JPS62502704A - 立体配座−独立並びに立体配座依存決定基を有するタンパク抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 決定基を有するタンパク抗原 本発明は抗体−抗原相互作用、特に立体配座−独立および立体配座依存決定基を 有するタンパク抗原を含む相互作用に関するも単一のタンパク抗原は多数の抗原 決定基を含むことができる。

この抗原決定基の各々は多数の特別なエピトープを含んでおり、該エピトープは 免疫原としての抗原に対して指令されあるいは産生された抗体と免疫反応し、か つ結合する。従って、細胞例えば病原体のゲノムは数種の抗原決定基およびエピ トープをコードできる。該決定基およびエピトープは哺乳類の免疫系によって外 来物質と認識され、かつ抗体産生を誘発するものである。

この抗原決定基が病原体の一部である場合、特定のエピトープに結合している抗 体は以下の点で臨床的に重要となり得る。即ち、このような結合は該抗体を産生 ずる宿主動物の保護を達成し得る。

他方、他のエピトープに結合している抗体は病原体に対する保護に関しては余り 重要でないが、免疫病原体の菌株または該病原体によって引起こされた疾病状態 の段階に関する情報を与えることができる。従って、抗体を識別し得ることは臨 床的に重要であるか、あるいは科学的に興味深いことである。該抗体の識別とは 所定の抗原の一つのエピトープと免疫反応し、かつ結合する抗体を、同じタンパ ク抗原の１または２以上の他のエピトープと免疫反応し、かつ結合する抗体から 識別することである。

球状タンパクを用いた初期の研究は、これらタンパクの抗原決定基が一般に立体 配座−依存性である、即ちエピトープは該領域のアミノ酸残基配列および該領域 の三次元構造の両者によって決定されることを示唆しているように思われる。例 えば、アーノン等（Ａｒｎｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）の研究報告〔ブロシーデインダ ス　オブザナショナル　アカデミ−オブ　サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　）、ＵＳＡ、１９６８．６２．１６３〕は、いわゆる“ループの非病 原性、内性タンパク卵白リゾチームが立体配座−依存抗原決定基であることを示 した。

しかしながら、極く最近のアール、ニー、レーナー（Ｒ，Ａ。

Ｌｅｒｎｅｒ　）とその共同研究者等の研究は、病原体−関連タンパクの抗原決 定基に対応する配列をもつポリペプチド免疫原を用いて、病原体からの宿主動物 の保護が、多数の立体配座をもっと思われる直鎮ポリペプチド免疫原を含むワク チンを用いることによって達成し得ることを示した。例えば、ピットル等（Ｂｉ ｔｔｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　）のネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、１９８２．２９ ８．３０およびゲラン等（Ｇｅｒｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）のブロシーデインダス　 オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）、ＵＳＡ、１９８３．８０，３６５を参照のこと。か くして、レーナーおよびその共同研究者等の研究は、ポリペプチド免疫原の立体 配座−依存性が厳密な要件であり、かつそれゆえ立体配座−依存抗原決定基およ びエピトープのみの存在は不正確な仮定であることを示しているようである。

肝炎Ｂウィルス（ＨＢＶ）は、世界的に、ヒトにおける急性かつ慢性疾病両者と 関連している。最近の報告は肝細胞癌と該ウィルスとが直接的に関係していると している〔モリアルティ下等（Ｍｏｒｉａｒｔｙ　ｅｔ　ａｌ、）　、サイエン ス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）、１９８５．２２７．４２９およびビーズリ−等（Ｂｅ ａｓｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　）のランセット（Ｌａｎｃｅｊ：　）、１９８１． １１２９．１１月２１日〕。

ＨＢＶのゲノムによってコードされる免疫マーカーは表面抗原（ＨＢｓＡｇ　） 　、コア抗原（ｌｌＢｃＡｇ　）　、コアー誘導抗原（ＨＢｅＡｇ）および上記 モリアルティー等によって報告されたいわゆるＨＢｘＡｇを含む。ｔｌＢｓＡｇ −特異抗体はＨＢＶ感染に対して防禦性であるから、慢性キャリヤーの血漿中に 存在するウィルスを含まないＨＢｓＡｇ含有エンベロープはＨＢＶワクチン源と して有効である。

ＨＢｓＡｇはｊ２５と命名された主要ポリペプチドとＣＰ２８と命名されたその グリコジル化形のものから構成される〔ベダーリン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　）等、 プロシーディンゲス　オブ　ザ　ナショナルアカデミ−オブ　サイエンス（Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）、ｔＪｓＡ、１９７７．１±、 １５４０）　。ｌｌＢｓＡｇのＰ２５ポリペプチドの完全な２２６アミノ酸配列 が部分アミノ酸配列データおよびこのポリペプチドをコードするウィルス遺伝子 （Ｓ）のヌクレオチド配列から推定されている〔バレンツェラ（Ｖａｌｅｎｚｕ ｅｌａ）、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、１９７９．２８０．８１５；バセッ ク（Ｐａｓｅｋ　）等、ネイチ−？　−（Ｎａｔｕｒｅ）、１９７９．２８２． ５７５；およびチャルネイ・（Ｃｈａｒｎａｙ　）等、ヌクレイツク　アシッズ 　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）、１９７９．１．３５ ３〕。

歴史的にはＨＢｓＡｇと結合した付随的を高分子量ポリペプチドがＰ２５および ＧＰ２８の凝集体であると考えられていた。しかしながら、Ｐ２５は大きな読取 り枠（ＯＲＦ）の第３の可能な翻訳開始部位ではじまっていて、プレーＳ領域と 呼ばれる１６３または１７４コドン（サブタイブー依存性）による相ではじまっ ている。チオライス（Ｔｉｏｌｌａｉｓ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　） 　、１９８０．２１３．４０６参照。

ＨＢＶ−関連の３３〜３６キロダルトン糖タンパク（ＧＰ３３）がスティソベ＆ ゲルリッヒ（Ｓｔｉｂｂｅ　＆　Ｇｅｒｌｉｃｈ）　Ｃジャーナルオブ　ヴイロ ロジ−（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、）、１９８３．４６．６２６〕によって報告されて おり、またＧＰ３３の配列がＯＲＦの第２の翻訳開始シグナルではじまっている ことを示唆した。これは第３の翻訳開始シグナルの５５コドン上流側にある〔カ タネオ（Ｃａｔｔａｎｅａ　）等、ネイチ−？　（Ｎａｔｕｒｅ　；　ａンドン ）、１９８３．３０５．３３６〕。また、ＧＰ３３は、現在ではプレー５（２） 領域と呼ばれているものにコードされたアミノ末端の５５アミノ酸残基とＰ２５ 配列とからなっていることが報告されている〔上記のスティッペ＆ゲルリッヒ（ Ｓｔｉｂｂｅ　＆　Ｇｅｒｌｉｃｈ）の文献；およびマチダ（Ｍａｃｈｉｄａ　 ）等、ガストロエンチロール（Ｇａｓｔｒｏｅ’ｎｔｅｒｏｌ、　）、１９８４ ．８６．９１０〕。

この報告を支持するものとして、ニューラス（Ｎｅｕｒａｔｈ　）　等は、サイ エンス（’５ｃｉｅｎｃｅ　）、１９８４．２２４．３９２において、プレー５ （２）領域の２６アミノー末端アミノ酸残基を包含するペプチドの合成を報告し た。彼等は抗−ペプチド抗体がＧＰ３３と反応することを報告した。最近、第１ の翻訳開始部位からコードされた生成物がＰ３９／ＧＰ４２と同定され、これは Ｇ　Ｐ３３配列と、プレー５（１）領域におけるゲノムによってコードされたア ミノ−末端の１０８〜１１９アミノ酸残基からなっている〔ヘールマン（ｆｌｅ ｅｒｍａｎｎ　）等、ジャーナル　オブ　ウ゛イロロジー（Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、）、１９８４．５２．３９６〕。

プレーＳ領域が記載したｌ−（Ｂ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列のすべての中におよび生 育を通してずっと保存されているという事実は、この領域に対するある機能的な 役割を示唆している〔ラオブ（Ｌａｕｂ　）等、ジャーナル　オブ　ヴイロロジ ー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）、１９８３．４８．２７１〕。この解釈は、ＧＰ４２お よびＧＰ３３ポリペプチドが、血液中の微量のもしくは非感染性ピリオンをもつ キャリヤーとは逆に、ウィルス血症性キャリヤー中に優先的に現れるようにみえ るという観察によって強く支持される〔上記スティンベ＆ゲルリッヒＣ３ｔｉｂ ｂｅ　＆　Ｇｅｔｌｉｃｈ）の文献；およびヘールマン（）Ｉｅｅｒｍａｎｎ　 ）等の文献〕。このことは、ウィルス複製とｌｌＢｓＡｇの高分子量ペプチド合 成との間に相関関係があることを示唆している。

また、ウィルス付着を媒介するとされている重合ヒトアルブミンに対する受容体 は、ＧＰ３３上に局在化されていることが報告されている〔マチダ（Ｍａｃｈｉ ｄａ　）等、ガストロエンチロール（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ、　）、１９ ８２．８５，３２０〕、ＨＢＶワクチン開発および免疫−媒介ウィルスクリアラ ンスの機構に関するこれら最近の発見の意味は明らかであり、以下に議論される ような、ｆｌＢｓＡｇのＳ−およびプレー５（２）にコードされたＧＰ３３ポリ ペプチドに対する免疫応答の研究を促している。

発明の簡単な概要 本発明はポリペプチド立体配座−独立抗原を目的とするものであり、該抗原は、 立体配座−依存抗原決定基および少なくとも１種の立体配座−独立抗原決定基を 含むタンパク抗原をコードするゲノムによってコードされた単一の分子である。

該ポリペプチド抗原は単一のタンパク抗原分子を作ることにより得られる。この 抗原分子は立体配座−依存抗原決定基のアミノ酸残基配列およびエピトープと、 立体配座−独立抗原決定基のアミノ酸残基配列およびエピトープとを含んでいる 。有効量の変性剤、例えば界面活性剤とシスチンのジスルフィド結合開裂剤（還 元剤）との混合物などを、水性媒質中でタンパク抗原と混合する。

該混合物を、該変性剤が実質的に立体配座−依存抗原決定基を変性し、かつ以下 のようなポリペプチド抗原を形成するのに十分な予め定められた時間維持する。

該ポリペプチド抗原は（ｉ）立体配座−独立抗原決定基のアミノ酸残基配列とエ ピトープを含み、かつ輸ｉ）立体配座−依存抗原決定基のアミノ酸残基配列をも つがエピトープをもたない。こうして調製したポリペプチド抗原を次に回収する 。

好ましい態様においては、タンパク抗原は３４キロダルトンポリペプチドを含む Ｈ８ｓＡｇ粒子、例えばチャイニーズハムスターの卵巣細胞内で、形質転換され た肝炎Ｂウィルスのプレー５（２）およびＳ領域のゲノムによって生成されたＨ ＢｓＡｇ　／　Ｐ　３４粒子である。この抗原の立体配座−独立決定基とプレー ５（２）領域であり、一方立体配座一依存決定基はＳ領域である。

立体配座−独立抗原決定基に対する抗体の存在または立体配座−独立決定基のエ ピトープを含む抗原に対する抗体の存在を調べるためのサンプルの固相免疫測定 用診断系は本発明のもう一つの局面を構成する。本発明の診断系は少なくとも１ つのコンテナを含み、該コインナには固体担体として固体マトリックスに結合し た有効量のポリペプチド抗原が含まれている。該抗原は（ｉ＞立体配座−依存抗 原決定基のアミノ酸残基配列を含み、該決定基のエピトープに乏しく（従って、 該決定基に対する抗体は結合しない）、かつ（１１）立体配座−独立抗原決定基 のアミノ酸残基配列およびエピトープを含む（従って該決定基に対する抗体と結 合する）。

抗体を検出するのに使用する診断系は第２のコンテナを含むことが好ましい。こ のコンテナは、立体配座−独立決定基と測定すべきサンプルからの抗体との免疫 反応を検知できる指示手段の有効量を含んでいる。抗原を検出するのに使用する 診断系は以下のような第２のコンテナを含むことが好ましい。即ち、第２のコン テナは、立体配座−独立決定基のエピトープと、測定すべきエピトープと免疫反 応しかつこれと結合する所定量の公知の抗体とを含む。また、第３の以下のよう なコンテナを含むことが好ましく、これは上記と類似の指示手段を含むものであ る。

固相測定法もまた本発明の目的である。一つの方法は、測定すべきサンプル中の 、立体配座−独立抗原に対する抗体の存在を、好ましくは立体配座−依存抗原に 対する抗体の存在下で検出するものであり、以下の各工程を含む。まず、固体マ トリックスに固定された有効量のポリペプチド抗原を含む固体担体を作成する。

この固定化ポリペプチド分子は（ｉ）立体配座−独立抗原決定基のアミノ酸残基 配列およびエピトープを含み、がっ（ｉｉ　）立体配座−依存抗原決定基のアミ ノ酸残基配列を含むが、該抗原決定基のエピトープに乏しい。この固体担体と、 立体配座−独立抗原決定基に対する抗体を測定すべき液体サンプルのアリコート とを混合して、固体／液体相混合物を作製する。この混合物を、立体配座−独立 抗原決定基に対する抗体が、固体担体の立体配座−独立抗原決定基と免疫反応し 、かつこれと結合するのに十分な予め定められた時間維持する。次いで、固相と 液相とを分離し、その後該固体担体に結合している抗体の存在を測定する。この 測定は、一般には指示手段を用いることによって行われ、該指示手段は固体担体 に結合している抗体の存在を検知するものである。

もう一つの方法は測定すべきサンプル中の抗原エピトープの存在を検出するもの である。このエピトープは、立体配座−独立抗原決定基のエピトープと免疫反応 し、かつこれと結合する抗体と免疫反応し、かつ結合する。この方法は以下のよ うな諸工程を含む。上記測定において作製したような固体担体を作製する。測定 すべきサンプルのアリコートを所定量の公知の抗体と混合して液相混合物を形成 する。ここで該公知の抗体は測定される抗原エピトープと免疫反応し、かつこれ と結合し、ま元立体配座−独立決定基のエピトープ°と免疫反応し、かつこれと 結合するものである。

この液体混合物を、上記公知の抗体が測定される抗原エピトープ七免疫反応し、 かつこれと結合するのに十分な予め決められた時間維持する。その後、該液体混 合物を固相と混合して、固体／液体相混合物を形成する。この混合物を、上記公 知の抗体が該固体担体の抗原決定基のエピトープと免疫反応し、かつこれと結合 するのに十分な予め決められた時間維持する。次いで、固体／液体混合物を分離 して、該固体担体に結合している抗体の存在量を測定する。測定された結合抗体 の量と、測定サンプルのない状態で結合した公知の抗体のコントロール量との間 の差は、測定サンプル中に抗原エピトープが存在していることを示している。

図面の簡単な記載 この本発明の開示の一部となる添付図面において、第１図は比較としてのインビ ボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）による抗−８および抗−プレー５（２）抗体産生を説明す る３つのグラフを含む。図に示したＢＩＯｌＢｌｏ、Ｄ２およびＢＩ　Ｏ，Ｓ　 （９’Ｒ）系のマウスを１群当たり５匹含む群を、形質転換されたチャイニーズ ハムスターの卵巣（ＣＨ○）細胞から得たｔｌＢｓＡｇ／　Ｐ　３４の完全フロ インドアシュパン）　（ＣＦＡ）溶液１μｇを腹腔内（ｉ、ｐ、）投与すること により免疫した。ＣＨＯ由来のｆｌＢｓＡｇ粒子中のＰ３４の相対量は３５％で あり、プレー５（２）領域はＰ、３４の約２５重量％を示した〔ミッチェル（Ｍ ｉｃｈｅｌ）等、プロシーディンゲス　オブ　ザナショナル　アカデミ−オブ　 サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

