JP2011530536A - 抗膵癌抗体 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
本研究は、NIH助成金RO1−CA54425による支援を一部受けた。米国政府は、本発明における一定の権利を有し得る。
DOTA−D−Asp−D−Lys(HSG)−D−Asp−D−Lys(HSG)−NH2(IMP271);
DOTA−D−Glu−D−Lys(HSG)−D−Glu−D−Lys(HSG)−NH2(IMP277);
DOTA−D−Tyr−D−Lys(HSG)−D−Glu−D−Lys(HSG)−NH2(IMP288);
DOTA−D−Ala−D−Lys(HSG)−D−Glu−D−Lys(HSG)−NH2(IMP0281);
NOTA−ITCベンジル−D−Ala−D−Lys(HSG)−D−Tyr−D−Lys(HSG)−NH2(IMP449);
NODA−Ga−D−Ala−D−Lys(HSG)−D−Tyr−D−Lys(HSG)−NH2(IMP460);
NOTA−D−Ala−D−Lys(HSG)−D−Tyr−D−Lys(HSG)−NH2(IMP461);
NOTA−D−Asp−D−Lys(HSG)−D−Tyr−D−Lys(HSG)−NH2(IMP462);
NOTA−D−Ala−D−Lys(HSG)−D−Tyr−D−Lys(HSG)−NH2(IMP465);
C−NETA−スクシニル−D−Lys(HSG)−D−Tyr−D−Lys(HSG)−NH2(IMP467);
S−NETA−D−Lys(HSG)−D−Tyr−D−Lys(HSG)−NH2(IMP469);および
L−NETA−スクシニル−D−Lys(HSG)−D−Tyr−D−Lys(HSG)−NH2(IMP470)
からなる群から選択されるターゲッティング可能な構築物/コンジュゲートに対する親和性を有する少なくとも1つの結合部位とを含む二重特異性抗体またはその断片も企図される。使用に好適な他のターゲッティング可能な構築物は、例えば、米国特許第6,576,746号;同第6,962,702号;同第7,052,872号;同第7,138,103号;同第7,172,751号;および同第7,405,320号、ならびに米国特許出願第12/112,289号に開示されており、これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。
特に指示しない限り、「1つの(a)」または「1つの(an)」は、1つまたは複数を意味する。
本発明の様々な実施形態は、正常または良性の膵組織ではなく膵癌と極めて高い選択性で反応する抗体に関するものである。抗膵癌抗体およびその断片は、好ましくは、ヒト膵臓の腫瘍から得られる未処理のムチン調製物に対して惹起されるが、部分精製ムチンまたは精製ムチンですらも利用し得る。このような抗体の非限定的な例は、PAM4抗体である。
特定の抗原に対するモノクローナル抗体は当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、KohlerおよびMilstein,Nature 256:495(1975)、およびColiganら(編),CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,第1巻,2.5.1−2.6.7ページ(John Wiley & Sons 1991)(以下、「Coligan」)を参照されたい。簡潔に述べると、抗膵癌MAbは、PAM4抗原などの、膵癌由来ムチンを含む組成物をマウスに注射し、血清試料を採取して抗体産生の存在を確認し、脾臓を摘出してBリンパ球を取得し、このBリンパ球と骨髄腫細胞を融合してハイブリドーマを産生させ、このハイブリドーマをクローニングし、PAM4抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、PAM4抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、ハイブリドーマ培養物から抗膵癌抗体を単離することにより得ることができる。
抗体断片は、例えば、F(ab’)2、Fab’、F(ab)2、Fab、Fv、sFv、scFvなどの、抗体の抗原結合部分である。特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の技術により作製することができる。例えば、F(ab’)2断片は、抗体分子のペプシン消化により産生することができる。これらのおよびその他の方法は、例えば、Goldenbergの米国特許第4,036,945号および同第4,331,647号、ならびにそれらに含まれる参照文献により記載されている。また、Nisonoffら,Arch Biochem.Biophys.89:230(1960)、Porter,Biochem.J.73:119(1959)、Edelmanら,METHODS IN ENZYMOLOGY 第1巻,422ページ(Academic Press 1967)、ならびにColigan(2.8.1−2.8.10ページおよび2.10−2.10.4および)も参照されたい。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルFab’断片の迅速かつ容易な同定を可能にするために、Fab’発現ライブラリーを構築することができる(Huseら,1989,Science,246:1274−1281)。
目的の抗膵癌抗体を含む融合タンパク質は、官能基間のグルタルアルデヒド結合からより特異的な結合までの種々の常法により調製することができる。本明細書に記載の融合タンパク質を含む抗体および/または抗体断片は、好ましくは、直接的に、あるいはリンカー部分を介して、あるいは抗体または断片上の1つまたは複数の官能基(例えば、アミン、カルボキシル、フェニル、チオール、もしくはヒドロキシル基)を介して、互いに共有結合している。グルタルアルデヒドの他、例えば、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、ビス(ヒドロキシスクシンイミド)エステル、カルボジイミド、マレイミドヒドロキシスクシンイミドエステルなどの様々な従来のリンカーを使用することができる。
二重特異性抗体または多重特異性抗体をプレターゲッティング技術で使用し得る。プレターゲッティングは、元々、骨髄などの正常組織に対する望ましくない毒性の一因となる直接的なターゲッティング抗体の血中クリアランスの遅さを解決するために開発された多段階プロセスである。プレターゲッティングでは、放射性核種またはその他の治療剤を、血液から数分以内にクリアランスされる小さい送達分子(ターゲッティング可能な構築物またはターゲッティング可能なコンジュゲート)に付加する。ターゲッティング可能な構築物および標的抗原に対する結合部位を有する、プレターゲッティング二重特異的抗体または多重特異的抗体をまず投与し、遊離抗体を血中からクリアランスさせ、その後、ターゲッティング可能な構築物を投与する。
発現ベクターは、宿主細胞内で発現される遺伝子を含むDNA分子である。通常、遺伝子発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーをはじめとする、特定の調節エレメントの制御下に置かれる。このような遺伝子は、調節エレメントに「機能的に連結されている」と言われる。プロモーターは構造遺伝子の転写を指令するDNA配列である。構造遺伝子はメッセンジャーRNA(mRNA)へと転写されるDNA配列であり、メッセンジャーRNAは、その後、ペプチドまたはタンパク質へと翻訳される。プロモーターが誘導性プロモーターの場合、誘導因子に応答して転写の割合が増加する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターの場合、転写の割合は誘導因子によって調節を受けない。エンハンサーは、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離または向きとは無関係に、転写効率を高めることができるDNA調節エレメントである。
特定の実施形態は、対象の悪性腫瘍を診断または治療する方法であって、対象に抗膵癌MAb、融合タンパク質、またはそれらの断片を投与することを含む方法に関するものであり、ここで、このMAb、融合タンパク質、または断片は、少なくとも1つの診断剤および/または治療剤に結合している。また、癌を診断または治療する方法であって、対象にPAM4抗原に対する1つまたは複数の抗原結合部位と1つまたは複数のハプテン結合部位とを含む多価多重特異性抗体またはその断片を投与すること、結合していない抗体が対象の血流からクリアランスされるのに十分な時間待つこと、ならびにその後、対象に、局在化した抗体のハプテン結合部位に結合する、診断剤、治療剤、またはそれらの組合せを含む担体分子を投与することを含む方法も好ましい。より好ましい実施形態では、癌は非内分泌膵癌である。
裸の抗膵癌抗体およびその断片の効力は、これらの裸の抗体を、同時にまたは順次にまたは所定の投与計画に従って投与される、1つまたは複数の他の裸の抗体、あるいは薬物、毒素、免疫調節物質、ホルモン、オリゴヌクレオチド、ホルモン拮抗薬、酵素、酵素阻害剤、治療用放射性核種、血管新生阻害剤などをはじめとする、1つまたは複数の治療剤とコンジュゲートされた1つまたは複数の免疫コンジュゲートで補うことによって増強することができる。あるいは、裸の抗体は、他の抗体に付加されていない治療剤とともに投与されてもよい。裸の抗膵癌抗体を補うために使用し得る抗体は、同じ癌細胞に対して向けられたものであってもよいし、または選択された裸の抗体の抗腫瘍効果を増強するために動員することができる免疫調節細胞(例えば、CD40+細胞)に対して向けられたものであってもよい。
抗膵癌抗体およびその断片は、治療または診断用の少なくとも1つの治療剤および/または診断剤にコンジュゲートされていてもよい。免疫療法の場合、その目的は、非標的組織への曝露を最小限に抑えて、細胞傷害用量の放射能、毒素、抗体、および/または薬物を標的細胞に送達することである。好ましくは、抗膵癌抗体は、膵腫瘍を診断および/または治療するために使用される。
本発明は、生体試料をPAM4抗原の存在についてインビトロでスクリーニングするための、抗膵癌抗体の使用を企図している。このような免疫アッセイでは、抗体、抗体断片、または融合タンパク質は、以下に記載されるように、液相で利用してもよいし、または固相担体に結合させてもよい。考慮すべき宿主免疫応答がないので、インビトロ診断の目的のために、マウス、キメラ、ヒト化、またはヒトなどの任意の種類の抗体を利用し得る。
放射性標識MAbを用いる様々なインビボ診断イメージング方法が周知である。免疫シンチグラフィー技術では、例えば、抗体をガンマ線放出放射性同位体で標識し、患者に導入する。ガンマカメラを用いて、ガンマ線放出放射性同位体の位置および分布を検出する。例えば、Srivastava(編),RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY(Plenum Press 1988)、Chase,「Medical Applications of Radioisotopes」(REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版,Gennaroら(編),624−652ページ(Mack Publishing Co.,1990))、およびBrown,「Clinical Use of Monoclonal Antibodies」(BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227−49,Pezzutoら(編)(Chapman & Hall 1993))を参照されたい。
