PT97632A - Processo de obtencao de polipeptidos relacionados com a proteina do antigenio de superficie do virus da hepatite b e de vacinas que os contem - Google Patents
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Classifications
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Description
72591 SCRF Case 95.2 -2-
MEMÓRIA DESCRITIVA
Referência Cruzada ao Pedido de Patente Relacionado
Este pedido de patente é uma continuação em parte do pedido de patente N® de Série 060 214, depositado em 10 de Junho de 1987, pedido esse que é uma continuação em parte do pedido de patente N® de Série 877 020, depositado em 20 de Junho de 1986, cujas descrições são aqui incorporadas para referência.
Campo Técnico do Invento O presente invento refere-se ao processo de preparação de novos polipéptidos relacionados com a proteína do antigénio de superfície do vírus da hepatite B (AgHBs) e à utilização daqueles polipéptidos em vacinas, reagentes de diagnóstico e semelhantes.
Antecedentes do Invento A hepatite virai continua a ser considerada como uma das doenças da Humanidade, mais importante, não dominada. 0 termo geral, hepatite virai, refere-se principalmente à hepatite A (hepatite infecciosa), à hepatite B (hepatite sérica) e à hepatite não-A e, não-B, embora outros vírus conhecidos tais como o vírus da febre amarela, o vírus de Epstein-Barr e o citomegalovírus possam causar a hepatite no homem. A hepatite é particularmente conhecida pelo seu ataque focal no fígado (Greek, hepar), mas a doença influencia também outros orgãos.
Seria desejável produzir uma vacina e os anticorpos resultantes que iriam proporcionar protecção contra o vírus da Hepatite B (HBV) e as doenças que ele causa. Historicamente, as vacinas e anticorpos têm sido preparados por morte ou atenuação dos vírus e depois injecção das partículas de vírus resultantes num paciente ou animal hospedeiro. Contudo, tais vacinas têm sempre o perigo inerente de o vírus poder não estar completamente morto ou suficientemente atenuado. Por vezes, a própria "vacina" causa a doença. 72591
SCRF Case 95.2 -3- 0 perigo dos vírus não atenuados pode, por vezes, ser ultrapassado utilizando só uma porção do vírus. Esta porção é normalmente uma proteína de uma cápside ou envólucro que forma a porção exterior do vírus. Contudo, até mesmo este processo não está livre de dificuldades bem conhecidas que incluem possíveis respostas patogénicas. A vacina produzida pode incluir antigénios que competem com, ou são mesmo prejudiciais para, a resposta imunitária desejada. Pode também estar presente um outro material antigénico que não está relacionado com a resposta imunitária desejada e que pode causar efeitos secundários indesejáveis.
Além disso, o HBV não se multiplica eficazmente em cultura celular, por consequência, não há nenhuma fonte de cultura de tecidos disponível para o HBV como imunogénio. Têm sido feitas várias tentativas para fabricar vacinas e anticorpos para outras doenças por outros processos. Estes processos incluem a produção de células produtoras de antigénio e de anticorpo por técnicas de ADN recombinante e processos de hibridoma. Contudo, estes processos para além de serem relativamente complicados e caros, são demorados e têm rendimentos quantitativos e qualitativos relativamente baixos. Deve ser tomado muito cuidado na preparação da vacina ou da célula produtora de anticorpo e na colheita do produto desejado. Há também preocupação quanto à segurança e confiança de qualquer processo que necessite do produto desejado a ser separado dos componentes não desejados, possivelmente patogénicos.
Em 1965, BlumBerg descobriu um antigénio que circula no sangue de certos seres humanos; (1965) J. Am. Med. Assoe.. 191:541 e (1967) Ann. Int. Med.. 66:924. Subsequentemente, Prince, verificou que esta substância era o antigénio de superfície do vinis da hepatite B (AgHBs) que é produzido em abundância por indivíduos que estão cronicamente infectados com o agente virai; (1968) Proc. Natl. Acad. Sei. fUSA^. 60:814. 0 antigénio de superfície da hepatite B (AgHBs) que ocorre naturalmente é composto por um polipéptido principal referido 72591 SCRF Case 95.2
como p25, e sua forma glicosilada, gp28. Contudo, foram identificados polipéptidos adicionais de maior peso molecular (p39/gp42 e gp33/gp36); Heermann. et alr (1984) J. Virol. 52:396: Stibbe, et al. (1982) Virol 123;436: Machida, et al. (1984) Gastroenterol. 86:910. A grande estrutura de leitura aberta (ORF) para o AgHBs termina num único codão de paragem mas pode iniciar-se em três possíveis codãos de início da tradução, que definem as regiões pre-Sl, pre-S2 e S originando os polipéptidos referidos como p39, p33 e p25, respectivamente. Todos os três polipéptidos partilham os 226 resíduos de aminoácidos da região s (p25). o p33 consiste na sequência p25 mais 55 resíduos do terminal amino (pré-S2); e o p39 consiste na sequência de p33 mais 119 resíduos do terminal amino (pré-Sl) no subtipo adw ou 108 resíduos no subtipo avw devido a uma deleção no terminal NH2 de 11 resíduos; Tiollais et al. (1981) Science 213:406. As posições dos resíduos de aminoácidos da região pre-S do AgHBs são numeradas no sentido do terminal carboxilo e de modo a que a posição 120 seja a primeira posição no polipéptido da região pré-S(2) de todos os subtipos de HBV. A numeração das posições começa de novo no polipéptido da região S com a posição 1 designada como o resíduo do terminal amino. O AgHBs tem sido o sujeito de uma extensa caracterização imunoquímica. Estudos serológicos mostram que várias estirpes do vírus da hepatite B (HBV) têm uma ou mais determinantes em comum, que são designadas por a. Cada estirpe tem também duas outras determinantes; quer a d. ou e quer a w ou r.. A especificidade do AgHBs está associada a um único polipéptido (Gold, et al. (1976) J. Immunol.. 117:1404 e Shih, et al (1978) J. Immunol. . 120.:520), cuja sequência completa de 226 aminoácidos é estabelecida a partir da sequência de nucleótidos do gene S do HBV (Tiollais, et al. (1981) Science. 213.:406); Valenzuela, et al, (1979) Nature (Londres), 280:815: Galibert, et al. (1979) Nature (Londres), 281:646 e Pasek, et alf (1979) Nature (Londres), 282:575.
72591 SCRF Case 95.2 -5-
Embora haja uma necessidade urgente para uma vacina de hepatite B para grupos que estão em maior risco de adquirir esta infecção, como referido acima, os vírus da hepatite A e B, não se multiplicam significativamente em cultura de células; consequentemente, não há qualquer fonte corrente de vírus propagados em laboratório para a preparação de vacinas. As vacinas para o HBV consistem em componentes subvirais do revestimento da superfície do vírus (AgHBs) purificados do plasma de doadores cronicamente infectados por HBV e inactivados; (McAuliffe, et al. (1980) Rev. Infect. Pis. . 2.:470). O processo de purificação produziu partículas contendo AgHBs/p25 mas não AgHBs/p3 3 ou AgHBs/p39. Os ensaios clínicos demonstraram a segurança e eficácia das vacinas de AgHBs correntes mas uma percentagem significativa de pessoas não é protegida por inoculação com tais vacinas devido a uma incapacidade genética para responder ao AgHBs/p25 (não respondentes à região S).
Nos ratinhos, a produção de anticorpos in vivo para o AgHBs é regulada, pelo menos, por dois genes de resposta imunitária (Ir), um na subregião I-A (Ir-HBs-1) e um na subregião I-C (Ir-HBs-2) do complexo H-2 de murino. A ligação entre o complexo principal de histocompatibilidade e a regulação da resposta imunitária ao AgHBs nos ratinhos tem sido alargada à resposta imunitária humana pela descrição de uma associação entre o fenótipo HLA-DR e a não resposta a uma vacina de AgHBs de ensaio, recente.
Em resposta à descoberta de que a região pré-S contém epítopos de célula T que induzem a resposta em algumas estirpes de ratinhos que não respondem à região S, as formulações de vacinas recentes têm incluído uma porção da região pré-S. Em particular, uma vacina disponível comercialmente contém AgHBs/p33ay e uma outra contém AgHBs/p33ad.
Assim, a construção de uma vacina de HBV devia incluir, idealmente, em adição aos epítopos imunogénicos de célula B, uma diversidade suficiente de determinantes epitópicos de célula T
72591 SCRF Case 95.2 para fornecerem a variação genética no reconhecimento do epítopo de uma população humana não consanguínea.
Sumário do Invento
Foram agora determinados os epítopos de célula T da região pré-S(2) de AgHBs. Em particular, mostrou-se, agora que as sequências específicas da região pré-S(2), localizadas entre os resíduos 148 e 174, actuam como epítopos de célula T. Os polipéptidos compósitos compreendendo os epítopos de célula T operativamente ligados ao epítopo de célula B de um AgHBs, normalmente um epítopo específico de grupo, nativo, em orientações específicas, têm sido descritos como imunogénios eficazes.
Na determinação de sequências específicas de epítopo de célula T, verificou-se que os animais que têm diferentes haplotipos H-2 reconhecem diferentes porções da região pré-S(2) como epítopos de células T. Adicionalmente, mesmo numa estirpe animal, podem ser reconhecidas diferentes regiões de subtipos d e y, como epítopos de célula T. Um animal pode também reconhecer um epítopo de célula T na região pré-S(2) de um subtipo mas não no outro. Assim, o presente invento contempla a utilização de epítopos de célula T de ambos os subtipos para sensibilizar ou vacinar para induzir resposta a uma vacina de HBV.
Um aspecto contemplado pelo presente invento é um polipéptido de epítopo de célula T de pré-S(2) de 6 a 50 resíduos de aminoácido consistindo essencialmente numa sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a, pelo menos, uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada a partir do grupo constituído por:
Resíduos 136-155, 136-174, 148-159, 148-174, 149-165, 152-159, 154-170, 156-165, 156-167, 156-170, 159-167, 159-169 e 159-174 da região pré-S(2) do AgHBs/d; e
Resíduos 136-155, 136-174, 146-165, 148-155, 148-165, 148-174,
159-169, e 161-174 da região 72591 SCRF Case 95.2 -7- 151-165, 151-170, 156-165, préS(2) do AgHBs/χ.
Este polipéptido está livre de resíduos de aminoácidos nas posições do terminal amino e do terminal carboxilo gue correspondem a resíduos de aminoácido adjacentes na sequência linear do AgHBs.
Um outro aspecto contemplado é um polipéptido compósito compreendendo um primeiro polipéptido (a) operativamente ligado ao terminal amino de um segundo polipéptido (b). O polipéptido (a) consiste essencialmente num polipéptido de epítopo de célula T de pré-S(2) de 6 a 50 resíduos de aminoácido incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde, pelo menos a uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada a partir do grupo constituído por resíduos 136-155, 136-174, 148-159, 148-174, 149-165, 152-159, 154-170, 156-165, 156-167, 156-170, 159-167, 159-169 e 159-174 da região pré-S(2) do AgHBS/d e resíduos 136-155, 136-174, 146-165, 148-155, 148-165, 148-174, 151-165, 151-170, 156-165, 159-169 e 161-174 da região pré-S(2) do AgHBs/γ.. 0 polipéptido (b) compreende uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a uma sequência de resíduos de aminoácido do AgHBs que contém um epítopo de célula B nativo.
Nas concretizações preferidas, o polipéptido compósito de epítopo de célula B é um epítopo de célula B específico de grupo, que pode conter uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde aos epítopos de célula B específicos de subtipo, uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a um epítopo de célula B de região S, uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a um epítopo de célula B de região pré-S(l) ou a um epítopo de célula B de região pré-S(2) ou um polipéptido de epítopo de célula T de pré-S(2) que corresponde aos resíduos 148-174 da região pré-S do AgHBs/d ou do AgHBs/χ.
Um outro aspecto contemplado por este invento é um polipéptido compósito de pelo menos 14 e não mais do que 100 resíduos de aminoácido compreendendo um primeiro polipéptido (a)
.tf’" í 72591 SCRF Case 95.2 -8-ligado ao terminal amino de um segundo polipéptido (b) em que o polipéptido (a) compreende um epítopo de célula T de pré-S(2) tendo uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde, pelo menos a uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada a partir do grupo constituído pelos resíduos 136-155, 136-174, 148-159, 148-174, 149-165, 152-159, 154-170, 156-165, 156-167, 156-170, 159-167, 159-169 e 159-174 da região pré-S(2) do AgHBS/d e resíduos 136-155, 136-174, 146-165, 148-155, 148-165, 148-174, 151-165, 151-170, 156-165, 159-169 e 161-174 da região pré-S(2) do AgHBs/y_. O polipéptido (b) compreende uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a uma sequência de resíduos de aminoácido do AgHBs que contém um epítopo de célula B nativo.
Nas concretizações preferidas, este polipéptido (b) é um epítopo específico de grupo, que pode possuir uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a um epítopo de célula B de região pré-S(2), nativo, uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a uma sequência de resíduos de aminoácido da região pré-S(2) do AgHBs seleccionada a partir do grupo constituído pelos resíduos 133-139, 133-143 e 137-143, e uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente a, pelo menos, uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada a partir do grupo constituído por (141-174)-(133-140), (146-160)--(133-143), (148-174)-(133-143), (151-165)-(133-143), (151-165)--(133-143), (151-174)-(133-143), da região pré-S(2) do AgHBS . É também contemplada uma vacina do vírus da hepatite B (HBV) de célula T de subtipo compósito compreendendo os polipéptidos (al) e (a2) em que o polipéptido (al) compreende uma sequência de aminoácidos correspondente à sequência de resíduos de aminoácidos de um epítopo de célula T de AgHBs/d, nativo, e o polipéptido (a2) compreende uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à sequência de resíduos de aminoácido de um epítopo de célula T de AgHBs/ϋ, nativo.
As concretizações preferidas podem conter um epítopo de célula T de região pré-S, nativo, (al) compreende uma sequência 72591 SCRF Case 95.2
-9- de resíduos de aminoácido que corresponde a uma sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada a partir do grupo 136-155, 136-174, 148-159, 148-174, 149-165, 152-159, 154-170, 156-165, 156-167, 156-170, 159-167, 159-169 e 159-174 da região pré-S(2) do AgHBS/d, (a2) compreende uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde a uma sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada a partir do grupo constituído por 136-155, 136-174, 146-165, 148-155, 148-165, 148-174, 151-165, 151-170, 156-165, 159-169 e 161-174 da região pré-S(2) do AgHBs/γ. compreendendo adicionalmente, pelo menos, um polipéptido (bl) ou um polipéptido (b2) que está operativamente ligado a, pelo menos um polipéptido (al) ou um polipéptido (a2), em que cada um dos polipéptidos (bl) e (b2) compreende uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à sequência de resíduos de aminoácido de tua epítopo de célula B nativo de AgHBs nativo.
Outras concretizações contêm os polipéptidos (al) e (a2) que estão operativamente ligados aos polipéptidos (bl) e (b2), res-pectivamente, e podem ter a mesma sequência de aminoácido ou estar operativamente ligados ao polipéptido (bl).
Ainda noutras concretizações, a vacina tem, pelo menos, um dos referidos polipéptidos (al) e (a2) presentes numa partícula, e pode ter ambos os polipéptidos na forma de uma partícula heterogénea. É também contemplado por este invento um processo de indução da resposta a uma vacina de HBV compreendendo a administração, cintes ou em conjunto com a administração da vacina, de uma quantidade eficaz de um imunogénio de célula T de subtipo compósito com, pelo menos, um epítopo de célula T de pré-S de AgHBs/d, nativo, e pelo menos um epítopo de célula T de pré-S de AgHBs/i, nativo.
Numa concretização deste processo, o imunogénio pode compreender uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada a partir do grupo constituído por resíduos 136-155, 72591 SCRF Case 95.2
-10- 'V.
