JPH04501203A

JPH04501203A - 後―輸血性，非―ａ，非―ｂ型肝炎ウィルス及び抗原

Info

Publication number: JPH04501203A
Application number: JP1508518A
Authority: JP
Inventors: レイズ，グレゴリー　アール．; ブラッドリー，ダニエル　ダブリュ．; ラビン，リンダ; フライ，カーク　イー．
Original assignee: ジェネラブズ　インコーポレイティド; アメリカ合衆国
Priority date: 1988-07-06
Filing date: 1989-06-28
Publication date: 1992-03-05
Also published as: AU4046489A; WO1990000597A1; EP0423239A1; EP0423239A4; CN1041005A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ’　−、−Ａ、　−Ｂ　ニウィルス　び′する　のクロス・リファレンス本出願は、１９８６年４月１に出願されたアメリカ特許出願第８４６、７５７号の一部継続出願である、１９８８年７月６日に出願されたアメリカ特許出願第２１５．７２８号の一部継続出願である、１９８８年８月４日に出願されたアメリカ特許出願第２２８，３３４号の一部継続出願である、１９８９年４月６日に出願されたアメリカ特許出願第３３４．７０１号の一部継続出願である、１９８９年５月１１日に出願されたアメリカ特許出願第３５０．５７０号の一部継続出願である。

序−一一一一一輪葺土公立本発明は、後−輸血性非−Ａ、非−Ｂ　（ＰＴ−ＮＡＮＢ）型肝炎に関連するウィルス、組換え方法により生成されたＰＴ　−ＮＡＮＢ抗原及びＰＴ　−ＮＡＮＢ肝炎に対するワクチンに関連する生成物及び方法、その診断及び予防に関する。

■−員急性ウィルス肝炎は、肝臓に影響を及ぼす有力的な病状を伴う全身性感染である。肝炎を引き起こす５種の型のウィルスが存在することが知られている＝Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）　、後−輸血性（ＰＴ）及び腸伝染（ＥＴ）　、非−Ａ、非−Ｂ　（ＮＡＮＢ）型肝炎物質及びＨＢＶ−関連デルタウィルス。特定のウィルス物質は、ＨＡＶ、　ＨＢＶ及びデルタウィルスに関連している。しがしながら、ＰＴ　−ＮＡＮＢ肝炎に関連する物質を報告する多くの出版物にもかがゎらず、原因物質は同定されていないように思える。

Ｈａｒｒｉｓｏｎ、　Ｐｒ旦ユ胆旦ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｔｃｉｎｅ、第１１版（１９Ｂ？）は、ウィルス又はウィルス抗原は明確に同定されているとは言及されていないけれども、少なくとも２種の異なった血液発生ＮＡＮＢ肝炎物質が存在することを報告する。

抗−ＨＢＶ抗体及びＨＢＶ抗原（ＨＢｓＡｇ）についての血液供与体の通常のスクリーニングは、血液の輸血の後、Ｂ型肝炎の発注を滅じたが、しかしＮＡＮＢ肝炎物質による感染にょる後−輸血性ＰＴ肝炎は、ＰＴ　−ＮＡＮＢ肝炎物質を同定するための許容できる血清学的なスクリーニング試験の欠乏のためにまだ有意な問題である。ワクチン及び診断に使用するために安全である組換えタンパク質を生成するために新規ウィルスの同定及びそのつ、イルスから得られる遺伝子情報の使用が、安全な血液供給の進歩において主な目的である。

聚迷文献ＰＴ　−ＮＡＮＢウィルス及び抗原はこれまで報告されている。たとえばアメリカ特許第４，４６４，４７４号及び第４．５４２．０１６号を参照のこと、　ＰＴ−ＮＡＮＢウィルスはトガウィルスであると報告されている。たとえばアメリカ特許第４．４６４．４７４号を参照のこと。Ｃ型肝炎ウィルスとして同定される肝炎ウィルス遺伝子の遺伝子工学が、ヨーロッパ特許出願第８８３１０９２２．５号（出願番号第０３１８２１６号）に報告されている。

主コＬ■」Ｌ封本発明によれば、ＰＴ　−ＮＡＮＢ肝炎に関連するウィルス粒子及びそれらに由来するゲノム物質を含んで成る単離物並びにそれらの調製及び使用方法が提供される。ウィルス粒子は、ＮＡＮＢ肝炎に対して敏感な細胞から得られ；敏感な宿主にＮＡＮＢ肝炎を引き起こすことができ；そしてウィルスによる感染に敏感な細胞にＮＡＮＢウィルス特異性抗原の発現を誘導することができるものとして特徴づけられる。ウィルス粒子は、診断のためのポリヌクレオチドプローブ並びに治療及び診断適用のための抗原及びワクチンを調製するためにゲノム物質の源として使用され得る。インビトロでのウィルス粒子の増殖は、ウィルス特異性細胞表面抗原を同定するために及びそのような抗原の源として使用され得る０弱化された又は不活性化されたウィルス粒子は、ワクチンとして使用され得る。

図面の簡単な説明第１図は、クローン＃３ｏに由来するＰＴ−ＮＡＮＢウィルスのフラグメントを示す。上部の列は、下部の列に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を表わす。

第２図は、λｇｔ−１１クローンＰＴ−２に由来するＰＴ−ＮＡＮＢウィルスのフラグメントを示す。略語は第１図におけるのと同じである。

第３図は、λｇｔ−１１クローンＰＴ−８に由来するＰＴ　−ＮＡＮＢウィルスのフラグメントを示す。略語は第１図におけるのと同じである。

第４図は、λｇｔ−１１クローンＰＴ−１９に由来するＰＴ−ＮＡＮＢウィルスのフラグメントを示す。略語は第１図におけるのと同じである。

第５図は、ＰＴ　−ＮＡＮＢウィルス遺伝子物質の一連の７種のフラグメントを示す。ｃＤＮＡ配列のみがこの図に示されている。

豊定豊里櫃■ｎ監本発明は、明白に同定されたウィルス遺伝子物質及び後−輸血性非−Ａ、非−Ｂ　（ＮＡＮＢ）型肝炎に関連するウィルス粒子の源を提供する。ウィルス粒子は、ウィルス粒子を含むと思われるサンプル、たとえば感染されたヒト及び他の類人種の血清から浮遊密度に基づいての分別により及びＮＡＮＢウィルスによる感染に敏感な細胞、たとえば肝細胞から得られる。ウィルス粒子単離体は、診断のためにプリーブを、治療及び診断目的のために抗原及びワクチンを調製するためにゲノム物質の源として直接使用され得、又はそれらは敏感な細胞系、たとえばヒト肝細胞を含んで成るトリオマ（ｔｒｉｏｍａ）において増殖せしめられ得る。感染された細胞は、ウィルス粒子の源として又はＮＡＮＢウィルス特異性抗体又は抗原を同定するために及びそのような抗原の源として使用され得る。

ウィルス粒子は、感染されたヒト又は他の感染された源、たとえばチンパンジー、血漿又はＮＡＮＢウィルスによる感染に敏感な他の細胞、たとえば肝細胞から得られる。ウィルスゲノム物質を得るためには、生物学的サンプルが遠心分離され、そしてサンプル中のウィルス粒子がらウィルスＲＮＡが抽出される。他方、ウィルス粒子を含んで成る精製された両分は、密度グラジェント、たとえばスクロース密度グラジェント上でのサンプルの分別により得られる。約１．０７〜約１．１３ｇｍ　／　ｃｄ　。

好ましくは１．０９〜１．１１ｇｍ／ｃｄの浮遊密度を有する両分が集められる。次にウィルス粒子を含んで成る両分が抽出され、そしてｃＤＮＡクローンがウィルスＲＮＡがら調製される。ウィルスは、第１〜５図に示される少な（とも１種のｃＤＮＡ配列を得るために逆転写され得るＲＮＡ配列を含んで成るゲノムを有するものとしてさらに特徴づけられる。これらのすべての配列は、ＰＴ　ＮＡＮＤにより感染されたヒト又はチンパンジーから単離されたウィルス遺伝子物質に由来する。たとえば第５図に示される初めの５種の配列は、ヒトから得られたウィルスに由来する。これらの配列はウィルスゲノムの異なったセグメントに由来し、そして無関係であるように思える。第５図に示される最後の２種の配列は、感染されたチンパンジーから得られたウィルスに由来する。これらのすべての配列は、これまで知られているＮＡＮＢ配列、たとえば公開されたヨーロッパ特許出願第０３１８２１６号（Ｃ型肝炎ウィルスセグメントを同定するものとして上記に言及された）に開示される配列とは異なるように思える。

