JPS58183629A - 非ａ非ｂ型肝炎関連モノクロナ−ル抗体および診断薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は非Ａ非Ｂ型肝炎関連モノクロナール抗体、該抗
体を含有する培養組成物および診断薬に関する。

ウィルス肝炎については従来よりＡ型およびＢ型の存在
が知られており、すでに関連抗原抗体系も明らかにされ
、これを利用した免疫血清学的な診断が可能となり、さ
らにワクチンの開発、導入にまで至っている。

しかしながら、これに伴って非Ａ非１３型肝炎。

すなわち、従来から知られているＡ型肝炎および１３型
肝炎のいずれにも属さないウィルス゛肝パ炎の存在が知
られるようになり、しかもその発生頻度が予想以上に高
いことが明らかとなって来た。例えば、輸面後肝炎の８
０〜９０９６あるいはさらにこれ以−Ｌのものが非Ａ非
Ｂ型肝炎であり、散発的に発生する急性肝炎についても
約５０９６は非Ａ非１３型肝炎であることが報告される
に至っている。また正常供血者の中にさえ非Ａ非Ｂ型肝
炎ウィルスの保有者がかなりの数存在することが明らか
となって来た。以下に記載する文献は非Ａ非１３型肝炎
に関する上述の状況を報告するものであり、参考のため
に列挙する。

１　’）　Ｐｒ１ｎｃｅ、　Ａ、Ｍ、ｅｔ　ａｌ、　：
Ｌｏｎｇ−ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓ
ｆｕｓｉｏｎ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　ｗｉｔｈｏｕｔｓ
ｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｏｆ　ｅｘ
ｐｏｓｕｒｅ　ｔ。

ｈｅｐａｔｉｔｉｓ−Ｂ　ｖｉｒｕｓ、　Ｌａｎｃｅｔ
、　ＩＩ：２４１−２４６＋１９７４゜ ２　）Ａｌｔｅｒ、　ｆ（、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、　：Ｃ
１１ｎｉｃａｌ　ａｎｄ　ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌａｎ
ａｌｙｓｉｓ　　ｏｆ　　ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ−ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｄｈｅｐａｔｉｔｉｓ、Ｌａｎｃｅｔ
、　ＩＩ　：　８３８−８４１．１９７５゜３　）　ｌ
；’ｅｉｎｓｔｏｎｅ、　Ｓ、Ｍ、　ｅｔ　ａｔ、　：
　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｈｅ
ｐａｔｉｔｉｓ　ｎｏｔ　ｄｕｅ　　ｔｏ　ｖｉｒａｌ
　　ｂｅｐａｔｉｔｉｓｔｙｐｅ　Ａ　ｏｒ　１３．Ｎ
、ｈ；ｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、　２９２　：　７６７−７
７０．１９７５゜ ４　）Ｍｅｙｅｒｓ、　Ｊ、　Ｉ）、　ｅｔ　ａｌ、　
　：　Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙｔｒａｎｓｍｉｔｔｅ
ｄ　　ｎｏｎ−Ａ、ｎｏｎ−Ｂ　　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ
。

Ａｎｎ、Ｉｎｔｅｒｎ、Ｍｅｄ、８７　：　５７−５９
＋　１９７７゜５　）　　Ｖｉｌｌａｒｅｊｏｓ、　Ｖ
、Ｍ、　ｅｌ、ａｌ、　　：　ｈ３ｖｉｄｅｎｃｅ　ｆ
ｏｒｖｉｒａｌ　　ｂｅｐａｔｉｔｉｓ　ｏｔｈｅｎ　
ｔｈａｎ　　ｔｙｐｅ　Ａ　ｏｒｔｙｐｅ　　Ｈａｍｏ
ｎｇ　　ｐｅｒｓｏｎｓ　　ｉｎ　　Ｃｏ５ｔａ　　Ｒ
ｉｃａ。

Ｎｕうｎｇｌ、　Ｊ、　ＩＩＪｅｄ、　２９３　：　１
３５０　１３５２．１９７５−６　）　　Ｉ）ｉｅｎｓ
ｔａｇ、　、Ｔ、　Ｌ、　　ｅｔ　　ａｌ、　　：　　
Ｅｔｉｏｌｏｇｙ　　ｏｆｓｐｏｒａｄｉｃ　ｈｅｐａ
ｔｉｔｉｓ　Ｂ　５ｕｒｆａｃｅ　ａｎｔｉｇｅｎ−ｎ
ｅｇａｔｉｖｅ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ、　Ａｎｎ、　Ｉ
ｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ、　８７　：１−６．１９７７゜ さて、ここで非Ａ非Ｂ型肝炎とはＡ型肝炎ウィルス、Ｂ
型肝炎ウィルス、サイトメガロウィルス。

エプスタインバーウィルスなど従来知られたウィルス以
外のウィルスが病原体として関与することにより発生す
ると考えられる肝炎であって、ｔＩＡ抗体、　Ｈ１ｉｓ
抗体、　［（Ｂｃ抗体、　［（１３ｅ抗体について有意
の」１昇が認められないものを言う。従って。

非Ａ非Ｂ型肝炎患者とは、肝炎ウィルスに起因する肝炎
患者であってＡ型肝炎診断および１ＢＢ型肝炎断におい
て陰性を示し、Ａ型肝炎からもＢ型肝炎からも除外され
た患者であると定義される。一般に非Ａ非Ｂ型肝炎では
、Ｂ型肝炎に比較すると輸血から発症までの平均潜伏期
が短く、またＧＰＴの最大値も低いという傾向がある。

しかしその反面、持続性があり９例えばＱＰＴ異常は慢
性化してかなりの長期間に及ぶという特徴がある。しか
し、いずれにせよ、非Ａ非Ｂ型肝炎は輸血後肝炎の大部
分を占めており、かつ非Ａ−非Ｂ型肝炎ウィルスが原因
となる肝疾患は肝硬変、肝癌など広範囲に及んでおり、
適切なる対応策が早急に開発されることが望まれている
のである。

かかる実情にかんがみ２本発明者の一部の者は非Ａ非Ｂ
型肝炎について一般的であり、かつ非Ａ非Ｂ型肝炎に特
異的である関連抗原を物質として単離することを試み、
その結果、非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝からの分離精製により
所期の物質を収得することに成功し、特願昭５６−８３
７３６によって特定される特許出願をおこなった。また
さらに引き続き、当該物質を用いて非Ａ非Ｂ型肝炎関連
抗体を免疫学的手法により作製することを試み。

これに成功し、特願昭５６−９７４２５によって特定さ
れる特許出願をおこなった。

これら特許出願された発明は非Ａ非Ｂ型肝炎の直接的な
診断を初めて可能にした点においてきわめて有意義なも
のであったと言うことができる。

しかしながら、当該発明に係る生産方法を実施した場合
において、それによって収得される当該発明物質の量は
すこぶる僅微であり、従って、実用化については未だ困
難な問題が残されていた。特に非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗体
は診断ばかりでなく。