さらなる薬学的方法を用いて、治療適用での抗膵癌抗体の作用期間を制御し得る。徐放性製剤は、抗体、抗体断片、または融合タンパク質と複合体を形成するかまたはそれらを吸着するポリマーの使用を通じて調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーとしては、ポリ(エチレン−コ−酢酸ビニル)のマトリックスおよびステアリン酸二量体とセバシン酸の無水共重合体のマトリックスが挙げられる。Sherwoodら,Bio/Technology 10:1446(1992)。このようなマトリックスからの抗体、抗体断片、または融合タンパク質の放出速度は、抗体、抗体断片、または融合タンパク質の分子量、マトリックス内の抗体の量、および分散している粒子の大きさによって決まる。Saltzmanら,Biophys.J.55:163(1989);Sherwoodら,前掲。他の固相投薬形態は、Anselら,PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,第5版(Lea & Febiger 1990)、およびGennaro(編),REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版(Mack Publishing Company 1990)、ならびにそれらの改訂版に記載されている。
様々な実施形態は、患者の罹患組織を治療または診断するのに好適な構成要素を含むキットに関するものであってもよい。例示的なキットには、本明細書に記載された少なくとも1つの抗体、抗原結合断片、または融合タンパク質が含まれていてもよい。投与するための構成要素を含む組成物が、消化管を介する送達(例えば、経口送達によるもの)のために処方されていない場合、何らかの他の経路を介してキット構成要素を送達することができる装置を含めてもよい。非経口送達などの用途のための、1つのタイプの装置は、対象の身体に組成物を注射するために使用されるシリンジである。吸入装置も使用し得る。特定の実施形態では、抗膵癌抗体またはその抗原結合断片は、抗体の滅菌液体処方物または、凍結乾燥製剤を含む予め充填されたシリンジまたは自動注射ペンといった形態の中に提供されてもよい(例えば、Kivitzら,Clin.Ther.2006,28:1619−29)。
好ましい実施形態では、特許請求された方法および組成物に、膵癌ムチンに対して惹起されたマウスPAM4 MAbのヒト化IgGである抗体hPAM4が利用されている。マウスPAM4配列のヒト化を利用して、ヒト抗マウス抗体(HAMA)応答が軽減された。ヒト化PAM4を作製するために、マウス相補性決定領域(CDR)をマウス免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖からヒトフレームワーク領域(FR)抗体配列に移し、次に、いくつかのヒトFR残基をそのマウス対応物と置き換えた。ヒト化モノクローナル抗体は、インビトロおよびインビボでの診断法および治療法で使用するのに好適である。
5’−AGTCTGGGGC TGAGGTGAAG AAGCCTGGGG CCTCAGTGAA GGTCTCCTGC GAGGCTTCTG GATACACATT CCCTAGCTAT GTTTTGCACT GGGTGAAGCA GGCCCCTGGA CAAGGGCTTG AGTGGATTGG ATATATTAAT CCTTACAATG ATGGTACTCA GTACAATGAG AAG−3’(配列番号20)
5’−AGGGTTCCCT GGCCCCAGTA AGCAAATCCG TAGCTACCAC CGAAGCCTCT TGCACAGTAA TACACGGCCG TGTCGTCAGA TCTCAGCCTG CTCAGCTCCA TGTAGGCTGT GTTGATGGAC GTGTCCCTGG TCAGTGTGGC CTTGCCTTTG AACTTCTCAT TGTACTGAGT ACC−3’(配列番号21)
hPAM4VHBACK 5’−CAG GTG CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCT GAG GTG A−3’(配列番号22)
hPAM4VHFOR 5’−TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT TCC CTG GCC CCA−3’(配列番号23)
5’−CAGTCTCCAT CCTCCCTGTC TGCATCTGTA GGAGACAGAG TCACCATGAC CTGCAGTGCC AGCTCAAGTG TAAGTTCCAG CTACTTGTAC TGGTACCAAC AGAAACCAGG GAAAGCCCCC AAACTCTGGA TTTATAGCAC ATCCAACCTG GCTTCTG−3’(配列番号24)
5’−GTCCCCCCTC CGAACGTGTA CGGGTACCTA TTCCACTGAT GGCAGAAATA AGAGGCAGAA TCTTCAGGTT GCAGACTGCT GATGGTGAGA GTGAAGTCTG TCCCAGATCC ACTGCCACTG AAGCGAGCAG GGACTCCAGA AGCCAGGTTG GATGTG−3’(配列番号25)
hPAM4VKBACK 5’−GAC ATC CAG CTG ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG−3’(配列番号26)
hPAM4VKFOR 5’−TTA GAT CTC CAG TCG TGT CCC CCC TCC GAA CGT−3’(配列番号27)
正常成体組織に対する免疫組織化学によって、PAM4反応性エピトープが胃腸管に限定されており、そこでは、染色は弱いが、陽性であることが示された(表1)。膵管、膵導管、膵腺房、および膵島細胞を含む、正常膵組織は染色が陰性であった。抗原として組織ホモジネートを用いるPAM4ベースの酵素免疫アッセイは全般的に免疫組織化学データを裏付けるものであった(表2)。PAM4エピトープは、正常な膵臓やその他の非胃腸管組織には存在しなかった。腫瘍組織では、PAM4は、25のうち21(85%)の膵癌(表3および表4)ならびに26のうち10の結腸癌と反応性があったが、胃、肺、乳房、卵巣、前立腺、肝臓、または腎臓の腫瘍とは限られた反応性しかなかった(表4)。PAM4反応性は、腫瘍分化のステージと相関しているようであり、中分化腫瘍または低分化腫瘍よりも高分化膵癌でより大きいパーセンテージの染色が見られた。一般に、低分化腫瘍は全膵癌の10%未満に相当する。
PAM4の最初の生体分布研究は、予測される分化の範囲を網羅する一連の4つの異なる異種移植ヒト膵腫瘍で行なった。使用した4つの腫瘍株AsPc1、BxPc3、Hs766T、およびCaPan1は各々、腫瘍内に131I−PAM4の濃縮を示し(範囲:3日目で21%〜48%ID/g)、これは、同時に投与された非特異的なアイソタイプ一致Ag8抗体(範囲:3日目で3.6%〜9.3%ID/g)よりも有意に(p<0.01〜0.001)高かった。この生体分布データを用いて、AsPc1、BxPc3、Hs766T、およびCaPan1のそれぞれに、注射量12,230;10,684;6,835;および15,843cGy/mCiの腫瘍に対する潜在的線量を推定した。実際の最大認容量(MTD)0.7mCiでは、PAM4は、異種移植腫瘍モデルの各々に実質的な線量をもたらすことができた。各腫瘍株において、放射性標識PAM4の血液レベルは、非特異的Ag8よりも有意に(p<0.01〜0.001)低かった。PAM4からの血液への潜在的線量はAg8からのものより1.4〜4.4倍低かった。PAM4からの腫瘍への線量をPAM4から血液への線量に対して標準化したところ、腫瘍が受け取った線量は2.2;3.3;3.4であり、それぞれ血液よりも13.1倍高かった。重要なことに、非腫瘍組織に対する潜在線量は最小であった。
動物モデルにおける膵癌の臨床症状をより近似させるため、本発明者らは、腫瘍細胞を膵頭に直接注入することにより同所性モデルを開発した。腹水が発症して10〜14週で死に至るまで、同所性CaPan1腫瘍は、明らかな症状を示さずに徐々に増殖した。移植後3〜4週までに、動物は触知可能な約0.2gの腫瘍を発生させた。増殖後8週以内に、約1.2gの原発性腫瘍が、肝臓や脾臓への転移を伴って見られた(1〜3個の転移腫瘍/動物;各腫瘍<0.1g)。10〜14週で腹水の発症を伴う横隔膜播種が明らかになった。通常、腹水の形成や時折生じる黄疸が、腫瘍増殖の最初の明らかな症状であった。この時点で、腫瘍は1〜2gとかなり大きく、動物には死に至るまで長くて3〜4週間しかなかった。
治療のための131I−PAM4の使用に関する最初の試験を、無胸腺マウスで皮下異種移植片として増殖したCaPan1腫瘍を用いて行なった。同じような用量の非特異的Ag8の治療効果も比較する試験において、0.25gの腫瘍を担持する動物に350μCiの131I−PAM4を投与した。1cm3の腫瘍を有する動物への131I−PAM4の投与のMTDは700μCiである。5週目と6週目までに、PAM4処置した動物は劇的な腫瘍退縮を示し、27週でも8匹中5匹で腫瘍がない状態であった。無処置およびAg8処置動物は、腫瘍増殖の急速な進行を示したが、これら2つの対照群の間で有意差は見られなかった。7週で、無処置群の腫瘍が最初の時点から20.0±14.6倍増殖したのに対し、131I−Ag8処置腫瘍は4.9±1.8倍しか増殖していなかった。この時点で、PAM4腫瘍はもとの大きさの0.1±0.1倍に退縮しており、無処置動物(p<0.001)と非特異的Ag8処置動物(p<0.01)の両方と有意差があった。
ゲムシタビン(ジェムザール(登録商標))と131I−PAM4放射免疫療法の併用の最初の試験は格子状アレイとして行ない、ゲムシタビン1回量(0、100、200、500mg/kg)に対して131I−PAM4 1回量([MTD=700μCi]MTDの100%、75%、50%、0%)とした。組み合わされたMTDは、500mg/kgゲムシタビンと350μCi 131I−PAM4(50%MTD)であることが分かった。体重減少により測定される毒性は、無毒とみなされる最大値、すなわち、体重の20%の減少にまで至った。併用治療プロトコルはゲムシタビン単独よりも有意に効果的であったが、この治療の効果は放射免疫療法単独と同程度であった。次の試験は、真の相乗的治療効果が見られるかどうかを調べるために、低用量のゲムシタビンと放射免疫療法で行なった。約1cm3(体重の約5%)の腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウスに、0、3、6、9、および12日目にゲムシタビン100mg/kgを投与し、0日目に100μCiの131I−PAM4を投与した。ゲムシタビン単独と比較して統計学的に有意(p<0.0001)な腫瘍の退縮(5つの腫瘍のうち2つが0.1cm3未満)および/または腫瘍の増殖阻害を伴って治療効果が見られた。したがって、驚くべきことに、より少ない投薬量の治療剤で、ゲムシタビンと放射免疫療法の併用の相乗効果があるように思われる。さらに留意すべきは、体重の点で、毒性が見られなかったことである。この併用治療プロトコルは、必要であれば、上記の放射免疫療法単独試験で行なったように、4週目に2回目の治療サイクルを開始して、複数回行なうことができる。
プレターゲッティングアプローチを用いる膵癌のイメージングのために、本発明者らは、キメラPAM4(cPAM4)Fab’とマウス734(m734)Fab’からなる二重特異性F(ab’)2抗体(bsMAb)を調製した。マウス734抗体はIn−DTPA錯体を認識する。このbsMAbを125I(7μCi)で標識し、ヒト膵癌異種移植片(CaPan1)を担持する無胸腺ヌードマウスに注射した。キメラリツキシマブ(抗CD20モノクローナル抗体)とm734から作製した非ターゲッティングF(ab’)2 bsMAbを131Iで標識し、対照として同時注射した。様々な時点(注射後4、24、36、48、および72時間)でマウスを解剖し、組織を摘出し、計数してグラム当たりの注射量パーセント(%ID/g)を測定した。対照bsリツキシマブと比較して、各時点でのbsPAM4の腫瘍取込みは有意に多かった(p<0.032またはそれより良い)。このタイプのプレターゲッティング系を用いた本発明者らのこれまでの実験から、良好な腫瘍:非腫瘍比を得るには1%ID/g未満の血液レベルが必要であることが示唆された。bsPAM4の投与後36時間では、血中1.10±0.40%ID/gであったが、注射後48時間では0.56±0.08%ID/gまで下がった。これら2つの時点での腫瘍取込みは、それぞれ6.43±1.50%ID/gおよび5.37±2.38%ID/gであった。これらの値は、36時間および48時間の時点で、それぞれ腫瘍中0.65±0.33%ID/gおよび0.47±0.19%ID/g(p<0.018およびp<0.0098)であった対照bsリツキシマブよりも有意に高かった。しかしながら、血液クリアランス速度は非常によく似ており、有意な差はなかった。
