JPS62181798A

JPS62181798A - モノクロ−ナル抗体

Info

Publication number: JPS62181798A
Application number: JP2474286A
Authority: JP
Inventors: Isao Ono; 小野　魁; Toshio Shikata; 志方　俊夫; Yoko Shimizu; 洋子清水; Suguru Yamada; 山田　英; Yoshikazu Honda; 喜員本多; Toshiro Maeda; 前田　俊郎
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1986-02-06
Filing date: 1986-02-06
Publication date: 1987-08-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、非Ａ非Ｂ５肝炎抗原に特異的なモノクローナ
ル抗体に関する。

（従来の技術）ウィルス性肝炎のうち、Ａ型およびＢ型肝炎については
、そのウィルスの実体が見出され。

免疫学的方法による診断も可能となつくいる。

しかしながら、Ａ型でもなくＢ型でもなく。

非Ａ非Ｂ型といわれる肝炎は輸血後肝炎の９Ｑう以上を
占めるとされているが、その原因ウィルスが同定されて
おらず、ヒトの非Ａ非ＢａＪ肝炎がチンパンジーへ感染
可能であることがｍｉ！されているにすぎない。

一万、非Ａ非Ｂ型肝炎に関連した抗原抗体系の検索も、
多くの研究者によって患者の血清を中心にされているが
、未だ明確な系は見出されていない。（たとえば、医学
のあゆみ第１／ＩＩ巻第９号、第１１１轟〜ＩＩｔ４１
瓜、昭和！ｔ６年）。

（発明の目的）そこで１本発明者らは、上記非Ａ非Ｂ５肝炎抗原連した
モノクローナル抗体を見出すヘク。

先ず非Ａ非Ｂ型肝炎回復期のチンパンジーおよびヒト末
梢血りンバ球のトランスフォーメーションを中心に種々
検討な宣ねた結果、非Ａ非Ｂ型肝炎発症の肝細胞内に出
現する抗原に特異的に反応するヒト及びチンパンジー型
モノクローナル抗体を樹立した。さらにこの抗体を用い
て。

非Ａ非Ｂ型肝炎発症の肝細胞内に出現する抗原を部分精
製し、マウスに免疫しハイブリドーマ法により種々検討
を永ねた結果１本発明にｉｌｌ達した。

するマウスモノクローナル抗体にある。

（問題点を解決するための手段）以下１本発明の詳細な説明する。

まず１本発明に係るマウスモノクローナル抗体を産生ず
る細胞株は１次のような方法により得られる。

Ａ、ヒト及びチンパンジー型モノクローナル抗体の作製以下の方法により、非Ａ非Ｂ型肝炎回復期トランスフオ
ームすることにより、非Ａ非Ｂ型肝炎発症の肝細胞内に
出現する抗原に特異的に反応するヒト及びチンパンジー
型モノクローナル抗体を樹豆する。

たとえば、非Ａ非Ｂ型肝炎回復期のチンパ分離する。

一万、ＥＢウィルスを産生放出している細胞（たとえば
、Ｂ９ターｇ）を培地中で培養し、その培養上清を分離
し、ウィルス源（ｆｆｌＢウィルス液）を得る、。

ついで、このＫＢウィルス液と上Ｋｔ　’）　７バ球を
接触させた後、ａ々の培養密度で１組織培養用マイクロ
タイタープレートに接種して培養する。

このトランスフオーメーンヨン法は、適宜常法を選ぶこ
とができるが、少ない細胞密度で接種するオリゴクロー
ン伝が好適に使用される。

細胞の増殖がみられる時期に、培養上清を集め、非Ａ非
Ｂ型肝炎発症の肝切片を用いて抗体活性のスクリーニン
グを行ない、抗体活性陽性のものについて、クローニン
グラ行すう０クローニングに際しては、軟寒天（ｓｏｉ’ｔａｇａｒ
　）法、限界希釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ａｉｌｕｔ、ｉ
ｏｎ　）法又は７ングルセルヤニビユレーシヨン（ａｉ
ｎｇｌｅ　ｃｅｌｌ　ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　）法
の常法を用いることができるが、主として軟寒天法およ
び限界希釈法が用いられる。

軟寒天法の場合、たとえば細胞をある密度で支持球入層
上の接Ｓ寒天層に植え込み、増殖してきたコミニーを分
離し、丙び浮遊培養に移し、抗体陽性のクローン株を取
得する。

また、限界希釈法の場合、たとえばＸ線照射した昶〜化
り細胞をフィダー細胞として。

細胞をある￥Ｂ反で組織培善用マイクロタイタープレー
トに植込み、抗体陽性のクローン株を取得する。

このクローン化された細胞株が産生ずる抗体は常のによ
り取得でと、この抗体は非Ａ非Ｂ型肝炎発症時の肝細胞
向に出現する抗原に特異的に反応する。

クマトグラフイー等により棺長することができ１次のよ
うな性質を有する。

ｌ）蔗糖密度勾配遠心ε及びゲル濾過法による分子量が
約デθｏ、　ｏ　ｏ　ｏであり。

り８ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル′ｉＦ、、気泳動法
による分子量約４３，０００のＩ（ｄと分子量約コＪ、
０００のＬ鎖からなるチンパンジー又はヒトの工ｇＭ抗
体である。

