JP5919604B2 - 抗膵癌抗体 - Google Patents

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Description

本出願は、２００８年１２月２４日に出願された米国特許出願第１２／３４３，６５５号および２００９年４月６日に出願された米国特許出願第１２／４１８，８７７号ならびに２００８年８月８日に出願された米国仮特許出願第６１／０８７，４６３号および２００９年１月１３日に出願された第６１／１４４，２２７号に対する優先権を主張する。上に引用した各々の優先権出願の文書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金援助を受けた研究または開発に関する声明
本研究は、ＮＩＨ助成金ＲＯ１−ＣＡ５４４２５による支援を一部受けた。米国政府は、本発明における一定の権利を有し得る。
本発明は、膵癌細胞には高選択性でかつ高頻度に結合し、他の癌細胞にはより少ない程度に結合し、正常膵臓細胞または膵炎にはそれほど結合しないマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体、ならびにそれらの断片に関する。好ましい実施形態では、抗体または断片は、ＰＡＭ４抗体または断片である。本抗体は、癌、特に膵癌の検出、診断、および治療に有用である。特定の実施形態では、本抗体は、最も初期の段階の膵癌の検出および／または診断に有用である。
膵癌は、主に膵管細胞内で生じる膵臓の悪性増殖物である。この疾患は９番目に多い癌形態であるが、男性と女性の癌による死因の、それぞれ、第４位と第５位である。膵臓の癌は、ほとんどの場合、致死的であり、５年生存率は３％未満である。
膵癌の最も一般的な症状としては、黄疸、腹痛、および体重減少が挙げられるが、これらは、その他に現れている要素とともに、非特異的な性質である。したがって、腫瘍増殖の初期の段階で膵癌を診断するのは困難であることが多く、しばしば試験開腹を含む、広範囲に及ぶ診断的精密検査を必要とする。超音波内視鏡検査とコンピュータ断層撮影は、膵癌の診断に現在利用可能な最良の非侵襲的手段である。しかしながら、信頼性のある小腫瘍の検出、および膵癌と限局性膵炎の識別は困難である。現在、膵癌患者の大部分は、腫瘍が既に嚢の外側に拡大して周囲臓器に浸潤してしまったおよび／または広範囲に転移してしまった後期に診断される。Ｇｏｌｄら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，３９：１４７−５４（２００１）。本疾患の後期検出は一般的であり、早期の膵癌診断は、臨床の場では稀である。
膵癌に利用可能な現在の治療法では、治癒することもないし、生存期間が大幅に向上することもない。外科的切除が、生存のチャンスを提供する唯一の方法である。しかしながら、腫瘍負荷が大きいために、１０％〜２５％の患者しか「治癒的切除術」の候補とならない。外科治療を受ける患者について、５年生存率は今なお悪く、平均すると約１０％でしかない。
膵癌の早期検出と診断、および疾患の適切な病期診断は延命効果の増大をもたらす。多くの研究室が、血流中への腫瘍関連マーカーの放出および生検標本中でのマーカー物質の検出に基づく診断法の開発を進めている。膵癌の最良の腫瘍関連マーカーは、ＣＡ１９．９の免疫アッセイである。このシアリル化されたＬｅａエピトープ構造のレベルの上昇は、膵癌患者の７０％に見られたが、検査されたどの限局性膵炎標本にも見られなかった。しかしながら、ＣＡ１９．９レベルは、いくつかの他の悪性疾患および良性疾患でも上昇することが分かっており、そのため、現在、このアッセイを診断に使用することはできない。しかしながら、手術後の持続的なＣＡ１９．９血清レベルの上昇が予後不良を示すので、このアッセイはモニタリングに有用である。多くの他のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が、様々な開発段階の診断用免疫アッセイとともに報告されている。これらには、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｂ７２．３、Ｉａ３、および様々な抗ＣＥＡ（癌胎児性抗原、またはＣＥＡＣＡＭ５）抗体が含まれるが、これらに限定されない。
抗体、特にＭＡｂおよび人工抗体または抗体断片が幅広く試験され、癌、自己免疫疾患、感染性疾患、炎症性疾患、および心臓血管疾患をはじめとする、様々なヒト障害の検出および治療に有用であることが示されている［ＦｉｌｐｕｌａおよびＭｃＧｕｉｒｅ，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ（１９９９）９：２３１−２４５］。抗体または抗体由来薬剤の臨床的有用性は、主に、特定の障害と関連する特異的な標的抗原へのその結合能によって決まる。選択性は、特に、診断剤または治療剤が体内の正常組織にとって毒性がある場合に、ヒト障害の検出および治療段階において、薬物、毒素、サイトカイン、ホルモン、ホルモン拮抗薬、酵素、酵素阻害剤、オリゴヌクレオチド、増殖因子、放射性核種、血管新生阻害剤、または金属などの診断剤または治療剤を標的部位に送達するのに有用である。放射性標識抗体は、卵巣癌、結腸癌、甲状腺髄様癌、およびリンパ腫をはじめとする、多くの悪性腫瘍において、ある程度の成功をもって用いられている。この技術は、膵癌に有用であることが分かる可能性もある。しかしながら、膵癌抗原に対するこれまでに報告された抗体を、膵癌の効果的な治療あるいは膵癌の早期検出および／または診断に利用するのに今日まで成功していない。
標的部位への薬剤の送達のために提案される１つのアプローチはダイレクト・ターゲッティングと呼ばれており、これは、診断剤または治療剤を含む抗体を用いて特異的抗原をターゲッティングするように設計された技術である。腫瘍との関連において、このダイレクト・ターゲッティングアプローチでは、その抗原によって標的腫瘍を認識する標識した抗腫瘍単一特異性抗体を用いる。この技術は、標識した単一特異性抗体を患者に注入し、この抗体を標的腫瘍に局在させ、診断または治療上の効用を得ることを含む。結合していない抗体は体内からクリアランスされる。
別の提案されている解決法は、「親和性増強系（ＡＥＳ）」と呼ばれており、これは、診断剤または治療剤を含む抗体による直接的な腫瘍ターゲッティングの欠陥を克服するように設計された技術である［米国特許第５，２５６，３９５号（１９９３）、Ｂａｒｂｅｔら，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ １４：１５３−１６６（１９９９）］。ＡＥＳでは、標識した二価ハプテン、および標的腫瘍と標識ハプテンの両方を認識する抗腫瘍／抗ハプテン二重特異性抗体を用いる。この方法ではまた、価数のより高いハプテンと特異性のより高い抗体を用いてもよい。この技術では、抗体を患者に注入し、それを標的腫瘍に局在させることを含む。結合していない抗体が血流からクリアランスされるのに十分な時間の後、標識ハプテンを投与する。ハプテンが標的細胞の部位に局在する抗体−抗原複合体に結合して、診断上または治療上の効用が得られると同時に、結合していないハプテンは身体から速やかにクリアランスされる。Ｂａｒｂｅｔは、二重特異性抗体が腫瘍表面に結合しているときに、二価ハプテンが二重特異性抗体と架橋し得るという可能性に言及している。結果として、標識複合体はより安定となり、より長い時間、腫瘍に留まる。
正常な膵組織やその他の正常組織と比較して、膵癌やその他の種類の癌に対する高い選択性を示す抗体が、依然として当該技術分野で必要とされている。特に、好ましくは疾患の最も初期の膵癌の有用な診断および／または治療手段として働き、かつ標的抗原での取込みの増大と健康個体の血中成分への結合の低下を示し、それによって、有毒な治療剤がそのような抗体にコンジュゲートされている場合に、正常な組織や細胞の、有毒な治療剤からの最適な保護も示す、抗体が依然として必要とされている。体液、特に血液中の膵癌関連抗原を検出するためのこのような抗体の使用は、この疾患が良性疾患と十分に見分けられる限り、その早期診断の向上を可能にすることができ、かつ治療応答をモニタリングするために、また潜在的に、疾患負荷を示すことによって予後診断を向上させるためにも使用することができる。
様々な実施形態において、本発明は、膵癌細胞に結合し、正常なまたは非腫瘍性の膵臓細胞にはほとんどまたは全く結合しない抗体、抗原結合抗体断片、および融合タンパク質に関する。好ましくは、抗体は、ＰａｎＩＮ−１Ａおよび１ＢならびにＰａｎＩＮ−２などの 最も初期の膵癌に結合する。より好ましくは、抗体は、ヒト浸潤性膵腺癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍、ＰａｎＩＮ−１Ａ、ＰａｎＩＮ−１Ｂ、およびＰａｎＩＮ−２病変の８０〜９０％またはそれより多くに結合する。最も好ましくは、抗体は、初期の膵癌と膵炎などの非悪性疾患とを区別することができる。このような抗体は、癌の早期検出や初期膵癌と良性膵臓疾患の示差診断に特に有用である。好ましい実施形態では、このような抗体は、初期の膵癌または特定の他の癌を有することが疑われる個体由来の試料のインビボまたはエクスビボ解析に有用である。
抗体、抗体断片、または融合タンパク質は、ムチンを用いた免疫化および／または選択によって得ることができ、膵癌のムチンに対して反応性であることが好ましい。したがって、抗体、抗体断片、および融合タンパク質は、膵癌細胞と関連する抗原に結合することが好ましい。抗体、抗体断片、または融合タンパク質は、ＭＵＣ−１またはＭＵＣ−５などの、膵癌で発現されるムチンに結合し得ることがより好ましい。特定の実施形態では、抗体、抗体断片、または融合タンパク質は、ＭＵＣ−１抗原がトランスフェクトされ、ＭＵＣ−１抗原を発現している細胞に結合し得る。
代わりの実施形態では、抗体、抗体断片、または融合タンパク質は、合成ペプチド配列、例えば、ファージディスプレイペプチドに結合し得る。抗膵癌抗体に結合し得る例示的なペプチドとしては、ＷＴＷＮＩＴＫＡＹＰＬＰ（配列番号２９）およびＡＣＰＥＷＷＧＴＴＣ（配列番号３０）が挙げられるが、これらに限定されない。このような合成ペプチドは、線状であっても環状であってもよく、内在性膵癌抗原対する抗体結合と競合してもしなくてもよい。合成ペプチド配列の特定位置のアミノ酸は、他のアミノ酸よりも抗体結合に重要でない場合がある。例えば、配列番号２９において、ペプチド配列の位置７、８、および１１の残基Ｋ、Ａ、およびＬを、依然として抗体結合を保持したままで改変し得る。同様に、配列番号３０において、配列の位置８および９のトレオニン残基を改変し得るが、位置９のトレオニンの置換は、ペプチドに対する抗体結合に大きく影響を及ぼす可能性がある。
他の好ましい実施形態では、標的膵癌抗原に対する抗体結合は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および／または過ヨウ素酸塩などの試薬で標的抗原を処理することにより阻害される。したがって、膵癌抗原に対する抗体結合は、ジスルフィド結合の存在および／または標的抗原のグリコシル化状態に左右され得る。より好ましい実施形態では、本抗体によって認識されるエピトープは、ＭＡ５抗体、ＣＬＨ２−２抗体、および／または４５Ｍ１抗体（例えば、Ｍａｊｏｒら，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３５：１３９−４８，１９８７；Ｄｉｏｎら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １０：５９５−６１０，１９９１参照）などの、他の報告されているムチン特異的抗体と交差反応しない。
本抗体または断片は、裸の抗体または断片であってもよいし、あるいは好ましくは、薬剤を標的組織に送達するための少なくとも１つの治療剤および／または診断剤にコンジュゲートされている。代わりの実施形態では、ＰＡＭ４抗体または断片は、標的細胞抗原に対する第１の結合部位とターゲッティング可能な構築物にコンジュゲートされたハプテンに対する第２の結合部位とを有する二重特異性融合タンパク質または抗体の一部であってもよい。一方、ターゲッティング可能な構築物は、プレターゲッティング技術で有用な、少なくとも１つの治療剤および／または診断剤に付着していてもよい。
好ましい実施形態では、本抗体、抗体断片、または融合タンパク質は、マウスＰＡＭ４抗体または断片、キメラＰＡＭ４抗体または断片、ヒト化ＰＡＭ４抗体または断片、あるいはヒトＰＡＭ４抗体または断片を含む。このようなＰＡＭ４抗体または断片は、好ましくは、マウスＰＡＭ４抗体のＣＤＲ配列、例えば、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＹ、配列番号１）、ＣＤＲ２（ＳＴＳＮＬＡＳ、配列番号２）、およびＣＤＲ３（ＨＱＷＮＲＹＰＹＴ，配列番号３）、ならびに重鎖可変領域ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＳＹＶＬＨ、配列番号４）、ＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＱＹＮＥＫＦＫＧ、配列番号５）、およびＣＤＲ３（ＧＦＧＧＳＹＧＦＡＹ、配列番号６）を含む。
特定の実施形態は、好ましくは、図１Ａおよび１Ｂに開示されるマウスＰＡＭ４可変領域配列（配列番号９および配列番号１１）を含む、マウスＰＡＭ４抗体の組成物および使用方法に関するものであってもよい。このようなマウスＰＡＭ４抗体または断片は、インビトロまたはエクスビボでの診断技術、例えば、膵癌または他の種類の癌を有することが疑われる対象由来の組織試料の免疫組織化学的解析または体液試料の免疫アッセイにおいて有用であり得る。
他の特定の実施形態は、ヒト抗体定常領域配列に結合したマウス可変領域配列を含む、キメラＰＡＭ４抗体の組成物および使用方法に関するものであってもよい。好ましくは、キメラＰＡＭ４抗体または断片は、図２Ａおよび２Ｂに示すｃＰＡＭ４可変領域配列（配列番号１２および配列番号１３）を含む。このようなキメラ抗体は、マウス抗体よりもヒトでの免疫原性が低いが、もとのマウス抗体の抗原結合特異性は保持している。キメラ抗体は、癌の診断および／または治療的処置で使用されることが当該技術分野で周知である。
さらに他の特定の実施形態は、上で論じられたマウスＰＡＭ４ ＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）配列および定常領域配列とを含む、ヒト化ＰＡＭ４抗体またはその断片の組成物および使用方法に関するものであってもよい。好ましい実施形態では、ヒト化ＰＡＭ４抗体またはその断片の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のＦＲは、マウスＰＡＭ４ ＭＡｂの対応するＦＲから置換された少なくとも１つのアミノ酸を含む。さらにより好ましくは、ヒト化ＰＡＭ４抗体またはその断片は、マウスＰＡＭ４重鎖可変領域（図１Ｂ）のアミノ酸残基５、２７、３０、３８、４８、６６、６７、および６９から選択される少なくともアミノ酸残基ならびに／またはマウスＰＡＭ４軽鎖可変領域（図１Ａ）のアミノ酸残基２１、４７、５９、６０、８５、８７、および１００から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を含み得る。最も好ましくは、ヒト化ＰＡＭ４抗体またはその断片は、図４ＢのｈＰＡＭ４ ＶＨアミノ酸配列（配列番号１９）および図４ＡのｈＰＡＭ４ ＶＫアミノ酸配列（配列番号１６）を含む。
代わりの実施形態では、抗膵癌抗体は、キメラＰＡＭ４（ｃＰＡＭ４）抗体と同じ抗原性決定基（エピトープ）に結合するマウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であってもよい。以下で論じるように、ｃＰＡＭ４抗体は、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＹ、配列番号１）、ＣＤＲ２（ＳＴＳＮＬＡＳ、配列番号２）、およびＣＤＲ３（ＨＱＷＮＲＹＰＹＴ、配列番号３）、ならびに重鎖可変領域ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＳＹＶＬＨ、配列番号４）、ＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＱＹＮＥＫＦＫＧ、配列番号５）、およびＣＤＲ３（ＧＦＧＧＳＹＧＦＡＹ、配列番号６）を含む抗体である。同じ抗原決定基に結合する抗体は、当該技術分野で公知の種々の技術によって、例えば、ｃＰＡＭ４抗体を競合抗体としておよびヒト膵臓ムチンを標的抗原として用いる競合的結合研究によって、同定し得る（例えば、以下の実施例１、段落［０２１４］参照）。ヒト膵臓ムチンへのｃＰＡＭ４抗体の結合を遮断する（競合する）抗体は、交差遮断抗体と呼ばれる。好ましくは、このような交差遮断抗体を、ヒト膵癌ムチンを含む抽出物で免疫化することにより調製する。
別の実施形態は、少なくとも１つの診断（または検出）剤に結合した抗膵癌抗体、抗体断片、または融合タンパク質を含む、癌細胞を標的とする診断用免疫コンジュゲートである。
好ましくは、診断剤は、放射性核種、造影剤、蛍光剤、化学発光剤、生物発光剤、常磁性イオン、酵素、および光活性診断剤からなる群から選択される。診断剤は、２０〜４，０００ｋｅＶのエネルギーを有する放射性核種であるか、あるいは１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、またはその他のガンマ線放射体、ベータ線放射体、もしくは陽電子放射体からなる群から選択される放射性核種であることがさらにより好ましい。特定の好ましい実施形態では、以下の実施例で記載されるように、診断用放射性核種の１８Ｆを標識やＰＥＴイメージングに使用する。アルミニウムなどの金属と錯化させ、１８Ｆ−金属錯体を、ターゲッティングタンパク質、ペプチド、または他の分子にコンジュゲートされたキレート化部分と結合させることにより、１８Ｆを抗体、抗体断片、またはペプチドに結合させ得る。
診断剤が、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、およびエルビウム（ＩＩＩ）などの常磁性イオン、またはバリウム、ジアトリゾ酸、ヨード化ケシ油エチルエステル、クエン酸ガリウム、イオカルミン酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパノ酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメチン酸、イオタスル、イオテトル酸、イオタラム酸、イオトロクス酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポダート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドン、および塩化タリウムなどの放射線不透過物質であることも好ましい。
さらに他の実施形態では、診断剤は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、およびフルオレスカミンからなる群から選択される蛍光標識化合物、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジンエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルからなる群から選択される化学発光標識化合物、またはルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンからなる群から選択される生物発光化合物である。別の実施形態では、診断用免疫コンジュゲートは、術中腫瘍診断、内視鏡的腫瘍診断、または血管内腫瘍診断で使用される。
別の実施形態は、少なくとも１つの治療剤に結合した抗体もしくはその断片または融合タンパク質を含む、癌細胞を標的とする治療用免疫コンジュゲートである。好ましくは、治療剤は、放射性核種、免疫調節物質、ホルモン、ホルモン拮抗薬、酵素、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチド、酵素阻害剤、光活性治療剤、薬物または毒素などの細胞毒性薬、血管新生阻害剤、およびアポトーシス促進剤からなる群から選択される。２つ以上の治療剤が使用される実施形態では、治療剤は、複数個の同じ治療剤またはその他の組合せの異なる治療剤を含み得る。
一実施形態では、米国特許第５，７３４，０３３号（この実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、ｂｃｌ−２発現を阻害する、アンチセンス分子またはｓｉＲＮＡなどの、オリゴヌクレオチドは、免疫コンジュゲートもしくは抗体融合タンパク質の治療剤部分にコンジュゲートしていてもよいし、または該治療剤部分を形成してもよい。あるいは、オリゴヌクレオチドは、裸のまたはコンジュゲートされた、ＰＡＭ４抗体などの、抗膵癌抗体または抗体断片と同時に、あるいは該抗膵癌抗体または抗体断片とともに順次、投与されてもよい。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｂｃｌ−２、ｐ５３、ｒａｓ、または他のよく知られたオンコジーンなどの、オンコジーンまたはオンコジーン産物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、治療剤は、薬物または毒素などの細胞毒性薬である。薬物が、窒素マスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素、ゲムシタビン、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素阻害剤、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモン拮抗薬、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、ＳＮ−３８、ドキソルビシンとその類似体、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗有糸分裂剤、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０）阻害剤、プロテオソーム阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、アポトーシス促進剤、メトトレキセート、ＣＰＴ−１１、およびそれらの組合せからなる群から選択されることも好ましい。
別の好ましい実施形態では、治療剤は、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌腸毒素−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される毒素である。または、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、幹細胞増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、およびそれらの組合せからなる群から選択される免疫調節物質。
他の好ましい実施形態では、治療剤は、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、および２１１Ｐｂ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される放射性核種である。オージェ放出粒子を伴って実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、１−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ、およびＩｒ−１９２。有用なベータ粒子放出核種の崩壊エネルギーは、好ましくは＜１、０００ｋｅＶ、より好ましくは＜１００ｋｅＶ、最も好ましくは＜７０ｋｅＶである。アルファ粒子の発生を伴って実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。このような放射性核種としては、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、およびＦｍ−２５５が挙げられるが、これらに限定されない。有用なアルファ粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２、０００〜１０、０００ｋｅＶ、より好ましくは３、０００〜８、０００ｋｅＶ、最も好ましくは４、０００〜７、０００ｋｅＶである。さらなる有用な潜在的放射性同位体としては、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、１６９Ｙｂなどが挙げられる。他の実施形態では、治療剤は、色原体および色素からなる群から選択される光活性治療剤である。
あるいは、治療剤は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼからなる群から選択される酵素である。このような酵素は、例えば、比較的無毒な形態で投与され、標的部位で酵素により細胞毒性薬へと変換されるプロドラッグと組み合わせて使用し得る。他の代替では、薬物は、対象の内在性酵素によってより毒性の少ない形態へと変換され得るが、治療酵素によって細胞毒性のある形態へと再変換され得る。
ＰＡＭ４標的抗原に対する親和性を有する少なくとも１つの結合部位と、ハプテン分子に対する親和性を有する１つまたは複数のハプテン結合部位とを含む多価多重特異性抗体またはその断片も企図される。好ましくは、抗体またはその断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは完全ヒト抗体またはそれらの断片である。ハプテン分子は、１つまたは複数の治療剤および／または診断剤を送達するためのターゲッティング可能な構築物にコンジュゲートされていてもよい。特定の好ましい実施形態では、多価抗体またはその断片は、以下の実施例に記載するような、ドック・ロック（ＤＮＬ）技術によって調製されてもよい。ｈＰＡＭ４抗体断片を組み入れた例示的なＤＮＬ構築物は、以下に記載するように、ＴＦ１０と表される。
ＰＡＭ４標的抗原に対する親和性を有する少なくとも１つの結合部位と、少なくとも１つの診断剤および／または治療剤を含むことができる、
ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ２７１）；
ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ２７７）；
ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ２８８）；
ＤＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ０２８１）；
ＮＯＴＡ−ＩＴＣベンジル−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ４４９）；
ＮＯＤＡ−Ｇａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ４６０）；
ＮＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ４６１）；
ＮＯＴＡ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ４６２）；
ＮＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ４６５）；
Ｃ−ＮＥＴＡ−スクシニル−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ４６７）；
Ｓ−ＮＥＴＡ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ４６９）；および
