JPS6357596A - モノクロ−ナル抗体、その製法およびそれからなる肝疾患診断剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はモノクローナル抗体、その製法およびモノクロ
ーナル抗体からなる肝疾患診断剤に関する。

さらに本発明は新規なモノクローナル抗体を用いた血清
中の肝細胞抗原の量を測定するための方法に関する。

さらにまた本発明は上記した新規なモノクローナル抗体
を用いる肝疾患診断法に関する。

多くの肝疾患においては肝細胞膜成分が血液中に存在し
、さらに病態によってはこれらの細胞膜成分が抗京とな
って体内に抗体が産生されることがある。

従って肝組織由来の抗原や、この抗原に対する抗体のレ
ベルは種々の肝疾患のマーカーとなりうろ。本発明のモ
ノクローナル抗体はヒト肝組織由来の抗原（ｌ（ｕｍａ
ｎ　Ｌｉｂｅｒ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ＡｎＬｉ−ｇｅ、
ｎ　、　ＨＬＳＡ）のレベルの測定、さらに特徴的には
ヒト肝癌細胞（ＨＣＣ−１１）由来の抗原のレベルの測
定、ひいては肝疾患とりわけ肝癌の診断に利用される。

〔従来の技術〕

従来肝疾患の診断にはＡＬＴ（アラニンアミノ転移酵素
）、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノ転移酵素）等肝臓に
存在する酵素の活性を測定する方法等が用いられていた
。

また従来臨床適用されている肝癌の診断方法としてＡＦ
Ｐ（α−フェトプロティン）の定量による方法かある。

しかしながら上記したＡＬＴ活性測定法、およびＡＳＴ
活性測定法は肝疾患について種々の情報を得ることがで
きるものの必ずしも肝機能に特有のものではなく正確な
診断のためにはさらに他の情報を得る手段が求められて
いた。

本発明者らは特願昭６０−２６５３２号で、ヒト肝細胞
抗原に対して特異的に作用する新規なモノクローナル抗
体（Ｈ−２）およびその製法およびそれからなる診断剤
を提案した。

このヒト肝細胞抗体に対して特異的に作用するモノクロ
ーナル抗体（Ｉ（−２）は、マウスをヒト肝細胞（正常
肝）抗原で免疫して得られるマウスの肝細胞と、マウス
のミエローマ細胞膜を細胞融合し、得られたヒト肝細胞
抗原に対するモノクローナル抗体を産生ずる能力を有す
る融合細胞を培地で培養するか、またはマウスの腹腔内
に移植して、培養液中にかまたは腹水中にこのモノクロ
ーナル抗体を生成させることによって得られたものであ
る。

さらに本発明者らはさきに上記したモノクローナル抗体
（Ｈ−２）を用いて血清中の抗ヒト肝特異抗原抗体量を
測定する方法を提案している（特１頭昭６０−０８２６
６４号）。

この測定方法は、ヒト肝細胞（正常肝）抗原に対するモ
ノクローナル抗体を固定化し、これに被検査血清とこの
モノクローナル抗体に対する抗血清を加え、上記の固定
化したモノクローナル抗体と抗血清とを結合さけ、固定
化したモノクローナル抗体に結合した抗血清に更に酵素
で標識した抗血清免疫グロブリンを加えて結合させ、こ
の結合した抗血清免疫グロブリンの量を測定することよ
りなる。

〔本発明の背景〕

我国は肝細胞膜成分の高危険地域の一つであるアジアに
あり、欧米諸国と比べ肝細胞癌の発生率は高い。肝細胞
癌は肝硬変症からの移行が極めて大きくその診断が重要
な課題となっている。

上記したＡＦＰの定量による肝癌の診断方法は現在臨床
通用されているものであるが、１９７０年代にＡＦＰの
ラジオイムノアッセイ法が開発されるに及んで、従来の
寒天ゲル内沈降法ではＡＦＰの証明されなかった疾患（
たとえば肝炎・肝硬変など）にもＡＦＰが認められるよ
うになり、正常成人血清中にもわずか（２０ｎｇ／ｍ（
！以下）ではあるがその存在が知られ初期の肝細胞層の
特異的診断法としての信頼性には若干欠けるところがあ
る。

