JP2763408B2 - Ｈｃｖに対する抗体の検出、ｈｃｖ感染の診断及びワクチンとしての予防に有用な合成ペプチド - Google Patents

Ｈｃｖに対する抗体の検出、ｈｃｖ感染の診断及びワクチンとしての予防に有用な合成ペプチド

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JP2763408B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス
（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ：ＨＣＶ）感
染、或いは非Ａ非Ｂ肝炎（ｎｏｎ−Ａ ｎｏｎ−Ｂ ｈ
ｅｐａｔｉｔｉｓ：ＮＡＮＢＨ）の診断および予防に特
異的なペプチド組成物に関連している。より詳細には、
本発明は体液中のＨＣＶに対する抗体の検出に特異的な
合成ペプチド組成物と、それを用いるイムノアッセイ
（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）に注目が向けられてい
る。本発明はまた、ＨＣＶに対するモノクローナルおよ
びポリクローナル抗体の産生を引き出す抗原としての、
そして、ＮＡＮＢＨもしくはＨＣＶ感染の予防用のワク
チン中の免疫原としての、該合成ペプチド組成物の利用
法も含んでいる。
【０００２】
【従来の技術】１９４０年代、２人の独立した研究者
は、ウイルス性肝炎にはＡ型とＢ型と呼ばれる少なくと
も２つのタイプのものがあり（ＨＡＶ，ＨＢＶ）、ＨＡ
ＶあるいはＨＢＶどちらか一方のタイプによる感染で
は、患者は交差免疫（ｃｒｏｓｓ−ｉｍｍｕｎｉｔｙ）
を示さないということを結論づけた。（１−３）。２つ
のウイルスに起因する病気を同定し、臨床的にそして血
清学的にこうした２つのタイプの肝炎を区別することが
可能となったのは、Ａ型肝炎および型肝炎のための血清
学的マーカーが導入された１９７０年代になってからや
っとのことである。
【０００３】次いで、１９７４年、輸血による肝炎の多
くのケースがＨＡＶやＨＢＶに帰属することができず、
こうしたウイルス以外の病原体の仕業であるということ
が、プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ）らにより示唆された。彼
らは、その病原体をＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と名付
けることを提案した（４）。別の肝炎の原因となる病原
体の存在は、その後、アルター（Ａｌｔｅｒ）らにより
確認されており、彼らは、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡ
ｇ）を保持していることがわかっている商業的な血液供
与者の排除は、輪血後肝炎の頻度を有意に減少させるが
（５）、それでもなお、輸血を受けた各年５００万人の
アメリカ人のうち、７から１０％が肝炎を発病すると報
告した。こうした輸血後肝炎のケースの９０％におい
て、ＨＡＶ、ＨＢＶ、エプシュタインーバール（Ｅｐｓ
ｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス、サイトメガロウイルス
（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）や、しばしば肝臓
疾患を起こす他のウイルスとは関連のない、特異なウイ
ルスが病因学的病原体として暗示された（５）。この感
染は非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）と呼ばれた。
【０００４】何年にもわたって、ＮＡＮＢＨは血液透析
をうける患者や、腎臓移植の受容者（６）や、静脈注射
による薬物乱用者（７）や、精神遅滞者たちのための施
設の患者（８）において、報告されている。さらに、Ｎ
ＡＮＢＨ患者の世話をしている看護婦たちもこの病気に
かかることがわかってきている。
【０００５】流行病学的証拠から、水媒介性の流行型
と、血液もしくは注射針と関係した型と、散発的におこ
る集団獲得型の３つの型のＮＡＮＢＨがありそうだとい
うことが示唆される。しかしながら、ＮＡＮＢＨをひき
おこす病原体の数、正確な性質は未だに完全には明らか
になっていないでいる。
【０００６】急性段階のＮＡＮＢＨは、Ｂ型肝炎の場合
よりも深刻ではなく、その病気はほとんど致死性ではな
い。しかしながら、ＮＡＮＢＨにかかっている人の１／
３を超える人々が、その病気の慢性型になり、そうなる
といつまでも感染性を保ったままになる。この慢性的な
状態は肝硬変へとつながり、最終的には肝癌となり得
る。
【０００７】推定上のＮＡＮＢＨウイルス抗原や、抗体
を検出しようと企てて、多くの手法が開発されてきた。
寒天−ゲル（ａｇａｒ−ｇｅｌ）拡散法、カウンター免
疫電気泳動法（ｃｏｕｎｔｅｒ ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、免疫蛍光顕微鏡法、免疫電
子顕微鏡法、ラジオイムノアッセイ（ｒａｄｉｏｉｍｍ
ｕｎｏａｓｓａｙ）、そして、患者からのクルードな
（ｃｒｕｄｅ）生物学的ライセート（ｌｙｓａｔｅ）と
抗体を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ
−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓ
ａｙ）がこれに含まれる。しかしながらこうしたアッセ
イのいずれも、ＮＡＮＢＨの診断試験として用いるのに
十分な感度、特異性、再現性がない。検出されたいくつ
かの反応性は、後に、ホストの細胞質抗原に対する抗体
の存在や、肝臓病を持っているもしくは持っていない患
者にしばしば存在する低レベルのリウマチ因子様物質
（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ−ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｓ
ｕｂｓｔａｎｃｅ）に帰属された。
【０００８】ＮＡＮＢＨに対する決定的な試験のない状
態で、過去の診断はひとつの消去法であった。急性肝炎
の臨床的存在と、Ａ型およびＢ型肝炎、エプシュタイン
−バールウイルス、サイトメガロウイルスに対する血清
学的マーカーの一貫した欠如に、それは基づいていた。
【０００９】ＮＡＮＢＨやＨＣＶに対する抗体の検出の
ためのいかなる特異的試験も有用ではなかったので、少
なくともある程度の輪血後ＮＡＮＢＨを予防する手段と
して、供与者をスクリーニングするための非特異的試験
の利用が過去１０年間採用されてきた。
【００１０】そのような代理試験の１つは肝臓の酵素レ
ベルを測る。肝臓のいくつかの酵素、殊にアラニンアミ
ノトランスフエラーゼ（ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔ
ｒａｎｓｆｅｒａｅ；ＡＬＴ）の濃度は、活発な肝炎に
かかっている患者の血中でしばしば上昇している。２つ
の独立した研究は、供与者ＡＬＴレベルと、輸血受容者
のＮＡＮＢＨ発病の相関関係を示した（９−１１）。し
かしながら、ＮＡＮＢＨを伝搬する血液供与者の約２０
％しか、肝臓の酵素濃度の上昇を示していないことが、
いくつかの研究により示された。他の研究者たちはさら
に、肝臓の酵素レベルが、激しい飲酒のような外来の要
素によって増加しうることを見出した。
【００１１】供与者集団をＢ型肝炎ウイルスの感染にか
かり易くする流行病学的環境も、ＮＡＮＢＨ病原体への
暴露に都合がいいかもしれない。スティーブンス（Ｓｔ
ｅｖｅｎｓ）らにより行われた研究（１２）は、Ｂ型肝
炎ウイルスに対する抗体の存在について、供与者におけ
る危険因子を評価した。その結果、Ｂ型肝炎コア抗原
（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｃｏｒｅ ａｎｔｉｇｅ
ｎ）に対する抗体（抗ＨＢｃ）について陽性（ボジティ
ブ）な血液単位は、抗ＨＢｃのない単位よりも受容者に
おいて２から３倍も大きなＮＡＮＢＨの危険を提供する
らしいということが示された。彼らは、供与者の抗ＨＢ
ｃスクリーニングが、輪血に起因するＮＡＮＢＨのケー
スの約１／３を防ぐ可能性があり、一方、ＡＬＴスクリ
ーニングは輪血後ＮＡＮＢＨのケースの半分近くを防ぐ
可能性があると結論づけた。
【００１２】消去法によりＮＡＮＢＨの診断を確立する
こうした代理試験の利用を以ってしても、ＮＡＮＢＨＶ
キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）の正しい同定は、満足する
にはほど遠かった。第１に、代理マーカーを欠く血液を
受け、なおＮＡＮＢＨを発病した患者が、非常に多い。
第２に、高いＡＬＴレベルを持つ供与者と抗ＨＢｃを持
つ供与者の間の重なりが少ししかない。最後に、代理マ
ーカーについてポジティブな血液単位の受容者だが、Ｈ
ＣＶとしても知られるＮＡＮＢＨＶに感染しない者がい
る（１３−１５）。
【００１３】以上の理由から、ＮＡＮＢＨＶキャリアを
同定し、汚染された血液や血液製品をスクリーニングし
て除くための感度の高い特異的な手法に対する早急な需
要がある。加えて、本病気の予防および／または処置の
ための効果的なワクチンおよび／または治療薬に対する
必要性もある。
【００１４】最近、カイロン（キロン）コーポレーショ
ン（Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）の科学者グループが、
特性づけられていないＮＡＮＢＨ病原体を含む血漿か
ら、ランダムプライマーによる（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉ
ｍｅｄ）相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーを作製し
た（１６）。彼らは、ＮＡＮＢＨと診断された患者から
の血清を用いてライブラリーをスクリーニングし、ＮＡ
ＮＢＨに特異的に関連した抗原をコードするｃＤＮＡク
ローンを単離した。このクローンは、トガウイルス科
（ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）もしくはフラビウイルス科
（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）と同様の病原体のゲノム
に由来することが見出された（１６）。この新しく同定
されたＮＡＮＢＨ病原体は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）と呼ばれた。この血液媒介性ＮＡＮＢＨウイルスの
ための特異的なアッセイが、ヒトスーパーオキシドジス
ムターゼ（ｈｕｍａｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓ
ｍｕｔａｓｅ；ＳＯＤ）と３６３ＨＣＶアミノ酸との融
合ポリペプチド（ＳＯＤ／ＨＣＶＣ１００−３と命名さ
れた）に基づいて開発された（１７）。ＳＯＤ／ＨＣＶ
Ｃ−１００−３を組換え酵母のクローンから培養し、精
製し、循環しているウイルス抗体の捕獲に用いた（１
７）。このＣ型肝炎ウイルスに由来するｃＤＮＡ塩基配
列のファミリーが、次いで詳しく報告された（１８）。
【００１５】しかしながら、カイロングループにより発
表されたＨＣＶの塩基配列は、ＨＣＶゲノムの約７５％
しかカバーしておらず、非構造遺伝子しか表していな
い。
【００１６】より最近になって、マユミ（Ｍａｙｕｍ
ｉ）らは、ヒトとチンパンジーのキャリアの２つの異な
るＨＣＶ株について、ＨＣＶゲノムの５′端塩基配列を
決定した（２７）。５′端塩基配列は、少なくとも３２
４ヌクレオチドの５′非コーティング領域を含んでお
り、２つの株でよく保存されていた。非コーティング領
域に続いて、１３４８ヌクレオチドのコーティング領域
があり、それは７３１０ヌクレオチドに及ぶプロトタイ
プのＨＣＶの報告された塩基配列を超えて続いている
（１８）。
【００１７】こうした結果に基づくと（１８、２７）、
ＨＣＶは少なくとも２８８６アミノ酸残基をコードして
いる中断なしのオープンリーディングフレーム（ｕｎｉ
ｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆ
ｒａｍｅ）を所有していると考えられる。
【００１８】Ｃ型肝炎ウイルスの完全ヌクレオチド配列
を他のフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）のそれ
（２８）と比較すると、コアタンパク質（即ち、ヌクレ
オキャプシドタンパク質）とエンベロープタンパク質を
コードしている２つの構造遺伝子が、マユミのグループ
により報告された（２７）ように、５′端塩基配列の各
々上流と下流の領域に位置するＨＣＶゲノム内に含まれ
ることが仮定される。ＨＣＶゲノム全体の構造や、構造
タンパク質・非構造タンパク質にコードされる予想され
たアミノ酸配列を注意深く分析することにより、我々
は、広範囲にわたる一連の実験により、そして血清学的
確認を通して、ＨＣＶタンパク質の免疫優性領域（ｉｍ
ｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ）を同定、特
性づけした。
【００１９】ＨＣＶゲノムの予想アミノ酸配列は表６に
示されているが、（ａ）の配列はＪ−１（２７，２９）
の配列であり、（ｂ）はＪ−４（２７）の配列であり、
（ｃ）はプロトタイプＰＴ（１８）の配列である。これ
らは保存的置換、欠失、置換がどこになされうるかを示
している。
【００２０】
【００２１】
【００２２】
【００２３】タンパク質の表面上の抗原性部位、免疫原
性部位を位置づけるために合成ペプチドがますます用い
られるようになり、このアプローチは“サイトディレク
テッドセロロジー（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ−ｓｅ
ｒｏｌｏｇｙ）”と最近名付けられた。本発明者（ワン
グ；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．）とその仲間は、ＨＩＶのエン
ベロープタンパク質上の高度に抗原性のエピトープを同
定し、特徴づけるために、そしてＨＩＶ（かつてはＨＴ
ＬＶ−ＩＩＩと記述されていた）に対する抗体の検出の
ための感度、特異性の高いイムノアッセイを開発するた
めに、このアプローチをとってきた（１９−２１）。１
９８８年４月５日発行の米国特許第４，７３５，８９６
号、１９８９年１１月７日発行の米国特許第４，８７
９，２１２号も参照されたい。その内容は、参照により
本明細書中に十分にとりこまれるものとする（２２、２
３）。次いで、正確にマッピングされ、よく特徴づけら
れたＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩに関連した一連の含成ペプチド
を、感染者におけるＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ抗体の検出のた
めの合成ペプチドに基づく診断アッセイの開発に用いた
（２４、２５）。１９８９年５月２３日発行の米国特許
第４，８３３，０７１号、１９８９年１月１３日に提出
された米国特許出願番号０７／２９７，６３５、１９９
０年１月２４日に提出された米国特許出願番号０７／４
６９，２９４も参照されたい。こうしたアッセイは、優
