JPH01257495A - 抗ｃｐｂ２モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒト胎盤より分離精製した抗血液凝固活性を
有する物質（以下ＣＰＢＩＩと略称する）に対して特異
的なモノクローナル抗体、これを産生するハイブリドー
マおよびその利用に関する。

（従来の技術） 細胞融合技術は、ケーラーとミルスタインの報告（Ｎａ
ｔｕｒｅ、　４９５〜４９７頁、　１９７５年）以来急
速に発展した。すなわち、咄乳動物の牌細胞とミエロー
マ（骨髄腫）細胞とを融合させた雑種細胞（ハイブリド
ーマ）は、用いた牌細胞の性質に応じて種々の抗体を産
生ずることが知られている。そしてこのバイプリドーマ
の性質を利用してクローニングをすることにより、種々
の蛋白質、ホルモン等の生体物質に対するモノクローナ
ル抗体を産生するバイプリドーマを作製すること、並び
にモノクローナル抗体を生産する試みがなされている（
　Ｅ、　Ｄａｌｅ　５ｅｒｖｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ。

Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、　
２７．　ＮＯ，１１，１７９７〜１８０８、１９８１）
。

一方、本出願人は先にヒトの胎盤から抗血液凝固活性を
有する物質（ｃｐａｌｌ）を分離精製することに成功し
、特許出願した（特願昭６１−２４３７７８号）、　　
ＣＰＢＩＩは下記の性質を有する医薬として有用な物質
である。

■　分子量（ＳＯ５−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法、還元状態及び非還元状態） ７３．０００±２．０００ ■　等電点（アンフオライトを用いる等電点カラム電気
泳動法） ６．２〜６．６ ■　安定性 ■　５０℃、３０分加熱処理で失活 ◎　ｐＨ５，５〜８．５で安定（３７℃）Ｏ血漿中３７
℃、１５分で安定 ■　　作　　用 ０　カルシウム回加凝固時間を延長 ＠　プロトロンビン時間を延長 Ｏ活性化部分トロンボプラスチン時間を延長 ■　アミノ酸分析 アミノ酸分析で、アスパラギン酸、スレオニン、セリン
、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、％シ
スチン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン
、チロシン、フェニルアラニン、ヒスチジン、リジン及
びアルギニンの存在が認められる。

ＣＰＢＩＩの製造法は、その−例を後記実施例１に示し
たが、要約すれば以下のとおりである。

まず、ヒト胎盤から胎盤ホモジネートを調製し、遠心分
離をおこなう、ホモジナイズ操作は、胎盤より羊膜等を
切除した後、生理食塩水にて充分洗浄し、ワーリングブ
レンダー及びポリトロンを用いておこなう。得られたホ
モジネートを遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る。

こうして得られた胎盤ホモジネート沈漬は、緩衝液で充
分洗浄し、再度遠心分離して、洗浄沈渣を分取し、以後
の抽出操作に付す。即ち、洗浄沈漬は、ＥＤＴＡ、　Ｅ
ＧＴ＾、シュウ酸、クエン酸、ニトリロ三酢酸ナトリウ
ム、リン酸等のキレート剤を含むｗｋ衝液及び／又は、
トリトンＸ−１００、ルプロール、ＳＯＳ　、デオキシ
コール酸等の界面活性剤を含む緩衝液に浸し、４℃〜８
℃にて一晩放置後、遠心分離して上清を集め抽出液を得
る。この場合、抽出は、キレート剤及び界面活性剤の両
方を用いて行うこともできる。

一方、胎盤ホモジネート上清は、更にｓｏ、ｏｏ。

〜１００，０００ｇの超遠心分離して沈漬部分であるマ
イクロシーム分画を得る。このマイクロシーム分画を洗
浄後、上記と同様にして、キレート剤及び／又は界面活
性剤抽出を行った後、超遠心分離して上清を集め抽出液
を得る。

このようにして得られた抽出液は、硫安分画に付される
。硫安分画は、先づ、上記抽出液に３５％飽和となるよ
うに固形硫安を加えて遠心分離し上清を分取する。次い
で、上清に対し８５％飽和となるように硫安を加えて遠
心分離し、沈漬を分取することによりおこなわれる。

得られた硫安分画は、更に公知の分離・精製手段、例え
ば透析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、吸
着クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、等
電点カラム電気泳動法、レクチン又は抗体を用いたアフ
ィニティー・クロマトグラフィー等を単独又は組合せ用
いることにより精製され、　　ＣＰＢＩＩが得られる。