Ｂ、マウスモノクローナル抗体の作製さらにこの抗体を用いて抗原測定法（たとえばラジオイ
ムノアッセイ系）を確立し、非Ａ非Ｂ型肝炎発症の肝細
胞内に出現する抗原を部分＃１製し、それをマウスに免
疫しその牌細胞とマウスミエローマの変異株を細胞融合
させ選択培地でハイプリドーマを選びだし非Ａ非Ｂ型肝
炎関連抗体陽性の培養細胞を得。

ついでこれをクローン化して目的とする抗体を産生ずる
細胞株を得ることができる。

抗原は、たとえば次のような方法によって得られる。

抗原の原料としては通常非Ａ非Ｂ型肝炎発症個体（ヒト
又はチンパンジー）の肝組織が用いられる。すなわち、
これをホモジナイズした後、ｇ、ｏｏｏ〜ｔｏ、ｏｏｏ
ｒ、ｐ、ｍ程［ｔｌ−ＪＯ分〜１時間程度遠心し、つい
で約１０万ｇａ度で超遠心し、沈査を得る。さらに、こ
の沈青な蔗糖、　ＣａＣ１，ＫＢｒ等による密度勾配遠
心に付すことにより、精製しうる。また。

必要に応じ、上記密度勾配遠心の前段として。

イオン交換体りａマドグラフィー又はアフイニテイ力ラ
ムクロマトグラフイーに付することかできる。また、上
記沈査を、任意の段階でゲルろ過クロマトグラフィーに
かけ含百フェリチンを除去することができる。

上記精製は、前記の抗体を用いて抗原をアッセイしなが
ら行なわれる。

アッセイを行なう場合、ラジオイムノアッセイ（Ｒ工Ａ
）ｆｆｉによるのが一般的であるが。

酵素抗体（１ＬＩａＡ　）法、受身赤血球凝集（ＰＨＡ
）２．等のアッセイ法によることもできる。

こりようにして得られる抗原は、蔗糖密度勾配遠心法に
よる密度が約／、／７〜／、コロであり、上記抗体と反
応し、非Ａ非Ｂ型肝炎に％異的である。

この抗原をマウスに免疫し、得られる牌細胞を抗体産生
細胞として、ミニロー？細胞と。

実施例に示すような方法により細胞融合させ。

目的とする抗体を産生ずる細胞を得ることができる。

このクローン化された細胞塊が人生する抗体は常法によ
り取得でき、この抗体は非Ａ非Ｂ型肝炎発症時の肝細胞
内に出現する抗原に特異的に反応する。

えられる抗体は、常法により、たとえば”　ｐｒｏｔｅ
ｉｎ　Ａ″−日ｏｐｎａｒｏｓｅ　−ＯＬ　−１ＩＴｐ
　等によるアフイニテイクａマドグラフィー等により精
製することができ、矢のような性質を有する。

ｌ）蔗糖密度勾配遠心法およびゲル濾過法により分子量
が約／　Ａ　Ｏ，０００であり。

；Ｉ）８ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
る分子量約ｔ　ｊ、　ｏ　ｏ　ｏのＨ鎖と分子量約ユＪ
、０００のＬｌｌからなるマウスエｇＧ抗体である。

（実施例）以下、実施例及び参考例により本発明をさらに詐細に説
明する。

参考例１１　非Ａ非Ｂ型肝炎発症時のチンパンジー末梢血９７７
球のトランスフォーメーションｌ）培　地ＲＰＭＩ／Ａ参〇培地に、リラシリンｉｏ。

μ＆／ＩｒＬｌ　、ストレプトマイシン１００μｇ／―
。

グルタεンユｍＭ、炭酸水素ナトリウム／、　Ａ　ＩＩ
ｌを加えた後、二＆化炭素を吹きこみｐＨ７，０〜？、
ＩＩとし、牛胎児血清（Ｆ’ｅｔａｌＣａｌｆ　Ｓｅｒ
ｕｍ　：　ＦｏＳ）を−０％となるように加えて便用す
る。

２）ＥＢウィルス液の作製ｍＢウィルスを産生ずるＢｆｊ−ｇ細胞（Ｐｒｏｃｅｅ
ａｉｐｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ａｃａｄｅｍｙ
　ｏｆ８０１１１ｎＯＩ８．　−７０（１）、　　／９
０−／９１７（／９　りＪ））をＪ　Ｘ　ｔｏ＠／ｍｌ
の細胞密度でＰＰＭ工１ｂｔｉ。