136-174, 148-159, 148-174, 149-165, 152-159, 154-170, 156-165, 156-167, 156-170, 159-167, 159-169 e 159-174 da região pré-S(2) do AgHBS/d sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada a partir do grupo 136-155, 136-174, 146-165, 148-155, 148-165, 148-174, 151-165, 151-170, 156-165, 159-169 e 161-174 da região pré-S(2) do AgHBs/y.
Numa concretização, o imunogénio e a vacina são administrados em simultâneo, como uma composição que compreende AgHBs/p39ad e AgHBs/p39ay. É também contemplada por este invento uma porção veículo sintética compreendendo a sequência 148-174 de pré-S(2) do HBV operativamente ligada a um ou mais imunogénios de polipéptido. Numa concretização preferida, a porção veículo é ligada ao terminal N do imunogénio polipéptido.
Breve Descricão das Figuras A Figura 1 ilustra a sequência de aminoácidos da região pré-S de seis subtipos de AgHBs. A Figura 2 ilustra a resposta proliferativa de célula T de ratinhos B10.S (círculos) e B10.M (quadrados) que foram sensibilizados com AgHBs/p39ad (circulos abertos, quadrados abertos) ou AqHBs/p39av (circulos a cheio, quadrados a cheio), relativamente ao desafio subsequente com AgHBs/p33ad. 0 eixo X representa a quantidade de AgHBs/p33ad utilizada para o estudo de proliferação de célula T em μg/ml. 0 eixo Y representa a quantidade de 3H-timidina (TdR[3H]) incorporada nas células T em contagens por minuto (CPMX10-3). A Figura 3 ilustra que a resposta proliferativa de célula T específica de pré-S(2), de B10.S, é específica de subtipo. Um grupo de cinco ratinhos B10.S foi imunizado com 4,0 ^g de (A) AgHBs/P33d ou (B) AgHBs/P33y e 10 dias depois as células do gânglio linfático popliteo (PLN) que drenam foram analisadas quanto à proliferação de célula T in vitro. Os antigénios 72591 SCRF Case 95.2
-11-testados para a indução da proliferação de célula T incluíram as partículas AgHBs/P33 contendo pré-S(2) dos subtipos d e y e as partículas AgHBs/p25 dos dois subtipos, que não tinham a região pré-S(2). A proliferação de célula T é expressa como a absorção de [3H]-TdR corrigida para a proliferação de fundo na ausência de antigénio (CPM). A proliferação de fundo alcançou 850-1500 cpm. A Figura 4 mostra a resposta proliferativa de célula T específica de pré-S(2), de B10.M, que é específica de subtipo. Um grupo de 5 ratinhos BH10.M foi imunizado com 4,0 μg de (A) AgHBs/P33d ou (B) AgHBs/P33y e 10 dias depois as células de PLN que drenam foram analisadas quanto à proliferação in vitro de células T causada pelo conjunto de antigénios indicado, como descrito na Figura 3. A Figura 5 demonstra que o polipéptido (P28) de pré-S(2) truncado pode substituir o polipéptido (P33) de pré-S(2) de comprimento total no que se refere ao reconhecimento de células T. Imunizaram-se grupos de 4 ratinhos cada, das estirpes indicadas, com 4,0 μg de AgHBs/P33d e foram determinadas as respostas proliferativas de célula T in vitro causadas por concentrações variáveis de AgHBs/P33d (P33) ou AgHBs/P28d (P28). As respostas mostradas representam concentrações de antigénio in vitro de 1,0 /xg/ml. A Figura 6 mostra a boa especificidade e dependência de subtipo da estirpe B10 [reconhecimento de célula T da sequência P133-174 da região pré-S(2)]. Imunizaram-se grupos de 5 ratinhos B10 (H-2b) com 100 μg de um péptido sintético representando (A) os resíduos 133-174 do subtipo d ou (B) os resíduos 133-174 do subtipo y da região pré-S(2). Dez dias depois foram recolhidas as células de PLN e analisadas quanto à activação de célula T causada pelas partículas AgHBs/P33 do subtipo apropriado ou por um conjunto de péptidos sintéticos derivados da sequência pré-S(2) de terminal C. É indicado o subtipo de cada sequência. A Figura 7 mostra a boa especificidade e dependência de subtipo da estirpe B10.M [reconhecimento de célula T da sequência 72591 SCRF Case 95.2 -12-
pl33-174 da região pré-S(2)]. Imunizaram-se grupos de 5 ratinhos B10.M (H-2f) com 100 Mg de (A) pl33-174d ou (B) pl33-174y, e foi determinada a proliferação de células T induzida pelo conjunto de antigénios indicado, como descrito na Figura 6. A Figura 8 mostra a boa especificidade e dependência de subtipo da estirpe B10.S [reconhecimento de célula T da sequência P133-174 da região pré-S(2)]. Imunizaram-se grupos de 5 ratinhos B10.S (H-2s) com 100 μg de (A) pl33-174d ou (B) pl33-174y e foi determinada a proliferação de célula T induzida pelo conjunto de antigénios indicado, como descrito na Figura 6. A Figura 9 mostra a boa especificidade e dependência de subtipo da estirpe B10.D2 [reconhecimento de célula T da sequência pl33-l74 da região pré-S(2)]. Imunizaram-se grupos de 5 ratinhos B10.D2 (H-2d) com 100 βg de (A) pl33-174d ou (B) pl33-174y, e foi determinada a proliferação de célula T induzida pelo conjunto de antigénios indicado, como descrito na Figura 3. A Figura 10 representa um sumário dos locais de reconhecimento de célula T nos subtipos d e y da região pré-S(2) idêntifi-cados entre um conjunto de estirpes de morinos representando 8 haplótipos H-2 distintos. Mostra-se a sequência de aminoácido da região pl48-174 do subtipo adw2 e a sequência de aminoácido do subtipo ayw é indicada por letras enquadradas. Similarmente, os locais de reconhecimento de célula T relevantes para a sequência do subtipo adw2 são indicados por linhas tracejadas. Os locais descritos não representam necessáriamente o tamanho mínimo requerido para induzir a proliferação de células T, mas representam sequências capazes de induzir a proliferação de células T pelo menos 10 vezes maior do que a de fundo a uma concentração de 10 Mg/ml. Os imunogénios utilizados para sensibilizar as células T utilizadas para definir estes locais incluem: AgHBs/P33 d e y, pl33-l74 d e y, e pl48-174d. N.D., não determinado. A Figura 11 mostra que a sensibilização com o AgHBs/P33 nativo provoca células T reactivas com antigénios péptido derivados da metade do terminal C da região pré-S(2). 72591
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Imunizaram-se grupos de 4 ratinhos B10(A) ou BIO.M(F) cornai,0 μg de AgHBs/P33d e determinaram-se as respostas proliferativas de célula T a células de PLN específicas para o conjunto de antigénios indicado, como descrito na Figura 3. A Figura 12 mostra como o contexto de um local de célula T pode influenciar a sua imunogenicidade. Imunizaram-se grupos de quatro ratinhos B10.S com 100 μg dos imunogénios péptido indicados, em adjuvante de Freund completo (CFA). Dez dias depois foram colhidas as células de PLN que drenam e foram analisadas as respostas proliferativas de células T induzidas por concentrações de 20 μg/ml de pl56-170 (barra vazia) e pl61-174 (barra a cheio). Os dados são expressos como uma percentagem da proliferação induzida pelo péptido imunizante, corrigida para o fundo. A Figura 13 é uma representação esquemática das respostas das células T e B aos imunogénios de pré-S(2) nativos e sintéticos. B-^ e B2 representam locais dominantes de ligação de anticorpo 6^612 representam locais dominantes de reconhecimento de célula T na estirpe B10.S. A presença de um símbolo The dentro de um circulo indica o reconhecimento de célula T do local de célula T indicado. A produção de anticorpos é indicada por linhas que irradiam do local de célula B.
Descrição Detalhada do Invento I. Introdução
Verificou-se que a inoculação de algumas estirpes de animais, que não respondem às regiões pré-S(2) e S do AgHBs (antigénio de superfície do vírus da hepatite B), com imunogénios contendo epítopos de célula T da região pré-S(l) estimulou a produção de anticorpo para as regiões pré-S(2) e S, para além do anticorpo específico para pré-S(l), ultrapassando assim a não resposta a uma vacina de vírus da hepatite B (HBV) (Milich, et al. J. Immunol. 137:315, 1986). Para facilitar a construção de vacinas totalmente ou parcialmente sintéticas, foram investigadas sequências de aminoácido que actuam como epítopos de célula T. Num aspecto deste invento, são contemplados os epítopos de célula
T da região pré-S(2) de AgHBs utilizados para sensibilizar ou vacinar um animal hospedeiro. Determinou-se agora gue aqueles epitopos de célula T estão localizados entre os resíduos 136 e 174 , com a maioria dos epitopos de célula T localizados entre os resíduos 148 e 174 da região pré-S(2).
Adicionalmente, foi agora mostrado que diferentes porções da região pré-S(2) actuam como epitopos de célula T em diferentes estirpes da mesma espécie de animal. Além disso, numa estirpe, podem ser reconhecidas diferentes regiões dos subtipos d e y como epitopos de célula T, ou uma estirpe pode reconhecer um epítopo de célula T na região pré-S(2) de um subtipo mas não reconhecer qualquer epítopo de célula T na região pré-S(2) do outro subtipo. Assim, num outro aspecto, o presente invento contempla a utilização de epitopos de célula T de ambos os subtipos, para sensibilizar ou vacinar um animal hospedeiro, para mitigar a não resposta a uma vacina de HBV. A sequência de resíduos de aminoácido da região pré-S de seis subtipos de HBV está ilustrada na Figura 1. O código de aminoácidos de uma letra utilizado na figura está ilustrado abaixo, na Tabela 1.
Aminoácido Tabela I Aberviatura de três letras Símbolo uma le' Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Ácido aspártico Asp D Asparagina ou ácido aspártico Asx B Cisteína Cys C Glutamina Gin Q Ácido glutâmico Glu E Glutamina ou ácido glutâmico Glx Z Glicina Gly G Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met H Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Thr T Triptofano Trp W Tirosina Tyr Y Valina Vai V
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II. Polipéptidos A. Polipéptidos do Epítopo de Célula T de Pré-Sf2^ 0 presente invento proporciona polipéptidos do epítopo de célula T de pré-S(2) de AgHBs. Os polipéptidos do epítopo de célula T de pré-S(2) deste invento são epítopos de célula T de AgHBs nativo. Isto é, os polipéptidos deste invento sensibilizam o auxílio da célula T relevante para o AgHBs nativo, além do auxílio da célula T relevante para o polipéptido. Assim, quando os polipéptidos do epítopo de célula T de pré-S(2) deste invento são utilizados para sensibilizar um animal hospedeiro, as células T sensibilizadas proliferam em resposta ao AgHBs e proporcionam o auxílio da célula T no reconhecimento da célula B do AgHBs.
Um polipéptido do epítopo de célula T deste invento inclui cerca de 6 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos compreendidos por uma sequência de resíduos de aminoácidos que corresponde a, pelo menos, uma sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada a partir do grupo constituído por:
Resíduos 136-155, 136-174, 148-159, 148-174, 149-165, 152-159, 154-170, 156-165, 156-167, 156-170, 159-167, 159-169 e 159-174 da região pré-S(2) do AgHBs/d; ou
Resíduos 136-155, 136-174, 146-165, 148-155, 148-165, 148-174, 151-165, 151-170, 156-165, 159-169, e 161-174 da região pré-S(2) do AgHBs/χ.
Por comodidade, será aqui utilizada a abreviatura p - (ou _- -_) para referir um polipéptido correspondente a uma porção da região pré-S, onde os espaços em branco indicam as posições do terminal amino ou carboxilo, respectivamente, do péptido. 0 polipéptido do epítopo de célula T pode incluir não mais do que 10, preferivelmente não mais do que 5, resíduos de aminoácido em cada uma das posições do terminal amino e do terminal carboxilo das sequências enumeradas que correspondem aos resíduos de aminoácidos adjacentes na sequência linear do AgHBs. Mais
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SCRF Case 95.2 -16-preferivelmente, o polipéptido do epítopo de célula T está isento de resíduos de aminoácido nas posições do terminal amino e nas posições de terminal carboxilo que correspondem aos resíduos de aminoácidos adjacentes na sequência linear do AgHBs. Um polipéptido do epítopo de célula B deste invento pode incluir uma pluralidade das sequências ou repetições ou repetições parciais das sequências, acima descritas.
Os epítopos de célula T nativos para várias estirpes de ratinhos estão indicados na Tabela 2, abaixo. 0 procedimento para a determinação dos epítopos de célula T relevantes é descrito, em detalhe, nos exemplos.
Epítopos Tabela 2 de célula T de t>ré-S(2) Estiroe ad av B10.P 149-165 151-170 B10 148-159 136-155 152-159 151-165 148-155 148-165 B10.BR 156-165 156-165 B10.M 156-167 N.R. B10.D2 156-170 146-165 B10.S 154-170 161-174 159-174 c3h.q 159-169 159-169 B10.RIII 159-167
Os resíduos de aminoácido que compreendem as sequências acima estão registados na Figura 1. Como mostrado naquela figura, há sequências ilustradas para 6 subtipos de AgHBs e todos os resíduos de aminoácidos não são os mesmos numa dada posição. Como aqui utilizadas, as sequências de AgHBs destinam-se a incluir as sequências alinhadas quer nas formas glicosiladas quer não glico-siladas para todos os subtipos de HBV, a não ser que seja de outro modo referido.
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Os resíduos de aminoácido presentes num polipéptido do epítopo de célula T do invento, além de uma sequência correspondente a uma sequência anteriormente descrita, podem ser quaisquer resíduos que não afectem materialmente as características básicas e novas de um polipéptido, como a seguir discutido. Tais resíduos adicionais são normalmente adicionados a um ou a ambos os terminais de um polipéptido descrito e podem incluir repetições e repetições parciais de uma sequência de polipéptido ou resíduos adjacentes da sequência de proteína AgHBS.
Podem ser adicionados um ou mais resíduos, normalmente no terminal carboxilo, com a finalidade de proporcionar um "ligador" ("linker") pelo qual os polipéptidos deste invento podem ser, de modo adequado, operativamente ligados uns aos outros ou, normalmente a um polipéptido do epítopo de célula B de AgHBs para formar um polipéptido compósito deste invento, como a seguir descrito em detalhe. Os resíduos de aminoácido ligadores são normalmente, pelo menos, um resíduo e podem ser 40 ou mais resíduos, mais frequentemente 1 a 10 resíduos. Os resíduos de aminoácido típicos utilizados para a ligação são a tirosina, cisteína, lisina, ácido glutâmico e aspártico, ou semelhantes. Adicionalmente, uma sequência de polipéptido deste invento pode diferir da sequência natural pela modificação da sequência por acilação do terminal NH2, por exemplo, acetilação, carboxilami-dação, por exemplo, amoníaco, metilamina, etc.
Uma sequência de polipéptido do epítopo de célula T do presente invento tem uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a uma porção da sequência de resíduos de aminoácido de AgHBs. Assim, um polipéptido do epítopo de célula T do presente invento não necessita de ser idêntico à sequência de resíduos de aminoácido de AgHBs. Normalmente, os análogos de péptido mantêm uma actividade de proliferação de células T subs-tâncialmente idêntica. Por consequência, um polipéptido do epítopo de célula T pode ser submetido a várias mudanças, tais como inserções, delecções e substituições, conservativas ou não conservativas, onde tais mudanças proporcionem certas vantagens 72591
SCRF Case 95.2 -18 na sua utilização e mantenham o atributo funcional importante de estimulação de células T.
As substituições conservativas são aquelas onde um resíduo de aminoácido é substituído por um outro resíduo biologicamente semelhante. Os exemplos de substituições conservativas incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por um outro, ou a substituição de um resíduo polar por um outro tal como um de entre a arginina e a lisina, de entre os ácidos glutâmico e aspártico ou de entre a glutamina e a asparagina e semelhantes. 0 termo "substituição conservativa" inclui também a utilização de um aminoácido substituído em vez de um aminoácido progenitor não substituído desde que um tal polipéptido exiba também a actividade de ligação requerida.