例えば、キレート剤又は／及び界面活性剤は抽出液を硫
安分画して得られた画分を充分透析し、この透析液をＤ
ＥＡＥ−トヨパールを用いる直線濃度勾配法により溶出
させ、活性画分を透析した後、活性画分を濃縮し、セフ
ァデックスＧ−１００を用いるゲル濾過させることによ
り　ＣＰＢＩＩを得る。

（発明が解決しようとする課題） しかし、胎盤中のＣＰＢＩＩは微量であり、また通常使
用される各種クロマト法では、ＣＰＢＩＩとの特異的結
合が充分ではなく、高純度のＣＰＢＩＩを取得すること
は困難であり、加えて工程が長く回収率も満足のいくも
のではなかった。

従って、高純度のＣＰＢＩＩを簡便に高回収率で取得す
る特異的精製法の開発が望まれていた。

また、抗血液凝固剤としての用途において、ＣＰＢＩＩ
の作用メカニズムの解明、血中濃度の測定等の手段とし
て、ＣＰＢＩＩの高感度検出法の開発も望まれていた。

（課題を解決するための手段〕 本発明者らは、これらの問題点を解決すべく鋭意研究を
重ねた結果、細胞融合により　ＣＰＢＩＩに対して特異
的なモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを得
、このバイブリドーマを利用してＣＰＢＩＩに特異的な
モノクローナル抗体を取得できること、さらに該モノク
ローナル抗体を利用すればＣＰＢｌｌの高純度精製、免
疫学的定量ができることを見い出し本発明を完成した。

すなわち本発明は、ＣＰＢＩＩに対して特異的なモノク
ローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生ずるバイプ
リドーマ、該モノクローナル抗体を免疫吸着剤として使
用することを特徴とする　（：ＰＢＩＩの精製法、−並
びに該モノクローナル抗体の標識体を使用することを特
徴とするＣＰＢＩＩの免疫学的測定法を提供するもので
ある。

ＣＰＢｌｌに対して特異的なモノクローナル抗体を産生
ずるバイプリドーマは、例えば次の如くして製造される
。すなわち、（１）抗原としてＣＰＢＩＩを用いて免疫
した動物から抗体産生細胞を調製し、（２）別に骨髄腫
細胞を調製し、（３）これらの細胞を融合させ、（４）
得られたハイブリドーマを選択的に増殖させ、（５）該
バイプリドーマから抗体産生ハイブリドーマを検索し、
（６）クローニングにより目的とするモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマを得る。次に各工程について説明
する。

（１）抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞の調製は、常法に準じて行えばよく、抗原
であるＣＰＢＩＩで動物を免疫し、その動物の抗体産生
細胞を取得する方法によればよい。動物としては、マウ
ス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジなどが例示さ
れ、抗体産生細胞としては膵臓、リンパ節、末梢血液等
から分離した細胞などが使用される。免疫方法としては
、フロイントのコンプリートアジュバントを併用する方
法が使用される。

（２）骨髄腫細胞の調製 細胞融合に使用する骨髄腫細胞は、特に限定されず、多
くの哺乳動物の細胞株が利用できるが、抗体産生細胞の
調製に用いた動物と同種の動物の細胞株を使用するのが
好ましい。用いる細胞株は、細胞融合の後に、未融合の
骨髄腫細胞が選択培地で生存できず、ハイブリドーマだ
けが増殖できるようにすることによって、未融合細胞と
融合細胞とを分けることを考慮して、特定の薬剤抵抗性
を有するものが好ましい。例えば８−アザグアニン抵抗
性の細胞は、ＨＡＴ培地中で生育できない性質を有する
ため好んで用いられる。具体的には、マウス骨髄腫細胞
株ＰＡＩ、　Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８゜Ｐ３−Ｘ６３−Ａ
ｇ８−Ｌｉｔ、　Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１．　Ｘ
６３−Ａｇ８−６．５．３．、　５ｐｚ１０−八ｇ１４
．　　ＦＯ，５ｘ９４／５ｘｘｏ、Ｂｕ、１゜ＭＰＣＩ
Ｉ−４５，６，７Ｇ、１．７等が用いられる。