また上記した本発明者らによるモノクローナル抗体（Ｈ
−２）を用いた方法は肝疾患全般の有効な診断方法であ
るが、肝硬変と肝癌を区別するのに有効なものとは言い
得ない。従って肝硬変と肝癌の臨床診断における抗原量
の差異を顕著に示すことのできる診断方法が望まれてい
ｆこ。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは鋭意研究の結果、ヒト肝細胞抗原とりイつ
けヒト肝癌細胞抗原に対する新規なモノクローナル抗体
を得ることに成功し、これをｆｑ用することによる肝疾
患とりわけ肝癌の診断剤を発明したのである。

すなわち本発明によればヒト肝細胞抗原に対するモノク
ローナル抗体が提供される。

本発明によれば、特にＩｇＭに属する免疫グロブリンで
あるヒト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体が提供
される。

さらに本発明によればマウスをヒト肝癌細胞（ＨＣＣ−
Ｍ）で癌化して得られる肝細胞とマウスミエローマ細胞
とを通常の方法で融合し、ヒト肝癌細胞抽出物である抗
原に対して陽性かつヒト正常肝細胞抽出物に対して陰性
である融合細胞をクローニングし、クローニングされた
細胞を培地で培養するかまたはマウス腹腔内に移植して
腹水癌化することにより培養液中または腹水中に該モノ
クローナル抗体を生産蓄積させ、該培養液または腹水中
からモノクローナル抗体を採取することを特徴とするヒ
ト肝癌細胞抗原（二対するモノクローナル抗体の製法が
提供される。

本発明によればさらにヒト肝細胞抗原に対するモノクロ
ーナル抗体からなる肝疾患診断剤が提供される。

さらに本発明によればヒト肝細胞抗原に対するモノクロ
ーナル抗体を用いて、免疫化学的方法によって被検者の
血清中のヒト肝細胞由来の抗原量を測定する方法および
該方法を用いた診断方法が提供される。

本発明の方法によればヒト肝細胞抗原に対するモノクロ
ーナル抗体は、次の如くして製造される。

（１）ヒト肝細胞抗原の調製 ヒトの肝細胞癌組織から樹立されて継代培養されている
ヒト肝癌細胞味ＨＣＣ−ＭよりＨＣＣ−Ｍ細胞をヌード
ラットに移植し、得られた腫瘍からブタノールを用いて
抗原を抽出する。

（２）免疫化動物細胞の調製 マウスをヒト肝癌細胞ＨＣＣ−Ｍで免疫し、その動物か
ら脾細胞を採取する。免疫化はそれ自体公知の方法によ
って実施される。

（３）融合細胞の作成 上記免疫化脛細胞とマウスミエローマ細胞とを常法に従
って融合させる。クローニングは（１）の抗原に対して
陽性でヒト正常肝ブタノール抽出抗原に対して陰性のウ
ェルから細胞をクローニングすることにより行う。これ
により二種の融合細胞１０Ｂ−２１，１０１１−２３が
確立される。

（４）モノクローナル抗体の調製 融合細胞１０Ｂ−２１およびｌ０Ｈ−２３株を培地で培
養するかまたはマウス腹腔内に移植して腹水癌化するこ
とにより培養液中または腹水中にモノクローナル抗体を
生成蓄積させ、培養液または腹水中から・常法によりモ
ノクローナル抗体を採取する。

本発明において得られる融合細胞１０Ｂ−２１および１
０１１−２３株は次の特性を有する。

（由来） マウスミエローマ細胞（Ｐ３−ＮＳＩ）とマウス牌臓細
胞との融合細胞である。

（形態） マウスミエローマ細胞とほぼ同様の形態を示す。

（機能） 免疫グロブリンＩｇＭを定常的に産生ずる。

（増殖性） ミエローマ細胞とほぼ同様の増殖性を示す。

たとえば７２時間で約１０倍に増殖する。

（保存性） ＝８０℃以下で長時間保存可能である。

（最適増殖条件） ｐｉ（７，２、温度３７℃ （培　地） ＲＰＭＩ−１６４０（米国、ギブコ社製）に１０％の牛
胎児血清を含ませたもの。

上記融合細胞１０Ｂ−２１および１０１１−２３株は昭
和６１年８月２１日に工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託申請されたが、その寄託の受託は拒否された。