れた感度、すばらしい特異性、そして、あるケースにお
いては、２つの密接に関係したウイルスの感染を区別す
るという無比の能力を提供し、したがってウイルスライ
セートもしくは組換えＤＮＡ由来のタンパク質のどちら
かに基づく、生物学的派生試験と関連して存在する問題
の多くを克服する。
【００２４】
【発明が解決しようとする課題】それ故、本病気サイク
ルの早期にＨＣＶ感染を同定し、モニターする検出もし
くは診断手順を開発することが本発明の目的である。
【００２５】別の目的としては、高感度で正確な試験手
順を開発することである。
【００２６】更なる目的は、体液中のＨＣＶに対する抗
体の存在を検出したり、ＮＡＮＢＨを診断するのに用い
得る試験試薬を、化学的に合成することである。
【００２７】また、別の目的は、ヒトを含む健康な哺乳
動物に導入した時、ＨＣＶに対する有効な抗体の産生を
刺激し、それにより、ＨＣＶ感染に対する保護を提供す
るワクチンを開発することである。
【００２８】更なる目的は、ＨＣＶに対するモノクロー
ナルおよびポリクローナル抗体の開発のために哺乳動物
に用いられる合成免疫原を提供することである。
【００２９】
【００３０】
【００３１】
【００３２】
【課題を解決するための手段】本発明によると、Ｃ型肝
炎ウイルス（ＨＣＶ）タンパク質の免疫優性領域を表
し、各々特異的な配列でアレンジされた一連の合成ペプ
チドが同定され、固相ペプチド合成法により作られる。
こうしたペプチドは、血清および体液中のＨＣＶに対す
る抗体の早期検出ならびに非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）
の診断のための高感度で正確な手法に有用であることが
わかっている。その高い免疫反応性より、こうしたペプ
チドはまた、Ｂａ１ｂ／Ｃマウスのような健康な哺乳動
物でのＨＣＶに対する抗体の産生を刺激するのにも、そ
して、ＨＣＶやＮＡＮＢＨＶ感染の予防のためのワクチ
ン組成物にも、有用であることが期待される。
【００３３】本発明によると、ＨＣＶに対する抗体の検
出とＮＡＮＢＨの診断に有用なペプチド組成物は、以下
の配列のペプチド、それらのアナログ、セグメント、混
合物、複合体（コンジュゲート）および重合体（ポリマ
ー）よりなる群から選択したペプチドを含む。
【００３４】
【００３５】（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ２であ
る）
【００３６】組合せの一例は次のようなものである：
【００３７】
【００３８】ここでＸは−ＯＨまたはＮＨ２である。ペ
プチドＩＩのセグメントの一例は次のようなものであ
る：
【００３９】
【００４０】ここでＸは−ＯＨまたはＮＨ２である（Ｉ
ＩＦ）。ペプチドＩＩＩのセグメントの一例は次のよう
なものである：
【００４１】
【００４２】ここでＸは−ＯＨまたはＮＨ２である（Ｉ
ＩＩＤ）。ペプチドＩＸのセグメントの一例は次のよう
なものである（ＩＸＣ）：
【００４３】
【００４４】本発明はまた、体液中のＨＣＶに対する抗
体を検出したり、ＮＡＮＢＨを診断する高感度で正確な
手法も含んでおり、それは以下の工程を特徴とする： Ａ．以下のアミノ酸配列を有するペプチド：
【００４５】
【００４６】（ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ２であ
る）それらのアナログ、セグメント、混合物、組合せ、
複合体および重合体よりなる群から選択したペプチドを
含むペプチド組成物の調製；そして Ｂ．イムノアッセイ手順に抗原として該ペプチド組成物
を有効量用いる。
【００４７】さらに、本発明によると、ペプチドをそれ
自体で、あるいは、ホモもしくはヘテロ官能性多価架橋
結合試薬の利用により、タンパク質に、またはホモもし
くはヘテロダイマーやより高度なオリゴマーの重合体担
体にカップリングさせて、あるいは、直接合成して、枝
分かれした多価のリジン樹脂との複合体として、ヒトを
含めた健康な哺乳動物でのＨＣＶに対する抗体の産生を
引きおこすのに用いることもできる。
【００４８】手法は、個々のペプチド、そのアナログも
しくはセグメントまたはそれらの混合物もしくは組合
せ、または重合体形態の各々を含むペプチド組成物を有
効量だけ、健康な哺乳動物の体内に、腹腔内もしくは皮
下注射により導入することを含んでいる。
【００４９】本発明のペプチドをキーとなる免疫原とし
て含むワクチンもまた調製され得る。そのようなワクチ
ン組成物は、ＨＣＶ感染またはＮＡＮＢＨを予防するの
に有用である可能性が期待される。
【００５０】本発明にしたがって、３つのペプチドとそ
のセグメントが、体液中のＨＣＶに対する抗体の検出
と、ＮＡＮＢＨの診断と、ＨＣＶに対する抗体の産生を
刺激することによる健康な哺乳動物の予防接種のため
に、化学的に合成される。こうしたペプチドは以下のよ
うな配列で、並んでいる：
【００５１】
【００５２】ここでＸは−ＯＨまたは−ＮＨ２である。
【００５３】こうしたペプチドは、組合せやセグメン
ト、即ち、末端のアミノ酸にさらにアミノ酸をもつこと
により、またはいずれかの末端よりアミノ酸を除くこと
により、より長いもしくはより短いペプチド鎖を含んで
いてもよい。
【００５４】こうしたペプチドは、異なるＨＣＶ単離体
間での株ごとの多様性に対処するためのアナログを含ん
でいてもよい。ＨＣＶは頻繁な突然変異を有すことが示
されている。それ故、Ｊ−１やＪ−４（参考文献＃２７
参照）のような変異株が存在することが予想される。保
存性置換の調整と、非保存性置換が関わっている変化か
らの選択を、規定の配列中に作ってもよい。ＨＣＶに対
する抗体により認識可能なペプチドの免疫反応性が保存
されている限り、合成ペプチドのアナログは、上記配列
の列挙されたアミノ酸の置換、挿入および／または欠失
を含んでいてもよいことが予想される。
【００５５】こうしたペプチドは、また複合体を含んで
いてもよい。即ち、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やヒ
ト血清アルブミン（ＨＳＡ）のような担体タンパク質に
カップリングされていてもよい。さらに、これらのペプ
チドは重合体を含んでいてもよい。即ち、枝分かれした
オクタマー状リジン樹脂のような重合性樹脂上で合成さ
れてもよい。
【００５６】体液中のＨＣＶに対する抗体の検出やＮＡ
ＮＢＨの診断のための試験試薬として有用なポリペプチ
ドのアミノ酸配列は、ＨＣＶタンパク質のアミノ酸配列
の部分的なセグメントに対応するように選択される。例
えば、ＨＣＶ Ｃ−１００と呼ばれる非構造タンパク
質、そしてコア（ヌクレオキャプシド）タンパク質のよ
うな構造タンパク質（２７）がある。
【００５７】エピトープ分析のためのＨＣＶタンパク質
の領域の選択において、完全なＨＣＶ Ｃ−１００タン
パク質および仮定コアタンパク質をカバーするアミノ酸
配列をもつ、４０ｍｅｒの大きさのペプチドを合成し
た。これらを、ＨＣＶ感染についてポジティブと診断さ
れた患者からの血清との免疫反応性について試験した。
ＨＣＶ Ｃ−１００タンパク質領域からの、Ｉ、ＩＩ、
ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩと名付けられた６つのオーバー
ラップするペプチドと、仮定コアタンパク質の領域から
の、ＶＩＩＩ、ＩＸと名付けられた２つの隣接したペプ
チドが、ポジティブなＨＣＶ血清との特異的免疫反応性
を有すると同定された。別のペプチドＶＩＩとその断片
は、この免疫優性領域のＣ端側にあり、それらも、ＨＣ
Ｖポジティブな血清の副集団との中程度の免疫反応性を
有すことが見出された。実施例１２を参照されたい。ペ
プチドＩＩＨは、Ｎ端に５つの付加的なアミノ酸をもつ
ペプチドＩＩの別のアナログであるが、高い免疫原性が
あることがわかっており、（上昇したＡＬＴレベルをも
つ）ＮＡＮＢＨＶ感染の急性段階にある患者からの血清
中の抗体により認識可能な付加的なエピトープを含んで
いる。そのペプチドのアミノ酸配列は以下に記す通りで
ある：
【００５８】
【００５９】６ペプチドＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、
ＶＩは、９０アミノ酸の領域：
【００６０】
【００６１】にわたり、そして、ポジティブコントロー
ル（陽性対照）血清との特異的な免疫反応性を有すこと
が見出された。表１は、ＨＣＶタンパク質のこの免疫優
性領域のアミノ酸配列を示しており、ＩからＶＩと名付
けられた６つの化学的に合成されたペプチドとそのセグ
メント（ＡからＨ）のアミノ酸配列を表している。
【００６２】別の２つのペプチド（ＶＩＩＩとＩＸ）
は、仮定ＨＣＶコアタンパク質の５′端の内側にある１
１９アミノ酸の領域：
【００６３】
【００６４】にわたり、よく特徴づけられたＨＣＶ抗体
ポジティブ血清の代表的なパネルとの特異的な免疫反応
性を有することが見出された。
【００６５】表７は、仮定ＨＣＶコアタンパク質のこの
免疫優性領域のアミノ酸配列を示しており、化学的に合
成された１０種のペプチドのアミノ酸配列を表してい
る。それらはペプチドＶＩＩＩとＩＸと名付けられ、そ
のセグメント（ＡからＤ）をもつ。こうしたペプチドの
各々を、１０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
５）中、５μｇ／ｍｌで、ポリスチレンマイクロウェル
プレート上にコートし、以下に記載する３工程の４５分
の酵素イムノアッセイ手順で、各々特定の臨床的集団の
代表として選択されたＨＣＶ抗体ポジティブ血清のパネ
ルを用いて、種々の血清希釈で試験した。
【００６６】
【００６７】
【００６８】全てのポジティブな血清のＥＩＡ吸光度全
体に基づく計算から、各々の合成ＨＣＶペプチドに関す
る％相対免疫反応性として表される一連の免疫反応性指
標を得た。ＩＩＦ、ＩＩＨ、ＩＩＩＤと名付けられた４
０マー、４７マー、３０マーのサイズをもち、以下のア
ミノ酸配列を各々もつ３つのペプチド：
【００６９】
【００７０】は、血清パネルと最も高い免疫反応性を有
すことが見出された。この広範囲にわたるエピトープマ
ッピング研究の結果として表１と７にリストされた４０
のＨＣＶペプチドの各々に関する相対免疫反応性（％）
は、ＨＣＶペプチドの抗原性の配置（コンフィギュレー
ション）に必要であるか、または関連していて、各々が
規定された配列にある、（下線のひかれた）いくつかの
アミノ酸残基クラスターの描写の基礎を提供する。６１
マーと５６マーのサイズのＶＩＩＩＥとＩＸＤと名付け
られた２つのペプチドは、各々、ＨＣＶ構造性コアタン
パク質領域内に位置し、以下のアミノ酸配列をもつ：
【００７１】
【００７２】ペプチドＸＩＩＩＥとＩＸＤはまた、この
領域で最も高い反応性を有していることも見出された。
【００７３】化学的に合成されたペプチドに基づくＨＣ
Ｖに対する抗体のアッセイは、生物学的材料に基づいた
免疫吸着剤を利用したアッセイに比べていくつかの利点
を示す。ペプチドは、自動化された固相法によりグラム
スケールの量でたやすく合成されうるので、一貫した収
率で質の高い再現性のある抗原を提供できる。生物学的
システムからの他の抗原の存在はそうした再現性を妨げ
る。さらに重要なことに、感染していない個人に見られ
る非特異的反応性は、アッセイに用いる調製物の不均一
性によるようである。このことは、生物学的材料に基づ
いた免疫吸着剤を用いたアッセイに特にあてはまる。こ
うしたプロセスの中では、ホストの抗原が、目的のウイ
ルスタンパク質と一緒に精製されることがしばしばあ
る。こうした夾雑する抗原に対する抗体は、正常な個人
にしばしば見られ、それ故ファルス（偽）ポジティブな
（偽陽性）結果をもたらしてしまう。
【００７４】本発明のアッセイは、別のアッセイ系で出
会うような偽ポジティブ反応を明らかに最小にするし、
同時に実質的に増加したシグナル／ノイズ比により真に
ポジティブな血清に対する高い感度を示す。この増加し
たシグナル／ノイズ（Ｓ／Ｃ）比は、多分、免疫吸着剤
の純度の結果生じるものであろう。本発明のアッセイは
また、ＨＣＶキャリアーの平均Ｓ／Ｃ比が、非感染者の
その平均Ｓ／Ｃ比の約８０〜２００倍ということから、
高度に特異的である。代表例としては図３−１、３−２
を参照されたい。
【００７５】ＨＣＶに対する抗体の検出のための固相免
疫吸着剤として有用なペプチドは、側鎖を保護されたｔ
−Ｂｏｃアミノ酸を用いた固相ペプチド合成法である
“古典的な”メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）
法により、以下のアミノ酸配列に相当するように合成さ
れる：
【００７６】
【００７７】（ここでＸは−ＮＨ２である）。
【００７８】こうしたペプチドの他のアナログ、セグメ
ント、組合せは、目的のｔ−Ｂｏｃアミノ酸を加えた
り、減じたり、置換したり、削ったりしてアミノ酸配列
を変えることにより調製してもよい。
【００７９】樹脂上の目的のブロックされたペプチドの
組み立ての完成に次いで、ペプチド樹脂を無水フッ化水
素酸で処理して、樹脂からペプチドを切り離す。ベンジ
ル由来のブロッキング基により合成中にはブロックされ
ているアミノ酸の官能基も、同時にペプチドから切り離
される。遊離ペプチドを、それから高速液体クロマトグ
ラフィ（ＨＰＬＣ）により分析、精製し、アミノ酸分析
により生化学的に特徴づける。
【００８０】約５０アミノ酸より多い、より長いペプチ
ドも、よく知られた組換え手法を便利に用いて調製し得
る。ペプチドの各アミノ酸について知られている核酸コ
ドンを利用し、そうしたペプチドをコードする合成遺伝
子を構築してもよい。合成遺伝子を、知られている技法
によりべクター構築物に挿入し、クローニングし、大腸
菌か酵母といったホスト（宿主）細胞にトランスフェク
トしてもよい。分泌されたポリペプチドを、次いで既知
の手順にしたがって加工し、精製してもよい。上述の手
順にしたがって合成されたペプチドは、ＨＣＶに対する
抗体に対して高度に反応性であり、ＨＣＶに対する抗体
の検出のための高感度で特異的な免疫吸着剤として用い
ることができる。
【００８１】図１−１、１−２、１−３、１−４そして
図１１−１と１１−２は、構造性、非構造性両方のＨＣ
Ｖタンパク質の免疫優性領域のアミノ酸配列を示してお
り、非構造タンパク質のＨＣＶ Ｃ−１００領域のケー
スにおいては、ペプチドに基づくＥＩＡ手順によりＡ４
９２ｎｍとして測定した、４つの代表的なＨＣＶ抗体 −−中程度に、−−−強く）寄与している下線の引かれ
たアミノ酸残基を正確に描いている。
【００８２】各ペプチドの免疫反応性を測定するのに用
いた、ペプチドに基づくＥＩＡ手順は、以下のとおりで
ある。各ペプチドを、重炭酸ナトリウム緩衝液（１０ｍ
Ｍ）、ｐＨ９．５中に５μｇ／ｍｌで、ウェル当り１０
０μｌ、ポリスチレンマイクロウェルプレート上にコー
トし、マイクロウェルプレートを３７℃で約１時間保温
し、洗って乾かした。テスト血清試料を、正常ヤギ血
清、ゼラチン、ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳで希釈し
た。テスト血清試料溶液２００μｌを各ウェルに加え、
３７℃で１５分間反応させた。ウェルを洗い、酵素ラベ
ルした抗体を、ＨＣＶ抗体−ペプチド複合体に結合させ
るために用いて、プレートをさらに１５分間保温した。
オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）のような発色剤
を、それから加えた。１５分後、１．０Ｍ Ｈ２ＳＯ４