非Ａ非Ｂ型肝炎の治療の目的においても多量に使用され
ることが予想されるものであるから、これを実用的規模
において１例えば培養によって多量に収得することが求
められるのである。また前記発明の非Ａ非Ｂ型肝炎関連
抗体は複数の抗原決定基をもつ抗原分子を使用してこれ
から免疫学的に作製したものであるから、これら抗原決
定基に対応する抗体の混合物として与えられている。従
って該混合物は非Ａ非Ｂ型肝炎関連の抗原決定基のみな
らず、他の抗原決定基とも反応する可能性があるのであ
る。それゆえ２診断薬としての有用性をさらに向−ヒさ
せるためには、抗体が非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原分子の−
Ｌの一つの抗原決定基と特異的に結合する抗体として作
製されることが要求されるのである。

かかる実情にかんがみ２本発明者はに：ｈｌｅｒおよび
ＭｉｌｓｔｅｉｎがＮａｔｕｒｅ　２５６４９５〜４９
７（１９７５）において開示した細胞融合技術を応用し
て非Ａ非１３型肝炎関連モノクロナール抗体を収得する
ことを検討した。その結果、新規なハイブリドーマなら
びにそれの培養組成物の収得およびモノクロナール抗体
の継続的な収得に成功し１本発明を完成するに至った。

細胞融合技術は融合細胞の培養により均質な、いわゆる
モノクロナールな抗体を連続的に生産せしめることを可
能にする技術であり。

その生産方法の一般的な概要自体はすでに公知である。

しかし得られる本発明モノクロナール抗体は新規物質で
あり、非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原に対して特異的な抗原抗
体反応を呈する。従って２本発明抗体は抗体サンドイツ
チ法を利用することによって非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原を
特異的に検出かつ定量することを可能にし、また抗原イ
ンヒビッション法を利用することによって非Ａ非Ｂ型肝
炎関連抗体をも特異的に検出かつ定量することを可能に
する。すなわち本発明抗体によって感度の高い診断薬の
提供が可能になるのである。また本発明抗体は量産可能
であり、かつ高力価である。すなわち１本発明抗体を産
生ずるハイブリドーマを生体内培養、とりわけ腹腔内培
養することによって、腹水中にこれを多量に生産せしめ
ることができ、かつ、高力価なものとして収得すること
ができるのである。

以」ユのごとく２本発明モノクロナール抗体は新規物質
であるばかりでなく、非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原に対して
免疫学的に特異的であり、従って、非Ａ非１３型肝炎関
連抗原および非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗体を高感度に測定す
ることのできる診断薬の提供を可能にする点、さらに量
産可能であり、高力価である点において進歩性がある。

次に本発明の構成について説明する。

本発明に係る非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原は前記特願昭５６
−８３７３６の明細書に詳記されるごとく非Ａ非Ｂ型肝
炎患者剖検肝を出発物質として通常のタンパク公開精製
法１例えば密度勾配遠心分離法、塩析法、電気泳動法、
ゲル濾過法、アフィニティークロマトグラフィー法９等
電点分劃法。

限外濾過法、コーンの分割法を適宜組合わせて収得する
ことができる。好ましい実施例の概要をもって説明すれ
ば、まず剖検肝ホモジネート上清について例えばセファ
クリルＳ−２００を用いてカラムクロマトグラフィー公
開を行い、得られた抗原陽性フラクションを限外濾過し
て加圧濃縮し。

最後に超遠心分離と透析を繰返す。ここで超遠心分離に
は蔗糖濃度勾配遠心および塩化セシウム密度勾配遠心を
組合わせて一回ないし数回行うのが好ましい。得られた
精製物は寒天ゲル内反応により非Ａ非Ｂ型肝炎回復期血
清との間に明瞭な一本の沈降線を示し、精製前の剖検肝
ホモジネート上清における沈降線と完全に融合すること
が確認される。

当該抗原の理化学的性状は以下のごとくである。

分子量はゲル濾過法により求めると１５０万以上である
。沈降定数（１０）はＢｅｃｋｍａｎｎ　Ｍｏｄｅｌ　
Ｅで測定すると５１．５８を示す。塩化セシウムまたは
臭化カリウム溶液中の浮上密度（９／ｃＪ）はアツベの
屈折計によって求めると１．１５〜１．２５である。粒
子直径（ｎｍ　）　　は電子顕微鏡観察によると２６〜
３７（平均３１．５）である。電気的移動度は免疫電気
泳動法により求めるとα２−α１グロブリンの領域であ
る。

また免疫学的性状は以下のごとくである。

非Ａ非Ｂ型肝炎回復期患者血清および頻回輸血歴のある
患者の血清との間に寒天ゲル内の沈降反応を示す。また
当該抗原を感作した羊赤血球は非Ａ非Ｂ型肝炎患者の回
復期血清との間に特異的にしかも高感度で受身赤血球凝
集反応を示す。その反面、［（Ａ抗体、　［（Ｂｓ抗体
、ＨＢｅ抗体、Ｈ１ｄｅ抗体、δ抗体、ＨＣ抗体、Ｅｌ
ｌ抗体、　Ａｒａｉ抗体。

Ｆ抗体、正常ヒト肝上清抗体、および各種の正常ヒト血
漿抗体のいずれとも反応を示さない。従って、当該抗原
は非Ａ非Ｂ型肝炎について一般的であり、かつ非Ａ非Ｂ
型肝炎に特異的な関連抗原であることが判明する。

当該抗原は適当なアジュバント、例えばフロイント完全
アジュバントと共に動物に頻回投与することによって当
該抗原に対する免疫抗体を産生せしめることができる。

従って１例えば免疫動物としてＢＡＬＢ／Ｃマウスを使
用し、当該抗原を１〜加μｇ／動物の量の皮下性によっ
て第一回目の投与をおこない、９０〜１２０日経過後に
再び当該抗原をアジュバント抜きで前記動物に１〜２０
μダ／動物の量の静脈内注射によって第２回目の投与を
おこなえば目的が達成される。後記実施例においては当
該抗原をｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａ
ｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に溶解して８５μｆ／、ｌとし、こ
の０２−にフロイント完全アジュバントの２ｍｌを加え
ＢＡＬＢ／Ｃマウスに第１回目の皮下投与をおこない、
１００日経過後第２回目の同量の抗原液の静脈内投与を
おこなった。

次に免疫動物から抗体産生細胞を取得するのであるが２
通常は牌細胞を利用するのが便利であり。

例えば前記ＢＡＬＢ／Ｃマウスの牌臓を抗原第２回目投
与から３日経過後に摘出し、　ＲＰ　Ｍ　ｌ−１６４０
培地中で細片番ご砕き、得られる懸濁液を１（、）’Ｍ
ｌ−１６４０中で遠心分離とデカントにより３回洗い。