上記配列からのヌクレオチドの配列のいづれかが、ウィルス核酸を検出し又は調節するためにプローブ又はプライマーとして使用され得る。そのようなプローブは、全体の配列よりも相当に短かいが、しかし長さは少なくとも１６個のヌクレオチドであるべきである。長さ２０〜５００、特に３０〜２００個のヌクレオチドからの中間オリゴヌクレオチドは特に特異的且つ２．速に作用するプローブを提供する。より長いオリゴヌクレオチド、たとえば遺伝子の完全な長さまでのオリゴヌクレオチドもまた有用である。ＲＮＡ及びＤＮＡプローブの両者が使用され得る。さらに、少なくとも８個、通常中なくとも１２個のアミノ酸配列、便利には少なくとも２０個のアミノ酸配列が、診断試薬、ワクチンの産生、抗体の産生、血清からの抗体の単離又は同様のことのためのエピトープ部位、免疫優性配列、ヘプテン又は同様のものとして使用され得る。普通、単離されたペプチドは、約１２５個よりも少ないアミノ酸、時々約１００個よりも少ないアミノ酸であろう。両親媒性配列又はＲｏｔｈｂａｒｄのアルゴリズムを満たす配列、たとえばＣ−Ｖ−Ｖ−Ｙ−Ｄ−Ｎ−Ｄ−Ｄ又はＥ−Ｐ−Ｖ−Ｎ−Ｐ−に−Ｄ−Ｐが使用され得る。

ウィルス配列と相同の配列がハイブリダイズし、そしてＭａｎｉ、ａｔ、１ｓ７ｊｃ！：”、＋　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎＬ〕Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ。

ＣｏｍｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｒｉｇ　Ｈａｒｂｏｒ＋　ＮＹ＋１９８２．３３２ページにおいてＲＮＡを検出し／ハイブリダイズせしめるために記載される条件下で検出できる。また、ＤＮＡハイブリダイゼーション条件のためには、３２４〜３２８ページ、特に３２５ページの第６段落を参照のこと。

遺伝子物質（ｃＤＮＡとして）の有意な配列は完全に同定されているので、合成化学によりこの天然の配列に一部又は全体的に基づいて種々のＤＮＡ及びＲＮＡ配列を生成することが可能であり、この後この得られた配列は既知の組換えＤＮＡ技法を用いて多（の利用できるＤＮＡベクターのいづれか中に挿入され得る。

従って、本発明は、自由に利用できる試薬、プラスミド及び微生物を用いて実施され得る。

たとえば、長さ１００個よりも多いヌクレオチド配列は、たとえばむ±状江」直れ鱈ｙ１邦コα咀、１１月／１２月、１９８４．３ページの広告により明らかなようにＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ　Ｍｏｄｅ１３Ｂ０Ａ　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒに基づいて容易に合成され得る。そのようなオリゴヌクレオチドは、オーバーラツプする相補的配列（たとえばコード鎖の１〜１００、相補的鎖００〜５０及び５１〜１５０、コード鎖の１０１〜２００、等）を調製する技法を用いて容易にスプライシングされ得、続いてハイブリダイズされ、そして鎖を連結される。

さらに、本明細書に開示されるペプチドのいづれかの直接的な合成を容易に利用できるようにする自動装置がまた利用できる。上記む朋復旦１旺旦朋ｊ」Ｌ肚懸の同じ版において、９９％以上の結合効力を有する商業的に入手できる自動ペプチド合成機が報告されている（３４ページ）。そのような装置は、直接的な合成又は他の既知の技法を用いて結合され得る一連のフラグメントの合成により本発明のペプチドに容易に接近できるようにする。

第１〜５図に示される特定のポリペプチド配列の他に、これらの配列に基づくペプチド配列及びそのマイナーな変異体を表わすフラグメントは、種々のペプチドの生物学的活性を有するであろう。たとえば、ＮＡＮＢ肝炎に対して特異的な免疫グロブリンにより認識され得る、その与えられたペプチド配列のフラグメントは、容易に調製され、そしてスクリーンされ得る。ペプチド合成機は、小さなポリペプチドフラグメント（たとえば１００個以上のアミノ酸）を調製するために使用され得、又は遺伝子工学の技法は大きなフラグメントを調製するために使用され得る。適切なポリペプチドフラグメントを同定する単純なスクリーニング方法は、全体のコードす、る抗原に対するモノクローナル抗体を調製し、アフィニティーカラムに前記抗体を結合せしめ、そしてその結合された抗体により保持されるペプチドフラグメントを捕獲することから成る。ポリクローナル抗血清が、所望によりモノクローナル抗体の代わりに使用され得る。この技法の適合性慝実験的に示されている。

大きなタンパク質から適切な免疫学的活性フラグメントを調製し、そして選択する能力は当業界において良く知られており、そして多くの出版物及び特許に記載されてし）る。たとえば、ウィルスタンパク質の免疫学的に活性的であるフラグメントの調製法を記載するアメリカ特許第４，６２９，７８３号を参照のこと。

１つの共通する変法は、融合されたタン）＜り質の形での本発明のポリペプチドの調製である。そのようなペプチドは、典型的には、宿主に発現されることが知られてし）る遺伝子のプロモーター領域を用いて、そして宿主タンノくり質のための遺伝子配列中に本発明のアミノ酸配列のすべて又番よ主要部分をコードするヌクレオチドを挿入することによって調製される。そのような融合されたタンパク質の例は、下記で論議されるβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を包含する。

免疫学的活性ペプチドフラグメントを調製するためのもう１つの技法は、長さ５〜１００個のアミノ酸（又はいづれかの介在の長さ、たとえば１０　、１５又はこの範囲においては２，３又は５の倍数）の一連のアミノ酸を合成し、そして抗血清（又はモノクローナル抗体）を用いて免疫学的活性についてスクリーンすることである。フラグメントは、交叉反応性を最適にするためにペプチドの全体の長さにそって選択される（たとえば長さ２０個のアミノ酸の一連のペプチド及びＡＡ＋−ＡＡＺ。、ＡＡｓ　ＡＡｔｓ　、　ＡＡＩＯＡＡ３゜、等を含んで成る）０次に、選択されたフラグメントは、本発明において記載されるように使用するために、組換え技法により多量のペプチドを生成するために使用され得る特に有用な対応するヌクレオチド配列に相当する。

さらに、前で述べたペプチド及びＤＮＡ分子のマイナーな変化はまた、当業者によって正しく評価されるであろう場合、より詳細に示されるそれらのペプチド及びＤＮＡ分子に相当するように思われる。たとえば、ロイシンのイソロイシン又はバリンとの単離された置換、アスバーテートのグルタメートとの置換、トレオニンのセリンとの置換、システィンのセリン又はアラニンとの置換又はアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸との類似する置換（すなわち保存的な置換）は、特にその置換が結合部位又は生物学的活性の他の部位でのアミノ酸を包含しない場合、得られる分子の生物学的活性に対して主な効果を有さないであろうことを予期することは道理的である。変化が官能的なペプチドをもたらすかどうかは、免疫原特異性に依存する免疫化又は診断試験において機能についての直接的な分析により容易に決定され得る。この方法の例は後で詳細に記載される。１個以上の置換が生じる場合のペプチドは、同じ方法で容易に試験され得る。好ましいペプチドは、２０個のアミノ酸の隣接する群において１２個よりも多くない、より好ましくは５個よりも多くないアミノ酸で異なる。アミノ酸の標準の保存群は、１文字のアミノ酸コードを用いてかっこで示されている：非極性（Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ。

Ｍ）；芳香族（Ｆ、Ｔ、Ｗ）ｉ負荷されていない極性（ｃ。

Ｓ、Ｔ、Ｃ，Ｎ、Ｑ）；酸性ＣＤ、Ｅ）；塩基性（Ｋ　、　Ｒ。

Ｈ）。芳香族群は、時々、より広い定義の非極性（Ｆ、Ｗ）又は負荷されていない極性（Ｔ）群に属すると思われる。

そのようなペプチドをコードする他のＤＮＡ分子は、第１表におけるコドンの列挙から容易に決定され得、そして同様に、第１〜５図のＤＮＡ配列に相当するように思われる。ペプチドにおけるＤＮＡコドンとアミノ酸との間で一定の関係が存在するので、ペプチドにおける置換又は他の変化のこの適用における論議は、その対応するＤＮＡ配列又はその配列が位置するＤＮＡ分子、組換えベクター又は形質転換された微生物に同様に適用できる（そして逆もまた同様である）。