本発明のヒト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体は
ヒト肝臓に存在する抗原とのみ反応し、ヒトの他の臓器
や他の動物の肝臓に存在する抗原とは反応しない。従っ
て各種ヒト肝疾患の病態診断剤として使用される。また
、本発明の診断剤は従来の肝機能検査の一つであるＡＬ
Ｔの検査結果とは相互関係を有しないので、全く異なっ
た面から、肝疾患の診断をすることができる。

本発明のｌ０Ｂ−２１およびｌ０Ｈ−２３モノクロ一ナ
ル抗体を用いて肝疾患を診断する場合には、常法により
、好ましくはコンペティティブ（Ｃｏｍｐｅｔ　ｉｔ　
１ｖｅ）ＥＬＩＳＡ法により患者血清中のヒト肝細胞抗
原を測定する。例えばヒト肝癌細胞（以下、ＨＣＣ−Ｍ
と略記する）ブタノール抽出抗原を固相化し、これに濃
度が既知の［（ＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原の一定量を
加え、次にこのＨＣＣ−Ｍて動物、例えばマウスを免疫
化して得られるｌ０Ｈ−２３モノクロ一ナル抗体を加え
、上記の固相化したＨ　ＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原お
よび添加したＨＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原と結合させ
、洗浄して固相化したＨＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原と
　これに結合したｌ０Ｈ−２３モノクロ一ナル抗体は残
留させるが添加したＨＣＣ−Ｍブタノール抽出物と結合
したｌ０Ｈ−２３モノクロ一ナル抗体は除去し、酵素、
ラジオアイソトープ、蛍光体等で標識した対応抗原例え
ば抗マウス免疫グロブリンＭ（以下抗マウス［ｇＭと略
記する）を加えて固相化したＨＣＣ−Ｍブタノール抽出
抗原に結合している１０１（−２３モノクロ一ナル抗体
に結合させ、この結合した標識抗マウスＩｇＭの量を測
定する。この標識抗マウスＩｇＭの量は例えば標識酵素
がペルオキシダーゼである場合には０−フェニレンジア
ミンと過酸化水素とで呈色させ４９０ｎｍの吸光度を測
定する。これらの測定方法の他に、ラテックス凝集反応
のような反応を用いる方法も利用可能である。このよう
に既知量の添加されたＨＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原と
固相化されたＩＩｃｅ−Ｍブタノール抽出抗原との間で
競合的にｌ０Ｈ−２３モノクロ一ナル抗体と反応するの
で、１０８−２３モノクロ一ナル抗体は両方に分配され
るが、洗浄によって固相化されたＨＣＣ−Ｍブタノール
抽出抗原と結合したＩ　Ｏ１１−２３モノクロ一ナル抗
体のみが残ることになる。

かくして添加されるＨＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原量に
応じて固相化されたＨＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原と結
合した１　０　Ｈ−２３モノクロ一ナル抗体の量が決ま
ることになる。従ってこの結合したｌ０Ｈ−２３モノク
ロ一ナル抗体の量を例えば酵素で標識した抗マウス１ｇ
）１を結合させて測定すれば既知量の添加されたＩＩＣ
Ｃ−Ｍブタノール抽出抗原に対応する固相化されたＨＣ
Ｃ−Ｍブタノール抽出抗原と結合したｌ０Ｈ−２３モノ
クロ一ナル抗体の量がわかることになる。この操作を添
加されるＨＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原の量を変動させ
て繰り返し行なうことにより検量線が得られる。次いで
肝細胞抗原の濃度が不明である被検査血清を固相化した
ＨＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原に加え、さらにこれにｌ
０Ｈ−２３モノクロ一ナル抗体を加え、同様にして固相
化したＨＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原に結合した１０）
１−２３モノクロ一ナル抗体の量を標識した抗マウスＩ
ｇＭを用いて測定し、これをさきに得られた検量線に当
てはめて被検査血清中の肝細胞抗原量を求めるのである
。