１μｇというＨＢｓＡｇ／　Ｐ　３４の投与量は０．９１３μｇのＳ領域のタン パクおよび０．０８７μｇのプレー５（２）領域のタンパクと等価である。

ＩｇＧ抗体はＳ領域に特異的に応答しく・：　ｌｌＢｓＡｇ／　Ｐ　２５につき 測定）、Ｓ＋ブレー５（２）領域（○：　ｌｌＢｓＡｇ／　Ｐ　３４につき測定 ）は固相放射性免疫測定法（ＲＩＡ）により第１回の免疫後１０日および２４° 日並びに第２回の免疫（２°）後２週間の時点で測定した。該第２回目の免疫は 、以下に詳しく述べるように、ミリッヒ＆チザリ（ｔＪｉｌｉｃｈ　＆　Ｃｈｉ ｓａｒｉ）によるジャーナル　オブザ　イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、） 、１９８２．１２９．３２０に記載された方法を用いて、不完全フロインドアジ ュバント（ＩＦＡ）中の’ＡｆＪ１の免疫原で行った。比較のために、破線（■ ）はＣＦＡ中の４μｇのＨＢｓＡｇ／　Ｐ　２５でｉ、　ｐ、投与で免疫したマ ウスの応答を表す。抗−ＨＢｓの力価は前免疫血清のカウントの２．５倍となる ように最大希釈として表わした。

第２図は、比較のためのＢ１．０．Ｓ、、ＢＩ　Ｏ，ＢＲおよびＢ１０゜Ｍ系マ ウスによるインビボでの抗−８および抗−プレー５（２）領域抗体産生を説明す るための３つのグラフを含む。上記種のマウスを１群当たり”５匹含む群を、第 １図で記載したように免疫し、血清を分析した。

第３図は、抗−プレー５（２）抗体応答の特異性およびＨ−２制限を説明するた めの３種の棒グラフを含む。Ｈ−２コンジエニツク系ネズミをＣＦＡ中の１μｇ のＨＢｓＡｇ／　Ｐ　３４で免疫し、免疫後２４日目の血清を、ＨＢｓＡｇ　／ 　Ｐ　３４のプレー５（２）領域、プレー　Ｓ　（２）ペプチドおよびＨＢｓＡ ｇ　／　Ｐ　２５に対して特異的なＩｇＧ抗体につきＲＩＡ法によって分析した 。

本発明のプレー５（２）領域特異的ＲＩＡは固相還元かつ変性ｆｌＢｓＡｇ／　 Ｐ　３４粒子ＣＨＢｓＡｇ／Ｐ３４　（ＳＤＳ／２ＭＥ）］を用いて開発した。

簡単にいえば、ＨＢｓＡｇ／　Ｐ　３４を、（最終濃度２％のドデシル硫酸ナト リウム（ＳＤＳ）および２％の２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）の混合物で ３７℃にて２時間処理し、ＰＨ９，６の０．０１Ｍ重炭酸塩バッファーで希釈し 、微量滴定プレートに一夜塗布し、チザ’Ｊ　（Ｃｈｉｓａｒｉ　）のジャーナ ル　オブ　ザイムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、１９８２．１２９．１ ３０に記載の標準的なＲＩＡ測定で使用した。この処理はＳ領域の抗原を９０％ 以上減少したが、プレー５（２）領域の抗原には何ら影響を与えなかった。

１ｉＢｓＡｇ／　Ｐ　２５に対して生成したグループ（抗−ＨＢｓ／ａ）および サブタイプ−特異的（抗−ＨＢｓ／ｙ）抗血清も示されている。抗−ＨＢｓ力価 は、前免疫血清のカウントの２．５倍となるような最大希釈のｌｏｇ、の逆数と して表わした。各系統のＨ−２ハブロタイブが示されている。

第４図は抗−天然ブレー５（２）および抗−プレー５（２）ペプチド抗血清を比 較する、競合抗体阻害測定を説明するための２つのグラフを含む。グラフ（ａ） において、固相−固定化ｔｌＢｓＡｇ／　Ｐ　３４を、マウス抗−天然ブレー５ （２）産生抗体の希釈液と混合し、約１８時間（−夜）、４℃にて維持（前もっ てインキュベートした）した。制限された量（１：　５０００）の免抗−ブレー ５（２）ペプチド二産生抗体を添加し、　＋２５Ｉで標識した抗−免１ｇＧを加 え、阻害の程度を測定した。）ＩＢｓＡｇ／　Ｐ　２５　（○）に対する抗体は 対照として用いた。グラフ（ｂ）において、固相−固定化ＨＢｓＡｇ／　Ｐ３４ を免抗−ブレー５（２）ペプチド−産生抗体（・）の希釈液と、約１８時間（− 夜）、４℃にて前インキュベートした。制限された量（１：５００）のマウス抗 −天然プレー５（２）を加え、次いで＋２５Ｉで標識した抗−マウスＩｇＧを加 え、阻害の程度を測定した。Ｓ領域合成ペプチド（○）に対する抗体はコントロ ールとして使用された。

第５図はＨＢｓＡｇ粒子上のコードされたプレー５（２）領域決定基およびプレ ー５（２）合成ペプチドの検出を示すグラフである。阻害抗原として、種々の濃 度のＨＢｓＡｇ／　Ｐ　３４　（・）、ＨＢｓＡｇ／　ｐ２５（○）、ＨＢｓＡ ｇ／Ｐ２５／Ｐ３４　（■；痕跡量のＧＰ３４を含む血清由来の）ＩＢｓＡｇ　 ）および合成プレー５（２）ペプチド（ロ）を、一定希釈率（１：５００）のマ ウス（ＢＩＯ）抗−プレー５（２）抗血清と共に、約１８時間（−夜）前インキ ュベートした。

次いで、抗体−抗原混合物を固相）ＩＢｓＡｇ／　Ｐ　３４　（０，１ｐ　ｇ　 ／ウェル）に加え、阻害の程度を各免疫反応に対して測定した。

第６図は、ｔｌＢｓＡｇ／　Ｐ　２５およびｔｌＢｓＡｇ／　Ｐ　３４感作によ り誘発されるＴ細胞増殖応答を説明するための２つのグラフである。

Ｃ，Ｈ，Ｑ７ウスの後部足踵に、ｌｌＢｓＡｇ／Ｐ２５　１６１−１ｇのＣＦＡ 液（グラフ（ａ））またはＨＢｓＡｇ／　Ｐ　３４　４　Ａｔ　ｇのＣＦＡ液（ グラフ（ｂ））のいずれかで免疫した。免疫後８日目に膝後面のリンパ節（ＰＬ Ｎ）細胞を採取し、種々の濃度の）ＩＢｓＡｇ／　Ｐ　３４（・）、ｔ（ＢｓＡ ｇ／　Ｐ　２５　（○）、ｔｌＢｓＡｇ／　Ｐ　２５　／　Ｐ　３４　（−）ま たは媒体のみと共に４日間培養した。増殖はＤＮＡ中への［：３Ｈ］−ｒｄＲの 取込みによって決定し、バックグラウンド（△ＣＰＭ）について調整した、１分 当たりのカウント数（ＣＰＩわとして表わした。

第７図は比較としてのＳ領域−特異的およびプレー５（２）領域−特異的Ｔ細胞 増殖応答を示す２つのグラフを含む。Ｈ−２コンジエニツクＢＩＯマウス（グラ フａ）およびＢ１０．Ｄ２マウス（グラフｂ）をＣＦＡ中の４ｐｇのＩ（ＢｓＡ ｇ／　Ｐ　３４で免疫した。

免疫後８日目に、ＰＬＮ細胞を採取し、示されたｔｌＢｓＡｇ処方物と共に、第 ６図におけるように４日間培養した［Ｐ３４（・）、Ｐ２５／Ｐ３４　（■）、 Ｐ２５　（○）または媒質のみ〕。増殖はＤ　Ｎ　Ａ中への［３ｌ−１１−Ｔｄ Ｒの取込みによって決定し、ＣＰＭで表わし、バックグラウンドにつき補正した （八ＣＰＭ）。

第８図は、比較としてのＳｌａ域−特異的およびプレー５（２）領域−特異的Ｔ 細胞増殖応答を示す２つのグラフを含む。第７図におけるように、Ｈ−２コンジ ェニックＢ１０．Ｓマウス（グラフａ）およびＢ１．０．ＢＲマウス（グラフｂ ）を免疫し、Ｔ細胞増殖応答を決定し、表示した。

第９図は、ミッチェル（Ｍｉｃｈｅｌ）等により、ブロシーデインダス　オブ　 ザ　ナショナル　アカデミ−オブ　サイエンス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）、ＵＳＡ、１９８４．８１．７７０８に 記載されたようなプラスミドｐＳ　Ｖ　Ｓ　ｄｈｆｒの模式的表示である。

本発明は数種の利益並びに利点を提供する。

本発明の利点の一つは、立体配座−独立抗原決定基に対する抗体測定用の手段を 提供し得ることであり、ここでは立体配座−独立並びに立体配座−依存抗原決定 基両者のアミノ酸残基配列を含む単一のポリペプチド抗原を使用する。

本発明のもう一つの利点は、立体配座−独立抗原決定基に対する抗体を、立体配 座−依存抗原決定基に対する抗体の存在下で測定し得ることであり、これら両決 定基は同一のタンパク質中に存在している。

本発明の特別な利点は、臨床的に重要かつ科学的に興味深いＳおよびプレー５（ ２）抗原決定基に対する、後者の測定法の証明である。

本発明の更に別の利点は、当業者には本発明の以下の詳細な記述並びにそれに付 随する特定の態様を参照することにより明らかとなるであろう。

本発明をより一層詳細に記載するに先立ち、ここで使用するいくつかの用語およ び句を定義する。

抗体−一抗原リガントと免疫反応し、かつこれと結合して免疫反応体を形成する Ｂ細胞によって産生される受容体分子。

抗原−一抗体と免疫反応し、かつこれによって結合されて免疫反応体を形成する リガンド分子であって、時として抗体養産生する免疫原となる。

抗原決定基（決定基）−一抗原を含む分子の領域であって、抗体は該抗原と共に 免疫反応体を形成する。

エピトープーー抗体と反応する抗原決定基の特異的部分。また、該決定基の免疫 支配部分も呼ばれる。

アミノ酸残基配列−一ペプチド結合によって一緒に結合されているアミノ酸残基 の特定の秩序立った配置。

タンパク抗原−一比較的高分子量の、例えば約１０キロダルトンより大きなアミ ノ酸残基配列であって、これは単一のタンパク、タンパク−ペプチド融合生成物 、配列から１もしくは２以上のタンパク中に存在するアミノ酸残基が欠落したタ ンパク状実在物などであり得る。

ポリペプチド抗原−一タンパク抗原から作られた本発明の抗原。

ペプチドまたはポリベブチドー−これらは互換的に使用され、比較的低分子量の 、例えば約２１０ダルトン〜約１０キ。ロダルトンのアミノ酸残基配列を意味す る。

立体配座−独立抗原決定基−−抗体と免疫反応し、かつ結合する抗原決定基が、 主としてそのアミノ酸残基配列に依存しており、かつあるとしてもほんのわずか にその三次元、第三構造に依存する該決定基を意味する。従って、このような決 定基はどちらがといえば線形である。これらの決定基は、またしばしばそのエピ トープ同様にシーケンシャルといわれる。

立体配座−依存抗原決定基ｍ＝抗体と免疫反応し、かつ結合する抗原決定基が、 そのアミノ酸残基配列および三次元構造、即ち第３構造の両者に依存している基 、即ち抗体と免疫反応し、がっ結合する抗体決定基が、例えば変性などによるそ の三次元、第三構造の変化によって実質的に破壊されてしまうものである。従、 って、このような決定基はどちらかといえば非線形であり、典型的には“ループ 構造を形成する工もしくはそれ以上のシスチンジスルフィド結合で結合されてい る。これら決定基は、またそのエピトープ同様に、しばしばノンシーケンシャル といわれる。

本発明はポリペプチド立体配座〜独立抗原決定基を意図しており、これは該決定 基並びに立体配座−依存抗原決定基をコードするゲノムによって・コードされる 。このペプチド抗原の製法並びにその使用も本発明の目的であり、例えば固体担 体としての固体マトリックスに固定された該ポリペプチド抗原を利用する診断系 などを目的とする。

本発明は、肝炎Ｂウィルス（ＨＢＶ）ゲノムによってコードされた配列をもつ一 つの特定の抗原を利用する診断法に基づき記載される。しかしながら、特別な典 型的ポリペプチド抗原に関連して記載される態様は一般性あるものと信する。し かも、本発明は立体配座−独立抗原決定基および立体配座−依存抗原決定基を含 む単一のタンパク抗原から調製したポリペプチド抗原を利用する実質的に任意の 診断法に適用し得るものである。

本発明はタンパク抗原として上記のＨＢｓＡｇ／　Ｐ　３４粒子を使用するが、 これはミッチェル（１，（ｉｃｈｅｌ）等がプロシーディングスオブ　ザ　ナシ ョナル　アカデミ−オブ　サイエンス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）、１９８５．１上、７７ｏ８に記載したよ うな形質転換されたＣ　ＨＯ細胞によって産生される。この研究で使用した粒子 はミッチェル等により提供されたものであり、上記のミッチェル等の論文に詳し く記載されているようにして調製し得る。しかしながら、簡単にいえば、これら 粒子は以下のように調製されることが報告された。

ｐＳＶＳｄｈｆｒと命名されたプラスミドを形成し、これをジヒドロフオレート リダクターゼ（ＤＨＰＲ−）を産生じないチャイルーズハムスター卵巣（ＣＨＯ ）細胞を形質転換するために使用した。プラスミドｐＳ　Ｖ　Ｓ　ｄｈｆｒは、 マルビース（Ｍａ　ｌｐ　１ｅｃｅ　）等によってニュークレイツク　アシッズ 　リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　）、１９８３、土工、４６ ４５に報告されたプラスミドｐＳＶＨ４から由来し、双頭配列に２つの転写単位 を含んでいた。

第１の転写単位はＨＢ　Ｖ　２．３キロベース（ｋｂ）　Ｂｇｌｌ　ＩＩＡ　Ｄ ＮＡフラグメントからなり、プレー５（２）領域、Ｓ遺伝子、およびＨＢｓＡｇ 　ｍＲＮ　Ａポリアデニル化部位を含み、シミアンウィルス４゜（ＳＶ４０）初 期プロモータから下流側に配置されている。第２の単位Ｌｔ　Ｍ　Ｍ　Ｔ　Ｖ　 −Ｌ　Ｔ　Ｒプロモータ、ＳＶ４０　を−抗原スプライス部位、およびＳＶ４０ 初期ｍＲＮＡポリアデニル化部位の制御下におかれたネズミのＤＨＲＦ　ｃＤＮ Ａからなっている。ジー（Ｌｅｅ　）等のネイチャ（Ｎａｔｕｒｅ　；　ｏンド ン）、１９８１．２９４．２２８を参照のこと。

更に詳しくは、第９図に模式的に示したように、プラスミドｐｓＶｓｄｈｆｅ自 体は以下のものがらなっている。即ち、ＨＢＶセグメントに先行する５Ｖ４０Ｄ ＮＡは初期プロモータを有する３６０塩基対のＰｖｕｌｌ　／　Ｈｉｎｄ　ＩＩ Ｉフラグメントに対応し、これはＨｉｎｄＩ［Ｉ切断部位においてプラント末端 連結により、ＨＢＶがらの２．３　ｋｂ　Ｂｇｊ２１１−Ａフラグメントに融合 されたものであった。

ＤＨＦＲｃＤＮＡを側面に有しているＭＭＴＶおよびＳＶ４０はｐＭＴＶｃｌｆ ｈｒ中に存在するものである〔上記ジー（Ｌｅｅ　）等の文献〕。ｐＢＲ３２２ シーケンスはβ−ラクタマーゼ遺伝子およりＨＦＲ”″細胞が選択され、かつＨ ＢｓＡｇ／が放射性免疫測定〔アウスリア（ＡＵＳＲＩＡ）　Ｉ［、アボット　 ラボラトリーズ（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　、ノースジカゴ（ Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ　）、ＩＬＩを用いて、細胞培養上澄について測定 された。ＨＢｓＡｇ産生クローンは遺伝子増幅に対して選択され、メトトレキサ ント耐性細胞を選択した。３７ＢＡ５Ｒ５０と名付けられたクローンが後の更な る研究のために選ばれた。

ＣＨＯＤＨＦＲ−細胞はプラスミド５ＶＳｄｈｆｅで形質転換され、約２２ｎｍ の径をもつ粒子を産生じ、該粒子はヒト血清中に見られたｔｌＢｓＡｇ粒子と同 じ塩化セリウム中での密度および径を有していた。この粒子は、夫々２２．２６ および３４キロダルトンの分子量を有する３種のタンパク質を含んでいた。２種 の低分子量のタンパク質がＳ遺伝子によってコードされた領域の２形態であると 報告され、一方分子量３４キロダルトンの物質はＳ領域およびプレーＳ領域の一 部の遺伝子両者によってコードされたものであると報告された。これら粒子を、 本明細書ではＨＢｓＡｇ／　Ｐ　３４とする。というのは３４キロダルトン物質 が存在するがらである。