遺伝子コード１ＰＨＥ　ＳＵＲＴＹＲＣＹＳ　ＵＰＨＥ　ＳＥＲＴＹＲＣＹＳ　ＣＵ　ＬＥＵ　ＳＥＲ５ｔｏｐ　５ｔｏｐ　ＡＬＥＵ　ＰＲＯ１（Ｉｓ　ＡＲＧ　ＵＬＥＤ　ＰＲＯＨＩＳ　ＡＲＧ　ＣＣＬＥＵ　ＰＲＯＧＬＮ　ＡＲＧ　ＡＩＬＥ　ＴＨＲＡＳＮ　ＳＥＲＵＩＬＥ　ＴＨＲＡＳＮ　ＳＥＲＣＡ　ＩＬＥ　ＴＨＲＬＹＳ　ＡＲＧ　ＡＶＡＬ　ＡＬＡ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＵＶＡＬ　ＡＬＡ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＣＧ　ＶＡＬ　ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＧＬＹ　Ａ第１〜５図に列挙される特定のヌクレオチド配列の他に、本発明のＤＮＡ　（又は対応するＲＮＡ）分子は特別に列挙されるそれらの前後に追加のヌクレオチドを有することができる。たとえば、ポリＡはｃＤＮＡの３′−末端に付加され得、短い（たとえば２０個よりも少ないヌクレオチド）配列は制限エンドヌクレアーゼ部位に対応する末端配列を付与するためにいづれかの末端に付加され得、停止コドンは翻訳を停止せしめるためにペプチド配列に続くことができ、そして同様のことが存在する。さらに、遺伝子から上流にプロモーター領域又は他の制御領域を含むＤＮＡ分子が調製され得る。本発明の配列を含むすべてのＤＮＡ分子は少なくとも１つの目的のために有用であろう。なぜならば、すべてはオリゴヌクレオチドプローブを生成するために最小にフラグメント化され得、そして生物学的源からのＰＴ　ＮＡＮＢ特異的核酸配列の単離又は検出に有用であるからである。

本発明のペプチドは、初めに相同調製物として、直接的な合成により又は本明細書に記載されるようなりローン化された遺伝子又はそのフラグメントを用いることによって調製され得る。　“相同”とは、ペプチド又はＤＮＡ配列を言及する場合、組成物に存在する実質的にすべての分子の一次分子構造（すなわちアミノ酸又はヌクレオチドの配列）が同一であることを意味する。前記の用語“実質的 ”とは、少なくとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９９重量％及び最つとも好ましくは少な（とも９９．８重量％であることを意味する。相同ペプチド又はＤＮＡ配列の完全な分子に由来するフラグメントの存在は、たった５重量％、好ましくは１重量％及びより好ましくは０．２重量％で存在する場合、相同性を決定する事において考慮されるべきでない。なぜならば、用語“相同”とは、類似する分子量のいくつかの分子が存在するが、しかしそれらの−次分子構造において異なる混合物に対立するものとして単一の定義された構造を有する完全な分子（及びそのフラグメント）の存在を言及するからである。

本明細書に使用される場合、用語“単離された”とは、他のペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡからそれぞれ分離され、そして単に溶媒、緩衝液、イオン又は前記物質の生化学溶液に通常存在する他の成分の存在において見出される純粋なペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡを言及する。“′単離された”とは、天然の状態での天然の物質又は成分に分離されている（たとえばアクリルアミドゲルで）が、しかし純粋な物質として又は溶液として得られていない天然の物質のいづれも包含しない。

用語“純粋°′とは好ましくは、上記の“実質的”と同じ数値限界を有する。本明細書に使用される場合、“により置換された”又は“置換”とは、起こるべき作用を必ずしも言及しないが、しかし指摘された“置換“アミノ酸が異なった式に存在することが示されているアミノ酸と同じ位置に存在する場合、存在するペプチドを言及する必要がある。

本明細書に記載される生物学的分子のいづれかの塩は、そのような分子が種々のｐＨの水溶液に存在する（又はその水溶液から単離される）場合、天然に存在するであろう。指摘された生物学的活性を有する分子のすべての塩は、本発明の範回内にあると思われる。ペプチドと先に存在することができる塩の例は、カルボン酸残基のアルカリ、アルカリ土類及び他の金属塩、アミノ残基の酸付加塩（たとえばＨＣｊり及び同じ分子内でのカルボン酸とアミノ残基との間での反応により形成される双性イオンを包含する。

本発明は、第１〜５図及び第１表に列挙される可能性あるコドン選択に基づいての組合せを選択することによって製造され得る個々のポリヌクレオチド及びポリペプチドのあらゆる可能性ある変化を特に言及し、そしてすべてのそのような変化は特別に開示されたものとして考慮されるべきである。

冗長性を回避するために、そのような変化は本明細書においては示されない。

遺伝子及び対応するタンパク質は上記で論ぜられた完全な合成技法により調製され得るが、本発明の好ましい態様においては、遺伝子情報は本明細書に記載されているようにして天然源から得られ、そして同定される。遺伝子物質はまず、多くの存在する技法のいづれかを用いて、遺伝子ライブラリーの形で得られる。初めに、ゲノムＤＮＡをランダムに切断し、そしてこの切断された物質を発現ベクター、たとえばλｇｔｌｌ中に挿入する。十分な組換え体が生成される場合、対象の抗原に対応する融合タンパク質を発現する少なくとも１種の組換え体をその集団中に有する良好な可能性が存在する。

実際、本発明のウィルスの大きさのゲノム（ＤＮＡとして約１０ｋｂｐ）に関しては、少なくとも約６Ｘ１０”個の独立した組換え体が必要とされる。これは、完全なゲノムが１００ｂｐの平均挿入体サイズを有する組換え体により表わされることを可能にし、ここで少なくとも１つの挿入体はいづれが１０塩基対領域内に存在するその末端の１つの末端と共に存在するであろう、正しい配向及び正しい読み枠で６回のそのような挿入のうち１回の挿入のみを可能にする場合、官能組換え体はおよそあらゆる１０個の塩基対に対応する融合体と共にそのようなライブラリーに存在すべきである。

遺伝子ライブラリーを調製するための第２の方法は、ウィルスの全体のＲＮＡの相補的Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｃＤＮＡ）コピーを製造し、そしてこれらを発現ベクターにおいて組換え分子としてクローン化することである０本発明に使用するための遺伝子情報を得るためにｃＤＮＡライブラリーを使用することが好ましい。

そのようなライブラリーは、ＮＡＮＢ感染性ヒト血漿から生成され、そしてＮＡＮＢ感染性ヒトからの血清によりスクリーンされた。血清と反応性である決定基を発現する組換え体の中には、第１〜４図に記載される組換え体が存在する。

所望する遺伝子物質を配置するために、ＮＡＮＢに対するポリクローナル抗血清を用いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーンすることができる。　ｃＤＮＡフラグメントは発現ベクター中に挿入され、そして適切な宿主への形質転換の後、宿主はポリクローナル抗血清に結合するタンパク質についてスクリーンされ得る。この方法で初めに同定された組換え体を分離することができる。次にそれらの得られたクローンは、完全なｃＤＮＡが同定されるまで大きなフラグメント又は部分的にオーバーラツプするフラグメントについてライブラリーをさらに調べるためにプローブとして使用され得る。

ＮＡＮＢ遺伝子物質は、単細胞微生物を操作し、そして増殖する標準の技法を用いて完全なフラグメント又は変性されたペプチドの生成のために使用され得る。

ワクチン開発及び／又は診断試薬のための候補体である抗原は、感染された患者からの血清により認識されるものを包含するであろう。さらに、いづれかの遺伝子配列がハイブリダイゼーションアッセイにおいてプローブとして使用され得る。

遺伝子工学の当業者の知識及び前で言及された指針と共に使用される場合、上記技法は所望する遺伝子物質の単離及び開示された配列と共に組換えＤＮＡベクターへのその使用を可能にするであろうが、同じ結果を導びく他の方法もまた知られており、そして本発明の組換えＤＮＡベクターの調製に使用され得る。

たとえばワクチンに使用するためのタンパク質の発現は、形質転換された宿主に複数のコピーの遺伝子を含むことによって、宿主において再生することが知られているベクター（たとえばｐＵｃ１８　；　ｐｔａｃ１２　；　ｐＩＮ　−ＩＩＩ−ｏｍｐＡｌ　、　２、又は３；ｐＯＴｓ　、　ｐＡｓｌ　；又はｐＫＫ２２３−３　）を選択することによって（これにより、挿入された外来性ＤＮＡから多量のタンパク質を生成する）、又はペプチド発現を増強する他の既知の手段によって増強され得る。すべての場合、ウィルスタンパク質は、ＤＮＡ配列がベクター中に機能的に挿入される場合に発現されるであろう。“機能的に挿入される ”とは、当業者により十分に理解されるように、正しく読み枠を整合し、そして正しい配向で存在することを意味する。典型的には、遺伝子はプロモーターから下流に挿入され、そしてその後に停止コドンが存在するであろうが、但しハイブリッドタンパク質（たぶん続いて切断される）としての生成が所望により使用され得る。