上記した）ＩＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原の固相化は通
常プラスチックウェル（Ｐｌａｓｔｉｃ　ｗｅｌｌ）で
行なわれこのプラスチックウェルにＨＣＣ−Ｍブタノー
ル抽出抗原が固相化されていない部分がある場合には次
に添加するＨＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原または血清中
の肝細胞抗原が更に固相化されることになって測定エラ
ーを生ずるので上記部分の目づめのために蛋白質たとえ
ばウソ胎児血清で保護することか行なわれる。

実施例１　モノクローナル抗体の調製 ■　ヒト肝癌細胞株ＨＣＣ−Ｍの樹立 １９８０年血清＋ｉＢｓＡｇ＋、ＨＢｅＡｇ＋、ＨＢｓ
Ａｂ−１ＨＢｅＡｂ−１ＨＢｃＡｂ＋、アルファフェト
プロティン陽性の３４才男性患者の手術時摘出された肝
細胞癌組織より下記のごとくして樹立された。

肝細胞癌組織を１０％ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍ（
ｌペニシリン、１００μ９７ｍ（ｌストレプトマイシン
添加ＲＰＭＩ−１６４０培地中で１ｍｍｍ息角に細切し
、プラスチックの培養管に移し２〜３ｍＱの同培地中で
培養した。培養開始後７０目に線維芽細胞に混じて上皮
性の細胞が増殖した。上皮性の細胞をラバーポリスマン
で剥離し別の培養管に移し更に培養を続けた。４週間後
に０．２５％トリプシンで細胞を剥離し、別の培養管に
移し更に培養を続けた。その後この細胞は現在（１９８
６年）に至るまで継代培養されている。

（ＨＣＣ−Ｍ細胞の特徴） ＨＣＣ”Ｍに適した培養液はＲＰＭＩ−１６４０であり
１０％のウシ胎児血清の添加が必要である。第１図に示
すとおり、この条件下では２４時間の集合倍加時間で増
殖し、軟寒天中では３０％のクローン効率（Ｃ１ｏｎａ
ｌ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）である。ヌードマウス（Ｂ
ＡＬＢ／ｃ　、　ｎｕ／ｎｕ）に再移植性であり、皮下
移植では５Ｘ　１０”の細胞数で１００％の生着率であ
る。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養された場合第２図に示すとおり
各細胞は多角形で敷石状に配列し単層で増殖する。第３
図で示すとおり電子顕微鏡観察によると核および核小体
が認められ豊富なりポゾームとポリゾームが認められろ
。

染色体数は６０から１２２に分布しており、平均は６３
であった。第４図に示すとおり五つのマーカー染色体が
認められた。

ＨＣＣ−Ｍは前記したＨ−２モノクロ一ナル抗体に反応
性を有しＨＬＳＡ　ｌ（ヒト肝特異抗原）を保有してい
る。

酵素抗体法で肝細胞癌２５例、肝硬変２５例、正常肝５
例の組織および表１に示す培養細胞株を検討した結果Ｈ
２２モノクロ一ナル抗によって規定されるＨＬＳＡ　１
は肝硬変細胞肝細胞癌の金側に見出された。従ってＨＬ
ＳＡ　ｌはＨＣＣ−Ｍ細胞を含めて肝細胞由来の細胞の
マーカーとして有用と考えられる（表１参照）。

肝細胞癌（組織）　　２０　　　　５　　　　０肝硬変
（組織）　　　　２５　　　　０　　　　０正常肝（組
織）　　　５　　　０　　　０培養細胞株”　　　　Ｈ
ＣＣ−Ｍ Ｃｈａｎｇ　１ｉｖｅｒ　ｃｅｌｌ ＰＬＣ／ＰＲＦ１５ ＣＯＬＯ−２０５ ＫＮ−２３ 中培養細胞株：Ｈｃｃ−Ｍ（ヒト肝細胞癌妹）Ｃｈａｎ
ｇ（正常成人肝由来） ＣＯＬＯ２０５（ヒト大腸癌株） ＭＫＮ２８（ヒト胃癌細胞株） ＰＬＣ／ＰＲＦ１５（ヒト肝細胞癌株）＋＋：強陽性　
　十：陽性　　−：、陰性数字は例数を表わす。