を５０μｌ加えて、反応を止めて、反応混合液の吸光度
を、４９２ｎｍにてＥＬＩＳＡリーダーで読んだ。
【００８３】図１−１に示すように、血清試料１は、ペ
プチドＩＡとＩＢとはほとんど反応していない。しかし
ながら、ペプチドＩＣとの反応性は有意に増加してお
り、次いでペプチドＩＤとは最小限の増加が見られ、ペ
プチドＩＥとＩＦでは付加的な増加が見られる。このこ
とは、ＨＣＶペプチドＩのシリーズにおいては、アミノ
酸残基の２つのクラスター、即ちＬｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（ＬＡＥＱＦ）とＨｉｓ−Ｌｅｕ−
Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ（ＨＬＰＹＩ）が、ＨＣＶペプ
チドＩの抗原決定基に寄与していることを示している。
同様に、残基のクラスター、即ち、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃ
ｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙ
ｒ−Ｉｌｅ（ＥＥＣＳＱＨＬＰＹＩ）が、ＨＣＶペプチ
ドＩＩのシリーズの免疫反応性に寄与していて；別の残
基クラスター、即ち、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｒｇ
（ＳＧＫＰＡＩＩＰＤＲ）が、ＨＣＶペプチドＩＩＩの
シリーズの免疫反応性に寄与していて；２つの残基クラ
スター、即ち、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈ
ｒ（ＧＬＬＱＴ）とＧｌｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−
Ｐｒｏ（ＥＶＩＡＰ）が、ＨＣＶペプチドＩＶとＶのシ
リーズの免疫反応性に寄与している。図１−１の下に示
されているように、ＨＣＶタンパク質のこの免疫優性領
域内の不連続なエピトープを表している、合計６つの間
のあいたアミノ酸残基クラスターは、血清試料１との特
異的ＨＣＶ免疫反応性に寄与していると同定されてい
る。
【００８４】図１−２は、ＨＣＶペプチドＩ、ＩＩ、Ｉ
ＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩのシリーズの計３１のオーバーラ
ップしているペプチドについて試験した時の、血清試料
２の免疫反応性プロフィールを表している。血清試料１
と２とで、免疫反応性プロフィールについて明らかな違
いがある。Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
（ＳＧＫＰＡ）とＩｌｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ（ＩＩＰＤＲＥＶ）の残基により
示される免疫優性エピトープは、その領域のＮ端側に位
置している。
【００８５】図１−３は、同じ３１のＨＣＶペプチドパ
ネルについて試験した時の、血清３の免疫反応性プロフ
ィールを表している。この広範囲にわたるエピトープマ
ッピング分析を通して、血清試料３は血清試料２と同様
の免疫反応性プロフィールを有していることが見出され
た。
【００８６】図１−４は血清試料４の免疫反応性プロフ
ィールを表しているが、これは試料２と３のプロフィー
ルとは有意に異なり、一方、試料１のそれとはいくらか
の類似性を保っている。
【００８７】まとめると、表１に表されているように合
計９０アミノ酸残基に及ぶＨＣＶ非構造タンパク質の免
疫優性領域と、表７に表されているように合計１１９ア
ミノ酸残基に及ぶＨＣＶ構造コアタンパク質の免疫優性
領域とをカバーする、一連の３１のオーバラップしてい
るペプチドについて行ったエピトープマッピング分析
は、異なるＨＣＶ抗体ポジティブ試料とこうしたＨＣＶ
ペプチドとの様々な度合いの免疫反応性を明らかにして
いる。こうした３１のＨＣＶペプチドの各々に関して、
８つのＨＣＶポジティブ血清を用いて得られたＥＩＡ吸
光度読みとり全体に基づいて（表２）、相対免疫反応性
（％）示標を、各ペプチドについて確立し、いくつかの
アミノ酸残基クラスターを、ＨＣＶ免疫反応性への寄与
が強いもの（例えばＩｌｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−
Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＡｒｇとＧ
１ｕ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ）；中程度のも
の（例えばＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ，
Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐ
ｈｅ，Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ，そして
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｎ）；弱いもの（例えばＬｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ）として同定した。
【００８８】同様に、ペプチドＶＩＩＩとＩＸとそのア
ナログーセグメントの相対免疫反応性が、表７に記して
ある。
【００８９】
【００９０】上述したエピトープマッピング研究に基づ
き、ペプチドＩＩＧのみ、２つのペプチドＩＩＦとＩＩ
ＩＤの混合物、ＩＩＦ、ＩＩＩＤ、Ｖの混合物、もしく
はＩＩＨとＶの混合物を固相抗原として用いて、４つの
代表的なＥＩＡを形づくった。
【００９１】図２−１と２−２は、カットオフに対する
シグナルの比による、ペプチドＩＩＧを５μｇ／ｍｌの
コーティンク濃度で用いた、ペプチドに基づくＨＣＶ−
ＥＩＡと、組換え体ＳＯＤ／ＨＣＶ Ｃ−１００−３タ
ンパク質に基づくＨＣＶ−ＥＩＡとの比較を表してい
る。図２−１では、様々に血清希釈したよく特徴づけら
れたＨＣＶ抗体ポジティブコントロールを試料として用
いた。図２−２では、血清変換から抗ＨＣＶ反応性まで
の期間に及ぶ単一個人の連続採血に由来する血清標本の
パネルを用いた。同様の希釈力価と、血清変換の日付を
同定する等しい能力という、各アッセイの感度を示す２
つのパラメーターが、本発明による合成ペプチドに基づ
くＥＩＡとｒＤＮＡ ＨＣＶ Ｃ−１００に基づくＥＩ
Ａとで得られるが、その際、本発明によるペプチドに基
づくアッセイは感度がより高く、ポジティブ標本に、よ
り高いシグナル／カットオフ比を与える。
【００９２】 第１〜３欄＝オルトＨＣＶ結果（Ｓ／Ｃによる）。 第５欄＝ＡＬＴ値はＩＵ／Ｌとしてカットオフを越える
値である。 第６欄＝アボット（Ａｂｂｏｔｔ’ｓ）抗−ＨＢｃの結
果（Ｓ／Ｃによる）。ここで、１．００以下の結果は、
この検定の競合結合原理により陽性である。
【００９３】図３−１と３−２は、ペプチドＩＩＧを５
μｇ／ｍｌのコーティング濃度で用いて、商業的供給源
からの２６４の正常血清と２６４の正常血漿について得
た、合成ペプチドに基づくＨＣＶ−ＥＩＡシグナル／カ
ットオフ比の頻度分布を表している。血清標本のネガテ
ィブなもの（ｎ＝２５０）とスクリーニングで選ばれた
ポジティブなもの（ｎ＝１４）についての平均Ｓ／Ｃ比
は、各々０．０３４と７．２０２であり、ネガティブ
（ｎ＝２５５）とポジティブ（ｎ＝９）な正常血漿標本
についての平均比は、各々０．０８４と７．０８９であ
る。スクリーニングで選ばれたポジティブなものと、全
てのネガティブなものとの鋭い対照性は、本発明のペプ
チドに基づくＨＣＶ−ＥＩＡを用いて得られる。
【００９４】ＨＣＶに対する抗体との免疫反応性におけ
る本発明によるペプチド組成物の高度な感度、特異性に
基づいて、本発明によるペプチド組成物は、ＮＡＮＢＨ
を予防するワクチンとしても、そしてヒトを含む哺乳動
物でのＨＣＶに対するモノクローナルおよびポリクロー
ナル両方の抗体の開発のための免疫原としても、有用で
あり得ると思われる。タンパク質にカップリングさせた
り、重合性担体樹脂（例：オクタマーの分枝状リジン樹
脂）上に合成したり、あるいはシステイン酸化によるジ
スルフィド架橋結合またはホモもしくはヘテロ官能性多
価架橋結合試薬を用いることにより、ホモもしくはヘテ
ロダイマーあるいはより大きいオリゴマーに重合させる
と、こうしたペプチド組成物は、正常な個体に導入し
て、健康な哺乳動物内でのＨＣＶに対する抗体の産生を
刺激することができる。
【００９５】本発明によるペプチドの利用の利点は多
い。
【００９６】本発明によるペプチド組成物は、ウイルス
から生物学的に誘導するわけではないので、予防接種を
受けようとする正常な個体を本病気にさらすことの危険
性もない。
【００９７】ペプチドは化学的に容易に合成されうる。
このことは、試験試薬やワクチンの作製過程の間、どん
な時でもＨＣＶの関与がないことを意味する。本発明の
過程により最小限にされ得る別の問題は、ＨＣＶ融合タ
ンパク質と一緒に精製されるホスト細胞からの抗原性物
質の存在によって起こる偽ポジティブ結果である。正常
な個人の中には、ホスト細胞からの抗原性物質と交差反
応する、大腸菌や酵母のタンパク質に対する抗体を持っ
ている者もいる。こうした正常な個人からの血清は、イ
ムノアッセイにてポジティブな応答を示し得る。
【００９８】さらに、適当なアミノ酸修飾や置換を用い
ると、規定されたアミノ酸配列に基づく様々なペプチド
アナログを、より低いバックグラウンドリーディングを
生じる特性や、ＨＣＶ抗体のスクリーニングアッセイに
有用な、固相へのよりよい結合能力を持つよう、合成し
うることが期待される。
【００９９】さらに、本発明のペプチド組成物は、合成
により調製されるので、性質をコントロールすることが
でき、その結果、試験結果の再現性を保証できる。ま
た、各試験手順は、非常に少量のペプチドしか必要とし
ない上、ペプチド調製費が比較的低いので、ＨＣＶに対
する抗体のために体液をスクリーニングしたり、ＮＡＮ
ＢＨ感染を診断したり、ワクチンを調製したりするのに
かかる費用は比較的低い。
【０１００】本発明にしたがって調製されたペプチド
は、それを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、
酵素イムノドットアッセイ、凝集ベースアッセイ、また
は他のよく知られたイムノアッセイ法での試験試薬とし
て用いることにより、ＨＣＶ感染の検出や、ＮＡＮＢＨ
の診断に利用することができる。好ましい手法はＥＬＩ
ＳＡである。ＥＬＩＳＡ技法は実施例１、２、８〜１
０、１２と１４〜１８に、凝集ベースアッセイは実施例
３、４に例示してある。実施例は、本発明の説明に用い
ているのであって本発明の範囲を制限するために用いて
いるのではない。
【０１０１】以下の方法では、プレートまたはビーズへ
のペプチドの結合がより容易になるようにするため、
０．２５重量％のグルタルアルデヒドをコーティング緩
衝液に添加してもよいことに注意するべきである。さら
に、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ
Ｏ）結合マウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体、また
は他の動物種由来のＨＲＰＯ結合２次抗体を、ＨＲＰＯ
結合ヤギ抗ヒトＩｇＧの代わりに２次抗体トレーサーと
して用いることも可能である。
【０１０２】本方法で用いられるゼラチンとしては、ウ
シ皮膚ゼラチン、ブタ皮膚ゼラチン、魚ゼラチン、ある
いはその他の既知の入手可能なゼラチンタンパク質を用
いることができ、またはアルブミンタンパク質を代わり
に使用することもできる。
【０１０３】
【実施例】実施例１ 酵素結合免疫吸着アッセイによ
る、ＨＣＶタンパク質Ｃ−１００の免 疫優性領域を包含
する合成ペプチドの相対免疫活性（％）の測定 １０ｍＭ ＮａＨＣＯ３バッファー、ｐＨ９．５中の、
上述のように調製したＩＡからＩＦ、ＩＩＡからＩＩ
Ｈ、ＩＩＩＡからＩＩＩＦ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＡからＶＩ
Ｅ（表１参照）の３１ペプチドの各々の５μｇ／ｍｌ溶
液１００μｌで、ウェルまたは９６ウェルプレートを４
℃で一晩（または３７℃で１時間）コーティングした。
ペプチドでコーティングしたウェルを、次に、３重量％
ゼラチンを含むＰＢＳ溶液２５０μｌを入れて３７℃で
１時間インキュベートして非特異的タンパク質結合部位
をブロックし、続いて、０．０５体積％ＴＷＥＥＮ２０
を含むＰＢＳで３回洗浄し、乾燥させた。試料を、２０
体積％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチン、０．０５体積
％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳで体積比１：２０に希釈
した。希釈した試料２００μｌを各ウェルに加え、３７
℃で１５分反応させた。
【０１０４】次に、結合していない抗体を除くために、
ウェルを０．０５体積％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳ溶
液で６回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを二次抗体トレーサーとして用
いて、陽性のウェルで形成されたＨＣＶ抗体−ペプチド
抗原複合体と結合させた。１体積％正常ヤギ血清、０．
０５体積％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳ溶液中１：１，
８００希釈のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ１
００μｌを各ウェルに加え、３７℃でさらに１５分間イ
ンキュベートした。
【０１０５】結合していない抗体を除くために、ウェル
を０．０５体積％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳ溶液で６
回洗浄し、クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０中、
０．０４重量％オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）お
よび０．１２体積％過酸化水素を含む基質混合液１００
μｌと反応させた。
【０１０６】この基質混合液を、有色産物を形成させる
ことによってペルオキシダーゼ標識を検出するために使
用した。反応は１００μｌの１．０Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加
えることにより停止し、ＥＬＩＳＡリーダーで４９２ｎ
ｍにおける吸光度（すなわちＡ４９２）を測定した。ア
ッセイは、８種の代表的なＨＣＶ抗体陽性血清群（パネ
ル）を用いて、１つの試料希釈（１：２０）につき１ウ
ェルずつを、２ウェルずつの試料希釈ブランク、非反応
性コントロール（対照）、弱反応性コントロールおよび
強反応性コントロール（ＮＲＣ、ＷＲＣ、ＳＲＣ）とと
もに行った。
【０１０７】本研究から得られた結果を表２に示す。４
９２ｎｍにおけるＥＩＡ吸光度の読み（ｙ座標）および
対応するＨＣＶペプチドの各々のアミノ酸配列（ｘ座
標）にしたがって、代表的な免疫反応性プロフィール
を、第１−１図から第１−４図に示されている８種の血