トランスフェクトされた膵臓細胞
MUC−1ムチンを発現しないPanC1ヒト膵腺癌細胞に、MUC−1をコードするcDNA(これは、Hudsonら(Amer.J.Pathol.148,3:951−60,1996)に開示されており、M.A.Hollingsworth博士(Univ.of Nebraska Medical Center,Omaha,NE)から得られたものである)をトランスフェクトした。このMUC−1 cDNAは、30タンデムリピート(30TR)型か、または42タンデムリピート(42TR)型のいずれかのMUC−1をコードしていた(Hudsonら,1996;Lidellら,FEBS J.275:481−89,2008)。このMUC−1配列は、コードされたタンデムリピート配列の数以外の点では同じであった。
MUC−1遺伝子をトランスフェクトされたHEK−293(ヒト胎児腎臓細胞)は、MA5モノクローナル抗体と反応するが、PAM4とは反応しないMUC−1を産生した(図示せず)。しかしながら、上で論じたように、非常に低レベルの内在性MUC−1を発現するMUC−1トランスフェクトPanC1細胞は、PAM4と強く反応し、MAb−MA5とは反応しないMUC−1を合成した。異種サンドイッチ免疫アッセイ(PAM4→MA5およびMA5→PAM4キャプチャー/プローブ)は、いくつかの細胞株由来の上清でシグナルを生じさせるように機能しなかった。PAM4またはMA5 MAbをキャプチャー試薬として使用しながら、ポリクローナル抗ムチン抗血清をプローブとして使用すると、効果的な免疫アッセイが実際に得られた。ポリクローナルをプローブとして用いるそれぞれの免疫アッセイにおけるこれら2つのMAbの交差遮断により、これらのMAbが独立したエピトープと反応することが示唆された。
膵臓ムチンPAM4抗原をDTTで処理すると(室温で15分間)、PAM4との反応性が完全に消失した(DTT−EC50、0.60±0.00μM)。MUC−1の唯一のシステイン(シスチン架橋)は膜貫通ドメインに存在し、DTTが接近できるはずがない。分泌型のMUC−1は膜貫通ドメインを含まず、それゆえ、分子内シスチン架橋を有さない。0.05Mの過ヨウ素酸ナトリウムを用いて室温で2時間、PAM4抗原を過ヨウ素酸酸化処理して得られたデータから、PAM4抗体との免疫反応性が40%失われたことが示された(図示せず)。さらなる過ヨウ素酸研究により、PAM4抗体との免疫反応性が60%も失われたことが示されている(図示せず)。過ヨウ素酸研究とDTT研究の結果から、PAM4エピトープが、何らかの最小形態のグリコシル化に立体構造的に依存しており、分子間ジスルフィド結合形成によって影響され得ることが示唆されている。
PanINでのPAM4エピトープの発現は、MUC−1に典型的なものと違っている。この発現は、市販のMAb−CLH2−2で検出されるMUC−5acについて報告されている発現によく似ている。しかしながら、PAM4キャプチャーとMAb−CLH2−2をプローブとして用いてサンドイッチ免疫アッセイを試みると、ネガティブな結果が得られた。これは、PAM4エピトープとCLH2−2エピトープが重なり、したがって互いに遮断し合う可能性があることを示唆するものであると思われるが、CLH2−2が42/66(64%)の胃癌と反応するのに対し、PAM4 MAbは、わずか6/40(15%)の胃癌、かつこのうち、局所的に反応するものとの反応性しか示さないことが報告された。
2つの異なるファージディスプレイペプチドライブラリーを用いてPAM4抗体結合を調べた。第1のものは、12個のアミノ酸配列からなる線状ペプチドライブラリーであり、第2のものは、ジスルフィド架橋で環化した7個のアミノ酸配列からなる環状ペプチドであった。本発明者らは、合わせて合計4ラウンドの間、個々のライブラリーを交互にhPAM4とhLL2に対してパニングし(抗CD22抗体によるネガティブ選択)、その後、ファージディスプレイされたペプチドを、hLL2に対する反応性が皆無かそれに近く、hPAM4とmPAM4の両方と反応するかどうかついてスクリーニングした。非特異的な形でのファージ結合(すなわち、エプラツズマブ[hLL2]に対する結合)を廃棄した。
膵炎、糖尿病、喫煙などのような、いくつかの病理学的条件によって、患者に膵癌が発生しやすくなる。この予め選択された患者群において、スクリーニング手段は、膵臓新生物の早期検出に特に重要である。本発明者らは、この疾患の一次診断を受けた患者由来の9つの慢性膵炎組織標本を検討した。本発明者らは、抗CD74 MAbと、炎症性浸潤の指標としてのLL1と、膵管細胞および膵腺房細胞の陽性対照としてのMAb−MA5とを用いた。2つの対照MAbが膵炎と一致する免疫組織学的証拠を提供したのに対し、PAM4が炎症を起こした膵組織と反応した例はなかった。しかしながら、1つの症例で、中分化膵腺癌も組織標本中に存在していた。PAM4は、この腫瘍内の新生物細胞を強く染色した。2つめの症例では、炎症を起こした組織はPAM4で陰性であったが、PAM4で標識される小さなPanIN前駆病変が同定された。この後者の標本内でのPanINの標識は、非悪性疾患と診断された患者の膵臓新生物の早期検出と一致する。これらの結果は、PAM4抗体を用いた検出および/または診断を、良性膵組織のバックグラウンドと対照させて膵臓新生物に対して高感度および高選択性に実施し得るを示している。
患者118−001、CWGは、複数の肝転移があるステージIVの膵腺癌を有する63歳の男性であり、2007年11月に診断を受けた。この患者は、第1の治療戦略として放射免疫療法とゲムシタビン化学療法の併用を開始することに同意し、その後、6.5mCi/m2の90Y−hPAM4を200mg/m2のゲムシタビンと併用した最初の治療サイクルを投与され、このサイクルに従って、ゲムシタビンが週1回で1〜4週目に投与され、90Y−hPAM4が週1回で2〜4週目に(3用量)投与された。最初のサイクルの後、大きな毒性が認められなかったので、2カ月後、同じ治療サイクルを繰り返した。驚くことに、最初の治療サイクルから4週間後にすでに、CTによる原発腫瘍と3つのうち2つの肝転移の直径の減少の証拠が認められ、これは、FDG−PETスキャンのSUV値の顕著な減少と一致しており、4つの腫瘍のうち3つが、この時点で通常のバックグラウンドレベルに戻っていた(図6および図7)。患者の治療前の1,297というCA−19.9レベルは、77という低いレベルにまで落ち、治療が効果的であることをさらに裏付けた。表8は、この患者における90Y−hPAM4を用いた放射免疫療法とゲムシタビン化学療法の併用の効果を示す。抗体にコンジュゲートされた、このような低い用量の放射性核種を、このような低く、毒性のない用量のゲムシタビンと併用することで、わずか1クールのこの治療の後ですら、このような抗腫瘍活性が示されたのは、驚くべきことであり、また予期しないことであった。
広範囲の手術不能膵腺癌を有し、直径1〜4cmに及ぶいくつかの肝転移、大幅な体重減少(体重30lb以上)、軽度の黄疸、無気力、および衰弱、ならびに投薬が必要な腹痛を有する56歳の男性に、各々200mg/m2の用量でゲムシタビン注入を4週投与する。最後の3回のゲムシタビン注入時に、90Y−DOTA−hPAM4放射性標識ヒト化抗体を、2時間のi.v.注入で、10mCi/m2の90Yおよび20mg抗体タンパク質の用量で投与する。2週間後、患者に、i.v.注入による600mg/m2の3週用量からなる1クールのゲムシタビン化学療法を投与する。次に、患者を4週間後に評価すると、患者は、軽度の白血球減少(グレード2)を示し、ベースラインを超える大きな血液または酵素の変化は他に見られないが、5,700から1,200への血液CA19.9力価の改善と黄疸の軽減とを示し、全体的な主観的改善がある。3週間後、より低い用量のゲムシタビン(週1回×4)と、3用量の90Y−DOTA−hPAM4のサイクルを繰り返す。4週間後、患者を再評価し、CTスキャンとPETスキャンにより、全腫瘍塊(原発癌と転移)が約40%低下したことと、CA19.9力価が870までさらに低下したことが確認される。患者は食欲と活動を取り戻し、痛み止めを必要とせずに、より普通の日常活動に復帰することができる。この患者は、この実験的治療を開始してから12lb太った。スキャンと血液値の繰り返しにより、この応答が6週後まで維持されることが示されている。
DDD融合タンパク質およびAD融合タンパク質
DNL技術を用いて、ほとんど全ての抗体もしくはその断片または他のエフェクター部分を含む、二量体、三量体、四量体、六量体などを作製することができる。特定の好ましい実施形態のために、IgG抗体またはFab抗体断片を、二量体化・ドッキングドメイン(DDD)配列またはアンカリングドメイン(AD)配列のいずれかを含む融合タンパク質として産生し得る。好ましい実施形態では、DDD部分とAD部分は融合タンパク質として産生されるが、当業者であれば、化学的架橋などの、他のコンジュゲーション方法を特許請求された方法および組成物の範囲内で利用し得ることを理解するであろう。
DDD1:SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号33)
DDD2:CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号34)
AD1:QIEYLAKQIVDNAIQQA(配列番号35)
AD2:CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(配列番号36)
プラスミドベクターpdHL2は、いくつかの抗体および抗体ベースの構築物を産生するのに使用されている。Gilliesら,J Immunol Methods(1989),125:191−202;Losmanら,Cancer(Phila)(1997),80:2660−6を参照されたい。このジシストロン性の哺乳動物発現ベクターはIgGの重鎖と軽鎖の合成を導く。ベクター配列は、多くの様々なIgG−pdHL2構築物とほとんど同じであり、唯一の違いは可変ドメイン(VHおよびVL)配列に存在する。当業者に公知の分子生物学のツールを用いて、これらのIgG発現ベクターをFab−DDDまたはFab−AD発現ベクターに変換することができる。Fab−DDD発現ベクターを作製するために、重鎖のヒンジ、CH2、およびCH3ドメインのコード配列を、ヒンジの最初の4残基、14残基のGly−Serリンカー、およびヒトRIIαの最初の44残基をコードする配列と置き換えた(DDD1と表す)。Fab−AD発現ベクターを作製するために、IgGのヒンジ、CH2、およびCH3ドメインの配列を、ヒンジの最初の4残基、15残基のGly−Serリンカー、およびバイオインフォマティックスとペプチドアレイ技術を用いて作製され、RIIα二量体と極めて高い親和性(0.4nM)で結合することが示された、AKAP−ISと呼ばれる17残基の合成ADをコードする配列と置き換えた(AD1と表す)。Altoら.Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A(2003),100:4445−50を参照されたい。
pdHL2プラスミドベクターを鋳型として用いてCH1ドメインをPCRで増幅した。左側のPCRプライマーは、CH1ドメインの上流(5’)末端と、CH1コード配列の5’にあるSacII制限エンドヌクレアーゼ部位とからなっていた。右側のプライマーは、ヒンジ(PKSC)の最初の4残基、続いて4つのグリシンと1つのセリンをコードする配列からなり、最後の2つのコドン(GS)はBamHI制限部位を含んでいた。410bpのPCR増幅物をPGEMT(登録商標)PCR クローニングベクター(PROMEGA(登録商標),Inc.)にクローニングし、クローンをT7(5’)方向での挿入についてスクリーニングした。
(G4S)2DDD1(配列番号37として開示された(G4S)2)と表される二重鎖オリゴヌクレオチドは、DDD1のアミノ酸配列と、その前の11残基のリンカーペプチドをコードし、最初の2つのコドンがBamHI制限部位を含むように、 Sigma GENOSYS(登録商標)(Haverhill,UK)により合成された。終止コドンとEagI制限部位は3’末端に付加されている。コードされたポリペプチド配列を以下に示す。
GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号38)