Quando um polipéptido do presente invento tem uma sequência que não é idêntica a uma porção da sequência de AgHBs por terem sido feitas uma ou mais delecções, inserções ou substituições conservativas ou não conservativas, normalmente não difere em mais do que cerca de 20% e mais frequentemente em não mais do que 10% dos resíduos de aminoácido. Como aqui utilizadas, as sequências que "correspondem substancialmente" a uma sequência específica são aquelas que têm não mais do que 10% de deleções, inserções ou substituições. Claro que podem ser adicionados resíduos adicionais em qualquer um dos terminais. Os resíduos adicionais podem corresponder aos resíduos adjacentes na sequência linear do AgHBs como foi previamente descrito, ou podem ser repetições da sequência ou resíduos de aminoácido que não estão relacionados com o AgHBs.
Os polipéptidos do presente invento podem ser sintetizados por quaisquer técnicas que sejam conhecidas daqueles peritos na arte dos polipéptidos. Pode ser encontrado um excelente sumário das muitas técnicas disponíveis em J. M. Steward e J. D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W. H. Freeman Co., São Francisco, 1969, e J. Meinhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Vol 2, p. 46, Academic Press (New York), 1983 para
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viS0* -19-síntese de péptidos em fase sólida, e E. Schroder e K. Kubke, "The Peptides", Vol. 1, Academic Press (New York), 1965 para a síntese clássica em solução.
Um polipéptido do epítopo de célula T é utilizado na sensibilização de um animal para estimular o reconhecimento de célula T do AgHBs antes ou em conjunto com a administração de uma vacina. Um polipéptido do epítopo de célula T deste invento é também utilizado como um imunogénio que sensibiliza células T que correspondem ao AgHBs nativo quando o epítopo de célula T está ligado a um polipéptido do epítopo de célula B de AgHBs.
Um polipéptido do epítopo de célula T deste invento é também útil como um substituto para imunogénios bem conhecidos tais como KLH, toxóide do tétano e gamaglobulina de bovino quando é desejada a indução específica de anticorpo. Os péptidos do epítopo de célula T deste invento são seguros, definidos e activos nas células T, o que os torna substitutos vantajosos para os imunogénios heterólogos.
Geralmente, os polipéptidos do epítopo de célula T deste invento utilizam-se para sensibilizar células T que correspondem ao AgHBs nativo do mesmo subtipo. Contudo, quando ligados aos polipéptidos do epítopo de célula B de AgHBs, estes péptidos estimulam a produção de anticorpo para o AgHBs, além de sensibilizarem células T.
B. Polipéptidos do Epítopo de Célula B
Um epítopo de célula B pode ser específico de subtipo ou específico de grupo (também referido como um epítopo de reacção cruzada), mais frequentemente específico de grupo. Um polipéptido do epítopo de célula B compreende uma sequência de aminoácido de, pelo menos, seis resíduos de aminoácido e pode incluir várias centenas de resíduos. Este epítopo pode compreender uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a um epítopo de célula B nativo que está isento de resíduos adjacentes na sequência AgHBs que não está envolvida no local de reconhecimento de 72591 SCRF Case 95.2
JL -20- y. anticorpo, ou alternativamente, pode ser ÀgHBs natural ou as regiões S, pré-S(l) ou pré-S(2) ou seus fragmentos ou combinações.
Os epítopos de célula B nativos de AgHBs são bem conhecidos e incluem os resíduos de aminoácido 32-41, 32-53, 94-105, 106--117, na região pré-S(l) (Milich, et al. J. Immunol.. 138:4457--4465, 1987), e 133-139 e 137-143 (Milich, et al. J. Immunol.. 137:2703-2710, 1986) na região pré-S(2). Os epítopos de célula B da região S são descritos por Frank R. Harmon e Joseph L. Melnick em "Synthetic Vaccines for Virai Hepatitis" (vol. 2, p. 31 em Svnthetic Vaccines. Ruth Arnon ed. CRC Press, 1987). III. Polipéotidos Compósitos A. Descrição
Um polipéptido compósito do presente invento compreende um primeiro polipéptido (a) que está operativamente ligado a um segundo polipéptido (b). 0 polipéptido (a) compreende um polipéptido do epítopo de célula T de pré-S(2) deste invento. 0 polipéptido (b) compreende uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a um epítopo de célula B de AgHBs nativo. Por "operativamente ligado" entende-se que o polipéptido do epítopo de célula T está covalentemente ligado ao polipéptido do epítopo de célula B. A ligação covalente pode ser uma ligação peptídica de modo que os [polipéptidos (a) e (b)] péptidos do compósito estejam ligados para formar uma única estrutura primária. Alternativamente, as subunidades peptídicas correspondentes aos polipéptidos (a) e (b) podem ser ligadas por uma outra ligação diferente da ligação peptídica, por exemplo através de uma cadeia lateral de resíduos de aminoácidos, formando assim aquilo que é tipicamente conhecido na arte como um "conjugado". Os polipéptidos compósitos podem ter um ou mais do mesmo ou diferente polipéptido do epítopo de célula T de pré-S(2) ligados a um ou mais polipéptidos do epítopo de célula B. Numa concretização, o polipéptido compósito compreende um ou mais polipéptidos do epítopo de célula T de pré-S(2) ligados a um 72591 SCRF Case 95.2 4? -21- fragmento de AgHBs relativamente grande, tal como p25, p33 ou p39. Quando o fragmento inclui a região pré-s(2), o epítopo de célula T será de um subtipo diferente do do epítopo de célula B (por exemplo p33/d + 148-174/y recombinante). Contudo, quando a região pré-S(2) não está presente no fragmento, i.e., quando o fragmento é AgHBs/p25, o epítopo de célula T pode ser de um ou ambos os subtipos. Assim, pode ser incluído ou um epítopo ou uma pluralidade de epítopos de célula T de pré-S(2) num polipéptido compósito.
Numa concretização preferida, os polipéptidos compósitos são sequências de resíduos de aminoácido relativamente curtas e são, por consequência, facilmente sintetizados por via química. Naquela concretização, os polipéptidos compósitos incluem, pelo menos, cerca de 14 e não mais do que cerca de 100 resíduos de aminoácido; preferivelmente não mais do que cerca de 50 resíduos de aminoácido; e mais preferivelmente não mais do que cerca de 30 resíduos de aminoácido. Naquela mesma concretização, um único polipéptido do epítopo de célula T de pré-S(2) será normalmente ligado a um único polipéptido do epítopo de célula B. O epítopo de célula T de pré-S(2) pode ser do mesmo ou de subtipo diferente do epítopo de célula B.
Os polipéptidos (a) e (b) podem ser separados por um grupo de espaçamento. Tais grupos de espaçamento são preferivelmente polímeros curtos de um a cerca de dez resíduos de aminoácidos. Normalmente, aqueles resíduos não são resíduos adjacentes na sequência linear do AgHBs, mas são seleccionados a partir de uma outra parte da molécula do AgHBs ou de uma sequência não relacionada. Podem também ser utilizadas sequências sem sentido tal como poliglicina.
Numa concretização mais preferida, que origina resultados inesperadamente bons, o epítopo de célula T de pré-S(2) do polipéptido compósito é directamente ligado ao terminal N de um polipéptido de epítopo de célula B de AgHBs. Os polipéptidos do epítopo de célula B de pré-S(2) úteis nestas combinações compósitas incluem os resíduos 133-139, 133-140, 133-143 e -22-
-22- J 72591 SCRF Case 95.2 137-143. Estes polipéptidos compósitos de pré-S(2) ma is preferidos incluem as sequências seguintes: (pl41-174)-(pl33-140), (pl46-160)-(pl33-143), (pl48-174)-(pl33-143), (pl51-165)-(pl33--143) e (pl51—174)-(pl33-143) da região pré-S(2) do AgHBs.
Embora o anticorpo possa ser originado, por ligação de um polipéptido do epítopo de célula T de pré-S(2) ao terminal C do polipéptido do epítopo de célula B, verificou-se agora que a orientação na qual os péptidos são ligados, é importante na origem do anticorpo dirigido para o epítopo de célula B desejado, pelo menos para os epítopos de célula B de pré-S(2). Os estudos que referem este princípio são descritos nos exemplos.
Para determinar a orientação óptima para os polipéptidos compósitos curtos que têm um epítopo de célula B de pré-S(l) ou S, podem ser realizados estudos similares. B. Síntese
Quando o polipéptido compósito tem uma sequência de resíduos de aminoácidos relativamente curta, ele pode ser sintetizado por técnicas químicas como anteriormente descrito para os polipéptidos do epítopo de célula T de pré-S(2). Contudo, quando o polipéptido compósito é relativamente longo, tipicamente o péptido do epítopo de célula T é sintetizado quimicamente, e subsequentemente ligado ao polipéptido do epítopo de célula B. 0 polipéptido do epítopo de célula B pode ser sintetizado quimicamente, produzido por técnicas recombinantes ou isolado do plasma.
Os segmentos de gene para as regiões S, pré-S(l) e pré-S(2) do AgHBs são conhecidos, e podem ser apropriadamente ligados uns aos outros e expressos em microorganismos tais como bactérias semelhantes a E_s_ coli ou leveduras semelhantes a Sj_ cerevisiae. assim como por células de mamíferos tais como células de ovário de ericeto chinês (CHO) para proporcionar polipéptidos do epítopo -23-
-23- J 72591 SCRF Case 95.2 de célula B. Por exemplo Tiollais e colaboradores [Michel, et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. (1984) 81:7708] descreveram a expressão em células de CHO de uma partícula recombinante contendo as regiões pré-S(2) e S de AgHBs ligadas umas às outras na ordem pela qual aquelas sequências são encontradas na natureza. Ver também Patente U.S. Na. 4 722 840 de Valenzuela et al.
Em vez de ligar meramente o epítopo de célula T ao epítopo de célula B, pode ser preparado (expresso) um polipéptido compósito que contém uma sequência de polipéptidos do epítopo de célula T de pré-S(2) de um ou ambos os subtipos, para além das sequências de polipéptidos do epítopo de célula B. Adicionalmente, pode ser preparado um polipéptido compósito com múltiplos epítopos de célula T e B de cada subtipo por inclusão de dois genomas para as mesmas sequências que codificam as variantes do subtipo tais como os subtipos ad e a^. Desta forma uma pluralidade de polipéptidos do epítopo de célula T de pré-S(2) de cada subtipo pode ser operativamente ligada a um certo número de polipéptidos do epítopo de célula B específicos de grupo e de subtipo, e expressa. Contudo, a utilização de uma pluralidade de polipéptidos curtos compreendendo não mais do que cerca de 30 resíduos de aminoácido pode ser vantajosa relativamente à utilização dos mesmos polipéptidos ligados uns aos outros para formar um único polipéptido maior, como a seguir descrito.
Um polipéptido recombinante pode ser preparado utilizando as técnicas bem conhecidas de engenheiria genética e os reagentes comercialmente disponíveis, visto que são bem conhecidas as sequências de resíduos de aminoácidos e as sequências genómicas para as regiões pré-S e S do AgHBs. Os vectores especificamente concebidos para clonagem de um genoma, para proporcionar quantidades úteis para a subsequente expressão da sequência de resíduos de aminoácidos desejada, estão também comercialmente disponíveis visto que são vectores especificamente concebidos para expressão. As bactérias, leveduras e células de mamíferos adequadas para transfecção pelo vector de expressão e para -24- 72591 SCRF Case 95.2 subsequente expressão dos polipéptidos, estão também disponíveis comercialmente.
Adicionalmente a Michel, et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. (1984) 81:7708, exemplos de descrições que descrevem técnicas para construir um polipéptido por engenharia genética anteriormente descritas, podem ser encontradas nas: Patentes U.S. N8 4 428 941 de Galibert, et al. N8 4 237 224 de Cohen, et al; N8 4 273 875 de Manis; Na 4 431 739 de Riggs; Ns 4 363 877 de Goodman, et al. Rodriguez & Tait, Recombinant DNA Techniques: An Introduction. The Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc. Menlo Park, CA (1983), cujas descrições são aqui incorporadas para referência. São conhecidos na arte numerosos processos para ligar operativamente o polipéptido (a) ao polipéptido (b) e podem ser utilizados quando o polipéptido compósito não é expresso recombinantemente como uma unidade. Por exemplo, um dialdeído, tal como o glutaraldeído, e um redutor, tal como o boro-hidreto de sódio, podem ser utilizados para ligar resíduos do terminal amino dos dois polipéptidos. Pode ser adicionado um resíduo de cisteína a um resíduo terminal do polipéptido (a). Utilizando o éster de N-maleimidobenzoíl-N-hidroxi-succinimida (MBS) e seguindo o procedimento de Liu, et al. (1979) Biochemistry. 18.:690, o resíduo de cisteína pode ser covalentemente ligado ao resíduo de terminal amino que reagiu com MBS do polipéptido (b). Pode também ser utilizada uma carbodiimida solúvel em água, tal como a l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, para ligar operativamente os dois polipéptidos. C. Utilidade
Os polipéptidos compósitos deste invento utilizam-se como imunogénios de uma vacina de HBV quando presentes numa quantidade eficaz, num diluente fisiologicamente aceitável. Os polipéptidos compósitos sensibilizam o auxílio de células T relevantes para o HBV nativo. Isto é, os polipéptidos sensibilizam células T que reconhecem o AgHBs nativo. Adicionalmente, os polipéptidos
72591 SCRF Case 95.2 -25-compósitos utilizam-se na indução da produção de anticorpos. A formulação de composições para utilização como vacinas é bem conhecida e é a seguir descrita.
Como descrito nos exemplos, um imunogénio compreendendo um epítopo de célula T de pré-S(2) ligado ao terminal amino de um epítopo de célula B de pré-S(2) nativo foi comparado a um polipéptido correspondendo a 120-145 [uma sequência de pré-S(2) que se diz ser útil como uma "vacina" sintética] e a uma sequência da região pré-S(2) nativa (pl33-174). A sequência pl20-145 induziu o anticorpo em, aproximadamente, 50% das estirpes de murinos examinadas e estimulou as células T. Contudo, as células T só foram relevantes para o péptido, não para o nativo. Isto é, a proliferação de células T foi induzida em resposta ao péptido, mas não em resposta ao AgHBs. Em contraste, um polipéptido compósito deste invento induziu o anticorpo em 100% das estirpes examinadas e estimulou as células T na maioria das estirpes que responderam ao AgHBs. A região pré-S(2) nativa (i.e., pl33-l74) sensibilizou células T relevantes para o AgHBs nativo e induziu uma pequena quantidade de anticorpo que reagiu com os epítopos de célula B nativos, 133-139 (o epítopo específico de grupo) e 137-143 (o epítopo específico de subtipo). A maioria do anticorpo induzido reagiu com os resíduos 156-171, sequência que não é um epítopo de célula B nativo. Em contraste, aquando da utilização de um polipéptido compósito deste invento, (pl51-174)-(pl33-143), a maioria do anticorpo foi dirigida para os epítopos de célula B nativos, particularmente para o epítopo específico de grupo, 133-139. IV. Imunoqénios de Subtipo Compósito
Num outro aspecto, o presente invento proporciona um imunogénio de subtipo compósito que contém uma sequência de aminoácidos que corresponde a, pelo menos, um epítopo de célula T de AgHBs/d nativo e uma sequência de aminoácidos que corresponde a, pelo menos, um epítopo de célula T de AgHBs/γ; nativo. Aquelas
sequências são designadas por polipéptidos (al) e (a2), respectivamente. Preferivelmente, serão incluídos os polipéptidos do epítopo de célula T da região pré-S.
As vacinas da região S de AgHBs comerciais desenvolvidas até à data (derivadas de plasma e recombinantes) têm consistido em partículas subvirais de um único subtipo (i.e., ad ou ay). A explicação tem sido a de que os anticorpos para o(s) determinante(s) (a) específica(s) de grupo são protectores e os anticorpos específicos de subtipo não são necessários para a protecção. Esta prática não tem tomado em consideração a necessidade de sensibilizar a memória das células T específica de subtipo. Assim, quando um indivíduo for imunizado com um subtipo, as células T de memória específicas de subtipo seriam incapazes de evocar uma resposta anamnésica no caso de uma subsequente infecção virai com o subtipo heterólogo.