■　ｌ０Ｂ−２１および１０１（−２３モノクロ一ナル
抗体の作成 ｉ　）　　ＨＣＣ−Ｍブタノール抽出物（抗原）の作成
１０％ウシ胎児血清加ＲＰＭ［培地に継代培養されてい
るＨＣＣ−Ｍ細胞を１匹あたりＩＸ　１０７個を０．１
ｍＱの培地中に希釈して数匹のヌードラット皮下に移植
した。約４週間後腫瘍径が１〜２ｃＩ１１となったとこ
ろで腫瘍を切除した。

壊死部分、結合織を除去した後、腫瘍をハサミでできる
だけ細切し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７，２
にて４回遠沈洗浄後、得られた細胞懸濁液を４倍量（Ｖ
／Ｖ）のＰＢＳ中２．５％　Ｉ−ブタノール中５分間室
温でゆっくり撹拌しながら抗原の抽出を行なった。次に
４℃で５００Ｘ９．１０分間遠沈し、上清を採取し、さ
らに４℃で２，０ＯＯＸ　９．２０分間遠沈した。得ら
れた上清を４℃にて１００倍量のＰＢＳで２４時間透析
し１−ブタノールを除去した。つぎに４°Ｃで１００，
０００９．１時間超遠沈し、その上清を分離し、−８０
℃で保存し以下の実験に粗製ブタノール抽出物　（Ｃｒ
ｕｄｅ　ＢｕｔａｎｏｌＥｘｔｒａｃｔ、ＣＢＥ）とし
て用いた。

ＨＣＣ−Ｍブタノール抽出物は５ＤＳ−ＰＡＧＥで３１
個のバンドが認められた。また高速液体クロマトグラフ
ィーによる分画を同様に抽出した正常ヒト肝組織と比較
したものを第５Ａおよび５Ｂ図に示す。

ｉｉ　）細胞融合 ＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスに背部数箇所の皮下と腹腔内に
一匹当り２Ｘ１０′１個のＨＣＣ−Ｍ細胞を注射した。

４週後と８週後に同様の注射を行ないブースターとし最
後の注射後４日後に膵臓を無菌的に摘出した。

細胞融合はに６ｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎの
方法に準じマウスミエローマ細胞のＰ３−ＮＳＩ細胞と
上記した脾細胞を融合させることにより行なった。クロ
ーニングはＨＣＣ−Ｍブタノール抽出物に対して陽性で
ヒト正常肝ブタノール抽出物に対して陰性のウェルから
細胞をクローニングした。クローニングは２回繰り返し
融合細胞を選択した。

その結果２種の融合細胞が確立され、それぞれ１０Ｂ−
２１，１０１（−２３と命名した。

融合細胞７Ｂ−８および１０１（−２３から常法に従っ
てそれぞれモノクローナル抗体１０Ｂ−２１およびモノ
クローナル抗体１０Ｈ−２３を得た。

（モノクローナル抗体１０Ｂ−２１およびｌ０Ｈ−２３
の特徴） 融合細胞１０Ｂ−２１および１０１１−２３の培養液に
ついて、マウス免疫グロブリンＩｇＧ１、Ｇ２ａ、　Ｇ
２ｂ、　Ｇ３、ＩｇＭおよびＩｇＡに対する家兎抗血清
を第２抗体として用いて検討したところモノクローナル
抗体１０Ｂ−２１およびモノクローナル抗体１０Ｈ−２
３ともにＩｇＭに属する免疫グロブリンであることが明
らかとなった。

次に肝癌、正常肝、胃癌、胃、腎の組織標本および培養
細胞株としてＨＣＣ−Ｍ細胞、Ｃｈａｎｇの肝細胞（正
常成人肝由来）、Ｃ０ＬＯ２０５（ヒト大腸癌株）およ
びＨｅ１ａについて、モノクローナル抗体１０Ｂ−２１
とｌ０Ｈ−２３の反応性を酵素抗体法により検索したと
ころ表２に示すとおりとなった。即ち、組織では肝癌が
強陽性、正常肝が陽性、そして培養細胞株ではＨＣＣ−
Ｍ細胞が強陽性、Ｃｈａｎｇの肝細胞が陽性であった。