清のうち４種に関してプロットしている。３１ペプチド
の各々の相対的免疫反応性指数（％）は、４９２ｎｍに
おける８種の血清の総吸光度に基づいた参考値としてペ
プチドＩＩＩＤを用いて算出されている（表１および表
２）。第１図は、表１および表２に示されたデータによ
る免疫優性領域のアミノ酸
【０１０８】要約すると、表１に示したようなＨＣＶの
免疫優性領域をカバーし、全９０アミノ酸残基にわたる
一連の重なり合った３１ペプチドを用いて行ったエピト
ープマッピング分析により、異なるＨＣＶ抗体陽性試料
およびこれらのＨＣＶペプチド間の免疫反応性の多様な
程度が明らかになる。本研究に基づいて、幾つかの不連
続なエピトープが、この免疫優性領域に位置付けられ
る。従来の常識からの推測に反して、ＨＣＶ抗体に対す
るこれらの抗原決定基を最もよく表出させるためには、
長めの、望ましくは２０残基を超える合成アミノ酸鎖を
持つことが好ましいことが見出される。
【０１０９】上述のエピトープマッピング解析に基づい
て、ペプチドＩＩＧのみ、またはペプチドＩＩＦとＩＩ
Ｄの混合物、またはペプチドＩＩＦ、ＩＩＩＤ、Ｖの混
合物、またはＩＩＨとＶの混合物を固相抗原として用い
た４つの代表的ＥＩＡを、以下の実施例２、８、９、１
０および１２で述べられるような効率研究のために設計
した。
【０１１０】実施例２ 酵素結合免疫吸着アッセイに
よるＨＣＶに対する抗体の検出 １００μｌの１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．
５中、コーティング濃度０．５μｇ／ウェルのペプチド
ＩＩＧのみ（ＩＩＧ ＥＩＡ）、または重量比がＩＩ
Ｆ：ＩＩＩＤ＝１：１のＩＩＦとＩＩＩＤの２種のペプ
チドの混合物（ＩＩＦ／ＩＩＩＤ ＥＩＡ）、１μｇ／
ウェルで、９６ウェルプレートのウェルを４℃で一晩
（または３７℃で１時間）コーティングした。ペプチド
でコートしたウェルを、次に、２５０μｌの３重量％ゼ
ラチンを含むＰＢＳ溶液を用いて３７℃で１時間インキ
ュベートして非特異的タンパク質結合部位をブロック
し、０．０５体積％のＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳでさ
らに３回洗浄して乾燥させた。
【０１１１】試料は、２０体積％正常ヤギ血清、１重量
％ゼラチン、０．０５体積％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢ
Ｓで、各々体積比１：２０に希釈した。２００μｌの希
釈した試料を各ウェルに添加し、３７℃で１５分間反応
させた。
【０１１２】次に、結合していない抗体を除くために、
０．０５体積％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳでウェルを
６回洗浄した。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ
結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを二次抗体トレーサーとして用い
て、陽性ウェルで形成されたＨＣＶ抗体−ペプチド抗原
複合体と結合させた。１体積％正常ヤギ血清、０．０５
体積％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳで１：１，８００に
希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ１００
μｌを各ウェルに加え、３７℃でさらに１５分間インキ
ュベートした。
【０１１３】結合していない抗体を除くためにウェルを
０．０５体積％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳで６回洗浄
し、クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０中に０．０
４重量％オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）および
０．１２体積％過酸化水素を含む基質混合液１００μｌ
と反応させた。この基質混合液は、有色産物を形成させ
ることによりペルオキシダーゼ標識を検出するために用
いた。反応は１００μｌの１．０Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加え
ることにより停止し、ＥＬＩＳＡリーダーで４９２ｎｍ
の吸光度（すなわちＡ４９２）を測定した。アッセイは
全ての試験試料について一つの試料希釈（１：２０）で
１回行った。各プレートは、全て２ウェルずつの試料希
釈液ブランク、陰性、弱ＨＣＶ反応性および強ＨＣＶ反
応性コントロールを含む８個のコントロールのパネルと
共に、実施した。強反応性コントロールはＨＣＶ陽性血
清を試料希釈緩衝液で１：３００に希釈することによっ
て調製し、これは本標準的４５分アッセイ法を行った場
合４９２ｎｍで約１．５の吸光度を示した。カットオフ
値は以下の公式に基づいて算出した：カットオフ値＝
（０．１×ＳＲＣ）＋ＮＲＣ元の吸光度（シグナルと呼
ぶ）と、カットオフに対するシグナルの比の双方を、す
べての解析した試料について記録した。
【０１１４】以下の試料群を、本発明にしたがってＨＣ
Ｖペプチドに基づいたＥＩＡで、５μｇ／ｍｌのペプチ
ドＩＩＧ、または５μｇ／ｍｌ ＩＩＦと５μｇ／ｍｌ
ＩＩＩＤを含む混合液でコートしたプレートを用いて
解析した： （ａ） 血清希釈物に基づいた、よく解析されたＨＣＶ
抗体陽性コントロール； （ＩＩＧおよびＩＩＦ／ＩＩＩＤの双方のＥＩＡで） （ｂ） 抗ＨＣＶ反応性への血清変換期にわたる、一個
体の連続的な採血に由来する血清試料パネル；（ＩＩＧ
およびＩＩＦ／ＩＩＩＤプレートの双方で） （ｃ） 市販の２６４正常血清および２６４正常血漿試
料；（ＩＩＧプレートのみ） （ｄ） ＨＢｓＡｇに対して陽性の個体（ｎ＝３０）；
（ＩＩＧとＩＩＦ／ＩＩＩＤの双方のプレートで） （ｅ） ＨＢｃタンパク質に対する抗体について陽性の
個体（ｎ＝３９）；（ＩＩＧとＩＩＦ／ＩＩＩＤの双方
のプレートで） （ｆ） アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）
酵素活性が上昇している（＞１００Ｉ．Ｕ．／Ｌ）個
体、（ｎ＝１７４）；（ＩＩＧとＩＩＦ／ＩＩＩＤの双
方のプレートで） （ｇ） レトロウイルスＨＩＶ−１（ｎ＝１００）、Ｈ
ＩＶ−２（ｎ＝１０）、ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ（ｎ＝１
４）に対する抗体について陽性の個体；すべて兆候なし
（全ｎ＝１２４）；（ＩＩＧとＩＩＦ／ＩＩＩＤの双方
のプレートで） （ｈ） ＡＩＤＳ、ＡＲＣ（ｎ＝２００）またはＡＴＬ
（ｎ＝１７０）疾患の個体（全ｎ＝７０）；（ＩＩＧと
ＩＩＦ／ＩＩＩＤの双方のプレートで） （ｉ） 自已免疫疾患の個体（ｎ＝２０）（ＩＩＧプレ
ートのみ） （ｊ） ランダムな供与者由来の、組換えＳＯＤ／ＨＣ
Ｖ Ｃ−１００−３ ＨＣＶ−ＥＩＡに反復的に反応性
の試料（ｎ：２３）（ＩＩＧとＩＩＦ／ＩＩＩＤの双方
のプレートで）。
【０１１５】グループ（ａ）および（ｂ）から得られた
結果はそれぞれ第２−１図および第２−２図に（ＩＩＧ
プレートから得られたデータのみ）、グループ（ｃ）か
ら得られた結果は第３−１図および第３−２図に、グル
ープ（ｄ）から（ｉ）で得られた結果は第４図に、グル
ープ（ｊ）由来のものは表３に、および第５図および第
６図に示す。
【０１１６】まとめると、第２−１図および第２−２図
に示されるように、ペプチドＩＩＧを用いる本発明のペ
プチドに基づいたＨＣＶ−ＥＩＡと、カイロン／オルト
（Ｃｈｉｒｏｎ／Ｏｒｔｈｏ）によって製造された組換
えＳＯＤ／ＨＣＶ Ｃ−１００−３タンパク質に基づい
たＨＣＶ−ＥＩＡとの間の、シグナル／カットオフ比に
よる比較を行った。各アッセイの感度の指標である２つ
のパラメーター、すなわち同様の希釈力価と血清変換の
日付を同定する同等の能力が、双方のアッセイに関して
得られる。しかしながら、本発明によるアッセイはより
感度が高く、陽性試料により高いシグナル／カットオフ
比を与える。
【０１１７】第３−１図および第３−２図に示すよう
に、コーティング濃度５μｇ／ｍｌでペプチドＩＩＧを
用いて、市販の２６４正常血清と２６４正常血漿試料で
得られたカットオフに対するＨＣＶ−ＥＩＡシグナルの
比の頻度分布から、それぞれ５．３％と３．４％の反応
性率が再現的に示された。これらの比率は、ｒＤＮＡＨ
ＣＶ Ｃ−１００に基づくＥＩＡキット（カイロン／オ
ルト）を用いた臨床試験で報告されているもの（通常
０．５〜１．０％）と比較して、相対的に高いものであ
る。しかしながら、本発明のアッセイでは、陰性（ｎ＝
２５０）と、スクリーニングにより陽性だと見出された
（ｎ＝１４）血清試料の平均Ｓ／Ｃ比は、それぞれ０．
０３４と７．２０２であり、陰性（ｎ＝２５５）と陽性
（ｎ＝９）の正常血漿試料に関しては、平均比はそれぞ
れ０．０８４と７．０８９である。陽性と判断されたも
のとすべての陰性のものとの間のこのような鋭い対比
は、おそらく、高い偽陽性の比率の可能性を防止するも
のである。これらの正常試料は商業的に血漿センターか
ら入手したものであり、ここでは支払いを受ける供与者
は、通常、厳密に監視されている血液銀行よりも、ウイ
ルスマーカーの検出率が高い集団を表し、より高い再現
性のある反応率も納得できるものである。以前の臨床研
究から、輸血を受けた患者の７から１０％はＮＡＮＢＨ
を発病し、これらの輪血後肝炎の症例の９０％はＮＡＮ
ＢＨＶによるものであることが示唆された（５）。これ
らの報告も、高い反応性が真の陽性の結果を表すとい
う、ここで得られたデータの解釈を支持するものであ
る。
【０１１８】ペプチドＩＩＧでコートされた代表的なプ
レートを用いて、すでに（ｄ）から（ｉ）の６個のグル
ープに分類されている、全部で６７７のよく解析された
臨床試料のスクリーニングから得られた結果を、第４図
のヒストグラム上にプロットした。
【０１１９】５０人のＨＢｓＡｇキャリアのうち１５人
（すなわち３０％）、３９人のＨＢｃ抗体陽性個体のう
ち３人（すなわち８％）、１７４人のＡＬＴ酵素活性が
上昇している個体のうち４３人（すなわち２４．７
％）、１２４人のレトロウイルス抗体を持つ兆候のない
個体のうち８人（６．５％）、２７０人のレトロウイル
ス関連疾患個体のうち６人（すなわち２．２％）、およ
び２０人の自己免疫疾患個体のうち０人（すなわち０
％）が、ペプチドＩＩＧを用いた本発明のペプチドＨＣ
Ｖ ＥＩＡで再現性よく反応することが見出された。す
べての陽性試料は、ペプチドＩＩＦ／ＩＩＩＤ ＨＣＶ
ＥＩＡで試験した場合にも陽性を示したが、より高いＳ
／Ｃ比であった。
【０１２０】異常な肝臓機能をもつ個体（２４．７％）
またはすでにＢ型肝炎に感染したもの（３０％および８
％）については、他の感染または疾患の個体（例えば
６．５％、２．２％、および０％）と比較すると、はる
かに高い陽性比率が見い出された。
【０１２１】注：ＨＢｓＡｇキャリアからの血清は、ア
メリカ赤十字感染疾患研究所から供与された；ＨＢｃ抗
体陽性供与者からの血清は、ボストン・バイオメディカ
社から入手した；ＡＬＴレベルが上昇した患者（＞１０
０Ｉ．Ｕ．／Ｌ）の血清はボストン・バイオメディカ社
とＮＡＢＩラボラトリーから入手した；レトロウイルス
抗体（ＨＩＶ−１およびＨＴＬＶ−１）を持つ兆候のな
い個体由来の血清はニューヨーク血液センターから入手
し、ＨＩＶ−２抗体を持つ個体の血清は西アフリカのギ
ニアビサウからのものであり、イタリアのＯ．バルニエ
（Ｖａｒｎｉｅｒ）博士から供与された；ＡＴＬ患者の
血清は、日本赤十字から供与された；ＡＩＤＳおよびＡ
ＲＣ患者由来の血清はコロンビア大学内科・外科のＤ．
ノウルス（Ｋｎｏｗｌｅｓ）博士、ロングアイランド・
ジューイッシュ病院のＦ．シーゲル（Ｓｉｅｇｅｌ）博
士から供与された；自己免疫疾患の多様な合併症をもつ
患者の血清は、コーネル大学医学部のＮ．チオラジ（Ｃ
ｈｉｏｒａｚｚｉ）博士から供与された。すべての血清
は、本研究を行う前にさらなる認可された血清学的マー
カーによって解析された。
【０１２２】表３は、ランダムな供与者集団から得た２
３の組換えＨＣＶ ＥＩＡで再現性よく反応する試料の
パネルに関する、本発明で述べたペプチドに基づくＨＣ
ＶＥＩＡで得られた結果を示したものである。各試料の
ＡＬＴレベルとＨＢｃ抗体反応性に関するデータは、陽
性供与者のＮＡＮＢＨ状態の間接的な証明のための付帯
的情報として与えられている。表に示されるように、間
接的にＮＡＮＢＨ状態が確認されている８つの試料すべ
てが、本発明によるペプチドに基づくＥＩＡにおいて陽
性だと判断された（ＩＩＧおよびＩＩＦ／ＩＩＩＤプレ
ートの双方で）。さらに、ペプチドに基づくアッセイで
高い値が出た４試料は、組換えＨＣＶＥＩＡによっても
同様に強い陽性の値が出され、これらの試料のＨＣＶ陽
性がさらに確認された。１試料のみがペプチドに基づく
ＨＣＶ ＥＩＡで弱い陽性であると判断されたが、これ
はその他のマーカーを欠いていた。しかし、この試料は
組換えＨＣＶ ＥＩＡでは陽性であると判断された。本
発明によるペプチドに基づくＥＩＡで陰性と判断された
残りの１０試料は、すべて０．９から２．６の境界値の
Ｓ／Ｃ比を持っていた。第５図は本発明によるペプチド
に基づくＨＣＶＥＩＡと、組換えに基づくＨＣＶ ＥＩ
Ａとの直接的な関連を、このパネルのそれぞれのＳ／Ｃ
比によって示したものである。このように、本発明によ
るペプチドに基づくＨＣＶ ＥＩＡは、ｒＤＮＡに基づ
くＨＣＶ ＥＩＡでこれまでスクリーニングされていた
再現性よく反応性を示す試料を、２つの異なるグルー
プ、すなわち他の既知のＮＡＮＢＨマーカーと高度に相
関を持つ陽性グループと、おそらくＨＣＶと関連のない
外的反応性を持つ試料である陰性グループとに、明確に
区別することができる。スクリーニングアッセイとして
の利用法に加えて、ペプチドに基づくＨＣＶ ＥＩＡ
は、ｒＤＮＡに基づくＨＣＶ ＥＩＡに対する陽性の確
認試験としても機能し得る。
【０１２３】注：このよく解析された血清パネルは、ア
メリカ赤十字ＱＣ研究所のＣ．ファング（Ｆａｎｇ）博
士によって供与された。
【０１２４】実施例３ 凝集に基づくアッセイによるＨ
ＣＶに対する抗体の検出 メリフィールド固相法によって合成される本願特許請求
の範囲のＨＣＶペプチドは、低濃度のグルタルアルデヒ
ド溶液（０．２５％）の存在下での、または既に報告さ
れている方法による（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
８：６９０−６９７，１９７９）ｍ−マレイミドベンゾ
イル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢ
Ｓ）などの他の架橋剤を用いる単純な架橋法によって、
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結合させることができ
る。例えば、０．３２ｍｌのＢＳＡ溶液（０．０１Ｍリ
ン酸緩衝液、ｐＨ７．０中、１０ｍｇ／ｍｌ）に対し
て、０．０１３ｍｌのＭＢＳ溶液（ジメチルホルムアミ
ド中、０．０２５ｍｇ／ｍｌ）を室温で加える。ＢＳＡ
溶液に添加するＭＢＳ量は、調べられる特異的な複合体
によって決定されるＭＢＳに対するＢＳＡの最適モル比
に依存して変えることができる。混合液を室温で１時間
攪拌し、その後に遠心して沈殿したアルブミンを除く。