(G4S)2−AD1(配列番号37として開示された(G4S)2)と表される二重鎖オリゴヌクレオチドは、AD1のアミノ酸配列と、その前の11残基のリンカーペプチドをコードし、最初の2つのコドンがBamHI制限部位を含むように、合成された(Sigma GENOSYS(登録商標))。終止コドンとEagI制限部位は3’末端に付加されている。コードされたポリペプチド配列を以下に示す。
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(配列番号39)
DDD1配列をコードする190bpの断片を、BamHI制限酵素とNotI制限酵素を用いてPGEMT(登録商標)から切り出し、その後、CH1−PGEMT(登録商標)中の同じ部位に連結して、シャトルベクターCH1−DDD1−PGEMT(登録商標)を作製した。
AD1配列を含む110bpの断片を、BamHI制限酵素とNotI制限酵素を用いてPGEMT(登録商標)から切り出し、その後、CH1−PGEMT(登録商標)中の同じ部位に連結して、シャトルベクターCH1−AD1−PGEMT(登録商標)を作製した。
このモジュール設計を用いて、CH1−DDD1またはCH1−AD1のいずれかをpdHL2ベクター中の任意のIgG構築物に組み込むことができる。pdHL2からSacII/EagI制限断片(CH1−CH3)を除去し、それを、それぞれのpGemTシャトルベクターから切り出される、CH1−DDD1またはCH1−AD1のSacII/EagI断片と置き換えることによって、重鎖定常ドメイン全体が上記の構築物のうちの1つと置き換えられる。
h679−Fd−AD1−pdHL2は、14アミノ酸残基から構成された柔軟なGly/Serペプチドスペーサーを介してAD1がFdのCH1ドメインのカルボキシル末端に結合したh679 Fabを産生するための発現ベクターである。h679の可変ドメインを含むpdHL2ベースのベクターは、SacII/EagI断片を、SacIIとEagIを用いてCH1−AD1−SV3シャトルベクターから切り出されたCH1−AD1断片と置き換えることにより、h679−Fd−AD1−pdHL2に変換された。
C−DDD1−Fd−hMN−14−pdHL2は、柔軟なペプチドスペーサーを介してCH1ドメインのカルボキシル末端でDDD1がhMN−14 Fabに結合している2コピーの融合タンパク質C−DDD1−Fab−hMN−14を含む安定な二量体を産生するための発現ベクターである。hMN−14 IgGを産生するために使用されている、プラスミドベクターhMN−14(I)−pdHL2は、SacIIおよびEagI制限エンドヌクレアーゼで消化してCH1−CH3ドメインを除去することと、SacIIおよびEagIを用いてCH1−DDD1−SV3シャトルベクターから切り出されたCH1−DDD1断片を挿入することにより、C−DDD1−Fd−hMN−14−pdHL2に変換された。
C−DDD2−Fd−hMN−14−pdHL2は、14アミノ酸残基のGly/Serペプチドリンカーを介してhMN−14のFdのカルボキシル末端に付加されたDDD2の二量体化・ドッキングドメイン配列を有するC−DDD2−Fab−hMN−14を産生するための発現ベクターである。分泌されるこの融合タンパク質は、DDD2ドメインの非共有結合的相互作用によって結合している2つの同一コピーのhMN−14 Fabから構成されている。
C−DDD2−Fab−hMN−14(A)と対を成してBとなるように、h679−Fab−AD2を設計した。h679−Fd−AD2−pdHL2は、14アミノ酸残基のGly/Serペプチドリンカーを介してCH1ドメインのカルボキシル末端に付加されたAD2のアンカリングドメイン配列を有するh679−Fab−AD2を産生するための発現ベクターである。AD2は、その前に1つのシステイン残基と、AD1のアンカードメイン配列の後にもう1つのシステイン残基とを有する。
TF2と表される三量体DNL構築物は、C−DDD2−Fab−hMN−14をh679−Fab−AD2と反応させることにより得られた。TF2の試験バッチを以下のように、>90%収率で作製した。プロテインLで精製したC−DDD2−Fab−hMN−14(200mg)をh679−Fab−AD2(60mg)と1.4:1のモル比で混合した。総タンパク質濃度は、1mM EDTAを含むPBS中に1.5mg/mlであった。その後の工程は、TCEP還元、HICクロマトグラフィー、DMSO酸化、およびIMP291親和性クロマトグラフィーを含んだ。TCEPを添加する前、SE−HPLCにより、a2b形成の形跡は示されていなかった。5mMのTCEPを添加すると、この二成分構造に予想される157kDaのタンパク質と一致するa2b複合体が速やかに形成された。IMP291親和性クロマトグラフィーによって、TF2をほぼ均一なるまで精製した(図示せず)。IMP291は、679 Fabが結合するHSGハプテンを含む合成ペプチドである(Rossiら,2005,Clin Cancer Res 11:7122s−29s)。IMP291未結合画分のSE−HPLC解析により、生成物からのa4、a2、および遊離カッパ鎖の除去が示された(図示せず)。
同様のプロトコルを用いて、2コピーのC−DDD2−Fab−hPAM4と1コピーのC−AD2−Fab−679を含む三量体TF10 DNL構築物を作製した。TF10中の癌を標的とする抗体成分は、放射性標識MAbとして詳細に研究されている(例えば、Goldら,Clin.Cancer Res.13:7380−7387,2007)ヒト化抗膵癌ムチンMAbのhPAM4から得られた。ハプテン結合成分は、ヒト化抗ヒスタミニル−スクシニル−グリシン(HSG)MAbのh679から得られた。TF10二重特異性([hPAM4]2×h679)抗体は、上記のように、(抗CEA)2×抗HSG bsAb TF2の作製について開示された方法を用いて作製した。TF10構築物は、2つのヒト化PAM4 Fabと1つのヒト化679 Fabを含む。
以下の研究は、hPAM4を組み込んだ二重特異性抗体と標識ペプチドを用いるプレターゲッティング技術を用いたインビボイメージングの実行可能性を示すものである。2コピーのC−DDD2−Fab−hPAM4と1コピーのC−AD2−Fab−679を含む、TF10二重特異性抗体を前述の実施例に記載したように調製した。TF10および111In−IMP−288ペプチドによるプレターゲッティングを用いて、0.2〜0.3gのヒト膵癌異種移植片を担持するヌードマウスをイメージングした。図8に示す結果は、111In標識ジ−HSGペプチドのIMP−288とともに、bsMAbプレターゲッティング法を用いる動物モデルで、輪郭が描かれた腫瘍をどれほど明瞭に検出することができるかということを示している。図8の上の6匹の動物に、2つの異なる用量のTF10(投与したペプチドのモルに対して10:1および20:1のモル比)を投与し、翌日、これらの動物に111In標識ジHSGペプチド(IMP288)を投与した。図8の下の他の3匹の動物には、111In−IMP−288のみを投与した(プレターゲッティングなし)。標識ペプチドを注入してから3時間後に画像を撮影した。これらの画像から、プレターゲッティングした動物では、0.2〜0.3gの腫瘍がはっきりと局在しているが、111In−ペプチドのみを投与した動物では局在が見られないことが示されている。腫瘍取込みは、平均して20〜25%ID/gであり、腫瘍/血液比は2000:1超、腫瘍/肝臓比は170:1、腫瘍/腎臓比は18/1であった。
種々の実施形態で、18F標識タンパク質またはペプチドを新規の技術により調製し、診断研究および/またはPETイメージングなどのイメージング研究に使用する。18F標識のための新規の技術は、DOTA、NOTA、もしくはNETAまたはそれらの誘導体などの、キレート化部分に錯化した、18F−金属錯体、好ましくは、18F−アルミニウム錯体の調製を含む。キレート化部分を、当該技術分野で周知のコンジュゲーション技術を用いて、タンパク質、ペプチド、または任意の他の分子に付加してもよい。特定の好ましい実施形態では、18F−Al錯体を、まず溶液中で形成させ、その後、既にタンパク質またはペプチドにコンジュゲートしているキレート化部分に付加する。しかしながら、代わりの実施形態では、アルミニウムをまずキレート化部分に付加し、後で18Fを付加してもよい。
ペプチドは、Fmoc戦略を用いて固相ペプチド合成によって合成した。Fmoc/Aloc保護基を用いて基をジアミノアミノ酸の側鎖に付加し、示差的に脱保護した。使用する酢酸に対して1:1の比でピペリジンを添加することを除き、Danglesら(J.Org.Chem.1987,52:4984−4993)の方法によって、Aloc基を除去した。非対称テトラ−t−ブチルDTPAは、McBrideら(米国特許出願公開第2005/0002945号、この実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている通りに作製した。
調製し、18F標識した最初のペプチドは、IMP272であった。
DTPA−Gln−Ala−Lys(HSG)−D−Tyr−Lys(HSG)−NH2 MH+ 1512
金属ストック溶液の約3μLアリコート(6×10−9mol)を、ポリプロピレン円錐形バイアル中に入れ、75μLの18F(受け取ったままの状態)と混合し、室温で約2分間インキュベートした後、0.1M NaOAc緩衝液(pH4)中の20μLの2mM(4×10−8mol)IMP272溶液と混合した。この溶液を、加熱ブロック中、100℃で15分間加熱し、逆相HPLCで分析した。IMP272は、インジウム(24%)、ガリウム(36%)、ジルコニウム(15%)、ルテチウム(37%)、およびイットリウム(2%)で標識された(図示せず)。これらの結果から、18F金属標識技術は、アルミニウム配位子に限定されるものではなく、他の金属も同様に利用することができることが示されている。異なる金属配位子を用いる場合、F−18−金属コンジュゲートの結合を最適化するために、異なるキレート化部分を利用してもよい。
以下のアミノ酸を以下に示す順序でSieberアミド樹脂に付加することによって、この樹脂上でペプチドIMP448 D−Ala−D−Lys(HSG)−D−Tyr−D−Lys(HSG)−NH2(MH+1009)を作製した。すなわち、Aloc−D−Lys(Fmoc)−OH、Trt−HSG−OHを付加し、Alocを切断し、Fmoc−D−Tyr(But)−OH、Aloc−D−Lys(Fmoc)−OH、Trt−HSG−OHを付加し、Alocを切断し、Fmoc−D−Ala−OHを付加し、最後にFmocを切断して、所望のペプチドを作製した。次に、このペプチドを樹脂から切断し、HPLCで精製すると、IMP448が生成され、次に、これをITCベンジルNOTAに結合させた。このペプチドIMP448、0.0757g(7.5×10−5mol)を、0.0509g(9.09×10−5mol)のITCベンジルNOTAと混合し、1mLの水に溶かした。次に、撹拌したペプチド/NOTA溶液に、無水炭酸カリウム(0.2171g)をゆっくりと添加した。炭酸塩を全て添加した後、この反応溶液はpH10.6であった。この反応液を室温で一晩撹拌させておいた。14時間後、この反応液を1M HClで注意深くクエンチし、HPLCで精製すると、48mgのIMP449が得られた。
ペプチドIMP449(0.002g、1.37×10−6mol)を、686μL(2mMペプチド溶液)の0.1M NaOAc(pH4.02)に溶かした。2mM Alの酢酸緩衝液(pH4)溶液3μLを、1.3mCiの18F 15μLと混合した。次に、この溶液を2mM IMP449溶液20μLと混合し、105℃で15分間加熱した。逆相HPLC分析により、放射能の35%(tR約10分)がペプチドに付着し、放射能の65%がカラムのボイド容量(3.1分、図示せず)で溶出されることが示され、放射能の大部分がペプチドと結合しないことが示された。粗標識混合物(5μL)をヒトプール血清と混合し、37℃でインキュベートした。15分後にアリコートを取って、HPLCで分析した。このHPLCにより、放射能の9.8%が依然としてペプチドに付着している(35%から減少)ことが示された。1時間後に別のアリコートを取って、HPLCで分析した。このHPLCにより、放射能の7.6%が依然としてペプチドに付着している(35%から減少)ことが示されたが、これは15分での量と本質的に同じであった(データは示さない)。
