JPH05301889A - 非ａ非ｂ型ペプチド - Google Patents

非ａ非ｂ型ペプチド

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JPH05301889A
JPH05301889A JP4205775A JP20577592A JPH05301889A JP H05301889 A JPH05301889 A JP H05301889A JP 4205775 A JP4205775 A JP 4205775A JP 20577592 A JP20577592 A JP 20577592A JP H05301889 A JPH05301889 A JP H05301889A
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peptide
nanbh
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test solution
acid sequence
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JP4205775A
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Winand Johannes Antonius Habets
ウイナンド・ヨハンネス・アントニウス・ハーベツツ
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Akzo NV
Original Assignee
Akzo NV
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 ＮＡＮＢＨに対する抗体と免疫化学反応する
ペプチド、及び試験液中のＮＡＮＢＨ又はＮＡＮＢＨ抗
体の検出方法、並びに本検出方法の適用時に使用すべき
免疫化学試薬及び試験用キット。 【効果】 該ペプチドは安全で非感染性である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス
（ＮＡＮＢＨ）に対する抗体と免疫化学反応するペプチ
ド又はそのフラグメント、並びにこのペプチド及びその
フラグメントの類似体に関する。
【０００２】本発明は更に、試験液中のＮＡＮＢＨ又は
ＮＡＮＢＨ抗体の検出方法、並びに本検出方法を実施す
るための免疫化学試薬及び試験用キットに関する。
【０００３】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】肝炎Ｃ
型ウイルス（ＨＣＶ）により引き起こされるかも知れな
い非Ａ非Ｂ型肝炎は、伝播性疾病であるか又はウイルス
誘発性であることが証明された疾病族である。非Ａ非Ｂ
型肝炎は、他の形態のウイルス関連肝臓疾患（例えば公
知の肝炎ウイルス、即ち肝炎Ａ型ウイルス（ＨＡＶ）、
肝炎Ｂ型ウイルス（ＨＢＶ）及びデルタ肝炎ウイルス
（ＨＤＶ）並びにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）又は
エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）により引き起
こされる疾患）と区別することができる。ＮＡＮＢＨは
輸血を受けた個人で最初に同定された。ヒトからチンパ
ンジーへの伝播及びチンパンジーでの連続継代により、
非Ａ非Ｂ型肝炎が１種以上の伝播性感染剤のせいである
ことが明らかになった。
【０００４】３つの型の非Ａ非Ｂ型肝炎（水系感染流行
性型、血液又は針に関連する型及び散発性（集団獲得
性）型）が存在するという疫学的証拠は示唆的である。
しかしながら、非Ａ非Ｂ型肝炎の原因となり得る上記感
染剤の数は知られていない。
【０００５】非Ａ非Ｂ型肝炎の臨床診断及び同定はま
ず、他のウイルスマーカーを除いて実施された。推定上
のＮＡＮＢＨ抗原及び抗体の検出のために使用される方
法の中には、寒天ゲル拡散、カウンター免疫電気泳動、
免疫蛍光顕微鏡検査、免疫電子顕微鏡検査、ラジオイム
ノアッセイ及びＥＬＩＳＡがある。しかしながら、これ
らのアッセイのいずれもＮＡＮＢＨの診断試験として使
用するのに感受性及び特異性及び再現性が不十分である
と判明している。
【０００６】しかしながら、ＮＡＮＢＨ感染の種々の段
階での確実な診断を可能とする特異的で感受性のある方
法の開発のためには、この型の免疫優性ウイルスエピト
ープを同定することが非常に重要である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】驚くべきことに例外的に
ＮＡＮＢＨ抗体と免疫化学反応する図１に示すような４
７個のアミノ酸のアミノ酸配列からなるペプチドを見出
した。
【０００８】本発明のアミノ酸配列はＮＡＮＢＨに関し
て公開された任意のアミノ酸配列（例えばＣｈｉｒｏｎ
によるヨーロッパ特許明細書第３８８，２３２号で発表