細胞ペレットをｌｊ　Ｐ　Ｍ　ｌ−１６４０中に再懸濁
して調整すればよい。

細胞融合用に使用する骨髄腫細胞系Ｐ３−Ｎ　Ｓ　Ｉ　
／　ｌ　−ＡＪ　４−１は２例えばＫｏｈｌｅｒ　等に
よってＥｕｒ、　Ｊ、　Ｉｒｒｒｎｕｎｏｌ、　Ｖｏｌ
　６　（１９７６）　２９２−２９５に記載されている
ようにｔ３ＡＬＢ／ＣマウスＭＯＰＣ２１から誘導され
た。これを以後ミエローマ細胞Ｎ５−１と呼ぶ。この種
の細胞は８−アザグアニンに対し耐性であり、酵素ヒボ
キサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラー
ゼを欠（ためにピポキサンチン−アミノプテリン−チミ
ジンを含有する培地（ＥｌＡ　Ｔ培地）中で死滅する。

なお、継代は８−アザグアニン２０μ９／ｍｌ。

１０％ｖ　／　ｖ胎児修生血清を補充した１１．ＰＭＩ
−１６４０培地でおこない、培地の交換は４日以内にお
こなうようにした。融合後のＨＡＴ培地による選択、ク
ローニングは１５％ｖ／ｖ　　胎児修生血清を補充した
ＲＰＭｉ−１６４０培地でおこなった。

細胞融合に使用する融合剤は一般に平均分子量が約１０
００〜６０００であるポリエチレングリコールが従来か
ら使用されており、特にポリエチレングリコール１５０
０は最も効率がよいといわれている。またその最適濃度
はポリエチレングリコールの分子量に応じて４０〜５０
％ｗ／ｖが望ましく。

例えばポリエチレングリコール１５００を使用する場合
には、ポリエチレングリコールにその１ｙ当り胎児仔牛
血清不含のＩＮＰＭＩ−１６４０を１ｍｌ加え溶解し、
用時３７°Ｃに加温して使用すればよい。

細胞融合は以下のごとくおこなう。

まず抗体産生細胞２例えば前記牌細胞およびミエローマ
細胞Ｎ５−１　　を胎児仔牛血清不含のＩｔ　Ｐ　Ｍ　
Ｉ　−１，６４０培地で洗い１次に細胞数において前者
と後者とを４：１〜１０：１の比率で混合し。

８００ｇで５分間遠心してペレットに形成せしめデカン
トで完全に培地を除（。これに３７℃に加温した前者融
合剤を細胞数約１〜２×１伊個当り１□）の割合で撹拌
しなから滴々加え、さらに撹拌を続けながら血清不含の
培地１０−を例えば５〜１０分間かけて徐々に加え、最
後に４００ｙで５分間遠心分離してポリエチレングリコ
ールを除き、１５９６ｖ／ｖ胎児仔牛血清含有のＲ，Ｐ
ＭＩ−１６４０培地加〜２００ｒｒＬｌに再懸濁し、融
合を完了する。

次に親細胞からの分離は例えば以下のととくＨＡ　Ｔ培
地中での培養によっておこなうことができる（　Ｉ（Ａ
　Ｔセレクション）。まず、９６穴の組織培養用平板の
各穴に前記懸濁液０．２１ｎｌ（細胞数１０ｓ〜１０６
個）を入れる。次に２〜４日おきに培地の半分をｌ（Ａ
’Ｉ’培地で置換する。１４日目以降には培地の置換を
ＨＴ培地で少なくとも２回以上おこない、その後にＲＰ
　Ｍ　Ｉ培地に変換する。

この１（ＡＴセレクションにおいて親細胞は死滅し、融
合細胞のみが残存する。次に当該残存融合細胞の中から
目的の非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗体を産生ずる細胞のみを適
当な方法１例えば受身赤血球凝集反応法（ＰＩ（Ａ法）
を用いて目的の抗体を産生じているか否かをチェックし
なからスクリーニングする。後記実施例においてはスク
リーニングをＰＨＡ法で測定した場合、凝集価が４倍以
」二となったときに抗体産生が陽性であると判定してお
こなった。

次に抗体陽性融合細胞を適当な方法で分別・培養し、単
一細胞から由来する単一クローン細胞株を作成する。こ
の操作をクローニングと呼び、その方法としては下記の
ごときリミティングダイリューション（限界希釈）法が
好ましい。

例えば胎児修生血清を補充し、かつＢＡＬＢ／Ｃマウス
の胸腺細胞をフィーダーとして補充したＲＰＭＩ−１６
４０培地で細胞懸濁液を細胞数１５個／ｄに希釈し、９
６穴の組織培養平板に０２−（細胞数３個／穴）ずつ入
れ培養し、細胞増殖の認められた穴の培養上清をスクリ
ーニングと同じ方法で抗体産生の有無をチェックする。

このリミティングダイリューション（限界希釈）による
クローニング操作を２回目以降においてはｌ穴当り１個
の細胞を入れる割合で計３回繰り返えす。

後記実施例に記載のごとく融合後クローニング終了に至
るまでの操作によって得られた結果は次のどと（であっ
た。すなわち、融合後最初に９６穴組織培養用平板の３
１５穴に培養したもののうち。

ＨＡ　Ｔ培地およびＨＴ’培地中で生存を示したのは１
５０穴であり、その中で抗体を産生ずる能力のある細胞
を含んでいたものは１６穴であった。ここから」１記ク
ローニング操作により最終的に１４クローンの単一クロ
ーン細胞株が得られた。これらにおけルハイブ＋）　Ｍ
−マヲＡＴ−Ｆ’−１乃至Ａ、ｉ’　−ｔ゛−１４の識
別表示をもってそれぞれ命名し、工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託申請した。またこの細胞株を生体外培
養することによって得られた培養」−清中のモノクロー
ナル抗体を硫安法で沈澱し、１３１３８で透析し、免疫
グロブリンの存在についてマイクロオフタロ二−法ｆ’
ＭＯ法）によって分析したところＩＱＧＩまたは■９・
Ｍ・の存在が確認された。

次にクローニングによってモノクローナル化した陽性ハ
イブリドーマは以下に示すようにこれを生体外培養、ま
たは生体内培養によって増殖せしめることができる。

生体外培養は他の免疫グロブリンを含まない純粋なモノ
クローナル抗体を得ることのできる方法であり９本発明
に係る陽性／１イブリドーマを適当な栄養培地１例えば
胎児修生血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で適
当時間培養すればよい。