Foi previamente demonstrado que um certo número de estirpes de murino imunizadas com AgHBs/P25(ad) reconheciam exclusivamente os locais de célula T específicos de subtipo, e nenhuns locais específicos de grupo na região S, mas produziam no entanto anticorpos anti-a assim como anticorpos anti-d. Por consequência, as células T específicas de subtipo são capazes de auxiliar a produção de um anticorpo de célula B específico de grupo. Milich, et al. J. Immunol.. 134:4194 (1985).
Verificou-se agora que quando foram examinadas as estirpes de murino B10.S e B10.M para a influência do subtipo na resposta imunitária de pré-S(2), também que o reconhecimento de célula T das regiões pré-S(l) e pré-S(2) era específico de subtipo. Isto é, as células T sensibilizadas com p39/ad reconheceram as partículas de AgHBs/ad, mas não as partículas de AgHBs/ay.. Estes estudos são descritos em detalhe nos exemplos. Esta especificidade de subtipo foi confirmada nos estudos que utilizam péptidos sintéticos. Os péptidos do subtipo d, invariavelmente, não reagiram, de modo cruzado com os péptidos de subtipo y ao nível da célula T.
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Assim, o presente invento contempla um imunogénio de subtipo compósito compreendendo um primeiro polipéptido imunogénico tendo um epítopo de célula T do subtipo d e um segundo polipéptido imunogénico tendo um polipéptido do epítopo de célula T de subtipo Para utilização nos processos deste invento, o primeiro e segundo polipéptidos estarão, cada um, presentes numa quantidade suficiente para induzir uma resposta de célula T específica de subtipo. Os polipéptidos podem estar na forma de partículas de polipéptidos tais como as partículas de AgHBs/p25, /p33 ou /p39 como aqui discutido ou como os polipéptidos do epítopo de célula T de pré-S(2) ou como polipéptidos compósitos aqui descritos. Ambos os subtipos de polipéptidos do epítopo de célula T podem também estar presentes numa única sequência de polipéptido como nos polipéptidos compósitos aqui discutidos, com a excepção de que um tal polipéptido contém um polipéptido do epítopo de célula T para cada subtipo que não necessita de ser um epítopo de célula T de pré-S(2).
Assim, o presente invento contempla uma partícula de subtipo de HBV múltipla compreendendo polipéptidos associados. Os polipéptidos que formam a partícula podem ser um ou mais dos polipéptidos compósitos aqui descritos, sózinhos ou em combinação com um ou mais dos polipéptidos de AgHBs/p25, /p33 e /p39. Se a partícula for constituída por um ou mais dos polipéptidos de AgHBs/p25, /p33 e /p39, pelo menos, um daqueles polipéptidos é do subtipo d e, pelo menos, um é do subtipo χ.
As partículas de subtipo de HBV múltiplas do presente invento podem ser preparadas utilizando as técnicas de ADN recombinantes bem conhecidas, tais como aquelas descritas na Patente U.S. Na. 4 722 840 de Valenzuela et al. Por exemplo, quando a partícula contém uma pluralidade de polipéptidos diferentes, cada um dos polipéptidos pode ser preparado separadamente e depois misturado e mantido sob certas condições para construção das partículas. Alternativamente, os diferentes polipéptidos podem ser expressos na mesma célula, preferivelmente sob certas condições para aí serem associados. Prefere-se que um só polipéptido para cada subtipo seja expresso numa única célula,
72591 SCRF Case 95.2 jr' preferivelmente de uma maneira policistrónica. Por exemplo, os subtipos d e ϊ do AgHBs/p25 podem ser dicistronicamente expressos numa levedura ou bactéria para assegurar que são construídas quantidades aproximadamente equivalentes do polipéptido de cada subtipo, na partícula.
Numa concretização preferida, pelo menos um dos polipéptidos do epítopo de célula T, normalmente os dois polipéptidos de epítopo de célula T, é ligado a um polipéptido do epítopo de célula B de AgHBs nativo. Os epítopos de célula T de cada subtipo podem ser ligados ao mesmo polipéptido do epítopo de célula B. Contudo, normalmente, o imunogénio de subtipo compósito irá compreender polipéptidos tendo epítopos de célula T e B de um único subtipo. Os imunogénios de subtipo compósito incluem misturas de AgHBs/p39 de cada subtipo. São alternativamente contempladas as misturas de polipéptidos sintetizados quimicamente, curtos, que incluem os epítopos de célula T e B de cada subtipo. São também contempladas as estruturas em partículas, por exemplo os lipossomas e semelhantes, contendo um(uns) epítopo(s) de célula B de interesse, expostos na superfície. Estes epítopos não necessitam de estar presentes na mesma molécula, isto é eles podem ser intraestruturais, não necessariamente intramoleculares.
Os imunogénios de subtipo compósito deste invento utilizam-se como imunogénios de célula T para sensibilizar células T que reconhecem o AgHBs nativo. Quando os imunogénios de subtipo compósito incluem os epítopos de célula B, os imunogénios utilizam-se como o imunogénio de uma vacina de HBV. A utilização dos imunogénios é descrita em detalhe, abaixo. V. Vacinas A. Introdução A palavra "vacina" nas suas várias formas gramaticais é aqui utilizada para descrever um tipo de inoculo contendo um ou mais polipéptidos deste invento como um ingrediente activo que é utilizado para induzir a imunidade activa num mamífero hospedeiro
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-29 ιλ contra o HBV. Uma vez que a imunidade activa envolve a produção de anticorpos, uma vacina ou inoculo pode assim conter ingredientes idênticos, mas as suas utilizações são diferentes. Na maioria dos casos, os ingredientes de uma vacina e de um inoculo são diferentes porque não podem ser utilizados em humanos muitos dos adjuvantes úteis em animais. B. Preparação É bem conhecida na arte a preparação de uma vacina que contém moléculas de polipéptido como ingredientes activos. Tais vacinas são, tipicamente, preparadas como injectáveis quer como soluções líquidas quer como suspensões; podem também ser preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injecção. A preparação pode também ser emulsionada. 0 ingrediente imunogénico activo é dissolvido, disperso ou misturado num excipiente que é farmaceuticamente aceitável e compatível com o ingrediente activo como é bem conhecido. As frases "adequado para utilização em humanos" e "farmaceuticamente aceitável" (fisiologicamente tolerável) referem-se a entidades moleculares e a composições que não produzem tipicamente uma reacção indesejada alérgica ou similar, tal como enfartamento gástrico, tontura e semelhantes, quando administradas a um humano. São excipientes adequados, por exemplo, água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato (PBS), dextrose, glicerol, etanol ou semelhantes e suas combinações. Adicionalmente, se desejado, a vacina pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tamponantes de pH, veículos ou adjuvantes que intensificam a eficácia da vacina. Uma concretização preferida contém cerca de 1 mg a cerca de 5 mg de péptido homólogo de AgHBs, exclusivo de veículo, em cerca de 1 ml de PBS. C. Veículos
Podem adicionar-se um ou mais resíduos de aminoácido -30 72591 SCRF Case 95.2 adicionais aos terminais amino ou carboxilo do péptido sintético para auxiliar a ligação do péptido a um veículo. Os resíduos de cisteína adicionados aos terminais amino ou carboxilo do péptido sintético têm mostrado ser particularmente úteis na formação de polímeros através de ligações dissulfureto. Contudo, podem também ser utilizados outros processos bem conhecidos na arte de preparação de conjugados. Os procedimentos de ligação, adicionais, exemplares incluem a utilização de produtos de reacção de adição de Michael, dialdeídos tais como glutaraldeído, Klipstein , et al. J. Infect. Pis.. 147:318-326 (1983) e semelhantes, ou a utilização da tecnologia de carbodiimida como na utilização de uma carbodiimida solúvel em água para formar ligações amida com o veículo, como anteriormente discutido para a ligação de uma pluralidade de polipéptidos, em conjunto, para formar um multímero sintético.
Os veículos úteis são bem conhecidos na arte e são geralmente, eles próprios proteínas. Exemplos de tais veículos são a hemocianina de lapa (KLH), edestina, tiroglobulina, albuminas tais como albumina de soro de bovino (BSA) ou albumina de soro humano (HSA), glóbulos vermelhos tais como eritrócitos de ovelha (SRBC), toxóide do tétano, toxóide da cólera, assim como poliaminoácidos tais como poli(D-lisina:ácido D-glutâmico), e semelhantes.
Como é também bem conhecido na arte, é muitas vezes benéfico ligar um polipéptido sintético ao seu veículo por meio de um grupo de ligação, intermediário. Como acima referido, o glutaraldeído é um de tais grupos de ligação. Contudo, quando é utilizada a cisteína, o grupo de ligação intermediário é preferivelmente uma m-maleimidobenzoíl-N-hidroxi-succinimida (MBS) como foi aqui utilizado.
Adicionalmente, a MBS pode ser primeiro adicionada ao veículo por uma reacção de permuta éster-amida, como descrito por Liu et al., supra. Em seguida, a adição pode ser seguida pela adição de um grupo mercapto bloqueado tal como ácido tiolacético (CH3COSH) sobre a ligação dupla maleímido. Após clivagem do
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-31-grupo bloqueador acilo, é formada uma ligação dissulfureto entre o grupo mercaptano de ligação desbloqueado e o mercaptano do resíduo de cisteína adicionado do polipéptido sintético.
Outros meios de imunopotenciação incluem a utilização de lipossomas e partículas do complexo imuno-estimulante (ISCOM). A versatilidade única dos lipossomas reside na sua ajustabilidade ao tamanho, características de superfície, composição em lípidos e formas nas quais podem acomodar aos antigénios. Nas partículas ISCOM, a matriz semelhante a gaiola é composta por Quil A, extraída da casca de uma árvore Sul Americana. É provocada uma forte resposta imunitária pelas proteínas ou péptidos antigénicos ligados por interacção hidrofóbica com a superfície da matriz.
Este invento junta um outro veículo ao reportório de veículos úteis, i.e., uma porção de veículo sintética compreendendo a sequência 148-174 de pré-S(2) do HBV operativamente ligada a um ou mais imunogénios de polipéptido. A escolha do veículo é mais dependente da utilização final do imunogénio do que da porção determinante do imunogénio e está baseada em critérios não particularmente envolvidos no presente invento. Por exemplo, se for utilizado um inóculo em animais, deve ser seleccionado um veículo que não produza uma reacção indesejada no animal particular. D. Administração
As vacinas são convencionalmente administradas, parentericamente, por injecção, por exemplo, ou subcutaneamente ou intramuscularmente. As formulações adicionais que são adequadas para outros modos de administração incluem supositórios e, em alguns casos, formulações orais. Para os supositórios, os ligantes e veículos tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquilenoglicóis ou triglicéridos; tais supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente activo na gama de 0,5% a 10%, preferivelmente 1-2%. As formulações orais incluem excipientes normalmente empregues tais como, por exemplo,
graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio e semelhantes. As composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de libertação sustida ou pós e contêm 10%-95% de ingrediente activo, preferivelmente 25-70%.
Um homólogo de antigénio virai pode ser formulado numa vacina como uma forma neutra ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres do anticorpo) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, os ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais formados com os grupos carboxilo livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férricos e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e semelhantes.
As vacinas são administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade tal que sejam terapeuticamente eficazes e imunogénicas. A quantidade a ser administrada depende do sujeito a ser tratado, da capacidade do sistema imunitário do sujeito para sintetizar anticorpos e do grau de protecção desejado. As quantidades precisas do ingrediente activo necessárias para administração dependem da opinião do médico e são características para cada indivíduo. Contudo, as gamas de dosagem adequadas são da ordem de cerca de cem microgramas a cerca de cem miligramas, preferivelmente cerca de um a cerca de 10 miligramas e mais preferivelmente cerca de 5 miligramas de ingrediente activo por quilograma de peso corporal do indivíduo. São também variáveis os regimes adequados para a administração inicial e injecções de reforço, mas são tipificados por uma administração inicial seguida, em intervalos de uma ou duas semanas, por uma injecção subsequente ou outra administração.
Uma vacina pode também incluir um adjuvante como parte do
72591 SCKF Case 95.2 -33-excipiente. Os adjuvantes tais como o adjuvante completo de Freund (CFA), o adjuvante incompleto de Freund (IFA) para utilização em mamíferos de laboratório são bem conhecidos na arte. Podem também ser utilizados adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis tais como o alumén. Um exemplo de vacina compreende assim um ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo cerca de 1 mg a cerca de 5 mg de homólogo de antigénio virai (imunogénio polipéptido) adsorvido em cerca de 0,5 mg a cerca de 2,5 mg de alumén. Uma vacina preferida compreende l ml de PBS contendo 1 mg de homólogo de antigénio virai adsorvido em 2,5 mg de alumén. VI. Processos de Utilização 0 presente invento contempla os processo de utilização dos imunogénios de subtipo compósito deste invento para modularem a resposta do HBV. 0 processo compreende a administração de uma composição compreendendo pelo menos um polipéptido do epítopo de célula T de AgHBs/d e pelo menos um polipéptido do epitopo de célula T de AgHBs/γ num diluente fisiologicamente aceitável. Cada polipéptido do epítopo de célula T está presente numa quantidade suficiente para induzir uma resposta de célula T. Preferivelmente, é administrada uma pluralidade de epítopos de célula T de cada subtipo.
Numa concretização, a composição está livre de epítopos de célula B e é utilizada para estimular as células T num paciente infectado cronicamente. Nos portadores crónicos de HBV, as células T do paciente não respondem adequadamente ao HBV. A utilização de imunogénios de célula T de subtipo compósito pode estimular as células T do paciente para modular a resposta do paciente ao HBV.
Numa concretização preferida é utilizado um imunogénio de subtipo compósito deste invento para induzir a resposta a uma vacina HBV. 0 imunogénio de subtipo compósito está presente como uma composição num diluente fisiologicamente aceitável que pode ser administrado antes ou em conjunto com a vacina. Normalmente,
o(s) epítopo(s) de célula T serão ligados a um(uns) epítopo(s) de célula B de AgHBs, epítopo(s) de célula B que podem compreender o imunogénio da vacina. Contudo, os epítopos de célula T não necessitam de ser ligados a um epítopo de célula B para sensibilizar o auxílio das células T para a produção de anticorpos, como descrito em detalhe nos exemplos.
Normalmente, a composição irá conter uma pluralidade de epítopos de célula B de AgHBs operativamente ligados a uma pluralidade de epítopos de célula T de AgHBs de cada subtipo. Numa concretização preferida, o imunogénio de subtipo compósito serve como o imunogénio de uma vacina de HBV e compreende uma pluralidade de polipéptidos do epítopo de célula T operativamente ligados a uma pluralidade de polipéptidos do epítopo de célula B. Os polipéptidos do epítopo de célula B presentes no imunogénio de subtipo compósito incluem preferivelmente uma pluralidade de epítopos de célula B de reacção cruzada das várias regiões do AgHBs e um ou mais epítopos de célula B específicos de subtipo para, pelo menos, um subtipo de HBV, preferivelmente cada um dos mais comuns.
Desta forma a composição irá proporcionar a sensibilização tanto das células B como das T numa única administração. Convenientemente, a composição irá conter partículas de AgHBs/p39 de cada subtipo. Contudo são também contempladas as composições contendo uma pluralidade de polipéptidos sintéticos curtos compreendendo os epítopos de célula T e B.
Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar, mas não a limitar, o presente invento.
VII. EXPERIÊNCIAS A. Materiais e Processos 1. Materiais
As estirpes de murino consanguíneas C57BL/10 (B10), B10.D2,
B10.BR, ΒΙΟ.S, ΒΙΟ.Μ, SJL/J, C3H.Q, C3H e Balb/c foram obtidas a partir da colónia de reprodução do Research Institute of scripps Clinic, La Jolla, CA. Foram utilizados em todos os estudos ratinhos fêmea com entre seis a oito semanas de idade no início dos estudos.