本発明の実施に従って組換えＤＮＡ分子及び形質転換された単細胞生物を調製するために使用され得る上記の一般的な方法の他に、他の既知の技法及びその変法が本発明を実施するために使用され得る。特に、遺伝子工学に関係する技法は最近、暴発的な成長及び開発を受けている。多くの最近のアメリカ特許は、プラスミド、遺伝子工学により製造された微生物及び本発明の実施に使用され得る遺伝子工学を行なう方法を開示する。たとえばアメリカ特許第４．２７３．８７５号は、プラスミド及びそのプラスミドの単離方法を開示する。アメリカ特許第４．３０３，８６３号は、ハイブリッドプラスミドが構成され、そして細菌宿主を形質転換するために使用される遺伝子工学により細菌を生成するための方法を開示する。アメリカ特許第４．４１９．４５０号は、組換えＤＮＡ作業においてクローニングビークルとして有用なプラスミドを開示する。アメリカ特許第４，３６２．８６７号は、組換えｃＤＮＡ構成方法及びクローニング方法において有用である、それによって生成されるハイブリッドヌクレオチドを開示する。アメリカ特許第４．４０３．０３６号は、ＤＮＡセグメントの複数のコピーを含むプラスミドを生成するための遺伝子試薬を開示する。アメリカ特許第４、３６３．８７７号は、組換えＤＮＡ）ランスファーベクターを開示する。アメリカ特許第４．３５６．２７０号は組換えＤＮＡクローニングビークルを開示し、そしてそれは遺伝子工学に使用される多くの用語及びそこに使用される基本的な方法を定義するので、遺伝子工学の分野において制限された経験を有する人々のために特に有用な開示である。アメリカ特許第４．３３６．３３６号は、融合された遺伝子及びそれを製造するための方法を開示する。アメリカ特許第４．３４９．６２９号は、プラスミドベクター及びその生成法及び使用を開示する。アメリカ特許第４．３３２．９０１号は、組換え体ＤＮＡに有用なりローニングベクターを開示する。これらの特許のいくつかは本発明の範囲内に存在しない特定の遺伝子生成物の製造に向けられているけれども、それらに記載される方法は、存在する読み取り枠配列と対象の配列とを置換することにより、遺伝子工学の当業者により本明細書に記載される発明の実施に容易に変性され得る。

本発明の包含は、ＮＡＮＢウィルスタンパク質及び対象株の遺伝子物質の非制限的供給がハイブリダイゼーションアッセイの開発に、又は診断、免疫化、治療及び研究に使用するための試薬としてこれらの物質を用いるいづれか他のタイプのアッセイに使用するために利用できるようになることにおいて有意である。ハイブリダイゼーションアッセイに遺伝子物質を用いる方法及び遺伝子物質の拡張及び増幅装置は、ＰＣＲシステム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｈｌｎｄｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）から入手できる。

本明細書に開示される原理及び変異ヌクレオチド配列に基づいてのオリゴヌクレオチドプローブを用いて、対象のウィルスからのタンパク質を発現することができる遺伝子及びウィルスゲノムの単離が特に企画される。使用する場合、プローブは典型的には、検出可能な手段（たとえば放射性核種、たとえば”Ｐｌ　３Ｈ又はビオチン）でラベルされ、そして配列が捜しめられる生物からの一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡと共にインキュベートされる。ハイブリダイゼーションは、−末鎖及び二本鎖（ハイブリダイズされた）ＤＮＡ　（又はＤＮＡ／ＲＮＡ）が分離された後（典型的にはニトロセルロース庵を用いて）、ラベルにより検出される。

オリゴヌクレオチドと共に使用するために適切なハイブリダイゼーション技法は良く知られている。いづれがの源から得られるウィルス又は遺伝子物質と本発明のウィルス及び遺伝子物質との同一性は、本明細書に記載される遺伝子配列がら調製されるプローブを用いてハイブリダイゼーションアッセイにより確認され得る。

プローブは、アッセイの同定を可能にする検出可能なラベルと共に通常使用されるが、ラベルされていないオリゴヌクレオチドもまた、ラベルされたプローブの前駆体として及び二本鎖ＤＮＡ（又はＤＮＡ／ＲＮＡ）の直接的な検出、たとえばニトロセルロース上での咬着を提供する方法に使用するために有用である。従って、用語“オリゴヌクレオチドプローブとは、ラベルされた及びラベルされていない形の両者を言及する。

さらに、いづれかの源からウィルス粒子を精製し、そしてウィルスを含むと思われる生物学的サンプル、たとえばＮＡＮＢ肝炎により感染された類人猿の血清又は他の体液から得られたウィルスペレットを浮遊密度に従って分別することによってＮＡＮＢ肝炎に関連するウィルス粒子及び遺伝子物質を同定するために必要なスクリーニングの量を減じることが可能である。適切な浮遊密度の両分を選択することによって、サンプルは本発明の特定のウィルスについて富化される。実際、１００％の力価された接種物が本明細書に記載される浮遊密度画分から回収され得る。

そのような技法を用いて、クローンは、調製され、そしてＮＡＮＢ抗血清により認識される免疫反応性タンパク質（β−ｇａｌ融合生成物）を製造するものとして特徴づけられる。遺伝子物質は、ヒト及びチンパンジーゲノム（感染された及び感染されていない）の両者に対して外来性であり、そして浮遊密度分別された血清から抽出された遺伝子物質の増幅の後、ＮＡＮＢ感染チンパンジーから得られたサンプルによるハイブリダイゼーションのために陽性であり、そしてＢ型肝炎により感染された対照のチンパンジーから得られた増幅された遺伝子物質に対して試験される場合、同じ分析において陰性である。

比較的多量のウィルスゲノム物質を増殖する手段として、本発明のウィルスは、そのウィルスによる感染に対して敏感なハイブリッド細胞系を用いて！ｙＹ上！で培養され得る。

本発明のＮＡＮＢウィルスを培養するために使用され得る不滅化されたウィルス特異性組繊細胞は、特に１９８６年４月１日に出願されたアメリカ特許出願第８４６．７５７号に記載されている。

細胞培養物からウィルス粒子を得るための技法は、上記出願ＮＡＮＢウィルス抗原は種々の源から得られる。その抗原は、損なわれていないウィルス粒子、一部劣化されたウィルス粒子、タンパク質−又は炭水化物−含有分子上に溶液又はいづれか他の物理的な形で存在することができ、そしてそれは、たとえば試験管の表面又は懸濁された粒子、たとえば血液細胞又はラテックス粒子に抗原を結合することによって粒子又は固体表面と共に化学的又は物理的に組合された抗原を包含する。本発明の抗原は、ウィルス粒子の少なくとも１つのエピトープ部位を含む物質として定義される。

ＮＡＮＢウィルス抗原を得るためには、抗原は、溶解性であり又は他のある形で存在しても、典型的にはまず、損われていない粒子以外の大きな寸法又は異なった密度を有する水不溶性汚染物、たとえば動物細胞及び細胞残骸並びに細胞性微生物、たとえば細菌から分離される。この全体の分離は一般的に、低速度の遠心分離により又は標準の技法を用いての濾過により達成される。　０．４５ミクロンの平均直径の孔を有する通常のフィルターが、全体の汚染物を保持し、そして抗原を通すことに有用である。

さらに、本発明の抗原は、全体の汚染物が除かれた後、所望しない水溶性物質から分離され得る。損われていないウィルス粒子又はそれらの水不溶性フラグメントのいづれかを回収することが所望される場合、サンプルからすべての水溶性構成成分を単に除（ことが便利である。適切な技法は、膜を通しての限外濾過、選択的な凝集剤又はタンパク質沈殿剤（たとえばポリエチレングリコール及び硫酸アンモニウム）の使用及びクロマトグラフィーを包含する。

クロマトグラフィーは、抗原の商業的な製造のために容易に増大され得るので、最っとも有用な方法である。架橋されたデキストランビーズを用いるゲルクロマトグラフィーシステムが使用される材料の典型である。タンパク質及び低分子量物質のゲルピースの空隙体積中への拡散を可能にし、それによって、全ウィルス粒子を実際妨害しないで通過せしめながら、カラムを通してそれらの汚染物の進行を妨げるであろう適切なゲルのカラムが選択され得る。特定の抗原が所望される場合、他のゲルサイズが、いづれか他のサイズの抗原の単離を提供するために選択され得る。従って、選択されるゲルは、日常の実験の要素であろう。

本明細書に記載される技法のいづれかが、所望により組合され得る。たとえば、塩化セシウム又はスクロース密度グラジェント上での粒子の分離、その後、種々の技法のいづれかを用いて粒子を破壊し、そしてゲル電気泳動上でウィルス抗原を単離し、ＮＡＮＢ抗原に対して特異的な抗体、たとえば抗血清に結合するタンパク質について選択することができる。

可溶性タンパク質抗原又は粒子フラグメントを単離するために特に適切である１つの技法は、アフィニティークロマトグラフィーである。本発明の抗原を結合することができる抗体は、従来の方法を用いて不溶性支持体に共有結合され又は吸着される。結合された抗体はカラムに置かれる。抗原を含むサンプルがカラムに通され、ここでそれは結合された抗体に結合する。免疫学的に結合された抗原は、緩衝液により洗浄され、そして次に、イオン強度又は洗浄緩衝液のｐＨを変えることによって開放され得る。一般的に、酸性のｐＨが結合された抗原を開放するために効果的である。その技法は、本発明の抗原からひじょうに関連するタンパク質を分離することにおいてひじょうに効果的である。