Ｌ−ＮＥＴＡ−スクシニル−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＩＭＰ４７０）
からなる群から選択されるターゲッティング可能な構築物／コンジュゲートに対する親和性を有する少なくとも１つの結合部位とを含む二重特異性抗体またはその断片も企図される。使用に好適な他のターゲッティング可能な構築物は、例えば、米国特許第６，５７６，７４６号；同第６，９６２，７０２号；同第７，０５２，８７２号；同第７，１３８，１０３号；同第７，１７２，７５１号；および同第７，４０５，３２０号、ならびに米国特許出願第１２／１１２，２８９号に開示されており、これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。
他の実施形態は、本明細書に記載される少なくとも２つの抗膵癌抗体およびその断片を含む融合タンパク質またはその断片に関する。あるいは、融合タンパク質またはその断片は、少なくとも１つの第１の抗膵癌抗体またはその断片と、少なくとも１つの第２のＭＡｂまたはその断片とを含み得る。好ましくは、第２のＭＡｂは、例えば、ＣＡ１９．９、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｎｄ２、Ｂ７２．３、ＣＣ４９、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、Ｌｅａ、ルイス抗原Ｌｅ（ｙ）、ＣＳＡｐ、インスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）、上皮糖タンパク質−１（ＥＧＰ−１）、上皮糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２）、ＣＤ−８０、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、炭酸アンヒドラーゼＩＸ、テネイシン、ＩＬ−６、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ７４（例えば、ミラツズマブ）、ＣＤ１３８（シンデカン−１）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＭＵＣ−５ａｃ、ＭＵＣ−１６、ＭＵＣ−１７、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管新生因子（例えば、ＶＥＧＦおよびＰｌＧＦ）、オンコジーン産物（例えば、ｂｃｌ−２、Ｋｒａｓ、ｐ５３）、ｃＭＥＴ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ならびに胃癌や結腸直腸癌と関連する抗原からなる群から選択される腫瘍関連抗原に結合する。抗体融合タンパク質またはその断片は、少なくとも１つの診断剤および／または治療剤をさらに含み得る。
本明細書に記載される抗膵癌抗体、融合タンパク質、多重特異性抗体、二重特異性抗体、またはそれらの断片をコードする核酸を含むＤＮＡ配列も本明細書に記載されている。他の実施形態は、抗体をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターおよび／または宿主細胞に関する。特定の好ましい実施形態では、宿主細胞は、無血清培地中での細胞形質転換および増殖に適応している、突然変異体Ｂｃｌ−２遺伝子、例えば、三重突然変異体Ｂｃｌ−２遺伝子（Ｔ６９Ｅ、Ｓ７０Ｅ、Ｓ８７Ｅ）で形質転換されたＳｐ２／０細胞株であってもよい（例えば、２００５年７月２５日に出願された米国特許出願第１１／１８７，８６３号（現在公開されている米国特許第７，５３１，３２７号）；２００６年７月１４日に出願された米国特許出願第１１／４８７，２１５号（現在公開されている米国特許第７，５３７，９３０号）；および２００７年１０月２４日に出願された米国特許出願第１１／８７７，７２８号を参照されたく、これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる）。
別の実施形態は、診断剤もしくは治療剤、またはその組合せを標的に送達する方法であって、（ｉ）少なくとも１つの診断剤および／または治療剤にコンジュゲートされた、ＰＡＭ４抗体または断片などの、抗膵癌抗体または断片を含む組成物を準備することと、ならびに（ｉｉ）本明細書で特許請求された抗体、抗体断片、または融合タンパク質のいずれか１つの診断用コンジュゲートまたは診断用コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
診断剤、治療剤、またはその組合せを標的に送達する方法であって、（ａ）ＰＡＭ４抗原に対する親和性を有し、かつ１つまたは複数のハプテン結合部位を含む、多価の多重特異性もしくは二重特異性抗体またはその断片のいずれか１つを対象に投与すること；（ｂ）ＰＡＭ４抗原に結合しない抗体が対象の血流からクリアランスされるのに十分な時間待つこと；および（ｃ）抗体の結合部位に結合する診断剤、治療剤、またはその組合せを含む担体分子を該対象に投与することを含む方法も企図される。好ましくは、担体分子は、抗体の２つ以上の結合部位に結合する。
癌を診断または治療するための方法であって、（ａ）ＰＡＭ４抗原に対する親和性を有し、かつ１つまたは複数のハプテン結合部位を含む、本明細書で特許請求された多価多重特異性抗体またはその断片のいずれか１つを対象に投与すること；（ｂ）一定量の結合しない抗体が対象の血流からクリアランスされるのに十分な時間待つこと；および（ｃ）抗体の結合部位に結合する診断剤、治療剤、またはその組合せを含む担体分子を該対象に投与することを含む方法が本明細書に記載されている。好ましい実施形態では、癌は膵癌である。本方法が、罹患組織の術中同定、罹患組織の内視鏡による同定、または罹患組織の血管内同定に使用することができることも好ましい。
別の実施形態は、対象の悪性腫瘍を治療する方法であって、任意で、少なくとも１つの治療剤にコンジュゲートされた、ＰＡＭ４抗原に結合する治療有効量の抗体またはその断片を該対象に投与することを含む方法である。抗体またはその断片は、代わりに、裸の抗体またはその断片であってもよい。より好ましい実施形態では、抗体または断片は、上記のような別の治療剤の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与される。
対象の悪性腫瘍、特に膵癌を診断する方法であって、（ａ）ＰＡＭ４抗原に結合する抗体またはその断片を含む診断用コンジュゲートを該対象に投与すること（ここで、該ＭＡｂまたはその断片は少なくとも１つの診断剤にコンジュゲートされている）、および（ｂ）膵癌細胞または他の悪性細胞に結合した標識抗体の存在を検出すること（ここで、抗体の結合は、膵癌または別の悪性腫瘍の存在の診断となる）を含む方法が本明細書で企図されている。好ましい実施形態では、抗体または断片は、膵癌に結合するが、正常膵組織、膵炎、または他の非悪性疾患には結合しない。あまり好ましくない実施形態では、抗体または断片は、非悪性細胞よりも癌細胞に顕著に高いレベルで結合し、癌と非悪性疾患の示差診断を可能にする。最も好ましい実施形態では、診断剤は、ＰＥＴイメージングにより検出されるＦ−１８標識分子であってもよい。
より好ましい実施形態では、ｈＰＡＭ４抗体などの抗膵癌抗体を使用することにより、悪性疾患の最も早い段階で、高い特異性と感度で膵癌を検出および／または診断することが可能になる。好ましくは、診断用の抗体または断片は、高分化膵癌、中分化膵癌、および低分化膵癌の少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは約１００％、ならびに浸潤性膵腺癌の９０％以上を標識することができる。有用な抗膵癌抗体は、好ましくはＰａｎＩＮ−１Ａ、ＰａｎＩＮ−１Ｂ、ＰａｎＩＮ−２、ＩＰＭＮ、およびＭＣＮ前駆病変の８５％以上を検出することができる。最も好ましくは、抗膵癌抗体を用いる免疫アッセイは、全ＰａｎＩＮの８９％以上、ＩＰＭＮの８６％以上、およびＭＣＮの９２％以上を検出することができる。
代わりの実施形態は、血液、血漿、または血清試料のインビトロ解析による個体におけるＰＡＭ４抗原の検出方法および／または膵癌の診断方法である。好ましくは、ＰＡＭ４抗体などの抗膵癌抗体を用いる免疫検出用に処理する前に、試料を、ブタノールなどの有機溶媒を用いて、有機相抽出にかける。有機相抽出後、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫アッセイ、固相ＲＩＡ、および同様の技術などの、当該技術分野で公知の種々の免疫アッセイのいずれかを用いて、水相を試料中のＰＡＭ４抗原の存在について解析する。
別の実施形態は、対象の癌細胞を治療する方法であって、ＰＡＭ４抗原に結合する裸の抗体もしくはその断片または裸の抗体融合タンパク質もしくはその断片を含む組成物を該対象に投与することを含む方法である。好ましくは、本方法は、ＣＡ１９．９、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｎｄ２、Ｂ７２．３、ＣＣ４９、抗ＣＥＡ、抗ＣＥＡＣＡＭ６、抗ＥＧＰ−１、抗ＥＧＰ−２、抗Ｌｅａ、ルイス抗原Ｌｅ（ｙ）により規定される抗体、ならびにＣＳＡｐ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＭＵＣ−５ａｃ、ＭＵＣ−１６、ＭＵＣ−１７、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＣＤ４０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４、ＣＤ１３８、血管新生因子（例えば、ＶＥＧＦおよび胎盤様増殖因子（ＰｌＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）、テネイシン、血小板由来増殖因子、ＩＬ−６、オンコジーン産物、ｃＭＥＴ、ならびにＨＥＲ２／ｎｅｕに対する抗体からなる群から選択される第２の裸の抗体またはその断片を投与することをさらに含む。
さらに他の実施形態は、対象の悪性腫瘍を診断する方法であって、（ｉ）ＰＡＭ４抗原に結合する抗体またはその断片を含む組成物を用いて該対象由来の標本に対するインビトロ診断アッセイを行なうこと、および（ｉｉ）標本中の悪性細胞に結合した抗体または断片の存在を検出することを含む方法に関する。好ましくは、悪性腫瘍は癌である。癌は膵癌であることがさらに好ましい。
マウスＰＡＭ４抗体の可変領域ｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列。図１Ａは、マウスＰＡＭ４ ＶｋのＤＮＡ（配列番号８）配列およびアミノ酸（配列番号９）配列を示す。図１Ｂは、マウスＰＡＭ４ ＶＨのＤＮＡ（配列番号１０）配列およびアミノ酸（配列番号１１）配列を示す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下に１文字暗号として示されている。ヌクレオチド配列の付番を右側に記す。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字で示され、下線が引かれている。アミノ酸残基の上の付番によって示されるように、ＫａｂａｔのＩｇ分子付番がアミノ酸残基に使用されている。１文字で付番されたアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ付番方式で規定された挿入残基である。挿入残基は、前の残基の接頭数字と同じ数字を有する。例えば、図１Ｂの残基８２、８２Ａ、８２Ｂ、および８２Ｃは、それぞれ、８２、Ａ、Ｂ、およびＣと示されている。 マウスＰＡＭ４抗体の可変領域ｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列。図１Ａは、マウスＰＡＭ４ ＶｋのＤＮＡ（配列番号８）配列およびアミノ酸（配列番号９）配列を示す。図１Ｂは、マウスＰＡＭ４ ＶＨのＤＮＡ（配列番号１０）配列およびアミノ酸（配列番号１１）配列を示す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列の下に１文字暗号として示されている。ヌクレオチド配列の付番を右側に記す。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字で示され、下線が引かれている。アミノ酸残基の上の付番によって示されるように、ＫａｂａｔのＩｇ分子付番がアミノ酸残基に使用されている。１文字で付番されたアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ付番方式で規定された挿入残基である。挿入残基は、前の残基の接頭数字と同じ数字を有する。例えば、図１Ｂの残基８２、８２Ａ、８２Ｂ、および８２Ｃは、それぞれ、８２、Ａ、Ｂ、およびＣと示されている。 Ｓｐ２／０細胞で発現されたキメラＰＡＭ４（ｃＰＡＭ４）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列。図２Ａは、ｃＰＡＭ４ Ｖｋのアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。図２Ｂは、ｃＰＡＭ４ ＶＨのアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。配列は、１文字暗号で示されている。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字で示され、下線が引かれている。アミノ酸の付番は、図１と同じである。 ヒト抗体ＰＡＭ４およびｈＰＡＭ４の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメント。図３Ａは、ヒト抗体Ｗａｌｋｅｒ（配列番号１４）とＰＡＭ４（配列番号９）およびｈＰＡＭ４（配列番号１６）のＶｋアミノ酸配列アラインメントを示し、図３Ｂは、ヒト抗体Ｗｉｌ２（ＦＲ１〜３）（配列番号１７）およびＮＥＷＭ（ＦＲ４）（配列番号２８）とＰＡＭ４（配列番号１１）およびｈＰＡＭ４（配列番号１９）のＶＨアミノ酸配列アラインメントを示す。点は、ヒト抗体またはヒト化抗体の対応する残基と同一なＰＡＭ４の残基を示す。囲み領域は、ＣＤＲ領域を表す。ｈＰＡＭ４のＮ末端残基とＣ末端残基（下線）は両方とも、使用されるステージングベクターにより固定されている。図１と同様に、ＫａｂａｔのＩｇ分子番号方式を用いて、残基に付番している。 ヒト抗体ＰＡＭ４およびｈＰＡＭ４の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアラインメント。図３Ａは、ヒト抗体Ｗａｌｋｅｒ（配列番号１４）とＰＡＭ４（配列番号９）およびｈＰＡＭ４（配列番号１６）のＶｋアミノ酸配列アラインメントを示し、図３Ｂは、ヒト抗体Ｗｉｌ２（ＦＲ１〜３）（配列番号１７）およびＮＥＷＭ（ＦＲ４）（配列番号２８）とＰＡＭ４（配列番号１１）およびｈＰＡＭ４（配列番号１９）のＶＨアミノ酸配列アラインメントを示す。点は、ヒト抗体またはヒト化抗体の対応する残基と同一なＰＡＭ４の残基を示す。囲み領域は、ＣＤＲ領域を表す。ｈＰＡＭ４のＮ末端残基とＣ末端残基（下線）は両方とも、使用されるステージングベクターにより固定されている。図１と同様に、ＫａｂａｔのＩｇ分子番号方式を用いて、残基に付番している。 Ｓｐ２／０細胞で発現されたヒト化ＰＡＭ４（ｈＰＡＭ４）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列。図４Ａは、ｈＰＡＭ４ ＶｋのＤＮＡ（配列番号１５）配列およびアミノ酸（配列番号１６）配列を示し、図４Ｂは、ｈＰＡＭ４ ＶＨのＤＮＡ（配列番号１８）配列およびアミノ酸（配列番号１９）配列を示す。ヌクレオチド配列の付番を右側に記す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は１文字暗号で示されている。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字で示され、下線が引かれている。図１Ａおよび図１Ｂと同様に、ＫａｂａｔのＩｇ分子付番方式がアミノ酸残基に対して使用されている。 Ｓｐ２／０細胞で発現されたヒト化ＰＡＭ４（ｈＰＡＭ４）の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列。図４Ａは、ｈＰＡＭ４ ＶｋのＤＮＡ（配列番号１５）配列およびアミノ酸（配列番号１６）配列を示し、図４Ｂは、ｈＰＡＭ４ ＶＨのＤＮＡ（配列番号１８）配列およびアミノ酸（配列番号１９）配列を示す。ヌクレオチド配列の付番を右側に記す。対応するＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は１文字暗号で示されている。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字で示され、下線が引かれている。図１Ａおよび図１Ｂと同様に、ＫａｂａｔのＩｇ分子付番方式がアミノ酸残基に対して使用されている。 キメラＰＡＭ４、ｃＰＡＭ４と比較した場合のヒト化ＰＡＭ４抗体、ｈＰＡＭ４の結合活性。ｈＰＡＭ４は菱形で示され、ｃＰＡＭ４は黒丸で示されている。結果は、１２５Ｉ−ｃＰＡＭ４のＣａＰａｎ１抗原に対する結合で競合したときの、ｈＰＡＭ４抗体とｃＰＡＭ４の同等の結合活性を示している。 分割された９０Ｙ−ｈＰＡＭ４＋ゲムシタビンによる治療を受けた手術不能転移性膵癌を有する患者のＰＥＴ／ＣＴ融合画像、治療前（左側）および治療後（右側）。丸は原発病変の位置を示し、これは、治療後のＰＥＴ／ＣＴ強度の著しい減少を示している。 分割された９０Ｙ−ｈＰＡＭ４＋ゲムシタビンによる治療を受けた手術不能転移性膵癌を有する患者の３Ｄ ＰＥＴ画像、治療前（左側）および治療後（右側）。矢印は、原発病変（右側）および転移（左側）の位置を示し、これらは各々、放射性標識ｈＰＡＭ４＋ゲムシタビンによる治療後のＰＥＴ画像強度の著しい減少を示している。 ＴＦ１０二重特異性抗膵癌ムチン抗体のプレターゲッティングを伴うまたは伴わない１１１Ｉｎ標識ジＨＳＧペプチド（ＩＭＰ２８８）を用いた腫瘍のインビボイメージング。図８Ａ−腫瘍の位置を示すマウス（矢印）。図８Ｂは、ＴＦ１０二重特異性抗体の存在下（上）または非存在下（下）で１１１Ｉｎ標識ＩＭＰ２８８を用いて検出された腫瘍を示す。 ＴＦ１０、ＰＡＭ４−ＩｇＧ、ＰＡＭ４−Ｆ（ａｂ’）２、および一価ｂｓＰＡＭ４化学的コンジュゲート（ＰＡＭ４−Ｆａｂ’×抗ＤＴＰＡ−Ｆａｂ’）の例示的な結合曲線。標的ムチン抗原に対する結合はＥＬＩＳＡアッセイで測定された。 ＣａＰａｎ１ヒト膵癌異種移植片（約０．２５ｇ）の免疫シンチグラフィー。（Ａ）二重特異性ＴＦ１０（８０μｇ、５．０７×１０−１０ｍｏｌ）を注射し、１６時間後に１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８（３０μＣｉ、５．０７×１０−１１ｍｏｌ）を投与したマウスの画像。画像は３時間後に撮影した。１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８を単独投与（３０μＣｉ、５．０７×１０−１１ｍｏｌ）したときに得られる画像の強度と一致するように、画像バックグラウンドの強度を高めた。（Ｂ）１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８を単独投与したマウスではターゲッティングが見られなかった。（Ｃ）1１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＰＡＭ４−ＩｇＧ（２０μＣｉ、５０μｇ）を投与し、２４時間後にイメージングしたマウスの画像。腫瘍は見えるが、かなりのバックグラウンド活性がこの時点でもまだ存在している。 ＣａＰａｎ１ヒト膵癌異種移植片を担持するヌードマウスにおける１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＰＡＭ４−ＩｇＧ（２０μＣｉ、５０μｇ）およびＴＦ１０でプレターゲッティングした１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８（８０μｇ、５．０７×１０−１０ｍｏｌのＴＦ１０の１６時間後に３０μＣｉ、５．０７×１０−１１ｍｏｌの１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８）の生体分布の延長（プレターゲッティング群の動物およびＩｇＧ群の動物について、平均腫瘍重量＋／−ＳＤは、それぞれ、０．２８＋／−０．２１および０．１０＋／−０．０６ｇである）。 ０．１５ｍＣｉの９０Ｙ−ｈＰＡＭ４ ＩｇＧ、またはＴＦ１０でプレターゲッティングした、０．２５もしくは０．５０ｍＣｉの９０Ｙ−ＩＭＰ−２８８による樹立された（約０．４ｃｍ３）ＣａＰａｎ１腫瘍の単一治療の治療活性。 ＰＴ−ＲＡＩＴ治療のゲムシタビン増強の効果。 セツキシマブとゲムシタビンおよびＰＴ−ＲＡＩＴの組合せの効果。 ＰＡＭ４ベースの免疫アッセイを用いた膵癌の示差診断。赤線は、ＲＯＣ解析に基づく、陽性結果のために選択されたカットオフレベルを示す。 健康ボランティアおよび様々な段階の膵癌を有する個体に由来する患者血清中のＰＡＭ４抗原の頻度分布。 ＰＡＭ４血清免疫アッセイについてのＲＯＣ曲線。
定義
特に指示しない限り、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つまたは複数を意味する。
本明細書で使用する場合、「約」は、プラスマイナス１０％を意味する。例えば、「約１００」は、９０〜１1０の任意の数を含む。
「実質的により少ない」という用語は、少なくとも９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％、より好ましくは９９．９％より少ないことを意味する。
本明細書で記載する場合、「ＰＡＭ４抗体」という用語は、マウスＰＡＭ４抗体、キメラＰＡＭ４抗体、ヒト化ＰＡＭ４抗体、およびヒトＰＡＭ４抗体を含む。好ましい実施形態では、ＰＡＭ４抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜配列番号６のＣＤＲ配列を含む。
本明細書で使用する場合、「ＰＡＭ４抗原」は、ＰＡＭ４抗体が結合する抗原である。好ましい実施形態では、ＤＴＴまたは過ヨウ素酸によるＰＡＭ４抗原の処理は、ＰＡＭ４抗体の結合を阻害または妨害する。より好ましい実施形態では、ＰＡＭ４抗原は、ＭＵＣ−１またはＭＵＣ−５などの、膵癌細胞により発現されるムチンのエピトープである。
本明細書で使用する場合、「抗膵癌抗体」は、ＰＡＭ４抗体と同じ診断特性、治療特性、および結合特性を示す抗体である。好ましい実施形態では、「抗膵癌抗体」は、ＰＡＭ４抗体と同じエピトープに結合する。
「非内分泌膵癌」は、通常、外分泌膵腺から発生する癌を指す。この用語は、膵インスリノーマを除外し、膵癌、膵腺癌、腺扁平上皮癌、扁平上皮癌、および巨細胞癌、ならびに腫瘍性ではあるが、まだ悪性ではない、膵上皮内腫瘍（ＰａｎＩＮ）、粘液性嚢胞腫瘍（ＭＣＮ）、および膵管内粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）などの前駆病変を含む。「膵癌」および「非内分泌膵癌」という用語は、本明細書で互換的に使用されている。
本明細書で使用される、抗体は、全長の（すなわち、天然に存在するもしくは通常の免疫グロブリン遺伝子断片の組換え過程で生成される）免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ抗体）または抗体断片のような、免疫グロブリン分子の免疫活性（すなわち、特異的結合）部分を指す。
抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどのような、抗体部分である。構造がどうであれ、抗体断片は、全長抗体によって認識されるのと同じ抗原と結合する。「抗体断片」という用語は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域からなる「Ｆｖ」断片や、重可変領域および軽可変領域がペプチドリンカーで連結されている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖ」タンパク質）などの、抗体の可変領域からなる単離された断片も含む。
裸の抗体は、治療剤または診断剤にコンジュゲートされていない抗体またはその断片である。一般に、抗体分子のＦｃ部分は、細胞溶解をもたらし得る機構を実行に移す、補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）などの、エフェクター機能を提供する。しかしながら、シグナル伝達誘導性アポトーシスなどの他の機構が働くので、Ｆｃ部分が治療機能に必要とされないこともある。裸の抗体には、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方、ならびに融合タンパク質および特定の組換え抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体も含まれる。
キメラ抗体は、１つの種に由来する抗体、好ましくは齧歯類抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含む組換えタンパク質であるが、抗体分子の定常ドメインはヒト抗体の定常ドメインに由来している。獣医学的適用では、キメラ抗体の定常ドメインは、ネコまたはイヌなどの、他の種の定常ドメインに由来していてもよい。
ヒト化抗体は、１つの種由来の抗体、例えば、齧歯類抗体由来のＣＤＲが、齧歯類抗体の重可変鎖および軽可変鎖からヒトの重可変ドメインおよび軽可変ドメイン（例えば、フレームワーク領域配列）に移されている組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインに由来する。特定の実施形態では、もとの（齧歯類）抗体由来の限られた数のフレームワーク領域アミノ酸残基が、ヒト抗体フレームワーク領域配列に代わりに挿入されていてもよい。
ヒト抗体は、例えば、抗原刺激に応答して特異的なヒト抗体を産生するように「改変」されているトランスジェニックマウスから得られる抗体である。この技術では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントが、内在性マウス重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含む胚性幹細胞株に由来するマウス系統に導入される。トランスジェニックマウスは、特定の抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを用いて、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６（１９９４）、およびＴａｙｌｏｒら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）によって記載されている。完全ヒト抗体は、全て当該技術分野で公知である、遺伝子または染色体トランスフェクション法、およびファージディスプレイ技術により構築することもできる。例えば、免疫化されていないドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからの、インビトロでのヒト抗体およびその断片の産生については、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージの主要外殻タンパク質遺伝子または非主要外殻タンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、機能的抗体断片としてファージ粒子の表面に提示される。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択により、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子を選択することにもなる。このように、ファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式で行なうことができ、参考のために、例えば、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞により作製されてもよい。米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照されたく、これらの実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。
