것은 정상 인체 혈청이 이용된 양성 대조군과 대조된다. 이전의 희석 단계없이 분획3이 이용되면 총 15.3% 억제가 얻어졌다. HBeAg 양성 혈청으로 배양하기 전에 분획3이 농축되면 더 높은 억제가 기대될 수 있다.
결과는 분획3이 선별 분석에서 HBeAg 신호를 감소시킬 수 있는 생체분자를 함유함을 나타냈다. 이들 생체분자는 다양한 HBeAg 분석에서 HBeAg 양성이지만 HBe 선별 분석에서 음성인 인체 혈청에서 원래 나타나는 HBeAg복합체로부터 유래된다. 명백히, 생체분자는 부분 정제후 에피토프 차단능력을 가진다.
실시예7
본 실시예는 NaSCN을 이용하여 HBeAg복합체가 어떻게 해리될 수 있는지를 보여준다.
방법
다양한 HBeAg 양성 혈청(HBe MAB 분석)을 HBV감염된 환자로부터 얻었다. 5M NaSCN 또는 PBS pH7.2로 혈청을 희석했다. 정상 인체 혈청을 음성 대조군으로 이용했다. 혈청을 혼합하고 상온에서 1시간동안 또는 4℃에서 밤새 쉐이커에서 배양했다. 배양후 정상 인체 혈청을 이용하여 혈청을 희석했다(1:5, 1:10, 1:20, 1:30, 1:100).
HBe 선별 분석을 이용하여 혈청을 HBe반응성에 대해 시험했다. 정제된 HBeAg복합체를 이용하여 유사한 실험을 수행했다. 실시예5에서 전술한 대로 HBeAg 복합체를 정제했다. 정제되지 않은 혈청을 양성 대조군으로 이용했다. 정제 후, 용출 분획을 NaSCN 또는 PBS pH7.2(1:1)로 희석하고 HBe 선별 분석에서 시험했다(1:50).
정상 인체 혈청을 희석제로 이용했다. 출발 물질과 비결합 분획을 동일한 방식으로 처리했다.
결과
HBe 선별 분석에서 중간 내지 높은 양성인(1:20희석에서 1000 A450nm에서의 신호) 혈청에 NaSCN을 첨가하면 1:5희석에서 원래 신호를 약간 감소시켰다. 하지만, 1:10 또는 그 이상의 희석에서는 PBS 또는 NaSCN 처리사이에 차이가 나타나지 않았다. HBe 선별 분석에서 원래 낮은 양성인 혈청에서 HBe 신호는 혈청이 NaSCN으로 배양되면 강하게 증가했다. 이 효과는 1:100의 희석에서도 관찰되었다. 선별 분석에서 완전히 음성이고 HBe MAB 분석에서 낮은 양성인 혈청은 NaSCN으로 처리한 후 음성이었다. 이 효과는 분석의 민감도에 의한 것으로 생각된다.
정제후 HBeAg복합체는 HBe MAB 분석을 이용한 용출 분획에서 확인될 수 있는 것으로 관찰되었다. 이들 복합체는 PBS로 희석한 후 HBe 선별 분석에서 음성이나 NaSCN으로 처리한 후에는 양성임이 밝혀졌다. 결론적으로, NaSCN을 이용한 HBeAg 복합체의 해리는 HBe 선별 분석에서 HBeAg 에피토프의 인지로 귀결된다.
실시예 8
본 실시예는 HBe N-타입과 HBe S-타입을 구별하는데 이용될 수 있는 새로운 방법을 보여준다.
생물 재료
총 22개의 혈청을 HBV감염된 환자로부터 얻었으며 이중 19개는 감염의 만성 단계동안 수거하고 3개는 급성 단계동안 수거했다. 모든 혈청은 Abbott HBeAg IMX 분석과 Organon Teknika HBe MAB 분석에서 HBeAg 양성이었다.
서열결정
실시예3에 기술된 대로 완전한 HBeAg 서열을 결정했다. 혈청은 아미노산 97(세린(S) 또는 아스파라긴(N))을 기초로 HBe S-타입 또는 N-타입으로 분류되었다.
다른 서브타입 결정 방법
각 HBeAg 양성 혈청을 Organon Teknika HBe MAB 분석과 Organon Teknika HBe 선별 분석 둘다에서 광범위한 희석 연속물(1/3, 1/5, 1/10에서 1/1000까지)에서 시험했다. 정상 인체 혈청(두 분석 모두에서 HBeAg 음성)을 희석제로 이용했다. 두 분석 모두 동일한 조건하에서 수행되었다.
축적, 용량반응 또는 S자모양과 같은 다양한 모델을 이용하여 가장 적합한 각 희석 곡선을 결정하고 추가 계산을 위해 이용했다. 흡광도 1000과 관련된 임의 단위(1임의 단위=희석도의 역수 값)의 총량을 각 혈청에 대해 결정했다(AU1000). 이어서, 각 혈청에 대해 Organon Teknika HBe MAB 분석에서 결정된 AU1000을 Organon Teknika HBe 선별 분석에서 결정된 AU1000으로 나누었다.