本発明の抗原はワクチンとして使用され得る。ワクチンを調製するための好ましい出発物質は、感染性ウィルスの組織培養により生成される粒子抗原である。その抗原は好ましくは、上記に記載されるように損なわれていない粒子として初めに回収される。しかしながら、他の源又は非粒子組換え体抗原から単離された粒子から適切なワクチンを調製することもまた可能である。非粒子抗原（典型的には可溶性抗原）が使用される場合、ウィルスエンベロープ又はウィルスカプシド由来のタンパク質がワクジンを調製するのに使用するために好ましい。これらのタンパク質は、また上記に記載されるように、アフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。

精製されたタンパク質がそれ自体免疫原性でない場合、それはタンパク質を免疫原性にするためにキャリヤーに結合され得る。キャリヤーは、ウシ血清アルブミン、キーホールリンベット（Ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ）のヘモシアニン及び同様のものを包含する。ヒトタンパク質を実質的に含まないように抗原を精製することが所望されるが、しかし必要でない。しかしながら、抗原は、タンパク質、ウィルス、及び汚染、栄養培地、細胞系、組織又はウィルスが培養され又は得られる病原性流体により導入されたヒト起源のものでない他の物質を含まないことがより重要である。

予防接種は、従来の態様で行なわれ得る。たとえば、ウィルス粒子又はタンパク質のいづれでも、その抗原は、適切な希釈剤、たとえば水、塩溶液、緩衝溶液、完全又は不完全アジュバント及び同様のものにおいて使用され得る。免疫原が抗体誘発のための標準技法、たとえば不活性化された又は弱められたウィルス粒子又は抗原を含む生理学的に適合する殺菌溶液の皮下投与により導入される。ウィルス粒子の免疫応答生成量が、典型的には、ｌｊｌ！１！又はそれ以下の体積で接種注射により投与される。

ワクチンとして使用する他に、組成物がＮＡＮＢウィルス粒子に対する抗体を調製するために使用され得る。その抗体は抗ウィルス剤として直接使用され得る。

抗体を調製するためには、宿主動物がウィルス粒子を用いて免疫化され、又は適切には、ウィルス粒子起源の非粒子抗原がワクチンについて上記で記載されているようにしてキャリヤーに結合される。宿主の血清又は血漿が、適切な間隔に続いて集められ、ウィルス粒子と反応性の抗体を含んで成る組成物が供給される。

Ｔグロブリン画分又はＩｇＧ抗体が、たとえば飽和された硫酸アンモニウム又はＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｄｅｘの使用により、又は当業者に知られている他の技法により得られる。抗体は、他の抗−ウィルス剤、たとえば薬物と関係する多くの悪い副作用を実質的にをさない。

抗体組成物は、可能性ある逆の免疫応答を最少にすることによって宿主システムとさらに一層適合せしめられる。これは、外来性種の抗体のＦｃ部分のすべて又は一部を除くことによって、又は宿主動物と同じ種の抗体を用いて、たとえばヒト／ヒトハイブリドーマ（下記を参照のこと）からの抗体の使用により達成される。

抗体はまた、抗体−ウィルス複合体がマクロファージにより認識されるので、免疫応答を高める手段としても使用され得る。その抗体は、抗体の他の治療投与のために使用される量と同じ量で投与され得る。たとえば、プールされたγグロブリンは、細胞中へのウィルス侵入を妨害するために、他のウィルス疾患、たとえば狂犬病、風疹及びＢ型肝炎の初期インキュベーションの間、０．０２〜０．１４！／体重！ｂで投与される。従って、ＮＡＮＢウィルス粒子と反応性の抗体は、単独で又は他の抗−ウィルス剤と一緒に、ＮＡＮＢウィルスにより感染された宿主に受動的に投与され、免疫応答及び／又は抗ウイルス薬剤の有効性が高められ得る。

他方、抗−ＮＡＮＢ−ウィルス抗体は、免疫原として抗−イディオタイプ抗体を投与することによって誘発され得る。便利には、上記のようにして調製された精製された抗−ＮＡＮＢ−ウィルス抗体が、宿主動物に抗−イディオタイプ抗体を誘発するために使用される。その組成物は、適切な希釈剤と共に宿主動物に投与される。投与の後、通常くり返しての投与の後、宿主は抗−イディオタイプ抗体を生成する。ＦＣ領域に対する免疫原性応答を排除するために、宿主動物と同じ種により生成された抗体が使用され得、又は投与された抗体のＦｃ９１ｊ域が除かれ得る。宿主動物に抗−イディオタイプ抗体を誘発した後、血清又は血漿が除かれ、抗体組成物が供給される。

その組成物は、抗−ＮＡＮＢ−ウィルス抗体のために上記のようにして精製され、又はアフィニティーマトリックスに結合される抗−ＮＡＮＢ−ウィルス抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。生成される抗− イディオタイプ抗体は、純粋なＮＡＮＢ抗原に形態的に類似し、そしてＮＡＮＢ粒子抗原を用いるよりもむしろＮＡＮＢワクチンを調製するために使用され得る。

患者に抗−ＮＡＮＢ−ウィルス抗体を誘発する手段として使用される場合、抗体の注入方法は、予防接種の目的のための手段と同じであり、すなわちアジュバントを含む又は含まない生理学的に適切な希釈剤における効果的な濃度で筋肉内、腹腔内、皮下又は同様に行なわれる。１又は複数回の追加免疫が所望される。抗体−ＮＡＮＢ−ウィルス抗体の誘発の抗−イディオタイプ方法は、抗−ＮＡＮＢ −ウィルス抗体の受動的投与により引き起こされる問題、たとえば逆の免疫応答、及び精製された血液成分の投与に関係する問題、たとえばまた特徴化されていない物質のような他の物質による感染を緩和する。

治療的な使用の他に、本発明の粒子及び抗原並びに遺伝子物質は、診断アッセイに使用され得る。ＮＡＮＢ肝炎の存在を検出するための方法は、ＮＡＮＢ肝炎ウィルスに関連する分析物の存在について生物学的サンプル、たとえば血液サンプル又は肝臓のパイプシー検体を分析することを含んで成る。分析物は、少なくとも約１６個の連続的なヌクレオチド、通常３０〜２００個のヌクレオチドの配列、及び第１〜５図に示されるｃＤＮＡ配列の実質的に十分な長さの配列を含んで成るプローブとハイブリダイズするヌクレオチド配列であることができる。分析物はＲＮＡ又はｃＤＮＡであり得る。

分析物は、少なくとも１つの次の特徴を有するウィルス粒子であり得る：　ＮＡＮＢ肝炎による感染に敏感な細胞から得られ；前記粒子による感染に敏感な細胞にウィルス−特異的表面抗原の発現を誘発することができ、ここで前記表面抗原はＮＡＮＨにより感染された宿主からの血清（非感染宿主からの血清ではない）により認識され；約１．０９〜１．１１ｇｍ／ｃ−の浮遊密度を有する。ウィルス粒子は、さらに、第１〜５図における配列の少なくとも１２個の連続的なヌクレオチドの配列に少なくとも８０％相同の配列、通常その配列内の少なくとも約６０個の連続的なヌクレオチドの配列に少なくとも約９０％相同の配列を含んで成るＲＮＡウィルスゲノムを有するものとして特徴づけられ得、そして第１〜５図における配列に実質的に相同の配列を含んで成る。分析物は、ＮＡＮＢウィルス粒子上に抗原、たとえば細胞表面抗原を認識する抗体を含んで成る。分析物はまた、ＮＡＮＢウィルス抗原でもあり得る。

分析物を検出するためには、分析物がプローブにハイブリダイズする場合、そのプローブは検出可能なラベルを含むことができる。同様に、分析物が抗体又は抗原である場合、それぞれラベルされた抗原又は抗体を用いて、ラベルにより検出され得る免疫学的複合体を形成するために分析物に結合され得る。

典型的には、分析物、たとえば表面抗原及び／又は完全な粒子を検出するための方法は、イムノアッセイに基づかれる。

イムノアッセイは、ＮＡＮＢ肝炎ウィルスによる感染から生じた宿主における抗体の存在を検出するために又はウィルス粒子又は抗原の存在を直接決定するアッセイにより行なわれ得る。

そのような技法は良く知られており、そしてここで詳細に記載する必要はない。

例は、異種及び同種イムノアッセイ技法の両者を包含する。両枝法は、ウィルス粒子又はその抗原と対応する特異的抗体との間での免疫学的複合体の形成に基づかれる。ウィルス抗原のための異種アッセイは典型的には、固体表面に結合される特異的モノクローナル又はポリクローナル抗体を使用する。サンドイッチアッセイはますます一般化して来た。固相の存在なしに溶液において行なわれ得る同種アッセイは、また、酵素−抗原接合体への遊離抗体の結合によりもたらされる酵素活性の差異を決定することによって使用され得る。多くの適切なアッセイが、アメリカ特許第３．８１７，８３７号、第４．００６．３６０号、第３．９９６，３４５号に開示される。