された配列）に該等していない。
【０００９】本発明は更に、尚ＮＡＮＢＨ抗体と免疫化
学反応するペプチドのフラグメント、及びこのペプチド
又はそのフラグメントを含んでいるポリペプチドに関す
る。
【００１０】図１に示すペプチドの類似体又は誘導体も
本発明に含まれる。
【００１１】“類似体”という用語は例えば、ペプチド
の発現後修飾（例えばグリコシル化、アセチル化、リン
酸化等）を意味する。
【００１２】特許請求の範囲には特に記載されていない
が、本発明のペプチドの免疫化学活性を作用させずに、
当該ペプチドの１個以上のアミノ酸を他のアミノ酸又は
アミノ酸の類似体若しくは誘導体に代えることができる
ことは自明である。
【００１３】本発明は更に、本発明のペプチド又はその
フラグメントを少なくとも１種含んでいる免疫化学試薬
に関する。
【００１４】本発明は更に、本発明のこれらのペプチド
を少なくとも１種使用する試験液中でのＮＡＮＢＨに対
する抗体の検出方法に関する。
【００１５】本発明は更に、本発明のペプチドを少なく
とも１種使用する試験液中でのＮＡＮＢＨの検出方法に
関する。
【００１６】本発明は更に、イムノアッセイで使用すべ
き試験用キットに関する。このキットは本発明の免疫化
学試薬を少なくとも１種含んでいる。
【００１７】核酸増幅技術（例えばそれぞれ米国特許明
細書第４，６８３，２０２号及びヨーロッパ特許明細書
第３２９，８２２号に記載の如きポリメラーゼ鎖反応
（ＰＣＲ）又は核酸配列を基準とする増幅（ＮＡＳＢ
Ａ））によりＮＡＮＢＨ ＤＮＡ又はＲＮＡを検出する
ために、本発明のアミノ酸配列をコードする新規な核酸
配列又はその部分、いわゆるプライマーを試験の基礎と
して使用することは本発明の範囲内である。
【００１８】本発明の一部は、前記増幅検出方法を実施
するための試験用増幅キットを含んでいる。
【００１９】更には、ＮＡＮＢ肝炎疾病の予防及び／又
は治療のために、本発明のペプチド又はそのフラグメン
トを適切な投薬量形態で使用することができる。このよ
うなペプチド又はそのフラグメントを活性成分として使
用して得られるワクチンの製造は当業者により実施され
得る。
【００２０】前述したペプチドは、試験液中のＮＡＮＢ
Ｈ又はＮＡＮＢＨ抗体の存在の定量のための診断方法で
使用するのに特に適していることが判明した。
【００２１】自然ＮＡＮＢＨとは対照的に、本発明のペ
プチドは安全な非感染源であるという大きな利点を有す
る。
【００２２】ペプチド合成のための公知の有機化学方法
の１つを適用して、又は組換え体ＤＮＡ技術により、本
発明のペプチドを製造する。後者の方法は、宿主として
の適切な微生物中で１種以上のペプチドをコードしてい
るポリヌクレオチド配列で組換え体ポリヌクレオチドを
発現して所望のペプチドを製造することからなる。
【００２３】ペプチド合成のための有機化学方法は、均
一相又はいわゆる固相での縮合反応による必要なアミノ
酸のカップリングを含んでいると考えられる。縮合反応
は以下のように実施され得る。
【００２４】ａ） 縮合剤の存在下で、遊離カルボキシ
ル基及び他の保護反応基を有する化合物（アミノ酸、ペ
プチド）と、遊離アミノ基及び他の保護反応基を有する
化合物（アミノ酸、ペプチド）との縮合； ｂ） 活性化カルボキシル基及び遊離した又は保護され
た他の反応基を有する化合物（アミノ酸、ペプチド）
と、遊離アミノ基及び遊離した又は保護された他の反応
基を有する化合物との縮合。
【００２５】中でもカルボキシル基を酸ハロゲン化物、
アジ化物、無水物、イミダゾリド又は活性化エステル
（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール若しくはｐ−ニトロフェニルエス
テル）に変換することによりカルボキシル基を活性化す
ることができる。
【００２６】前述した縮合反応のための最も通常の方法
は、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １
−３（Ｅｄ． Ｇｒｏｓｓ， Ｅ． ａｎｄ Ｍｅｉｅ
ｎｈｏｆｅｒ， Ｊ．）１９７９，１９８０，１９８１
（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ）に記載の如
きカルボジイミド法、アジド法、混合無水物法及び活性
化エステルを使用する方法である。
【００２７】“固相”を使用しての本発明のペプチドの
適切なフラグメントの製造は例えば、Ｊ． Ａｍｅｒ．
Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８５， ２１４９（１９６
３）及びＩｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ Ｒｅｓ． ３５， １６１−２１４（１９９０）
に記載されている。製造すべきペプチドのアミノ酸のカ
ップリングは通常カルボキシル末端側基で開始する。こ
の方法のためには、反応基が存在するか又はこのような