＋１０％ｙＣｓ培地を用いて７日間培養し。

ｏ、４Ｉｚμｍのミリポアフィルタ−で濾過した培養上
清をウィルス液として用いる。ウィルスの力価判定には
、Ｉ！ｌ帯血のトランスフォーメーションを利用したＴ
”ｉｏ／−を用いる。ウィルスは、その力価がｌ０ＩＩ
ＴＤｌｌ＋Ｉ／一以上のものを用いる。

３）　りンパ球の分離ヘパリン加採血した非Ａ非Ｂ型肝炎発症時１．θり７）
で単核球を分取し、末梢血リンパ球とし【用いる。上記
の方法で末梢血／　ｍｌ当り約１０６個の末梢血りンバ
球が分離される。

リ　ＥＢウィルスの吸着及び培養遠心により沈査とした末梢血リンパ球／　０”個当り／　ｍｅのＥＢウィルスｖ張（ｔ　Ｏ＠
　ＴＤｌ１６／ｍｅ以上）を加え、、７７Ｃで１時間放
置する。

その後、趙心によりウィルス液を除きＲＰＶ工／６ダＯ＋コ０％Ｆ’Ｏ日培地を刃口え細施靜
度を調整し、平底マイクロタイタープレートにｏ、　ｉ
　ｔｎｌずつｍｆｆｔｉｌをイ近えこむ。ｑ８後に培地
を０．　／　ｍｌｌ刀先以後ｌ〜り日に１度培地の半世
父撲乞行う。植えこむ細胞数によって異なるが、平底マ
イクロタイタープレートのウェル当９１０１個では、７
〜ＩＯ日で細胞が細胞集塊を形成し活発に増殖して（る
。通常、ＥＢウィルスを吸着させた末梢血リンパ球を、
平底マイクロタイタープレートのウェル当９７０３〜ｌ
Ｏ１個の細胞密度で植えこむ。

り培養上清中の非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗体の’ｒ’４　ｌ
ｆｌ。

細胞が増殖してぎたら、培養上？ｆｌを集め抗体価を一
１定する。その時期は、植えこむ細胞数によって異なる
が、３透口からｙ透口にかけて抗体活性陽性のウェルが
認められる。抗体陽性のウェルは、コグ穴マルチウェル
プレート、Ｊｔｙｍのシャーレ、４０朋のシャーレと培
ｔ＝ｉを拡大し、トランス７、＋ｌ−−ムロ週目位から
クローニングを行う。

コ　クローニング限界希釈法により行った。あらかじめ／　！　００　Ｒａｄ以上照射したバーキットリンパ腫
細胞をマイクロタイタープレートにウェル当りλｚ、ｏ
ｏｏ個植えこむ。次ＫＲＰＭＩ／Ａ４’Ｏ＋コ０％Ｆｏ
ｅ培地でｉｏ、ｓｒ、２．３．１個１０、／Ｍｌとなる
ように細胞を希釈し、これをマイクロタイタープレート
に０．　／　ｒＩＬｌずつ植えこみ培養する。ダ日後に
培地を０．　／　ｍｅ加え以後ｌＩ〜７日に１度培地の
半量父換を行５゜培養開始後７０〜２０日で肉眼で認め
られるコロニーが形成される。その結果クローン株を得
る。

Ｊ　抗体の取得および精製上記クローン株を０．３％牛血清アルブミン（Ｆ）１３
Ｂ）金魚血清培地（Ｒ工ＴＯｊｊ−デ培地）中で増殖さ
せ、培養上清を集め抗体を取得する。この上清を限外濾
過（分子ｔＪＯ万以下の分子を排除する）　後、、　”
　８ｅｐｈａｃｒ７１″日−３００によるゲル濾過クロ
ットグラフィ−（０，−Ｍホウ１１１瑳’ｉｉｕ液ｐＨ
９，０）で精製し抗体を得た。このチンパンジー型の精
製抗体は。

オフタロニー法および免疫電気泳動云で。

ＩｇＭ抗体に対応する沈降線を示した。還元条件下の８
Ｄ８を気泳動分析では工ｇＭのＨ鎖とＬ鎖に相当する一
本のバンドが認められた。

参考例コ参考９ｉＪ　／において、ヒト末梢血リンパ球を用いて
、下記軟寒天法によりクローニングを行なった以外は参
考９１１　／と同様にして、細胞株を得。

つ（・でヒト型の精製抗体を得た。

（軟寒天法）支ｊ・芋層θ、ｊ値、接穂層０．　Ｊ・ｈのアガロース
１リー／　　　　コロイ〆　　　　　　　　　シー　　
プラーク（Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｏ上１０１（Ｌ＋Ｂ社ｄ″
Ｓｅａ　Ｐｌａｑｕｅ″アガロース）を含むＲＰＭ工１
６ダ０＋−０％７０８培地を用いる。細胞はプレート当
り１００〜１０，０００個植えこむ。培養開始後ＩＯ−
λ０日で肉眼で認められるコロニーが形成される。この
時点で。