治療剤は、抗体部分と別々に、同時に、もしくは順次に投与される、あるいは抗体部分、すなわち、抗体もしくは抗体断片、またはサブ断片にコンジュゲートされている化合物、分子、または原子であり、疾患の治療において有用である。治療剤の例としては、抗体、抗体断片、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節物質、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホウ素化合物、光活性剤または色素、および放射性同位体が挙げられる。有用な治療剤は、以下でより詳細に記載されている。
診断剤は、抗体部分またはターゲッティング可能な構築物にコンジュゲートされて投与され得る分子、原子、または他の検出可能部分であり、標的抗原を含む細胞の位置を特定することによって疾患を検出または診断する際に有用である。有用な診断剤としては、放射性同位体、色素（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を含むもの）、造影剤、蛍光化合物または蛍光分子、および磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）または陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャニング用の増強剤（例えば、常磁性イオン）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、診断剤は、放射性同位体、磁気共鳴イメージングで使用される増強剤、および蛍光化合物からなる群から選択される。抗体成分に放射性金属または常磁性イオンを付加するために、イオンを結合させるための多様なキレート基が付着した長いテールを有する試薬と抗体成分を反応させる必要があり得る。このようなテールは、ポリリジン、多糖、または例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリオキシム、およびこの目的のために有用であることが公知の同様の基などのキレート基に結合することができるペンダント基を有する他の誘導体化鎖もしくは誘導体化可能な鎖などのポリマーであることができる。キレート剤は標準的な化学反応を用いて抗体に結合される。キレート剤は通常、免疫反応性の損失を最小限に抑え、かつ凝集および／または内部架橋を最小限に抑えて分子との結合形成を可能にする基により抗体に連結される。キレート剤を抗体にコンジュゲートするための他のより特殊な方法および試薬は、米国特許第４，８２４，６５９号に開示されており、その実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。特に有用な金属−キレート剤の組合せとしては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７６Ｂｒなどの、一般エネルギー範囲６０〜４，０００ｋｅＶの診断用同位体とともに放射性イメージングに使用される、２−ベンジルＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられる。同じキレート剤が、マンガン、鉄、およびガドリニウムなどの非放射性金属と錯化する場合、本発明の抗体とともに使用するとＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’−三酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン四酢酸）、およびＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）などの大環状のキレート剤は、種々の金属および放射性金属と一緒に、最も具体的には、それぞれ、ガリウム、イットリウム、および銅などの放射性核種と一緒にすると有用である。このような金属−キレート剤錯体は、環のサイズを目的の金属に合わせることにより極めて安定にすることができる。放射免疫治療（ＲＡＩＴ）用の２２３Ｒａなどの安定に結合する核種を対象とする他のリング型キレート剤、例えば、大環状ポリエーテルが本発明に包含される。つい最近では、ほとんど全ての分子をＰＥＴイメージングで有用な１８Ｆ原子で標識するための一般的に有用な技術が、米国特許出願第１２／１１２，２８９号（現在公開されている米国特許第７，５６３，４３３号）に記載されており、この実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。
免疫コンジュゲートは、少なくとも１つの治療剤および／または診断剤にコンジュゲートされた抗体、抗体断片、または融合タンパク質である。診断剤は、放射性核種または非放射性核種、造影剤（例えば、磁気共鳴イメージング、コンピュータ断層撮影、または超音波検査用のもの）を含むことができ、放射性核種は、ガンマ線、ベータ線、アルファ線、オージェ電子、または陽電子を放出する同位体であることができる。治療剤は、以下でより詳細に記載される、癌などの疾患状態を治療するために有用な任意の薬剤であってもよい。
発現ベクターは、宿主細胞内で発現される遺伝子を含むＤＮＡ分子である。通常、遺伝子発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーをはじめとする、特定の調節エレメントの制御下に置かれる。このような遺伝子は、調節エレメントに「機能的に連結されている」と言われる。
組換え宿主は、クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかを含む任意の原核細胞または真核細胞であってもよい。この用語は、宿主細胞の染色体またはゲノム中にクローニングされた遺伝子を含むように遺伝子改変された、原核細胞または真核細胞、およびトランスジェニック動物も含む。好適な哺乳動物宿主細胞としては、ＳＰ２／０細胞およびＮＳ０細胞などの骨髄腫細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ハイブリドーマ細胞株、および抗体発現に有用な他の哺乳動物宿主細胞が挙げられる。２００５年７月２５日に出願された米国特許出願第１１／１８７，８６３号（現在公開されている米国特許第７，５３１，３２７号）、２００６年７月１４日に出願された米国特許出願第１１／４８７，２１５号（現在公開されている米国特許第７，５３７，９３０号）、および２００７年１０月２４日に出願された米国特許出願第１１／８７７，７２８号（これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、Ｂｃｌ−ＥＥＥ遺伝子などのアポトーシス阻害因子をトランスフェクトされ、かつ無血清条件で増殖し、さらにトランスフェクトするのに適しているＳＰ２／０細胞も、ｍＡｂおよび他の融合タンパク質の発現に特に有用である。
本明細書で使用する場合、抗体融合タンパク質という用語は、特異性が同じまたは異なる２つ以上の同じまたは異なる天然抗体、単鎖抗体、または抗体断片が連結されている、組換えで産生された抗原結合分子である。融合タンパク質の価数は、この融合タンパク質が抗原またはエピトープに対して有している結合アームまたは結合部位の総数、すなわち、一価、二価、三価、または多価を示す。抗体融合タンパク質が多価であるということは、抗原に対する結合において複数の相互作用を利用できることを意味し、したがって、抗原に対する結合の結合力が高まる。特異性は、抗体融合タンパク質がいくつの抗原またはエピトープに結合することができるかということ、すなわち、単一特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性を示す。これらの定義を用いると、天然抗体、例えば、ＩｇＧは、結合アームを２本有するので二価であるが、１つの抗原に結合するので単一特異性である。単一特異性の多価融合タンパク質は、エピトープに対して２つ以上の結合部位を有するが、同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープとしか結合せず、例えば、ダイアボディーは同じ抗原と反応性のある２つの結合部位を有する。融合タンパク質は、異なる抗体成分の多価もしくは多重特異性の組合せ、または同じ抗体成分の複数のコピーを含み得る。融合タンパク質はさらに治療剤を含み得る。このような融合タンパク質に好適な治療剤の例としては、免疫調節物質（「抗体−免疫調節物質融合タンパク質」）および毒素（「抗体−毒素融合タンパク質」）が挙げられる。１つの好ましい毒素は、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、好ましくは組換えＲＮアーゼを含む。
多重特異性抗体は、異なる構造の少なくとも２つの標的、例えば、２つの異なる抗原、同じ抗原上の２つの異なるエピトープ、あるいはハプテンおよび／または抗原もしくはエピトープに同時に結合することができる抗体である。多重特異性の多価抗体は２つ以上の結合部位を有する構築物であり、これらの結合部位は特異性が異なる。
二重特異性抗体は、２つの異なる標的に同時に結合することができる抗体である。二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）および二重特異性抗体断片（ｂｓＦａｂ）は、例えば、腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも１つのアームと、治療剤または診断剤を含むターゲッティング可能なコンジュゲートに特異的に結合する少なくとも１つの他のアームとを有し得る。分子工学を用いて、種々の二重特異性融合タンパク質を産生することができる。
ＰＡＭ４抗体
本発明の様々な実施形態は、正常または良性の膵組織ではなく膵癌と極めて高い選択性で反応する抗体に関するものである。抗膵癌抗体およびその断片は、好ましくは、ヒト膵臓の腫瘍から得られる未処理のムチン調製物に対して惹起されるが、部分精製ムチンまたは精製ムチンですらも利用し得る。このような抗体の非限定的な例は、ＰＡＭ４抗体である。
マウスＰＡＭ４（ｍＰＡＭ４）抗体は、異種移植されたＲＩＰ−１ヒト膵癌由来の膵癌ムチンを免疫原として用いることにより開発された（Ｇｏｌｄら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５７：２０４−２１０，１９９４）。以下で論じるように、抗体の交差反応性研究や免疫組織化学染色研究により、ＰＡＭ４抗体は標的膵癌抗原上の独特かつ新規なエピトープを認識することが示されている。免疫組織化学染色研究（例えば、実施例２に記載の研究）により、ＰＡＭ４ ＭＡｂは、乳癌細胞、膵癌細胞、および他の癌細胞により発現される抗原に結合し、正常ヒト組織への結合は限られていることが示されている。しかしながら、最大の発現は通常、膵癌細胞によるものである。したがって、ＰＡＭ４抗体は、膵癌に比較的特異的であり、膵癌細胞に優先的に結合する。ＰＡＭ４抗体は、内在化することができる標的エピトープと反応する。このエピトープは、膵癌と関連しかつ限局性膵炎または正常膵組織と関連しない抗原によって主に発現される。ＰＡＭ４エピトープに対するＰＡＭ４抗体の結合は、抗原をＤＴＴまたは過ヨウ素酸で処理することにより阻害される。動物モデルで放射性標識ＰＡＭ４ ＭＡｂを用いた局在研究および治療研究により、腫瘍ターゲッティングと治療効力が示されている。
ＰＡＭ４抗体は、多くの臓器および腫瘍型によって発現されるが、膵癌細胞で優先的に発現されるＰＡＭ４抗原に結合する。ＰＡＭ４ ＭＡｂを用いた研究（例えば、実施例３の研究）により、抗体が、いくつかの重要な特性を示すことが示されており、これらの特性のために、抗体は臨床診断および臨床治療用途にふさわしい候補となる。ＰＡＭ４抗原は、膵癌やその他の癌の診断および治療の有用な標的を提供する。ＰＡＭ４抗体は、ＰＡＭ４以外の抗膵癌抗体（ＣＡ１９．９、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｎｄ２、ＣＥＡＣＡＭ５、Ｂ７２．３、抗Ｌｅａ、およびその他の抗ルイス抗原）によって認識されるエピトープとは異なる膵癌抗原のエピトープを認識するようである。
ＰＡＭ４抗体と組み合わせてまたはＰＡＭ４抗体とともに使用するのに好適な抗体としては、例えば、抗体ＣＡ１９．９、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｎｄ２、Ｂ７２．３、ＣＣ４９、抗ＣＥＡ、抗ＣＥＡＣＡＭ６、抗Ｌｅａ、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ７４、抗ＣＤ１３８、ならびにルイス抗原Ｌｅ（ｙ）により規定される抗体、または結腸特異的抗原ｐ（ＣＳＡｐ）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＭＵＣ−５ａｃ、ＭＵＣ−１６、ＭＵＣ−１７、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、血管新生因子（例えば、ＶＥＧＦおよびＰｌＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）、テネイシン、血小板由来増殖因子、およびＩＬ−６、ならびにオンコジーン産物（ｂｃｌ−２、Ｋｒａｓ、ｐ５３）、ｃＭＥＴに対する抗体、および腫瘍壊死物質に対する抗体、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎらによる特許（米国特許第６、０７１、４９１号、同第６．０１７、５１４号、同第５、０１９、３６８号、および同第５、８８２、６２６号）に記載されているような抗体が挙げられる。このような抗体は、ＰＡＭ４抗体免疫検出法および免疫治療法を補完するのに有用である。これらのおよびその他の治療剤は、ＰＡＭ４抗体の投与前に、投与と同時に、投与後に投与されたとき、ＰＡＭ４抗体などの抗膵癌抗体と相乗的に作用することができる。
治療用途において、腫瘍細胞に対するエフェクター細胞機能に関与する免疫調節物質に作動性または拮抗性を示す抗体も、単独または他の腫瘍関連抗体（一例として、ＣＤ４０に対する抗体）と組み合わせたＰＡＭ４抗体と併用して有用であることができる。Ｔｏｄｒｙｋら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４８：１３９−１４７（２００１）；Ｔｕｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６６：８９−９４（２００１）。オンコジーン（例えば、ｂｃｌ−２、Ｋｒａｓ、ｐ５３、ｃＭＥＴ）のマーカーもしくは産物に対する抗体、またはＶＥＧＦＲおよび胎盤様増殖因子（ＰｌＧＦ）などの、血管新生因子に対する抗体も有用である。
ＰＡＭ４抗原の異なるエピトープに結合する別のＰＡＭ４様抗体が利用可能であることは、臨床試料中のＰＡＭ４抗原を検出するために有用な、二重決定基酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の開発にとって重要である。ＥＬＩＳＡ実験は、実施例１および５に記載されている。
本明細書に記載されるマウスＰＡＭ４抗体、キメラＰＡＭ４抗体、ヒト化ＰＡＭ４抗体、および完全ヒトＰＡＭ４抗体、ならびにそれらの断片は、診断法および／または治療法に有用な抗膵癌抗体の例となるものである。以下の実施例では、ヒト化ＰＭＡ４抗体の構築および使用の好ましい実施形態が開示されている。非ヒトモノクローナル抗体はヒト宿主により外来タンパク質として認識され得るので、注射を繰り返すと、有害な過敏性反応が生じることがあるが、マウス抗体配列をヒト化することにより、患者が経験し得る有害免疫応答を減らすことができる。マウスに基づくモノクローナル抗体の場合、これは、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答と呼ばれることが多い。ヒト化抗膵癌抗体またはその断片のフレームワーク領域中のいくつかのヒト残基を、そのマウス対応物に置き換えることが好ましい。２つの異なるヒト抗体由来のフレームワーク配列の組合せをＶＨに用いることも好ましい。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインに由来している。
別の好ましい実施形態は、ヒトＰＡＭ４抗体などのヒト抗膵癌抗体である。ヒト抗体は、例えば、抗原刺激に応答して特異的なヒト抗体を産生するように「改変」されているトランスジェニックマウスから得られる抗体である。この技術では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントが、内在性重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含む胚性幹細胞株に由来するマウス系統に導入される。トランスジェニックマウスは、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを用いて、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６（１９９４）、およびＴａｙｌｏｒら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）によって記載されている。
完全ヒト抗体は、全て当該技術分野で公知である、遺伝子または染色体トランスフェクション法、およびファージディスプレイ技術により構築することもできる。例えば、免疫化されていないドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからのインビトロでのヒト抗体およびその断片の産生については、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージの主要外殻タンパク質遺伝子または非主要外殻タンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、機能的抗体断片としてファージ粒子の表面に提示される。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択により、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子を選択することにもなる。このように、ファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式で行なうことができ、参考のために、例えば、ＪｏｈｎｓｏｎおよびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。
抗体調製
特定の抗原に対するモノクローナル抗体は当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）、およびＣｏｌｉｇａｎら（編），ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，第１巻，２．５．１−２．６．７ページ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９１）（以下、「Ｃｏｌｉｇａｎ」）を参照されたい。簡潔に述べると、抗膵癌ＭＡｂは、ＰＡＭ４抗原などの、膵癌由来ムチンを含む組成物をマウスに注射し、血清試料を採取して抗体産生の存在を確認し、脾臓を摘出してＢリンパ球を取得し、このＢリンパ球と骨髄腫細胞を融合してハイブリドーマを産生させ、このハイブリドーマをクローニングし、ＰＡＭ４抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、ＰＡＭ４抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、ハイブリドーマ培養物から抗膵癌抗体を単離することにより得ることができる。
免疫原に対する最初の抗体惹起の後に、抗体の配列を決定し、その後、キメラ抗体またはヒト化抗体を産生するための組換え技術により、抗体を調製することができる。マウス抗体および抗体断片のキメラ化は当業者に周知である。キメラ化モノクローナル抗体に由来する抗体成分を使用することによって、マウス定常領域の免疫原性と関連する潜在的な問題が軽減される。
マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的な技術は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｏｒｌａｎｄｉらの刊行物，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３（１９８９）により記載されている。一般に、マウス抗体のＶＫ（可変軽鎖）配列とＶＨ（可変重鎖）配列は、ＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥ、およびｃＤＮＡライブラリスクリーニングなどの、種々の分子クローニング法によって得ることができる。具体的に、マウスＰＡＭ４ ＭＡｂのＶＨ配列とＶＫ配列は、ＲＴ−ＰＣＲでハイブリドーマ細胞からＰＣＲ増幅によりクローニングされ、それらの配列は、ＤＮＡシーケンシングにより決定された。それらが本物であることを確かめるために、クローニングしたＶＫ遺伝子とＶＨ遺伝子を、Ｏｒｌａｎｄｉら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６：３８３３，１９８９）によって記載されたように、キメラＡｂとして細胞培養で発現させることができる。
好ましい実施形態では、キメラ化ＰＡＭ４抗体または抗体断片は、マウスＰＡＭ４ ＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）とヒト抗体の軽鎖定常領域および重鎖定常領域とを含み、ここで、キメラ化ＰＡＭ４の軽鎖可変領域のＣＤＲは、ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＹ（配列番号１）というアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号２）というアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、およびＨＱＷＮＲＹＰＹＴ（配列番号３）というアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、キメラ化ＰＡＭ４ ＭＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲは、ＳＹＶＬＨ（配列番号４）というアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＱＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５）というアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、ＧＦＧＧＳＹＧＦＡＹ（配列番号６）というアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。キメラ化モノクローナル抗体に由来する抗体成分を使用することによって、マウス定常領域の免疫原性と関連する潜在的な問題が軽減される。
マウス抗体および抗体断片のヒト化も当業者に周知である。ヒト化ＭＡｂを産生するための技術は、例えば、Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２）、Ｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９２）、Ｍｏｕｎｔａｉｎら．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｅｎｇ Ｒｅｖ．１０：１（１９９２）、およびＣｏｌｉｇａｎ（１０．１９．１−１０．１９．１１ページ）によって開示されており、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス相補性決定領域をマウス免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖からヒト可変ドメインに移し、次いで、ヒト残基をマウス対応物のフレームワーク領域中に代わりに挿入することによって産生し得る。ヒト定常領域配列に加えて、ヒトフレームワーク領域配列を使用することによって、ＨＡＭＡ反応を誘導する機会をさらに減らすことができる。
上記のように得られた、ＰＡＭ４可変領域配列に基づいて、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｅｕｎｇら（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１４１３（１９９５））により記載されたように、ヒト化ＰＡＭ４抗体を設計および構築することができる。実施例１には、ｈＰＡＭ４ ＭＡｂの構築に使用されたヒト化のプロセスが記載されている。
ｈＰＡＭ４抗体を調製するために使用されるプライマーのヌクレオチド配列については、以下の実施例１で論じられている。好ましい実施形態では、ヒト化ＰＡＭ４抗体または抗体断片は、上で開示された軽鎖と重鎖のＣＤＲ配列（配列番号１〜配列番号６）を含む。ヒト化抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＦＲが、マウスＰＡＭ４ ＭＡｂの対応するＦＲから置換された少なくとも１つのアミノ酸を含むことも好ましい。
完全ヒト抗体、例えば、ヒトＰＡＭ４をヒト以外のトランスジェニック動物から得ることができる。例えば、Ｍｅｎｄｅｚら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）；米国特許第５，６３３，４２５号を参照されたい。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスからヒト抗体を回収することができる。マウス液性免疫系は、内在性免疫グロブリン遺伝子を不活化し、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによってヒト化される。ヒト免疫グロブリン遺伝子座は非常に複雑であり、合わせるとヒトゲノムのほぼ０．２％を占める多数の別個のセグメントを含む。トランスジェニックマウスが十分な抗体レパートリーを確実に産生できるようにするためには、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分をマウスゲノムに導入しなければならない。これは、生殖系列構成のヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座のいずれかを含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成から始まる段階的プロセスで達成される。各挿入物は約１Ｍｂのサイズなので、ＹＡＣ構築物は免疫グロブリン遺伝子座の重複断片の相同組換えを必要とする。一方は重鎖遺伝子座を含み、一方は軽鎖遺伝子座を含む２つのＹＡＣを、ＹＡＣ含有酵母スフェロプラストとマウス胚性幹細胞の融合を通じてマウスに別々に導入する。次いで、胚性幹細胞クローンをマウス胚盤胞にマイクロインジェクションする。得られたキメラの雄を、生殖系列からＹＡＣを伝達するその能力についてスクリーニングし、マウス抗体産生に欠損があるマウスと交配させる。一方はヒト重鎖遺伝子遺伝子座を含み、もう一方はヒト軽鎖遺伝子遺伝子座を含む２つのトランスジェニック系統を交配させ、免疫化に応答してヒト抗体を産生する子孫を作り出す。