表　　２ ｊｌ　正常肝　旺　！−〒− １０Ｂ−２１＋＋＋　　　　　　＋　　　　　　　−−
−１０Ｈ−２３＋＋＋　　　　　　　　十　　　　　　
　　−−−ＨＣＣ−Ｍ　　Ｃｈａｎｇ”　　Ｃ０ＬＯ−
２０５”　　ＨｅＬａ”１（ＩＢ−２１＋＋＋　　　　
　　十＋　　　　　　　　　−’　　　　　　　　−１
０Ｈ−２３＋↑＋　　　　＋−− 傘Ｃｈａｎｇ（正常成人肝由来） ＣＯＬＯ−２０５（ヒト大腸癌法） 上表からもわかるようにモノクローナル抗体１０Ｂ−２
１およびｌ０Ｈ−２３はともに認識する対応抗原はＨＣ
Ｃ−Ｍを含めて肝細胞由来の抗原であることが明らかと
なった。

実施例２　モノクローナル抗体を用いた抗原の測定方法
および肝癌の診断 ■　モノクローナル抗体１０Ｂ−２１についてＩ）検量
線の作成 ＩＩ　ＣＣ−Ｍブタノール抽出物（１０μ９／ｉｌυを
９６穴のプレートの各ウェルに５０μρずつ加え、３７
°Ｃで１時間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄した
。

２０％ウシ胎児血清加ＰＢＳ　２００μ（１／　ｗｅｌ
ｌを加えて３７℃、１時間インキュベートし、ＰＢＳで
３回洗浄した。

次に０．２％ウシ血清アルブミン、０．０５％ツイーン
２０加ＰＢＳ（洗浄液）で０から１００μ’ｊ／ｍＱに
希釈したＨＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原をスタンダード
として各ウェルに５０μρずつ加え、更にモノクローナ
ル抗体１０Ｂ−２１（８倍希釈）を５０μρずつ加えて
、３７℃で１時間インキュベートした。２回洗浄後、２
，０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ
Ｍを５０μβずつ加えて３７℃で１時間インキュベート
した。次に洗浄液で３回洗浄後基質として０−フェニレ
ンジアミン２０＋ｎｇと３０％過酸化水素２０μｇを５
０ｍＣの０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５，０
，）に溶解したものを１５０μσずつ加えて室温で３０
分呈色反応を行ない、２．５Ｍ硫酸を５０μρずつ加え
て反応を停止後４９０ｎｍの吸光度を測定した。実験は
２連で行ない平均値を求めた。得られた検量線を第６図
に示す。

第６図に示すとおり、０から１００１１ｇ／ｍρの範囲
でＨＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原濃度の自然対数と吸光
度との間には直線関係が認められ、検量線として優れた
ものであった。

１１）被検血清中のモノクローナル抗体１０Ｂ−２１対
応抗原量の測定 上記した■−１）の操作のスタンダードのかわりに肝疾
患患者から得た被検血清を２００倍希釈して用いて同様
の操作を行なった。対象とする肝疾患には肝癌、肝硬変
、慢性肝炎が含まれる。測定された吸光度から■−１）
で得られた検量線を使って被検血清中の抗原量を求めた
。結果を表３に示す。

表　　３ 肝疾患患者血清中に検出される １０Ｂ−２１対応抗原量 対　　象　　　　　　　症例数　　抗原量（ｕｎｉｔ／
ｍの肝　　　癌　　　　　　　　　２５　　　　２６６
６．３肝硬変　　　１３　６６３．７９ 慢性肝炎　　　　　８　　２０１９．８健常コントロー
ル　１７　　４４８．２６■　モノクローナル抗体１０
Ｈ−２３についてｉ）検量線の作成 モノクローナル抗体１０Ｂ−２１（８倍希釈）のかイっ
りにｌ０Ｈ−２３（１６倍希釈）を用いて■−１）と同
様の操作を行ない良好な検量線を得た。結果を第７図に
示す。