（３）細胞融合 細胞融合は、通常ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩｌ［ｉ４０培地
、ＩＭＤＭ培地などの培地中で、骨髄腫細胞と抗体産生
細胞を混合（混合比は通常１：４〜１：１０）すること
により行われる。融合促進剤としては、平均分子量１，
０００〜ａ、ｏｏｏのポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）が使用できる。ＰＥＧの使用濃度は通常３０〜５０％
である。更に近年開発された高電圧パルスによる電気融
合装置を用いる細胞融合法がある。細胞の種類により融
合条件を若干変えるとＰＥＧを用いた融合より優れた融
合効率が得られる。

（４）バイプリドーマの選択的増殖 細胞融合を終えた細胞は、１０％ＦＣ５含有ｆＭＤＭ培
地などで適当に希釈し、遠心分離する。沈渣を選択培地
（たとえば、）ＩＡＴ培地）で浮遊し、９６ウエルマイ
クロプレートに接種した後、５％炭酸ガス培養装置で培
養する。選択培地で生育してくる細胞はバイプリドーマ
である。

（５）抗体産生ハイブリドーマの検索 抗体産生ハイブリドーマの検索は、常法に従えばよく、
特に限定されない。たとえば、ハイブリドーマの増殖し
た培養液を採取し、ＣＰＢＩＩと反応させたのち、酵素
、ケイ光物質、発光物質などでラベルした第２抗体との
反応により検索できる。

（６）クローニング 抗体産生バイブリドーマを含むことを確認した培養ウェ
ル中の細胞を限界希釈法などによりクローニングを行い
、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。

以上の操作によってＣＰＢＩＩに特異的なモノクローナ
ル抗体産生ｊハイブリドーマＣＰＢＩｆ−）１２９、Ｃ
ＰＢＩＩ−Ｈ２Ｓ　、　　　ＣＰＢＩＩ　　−Ｈ３１１
，ＣＰＢｌｌ　−Ｈ５１１を得た。これらのハイブリド
ーマはそれぞれＣＰＢＩＩに特異的なモノクローナル抗
体を産生ずる新規な細胞である。そこでこれらの細胞は
工業技術院微生物工業技術研究所にＢＰ−１７５３（Ｃ
ＰＢ−ＩＩ　）１２９）　、　ＢＰ−１７５４（ＣＰＢ
−ＩＩ　Ｈ２Ｓ）　、　ＢＰ−１フ５５　（ＣＩ”Ｂ−
１１）１３１１）及びＢＰ−１７５８（ＣＰＢ−１１８
５１１）として寄託した。

ＣＰＢＩＩに特異的なモノクローナル抗体は、上記で得
られた抗体産生バイプリドーマを利用することにより調
製される。すなわち、抗体産生バイプリドーマを適当な
培地中で培養することにより、その培養上清から本発明
モノクローナル抗体が得られる。また、モノクローナル
抗体を大量に製造するには、骨髄−細胞の由来動物と同
種の動物にブリスタン（２，６，１０゜１４−テトラメ
チルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、
抗体産生バイプリドーマを接種することにより、インビ
ボで抗体産生バイプリドーマを大量に増殖させる方法が
用いられる。この方法によれば、接種した動物の血清お
よび腹水中に高濃度のモノクローナル抗体が生ずる。モ
ノクローナル抗体の分離精製は、通常の血清からの抗体
の精製に使用されている方法に従って実施できる。

斯くして得られた本発明モノクローナル抗体は、使用す
る抗体産生ハイブリドーマの種類により　ＣＰＢｌｌ−
＾２９．　　ＣＰＢＩＩ−＾７６、　　ＣＰＢＩＩ−＾
３１１゜ＣＰＢＩＩ−＾５１１の４種類存在する。これ
らのモノクローナル抗体は、表１に示す性質を有する。

なお表１中、分子量は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法により、等電点は等電点電気泳動法（ＩＪＢ
−カラム等電点電気泳動装置）により、免疫グロブリン
サブクラスはオクタローニーの二重免疫拡散法〔ウサギ
ポリクローナル抗体（マイルズ社製）使用〕により測定
した。

表１ 本発明モノクローナル抗体を免疫吸着剤として利用する
ことによって、ＣＰＢｌｌを精製する方法は、例えば本
発明モノクローナル抗体をデキストランゲル、アガロー
スゲル、ポリビニルゲル等の不溶性担体に結合させ、該
モノクローナル抗体結合担体を免疫吸着剤として用い、
カラムクロマトグラフィーに付すことにより実施される
。不溶性担体とモノクローナル抗体との結合は、ブロム
シアン法やエポキシ、アミノ、カルボキシル、もしくは
ホルミル基等を介して結合させることができる。