抗体は、当該技術分野で公知の方法を用いて細胞培養技術により産生することができる。１つの例では、トランスフェクトーマ培養物を無血清培地に適合させる。ヒト化抗体の産生のために、ＨＳＦＭを用いてローラーボトル中５００ｍｌの培養物として細胞を増殖させることができる。培養物を遠心分離し、上清を０．２μｍのメンブレンに通して濾過する。濾過した培地をプロテインＡカラム（１×３ｃｍ）に流速１ｍｌ／分で通す。次いで、樹脂を約１０カラム容量のＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．５）を用いて、プロテインＡ結合抗体をカラムから溶出させる。１．０ｍｌ画分を、１０μｌの３Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．６）を含むチューブに回収し、２８０／２６０ｎｍの吸光度からタンパク質濃度を測定する。ピーク画分をプールし、ＰＢＳに対して透析し、例えば、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０フィルター（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて抗体を濃縮する。抗体濃度はＥＬＩＳＡで測定し、ＰＢＳを用いてその濃度を約１ｍｇ／ｍｌに調整する。試料にアジ化ナトリウム０．０１％（ｗ／ｖ）を防腐剤として加えると好都合である。
抗体は、種々の十分確立されている技術によりハイブリドーマ培養物から単離および精製することができる。このような単離技術としては、プロテインＡセファロースを用いる親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ（２．７．１−２．７．１２ページおよび２．９．１−２．９．３ページ）を参照されたい。ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，第１０巻，７９−１０４ページのＢａｉｎｅｓら，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（ＩｇＧ）」（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）も参照されたい。
抗膵癌ＭＡｂは、当業者に周知の種々の技術によって特徴解析することができる。例えば、抗体のＰＡＭ４抗原に対する結合能力は、間接的酵素免疫アッセイ、フローサイトメトリー解析、ＥＬＩＳＡ、またはウエスタンブロット解析を用いて確認することができる。
抗体断片
抗体断片は、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖなどの、抗体の抗原結合部分である。特定のエピトープを認識する抗体断片は、公知の技術により作製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体分子のペプシン消化により産生することができる。これらのおよびその他の方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号、ならびにそれらに含まれる参照文献により記載されている。また、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０（１９６０）、Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９（１９５９）、Ｅｄｅｌｍａｎら，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ 第１巻，４２２ページ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）、ならびにＣｏｌｉｇａｎ（２．８．１−２．８．１０ページおよび２．１０−２．１０．４および）も参照されたい。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’断片の迅速かつ容易な同定を可能にするために、Ｆａｂ’発現ライブラリーを構築することができる（Ｈｕｓｅら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７４−１２８１）。
単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、１つのＶＬドメインと１つのＶＨドメインを含む。このＶＬドメインとＶＨドメインは、標的結合部位を形成するように会合している。これら２つのドメインはさらに、ペプチドリンカー（Ｌ）によって共有結合している。ｓｃＦｖ分子は、ＶＬ−Ｌ−ＶＨ（ＶＬドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部である場合）、またはＶＨ−Ｌ−ＶＬ（ＶＨドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部である場合）のいずれかとして表される。ｓｃＦｖ分子の作製方法、および好適なペプチドリンカーの設計方法は、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｒ．ＲａａｇおよびＭ．Ｗｈｉｔｌｏｗ，「Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｆｖｓ．」 ＦＡＳＥＢ 第９巻：７３−８０（１９９５）、ならびにＲ．Ｅ．ＢｉｒｄおよびＢ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ，「Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ」，ＴＩＢＴＥＣＨ，第９巻：１３２−１３７（１９９１）に記載されている。
他の抗体断片、例えば、単ドメイン抗体断片は当該技術分野で公知であり、特許請求された構築物で使用し得る。単ドメイン抗体（ＶＨＨ）は、標準的な免疫化技術により、例えば、ラクダ、アルパカ、またはラマから得ることができる（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら，ＴＩＢＳ ２６：２３０−２３５，２００１；Ｙａｕら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８１：１６１−７５，２００３；Ｍａａｓｓら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２４：１３−２５，２００７参照）。ＶＨＨは、強力な抗原結合能を有し得、従来のＶＨ−ＶＬ対には接近不可能な新規のエピトープと相互作用することができる（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら，２００１）。アルパカ血清ＩｇＧは、ラクダ科重鎖のみのＩｇＧ抗体（ＨＣＡｂ）を約５０％含む（Ｍａａｓｓら，２００７）。アルパカをＴＮＦ−αなどの既知の抗原で免疫化することができ、標的抗原に結合しかつ標的抗原を中和するＶＨＨを単離することができる（Ｍａａｓｓら，２００７）。ほぼ全てのアルパカＶＨＨコード配列を増幅するＰＣＲプライマーが同定されており、これらのプライマーを用いて、アルパカＶＨＨファージディスプレイライブラリーを構築することができ、このライブラリーを当該技術分野で周知の標準的なバイオパニング技術による抗体断片単離に使用することができる（Ｍａａｓｓら，２００７）。
抗体断片は、全長抗体のタンパク質分解的加水分解によって、または断片をコードするＤＮＡの、大腸菌もしくは別の宿主内での発現によって調製することもできる。抗体断片は、常法により全長抗体のペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。例えば、抗体断片は、抗体をペプシンで酵素的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２と表される約１００Ｋｄの断片を得ることにより作製することができる。この断片を、チオール還元剤、および任意でジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基に対する遮断基を用いてさらに切断し、約５０ＫｄのＦａｂ’一価断片を生じさせることができる。あるいは、パパインを用いる酵素的切断によって、２つの一価Ｆａｂ断片と１つのＦｃ断片が直接的に生じる。
別の形態の抗体断片は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲは、抗体が結合するエピトープに構造上相補的であって、かつ可変領域の残りの部分よりも変化しやすい抗体の可変領域のセグメントである。したがって、ＣＤＲは超可変領域と呼ばれることもある。可変領域は３つのＣＤＲを含む。ＣＤＲペプチドは、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得ることができる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することにより調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６（１９９１）；Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆモノクローナル ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ」（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ、Ｒｉｔｔｅｒら（編），１６６−１７９ページ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５））；およびＷａｒｄら，「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ、Ｂｉｒｃｈら，（編），１３７−１８５ページ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５））を参照されたい。
重鎖を分離して一価の軽鎖−重鎖断片を形成し、さらに断片を切断するような他の抗体切断方法、または他の酵素学的、化学的、もしくは遺伝学的技術も、これらの断片が完全抗体により認識される抗原に結合する限り使用し得る。
抗体融合タンパク質
目的の抗膵癌抗体を含む融合タンパク質は、官能基間のグルタルアルデヒド結合からより特異的な結合までの種々の常法により調製することができる。本明細書に記載の融合タンパク質を含む抗体および／または抗体断片は、好ましくは、直接的に、あるいはリンカー部分を介して、あるいは抗体または断片上の１つまたは複数の官能基（例えば、アミン、カルボキシル、フェニル、チオール、もしくはヒドロキシル基）を介して、互いに共有結合している。グルタルアルデヒドの他、例えば、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、ビス（ヒドロキシスクシンイミド）エステル、カルボジイミド、マレイミドヒドロキシスクシンイミドエステルなどの様々な従来のリンカーを使用することができる。
融合タンパク質を作製する簡単な方法は、グルタルアルデヒドの存在下で抗体または断片を混合することである。最初のシッフ塩基結合は、例えば、第２級アミンへのホウ化水素還元により安定化させることができる。ジイソチオシアネートまたはカルボジイミドを、位置特異的でないリンカーとしてグルタルアルデヒドの代わりに使用することもできる。一実施形態では、抗体融合タンパク質は、抗膵癌ＭＡｂまたはその断片含み、このＭＡｂはＰＡＭ４抗原に結合する。この融合タンパク質およびその断片は膵癌細胞に優先的に結合する。この一価単一特異性ＭＡｂは抗原のダイレクト・ターゲッティングに有用であるが、このダイレクト・ターゲッティングでは、ＭＡｂが治療剤、診断剤、またはそれらの組合せに結合しており、このタンパク質が患者に直接投与される。
融合タンパク質は、代わりに、ＰＡＭ４抗原の異なるエピトープに結合する少なくとも２つの抗膵癌ＭＡｂまたはその断片を含み得る。例えば、ＭＡｂは、抗原特異的なダイアボディー、トリアボディー、およびテトラボディーを生じさせることができ、これらは多価であるが、ＰＡＭ４抗原に対して単一特異的である。２つ以上のｓｃＦｖ分子の非共有結合的会合によって、機能的なダイアボディー、トリアボディー、およびテトラボディーが形成され得る。単一特異性ダイアボディーは同じｓｃＦｖのホモ二量体であり、各ｓｃＦｖは、短いリンカーによって同じ抗体のＶＬドメインに連結されている、選択された抗体由来のＶＨドメインを含む。ダイアボディーは、２つのＦｖ結合部位を生じさせる、２つのｓｃＦｖの非共有結合的会合によって形成された二価の二量体である。トリアボディーは、３つの結合部位を生じさせる、３つのｓｃＦｖからなる三価の三量体の形成により生じ、テトラボディーは、４つの結合部位を生じさせる、４つのｓｃＦｖからなる四価の四量体である。いくつかの単一特異性ダイアボディーが、ＶＨ１−リンカー−ＶＬ１を含む組換え遺伝子構築物を含む発現ベクターを用いて作製されている。Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）；Ａｔｗｅｌｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３３：１３０１−１３０２（１９９６）；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：６３２−６３１（１９９７）；Ｈｅｌｆｒｉｃｈら，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７６：２３２−２３９（１９９８）；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７７：７６３−７７２（１９９８）；Ｈｏｌｉｇｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９：２９０９−２９１６（１９９９））を参照されたい。ｓｃＦｖを構築する方法は、米国特許第４，９４６，７７８号（１９９０）および米国特許第５，１３２，４０５号（１９９２）に開示されており、これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。ｓｃＦｖに基づく多価単一特異性抗体の作製方法は、米国特許第５，８３７，２４２号（１９９８）、米国特許第５，８４４，０９４号（１９９８）、およびＷＯ９８／４４００１号（１９９８）に開示されており、これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。多価単一特異性抗体融合タンパク質は、同じ抗原上または別の抗原上に存在し得る２つ以上の同種のエピトープに結合する。価数の増加により、さらなる相互作用、親和性の増強、および滞留時間の延長が可能になる。これらの抗体融合タンパク質をダイレクト・ターゲッティング系で使用することができるが、この系では、抗体融合タンパク質が治療剤、診断剤、またはそれらの組合せにコンジュゲートされており、それを必要とする患者に直接投与される。
好ましい実施形態は、ＰＡＭ４標的エピトープに対する親和性を有する１つまたは複数の抗原結合部位と、膵癌と関連する他のエピトープに対する１つまたは複数のさらなる結合部位とを含む多価多重特異性抗体またはその断片である。この融合タンパク質は、同じまたは異なる抗原上に存在し得る少なくとも２つの異なるエピトープに結合するので、多重特異性である。例えば、融合タンパク質は２つ以上の抗原結合部位を含んでいてもよく、第１の抗原結合部位はＰＡＭ４抗原エピトープに対する親和性を有し、第２の抗原結合部位はＴＡＧ−７２またはＣＥＡなどの別の標的抗原に対する親和性を有する。別の例は、ＣＡ１９．９ ＭＡｂ（またはその断片）およびＰＡＭ４ ＭＡｂ（またはその断片）を含み得る二重特異性抗体融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、ＣＡ１９．９およびＰＡＭ４に対する親和性を有する。抗体融合タンパク質およびその断片をダイレクト・ターゲッティング系で使用することができるが、この系では、抗体融合タンパク質が治療剤、診断剤、またはそれらの組合せにコンジュゲートされており、それを必要とする患者に直接投与される。
別の好ましい実施形態は、ＰＡＭ４標的エピトープに対する親和性を有する少なくとも１つの結合部位と、ハプテン分子に対する親和性を有する少なくとも１つのハプテン結合部位とを含む多価多重特異性抗体である。例えば、二重特異性融合タンパク質は、６７９ ＭＡｂ（またはその断片）およびＰＡＭ４ ＭＡｂ（またはその断片）を含み得る。モノクローナル６７９抗体は、トリペプチド部分のヒスタミンスクシニルグリシル（ＨＳＧ）を含む分子に高い親和性で結合する。このような二重特異性ＰＡＭ４抗体融合タンパク質は、例えば、上記のように、６７９からＦ（ａｂ’）２断片を得ることにより調製することができる。６７９ Ｆ（ａｂ’）２断片の鎖間ジスルフィド架橋を、軽鎖−重鎖結合が起こらないように注意しながらＤＴＴで穏やかに還元して、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を形成させる。このＳＨ基を過剰のビス−マレイミドリンカー（１，１’−（メチレンジ−４，１−フェニレン）ビス−マレイミド）で活性化させる。ＰＡＭ４ ＭＡｂをＦａｂ’−ＳＨに変換した後、活性化した６７９ Ｆａｂ’−ＳＨ断片と反応させて二重特異性抗体融合タンパク質を得る。この二重特異性抗体融合タンパク質のような二重特異性抗体融合タンパク質は、親和性増強系で使用することができるが、この系では、標的抗原が融合タンパク質でプレターゲッティングされ、次に、１つまたは複数のＨＳＧハプテンを含む担体部分（ターゲッティング可能な構築物）に結合した診断剤または治療剤でターゲッティングされる。代わりの好ましい実施形態では、ＴＦ１０などの、ＤＮＬベースのｈＰＡＭ４−６７９構築物を、以下の実施例に記載されるように調製し、使用してもよい。
二重特異性抗体は、種々の従来法、例えば、ジスルフィドを切断し、全ＩｇＧまたは好ましくはＦ（ａｂ’）２断片の混合物を再形成し、２つ以上のハイブリドーマを融合して２つ以上の特異性を有する抗体を産生するポリオーマを形成させることによって、および遺伝子改変によって作製することができる。二重特異性抗体融合タンパク質は、異なる抗体の還元的切断によって生じるＦａｂ’断片の酸化的切断によって調製されている。これは、２つの異なる抗体のペプシン消化によって生じた２つの異なるＦ（ａｂ’）２断片を混合し、還元的切断によりＦａｂ’断片の混合物を形成し、次いで、酸化によってジスルフィド結合を再形成して、もとのエピトープの各々に特異的なＦａｂ’部分を含む二重特異性抗体融合タンパク質を含むＦ（ａｂ’）２断片の混合物を産生することにより行なうのが有利である。抗体融合タンパク質の調製のための一般的技術は、例えば、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．９３：４７０（１９６１）、Ｈｍｍｅｒｌｉｎｇら，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１２８：１４６１（１９６８）、および米国特許第４，３３１，６４７号に見出し得る。
より選択性の高い結合は、マレイミドヒドロキシスクシンイミドエステルなどのヘテロ二官能性リンカーを用いることにより達成することができる。このエステルと抗体または断片との反応により、抗体または断片上のアミン基が誘導体化され、次にこの誘導体を、例えば、遊離スルフヒドリル基を有する抗体Ｆａｂ断片（または、例えば、トラウト試薬によりスルフヒドリル基がそれに付加されたより大きな断片または完全抗体）と反応させることができる。このようなリンカーは同じ抗体中の基を架橋する可能性が低く、結合の選択性を向上させる。
抗原結合部位から離れた部位で抗体または断片を連結するのが有利である。これは、例えば、上記のように、切断された鎖内スルフヒドリル基に連結することにより達成することができる。別の方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有する別の抗体と反応させることを含む。これにより最初のシッフ塩基結合が生じるが、これを、例えば、ホウ化水素還元によって第２級アミンへと還元することにより安定化し、最終的な複合体を形成させることが好ましい。このような部位特異的結合は、小分子については米国特許第４，６７１，９５８号に、より大きな付加物については米国特許第４，６９９，７８４号に開示されており、それらの各々の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。
１２アミノ酸残基長よりも長いリンカー（例えば、１５または１８残基のリンカー）を有するｓｃＦｖでは、同じ鎖上のＶＨドメインとＶＬドメイン間の相互作用が可能になり、通常、単量体、二量体（ダイアボディーと呼ばれる）、および少量のより質量の大きい多量体の混合物が形成される（Ｋｏｒｔｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９４）２２１：１５１−１５７）。しかしながら、５つ以下のアミノ酸残基のリンカーを有するｓｃＦｖでは、同じ鎖上のＶＨドメインとＶＬドメインの分子内対合は妨げられ、異なる鎖上のＶＨドメインとＶＬドメインの対合が強いられる。３〜１２残基のリンカーでは、主に二量体が形成される（Ａｔｗｅｌｌら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９９）１２：５９７−６０４）。０〜２残基のリンカーの場合、ｓｃＦｖの三量体（トリアボディーと呼ばれる）、四量体（テトラボディーと呼ばれる）、またはより高次のオリゴマー構造物が形成されるが、オリゴマー化の正確なパターンは、リンカーの長さの他、Ｖドメインの組成および向きに依存するように思われる。
つい最近では、ほとんど全ての所望の組合せで抗体、抗体断片、および／またはその他のエフェクター部分の混合物を構築するための新規の技術が、２００６年３月２４日に出願された米国特許出願第１１／３８９，３５８号（現在公開されている米国特許第７，５５０，１４３号）；２００６年３月２８日に出願された同第１１／３９１，５８４号（現在公開されている米国特許第７，５２１，０５６号）；２００６年６月２９日に出願された同第１１／４７８，０２１号（現在公開されている米国特許第７，５３４，８６６号）；２００６年１２月５日に出願された同第１１／６３３，７２９号（現在公開されている米国特許第７，５２７，７８７号）；および２００７年１０月２６日に出願された同第１１／９２５，４０８号に記載されており、これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。一般にドック・ロック（ＤＮＬ）として知られる技術は、二量体化・ドッキングドメイン（ＤＤＤ）配列およびアンカリングドメイン（ＡＤ）配列と呼ばれる２つの相補的ペプチド配列のうちの１つをそのＮ末端またはＣ末端に含む融合タンパク質の産生を含む。好ましい実施形態では、ＤＤＤ配列は、ｃＡＭＰ依存的タンパク質キナーゼの調節サブユニットに由来し、ＡＤ配列は、Ａキナーゼアンカリングタンパク質（ＡＫＡＰ）の配列に由来する。ＤＤＤ配列は、ＡＤ配列に結合する二量体を形成し、これにより、三量体、四量体、六量体、または任意の種々の他の複合体の形成が可能になる。抗体または抗体断片などのエフェクター部分をＤＤＤ配列およびＡＤ配列に付加することによって、抗体または抗体断片の任意の選択された組合せの複合体を形成し得る。ＤＮＬ複合体は、ジスルフィド結合またはその他の結合の形成により共有結合的に安定化し得る。
任意の公知の抗ＴＡＡ抗体の抗原結合可変領域配列を含む二重特異性抗体を使用してもよく、抗ＴＡＡ抗体としては、ｈＰＡＭ４（米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ３１（米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（米国特許第７，０７４，４０３号）、ｈＭｕ−９（米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（米国特許出願第１１，３６８，２９６号）、ｈＭＮ−１４（米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＲＳ７（米国特許第７，２３８，７８５号）、ｈＭＮ−３（米国特許出願第１０，６７２，２７８号）、およびｈＲ１（２００９年１月２０日に出願された米国仮特許出願第６１，１４５，８９６号）が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、引用された特許または特許出願の各々の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。