パスツールピペットを用いてコロニー製１汲い上げ、あ
らかじめ０．　／αのＲＰＭ工／６ダｏ＋、ｔｏ％ＦＣ
８培地を入れたマイクロタイタープレートに細胞を移し
て培養し、クローン株を得る。

なお、上記の精製抗体も、オフタロニー法および免疫電
気泳動伝で、工ｇｌ（抗体に対応する沈降線を示した。

また還元条件下のＢＤＢ＠気泳動分析ではＩｇＭのＨｇ
とＬ鎖に相半する一本のバンドが認められた。

参考例Ｊ（抗原の単離稍製法）（Ｉ）　　非Ａ非Ｂ型肝炎発症時のチンパンジー肝細胞
内に出現する抗原の４ｉ離精製法（１）非Ａ非Ｂ型肝炎発症時のチンパンジー肝細ｊ泡塊
Ｃ３ｋｇ＞を小片にミンスして、冷トリス緩衝？％！（
−！ｔＯｍＭトＩＪス塩酸緩衝液。

含０．ｌｋＭ塩化ナトリウムＪ６よびノｍＭＫＤＴＡ、
ｐＨ７，ｓ　）に懸濁し、全容積が３３０ｍ１になるよ
うにｖ！４製した。次に、外套が０℃によく冷えるよう
に設定したヒスコトロン超高速万能ホモジナイザー（Ｋ
、　Ｋ。

日音医理科器械製作所）でホモジナイズし。

ｇ、０００　ｒｐｍ、４４　Ｔ：、で１時間遠心し、そ
の上清をＪＯＯゴ採取した。

（２）　　このようにして得られた試料なＲＰ＋Ｊｏ−
１−（Ｈｌｔａａｈｉ）でＪ　Ｏ，υｏｏｒｐｍ、ａ℃
で１０時間超遠心を行い上清と沈査とに分別した。上清
と沈ｉ　（！ｒ　ＯｔｌＬｌ冷トリス緩＠液に懸濁可溶
化）について各々後述のラジオイムノアッセイ法により
抗原の測定を試みた。その結果９５％以上の抗原は沈査
に回収された。

（３）　　このようにして得られた抗原画分／７ｔｓｌ
を６０％頭糖コａおよびＪ０優蔗糖（Ｗ／Ｖ　。

トリス緩ｇＩ液）コＯｄの上に重層させ（遠心’ｇ　Ｊ
本）　、　ＲＰＢ−２！ｒ　ａ−ター（Ｈｌｔａｃｈｉ
）でコ！ｒ、０００ｒｐｍ、　ＩＩ　℃で、２４１時間
超遠心を行い上清と沈査（６０ｑｂ蔗糖上層）とに分別
した。上首と沈査（ｉｏ−冷トリス緩衝液に懸濁可溶化
）について各々ＲＩＡ法によシ抗原の測定を試みた。そ
の結果９ｊ−以上の抗原は沈査に回収された。

（４）　　このようにして得られた抗原画分ｊ−（遠心
管一本）を非平衡＃糖密度勾配遠心（Ｗ／Ｗ、　／θ−
４１ｓ％蔗糖密度勾配トリス緩衝液、ＲＰＢ−コＩｏ−
ター（Ｈｔｔａｃｈｉ）、コ！ｒ、０００ｒｐｍ、ｌＣ
，／時間）を行い）′ｙ１１７　ｔｕｂｅの分画を行い
、各々の両分についてＲＩＡ法によシ抗原の測定を試み
た。その結果、蔗糖濃度１ｇ％〜ダｌ−の両分に抗原が
回収された。

（５）　　このようにして得られた抗原画分、両分Ｉ：蔗糖濃度／ｌ〜−ｓ％画分■：蔗糖濃度λ！〜３３％および画分■：蔗糖濃度ＪＪ−ダ／％の各画分を各々 θＪｍ／１ｌＩＪｉｉｉＬ、蔗糖密度勾配遠心（Ｗ／Ｗ
、７０〜４０％蔗糖密度勾配トリス緩衝液１２ゴ、ＲＰ
Ｂ−４ＩＯＴローター　（ａｔｔａｃｈｔ）　、、２ダ
、　００ｏｒｐｍ、Ｉ　Ｃ、クコ時間）を行い、θ−７
ｔｅｌ／　ｔｕｂｅ　　の分画を行イ、各々の画分につ
いてＲＩＡ法により抗原の測定を試みた。その結果、画
分■、■、■ともに焦糖密度ｐ　＝　／、／　７〜八コ
ロの画分に抗原が回収された。