また、ミッチェル（Ｍｉｃｈｅｌ）等は、これら粒子が、重合ヒト血清アルブミ ン（ｐＨ３Δ）に対する受容体を含む形質転換されたＣＨＯＤＨＰＲ−によって 作られることを報告した。また、これがマウスにおける受容体部位に対する抗体 産生を誘発させるのに利用できることも報告した。本発明者等は、これらの粒子 を用いて、ここでプレー５（２）領域のアミノ末端２６残基に対する抗体の初期 出現、即ち免疫後初期段階での出現に関連して述べるように、これら粒子のプレ ー５（２）領域の免疫原を特徴付けした。また、これら粒子を使用して以下に述 べるポリペプチド抗原（ＩＩＢｓＡｇ／Ｐ３４　（ＳＤＳ／２ＭＥ））を調製し 得ることをも見出した。

立体配座−独立抗原決定基〔プレー５（２）領域〕のアミノ酸残基配列およびエ ビ、トープ並びに立体配座−依存抗原決定基（Ｓ領域）のアミノ酸残基配列およ びエピトープを含むｔｌＢｓＡｇ／　Ｐ　３４粒子は、ここで記述する発明で必 要とするタンパク抗原ではないが、その態様を説明丈るために使用し得る他の実 在物の代表的なものである。ＨＢＶプレー５（２）領域またはプレー５（２）抗 原エピトープに対する抗体の存在の検出のための決定にとって、少なくとも３種 の他の物質をタンパク抗原として使用することができる。）ＩＢｓＡｇ／　Ｐ　 ３４粒子などの、これら物質の各々は、構造サブユニットとして複数の抗原タン パク分子を含む。

５このような物質の１つと棒状粒子であって、ラッカーマン（Ｚｕｃｋｅｒｍａ ｎ　）によりヘパティティス＆ブラッド　トランスヒユージョン（Ｈｅｐａｔｉ ｔｉｓ　ａｎｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　）　、ジー、ニス。

フィアス（Ｖｙａｓ　）等編、グリュン＆ストラットン（Ｇｒｕｎｅ　＆５ｔｒ ａｔｔｏｎ）　、＝−Ｌ−ヨーク、第３０章（１９７３）に記載の論文およびそ こで引用された参考文献で議論されているように、ｌｌＢｓＡｇ／ポジティブフ ラグメントと呼ばれる。このフラグメントは径約２０ｎｍを有し、かつ長さは５ ０ｎｍ以下から２３０ｎｍまでの範囲で変化することを報告している。これらフ ラグメントは非感染性であり、ゾーン（Ｄａｎｅ　）粒子として知られる感染性 ＨＢＶ実在物と同レベルにおいて表現されたＳおよびプレー５（２）領域を含ん でいる。

ゾーン粒子は多層法であり、平均直径４２ｎｍを有していると報告されている。

ゾーン粒子は本発明で使用できるが、好ましくない。というのは、これらが著し く感染性であるためである。

ＨＢ　ＶコードＳおよびプレー５（２）領域に対する抗体研究のために、本発明 で有用な第３の物質は平均粒径約２２ｎｍの球状粒子であり、これは、ＨＢ　Ｖ 感染を受けた患者の血液および血清中に見出される。この径２２ｎｍの粒子はそ れ自体感染性ではないが、表現されたＳ領域よりもより低い量の表現プレー５（ ２）領域を示し、ゾーン粒子、上記のＣＨＯ−由来のｆｌＢｓＡｇ／　Ｐ　３４ 粒子またはｔｌＢｓＡｇ−ポジティブフラグメントよりも多い。

立体配座−独立および立体配座−依存抗原決定基を含む他のタンパク抗原が知ら れており、これらは免疫原として合成または開裂により得られたポリペプチドを 用いて行われた公開された研究を参照することにより見出し得る。該免疫原によ りタンパク分子の三次元決定基に対する抗体が産生される。例えばアーノン（Ａ ｒｎｏｎ　）等のブロシーデインダス　オブ　ザ　ナショナル　アカデミ−オブ 　サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　、ＵＳＡ　 。

１９６８．６２．１６３に発表された論文では、いわゆる１リゾチーム　ループ が立体配座−依存抗原決定基であることが示されプこ。

極＜１υ近、グリーン（Ｇｒｅｅｎ　）等はセル（Ｃｅｌｌ）、１９８２．２８ ．４７７に、インフルエンザウィルスＸ４７の赤血球凝集素分子（ｉ（Ａｌ）の 大部分を覆っているシーケンスをもつ線状ポリペプチドの合成を発表している。

これらの研究者は抗体産生を誘発するために合成ポリペプチドを用いた。彼等は ＩＡＩのカルボキシル末端領域に対する抗体の良好な結合性を報告しており、該 ＨＡＩは比較的線状で立体構造上の制限には無関係である。この結論はＸ−線分 析に基くものである。また、アミノ末端から１３５〜１４９残基離れた位置に局 在しているＨΔ■のより立体構造的に歪んだ“ループ領域に対する抗ポリペプチ ド抗体の低い結合性をも報告している。この報告から、ループ領域が立体配座− 依存抗原決定基を構成し、一方カルボキシ末端領域が立体配座−独立抗原決定基 を構成するものと結論できる。

タンパク抗原の立体配座−依存抗原決定基のエピトープがポリペプチド抗原中に おいて乏しく（欠けており）、一方立体配座一依存および立体配座−独立決定基 に元々存在していたアミノ酸残基配列は存在する。同様に立体配座−独立エビト ープのエピトープも存在する。このポリペプチド抗原は立体配座−依存エピトー プの変性によって調製することが有利である。

立体配座−依存決定基およびエピトープの存在が、通常抗体との反応によって同 定されていることは注目すべきことである。しかしながら、このような領域は、 また夫々変性前後のタンパク抗原およびポリペプチド抗原のＮＭＲスペクトルま たはＸ−線スペクトル変化によっても確認することができる。更に、変性された タンパク質は、ゲル電気泳動での易動度の差、円偏光二色性スペクトル（ＣＤス ペクトル）および等電点の違いに基き未変性物質、即ち天然物質と区別すること ができる。更に、変性された物質は天然物質よりもより少量のシスチンジスルフ ィド結合を有し、かつより多量のシスティン残基（またはアルキル化システィン 残基）を有している。

タンパクの変性法は当分野で周知である。この変性は、エピトープの三次元構造 を水素結合およびイオン結合を壊すことにより変えることを含む物理作用並びに 共有結合を切断することを含む化学的作用を包含する。好ましい態様においては 、物理的および化学的変性両者を利用することによりポリペプチド含有抗原を調 製する。

本発明において有用な典型的なタンパク抗原はシスチンジスルフィド結合を含み 、この結合は立体配座−依存抗原決定基のエピトープに対して立体構造（三次元 構造）を付与するのに役立つ。

エピトープの立体構造に寄与する１または２以上のシスチンジスルフィド結合の 存在のために、変性剤は化学変性剤として水溶性シスチン−ジスルフィド結合切 断剤を含有する。

水溶性ジスルフィド結合切断剤は化学並びに生物化学分野では周知である。これ らの試薬は一般には還元剤と考えられており、アルカリ金属ボロハイドレートお よびシアノボロハイドレート、例えばナトリウムボロハイドレートおよびナトリ ウムシアノボロハイドレートなどを包含する。

チオール含有薬剤も有用である。この変性剤群はｐＨ値が７で電気的に中性であ る試薬および該ＰＨ値で電荷を保持する試薬を含む。電気的に中性な試薬の中に は、２−メルカプトエタノール、グリセロールモノ−チオグリコレート、ジチオ スレイトール、ジチオエリ）！Ｊｌ−−ル等が含まれる。ｐＨ値７で電荷を保持 する代表的なチオール含有薬剤としては、２−メルカプトエチルアミン、メルカ プト酢酸（チオグリコール酸）、３−チオプロピオン酸およびチオ乳酸、その他 これら酸のアルカリ金属塩、２−ヒドロキシアルキルアンモニウム塩およびアン モニウム塩、例えばナトリウムチオグリコレート、３−チオプロピオン酸アンモ ニウム、カリウムチオラクテート、チオグリコール酸ジ−イソプロパツールアン モニウム、チオ乳酸エタノールアンモニウム等が含まれる。

アルカリ金属およびアンモニウムの重亜硫酸塩およびチオ硫酸塩もシスチンのジ スルフィド結合も開裂させるのに有用である。

このような物質の代表としては、重亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸アンモニウム、 チオ硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウム等があげられる。　・ 水溶性シスチンのジスルフィド結合開裂剤はｐＨ値７において電気的に中性であ り、例えば、２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）が特に好ましい。以下に使用 される２ＭＥは、例示的な水溶性ジスルフィド結合開裂剤として使用される。

上記シスチンジスルフィド結合開裂剤は、通常のタンパクまたはポリペプチド関 連化学において使用される温度、反応時間および溶媒（水性媒質）の標準条件下 ではペプチド結合を開裂しない、ということは注目すべきことである。従って、 立体配座−依存および立体配座−独立双方の決定基のアミノ酸残基配列は依然と して存在し、即ちタンパク抗原が前記ジスルフィド結合開裂剤と反応した後もそ のまま変わらず存在する。

水素結合および／または残基間イオン結合を開裂させる物理的変性剤も好ましく は前記変性剤の一部である。尿素およびグアニジンのような比較的低分子物質が 水素結合およびイオン結合を開裂させるのに有用であるとして知られている。し かしながら、タンパク質およびポリペプチドの安定化をもたらす比較的大きな界 面活性剤分子を使用することが好ましい。

代表的な界面活性剤はアニオン系および非イオン系物質を含む。

該アニオン系界面活性剤は好ましくは分子のアニオン部としてスルフェート基ま たはスルホネート基および１０〜１８個の炭素原子（Ｃ，、−Ｃ，、）を有する 脂肪族鎖を含む。非イオン系界面活性剤は好ましくは、１０〜１８個の炭素原子 （Ｃ，、〜Ｃ＋ｅ）を有する脂肪族鎖と、重合度１〜１００のエチレンオキサイ ド単位または重合度６〜７５のエチレンオキサイド単位および非脂肪族鎖とを含 む。

スルフェート基を含む有用なアニオン系界面活性剤を例示すると、ドデシル硫酸 ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム（ＡＬＳ）、ラウリル硫酸カ リウム、デシル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、牛脂硫酸ナトリウ ム（牛脂から由来する硫酸化アルコール混合物）；１１〜１５個の炭素原子（Ｃ １゜〜Ｃ＋ｓ）を有するアルコールから成るポリエチレングリコールエーテル硫 酸のアルカリ金属塩およびアンモニウム塩、例えば１分子当たり１〜４の平均重 合度のエチレンオキサイド単位を有する炭素原子数１２〜１５（Ｃ，□〜Ｃ＋ｓ ）の脂肪族アルコール混合物の硫酸化ポリエチレングリコールエーテルのナトリ ウム塩、１分子当り１〜４の平均重合度のエチレンオキサイド単位を有する、炭 素原子数１２〜１３（Ｃ，、〜Ｃ５３）の脂肪族アルコール混合物の硫酸化ポリ エチレングリコールエーテルのナトリウム塩および、１分子当たり平均重合度１ 〜４のエチレンオキサイド単位を含む硫酸化エトキシルミリスチルアルコールの カリウム塩；エトキシルアルキルフェノールのアンモニウム塩およびアルカリ金 属塩、例えばエーテル成分が１分子当たり平均１個の反応エチレンオキサイド単 位を含むノニルフェニルエーテル硫酸のアンモニウム塩、ナトリウム塩またはカ リウム塩等が含まれる。

スルホネート基を含むアニオン系界面活性剤を例示すると、炭素原子数１０〜１ ８（Ｃｉ。〜Ｃ、、）の脂肪酸イセチオネートのアルカリ金属およびアンモニウ ム塩、例えば、ココイルイセチオネート（イセチオン酸のヤシ油脂肪酸エステル のナトリウム塩）、ラウロイルイセチオネートアンモニウム、オレイルイセチオ ネートナトリウム、Ｎ−ココイル−Ｎ−メチルタウレートカリウム（Ｎ−メチル タウリンのヤシ油脂肪酸アミドのカリウム塩）、混合した炭素原子数１４〜１６ （Ｃ，、〜ｃ１６）を有するオレフィンスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼ ンスルポン酸ナトリウム、デシルベンゼンスルホン酸カリウム等が含まれる。

有用なアニオン系界面活性剤は一般的に１分子当たり１〜約１００個の反応エチ レンオキサイド単位を含む。このような分子の代表的なものとして、エトキシ化 Ｃ０゜〜ｃ１．（炭素原子を１０〜１８個含む）脂肪族アルコール、例えば１分 子当たり、平均して約２．４．６．７．１０．１１．１３．１５．２ｏ、２７． ３０．４０．５０または１００個の反応エチレンオキサイド単位ヲ含ムステアリ ルアルコールのポリエチレングリコールエーテル；１分子当たり平均５．７．９ ．１２．２０，３０または４０個の反応エチレンオキサイド単位を含む混合物Ｃ Ｉｌ〜Ｃ８，（炭素原子を１１〜１５個含む）脂肪族アルコール；１分子当たり 平均１．２．４．５．６．１０．１２．１６．２０，２５．３ｏまたは４５個の 反応エチレンオキサイド単位を含むセチルアルコールのポリエチレングリコール エーテル；１分子当たり、平均１．３．５．７．９．１０．１３または４０個の 反応エチレンオキサイド単位を含むエトキシル化オクチルフェニルエーテル：１ 分子当たり平均１．２．４．５．６．７．８．９．１０，１１．１２．１３．１ ４．１５．１８．２０．２３．３０．４０．５０または１００個の反応エチレン オキサイド単位を含むエトキシル化ノニルフェニルエーテル；１分子当たり平均 ６．８．９．１０．１２．１４．１６．１８．２０．３２．４０または７５個の 重合、反応エチレンオキサイド単位を含むポリエチレンオキサイド（ポリエチレ ングリコール）等があげられる。

前記変性剤は好ましくは、前記界面活性剤とシスチンジスルフィド結合開裂剤と の混合物として使用される。前記立体配座−依存決定基を変性させ、そのエピト ープを除去し、一方で該決定基およびエピトープのアミノ酸残基配列を維持する のに有効な量の変性剤を、タンパク抗原と混合する。立体配座−依存決定基の変 性に使用する水性媒質中に存在する各々の成分の量は、使用するタンパク抗原の 種類および量の関数であると同様に、使用する試薬の種類の関数でもある。

所定の量のタンパク抗原に対する特異的かつ有効な変性剤量の決定は十分に生化 学分野における熟練者の技術範囲内である。しかしながら、一般的には、水性変 性媒質ｌ　ｍｌｌあたり約１ナノグラム（ｎｇ）〜１０ミリグラム（ｍｇ）のタ ンパク抗原濃度を有する水性変性組成物に対し、前記界面活性剤は約０．１〜１ ０重量％、好ましくは約１〜約５重量％存在し、かつ前記ジスルフィド結合開裂 剤は約０．１〜約１０重量％、好ましくは約１〜約５重量％存在する。前記ＨＢ ｓＡｇ／　Ｐ　３４粒子は約０．０３■／　ｍｌの濃度で変性された。

上述の有効量の変性剤とタンパク抗原との混合物は、前記決定基の前記エピトー プを変性し、かつ前記ポリペプチド抗原を形成するに十分な予め設定された時間 維持される。この変性に必要な正確な時間は、当業者が容易に決定し得るパラメ ータである。しかしながら、３７℃では約１〜約５時間の反応時間で通常は十分 である。

所定のポリペプチド抗原を、次いで従来の方法により回収し、乾燥する。この回 収は、カラムクロマトグラフィーなどの精製法により行ない、次いで凍結乾燥す る。更に好ましくは、前記ポリペプチド抗原は、ポリスチレンまたはポリ塩化ビ ニル製の微量滴定プレートのウェルのような固体マトリックスに固定して回収し た後に空気中またはオーブン中で乾燥する。