As partículas de AaHBs/p33/av recombinantes foram fornecidas pelo Dr. P. Tiollais (Instituto Pasteur, Paris). Aquelas partículas foram preparadas a partir de células do ovário de ericeto chinês (CHO) transfectadas com um plasmídeo contendo o gene S e o gene da região pré-S do subtipo ayd do HBV. As partículas derivadas de CHO são compostas pelo p25 codificado por S mais o p33 codificado por pré-S(2) e S numa razão de aproximadamente 3 para 1, como descrito em Michel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA.. (1984) 81:7708 que é aqui incorporado para referência. As partículas recombinantes de AgHBs/p33/ad foram fornecidas por Angen.
As partículas de AqHBs/p33/ad derivadas do soro, purificadas, foram fornecidas por Amgen. As partículas de AaHBs/p39/ad derivadas do soro, purificadas, foram fornecidas pelo Dr. D. Peterson (Medicai College of Virgínia, Richmond, VA). Aquelas partículas foram derivadas do subtipo adw2 e contêm p39 representado como aproximadamente 8,2 por cento dos polipéptidos constituintes. Uma preparação de AqHBs/p39/av derivada do plasma foi também fornecida pelo Dr. Peterson.
As preparações purificadas de AgHBs/p25/ad foram fornecidas pelo Dr. R. Louis (Cutter Laboratories, Berkeley, CA.). A preparação foi purificada por Cutter Laboratories a partir de plasma humano por uma combinação de procedimentos padrão incluindo a ultracentrifugação, precepitação com sulfato de amónio, digestão com pepsina e cromatografia em gel. A preparação resultante era composta exclusivamente do polipéptido (p25) de 25 quilodalton (kd) e sua forma glicosilada (gp28).
As preparações de AgHBs purificadas, derivadas do plasma, representando ambos os subtipos ad e âl e constituídas por várias
I 72591 ^ SCRF Case 95.2 proporções de p25, p33 e p39 foram fornecidas pelo Dr. J. Gerin (Georgetown University, Rockville, MD). A preparação contendo a maior proporção de pré-S(l) (p39) foi predominantemente utilizada durante todo este estudo e foi designada por AgHBs/p39.
Houve variação na quantidade de antigenicidade específica da região S por unidade de peso das partículas nas preparações de AgHBs aqui utilizadas. Por consequência, todas as preparações de AgHBs foram primeiro equilibradas relativamente à antigenicidade específica da região S em termos da ligação do anticorpo utilizando um ensaio de imunossorção com enzima ligada (ELISA), tipo sanduíche, de fase sólida, descrito a seguir . Depois as proporções de p25, p33 e p39 presentes nas várias preparações de partícula de AgHBs foram similarmente determinadas. Num ensaio ELISA, tipo sanduíche, que é bem conhecido na arte, o antigénio (AgHBs), a ser medido foi ensanduichado entre um anticorpo monoclonal ligado à fase sólida específico quer para S, pré-S(l) ou pré-S(2) e um segundo anti-S monoclonal marcado com peroxidase (não reactivo de forma cruzada com o anti-S monoclonal de fase sólida) aqui utilizado como uma sonda.
Os dois anticorpos monoclonais (Mabs) específicos para a região S do AgHBs foram fornecidos pelo Dr. P. Kaplan (Ortho Diagnostics, Inc., Raritan, NJ). Os Mabs específicos para a região pré-S(l) do AgHBs (A18/7) foram fornecidos pelo Dr. W. Gerlich (University of Gottingen, Gottingen, Alemanha). Aqueles Mabs são descritos em Heerman et al.. (1984) J.Virol.. 52: 396. Os Mabs 5520, 5521 e 5535 específicos para pré-S(2) foram produzidos a seguir à imunização de ratinhos Balb/c com o péptido sintético pl33/15l (subtipo ayw) acopolado à ovalbumina e foram fornecidos pelo Dr. T. Nakamura (institute of Immunology, Tokyo, Japão), como descrito em Okamoto, et alf J. Tmmunol.. (1985) 134:1212. 0 Mab 4408 é o 5161 específico para pré-S(2), produzido a seguir à imunização dos ratos Balb/c com polipéptido p33 intacto derivado das partículas de AoHBs/avw como descrito por Machida, et al (1984) Gastroenterol.. 86: 910, foram também fornecidos pelo Dr. T. Nakamura.
yf d? 72591 SCRF Case 95.2 -37- 2. Processos a. Imunização
Para estudar a produção de anticorpos in vivo, foram imunizados grupos de ratinhos utilizando inóculos contendo ou 4,0 microgramas de ÀgHBs nativo nas suas várias formas, p25, p33 ou p39, ou 100 microgramas dos vários polipéptidos sintéticos como imunogénio disperso em adjuvante completo de Freund (CFA), por injecção intraperitoneal (IP) como a imunização primária (1*)· Uma imunização secundária (2*) utilizando um inóculo contendo 2 microgramas (^g) de AgHBs nas suas várias formas ou 50 de um polipéptido sintético como imunogénio em adjuvante incompleto de Freund (IFA) foi administrada IP aproximadamente quatro semanas após a imunização primária (1*)· Os soros dos ratinhos foram obtidos a partir do plexo retroorbital 10 e 24 dias a seguir à imunização primária e, de novo, 2 semanas a seguir à imunização secundária, a não ser que de outro modo referido. A sensibilização in vivo para o ensaio proliferativo de células T foi realizado por injecções na almofada da pata traseira de 4 μg de AgHBs ou de 100 jug de polipéptido sintético em CFA.
b. Medição dos Anticorpos Anti-HBs e Anti-pré-S
Os anticorpos anti-S e anti pré-S induzidos por imunização com um polipéptido sintético ou AgHBs nativo e os anticorpos anti-polipéptido induzidos por imunizações com polipéptido foram medidos pelos processos seguintes. (1) Doseamento radio-imunolóqico
Os soros de murinos foram avaliados quanto à reactividade anti-S, anti-pré-S(l) ou anti-pré-S(2) e anti-polipéptido sintético num doseamento rádio-imunológico (RIA), específico da classe da imunoglobulina, indirecto, utilizando como o ligando ligado à fase sólida um polipéptido sintético (1-2 /ng por 72591 SCRF Case 95.2 -38-
,r '^geoesvi^eSP'
jf OLemaaH
alvéolo) ou partículas de AgHBs purificadas (0,1 microgramas por alvéolo). As IgG anti-ratinho de cabra, foram utilizadas para ligar os anticorpos de murino ligados ao ligando de fase sólida. Após remoção por lavagem de quaisquer anticorpos anti-ratinho de cabra não ligados, foram misturadas as IgG anti-cabra de suino marcadas com 125I e mantidas com os anticorpos anti-ratinho de cabra ligados à fase sólida como descrito em Milich, et al. (1982) J. IMMUNOL.. 129: 320. O AgHBs/p25/ad foi Utilizado como um ligando ligado à fase sólida para ensaiar o anticorpo específico anti-região s. O polipéptido sintético pl20-l45, pl33--140 ou pl35-145 foi utilizado como um ligando ligado à fase sólida para ensaiar o anticorpo específico de pré-S(2). Similarmente, o polipéptido sintético p94-117 foi utilizado para ensaiar o anticorpo específico de pré-S(l). Outras preparações de AgHBs e péptidos sintéticos foram utilizadas como ligandos ligados à fase sólida nestes estudos, como indicado. Os dados são expressos como um título de anticorpo que representa a maior diluição para originar três vezes as contagens de valores de soros de pré-imunização. Os anticorpos monoclonais específicos para estes mesmos antigénios foram ensaiados pelo mesmo RIA de fase sólida, indirecto, com excepção de que os dados são expressos como título de anticorpo que representa a concentração mínima requerida para detectar uma ligação superior a cinco vezes as contagens do valor de fundo.
(2) ELISA
Os soros humanos foram ensaiados quanto à reactividade do anticorpo utilizando péptidos sintéticos pré-S(l) ou pré-S(2), específicos, como os ligandos ligados à fase sólida (1,0 micrograma por alvéolo) num ensaio de imunossorção com enzima ligado (ELISA). Os soros ensaiados foram primeiro misturados e mantidos (incubados) com os ligandos ligados à fase sólida. Após remoção de quaisquer constituintes de soro não ligado, as fases sólidas resultantes foram sondadas com um anticorpo monoclonal IgG anti-humano marcado com peroxidase. Os valores de densidade óptica da amostra a 490 nanómetros (D.O. 490) superiores a quatro vezes os dos soros normais foram considerados positivos i i
72591 SCRF Case 95.2 “39” $ ** £. € utilizando diluições de 1:50 dos soros humanos que foram misturados e mantidos (incubados) com ligando. Os péptidos de pré-S(2) utilizados como ligandos estão registados abaixo. Péptidos de Célula T de Pré-S(2) Disponíveis e Utilizados nas Experiências 120-145/d & y 143-174/d 156-169/d 133-174/d & y 144-160/d 156-170/d 136-155/d & y 146-157/d 156-172/d 141-160/d & y 146-159/d 158/170/d 146-165/d & y 146-160/d 120-131/adw 151-170/d & Y 148-160/d 120-132/ayw 156-174/d & y 148-174/d 120-132/adw2 159-174/d & y 149-170/d 120-145/adw2 161-174/d & y 152-172/d 120-145/ayw 162-174/d & y 153-174/d 128-138/adw2 164-174/d & y 154-170/d 141-174/d-(133-140) 166-174/d & y 154-172/d 151-174/d-(133-143) 131-174/d 156-165/d 138-174/d 156-167/d 725S1
SCRF Case 95.2 -40- > . 5»
Os ensaios de competição de anticorpo-anticorpo fóram realizados por pré-mistura e manutenção (pré-incubação) de concentrações variadas [0,6-625 nanogramas por mililitro (ng/ml)] do anticorpo de competição não marcado com uma concentração limitante predeterminada de ligando ligado à fase sólida (AgHBs/p33, 0,1 Mg por alvéolo) durante um período de tempo de cerca de 18 horas (durante a noite) a 4°C, seguidas por mistura e manutenção (incubação) de uma quantidade predeterminada de um segundo anticorpo marcado com enzima (peroxidase de rábano silvestre) cuja inibição está a ser medida. Os resultados são expressos como percentagem de inibição da interacção de ligando ligado à fase sólida com anticorpo marcado. Os anticorpos monoclonais 4408, 5521 e 5161 foram marcados com enzima e utilizados como descrito. Os anticorpos de competição utilizados nestes estudos foram ou anticorpos monoclonais ou policlonais produzidos para polipéptidos sintéticos ou para preparações de partículas de AgHBs. c. Ensaio de Proliferação de Célula T Específica de AgHBs
Grupos de quatro ratinhos foram imunizados nas almofadas das patas traseiras com uma emulsão de CFA e 4 Mg de AgHBs ou 100 y.q de polipéptido sintético. Oito a dez dias mais tarde as células do gânglio linfático popliteo (PLN) foram colhidas e cultivadas in vitro para uma concentração de 5 x lo5 células/ml com vários antigénios de desafio (ligandos). Os antigénios in vitro incluíam AgHBs nativo [p25, p33 e p39 que continham várias razões de S, pré-S(l) e pré-S(2), conhecidas] e os polipéptidos sintéticos de região pré-S pl20-145/ad, p!20-145/ay.
As células do gânglio linfático popliteo que drenam foram removidas assepticamente de cada ratinho e preparadas para originarem uma suspensão de unicelular. As células foram duas vezes lavadas com uma solução salina equilibrada (BSS) contendo solução salina tamponada com fosfato (pH 7,2). As células foram ressuspensas em meio de Click contendo BSS, L-glutamina, piruvato de sódio, antibióticos, 2-mercaptoetanol, aminoácidos essenciais e não essenciais e vitaminas. [Ver Click, et al. (1972) Cell.
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-41-
Immunol. . 3.:264]. O meio de Click foi modificado pela adição HEPES 10 milimolar (mM) (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-eta no-sulfónico) e gentamicina (10 jug/ml) e pela substituição do soro de ratinho normal singénico a 0,5 por cento por soro de feto de vitelo.
Os antigénios foram ensaiados em cultura numa gama de doses de 0,003-1 /ig/ml para as preparações de AgHBs e 0,07-200 μg/ml para os polipéptidos sintéticos.
As células do gânglio linfático viáveis (5 x 105) em 0,1 ml de meio foram colocadas em alvéolos de microtitulação de fundo plano (Falcon 3072, Falcon Plastics, Inc.) com: (a) 0,1 mililitro de meio contendo várias concentrações de uma preparação de AgHBs ou de um péptido sintético, (b) meio de cultura e ovalbumina [200 microgramas por mililitro ^g/ml)] como um controlo negativo, ou (c) 100 mg/ml de derivado de proteína purificado (PPD); (Parke-Davis, Detroit, MI) como um controlo positivo.
As culturas foram mantidas durante cinco dias a 37°C numa atmosfera humidificada contendo 5 por cento de dióxido de carbono em ar.
No quarto dia, cada cultura foi misturada e mantida (incubada) com um microcurie (/iCi) de 3H-timidina (3HTdR) (6,7 Ci/milimole, New England Nuclear, Boston, MA) durante 16 horas antes da colheita. As células foram colhidas em tiras de filtro e a proliferação foi determinada pela incorporação de 3HTdR no ADN. Os dados são expressos como contagens por minuto (cpm) corrigidas para a proliferação de fundo na ausência de antigénio. Foi previamente mostrado que a resposta de proliferação específica de AgHBs de células PLN que drenam colhidas aos 13 dias após a imunização foi devida às células T proliferantes; Milich, et al. (1983) J. Immunol.. 130:1401. Por consequência, as células PLN não fraccionadas foram utilizadas nas análises aqui descritas. d. Síntese de Polipéptidos
Os polipéptidos correspondentes à região pré-S(2) aqui uti- -42- -42- /*> 72591 SCRF Case 95.2 lizados foram sintetizados quimicamente por processos de fase sólida como descrito em Merrifield, et al. (1963) J. Am. Chem. Soc.. 85:2149.
Um polipéptido para utilização no presente invento é designado abaixo por uma abreviatura do número do resíduo e pela sequência de resíduos de aminoácidos do polipéptido:
POLIPÉPTIDOS Número de Resíduos 136-174 136-155 148-159 148- 174 149- 165 152-159 154-170 156-165 156-167 156-170 159-167 159-169 159-174 136-174 136-155 146-165 148-155 148-165 148-174 151-165 151-170 156-165 159-169 161-174
Sequência de Resíduos de Aminoâcido Subtioo adw
VRGLYLPAGGSSSGTVNPAPNIASHIS SISARTGDPVTI VRGLYLPAGGS S SGTVNPAP
SGTVNPAPNIAS
SGTVNPAPNIASHISSISARTGDPVTI GTVNPAPNIASHISSIS NPAPNIAS
APNIASHISSISARTGD
NIASHISSIS
NIASHISSISAR
NIASHISSISARTGD
SHISSISAR
SHISSISARTG
SHISSISARTGDPVTI
Subtipo ayw
VRGLYFPAGGSSSGTVNPVLTTASPLSSIFSRIGDPALN
VRGLYFPAGGSSSGTVNPVL
SSSGTVNPVLTTASPLSSIF
SGTVNPVL
SGTVNPVLTTASPLSSIF
SGTVNPVLTTASPLSSIFSRIGDPALN
VNPVLTTASPLSSIF
VNPVLTTASPLSSIFSRIGD
TTASPLSSIF
SPLSSIFSRIG
LSSIFSRIGDPALN /Sá 72591 SCRF Case 95.2
-43- 0 processo de fase sólida de síntese de polipéptidos foi praticado utilizando um Sintetizador de Péptidos Vega 250 e um Sintetizador de Péptidos 430A da Applied Biosciences, disponível comercialmente em Vega Biothecnologies, Inc., Tucsonf AZ, e Applied Biosystems, Foster City, CA, respectivamente. A composição de cada polipéptido foi confirmada por análise dos aminoácidos.