（ＩＩ）　　非Ａ非Ｂ型肝炎発症時のチンパンジー肝細
胞内に出ｉｔする抗原の単ｍｒｊｗ法（１）非Ａ非Ｂ型
肝炎発症時のチンパンジー肝細胞塊（ＪＡｆ）を小片に
ミンスして、冷トリス緩衝液（ｔＯｍＭトリス塩醒緩塩
液緩衝液、ｔｓｙｔ塩化ナトリウムおよび／ｍＭＥＤＴ
Ａ、ｐＨｔ、ｓ）　　に懸濁し、全容積が３１０艷にな
るように調製した。次に、外套が０℃によく冷えるよう
に設定した１ヒスコトロン”超高速万能ホモジナイザー
（Ｋ、に、日音医理科器械製作所）でホモジナイズし、
１．００Ｏｒｐｍ、　４ＩＣで１時間遠心し、その上清
をＪＯＯＩＬＩ採取した。

（２）　　このようにして得られた濃縮試料λコゴな６
０％蔗ｊ＠Ｊνおよびコ０鴨蔗糖（Ｗ／ｆｆ　。

トリス緩衝液）ａｏｍｌの上に重層させ（遠心管一本）
、ＲＰＩＩコロ−ター（Ｈｉｔ、ａｃｈｉ　）でＪｏ、
ｏｏｏｒｐｍ、ｕ’ｃでコ時間超遠心を行い上清と沈ｆ
（４０％蔗糟上層）とに分別した。上清と沈査（／１ｍ
ｊ冷トリス緩衝液に懸濁可溶化）について各々ＲＩＡ法
により抗原の測定を試みた。その結果テ３％以上の抗原
は沈査に回収された。

（３）　　このよ５ＫＬ、て得られた抗原画分７ａ（遠
心’ｆｌＡ本）をｇ　ａ密り勾配ｍ　心（”／”　。

１Ｏ−４（７慢蔗糖密度勾配、トリス緩衝液。

ＲＰＢ−コ！ａ−ター（Ｈｌｔａｃｈｉ）、　２１１．
００Ｏｒｐｍ、　　Ｉ　Ｃ，Ｊ　ｏ時間）を行い、１．
りＩＬｔ／ｔｕｂｅの分画を行い、各々の画分について
ＲＩＡ法により抗原の測定を試みた。その結果、蔗塘＠
度ρ＝／、／７〜／、コ乙の画分に抗原が回収された。

（４）　　この抗原画分をさらに（５）と同様の方法に
より人稟糖密度勾配遠心をくり返し、蔗糖密度ρ＝／、
／７〜／、２Ａの画分に抗原が回収された。

（５）　　このようにして得られた抗原画分をクロマト
グラフィー（トリス緩［りを行い抗原画分に混在するフ
ェリチンを除去した。

（ＩＩＩ）　　ラジオイムノアッセイｓ（Ｒ工Ａ）２０
ｃｍ＞に１ｒｎｌのＩＯ％Ｂ　８　Ａ　（Ｂｏｖｉｎｅ
Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｂｕｍｉｎ　、ウシ血清アルブミン）
０、−Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０）を流し
担体をアルブミンでブロックする。

λ　ポリスチレンチューブ（７ｔｘ　／−ｍｘ　）に、
ｔ　００　／ｊ　ｅｉＮａ１２ｓＩを分注する。

３３０μ／ＩｇＭ抗体（後述の参考例／で得うしたヒト
エｇＭモノクローン抗体、ＳＯμｇ、０．２Ｍホウ醒ナ
トリウム緩衝液液Ｈｖ、０）を刃口火よく攪拌する。

ｌＩ　５ｏｐＨｏラミｙＴ溶Ｑ（ｌｒｎ９／ｍ１０．２
Ｍホウ酸ナトリウム緩ｆ：ｆＩ液ｐＨ９，０）を加えよ
く攪拌し室温で１分間反応させる。

ｓ　　ｇｏμｌメタ重亜硫酸ナトリウム（ユｊＩｎ９７
ｍｌ、　　ｏ、コＭホウ酸ナトリウム緩液液ｐＨデ、ｏ
）を加えよく攪拌する。

１、　３００μ！ヨウ化カリ浴液（／■／プホウ酸ナト
ナトリウム緩衝液ｐＨ９，含０、７％Ｂ８Ａ）を加えよ
く攪拌する。

７．１日Ｑｐｈａ（ＬｅＸ″Ｇ−−ｊカラムでＩｇＭ画
分を分画する。

（１１）ラジオイムノアッセイ法／　　０．−Ｍホウ酸ナトリウム緩衝ｇｐＨ９，Ｏに可
ｍ化した工ｇＭ抗体（ｔｏｏｔｔｆｌ／ゴ）を’　Ｆａ
ｌＣＯｆ１″プレート（タル穴マイクロタイター）　（
’ＦａｌＯＯｎ　ｊ　９　／コ″）に吸着させる（９℃
、−昼夜）コ　抗体溶腋を除き０．０　／　Ｍ　１３　：／酸緩液
液ｐＨ７，コ（ＰＢＳ）で洗浄３％ｌ３ＥＩＡ−ＰＢＳ
でプレートをブロックする。