ｉｉ　）被検血清中のモノクローナル抗体ｒ　ＯＨ−２
３対応抗原量の測定 モノクローナル抗体１０Ｂ−２１（８倍希釈）のかわり
にｌ０Ｈ−２３（１６倍希釈）を用いて■−ｉｉ　）と
同様の操作を行ない吸光度を測定した。■−１）で得ら
れた検量線を使って被検血清中の抗原量を求めた。結果
を表４に示す。

表　　４ 肝疾患患者血清中に検出されろ １０　Ｈ−２３対応抗原量 対　　象　　　　　症例数　　　８量（ｕｎｉｔ／ｍの
肝　　　　癌　　　　　　１２　　　　　　１２６３７
．３肝硬変　　５　　６０８０．８ 慢性肝炎　　　　４　　　　８０６７．０〔発明の効果
〕 表３かられかるとおり、本発明のモノクローナル抗体１
０Ｂ−２１では肝硬変（１３例）に比して肝癌（２５例
）では約４．０倍高値であり、また表４かられかるとお
り、本発明のモノクローナル抗体１０ト２３では肝硬変
（５例）に比して肝癌（１２例）では約３．８倍高値で
あった。従って本発明の診断方法は現在重大な課題とな
っている肝硬変から肝癌への移行の臨床診断に極めて有
色層な判定材料を与えるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨＣＣ−Ｍ細胞の生長を示すグラフである。 第２図はＨＣＣ−Ｍ細胞の増殖した状聾を示す図（写真
）である。 第３図はＨＣＣ−Ｍ細胞の電子顕微鏡写真である。 第４図はＨＣＣ−Ｍ細胞の抜型とマーカーの染色体を示
す。 第５Ａ図は＋１　Ｐ　Ｌ　ＣによるＨＣＣ−Ｍブタノー
ル抽出物の分析結果、第５Ｂ図はＨＰＬＣによるヒト正
常肝細胞ブタノール抽出物の分析結果を示す。 第６図はコンペティティブＥＬＩＳＡにおいてモノクロ
ーナル抗体１０Ｂ−２１を用いた場合のＩ（ＣＣ−Ｍブ
タノール抽出抗原（標準物質）ａ度と吸光度の関係を示
す検量線グラフである。 第７図はコンペティティブＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａにおいて
モノクローナル抗体１０■−２３を用いた場合のＨＣＣ
−菫ブタノール抽出抗原濃度と吸光度の関係を示す検量
線グラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ヒト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体。 ２）ＩｇＭに属する免疫グロブリンである特許請求の範
   囲第１項記載のモノクローナル抗体。 ３）マウスをヒト肝癌細胞（ＨＣＣ−Ｍ）で癌化して得
   られる脾細胞とマウスミエローマ細胞とを通常の方法で
   融合し、ヒト肝癌細胞抽出物である抗原に対して陽性か
   つヒト正常肝細胞抽出物に対して陰性である融合細胞を
   クローニングし、クローニングされた細胞を培地で培養
   するかまたはマウス腹腔内に移植して腹水癌化すること
   により培養液中または腹水中に該モノクローナル抗体を
   生産蓄積させ、該培養液または腹水中からモノクローナ
   ル抗体を採取することを特徴とするヒト肝細胞抗原に対
   するモノクローナル抗体の製法。 ４）ヒト肝細胞抗原に対するモノクローナル抗体からな
   る肝疾患診断剤。 ５）ヒト肝癌細胞抗原に対するモノクローナル抗体を用
   いて免疫化学的方法によって被検査血清中のヒト肝癌細
   胞抗原を測定する方法。 ６）ヒト肝癌細胞ＨＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原を固定
   化し、これに被検査血清とこのヒト肝癌細胞抗原に対す
   るモノクローナル抗体を加え、上記の固定化したヒト肝
   癌細胞ＨＣＣ−Ｍブタノール抽出抗原とモノクローナル
   抗体とを結合させ、固定化したヒト肝癌細胞ＨＣＣ−Ｍ
   ブタノール抽出抗原に結合したモノクローナル抗体に更
   に酵素で標識した抗マウス免疫グロブリンを加えて結合
   させ、この結合した抗マウス免疫グロブリンの量を測定
   することからなる特許請求の範囲第５項に記載の方法。