生体内培養はわずかに他の免疫グロブリンを夾雑する結
果となるものの、非常に多量のモノクローナル抗体を産
生ずることのできる方法であり。

例えばあらかじめＢＡＬＢ／Ｃマウスにプリスタン（２
，６，１０，１４−テレラメチルペンタデカン）を腹腔
内投与して２日以上経過後１本発明に係る陽性ハイブリ
ドーマを腹腔内投与し、２〜３週を要して腹水腫瘍とし
てマウスの体内に増殖・定着せしめればよい。当該培養
後腹水およびまたは血清を採取し、塩析、クロマトグラ
フィー等の分離精製操作をおこなえば１本発明モノクロ
ナール抗体を得ることができる。例えば後記実施例に示
されるごと＜　ＢＡＬＢ／Ｃマウスにプリスタン０．５
　ｒ、４を腹腔内投与し、２〜３０日後、陽性／％イブ
リドーマ２〜４Ｘ１０’個を腹腔内投与し、２〜３週後
に腹水をとり２本発明に係る非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原に
対する特異的な抗体活性をＰ　ＨＡ法およびＭＯ法によ
って確認し、　　５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００を用
いるクロマトグラフィーによって免疫グロブリンの分画
をおこない、ＰＨＡ法によって陽性フラクションを確認
し、プールすればよい。

本発明モノクロナール抗体は後記実験例によって示され
るごとく本発明に係る非Ａ非１３型肝炎関連抗原との間
において特異的な抗原抗体反応を呈する。これは本発明
抗体を特定する性状であり。

この性状を利用して、同じく後記実験例によって示され
るごとく、非常に高感度に非Ａ非１３型肝炎関連抗原お
よび非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原を検出かつ定量することの
できる診断薬が提供される。ここに得られる診断薬は本
発明モノクロナール抗体を主要な構成成分として含有す
る診断薬であって当該抗体の特定の性質を専ら利用する
物の発明であるから、特定発明に対し一定の関係をもっ
て成立する別の発明である。

次に本発明診断薬は本発明抗体を使用していづれの免疫
学的試験方法を利用するものであってもよく免疫学的試
験方法に応じて適宜に調製することができる。例えば試
験方法としてマイクロオフタロニー法（ＭＯ）、免疫電
気泳動法（ＩＥＳ。

ＩＥＰ）、補体結合反応法（ＣＦ）、免疫粘着血球凝集
反応法（ＩＡＨＡ）、−元平板免疫拡散法（ＳＪ、ｊＩ
Ｄ）を利用する場合には本発明抗体をそのまま使用して
適当な形態に調製すればよい。−例として一元平板免疫
拡散法を利用する場合を示せば、支持体として寒天、ア
ガロース、デンプン。

ポリアクリルアミドゲル等の中から適当なものをはプラ
スチック容器内に流し冷却固化し、固化したゲル平板に
被検血清注入用の孔をあければよい。

また、試験方法として逆受身赤血球凝集反応法（ｉｔ　
−１）　ｔ（Ａ）　、放射性免疫測定法（ＲＩＡ、）。

酵素抗体法（ＪＵｉＡ）等を利用する場合には本発明抗
体を適当なる結合体として使用すればよい。

すなわち、逆受身赤血球凝集反応法（ｌ（−ＰＨＡ）を
利用する場合には本発明抗体を微小粒子に結合させる。

微小粒子としては哺乳類および鳥類の赤血球が好ましい
が、その他、ポリスチレンラテックス、ポリエステルラ
テックス、塩化ビニル、ベントナイト、ガラスピーズ等
も使用することができる。本発明抗体と微小粒子を結合
させるには。

例えばゲルタールアルデヒド、ホルムアルデヒド。

タンニン酸、ビスジアゾダイズベンチジン、塩化クロム
、カルボジイミドなどを使用すればよい。

放射性免疫測定法（ｌ（、ＩＡ）を利用する場合には本
発明抗体をアイソトープでラベル化する。アイソトープ
としては＋２５　（、＋３１　（を使用することができ
、クロラミンＴ法により結合させればよい。

酵素抗体法（’ＥＬＩＳＡ）を利用する場合には。

本発明抗体を酵素と結合させる。酵素としては。

例えばグルコースオキシダーゼ、アルカリホスファター
ゼ、ペルオキシダーゼ、ベーターガラクトシダーゼ等を
使用することができる。結合剤としてはゲルタールアル
デヒドを使用すればよい。

本発明診断薬は非Ａ非Ｂ型肝炎の診断のために使用され
るが、そのほかに非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原および非Ａ非
Ｂ型肝炎関連抗体の試験的な検出用試薬あるいは定量用
試薬として使用することができることはもちろんである
。従って本発明診断薬はその用語を狭義に解釈したもの
に限定されてはならず、試薬をも包含する意味に解しな
ければならない。

本発明モノクロナール抗体および診断薬の有用性を以下
に記載する実験例をもって説明する。

実験例１ 試料 ａ　非Ａ非Ｂ型肝炎剖検肝からの分離精製によって得ら
れ、下記の理化学的性状を有する非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗
原（以下Ａ、Ｎ−６５２０と略記する） 分子量　　　　　　　１５０万以上（ゲル濾過法）沈降
定数（１，０）５１．５８　　　（超遠心分析法）浮上
密度（ｇ／ｃｄ）　　　　１．１５〜１．２５（塩化セ
シウム中および臭化カリウム中） 粒子直径（ｎｍ）　　　　２６−３７ 電気的移動度　　　　　α、−唱グログロブリン領域ガ
ロースゲル中） ｂ　非Ａ′−ＪＰＢ型肝炎患者血清（Ａ　Ｎ　−６５２
０に対する抗体陽性） Ｃ後記実施例１の（１）精製抗体の調製の項に記載の家
兎免疫血清からの精製抗体。ＡＮ−６５２０抗体と略記
する。

ｄ　後記実施例２において得られた腹水であって。

後記実施例１において得られたハイブリドーマＡ、　’
ＩＩ”　−ＩＩ”　−１より産生されたもの。

ｅ　後記実施例２において得られた腹水であって。

後記実施例１において得られたハイブリドーマＡＴ−Ｆ
−３より産生されたもの。

方法 ｙカｏ−スＡ　−４５（平井化学）０．８９６（Ｗ／Ｖ
）。

ｇｌ）ＴＡ−３Ｎａ　Ｏ，００２Ｍ、　　塩化ナトリウ
ム０１Ｍ　、　Ｎａ　Ｎｓ　０．１９６をトリス塩酸緩
衝液（’０．ＯＩＭ。

ｐＨ７，５）に溶解し、厚さ１．５　ｍｍの寒天ゲル平
板を作製し、試料についてマイクロオフタロニー法によ
る検出テストをおこなった。

結果 結果を図１に示す。図１は寒天ゲル内反応によって生ず
る沈降線の生成状況を示す模式図であり１図中、ａ〜ｅ
の文字をもって示した九枠は対応する試料をスポットし
た配置エリアを表わす。図１より、腹水中の本発明モノ
クロナール抗体はいづれもＡＮ−６５２０との間におい
て明瞭な沈降線を生成し、さらに、いづれの沈降線もＡ
Ｎ−６５２０と非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清および家兎免疫
血清からのＡＮ−６５２０抗体との間において生成する
沈降線と相互に融合することが観察される。従って１本
発明モノクロナール抗体は非Ａ非１３型肝炎関連抗原と
の間において特異的な抗原抗体反応を呈するものであり
、当該特異性は他の非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗体に個有であ
って、それらに共通する免疫学的性状と同一であること
が判明する。