前記ポリペプチド抗原は、前記マトリックスに固定し、乾燥した状態で回収する ことが特に好ましい。この理由は、溶解した抗原における開裂したジスルフィド 結合が再酸化し、前に開裂したシスチンのジスルフィド結合を再形成し、それに より、もとのエピトープを再形成するからである。加えて、シスチン結合の還元 により形成されるシスティンメルカプタン基がヨードアセタミドなどを用いて行 なわれるアルキル化により、再酸化から保護されるような場合でさえも、最初に 存在したエピトープと実質的に同一のエピトープを水溶液中に再形成し得る。か くして、固体マトリックスへの固定および乾燥は、前記立体配座−依存決定基の エピトープを実質的に永久に変性させるために使用し得る。

固体担体としての固体マトリックスに固定された所定のポリペプチド抗原は、固 相免疫測定法において特に有用である。

前記抗原は、一般に水性媒質からの吸着により固体マ）　ＩＪソックス固定され るが、当業者により公知のいくつかの固定方法が使用できる。このような方法の 代表は、例えば架橋結合したデキストランまたはセルロース誘導体、ラテックス 粒子と関連して以下に述べるようなグルタルアルデヒド結合剤等のグルコース含 有マトリックスとシアノゲンブロマイドの反応により生成する反応性カルボキシ ル官能基とポリペプチドの反応である。

１つの代表的な固相免疫測定法は、例えばＨＢＶゲノムによりコードされたブレ ゛−Ｓ　（２）領域のような立体配座−独立抗原決定基のエピトープに対する抗 体の存在に対して行なわれるものである。このことは、第１図および第２図のグ ラフおよびこれらの図に関する■章Ｂの議論において示されている。前記固体担 体は、抗原エピトープの存在に対する固相免疫測定法に有用であり、該抗体エピ トープは例えばプレー５（２）エピトープのような立体配座−独立抗原決定基と 免疫反応し、かつ該決定基に結合する抗体と免疫反応しかつ該抗体に結合する。

このことは、第５図およびこの図に関する■章Ｂの議論において示されている。

有利な固体マトリックスはこの技術においては公知である。このような物質は、 セファデクス（５ＥＰＨＡＤＥＸ　）の商標でファルマーシア　ファイン　ケミ カルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　にュージャー ジー州、ビスカタウｚ　−（Ｐｉｓｃａｔｓｗａｙ、　ＮＪ）　３により販売さ れている架橋ブトストラン、アガロース、ガラスピーズ、ポリ塩化ビニル、ポリ スチレン、架橋アクリルアミド、ニトロセルロースまたはシートあるいはストリ ップのようなナイロンを支持体としたウェブ、または例えばポリスチレンあるい は塩化ビニル製の微量滴定板のウェル等をふくむ。

凝集型測定におてい有用なラテックス粒子も有用な固体マトリックスである。こ のような物質は、日本合成ゴム株式会社（日本、東京）により供給され、アニオ ン系石鹸に分散されているカルボキジ官能性粒子として記載されている。このよ うな粒子の代表的なものは０．３０８μの平均粒径を有し、かつ１個のカルボキ シ基当たり約１５〜約３０平方オングストロームの平均カルボキシ官能基分布を 有する。

使用の前に、前記粒子を、１，３−ジアミノ−２−プロパツールのようなジアミ ンと反応させて、遊離アミノ基を維持する一方、粒子のカルボキシ基との複数の アミド結合を形成する。該遊離アミンを、次いでグルタルアルデヒドのようなジ アルデヒドおよびポリペプチド抗原と反応させて、シップ塩基反応生成物を形成 する。このシッフ塩基反応生成物は、次いでホウ水素化ナトリウムのような水溶 性還元剤で還元されて、有用な固体担体を与える。

当業者等は、ここで使用しうる固相免疫測定法に対して、多くの方法があること を理解している。代表的かつ有用な固相測定法は、酸素結合イムノツルバント測 定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）および螢光免疫測定法（Ｆｌ Δ）を含む。これらの測定方法の各々は、単抗体法または二抗体法を使用し得る 。

これらの方法では指示手段が使用でき、これは免疫反応即ち、測定すべき抗体と 前記固体担体のポリペプチド抗原との結合を検出する。代表的な方法は、マッギ オ、「酵素免疫測定Ｊ　ＣＲＣプレス、オハイオ州、クリーブランド（１’９８ １年）、［Ｍａｇｇｉｏ。

Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｃ１ｅｖｅｌ ａｎｄ、　Ｏｆｆ　（１９８１）　〕、オ、、ｌ：　ｒ、、Ｆ　：＋”−ルドマ ン、「螢光抗体法」、アカデミツクプレス、二Ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｎｔ ｉｂｏｄｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ、　ＮＹ（１９８０）：］に説明され、公知である。放射線免疫測定は、 本研究において使用され、以下■章Ｂの結果において議論され、更に以下の議論 において示すように使用されうる。

概して、抗体検出に対する本発明の固相免疫測定は下記の工程を含む。すなわち 、 （ａ）　固体マトリックスに固定された本発明のポリペプチド抗原を有効景含む 固体担体を作製する。前述のように、ポリペプチド抗原は単一分子であり、＜１ ）ＨＢＶによりコードされたプレー　Ｓ　（２）領域のような立体配座−独立抗 原決定基のアミノ酸残基配列およびエピトープを含み、がっ（ｉｉ　）立体配座 −依存抗原決定基のアミノ酸残基配列を含むが該決定基のエピトープに乏しい。

（ｂ）　測定すべき液体サンプルを、固体担体と混合して、固相／液相混合物を 形成する。使用するサンプルを、ＨＢ、ＶによりコードされたブＬ／−Ｓ　（２ ）領域に対゛する抗体などの、立体配座−独立抗原決定基に対する抗体の存在に 関して測定し得る。

（Ｃ）　このようにして形成された前記固相／液相混合物を、立体配座−独立決 定基に対する抗体が、固体担体の抗原決定基と免疫反応し、かつ該決定基に結合 する（該決定基と免疫反応体を形成する）に十分な予め設定した時間維持する。

後固相を水洗し、立体配座−独立決定基に特異的に結合していない抗体が固相上 に存在しないようにする。

（ｅ）　結合した抗体、すなわち、特異的に前記固体担体に結合した抗体の存在 を測定する。結合した抗体の存在は、一般には測定される抗体のＦｃ部分に対し て信号を発するように結合した第２の抗体指示手段により、例えば前記信号がこ れら抗体に結合したヨウ素−１２５により与えられるγ−放射線により提供され るように測定される。前記信号手段は、前記立体配座−独立決定基に対して最初 に言及された測定すべき抗体への２番目の抗体の結合を示し、これによって、こ れら最初に言及した抗体の存在および量を信号で示す。

抗原エピトープの存在に対する本発明の固相免疫測定の工程は、上述と同様であ る。しかしながら、工程（ｂ）の測定すべき液体サンプルは前記立体配座−独立 決定基のエピトープと免疫反応し、かつ該エピトープに結合する既知抗体の予め 設定した量と混合し、液体の既知の抗体／サンプル混合物を形成する。この混合 は、一般には固体担体と液体サンプル゛の混合の前に行なわれる。前記液体混合 物を、既知の抗体がサンプル中に存在する抗原エピトープと免疫反応しかつ該エ ピトープに結合する十分な時間維持する。

前記液体の既知抗体／サンプル混合物を、次いで、前記固体担体と混合し、上記 工程（ｂ）において形成した混合物に類似の固相／液相混合物を形成する。続い て、前記抗体測定法に対する工程（Ｃ）、（ｄ）および（ｅ）に類似した操作を 行なう。上記、工程（ｅ）に類似した工程において測定した特異的に、結合した 抗体の量と前記既知の抗体により示された結合のコントロール量との差は、測定 される前記サンプル中の抗原エピトープの存在量を示している。結合した抗体の コントロール量の測定はかくして、本方法の別の工程を構成し、かつ工程（ｅ） と同様な該測定の前に行なわれうる。

立体配座−独立決定基のエピトープと免疫反応しかつ該エピトープに結合する前 記既知の抗体は、アミノ酸配列の点でここで使用されかつニューラス（Ｎｅｕｒ ａｔｈ）等の〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８４．２２４．３９２〕に よって述べられた、プレー５（２）領域のアミノ末端に対応する２６残基のペプ チドのような、立体配座−独立決定基のエピトープの配列に対応するペプチドで 免疫処置することにより得ることができる。加えて、第１図に関して述べるよう に抗ブレー５（２）領域を含むが、抗−８領域のないＨＢｓＡｇ　／　Ｐ　３４ によって誘発される１０日口の抗血清が使用される。

より詳しくは、既に述べたように、ＲＩＡは本研究においてはＨＢＶゲノムによ ってコードされたプレー５（２）領域のエピトープおよび立体配座−独立抗原決 定基に対する抗体の存在について測定するために使用した。ある場合には、抗プ レー５（２）抗体は抗−８抗体の存在下で測定し、これは、ヒトを含む臨床測定 においては通常の環境である。他の場合には、前記抗ブレー５（２）抗体は抗− ８抗体のないサンプル中で測定した。すなわち、アミノ末端の２６アミノ酸残基 のプレー５（２）ペプチドを免疫原として使用するか、または双方の領域を含む 免疫原（ＨＢｓＡｇ／　Ｐ　３４粒子）に対し最初の免疫応答の初期段階では、 抗Ｓ抗体は検出可能な量では存在していなかった。

代表的な免疫測定において固相として使用される固体担体は、ポリスチレンの除 去可能な平底型ＷＪ、量滴定ウェル〔バージニア州アレキサンドリアのグイナテ ック　ラボ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂ。

Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　ＶＡ）より販売されているリムーバウェルズ（ＲＥＭ ＯＶＡＩＩＩＥＬＬＳ　）　］の固体マトリックスであった。前に議論した２％ の２ＭＥおよび２％のＳＤＳを含む水性媒質中で変性されたＨＢｓＡｇ／　Ｐ　 ３４粒子はポリペプチド抗原として使用し、以後ｒ　ＨＢｓＡｇ／Ｐ３４．（Ｓ ＤＳ／２ＭＥ）Ｊとして示し、本発明の粒子を前駆体、タンパク抗原粒子と区別 した。前記ｌｌＢｓＡｇ／　Ｐ　３４（ＳＤＳ／２ＭＥ）粒子は、ウェルの底部 に、ＰＨ９，６の０．０１モル（Ｍ）重炭酸塩緩衝液中に２．５μｇ／ｍ！濃度 でＨＢｓＡｇ／　Ｐ３４　（ＳＤＳ／２ＭＥ）を含む５０μ！の水溶液を入れ、 かつ水を約１８時間（−夜）にわたって室温で蒸発させることにより、前記マト リックスに固定した。

次いで、ｐＨ７，２のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に１重量％のウシ血清アルブミ ン（ＢＳＡ）を含む水溶液を前記ウェルを洗浄するために使用した。この洗浄工 程によりウェル上の非特異的結合部位が遮蔽される（ウェルを急冷した）。前記 ウェルは使用前に、１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中に１０容量％の正常ヒト血清（ ＮＨ３）（ＰＢＳ／ＮＨ３／ＢＳＡ）をｌむ溶液５０ｕＡ’で洗浄シタ。

測定のため、Ｐ　Ｂ　Ｓ　／　Ｎ　ＨＳ　／　Ｂ　ＳΔ中に溶解した滴定用希釈 液中の測定すべきサンプル５０μβ（マウス血清）をプレートの個々のウェル中 で混合し、固体／液体混合物を形成した。これら混合物を、抗プレー５（２）抗 体が前記固体マ）　ＩＪソックス固定したポリペプチド抗原に結合するに十分な 予め設定した時間（３７℃で２時間）維持した（保温した）。前記固体／液体混 合物を次いで分離し、かつこの分離した固相をＰＢＳ中に１％のＢＳＡを含む水 溶液で洗浄した。

次いで、前記固体担体に結合した抗プレー３　（２）抗体の存在お　・よび量を 測定した。この測定は、５０μｌの適当に希釈した（　］、　／　３００〜１１ ５００）ヤギ抗−マウスＩｇＧまたはＴｇＭ抗血清〔メルンーラボラトリーズ、 バージニア州、スプリングフィールド（Ｍｅｒｃｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、　Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、　ＶＡ　）　］　、すなわち、固固体体に結合し た前記マウスの抗ブレー５（２）抗体と免疫反応し、かつ該抗体に結合する抗体 と混合して、第２の固相／液相混合物を形成することによってなされた。この第 ２の固相／液相混合物を、前記第２の抗体に対して少しの間、すなわち予め設定 した時間（３７℃にて９０分間）維持し、第１の抗体〔マウス抗−ブレー５（２ ）］と免疫反応乙、かつ該抗体に結合させた。前記固相および液相を分離し、か つ固体担体を洗浄し、非特異的に結合した抗体を除去した。

親和精製した豚抗−ヤギＩｇＧ　（ＳＡＧＧ）をベーリンガーマンハイム　バイ オケミカル社（インディアナ州、インディアナポリス）　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ ｒ　ｌＪａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉ ｓ。

ＩＮ＞１より購入した。マツコーナハイとディクソン（ＭｃＣｏｎａｈｅｙａｎ ｄ口１ｘｏｎ　）の〔インターナショナル　アーカイブ　オブ　アレルギー　ア プライド　イミュノロジー、（Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　ＡＩｌｅｒｇｙＡｐｐｌ 、Ｉｍｍｕｎｏｌ　）、１９６６．２９．１８５〕に記載のクロラミン−Ｔ法の 改良法を使用して、上記５ＡＧＧを１２５■で放射線標識した。

１分間当たり３．０〜３．３Ｘ１０’カウント（ＣＰＭ）を含む５０μｌの１２ Ｊ−３ＡＧＧ溶液〔第３の抗体、すなわち、指示手段として使用する前に工程（ ｅ）の信号手段に結合した第２の抗体〕をウェルに添加し、第３の固相／液相混 合物を形成した。この混合物を、前記第３の抗体が前記第２の抗体と免疫反応し 、かつ該抗体に結合するのに十分な、予め設定した時間（３７℃で２時間）維持 した。前記固相および液相を分離した。前記固相（ウェル）を洗浄し、非特異的 に結合した抗体を除去した。更に、自動ガンマ線カウンタ内に置き、カウントを 行なった。前免疫により示されるカウントの２．５倍のカウントを生じる最も高 い血清免疫希釈倍率が各々の免疫血清に対する力価と考えられる。これらの力価 はＩ　０ｇ２の逆数として表わされる。

当業者は、以前にまた以後に議論する結果において使用される第３の豚抗−ヤギ 抗体を常に使用する必要はない。■＋２５で標識したヤギー抗マウス抗体の使用 が信号として役立ちうる。しばしば、増巾剤などとも呼ばれる第３の抗体の使用 は、より高感度の測定をもたらす。

ＥＬ’ＩＳＡに対し２ては、信号手段として指示手段に結合される酵素の代表例 （第３の抗体、すなわち抗体増巾剤が使用されない場合は第２の抗体）はセイヨ ウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等を含む。これら酵素の各 々は、例えば、過酸化水素および０−フェニレンジアミンおよびｐ−ニトロフェ ニルホスフェートのような呈色試薬（基質）と共に使用される。例えば、ホスフ ァターゼの結合したヤギ抗−ヒト、ウサギ抗−ヤギおよびウサギ抗−マウス抗体 並びにペルオキシダーゼの結合したウサギ抗−ヤギ、ヤギ抗−マウスおよびヤギ ー抗−ヒＩ・抗体のような別の動物の抗体によって生成されたある動物の酵素結 合した抗体（結合体）は、シグマ　ケミカル　カンパニー、ミズージー州、セン トルイス（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　ｏｆ　Ｓｔ、　Ｌ ｏｕｉｓ、　ＭＯ，）など数社から市販品として入手できる。

同様な測定を、立体配座−独立決定基に対する抗体の存在を信号で知らせる指示 手段として、抗体に結合した螢光色素を使用して行なうこともできる。該螢光色 素は一般にイソチオシアネート基により、第３の抗体（すなわち、上記のような 第２の抗体）と結合して、複合体を形成する。代表的な螢光色素はフルオレセイ ンインチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンＢイソチオシアネート（ＲＩＴ Ｃ）およびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）を含む。

例えば、ＴＲＩＴＣ結合ヤギ抗−ヒト抗体並びにＦＩＴＣ結合ヤギ抗−ヒト、ウ サギ抗−マウス、ヤギ抗−マウス、ヤギ抗−ウサギおよび羊抗−マウス抗体のよ うな複合体は、例えばシグマヶ、ミカル　カンパ＝　−（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）等の数社から市販品として入手できる。