沈殿を除いた混合液を次にセファデックスＧ−２５でゲ
ル濾過し、２８０ｎｍの吸光度で検出されたタンパク質
含有画分を集め、−７０℃で使用時まで保存する。
【０１２５】ペプチドをＨ２Ｏで１０ｍｇ／ｍｌに溶解
する。あらかじめ決定した量の各ペプチド溶液を、すで
に活性化しておいたＢＳＡ−ＭＢＳ溶液に滴下し、室温
で３時間攪拌する。最終的なペプチド−ＢＳＡ複合体
は、ゲル濾過または徹底的な透析によって遊離ペプチド
から分離する。ペプチドのＢＳＡに対する比は、通常の
方法によってＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定する。
【０１２６】上述のペプチド−ＢＳＡ複合過程を用いて
複合体を形成したペプチドＩＩＧ−ＢＳＡを、２重にア
ルデヒドで固定したヒト０赤血球にｐＨ４．０で吸着さ
せた。ペプチド−複合体でコートした赤血球を、次にＮ
ａＢＨ４で処理し、非特異的なタンパク質結合を防止し
た。次に、ペプチド−複合体でコートした赤血球をＰＢ
Ｓで洗浄し、５％正常ヒト血清−ＰＢＳ溶液とインキュ
ベートした。これらの処理された細胞を次に、血清およ
び血漿試料中のＨＣＶ抗体の検出のための凝集アッセイ
に用いた。試料は試料希釈緩衝液で１：１０に希釈し、
等体積の指示細胞（５０μｌ）を希釈した試料に混合し
た。凝集パターンは１時間以内に安定した；アッセイ結
果は裸眼で読み、さらにウェルの周辺と中央の吸光度の
読みで決定されるＰ／Ｃ比を与える光学装置（オリンパ
ス社から販売）によって定量化した。本実験では、Ｐ／
Ｃ比２０をアッセイカットオフとして設定し、陽性の凝
集パターンは＜２０の、陰性パターンは＞２０の比を持
つものとした。
【０１２７】総数２０のｒＤＮＡ ＨＣＶ ＥＩＡで再
現性よく反応する試料を、ペプチドＩＩＧ−ＢＳＡ複合
体を固相として用いて、上述のＨＣＶ受動的凝血アッセ
イ（ＰＨＡ）においてＨＣＶに対する抗体に関する試験
を行った。第６図は、ペプチドに基づくＨＣＶ ＰＨＡ
と組換えに基づくＨＣＶ ＥＩＡとの間の相関を、それ
ぞれのＰ／Ｃ比とＳ／Ｃ比によって示したものである。
Ｓ／Ｃ ＥＩＡ比が３を超えるすべての試料は、ＨＣＶ
ＰＨＡテストで陽性であることが見いだされた。１つ
の例外を含み、境界上のＳ／Ｃ比（０．９から２）を持
つすべての試料は、このＰＨＡ試験では陰性と判断され
た。
【０１２８】実施例４ 固相免疫吸着剤として、ＨＣＶ
ペプチド混合物でコートした、ゼラチン粒子、異なる動
物種の赤血球またはラテックス粒子を用いた凝集アッセ
イによるＨＣＶに対する抗体の検出 １ｍｌの徹底的に洗浄した赤血球、ゼラチン粒子または
ポリスチレンラテックス粒子を、効果的な濃度のＨＣＶ
ペプチド混合物、またはその複合体でコートする。ペプ
チド混合物またはその複合体でコートした細胞または粒
子を、次に、スライドグラスまたは９６ウェルＵ型マイ
クロプレートのウェル中で、段階的に希釈した血清試料
とインキュベートした。室温で約１時間放置した後、ま
たはラテックス粒子による微小凝集の場合には数分後、
各ウェルの底またはスライドグラス上で安定した凝集パ
ターンを読む。また、陽性反応を示した最も高い希釈を
記録する。
【０１２９】これは、血清または生物溶液を含む試料中
のＨＣＶに対する抗体の定性的および定量的検出の双方
に用いられる一工程アッセイである。
【０１３０】実施例５ 凝集アッセイを用いるＨＣＶ抗体検出のための試験キッ
トは、複数のマイクロウェルプレートおよび、（１）Ｈ
ＣＶペプチドでコートした赤血球、ゼラチン粒子、また
はラテックスポリスチレン粒子の瓶；（２）陰性コント
ロール；（３）不活化したＨＣＶ陽性コントロール；お
よび（４）試料希釈液を含むその他の凝集アッセイのた
めの付属物質を含む、小分けした内容物を含む。実施例
３および実施例４に記載した方法が以下に続く。
【０１３１】実施例６ ＨＣＶ抗体検出のための酵素イムノアッセイに基づいた
診断試験キットを構築することができる。試験キット
は、使用前に１００μｌの１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３緩衝
液、ｐＨ９．５中の本発明のＨＣＶペプチドまたはペプ
チド混合物でコートした複数の９６ウェルプレートを含
む小分けした内容物を含む。本キットはさらに、独立に
密閉された容器中に、１）陰性コントロール；２）不活
化したＨＣＶ陽性コントロール；３）試料希釈液；４）
ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ二次抗体；および
５）例えばリン酸クエン酸緩衝液中のオルトフェニレン
ジアミン（ＯＰＤ）と過酸化水素の溶液からなる発色指
示薬からなる酵素検出のための物質を含む。実施例１お
よび実施例２で述べた方法が以下に続く。
【０１３２】この試験キットでは、本発明のペプチドま
たはペプチド混合物であらかじめコートした９６ウェル
プレートの代わりに、本発明のペプチドでコートしたポ
リスチレンビーズ、または調整した孔サイズのガラスビ
ーズをつめた複数のミニカラム、またはニトロセルロー
ス紙片を、固相免疫吸着剤として使用することもでき
る。
【０１３３】実施例７ ＨＣＶ抗体の高い力価を維持さ
せるためのオクタマーＨＣＶペプチドでの免疫 合成ＨＣＶペプチドを、エピトープに基づくサブユニッ
トＮＡＮＢＨワクチンの究極的な開発のための、配列に
関連した抗ＨＣＶ抗体の生成のための免疫原として使用
することに加えて、三官能性アミノ酸リジンの制限され
た段階的増加を用いてペプチド免疫原のための低分子量
担体として働くコアを形成させる別の手法も用いること
ができる。三官能性アミノ酸Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）
は、Ｎ−αおよびＮ−εアミノ基が共に反応末端として
機能するため、特に適当である。したがって、Ｂｏｃ−
Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）の段階的増加は２ｎ個の反応末端を生
成する。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）の結合の第１段階
は、２価担体として２つの反応末端を作る。Ｂｏｃ−Ｌ
ｙｓ（Ｂｏｃ）による第２、第３段階の連続的生成は、
４個の（４価）、および８個の（８価）反応性アミノ末
端を形成し、それにペプチド抗原が結合する。
【０１３４】本発明のＨＣＶペプチドは、ヒトを含む哺
乳動物の高力価の維持の開発のために、以下に述べるよ
うに、この担体系上に取り込ませることができる。
【０１３５】
【０１３６】本発明のオクタマーＨＣＶペプチド（表
１）は、メリフィールドの固相法を用いて、アプライド
・バイオシステムズ（ＡＢＩ）モデル４３０Ａ、または
バイオサーチモデル９５００のいずれかの、自動化され
たペプチド合成機で合成される。
【０１３７】酸に不安定なｔ−ブチルオキシカルボニル
基（ｔ−Ｂｏｃ）および酸に安定な基の双方を、それぞ
れ合成中のＮ−αアミノ酸およびアミノ酸の官能性側鎖
の保護のために使用する。オクタマーペプチドは合成オ
クタマー樹脂上に結合させることによって合成される。
【０１３８】オクタマー樹脂は、０．１４ｍｍｏｌ／ｇ
ＭＢＨＡ（４−メチルベンズヒドリルアミン）樹脂上
にジ−ｔ−Ｂｏｃ ｌｙｓを結合させることによって調
製する（バイオサーチ９５００は、この調製のために、
その量の可変性により用いられる）。ジ−Ｂｏｃ Ｌｙ
ｓの単独の結合の後に、２つのキャッピング反応が行わ
れる〔例えば０．３Ｍアセチルイミダゾールを含むＤＭ
Ｆ（ジメチルホルムアミド）溶液〕。合成オクタマー樹
脂の置換レベルは、ニンヒドリン試験によって決定され
る。
【０１３９】４００〜５００ｇの重量のダンカン・ハー
トレー・ランダムブレッドモルモットのメス（免疫原あ
たり２匹）を宿主として使用する。最初の免疫には、
０．５ｍｌＰＢＳ中１００μｇのオクタマーＨＣＶペプ
チドを等量の完全フロイント・アジュバントと混合し、
各動物の複数の場所に、皮下および皮膚内の双方に注射
する。２〜３週間置いた後、同じ免疫原を等量、不完全
フロイント・アジュバントを用いて各動物に追加免疫と
して注射する。定期的に動物の心臓採血により、各血清
の抗ＨＣＶ力価を追跡する。連続的な追加免疫を定期的
に行う。
【０１４０】実施例８ 酵素結合免疫吸着アッセイによ
る合成ペプチドの相対免疫反応性（％） ９６ウェルプレートのウェルを、１００μｌ／ウェルの
１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．５中、５μｇ
／ｍｌの濃度のさらなる９種のペプチド、ＶＡ、ＶＢ、
ＶＣ、ＶＤ、ＶＥ（＝Ｖ）、ＶＩＡ、ＶＩＢ、ＶＩＣ、
ＶＩＤ、ＶＩＥ（上述のペプチドに関しては表１を参照
されたい）の各々で、４℃で一晩（または３７℃で１時
間コートした。各ペプチドの免疫反応性は、実施例１で
述べたように測定した。ＶおよびＶＩシリーズの１０ペ
プチドに関して得られた結果を表２に示す。４９２ｎｍ
におけるＥＩＡ吸光度の読み（ｙ座標）と、対応するＨ
ＣＶペプチドの各々のアミノ酸配列（ｘ座標）にしたが
って、代表的な免疫反応性プロフィールを、第１−１図
から第１−４図に示したように、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ
シリーズの最初の２０ペプチドとともに、ＶおよびＶＩ
シリーズの１０ペプチドに関して８血清のうち４血清に
ついてプロットしている。追加された１０ペプチドの各
々の相対免疫反応性指数（％）は、ペプチドＩＩＩＤを
参考として用いて同様に算出する。これらの１０ペプチ
ドで同定されたＡＳＲＱＡやＥＶＩＡＰなどのさらなる
残基のクラスターは、全体のＨＣＶ抗体反応性にさらに
寄与していることが示された。
【０１４１】要約すると、重なり合うペプチドシリーズ
で行ったエピトープマッピング解析から、異なるＨＣＶ
抗体陽性試料とこれらのＨＣＶペプチドとの間の多様な
程度の免疫反応性が示された。上述のエピトープマッピ
ング解析に基づいて、ペプチドＩＩＦ、ＩＩＩＤ、およ
びＶを固相抗原として用いる第３の代表的ＥＩＡを、ペ
プチドＩＩＦ、ＩＩＩＤを用いたものと比較して、実施
例９で述べるような試験のために構築した。
【０１４２】実施例９ 酵素結合免疫吸着アッセイによ
る連続試料中のＨＣＶに対する抗体の検出 （ａ）輸血によって感染したＮＡＮＢＨの症例から由来
した２４試料からなるコードしたパネルを、各５μｇ／
ｍｌのＩＩＦとＩＩＩＤの混合物、または各５μｇ／ｍ
ｌのＩＩＦ、ＩＩＩＤおよびＶでコートしたプレートを
用いて、２つの型のＥＩＡで試験した。パネルはＮＩＨ
のＨ．アルター（Ａｌｔｅｒ）博士に供与されたもので
あり、結果は彼の研究室で解析されたものである。
【０１４３】第７−１図に示したように、各々ペプチド
ＩＩＦ／ＩＩＩＤ／Ｖでコートしたプレート（カーブ
Ａ）と、ペプチドＩＩＦ／ＩＩＩＤでコートしたプレー
ト（カーブＢ）を用いた２つの型で試験された１０年の
期間にわたる２つの抗ＨＣＶプロファイルは、興味深い
対比を示した。
【０１４４】記録によれば、血清陰性の患者は、ＨＣＶ
が混入した血液単位を１９８０年８月２０日に輸血され
た。輸血の結果、Ａ型の試験によって患者の血清中に少
量の受動的ＨＣＶ抗体が検出された。患者のＨＣＶ抗体
の能動的発生は、１１月１４日（最初の輸血後約３カ
月）からどちらの型のアッセイでも検出されるようにな
った。輸血によるＨＣＶ感染の結果として発生したＨＣ
Ｖ抗体は、次の１０年間維持され続けた。輸血後４カ月
目の血清では、ペプチドＶでさらにコートしたプレート
（カーブＡ）によってより高いシグナルが検出された。
ペプチドＶによって表されるエピトープは、隣接した免
疫優性領域を表し、ペプチドＩＩＦおよびＩＩＩＤによ
って表されるエピトープよりもわずかに遅い時期に豊富
なＨＣＶ抗体を誘導することが示された。
【０１４５】（ｂ）ＮＡＮＢＨを持つ血液透析患者の代
表例からの連続的試料は、ニューヨークのニューヨーク
血液センターのクラッド・スティーブンス（Ｃｌａｄｄ
Ｓｔｅｖｅｎｓ）によって供与され、３種のペプチド
ＩＩＩＦ／ＩＩＤ／Ｖの混合物でコートされたプレート
で試験した。試料の経歴を第７−２図に示す。ペプチド
に基づくＥＩＡによって、ＡＬＴの増加によって確認さ
れた疾患の急性期の開始後約２カ月の試料が検出された
という結果が示されている。
【０１４６】（ｃ）典型的なチンパンジーの連続試料
を、ＩＩＩＦ／ＩＩＤ／Ｖペプチドの混合物を用いたペ
プチドに基づくＨＣＶ ＥＩＡで試験した。このチンパ
ンジーは０日目によく解析されたＮＡＮＢＨ株を接種さ
れた。ＡＬＴレベルの増加によって確認される感染の急
性期に続いて、接種後約６０日目にＨＣＶに対する抗体
が検出された（第７−３図）。
【０１４７】実施例１０ ペプチドに基づくＨＣＶ Ｅ
ＩＡによる低危険度ランダム血液供与者のスクリーニン
グ 血液銀行から入手した２０３５供与者の試料を、各５μ
ｇ／ｍｌのペプチドＩＩＦ、ＩＩＩＤおよびＶの混合物
でコートしたＥＩＡによって、実施例２で述べた方法に
したがって試験を行った。結果を第８−１図および第８
−２図に示す。ペプチドに基づくＨＣＶ−ＥＩＡシグナ
ルのカットオフに対する比の頻度分布は、最初の反応率
が１．１８％、再現性のある反応率が１．０８であるこ
とを示した。８８％の初期反応試料は、再現性よく反応
性を示し、アッセイの高い再現性を示唆する。すべてボ
ランティアである低危険度ランダム血液供与者試料で得
られたペプチドに基づくＨＣＶ−ＥＩＡの再現性のある
反応率は、商業的に支払われた供与者集団から得られた
ものよりも低かった（実施例２参照）。
【０１４８】実施例１１ 確認試験としての合成ペプチ
ドに基づくＨＣＶ中和ＥＩＡ ９６ウェルプレートのウェルを、１００μｌの１０ｍＭ
ＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．５中、各５μｇ／ｍｌ
の２つのペプチドＩＩＦおよびＩＩＩＤの混合液で、４
℃で一晩（または３７℃で１時間）コートした。直接Ｈ
ＣＶ ＥＩＡでスクリーニングされた再現性よく反応性
を示す試料を、コントロール試料希釈緩衝液（すなわ
ち、２０体積％の正常ヤギ血清、１重量％ゼラチンおよ
び０．０５体積％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳ）で体積
比で１：２０に希釈したもの、または種々の量のＨＣＶ
ペプチド類似物質ＩＶ（アミノ酸配列は表１参照）を含
む同じ試料希釈緩衝液とインキュベートし、３７℃で１
時間反応させた。
【０１４９】次に、各ウェルに２００μｌのペプチドＩ
Ｖ中和試料を加え、３７℃で１５分間反応させ、実施例
２で述べたＥＩＡ法を行う。２つの弱反応性試料および
２つの強反応性試料を含む４つの典型的な反応性試料を
試験した。１つの強反応性試料は、中和試験前にさらに
試料希釈緩衝液で１：１０に希釈した。第９図と表４に
示すように、ペプチドＩＶに関して、ＨＣＶ ＥＩＡの
用量に依存した阻害（あるいは中和）が見られた。コン
トロールと比較した場合、ペプチドＩＶ５０μｇ／ｍｌ
の濃度でも４種全ての試料で顕著な阻害が見られた。
【０１５０】実施例１２ ＥＩＡによる血液透析患者中
のＨＣＶに対する抗体の検出 血液透析患者群の７４試料からなるコードされたパネル
を、ＨＣＶペプチドＩＩＨとＶそれぞれ１０．５μｇ／
ｍｌの混合物でコートしたプレートを用いたＥＩＡ、ま
たは組換えＨＣＶタンパク質に基づくＥＩＡの、２つの
型のＥＩＡで試験した。パネルは、日本の予防衛生研究