実験例２ 後記実施例４記載のごとくに調製して本発明モノクロナ
ール抗体で感作した粗面ガラスピーズ（直径５．０±０
．２　ｍｍ　）を試験管にとり、各種濃度のＡ　Ｎ　−
６５２０溶液１００　ｕ、ｚを加え４０℃で２時間放置
し、抗原を十分に結合させた後未結合蛋白をＴｗｅｅｎ
　２０のＱ、１％ＰＬ−３８溶液で３回洗った。あらか
じめ後記実施例５記載のごとくに調製して１２５［で標
識した本発明モノクロナール抗体を１　％Ｂ　Ｓ　Ａ　
（０，１９６ＮａＮ３含有）で希釈し、１ｘ１０　’　
ｃ　ｐｍに調整したものを用意し、この１００μｅを前
記ガラスピーズに加え、４０℃で１時間放置し、再びＴ
ｗｅｅｎ　２０の１％Ｐ　１−Ｊ　Ｓ溶液で３回洗い。

各試料についてカウントした。

結果 結果を図２に示す。Ａ　Ｎ　−６５２０の濃度がＯｎＮ
／ｒｎｌである場合（対照試料）のカウント数は平均２
００　ｃｐｍであった。一般にＳ／Ｎ比（Ｓは各試料に
ついて、またＮは対照試料についてのそれぞれｃｐｍ値
を表わす）が２１以上である場合に抗原陽性の可能性が
あると認められるから、上記測定法におけるＡ　Ｎ　−
６５２０の測定感度は０．７５ｒ＋ｙ／ｍｌであること
が判明する。つまり１本発明モノクロナール抗体は０．
７５ｎｆ／ｍ／という高感度の測定法を可能にするもの
である。

実験例３ −　試料 二人の非Ａ非Ｂ型肝炎患者から採取した血清ＡおよびＢ
を図３の横軸に記載の各希釈倍数をもって希釈し、検体
試料とした。対照試料としてあらかじめＰ　［−１Ａ法
によって測定した場合に抗体陰性であった血清Ｎ（試料
数４）および３２倍以上の高い抗体価を示した血清Ｐ（
試料数４）を用意した。

方法 試料ｔｏ　ｕｅにＲＩＡ緩衝液（ＰＢｓに８８Ａを１％
、ＮａＮ３を０，１％溶解した溶液）４０μｌを加えて
血清希釈液を用意した。別にＡＮ−６５２０を１ｔｉＡ
緩衝液に溶解して２００ｎｙ／ｍｌとし抗原液とした。

試験管に血清希釈液５０μｌおよび抗原液５０μｌをと
り、３７℃で６０分間および４℃で一夜放置し、後記実
施例４で調製されたガラスピーズをけるごと＜ｌＸｌ０
″’ｃｐｍに調整した。ｊｔＭ　ｌ標識抗体液１００μ
ｌを加え４０℃で１時間放置し。

’ｒｗｅｅｎ　２０の１％Ｐ　ｋ３　Ｓ溶液で３回洗い
、各試料をカウントした。次に各検体試料につき次式に
従って抗原抑制率を算出した。

式中＋　Ｓｃｐｍは検体試料についてのカウント数。

ＮｃｐｍおよびＰｃｐｍは血清Ｎについてのカウント数
の平均値および血清Ｐについてのカウント数の平均値を
表わす。

別に血清ＡおよびＢの抗体価をＰｌ（Ａ法によって測定
した。

結果 結果を図３に示す。図３は検体血清の希釈倍数と抗原抑
制率との関係を表わし、○印線は血清Ａについて、また
・印線は血清Ｂについてのものを示す。なお、Ｐ）ｉＡ
法で測定した場合における血清Ａの抗体価は１６倍、血
清Ｂの抗体価は８倍であった。

一般に抗原抑制率が５０９６以上である場合に抗体陽性
と認められるから、上記測定方法によって測定したとき
血清Ａについては１６０倍希釈まで、また血清Ｂについ
ては間借希釈まで抗体陽性であると示される。他方ＰＩ
（Ａ法によって測定したときには血清Ａについては１６
倍、血清Ｂについては８倍が限界であるから上記測定方
法では感度が約１０倍に上昇する。すなわち本発明モノ
クロナール抗体を主要な構成成分として含有する診断薬
であって、ＩＬＩＡ法を利用する上記測定方法のものけ
診新薬として優れた有用性を持つことが判明する。

実験例４ 各種肝疾患患者血清について実験例３方法の項に記載の
方法によって抗原抑制率を求め、抗原抑制率が７０％以
上を示したときに抗体陽性であると判定した。得られた
成績を病原ウィルス別および疾患別にまとめ表１に示す
。

表中２分母の数値は該当疾患症例数１分子の数値は陽性
症例数を表わす。また括弧内は陽性率（パーセント）を
示す。表１より本発明診断薬が非Ａ非Ｉ３型肝炎を特異
的に検索しつるものであることが判明する。

実験例５ 試料 実施例１において凝集抗体面が４倍以上を示したクロー
ンのうち１２クローンについてモノクロナール抗体を産
生ずるハイブリドーマ（表２ハイブリドーマ識別表示欄
に記載の１２種のハイブリドーマ）を選び、それぞれに
ついて実施例２記載の要領により腹腔内培養をおこない
、得られた腹水を検体試料とした。他に対照試料として
ＢＡＬＢ／ＣマウスにＦｒ１ｅｎｄ白血病ウイルスを免
疫せしめ。

その牌細胞とＮＳ−１とを融合して得られたハイブリド
ーマ（表２ハイブリドーマ識別表示欄においてＡ−１２
と記載する）について実施例２記載の要領により腹腔内
培養をおこない、その腹水（モノクロナール抗体Ｉｇ（
＋）を用意した。

方法 各試料について下記（１）〜（３）をおこなった。

（１）後記実施例１に記載のＰ　ｌ−Ｉ　Ａ法により抗
体価を求める。

（２）各試料を１０倍および１０００倍に希釈したもの
について実施例１方法の項に記載のＭＯ法により沈降線
の生成状況を観察する。

（３）各試料を１０００倍希釈したのち実験例３方法の
項に記載のＲＩＡ法により添加抗原の抑制率を求める。

結果 結果を表２に示す。

なお、ＭＯ法における記載中 廿は強陽性 ＋は陽性 士は弱陽性 −は陰性 をそれぞれ意味する。

表２より本発明モノクロナール抗体はいづれも高力価で
あることが判明する。

表　　　２ 以下に記載する実施例をもって本発明をさらに詳細に説
明する。

実施例Ｉ ＡＮ−６５２０をｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅ
ｄ　５ａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）に溶解して８５μＦｊ　／
ｍｌの抗原液とし。