精製IMP449を用いたさらなる研究により、18F標識ペプチドが、ヒト血清中、37℃で少なくとも1時間、極めて安定であり(91%、図示せず)、かつヒト血清中、37℃で少なくとも4時間、ある程度安定である(76%、図示せず)ことが示された。さらなる研究を行ない、その場合には、IMP449を安定化剤としてのアスコルビン酸の存在下で調製した。これらの研究(図示せず)では、金属−18F−ペプチド錯体は、37℃で4時間後、血清中での検出可能な分解を示さなかった。18F標識ペプチドを注射してから30分後のマウスの尿にはペプチドに結合した18Fが含まれることが分かった(図示せず)。これらの結果から、本明細書に開示された18F標識ペプチドが、18Fイメージング研究に使用されるインビボに近似した条件下で十分な安定性を示すことが示されている。
18F標識IMP449を以下のように調製した。約0.5mL中の18F、54.7mCiを0.1M NaOAc緩衝液(pH4)中の2mM Al 3μLと混合した。3分後、0.5M NaOAc緩衝液(pH4)中の0.05M IMP449 10μLを添加し、反応液を96℃の加熱ブロック中で15分間加熱した。この反応液の中身をシリンジで取り除いた。次に、C18カラムを用いるHPLCで粗標識ペプチドを精製した。流速は3mL/分であった。緩衝液Aは水中の0.1%TFAであり、緩衝液Bは、0.1%TFAを含む水中の90%アセトニトリルであった。勾配は、100%のAから75/25のA:Bへと15分かけて移行した。最初に溶出する標識ペプチドと未標識ペプチドとの間に保持時間(tR)の差が約1分あった。HPLC溶出物を0.5分(mL)ずつの画分で回収した。使用したカラムにもよるが、標識ペプチドは6〜9分のtRを有していた。目的の画分を水に2倍希釈し、その溶液を1cc Waters(登録商標)HLBカラム筒に入れることによって、HPLC精製したペプチド試料をさらに処理した。このカートリッジを3×1mLの水で溶出して、アセトニトリルとTFAを除去し、次いで400μLのEtOH/H20(1:1)で18F標識ペプチドを溶出した。精製された[Al18F]IMP449は、分析的HPLC C18カラムで単一のピークとして溶出した(図示せず)。
要約
前臨床試験および臨床試験により、膵癌の核イメージングや放射免疫療法への放射性標識mAb−PAM4の適用が示されている。本発明者らは、本明細書において、イメージングや治療を改善するための放射性標識ペプチドをプレターゲッティングするために、PAM4をベースとする新規の二重特異性モノクローナル抗体(mAb)構築物であるTF10の能力を検討した。TF10は、mAb−PAM4については二価、mAb−679については一価であり、ヒスタミン−スクシニル−グリシンハプテンに対して反応性があるヒト化二重特異性mAbである。放射性標識されたTF10および/またはTF10でプレターゲッティングされたハプテン−ペプチド(IMP−288)の生体分布研究および核イメージングを、CaPan1ヒト膵癌異種移植片を担持するヌードマウスで行なった。125I−TF10は血液から速やかにクリアランスされ、16時間までに、グラム当たりの注射用量(ID/g)の1%未満にまでレベルが低下した。腫瘍取込みは、この時点で3.47±0.66%ID/gであり、どの正常組織にも蓄積していなかった。プレターゲッティングアプローチの有用性を示すために、111In−IMP−288をTF10の16時間後に投与した。放射性標識ペプチドを投与してから3時間で、腫瘍内への強い取込みがイメージングで示され、正常組織への付着の形跡は見つからなかった(実施例16)。111In−ペプチドのみを投与した動物ではターゲッティングが見られなかった(実施例16)。TF10でプレターゲッティングされた111In−IMP−288の腫瘍取込みが24.3±1.7%ID/gであったのに対し、111In−IMP−288単独では、腫瘍取込みは、16時間でわずか0.12±0.002%ID/gであった。腫瘍/血液比は、111In−PAM4−IgG(24時間で約5:1;P<0.0003)と比較して、プレターゲッティング群(3時間で約1,000:1)では有意に大きかった。放射線量の推定から、TF10/90Y−ペプチドのプレターゲッティングによって、90Y−PAM4−IgGよりも大きい抗腫瘍効果がもたらされることが示唆された。したがって、これらの結果から、直接放射性標識したPAM4−IgGと比較して、TF10プレターゲッティングが、膵癌の早期検出、診断、および治療のためのイメージングの向上をもたらし得ることが裏付けられている(Goldら,CancerRes2008,68(12):4819−26)。
TF2およびTF10二重特異性DNL構築物とIMP288ターゲッティングペプチドとを上記のように調製した。ヨウ化ナトリウム(125I)および塩化インジウム(111In)はPERKIN−ELMER(登録商標)から入手した。TF10をヨードゲン法により125Iで通常通り標識し、サイズ排除スピンカラムの使用により精製した。DOTA−ペプチドおよびDOTA−PAM4−IgGの111InClでの放射性標識を以前に記載されているように行なった(Rossiら,Proc Natl Acad Sci USA 2006,103:6841−6;McBrideら,J Nucl Med 2006,47:1678−88)。サイズ排除高速液体クロマトグラフィーで放射性標識産物の精製を調べ、遊離の未結合同位体の量を即時TLCで測定した。
二重特異性mAb TF10のインビトロでの特徴解析。標的ムチン抗原に対するTF10の結合をELISAで解析した(図9)。これらの結果から、二価TF10、PAM4−IgG、およびPAM4−F(ab’)2についてのほとんど同一の結合曲線が示されたが(半最大結合は、それぞれ、1.42±0.10、1.31±0.12、および1.83±0.16nmol/Lと計算された;全てについてP>0.05)、一価bsPAM4化学的コンジュゲート(PAM4−Fab’×抗DTPA−Fab’)は有意により低い結合力を有し(半最大結合、30.61±2.05nmol/L;TF10と比較して、P=0.0379)、TF10が二価の様式で結合することが示唆された。ムチンに結合した125I−TF10の免疫反応性画分は87%であり、未結合のTF10が9%、遊離のヨウ素が3%であることが分かった(図示せず)。111In−IMP−288の90%はTF10に結合した(図示せず)。TF10に結合した全ての111In−IMP−288のうちで、過剰のムチン(200μg)を添加したときに、92%がより高い分子量で溶出し、わずか3%がムチン非反応性のTF10画分とともに溶出した。さらに5%の放射性標識ペプチドが、遊離ペプチド容量に溶出された。TF10の非存在下でムチン抗原に結合した放射性標識ペプチドはなかった(図示せず)。
解剖学的画像を提供する、超音波検査技術、コンピュータ断層撮影(CT)技術、および磁気共鳴イメージング(MRI)技術などの、現在の診断モダリティーは、代謝環境のPETイメージングとともに、膵臓腫瘤の検出において高い感度を提供することが当たり前のように分かっている。しかしながら、これらのデータは、大部分、既に臨床症状を呈している集団での>2cmの病変の検出に基づくものである。膵癌の進行のこの時点では、予後はかなり悲惨なものである。患者の転帰を改善するために、無症状の患者での小さな初期の膵臓新生物の検出が必要である。
要約
90Y−hPAM4 IgGは、現在、ステージIII/IV膵癌の患者におけるゲムシタビンと併用した第I/II相試験で検討中である。本発明者らは、同様の量の放射能を膵癌異種移植片に送達することができるが、血液毒性があまりない放射性核種をプレターゲッティングする新しいアプローチであって、ゲムシタビンとの併用により適しているものを開示している。約0.4cm3の皮下CaPan1ヒト膵癌を担持するヌードマウスに、組換えbsMAbであるTF10を投与し、1日後に、90Y−標識ハプテン−ペプチド(IMP−288)を投与した。様々な線量とスケジュールのゲムシタビンをこの治療に加えて、腫瘍進行を28週までモニタリングした。0.7mCi PT−RAIT単独により、血球数が一時的に60%失われたに過ぎず、0.9mCi PT−RAIT単独および0.7mCi PT−RAIT+6mgゲムシタビン(ヒト当量約1000mg/m2)を投与した動物では、9カ月後に腎毒性の組織学的証拠が見られなかった。単回用量の0.25または0.5mCi PT−RAIT単独で、それぞれ、腫瘍の20%および80%を完全に除去することができる。標準的なゲムシタビンレジメン(週1回6mg×3;1週休み;3回繰り返す)に加えられた月1回の分割PT−RAIT(各ゲムシタビンサイクルの開始時に0.25mCi/投与で投与)によって、腫瘍が3.0cm3に達するまでの時間中央値がPT−RAIT単独を上回って有意に増加した。PT−RAITに加えるゲムシタビンの細胞傷害性のない放射性増感用量レジメンを検討する他の治療計画もまた、PT−RAIT単独を上回って治療応答の有意な改善を示した。これらの結果は、PT−RAITが膵癌治療のための有望な新しいアプローチであることを示している。今回のデータは、PT−RAITとゲムシタビンを併用することによって治療応答が増強されることを示している。
TF10二重特異性抗体を上記のように調製した。プレターゲッティングのために、TF10を、ヒト膵腺癌細胞株CaPanを担持するヌードマウスに投与した。TF10が血液からクリアランスされるのに十分な時間(16h)を取った後、放射性標識された二価HSG−ペプチドを投与した。低分子量のHSG−ペプチド(約1.4kD)は、数分以内に血液からクリアランスされて、血管外スペースに入り、そこで、プレターゲッティングされたTF10 bsMAbの抗HSGアームに結合することができる。数時間以内に、放射性標識HSG−ペプチドの>80%が尿中に排出され、腫瘍にペプチドが局在したまま残り、正常組織中には微量しか残らない。
図12は、0.15mCiの90Y−hPAM4 IgG、またはTF10でプレターゲッティングした0.25もしくは0.50mCiの90Y−IMP−288による、樹立された(約0.4cm3)CaPan1腫瘍の単一治療から得られた治療活性を示している。同様の抗腫瘍活性が0.5mCiのプレターゲッティング線量と0.15mCi線量の直接放射性標識されたIgGでも見られたが、直接コンジュゲートのこのレベルで血液毒性が重篤であった(図示せず)のに対し、プレターゲッティング線量は中程度の毒性しかなかった(図示せず)。実際、90Y−IMP−288を用いるプレターゲッティングのMTDは、ヌードマウスにおいて少なくとも0.9mCiである。
本発明者らは、90Y−DOTA−ジ−HSGペプチド(IMP−288)とTF10による分割療法を評価した。皮下にCaPan1ヒト膵癌異種移植片0.32〜0.54cm3を担持するヌードマウスで、TF10と放射性標識IMP−288を用いた研究を行なった。治療のために、TF10でプレターゲッティングされる90Y−IMP−288を、[A]一度に(0週目に0.6mCi)または[B]分割して(0週目と1週目に0.3mCi)、[C]分割して(0週目と1週目と2週目に0.2mCi)、もしくは[D]分割して(0週目と1週目と4週目に0.2mCi)、投与した。
PCに極めて特異的なヒト化抗体である90Y−hPAM4は、進行性疾患を有する患者において一過性の活性を示し、GEMは、前臨床研究で、RAITを増強した。この研究では、未治療の、切除不能PCを有する患者における90Y−hPAM4+GEMの反復治療サイクルを評価した。進行するかまたは許容できない毒性が現れるまで、コホート単位で90Y線量を増量し、患者は4週サイクルを繰り返した(週1回、200mg/m2のGEM、90Y−hPAM4、週1回、2〜4週目)。応答評価には、CT、FDG−PET、およびCA19.9血清レベルを用いた。
PAM4抗体を用いて免疫組織化学研究を行なった。染色組織切片で得られた結果は、PAM4と正常な膵管、膵導管、および膵腺房組織の反応を示さなかった(図示せず)。対照的に、同じ組織試料に適用されるMA5抗体の使用により、正常な膵管および膵腺房組織のびまん性の陽性染色が示された(図示せず)。高分化または中分化膵腺癌を有する組織切片では、PAM4染色が陽性であり、大半は細胞質の染色であったが、細胞表面での増強が見られた。同じ組織切片中の正常膵組織は染色されなかった。