所の研究者によって供与された。結果は血清供与者が解
析し、組換えＨＩＶタンパク質に基づくＥＩＡと比較し
た。
【０１５１】第１０図に示すように、ペプチドに基づく
ＨＣＶ ＥＩＡと、組換えＨＣＶタンパク質に基づくＨ
ＣＶ ＥＩＡによるＡ４９２ｎｍの読みのｘ−ｙプロッ
トから、これらの２つのアッセイの強い相関が明らかに
なった（カットオフ０．２および０．４は、対応するア
ッセイデザインに基づいて得られたものである）。ＨＣ
Ｖ感染の可能性が非常に高い血液透析患者のこれらの７
４試料は、これらの２つの型のＥＩＡでのそれぞれの反
応性に基づいて、４つのグループに分けられた。上側右
のブロックは、双方のアッセイで陽性と判断されたもの
であり、下側左のブロックは双方のアッセイで陰性と判
断されたものである。上側左のブロックに示されるよう
に、７４の高危険性試料のうちで、組換え体に基づくＥ
ＩＡで陽性であり、ペプチドに基づくＥＩＡで陰性と判
断されたものは皆無であった。それに対して、下側右の
ブロックで示されるように、７４の高危険性試料のうち
５試料は、ペプチドに基づくＥＩＡで陽性であり、組換
え体に基づくＥＩＡでは陰性であると判断され、ＨＣＶ
の感染の危険性の高い患者由来の試料で試験する場合に
は、ペプチドに基づくＨＣＶ ＥＩＡの方がより感度が
高いことが示唆された。
【０１５２】実施例１３ ＡＬＴレベルが上昇している
希な試料中の抗ＨＣＶ活性の検出 これらの結果は、ＨＣＶタンパク質Ｃ−１００のＣ末端
近くの領域をカバーするペプチドＶＩＩシリーズの合成
ペプチド、および免疫優性領域由来のペプチドＩＩＨに
よるＨＣＶ感染の急性期に典型的なものである。
【０１５３】９６ウェルプレートのウェルを、ウェルあ
たり１００μｌの１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ
９．５中、５μｇ／ｍｌの６種のペプチドＶＩＩＡ、Ｖ
ＩＩＢ、ＶＩＩＣ、ＶＩＩＤ、ＩＩＧおよびＩＩＨの各
々で、３７℃で１時間コートした。各々の試料での各ペ
プチドの免疫反応性は、実施例１で述べたように測定し
た。表５に示すように、試料３ではペプチドＶＩＩＣと
ＶＩＩＤに関して弱い免疫反応性が示されたが、ＶＩＩ
ＡとＶＩＩＢでは示されなかった。試料ＮＡＢ−２−２
では、ペプチドＩＩＨに関して中程度の免疫反応性が示
されたが、ＩＩＧでは示されなかった。どちらの試料も
高レベルのＡＬＴ活性を持つことが示され、ＨＣＶ感染
の急性期の患者由来の試料の典型的なものであった。
【０１５４】
【０１５５】
【０１５６】実施例１４ 酵素結合免疫吸着アッセイに
よるＨＣＶコアタンパク質と仮定されるタンパク質の免
疫優性領域をカバーする合成ペプチドに関する相対免疫
反応性（％）の測定 ９６ウェルプレートのウェルを、上記のように調製した
ウェルあたり１００μｌの１０ｍｌ ＮａＨＣＯ３緩衝
液、ｐＨ９．５中、５μｇ／ｍｌの１０種のペプチド、
ＶＩＩＩＡ、ＶＩＩＩＢ、ＶＩＩＩＣ、ＶＩＩＩＤ、
ＶＩＩＩＥ（＝ＶＩＩＩ）、ＩＸＡ、ＩＸＢ、ＩＸＣ、
ＩＸＤおよびＩＸＥ（＝ＩＸ）の各々（表７参照）で、
４℃で一晩（または３７℃で１時間）コートした。それ
以外のプレートコーティング法および酵素イムノアッセ
イ法は、実施例１で述べたように行った。
【０１５７】本研究から得られた結果を第１１−１図お
よび第１１−２図に示す。４９２ｎｍでのＥＩＡ吸光度
の読み（ｙ座標）と、対応するＨＣＶペプチドの各々の
アミノ酸配列（ｘ座標）にしたがって、第１１−１図と
第１１−２図に示された８つのパネル血清のうち４種に
ついて、代表的な免疫反応性プロフィールをプロットし
た。１０ペプチドの各々に関する相対免疫反応性指数
（％）（表７）を、４９２ｎｍにおける８種の血清の総
吸光度に基づいて、最も高い吸光度の読みを持つペプチ
ドＩＩＩＤ（表１参照）に対して計算した（計算例は表
１および表２参照）。第１１−１図と第１１−２図は、
免疫反応性実験で得られたデータによる免疫優性領域の
アミノ酸配列を示す。例えば、血清試料１は、対応する
ペプチド群で２０マー範囲の最も短い部類であるペプチ
ドＶＩＩＩＡおよびＩＸＡと強く反応する（ＯＤが１．
５〜３．５）。Ｎ末端へのさらなるアミノ酸付加は、こ
れらの類似ペプチドの免疫反応性を顕著には増大させな
かった（第１１−１図および第１１−２図の試料１参
照）。
【０１５８】しかしながら、＃３や＃４などの他の血清
試料はそれぞれＶＩＩＩＢ、ＶＩＩＩＣとさらに強く反
応し、ＩＸシリーズの類似ペプチドとさらに免疫反応性
が増大して反応した（第１１−１図、第１１−２図、試
料＃３および＃４参照）。さらに、血清試料２は対応す
るＶＩＩＩおよびＩＸシリーズのペプチドと弱く反応し
た。これらの反応性プロフィールにより、予想されたＨ
ＣＶコアタンパク質領域のより複雑なエピトープ分布が
示唆され、診断目的で最も高い免疫反応性を示すには長
いサイズのペプチドを必要とする、いくつかの不連続な
直鎖状エピトープおよび構造的エピトープが含まれる可
能性がある。
【０１５９】要約すると、表７と第１１−１図および第
１１−２図に示される全部で１１９アミノ酸残基にわた
る予想されるＨＣＶコアタンパク質の免疫優性領域をカ
バーする１０種のペプチド群を用いて行ったエピトープ
マッピング解析から、異なるＨＣＶ抗体陽性血清試料
と、ＶＩＩＩおよびＩＸシリーズの類似のＨＣＶペプチ
ドとの間に多様な程度の免疫反応性があることが示され
た。この場合、ＨＣＶ抗体に対するこれらの抗原決定基
を最適に表わさせるためには、長いアミノ酸鎖、理想的
には２０を超えるアミノ酸鎖を持つ合成ペプチドである
ことが望ましいことが明らかになった。
【０１６０】上述のエピトープマッピング解析に基づ
き、ＨＣＶコア領域由来のペプチドＶＩＩＩＥ、ＩＸＤ
を単独で、あるいはＨＣＶ非構造領域からのエプチドＩ
ＩＨおよびＶとの混合物として用いて、さらなる典型的
なＥＩＡを、以下の実施例１５、１６、１７および１８
で述べる研究のために設計した。
【０１６１】実施例１５ 様式Ｃ、様式Ｄ、様式Ａを用
いたペプチドに基づく酵素結合免疫吸着アッセイによる
ＨＣＶに対する抗体の検出 以下の４グループの試料： （ａ） ＡＩＤＳ、ＡＲＣの個体（ｎ＝６３）； （ｂ） ＨＢｓＡｇについて陽性の個体（ｎ＝５０）； （ｃ） ＨＢｃタンパク質に対する抗体について陽性の
個体（ｎ＝２２）；および （ｄ） アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）
酵素活性が上昇している（＞１００ Ｉ．Ｕ．／Ｌ）個
体（ｎ＝８６） を、（ｉ）それぞれ５μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌの
ペプチドＩＩＨおよびＶ（様式Ａ）、（ｉｉ）それぞれ
５、３、２μｇ／ｍｌのペプチドＩＩＨ、ＶおよびＶＩ
ＩＩＥ（様式Ｃ、ＨＣＶコアおよび非構造ペプチドの両
方を含む）あるいは（ｉｉｉ）それぞれ２μｇ／ｍｌの
ペプチドＶＩＩＩＥおよびＩＸＤ（様式Ｄ、ＨＣＶコア
ペプチドのみ）、のいずれかを用いてコートしたプレー
トで、本発明の典型的ＨＣＶペプチドに基づくＥＩＡで
解析した。
【０１６２】典型的なロットのペプチドでコートしたプ
レートを用いて、Ａ、Ｃ、またはＤの様式のＥＩＡで、
（ａ）から（ｄ）の４グループにあらかじめ分類した全
部で２２１のよく解析された臨床試料のスクリーニング
で得られた結果を、第１２−１図、第１２−２図、およ
び第１２−３図に示したヒストグラムにプロットした。
【０１６３】全部で６３のＡＩＤＳ／ＡＲＣ患者試料を
解析したうち、ＥＩＡ様式Ａ、Ｃ、およびＤでそれぞれ
４６．０％、５５．６％、および５０．８％の患者はＨ
ＣＶ抗体陽性であった。５０のＨＢｓＡｇ陽性個体のう
ち、３６．０％、４２．０％および３６％の個体が、そ
れぞれＥＩＡ様式Ａ、Ｃ、ＤでＨＣＶ抗体についても陽
性であることが示された。２２のＨＢｃ抗体陽性個体の
うち、２７．３％、２２．７％および１８．２％が、Ｅ
ＩＡ様式Ａ、ＣおよびＤでＨＣＶ抗体陽性であると判断
された。ＡＬＴレベルが上昇している８６の患者のう
ち、９０．７％、９１．５％、および８５．４％が、Ｅ
ＩＡ様式Ａ、Ｃ、およびＤでＨＣＶ抗体陽性であること
が示された。ＨＣＶ陽性試料について、ノイズに対する
シグナルの比の総体的分布は、固相抗原としてＨＣＶ非
構造領域由来のペプチドのみを使用する様式Ａよりも、
ＨＣＶコア領域由来のペプチド（ＶＩＩＩＥ）を含む様
式Ｃおよび様式Ｄの方が高いことが示された。
【０１６４】ＨＣＶ ＥＩＡ様式Ａでの結果がボーダー
ライン上で陽性（Ｓ／Ｃ比が〜１．０）であった１つの
ＨＢｃ抗体試料を除いて、ＨＣＶ構造（コア）と非構造
領域の双方由来のペプチド（ＩＩＨ、Ｖ、およびＶＩＩ
ＩＥ）を含む様式Ｃが最も感度が高かった。感度の顕著
な上昇から、様式ＣはＨＣＶ抗体スクリーニングアッセ
イの理想的な候補である。
【０１６５】実施例１６ 低危険度ランダム血液供与者
に対する３種のペプチドに基づくＨＣＶ ＥＩＡ、様式
（Ａ、Ｃ、およびＤ）を用いる試験結果の比較 血液銀行から入手した典型的な２６４供与者の試料を、
３種すべてのＥＩＡ様式で試験した。
【０１６６】結果を第１３−１図から第１３−６図に示
す。ペプチドに基づいたＨＣＶ−ＥＩＡシグナルのカッ
トオフに対する比の頻度分布から、様式Ａ、Ｃ、および
Ｄについてそれぞれ最初の反応率が１．１３％、３．０
％、および３．０％であることが示された。陰性の試料
は、３種全てのアッセイ様式でカットオフに対するシグ
ナルの比が相対的に低かった（第１３−１図、第１３−
３図、第１３−５図参照）。反復実験から、様式Ａ、
Ｃ、およびＤでそれぞれ１．１３％、１．９％、および
１．９％の再現性のある反応率が得られた。陽性と判断
された血清のうち、様式ＣとＤの双方で強く反応した試
料が４種存在したが、様式Ａでは陰性と同定された。こ
れはＨＣＶ抗体検出アッセイが構造タンパク質領域由来
のエピトープを含まない場合には、偽陰性と判定する可
能性があることを示唆している。
【０１６７】実施例１７ 多様な酵素結合免疫吸着アッ
セイによるよく解析された連続試料中のＨＣＶに対する
抗体の検出 （ａ）ＮＡＮＢＨが輸血で伝播した症例の２４試料から
なるコードしたパネルを３種のＨＣＶ ＥＩＡ様式
（Ａ、Ｂ、およびＣ）で試験し、血清変換を検出する際
の様式のそれぞれの感度を決定した。パネルはＮＩＨの
Ｈ．アルター（Ａｌｔｅｒ）博士から供与され、結果は
彼の研究室で解析された。
【０１６８】第１４−１図に示すように、それぞれペプ
チドＩＩＦ／ＩＩＩＤ／Ｖでコートしたプレート（カー
ブＡ）；ペプチドＩＩＦ／ＩＩＩＤでコートしたプレー
ト（カーブＢ）；およびペプチドＩＩＨ、Ｖ、およびＶ
ＩＩＩＥでコートしたプレート（カーブＣ）を用いた３
つの様式で試験を行ったところ、１０年間にわたる血清
での３つの抗ＨＣＶプロフィールは、興味深い対照を示
した。
【０１６９】輸血の結果、様式ＡとＣの双方で受容者の
血清に受動的ＨＣＶ抗体が微量検出された。１１月１４
日（最初の輸血から３ケ月後）から、３種すべての様式
で受容者のＨＣＶ抗体の能動的発生が検出されるように
なり、その日に様式Ｃが最も高いＳ／Ｃ比を示した。こ
のことは、ＨＣＶ ＥＩＡ様式Ｃを用いることによって
得られた増大した感度をさらに確認するものである。
【０１７０】（ｂ）典型的なチパンジー由来の連続的試
料を、組換えＨＣＶ Ｃ−１００に基づくラジオイムノ
アッセイ（ＲＩＡ）と比較して、ＨＣＶ ＥＩＡ様式Ｃ
で試験した。０日目にチンパンジーによく解析されてい
るＮＡＮＢＨＶ株を接種した。ＡＬＴレベルの上昇によ
って示された感染の急性期の後、接種後４７日目にＨＣ
Ｖ抗体が検出された（第１４−２図）。ＨＣＶ ＥＩＡ
様式Ｃは、ｒＤＮＡに基づくＲＩＡよりも約４０日早く
ＨＣＶ抗体を検出することができた。ｒＤＮＡＲＩＡよ
りも、ＨＣＶ ＥＩＡ様式Ｃで得られたシグナル／カッ
トオフ比の方が高かった。
【０１７１】（ｃ）セロロジック社が集めた３つのよく
解析された典型的ＨＣＶ血清変換パネル由来の連続的試
料を、実施例１５で定義されたＨＣＶ ＥＩＡ様式Ａ、
Ｃ、およびＤで試験し、さらにｒＤＮＡ ＨＣＶ Ｃ−
１００に基づくＥＩＡでも試験した。表８に示すよう
に、ＨＣＶ ＥＩＡ様式ＣとＤの双方は、ｒＤＮＡ Ｈ
ＣＶ−１００に基づくＥＩＡとＨＣＶ ＥＩＡ様式Ａよ
りも４〜８週間早く、３つのパネルのうち２つでＨＣＶ
抗体陽性を検出した。これは、ＨＣＶ構造（コア）タン
パク質領域由来のペプチドを含むＨＣＶ ＥＩＡの感度
をさらに示すものである。
【０１７２】実施例１８ 多様な様式のＨＣＶ ＥＩＡ
による、血液透析患者のＨＣＶに対する抗体の検出 一群の血液透析患者からの７４の試料からなるコードパ
ネルを、３つのタイプのＨＣＶ ＥＩＡにより試験し
た；これらは、組換え体ＨＣＶタンパク質に基づくＥＩ
Ａと、そしてＨＣＶペプチドＩＩＨとＶをそれぞれ１
０、５μｇ／ｍｌの混合物（様式Ａ）またはＨＣＶペプ
チドＩＩＨ、Ｖ、ＶＩＩＩＥをそれぞれ５、３、２μｇ
／ｍｌの混合物（様式Ｃ）のいずれかでコートしたプレ
ートを用いる２つのタイプである。パネルは日本の予防
衛生研究所の研究者により提供された。結果は、血清提
供者が解析し、組換え体ＨＣＶタンパク質に基づくＥＩ
Ａと比較した。
【０１７３】図１５−１に示すように、ペプチドに基づ
くＨＣＶ ＥＩＡ様式Ｃと組換え体ＨＣＶタンパク質に
基づくＨＣＶ ＥＩＡに対するＡ４９２ｎｍの読みとり
のｘ−ｙプロットは、ｒＤＮＡ ＨＣＶ Ｃ−１００タ
ンパク質に基づくＨＣＶＥＩＡと比較して、ペプチドに
基づくＨＣＶ ＥＩＡ様式Ｃを用いると感度が増加した
ことを明らかにした（０．２と０．４というカットオフ
値は、相当するアッセイデザインに基づいて得られ
た）。ＨＣＶ感染の危険が高い透析患者から得たこの７
４の試料は、これらの２つのタイプのＥＩＡに対するそ
れぞれの反応性に基づき、４つのカテゴリーに分類され
た。上側右のブロックは両方のアッセイによりポジティ
ブとされた試料、そして下側左のブロックは両方のアッ
セイによりネガティブとされた試料を示す。上側左のブ
ロックに示されるように、７４の高リスク試料のいずれ
も、組換え体に基づくＥＩＡによりポジティブでペプチ
ドに基づくＥＩＡによりネガティブなものは見られなか
ったが、一方、下側右のブロックに示されるように、こ
れらの７４の高リスク試料のうち“１１”がペプチドに
基づくＥＩＡ様式Ｃによりポジティブで、組換え体に基
づくＥＩＡによりネガティブと記録された。
【０１７４】ＨＣＶ ＥＩＡ様式Ａと比較すると、（Ｈ
ＣＶコアペプチドを含む）ペプチドに基づくＨＣＶ Ｅ
ＩＡ様式Ｃについて感度の増加が得られ、かわって様式
Ａは組換え体ＨＣＶ Ｃ−１００タンパク質に基づくＥ
ＩＡと比較して改善された感度を示す（実施例１２、図
１０参照）。
【０１７５】このような感度比較の正当性をさらに証明
するために、透析患者の各標本について得られた他の臨
床データを、相当するＥＩＡ比と一緒に表にした（表
９）。１１の注目された標本のうち、ほとんどが、増加
したＧＯＴ／ＧＰＴレベルを示し、以前の頻繁な上昇し
たＧＰＴの経歴に関連づけられた。１１試料の全てが、
ｒＤＮＡ ＨＣＶ Ｃ−１００に基づくＥＩＡではネガ
ティブと判定された。しかしながら、こうした同じ試料
が、ペプチドに基づくＨＣＶ ＥＩＡ様式Ｃにおいて強
く反応した（Ｏ．Ｄ．で、〜１．５）。ペプチドＶＩＩ
Ｉ（ＶＩＩＩＥ）は、保存された構造（コア）タンパク
質領域から選択されたアミノ酸配列にしたがって合成さ
れたので、（様式Ｃのような）ペプチドに基づくＨＣＶ
ＥＩＡにそれを含めることは、ＨＣＶ単離株間の株ご