ＮＡＮＢウィルスにより誘発される抗体の存在についてアッセイする場合、本発明のウィルス及び抗原は、ＩｇＧ又はＩｇＭ抗体のいづれかを検出するために特異的結合剤として使用され得る。ＩｇＭ抗体は典型的には、感染の進行の間に出現する最初の抗体であるので、ＩｇＧ合成がまた開始されていない場合、宿主の血流に存在するＩｇＦ′ＩとＩｇＧ抗体との間の特異的な相違が、感染が最近であるか、又は慢性的であるかのいづれかの決定を医者又は他の研究者に可能にするであろう。

本発明の遺伝子物質は、天然に生じる感染体に存在する遺伝子物質のためのプローブとして多くのアッセイに使用され得る。ハイブリダイゼーシゴンアッセイによる後での分析のために標的核酸の増幅のための１つの方法は、ポリマラーゼ鎖反応又はＰＣＲ技法として知られている。ＰＣＲ技法は、お互い一定の間隔を開けられ、そして第１〜５図に示される遺伝子配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、凝わしい病理学的サンプルにおける本発明のウィルス粒子を検出するために適用され得る。プライマーは、二本鎖ＤＮＡ分子の反対側の鎖に相補的であり、そして典型的には約５０〜４５０ｎ　を又はそれ以上により分離される。この方法は、特定のオリゴヌクレオチドプライマーの調製及び次に標的ＤＮＡ変性の反復サイクル、プライマー結合及び所望する長さのプローブを得るためのＤＮＡポリマラーゼによる延長を伴う。１つのプライマーから生成される延長生成物は、他のプライマーのための追加の標的配列として作用する。標的配列の増幅程度は、実施されるサイクルの回数により調節され、そして単純な式２ ”　（式中、ｎはサイクルの回数である）により理論的に計算される。サイクル当たりの平均効率が約６５％〜８５％の範囲である場合、２５回のサイクルは標的配列の０．３〜５ａｉｋｉ＠ζ、、　Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）　３２４　：　１６３〜１６６　；及び５ｅｈａｒｆ　ｆｔ　ｅ　、　＋釘違狙鰭（１９８６）％３３　：　１０７６〜１０７８に記載される。また、アメリカ特許第４．６８３．１９４号；第４．６８３．１９５号；及び第４．６８３．２０２号も参照のこと。

ＮＡＮＢ−ウィルス粒子及びタンパク質に対する抗体及び抗−イディオタイプ抗体のインビボ使用及び診断使用の両者のためには、モノクローナル抗体を使用することが好ましい。モノクローナル抗−ウィルス粒子抗体又は抗−イディオタイプ抗体は次のようにして生成され得る。免疫化された動物からの膵臓又はリンパ球を取り出し、そして当業者に既知の方法により不滅化され又はハイブリドーマを調製するために使用される。ヒト−ヒトハイブリドーマを生成するためには、ヒトリンパ球供与体が選択される。ＮＡＮＢウィルスにより感染されることが知られている供与体（ここで感染は血液における抗−ウィルス抗体の存在により又はウィルス培養により示されている）は、適切なリンパ球供与体として作用することができる。リンパ球は末梢血液サンプルから単離され得又は膵臓細胞は、その供与体が牌摘出にゆだねる場合に使用され得る。エプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）はヒトリンパ球ヲ不滅化するために使用され得、又はヒト融合パートナ−はヒト−ヒトハイブリドーマを生成するために使用され得る。ペプチドによる主なインビトロ免疫化はまた、ヒトモノクローナル抗体の生成にも使用され得る。

不滅化された細胞により分泌される抗体は、所望する特異性の抗体と分泌するクローンを決定するためにスクリーンされる。モノクローナル抗−ウィルス粒子抗体に関しては、その抗体はＮＡＮＢウィルス粒子に結合すべきである。モノクローナル抗−イディオタイプ抗体に関しては、その抗体は抗−ウィルス粒子抗体に結合すべきである。所望する特異性の抗体を生成する細胞が選択される。

本発明をより詳しく理解するために、次の例が与えられるが、この例は例示的であって、本発明を限定するものではない。

実−一一一一一狡ＮＡＮＢウィルス粒子により感染された２種のハイブリッド肝臓細胞培養物を、１９８８年６月２４日、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８８２のＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｎｅＣｏｌ　１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）に寄託した。それらの２種のハイブリッド培養物はＧＬ）１０３およびＧＬＨＯ４であり、そしてＡＴＣＣ寄託番号ＣＲＬ９７５４及びＣＲＩ、９７５５をそれぞれ付与された。感染されていないハイブリッド肝細胞培養物ＧＬＨ０２も、１９８６年３月２６日、ＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ寄託番号）ＩＢ９０２７を付与された。

■−１旦上血」皇多　されたＮＡＮＢ旦　からｃＤＮＡクローンΩＮ製ＮＡＮＢ肝炎を有するものとして診断されたヒト患者からの血清を、５１４４０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて３０．０００ｒｐａ＋で、５°Ｃで２．５時間遠心分離した。上清液を除き、そして捨て、そしてベレットを、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）を含む５０１の酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，８）に溶解した。ＲＮＡを、ＳＤＳを含まない同じ緩衝液に平衡化されたフェノールを用いて選択的に抽出した。水性相における核酸を無水エタノール２体積を用いて沈殿せしめた。ＲＮＡを、製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｉｎｄｔａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎｄｉａｎａ）により述べられている方法に従って、Ｄ’ＮＡ合成キットを用いて二本１ｊｃＤＮＡ中に逆転写した。但し、ランダムプライマーとオリゴｄｔプライマーとの置換がそのキットに提供された。

得られたｄｓＤＮＡ＠ＥｃｏＲＩリンカ−に連結し、そして付着性ＥｃｏＲＩ部位の生成の後、供給者（ＰｒｏＭｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｍａｄｉｓｏｎ＋Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により記載されているようにしてλｇｔｌｌ中に挿入した。プラークをＮＡＮＢ−感染性ヒト抗血清によりスクリーンし、そして陽性クローンを単離した。次にそのクローンを、ＮＡＮＢ−感染性ヒト抗血清を用いて再スクリーンし、そしてプラーク精製した。

利用できる配列相同調査プログラムを用いての第１〜４図に示される配列の分析は、クローン化された配列がデータバンク（ＧｅｎＢａｎｋバージョン５４及び５７）に発録された配列のいづれとも異なっていることを示した。相同性は、ＧｅｎＢａｎｋバージョン５２に含まれるポリペプチド配列に見出されなかった。

第５図に示されるＤＮＡ配列の分析（ＧｅｎＢａｎｋバージョン５７に対する）は、有意な相同性を示さながった。

豆王皇猜１ヒト血漿に元来由来するＮＡＮＢウィルス粒子を次のようにして単離した：　ＮＡＮＢ肝炎を有するとして診断された患者がら由来するＮＡＮＢウィルス粒子を含んで成る感染された血漿により接種されたチンパンジーからの血漿接種物を、０．００１ＭのＥＤＴＡ、０．１Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０１ＭのトリスＨＣＩ。

（ｐＨ８，０）溶液中、線状２０〜５５％スクロースグラジェントの上部に積層した。そのグラジェントを、Ｈｏｅｆｅｒグラジェントマーカーを用いて調製した。チンパンジーの接種物は、１０’個のチンパンジー感染用量（ＣＩＤ）のＮＡＮＢウィルス粒子を含んだ。グラジェントを、針４０ローターを用いて、３０．０００ｒｐｖａで５℃で１８時間遠心分離した。グラジェントの分別の後、その画分を、チンパンジーへの再注射により感染性について分析した。１．０９〜１．１１ｇｍ／ｃｍの浮遊密度を有する両分は、チンパンジーへの接種後、約３０日でのアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の上昇に基づいて、１：１０ｈの希釈度で感染性＋１されたウィルス粒　からのｃＤＮＡの調１１．０９〜１．１１ｇｍ／ａｄの浮遊密度を有する、例２に記載されているようにして得られたウィルス粒子を用いて、例１に記載されているようにしてｃＤＮＡを調製した。次にその得られたｃＤＮＡを、１９８８年６月１７日に出願された共通所有の特許出願第２０８．５１２号（この開示は引用により本明細書に組込まれる）に記載されている技法を用いて増幅した。対照として、増幅されたｃＤＮＡを、ＮＡＮＢのｃＤＮＡに関するのと同じ方法で、ＨＢＶにより慢性的に感染されたチンパンジーの浮遊密度分別された血漿から調製した。感染され、そして制御増幅されたｃＤＮＡを、アガロースゲル（２％）を用いて電気泳動せしめ、そして次に５ｏｕｔｈｅｒｎ（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、（１９７５）　９８　：　５０３）の方法によりニトロセルロースフィルターに移シタ。