前記プレー５（２）領域に対する抗体などの、立体配座−独立決定基に対する抗 体の存在を測定するＲＩＡ、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ法に加えて、別の公知の方 法も使用できる。１つの方法においては、　１′工のような信号手段に結合した スタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ ）のタンパクＡを、固体担体に結合した測定すべき抗体の存在を測定するために 使用する。

別の方法においては、第３の抗体（すなわち、前述のような、第２の抗体）に結 合したビオチンが、例えば、セイヨウワサビペルオキシドなどの信号手段おそれ 自身結合したアビジンと組合せて、免疫反応を信号で知らせるため使用される。

ビオチン結合ヤギ抗−ウサギ、ヤギ抗−ヒト、ヤギ抗−マウスおよびウサギ抗− ヤギＩ　ｇ　Ｇ’ｓのようなビオチン結合抗体複合体は市販品としてポリサイエ ンス社（ペンシルバニア州、ウォリントン）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｉ ｎｃ、　ｏｆ　Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、　ＰＡ、）がら入手できる。′アビジン ーＦＩＴＣ，アビジンーＲＩＴＣ，アビジン−ペルオキシダーゼおよびアビジン −アルカリホスファターゼも市販品としてポリサイエンス社から入手でき、これ はビチオン結合抗体と共に使用することにより信号を発生する。更に、他の方法 も当業者には周知である。

前述のように、立体配座−独立抗原決定基と免疫反応し、かつ該決定基に結合す る抗体と免疫反応し、かつ該抗体により結合されたプレー５（２）エピトープの ような抗原エピトープの存在に対する固相免疫測定は、このような抗体用の上記 測定に類似している。前述の試薬および前記ＥＬＩＳＡ’、ＦＩＡおよび他の診 断法が、分析すべきサンプル中の抗体の存在を測定する場合におけると同様に、 抗原エピトープ測定に適用しつる。このような抗体エピトープの存在の測定に対 する詳細を下記結果の章で述べる。また、当業者はこのような測定がいかにして 行なわれるかを理解できる。

以下に述べる特定の方法では、既に述べたようにマウス免疫血清を使用した。特 に開示された方法および系を使用した臨床的研究において、被測定サンプルは、 ＨＢＶ感染に敏感なチンパンジーまたはヒトのような動物から採取する。免疫血 清に加えて、これらサンプルはまた、脳を髄液、唾液、リンパ液、気管支の洗浄 液、尿、精液、組織ホモジネートおよびもちろん、血液および血漿であっても良 い。

本発明はまた、好ましくはキットの形のサンプル測定用の診断系をも意図してい る。前記サンプルは、好ましくは、立体配座−依存決定基に対する抗体の存在下 で、立体配座−独立抗原決定基に対する抗体の存在につき測定される。ここにお いて、立体配座−独立及び立体配座−依存決定基の双方共、単一のタンパク抗原 中に存在している。前記サンプルは、立体配座−独立抗原決定基と免疫反応しか つ該決定基と結合するが、立体配座−依存決定基とはこのような免疫反応を示さ ない抗体と免疫反応を行ない、かつ該抗体により結合される抗原エピトープの存 在についても測定され得る。ここにおいて、前記立体配座−独立および立体配座 −依存決定基は双方共単−タンパク質中に存在する。

前記システムは（１）固体担体のような固体マトリックスに固定された本発明の ポリペプチド抗原の有効量を含む少なくとも１つのコンテナーを含み、この抗原 は、単一分子中において（ｉ）立体配座−依存抗原決定基のアミノ酸残基配列を 含むが該決定基のエピトープに乏しく、かつ（ｉｉ　）立体配座−独立抗原決定 基の前記アミノ酸残基配列およびエピトープを含む。

好ましくは、上記系の一態様においては第２のコンテチーを含み、該コンテナー においては偉）立体配座−独立決定基と、被測定サンプルからの抗体との免疫反 応を検知し信号により知らせることのできる指示手段が含まれる。本発明の系の 別の具体例は、好ましくは（２）前記固体担体の立体配座−独立決定基のエピト ープと免疫反応しかつ該エピトープに結合し、かつサンプル中での存在を測定し ようとする抗体のエピトープとも免疫反応しかつ該エピトープに結合するような 、予め設定された量の既知抗体を含む第２のコンテナー、および（３）固体担体 の立体配座−独立決定基のエピトープと既知抗体の免疫反応を信号により知らせ るにとのできる指示手段を含む第３のコンテナーを含む。

上記系の代表的な固体担体は、前記ブレー５（２）領域（ご対する抗体に関する 前記測定において使用された微量滴定プレートである。

この固体担体即ち前記マトリ・ノラスのどれかを使用して調製しｔこ固体担体は 前記診断系に使用し得る。

前述のポリペプチド抗原固定ウェルのような固体担体Ｇよ、微量滴定プレートに より形成されるコンテナーに包含される。し力１しながら、他の前述の固体マト リ・ノラスの１つ力）ら調製される固体担体は、プラスチックまたはガラスのビ ンまた（よノイイアルのような別々のコンテナーまたは、プラスチ・ツクまた？ ま紙製のエンベロープ中に包含させることを意図している。

前記ポリペプチド抗原は有効量で固体マトリ・ンラスζこ固定された状態で与え られる。種々の測定を行なうための抗原の有効量Ｃま測定毎に異なり、また固体 マトリ・ンラスの表面積（こよっても異なることは当業者は認識している。しか しながら、ポリペプチド抗原の有効量の決定は、当業者の、能力の範囲内で行〕 、（われる。ここで使用される特定のサンプルにおいては、約１２５ｎｇのポリ ペプチド抗原が約０．５　ｃｍの直径を有する固体マ）　’Ｊ　・ｙラス（こつ き使用される。

前記抗体または抗原どちらかの測定の態様の好ましＧ）指示手段は一般には、前 記第３（または第２）の信号手段結合抗体また（ま本発明の測定方法に関して議 論される冬！二りより」しム久Ｘ−エクーレウス　タンパクＡである。信号手段 は一般（ご番よ、力゛ラスまたζまプラスチックビン中に予め決定された量で含 まれる凍結乾燥された形で供給される。前記立体配座−独立決定基の抗原エピト ープの存在に対する測定に使用される系の具体例の公知の抗体としては、代表的 には、前記固相免疫測定法に関して記載されたものである。これらの抗体は、ま た好ましくは、コンテナー中で凍結乾燥した形で供給される。

前記研究では、少なくとも２つの［（−２結合免疫応答（Ｉｒ　）遺伝子の影響 並びにＨＢｓＡｇに対するネズミの体液および細胞の免疫応答の定量的かつ定性 的面が調べられた〔ミリッヒとチザーリ（Ｍｉｌｉｃｈ　ａｎｄ　Ｃｈｉｓａｒ ｉ）　、ジャーナル　オブ　イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、１９８ ２．１２９．３２０）およびミリッヒ（Ｍｉｌｉｃｈ）等、ジャーナル　オブ　 エクスペリメンタル　メディシ７　（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　）　１９８４．１ ５９．４１）、ＨＢｓＡｇの高応答物（Ｈ−２’−ｑ）、および非応答物ハブロ タイブ（Ｈ−２ｆ・Ｓ）が上記ミリッヒとチザーりにより同定された。

これらの研究において使用されたＨＢｓＡｇは前記Ｐ２５／　ＧＰ２８ポリペプ チドを含むが、ブレー５（２）でフードされたより大きな分子量のポリペプチド に乏しい。従ってここではＨＢｓＡｇ／Ｐ　２５として記載している。ここで述 べた本研究の決定基をコード化したブレー５（２）への免疫応答は、ＴおよびＢ 細胞レベルでの免疫原、特異性、Ｈ−２結合調節および可能な重複調節機構、す なわち抗−Ｓ一応答に対してブレー５（２）領域に生成されたヘルパーＴ細胞作 用の可能な影響などの点から、ＨＢｓＡｇのＳ−コード決定基と比較して検討し た。

本研究では、ＨＢＶゲノムによりコードされたＳ遺伝子およびブレー５（２）領 域を含むプラスミドで感染されたチャイニーズハムスタの卵巣［ＣＨ○］細胞か ら誘発されるＨＢｓＡｇ粒子を使用した。これはＨＢｓＡｇ　／Ｐ３４として表 わされている。該ＨＢｓＡｇ／Ｐ３４粒子はＳコードＰ２５／ＧＰ２８ポリペプ チドと、前記ブレー５（２）およびＳ−コードＧＰ３４ポリペプチドとから成る 。前記ＧＰ３４ポリペプチドはＨＢＶ　ＧＰ３３に相当する〔ミッチェル（Ｍｉ ｃｈｅ＋）等、プロシーディッラス　オブ　ザナショナル　アカデミツク　サイ エンス　イン　ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳ Ａ）、１９８５、ｌ上、７７０８’ｌ。

一群（ＤＨ−２コンジエニツクなネズミ系はＨＢｓＡｇ／Ｐ３４で免疫され、ブ レー５（２）およびＳ領域決定基に対して特異的なエンビボ抗体生成およびイン ビトロＴ細胞増殖性応答について検討された。これらの研究の結果は下記の事柄 を示している。すなわち、（１）ＨＢｓＡｇのブレー５（２）コード領域は、Ｔ およびＢ細胞レベルで前記Ｓ遺伝子コード群およびサブタイブー特異的決定基よ りかなり免疫原があり、（２）このブレー５（２）コード領域上において優性な 抗体結合部位（エピトープ）は、前記ＣＰ３４のアミノ末端２６アミノ酸上に表 現され、（３）ＨＢｓＡｇのブレー５（２）コード領域に対する免疫応答は、Ｓ 領域決定基に対する応答を調節する遺伝子と異なる・Ｈ−２−結合遺伝子により 調節され、かつ（４ＥＢｓＡｇ　／Ｐ３４によるＳ領域非応答系、ブレー５（２ ）領域応答系の免疫によって非応答性のものを排除し、かつブレー５（２）特異 的応答並びにＳ−特異的応答を誘発し得る。　゛本発明の基礎をなす本研究から の上記結論は以下の章の発見に基いてなされた。

２、ＨＢｓＡｇ／Ｐ３４での免疫化は試験されたすべての動物種において、抗Ｓ 領域抗体応答に比較して、より優れた抗−ブレー５（２）領域応答を誘発する。

１１−２コンジエニツク系からの５匹のマウスの群が、０．２ｍβの完全フロイ ンドアジコバント（ＣＦＡ）中に乳化された各々のＨＢｓＡｇ／Ｐ３４　１．０ ａｇを含む単位用量で腹腔内（ｉ、ｐ、）投与により免疫された。この用量は重 量基準でマウスあたり０．９　］、　３μｇのＳ領域コードタンパクおよび０、 ０８７μｇのブｌ／　−Ｓ　（２）領域コードポリペプチドに等価であるか、ま たはプレー５（２）領域コードポリペプチドより約１０倍Ｓ領域コードタンパク が過剰である。前記Ｓ領域（ＨＢｓ八ｇへＰ２５に関し測定された）およびＳ領 域にプレー５（２）領域を加えたもの（１−（ＢｓＡｇ　−／　Ｐ　３４に関し て測定された）に対して特異的な前記ＩｇＧ抗体応答は、第１回目の免疫後１０ 日および２４日目、および不完全フロインドアシュパン）（ＩＦ’Ａ＞中の０， ５μｇのＨＢｓＡｇ／Ｐ３４で第２回目の免疫後２週間口に固相放射線免疫測定 （ＲｒＡ）により測定された。第１図に示されるすべての動物系統は、たとえそ れらがプレー５（２）領域タンパクに比較して、１０倍大きな投与量のＳ領域タ ンパクを受けとったとしても、Ｓ領域応答がない状態で１０日目にＩ　ｇ　Ｇ抗 −プレー５（２）応答性を獲得する。

４μｇ量のＨＢｓＡｇ　／Ｐ２５に対するこれら動物系の応答も、比較として第 １図に示されている。〔破線：プレー５（２）領域タンパクの量に比較して４６ 倍多いＳ領域抗原量を表わす〕。前記１０日目のプレー５（２）応答は、４ｔ− ｔｇの［（ＢｓＡｇ／Ｐ２５で免疫された各々の動物系における前記Ｓ領域−特 異的応答よりかなり大きかった。（第１ａＳｂおよびＣ図）。

前記２４日目の抗−プレー５（２）応答もまた各々の動物系において前記抗−８ 領域応答よりかなり高かった。前記動物系ＢＩＯ抗−ブーブレー２）応答は抗− ８応答より２５倍大きく（第１ａ図）、前記動物系Ｂ１．０．Ｄ２抗−プレー５ （２）応答は抗Ｓ応答より２００倍大きく（第１ｂ図）、かつＢＩＯ，Ｓ　（９ Ｒ）動物系は２４日目には依然としてＳ領域に対し非応答性であるが、この時点 で抗−プレー５（２）の力価１　：１６２０を達成している（第１ｃ図）。

ＨＢｓＡｇ／Ｐ３４免疫により誘発された、２４日目の抗−プレー５（２）応答 は、４μｇの！（ＢｓＡｇ／Ｐ２５による免疫後の前記抗Ｓ応答より可変的に高 かった。これら２つの応答の大きさの差はＢ１０．Ｄ２、ＢＩＯｌおよびＢＩＯ ，Ｓ　（９Ｒ）の順で抗Ｓ応答状態に依存する。

二次免疫（２°）後、前記抗−ブレーＳおよび抗Ｓ領域応答は等価［Ｂ１０．Ｄ ２＝Ｂ１０．Ｓ　（９Ｒ）］であるか、プレー５（２）応答が大きい（８１０１ ４倍の差）（第１ａ、ｂ、ｃ図）。これは、Ｂ１０．Ｄ２系においてはおどろく べきことではない。なぜならＨＢｓ八ｇへＰ２５での免疫は１：４０．０００の 力価で抗−８応答を誘発するからである（第１ｂ図）。しかしながら、ＨＢｓＡ ｇ　／Ｐ３４　（０，５μｇ−Ｉ　ＦＡ）での二次免疫の後に８１０゜５（９Ｒ ）系により産生される抗−８量は４μｇのＨＢｓＡｇ／Ｐ２５での二次免疫によ り導かれる抗Ｓよりかなり大きい（８０倍）（第１ｃ図）。この動物系における 比較的有効な抗−ブレーＳ応答を考えると、これは前記Ｓ−特異的応答に対する プレー５（２）応答による正の影響を示唆している。

Ｂ１０．Ｓマウス系の免疫により、抗プレー５（２）応答が抗Ｓ領域応答に正の 影響を及ぼすことを認識した。前記Ｂ１０．Ｓ系は、４μｇのＨＢｓＡｇ／Ｐ２ ５による二次免疫の後でさえも、Ｓ領域決定基に対し完全に非応答性である〔第 ２ａ図、ミリッヒ（Ｍｉｌｉｃｈ）等、ジャーナル　オブ　エクスベリメンタル メディシン、（Ｊ、　Ｅｘｐ、　１Ｊｅｄ、　）、１９８４．１５９．４１〕。

しかしながら、前記ＢＩＯ，Ｓ系は、ＨＢｓＡｇ　／Ｐ３４により免疫した際に 前記プレー５（２）領域に対する　２４日目の応答、即ちＩｇＧを産生じた（第 ２ａ図）。

更に、ＨＢｓＡｇ／Ｐ３４により二次免疫した場合、この「Ｓ領域−非応答性」 動物系は、二次抗−ブレー５（２）応答（力価＝１：５１２０＞と同様に抗Ｓ特 異的応答（力価＝１　：　６４０）を獲得した。ＨＢｓＡｇ／Ｐ３４免疫の後に 、Ｂ１０．ＳおよびＢ１０゜Ｓ　（９Ｒ）系によって産生された抗Ｓ抗体は、サ ブタイプ−特異性（すなわち、抗−ＨＢｓＡｇ／ｙ）であり、一方　ＢＩＯおよ びＢ１０．Ｄ２系により産生されたものは、グループおよびサブ“タイプ−特異 抗体応答を含むことは興味あることである。