その０２ｍ１とフロイント完全アジュバント０．２．、
／とを混合しＢＡＬＢ／Ｃマウスに皮下投与した。

１００日経過後同マウスに上記の抗原液０．２　ｍｊ！
を静脈内投与した。その３日後に同マウスの牌臓を摘出
し、　Ｉ（ＰＭＩ−１６４０培地中で細砕し、得られる
細胞懸濁液をＲＰＭＩ−１６４０中で遠心分離により３
回洗い、ＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁した。当該牌細
胞１２．８Ｘ１０７個および■ｔＰＭ■−１６４ｏで１
回洗ツタミエローマ細胞（ＮＳ−１）　３．２ｘ１０７
個とを混合し、８００５Ｊで５分間遠心してペレットに
形成せしめ、培地を除去した。これにポリエチレングリ
コール４０００　（平井化学）を１（、Ｐ　Ｍ　Ｉ　−
１６４０培地に５０％Ｗ／Ｖとなるように溶解した液］
、　ｍｌを撹拌しなから滴々加え、さらに撹拌を続けな
がらＩもＰＭｆ−１６４０１０ｍｌを５〜１０分間がけ
て徐々に加え、最後に４００ダで５分間遠心分離してポ
リエチレングリコールを除き、１５％ｖ　／ｖ胎児仔修
生清含有のＩ’Ｌ　Ｉ）Ｍ　ｌ−１６４０培地６４ｍ１
に再懸濁した。次に％大組織培養平板の３１５穴に上記
懸濁液０．２．．１（細胞数５Ｘ１０”個）ずつを入れ
、翌日から２−３日おきに培養上清の半量をＨＡ　’ｒ
　培地（ヒポキサンチン１３６．１η／祠、アミノプテ
リン１゜７６”ｆ／ｍ／、チミジン３８，７５　Ｗ／／
　ｍｌ、胎児修生血清１５’７５　Ｙ／Ｖ加えたＲ、Ｐ
ＭＩ−１６４０培地）で置換した（　Ｉ（Ａ　Ｔセレク
ション）。１０日目抜１５穴のうち１５０穴で融合細胞
の存在が観察された。その培養、］−清についてＰＨＡ
法によるスクリーニングをおこなったところ凝集抗体価
が４倍以」ユを示した穴は１６個であった。

次にこの陽性結果を示した１６穴の細胞各々を胎児修生
血清１５％ｖ　／ｖおよびＢＡ、Ｔ、１３／Ｃマウス胸
腺細胞３Ｘ１．Ｏ’／ｍ／を補充したＲＰＭＩ−１６４
０培地で希釈し、９６穴組織培養用平板の各穴に０．２
７１（細胞数３個）ずつ入れ培養し、その」−清液につ
いてＰ　ｌ−Ｉ　Ａ法によるスクリーニングを行い抗体
産生細胞株を選ぶというクローニング操作を行った（リ
ミティングダイリューション）。さらに抗体陽性細胞に
ついて上記クローニング操作を細胞１個が１穴に入る希
釈率で２回繰り返しおこない。

最終的に１４クローンの抗体産生細胞融合株が得られた
。これらにおけるバイブドーマを識別表示ＡＴ−Ｆ−ｌ
乃至Ａ’ｌ’−Ｆ”−１４をもって命名した。

この細胞株の培養、］−清２（Ｗに硫安飽和水溶液加ｄ
を加え、室温で１時間放置し、　　９，０００　ｒｐｍ
で２０分間遠心し、得られる沈澱をＰＩＪＳｏ、５ｍｌ
で再溶解し、Ｐ１３Ｓで一日間透析した。得られた濃縮
蛋白液についてＭＯ法およびゲル濾過法により免疫グロ
ブリンのサブクラスの同定を行ったところ１ｏＧ１およ
び１．Ｍであった。なお）’Ｉ（Ａ法によるスクリーニ
ングは以下のごとく行った。

（１）精製抗原の調製 非Ａ非１３型肝炎患者の剖検肝約５ｇを細切し。

トリス塩酸緩衝生理食塩液（０，０１Ｍ、　ｐＨ７，５
）２０　ｍｌを加え、ホモジナイズした。次に１０，０
００ｒｐｍで２０分間遠心して、その上清をとり１分離
精製前の肝ホモジネート上清とした。

あらかじめトリス塩酸緩衝生理食塩液（０，０１Ｍ。

ｐＨ７，５）で平衡化したセファクリルＳ　−２００（
ファルマシア製）の充填カラム（２，６Ｘ９０ｃｍ）に
肝ホモジネート上清ＬＯｍｌを添加し、トリス塩酸緩衝
生理食塩液（０，０１Ｍ、　ｐＨ７，５）　テ溶出し、
２８゜ｎｍの紫外部吸収で連続モニターしながら、抗原
活性を有する第一ピークの相当劃分をプールした。

なお、抗原活性は寒天ゲル内反応により検索した。

プールした割分は限外が適法（アミコン製ＰＭ−１０）
によって加圧濃縮した。

次に得られた濃縮液について、支持体としてセファクリ
ル８−２００（ファルマシア製）の代わりにセファクリ
ルＳ−３０Ｍファルマシア製）を使用して上記記載にお
けると同様に溶出操作をおこない、再び限外濾過法によ
り加圧濃縮した。

次に得られた濃縮液５□Ｊについて蔗糖濃度勾配こない
＋　　５％、１５％、２５％、３５％ｒは各１゜ｒｎ／
ニ、４５９６．　６０％では各５−になるように作製し
、濃縮液を最上部に添加した。処理後チューブ底より２
．５　ｍｌ／　ｔｕｂｅの割合で分劃し、抗原活性を有
する蔗糖濃度２５〜４０％相当劃分をプー側した。プー
ルした割分についてトリス塩酸緩衝生理食塩液（０，０
１Ｍ、　ｐＨ７，５）　　透析をおこない。

限外濾過法（アミコン製ＰＭ−１０）により加圧濃縮し
た。

次に得られた濃縮液について塩化セシウム平衡密度勾配
遠心分離（４０，００・Ｏｒｐｍ、　２０時間）をおこ
なった。１．００〜１．５０ｙ／ｃｄの密度勾配範囲に
おいて各４．５ｍｌを作製し、濃縮液を最上部に添加し
た。処理後、チューブ上層より、０．２ｍｔ／１ｕｂｅ
の割合で分劃し、抗原活性を有する塩化セシウム密度１
．１５〜１．２５ｆ／ｃｄ相当劃分をプールした。なお
各割分の比重はアツベの屈折計で測定した。プールした
割分についてトリス塩酸緩衝生理食塩液（０，ＯＩＭ、
ｐ［（７，５）で透析した。