との多様性により高いチャンスでめぐりあうような地理
的に異なる領域からの標本を試験する時には、特に適し
ているだろう。
【０１７６】上の実施例は本発明の例証となるものであ
って、その範囲を限定するものではないことをご理解願
いたい。
【０１７７】
【０１７８】
【０１７９】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＨＣＶ非構造タンパク質の免疫優性領
域のアミノ酸配列を示しており、４つの代表的なＨＣＶ
抗体ポジティブ血清のうちの１つとのこれらのＨＣＶペ
プチドの免疫反応性に寄与しているアミノ酸残基を正確
になぞっ Ａ手順による４９２ｎｍの吸光度として測定された。
【図２】別の血清資料を用いた以外は図１と同様にして
得られたアミノ酸配列を示すグラフである。
【図３】更に別の血清資料を用いた以外は図１と同様に
して得られたアミノ酸配列を示すグラフである。
【図４】前記のものと更に異なる血清資料を用いた場合
のアミノ酸配列を示すグラフである。
【図５】図５−（１）、５−（２）は、非構造タンパク
質の配列由来の本発明のペプチドＩＩＧのみを用いたペ
プチドに基づくＨＣＶ−ＥＩＡと、組換え体ＳＯＤ／Ｈ
ＣＶ Ｃ−１００−３タンパク質に基づくＨＣＶ−ＥＩ
Ａとの間の、シグナル／カットオフ比の比較である。図
５−（１）では、よく特徴づけられているＨＣＶ抗体の
ポジティブコントロールを、様々に血清希釈して、試験
試料として用いた。図５−（２）では、抗ＨＣＶ反応性
への血清変換の期間中に一個人からの連続的な採血から
得た血清標本のパネルを、試料として用いた。
【図６】図６−（１）、６−（２）は、ペプチドＩＩＧ
を用いて、商業的供給源からの２６４の正常血清と２６
４の正常血漿標品で得たシグナル／カットオフ比により
表したＨＣＶ−ＥＩＡポジティブの頻度分布を表してい
る。ネガティブ（ｎ＝２５０）と、スクリーニングによ
り判別されたポジティブ（ｎ＝１４）の血清標品に関す
るＳ／Ｃ比の平均値は、各々０．０３４と７．２０２で
あり、ネガティブ（ｎ＝２５５）とポジティブ（ｎ＝
９）の正常血漿標品に関しては、Ｓ／Ｃ比平均値は各々
０．０８４と７．０８９である。
【図７】図７は、（ａ）ＨＢｓＡｇについてポジティブ
（ｎ＝５０）；（ｂ）ＨＢｃタンパク質に対する抗体に
ついてポジティブ（ｎ＝３９）；（ｃ）上昇した（＞１
００Ｉ．Ｕ．／Ｌ）アラニンアミノトランスフェラーゼ
（ＡＬＴ）酵素活性をもつ（ｎ＝１７４）；（ｄ）レト
ロウイルスＨＩＶ−１に対する抗体についてポジティブ
（ｎ＝１００）、同ＨＩＶ−２（ｎ＝１０）、同ＨＴＬ
Ｖ−Ｉ／ＩＩ（ｎ＝１４）；全て無症候性のもの（計ｎ
＝１２４）；（ｅ）ＡＩＤＳ，ＡＲＣ（ｎ＝２００）ま
たはＡＴＬ（ｎ＝１７０）の病気をもつ（計ｎ＝２７
０）；（ｆ）自已免疫性疾患をもつ（ｎ＝２０）、とい
った個人からの血清との、ペプチドＩＩＧの免疫反応性
を表したヒストグラムである。
【図８】図８は、無作為供与者集団から得た、反復的に
反応する標本（ｎ＝２３）のパネルでの各々のＳ／Ｃ比
により表した、本発明のペプチドＩＩＦとＩＩＩＤを用
いてのＥＩＡ結果と、組換え体ＳＯＤ／ＨＣＶ Ｃ−１
００−３を用いた時のそれとの間の比較である。
【図９】図９は、無作為供与者集団から得たＳＯＤ／Ｈ
ＣＶ Ｃ−１００−３ ＨＣＶＥＩＡで反復的に反応性
の標本（ｎ＝２０）のパネルに関する各々のＰ／Ｃ比と
Ｓ／Ｃ比により表した、ペプチドＩＩＧを用いる時と組
換え体ＳＯＤ／ＨＣＶＣ−１００−３ ＥＩＡを用いた
時の受動的赤血球凝集反応アッセイ（ＰＨＡ）の比較で
ある。ＰＨＡにより得られた結果について、凝集パター
ンを、特別設計の光学読みとり計器〔オリンパスコーポ
レーション（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ）製〕により定量したが、その際、Ｐ／Ｃ比が、２０
より大きいものをネガティブ、２０より小さいものをポ
ジティブとみなした。
【図１０】図１０は、ＨＣＶ感染血液を受けた後血清変
換したＮＡＮＢＨ患者から１０年にわたって集めた血清
試料の研究である。試料は、比較のため、Ａ（各５μｇ
／ｍｌのペプチドＩＩＦ、ＩＩＩＤによりコート）とＢ
（各５μｇ／ｍｌのペプチドＩＩＦ、ＩＩＩＤ、Ｖでコ
ート）の２つのＥＩＡ様式により試験した。血清試料は
ＮＩＨのＨ．アルター博士（Ａｌｔｅｒ）より提供され
た。
【図１１】図１１は、ニューヨーク血液センター（Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ）のＣ．スチ
ーブンス博士（Ｓｔｅｖｅｎｓ）の好意により提供され
た、血清変換してＮＡＮＢＨにかかった血液透析患者か
らの血清試料を用いての動態調査である。これらはＥＩ
Ａ様式Ｂ（各５μｇ／ｍｌのペプチドＩＩＦ、ＩＩＩ
Ｄ、Ｖでコート）により試験した。
【図１２】図１２は、疾患コントロールセンター（Ｃｅ
ｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）
のＤ．ブラドリー博士（Ｂｒａｄｌｅｙ）の好意により
提供された、よく特徴づけられたＨＣＶ株を接種された
後、血清変換してＮＡＮＢＨにかかったチンパンジーか
らの血清試料を用いての、同じくＥＩＡ様式Ｂにより試
験した第２の動態調査である。
【図１３】図１３−（１）と１３−（２）は、ＨＣＶ−
ＥＩＡ様式Ｂによるネガティブとポジティブの両方の血
清標品のシグナル／カットオフ比の頻度分布を表してい
る。結果は、血液銀行でスクリーニングされた、２０３
５の低リスク無作為血液供与者標品を用いて得た。
【図１４】図１４は、各５μｇ／ｍｌのペプチドＩＩ
Ｄ、ＩＩＩＦでコートしたプレートへのＨＣＶ特異的抗
体の結合の、様々なペプチドＩＶの濃度でのペプチドＩ
Ｖ（アナログ）による阻害を示している。
【図１５】図１５は、日本の国立予防衛生研究所の研究
者の好意により提供された７４の血液透析患者からの試
料を用いての、ペプチドに基づくＨＣＶ ＥＩＡ（１０
μｇ／ｍｌのペプチドＩＩＨと５μｇ／ｍｌのＶでコー
ト）と、組換え体タンパク質に基づくＨＣＶ ＥＩＡと
の間の比較である。
【図１６】図１６は、仮定されたＨＣＶ構造（コアもし
くはヌクレオキャプシド）タンパク質の免疫優性領域の
アミノ酸配列を示しており、４つの代表的なＨＣＶ抗体
ポジティブ血清（試料１−４）と、これらのＨＣＶペプ
チドの免疫反応性に寄与しているアミノ酸残基を正確に
なぞっている。免疫反応性は、ＥＩＡ手順により４９２
ｎｍの吸収度として測定した。
【図１７】図１７は、異なるタイプのＨＣＶペプチド
（ＩＸ）を用いた場合に図１６と同様にして得られたグ
ラフである。
【図１８】図１８は、（ａ）ＡＩＤＳ、ＡＲＣにかかっ
ている（ｎ＝６３）；（ｂ）ＨＢｓＡｇについてポジテ
ィブ（ｎ＝５０）；（ｃ）ＨＢｃタンパク質に対する抗
体についてポジティブ（ｎ＝２２）；（ｄ）上昇した
（＞１００Ｉ．Ｕ．／Ｌ）アラニンアミノトランスフェ
ラーゼ（ＡＬＴ）酵素活性をもつ（ｎ＝８６）、という
個人からの２２１の血清を、ペプチドＩＩＨ、Ｖ、ＶＩ
ＩＩＥを各々５、３、２μｇ／ｍｌで用いる様式ＣのＨ
ＣＶ ＥＩＡ様式を用いて試験した、ＨＣＶポジティブ
性の頻度分布を表すヒストグラムである。
【図１９】図１９は、ペプチドＶＩＩＩＥとＩＸＤを各
々２、２μｇ／ｍｌ用いる形式Ｄによる図１８と同様の
ヒストグラムである。
【図２０】図２０は、ペプチドＩＩＨとＶとを各々５、
３μｇ／ｍｌ用いる形式Ａによる図１８と同様のヒスト
グラムである。
【図２１】図２１は、ＨＣＶ−ＥＩＡ様式Ａ（２１−１
および２１−２）を用いて試験した、低リスク無作為供
与者標本でのＨＣＶポジティブの、カットオフに対する
シグナルの比の頻度分布を表している。結果は血液銀行
でスクリーニング試験された。
【図２２】図２２は、ＨＣＶ−ＥＩＡ様式Ｃ（図２２−
１および図２２−２）を用いて図２１と同様に得られた
グラフである。
【図２３】図２３は、ＨＣＶ−ＥＩＡ様式Ｄ（図２３−
１および図２３−２）を用いて図２１と同様にして得ら
れたグラフである。
【図２４】図２４は、ＨＣＶ感染した血液を受けた後、
血清変換したＮＡＮＢＨ患者から、１０年の期間にわた
り集められた血清試料の研究である。試料は、他の２つ
のＥＩＡ様式（ＡおよびＢと呼ばれる）と比較して、Ｃ
と呼ばれる第３番目のＥＩＡ様式（各々５、３、２μｇ
／ｍｌのペプチドＩＩＨ、Ｖ、ＶＩＩＩＥでコート）に
より試験した。
【図２５】図２５は、疾患コントロールセンター（ＣＤ
Ｃ）のブラドリー博士の好意により提供された、よく特
徴づけられたＨＣＶ株を接種された後、血清変換し、Ｎ
ＡＮＢＨにかかったチンパンジーからの血清試料に関す
る別の動態調査である。これらの試料は、ｒＤＮＡに基
づくＨＣＶ Ｃ−１００タンパク質を抗原として用いる
ＲＩＡと比較して、ＨＣＶ ＥＩＡ様式Ｃにより試験し
た。ＡＬＴレベルもまた、参考パラメーターとして各採
血ごとに示されている。
【図２６】図２６は、日本の国立予防衛生研究所の研究
者の好意により提供された血液透析患者からの試料に関
する、ｘ−ｙプロットを通した、データを並べての比較
である。結果は、ペプチドに基づくＨＣＶ ＥＩＡ様式
Ｃ（ＩＩＨ、Ｖ、ＶＩＩＩＥを各々５、３、２μｇ／ｍ
ｌで含む、構造、非構造の両方のタンパク質に由来する
ペプチドでコート）、および組換え体ＨＣＶ Ｃ−１０
０タンパク質に基づくＥＩＡを用いることにより得られ
た。
【図２７】図２７は、ＨＣＶ−ＥＩＡ様式Ｃに代えてＨ
ＣＶ−ＥＩＡ様式Ａ（ＩＩＨとＶを各々５、３μｇ／ｍ
ｌで含む非構造タンパク質の領域に由来するペプチドで
コート）を用いることによって図２６の場合と同様にし
て得られたデータを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/576 33/576 Ｚ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/18 C07K 7/08 C12P 21/08 G01N 33/53 G01N 33/576 A61K 38/00

Claims (27)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ｉ）ＨＣＶのＡＡ1709−ＡＡ1748（ペプ
    チドＩ） 並びにＨＣＶのＡＡ1734−ＡＡ1748（ペプチドＩＡ）、
    ＨＣＶのＡＡ1729−ＡＡ1748（ペプチドＩＢ）、ＨＣＶ
    のＡＡ1723−ＡＡ1748（ペプチドＩＣ）、ＨＣＶのＡＡ
    1719−ＡＡ1748（ペプチドＩＤ）及びＨＣＶのＡＡ1714
    −Ａ1748（ペプチドＩＥ）を含むそれらのセグメント； ii）ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1735（ペプチドIIＨ） 並びにＨＣＶのＡＡ1721−ＡＡ1735（ペプチドIIＡ）、
    ＨＣＶのＡＡ1716−Ａ1735（ペプチドIIＢ）、ＨＣＶの
    ＡＡ1711−ＡＡ1735（ペプチドIIＣ）、ＨＣＶのＡＡ
    1706−ＡＡ1735（ペプチドIIＤ）、ＨＣＶのＡＡ1701−
    ＡＡ1735（ペプチドIIＥ）、ＨＣＶのＡＡ1696−ＡＡ
    1735（ペプチドIIＦ）及びＨＣＶのＡＡ1694−ＡＡ1735
    （ペプチドIIＧ）を含むそれらのセグメント； iii)ＨＣＶのＡＡ1679−ＡＡ1718（ペプチドIII) 並びにＨＣＶのＡＡ1704−ＡＡ1718（ペプチドIII
    Ａ）、ＨＣＶのＡＡ1699−ＡＡ1718（ペプチドIII
    Ｂ）、ＨＣＶのＡＡ1694−ＡＡ1718（ペプチドIII
    Ｃ）、ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1718（ペプチドIII Ｄ）
    及びＨＣＶのＡＡ1684−ＡＡ1718（ペプチドIII Ｅ）を
    含むそれらのセグメント； iv）ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1728（ペプチドIV）； ｖ）ＨＣＶのＡＡ1729−ＡＡ1768（ペプチドＶ） 並びにＨＣＶのＡＡ1749−ＡＡ1768（ペプチドＶＡ）、
    ＨＣＶのＡＡ1744−ＡＡ1768（ペプチドＶＢ）、ＨＣＶ
    のＡＡ1739−ＡＡ1768（ペプチドＶＣ）及びＨＣＶのＡ
    Ａ1734−ＡＡ1768（ペプチドＶＤ）を含むそれらのセグ
    メント； vi）ＨＣＶのＡＡ1719−ＡＡ1759 (ペプチドVIＥ) 並びにＨＣＶのＡＡ1739−ＡＡ1759（ペプチドVIＡ）、
    ＨＣＶのＡＡ1734−ＡＡ1759（ペプチドVIＢ）、ＨＣＶ
    のＡＡ1729−ＡＡ1759（ペプチドVIＣ）及びＨＣＶのＡ
    Ａ1724−ＡＡ1759（ペプチドVIＤ）を含むそれらのセグ
    メント； vii)ＨＣＶのＡＡ1889−ＡＡ1931（ペプチドVII) 並びにＨＣＶのＡＡ1912−ＡＡ1931（ペプチドVII
    Ａ）、ＨＣＶのＡＡ1904−ＡＡ1931（ペプチドVII Ｂ）
    及びＨＣＶのＡＡ1896−ＡＡ1931（ペプチドVII Ｃ）を
    含むそれらのセグメント； viii）ＨＣＶのＡＡ2 −ＡＡ62（ペプチドVIIIＥ） 並びにＨＣＶのＡＡ41−ＡＡ62（ペプチドVIIIＡ）、Ｈ
    ＣＶのＡＡ31−ＡＡ62（ペプチドVIIIＢ）、ＨＣＶのＡ
    Ａ21−ＡＡ62（ペプチドVIIIＣ）、ＨＣＶのＡＡ11−Ａ
    Ａ62（ペプチドVIIIＤ）及びＨＣＶのＡＡ10−ＡＡ53を
    含むそれらのセグメント； ix）ＨＣＶのＡＡ60−ＡＡ120 （ペプチドIX） 並びにＨＣＶのＡＡ96−ＡＡ120 （ペプチドIXＡ）、Ｈ
    ＣＶのＡＡ85−ＡＡ120 （ペプチドIXＢ）、ＨＣＶのＡ
    Ａ75−ＡＡ120 （ペプチドIXＣ）及びＨＣＶのＡＡ65−
    ＡＡ120 （ペプチドIXＤ）を含むそれらのセグメント： からなる群から選択されるペプチド。
  2. 【請求項２】 モノ、トリ又はヘプタリシンコア上の、
    請求項１で定義されるペプチド若しくはそれらのセグメ
    ントの分枝状二量体、四量体又は八量体を含み、かつ、
    ＨＣＶに対する抗体に対して特異的免疫反応性を有する
    ポリマー。
  3. 【請求項３】 担体タンパク質と複合体となっている請
    求項１で定義されるペプチド若しくはそのセグメントを
    含み、かつ、ＨＣＶに対する抗体に対して特異的免疫反
    応性を有する複合体。
  4. 【請求項４】 請求項１で定義されるペプチド若しくは
    そのセグメント、又は請求項２で定義されるポリマー、
    又は請求項３で定義される複合体を含む、被験体中のＨ
    ＣＶに対する抗体を検出するための組成物。
  5. 【請求項５】 ペプチドがＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1735
    （ペプチドIIＨ）又は請求項１で定義されるそのセグメ
    ントである請求項４に記載の組成物。
  6. 【請求項６】 ペプチドがＨＣＶのＡＡ1679−ＡＡ1718
    （ペプチドIII)のセグメントを含み、かつ、 ｉ）ＨＣＶのＡＡ1694−ＡＡ1718（ペプチドIII Ｃ） ii）ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1718（ペプチドIII Ｄ） iii)ＨＣＶのＡＡ1684−ＡＡ1718（ペプチドIII Ｅ）： からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求