前記Ｂ１０．ＢＲ系はプレー５（２）領域に対しては低応答性であるが、それに もかかわらず２４日目のＨＢｓＡｇ／Ｐ３４免疫でのＳ−特異抗体応答に比較し て、またＨＢｓＡｇ／Ｐ２５　（４μｇ）免疫後の抗Ｓ応答に比較して、より優 れたプレー５（２）を産生じた（第２ｂ図）。前記Ｂ１０．Ｍ系は、ＨＢｓＡｇ のＳ領域およびプレー５（２）領域双方に対し、実質上非応答性であった（第２ Ｃ図）。

以上より、これらの結果は、ＨＢｓＡｇの前記プレー５（２）領域が、有効免疫 投与量および一次応答の大きさおよびその開始時間に関しては、体液レベルでＳ 領域よりも優れた免疫原であることを示している。更に、プレー５（２）領域は Ｓ領域特異的応答に対し正の影響を与えうる。

４、　プレー５（２）領域抗体応答の特異性。抗ブレー５（２）応答はプレー　 Ｓ　（２）およびＳ領域双方の決定基（ＨＢｓＡｇ　／Ｐ３４）を含むＨＢｓＡ ｇ粒子　上で測定されるので、プレー５（２）領域特異的測定を確立するのが望 ましい。プレー５（２）領域抗原は還元および洗浄剤による変性に抵抗性がある ことは前に報告した〔ニューラス（Ｎｅｕｒａｔｈ　）等、サイエンス、（Ｓｃ ｉｅｎｃｅ）、１９８４．２２４．３９２〕。逆に、主なグループおよびサブタ イブー特異的Ｓ領域抗原決定基は立体配座−依存であり、かつ全く、変性条件に 対し例えば各成分が最終濃度２％になるような、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ Ｓ）および２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）の変性量を含む水性混合物で処 理したＨＢｓＡｇ／Ｐ３４を固相に固定したポリペプチド抗原（ＨＢｓＡｇ／Ｐ ３４（ＳＤＳ／２ＭＥ））として使用し、固体マトリックスとしてのポリスチレ ン微量滴定板のウェルに固定されたＨＢｓＡｇ　／Ｐ３４　（ＳＤＳ／２ＭＥ） 抗原を含む固体担体でプレー５（２）および非Ｓ領域抗体価を測定した。このよ うにして調製した固体マトリックス固定ポリペプチド抗原は、立体配座−独立決 定基〔プレー５（２））のアミノ酸残基配列およびエピトープを含み、かつ立体 配座−依存抗原決定基のアミノ酸残基配列を含むが立体配座−依存抗原決定基（ Ｓ）のエピトープに乏しかった。

前記プレー５（２）領域の２６アミノー末端アミノ酸を包含する、７２３４粒子 で免疫することにより産生される抗血清を測定するための固相配位子として使用 される。この合成ペプチドの利点は、その明確な特異性、残留「変性」Ｓ領域決 定基の欠乏およびそれが免疫原としては使用されないという事実であった。

このポリペプチドはその配列の点で、ＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａから誘発されるよう なａｙｗザブタイプのＭｅｔ−１２０−Ｇｌｙ−１４５のアミノ酸残基に対応し ている。左から右へ即ちアミン末端基からカルボキシ末端基の方向に書かれたア ミノ酸残基配列は、下記式に相当する。すなわち、 Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｔ＋ｅ　Ｈｉｓ 　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　−Ａｓｐ　Ｐｒｏ　ＡｒｇＶａｌ　Ａｒｇ 　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙである。

アミノ酸残基に対して、最近採用された単一文字コードを使用すれば、上記配列 は次のようにもかける。すなわぢＭＱＩＪＳＴＴＦＨＱＴＬＱＤＰＲＶＲＧＬＹ ＦＰＡＧＧである。

第３図に示されるように、Ｓ領域のグループ−特異的（抗−ＨＢｓ／　ａ　）お よびサブタイブー特異的（抗−ＨＢｓ／　ｙ　）決定基によって誘発された抗血 清は、ＨＢｓＡｇ／Ｐ２５粒子上で合成ブレー５（２）ペプチドと反応性を有す るが、固体マトリックスに固定されたＳＤＳ／２ＭＥで処理されたＨＢｓ八ｇへ Ｐ３４粒子［ＨＢｓＡｇ　／Ｐ３４　（ＳＤＳ／２ＭＥ）Ｅ上では合成プレー５ （２）ペプチドとまったく反応性を有しなかった。これらの抗血清は、天然のＨ ＢｓＡｇ／Ｐ３４粒子とも反応性を有した。これらの結果は、Ｓ領域コードおよ びプレー５（２）領域コード抗原の間に交差反応性がないことを示している。

一連のネズミ系は、ＨＢｓＡｇ／Ｐ３４で免疫され、かつその２４日目のＩｇＧ 抗体応答は、第３図に示される３つの固相抗原上で比較された。前記ＢＩＯ１Ｂ １０．Ｄ２およびＣ，Ｈ，Ｑ系は、２４日目に抗−プレーＳ（２）（ＨＢｓＡｇ ／Ｐ３４　（ＳＤＳ／２ＭＥ）および合成ペプチド上で検出される〕および抗Ｓ 　（ＨＢｓＡｇ／Ｐ２５上で検出される）双方の抗原決定基に対して特異的な抗 体を産生じた。しかしながら、すべての場合において、前記プレー５（２）応答 の方がかなり大きい。

また、ＨＢｓＡｇ　／Ｐ３４　（ＳＤＳ／２ＭＥ）上に検出されるプレー５（２ ）抗体の量（力価）は、プレー５（２）ペプチドに検出されるプレー５（２）抗 体に実質的には等価であった（２倍以下の差）という事実はこれら系において興 味することである。

ＢＩＯ，Ｓ　（９Ｒ）およびＢ１０．Ｓ系は、２４日目にブレー５（２）−特異 的応答性を示し、かつこの時点でＳ−特異的応答性を示さなかった（第３図）。

再び、同様の量のプレー５（２）領域抗体が、固体マトリックスに固定されたＨ ＢｓＡｇ　／Ｐ３４　（ＳＤＳ／２ＭＥ）上またはプレー５（２）ペプチド上で 測定され検出された。

前記Ｂ１０．ＢＲおよびＣ，Ｈ，Ｑ系（Ｈ−２に双方）は、−次免疫の後、プレ ー５（２）−特異的抗体が固体マトリックス−固定ＨＢｓＡｇ　／Ｐ３４　（Ｓ ＤＳ／２ＭＥ）粒子上にのみ検出され、固体マトリックス−固定ブレー５（２） ペプチド上には検出されないということにおいて、特異なものであった。このこ とは、抗プレー５（２）ペプチド応答が二次免疫の後に検出されるので、これら 低応答系における定量的な差を表わしている。更に、これらの系は、合成ペプチ ド上で表現されないプレー５（２）エピトープを認識しつる。

更に、前記抗−ブレー５（２）領域応答の特異性を調べるため、競合的抗体阻害 測定を行なって、抗天然プレー５（２）と抗−プレー５（２）ペプチド抗血清と を比較した。抗体天然プレー５（２）抗血清は、ＨＢｓＡｇ／Ｐ３４で免疫され たＢＩＯマウス内で産生され、かつ免疫後１０日目に集められた。この抗血清は プレー５（２）領域特異性であり、かつ抗−８反応性を含まなかった（第１ａ図 ）。プレー５（２）ペプチドに対する抗血清は前記２６−残基ペプチドによって 生成され、かつニューヨーク州、ニューヨークツニューヨーク血液センターのリ ンズレ−エフ、キンボール　リサーチ　インスティテユートのニー・アール・ニ ューラス（八、Ｒ，Ｎｅｕｒａｔｈｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｉｎｄｓｌｅｙ　Ｆ、Ｋｉ ｍｂａｌｌ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｈｅ　ＮｅｗＹｏ ｒｋ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ）により提供された 。

第４ａ図に示すように、ＨＢＳＡｇ／Ｐ３４を抗プレー５（２）ペプチド（１： ５０００）の間の前記免疫反応および結合は、抗天然ブレー５（２）抗血清の稀 釈物で定量的に抑制された。一方抗一天然Ｓ領域抗血清はいかなる抑制効果も有 しなかった。補足的な研究においては、ＨＢｓＡｇ　／Ｐ３４と抗天然プレー５ （２）（１５００）の間の前記反応は、抗−プレー５（２）ペプチド抗血清によ り定量的に抑制され、かつ抗Ｓペプチド抗血清に関するいがなる効果も観察され なかった（第４ｂ図）。

使用された抗Ｓペプチド抗血清はカリフォルニア州、ラ　ジョラのリサーチイン スティテユート　オブ　スクリップス　クリニックのアール・ニー・ラーナー博 士（叶、Ｒ，Ａ、Ｌｅｒｎｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅＲｅｓｅａｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕ ｔｅ　ｏｆ　５ｃｒｉｐｐｓ　Ｃｌ１ｎｉｃ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ　）によ り提供され、ゲリン（Ｇｅｒｉｎ　）等の（「プロシーディンゲス　オブザ　ナ ショナル　アカデミツク　サイエンス　イン　ＵＳＡＪ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、［ｌ５Ａ）、１９８３，８０．２３６５）の４９ａと命名さ れたペプチドによって生成された。ポリペプチド４９ａはＨＢＳＡｇサブタイプ １ム里のアミノ末端から１２５〜１３７に亘る配列を有している。左がら右へ即 ちアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書かれたポリペプチドの配列は、下記 式％式％ １００％の抑制を達成できないことは、これら２つの抗血清が異なるエピトープ をｇ７ＪＱすることを示している。しかしながら、観察される重要な競合は、抗 −ペプチドおよび抗−天然ブレー５（２）抗血清がプレー５（２）領域のエピト ープを重複して認識していることを示している。加えて、前記プレー５（２）ペ プチドは、抗天然ブレー５（２）抗体のＨＢｓＡｇ／Ｐ３４との相互作用の重大 な抑制を立証するが、抑制はＨＢｓＡｇ／Ｐ３４に比較して１／１１２の低効率 （重量基準で）を示した（第５図）。

５、　インビボ抗−プレー５（２）領域抗体産生の調節はＩ］−２−結合である 。インビボ抗−プレー５（２）産生の量（第３図）および速度（第１．２図）が 、調査中のＨ−２コンジエニツク系においては、高応答性から非応答性フェノタ イプへ変化することを示した。これらの結果に基いて、前記Ｈ−２ｂ′’＝’ハ ブロタイブがプレー５（２）領域（１０日および２４日目の応答）に対する高応 答性として分類され、Ｈ−２”ハブロタイブが中間応答（２４日目応答）性とし て、Ｈ−２’″ハブロタイブ低応答性（限界２４日目応答）として、かつＨ−２ １ハブロタイブが非応答性として分類されう１５９．４１〕、Ｓ領域決定基に対 するインビ、ボ抗体産生およびＴ細胞増殖特異性はＨ−２結合したＩｒ遺伝子に より調節される。

しかしながら、Ｈ−２ハブロタイブの中で、Ｓ領域に対する応答状態の階級はプ レー５（２）領域に対して観察されるものと異なる。

例えば、前記Ｈ−２’およびＨ−２’ハブロタイブは前記Ｓ領域に対して高応答 性であり、一方前記Ｈ〜２ｂハブロタイブは中間的応答性であり、かつ前記Ｈ− ２ｋハブロタイブは低応答性フェノタイプであるが、Ｈ−２’ハブロタイブの非 応答性状態よより優れている。前記プレー５（２）応答のＨ−２調整はＨ−２ｂ ハブロタイブが少なくともｌ−１−２’−’ハブロタイブに等価であり、かっＨ −２’ハブロタイブが非応答性フェノタイプに対立するように中間応答性である ということにおいて異なる。これらのデータは異なるＨ−２−結合遺伝子がＳお よびプレー５（２）−特異性のインビボ抗体産生に影響を及ぼすということを示 している。

６、ＨＢｓＡＩＸのプレー５（２）領域に対するＴ細胞増殖応答特異性はＳ領域 に対するＴ細胞増殖応答特異性より非常に大きい。

ＨＢｓΔ乙のプレー５（２）領域に対するイン１“ボ抗体産生に関していくつか の基がＳ領域決定基の認識を通して誘導されるヘルパーＴ細胞に対立するものと して、プレー５（２）特異的ヘルパーＴ細胞すなわちハブテンのようなＰｒｅ− ３（２）の影響を示した。第１に、インビボ抗プレー、Ｓ　（２）抗体産生は、 抗Ｓ抗体産生とは異なる方法でＨ−２−結合される（第３図）。第２に、ＨＢｓ Ａｇ／Ｐ３４による免疫は、０．０８７μｇのプレー５（２）タンパクにょるｉ 、ｐ免疫後１０日程でかなりの量のＩｇＧクラスの抗ブレー５（２）抗体を誘発 し、かつ、実際に、ＩｇＧ抗体抗体カニ００日目１ｇＭ応答より高いことが知ら れていた。第３に、ＨＢｓＡｇ　／　Ｐ　２５非応答性状態は、ＨＢｓＡｇ／Ｐ ３４で免疫することにより回避された。

ＨＢｓＡｇのプレー５（２）領域によるＴ細胞認識を直接調べるため、ＨＢｓＡ ｇ／Ｐ３４で抗原刺激を受けたマウスのＴ細胞増殖応答性が測定された。マウス は、後部足踵において、ＣＦＡ中の総量４ｔ−ｔｇのＨＢｓＡｇ／Ｐ３４または Ｉ　６１−１ｇのＨＢｓＡｇ／Ｐ２５で免疫された。ＰＬＮ細胞液を８日目に採 取し、種々の濃度のＨＢｓＡｇ／Ｐ３４、ＨＢｓＡｇ／Ｐ２５または主とじてｔ −Ｉ　ＢｓＡｇ　／　Ｐ　２５から成るが、少量のＰ３４をも含むようなＨＢｓ 八ｇへ方物（ＨＢｓＡｇ　／Ｐ２５／Ｐ３４）と共に培養した。

これらの処方物は抗−プレー５（２）抗血清の定量的抑制によりプレー５（２） 抗原につき測定された（第５図）。５０％抑制を生じるに必要な濃度の点で、Ｈ ＢｓＡｇ／Ｐ３４はＨＢｓＡｇ／Ｐ２５／Ｐ３４より約２８倍有効に抑制を達成 した。該ＨＢｓＡｇ／Ｐ２５処方物は全く非反応性であった。これらの処方物は 抗プレー５（２）ペプチド抗血清に対してテストした場合には同じパターンを示 した。

これら３種のＨＢｓＡｇ処方物すべてが等しい量のＳ領域タンパクを含むので、 これらはＨＢｓＡｇ／Ｐ２５で刺激をうけたＰＬＮ　Ｔ細胞に匹敵するＴ細胞増 殖応答を誘発することが予想され、かつこれが正しいことがわかった（第６ａ図 ）。Ｃ３Ｈ，Ｑマウスは１６μｇのＨＢｓΔｇ／Ｐ２５（最適の８日目のＳ領域 −特異的Ｔ細胞増殖応答性を導き出すため必要な量）〔ミリッヒ０Ｊｉｌｉｃｈ ）等、ジャーナル　オブ　イミュノロジー、（Ｊ、’　Ｉｍｍｕｎｏｌ＞、１９ ８３、±３０，１４０１）で免疫され、８日目のＰＬＮＴ細胞に３種のＨＢｓＡ ｇ処方物の濃度を変えて投与し、かっこの投与量応答曲線を決定した。

ＨＢｓＡｇ／Ｐ２５による免疫はＳ領域−特異的Ｔ細胞を感作した。また、該Ｔ 細胞は種々のＨＢｓＡｇ処方物に対して、インビトロでの投与に関し等価に増殖 する（第６ａ図）。このＳ領域−特異的Ｔ細胞増殖の程度および観察される投与 量応答曲線は、て、４ｔ−ｔｇのＨＢｓＡｇ　／Ｐ３４　（３，６５μｇｓ　； ０．３５μｇプ１／　−Ｓ　（２）　）でのＣ，Ｈ，Ｑマウスの免疫は、Ｓ領域 −特異的Ｔ細胞応答に比較して、左にシフトした投与量応答曲線を有するかなり 程度の大きなプレー５（２）−特異的Ｔ細胞増殖応答を誘発した（第６ｂ図）。

例えば、インビトロでは２０００　（ｎｇ／　ｍＡ）の濃度のＨＢｓＡｇ／Ｐ２ ５が、７．０ｎｇ／ｍＡのＨＢｓΔｇ／Ｐ３４と等価なＴ細胞増殖応答を導、く のに必要とされた（２８６倍の差）。