このモノクローナル抗体結合不溶性担体からなるカラム
に粗ＣＰＢＩＩを添加し、カラムに吸着した　ＣＰＢＩ
Ｉを溶出させることにより高純度のＣＰＢＩＩが得られ
る。

本発明モノクローナル抗体の標識体を利用するｃｐｅｔ
夏の免疫測定法は、例えば本発明モノクローナル抗体を
酵素、各種のアイソトープ、蛍光物質等の標識剤で標識
し、これにＣＩ’Ｂ１１を含む試料を加え、ＣＰＢＩＩ
と標識体との免疫反応生酸物の標識量を測定することに
よって実施される。また−船釣な方法としてＥＬＩＳＡ
法を用いることもできる。

（発明の効果） 本発明のハイブリドーマはＣＰＢＩＩに対して特異的な
モノクローナル抗体を産生ずる。そしてこのモノクロー
ナル抗体を用いれば、　　ＣＰＢＩＴの分離精製工程を
短縮でき、極めて高純度のＣＰＢＩＩを高回収率で得る
ことができる。さらに、モノクローナル抗体と結合させ
た不溶性担体は、洗浄すれば再使用可能であり、精製工
程の短縮だけでなく、経済的であることから工業的に極
めて有用である。

また、本発明の抗ｃｐｅｔｔモノクローナル抗体は、血
液の凝固線溶系の異常疾患の治療におけるＣＰＢＩＩの
免疫定量に使用できる。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例１ 抗ＣＰＢＩＩモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
製造： （１）抗原（ＣＰＢ［Ｉ）の精製 （１）ヒト胎盤５個（約２，５００ｇ）より、膜等を除
去し、生理食塩水で充分洗浄後ミンチする。これに５０
ｍＭ）−リス−塩酸緩衝を夜（ｐＨ７，４）　２℃を加
え、ワーリングブレンダーを用いて破砕し、次いで更に
、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）で磨砕する。得られ
たホモジネートを７，０００ｒｐｍ１５分間遠心分離し
、沈漬を分取した。得られた沈渣に再度５０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）　２　ｍを加え、ポリトロ
ンでホモジナイズし、７，０００ｒｐｍ１５分間遠心分
離して洗浄沈漬を得た。この操作を数回繰り返し、血液
成分を除去して、洗浄沈渣的９００ｇを得た。

（ｉｉ）　　（ｉ’）で得た沈漬９００ｇに、５０ｍＭ
ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液’（ｐ）１
７．４）を約２ＩＬ加え、ワーリングブレンダーでホモ
ジナイズする。このホモジネートを４℃にて、−夜攪拌
後７，０００ｒｐＩＩ１１５分間遠心分離して、抽出液
２℃を得た。

（ｉｉＮ　　（ｉｎ　で得た抽出液に固形硫安を加え、
３５％飽和とし、４℃で３０分〜数時間放置後、７，０
００ｒｐｍ１５分間遠心分離し上清を分取した。この上
清に更に硫安を加え、８５％飽和とし、４℃で２時間放
置した後７．０００ｒｐｍ１５分間遠心分離し、沈漬を
分取した。得られた沈漬を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
の少量に溶かし、同緩衝液に対し、４℃で一夜、充分に
透析した。透析中に生じた沈澱は、７，０００ｒｐｍ１
５分間遠心分離して除き、透析液３９０ｍｊ２を得た。

（ＩＶ）得られた透析液を、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，４）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨバール（
φ５．５　ｘ　１９　ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液にて
充分洗浄した後、０〜０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む同
ｉ衝液４１を用い、直線濃度勾配により１分画２０ｍｊ
２となる様に溶出させた。活性画分は、はぼ０．２Ｍ塩
化ナトリウム濃度付近にて溶出され、２００ｍｊ２の活
性画分を得た。

（Ｖ）得られた活性画分をダイアフローメンブランフィ
ルタ−ＹＭ−１０を用いて濃縮した。

濃縮液をセファデックスＧ−１００を用いるゲル濾過（
φ４．５　ｘ　７５　ｃｍ）に付し、生理食塩水で１分
画８　　ｍ２になるように溶出させ、活性画分７０〜８
２を集め、これを限外濾過により濃縮して、　ＣＰＢＩ
Ｔ　１４　　ｍ、Ｍ（蛋白重量５９．３ｍｇ、　Ｌｏｗ
ｒｙ法）を得た。