特定の実施形態では、PEG化形態の抗体または免疫コンジュゲートを含む構築物を調製することが好ましい場合がある。このようなPEG化構築物はDNL技術によって調製し得る。
IMP350:CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SS−tbu)−NH2(配列番号41)
AD2の配列を組み入れたIMP350を、ペプチド合成機でFmoc法を用いて、Sieber Amide樹脂を用いて0.1mmolスケールで作製した。C末端から順に、使用された保護アミノ酸は、Fmoc−Cys(t−Buthio)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Asp(OBut)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Tyr(But)−OH、Fmoc−Glu(OBut)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Gly−OH、およびFmoc−Cys(Trt)−OHであった。ペプチドを樹脂から切断し、逆相(RP)−HPLCで精製した。
IMP350(0.0104g)を、7mLの1M Tris緩衝液(pH7.81)中で、0.1022gのmPEG−OPTE(20kDa、NEKTAR Therapeutics)と混合した。次に、アセトニトリル(1mL)を添加して、懸濁された材料をいくぶん溶解した。この反応液を室温で3時間撹拌し、次に、0.0549gのシステインとともに0.0527gのTCEPを添加した。この反応混合物を1.5時間撹拌し、次に、水中の20%エタノールで平衡化したPD−10脱塩カラムで精製した。この試料を溶出させ、凍結させ、凍結乾燥させて、0.0924gの粗PEG20−IMP350(MALDIでMH+ 23508)を得た。
IMP360:CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SS−tbu)G−EDANS(配列番号42)MH+ 2660
AD2配列を組み入れたIMP360を、ペプチド合成機でFmoc法を用いて、Fmoc−Gly−EDANS樹脂を用いて0.1mmolスケールで合成した。0.23gのFmoc−Gly−OH、0.29gのHATU、26μLのDIEA、7.5mLのDMF、および0.57gのEDANS樹脂(NOVABIOCHEM(登録商標))を用いて、Fmoc−Gly−OHを樹脂に手作業で添加した。これらの試薬を混合し、樹脂に添加した。反応液を室温で2.5時間混合し、樹脂をDMFおよびIPAで洗浄して、余分な試薬を除去した。C末端から順に、使用された保護アミノ酸は、Fmoc−Cys(t−Buthio)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Asp(OBut)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Tyr(But)−OH、Fmoc−Glu(OBut)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Gly−OH、およびFmoc−Cys(Trt)−OHであった。ペプチドを樹脂から切断し、RP−HPLCで精製した。
IMP413の合成のために、IMP360(0.0103g)を、7mLの1M tris緩衝液(pH7.81)中で0.1601gのmPEG−OPTE(30kDa、NEKTAR(登録商標)Therapeutics)と混合した。次に、アセトニトリル(1mL)を添加して、懸濁された材料をいくぶん溶解した。この反応液を室温で4.5時間撹拌し、次に、0.0473gのシステインとともに0.0423gのTCEPを添加した。この反応混合物を2時間撹拌した後、2日間透析した。透析した材料を凍結させ、凍結乾燥させて、0.1552gの粗IMP413(MH+ 34499)を得た。
IMP421 Ac−C−PEG3−C(S−tBu)GQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(S−tBU)G−NH2(配列番号43)
以下のアミノ酸を以下に示す順序で樹脂に添加することによって、ペプチドIMP421(MH+ 2891)をNOVASYN(登録商標)TGR樹脂(487.6mg、0.112mmol)上に作製した:Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Cys(t−Buthio)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Asn(Trt)−OH、Fmoc−Asp(OBut)−OH、Fmoc−Val−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Lys(Boc)−OH、Fmoc−Ala−OH、Fmoc−Leu−OH、Fmoc−Tyr(But)−OH、Fmoc−Glu(OBut)−OH、Fmoc−Ile−OH、Fmoc−Gln(Trt)−OH、Fmoc−Gly−OH、Fmoc−Cys(t−Buthio)−OH、Fmoc−NH−PEG3−COOH、Fmoc−Cys(Trt)−OH。N末端アミノ酸はアセチル誘導体として保護された。次に、ペプチドを樹脂から切断し、RP−HPLCで精製して、32.7mgの白色固体を生じた。
AD2の配列を組み入れたIMP421(配列番号43)を、標準的な化学的手段で合成した。15.2mg(5.26μmol)のIMP421(F.W.2890.50)と274.5mg(6.86μmol)のmPEG2−MAL−40Kのアセトニトリル溶液1mLに、1M Tris(pH7.8) 7mLを添加し、室温で3時間反応させておいた。余分なmPEG2−MAL−40Kを49.4mgのL−システインでクエンチした後、59.1mgのTCEPを用いて1時間かけてS−S−tBu脱保護を行なった。この反応混合物を、2つの3〜12mLの限度容量の10K SLIDE−A−LYZER透析カセット(各カセットに4ml)を用いて、5Lの5mM酢酸アンモニウム(pH5.0)中に2〜8℃で一晩透析した。次の日、5mM酢酸アンモニウム(pH5.0)の5Lの緩衝液交換をさらに3回行ない、各透析を少なくとも2.5時間続けた。精製産物(19.4mL)を2つの20mLシンチレーションバイアルに移し、凍結し、凍結乾燥して、246.7mgの白色固体が得られた。MALDI−TOFにより、mPEG2−MAL−40K 42,982およびIMP−457 45,500という結果が得られた。
20kDa PEGに結合した2コピーのhPAM4 Fabを有するDNL構造物を調製する。還元および凍結乾燥したIMP362を、250mM イミダゾール、0.02% Tween 20、150mM NaCl、1mM EDTA、50mM NaH2PO4、pH7.5中のhPAM4 Fab−DDD2に10倍モル過剰で添加することにより、DNL反応を行なう。室温暗所で6時間後、反応混合物を、暗所4℃で、CMローディング緩衝液(150mM NaCl、20mM NaAc、pH4.5)に対して透析する。この溶液を、CMローディング緩衝液で予め平衡化した1mL Hi−Trap CM−FFカラム(AMERSHAM(登録商標))に充填する。試料を充填した後、カラムをCMローディング緩衝液でベースラインまで洗浄し、続いて、15mLの0.25M NaCl、20mM NaAc、pH4.5で洗浄する。PEG化hPAM4を12.5mLの0.5M NaCl、20mM NaAc、pH4.5で溶出させる。
IFN−α2bのcDNA配列をPCRで増幅し、以下の特徴、すなわち、XbaI−−−シグナルペプチド−−−IFNα2b−−−6 His−−−BamHI(6 Hisは配列番号59として開示されている)を含む配列(配列中、XbaIおよびBamHIは制限部位であり、シグナルペプチドはIFN−α2b由来のものであり、6 Hisはヘキサヒスチジンタグ(配列番号59)である)が得られた。結果として生じる分泌タンパク質は、そのC末端で配列番号44からなるポリペプチドに融合したIFN−α2bからなる。
KSHHHHHHGSGGGGSGGGCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号44)
IFNA2 XbaI 左
5'−TCTAGACACAGGACCTCATCATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGG−3'(配列番号45)
IFNA2 BamHI 右
5'−GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGC−3'(配列番号46)
C−H−AD2−IgG−pdHL2発現ベクターの作製
pdHL2哺乳動物発現ベクターは、多くの組換えIgGの発現を仲介するために使用されている。任意のIgG−pdHL2ベクターをC−H−AD2−IgG−pdHL2ベクターに変換しやすくするために、プラスミドシャトルベクターを産生した。Fc(CH2ドメインおよびCH3ドメイン)の遺伝子を、pdHL2ベクターを鋳型とし、オリゴヌクレオチドFc BglII左およびFc Bam−EcoRI右をプライマーとして用いて増幅した。
Fc BglII 左
5'−AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG−3'(配列番号47)
Fc Bam−EcoRI 右
5'−GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG−3'(配列番号48)
任意のIgG−pdHL2発現ベクターをC−H−AD2−IgG−pdHL2発現ベクターに変換するために、861bpのBsrGI/NdeI制限断片を前者から切り出し、Fc−AD2−pdHL2ベクターから切り出される952bpのBsrGI/NdeI制限断片と置き換える。BsrGIはCH3ドメイン中で切断し、NdeIは発現カセットの下流(3’)で切断する。この方法を用いて、hPAM4 IgG−AD2タンパク質を作製する。
還元および凍結乾燥したhPAM4 IgG−AD2を、250mM イミダゾール、0.02% Tween 20、150mM NaCl、1mM EDTA、50mM NaH2PO4、pH7.5中のIFN−α2b−DDD2に添加することにより、DNL反応を行なう。室温暗所で6時間後、反応混合物を、暗所4℃で、CMローディング緩衝液(150mM NaCl、20mM NaAc、pH4.5)に対して透析する。この溶液を、CMローディング緩衝液で予め平衡化した1mL Hi−Trap CM−FFカラム(AMERSHAM(登録商標))に充填する。試料を充填した後、カラムをCMローディング緩衝液でベースラインまで洗浄し、続いて、15mLの0.25M NaCl、20mM NaAc、pH4.5で洗浄する。産物を12.5mLの0.5M NaCl、20mM NaAc、pH4.5で溶出させる。このDNL反応によって、hPAM4 IgGとIFN−α2b二量体の部位特異的でかつ共有結合的なコンジュゲーションが生じる。IgG部分とIFN−α2b部分は両方とも、DNL構築物中でそれらのそれぞれの生理活性を保持している。膵癌またはPAM4抗原を発現する他の癌への標的送達のために、この技術を用いて、任意のサイトカインまたは他の生理活性タンパク質もしくはペプチドをhPAM4に付加し得る。
特定の好ましい実施形態では、DNL複合体に組み込まれたAD配列とDDD配列は、上記のように、AD2(配列番号36)とDDD2(配列番号34)のアミノ酸配列を含む。しかしながら、代わりの実施形態では、AD部分および/またはDDD部分の配列変異体をサイトカイン−MAb DNL複合体の構築で利用してもよい。ADドメインとDDDドメインの構造−機能関係は研究の主題となっている(例えば、Burns−Hamuroら,2005,Protein Sci 14:2982−92;Carrら,2001,J Biol Chem 276:17332−38;Altoら,2003,Proc Natl Acad Sci USA 100:4445−50;Hundsruckerら,2006,Biochem J 396:297−306;Stokkaら,2006,Biochem J 400:493−99;Goldら,2006,Mol Cell 24:383−95;Kindermanら,2006,Mol Cell 24:397−408を参照されたい)。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号33)