有用な他の抗体は、多種多様な公知の供給源から市販で入手し得る。例えば、種々の抗体を分泌するハイブリドーマ株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能である。腫瘍関連抗原を含むが、これに限定されない、様々な疾患標的に対する多数の抗体が、ＡＴＣＣに寄託されており、かつ／またはこれらの抗体は、可変領域配列が公表されており、特許請求された方法および組成物で使用するために利用可能である。例えば、米国特許第７，３１２，３１８号；同第７，２８２，５６７号；同第７，１５１，１６４号；同第７，０７４，４０３号；同第７，０６０，８０２号；同第７，０５６，５０９号；同第７，０４９，０６０号；同第７，０４５，１３２号；同第７，０４１，８０３号；同第７，０４１，８０２号；同第７，０４１，２９３号；同第７，０３８，０１８号；同第７，０３７，４９８号；同第７，０１２，１３３号；同第７，００１，５９８号；同第６，９９８，４６８号；同第６，９９４，９７６号；同第６，９９４，８５２号；同第６，９８９，２４１号；同第６，９７４，８６３号；同第６，９６５，０１８号；同第６，９６４，８５４号；同第６，９６２，９８１号；同第６，９６２，８１３号；同第６，９５６，１０７号；同第６，９５１，９２４号；同第６，９４９，２４４号；同第６，９４６，１２９号；同第６，９４３，０２０号；同第６，９３９，５４７号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，６４５号；同第６，９２１，５３３号；同第６，９１９，４３３号；同第６，９１９，０７８号；同第６，９１６，４７５号；同第６，９０５，６８１号；同第６，８９９，８７９号；同第６，８９３，６２５号；同第６，８８７，４６８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，８８４，５９４号；同第６，８８１，４０５号；同第６，８７８，８１２号；同第６，８７５，５８０号；同第６，８７２，５６８号；同第６，８６７，００６号；同第６，８６４，０６２号；同第６，８６１，５１１号；同第６，８６１，２２７号；同第６，８６１，２２６号；同第６，８３８，２８２号；同第６，８３５，５４９号；同第６，８３５，３７０号；同第６，８２４，７８０号；同第６，８２４，７７８号；同第６，８１２，２０６号；同第６，７９３，９２４号；同第６，７８３，７５８号；同第６，７７０，４５０号；同第６，７６７，７１１号；同第６，７６４，６８８号；同第６，７６４，６８１号；同第６，７６４，６７９号；同第６，７４３，８９８号；同第６，７３３，９８１号；同第６，７３０，３０７号；同第６，７２０，１５号；同第６，７１６，９６６号；同第６，７０９，６５３号；同第６，６９３，１７６号；同第６，６９２，９０８号；同第６，６８９，６０７号；同第６，６８９，３６２号；同第６，６８９，３５５号；同第６，６８２，７３７号；同第６，６８２，７３６号；同第６，６８２，７３４号；同第６，６７３，３４４号；同第６，６５３，１０４号；同第６，６５２，８５２号；同第６，６３５，４８２号；同第６，６３０，１４４号；同第６，６１０，８３３号；同第６，６１０，２９４号；同第６，６０５，４４１号；同第６，６０５，２７９号；同第６，５９６，８５２号；同第６，５９２，８６８号；同第６，５７６，７４５号；同第６，５７２；８５６号；同第６，５６６，０７６号；同第６，５６２，６１８号；同第６，５４５，１３０号；同第６，５４４，７４９号；同第６，５３４，０５８号；同第６，５２８，６２５号；同第６，５２８，２６９号；同第６，５２１，２２７号；同第６，５１８，４０４号；同第６，５１１，６６５号；同第６，４９１，９１５号；同第６，４８８，９３０号；同第６，４８２，５９８号；同第６，４８２，４０８号；同第６，４７９，２４７号；同第６，４６８，５３１号；同第６，４６８，５２９号；同第６，４６５，１７３号；同第６，４６１，８２３号；同第６，４５８，３５６号；同第６，４５５，０４４号；同第６，４５５，０４０， ６，４５１，３１０号；同第６，４４４，２０６’ ６，４４１，１４３号；同第６，４３２，４０４号；同第６，４３２，４０２号；同第６，４１９，９２８号；同第６，４１３，７２６号；同第６，４０６，６９４号；同第６，４０３，７７０号；同第６，４０３，０９１号；同第６，３９５，２７６号；同第６，３９５，２７４号；同第６，３８７，３５０号；同第６，３８３，７５９号；同第６，３８３，４８４号；同第６，３７６，６５４号；同第６，３７２，２１５号；同第６，３５９，１２６号；同第６，３５５，４８１号；同第６，３５５，４４４号；同第６，３５５，２４５号；同第６，３５５，２４４号；同第６，３４６，２４６号；同第６，３４４，１９８号；同第６，３４０，５７１号；同第６，３４０，４５９号；同第６，３３１，１７５号；同第６，３０６，３９３号；同第６，２５４，８６８号；同第６，１８７，２８７号；同第６，１８３，７４４号；同第６，１２９，９１４号；同第６，１２０，７６７号；同第６，０９６，２８９号；同第６，０７７，４９９号；同第５，９２２，３０２号；同第５，８７４，５４０号；同第５，８１４，４４０号；同第５，７９８，２２９号；同第５，７８９，５５４号；同第５，７７６，４５６号；同第５，７３６，１１９号；同第５，７１６，５９５号；同第５，６７７，１３６号；同第５，５８７，４５９号；同第５，４４３，９５３号、同第５，５２５，３３８号を参照されたく、これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。これらは例に過ぎず、多種多様な他の抗体およびそのハイブリドーマが当該技術分野で公知である。当業者であれば、目的の選択された疾患関連標的に対する抗体を求めて単にＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ、および／またはＵＳＰＴＯのデータベースを探索することによって、ほぼ全ての疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマを入手し得ることを理解するであろう。当該技術分野で周知の標準的な技術を用いて、クローニングした抗体の抗原結合ドメインを増幅し、切り出し、発現ベクターに連結し、適合した宿主細胞にトランスフェクトし、タンパク質産生に使用し得る。
プレターゲッティング
二重特異性抗体または多重特異性抗体をプレターゲッティング技術で使用し得る。プレターゲッティングは、元々、骨髄などの正常組織に対する望ましくない毒性の一因となる直接的なターゲッティング抗体の血中クリアランスの遅さを解決するために開発された多段階プロセスである。プレターゲッティングでは、放射性核種またはその他の治療剤を、血液から数分以内にクリアランスされる小さい送達分子（ターゲッティング可能な構築物またはターゲッティング可能なコンジュゲート）に付加する。ターゲッティング可能な構築物および標的抗原に対する結合部位を有する、プレターゲッティング二重特異的抗体または多重特異的抗体をまず投与し、遊離抗体を血中からクリアランスさせ、その後、ターゲッティング可能な構築物を投与する。
プレターゲッティング法は、例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎら，米国特許第４，８６３，７１３号；Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：２２６，１９８８；Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２８：１２９４，１９８７；Ｏｅｈｒら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：７２８，１９８８；Ｋｌｉｂａｎｏｖら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２９：１９５１，１９８８；Ｓｉｎｉｔｓｙｎら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３０：６６，１９８９；Ｋａｌｏｆｏｎｏｓら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３１：１７９１，１９９０；Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４８：１６７，１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：５９６０，１９９１；Ｐａｇａｎｅｌｌｉら，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２：２１１，１９９１；米国特許第５，２５６，３９５号；Ｓｔｉｃｋｎｅｙら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：６６５０，１９９１；Ｙｕａｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：３１１９，１９９１；米国特許第６，０７７，４９９号；米国特許出願第０９／５９７，５８０号；米国特許出願第１０／３６１，０２６号；米国特許出願第０９／３３７，７５６号；米国特許出願第０９／８２３，７４６号；米国特許出願第１０／１１６，１１６号；米国特許出願第０９／３８２，１８６号；米国特許出願第１０／１５０，６５４号；米国特許第６，０９０，３８１号；米国特許第６，４７２，５１１号；米国特許出願第１０／１１４，３１５号；米国仮特許出願第６０／３８６，４１１号；米国仮特許出願第６０／３４５，６４１号；米国仮特許出願第６０／３３２８，８３５号；米国仮特許出願第６０／４２６，３７９号；米国特許出願第０９／８２３，７４６号；米国特許出願第０９／３３７，７５６号；米国仮特許出願第６０／３４２，１０３号；および米国特許第６，９６２，７０２号に開示されているように、当該技術分野で周知である。
対象の疾患または障害を治療または診断するプレターゲッティング法は、（１）対象に二重特異性抗体または抗原結合抗体断片を投与し、（２）必要に応じて、対象にクリアリング組成物を投与し、この組成物に血中から抗体をクリアランスさせ、（３）対象に１つまたは複数のキレート化されたもしくは化学的に結合された治療剤または診断剤を含むターゲッティング可能な構築物を投与することにより、提供され得る。この技術は、ターゲッティング可能な構築物にコンジュゲートした酵素を投与し、次いで、この酵素によって活性形態に変換されるプロドラッグを投与することにより、抗体依存的酵素プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）に利用し得る。
発現ベクターおよび宿主細胞
発現ベクターは、宿主細胞内で発現される遺伝子を含むＤＮＡ分子である。通常、遺伝子発現は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーをはじめとする、特定の調節エレメントの制御下に置かれる。このような遺伝子は、調節エレメントに「機能的に連結されている」と言われる。プロモーターは構造遺伝子の転写を指令するＤＮＡ配列である。構造遺伝子はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へと転写されるＤＮＡ配列であり、メッセンジャーＲＮＡは、その後、ペプチドまたはタンパク質へと翻訳される。プロモーターが誘導性プロモーターの場合、誘導因子に応答して転写の割合が増加する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターの場合、転写の割合は誘導因子によって調節を受けない。エンハンサーは、転写の開始部位に対するエンハンサーの距離または向きとは無関係に、転写効率を高めることができるＤＮＡ調節エレメントである。
単離されたＤＮＡ分子は、細胞または生物の染色体ＤＮＡに組み込まれていないＤＮＡの断片である。好ましい実施形態では、発現されるＤＮＡ配列は、発現ベクターにパッケージングされ、宿主細胞にトランスフェクトされるが、宿主細胞内では、宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれることが好ましい。例えば、より短いオリゴヌクレオチドの化学合成およびタンパク質コード配列へのアセンブリよる任意の選択された配列の核酸の構築方法が当該技術分野で周知である。あるいは、制限エンドヌクレアーゼを用いて目的のＤＮＡ配列を切断し、つなぎ合わせて、選択されたタンパク質コード配列を作製してもよい。部位特異的突然変異導入などの、コードされたタンパク質配列中に特定の変化を生じさせるための他の技術も周知である。
クローニングベクターは、プラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどの、宿主細胞で自律的に複製する能力を有するＤＮＡ分子である。クローニングベクターは、典型的には、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、この部位に、ベクターの本質的な生物学的機能を失わせずに決定可能な様式で外来ＤＮＡ配列、ならびにクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択で使用するのに好適なマーカー遺伝子を挿入することができる。マーカー遺伝子は、典型的には、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、またはその他の抗生物質に対する耐性を与える遺伝子を含む。組換え宿主は、クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれかを含む任意の原核細胞または真核細胞であってもよい。この用語は、宿主細胞の染色体またはゲノム中にクローニングされた遺伝子を含むように遺伝子改変された、原核細胞または真核細胞も含む。
好適な宿主細胞としては、微生物または哺乳動物の宿主細胞が挙げられる。好ましい宿主は、ＭＡｂおよびその他の融合タンパク質の産生用に開発されたヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６である。したがって、好ましい実施形態は、抗膵癌ＭＡｂ、コンジュゲート、融合タンパク質またはそれらの断片をコードするＤＮＡ配列を含む宿主細胞である。ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＷＯ９７／００３２６号）は、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下にＡｄ血清型５（Ａｄ５）Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂコード配列（Ａｄ５ヌクレオチド４５９〜３５１０）を含むプラスミドを用いた、初代ヒト胎児網膜細胞のトランスフェクションにより作製された。
ＳＰ２／０細胞、およびＮＳ０細胞などの骨髄腫細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ハイブリドーマ細胞株、および抗体発現に有用な他の哺乳動物宿主細胞をはじめとする、他の哺乳動物宿主細胞を使用してもよい。２００５年７月２５日に出願された米国特許出願第１１／１８７，８６３号（現在公開されている米国特許第７，５３１，３２７号）； ２００６年７月１４日に出願された米国特許出願第 １１／４８７，２１５号（現在公開されている米国特許第７，５３７，９３０号）；および２００７年１０月２４日に出願された米国特許出願第１１／８７７，７２８号（これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、Ｂｃｌ−ＥＥＥ遺伝子などのアポトーシス阻害因子をトランスフェクトされ、かつ無血清条件で増殖し、さらにトランスフェクトするのに適しているＳＰ２／０細胞も、ｍＡｂおよび他の融合タンパク質の発現に特に有用である。場合によって、発現されるアポトーシス阻害因子および／または構造遺伝子は、宿主細胞を適切な濃度のメトトレキセートに曝露させることによって増幅し得る。Ｂｃｌ−ＥＥＥをトランスフェクトされ、 無血清培地中で増殖するように馴化したＳＰ２／０細胞は、培養寿命が長くなり、細胞密度がより高く、かつタンパク質産生率が顕著により高いことが報告されている（米国特許第７，５３１，３２７号；米国特許第７，５３７，９３０号）；２００７年１０月２４日に出願された米国特許出願第１１／８７７，７２８号）。
治療および診断への抗体使用
特定の実施形態は、対象の悪性腫瘍を診断または治療する方法であって、対象に抗膵癌ＭＡｂ、融合タンパク質、またはそれらの断片を投与することを含む方法に関するものであり、ここで、このＭＡｂ、融合タンパク質、または断片は、少なくとも１つの診断剤および／または治療剤に結合している。また、癌を診断または治療する方法であって、対象にＰＡＭ４抗原に対する１つまたは複数の抗原結合部位と１つまたは複数のハプテン結合部位とを含む多価多重特異性抗体またはその断片を投与すること、結合していない抗体が対象の血流からクリアランスされるのに十分な時間待つこと、ならびにその後、対象に、局在化した抗体のハプテン結合部位に結合する、診断剤、治療剤、またはそれらの組合せを含む担体分子を投与することを含む方法も好ましい。より好ましい実施形態では、癌は非内分泌膵癌である。
インビトロ診断にＭＡｂを使用することは周知である。例えば、Ｃａｒｌｓｓｏｎら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７（６）：５６７（１９８９）を参照されたい。例えば、ＭＡｂは、生検試料由来の組織における腫瘍関連抗原の存在を検出するために使用することができる。ＭＡｂは、放射性免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、および蛍光免疫アッセイなどの技術を用いて、臨床体液試料中の腫瘍関連抗原の量を測定するためにも使用できる。
腫瘍標的化ＭＡｂと毒素のコンジュゲートは、インビボで癌細胞を選択的に死滅させるために使用することができる（Ｓｐａｌｄｉｎｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９（８）：７０１（１９９１）；Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １（１）：６４（１９９４））。例えば、実験動物モデルにおける治療研究により、細胞傷害性放射性核種を有する抗体の抗腫瘍活性が示されている（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４１：４３５４（１９８１）、Ｃｈｅｕｎｇら，Ｊ．Ｎａｔ’ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．７７：７３９（１９８６）、およびＳｅｎｅｋｏｗｉｔｓｃｈら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３０：５３１（１９８９））。好ましい実施形態では、コンジュゲートは、９０Ｙ標識ｈＰＡＭ４抗体を含む。コンジュゲートは、任意で１つまたは複数の他の治療剤とともに投与されてもよい。好ましい実施形態では、９０Ｙ標識ｈＰＡＭ４は、ゲムシタビンまたは５−フルオロウラシルとともに膵癌患者に投与される。さらに好ましい実施形態では、９０Ｙは、ｈＰＡＭ４に付加されるＤＯＴＡキレート剤にコンジュゲートされる。またさらに好ましい実施形態では、より少なく、より毒性の低い反復用量のゲムシタビンをより少ない、分割用量の９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ｈＰＡＭ４と組み合わせるように、９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ｈＰＡＭ４を、治療周期を含む分割用量で、ゲムシタビンと組み合わせる。
認容性である場合、この分割用量スケジュールの反復周期が示される。一例として、ゲムシタビン２００ｍｇ／ｍ２の４週投与を、９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ｈＰＡＭ４ ８ｍｇ／ｍ２の３週投与と組み合わせ、後者をゲムシタビン投与の２週目に開始する。これで１回の治療周期が構成される。両方の薬剤の骨髄抑制効果は累積的であり得るので、各成分がより多いかまたはより少ない、さらに他の用量で、分割用量が構成されてもよく、これは、造血毒性を評価する従来の手段で決定される。このような治療介入に習熟した医師ならば、骨髄抑制性治療剤への事前曝露を含む多くの要因に基づく患者の骨髄の状態や全身の健康状態を根拠にしてこれらの用量を調整することができる。これらの原則は、放射性標識ｈＰＡＭ４と、５−フルオロウラシルやシスプラチンなどの放射線増感薬をはじめとする他の治療剤との組合せにも適用することができる。
キメラ抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体ならびにそれらの断片は、インビボでの治療法および診断法に使用されている。したがって、診断剤もしくは治療剤、またはそれらの組合せを標的に送達する方法であって、（ｉ）少なくとも１つの診断剤および／または治療剤にコンジュゲートされたキメラＰＡＭ４抗体、ヒト化ＰＡＭ４抗体、またはヒトＰＡＭ４抗体などの、抗膵癌抗体またはその断片を含む組成物を準備すること、ならびに（ｉｉ）その診断用または治療用の抗体コンジュゲートを対象に投与することを含む方法が企図される。好ましい実施形態では、抗膵癌抗体およびその断片は、ヒト化されているかまたは完全ヒト型である。
また、例えば、少なくとも１つの診断剤または少なくとも１つの治療剤に結合した、キメラＰＡＭ４ ＭＡｂ、ヒト化ＰＡＭ４ ＭＡｂ、もしくはヒトＰＡＭ４ ＭＡｂまたはそれらの断片を含む、癌細胞を標的とする診断用または治療用のコンジュゲートも本明細書に記載されている。好ましくは、診断用コンジュゲートは、光活性診断剤、超音波検出剤、ＭＲＩ造影剤、または１８Ｆもしくは６８ＧａなどのＰＥＴ放射性核種である。さらに好ましくは、診断剤は、２０〜４，０００ｋｅＶのエネルギーを有する放射性核種である。
別の実施形態は、悪性腫瘍を治療する方法であって、ＰＡＭ４抗体などの、裸の抗膵癌抗体、抗体断片、または融合タンパク質を、単独でまたは１つもしくは複数の他の治療剤とともに投与することを含む方法に関する。他の治療剤は、抗体の前に、抗体と同時に、または抗体の後に加えてもよい。好ましい実施形態では、治療剤はゲムシタビンであり、より好ましい実施形態では、ゲムシタビンは、週１回６週間投与される従来の８００〜１，０００ｍｇ／ｍ２用量のゲムシタビンよりも少ない用量で、分割投与スケジュールでｈＰＡＭ４放射性コンジュゲートとともに投与される。例えば、分割治療用量の９０Ｙ−ＰＡＭ４と組み合わせる場合、放射線増感剤として作用することが意図される反復分割用量のゲムシタビン２００〜３８０ｍｇ／ｍ２が注入される。当業者であれば、本明細書に記載され、特許請求された抗体、融合タンパク質、および／またはそれらの断片を、熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）を含むが、これに限定されない、任意の公知のまたは記載された治療剤とともに投与し得ることを理解するであろう。
治療用組成物は、少なくとも１つのヒト化抗膵癌抗体もしくは完全ヒト抗膵癌抗体またはそれらの断片を、単独でかつコンジュゲートさせずにか、他のヒト化抗体もしくはキメラ抗体、ヒト抗体などの、他の抗体もしくはその断片、治療剤、または免疫調節物質とコンジュゲートさせてか、あるいはこれらとコンジュゲートさせずに組み合わせてかのいずれかで含む。また、同じまたは異なるエピトープもしくは抗原に対する裸のまたはコンジュゲートされた抗体を、１つまたは複数の抗膵癌抗体もしくはその断片と組み合わせてもよい。
したがって、本発明は、融合タンパク質およびその断片を含む、抗膵癌抗体およびその断片を、裸の抗体または抗体断片として、単独で投与すること、または集学的療法として投与することを企図している。好ましくは、抗体は、ヒト化ＰＡＭ４抗体もしくは完全ヒトＰＡＭ４抗体またはそれらの断片である。集学的療法は、他の抗体を裸の抗体、融合タンパク質の形態で、または免疫コンジュゲートとして投与することを伴う、裸の抗膵癌抗体による免疫療法をさらに含む。例えば、ヒト化ＰＡＭ４抗体または完全ヒトＰＡＭ４抗体を、別の裸の抗体、あるいは同位体、１つもしくは複数の化学療法剤、サイトカイン、毒素、またはそれらの組合せとコンジュゲートされたヒト化ＰＡＭ４抗体またはその他の抗体と組み合わせてもよい。例えば、本発明は、ＣＡ１９．９、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｎｄ２、Ｂ７２．３、ＣＣ４９、抗Ｌｅａ抗体、他のルイス抗原（例えば、Ｌｅ（ｙ））に対する抗体、ならびに癌胎児性抗原（ＣＥＡまたはＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、結腸特異的抗原ｐ（ＣＳＡｐ）、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＭＵＣ−５ａｃ、ＭＵＣ−１６、ＭＵＣ−１７、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ７４、ＣＤ１３８、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、血管新生因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）、テネイシン、血小板由来増殖因子、およびＩＬ−６に対する抗体、ならびにオンコジーン産物（例えば、ｂｃｌ−２、Ｋｒａｓ、ｐ５３）、ｃＭＥＴに対する抗体、ならびに腫瘍壊死物質に対する抗体などの他の膵腫瘍関連抗体の前に、これらと組み合わせて、またはこれらの後に、裸のまたはコンジュゲートされたＰＡＭ４抗体またはその断片を処置することを企図している。これらの固形腫瘍抗体は裸であってもよいし、または特に、薬物、毒素、同位体、放射性核種、もしくは免疫調節物質とコンジュゲートされていてもよい。多くの異なる抗体の組合せを、裸の形態かまたはコンジュゲートされた形態のいずれかで構築し、使用してもよい。あるいは、異なる裸の抗体の組合せを、連続的に、同時に、または順次に投与される、細胞傷害剤などの他の治療剤、または放射線と組み合わせて投与するために利用してもよい。
本明細書に記載の抗体はＰＡＭ４陽性腫瘍を直接ターゲッティングする。抗体は、膵癌または他の癌抗原に選択的に結合し、分子上の結合部位の数が増すにつれ、標的細胞に対する親和性が増し、所望の場所での滞留時間の延長が見られる。さらに、抗原に結合しない分子は身体から速やかにクリアランスされ、正常組織の曝露が最小限に抑えられる。多重特異性抗体の使用はＡＥＳ系でのものであり、この系では、その後の診断剤または治療剤の特異的送達のために、抗ＰＡＭ４抗体が陽性腫瘍をプレターゲッティングする。薬剤は、ヒスタミンスクシニルグリシル（ＨＳＧ）含有ペプチドによって運ばれ得る。６７９と呼ばれるマウスモノクローナル抗体は、トリペプチドＨＳＧハプテンを含む分子に高い親和性で結合し（Ｍｏｒｅｌら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２７，９９５−１０００，１９９０）、ｈＰＡＭ４との二重特異性抗体を形成させるために使用し得る。しかし、ヒト化型の６７９の使用が一層より好ましい。また、Ｉｎ−ＤＴＰＡまたはＮＯＴＡなどの、代わりとなるハプテンを利用してもよい。二重特異性抗体は標的とされる抗原に選択的に結合し、親和性の増大や所望の場所での滞留時間の延長を可能にする。さらに、抗原に結合しない抗体は身体から速やかにクリアランスされ、正常組織の曝露が最小限に抑えられる。ＰＡＭ４抗体および他の膵癌に対する抗体は、哺乳動物の癌の診断および／または治療に使用することができる。診断には、公知の技術を用いて、結合した標識抗体または断片を検出する工程がさらに必要となる。
この用途に関して、「診断」または「検出」という用語は、互換的に使用されることができる。通常、診断が組織の特定の組織学的状態を規定することを指すのに対し、検出は、特定の抗原を含む組織、病変、または生物を認識および限局化するものである。
抗体およびその断片の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜腔内、髄腔内への注射、局所的カテーテルによる灌流、または直接的な病巣内への注射により行なうことができる。抗体を注射により投与する場合、投与は、連続注入によるもの、または単回もしくは複数回のボーラス注射によるものであってもよい。
裸の抗体による療法
裸の抗膵癌抗体およびその断片の効力は、これらの裸の抗体を、同時にまたは順次にまたは所定の投与計画に従って投与される、1つまたは複数の他の裸の抗体、あるいは薬物、毒素、免疫調節物質、ホルモン、オリゴヌクレオチド、ホルモン拮抗薬、酵素、酵素阻害剤、治療用放射性核種、血管新生阻害剤などをはじめとする、1つまたは複数の治療剤とコンジュゲートされた1つまたは複数の免疫コンジュゲートで補うことによって増強することができる。あるいは、裸の抗体は、他の抗体に付加されていない治療剤とともに投与されてもよい。裸の抗膵癌抗体を補うために使用し得る抗体は、同じ癌細胞に対して向けられたものであってもよいし、または選択された裸の抗体の抗腫瘍効果を増強するために動員することができる免疫調節細胞（例えば、ＣＤ４０＋細胞）に対して向けられたものであってもよい。
免疫コンジュゲート、治療剤、および診断剤
抗膵癌抗体およびその断片は、治療または診断用の少なくとも１つの治療剤および／または診断剤にコンジュゲートされていてもよい。免疫療法の場合、その目的は、非標的組織への曝露を最小限に抑えて、細胞傷害用量の放射能、毒素、抗体、および／または薬物を標的細胞に送達することである。好ましくは、抗膵癌抗体は、膵腫瘍を診断および／または治療するために使用される。
抗体、抗体断片、または融合タンパク質はどれも、当該技術分野で公知の種々の技術を用いて、１つまたは複数の治療剤または診断剤とコンジュゲートすることができる。１つまたは複数の治療剤または診断剤を、各々の抗体、抗体断片、または融合タンパク質に結合させてもよい。Ｆｃ領域が存在しない場合（特定の抗体断片の場合）、治療剤または診断剤を付加し得る抗体または抗体断片のいずれかの軽鎖可変領域に炭水化物部分を導入することが可能である。例えば、Ｌｅｕｎｇら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９１９（１９９５）、Ｈａｎｓｅｎら，米国特許第５，４４３，９５３号（１９９５）、Ｌｅｕｎｇら，米国特許第６，２５４，８６８号を参照されたく、各々の特許の実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。