最小のＳ領域−特異的Ｔ細胞応答を準最適Ｓ領域感作用量（３，６５μｇ）とす ることができる。０．３５μｇのプレー５（２）領域感作用量はＳ領域投与量よ り１０倍少なく、かつ１６μｇの最適Ｓ領域（ＨＢｓＡｇ　／　Ｐ　２５　）感 作用量より４５倍少ないが、それでもＳ領域抗原のいずれかの投与量よりかなり 大きなＴ細胞増殖応答を誘発することは注目に値する（第５ａＳｂ図）。これら のデータは、有効感作用量、Ｔ細胞増殖度および定量的インビトロ投与量応答白 線の点でプレー５（２）領域がＴ細胞レベルでＨＢｓＡｇのＳコード領域より免 疫原であることを示している。

ＰＬＮ細胞増殖のＴ細胞の性質を確認するため、抗原依存のＩＬ−２産生はいつ も一対の培養細胞中で測淀された。ここで報告されるすべての８日間のＰＬＮ培 養において、抗原投与量依存ＩＬ−２産生はＳ領域Ｔ細胞応答に対して前に知ら れているようなＰＬＮ増殖応答に正確に相関した。前記増殖応答のＨＢｓＡｇ特 異性は卵白アルブミンで感作したＰＬＮ細胞がいずれのｔｌＢｓＡｇ試料によっ てもＴＬ−２を増殖せずまた分泌しなかったという事実（こより確言忍された。

７、　プレー５（２）−特異的Ｔ細胞増殖応答はＨ−２結合の遺伝子により調節 され、インビボ抗−プレー５（２）抗体産生に相関している。

Ｈ−２結合遺伝子のプレー５（２）−特異的Ｔ細胞増殖応答への影響を評価する ため、一連の１４−２コンジエニツク系のＨＢｓＡｇ／Ｐ３４に対するＴ押胞増 殖応答が調べられた。抗−プレー５（２）抗体産生の程度を減少させるために検 討された系は、ＢＩＯ。

Ｂ１０．Ｄ２、Ｂ１０．Ｓ、およびＢ１０．ＢＲであった。４ｔｔｇのＨＢｓＡ ｇ／Ｐ３４免疫投与量はＣ３Ｈ，Ｑ系において、プレー５（２）とＳ−特異的Ｔ 細胞増殖応答とははっきり区別されるので、この投与量は各々の系から４匹のマ ウスのグループを刺激するためずっと使用された（ｉＳｂ図）。ＰＬＮ細胞液を 免疫の後８日目に採取し、インビトロでＨＢｓＡｇ／Ｐ３４、ＨＢｓＡｇ／Ｐ２ ５またはＨＢｓＡｇ　／Ｐ２５／Ｐ３４を投与した。

Ｃ３Ｈ，Ｑ系と同様、前記８１０系はプレー５（２）特異的Ｔ細胞増殖応答を示 し、かつ重大な増殖（例えばバックグランドに対し２０００ＣＰＭ）が１．５ｎ ｇ／ｍβ程度の最少ＨＢｓＡｇ　／Ｐ３４濃度で観察された（第７ａ図）。この 系においてはＳ領域特異的（ＨＢｓＡｇ　／Ｐ２５）Ｔ細胞応答が全くないこと が記録され、ＨＢｓＡｇ　／Ｐ２５／Ｐ３４抗原により誘発された最小応答はプ レー５（２）−特異的であることを示した。

前記ＢＩＯ１Ｄ２系は７．０ｎｇ／ｍ１の最小ＨＢｓＡｇ　／　Ｐ３４投与量（ Ｂ１０と８１０．Ｄ２間テ４．７倍）差）テプレー５（２）特異的Ｔ細胞応答を 生じた（第７ｂ図）。この系における限界的であるが正のＳ領域−特異的応答が ＢＩＯ系の負の応答に比較して記述され、これは、これら系のＨＢｓＡｇ／Ｐ２ ５応答状態と一致する（Ｂ１０．Ｄ２はＢＩＯより大きい）。

前記Ｓ領域非応答性の８１０．Ｓ系はＨＢｓＡｇ／Ｐ３４にょる感作後に特異的 Ｔ細胞増殖応答を示した（第８ａ図）。しかしながら、前記投与量応答曲線は、 １５μｇ／ｍ（ｌの最小ＨＢｓＡｇ／Ｐ３４の投与１（ＢｌＯとＢＩＯ，Ｓ系と 間で１０倍の差）に関し、ＢＩＯおよびＢ１０．Ｄ２系に比べて右ヘシフトした 。

ＨＢｓＡｇ　／　Ｐ　２５およびＨＢｓＡｇ　／Ｐ２５／Ｐ３４は、Ｓ領域非応 答状態および見掛けの限定量のプレー５（２）タンパクに去れそれ一致するが、 この系における応答を誘発しなかった。

前記Ｂ１０．Ｓ系は適切な１６μｇ投与量のＨＢｓ八ｇへＰ２５に対してさえ、 Ｔ細胞レベルでは非応答性である。それゆえに、この系におけるＨ　’Ｂ　ｓΔ ｇ　／Ｐ３４免疫後の抗Ｓ領域抗体産生は、Ｂ細胞クローンを識別するＳ−領域 に対する機能的ブレー５（２）領域特異的ヘルパーＴ細胞を最もよく反映してい る。この　「交差−領域の」ヘルパーＴ細胞は、グループ特異的抗Ｓ領域を産生 じないので、Ｓ領域サブタイプ決定基に限定されているように思われる。

抗体産生の点で最も近いプレー５（２）応答性系はＢ１０．ＢＲである。これは また、Ｔ細胞増殖によって測定される最低の応答系である（第８ｂ図）。増殖応 答を導き出すための最少ＨＢｓＡｇ／Ｐ３４ｍ度は、３０ｎｇ／　ｃａｌ　＜Ｂ ＩＯおよびＢ１０．ＢＲ系間では２０倍の差）であった。更に、前記プレー５（ ２）特異性は、異なるＨＢｓＡｇの処方物によるＴ細胞活性化がないことによっ て再び立証された。

Ｓ領域およびプレー５（２）領域Ｔ細胞増殖応答間の差は、プレー５（２）領域 に関する系の変化が最大抗原濃度での増殖の最小差を有する投与量応答曲線にお けるシフトにより特徴づけられているということである。逆に、高応答性系から 低応答性系に至るものの中でＳ領域−特異的Ｔ細胞増殖応答は、双方の点におい て異なる。

この観察は、Ｓ領域に対立するものとして、プレー５（２）領域のＴ容性ノ＋１ １ｉ序は、左カラ右へ順＋、：Ｂ１０、Ｂ１０．Ｄ２、ＢＩＯ，Ｓ、Ｂ１０．Ｂ Ｒであり、これらは、これらＨ−２コンジエニツク系におけるインビボ抗−ブレ ー５（２）抗体産生と相関している。これらの結果は、前記Ｉ（−２結合遺伝子 がプレー５（２）特異的Ｔ細胞増殖並びに応答にインビボ抗体産生に影響を与え 、多分同一である章Ｂ　（６）　−（７）の第６〜８図に示されるＴ細胞増殖応 答は、免疫原としての前記プレー５（２）および共に複製されたＳ領域の双方に 関連し、かつＴ細胞刺激作用基としてＳおよびプレー５（２）領域とを比較した 。プレー５（２）領域のＴ細胞増殖効果は、本発明者が今まで観察した最も大き なものであった。

キーホール　リフペット　ヘモシアニン（ＫＬＨ）は、比較的低分子量のキャリ ヤーとしてよく使用されるタンノｆりであり、ワクチンや他の接種物の調製に使 用される。／＼ブテン性のポリペプチド結合体である。ＫＬ）１は比較的不十分 なタン）＜りであるが、その全体的なＴ細胞刺激および増殖効果の故に免疫原ポ リペブチＨＢＶのプレー５（２）領域により誘発された強いＴ細胞増殖の故に、 プレー５（２）領域またはこの領域内のアミノ酸残基配列は、ＫＬＨＯ代りに使 用され、他の免疫原に対する抗体の産生を誘発するための、ワクチンおよび他の 接種物に必要なＴ細胞増殖を与えると信じられている。

かくして、その配列がプレー５（２）ポリペプチドのＴ細胞増殖部を含む全５５ 残基ブレー５（２）領域ポリペプチドまたは他のポリペプチドは別の、−次免疫 原として化学的に結合し、結合体を形成する。結果として得られる結合体は、従 ってワクチンまたは他の接種物に活性免疫原として配合されうる。既に述べたプ レー５（２）領域含有Ｔ細胞増殖誘発基に加えて、ヒールマン（Ｈｅｅｒｍａｎ 　）等、〔ジャーナル　オブ　バイａｏジー、（ＪＪｉｒｏ！　）、１９８４． ５３゜３９６〕および、スティッペとゲルリッヒ（Ｓｔｉｂｂｅ　ａｎｄ　Ｇｅ ｒｌｉｃｈ）〔シャーナルオフハイロロジー、（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ　）、１９８３ ．４６．６２Ｇ〕は、ここで使用しうる１１キロダルトンポリペプチドの産生に 関して報告した。この物質は、スタフィロコッカスアウレウスｖ８酵素を使用し て、ＨＢＶ感染された血清からＧＰ３９およびＧＰ４２またはＧＰ３３およびＧ Ｐ３６ボリペプチドそれぞれの開裂により産生されると報告された。前記１１キ ロダルトンポリペプチドはアミノ末端ＨＢＶ　Ｓ領域のいくつかのアミノ−末端 残基並びにプレー５（２）領域５５残基を含むことが報告１つの具体例において は、前記５５残基ポリペプチドは、例えば、ゲリン（Ｇｅｔｉｎ　）等、〔プロ ′シーディンゲス４　オブ　ザ　ナショナル　アカデミツク　サイエンス　イン 　Ｕ、Ｓ、　Ａ１、（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）、１９８３．８０， ２３６５）によって、ペプチド４９．４９ａおよび７２として開示されたＨＢｓ Ａｇタンパクのアミノ末端から１１０−１３７の位置に相当するポリペプチド、 ビトル（Ｂｉｔｔｌｅ）等、〔ネイチャー、（Ｎａｔｕｒｅ　）、１９８２．２ ９８．３０〕によって開示されたような、口締症ビールス（ＦＭＤＶ）のＶＰ、 タンパクのアミノ末端から１４１〜１６０の位置に相当するポリペプチド等のよ うな一次免疫原に対するキャリヤーとして使用される。第二の免疫原はグルタル アルデヒド、水溶性カルボジイミド等によるような公知の手段により前記５５残 基キヤリヤーポリペプチドに結合しうる。

別の具体例においては、プレー５（２）ポリペプチドまたはそのＴ細胞増殖誘導 部は、抗体が必要とされる免疫原と共にキャリヤーに結合される。この場合、ヒ トに使用できる破傷風トキソイドのようなキャリヤーを使用しうる。前述のよう なカプリング法がこの具体例において使用されうる。

更に別の具体例においては、プレー５（２）ポリペプチドまたはそのＴ細胞増殖 部は、抗体が必要とされるポリペプチド免疫原と重合されつる。ポリペプチドの いくつかの共重合手段は公知である。

１つの例示的方法において、システィン（Ｃ，ｙｓ）残基が、各々のポリペプチ ドのアミノ−およびカルボキシ末端に備えられ、それによってｄｉ−Ｃｙｓポリ ペプチドなどが提供される。ゲリン（Ｇｅｔｉｎ　）　等＃よびビトル（Ｂｉｔ ｔｌｅ）等によって、それぞれ報告された前記ＨＢｓＡｇまたはＦＭＤＶポリペ プチドのような所定の免疫原のｄｉ−Ｃｙｓポリペプチドは、プレー５（２）領 域の完全な５５アミノ酸残基配列と末端Ｃｙｓ残基とを含むポリペプチドのよう な、有効割合のｄｉ−Ｃｙｓブレー５（２）領域ポリペプチドを有する水性組成 物中で混合されている。結果として生じる混合物は、実質的にいかなる遊離メル カプタン基も組成物に残らなくなるまで空気で酸化し、共重合体を形成する。

結果として生じる共重合体含有水性組成物は、濃縮され、凍結乾怪により乾燥さ れ使用されつる。または、この共重合体はゲル透過タロマドグラフィー等の使用 によりこの後精製されつる。代表的な製造方法においては、前記共重合体は精製 後ワクチンまたは接種物に使用される。

宿主動物のＴ細胞応答を増大させることに加え、前記プレー５（２）領域は第２ 図に関して議論された結果により示され、Ｓ領域に対する抗体の産生に、別の方 法で不十分に応答する動物（低および非応答動物）のＢ細胞応答を増強する。か くして、プレーＳ（２）領域はプレー５（２）領域抗体産生並びにＳ領域を誘発 するために作用し、それにより、接種された動物におけるＳ領域非応答性を回避 するように作用するヘルパーＴ細胞活性を発生するようにみえる。

かくして、前述の結果は、通常はＳ領域免疫原にわずかしかまたは全く応答を示 さない（低応答）宿主動物における、増強された体液の免疫性応答がＳ領域と同 じポリペプチド上にプレー５（２）領域配列を含む接種物を動物に導入すること により提供されることを示している。このような結果は、ペプチド結合によるプ レー５（２）領域ポリペプチドの一次Ｓ領域への化学結合を示す。

これらの結果はまた、その免疫原に対し低い体液免疫性応答を示す動物における ＨＢＶ　Ｓ領域免疫原に対する体液免疫性応答を増強する方法を示している。こ の方法によれば、肝炎ＢウィルスゲノムによりコードされたＳ領域の免疫原に対 する宿主動物の体液免疫性応答は、Ｓ領域免疫原に化学的に結合し、生理学的に 許容される稀釈剤に単位量として分散される、プレー５（２）領域含有ポリペプ チドの増強可能な量を含む接種物を宿主動物に導入することによって強められう る。使用されるプレー５（２）領域含有ポリペプチドの増強可能量は、存在する Ｓ領域免疫原の測定可能な量の少なくとも約１７２０の量であり、測定可能なＳ 領域免疫原量にほぼ等しい。

前記Ｓ領域免疫原およびブｌ／　−Ｓ　（２）領域相乗基は第２図に関して示さ れたデータに対する場合と同じ分子に存在すべきである。

ここにおいてはＣＨＯ−感染ＨＢｓＡｇ／Ｐ３４粒子が使用され、かつプレー５ （２）領域のＳ領域免疫原に対する重量比は約１：１０であった。このＳ領域− 次免疫原およびプレー５（２）領域相乗基はまた、独立体に分離されうる。すな わち、これは、既に述べられたような方法により使用に先だって共に化学的に結 合される。

Ｓ領域免疫原を含むワクチンに対し、ごの免疫原は前記ＨＢｓｌに／Ｐ３４粒子 により与えられうる。補助的なＳ領域免疫原としては前記Ｉ（Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ− 正のフィラメント、ＨＢＶのワクチンに通常使用されるようなＨＢＶ−感染動物 の血液中に見られる２２ｎｍり報告されている４９．４９ａ、および７２と命名 された合成ポ（１，９８２’）　］により報告されている合成ポリペプチド等を 含む。

前記［（ＢｓＡｇ／Ｐ３４粒子はプレー５（２）領域相乗基を備えうる。補助的 なプレー５（２）領域相乗基としてはピールマンＨｅｅｒｍａｎｎダルトンポリ ペプチド、前記ＨＢＳＡ４−正フィラメント、アミノ酸配列の点でＨＢＶゲノム によりコードされたプレー５（２）領域に相当する５５残基ポリペプチド等を含 む。

Ｓ領域免疫原およびプレー５（２）領域相乗基の両方がワクチンに施される場合 、測定可能なＳ領域免疫原の毒はワクチン中に存在しかつ、ここで述べる抗原エ ピトープ法、すなわぢアボットラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ　）によって商標アウスリア■（ＡＵＳＲＩＡ　ＩＩ）として販売さ れているものなどの市販品として入手できるＳ領域測定キットの使用によって、 または同様の測定方法によって測定されうる量である。この量の抗プレー５（２ ）領域ポリペプチドが、ここで述べるように公知の抗ブレー５（２）領域特異的 抗血清の抑制により測定されつる。Ｓ領域含有−次免疫原とプレー５（２）領域 含有相乗基の両方を含むワクチンは、プレー５（２）領域含有相乗基に化学的に 結合したＳ領域含有免疫原に対し体液免疫性応答を示す動物において予防を与え るのに有効な量のＳ領域免疫原を含む。ここでは、応答する動物はこの免疫原に 対し低い応答しか示さない、ワクチンを接種した動物と同じ種のものである。使 用される個々のＳ領域免疫原の有効量は当業者によく知られるように使用される 特異的免疫原、′宿主動物、所定の抗体力価を動物内で達成するのに必要とされ る速度、使用される接種規制等に応じて変わる。本研究のマウスに対して、前記 ワクチンは約０．９μｇのＳ領域含有−次免疫原を含み、このうち、約　０．２ ５μｇのＳ領域含有−次免疫原が化学的にプレー５（２）領域ポリペプチドに結 合された。