    項４に記載の組成物。
  7. 【請求項７】 ペプチドがＨＣＶのＡＡ2 −ＡＡ62（ペ
    プチドVIIIＥ）のセグメントを含み、かつ、 ｉ）ＨＣＶのＡＡ11−ＡＡ62（ペプチドVIIIＤ） ii）ＨＣＶのＡＡ21−ＡＡ62（ペプチドVIIIＣ） iii)ＨＣＶのＡＡ31−ＡＡ62（ペプチドVIIIＢ） iv）ＨＣＶのＡＡ41−ＡＡ62（ペプチドVIIIＡ）： からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求
    項４に記載の組成物。
  8. 【請求項８】 ペプチドがＨＣＶのＡＡ60−ＡＡ120(ペ
    プチドIX）のセグメントを含み、かつ、 ｉ）ＨＣＶのＡＡ65−ＡＡ120 （ペプチドIXＤ） ii）ＨＣＶのＡＡ75−ＡＡ120 （ペプチドIXＣ） iii)ＨＣＶのＡＡ85−ＡＡ120 （ペプチドIXＢ） iv）ＨＣＶのＡＡ95−ＡＡ120 （ペプチドIXＡ）： からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求
    項４に記載の組成物。
  9. 【請求項９】 ペプチドが以下のアミノ酸配列： Ser-Thr-Ile-Pro-Lys-Pro-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Arg- Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-PrO-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro- Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu- Pro-Arg-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Ala-Thr- Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Arg- Arg-X （ここでＸは−ＯＨ又は−ＮＨ2 である）を有する、請
    求項４に記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 ペプチドが以下のアミノ酸配列： Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Val-Arg- Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Thr-Trp-Ala-Gln-Pro- Gly-Tyr-Pro-Trp-Pro-Leu-Tyr-Gly-Asn-Glu- Gly-Cys-Gly-Trp-Ala-Gly-Trp-Leu-Leu-Ser- Pro-Arg-Gly-Ser-Arg-Pro-Ser-Trp-Gly-Pro- Thr-Asp-Pro-Arg-Arg-Arg-Ser-Arg-Asn-Leu- Gly-X; （ここで、Ｘは−ＯＨ又は−ＮＨ2 である）を有する、
    請求項４に記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 ｉ）請求項４に記載の組成物でコート
    されている固相； ii）ネガティブコントロールサンプル； iii)不活化されているＨＣＶポジティブコントロールサ
    ンプル； iv）標本希釈液； ｖ）酵素標識したヒトＩｇＧに対する抗体；及び vi）酵素基質： を含む、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）又は非Ａ非Ｂ肝炎
    ウィルス（ＮＡＮＢＨＶ）に対する抗体の検出のための
    酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）テストキッ
    ト。
  12. 【請求項１２】 固相が、 ｉ）ＨＣＶのＡＡ1711−ＡＡ1735 ii）ＨＣＶのＡＡ1706−ＡＡ1735 iii)ＨＣＶのＡＡ1701−ＡＡ1735 iv）ＨＣＶのＡＡ1696−ＡＡ1735 ｖ）ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1735： からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチ
    ドIIＨのセグメントを含むペプチド組成物でコートされ
    ている、請求項１１に記載のＥＬＩＳＡテストキット。
  13. 【請求項１３】 固相がアミノ酸配列ＨＣＶのＡＡ1689
    −ＡＡ1735を有するペプチドでコートされている、請求
    項１１に記載のＥＬＩＳＡテストキット。
  14. 【請求項１４】 固相が、 ｉ）ＨＣＶのＡＡ1694−ＡＡ1718 ii）ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1718 iii)ＨＣＶのＡＡ1684−ＡＡ1718： からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＨＣ
    ＶのＡＡ1679−ＡＡ1718（ペプチドIII)のセグメントを
    含むペプチド組成物でコートされている、請求項１１に
    記載のＥＬＩＳＡテストキット。
  15. 【請求項１５】 ペプチドIII のセグメントが、 ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1718： のアミノ酸配列を有している、請求項１４に記載のＥＬ
    ＩＳＡテストキット。
  16. 【請求項１６】 固相が、 ｉ）ＨＣＶのＡＡ11−ＡＡ62 ii）ＨＣＶのＡＡ21−ＡＡ62 iii)ＨＣＶのＡＡ31−ＡＡ62 iv）ＨＣＶのＡＡ41−ＡＡ62： からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチ
    ドVIIIのセグメントを含むペプチド組成物でコートされ
    ている、請求項１１に記載のＥＬＩＳＡテストキット。
  17. 【請求項１７】 固相が、 ｉ）ＨＣＶのＡＡ65−ＡＡ120 ii）ＨＣＶのＡＡ75−ＡＡ120 iii)ＨＣＶのＡＡ85−ＡＡ120 iv）ＨＣＶのＡＡ96−ＡＡ120 ： からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチ
    ドIXのセグメントを含むペプチド組成物でコートされて
    いる、請求項１１に記載のＥＬＩＳＡテストキット。
  18. 【請求項１８】 固相がアミノ酸配列ＨＣＶのＡＡ2 −
    ＡＡ62を有するペプチドを含むペプチド組成物でコート
    されている、請求項１１に記載のＥＬＩＳＡテストキッ
    ト。
  19. 【請求項１９】 固相がアミノ酸配列ＨＣＶのＡＡ60−
    ＡＡ120 を有するペプチドを含むペプチド組成物でコー
    トされている、請求項１１に記載のＥＬＩＳＡテストキ
    ット。
  20. 【請求項２０】 固相が、それぞれ以下のアミノ酸配
    列： ｉ）ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1735（ペプチドIIＨ） ii）ＨＣＶのＡＡ1729−ＡＡ1768（ペプチドＶ）： を有するペプチドIIＨ及びＶの混合物を含むペプチド組
    成物でコートされている、請求項１１に記載のＥＬＩＳ
    Ａテストキット。
  21. 【請求項２１】 固相が、それぞれ以下のアミノ酸配
    列： ｉ）ＨＣＶのＡＡ1696−ＡＡ1735（ペプチドIIＦ） ii）ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1718（ペプチドIII Ｄ） iii)ＨＣＶのＡＡ1729−ＡＡ1768（ペプチドＶ）： を有するペプチドIIＦ、III Ｄ及びＶの混合物を含むペ
    プチド組成物でコートされている、請求項１１に記載の
    ＥＬＩＳＡテストキット。
  22. 【請求項２２】 固相が、それぞれ以下のアミノ酸配
    列： ｉ）ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1735（ペプチドIIＨ） ii）ＨＣＶのＡＡ1729−ＡＡ1768（ペプチドＶ） iii)ＨＣＶのＡＡ2 −ＡＡ62（ペプチドVIIIＥ）： を有するペプチドIIＨ、Ｖ及びVIIIＥの混合物を含むペ
    プチド組成物でコートされている、請求項１１に記載の
    ＥＬＩＳＡテストキット。
  23. 【請求項２３】 固相が、それぞれ以下のアミノ酸配
    列： ｉ）ＨＣＶのＡＡ2 −ＡＡ62（ペプチドVIIIＥ） ii）ＨＣＶのＡＡ65−ＡＡ120 （ペプチドIXＤ）： を有するペプチドVIIIＥ及びIXＤの混合物を含むペプチ
    ド組成物でコートされている、請求項１１に記載のＥＬ
    ＩＳＡテストキット。
  24. 【請求項２４】 ｉ）ＨＣＶのＡＡ1709−ＡＡ1748（ペ
    プチドＩ） 並びにＨＣＶのＡＡ1734−ＡＡ1748（ペプチドＩＡ）、
    ＨＣＶのＡＡ1729−ＡＡ1748（ペプチドＩＢ）、ＨＣＶ
    のＡＡ1723−ＡＡ1748（ペプチドＩＣ）、ＨＣＶのＡＡ
    1719−ＡＡ1748（ペプチドＩＤ）及びＨＣＶのＡＡ1714
    −ＡＡ1748（ペプチドＩＥ）を含むそれらのセグメン
    ト； ii）ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1735（ペプチドIIＨ） 並びにＨＣＶのＡＡ1721−ＡＡ1735（ペプチドIIＡ）、
    ＨＣＶのＡＡ1716−ＡＡ1735（ペプチドIIＢ）、ＨＣＶ
    のＡＡ1711−ＡＡ1735（ペプチドIIＣ）、ＨＣＶのＡＡ
    1706−ＡＡ1735（ペプチドIIＤ）、ＨＣＶのＡＡ1701−
    ＡＡ1735（ペプチドIIＥ）、ＨＣＶのＡＡ1696−ＡＡ
    1735（ペプチドIIＦ）及びＨＣＶのＡＡ1694−ＡＡ1735
    （ペプチドIIＧ）を含むそれらのセグメント； iii)ＨＣＶのＡＡ1679−ＡＡ1718（ペプチドIII) 並びにＨＣＶのＡＡ1704−ＡＡ1718（ペプチドIII
    Ａ）、ＨＣＶのＡＡ1699−ＡＡ1718（ペプチドIII
    Ｂ）、ＨＣＶのＡＡ1694−ＡＡ1718（ペプチドIII
    Ｃ）、ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1718（ペプチドIII Ｄ）
    及びＨＣＶのＡＡ1684−ＡＡ1718（ペプチドIII Ｅ）を
    含むそれらのセグメント； iv）ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1728（ペプチドIV）； ｖ）ＨＣＶのＡＡ1729−ＡＡ1768（ペプチドＶ） 並びにＨＣＶのＡＡ1749−ＡＡ1768（ペプチドＶＡ）、
    ＨＣＶのＡＡ1744−ＡＡ1768（ペプチドＶＢ）、ＨＣＶ
    のＡＡ1739−ＡＡ1768（ペプチドＶＣ）及びＨＣＶのＡ
    Ａ1734−ＡＡ1768（ペプチドＶＤ）を含むそれらのセグ
    メント； vi）ＨＣＶのＡＡ1719−ＡＡ1759 (ペプチドVIＥ） 並びにＨＣＶのＡＡ1739−ＡＡ1759 (ペプチドVIＡ）、
    ＨＣＶのＡＡ1734−ＡＡ1759（ペプチドVIＢ）、ＨＣＶ
    のＡＡ1729−ＡＡ1759（ペプチドVIＣ）及びＨＣＶのＡ
    Ａ1724−ＡＡ1759（ペプチドVIＤ）を含むそれらのセグ
    メント； vii)ＨＣＶのＡＡ1889 ＡＡ1931（ペプチドVII) 並びにＨＣＶのＡＡ1912−ＡＡ1931（ペプチドVII
    Ａ）、ＨＣＶのＡＡ1904−ＡＡ1931（ペプチドVII Ｂ）
    及びＨＣＶのＡＡ1896−ＡＡ1931（ペプチドVII Ｃ）を
    含むそれらのセグメント； viii）ＨＣＶのＡＡ2 −ＡＡ62（ペプチドVIIIＥ） 並びにＨＣＶのＡＡ41−ＡＡ62（ペプチドVIIIＡ）、Ｈ
    ＣＶのＡＡ31−ＡＡ62（ペプチドVIIIＢ）、ＨＣＶのＡ
    Ａ21−ＡＡ62（ペプチドVIIIＣ）、ＨＣＶのＡＡ11−Ａ
    Ａ62（ペプチドVIIIＤ）及びＨＣＶのＡＡ10−ＡＡ53を
    含むそれらのセグメント； ix）ＨＣＶのＡＡ60−ＡＡ120 （ペプチドIX） 並びにＨＣＶのＡＡ96−ＡＡ120 （ペプチドIXＡ）、Ｈ
    ＣＶのＡＡ85−ＡＡ120 （ペプチドIXＢ）、ＨＣＶのＡ
    Ａ75−ＡＡ120 （ペプチドIXＣ）及びＨＣＶのＡＡ65−
    ＡＡ120 （ペプチドIXＤ）を含むそれらのセグメント； 或いはそれらのいかなるものであってもよい組合せ； ｘ）ネガティブコントロールサンプル； xi）不活化されたＨＣＶポジティブコントロールサンプ
    ル； xii)標本希釈液； xiii）酵素標識したヒトＩｇＧに対する抗体；及び xiv)酵素基質： を含む、ＨＣＶ若しくはＮＡＮＢＨＶに対する抗体の検
    出又はＨＣＶ若しくはＮＡＮＢＨＶ感染の診断のための
    ＥＬＩＳＡテストキット。
  25. 【請求項２５】 ｉ）ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1735（ペ
    プチドIIＨ） ＨＣＶのＡＡ1729−ＡＡ1768（ペプチドＶ）： を含むペプチド組成物でコートされた固相 ii）ネガティブコントロールサンプル； iii)不活化されたＨＣＶポジティブコントロールサンプ
    ル； iv）標本希釈液； ｖ）酵素標識されたヒトＩｇＧに対する抗体；及び vi）酵素基質： を含む、ＨＣＶ若しくはＮＡＮＢＨＶに対する抗体の検
    出又はＨＣＶ若しくはＮＡＮＢＨＶ感染の診断のための
    ＥＬＩＳＡテストキット。
  26. 【請求項２６】 ｉ）ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1735（ペ
    プチドIIＨ） ＨＣＶのＡＡ2 −ＡＡ62（ペプチドVIII）： を含むペプチド組成物でコートされた固相 ii）ネガティブコントロールサンプル； iii)不活化されたＨＣＶポジティブコントロールサンプ
    ル； iv）標本希釈液； ｖ）酵素標識されたヒトＩｇＧに対する抗体；及び vi）酵素基質： を含む、ＨＣＶ若しくはＮＡＮＢＨＶに対する抗体の検
    出又はＨＣＶ若しくはＮＡＮＢＨＶ感染の診断のための
    ＥＬＩＳＡテストキット。
  27. 【請求項２７】 ｉ）ＨＣＶのＡＡ1689−ＡＡ1735（ペ
    プチドIIＨ） ＨＣＶのＡＡ1729−ＡＡ1768（ペプチドＶ） ＨＣＶのＡＡ2 −ＡＡ62（ペプチドIII)： を含むペプチド組成物でコートされた固相 ii）ネガティブコントロールサンプル； iii)不活化されたＨＣＶポジティブコントロールサンプ
    ル； iv）標本希釈液； ｖ）酵素標識されたヒトＩｇＧに対する抗体；及び vi）酵素基質： を含む、ＨＣＶ若しくはＮＡＮＢＨＶに対する抗体の検
    出又はＨＣＶ若しくはＮＡＮＢＨＶ感染の診断のための
    ＥＬＩＳＡテストキット。
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