Em resumo, na preparação de um polipéptido sintético pelo processo de fase sólida anterior, os resíduos de aminoácido são ligados a uma resina (suporte sólido) através de uma ligação éster do resíduo do terminal carboxilo. Quando o polipéptido vai ser ligado a um veículo ou a um outro polipéptido através de um resíduo Cys ou feito reagir através dos resíduos Cys terminais, é conveniente utilizar esse resíduo Cys como resíduo do terminal carboxilo que é ligado por éster à resina. 0 grupo amino-alfa de cada aminoácido adicionado é tipicamente protegido por um grupo butoxicarbonilo terciário (T-BOC) antes do aminoácido ser adicionado à cadeia de polipéptidos em crescimento. O grupo t-BOC é então removido cintes da adição do aminoácido seguinte à cadeia de polipéptidos em crescimento.
As cadeias laterais de aminoácidos, reactivas, foram também protegidas durante a síntese dos polipéptidos. Foram utilizados grupos protectores de cadeia lateral, usuais, para os resíduos de aminoácido restantes, como se segue: 0-(p.-bromobenzilo-xicarbonilo) para a tirosina; 0-benzilo para a treonima, serina, ácido aspártico e ácido glutâmico; 4-metilbenzilo e S-metoxibenzilo para a cisteína, dinitrofenilo para a histidina? 2-clorobenzoxicarbonilo para a lisina e tosilo para a arginina.
Os péptidos sintetizados no Sintetizador de Péptidos Modelo 430A da Applied Biosystems foram feitos utilizando o processo de anidrido simétrico de Hagenmaier, H. e Frank, A. (1972) . Hopoe-Seyler·s Z. Phvsiol. Chem.. 353:1973. O processo de DCC in situ, como descrito por Merrifield, etal. (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149. foi utilizado para sintetizar os péptidos do
J 72591 SCRF Case 95.2 -45-
não respondente à região S) e B10.M (um não respondente à região pré-S(2) e S). Os ratinhos foram desafiados com 6,0 μg de AqHBs/p39ad e AqHBs/p39av. Foi estudada a resposta proliferativa de célula T às várias quantidades de AgHBs/p33ad.
Os resultados são ilustrados na Figura 2. Como observado na figura, as células T sensibilizadas com p39/ad reconheceram as partículas de AgHBs contendo pré-S(2)/ad. mas não as partículas contendo pré-S(2)/ay. Por consequência, o reconhecimento pelas células T da região pré-S(2) é específico de subtipo. Os estudos com os locais de célula T de região pré-S(l) (i.e., pl2-21 e p53-73) indicam também uma resposta das células T específica de subtipo na região pré-S(1).
Além disso, os ratinhos B10.M que são não respondentes às regiões pré-S(2) e S quando imunizados com as partículas de pré-S(2)- ou S-AgHBs/ay. são respondentes às partículas de pré-S(2)-AgHBs/ad e produzem anticorpos anti-S e anti-pré-S(2), como ilustrado na Tabela 3. Como se pode observar na Tabela 3, abaixo, os ratinhos B10.M, que são não respondentes às regiões pré-S(2) e S quando imunizados com partículas de pré-S(2)- ou S-AgHBs/ay, são respondentes às partículas de pré-S(2)-AgHBs/ad e produzem os anticorpos anti-S e os anti-S(2). (Segue Tabela 3) -46- 72591
J SCRF Case 95.2 TABEIA 3
Especificidade de Subtipo das Respostas dos Anticorpos
Titulo do Anticorpo
Imunoaénio Estime1 TemDO1 Anti-S Anti-nré AgHBs/P33(ay) B10.S lOd. 0 0 24 d. 0 1:640 2. 1:640 1:10240 B10.M lOd. 0 0 24d. 0 0 2. 0 0 AgHBs/P33(ad) B10.S lOd. 0 1:640 24d. 1:640 1:640 B10.M lOd. 0 1:160 24 d. 1:2560 1:5120 1 Os ratinhos B10.S são não respondentes à região S do AgHBs de ambos os subtipos quando imunizados com AgHBs/P25. Os ratinhos B10.H são não respondentes à região S do AgHBs de ambos os subtipos (i.e., AgHBs/P25), e à região pré-S(2) do subtipo ay [i.e.r AgHBs/gP33(ay)], mas são respondentes ao subtipo ad [i.e., AgHBs/gP33(ad)]. 1
Tempo em dias (d.) após as imunizações primárias. 2° = resposta após imunização secundária. 72591
SCKF case 95.2
Estes resultados indicam que as vacinas de AgHBs “^«atendo S e pré-S(2) beneficiam da inclusão dos subtipos £d e ãi de pré-S(2) e S, pelo menos, por duas razões: (1) a sensibilização de memória de célula T relevante para a infecção de subtipo com qualquer um dos subtipos do vírus; e (2) os não respondentes a tom subtipo podem ser respondentes ao outro subtipo em termos da produção de anticorpos e por consequência, o número de não respondentes genéticos pode ser reduzido.
Este estudo mostra que a sensibilização de memória das células T é específica de subtipo. O estudo mostra também que um animal que é não respondente a um subtipo de AgHBs pode ser respondente ao outro subtipo em termos da produção de anticorpos. Quando tomados em conjunto, os resultados mostram que a inclusão de epítopos de célula T de ambos os subtipos reduz o número de não respondentes genéticos. EXEMPLO 2
Determinação dos Epitooos de Célula T de Pré-S(21 A boa especificidade das células T específicas para a região pré-S(2) do AgHBs foi mapeada como descrito para a região pré-S(l). (Ver Milich, et al. .T. Ττητιηιηοΐ. . 138:4457-4465, 1987). Em resumo, foram imunizadas várias estirpes de murinos dispares H-2, consanguíneas, com 6 μg de partículas de AgHBs/p33 do subtipo ad. Dez dias mais tarde, as células T do gânglio linfático foram colhidas e cultivadas com concentrações variadas de partículas de AgHBs/p33 de ambos os subtipos ad e ay.; e um conjunto de péptidos sintéticos (ver lista de péptidos de célula T de pré-S(2)). A experiência recíproca foi realizada quando os péptidos de célula T activos foram localizados. Os ratinhos foram imunizados com péptidos sintéticos e as células T do gânglio linfático foram colhidas e cultivadas com partículas de AgHBs (p33) nativas para confirmar a relevância da resposta do péptido das células T à proteína nativa.
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A Tabela 2 ilustra os epítopos de célula T de pré-S(2) para as várias estirpes de ratinhos, testadas. Como mostrado na tabela, os epítopos de célula T para o subtipo adw encontram-se nos resíduos 148 a 174, enquanto que os epítopos de célula T de ayw se encontram nos resíduos 136 a 174. A tabela ilustra também que a estirpe B10.M não respondeu a qualquer porção da sequência pré-S(2) de a^ como um epítopo de célula T, mas reconheceu um epítopo de célula T de pré-S(2)/ad.
Este estudo ilustra adicionalmente a necessidade para a inclusão de epítopos de célula T de cada subtipo para reduzir o número de não respondentes genéticos a uma vacina de HBV. EXEMPLO 3
Resposta à Vacina de Pré-S(2) Sintética
Os polipéptidos sintéticos tendo uma sequência correspondente a pl33-174/ad ou pl31-174/ad foram preparados e injectados em ratinhos como descrito acima. O anticorpo induzido foi analisado por ELISA como descrito acima. Embora uma pequena quantidade do anticorpo induzido fosse dirigida para pl33-139 e Ρ137-143 (os epítopos de célula B nativos específicos de grupo e subtipo, respectivamente), a maioria da resposta ao anticorpo foi para pl56-171, , que não é um epítopo de célula B nativo.
Para determinar se a orientação dos epítopos de célula T e B influenciava a resposta, os ratinhos foram injectados com (pl41-174)-(pl33-140)/ad ou (pl51-174)-(pl33-143)/M· 0 anticorpo induzido foi estudado. Ambos os polipéptidos mostraram ser mais imunogénicos do que o pl33-174. Isto é, foi produzido mais anticorpo. Além disso, a maioria do anticorpo foi dirigido para
ρ133-139, ο local de célula Β específico de grupo, nativo. Àlgum anticorpo foi também dirigido para pl37-143, o epítopo de célula B específico de subtipo, nativo. Adicionalmente, foi produzida uma quantidade aumentada de anticorpo nativo, em comparação com a quantidade induzida por pl33-l74 (uma porção da região pré-S(2), na sua ordem natural). A utilização daqueles péptidos foi comparada à do pl20-145, um polipéptido que tem sido utilizado como uma vacina de pré-S(2) sintética. Em contraste com o pl20-145, onde cerca de 50% das estirpes de ratinho testadas foram não respondentes em termos da produção de anticorpos, nenhuma estirpe de murinos foi não res-pondente quando imunizada com (pl41-174)-(pl33-140)/ad ou com (pl51-174)-(pl33-143)/ad·
Além disso, o (pl51-174)-(pl33-143) foi mais eficaz como uma vacina de pré-S(2) do que o pl20-145, visto que ele sensibilizou células T relevantes para o AgHBs nativo. Em contraste, o pl20-145 sensibilizou células T relevantes para o imunogénio de polipéptido mas não para o AgHBs.
Por consequência, pode ser necessária uma região de célula T intensificada para eliminar os não respondentes. Para intensificar a região de célula T, pode ser utilizada uma região maior que inclua mais alguns dos epítopos de célula T, i.e. pl41 -174 em vez de pl5l-l74, ou pode ser utilizada, concorrentemente, uma pluralidade de regiões de polipéptido do epítopo de célula T, mais pequenas, por exemplo, (pl46-160)-(pl33-143), (pl51-165)-(pl33-143) e (pl60-174)--(P133-143).
Como previamente mostrado, a produção de anticorpos para as três regiões do AgHBs é restringida independentemente por H-2 e, no entanto, exibe sobreposição dos mecanismos reguladores. A influência do reconhecimento de célula T específica de região do AgHBs, que podia actuar de modo a auxiliar os clones de célula B respondentes a todas as regiões foi mostrada directamente pelas células T de estirpe B10.M de murino que não responderam às
72591 SCRF Case 95.2 -50-regiões S ou pré-S(2)/ay. Quando a estirpe foi sensibilizada imunologicamente com AqHBs/p39ayf as células T só reconheceram a região pré-S(l). Contudo, esta estirpe produz anticorpos específicos anti-S, anti-pré-S(2) e anti-pré-S(l) a seguir à imunização com AgHBs/p39. Por consequência, as células T específicas de pré-S(l) podem proporcionar um auxílio funcional para os clones de célula B que reconhecem os determinantes da região S, pré-S(2) e pré-S(l), presumivelmente no polipéptido p39 do AgHBs.
Os resultados cumulativos dos estudos correntes sobre a resposta imunitária para as regiões pré-S do AgHBs têm importantes implicações em termos do futuro desenvolvimento da vacina de AgHBs. 0 trabalho prévio sugeriu um número inesperadamente baixo de locais de reconhecimento de célula T no AgHBs/p25, considerando a sua natureza em partículas e o tamanho da subunidade de polipéptido (226 resíduos de aminoácido); Milich, et_al, (1985) J. Immunol.. 134:4203. Isto reflectiu-se na capacidade para identificar, pelo menos, dois haplótipos H-2 (H-2^'s) de murino que eram não respondentes totais , e um (H-2t4) que só era respondente às determinantes de subtipo a seguir à imunização com AgHBs/p25; Milich, et al.. (1984) J. Exp. Med.. 159:41. Em contraste, não foi ainda identificado um haplótipo não respondente a seguir à imunização com AgHBs/p39 de entre os haplótipos H-2 seguintes estudados até à data: q, d, s, k, b, p, f, t4.
Como acima discutido, a falta de não resposta genética ao AgHBs/p39 pode ser atribuída a uma complexidade aumentada do reconhecimento de célula T. Ao nível da célula T, as regiões pré-S(2) e pré-S(l) proporcionam uma heterogeneidade antigénica específica de subtipo, adicional, para o AgHBs/p25, que compreende a vacina Americana derivada de plasma, corrente (Heptavax-B, Merk Sharp and Dohme, Philadelphia, PA). Por consequência, a inclusão de epítopos de célula T de ambos os subtipos de AgHBs/p39 nas vacinas de AgHBs pode diminuir a incidência da não resposta genética.
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É evidente, a partir do presente trabalho e de estudos prévios (Neurath, et al. (1984) Science. 224:392. Neurath, e£ al. (1985), Nature (Londres). 315:154) que os anticorpos específicos de pré-S(l) e pré-S(2), assim como os específicos de s, são produzidos durante a infecção por HBV, no homem. Contudo, a produção de anticorpos específicos para as regiões pré-S(l), pré-S(2) e S do AgHBs não é previsível das respostas de célula T específicas, visto que o auxílio de célula T pode derivar de uma população de células T limitada ao reconhecimento de uma única região de um subtipo particular. Isto é importante no contexto da hipótese de que a clearance do HBV é mediada ao nível da célula T. Por exemplo, uma resposta de célula T auxiliar ou célula T citotóxica específica de pré-S(2) pode ser requerida para a clearance virai, mas não requerida para a produção de anticorpos anti-pré-S(2), como foi observado na estirpe B10.M.
Foi descrito que um certo número de não respondentes a vacinas de AgHBs/p25 que foram subsequentemente infectados com HBV, não só eliminaram a infecção (i.e. não se tornaram portadores crónicos), como também produziram uma resposta de anticorpo da região S; Walker, et al.. (1981) Transfusion. 21:601 (Abstract). Uma explicação possível para este fenómeno é o de que após infecção com HBV, as células T específicas de pré-S proporcionam auxílio para as células B específicas da região S resultando na produção de anti-S por não respondentes à vacina, análogos aos modelos de murino B10.S e B10.M. Por consequência, a utilização de uma variedade suficiente de epítopos de célula T de cada subtipo, pode eliminar os não respondentes humanos como foi demonstrado em ratinhos. EXEMPLO 4
Os estudos utilizando um polipéptido de pré-S(2) truncado e polipéptidos sintéticos curtos mostraram que a sequência terminal (P148-174) é o foco dominante de reconhecimento de célula T em todas as estirpes de murino testadas. Esta sequência de polipéptido truncado contém 17 locais de reconhecimento
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específlcos de subtipo , cuja boa especificidade está dependente do haplótipo da estirpe que responde. A capacidade dos péptidos sintéticos para provocar a reacção cruzada de células T com a região pré-S(2) nativa é variável e dependente da natureza do péptido de imunização.
Foram sintetizados dois conjuntos de péptidos. 0 primeiro conjunto contendo os subtipos d e y da região pré-S(2) incluiu: P133-174, pl48-174, pl20-145/ pl36-155, pl41-160/ pl46-165/ pl51--170/ pl56-174, pl61-174, pl66-174. 0 segundo conjunto inclui; pl46-160/ pl46-159, pl46-157/ pl48-160. pl49-160, p!52-172, Ρ154-172, pl54-170, pl56-172, pl56-170, pl56-169/ pl56-167, pl56-165, pl58-170, pl59-174, pl62-174.
As respostas de célula T foram avaliadas como anteriormente descrito.
Resultados A resposta proliferativa de célula T para a região pré-Sf 2) do AoHBs é especifica de subtino A Figura 3 mostra que a resposta proliferativa de célula T para a região pré-S(2) do AgHBs é específica de subtipo. Os ratinhos B10.S e B10.M foram imunizados com AgHBs/P33 do subtipo d ou y e as células T do gânglio linfático popliteo (PLN) que drenam foram examinadas quanto à resposta proliferativa ao AgHBs/P33 e AgHBs/P25 de ambos os subtipos. Como mostrado na Figura 3A, as células T nos ratinhos B10.S sensibilizados com AgHBs/P33d só responderam ao subtipo d. A especificidade de pré-S(2) da resposta foi confirmada pela falta de resposta às partículas de AgHBs/P25 d ou y, que carecem da região pré-S(2). A resposta recíproca é mostrada na Figura 3B na qual os ratinhos sensibilizados com o subtipo y responderam eficazmente ao
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AgHBs/P33y mas só ligeiramente ao AgHBs/P33d.