ここに得られた溶液に含まれる物質の理化学的性状は下
記のごとくであり、精製抗原として使用した。

分子量　　　　　１５０Ｍ以上　（ゲル濾過法）浮上密
度（Ｅｌ／ｃｄ）１．１５−１．２５（塩化セシウム中
および臭化カリウム中） 粒子直径（ｎｍ）　　　２６〜３７ 電気的移動度　　　ｃｔ２−α、グロブリン領域（アガ
ロースゲル中） （２）感作赤血球の調製 ヒツジ血液を遠心管にとり、生理食塩液を用いて２．０
０Ｏｒｐｍで１０分間の遠心分離を５回繰返し。

赤血球を洗滌した。この赤血球にｐＨ７，５，０，１５
Ｍのリン酸緩衝生理食塩液を加えて５９６濃度に調製し
た。同リン酸緩衝生理食塩液で２．５９６濃度に調整し
たゲルタールアルデヒド溶液を前記赤血球浮遊液中に、
その５分の１容加え、撹拌しながら室温で約５時間反応
させ、赤血球を固定した。ついでこの溶液を遠心分離し
て固定赤血球を得、さらに生理食塩液を用い遠心分離に
より数回洗滌した。この固定赤血球を前記リン酸緩衝液
で５％浮遊液に調整し、これに同リン酸緩衝生理食塩液
で５′ｉｎｇ／ｄ／に調整したタンニン酸溶液を等量添
加して３０分間撹拌した。この溶液を遠心分離してタン
ニン酸処理固定赤血球を得、さらに生理食塩液を用い遠
心分離により数回洗滌した。得られたタンニン酸処理固
定赤血球に前記リン酸緩衝液を加え、５９６赤血球浮遊
液とした。

この赤血球浮遊液と前記精製抗原を前記リン酸緩衝生理
食塩液で蛋白質濃度が約５０μ９　、’ｍｔ　（抗体希
釈比１：２０）になるように希釈した液とを同量混合し
、室温で６０分間撹拌して感作した。この液を遠心分離
して感作血球を得、さらに生理食塩液を用い遠心分離に
より数回洗滌した。得られた感作赤血球に２％正常家兎
血清含有リン酸緩衝生理食塩液を加えて７％浮遊液とし
た。この感作赤血球をＰＨＡ法を利用する検出試薬に使
用した。

（３）方　法 アクリル製のマイクロタイトレージョンプレート（■−
タイプ）に２％正常家兎血清を含有するリン酸緩衝生理
食塩液（０，１５Ｍ　、　　Ｉ）　Ｈ７，２）２！５ｔ
ｔｅを添加し、検体試料を二系列づつ２　倍希釈した。

次に一方の系列には２％正常家兎血清を含有するリン酸
緩衝生理食塩液（０，１５Ｍ、　　ｐｔ（７，２）　２
５μｌを、他方の系列には前記精製抗原１００倍希釈液
２５μｌを添加し、３７℃で３０分間インキュベートし
た。その後抗原感作羊赤血球を添加し。

室温で２時間放置し、凝集の有無を確認した。精製抗原
の凝集を認めた最大希釈倍数の逆数を抗体価とした。

実施例２ ＢＡＬＢ／Ｃマウスにプリスタン（２，６，１０゜１４
−テトラメチルペンタデカン）０．５．ｌ／を腹腔的投
与し、２〜３０日後同目抜スに実施例１によって得られ
た抗体産生細胞融合株（細胞数２〜４Ｘ１０’個相当分
）を腹腔的投与し、２〜３週間後に腹水を採取した。当
該腹水についてＰＨＡ法による測定をおこなったところ
凝集抗体価は約１０５〜１０７であった。当該腹水は本
発明モノクローナル抗体を含有する培養組成物である。

実施例３ 実施例２で得られた腹水２ｍｌをセファクリルＳ−２０
０カラム（２６Ｘ３６ｃｍ）にかけ、０．０１Ｍ−）リ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に塩化ナトリウムＯ，１５
Ｍ、ＢＤＴＡ−３Ｎａ　Ｏ，００２ＭおよびＮａＮ５０
．１％を加えた溶出液によって５ｍｌづつ分割し、各フ
ラクションについてＰｉ（人法によるスクリーニングを
おこない、抗体陽性を示したフラクションをプールし、
精製物とした。ＩｇＧとしての収量は３４．４ηであっ
た。これを蛋白量的１ｇ！／−となるように調整して凍
結保存した（モノクロナール抗体精製物）。この濃度に
おいてＰＩ−ＩＡ法による測定をおこなったところ、凝
集抗体価は６０．０００倍であった。

実施例４ ２％３−アミノプロピルトリエトキシシランアセトン溶
液に粗面ガラスピーズ（直径約５１′ｒＬｒｒＬ）を入
れ、室温で３０分間撹拌し、ＰＨ８で洗った。

次に１０％ゲルタールアルデヒドＰＢＳ溶液を加えて室
温で３時間撹拌しｌ）　Ｂ　Ｓで洗った。得られたアル
デヒドガラスピーズに実施例３によって得られたモノク
ロナール抗体精製物１２．５μｆ／ｍｌを加え４℃で一
夜放置し、ＰＢＳで洗い１次に１９６エタノールアミン
ＰＢＳ溶液に入れ、室温で１時間放置し、再びＰＢＳで
洗い、５９６Ｈ８Ａ溶液（Ｎａ　Ｎｓ　０．１９６を含
む）中で４℃で保存した。

本実施例によって得られた物はモノクロナール抗体で表
面コートされたガラスピーズであり、抗体サンドイツチ
法を利用する診断薬に使用される。

実施例５ 実施例３１こよって得られたモノクロナール抗体精製物
（蛋白量１ｒＲＩｉ／−）　１０μｆｆｉ、　ｓミリキ
ューリーの”’ｌ−Ｎａおよび０．０５　Ｍリン酸生理
食塩液（ｐＨ７，５）０．２９　ｒｎｌを加え、さらに
クロラミンＴを蒸溜水に２．５■／ｒｒＬｌの割合に溶
解した液を２μｅ加えて４℃で５分間撹拌する。次いで
メタ重亜硫酸ナトリウムを蒸溜水に２．５η／ｍｌの割
合に溶解した液を２μｌ加えて反応を停止させる。ただ
ちにバイオゲルＰ−１０を用いた遠心ゲルが過により１
２５■標識物質と遊離の１２５１とを分離する。得られ
た１２５丁標識物質の比放射能は約１０〜２０μＣ１／
μｇとなる。この＋２″Ｉ標識物質はＲ，ＩＡ法を利用
する診断薬に使用される。

実施例６ 実施例３によって得られたモノクロナール抗体精製物を
５〜１０ｒｆｔｇ／、、／となるまで濃縮し、この０．
１〜０．２　ｍｌに対してアルカリホスファターゼ（５
η／　ｍｌ　）を０．３ｍｌの割合で添加し撹拌する。

次に２．５％ゲルタールアルデヒド溶液５０μｌを添加
し、室温で３０分間撹拌する。これを０．０５Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　　で−昼夜透析し。