一般に、ここで使用されたマウスのような宿主動物に対するＳ領域免疫原の単位 投与量は動物光たり約０．１〜約１０μｇのＳ領域免疫原を含む。マウスは一般 には、約２５ｇの重さがあり、かくして、示されるようにＨＢｓＡｇ／Ｐ３４粒 子を使用する有効量は、接種された動物の体重１ｋｇあたり約４〜４００μｇで ある。

上記ゲリン（Ｇｅｔｉｎ　）等は、チノパンツー１匹当たり０．５ｍｊ７の投与 量につき１　＋ｒ＋ｇのポリペプチドを含むＫＬＨポリペプチド結合体の予防単 位投与量を使用して報告した。ここにおいて、ポリペプチドはＨＢｓＡｇサブタ イプａｙｗのアミノ末端から１１０＝１３７の位置に相当する。ヒトをＨＢＶか ら予防するワクチンは一般に投与量あたり、約２０μｇのＳ領域含有２２ｎｍＨ ＢｓＡｇ粒子を含む。

生理学的に許容できる稀釈剤はワクチンおよび接種技術において公知のものであ り、かつ蒸留水またはイオン交換水、標準的生理食塩水、リン酸緩衝液等を含む 。このような稀釈剤は同様に公知の完全フロインドアジュバント、不完全フロイ ンドアジュバント、ミョウバン、百日咳菌アジュバント等のアジュバントを含み うる。

本発明を好ましい具体例に関して述べてきた。当業者においては開示された構成 および方法の改良および／または変更が以上述べた本発明の範囲を逸脱すること なくなされうろことは明らかである。

浄書（内容に変更なし） 抗ＨＢ、抗体価　（１／希釈） ９：！表昭６２−５０２７（１４（１Ｂ）浄書（内容に変更ない 抗Ｈａｓ抗体価　（１／希釈） ＡＮＴｉ　Ｈａ！３　ＴＩＴＥＲ（１／　ＤｉＬｕｔｊｏｎ　）浄書て内容に変 更なし） 浄ＩＦ（内容に変更なし） 阻害率（％） ↓ 浄書（内容に変更なし） 阻害率（％） −〜　ＣＪＪ　尋　Ｑ　■　Ｎ　■　ψ　０浄書（内容に変更なし） んｈ　−ツ　ロ１ 浄書（内容【；変更なし） 第６図 ＨＢ５Ａｇ　（ｎｇ／ｍＬ　） 第　ｒ　区 手続補正書（方式） 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、事件の表示　ＰＣＴ／ＵＳ８６１０’０４７６３、補正をする者 事件との関係　出願人 図面の翻訳文　代理権を証明する書面 ７、補正の内容　別紙のとおり 国際調査報告

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．立体配座−依存抗原決定基および立体配座−独立抗原決定基の両者を含むタ ンパク抗原からポリペプチド立体配座−独立抗原を製造する方法であって、 （ａ）立体配座−独立抗原決定基のアミノ酸残基配列およびエピトープ並びに立 体配座−依存抗原決定基のアミノ酸残基配列およびエピトープを含有する単一の タンパク抗原を作製し、（ｂ）水性媒体中で、有効量の変性剤と上記タンパク抗 原とを混合して混合物を形成し、 （ｃ）上記変性剤が上記タンパク抗原の立体配座−依存決定基のエピトープを実 質的に変性し、かつ（ｉ）立体配座−独立抗原決定基のアミノ酸残基配列および エピトープを含み、かつ（ｉｉ）立体配座−依存抗原決定基のアミノ酸残基配列 を含み、そのエピトープに乏しいポリペプチド抗原を生成するのに十分な予め定 められた時間、上記混合物を維持し、 （ｄ）上記水性媒質から上記ポリペプチド抗原を回収する、各工程を含む上記ポ リペプチド立体配座−独立抗原の製造法。
2. ２．上記タンパク抗原が肝炎Ｂウィルスのゲノムによりコードされることを特徴 とする請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．上記立体配座−依存抗原決定基が、上記肝炎ＢウィルスのＳ領域に含まれて いることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．上記立体配座−独立抗原決定基が上記肝炎Ｂウィルスのプレ−Ｓ（２）領域 に含まれていることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．上記変性剤が界面活性剤とシスチンジスルフィド結合切断剤との混合物であ る請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．上記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムであり、かつ上記シスチンジスル フィド結合切断剤が２−メルカプトエタノールであることを特徴とする請求の範 囲第５項記載の方法。
7. ７．立体配座−独立抗原決定基および立体配座−依存抗原決定基の両者が単一の タンパク抗原内に存在する場合に、該立体配座−独立抗原決定基に対する抗体の 存在についてサンプルを免疫学的に測定するための診断系であって、該系が少な くとも１つのコンテナを含み、該コンテナは固体担体としての固体マトリックス に固定された有効量のポリペプチド抗原を含み、該ポリペプチド抗原が（ｉ）上 記立体配座−依存決定基のアミノ酸残基配列を含むが、該決定基のエピトープに 乏しく、かつ（ｉｉ）上記立体配座−独立決定基のアミノ酸残基配列およびエピ トープを含むことを特徴とする上記診断系。
8. ８．更に第２のコンテナを含み、該コンテナが上記立体配座−独立決定基と、測 定すべきサンプルからの抗体との免疫反応を検出することのできる指示手段を有 効量で含有することを特徴とする請求の範囲第７項記載の診断系。
9. ９．更に第２のコンテナを含み、該コンテナが上記立体配座−独立決定基のエピ トープと免疫反応し、かつこれと結合し、かつ上記サンプル中の測定すべき抗原 のエピトープとも免疫反応し、しかもこれと結合する公知の抗体を予め定められ た量で含有し、更に第２のコンテナを含み、該第３のコンテナが、上記固体担体 に固定された立体配座−独立決定基のエピトープと上記公知の抗体との免疫反応 を検出し得る指示手段を含むことを特徴とする請求の範囲第７項記載の診断系。
10. １０．肝炎ＢウィルスゲノムによってコードされるＳ領域に対する抗体の存在下 で、該ゲノムによってコードされるプレ−Ｓ（２）領域に対する抗体を含有する サンプルの測定を実施することのできる診断系であって、少なくとも一つのコン テナを含み、該コンテナが固体担体に固定された有効量のポリペプチド抗原を含 み、該ポリペプチド抗原が（ａ）該肝炎ＢウィルスによってコードされたＳ領域 のアミノ酸残基配列を含み、かつ該Ｓ領域のエピトープに乏しく、しかも（ｂ） 該ウィルスによってコードされたプレ−Ｓ（２）領域のアミノ酸残基配列および 抗原決定基を含むことを特徴とする上記診断系。
11. １１．上記ポリペプチド抗原が約３４，０００ダルトンの分子量を有するもので あることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の診断系。
12. １２．測定すべきサンプル中で、立体配座−依存抗原に対する抗体の存在下で、 立体配座−独立抗原に対する抗体を検出するための固相測定法であって、 （ａ）固体マトリックスに固定された有効量のポリペプチド抗原を含む固体担体 を作製し、但し該ポリペプチド抗原は（ｉ）立体配座−独立抗原決定基のアミノ 酸残基配列およびエピトープを含み、しかも（ｉｉ）立体配座−依存抗原決定基 のアミノ酸残基配列を含むが、該抗原決定基のエピトープに乏しい、（ｂ）該固 体担体と、立体配座−独立抗原決定基に対する抗体について測定すべき液状サン プルのアリコートとを混合して、固相／液相混合物を形成し、 （ｃ）上記立体配座−独立抗原決定基に対する抗体が上記固体担体の上記抗原決 定基と免疫反応し、かつこれと結合するのに十分な予め定められた時間、該混合 物を維持し、（ｄ）上記固相と液相とを分離し、 （ｅ）上記固体担体に結合している抗体の存在を測定する、各工程を含むことを 特徴とする、上記固相測定法。
13. １３．上記タンパク抗原が肝炎Ｂウイルスのゲノムでコードされることを特徴と する請求の範囲第１２項記載の固相測定法。
14. １４．上記立体配座−依存抗原決定基が上記ウィルスのゲノムのＳ領域でコード されることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の方法。
15. １５．上記測定すべきサンプルがヒトからのものであることを特徴とする請求の 範囲第１４項記載の方法。
16. １６．被測定サンプル中の、肝炎Ｂウィルスによってコードされたをプレ−Ｓ（ ２）領域に対する抗体を検出するための固相測定法であって、 （ａ）（ｉ）上記肝炎ＢウィルスによりコードされたＳ領域のアミノ酸残基配列 を有するが、Ｓ領域のエピトープに乏しく・かつ（ｉｉ）上記ウィルスによって ロードされたプレ−Ｓ（２）領域のアミノ酸残基配列および抗原決定基を含み、 固体マトリックスに固定されているポリペプチド抗原の有効量を含有する固体担 体を作製し、 （ｂ）該固体担体を、上記プレ−Ｓ（２）領域に対する抗体を測定すべき液状サ ンプルのアリコートとを混合して、固相／液相混合物を形成し、 （ｃ）上記プレ−Ｓ（２）領域に対する固体が上記固体担体の抗原決定基と免疫 反応し、かつ結合するのに十分な、予め定められた時間、上記混合物を維持し、 （ｄ）該固相と液相とを分離し、 （ｅ）上記固体担体に結合した抗体の存在を決定する、各工程を含むことを特徴 とする上記固相測定法。
17. １７．上記タンパク抗原が分子量約３４，０００ダルトンを有する請求の範囲第 １６項記載の方法。
18. １８．上記被測定サンプルがヒトから得られたものである請求の範囲第１６項記 載の方法。
19. １９．上記工程（ｅ）における固体担体に結合した第１の抗体の存在を、 （ｆ）上記工程（ｄ）で分離された固体担体と、上記第１の抗体と免疫反応し、 かつ結合する第２の抗体を結合した指示手段を含む液状組成物とを混合して第２ の固相／液相混合物を形成し、ここで、該指示手段は上記第２並びに第１抗体間 の免疫反応を検出し、それによって上記混合物中に上記第１抗体が存在するか否 かを検出する、 （ｇ）上記第２抗体が上記第１抗体と免疫反応しかつ結合するのに十分な予め決 められた時間、上記第２の固相／液相混合物を維持し、 （ｈ）該第２の固相／液相混合物から固相および液相を分離し、（ｉ）上記指示 手段からのシグナルが存在するか否かを検査する、各工程によって決定すること を特徴とする請求の範囲第１６項記載の方法。
20. ２０．立体配座−独立抗原決定基のエピトープとも免疫反応し、かつ結合する抗 体と免疫反応し、結合する被測定サンプル中の抗原エピトープを検出するための 固相測定法であって、（ａ）固体マトリックスに固定されたポリペプチド抗原の 有効量を含む固体担体を作製し、ただし該ポリペプチド抗原は（ｉ）立体配座− 独立抗原決定基のアミノ酸残基配列およびエピトープを含み、（ｉｉ）立体配座 −依存抗原決定基のアミノ酸残基配列を含むが、該決定基のエピトープに乏しい ものである。 （ｂ）上記抗原エピトープの存在を測定すべき液状サンプルのアリコートと、予 め決められた量の公知の抗体とを混合して、液相混合物を形成し、ここで該公知 の抗体は上記測定すべき抗原エピトープおよび上記立体配座−独立決定基のエピ トープと免疫反応し、結合する、 （ｃ）上記公知の抗体が上記測定すべき抗原エピトープと免疫反応し、かつ結合 するのに十分な予め決められた時間、上記液相混合物を保持し、 （ｄ）その後、該液相混合物と上記固体担体とを混合して固／液混合物を形成し 、 （ｅ）該公知の抗体が該固体担体に固定された抗原決定基のエピトープと免疫反 応し、結合するのに十分な予め定められた時間、上記固相／液相混合物を維持し 、 （ｆ）該固相と液相とを分離し、 （ｇ）上記固体担体に結合した抗体の存在を決定する、各工程を含むことを特徴 とする上記固相測定法。
21. ２１．上記抗原エピトープが肝炎Ｂウィルスによってコードされたプレ−Ｓ（２ ）領域にあることを特徴とする請求の範囲第２０項記載の方法。
22. ２２．上記立体配座−独立抗原エピトープが肝炎Ｂウィルスによってコードされ たプレ−Ｓ（２）領域にあることを特徴とする請求の範囲第２０項記載の方法。
23. ２３．被測定サンプル中の、肝炎Ｂウィルスによりコードされたプレ−Ｓ（２） 領域の存在の測定法であって、（ａ）固体マトリックスに固定されたポリペプチ ド抗原の有効量を含有する固体担体を作製し、ここで該ポリペプチド抗原は（ｉ ）肝炎Ｂウィルスによりコードされたプレ−Ｓ（２）領域のエピトープおよびア ミノ酸残基配列を含み、かつ（ｉｉ）該ウィルスによりコードされたＳ領域のア ミノ酸残基配列を含み、一方該Ｓ領域のエピトープに乏しい、 （ｂ）上記プレ−Ｓ（２）領域のエピトープの存在を測定するための液状サンプ ルのアワコートと、該エピトープと免疫反応し、結合することが知られている抗 体の予め決められた量とを混合して、液相混合物を形成し、 （ｃ）上記抗体が上記サンプル中に存在するプレ−Ｓ（２）領域のエピトープと 免疫反応し、結合するのに十分な予め決められた時間、上記液状混合物を維持し 、 （ｄ）その後、該液状混合物と上記固体担体とを混合して、固相／液相混合物を 得、 （ｅ）上記抗体が上記固体担体のプレ−Ｓ（２）領域のエピトープと免疫反応し 、結合するのに十分な予め定められた時間、該固／液混合物を維持し、 （ｆ）該固相と液相とを分離し、 （ｇ）上記固体担体に結合した抗体の存在およびその量を決定する、ただし結合 した抗体の量と、上記既知量の上記公知の抗体によって示される対照の結合量と の差が上記サンプル中における上記抗原エピトープの存在を示す、 各工程を含むことを特徴とする上記測定法。
24. ２４．上記公知の抗体が、アミノ酸残基配列につき、上記プレ−Ｓ（２）領域の エピトープの配列に対応するポリペプチド免疫原によって生ずるものである請求 の範囲第２３項記載の方法。
25. ２５．上記ポリペプチドが以下の式： 【配列があります】 で示される、左から右に書かれ、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって表わ されたアミノ酸残基配列を有することを特徴とする請求の範囲第２４項記載の方 法。
26. ２６．上記ポリペプチド抗原が約３４，０００の分子量を有することを特徴とす る請求の範囲第２３項記載の方法。
27. ２７．上記サンプルが血液、血清、血漿、髄液、唾液、リンパ液、尿、精液、組 織ホモジネート、胆汁、腸含有物および気管支洗液からなる群から選ばれること を特徴とする請求の範囲第２３項記載の方法。
28. ２８．Ｓ領域の免疫原に対して低い応答性を示す動物中の肝炎Ｂウイルスにより コードされた該Ｓ領域の免疫原に対する体液の免疫応答性を高める方法であって 、Ｓ領域のポリペプチド免疫原と化学的に結合している上記ウイルスゲノムによ りコードされたプレ−Ｓ（２）領域のポリペプチドの有効量を分散状態で含む生 理的に許容される稀釈剤を含有するワクチンを上記動物に投与することを含み、 該Ｓ領域の免疫原は有効量で存在していて、プレ−Ｓ（２）領域含有ポテンシェ ータと化学的に結合したＳ領域含有免疫原に対し応答性を示す動物を保護し、こ こで正常な動物は上記ワクチン投与した動物と同種のものである、ことを特徴と する上記方法。
29. ２９．上記有効量が測定し得るＳ領域の免疫原の量の少なくとも約１／２０であ ることを特徴とする請求の範囲第２８項記載の方法。