クローン＃３０（例１におけるようにして得られた：第１図におけるような配列）を、キット製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｓ旧ｏｃｈｅｓｉｃａｌｓ＋　Ｉｎｄｉａｎｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎｄｉａｎａ）により提供される教授に従って３２ｐヌクレオチド及びランダムプライマーキットを用いて放射性ラベルした。次にその放射性ラベルされたクローン＃３０を、分別されたウィルス粒子からの増幅されたｃＤＮＡを含むフィルターに対するハイブリダイゼーションプローブとして使用した。オートラジオグラフィーにより検出される場合、特異的ハイブリダイゼーションは、ＮＡＮＢ感染チンパンジーから調製されたｃＤＮＡに関してのみ明白であった。従って、ＮＡＮＢ−感染されたヒト源から単離された分子クローン＃３０（異なったＮＡＮＢ−感染されたヒトからの血清を用いて同定され、そしてヒト及びチンパンジーのゲノムに対して外来性であるものとして特徴づけられている）は、チンパンジーにおいて継代された（但し感染されたヒトに源を発する）実証された感染性ＮＡＮＢ粒子の富化された源から調製されたｃＤＮＡに存在する相同配列を検出したことが示された。クローンＰＴ’　２　、ＰＴ’　８及びＰＴ’　９はまた、ＮＡＮＢ−感染されたチンパンジーから調製されたｃＤＮＡに対して特異的にハイブリダイズした。

劃−」工ＮＡＮＢウィルスによる　゛　ヒ　れ丸圧鞭臘ｑ皿束ハイブリッド肝細胞を、２４−ウェルのトレーにｌＸｌ０”個の細胞／ウェルでプレートし、そして（ａ　）　ＮＡＮＢウィルス物質を含むことが第２のチンパンジーへのその継代により知られているチンパンジーからの血漿又は（ｂ）急性輸血後のＮＡＮＢ肝炎の個人からのヒト血漿１００Ｉにより被覆した。チンパンジーの血清及び細胞の初期インキュベーションの後、ｌ　ＭＤＭ及び２０％ＦＣＳを含む増殖培地０．５１ｄを個々のウェルに添加し、そしてその細胞を加湿された７％ＣＯ□のインキュベーターにおいて３７°Ｃで増殖せしめた。その培養物に３〜４日ごとに増殖培地を供給し、・そしてハイブリッド肝細胞を１週ごとに取り出し、ＮＡＮＢの存在についてアッセイした。

ウィルス粒子の存在を検出するために、その細胞を、ＮＡＮＢウィルス特異的表面抗原の発現について分析した。その方法は次の通りである：約ｌＸｌ０’個の細胞を含む培養培地のアリコートを培養ウェルから除き、そしてその細胞を２００Ｘｇで１０分間遠心分離することによりペレット化した。その細胞をＰＢＳにより３度洗浄した後、その細胞を２．５Ｘ１０’個の細胞／−に再懸濁し、そしてその細胞懸濁液１０１１１を顕微鏡のスライド上に滴下し、そして空気乾燥せしめた。次に乾燥細胞をアセトンの添加により１分間スライド上に固定した。非特異的結合を最少にするために、スライドを湿潤チャンバー中において室温で３０分間、正常なりギ血清（１：１０の希釈度）と共に予備インキュベートした。

スライドをＰＢＳにより３度及び蒸留水により１度洗浄し、次にパネルチンパンジー（第２表の左で同定される、下記を参照のこと）の１つから得られた試験血清７０ｄをそれらのスライドに添加した。個々の血清サンプルを、感染されていないハイブリッド肝細胞（ｒｄ血清当たり１０７個の細胞）により予備吸収し、非特異的に細胞に結合する傾向がある血清因子を除いた。添加された血清を含むスライドを、加湿チャンバーにおいて室温で９０分間インキュベートし、次に再びＰＢＳにより３度及び蒸留水により１度洗浄した。

ヤギ抗−ヒトＩｇＧ及びフルオレセインイソチオシアネートにより接合されたＩｇＭ（ＦＩＴＣ接合抗体）を、市販源（Ｚｙｍｅｄ　Ｌａｂｓ）から得た。それらをＰＢＳによりそれぞれ希釈し、約１Ｎの抗体／ｄ！の最終濃度にした。抗− ＩｇＭ又は抗−ＩｇＧ　ＦＩＴＣ−接合抗体（７０ｍ）のいづれかを前記洗浄された細胞に添加し、そしてそのスライドを室温で３０分間インキュベートした。

上記のようにＰＢＳ及び蒸留水により洗浄した後、スライドＰＢＳ中、５０％グリセロール溶液１滴により固定し、そして螢光顕微鏡下で観察した。細胞を、弱い（＋）、中間（＋＋）及び強い（＋＋＋）螢光について評価した。

免疫螢光の最初の徴候は、個々のウィルス源による初期の細胞感染の後、約６〜８週で生じた。第２表に示される結果は、ＮＡＮＢ吻質を含むことが知られているチンパンジーの血漿により感染された後６週で得られた。

ＮＡＮＢウィルスにより感染された不滅化された肝細胞におけるＮＡＮＢウィルス細胞表面抗原の発現ハイプリドーマとの　・ｉ乙島ノニ　双−一豆　１１１よ履ｉむυゴ嘆ｙＡ　回復期のＨＡＶ　− Ｂ′　正常　− Ｂ　急性ＮＡＮＢ　＋　− Ｄ　急性ＮＡＮＢ　＋＋　− Ｅ　正常　− Ｆ　回復期のＨＢＶ　− Ｇ　慢性ＮＡＮＢ　＋＋＋　− Ｈ慢性ＮＡＮＢ　− 第２表の右側の欄に見られるように、特異的免疫螢光性は、ＮＡＮＢ感染された動物からの血清に関してのみ観察され、そして感染されていない動物又はＨＢＶにより感染された動物からの血清に関しては観察されなかった。その結果は、（ａ）ハイブリッド肝細胞はＮＡＮＢウィルスにより感染され得、（ｂ）感染されたハイブリッド細胞は、既知のＮＡＮＢ感染を有するチンパンジーからのＮＡＮＢ血清抗体により認識されるウィルス特異性表面抗原を発現し、そして（ｃ）約４〜６週間のインキュベーション期間が表面抗原の発現のために必要とされることを示す。

第２表に示される結果は、抗−１ｇＧ抗体により得られた。

免疫螢光性は、チンパンジーの抗−ＮＡＮＢ抗体がＩｇＧ抗体であるかどうかが予測される場合、ＰＩＴＣ−接合抗−ＩｇＭ抗体に関しては観察されなかった。

急性輸血後ＮＡＮＢを有する患者からの血漿は、感染されたチンパンジーからの血漿により上記で得られた結に類似する結果を付与した。６週間後、患者の血漿を用いて感染されたハイブリッド肝細胞は、ＮＡＮＢ−感染されたチンパンジーからの血清との特異的免疫螢光性を示したが、しかし対照（感染されていない）のチンパンジーからの血清とはその免疫螢光性は示さなかった。

バイブミツド　か゛のＮＡＮＢＱウィルスｔ　のロＮＡＮＢ−感染されたハイブリッド細胞をまた、感染ウィルスの存在について試験した。感染後１２週での感染されたハイブリッド細胞（例４に記載されるようにして得られた）を遠心分離により集め、次にＰＢＳにより３度洗浄した。その細胞をＰＢＳに再懸濁し、約５Ｘ１０’個の細胞／ｄの濃度にし、そして音波処理し、透明にした。次に上滑液（０，５ｄ／ウエル）を、感染されていないハイブリッド上に接種し、そして例４に記載される方法で、チンパンジーの血漿による細胞感染のために培養した。細胞を含まない溶解物をまた、低張溶解又は凍結−融解により調製することができる。連続した培養での約６〜８週間後、特異的免疫螢光性は、チンパンジーのＮＡＮＢ血清に関して観察されたが、しかし感染されていない動物からの血清に関しては観察されず、そしてこの事は、そのようにして増殖された細胞粒子がそれらの感染性を保持していることを示した。