基が導入され得る固相が必要である。これは例えばベン
ゼンと反応性クロロメチル基を有するジビニルベンゼン
とのコポリマー、又はヒドロキシメチル官能基若しくは
アミン官能基と反応させられるポリマー固相であり得
る。
【００２８】特に適した固相は例えば、Ｗａｎｇにより
（１９７４）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ９
５，１３２８に記載されているｐ−アルコキシベンジル
アルコール樹脂（４−ヒドロキシメチルフェノキシメチ
ルコポリスチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂）であ
る。合成後に、ペプチドを穏やかな条件下でこの固相か
ら分離することができる。
【００２９】所望のアミノ酸配列の合成後に、例えばト
リフルオロ酢酸に溶解したトリフルオロメタンスルホン
酸又はメタンスルホン酸を使用して、ペプチドを樹脂か
ら解離させる。低級アルコール、好ましくはメタノール
又はエタノールでエステル交換してペプチドをキャリヤ
ーから除去することもできる。この場合、ペプチドの低
級アルキルエステルが直接生成する。同様にアンモニア
を使用しての分離により、本発明のペプチドのアミドが
得られる。
【００３０】縮合反応に関与し得ない反応基は前述した
如く、酸、塩基による加水分解又は還元により非常に簡
単に除去され得る基により有効に保護されている。従っ
て、例えばメタノール、エタノール、第三ブタノール、
ベンジルアルコール又はｐ−ニトロベンジルアルコール
及び固体支持体に結合されたアミンでエステル化してカ
ルボキシル基を有効に保護することができる。
【００３１】アミノ基を有効に保護し得る基はエトキシ
カルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブト
キシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボ
ニル基又はスルホン酸から得られる酸基（例えばベンゼ
ンスルホニル基若しくはｐ−トルエンスルホニル基）で
あるが、他の基（置換若しくは非置換のアリール基若し
くはアラルキル基、例えばベンジル基及びトリフェニル
メチル基、又はオルトニトロフェニルスルフェニル基及
び２−ベンゾイル−１−メチルビニル基のような基）を
使用することもできる。特に適したα−アミノ保護基は
例えば塩基感受性９−フルオレニルメトキシカルボニル
（Ｆｍｏｃ）基である（Ｃａｒｐｉｎｏ＆ Ｈａｎ（１
９７０）Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ９
２，５７４８）。
【００３２】考えられる保護基についてのより詳細な説
明が、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．
１−９（Ｅｄｓ． Ｇｒｏｓｓ， Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎ
ｄ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）１９７９−１９８
７（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）に記
載されている。
【００３３】リシンのε−アミノ基を保護することも必
要であり、またアルギニンのグアニジン基についても保
護が望ましい。この点については通常の保護基はリシン
の場合でＢｏｃ基、アルギニンの場合でＰｍｃ基、Ｐｍ
ｓ基、Ｍｂｓ基又はＭｔｒ基である。
【００３４】特定基の種類に依存して従来からの種々の
方法により、例えばトリフルオロ酢酸を使用するか、又
は例えば水素及びパラジウムのような触媒若しくは氷酢
酸中のＨＢｒを使用しての穏やかな還元により保護基を
分離することができる。
【００３５】前述した如く、本発明のペプチドを組換え
体ＤＮＡ技術により製造することもできる。ペプチドを
反復配列（“縦列”）で組み込むとき又はペプチドを
（遥かに大きい）タンパク質又はポリペプチドの成分と
して製造できるときにはこの可能性は特に重要である。
従って、この型のペプチド製造は本発明の範囲内であ
る。このために組換え体ＤＮＡの成分として、本発明の
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用する。
【００３６】本発明のペプチドをコードするこの型のポ
リヌクレオチド及びこのポリヌクレオチドが組み込まれ
る組換え体ＤＮＡも本発明の範囲内である。
【００３７】更には、概して （ａ）ペプチドの酸付加塩； （ｂ）ペプチドのアミド、特にＣ末端アミド； （ｃ）エステル、特にＣ末端エステル、及び （ｄ）Ｎ−アシル誘導体、特にＮ−末端アシル誘導体、
とりわけＮ−アセチル誘導体 を意味するこれらのペプチドの機能誘導体も本発明のペ
プチドとみなす。