Ｊ　標伽抗原あるいは抗原画分をゼラチン−ＦＢ日（Ｏ
，２Ｚ％ゼラチンーＰＢＳ。

含０．０！％ＮＦ−’ＩＯおよび０．０２％ｙ　ａ　Ｎ
３　）で希釈し、１１１μｍをｄｕｐ　１　ｉ　ｃ　ａ
　ｔ　ｅで分圧し、２〜１６時間、室温で反応させる。

、トウイー／ｑ　　ＰＢＳ　−ｒ、ｗｅｅｎ”２Ｑ（ｏ、７％）で洗
浄する。

５１２ｓ工ラベル抗体をゼラチン−ＰＢＳで希釈し、　
ｚ　ｘ　ｔ　ｏ’　ｃｐｍ／！ｏ　ｔｔｌ　’ｆａＫ’
ｔヲ５０μノずつ分注し、コ〜１６時間、室温で反応さ
せる。

、トウイー／６　Ｐ　Ｂ　Ｓ　　　ｔｗｅｅｎ″２ｏで洗浄する。

７　個々のウェルを切断し、放射能活性をガンマ−カウ
ンターで測定する。

実施ｆＩＩｌ／　非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原に対するマウス特異抗体の
作製／）培　地ＲＰＭＩ＃４１培地に、リラシリン１００ｐ９／ｍｌ、
　ストレプトマイシｙ　ｉ　ｏ　ｏ　ｐ９７ｍ！　。

グルタミンコｍＭ、　炭酸水素ナトリウムｉ、　ｂ　ｙ
　／Ｊを加えた後二醗化炭素を吹き込みｐＨ７，０〜７
．４’とし牛胎児血清（ＦｅｔａｌＣａｌｆ　Ｓｅｒｕ
ｍ　：　ＦＯＥｉ　）を７０％となるように加えて使用
する。

コ）　ミエローマ細胞株Ｂａｌ’ｂ／ｃ−ｙウス由来の骨髄細胞ＭＯ−ＰＣｉ−
２１の体化細胞でＳアザグアニン耐性のＰ３ｉｘｂＪ−
ＡｇＪ−Ｕｌ（Ｐ、ｙＴＪ／）を用いた。これはグロプ
リンノンシクリーター株である。

Ｊ）免疫および抗体６１１定に用いる抗原は参考例Ｊに
従って分離することにより得られた。

４Ｉ）　　精製した非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原（ｌＯη／
ｍｅ）をフロイント完全アジュバントと等量混合、浮化
し、　Ｂａ１ｂ／ｃマウスに一匹当り００−ｓ　ｍｙ／
　ｏ、　ｓ　ａｔずつ腹腔に接糧−次感作した。３週間
後、抗原０．３ダ／　ｏ、　ｚ　ｍｔずつ腹腔または０
．　Ｊ　Ｑ　／　０．　Ｊ　Ｍｅずつ尾静脈に接種−次
感作した。そのダ日後の牌細胞を抗体産生細胞として、
ミエローマ細胞と細胞融合させた。

り細胞融合法ミニａ−で細胞、牌細胞ともにＨａｎｈｓ液で３回洗浄
徐、ＲＰＭＸ１４＊０　１０％ＷＯＢに浮遊させ細胞数
を算定する。１ｘ１０６個のＰＪＵ／に対してｔ、５−
ｉｏｘｔｏ・個の牌細胞を１〜３時間培養する。つぎに
ＭＫＭで遠心洗浄し、１０日を除きガラススビッツ試験
管に細胞を集める。上清を完全にとり去った後、ペレッ
ト状の細胞をほぐし。

あらかじめＪ７Ｃに温めておいたＰＢＢ液（ＰＥＧ−１
０００，Ｑ　ｕ、ｔ％含有ＭＥＭ）をｏ、　ｚ　Ｍｅ加
え、室温で１分間反応させた後。

Ｊ　？　℃（７）　Ｍ　Ｂ　Ｍ　１５　／　ｍｔを３０
秒ごトニｌ。

回加える。その間試カミ管をゆっくり回しし続ける。こ
のように細胞融合させた細胞を遠心洗浄し、ｐＪｕｉ細
胞数が５〜ＩＯ×ｔｏｓ、／ｒｕｌＫナルヨ５ＫＲＰＭ
Ｘｌ＆’ＩＯ含１０％ＦＣＢを加える。その０．２ｍ／
をマイクロタイタープレートに分注する。コク時間培養
後上清を半量すてＨＡＴ　（Ｈｙｐｏｚａｎｔｈｉｎ。

Ａｍ１ｎｏｐｔｅｒｉｎｅ、　’ｒｈｙｍｉｄｉｎｅ　
）培地を加える。

以仔この機作を９８時間ごとに一週間繰り返ス。ミエロ
ーマ細胞および牌細胞ともにＨＡＴ培地中では壜殖でき
ないので増殖しハイツリドーｉてくる細胞はｈ７ｂｒｉａｏｔｎａと考えられる。した
がって、ｉｏ〜ｌダ日後増殖してきたハイプリドーマの
認められるウェルの培警液についてのみ抗体活性を調べ
た。