（２）免疫牌細胞の調製 上述の如く精製したＣＰＢＩＩ　１００μｇをフロイン
ト・コンプリート・アジュバントに乳濁化させ、ＢＡＬ
Ｂ／　Ｃ系マウスの１１ｍ腔内に投与した。

以後、２週間の間隔で５０μｇのＣＰＢｌｌとアジュバ
ント乳濁液を２回投与し、最後にＣＰＢＩＴ　５０μｇ
のみを投与し免疫を完了した。

３日後にマウスを殺し、膵臓を摘出、細断した後１００
メツシユのナイロン網で濾過し、膵臓の単離細胞を得た
。

（３）バイプリドーマの調製 得られた免疫牌細胞に低張液（１５５ｍＭ塩化アンモニ
ウム）を加え赤血球を溶血した後ｌ５ｃｏｖｅ’ｓ　Ｍ
ｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ
（ＩＭＤＭ）で細胞を洗った。マウス骨髄腫細胞ＦＡＩ
はＩＭＤＭで２回洗った。両細胞数を計測し、牌細胞と
ＦＡＩ細胞の割合を５対１にして遠心した。上清を捨て
、細胞沈漬に融合用緩衝液（マンニトール０．２５Ｍ、
　ＣａＣＩｔ２０．１ｍＭ。

ＭｇＣ１２０，１ｍＭ、　）−リス−塩酸０．２ｍＭ、
　ｐＨ７，２）を加えよく攪拌した後遠心する。この操
作を２回繰返した。細胞沈渣に融合用緩衝液を加え細胞
密度を４Ｘ１０’／ｍｊ２に調製した。細胞融合装置（
島津製作所５ＳＨ−１型）の電極間に１００〜２００μ
Ｊ２精下しＩ　Ｍ）ｌｚ、４０　Ｖで１０秒間電圧をか
けた後３００　Ｖ、　１／６０秒で数回電気パルスをか
けた。５分間静置した後ＩＭＤＭで電極間の細胞を洗い
出し遠心管に移した後１．ＯＯＯｒｐｍ８分間遠心した
。

沈漬をｌＯ％ＦＣ５添加ＩＭＤＭで浮遊し再度遠心して
上清を捨てた。

ヒボキサンチン１０−’Ｍ、アミノプテリン４Ｘ１０”
’Ｍ及びチミジン１．６Ｘ　１０−’Ｍを加えた（ＨＡ
Ｔ−）　１０％ＦＣ５添加ＩＭ添加管用い沈渣を細胞密
度４Ｘ１０’／ｍｌ！になるように再浮遊し、９６ウエ
ルマイクロプレートに１００μｍずつ分注した。３〜４
日ごとに培地５０μｍ追加し、細胞の増殖を見た。

ＨＡＴ選択により、バイプリドーマのみ増殖することを
確認した。

（４）抗体産生バイプリドーマの検索 バイプリドーマが増殖したウェルの培養液を採取し酵素
免疫法により、ＣＰＢＩＩに対する抗体産生バイプリド
ーマを調べた。まず、９６ウエルマイクロプレート（イ
ムノプレート１１ヌンク社製）にＣＰＢＩＩを０．１μ
ｇ／１００μｆｌ／ウェル分注し、２５℃で１８時間静
置し吸着させる。次いで検体である培養液を１゛ＯＯμ
Ｌ／ウエル注入し、２５℃で２時間゛反応させる。０．
０５％Ｔｗｅａｎ　２０を含むリン酸Ｈａ食塩水（ＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄後、ワサビパーオキシダー
ゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（カヘル社製）を１００ｕｕ
／ウェル加え、２時間後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄
する。これに、０．００１％過酸化水素、０．４ｙａｇ
／　ｔａｉｌオルトフェニレンジアミン（シグマ社製）
の０．１Ｍクエン酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ４
，０）を加え、波長４９２ｒ＋＋ｓの吸光度を測定した
。