결과
본 실험으로부터 상기 방법이 HBeAg 서열을 결정하지 않고도 HBe S-타입과 HBe N-타입을 구별하기에 적합한 것으로 결론지을 수 있다(도3). 본 실험의 결과는 0.03이하의 비율은 HBe S-타입을 의미하며 0.13이상의 비율은 HBe N-타입과 관련됨을 나타낸다.
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 :
(A) 성명 : 악조 노벨 엔.브이.
(B) 거리: 벨페르베그 76
(C) 도시: 아르넴
(D) 국가: 네덜란드
(F) 우편번호: 6824BM
(ii) 발명의 명칭 : B형 간염의 감염 결과를 예측하는 방법
(iii) 서열의 수 : 24
(iv) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 유형 : 플로피디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종
(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : 페이턴트인 릴리즈 #1.0, 버전 #1.25
(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :
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(2) 서열 번호 18 에 대한 정보 :
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(2) 서열 번호 23 에 대한 정보 :
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(A) 길이 : 41염기쌍
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(2) 서열 번호 24 에 대한 정보 :
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(A) 길이 : 38 염기쌍
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(D) 형태 : 미지
(ii) 분자 유형 : cDNA
(xi) 서열 : 서열 번호 24:

Claims (15)

  1. 완전한 HBeAg 서열의 아미노산 85-109를 포함하는 영역에 위치한 HBeAg상의 에피토프를 차단할 수 있는 생체분자와 HBeAg를 함유한 순환 복합체의 존재를 급성 단계 시료에서 검출함으로써 급성 B형 간염 감염 환자에서 감염 과정을 예측하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, HBeAg에 대해, 기탁번호 95090611로 ECACC에 기탁된 세포주에 의해 생성된 항체와 동일한 면역반응성을 가진 항체와 상기 시료를 접촉시키는 방법.
  3. 제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 기탁번호 95090611로 ECACC에 기탁된 세포주에 의해 생성된 단일클론 항체인 방법.
  4. 제 1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 고체상에 피복된 것인 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 고체상에 존재하는 항체에 의해 인지되는 에피토프를 인지하지 않는, HBeAg에 대한 표지된 항체와 고체상을 접촉시켜 고체상에 형성된 면역복합체를 검출하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 표지된 항체가 인체 단일클론 항체인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 시료에 존재하는 HBeAg함유 복합체가 해리되어 시료에 존재하는 생체분자가 유리되고, 그후 시료를 생체분자에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드 또는 재조합 단백질 또는 임의의 기타 물질과 접촉시켜 결합된 생체분자를 검출하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 서열 번호1 또는 서열 번호 2에 개시된 아미노산 서열의 일부 이상을 포함하는 펩티드가 이용되는 방법.
  9. HBeAg에 결합된 특이적 생체분자를 포함하는 순환 복합체의 검출을 위한 분석의, 급성 HBV감염 환자에서 감염 과정을 예측하는 방법에서의 용도.
  10. 급성 B형 간염 감염의 과정을 예측하는 방법에서 이용될 수 있는 시험키트로서, HBeAg에 대해, 기탁번호 95090611로 ECACC에 기탁된 세포주에 의해 생성된 단일클론 항체와 동일한 반응성을 가진 첫 번째 항체로 피복된 고체상 및 고체상에 형성된, 첫 번째 항체와 시료에 존재하는 임의의 HBeAg 사이의 면역복합체와 반응할 수 있는 두 번째 항체를 포함하는 표지된 시약을 포함하는 키트.
  11. HBeAg에 대해, 기탁번호 95090611로 ECACC에 기탁된 세포주로부터 유래된 단일클론 항체와 동일한 반응성을 갖는 단일클론 항체.
  12. HBeAg에 대해, 기탁번호 95090611로 ECACC에 기탁된 세포주로부터 유래된 단일클론 항체와 동일한 반응성을 갖는 단일클론 항체의, B형 간염 감염의 결과를 예측하는 방법에서의 용도.
  13. 제 11항의 단일클론 항체를 생성할 수 있는 세포주.
  14. 기탁번호 95090611로 ECACC에 기탁된 세포주.
  15. (a)HBeAg에 대해, 기탁번호 96090611로 ECACC에 기탁된 세포주에서 유래된 단일클론 항체와 동일한 반응성을 갖는 항체로 피복된 고체상과 HBeAg 함유 시료의 일부를 접촉시키고 고체상에 형성된 면역 복합체를 검출하는 단계,
    (b)S타입의 HBeAg와 N타입의 HBeAg에 대해 동일한 반응성을 가진 항-HBeAg 항체로 피복된 고체상과 시료의 일부를 접촉시키는 단계,
    (c)단계(a)와 (b)에서 얻어진 반응성 사이의 비율로부터, 시료에 존재하는 B형 간염 e항원이 N-타입인지 S-타입인지를 결정하는 단계
    를 포함하는, B형 간염 e항원(HBeAg) N-타입과 HBeAg S타입을 구별하는 방법.
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