Altoら(2003)は、様々なAKAPタンパク質のAD配列のバイオインフォマティック解析を行ない、DDDに対する0.4nMという結合定数を有する、AKAP−IS(配列番号35)と呼ばれるRII選択的AD配列を設計した。AKAP−IS配列は、PKAに対するAKAP結合のペプチド拮抗薬として設計された。置換するとDDDに対する結合が低下する傾向にあるAKAP−IS配列中の残基に、以下の配列番号35中で下線を付す。
QIEYLAKQIVDNAIQQA(配列番号35)
同様に、Gold(2006)は、結晶学とペプチドスクリーニングを利用して、RIアイソフォームと比較してPKAのRIIアイソフォームの場合に5桁高い選択性を示す、スーパーAKAP−IS配列(配列番号49)を開発した。下線が付された残基は、RIIαのDDD部分に対する結合を増大させる、AKAP−IS配列と比べた、アミノ酸置換の位置を指す。この配列において、N末端のQ残基は残基番号4と付番され、C末端のA残基は残基番号20と付番されている。RIIαに対する親和性に影響を与えるために置換することができる残基は、残基8、11、15、16、18、19、および20であった(Goldら,2006)。特定の代わりの実施形態では、サイトカイン−MAb DNL構築物を調製するために、スーパーAKAP−IS配列をAKAP−IS AD部分配列と置き換え得ることが企図される。AKAP−IS AD配列と置き換え得る他の代わりの配列を配列番号50〜52に示す。AKAP−IS配列と比べた置換に下線を付す。配列番号49に示すAKAP−IS配列に関して、AD部分は、追加のN末端残基システインおよびグリシンならびにC末端残基グリシンおよびシステインも含み得ることが予想される。
スーパーAKAP−IS
QIEYVAKQIVDYAIHQA(配列番号49)
代わりのAKAP配列
QIEYKAKQIVDHAIHQA(配列番号50)
QIEYHAKQIVDHAIHQA(配列番号51)
QIEYVAKQIVDHAIHQA(配列番号52)
Ht31
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(配列番号53)
RIAD
LEQYANQLADQIIKEATE(配列番号54)
PV−38
FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(配列番号55)
AKAP−IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(配列番号35)
AKAP7δ−wt−pep
PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY(配列番号56)
AKAP7δ−L304T−pep
PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY(配列番号57)
AKAP7δ−L308D−pep
PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY(配列番号58)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号33)
特定の実施形態では、血液、血漿、または血清試料などの、非侵襲的な技術によって得ることができる試料のインビトロ解析により、対象のPAM4抗原の存在を検出することおよび/または対象の膵癌の存在を診断することが好ましい。このようなエクスビボ解析は、例えば、ある個人が特定の場所に膵腫瘍を有すると考えるアプリオリな理由がないスクリーニング法において好ましいものであり得る。
試薬−無胸腺ヌードマウスの異種移植片として増殖したヒト膵癌である、CaPan1からヒト膵臓ムチン調製物を単離した。簡潔に述べると、組織1gを0.5M塩化ナトリウムを含む0.1M重炭酸アンモニウム10mL中でホモジナイズした。次に、試料を遠心分離して上清を得、これをSEPHAROSE(登録商標)−4B−CLカラムで分画し、ボイド容量物質をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかけた。非吸着画分を脱イオン水に対して大規模に透析した後、凍結乾燥させた。1mg/mL溶液を、0.15M塩化ナトリウムを含む0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)(リン酸緩衝化生理食塩水[PBS])中に調製し、免疫アッセイ標準のストック溶液として用いた。ポリクローナル抗ムチン抗血清を、以前に記載されたように、ウサギの免疫化により調製した(Goldら,Cancer Res 43:235−38,1983)。IgG画分を精製し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)と分子ふるい高速液体クロマトグラフィーとで純度について評価した。CA19−9の定量用のキットは、PANOMICS(登録商標)Inc(Redwood City,CA)から購入した。
PAM4ベースの免疫アッセイの開発および特徴解析−本発明者らは、異種移植したCaPan1ヒト膵腫瘍から精製したムチンの初期参照標準に基づく任意ユニット/mLで結果を報告することを選んだ。免疫アッセイの検出下限は1.0ユニット/mLであり、100ユニット/mLを上回るムチン濃度で飽和が生じた。線形範囲は、抗原1.5ユニット/mL〜25ユニット/mLであると決定された(図示せず)。アッセイ(n=5)間の変動係数(CV)を、20ユニット/mL(CV=8.0%)と8ユニット/mL(CV=3.8%)の参照標準について算出した。平均回収は、20ユニット/mL標準と8ユニット/mL標準について、それぞれ17.5±2.8と7.1±1.9であった。
異種移植されたRIP1 ヒト膵癌の腫瘍をヌードマウスで増殖させ、摘出する。ヒト膵癌ムチンをGoldら(Int J Cancer 1994,15:204−10)に従って抽出し、標準的なプロトコル(Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,第5章,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY.)に従ってマウスを免疫化するのに用いる。抗体産生ハイブリドーマ細胞を免疫化マウスから調製し、ヒト膵癌ムチン抽出物に対する結合についてスクリーニングする。陽性クローンを拡大し、モノクローナル抗体を、実施例1に記載したような競合的結合アッセイを用いて、cPAM4に対する交差遮断活性について試験する。cPAM4に対する交差遮断抗体をヒト膵癌ムチンに対する結合の競合によって同定する。
Claims (55)
- 膵癌細胞に結合し、正常膵組織または膵炎または良性膵組織に結合しない少なくとも1つの抗膵癌抗体またはその抗原結合断片を含む抗体構築物。
- 前記抗膵癌抗体が、PanIN−1A、PanIN−1B、PanIN−2、浸潤性膵腺癌、膵癌、粘液性嚢胞腫瘍(MCN)、膵管内粘液性腫瘍(IPMN)、および膵管内乳頭粘液性腫瘍に結合する、請求項1に記載の抗体構築物。
- 前記構築物が、1コピーの679抗体断片部分に結合した2コピーのPAM4抗体断片部分を含む三量体DNL(ドック・ロック)構築物である、請求項1に記載の抗体構築物。
- 各々のPAM4抗体断片部分が、DDD2(配列番号34)配列に結合したPAM4 Fab断片を含み、前記679抗体断片部分が、AD2(配列番号36)配列に結合した679 Fab断片を含み、前記DDD2配列の二量体が前記AD2配列に結合して、三量体構築物を形成する、請求項3に記載の抗体構築物。
- 前記PAM4抗体断片がhPAM4 Fab断片であり、前記679抗体断片がh679 Fab断片である、請求項4に記載の抗体構築物。
- 前記PAM4抗体断片部分が、軽鎖可変領域CDR配列のCDR1(SASSSVSSSYLY、配列番号1)、CDR2(STSNLAS、配列番号2)、およびCDR3(HQWNRYPYT、配列番号3)、ならびに重鎖可変領域CDR配列のCDR1(SYVLH、配列番号4)、CDR2(YINPYNDGTQYNEKFKG、配列番号5)、およびCDR3(GFGGSYGFAY、配列番号6)を含む、請求項3に記載の抗体構築物。
- 前記PAM4抗体断片部分が、マウス抗体PAM4断片、キメラ抗体PAM4断片、ヒト化抗体PAM4断片、またはヒト抗体PAM4断片を含む、請求項3に記載の抗体構築物。
- 前記抗膵癌抗体またはその断片がPAM4抗原に結合する、請求項1に記載の抗体構築物。
- 前記抗膵癌抗体またはその断片が、キメラPAM4(cPAM4)抗体とヒト膵癌ムチンに対する結合を競合し、前記cPAM4抗体が、軽鎖可変領域CDR配列のCDR1(SASSSVSSSYLY、配列番号1)、CDR2(STSNLAS、配列番号2)、およびCDR3(HQWNRYPYT、配列番号3)、ならびに重鎖可変領域CDR配列のCDR1(SYVLH、配列番号4)、CDR2(YINPYNDGTQYNEKFKG、配列番号5)、およびCDR3(GFGGSYGFAY、配列番号6)を含む、請求項1に記載の抗体構築物。
- 前記抗膵癌抗体またはその断片が、アミノ酸配列WTWNITKAYPLP(配列番号29)を含む線状ペプチドまたはアミノ酸配列ACPEWWGTTC(配列番号30)を含む環状ペプチドに結合する、請求項1に記載の抗体構築物。
- 膵癌を有する個体に、膵癌細胞に結合し、正常膵組織または膵炎または良性膵組織に結合しない少なくとも1つの抗膵癌抗体またはその抗原結合断片を含む抗体構築物を投与することを含む、膵癌を治療する方法。
- 前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、80%以上のヒトの浸潤性膵腺癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍、PanIN−1A、PanIN−1B、およびPanIN−2に結合する、請求項11に記載の方法。
- 前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、PanIN−1A、PanIN−1B、およびPanIN−2に結合するが、膵炎には結合しない、請求項11に記載の方法。
- 前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が裸の抗体またはその断片である、請求項11に記載の方法。
- 少なくとも1つの治療剤を個体に投与することをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が少なくとも1つの治療剤にコンジュゲートされている、請求項11に記載の方法。