Em contraste, embora específica de subtipo, a Figura 4 mostra que a resposta, em ratinhos B10.M, só era marginal ao subtipo y do AgHBs/P33. A metade do terminal C de pré-S(2) é o local de reconhecimento de célula T. dominante, para todas as estirpes de murino testadas A Figura 5 demonstra que o reconhecimento de célula T numa variedade de estirpes está focado na metade do terminal C da região pré-S(2). As células T sensibilizadas com AgHBs/P33d de um certo número de estirpes foram cultivadas com as partículas de AgHBs de comprimento total (P33) ou N-terminalmente truncadas (P28). Porque a versão truncada provocou uma proliferação de células T significativa, em todas as estirpes imunizadas com AgHBs/P33, parece que os resíduos do terminal N (120-139) não desempenham um papel significativo no reconhecimento de célula T. A boa especificidade do reconhecimento de célula T da região pré-S(2) do AgHBs é dependente de MHC. 0 péptido 133-174, que possui os locais de reconhecimento de célula T e B relevantes para a proteína nativa e correspondentes aos subtipos d e y, foi utilizado para definir, adicionalmente, os locais de reconhecimento de célula T na região pré-S(2). Várias estirpes congénicas H-2 foram imunizadas com os subtipos d e y deste péptido e as células de PLN que drenam foram examinadas quanto à resposta proliferativa causada por um conjunto de antigénios.
Embora mostrasse outra vez especificidade de subtipo, a boa especificidade do reconhecimento de célula T B10 foi distinta da dos subtipos d e y. Como observado na Figura 6A, as sequências predominantemente reconhecidas pelas células T B10 sensibilizadas foram pl41-160d, pl46-165d e, num menor grau, pl51-170d. Em contraste, para o subtipo y, o pl36-l55y foi o local de reconhecimento dominante e, num menor grau, o pl51-165y (Figura 72591 SCRF Case 95.2
-54- 6B). Por consequência, as respostas não são de reacção cruzada porque regiões distintas são reconhecidas por células T sensibilizadas com cada subtipo. Isto sugere a substituição de resíduos agretópicos (resíduos que contactam com moléculas de MHC) relevantes para o haplótipo H-2^.
Por outro lado, as células T sensibilizadas com pl33-174d B10.M responderam ao pl56-170d e pl56-174d (Figura 7A) e não conseguiram responder completamente ao pl33-i74y (Figura 7B), o que é compatível com a Figura 4. Parece que uma ou mais das 6 substituições de aminoácidos nesta área (Figura 10) do subtipo y interfere com a reacção dos resíduos agrotópicos com as moléculas de MHC da classe II B10.M.
Uma especificidade de subtipo similar é evidente para B10.S, como mostrado na Figura 8A e B. A imunização com pl33-174d causou respostas de células T para pl51-170d e 156-174d mas não para os seus complementos y (6A). Reciprocamente, a imunização com pl33-174y causou uma resposta vigorosa nos locais 156-174y e 161-174y. 0 subtipo d de pl33-174 é só moderadamente imunogénico em B10.D2, como observado na Figura 9A, em contraste com o subtipo y (Figura 9B), onde os péptidos são também antigénicos. A sequência pl46-165y parece representar o foco da resposta. Um sumário do reconhecimento de célula T da região pré-S(2) dos subtipos d e y, em 8 estirpes de murinos que representam 8 haplótipos H-2 diferentes, é apresentado na Figura 10. É evidente a partir da análise acima que o local de célula T, específico, reconhecido é dependente do haplótipo H-2 da estirpe que responde. 0 número absoluto de locais de reconhecimento de célula T que se sobrepõem mas que são distintos (17) e a sua concentração numa tal região tão limitada (27 resíduos) de pré-S(2) é impressionante. É também notável que todo o local de reconhecimento de célula T, definido neste estudo, seja específico de subtipo. Isto é compatível com a especificidade de resposta de célula T B10.S e B10.M para o AgHBs/P33 e indica que as últimas estirpes não são únicas quanto a este aspecto.
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Na Figura 11A, as células T sensibilizadas com AgHBs/P33 B10 reagem eficazmente com AgHBs/P28 (a sequência truncada), pl41-160 e pl46-165, compatíveis com o local de célula T dominante, Ρ149-157, que foi também definido com péptidos sintéticos pl33-174 e pl48-174, como imunogénios. Similarmente, as células T sensibilizadas com AgHBs/P33, B10.M, reagem eficazmente com AgHBs/P28, pl51-170 e pl56-174, compatíveis com o local dominante, pl56-167, que foi também definido com péptidos sintéticos pl33-174 e pl48-174, como imunogénios (Figura 11B). Não há qualquer evidência de que as células T desafiadas com AgHBs/P3 3 de qualquer estirpe reconheçam a metade do terminal N (P120-147) do pré-S(2).
Discussão
Estes estudos sugerem a possibilidade de que regiões de uma proteína que possuem características físicas/químicas ideais para a interacção com moléculas de MHC e/ou TCR serão excelentes alvos para o reconhecimento de células por múltiplas estirpes. Embora não exista, provavelmente,um local de reconhecimento de célula T "universal", a região pl48-174 de pré-S(2) representa uma sequência relativamente curta (27 resíduos) com 17 locais específicos reconhecidos unicamente por 8 dos 8 haplótipos H-2 testados.
Como benefício adicional, a sequência pl48-174 da região pré-S(2) pode servir como uma porção veículo de célula T específica, sintética, para epítopos de célula T não HBV para proporcionar a função, de célula Th, de indução da produção de anticorpos numa variedade de haplótipos de MHC.
Se a resposta de célula T, humana, para pré-S(2) for focada na região do terminal C, variável por subtipo, o que parece provável tendo em vista a predominância desta região no reconhecimento de célula T de murino,ambos os subtipos principais de AgHBs/P33 deviam ser incluídos em vacinas contendo pré-S(2) de terceira geração. É também imperativo que uma vacina de -56-
-56- J 72591 SCRF Case 95.2 células T çpfe podem Como foi observado está dependente da subunidade sintética seja capaz de provocar reagir cruzadamente com o antigénio nativo, neste estudo, e abaixo, esta característica natureza do imunogénio sintético. EXEMPLO 5
Imunoaénios de Pré-S(2) Sintéticos
Uma finalidade deste estudo foi a de examinar a influência do subtipo virai na produção de anticorpos in vivo para a região pré-S(2) do AgHBs. Uma segunda finalidade foi a de "construir" um imunogénio de pré-S(2) sintético, com base na combinação dos locais de reconhecimento de célula B e T, dominantes, num único péptido. Os processos utilizados foram como anteriormente descrito.
Resultados
Partículas de AaHBs/P33 como Imunogénio A Tabela 4 mostra a resposta primária do anticorpo causada por imunização com partículas de AgHBs/P33 em seis estirpes de ratinhos que variam no haplótipo H-2. (Segue Tabela 4)
TABELA 4
Resposta primária do anticorpo à imunização com AgHBs/P33d Estirpe3 Tempo (Dias) H-2 Título do anticorpo(l/Diluição) Anti-pré-S(2) Anti-S B10 10 b 2560 (+)b 160 (+) 24 40960 (+) 2560 (+) B10.M 10 f 160 (0) 0 (0) 24 5120 (0) 2560 (0) B10.S 10 s 640 (+) 0 (0) 24 1280 (+) 640 (±) biod2 10 d 1280 (+) 40 ( + ) 24 2560 (+) 10240 (+) B10 BR 10 k 40 (0) 0 (0) 24 2560 (+) 320 (+) c3h.q 10 q 640 (+) 40 ( + ) 24 10240 (+) 640 (+) 3 Grupos de 5 ratinhos cada, das estirpes indicadas, foram imunizados i.p. com 2,0 ug de AgHBs/GP33d emulsionado em CFA. Dez e 24 dias após a imunização os soros foram recolhidos, reunidos e foi determinado o anticorpo anti-pré-S(2) e anti-HBS (S) IgG por ELISA utilizando o péptido de pré-S(2) pl20-145d e AgHBs/P25d como antigénios de fase sólida, respectivamente. 0 título do anticorpo é expresso como o recíproco da diluição de soro que produziu 3 x a leitura da D.O. dos soros de pré-imunização. b Estado respondente após imunização com o subtipo avw do AgHBs/P33.
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Os estudos prévios mostraram que a estirpe B10.M não é respondente a ambas as regiões S e pré-S(2) do AgHBs. Contudo, estes estudos só utilizaram partículas de AgHBs do subtipo ayw. Quando desafiados com partículas de AgHBs do subtipo adw2, foram produzidos anticorpos anti-região S e anti-região pré-S(2). Estas respostas positivas são compatíveis com a verificação de que as células T B10.M são capazes de reconhecimento eficaz do subtipo adw2 mas não do subtipo ayw da região pré-S(2). Visto que os estudos sobre células T também indicam que a estirpe B10.M era não respondente à célula T para a região pré-S(2) de ambos os subtipos, a produção de anticorpos resulta provavelmente da função de célula T de auxílio (Th) específica de pré-S(2)/d. Estes estudos indicam que a frequência de não respondentes a pré-S(2) pode ser diminuída por simples imunização com ambos os subtipos. A Tabela 5 mostra a boa especificidade para o anticorpo anti-pré-S(2) causada por imunização com AgHBs/P33d. A natureza independente da conformação dos determinantes antigénicos da região pré-S(2) permite a utilização de péptidos sintéticos como ligandos para a análise de especificidade. Todas as estirpes produziram anticorpos contra a sequência pl20-145, independentemente do subtipo. (Segue Tabela 5)
TABELA 5
Boa especificidade do anticorpo anti-pré-S(2) causada por imunização com AgHBS/P33d
Estirpea Título do anticorpo(l/Diluição)
Antigénios pl20-145d pl20-145y pl20-132d pl33-140d/y pl56-174d pl56-174y B10 40960 20480 0 2560 40 0 B10.M 5120 5120 0 1280 160 0 B10.S 1280 1280 0 160 40 0 bio.d2 2560 2560 0 320 160 0 bio.br 2560 1280 0 160 0 0 C,H.Q 10240 5120 0 320 10240 160
Grupos de 5 ratinhos cada, das estirpes indicadas, foram imunizados i.p. com 2,0 pg de AgHBs/P33d emulsionado em CFA, e 24 dias mais tarde foi determinado o anticorpo IgG específico para os péptidos da região pré-SC2) indicados, por ELISA. 0 título do anticorpo é expresso como o recíproco da diluição de soro que originou 3 x a leitura da D.O. dos soros de pré-imunização.
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A falta de reactividade com pl20-132d e a reactividade positiva com pl33-140d/y define que a especificidade dominante é a do 133-140 (os títulos mais elevados de pl25-l45 são devidos à maior adesão deste péptido a uma superfície de fase sólida). A sequência pl33-l40 é conservada entre os subtipos d e y, por consequência, a falta de reactividade de anticorpo específico de subtipo no péptido pl20-145 (i.e., a ligação aos subtipos y e d) não é significativamente diferente. Estas, e verificações similares após imunização com AgHBs/P33y, indicam que a resposta de anticorpo predominante para a região pré-S(2) é específica de grupo. Por consequência, a influência do subtipo é expressa ao nível do estado respondente/não respondente do anticorpo, que é mediado por célula T, e não é evidente em termos de reactividade cruzada de anticorpo entre os subtipos d e y. Isto é, o subtipo virai influencia o facto do anticorpo específico ser produzido, mas uma vez produzido, o anticorpo é completamente cruzadamente reactivo em ambos os subtipos.
Imunoaénio Sintético n!33-174/d 0 péptido pl33-174 foi muito imunogénico para a sua própria sequência, como observado na Tabela 6, contudo, os anti-soros produzidos reagiram cruzadamente de modo bastante fraco com o AgHBs/P33d nativo, com a excepção da estirpe B10. Embora a sequência pl33-174d seja aquela do AgHBs/P33d nativo, os dois não causaram respostas similares. A imunização com AgHBs/P33d ou y causa um anticorpo similarmente focado na região pl33-143 de pré-S(2), que é cruzadamente reactivo com partículas nativas só com baixa reactividade com pl56-l74. (Segue Tabela 6)
TABELA 6
Boa especificidade da resposta do anticorpo à imunização com o imunogénio p!33~174d de pré-S(2) sintético
Estirpe3 Tempo (Semanas) Título do anticorpo(l/Diluiç3o) AgHBs pl33-174d pl20-145d d y Pl56-174d d y B10 2 10240 640 163840 640 20480 160 4 655360 10240 655360 20480 163840 640 B10.S 2 160 0 10240 0 640 0 4 1280 0 81920 1280 5120 0 B10.M 2 0 0 10240 160 2560 0 4 640 0 40960 10240 20480 0 610.BR 2 0 0 5120 0 640 O 4 320 0 163840 640 10240 0 bio.d2 2 0 0 2560 0 640 0 4 640 0 40960 0 1280 0 B10.P 2 640 0 40960 2560 2560 0 4 2560 640 163840 20480 2560 0 a Grupos de 5 ratinhos cada, , das estirpes indicadas, foram imunizados i.p. com 100 Mg pl33-174d emulsionado ern CFA. Duas e 4 semanas após a imunização os soros foram reunidos analisados quanto ao anticorpo IgG reactivo com os antigénios indicados, por ELISA. O título do anticorpo é expresso como o recíproco da diluição de eoro que produziu 3 x a leitura da 0.0. dos soros de pré-imunização. 72591 SCRF Case 95.2 -62-
Imunocrénio Sintético n!51-174f133-143Wd
Foi examinado o efeito da inversão da orientação dos locais de célula B e T. Um péptido específico de pré-S(2) compósito foi sintetizado por colocação da sequência de reconhecimento de célula, pl5l-174, N terminalmente aos locais de célula B dominante no pl33-143. Este péptido foi designado por pl51-174(133-143)/d. A boa especificidade dos anticorpos causados é mostrada na Tabela 7. Em todas as estirpes a imunização primária resultou em elevados títulos principalmente focados em pl33-l43 (como detectado no pl20-l45 aderido à fase sólida). Estes anticorpos foram também altamente cruzadamente reactivos contra o AgHBs/P33 nativo de ambos os subtipos em todas as estirpes à excepção da B10.P, mas quase nunca com pl56-174. A boa especificidade a especificidade de grupo e a reactividade cruzada mimetizaram aquelas do AgHBs/P33, e foram bastante diferentes das do pl33-174. Embora a sequência pl33-174 seja mais "semelhante à nativa" o péptido sintético com a orientação inversa exibe uma reactividade mais "semelhante à nativa". Para além da orientação, o espaçamento dos locais reactivos foi diferente entre os dois imunogénios. Doze resíduos separam os locais B e T em pl33-174, e só quatro resíduos em pl51-174(133-l43). (Segue Tabela 7)
TABELA 7
Boa especificidade da resposta do anticorpo à imunização com o imunogénio p!51-174 (133-143)/d de pré-S(2) sintético
Estirpe3 Tempo (Semanas) Título AgHBs/P33 d y do anticorpo(l/Diluição) P120-145 P156-174 d yd y B10 2 1280 1280 40960 40960 1280 0 4 20480 10240 163840 163840 5120 0 B10.S 2 5120 1280 20480 20480 640 0 4 20480 10240 163840 81920 5120 0 B10.H 2 1280 1280 163840 10240 40 0 4 20480 20480 327680 40960 40 0 B10.8R 2 5120 5120 20480 20480 160 0 4 20480 10240 81920 81920 40 0 bio.d2 2 5120 320 5120 20480 160 0 4 81920 10240 81920 40960 2560 0 B10.P 2 0 0 1280 160 0 0 4 0 0 40960 1280 0 0 a Grupos de 5 ratinhos cada, das estirpes indicadas, foram imunizados i.p, com 100 M9 de pl5i—174C133/143)/d em CFA, e foi determinado o anticorpo IgG específico dos antigénios indicados, 2 e 4 semanas após a imunização. A estirpe B10 foi imunizada com 141-174(l33-l43)/d para incluir o local de célula T dominante para esta estirpe (i.e., P149-157 (13)).