抗体の炭水化物部分を介して抗体成分にペプチドをコンジュゲートする方法は当業者に周知である。例えば、Ｓｈｉｈら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４１：８３２（１９８８）；Ｓｈｉｈら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：１１０１（１９９０）；およびＳｈｉｈら，米国特許第５，０５７，３１３号を参照されたく、これらの実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。一般的な方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有し、かつペプチドまたは薬物などの、複数の治療剤が付加された担体ポリマーと反応させることを含む。この反応により、最初のシッフ塩基（イミン）結合が生じ、この結合は、第２級アミンへの還元によって安定化され、最終的なコンジュゲートを形成することができる。
抗体融合タンパク質または多重特異性抗体は２つ以上の抗体またはその断片を含み、その各々は、少なくとも１つの治療剤および／または診断剤に付加されていてもよい。したがって、抗体融合タンパク質の1つまたは複数の抗体またはその断片は、付加された２つ以上の治療剤および／または診断剤を有することができる。さらに、これらの治療剤は同じである必要はなく、異なる治療剤であることができ、例えば、薬物や放射性同位体を同じ融合タンパク質に付加することができる。特に、ＩｇＧを１３１Ｉで放射性標識し、薬物に付加することができる。１３１ＩはＩｇＧのチロシンに取り込ませることができ、薬物はＩｇＧリジンのイプシロンアミノ基に付加することができる。治療剤と診断剤は両方とも、還元されたＳＨ基、および抗体の炭水化物側鎖に付加することもできる。あるいは、二重特異性抗体は、疾患抗原に対する１つの抗体またはその断片と、上で論じられたようなプレターゲッティング技術で使用されるターゲッティング可能な構築物に付加されたハプテンに対する別の抗体またはその断片とを含んでいてもよい。
多種多様な診断試薬および治療試薬、例えば、薬物、毒素、オリゴヌクレオチド、免疫調節物質、ホルモン、ホルモン拮抗薬、酵素、酵素阻害剤、放射性核種、血管新生阻害剤などを同時投与もしくは順次投与することができ、または有利には本発明の抗体にコンジュゲートさせることができる。本明細書に列挙した治療剤は、上記のような裸の抗体とは別に投与しても有用な薬剤である。治療剤としては、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、ゲムシタビン、エピドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、ＳＮ−３８、ＣＯＸ−２阻害剤、抗有糸分裂剤、抗血管新生剤、およびアポトーシス剤、特にドキソルビシン、メトトレキセート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン、プロテオソーム阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ならびにこれらのおよびその他の種類の抗癌剤由来の他のものなどのような化学療法薬が挙げられる。同時投与もしくは順次投与のために、または免疫コンジュゲートおよび抗体融合タンパク質の調製のために有用な他の癌化学療法薬としては、窒素マスタード、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ＣＯＸ−２阻害剤、代謝拮抗薬、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、ｍＴＯＲ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、プロテオソーム阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、カンプトテシン、ホルモンなどが挙げられる。好適な化学療法剤は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１９版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９９５）、およびＧＯＯＤＭＡＮおよびＧＩＬＭＡＮ’Ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥ ＲＡＰＥＵＴＩＣＳ、第７版（Ｍａｃ Ｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９８５）、ならびにこれらの刊行物の改訂版に記載されている。実験薬などの、他の好適な化学療法剤は当業者に公知である。
好ましい実施形態では、カンプトテシンおよび関連化合物（例えば、ＳＮ−３８）のコンジュゲートを、ｈＰＡＭ４または例えば、２００８年２月６日に出願された米国特許出願第１２／０２６，８１１号；および２００６年３月２３日に出願された米国特許出願第１１／３８８，０３２号（これらの実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているような他の抗膵癌抗体にコンジュゲートさせてもよい。
別の好ましい実施形態では、ｈＰＡＭ４抗体をゲムシタビンにコンジュゲートさせる。別の実施形態では、ゲムシタビンを、裸のまたはコンジュゲートされたキメラＰＡＭ４抗体、ヒト化ＰＡＭ４抗体、またはヒトＰＡＭ４抗体の前、後、またはこれらと同時に投与する。好ましくは、コンジュゲートされたｈＰＡＭ４抗体または抗体断片を放射性核種にコンジュゲートさせる。
毒素は、動物、植物、または微生物起原のものであることができる。シュードモナス外毒素などの毒素はまた、抗膵癌抗体およびｈＰＡＭ４抗体の免疫コンジュゲートの治療剤部分と複合体化されてもよく、またはこのような治療剤部分を形成してもよい。このようなコンジュゲートまたは他の融合タンパク質の調製に好適に利用される他の毒素としては、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌腸毒素−Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素が挙げられる。例えば、Ｐａｓｔａｎら，Ｃｅｌｌ ４７：６４１（１９８６）、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ−−Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ ４４：４３（１９９４）、ＳｈａｒｋｅｙおよびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，ＣＡ−−Ａ Ｃａｎｃｅｒ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ ５６：２２６（２００６）を参照されたい。使用に好適なさらなる毒素は当業者に公知であり、米国特許第６，０７７，４９９号に開示されており、この実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。
サイトカインなどの免疫調節物質はまた、免疫コンジュゲートの治療剤部分にコンジュゲートされてもよく、もしくはこのような治療剤部分を形成してもよく、または抗体、抗体断片、もしくは融合タンパク質にコンジュゲートされずに投与されてもよい。融合タンパク質は、異なる抗原に結合する１つまたは複数の抗体またはその断片を含み得る。例えば、融合タンパク質はＰＡＭ４抗原および免疫調節細胞または免疫調節因子と結合し得る。あるいは、対象は、裸の抗体、抗体断片、または融合タンパク質、およびそれとは別に投与されるサイトカインを受容することができ、このサイトカインは裸の抗体の投与の前、投与と同時、または投与の後に投与することができる。本明細書で使用する場合、「免疫調節物質」という用語は、サイトカイン、リンホカイン、モノカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インスリン様増殖因子（ＩＬＧＦ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ミューラー管阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、インターロイキン（ＩＬ）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、Ｓ１因子、ＩＬ−１、ＩＬ−１ｃｃ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、およびＩＬ−２５、ＬＩＦ、ｋｉｔ−リガンド、ＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、ならびにＬＴなどを含む。
あるいは、抗体および断片は、抗体を酵素に連結することにより、検出可能なように標識することができる。抗体−酵素コンジュゲートを適当な基質の存在下でインキュベートすると、酵素部分は基質と反応して、例えば、分光学的手段、蛍光分析手段、または視覚的手段により検出することができる化学的部分を生じる。抗体を検出可能なように標識するために使用することができる酵素の例としては、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
治療剤または診断剤は、ジスルフィド結合形成を介して、還元された抗体成分のヒンジ領域に付加することができる。代替法として、このような薬剤は、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などの、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて抗体成分に付加することができる。Ｙｕら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６：２４４（１９９４）。このようなコンジュゲーションに関する一般的な技術は当該技術分野で周知である。例えば、Ｗｏｎｇ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳ−ＬＩＮＫＩＮＧ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら，「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｂｉｒｃｈら（編），１８７−２３０ページ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５））；Ｐｒｉｃｅ，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｒｉｔｔｅｒら（編），６０−８４ページ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５））を参照されたい。あるいは、治療剤または診断剤は、抗体のＦｃ領域の炭水化物部分を介してコンジュゲートさせることができる。この炭水化物基は、チオール基に結合している同じ薬剤の付加量を増加させるために使用することができるし、またはこの炭水化物部分は異なるペプチドに結合させるために使用することができる。
免疫コンジュゲートは、罹患組織を検出するための1つまたは複数の放射性同位体を含み得る。特に有用な診断用放射性核種としては、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、または他のガンマ線放射体、ベータ線放射体、もしくは陽電子放射体が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、好ましくは２０〜４、０００ｋｅＶの範囲、より好ましくは２５〜４、０００ｋｅＶの範囲、一層より好ましくは２５〜１、０００ｋｅＶの範囲、さらにより好ましくは７０〜７００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギーを有する。有用な陽電子放出放射性核種の総崩壊エネルギーは、好ましくは＜２、０００ｋｅＶ、より好ましくは１、０００ｋｅＶ未満、最も好ましくは＜７００ｋｅＶである。ガンマ線検出を利用する診断剤として有用な放射性核種としては、限定するものではないが、５ｌＣｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７５Ｓｅ、９７Ｒｕ、９９ｍＴｃ、ｌ１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１６９Ｙｂ、１９７Ｈｇ、および２０１Ｔｌが挙げられる。有用なガンマ線放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜２０００ｋｅＶ、より好ましくは６０〜６００ｋｅＶ、最も好ましくは１００〜３００ｋｅＶである。
免疫コンジュゲートは、罹患組織を治療するための１つまたは複数の放射性同位体を含み得る。特に有用な治療用放射性核種としては、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、および２１１Ｐｂが挙げられるが、これらに限定されるものではない。治療用放射性核種は、好ましくは２０〜６，０００ｋｅＶの範囲、好ましくはオージェ放射体については６０〜２００ｋｅＶ、ベータ放射体については１００〜２，５００ｋｅＶ、およびアルファ放射体については４，０００〜６，０００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギーを有する。有用なベータ粒子放出核種の最大崩壊エネルギーは好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。また、オージェ放出粒子を伴って実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍ、およびＩｒ−１９２。有用なベータ粒子放出核種の崩壊エネルギーは、好ましくは＜１，０００ｋｅＶ、より好ましくは＜１００ｋｅＶ、最も好ましくは＜７０ｋｅＶである。また、アルファ粒子の発生を伴って実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。このような放射性核種としては、限定するものではないが、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３、およびＦｍ−２５５が挙げられる。有用なアルファ粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。
例えば、６７Ｃｕは、その半減期が６１．５時間であることや、ベータ粒子とガンマ線を豊富に供給することから、放射免疫療法のためのより有望な放射性同位体の１つと考えられるが、これはキレート剤のｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸（ＴＥＴＡ）を用いて抗体にコンジュゲートさせることができる。Ｃｈａｓｅ，前掲。あるいは、エネルギーに富んだベータ粒子を放出する９０Ｙは、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を用いて、またはより好ましくはＤＯＴＡを用いて、抗体、抗体断片、または融合タンパク質に結合させることができる。９０Ｙを抗体またはターゲッティング可能な構築物にコンジュゲートさせる方法は当該技術分野で公知であり、任意のそのような公知の方法を使用し得る（例えば、米国特許第７，２５９，２４９号を参照されたく、この実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。また、Ｌｉｎｄｅｎら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：５２１５−２２，２００５；Ｓｈａｒｋｅｙら，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．４６：６２０−３３，２００５；Ｓｈａｒｋｅｙら，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．４４：２０００−１８，２００３を参照されたい）。
可能性のあるさらなる放射性同位体としては、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１９９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、１６９Ｙｂなどが挙げられる。
別の実施形態では、放射線増感剤を、裸のまたはコンジュゲートされた抗体または抗体断片と組み合わせて使用することができる。例えば、放射線増感剤を、放射性標識された抗体または抗体断片と組み合わせて使用することができる。放射線増感剤の付加により、放射性標識された抗体または抗体断片単独での治療と比較して、効力の増強が可能になる。放射線増感剤は、Ｄ．Ｍ．Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ（編），ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ ＷＩＴＨ ＲＡＤＩＯＬＡＢＥＬＥＤ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に記載されている。この技術とともに使用される他の典型的な目的の放射線増感剤としては、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、およびシスプラチンが挙げられ、これらは、膵癌をはじめとする様々な癌の治療における外部照射と組み合わせて使用されている。それゆえ、本発明者らは、分割用量の９０Ｙ−ｈＰＡＭ４と組み合わせたゲムシタビンの放射線増感用量と思われる量（４週間にわたって週１回２００ｍｇ／ｍ２）のゲムシタビンの組合せを研究し、良好な認容性を示す（３つの標準に対してＮＣＩ−ＣＴＣによるグレード３〜４の毒性がない）ことが分かっているこの組合せの単回サイクルの後に膵癌縮小の客観的証拠を見つけた。
熱中性子活性化療法のためのホウ素付加物を付加した担体を有する抗体またはその断片も通常同様にして達成される。しかしながら、中性子照射を行なう前に、ターゲッティングされない免疫コンジュゲートがクリアランスされるまで待つのが有利である。クリアランスは抗膵癌抗体に結合する抗イディオタイプ抗体を用いて促進することができる。この一般原理を記載したものとしては、米国特許第４，６２４，８４６号を参照されたい。例えば、カルボランなどのホウ素付加物を抗体に付加することができる。カルボランは当該技術分野で周知のように、ペンダント側鎖上のカルボキシル官能基を用いて調製することができる。アミノデキストランなどの担体へのカルボランの付加は、カルボランのカルボキシル基を活性化し、担体上のアミンと縮合することにより達成することができる。次に、この中間コンジュゲートを抗体にコンジュゲートさせる。抗体コンジュゲートを投与した後、ホウ素付加物を熱中性子の照射によって活性化し、アルファ放射により崩壊して毒性の高い、短期の効果を生じる放射性原子へと変換させる。
対象の癌を診断する方法は、診断用免疫コンジュゲートを投与し、癌または腫瘍に局在化する免疫コンジュゲートに付加された診断用標識を検出することによって達成し得る。抗体、抗体断片、または融合タンパク質を診断剤にコンジュゲートさせてもよいし、または診断剤に付加されたターゲッティング可能な構築物を用いるプレターゲッティング技術で投与されてもよい。診断剤として使用することができる放射性薬剤は上で論じられている。好適な非放射性診断剤は、磁気共鳴イメージング、Ｘ線、コンピュータ断層撮影、または超音波検査に好適な造影剤である。磁気イメージング剤としては、例えば、マンガン、鉄、およびガドリニウムなどの非放射性金属を、２−ベンジル−ＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体を含む金属キレート剤の組合せと錯化したものが挙げられる。２００１年１０月１０日に出願された米国特許出願第０９／９２１，２９０号を参照されたく、その実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。また、ＰＥＴスキャニングヌクレオチドなどの他のイメージング剤、好ましくは１８Ｆを使用してもよい。
例えば、ガドリニウムイオン、ランタニウムイオン、ジスプロシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、または他の同等の標識をはじめとするＭＲＩ造影剤、ＣＴ造影剤、および超音波造影剤などの、造影剤を診断剤として使用してもよい。使用に好適な常磁性イオンとしては、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、およびエルビウム（ＩＩＩ）が挙げられるが、ガドリニウムが特に好ましい。
Ｘ線イメージングなどの他の状況で有用なイオンとしては、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、および特にビスマス（ＩＩＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。蛍光標識としては、ローダミン、フルオレセイン、およびレノグラフィンが挙げられる。ローダミンおよびフルオレセインは、イソチオシアネート中間体を介して連結されることが多い。
磁気共鳴イメージング技術用のものをはじめとして、金属も診断剤で有用である。これらの金属としては、ガドリニウム、マンガン、鉄、クロム、銅、コバルト、ニッケル、ジスプロシウム、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウム、およびネオジムが挙げられるが、これらに限定されない。抗体に放射性金属または常磁性イオンを付加するために、イオンを結合させるための多様なキレート基が付加した長いテールを有する試薬と反応させる必要があり得る。このような尾部は、ポリリジン、多糖、または例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリオキシム、およびこの目的のために有用であることが知られている同様の基などの、キレート基に結合することができるペンダント基を有する他の誘導体化されたまたは誘導体化可能な鎖であることができる。
キレート剤を、標準的な化学反応を用いて、抗体、融合タンパク質、またはそれらの断片に結合させる。キレート剤は通常、免疫反応性の損失を最小限に抑え、凝集および／または内部架橋を最小限に抑えて、分子との結合の形成を可能にする基により抗体に連結される。キレート剤を抗体にコンジュゲートさせるための他の、より特殊な方法および試薬は、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」と題されたＨａｗｔｈｏｒｎｅの米国特許第４，８２４，６５９号（１９８９年４月２５日に出願）に開示されており、この実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる。特に有用な金属−キレート剤の組合せとしては、一般エネルギー範囲２０〜２，０００ｋｅＶの診断用同位体とともに用いられる、２−ベンジルＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられる。同じキレート剤が、マンガン、鉄、およびガドリニウムなどの非放射性金属と錯化している場合は、ＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡなどの大環状キレート剤は、種々の金属および放射性金属とともに、最も具体的には、それぞれガリウム、イットリウム、および銅の放射性核種と一緒にすると有用である。このような金属−キレート剤の錯体は、環のサイズを目的の金属に合わせることにより極めて安定にすることができる。ＲＡＩＴのための２２３Ｒａなどの、安定に結合する核種に対して対象となる、大環状ポリエーテルなどの他の環型キレート剤は、本発明に包含される。
放射性不透過物質および造影物質は、Ｘ線の増強やコンピュータ断層撮影に使用され、これらには、ヨード化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、タリウム化合物などが含まれる。具体的な化合物には、バリウム、ジアトリゾ酸、ヨード化ケシ油エチルエステル、クエン酸ガリウム、イオカルミン酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパノ酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメチン酸、イオタスル、イオテトル酸、イオタラム酸、イオトロクス酸、イオキサグル酸、イオキソトリゾ酸、イポダート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドン、および塩化タリウムが含まれる。
抗体、抗体断片、または融合タンパク質を蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識ＭＡｂの存在は、抗体を適切な波長の光に曝し、生じた蛍光を検出することにより決定される。蛍光標識化合物としては、Ａｌｅｘａ ３５０、Ａｌｅｘａ ４３０、ＡＭＣＡ、アミノアクリジン、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、５−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２’，４’，５’，７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルアミノ、カスケードブルー、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、ダンシルクロライド、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレスカミン、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファストバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラアミノ安息香酸、エリスロシン、フタロシアニン、フタルデヒド、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、希土類金属クリプテート、ユーロピウムトリスビピリジンジアミン、ユーロピウムクリプテートまたはキレート剤、ジアミン、ジシアニン、ラホーヤブルー色素、アロピコシアニン、アロコシアニンＢ、フィコシアニンＣ、フィコシアニンＲ、チアミン、フィコエリスロシアニン、フィコエリスリンＲ、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンイソチオシアネート、ローダミンレッド、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、テトラメチルローダミン、およびテキサスレッドが挙げられる。蛍光標識抗体は、フローサイトメトリー解析に特に有用であるが、内視鏡検出法および血管内検出法で使用することもできる。
あるいは、抗体、抗体断片、または融合タンパク質は、抗体と化学発光化合物を結合させることにより検出可能なように標識することができる。化学発光タグ付きＭＡｂの存在は、化学反応の過程で生じる発光の存在を検出することにより決定される。化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジンエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルが挙げられる。