■一旦」ブリッド　において　されたＮＡＮＢウィルス拉子至文工酉五皿束立皇女定株ＮＡＮＢ−感染された細胞からの分子クローンを、インビトロ継代がウィルス感染性の得られる弱体化を伴って、不完全なウィルス粒子の発生を導びくかどうかを決定するために単離する。その方法は次の通りである：感染された細胞を指数増殖期で増殖し、そして次に３．００Ｏｒｐｍで１０分間の遠心分離により収穫する。細胞を含まない溶解物を、ドライアイス／エタノール上で凍結し、そして室温で融解する３回の連続的なサイクルにより５Ｘ１０” 個の細胞から調製する。その溶解物を、マイクロフユージを用いて、１０．０ＯＯＸ　ｇで１５分間の遠心分離により透明にする。次に上滑液を、上記（例２を参照のこと）のようにしてスクロース線状密度グラジェント上に負荷する。１．０９〜１．１１ｇｍ／ｃＪの浮遊密度を有する両分を集め、そして粒子を例３に記載されているようにしてＲＮＡについて抽出する。ｃＤＮＡへの転換及び例３に記載されているようにしての増幅の後、その増幅されたｃＤＮＡをサザンプロットハイプリダイゼーションにより分析し、ＮＡＮＢ相同配列の存在を確証する。使用されるプローブは、第１〜４図に示されている配列のｃＤＮＡクローンである。次に、その物質をλｇｔｌＯ中にクローン化し、そして分子クローンを、プローブとして第１〜４図に示される分子クローンを用いてのハイブリダイゼーションにより選択する。感染されたハイブリッド肝細胞に由来する分子クローンの主要ヌクレオチド配列を分析し、不完全なウィルス粒子がインビトロでの継代の間、生成されたかどうかを決定する。

本明細書に言及されるすべての出版物及び特許出願は、当業者の熟練のレベルのしるしである。すべての出版物及び特許出願は、引用により本明細書中に組込まれる。

この発明の好ましい態様を詳細に示し、そして記載したが、これによって本発明の範囲を限定するものではない。

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Claims

【特許請求の範囲】１．非−Ａ、非−Ｂ（ＮＡＮＢ）型ウィルスゲノム物質を含んで成るハイブリッド細胞であって、前記細胞が、前記ハイブリッド細胞を、感染性ＮＡＮＢウィルス粒子を含んで成るサンプルにより感染せしめることを含んで成る方法により生成されることを特徴とするハイブリッド細胞。２．前記感染性ウィルス粒子が約１．０９〜約１．１１ｇｍ／ｃｍ２の浮遊密度を有する請求の範囲第１項記載のハイブリッド細胞。３．非−Ａ、非−Ｂ肝炎（ＮＡＮＢ）型ウィルスゲノム物質を増殖するための方法であって、ＮＡＮＢウィルスゲノム物質により感染されたハイブリッド細胞系を、前記ウィルスゲノム物質が増殖するのに十分な時間増殖せしめることを含んで成る方法。４．前記細胞系を、感染されていないハイブリッド細胞と感染性ＮＡＮＢウィルス粒子を含んで成るサンプルとを接触せしめることによって感染せしめる請求の範囲第３項記載の方法。５．前記サンプルが、非−Ａ、非−Ｂ画分として集まる浮遊密度に基づいて汚染物から分離された非− Ａ、非−Ｂ型肝炎に関連するウィルス粒子及び抗原並びに約１．０７〜約１．１３ｇｍ／ｃｍ２の浮遊密度を有する物質を含んで成る請求の範囲第４項記載の方法。６．前記画分が約１．０９〜約１．１１ｇｍ／ｃｍ２の浮遊密度を有する物質を含む請求の範囲第４項記載の方法。７．生物学的サンプルから単離されるウィルス粒子であって、ＰＴ一非−Ａ、非 −Ｂ（ＮＡＮＢ）型肝炎ウィルスによる感染に敏感な細胞から得られ、そして約１．０９〜約１．１１ｇｍ／ｃｍ２の浮遊密度を有するものとして特徴づけられているウィルス粒子。８．前記生物学的サンプルが、ＰＴ−ＮＡＮＢ肝炎ウィルスにより感染された宿主からの血漿又は肝細胞である請求の範囲第７項記載のウィルス粒子。９．前記宿主がヒトである請求の範囲第８項記載のウィルス粒子。１０．前記粒子が、次のＤＮＡ配列：【配列があります】又は【配列があります】又は【配列があります】又は【配列があります】又は【配列があります】又は【配列があります】又は【配列があります】又は【配列があります】又は【配列があります】の１つ内の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドの配列に少なくとも８０％相同の配列を含んで成るＲＮＡウィルスゲノムを有するものとしてさらに特徴づけられる請求の範囲第７項記載のウィルス粒子。１１．前記ウィルスゲノムが前記配列内の少なくとも６０個の連続するヌクレオチドの配列に少なくとも９０％相同の配列を含んで成る請求の範囲第１０項記載のウィルス粒子。１２．請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドのセグメントに実質的に相補的な領域又はそのセグメントと同じ領域を有する実質的に純粋なポリヌクレオチド。１３．前記ポリヌクレオチドが前記配列の１つの完全な配列を実質的に含んで成る請求の範囲第１２項記載のポリヌクレオチド。１４．少なくとも１種の抗原決定基を定義するＰＴ一非−Ａ、非−Ｂ型ウィルス抗原であって、請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ配列又は相補的配列に実質的に相同の配列により一部コードされたタンパク質を含んで成る抗原。１５．他のタンパク質を実質的に含まない請求の範囲第１４項記載の抗原。１６．細菌において機能する複製システム、形質転換体の検出のためのマーカー及び請求の範囲第１０項記載の配列の少なくとも６０個のヌクレオチドの配列に実質的に相同する配列を含んで成るベクター。１７．非−Ａ、非−Ｂ型肝炎ウィルスの存在を検出するための方法であって、分析物の存在を決定するために生物学的サンプルを分析することを含んで成り、ここで前記分析物は請求の範囲第１０項記載の配列の少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含んで成るプローブとハイブリダイズする配列を有するヌクレオチド配列を含んで成ることを特徴とする方法。１８．非−Ａ、非−Ｂ（ＮＡＮＢ）型肝炎ウィルス物質に対して宿主を免疫化するためのワクチンであって、生理学的に適合する溶液にウィルス抗原又は不活性化された又は弱められたウィルス粒子を含んで成り、ここで前記抗原又は粒子がＮＡＮＢＢ肝炎ウィルスにより感染された細胞から得られることを特徴とするワクチン。１９．前記ウィルス抗原又は前記ウィルス粒子が、請求の範囲第１０項記載の配列に実質的に相同する配列により一部コードされるタンパク質を含んで成り、そして前記タンパク質が少なくとも１種の抗原決定基を定義する請求の範囲第１８項記載のワクチン。２０．前記抗原決定基が既知のＮＡＮＢ感染を有するチンパンジー又はヒトからのＮＡＮＢ血清抗体により認識される請求の範囲第１９項記載のワクチン。２１．抗体組成物を含んで成る抗−ウィルス物質であって、前記抗体が後一輪血性非−Ａ、非Ｂ（ＰＴ−ＮＡＮＢ）型肝炎ウィルス粒子に結合することができ、そして前記抗体の生成が前記宿主動物に、生物学的サンプルから単離されたＰＴ −ＮＡＮＢウィルス粒子又はＰＴ−ＮＡＮＢウィルス粒子由来の非−粒子抗原を含んで成る免疫原組成物を投与することによって得られ、ここで前記ウィルス粒子がＰＴ−ＮＡＮＢによる感染に敏感な細胞から得られるものとして特徴づけられていることを特徴とする抗ウィルス物質。２２．前記抗体のＦｃ領域の少なくとも一部が除去されている請求の範囲第２１項記載の抗ウィルス物質。２３．前記生成が、前記抗体を合成する前記宿主動物からの細胞を含んで成るハイブリドーマ細胞の調製により不滅化される請求の範囲第２１項記載の抗ウィルス物質。２４．前記ハイブリドーマがヒト−ヒトハイブリドーマである請求の範囲第２３項記載の抗ウィルス物質。２５．前記抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第２４項記載の抗ウィルス物質。２６．後一輸血性非−Ａ、非−Ｂ（ＰＴ−ＮＡＮＢ）型肝炎ウィルス粒子に結合できる抗体を生成するハイブリドーマ。２７．前記抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第２６項記載のハイブリドーマ。２８．生来の非−Ａ、非−Ｂ（ＰＴ−ＮＡＮＢ）型肝炎ウィルス物質に少なくとも実質的に類似するコンホーメーションを有する抗体を含んで成る抗−イデイオタイプ抗体組成物であって、前記抗体の生成が抗−ＰＴ−ＮＡＮＢウィルス抗体を含んで成る免疫原組成物を宿主動物に投与することによって得られることを特徴とする抗−イディオタイプ抗体組成物。２９．抗−ウィルス剤により処理された後一輸血性非−Ａ、非−Ｂ（ＰＴ−ＮＡＮＢ）型肝炎ウィルス感染宿主動物における前記抗−ウィルス剤の有効性を高めるための方法であって、抗−ＰＴ−ＮＡＮＢ抗体組成物及び前記抗ウィルス剤により前記宿主を処理することを含んで成る方法。３０．前記処理が、生来のＰＴ−ＮＡＮＢ型肝炎ウィルス抗原に少なくとも実質的に類似するコンホーメーションを有する抗−イデイオタイプ抗体を前記宿主動物に投与することによって前記宿主動物に前記抗−ＰＴ−ＮＡＮＢ抗体組成物を誘発せしめることを含んで成る請求の範囲第２９項記載の方法。