検体中、ＣＰＢＩＩに対する抗体が存在したウェルにの
み発色が観察されるので、発色したウェルの細胞を採取
した。

（５）　　ＣＰＢＩＩに対するうモノクローナル抗体産
生細胞のクローニング マウスの腹腔にＩＭＤＭを注射して採取した腹腔細′胞
をフィーダー細胞として使用した。

１０％ＦＣ５添加ＩＭＤＭに浮遊した腹腔細胞（Ｉ　Ｘ
　１０’個／ｍｆｌ）を９６ウエルマイクロプレートに
１００μｍずつ分注した。翌日、抗体産生バイプリドー
マを５個／ｍｌＬに調製し、各゛ウェルに１００μｍず
つ分注した。３日ごとに培地を交換し適当な量まで細胞
が増殖したウェルから順に培養上清を採取し、上記と同
一の方法により、抗体産生を確−認した。陽性のウェル
は再度クローニングし、抗ＣＰＢＩＩモノクローナル抗
体産生バイプリドーマを得た。これらのバイプリドーマ
は、４種類得られ、前記表１の如くそれぞれ産生ずる抗
ＣＰＢＩＩモノクローナル抗体の種類により、　ＣＰＢ
ＩＩ　−Ｈ２９，ＣＰＢＩＩ　−８７６゜ＣＰＢＩＩ　
−Ｈ３１１，ＣＰＢＩＩ−Ｈ５１１と命名した。

実施例２ 抗ＣＰＢＩＩモノクローナル抗体の調製ニア週令以上の
ＢＡＬＢ／ｃ系マウスにプリスタン（アルドリッチ社製
）　０．５ｍｊ２を腹腔的投与し、約１週間後、上記で
得たバイプリドーマ１×１０６個／マウス腹腔内接種し
た。約１０日後、マウス腹腔より腹水を採取した。これ
を３、ＯＯＯｒｐｍ、　１０分間遠心分離し、上清を分
取しその５　　ｍｆｌに硫酸アンモニウムを終４度が５
０％飽和濃度になるように加え、４℃で６０分間攪拌す
る。次いで、１０，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分難し
、沈渣を０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）に溶か
し同緩衝液に対して透析した。これに等量の１．５Ｍグ
リシン−３Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，９）を加
えた後、同緩衝液で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ　５
ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂ（）７）レマシア社製）
カラムクロマトグラフィーに付した。

モノクローナル抗体の溶出は、０．１Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ４）で行い、抗ＣＰＢＩＴモノクローナル抗体を
得た。　ＣＰＢＩＩ−Ｈ２９を用いた場合は、ＣＰＢＩ
Ｉ−Ａ２９を２２．２ｍｇ％ＧＰＢｒｌ−８７６を用い
た場合は、　ＣＰＢＩＩ−Ａ７６を７．８ｍｇ、　ＣＰ
ＢＩＩ−Ｈ３１１を用いた場合は、　ＣＰＢＩＴ−Ａ３
１１を１６　ｍｇ、　　ＣＰＢｌｌ　−８５１１を用い
た場合は、Ｃ１’Ｂ１１−八５１１を２９ｍ８得た。

これらの抗ＣＰＢＩＩモノクローナル抗体は、前記表１
の性質を示した。

実施例３ 免疫吸着クロマトグラフィーによる　ＣＰＢＩＩの精製
： （］）抗ＣＰＢＩｒモノクローナル抗体の担体への結合 ブロムシアン活性化セファロース４Ｂ（０，４ｇ）を、
１　ｍＭ塩酸、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム−０，５Ｍ塩
化ナトリウム（ｐＨ８，３）緩衝液で順次洗浄し、ブロ
ムシアン活性化セファロース４Ｂのカップリング緩衝液
（１，５ａｌ　）溶液を調製した。

これに、精製モノクローナル抗体ＣＰＢＩＩ−Ａ７６２
０１ｇのカップリング緩衝液（１ｍＪ２）ｉ液を加え、
室温で２時間据とうしグラスフィルターで脱水した。更
に、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（１）Ｈ８，Ｏ）　１
ｏ　　ｍｘを加え、室温で２時間振とうし、残った活性
部位をブロックした。

得られた抗体結合セファロース４Ｂを、０．１Ｍトリス
−塩酸−０，５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，３）
、ｆｌ、１Ｍ酢酸−０，５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ４，０）で交互に３回洗浄し、０．１Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，４）で平衡化し、抗体カラム７６を得
た。

（２）抗体カラムによる　ＣＰＢＩＴの精製上記で作製
した抗体カラム７６に、実施例１−　　ｔｉ＞　−（＊
Ｎ　で得た粗ＣＰＢＩＩ溶液をかけ、平衡化に用いた緩
衝液で充分洗浄した。