同様に、生物発光化合物を用いて、抗体およびその断片を標識することもできる。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める生物系で見られる一種の化学発光である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより決定される。標識に有用な生物発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンが挙げられる。
したがって、対象の悪性腫瘍を診断する方法であって、抗膵癌ＭＡｂ、融合タンパク質、またはそれらの断片を含む組成物を用いて、対象由来の標本（体液、組織、または細胞）に対するインビトロ診断アッセイを行なうことを含む方法が記載されている。結合した抗体の存在によって細胞または組織中のＰＡＭ４抗原の存在を検出するために、免疫組織化学を使用することができる。好ましくは、診断される悪性腫瘍は癌である。最も好ましくは、癌は膵癌である。
さらに、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、もしくはＮＯＴＡなどのキレート剤、あるいは蛍光分子などの検出可能な標識、または重金属もしくは放射性核種などの細胞傷害剤が付加される、好適なペプチドを本抗体にコンジュゲートすることができる。例えば、治療上有用な免疫コンジュゲートは、光活性剤または色素を抗体融合タンパク質にコンジュゲートすることによって得ることができる。蛍光色素などの蛍光組成物、および他の色素原、または可視光線に感受性のあるポルフィリンなどの色素は、好適な光線を病変に当てることにより病変の検出および治療に使用されている。治療においては、これは、光照射、光療法、または光線力学療法と呼ばれている（Ｊｏｒｉら（編），ＰＨＯＴＯＤＹＮＡＭＩＣ ＴＨＥＲＡＰＹ ＯＦ ＴＵＭＯＲＳ ＡＮＤ ＯＴＨＥＲ ＤＩＳＥＡＳＥＳ（Ｌｉｂｒｅｒｉａ Ｐｒｏｇｅｔｔｏ １９８５）；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈ，Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ ２２：４３０（１９８６））。さらに、モノクローナル抗体は、光療法を行なうために光活性化色素と結合されている。Ｍｅｗら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３０：１４７３（１９８３）；同，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５：４３８０（１９８５）；Ｏｓｅｒｏｆｆら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８７４４（１９８６）；同，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４６：８３（１９８７）；Ｈａｓａｎら，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．２８８：４７１（１９８９）；Ｔａｔｓｕｔａら，Ｌａｓｅｒｓ Ｓｕｒｇ．Ｍｅｄ．９：４２２（１９８９）；Ｐｅｌｅｇｒｉｎら，Ｃａｎｃｅｒ ６７：２５２９（１９９１）。
治療目的で、抗膵癌抗体およびその断片は、治療的有効量で患者に投与される。抗体は、投与される量が生理学的に意義のあるものであるならば、「治療的有効量」で投与されると言われる。その存在がレシピエント患者の生理に検出可能な変化をもたらすならば、薬剤は生理学的に意義のあるものである。
診断剤は、抗体、抗体断片、もしくは融合タンパク質、またはターゲッティング可能な構築物にコンジュゲートして投与し得る分子または原子であり、疾患関連抗原を含む細胞の位置を特定することによって疾患を診断／検出する際に有用である。有用な診断剤としては、放射性同位体、色素（例えば、ビオチン−ストレプトアビジン複合体を含むもの）、放射線不透過物質（例えば、ヨウ素、バリウム、ガリウム、およびタリウム化合物など）、造影剤、蛍光化合物または分子、ならびに磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のための増強剤（例えば、常磁性イオン）が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第６，３３１，１７５号には、ＭＲＩ技術およびＭＲＩ増強剤にコンジュゲートされた抗体の調製が記載されている。好ましくは、診断剤は、核イメージング、内視鏡検査、および血管内検査のための放射性同位体、磁気共鳴イメージングまたは超音波検査で使用する増強剤、Ｘ線およびコンピュータ断層撮影のための放射線不透過剤および造影剤、ならびに内視鏡蛍光透視法を含む蛍光透視法のための蛍光化合物からなる群から選択される。抗体にコンジュゲートされているかまたは二重特異性プレターゲッティング法で使用される蛍光剤および放射活性剤は、特に、ガンマ放射体、ベータ放射体、および陽電子放射体とともに、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇの米国特許第５，７１６，５９５号、同第６，０９６，２８９号、および米国特許出願第０９／３４８，８１８号（これらの実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているような、悪性腫瘍などの罹患組織または細胞塊と関連する標的抗原の内視鏡的検出、術中検出、または血管内検出に特に有用である。内視鏡適用は、結腸などの内視鏡検査が可能な構造に拡散している場合に使用し得る。陽電子放出断層撮影に有用な放射性核種としては、Ｆ−１８、Ｍｎ−５１、Ｍｎ−５２ｍ、Ｆｅ−５２、Ｃｏ−５５、Ｃｕ−６２、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６８、Ａｓ−７２、Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６、Ｒｂ−８２ｍ、Ｓｒ−８３、Ｙ−８６、Ｚｒ−８９、Ｔｃ−９４ｍ、Ｉｎ−１１０、Ｉ−１２０、およびＩ−１２４が挙げられるが、これらに限定されない。有用な陽電子放出放射性核種の総崩壊エネルギーは、好ましくは＜２，０００ｋｅＶ、より好ましくは１，０００ｋｅＶ未満、最も好ましくは＜７００ｋｅＶである。ガンマ線検出を利用する診断剤として有用な放射性核種としては、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｓｅ−７５、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１ｌｌ、ｍ−１１４ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｙｂ−ｌ６９、Ｈｇ−１９７、およびＴｌ−２０１が挙げられるが、これらに限定されない。有用なガンマ線放出放射性核種の崩壊エネルギーは、好ましくは２０〜２０００ｋｅＶ、より好ましくは６０〜６００ｋｅＶ、最も好ましくは１００〜３００ｋｅＶである。
インビトロ診断
本発明は、生体試料をＰＡＭ４抗原の存在についてインビトロでスクリーニングするための、抗膵癌抗体の使用を企図している。このような免疫アッセイでは、抗体、抗体断片、または融合タンパク質は、以下に記載されるように、液相で利用してもよいし、または固相担体に結合させてもよい。考慮すべき宿主免疫応答がないので、インビトロ診断の目的のために、マウス、キメラ、ヒト化、またはヒトなどの任意の種類の抗体を利用し得る。
生体試料がＰＡＭ４抗原を含むかどうかを決定するためのスクリーニング方法の一例は、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）である。例えば、ＲＩＡの一形態では、被試物質を放射性標識ＰＡＭ４抗原の存在下でＰＡＭ４ ＭＡｂと混合する。この方法では、試験物質の濃度は、ＭＡｂと結合している標識ＰＡＭ４抗原の量と反比例し、遊離の標識ＰＡＭ４抗原の量と直接関係する。他の好適なスクリーニング法は当業者には容易に明らかとなるであろう。
あるいは、抗膵癌抗体、抗体断片、または融合タンパク質が固相担体に結合されているインビトロアッセイを行なうことができる。例えば、ポリマーをコーティングしたビーズ、プレート、またはチューブなどの不溶性の支持体にＭＡｂを結合させるために、ＭＡｂをアミノデキストランなどのポリマーに付加することができる。
他の好適なインビトロアッセイは当業者には容易に明らかとなるであろう。検出可能なように標識された抗体およびＰＡＭ４抗原の具体的な濃度、インキュベーションの温度および時間、ならびにその他のアッセイ条件は、試料中のＰＡＭ４抗原の濃度、試料の性質などを含む様々な要因によって異なり得る。抗膵癌抗体の試料の結合活性は、周知の方法に従って測定し得る。当業者であれば、通常の実験を用いて、各測定についての操作的でかつ最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。
生体試料中のＰＡＭ４抗原の存在は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定することができる（例えば、Ｇｏｌｄら．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２４：２５２−５８，２００６）。直接競合ＥＬＩＳＡでは、純粋または半純粋な抗原調製物を、試験される体液または細胞抽出物に不溶性の固相支持体に結合させ、検出可能なように標識した一定量の可溶性抗体を添加すると、固相抗原と標識抗体の間で形成される二元複合体の検出および／または定量が可能になる。
対照的に、「二部位ＥＬＩＳＡ」または「サンドイッチアッセイ」としても知られる「二重決定基」ＥＬＩＳＡでは少量の抗原しか必要とされず、このアッセイでは抗原の大量精製の必要はない。したがって、二重決定基ＥＬＩＳＡは、臨床試料中の抗原の検出のための直接競合ＥＬＩＳＡにとって好ましい。例えば、生検標本中のｃ−ｍｙｃ癌タンパク質の定量のための二重決定基ＥＬＩＳＡの使用を参照されたい。Ｆｉｅｌｄら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ４：１４６３（１９８９）；Ｓｐａｎｄｉｄｏｓら，ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：８２１（１９８９）。
二重決定基ＥＬＩＳＡでは、一定量の非標識ＭＡｂまたは抗体断片（「キャプチャー抗体」）を固相支持体に結合させ、試験試料をキャプチャー抗体と接触させ、検出可能なように標識した一定量の可溶性抗体（または抗体断片）を添加すると、キャプチャー抗体と抗原と標識抗体の間で形成される三元複合体の検出および／または定量が可能になる。この文脈において、抗体断片は、ＰＡＭ４抗原のエピトープに結合する抗膵癌ＭＡｂの一部である。二重決定基ＥＬＩＳＡを実施する方法は周知である。例えば、Ｆｉｅｌｄら，前掲、Ｓｐａｎｄｉｄｏｓら，前掲、およびＭｏｏｒｅら，「Ｔｗｉｎ−Ｓｉｔｅ ＥＬＩＳＡｓ ｆｏｒ ｆｏｓ ａｎｄ ｍｙｃ Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＡＭＰＡＫ Ｓｙｓｔｅｍ」（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，第１０巻，２７３−２８１ページ（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２））を参照されたい。
二重決定基ＥＬＩＳＡでは、可溶性抗体または抗体断片は、キャプチャー抗体によって認識されるエピトープとは異なるＰＡＭ４エピトープに結合しなければならない。二重決定基ＥＬＩＳＡは、生検試料中にＰＡＭ４抗原が存在するかどうかを確認するために行なうことができる。あるいは、このアッセイは、体液の臨床試料中に存在するＰＡＭ４抗原の量を定量するために行なうことができる。この定量アッセイは、精製ＰＡＭ４抗原の希釈物を含めることにより行なうことができる。
抗膵癌Ｍａｂ、融合タンパク質、およびそれらの断片は、アッセイキットの製造にも適している。このようなキットは、バイアル、チューブなどのような１つまたは複数の容器手段（該容器手段は各々、免疫アッセイの個別の要素を含む）を密封して収容するように区画化されている運搬手段を含み得る。
本発明の抗体、抗体断片、および融合タンパク質を用いて、組織学的標本から調製した組織切片中のＰＡＭ４抗原の存在を検出することもできる。このようなインサイチュ検出を用いて、ＰＡＭ４抗原の存在を決定したり、検査組織におけるＰＡＭ４抗原の分布を決定したりすることができる。インサイチュ検出は、検出可能なように標識した抗体を凍結組織切片に適用することによって達成することができる。研究により、ＰＡＭ４抗原はパラフィン包埋切片で保存されることが示されている。インサイチュ検出の一般的な技術は当業者に周知である。例えば、Ｐｏｎｄｅｒ，「Ｃｅｌｌ Ｍａｒｋｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」（ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ １１３−３８ Ｍｏｎｋ（編）（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８７））、およびＣｏｌｉｇａｎの５．８．１−５．８．８ページを参照されたい。
抗体、抗体断片、および融合タンパク質は、任意の適切なマーカー部分、例えば、放射性同位体、酵素、蛍光標識、色素、色素原、化学発光標識、生物発光標識、または常磁性標識で検出可能なように標識することができる。
マーカー部分は、ガンマカウンターもしくはシンチレーションカウンターを使用するような手段によって、またはオートラジオグラフィーによって検出される放射性同位体であることができる。好ましい実施形態では、診断用コンジュゲートは、ガンマ線、ベータ線、または陽電子放出同位体である。本記載におけるマーカー部分とは、所定の条件下でシグナルを発生する分子を指す。マーカー部分の例としては、放射性同位体、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、および常磁性標識が挙げられる。
マーカー部分の抗膵癌抗体に対する結合は、当該技術分野で公知の標準的な技術を用いて達成することができる。これに関する典型的な方法は、Ｋｅｎｎｅｄｙら，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ ７０：１（１９７６）、Ｓｃｈｕｒｓら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ８１：１（１９７７）、Ｓｈｉｈら，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４６：１１０１（１９９０）によって記載されている。
上記のインビトロ検出法およびインサイチュ検出法を用いて、病状の診断または病期判定を補助し得る。例えば、このような方法を用いて、膵癌などの、ＰＡＭ４抗原を発現する腫瘍を検出することができる。
インビボ診断／検出
放射性標識ＭＡｂを用いる様々なインビボ診断イメージング方法が周知である。免疫シンチグラフィー技術では、例えば、抗体をガンマ線放出放射性同位体で標識し、患者に導入する。ガンマカメラを用いて、ガンマ線放出放射性同位体の位置および分布を検出する。例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（編），ＲＡＤＩＯＬＡＢＥＬＥＤ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＦＯＲ ＩＭＡＧＩＮＧ ＡＮＤ ＴＨＥＲＡＰＹ（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９８８）、Ｃｈａｓｅ，「Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ」（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏら（編），６２４−６５２ページ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９９０））、およびＢｒｏｗｎ，「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｓｅ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＰＨＡＲＭＡＣＹ ２２７−４９，Ｐｅｚｚｕｔｏら（編）（Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ １９９３））を参照されたい。
診断イメージングでは、放射性同位体を、直接的にまたは中間的官能基を用いて間接的に、抗体に結合させてもよい。有用な中間的官能基としては、エチレンジアミン四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸などのキレート剤が挙げられる。例えば、Ｓｈｉｈら，前掲、および米国特許第５，０５７，３１３号を参照されたい。
患者に送達される放射線量は、最小の半減期、最小の身体残留、および検出と正確な測定を可能にする最少の同位体量の最良の組合せとなるように同位体を選択することで可能な限り低レベルに維持される。抗膵癌抗体に結合させることができ、かつ診断イメージングに適当な放射性同位体の例は、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、および１８Ｆである。
本抗体、抗体断片、および融合タンパク質は、インビボ診断の目的で、常磁性イオンおよび種々の放射線造影剤で標識することもできる。磁気共鳴イメージングに特に有用な造影剤は、ガドリニウム、マンガン、ジスプロシウム、ランタン、または鉄イオンを含む。さらなる薬剤としては、クロム、銅、コバルト、ニッケル、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウム、またはネオジムが挙げられる。抗体およびその断片は、超音波造影剤／増強剤にコンジュゲートすることもできる。例えば、１つの超音波造影剤はリポソームである。また、超音波造影剤はガス充填されたリポソームであることが好ましい。
好ましい実施形態では、二重特異性抗体を造影剤にコンジュゲートすることができる。例えば、二重特異性抗体は、超音波イメージングで使用するための２つ以上の画像増強剤を含んでもよい。別の好ましい態様では、造影剤はリポソームである。好ましくは、リポソームは、リポソームの外面に共有結合した二価のＤＴＰＡ−ペプチドを含む。
薬学的に好適な賦形剤
さらなる薬学的方法を用いて、治療適用での抗膵癌抗体の作用期間を制御し得る。徐放性製剤は、抗体、抗体断片、または融合タンパク質と複合体を形成するかまたはそれらを吸着するポリマーの使用を通じて調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーとしては、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）のマトリックスおよびステアリン酸二量体とセバシン酸の無水共重合体のマトリックスが挙げられる。Ｓｈｅｒｗｏｏｄら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４４６（１９９２）。このようなマトリックスからの抗体、抗体断片、または融合タンパク質の放出速度は、抗体、抗体断片、または融合タンパク質の分子量、マトリックス内の抗体の量、および分散している粒子の大きさによって決まる。Ｓａｌｔｚｍａｎら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら，前掲。他の固相投薬形態は、Ａｎｓｅｌら，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，第５版（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）、およびＧｅｎｎａｒｏ（編），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）、ならびにそれらの改訂版に記載されている。
対象に送達される抗体、その断片、または融合タンパク質は、１つまたは複数の薬学的に好適な賦形剤、１つまたは複数の追加成分、あるいはこれらの何らかの組合せを含む。抗体を公知の方法に従って処方し、免疫コンジュゲートまたは裸の抗体が薬学的に好適な賦形剤と混合物中で組み合わされている薬学的に有用な組成物を調製することができる。滅菌リン酸緩衝化食塩水は、薬学的に好適な賦形剤の一例である。他の好適な賦形剤は当業者に周知である。例えば、Ａｎｓｅｌら，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，第５版（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）、およびＧｅｎｎａｒｏ（編），ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）、ならびにそれらの改訂版を参照されたい。
免疫コンジュゲートまたは裸の抗体は、例えば、ボーラス注射または持続注入による静脈内投与のために処方することができる。注射用処方物は、添加した防腐剤とともに、単位投薬形態で、例えば、アンプル中でまたは複数回投与容器中で提供することができる。これらの組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳濁液のような形態をとることでき、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤のような処方剤を含むことができる。あるいは、活性成分は、使用前に、好適なビヒクル（例えば、滅菌パイロジェンフリー水）で構成するための粉末形態であることができる。
また、免疫コンジュゲート、裸の抗体、およびそれらの断片、または融合タンパク質を、皮下にまたは他の非経口経路で哺乳動物に投与してもよい。好ましい実施形態では、抗体またはその断片は、１投与当たり２０〜２０００ミリグラムタンパク質の投薬量で投与される。さらに、投与は、持続注入によるものであっても、または単回もしくは複数回のボーラス注射によるものであってもよい。一般に、投与される免疫コンジュゲート、融合タンパク質、または裸の抗体のヒトについての投薬量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の健康状態、および過去の病歴のような要因によって異なる。通常、単回の静脈内注入として約１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の投薬量の免疫コンジュゲート、抗体融合タンパク質、または裸の抗体をレシピエントに与えるのが望ましいが、状況によっては、より少ないまたはより多い投薬量を投与してもよい。この投薬量を必要に応じて繰り返してもよく、例えば、週１回を４〜１０週間、好ましくは週１回を８週間、より好ましくは週１回を４週間繰り返してもよい。また、１週間おきに数カ月間のようにより低い頻度でまたは週に２回もしくは３回のようにより高い頻度で投与してもよい。用量およびスケジュールを適宜調整して、投薬を様々な非経口経路により投与してもよい。
キット
様々な実施形態は、患者の罹患組織を治療または診断するのに好適な構成要素を含むキットに関するものであってもよい。例示的なキットには、本明細書に記載された少なくとも１つの抗体、抗原結合断片、または融合タンパク質が含まれていてもよい。投与するための構成要素を含む組成物が、消化管を介する送達（例えば、経口送達によるもの）のために処方されていない場合、何らかの他の経路を介してキット構成要素を送達することができる装置を含めてもよい。非経口送達などの用途のための、１つのタイプの装置は、対象の身体に組成物を注射するために使用されるシリンジである。吸入装置も使用し得る。特定の実施形態では、抗膵癌抗体またはその抗原結合断片は、抗体の滅菌液体処方物または、凍結乾燥製剤を含む予め充填されたシリンジまたは自動注射ペンといった形態の中に提供されてもよい（例えば、Ｋｉｖｉｔｚら，Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２００６，２８：１６１９−２９）。
キット構成要素は、１つにまとめて包装してもよいし、または２つ以上の容器に分けてもよい。いくつかの実施形態では、容器は、再構成に好適な組成物の滅菌凍結乾燥処方物を含むバイアルであってもよい。キットはまた、他の試薬の再構成および／または希釈に好適な1つまたは複数の緩衝液を含んでいてもよい。使用し得るその他の容器としては、袋、トレイ、箱、チューブなどが挙げられるが、これらに限定されない。キット構成要素をこれらの容器内に包装し、滅菌状態で維持してもよい。含めることができる別の構成要素は、キットを使用するための取扱説明書である。
以下の実施例は本発明の実施形態を例示するものであって、特許請求の範囲を限定するものではない。実施例では、例示的な抗膵癌モノクローナル抗体（ＰＡＭ４）を利用した研究が論じられている。ＰＡＭ４ ＭＡｂを用いた臨床研究は、膵癌病変の大部分が患者においてターゲッティングされ、正常組織での取込みが示されなかったことを示している。線量測定により、３：１〜１０：１の腫瘍対赤色骨髄用量比で、１０〜２０ｃＧｙ／ｍＣｉを腫瘍に送達することが可能であることが示された。このデータは、ＰＡＭ４が膵癌の治療に有用であることを示している。
実施例１．ヒト化ＰＡＭ４ ＭＡｂ
好ましい実施形態では、特許請求された方法および組成物に、膵癌ムチンに対して惹起されたマウスＰＡＭ４ ＭＡｂのヒト化ＩｇＧである抗体ｈＰＡＭ４が利用されている。マウスＰＡＭ４配列のヒト化を利用して、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答が軽減された。ヒト化ＰＡＭ４を作製するために、マウス相補性決定領域（ＣＤＲ）をマウス免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖からヒトフレームワーク領域（ＦＲ）抗体配列に移し、次に、いくつかのヒトＦＲ残基をそのマウス対応物と置き換えた。ヒト化モノクローナル抗体は、インビトロおよびインビボでの診断法および治療法で使用するのに好適である。
マウスＰＡＭ４ ＭＡｂの可変領域フレームワーク配列（図１Ａおよび１Ｂ）とＫａｂａｔデータベース中の既知のヒト抗体の比較により、ＰＡＭ４のＶＫとＶＨのＦＲが、それぞれ、ヒト抗体のＷａｌｋｅｒ ＶＫとＷｉｌ２ ＶＨのＦＲと最も高い配列相同性を示すことが示された。それゆえ、Ｗａｌｋｅｒ ＶＫとＷｉｌ２ ＶＨのＦＲをヒトフレームワークとして選択し、その中に、ＰＡＭ４のＶＫとＶＨに対するマウスＣＤＲを、それぞれ移植した（図３）。しかしながら、ＰＡＭ４重鎖のヒト化の場合には、ヒト抗体ＮＥＷＭのＦＲ４配列を用いて、Ｗｉｌ２ ＦＲ４配列を置き換えた（図３Ｂ）。推定ＣＤＲに隣接するＰＡＭ４ ＦＲ中の数アミノ酸残基は、これらの残基が他のＦＲ残基よりもＡｇ結合に対する影響が大きいという考えに基づき、ｈＰＡＭ４中で維持された。これらの残基は、ＶＫの２１Ｍ、４７Ｗ、５９Ｐ、６０Ａ、８５Ｓ、８７Ｆ、および１００Ｇ、ならびにＶＨの２７Ｙ、３０Ｐ、３８Ｋ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａ、および６９Ｌであった。ｈＰＡＭ４ ＶＫ（配列番号１６）およびＶＨ（配列番号１９）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、図３Ａおよび３Ｂに示す。
長いオリゴヌクレオチド合成とＰＣＲの組合せを用いて、ｈＰＡＭ４用に設計したＶＫおよびＶＨ遺伝子（図４）を構築するために、Ｌｅｕｎｇら（Ｌｅｕｎｇら，１９９４）によって記載された改良された戦略を用いた。ｈＰＡＭ４ ＶＨドメインの構築のために、２つの長いオリゴヌクレオチドであるｈＰＡＭ４ＶＨＡ（１７３ｍｅｒ）とｈＰＡＭ４ＶＨＢ（１７３ｍｅｒ）を、自動ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）で合成した。