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Influência do ol51-174f133-143) na Boa Especificidade de Célula T
Os ratinhos B10.S foram imunizados com imunogénios sintéticos do subtipo d, incluindo: pl33-174, pl51-174 (133-143), Ρ148-174, P156-174 e pl6l-l74 e foi examinada a proliferação de célula T. A Figura 12 mostra que as células sensibilizadas com pl33-174 reconheceram o local pl56-170f mas não o local pl61-174. Reciprocamente, as células T desafiadas com pl51-174(133-143) reconheceram preferencialmente o local pl61-174. A imunização com os outros péptidos causou respostas equivalentes para pl56-170 e P161-174.
Este resultados indicam que o maior contexto no qual existe um local de célula T pode influenciar a sua imunogenicidade. Por exemplo, a sequência pl61-174 não é imunogénica no contexto de pl33-174, e no entanto representa o local de reconhecimento de célula T dominante no imunogénio pl51-174(133-143). Também de interesse é o facto de que pl61-174 foi mais eficaz em termos da sensibilização do reconhecimento de célula T específica de AgHBs/P33 nativo.
Produção de Anticorpos por Imunogénios de Orientação Variada
Um sumário dos resultados de imunização envolvendo as estirpes de murino com haplotipos H-2 dispares e três imunogénios de pré-S(2) (subtipo d) de diferente orientação, é apresentado na Tabela 8. Os péptidos pl33-l74 e pl51-174(133-143) combinam o local de célula B com a região de reconhecimento de célula T de terminal C em diferentes orientações e o péptido pl20-145 combina o local de célula B com a sequência 120-132 de terminal N. (Segue Tabela 8) > 72591 SCRF Case 95.2 -65-
TftBELA 8
Comparação das respostas dos anticorpos após imunização com três imunogéníos de pré-S(2) sintéticos do subtipo adw2 Estirpe3 Imunogénio Titulo do Anticorpo (1/Oiluiçâo)
AgHBs/P33 d y pl20-145d pl56-174d B10 120-145b 1280 320 20480 0 133-174 163840 10240 20480 163840 141-174(133-143) 20480 10240 163840 5120 B10.S 120-145 0 0 320 0 133-174 1280 0 1280 5120 151-174(133-143) 20480 10240 163840 5120 B10.H 120-145 0 0 0 0 133-174 640 0 10240 20480 151-174(133-143) 20480 20480 327680 40 B10.BR 120-145 20480 5120 40960 0 133-174 320 0 640 10240 151-174(133-143) 20480 10240 81920 40 bio.d2 120-145 0 0 0 0 133-174 640 0 0 1280 151-174(133-143) 81920 10240 81920 2560 c3h.q 120-145 81920 81920 655360 0 133-174 10240 0 2560 10240 151-174(133-143) 1280 0 320 40 a Grupos de 5 ratinhos cada, das estirpes mostradas, foram imunizados i.p. com 100 pg em CFft dos imunogéníos de pré-S(2) sintéticos, indicados. Os soros foram recolhidos 4 semanas após a imunização e analisados quanto aos anticorpos IgG específicos para os antigénios indicados.
As caixas representam a localização do(s) epitopo(s) de célula B dominante(s) da região
Pré-S(2) representada pelos resíduos 133-143.
Embora o pl20-145 causasse um anticorpo anti-pl20-145 de alto título cruzadamente reactivo com AgHBs/P33 de ambos os subtipos em ratinhos C3H.Q e B10.BR, e para uma menor extensão em ratinhos B10, as estirpes B10.S, B10.M e B10.DR2 foram não respondentes ou fracas respondentes, sugerindo uma falta de capacidade de reconhecimento da sequência pl20-l45. O pl33—174 causou anticorpos de todas as estirpes, indicando uma capacidade de reconhecimento da metade do terminal c da região pré-S(2). 0 anticorpo anti-pl56-l74 produzido é cruzadamente reactivo com AgHBs/P33, contudo é específico do subtipo quer para pl56-174 quer para AgHBs/P33, A imunização com pl51-174(133-143) [pl41-174(133-143) no caso dos ratinhos B10] causou um anticorpo reactivo anti-pl33-143 de alto título e pouco anticorpo anti-pl56-174. Os anticorpos anti-péptido são cruzadamente reactivos contra ambos os subtipos de AgHBs/P33 em todas as estirpes com excepção da C3H.Q. Por consequência, na maioria das estirpes, o pl51-174(133-143) foi nitidamente o imunogénio superior e que mais fielmente mimetizou a resposta induzida por AgHBs/P33.
Discussão
Como previsto pelas experiências de reconhecimento de célula T, os ratinhos B10.H que não produziram anticorpos após imunização com subtipo ayw da região pré-S(2), são capazes de produzir eficazmente anticorpo anti-pré-S(2) após imunização com AgHBs/P33 do subtipo adw2. Este é o exemplo mais dramático da influência do subtipo na produção de anticorpo: uma estirpe não respondente a pré-S(2) é convertida numa estirpe respondente a pré-S(2) por imunização simples com o subtipo alternativo.
Porque a baixa resposta até não existente dos receptores humanos de uma vacina de AgHBs/P25 foi recentemente correlacionada com certos haplotipos de MHC, é razoável supor que a resposta imunitária específica de pré-S(2), humana, seja regulada por genes ligados a MHC independentemente da regulação da região S, como tem sido demonstrado no ratinho. Por 72591 SCRF Case 95.2 -67-
consequência, a influência de subtipo virai de^^&á" s» razoavelmente esperada no reconhecimento de célula T da região pré-S(2)f no homem. A Figura 13 representa um sumário da experiência com dois imunogénios de pré-S(2) sintéticos quando comparados ao AgHBs/P3 3. 1. A imunização de ratinhos B10.S com AgHBs/P33 nativo causou um anticorpo principalmente específico para pl33-139 (B-^) e numa menor extensão para pl37-143 (B2). São também observados dois locais de reconhecimento de célula T que se sobrepõem (Tx e T2), em pl56-170 e pl61-174, respectivamente. 2. Os mesmos os ratinhos imunizados com pl33-174, que é linearmente similar ao imunogénio de pré-S(2) sintético nativo, produzem anticorpos para um único local pl56-l74, e significativamente menos para B^ e B2· Ao nível da célula T, as células T sensibilizadas reconhecem exclusivamente o epítopo de T^# e o anticorpo produzido não é muito reactivo de forma cruzada em AgHBs/P33 nativo. 3. A imunização com pl51-174(133-143), por outro lado, resulta numa resposta de anticorpo mais "semelhante à nativa" i.e., principalmente dirigida para 63^62, e muito reactiva de modo cruzado com o AgHBs/P33 nativo. Em contraste com pl33-174, as células desafiadas com pl51-174(133-143 ) reconhecem preferencialmente T2
Sejam quais forem os mecanismos celulares que possam explicar a imunogenicidade intensificada de pl5l-l74(133-143) este péptido compósito representa um imunogénio de pré-S(2) sintético eficaz na maioria dos haplotipos de MHC testados. Por consequência, é razoável esperar que seja obtido no homem um efeito de orientação similar e devia ser considerado em qualquer tentativa para "construir" uma vacina superior.
Embora o presente invento tenha sido agora descrito em termos de certas concretizações preferidas, e exemplificado relativamente a elas, um perito na arte irá rapidamente verificar que podem ser feitas várias modificações, mudanças, omissões e substituições sem afastamento do seu espírito. Por consequência
72591 SCRF Case 95.2 -68-deseja-se que o presente invento seja limitado somente pelo âmbito das reivindicações seguintes.
Claims (33)
- J 72591 SCRF Case 95.2 -69-REIVINDICACÕES 1 - Processo de obtenção de um polipéptido de epitopo de célula T de pre-S(2) com 6 a 50 resíduos de aminoácido consistindo essencialmente numa primeira sequência de resíduos de aminoácido correspondendo a uma fórmula seleccionada do grupo consistindo em: resíduos 136-155, 136-174, 148-159, 148-174, 149-165, 152-159, 154-170, 156-165, 156-167, 156-170, 159-167, 159-169 e 159-174 da região pre-S(2) de AgsHB/d; e uma segunda sequência de resíduos de aminoácido correspondendo a uma fórmula seleccionado do grupo consistindo em: resíduos 136-155, 136-174, 146-165, 148-155, 148-165, 148-174, 151-165, 151-170, 156-165, 159-169, e 161-174 da região pre-S(2) de AgsHB/^; caracterizado por realizar uma síntese peptídica em fase sólida.
- 2 - Processo de obtenção de um polipéptido compósito carac-terizado por compreender a síntese de um primeiro polipéptido (a) operativamente ligado ao terminal amino de um segundo polipéptido (b), no qual o polipéptido (a) consiste essencialmente num polipéptido de epitopo de célula T de pré-S(2) com 6 a 50 resíduos de aminoácido incluindo uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a, pelo menos, uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada do grupo consistindo nos resíduos 136-155, 136-174, 148-159, 148-174, 149-165, 152-159, 154-170, 156-165, 156-167, 156-170, 159-167, 159-169 e 159-174 da região pre-S(2) de AasHB/d e resíduos 136-155, 136-174, 146-165, 148-155, 148-165, 148-174, 151-165, 151-170, 156-165, 159-169, e 161-174 da região pre-S(2) de AgsHB/γ.; e o polipéptido (b) compreende uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a uma sequência de resíduos de aminoácido de AgsHB que contém um epitopo de célula B nativo. 72591SCRF Case 95.2 -70-
- 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido epítopo de célula B ser um epítopo de célula B específico do grupo.
- 4 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o polipéptido (b) compreender uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a um epítopo de célula B específico do subtipo.
- 5 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o polipéptido (b) compreender uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a um epítopo de célula B da região S.
- 6 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o polipéptido (b) compreender uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a um epítopo de célula B da região pre-S(l) ou a um epítopo de célula B da região pre-S(2).
- 7 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o polipéptido (a) consistir num polipéptido de epítopo de célula T de pre-S(2) que corresponde aos resíduos 148-174 da região pre-S de AgsHB/d ou AgsHB/χ.
- 8 - Processo de obtenção de um polipéptido compósito caracterizado por compreender a síntese de um polipéptido com pelo menos 14 , e não mais do que 100, resíduos de aminoácido compreendendo um primeiro polipéptido (a) ligado ao terminal amino de um segundo polipéptido (b), no qual o polipéptido (a) compreende um epítopo de célula T de pre-—S(2) possuindo uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a, pelo menos, uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada do grupo consistindo nos resíduos 136--155, 136-174, 148-159, 148-174, 149-165, 152-159, 154-170, 156-165, 156-167, 156-170, 159-167, 159-169 e 159-174 da região pre-S(2) de AcxsHB/d e resíduos 136-155, 136-174, 146-165, 148--155, 148-174, 151-165, 151-170, 156-165, 159-169, e 161-174 da região pre-S(2) de AgsHB/χ; e72591 SCRF Case 95.2 -71- o polipéptido (b) compreende uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a uma sequência de resíduos de aminoácido de AgsHB que contém um epítopo de célula B nativo.
- 9 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o referido epítopo de célula B ser um epítopo específico do grupo.
- 10 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o polipéptido (b) compreender uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a um epítopo de célula B da região pre-s(2).
- 11 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o polipéptido (b) compreender uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a uma sequência de resíduos de aminoácido da região pre-S(2) de AgsHB seleccionada do grupo consistindo em: resíduos 133-139, 133-143 e 137-143.
- 12 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a pelo menos uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada do grupo consistindo nos resíduos (141-174)-(133--140), (146-160)-(133-143), (148-174)-(133-143), (151-165)-(133--143) e (151-174)-(133-143) da região pre-S(2) de AgsHB.
- 13 - Processo de preparação de uma vacina compósita de sub-tipos de célula T para o vírus da hepatite B , caracterizado por compreender a síntese dos polipéptidos (al) e (a2) nos quais: o polipéptido (al) compreende uma sequência de aminoácidos correspondendo à sequência de resíduos de aminoácido de um epítopo de célula T de AgsHB/d nativo e o polipéptido (a2) compreende uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à sequência de resíduos de aminoácido de um epítopo de célula T de AgsHB/γ. nativo, e a sua dissolução, dispersão ou mistura, como ingrediente activo, com um excipiente farmaceuticamente aceitável e compatível com o J 72591 SCRF Case 95.2 -72-ingrediente activo
- 14 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracteriza-do por pelo menos um dos referidos polipéptidos corresponder a um epítopo de célula T da região pre-S(2) nativo.
- 15 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracteriza-do por o polipéptido (al) compreender uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada do grupo consistindo nos resíduos 136-155, 136-174, 148-159, 148-174, 149-165, 152-159, 154-170, 156-165, 156-167, 156-170, 159-167, 159-169 e 159-174 da região pre-S(2) de AasHB/d.
- 16 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracteriza-do por o polipéptido (a2) compreender uma sequência de resíduos de aminoácido que corresponde a uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada do grupo consistindo nos resíduos 136-155, 136-174, 146-165, 148-155, 148-165, 148-174, 151-165, 151-170, 156-165, 159-169, e 161-174 da região pré-S(2) de AgsHB/γ..
- 17 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracteri-zado por compreender adicionalmente pelo menos um polipéptido (bl) e um polipéptido (b2) que estão operativamente ligados a pelo menos um dos polipéptidos (al) e (a2), compreendendo cada um dos polipéptidos (bl) e (b2) uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à sequência de resíduos de aminoácido de um epítopo de célula B nativo de AgsHB nativo.
- 18 - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracteriza-do por os polipéptido (al) e (a2) estarem operativamente ligados aos polipéptidos (bl) e (b2), respectivamente.
- 19 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracteri-zado por os polipéptidos (bl) e (b2) terem a mesma sequência de aminoácidos.72591 SCKF Case 95.2 -73-
- 20 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracteri-zado por os polipéptidos (al) e (a2) estarem operativamente ligados ao polipéptido (bl).
- 21 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido epítopo de célula B nativo ser um epítopo de célula B específico de grupo.
- 22 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido epítopo de célula T nativo ser um epítopo de célula T de pre-S de AgsHB.
- 23 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido epítopo de célula B nativo ser um epítopo de célula B de pre-S de AgsHB.
- 24 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o polipéptido (al) estar operativamente ligado ao polipéptido (bl) e compreender AgsHB/p39ad.
- 25 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o polipéptido (a2) estar operativamente ligado ao polipéptido (b2) e compreender AasHB/p33ay.
- 26 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender AgsHB/p39ad e AgsHB/p33ay.
- 27 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por pelo menos um dos polipéptidos (al) e (a2) estar presente numa partícula.
- 28 - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por ambos os referidos polipéptidos formarem uma partícula heterogénea.
- 29 - Processo de preparação de uma porção veículo sintética caracterizado por compreender ligar operativamente uma sequência correspondendo à sequência de pre-S(2) de AgsHB/d ou /y, -74- 72591 SCEF Case 95.2 148-174, a um ou vários imunogénios polipeptídicos.
- 30 - Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por o referido veículo ser ligado ao terminal N do referido imunogénio polipeptídico.
- 31 - Processo de preparação de uma vacina caracterizado por compreender misturar os dois subtipos ay e ad major do vírus da hepatite B de cada um de e uma pluralidade de epítopos de antigénios seleccionados de entre os antigénios S e pre-S, sob a forma de qualquer uma sua permutação ou combinação.
- 32 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por os referidos epítopos estarem em moléculas separadas ligadas a uma estrutura insolúvel.
- 33 - Processo de preparação de uma vacina compósita de subtipos de célula T para o vírus da hepatite B (HBV), caracterizado por se dissolver, dispersar ou misturar um polipéptido (al) compreendendo uma sequência de aminoácidos correspondendo à sequência de resíduos de aminoácido de um epítopo de célula T de AgsHB/d nativo e um polipéptido (a2) compreendendo uma sequência de resíduos de aminoácido correspondendo à sequência de resíduos de aminoácido de um epítopo de célula T de AgsHB/y. nativo, como ingrediente activo, num excipiente farmaceuticamente aceitável e compatível com o ingrediente activo. Lisboa, Mfci $91 Por SCRIPPS CLINIC AND RESEARCH FOUNDATION =0 AGENTE 0FICIAL=
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