（：ＰＢ［１の溶出は、■０．１Ｍ酢酸−０．１５Ｍ塩
化ナトリウム緩衝液（＋）Ｈ３，５）を用いる方法、あ
るいは００．２Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）
を用いる方法で行うことができる。

ＣＰＢｌｌは、素通り画分には認められず、溶出画分か
ら８０％以上の回収率で精製することができた。

尚、精製結果は回収率で表２に示した。

ＣＰＢｌｌの測定は、実施例４の方法で行った。

表２ ＣＰＢＩ！回収率（％） 実施例４ 抗（：ＰＢ１１モノクローナル抗体を用いる　ＣＰＢＩ
Ｉの測定： Ｓ、　Ｙｏｓｈｉｔａｋｅらの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｎ＋、　９２゜１４１３−１４２４．１９８２）に準
じてホースラデイツシュ（西洋わさび）ペルオキシダー
ゼ（以下ＨＲＰと略す）を、抗ＣＰＢ１１モノクローナ
ル抗体に結合させた。このＨＲＰ標識抗（：ＰＢＩＩモ
ノクローナル抗体を用いて、以下の如＜　ＥＬＩＳＡ法
によりＣＰＢＩＩの測定を行った。９６ウエル平底マイ
クロプレートの各ウェルに０．０５Ｍ炭酸ナトリウム（
ｐ）１９．８）に溶解したモノクローナル抗体を１００
μβずつ添加し、２５℃で２時間コーティングした。　
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、試料の０．１Ｍトリス−
塩酸、２５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０　（ｐＨ７，４）緩衝液溶液１００μｋを加えた。

２５℃で一晩反応させた後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄
し、ＨＲＰ標識モノクローナル抗体のＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎ希釈溶液をｔｏｏｕｎ加え、２５℃で２時間反応させ
た。　ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄後、ｔｏｏμｘの基質
溶液（オルトフェニレンジアミン０．４ｍｇ／ｍ１およ
び０．０１％過酸化水素の０．１Ｍクエン酸リす酸ｉ衝
液、ｐｏｓ、ｏ）を添加し、２５℃で３０分間反応させ
た。４．５Ｍ硫酸５０μｍを加えて反応を停止させた後
、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、表
３に示す如く、コーティング用モノクローナル抗体とし
てＣＰＢＩＩ−Ａ２９を用い、標識用モノクローナル抗
体としてＣＰＢＩＩ−Ａ７Ｂ、　ＣＰＢＩＩ−＾３１１
．　ＣＰＢＩＩ−Ａ５１１を用いた場合、及びコーティ
ング用モノクローナル抗体としてＣＰＢＩＩ−Ａ５１１
を用い、標識用モノクローナル抗体としてＣＰＢＩＩ−
八２９．　　ＣＰＢＩＩ−Ａ７６を用いた場合には、ｌ
　〜１００　ｎｇ／ｍｕの範囲のＣＰＢＩＩを検出でき
る。

表３ −　二速用不可 ＋、＋＋：通用不充分 ＋１＋二適用可 また、コーティング用モノクローナル抗体としてＣＰＢ
　ｌｌ−Ａ２９を用い、標識用モノクローナル抗体とし
て、ＣＰＢＩＩ−Ａ５１１を用いた場合の検量線は、図
１に示す如く極めて感度が高く、しかも良好な直線性を
示した。

【図面の簡単な説明】

図１は、実施例４のＣＰＢＩＩ測定法におけるｃｐｅｔ
ｔ濃度と吸光度（４９ｚｒ＋＋＋＋）との関係を示す図
面である。 図１：コーティング用モノクローナル抗体としてはＣＰ
ＢＩＩ−Ａ２９を使用し、標識用モノクローナル抗体と
してはＣＰＢＩＩ−Ａ７６及びＡ３１１を使用した。 以　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質ＣＰＢIIに対し
   て特異的なモノクローナル抗体。２、ヒト胎盤由来の抗
   血液凝固活性物質ＣＰＢIIに対して特異的なモノクロー
   ナル抗体を産生するハイブリドーマ。 ３、ヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質ＣＰＢIIに対し
   て特異的なモノクローナル抗体を免疫吸着剤として使用
   することを特徴とするヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物
   資ＣＰＢIIの精製法。 ４、ヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物質ＣＰＢIIに対し
   て特異的なモノクローナル抗体の標識体を使用すること
   を特徴とするヒト胎盤由来の抗血液凝固活性物資ＣＰＢ
   IIの免疫学的測定法。