【００３８】製造された前記ペプチド又はそのフラグメ
ントを使用して、ポリクローナル抗体及びモノクローナ
ル抗体を産生する。本発明のペプチドに対するモノクロ
ーナル抗体は当業者により容易に産生され得る。
【００３９】ハイブリドーマによるモノクローナル抗体
の製造はよく知られている。細胞融合、不滅化抗体産生
細胞系が生じ得るが、他の技術（例えばＢ−リンパ球の
腫瘍原性ＤＮＡによる直接形質転換又はエプスタイン−
バールウイルスによるトランスフェクション）も使用可
能である。
【００４０】本発明のペプチドに対するモノクローナル
抗体及びポリクローナル抗体は診断に非常に適している
が、中和するこれらの抗体は受動免疫療法に非常に有用
である。特にモノクローナル抗体を使用して、抗イディ
オタイプ抗体を産生してもよい。抗イディオタイプ抗体
を産生するための技術は従来技術で知られている。
【００４１】この抗イディオタイプ抗体は非Ａ非Ｂ型肝
炎の予防及び／又は治療、並びにＮＡＮＢＨ抗原の重要
なエピトープ部位の解明にも有用である。
【００４２】本発明のペプチドを抗原として使用して、
ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞
系を製造した。このモノクローナル抗体は高い反応性で
本発明のペプチドに対するものである。
【００４３】本発明の“免疫化学試薬”という用語は通
常、本発明の１種以上のペプチドと、適切な支持体又は
標識物質とからなっている。
【００４４】使用し得る支持体は例えばマイクロテスト
若しくはキュベットの内壁、管若しくは細管、膜、フィ
ルタ、試験用ストリップ又は粒子（例えばラテックス粒
子、赤血球、染料ゾル、金属ゾル若しくはゾル粒子とし
ての金属化合物、ＢＳＡ若しくはＫＬＨのようなキャリ
ヤータンパク質）の表面である。
【００４５】使用し得る標識物質は中でも放射性同位
体、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、金属ゾル又はゾル粒
子としての金属化合物である。
【００４６】試験液中でのＮＡＮＢＨに対する抗体の検
出方法では、本発明の免疫化学試薬を試薬流体と接触さ
せる。その後、試薬流体中のペプチドと抗体との間で生
成された免疫錯体の存在を検出する。この検出により試
験液中のＮＡＮＢＨ抗体の存在を認めて、定量すること
ができる。
【００４７】免疫化学試薬の種類、更には特性に依存し
て、生起する免疫化学反応はいわゆるサンドイッチ反
応、凝集反応、競合反応又は阻害反応である。
【００４８】試験液中でのＮＡＮＢＨ検出のために、本
発明の免疫化学試薬を試験液及びＮＡＮＢＨ抗体と接触
させ、その後生成された免疫錯体の存在を検出し、これ
から試験液中のＮＡＮＢＨの存在を定量することができ
る。
【００４９】試験液中のＮＡＮＢＨ検出のために特に適
した方法は、標識物質を備えた本発明のペプチドと、Ｎ
ＡＮＢＨ抗原（試験液中に存在）との間で行われる競合
反応に基づいている。この反応ではペプチドと抗原とが
固体支持体に付着したＮＡＮＢＨに対する抗体と競合し
ている。
【００５０】本発明の試験用キットは前述した如き免疫
化学試薬を主成分として含んでいる。ＮＡＮＢＨ抗体検
出のためにサンドイッチ反応を実施するには、試験用キ
ットは例えば、固体支持体（例えばマイクロテストウェ
ルの内壁）にコーティングされた本発明のペプチドと、
本発明の標識ペプチド又は標識抗体とを含み得る。他の
サンドイッチ反応試験フォーマットはＮＡＮＢＨ抗原の
検出であって、本発明のモノクローナル抗体を固体支持
体にコーティングし、モノクローナル抗体を抱合体とし
て使用する。
【００５１】例えばサンドイッチ反応はエンザイムイム
ノアッセイに関して当社が出願した米国特許ＲＥ３１．
００６号及びＲＥ３２．６９６号（Ｓｃｈｕｕｒｓ等）
に記載されている。
【００５２】競合反応を実施するには、試験用キットは
固体支持体にコーティングされた本発明のペプチドと、
ＮＡＮＢＨに対する標識抗体、好ましくはこのペプチド
に対するモノクローナル抗体とを含み得る。
【００５３】凝集反応では、試験用キットは免疫化学試
薬を含み、この免疫化学試薬は粒子又はゾルにコーティ
ングされた本発明のペプチドを含み得る。
【００５４】試験用キットの他の実施態様としては例え
ば、固体支持体にコーティングされるＮＡＮＢＨに対す
る抗体上の結合部位のために検出すべきＮＡＮＢＨ抗原
と共に、本発明の標識ペプチドを競合反応で免疫化学試
薬として使用する。
【００５５】
【実施例】前述した固相技術を使用して図１の配列（Ｘ
＝Ｇｌｙ）のペプチド（長さ：４７個のアミノ酸）を製
造し、１００ｍＭリン酸緩衝溶液ｐＨ９．６に７．５μ
ｇ／ｍｌで溶解し、このペプチド溶液１３５μｌをＮＵ
ＮＣマイクロタイタープレートの各ウェルに置いた。一
晩中４℃でペプチドをマイクロタイタープレートに結合
させた。
【００５６】その後、０．０５％ツイーン２０(R)を
０．２ＭトリスｐＨ７．４／０．２ＭＮａＣｌに溶解し