- 前記治療剤が、放射性核種、免疫調節物質、ホルモン、ホルモン拮抗薬、酵素、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、酵素阻害剤、光活性治療剤、細胞毒性薬、薬物、毒素、血管新生阻害剤、およびアポトーシス促進剤からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記薬物が、窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素、ゲムシタビン、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、COX−2阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素阻害剤、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモン拮抗薬、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、SN−38、ドキソルビシンとその類似体、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗有糸分裂剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、mTOR阻害剤、熱ショックタンパク質(HSP90)阻害剤、プロテオソーム阻害剤、HDAC阻害剤、アポトーシス促進剤、メトトレキセート、およびCPT−11からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記毒素が、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ(RNアーゼ)、DNアーゼI、ブドウ球菌腸毒素−A、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記免疫調節物質が、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子(CSF)、インターロイキン(IL)、インターフェロン(IFN)、幹細胞増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、腫瘍壊死因子(TNF)、顆粒球−コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子(GM−CSF)、インターフェロン−α、インターフェロン−β 、インターフェロン−γ 、および「S1因子」と表される幹細胞増殖因子からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記サイトカインが、ヒト増殖ホルモン、N−メチオニルヒト増殖ホルモン、ウシ増殖ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、糖タンパク質濾胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、黄体形成ホルモン(LH)、胎盤増殖因子(PlGF)、肝増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、OBタンパク質、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β 、ミューラー管阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン(TPO)、NGF−β 、血小板増殖因子、TGF−α、TGF−β 、インスリン様増殖因子−I、インスリン様増殖因子−II、エリスロポエチン(EPO)、骨誘導因子、インターフェロン−α、インターフェロン−β 、インターフェロン−γ 、マクロファージ−CSF(M−CSF)、IL−1、IL−1α、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−21、IL−25、LIF、FLT−3、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、TNF−α、およびLTからなる群から選択される、請求項20に記載の方法。
- 前記放射性核種が、111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、152Dy、166Dy、161Ho、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、211Pb、58Co、80mBr、99mTc、103mRh、109Pt、119Sb、189mOs、192Ir、219Rn、215Po、221Fr、217At、255Fm、11C、13N、15O、75Br、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、143Pr、57Co、51Cr、75Se、201Tl、76Br、および169Ybからなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記抗膵癌抗体または抗原結合断片にコンジュゲートしていない第2の治療剤を個体に投与することをさらに含む、請求項16に記載の方法。
- 前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が放射性核種にコンジュゲートされており、前記第2の治療剤が、前記抗膵癌抗体または断片が投与される前に個体に投与される放射線増感剤である、請求項23に記載の方法。
- 前記抗体構築物が、少なくとも1つのPAM4抗体またはその抗原結合断片と、ターゲッティング可能な構築物上のハプテンに結合する少なくとも1つの抗体または断片とを含む二重特異性または多重特異性抗体であり、少なくとも1つの治療剤に結合したターゲッティング可能な構築物を投与することをさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 前記抗体構築物が、1コピーの679抗体断片部分に結合した2コピーのPAM4抗体断片部分を含む三量体DNL(ドック・ロック)構築物であり、前記ターゲッティング可能な構築物が少なくとも1つのHSGハプテンを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記抗体構築物が、腫瘍関連抗原(TAA)に結合する第2の抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記第2の抗体が、CA19.9、DUPAN2、SPAN1、Nd2、B72.3、CC49、抗Lea抗体、Le(y)などの他のルイス抗原に結合する抗体、癌胎児性抗原(CEA)、CEACAM6、結腸特異的抗原p(CSAp)、MUC−1、MUC−2、MUC−3、MUC−4、MUC−5ac、MUC−16、MUC−17、HLA−DR、CD40、CD74、CD−80、CD138、HER2/neu、EGFR、EGP−1、EGP−2、血管新生因子、VEGF、PlGF、インスリン様増殖因子(ILGF)、炭酸アンヒドラーゼIX、テネイシン、血小板由来増殖因子、IL−6、オンコジーン産物、bcl−2、Kras、p53、HER2/neu、cMETに対する抗体、および腫瘍壊死物質に対する抗体からなる群から選択される、請求項27に記載の方法。
- 膵癌を検出または診断する方法であって、
a)膵癌細胞に結合し、正常膵組織または膵炎または良性膵組織に結合しない少なくとも1つの抗膵癌抗体またはその抗原結合断片を含む抗体構築物を個体に投与すること、および
b)膵癌細胞に結合した前記抗体構築物を検出すること、を含む方法。 - 前記抗膵癌抗体が、PanIN−1A、PanIN−1B、PanIN−2、浸潤性膵腺癌、膵癌、粘液性嚢胞腫瘍(MCN)、膵管内粘液性腫瘍(IPMN)、および膵管内乳頭粘液性腫瘍に結合する、請求項29に記載の方法。
- 前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、80%以上のヒトの浸潤性膵腺癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍、PanIN−1A、PanIN−1B、およびPanIN−2に結合する、請求項29に記載の方法。
- 前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、PanIN−1A、PanIN−1B、およびPanIN−2に結合するが、膵炎には結合しない、請求項29に記載の方法。
- 前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、少なくとも1つの診断剤にコンジュゲートされている、請求項29に記載の方法。
- 前記診断剤が、放射性核種、造影剤、蛍光剤、化学発光剤、生物発光剤、常磁性イオン、酵素、および光活性診断剤からなる群から選択される、請求項33に記載の方法。
- 前記診断剤が、110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154−158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、またはその他のガンマ線放射体、ベータ線放射体、もしくは陽電子放射体からなる群から選択される放射性核種である、請求項34に記載の方法。
- 前記放射性核種が18Fであり、PETイメージングをさらに含む、請求項35に記載の方法。
- 前記常磁性イオンが、クロム(III)、マンガン(II)、鉄(III)、鉄(II)、コバルト(II)、ニッケル(II)、銅(II)、ネオジム(III)、サマリウム(III)、イッテルビウム(III)、ガドリニウム(III)、バナジウム(II)、テルビウム(III)、ジスプロシウム(III)、ホルミウム(III)、およびエルビウム(III)からなる群から選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記診断剤が、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルデヒド、およびフルオレスカミンからなる群から選択される蛍光標識化合物、またはルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジンエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルからなる群から選択される化学発光標識化合物、またはルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンからなる群から選択される生物発光化合物である、請求項34に記載の方法。
- 前記方法が、術中処置、内視鏡的処置、または血管内処置で使用される、請求項29に記載の方法。
- 前記抗体構築物が、1コピーの679抗体断片部分に結合した2コピーのPAM4抗体断片部分を含む三量体DNL(ドック・ロック)構築物であり、少なくとも1つのHSGハプテンを含むターゲッティング可能な構築物を個体に投与することをさらに含み、前記ターゲッティング可能な構築物が少なくとも1つの診断剤にコンジュゲートされている、請求項29に記載の方法。
- 前記診断剤が18Fであり、PETイメージングをさらに含む、請求項40に記載の方法。
- 膵癌を診断する方法であって、
a)前記抗体が、少なくとも1つの診断剤で標識されているか、または前記抗体が少なくとも1つの診断剤で標識されたターゲッティング可能な構築物に結合する二重特異性抗体の一部である、請求項1に記載の抗体を得ること;
b)膵癌細胞を含むことが疑われる試料に前記抗体を曝露させること;および
c)試料への抗体の結合が膵癌の存在を示す、試料中の膵癌細胞に結合した抗体の存在を検出すること、を含む方法。 - 前記試料への抗体の結合が、前記試料中の膵癌の存在を正常なまたは良性の膵組織と区別する、請求項42に記載の方法。
- 前記試料への抗体の結合が、前記試料中の膵癌の存在を膵炎と区別する、請求項42に記載の方法。
- 前記試料への抗体の結合が、前記試料中の初期膵癌の存在の診断となる、請求項42に記載の方法。
- 前記抗体がインビボまたはインビトロで前記試料に曝露される、請求項42に記載の方法。
- 前記試料が血清試料であり、前記試料を前記抗体に曝露する前に、前記血清試料に対して有機相抽出を行なうことをさらに含む、請求項42に記載の方法。
- 前記有機相がブタノールである、請求項47に記載の方法。
- 第1の融合タンパク質および第2の融合タンパク質を含むDNL構築物であって、前記第1の融合タンパク質が、DDDペプチドまたはADペプチドに結合したhPAM4抗体またはその抗原結合断片を含み、前記第2の融合タンパク質が、前記第1の融合タンパク質がDDDペプチドを含む場合にADペプチドを含む、または前記第1の融合タンパク質がADペプチドを含む場合にDDDペプチドを含む、DNL構築物。
- 前記DDDペプチドがDDD2ペプチド(配列番号34)であり、前記ADペプチドがAD2ペプチド(配列番号36)である、請求項49に記載のDNL構築物。
- 前記第2の融合タンパク質がポリエチレングリコール(PEG)部分にコンジュゲートされている、請求項49に記載のDNL構築物。
- 前記第2の融合タンパク質がサイトカイン部分を含む、請求項49に記載のDNL構築物。
- 前記サイトカイン部分がインターフェロン−α2bである、請求項52に記載のDNL構築物。
- 前記第2の融合タンパク質がh679抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項49に記載のDNL構築物。
- 膵癌の治療、検出、または診断用の医薬品を製造するための請求項49に記載のDNL構築物の使用。
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