２．００Ｏｒｐｍ　で１０分間遠心分離したのち、その
俸 上清は酵素標識抗僚としてｇｌＡ法を利用する診断薬に
使用される。

実施例７ ヒツジ血液を遠心管にとり、生理食塩液を用いて２．０
０　Ｏｒｐｍで１０分間の遠心分離を５回繰返し。

赤血球を洗滌した。この赤血球にｐｌ＋　７．５　、０
．１５Ｍのリン酸緩衝生理食塩液を加えて５９６濃度に
調製した。同リン酸緩衝生理食塩液で２．５％濃度に調
整したゲルタールアルデヒド溶液を前記赤血球浮遊液中
に、その５分の１容加え、撹拌しながら室温で約５時間
反応させ、赤血球を固定した。ついでこの溶液を遠心分
離して固定赤血球を得、さらに生理食塩液を用い遠心分
離により数回洗滌した。この固定赤血球を前記リン酸緩
衝液で５％浮遊液に調整し、これに同リン酸緩衝生理食
塩液で５■／ｄｉ　に調整したタンニン酸溶液を等量添
加して３０分間撹拌した。この溶液を遠心分離してタン
ニン酸処理固定赤血球を得、さらに生理食塩液を用い遠
心分離により数回洗滌した。得られたタンニン酸処理固
定赤血球に前記リン酸緩衝液を加え、５％赤血球浮遊液
とした。

この赤血球浮遊液と実施例３で得られたモノクロナール
抗体精製物を前記リン酸緩衝生理食塩液で蛋白質濃度が
約１０μｆ／ｍｌになるように希釈した液とを同量混合
し、室温で６０分間撹拌して感作した。この液を遠心分
離して感作血球を得。

さらに生理食塩液を用い遠心分離により数回洗滌した。

得られた感作赤血球に２％正常家兎血清含有リン酸緩衝
生理食塩液を加えて７％浮遊液とした。この感作赤血球
はＲ，−ＰＨＡ法を利用する診断薬に使用される。

【図面の簡単な説明】

図１は実験例１結果の項に記載の図１に相当する図面で
あり、マイクロオフタロニー法における沈降線の生成状
況を示す模式図である。 図２は実験例２結果の項に記載の図２に相当し。 抗体サンドイッチ）ｌＡ法における抗原濃度とｃｐｍと
の関係を示す。 図３は実験例３結果の項に記載の図３に相当し。 ｌメ１１ 図　　　２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）非Ａ非Ｂ型肝炎部検肝からの分解精製によって得
   られ、下記の理化学的性状を有する非Ａ非Ｂ型肝炎関連
   抗原との間において特異的な抗原抗体反応を呈する非Ａ
   非Ｂ型肝炎関連モノクロナール抗体 分　子　量　　　　１５０万以上（ゲル濾過法）沈降定
   数（１０−Ｉ８）　　５１，５Ｓ　　（超遠心分析法）
   浮上密度（ｆ／／ｌＡ　　　１．１５〜１．２５（塩化
   セシウム中および臭化カリウム中） 粒子直径（ｎｍ）　　　　２６〜３７ 電気的移動度　　　　α、−ｄ、グロブリン領域（アガ
   ロースゲル中） （２）非Ａ非Ｂ型肝炎関連モノクロナール抗体が。 特許請求の範囲第１項記載の非Ａ非Ｂ型肝炎関連抗原を
   動物に感作し、該動物より抗体産生細胞を取得し、該細
   胞とミエローマ細胞とを融合し、ＨＡＴ培地中で選択し
   、抗体産生能についてスクリーニングし、クローニング
   ロナール抗体である特許請求の範囲第１項記載の非Ａ非
   Ｂ型肝炎関連モノクロナール抗体（３）動物がマウスで
   ある特許請求の範囲第１項または第２項記載の非Ａ非Ｂ
   型肝炎関連モノクロナール抗体 （４）抗体産生細胞が牌細胞である特許請求の範囲第１
   項乃至第３項記載の非Ａ非Ｂ型肝炎関連モノクロナール
   抗体 （５）　　ミエローマ細胞がマウス骨髄腫細胞である特
   許請求の範囲第１項乃至第４項記載の非Ａ非Ｂ型肝炎関
   連モノクロナール抗体 （６）　　融合がポリエチレングリコールを融合剤とし
   ておこなわれる融合である特許請求の範囲第１項乃至第
   ５項記載の非Ａ非Ｂ型肝炎関連モノクロナール抗体 （７）　　クローニングがリミティングダイリューショ
   ンによっておこなわれるクローニングである特許請求の
   範囲第１項乃至第６項記載の非Ａ非Ｂ型肝炎関連モノク
   ロナール抗体 （８）非Ａ非Ｂ型肝炎関連モノクロナール抗体が特許請
   求の範囲第２項乃至第７項記載の７１イブリドーマの培
   養上清液の状態によって与えられる特許請求の範囲第２
   項乃至第７項記載の非Ａ非１３型肝炎関連モノクロナー
   ル抗体（９）非Ａ非１３型肝炎関連モノクロナール抗体
   が特許請求の範囲第２項乃至第７項記載のノ・イブリド
   ーマを組織適合性動物に投与して得られる腹水液の状態
   によって与えられる特許請求の範囲第２項乃至第７項記
   載の非Ａ非１３型肝炎剖検肝体 ００　　非Ａ非１３型肝炎剖検肝からの分離精製によっ
   て得られ、下記の理化学的性状を有する非Ａ非Ｂ型肝炎
   関連抗原 との間において特異的な抗原抗体反応を呈する非Ａ非Ｂ
   型肝炎関連モノクロナール抗体を主要な構成成分とする
   非Ａ非Ｂ型肝炎診断薬分子量　　　　　１５０万以上（
   ゲル沖過法）沈降定数（１０）　　５１．５８　　　（
   超遠心分析法）浮−Ｌ密度（ｆ／ａｉ）１．１５−１．
   ２５（塩化セシウム中および臭化カリウム中） 粒子直径（ｎｍ）　　２６〜３７ 電気的移動度　　α２−ｄ１グロブリン領域（アガロー
   スゲル中） ＋１１）　　診断薬が逆受身赤血球凝集反応法を利用す
   る診断薬である特許請求の範囲第１０項記載の非Ａ非Ｂ
   型肝炎診断薬 （１２逆受身赤血球凝集反応法が羊の感作赤血球を使用
   するものである特許請求の範囲第１１項記載の非Ａ非Ｂ
   型肝炎診断薬 （１３診断薬が抗体サンドイツチ法を利用する診断薬で
   ある特許請求の範囲第１０項記載の非Ａ非Ｂ型肝炎診断
   薬 （Ｉ４１　　抗体サンドイツチ法が感作ガラスピーズお
   よび１２５■標識抗体を使用するものである特許請求の
   範囲第１３項記載の非Ａ非Ｂ型肝炎診断薬 （１９抗体サンドイツチ法が感作固相面およびアルカリ
   ホスファターゼ標識抗体を使用するものである特許請求
   の範囲第１３項記載の非Ａ非１３型肝炎診断薬