た溶液でプレートを室温で５分間ブロックした。次いで
プレートを、ウェル当たり２５０μｌ使用して、０．２
ＭトリスｐＨ７．４／０．２Ｍ ＮａＣｌで一度、０．
０４ＭトリスｐＨ７．４で２度洗浄し、乾燥した。非Ａ
非Ｂ型肝炎ウイルスに特異な抗体を定量するために、試
料希釈剤（リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）／２０％正常ヤギ
血清／１％トリトンＸ１００）（ウェル当たり１００μ
ｌ）で血清試料を希釈し、ウェルにピペットで加え、３
７℃で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ／
０．０５％ツイーン２０(R)で洗浄した後に、試料希釈
剤で希釈したペルオキシダーゼ（ウェル当たり１００μ
ｌ、３７℃で１時間）で標識したヤギ抗ヒト免疫グロブ
リンで結合ヒト抗体を検出した。プレートをＰＢＳ／
０．０５５％ツイーン２０(R)で４度洗浄した。ＴＭＢ
をペルオキシダーゼ酵素用基質として（ウェル当たり１
００μｌ）加えて、室温で３０分間反応させた。１００
μｌの２ＭＨ2ＳＯ4を各ウェルに加えて反応を停止させ
た。Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ ｍｉｃｒｏｅｌ
ｉｓａ読取り機において４５０ｎｍで黄色を読取った。
【００５７】非Ａ非Ｂ型肝炎の患者の血清を使用して、
１．４〜２．９の吸光係数を測定したが、１８人の正常
ヒト血清の平均吸光係数は０．２０８（標準偏差０．１
５）であった。
【００５８】対照として２種類の無関係のペプチドで手
順を繰り返した。いずれの場合も正常ヒト血清及びＮＡ
ＮＢＨ患者の血清試料を使用して得られた吸光係数に大
きな差は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】４７個のアミノ酸のアミノ酸配列を示す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 9284−4Ｃ 39/29 9284−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 99:00

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＮＡＮＢＨ抗体と免疫化学反応する図１
    に示すアミノ酸配列からなるペプチド若しくはそのフラ
    グメント、並びに該ペプチド及び該フラグメントの類似
    体、又は該ペプチド若しくは該フラグメントを含んでい
    るポリペプチド。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のペプチド、フラグメン
    ト又はポリペプチドを含んでいる免疫化学試薬。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載のアミノ酸配列をコード
    する核酸配列又はそのフラグメントを含んでいるベクタ
    ー。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載のペプチド又はそのフラ
    グメントに対するモノクローナル抗体。
  5. 【請求項５】 試験液中でのＮＡＮＢＨに対する抗体の
    検出方法であって、請求項２に記載の免疫化学試薬を試
    験液と接触させ、試験液中のペプチドと抗体との間で生
    成された免疫錯体の存在を検出し、試験液中のＮＡＮＢ
    Ｈ抗体の存在を定量することを特徴とする方法。
  6. 【請求項６】 試験液中でのＮＡＮＢＨの検出方法であ
    って、請求項２に記載の免疫化学試薬を試験液及びＮＡ
    ＮＢＨ抗体と接触させ、その後、生成された免疫錯体の
    存在を検出し、これから試験液中のＮＡＮＢＨの存在を
    定量することを特徴とする方法。
  7. 【請求項７】 非Ａ非Ｂ型肝炎核酸配列の核酸増幅を実
    施、検出するために請求項１に記載のアミノ酸配列をコ
    ードする配列又はそのフラグメントをプライマーとして
    使用して行う試験液中での非Ａ非Ｂ型肝炎核酸配列の増
    幅検出方法。
  8. 【請求項８】 請求項５又は６に記載のイムノアッセイ
    を実施するための試験用キット。
  9. 【請求項９】 請求項７に記載の増幅検出方法を実施す
    るための試験用増幅キット。
JP4205775A 1991-08-02 1992-07-31 非ａ非ｂ型ペプチド Pending JPH05301889A (ja)

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NL91202740.6 1991-10-23
NL91201999.9 1991-10-23
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