６）抗体活性のスクリーニング抗体活性のスクリーニングは１次に示すラジオイムノア
ッセイ法により行った。

ラジオイムノアッセイ法（そのｌ）／　　０．−Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９，０に可
溶化したｆｆ１Ｂウイルストランスフオームεにより得
られた１ｇＭ抗体（参考例１、コ）（１ｏｏａｊＪ／ｍ
Ｌ）を”Ｆａｌｃｏｎ”プレート（９６穴マイクロメイ
タ−プレ＋　）、　　”Ｆａｌｃｏｎ　Ｊ９／Ｊ”）に
吸着させる（ダＣ１−昼夜）。

コ　抗体ｆ１５ｆｆｉを除き０．０／ｕリン酸緩衝液ｐ
ｕ　ｔ、ａ　（ＰＢＸ）　で洗Ｒｋｊ−９６Ｂ８Ａ−Ｐ
ＢＸでプレートをブロックスル。

Ｊ　標準抗原をゼラチン−Ｐ　Ｂ　Ｂ　（０，１！囁ゼ
ラチン−ＰＢＳ、含０．０３％ＮＰ−４ＩＯおよび０．
０−％Ｎ’Ｎｓ）”ｅ希１１＜Ｌ。

！ＯμｊをｄｕｐｌｉＯＩＬｔｅで分圧し、−〜１６時
間、室温で反応させる。

ＩＩ　　ＰＢＢ−Ｔｗｅｅｎ−２０”　（０，１％　）
　”ｅ洗浄する。

３　ハイプリドーマの認められるウェルの培Ｊ［を！　
Ｄ　ｉａｌず”）分注１．、、　Ｊ　〜／　４時間室温
で反応させる。

４　　Ｐ−ＢＳ−＠Ｔｗｅａｎ−２０”で洗浄する。

７　　ＩｎＩラベル抗マ抗マウスイムノグリプリン抗体
ラチン−ＰＢＢで希釈し、Ｓ×／　０’　ｃｐｍ／　ｊ
　Ｏｆｉｇ溶液をｚ　ｏ　ｐｉずつ分注し、Ｊ〜７６時
間、室温で反応させる。

ＩＩ　　Ｐ　Ｂ　Ｂ　−’　Ｔｗｅｅｎ−２０”で洗浄
する。

デ　個々のウェルを切断し、放射能１δ性なガンマ−カ
ウンターで錦１定する。

ラジオイムノアッセイ（そのコ）／　　ＰＢＢにＯＫ溶化した抗マウスイムノブＣＩ２リ
ン抗体（ＩｇＧサブクラス、ｌｏμｇ／ｗｄ　）　ｙ″
ｙａＩｃｏｎ″ｙａＩｃｏｎ″グレートタイタープレー
ト、″’Ｆａ↓ｃｏｎｅ？／コ″）に吸着させる（ダ℃
、−昼夜）。

コ　抗Ｓ＆各１！＆な除き０．０ＩＭｌ’ＢＢで洗浄ｊ
慢Ｂ８Ａ−ＰＢ８でプレートをブロックする。

Ｊ　ハイプリドーマの認められるウェルの培魯液をｇｏ
μｅずつ分注し、２〜！６時１１１１室α↓で反応させ
る。

ｘｉ　　ＰＢＳ−”Ｔｗｅｅｎ、２０″で洗浄する。

Ｓ　忙準抗原をゼラチン−Ｉ’ＢＳで希釈し。

ｓ　ｏ　ｔｔｌをｄｕｐｌｉｃａｔｅで分注し、−〜１
６時間室温で反応させる。

６ｐ　ｎ　ｓ　−”　Ｔｗｅｅｎ　２０　”で洗浄する
。

７　１２Ｂ工ラベル抗体（ｆｆｉＢウィルストランスフ
オーム法により得られた工ｇＭ抗体。

参考９ＩＪ／　、コ）をゼラチンＰＢ８で希釈し、　ｓ
　ｘ　ｔ　ｏ４ｃｐｒｎ／ｒ　ｏ　μＪ！’溶液を！０
ｆｉｌずつ分注し、２〜１６時間、室温で反応させる。

ｇ　　Ｉ’ＢＳ−″’ｒｗｅｅｎ−−Ｑ″で洗浄する。

９　個々のウェルを切断し、放射能活性をガンマ−カウ
ンターで測定する。

上述の方法に従い得られたハイプリドーマｔ、″！ｉ養
液上汀ｔをマイクロタイタープレート内で、２ｎ希釈し
、ラジオイムノアッセイ法によりｖＱＩＪと判定される
ｉｆ！Ｌ高希釈倍数をもってハイプリドーマの分泌する
抗体価とした。

り）　クローニング限界希釈法によりクローニングを行った。

マウスの牌細胞を／ｊ％Ｐ　ＣＢ　含有ＲＰＭＸ／ｌ、
ｌＩＯ培地１／Ｃ／　０７ｃｅｌｌｓ　／ｒｒｔｌとな
るように懸濁しｆｅｅｄｅｒ　１ａｙｅｒ　　とした。

ハイブリドーマを／、０．コ、　０．／　ｃｅｌｌｓ　
／ｗｅｌｌの３段階に希釈しゾロ穴マイクロタイタープ
レートＩｃ　Ｏ，／　ｍずつまいた。１週間後倒立顕微
鏡でｌコロニー／ｗｅｌｌのものを探し、上述のラジオ
イムノアッセイ法により測定した。

さらに数回のクローニングをくり返し抗体産生能が安定
で、細胞の生育が良いりｏ　−ンを選択した。

Ｓ）抗体の取得および精製上記りａ−ン株をＯ，Ｓ％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）
台無血清培地（ＮＹＳＦ−１ＩＯＩＩ培地）中で増殖さ
せ、培養上清を集め抗体を取得する。この上清を硫安で
塩析・濃縮後。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ日ｅｐｈａｒｏｓｅ　’　−ＯＬ　
−ＩＩ　Ｂによるアフイニテイクロマトグラフイー（’ＭＡＰ８バッファー”、　Ｂｉｏ　−Ｒａｄ社製）
で精製し抗体を得た。このマウス由来の精製抗体は、オ
フタロニー法および免疫電気泳動法で工ｇＭ抗体に対応
する沈降線を示した。還元条件下のＳＤＳ［気泳動分析
では工ｇ（）のＨｇ４とＬ鎖に相当する一本のバンドが
認められた。

参考ｆ１１１（１）　　非Ａ　ｑ　Ｂ型肝炎陽性肝組織との反応性実
施例１で得られた抗体を用いて、非Ａ非Ｂ型肝炎発症時
の肝組織を螢光抗体法により反応させ反応性の有無を調
べた。

すなわち、クリオスタットで薄切した肝組織切片をアセ
トンで室温で７０分間処置する。

乾燥後、上記の非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗体（−次抗体）を
切片の上にのせ湿潤箱に入れて、？７ＣでＡＯ分間反応
させる。このときに用いる抗体液は、あらかじめｙ反を
適当に希釈したものを用いるＰＢ８で一次抗体を洗い流
し、振盪しながらＰＢＳ中で洗浄する。次にＦＩＴＣラ
ベルした抗マウスイムノグロブリン抗体（２次抗体）を
上記と同様に３７℃で６Ｑ分間反応させる。ＰＢＳで標
識抗体を洗い流し、振盪しながらＰＢＳ中で洗浄する。

風乾後、封入剤〔グリセリｙ　：　０．　ｋ　Ｍ　Ｎａ
２Ｃｏ、−ＮａＨＯＯ３緩衝液（デ：ｌ）〕を滴下し、
カバーグラスで封入する。水銀ランプを光源とした螢光
顕ａ鏡を用いて観察する。

その結果１本抗体は、非Ａ非Ｂ型肝炎の発症時に出現し
た抗原に対して反応する抗体であることが判明した。

（２）　　非Ａ非Ｂ型肝炎陰性肝組織との反応性上記（
１）におけると同様の方法で、実施例／で得られた抗体
を用いて、非Ａ非Ｂ型肝炎陰性肝組織を螢光抗体法によ
り反応させ反応性の有無を調べた。

その結果１本抗体は、Ａ型肝炎もしくはＢ型肝炎の肝組
織切片と反応せす、非ウィルス性肝炎の肝組織切片とも
反応せず、また、正常肝組織切片とも反応しないことが
判明した。

（発明の効果）本発明に係るモノクローナル抗体は、非Ａ非Ｂ型肝炎抗
原に特異的であり、非Ａ非Ｂ型肝炎の診断、輸血用血清
のスクリーニング、原因ウィルスの精製等に有用である
。さらに１本杭体は非Ａ非Ｂ型肝炎の治療にも有効であ
ると期待される。

出　願　人　三菱化成工業株式会社代　理　人　弁理士　長谷用　　− はか１名手続補正書（自発）１　事件の表示　昭和６／年　特　許　願第−≠７グ２
　号２　発　明　の名称　　モノクローナル抗体３　補
正をする者出願人　（ｔｐ４）三菱化成工業株式会社１？か一３名４代理人〒１００（ほか　ｌ　名）５　補正の対象　　明細書の「発明の詳細な説明」の欄
−／ｌ　Ｉ−Ｕ／Ｊとあるを「ｐ　Ｊ−Ｘ　６ｊ−Ａ　
、ｊ７　ｆｆ−Ｕ　／Ｊと訂正する。

（２）　　同書筒、２ｇ頁第６行に「工ｆ／Ｍ　抗体」
とあるを「工ｇａ　　抗体」と訂正する。

以　　上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）非Ａ非Ｂ型肝炎発症時の肝細胞内に出現する抗原
に特異的に反応するマウスモノクローナル抗体。