ｈＰＡＭ４ＶＨＡは、ｈＰＡＭ４ ＶＨドメインのｎｔ１７〜１８９を表す。
５’−ＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣ ＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧ ＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧ ＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡ ＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣ ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＧ ＧＡＴＡＣＡＣＡＴＴ ＣＣＣＴＡＧＣＴＡＴ ＧＴＴＴＴＧＣＡＣＴ ＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡ ＧＧＣＣＣＣＴＧＧＡ ＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧ ＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧ ＡＴＡＴＡＴＴＡＡＴ ＣＣＴＴＡＣＡＡＴＧ ＡＴＧＧＴＡＣＴＣＡ ＧＴＡＣＡＡＴＧＡＧ ＡＡＧ−３’（配列番号２０）
ｈＰＡＭ４ＶＨＢは、ｎｔ１６９〜３４１に相補的なｈＰＡＭ４ ＶＨドメインのマイナス鎖を表す。
５’−ＡＧＧＧＴＴＣＣＣＴ ＧＧＣＣＣＣＡＧＴＡ ＡＧＣＡＡＡＴＣＣＧ ＴＡＧＣＴＡＣＣＡＣ ＣＧＡＡＧＣＣＴＣＴ ＴＧＣＡＣＡＧＴＡＡ ＴＡＣＡＣＧＧＣＣＧ ＴＧＴＣＧＴＣＡＧＡ ＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧ ＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡ ＴＧＴＡＧＧＣＴＧＴ ＧＴＴＧＡＴＧＧＡＣ ＧＴＧＴＣＣＣＴＧＧ ＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣ ＣＴＴＧＣＣＴＴＴＧ ＡＡＣＴＴＣＴＣＡＴ ＴＧＴＡＣＴＧＡＧＴ ＡＣＣ−３’（配列番号２１）
ｈＰＡＭ４ＶＨＡおよびＶＨＢの３’末端配列（２１ｎｔ残基）は互いに相補的である。規定のＰＣＲ条件下で、ｈＰＡＭ４ＶＨＡおよびＶＨＢの３’末端はアニールして、短い二本鎖ＤＮＡを形成し、残りの長いオリゴヌクレオチドがその両側に連なる。アニールした末端は各々、一本鎖ＤＮＡの転写用のプライマーとして働き、ｈＰＡＭ４ ＶＨのｎｔ１７〜３４１から構成される二本鎖ＤＮＡを生じさせる。全長ｈＰＡＭ４ ＶＨを形成させるために、このＤＮＡを２つの短いオリゴヌクレオチド、ｈＰＡＭ４ＶＨＢＡＣＫおよびｈＰＡＭ４ＶＨＦＯＲの存在下でさらに増幅した。下線部は、図４Ｂに示すサブクローニングのための制限部位である。
ｈＰＡＭ４ＶＨＢＡＣＫ ５’−ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＴＧ Ａ−３’（配列番号２２）
ｈＰＡＭ４ＶＨＦＯＲ ５’−ＴＧＡ ＧＧＡ ＧＡＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＣＡＧ ＧＧＴ ＴＣＣ ＣＴＧ ＧＣＣ ＣＣＡ−３’（配列番号２３）
最少量のｈＰＡＭ４ＶＨＡおよびＶＨＢ（実験により決定）を、１０μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．３、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、２μｍｏｌのｈＰＡＭ４ＶＨＢＡＣＫおよびｈＰＡＭ４ＶＫＦＯＲ、ならびに２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）の存在下で増幅した。この反応混合物を、９４℃で１分間の変性、４５℃で１分間のアニーリング、および７２℃で１．５分間の重合からなる３サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にかけた。この手順の後に、９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、および７２℃で１分間の重合からなる２７サイクルのＰＣＲ反応が行なわれた。ｈＰＡＭ４ ＶＨの二本鎖ＰＣＲ増幅産物をゲル精製し、ＰｓｔＩ制限部位とＢｓｔＥＩＩ制限部位で制限消化し、重鎖ステージングベクターＶＨｐＢＳ２の相補的なＰｓｔＩ／ＢｓｔＥＩＩ制限部位にクローニングした。このベクターにおいて、ＶＨ配列は、翻訳開始コドンをコードするＤＮＡ配列および５’末端でインフレームに連結された分泌シグナルペプチドおよび３’末端のイントロン配列と完全にアセンブルされていた。ＶＨｐＢＳ２は、ＶＨｐＢＳの改変型ステージングベクターであり（Ｌｅｕｎｇら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９，１９９４）、このベクターには、次のサブクローニング工程を容易にするために、ＸｈｏＩ制限部位が翻訳開始コドンの１６塩基上流に導入されていた。アセンブルされたＶＨ遺伝子を、ＩｇＨエンハンサーおよびＭＴ１プロモーターの制御下にあるヒトＩｇＧ重鎖と軽鎖の両方、ならびに選択および増殖のマーカーとしてのマウスｄ／ｆｒ遺伝子の発現カセットを含む発現ベクターのｐｄＨＬ２に、ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ制限断片としてサブクローニングした。ｐｄＨＬ２の重鎖領域は、ＢａｍＨＩ制限部位を欠いているので、このライゲーションでは、可変鎖のＢａｍＨＩ部位とｐｄＨＬ２ベクターに存在するＨｉｎｄＩＩＩ部位とを架橋するためのリンカーを使用する必要がある。得られた発現ベクターをｈＰＡＭ４ＶＨｐｄＨＬ２と表した。
ヒト化ＶＫ配列の全長ＤＮＡを構築するために、ｈＰＡＭ４ＶＫＡ（１５７ｍｅｒ）およびｈＰＡＭ４ＶＫＢ（１５６ｍｅｒ）を上記のように合成した。ｈＰＡＭ４ＶＫＡおよびＶＫＢを、２つの短いオリゴヌクレオチド、ｈＰＡＭ４ＶＫＢＡＣＫおよびｈＰＡＭ４ＶＫＦＯＲによって、上記のように増幅した。
ｈＰＡＭ４ＶＫＡは、ｈＰＡＭ４ ＶＫドメインのｎｔ１６〜１７２を表す。
５’−ＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴ ＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣ ＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡ ＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧ ＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣ ＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣ ＡＧＣＴＣＡＡＧＴＧ ＴＡＡＧＴＴＣＣＡＧ ＣＴＡＣＴＴＧＴＡＣ ＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣ ＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧ ＧＡＡＡＧＣＣＣＣＣ ＡＡＡＣＴＣＴＧＧＡ ＴＴＴＡＴＡＧＣＡＣ ＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧ ＧＣＴＴＣＴＧ−３’（配列番号２４）
ｈＰＡＭ４ＶＫＢは、ｎｔ１５３〜３０８に相補的なｈＰＡＭ４ ＶＫドメインのマイナス鎖を表す。
５’−ＧＴＣＣＣＣＣＣＴＣ ＣＧＡＡＣＧＴＧＴＡ ＣＧＧＧＴＡＣＣＴＡ ＴＴＣＣＡＣＴＧＡＴ ＧＧＣＡＧＡＡＡＴＡ ＡＧＡＧＧＣＡＧＡＡ ＴＣＴＴＣＡＧＧＴＴ ＧＣＡＧＡＣＴＧＣＴ ＧＡＴＧＧＴＧＡＧＡ ＧＴＧＡＡＧＴＣＴＧ ＴＣＣＣＡＧＡＴＣＣ ＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧ ＡＡＧＣＧＡＧＣＡＧ ＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡ ＡＧＣＣＡＧＧＴＴＧ ＧＡＴＧＴＧ−３’（配列番号２５）
ｈＰＡＭ４ＶＫＡおよびＶＫＢの３’末端配列（２０ｎｔ残基）は互いに相補的である。規定のＰＣＲ条件下で、ｈＰＡＭ４ＶＨＡおよびＶＨＢの３’末端はアニールして、短い二本鎖ＤＮＡを形成し、残りの長いオリゴヌクレオチドがその両側に連なる。アニールした末端は各々、一本鎖ＤＮＡの転写用のプライマーとして働き、ｈＰＡＭ４ ＶＫのｎｔ１６〜３０８から構成される二本鎖ＤＮＡを生じさせる。全長ｈＰＡＭ４ ＶＫを形成させるために、このＤＮＡを２つの短いオリゴヌクレオチド、ｈＰＡＭ４ＶＫＢＡＣＫおよびｈＰＡＭ４ＶＫＦＯＲの存在下でさらに増幅した。下線部は、以下に示すサブクローニングのための制限部位である。
ｈＰＡＭ４ＶＫＢＡＣＫ ５’−ＧＡＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＡＣＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＴＣＣ ＴＣＣ ＣＴＧ−３’（配列番号２６）
ｈＰＡＭ４ＶＫＦＯＲ ５’−ＴＴＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＣＡＧ ＴＣＧ ＴＧＴ ＣＣＣ ＣＣＣ ＴＣＣ ＧＡＡ ＣＧＴ−３’（配列番号２７）
ゲル精製したｈＰＡＭ４ ＶＫのＰＣＲ産物をＰｖｕＩＩおよびＢｇｌＩＩで制限消化し、軽鎖ステージングベクターＶＫｐＢＲ２の相補的なＰｖｕＩＩ／ＢｃｌＩ部位にクローニングした。ＶＫｐＢＲ２は、ＶＫｐＢＲの改変型ステージングベクターであり（Ｌｅｕｎｇら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９，１９９４）、このベクターには、ＸｂａＩ制限部位が翻訳開始コドンの１６塩基上流に導入されていた。アセンブルされたＶＫ遺伝子を、ＶＨ配列を含む発現ベクターのｈＰＡＭ４ＶＨｐｄＨＬ２に、ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ制限断片としてサブクローニングした。得られた発現ベクターをｈＰＡＭ４ｐｄＨＬ２と表した。
約３０μｇのｈＰＡＭ４ｐｄＨＬ２をＳａｌＩによる消化で線状化し、４５０Ｖおよび２５μＦでのエレクトロポレーションによりＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を９６ウェルプレートに入れ、ＣＯ２細胞培養インキュベーターで２日間インキュベートした後、ＭＴＸ耐性について選択した。選択から生き残ったコロニーが２〜３週間で出現し、これをＥＬＩＳＡアッセイでヒト抗体分泌について選択した。簡潔に述べると、生き残ったコロニー由来の上清（約１００ｕｌ）を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片特異的ＡｂでプレコーティングしたＥＬＩＳＡマイクロプレートのウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。結合しなかったタンパク質は、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄することにより除去した。セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片特異的Ａｂをウェルに添加した。１時間インキュベートした後、ＰＢＳ中に４ｍＭ ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）と０．０４％Ｈ２Ｏ２とを含む基質溶液（１００μＬ／ウェル）を洗浄後のウェルに添加した。暗所で３０分間発色させ、５０μＬの４Ｎ Ｈ２ＳＯ４溶液を添加することにより反応を停止させた。ＥＬＩＳＡリーダーで４９０ｎｍの吸光度を読み取ることにより、結合したヒトＩｇＧを測定した。陽性細胞クローンを拡大し、プロテインＡカラムでの親和性クロマトグラフィーにより、ｈＰＡＭ４を細胞培養上精から精製した。
膵癌細胞抽出物でコーティングしたマイクロタイタープレート中でのＥＬＩＳＡアッセイにより、ｈＰＡＭ４のＡｇ結合活性を確認した。ｈＰＡＭ４のＡｇ結合親和性を、マウスＶドメインとヒトＣドメインから構成されるキメラＰＡＭ４のＡｇ結合親和性と比較して評価するために、ＰＡＭ４抗原でコーティングしたプレートを用いるＥＬＩＳＡ競合結合アッセイを開発した。様々な濃度のｃＰＡＭ４またはｈＰＡＭ４と混合した一定量のＨＲＰコンジュゲートｃＰＡＭ４を、コーティングしたウェルに添加し、室温で１〜２時間インキュベートした。４ｍＭ ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩と０．０４％Ｈ２Ｏ２とを含む基質溶液を添加した後、４９０ｎｍの吸光度を読み取ることにより、ＣａＰａｎ１ Ａｇに結合したＨＲＰコンジュゲートｃＰＡＭ４の量を明らかにした。図４の競合アッセイで示されるように、ｈＰＡＭ４抗体およびｃＰＡＭ４抗体は、よく似た結合活性を示した。
実施例２．免疫組織化学染色研究
正常成体組織に対する免疫組織化学によって、ＰＡＭ４反応性エピトープが胃腸管に限定されており、そこでは、染色は弱いが、陽性であることが示された（表１）。膵管、膵導管、膵腺房、および膵島細胞を含む、正常膵組織は染色が陰性であった。抗原として組織ホモジネートを用いるＰＡＭ４ベースの酵素免疫アッセイは全般的に免疫組織化学データを裏付けるものであった（表２）。ＰＡＭ４エピトープは、正常な膵臓やその他の非胃腸管組織には存在しなかった。腫瘍組織では、ＰＡＭ４は、２５のうち２１（８５％）の膵癌（表３および表４）ならびに２６のうち１０の結腸癌と反応性があったが、胃、肺、乳房、卵巣、前立腺、肝臓、または腎臓の腫瘍とは限られた反応性しかなかった（表４）。ＰＡＭ４反応性は、腫瘍分化のステージと相関しているようであり、中分化腫瘍または低分化腫瘍よりも高分化膵癌でより大きいパーセンテージの染色が見られた。一般に、低分化腫瘍は全膵癌の１０％未満に相当する。
これらの研究により、ＰＡＭ４の反応性と組織分布（正常なものと癌の両方）は、ＣＡｌ９．９、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｎｄ２、およびＢ７２．３抗体、ならびにルイス抗原に対する抗体について報告されているものとは異なることが示された。これらのＭＡｂのうちのあるもので行なわれた交差遮断研究と考え合わせると、このデータは、ＰＡＭ４ ＭＡｂが独特でかつ新規なエピトープを認識することを示唆する。ＣＡ１９．９、ＤＵＰＡＮ２、および抗Ｌｅａ抗体によって認識される抗原と比較した場合、ＰＡＭ４抗原は、その組織分布がより限定されているものと思われ、より高いパーセンテージの膵腫瘍と反応性がある。さらに、ＰＡＭ４抗原は、同じ濃度でも反応全体の強度がより大きく、膵腫瘍内のより高いパーセンテージの細胞と反応性がある。最後に、ＰＡＭ４は、１２の慢性膵炎標本のうちの３つと弱く反応するに過ぎないことが分かったが、一方、ＣＡ１９．９とＤＵＰＡＮ２は、１２全ての標本と強く反応した。特異性は、使用するアッセイのタイプや検査する組織の範囲および数よって一部決まることが認識されるが、正常膵組織と腫瘍膵組織を識別するＰＡＭ４の能力、大きいパーセンテージの癌標本と反応するその能力、高い反応強度、および初期膵癌と膵炎などの良性症状を識別する能力は、この例示的な抗膵癌抗体の重要な特徴である。
Figure 0005919604
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実施例３．放射性標識ＰＡＭ４のインビボ生体分布および腫瘍ターゲッティング
ＰＡＭ４の最初の生体分布研究は、予測される分化の範囲を網羅する一連の４つの異なる異種移植ヒト膵腫瘍で行なった。使用した４つの腫瘍株ＡｓＰｃ１、ＢｘＰｃ３、Ｈｓ７６６Ｔ、およびＣａＰａｎ１は各々、腫瘍内に１３１Ｉ−ＰＡＭ４の濃縮を示し（範囲：３日目で２１％〜４８％ＩＤ／ｇ）、これは、同時に投与された非特異的なアイソタイプ一致Ａｇ８抗体（範囲：３日目で３．６％〜９．３％ＩＤ／ｇ）よりも有意に（ｐ＜０．０１〜０．００１）高かった。この生体分布データを用いて、ＡｓＰｃ１、ＢｘＰｃ３、Ｈｓ７６６Ｔ、およびＣａＰａｎ１のそれぞれに、注射量１２，２３０；１０，６８４；６，８３５；および１５，８４３ｃＧｙ／ｍＣｉの腫瘍に対する潜在的線量を推定した。実際の最大認容量（ＭＴＤ）０．７ｍＣｉでは、ＰＡＭ４は、異種移植腫瘍モデルの各々に実質的な線量をもたらすことができた。各腫瘍株において、放射性標識ＰＡＭ４の血液レベルは、非特異的Ａｇ８よりも有意に（ｐ＜０．０１〜０．００１）低かった。ＰＡＭ４からの血液への潜在的線量はＡｇ８からのものより１．４〜４．４倍低かった。ＰＡＭ４からの腫瘍への線量をＰＡＭ４から血液への線量に対して標準化したところ、腫瘍が受け取った線量は２．２；３．３；３．４であり、それぞれ血液よりも１３．１倍高かった。重要なことに、非腫瘍組織に対する潜在線量は最小であった。
ＣａＰａｎ１腫瘍モデルを用いて、ＰＡＭ４の生体分布を抗ＣＥＡ抗体であるＭＮ１４と比較した。腫瘍内のＰＡＭ４の濃度は初期の時点ではＭＮ１４よりもずっと高く、３日目の腫瘍：血液比は、ＭＮ１４の場合の２．７±１．９と比較して、ＰＡＭ４の場合、１２．７±２．３であった。腫瘍内へのＰＡＭ４の取込みは、初期の時点でＭＮ１４の場合よりも有意に高かったが（１日目ではｐ＜０．００１；３日目ではｐ＜０．０１）、線量測定解析により、１４日の試験期間にわたってＭＮ１４と比較した場合、ＰＡＭ４から腫瘍へは３．２倍高い線量であるに過ぎないことが示された。これは、ＰＡＭ４が腫瘍から速やかにクリアランスされるためであり、したがって後の時点では、２つの抗体が同じような濃度で腫瘍内に存在していた。腫瘍からのＰＡＭ４の速やかなクリアランスは、ＢｘＰｃ３およびＨｓ７６６Ｔ腫瘍モデルでも見られたが、ＡｓＰｃ１腫瘍モデルでは見られなかった。これらの観察結果は、例えば、結腸直腸癌におけるＧ９やＢ７２．３などの、他の抗ムチン抗体について報告されているもの（各々、ＭＮ１４抗体と比較した場合に、より長い保持時間を示した）とは異なっていた。ＰＡＭ４の代謝についての研究から得られた結果は、まず腫瘍細胞に結合した後、抗体が速やかに放出され、おそらくは異化されるかまたは抗原：抗体複合体として隔離されることを示している。血液クリアランスも非常に速い。これらのデータは、１３１Ｉが治療用途のための同位体の適当な選択肢とはなり得ないことを示唆している。頻繁に投与することができる、９０Ｙまたは１８８Ｒｅなどの、短命な同位体がより効果的な試薬であり得る。
ＰＡＭ４は、ＣａＰａｎ１腫瘍モデルを除いて、正常組織へのターゲッティングの形跡を示さず、ＣａＰａｎ１腫瘍モデルでは、小さいが、統計的に有意な脾臓への取込みが見られた（範囲は３日目で３．１〜７．５％ＩＤ／ｇ）。この種の脾臓ターゲッティングは、抗ムチン抗体Ｂ７２．３およびＣＣ４９の臨床適用で見られている。重要なことに、これらの研究では、脾臓ターゲッティングが腫瘍への抗体の取込みに影響を及ぼすことも、核スキャンの解釈の妨げとなることもなかった。これらの研究から、脾臓ターゲッティングが脾臓中の交差反応抗原によるものでも、Ｆｃ受容体による結合によるものでもなく、むしろ１つまたは複数の以下の可能性、すなわち、脾臓にトラップされた抗原の直接的なターゲッティングか、または血液中で形成されたもしくは腫瘍部位から放出された抗原：抗体複合体の間接的な取込みによるものであったことが示唆された。後者では、血液中に免疫複合体が存在することが必要である。しかしながら、これらは、５分といった初期の標本や７日目といった後期の標本をゲル濾過（ＨＰＬＣ、ＧＦ−２５０カラム）で検討した場合には見られず、放射性標識抗体はネイティブな物質として溶出した。前者の説明は、ＣａＰａｎ１腫瘍が大量のＰＡＭ４反応性抗原を産生し、検討した他の腫瘍細胞株よりも１００〜１０００倍多いという事実から見てより可能性が高いと思われる。これらの他の腫瘍株ではＰＡＭ４による脾臓ターゲッティングがないことから、この現象は過剰な抗原産生に関連したものであることが示唆される。脾臓ターゲッティングは、タンパク質用量をもとの２μｇから１０μｇに増加させることによって克服することができる。脾臓にトラップされた抗原の多くは、おそらく放射性標識抗体ではなく非標識ＰＡＭ４と複合体を形成したものと思われる。タンパク質用量を増加させることで、腫瘍または非腫瘍組織へのＰＡＭ４のターゲッティングに悪影響はなかった。それどころか、タンパク質用量を１００μｇまで増加させることにより、ＣａＰａｎ１腫瘍内の放射性標識ＰＡＭ４濃度が２倍を超えた。
実施例４．無胸腺ヌードマウスにおける同所性膵腫瘍モデルの開発
動物モデルにおける膵癌の臨床症状をより近似させるため、本発明者らは、腫瘍細胞を膵頭に直接注入することにより同所性モデルを開発した。腹水が発症して１０〜１４週で死に至るまで、同所性ＣａＰａｎ１腫瘍は、明らかな症状を示さずに徐々に増殖した。移植後３〜４週までに、動物は触知可能な約０．２ｇの腫瘍を発生させた。増殖後８週以内に、約１．２ｇの原発性腫瘍が、肝臓や脾臓への転移を伴って見られた（１〜３個の転移腫瘍／動物；各腫瘍＜０．１ｇ）。１０〜１４週で腹水の発症を伴う横隔膜播種が明らかになった。通常、腹水の形成や時折生じる黄疸が、腫瘍増殖の最初の明らかな症状であった。この時点で、腫瘍は１〜２ｇとかなり大きく、動物には死に至るまで長くて３〜４週間しかなかった。
４週齢の同所性腫瘍（約０．２ｇ）を担持する動物に投与した放射性標識１３１Ｉ−ＰＡＭ４は、１日目に７．９±３．０の局在化指数で原発性腫瘍への特異的ターゲッティングを示し、１４日目には２２．８±１５．３に増加した。他の組織への特異的ターゲッティングの形跡は見られなかった。肝臓や脾臓への腫瘍転移が見られたある症例では、両転移ともターゲッティングされ、高濃度の放射性標識抗体を有していた。さらに、約半分の動物が切開部位に皮下腫瘍を発生させた。同じ動物の同所性腫瘍と皮下腫瘍のターゲッティングに有意な差は見られず、また、動物にさらなる皮下腫瘍があるかないかにかかわらず、同所性腫瘍のターゲッティングに有意な差は見られなかった。ＰＡＭ４から原発性腫瘍および血液への推定線量は、それぞれ６，７０４および１，６５５ｃＧｙ／ｍＣｉであった。
実施例５．膵癌の実験的放射免疫療法
治療のための１３１Ｉ−ＰＡＭ４の使用に関する最初の試験を、無胸腺マウスで皮下異種移植片として増殖したＣａＰａｎ１腫瘍を用いて行なった。同じような用量の非特異的Ａｇ８の治療効果も比較する試験において、０．２５ｇの腫瘍を担持する動物に３５０μＣｉの１３１Ｉ−ＰＡＭ４を投与した。１ｃｍ３の腫瘍を有する動物への１３１Ｉ−ＰＡＭ４の投与のＭＴＤは７００μＣｉである。５週目と６週目までに、ＰＡＭ４処置した動物は劇的な腫瘍退縮を示し、２７週でも８匹中５匹で腫瘍がない状態であった。無処置およびＡｇ８処置動物は、腫瘍増殖の急速な進行を示したが、これら２つの対照群の間で有意差は見られなかった。７週で、無処置群の腫瘍が最初の時点から２０．０±１４．６倍増殖したのに対し、１３１Ｉ−Ａｇ８処置腫瘍は４．９±１．８倍しか増殖していなかった。この時点で、ＰＡＭ４腫瘍はもとの大きさの０．１±０．１倍に退縮しており、無処置動物（ｐ＜０．００１）と非特異的Ａｇ８処置動物（ｐ＜０．０１）の両方と有意差があった。
これらのデータは、ＣａＰａｎ１腫瘍が１３１Ｉ−ＰＡＭ４による処置に感受性があったことを示している。転帰、すなわち、腫瘍の退縮または進行は、最初の腫瘍の大きさをはじめとするいくつかの要因に左右された。したがって、０．２５ｇ、０．５ｇ、ｌ．０ｇ、または２．０ｇのＣａＰａｎ１腫瘍負荷を担持する動物群を３５０μＣｉ １３１Ｉ−ＰＡＭ４の１回投与で処置した。最初の腫瘍の大きさが０．２５ｇおよび０．５ｇの動物の大多数（各群１０匹の動物中９匹）は、処置後少なくとも１６週間、腫瘍退縮または増殖阻害を示した。１．０ｇ腫瘍群では、７匹中５匹で、１６週間、腫瘍増殖がなく、また２．０ｇ腫瘍群では、９匹中６匹で、進行するまで６週間、腫瘍増殖がなかった。１回の３５０μＣｉの投与はより大きい腫瘍に対してそれほど効果的ではないが、１回投与は大きい腫瘍に対する適切な投与計画ではない可能性がある。
毒性試験によって、より大きい腫瘍負荷の場合により効果的な可能性がある放射免疫療法を複数回行なうことができることが示されている。平均１．０ｇのＣａＰａｎ１腫瘍を担持する動物に、３５０μＣｉ １３１Ｉ−ＰＡＭ４を１回投与するか、０時間と４週で２回投与するか、またはこれらの動物を無処置とした。無処置群の平均生存期間は３．７±１．０週であった（生存は腫瘍が５ｃｍ３に達するまでの時間と定義する）。動物は早くも３週で死亡し、６週を過ぎて生き残った動物はいなかった。３５０μＣｉ １３１Ｉ−ＰＡＭ４の１回投与により、生存期間は１８．８±４．２週まで有意に増加した（ｐ＜０．０００１）。動物の死亡の範囲は、１３週から２５週まで延長された。２６週の試験期間の終了時に生存していた動物はいなかった。
１回投与群と比較して２回投与群では生存期間の有意な増加が見られた。動物の半数が２６週の時点で生存しており、腫瘍の大きさは１．０〜２．８ｃｍ３で、平均腫瘍増殖率は最初の腫瘍の大きさから１．６±０．７倍であった。２６週で生存していなかった動物について、平均生存期間（１７．７±５．３週）は１回投与群と同程度であった。
ＰＡＭ４による治療試験も同所性腫瘍モデルを用いて行なった。４週齢の同所性腫瘍（推定腫瘍重量０．２５ｇ）を担持する動物群を無処置のままとするか、３５０μＣｉ １３１Ｉ−ＰＡＭ４または３５０μＣｉ １３１Ｉ−非特異的Ａｇ８の１回投与で処置した。無処置動物は１０週までに死亡率５０％を示し、１５週で生存しているものはいなかった。腫瘍増殖後４週で非特異的１３１Ｉ−Ａｇ８を投与した動物は、７週で死亡率５０％を示し、１４週で生存しているものはいなかった。これら２つの群の間に統計学的（ログランク解析）に有意な差はなかったが、Ａｇ８処置動物で放射線毒性が起こった可能性がある。放射性標識ＰＡＭ４は、無処置またはＡｇ８処置動物と比較して有意な生存利益をもたらし（ｐ＜０．００１）、実験の終了時の１６週で生存率７０％であった。この時点で、生存していた動物を屠殺し、腫瘍の大きさを測定した。全ての動物に平均重量１．２ｇの腫瘍があっただけでなく、７匹の動物中４匹で１つまたは２つの小さな（＜０．１ｇ）転移の形跡もあった。増殖後１６週の時点で、これらの腫瘍は８週齢の腫瘍により典型的なものであった。
実施例６．ジェムザール（登録商標）化学療法と１３１Ｉ−ＰＡＭ４実験的放射免疫療法の併用モダリティ
ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））と１３１Ｉ−ＰＡＭ４放射免疫療法の併用の最初の試験は格子状アレイとして行ない、ゲムシタビン１回量（０、１００、２００、５００ｍｇ／ｋｇ）に対して１３１Ｉ−ＰＡＭ４ １回量（［ＭＴＤ＝７００μＣｉ］ＭＴＤの１００％、７５％、５０％、０％）とした。組み合わされたＭＴＤは、５００ｍｇ／ｋｇゲムシタビンと３５０μＣｉ １３１Ｉ−ＰＡＭ４（５０％ＭＴＤ）であることが分かった。体重減少により測定される毒性は、無毒とみなされる最大値、すなわち、体重の２０％の減少にまで至った。併用治療プロトコルはゲムシタビン単独よりも有意に効果的であったが、この治療の効果は放射免疫療法単独と同程度であった。次の試験は、真の相乗的治療効果が見られるかどうかを調べるために、低用量のゲムシタビンと放射免疫療法で行なった。約１ｃｍ３（体重の約５％）の腫瘍を担持する無胸腺ヌードマウスに、０、３、６、９、および１２日目にゲムシタビン１００ｍｇ／ｋｇを投与し、０日目に１００μＣｉの１３１Ｉ−ＰＡＭ４を投与した。ゲムシタビン単独と比較して統計学的に有意（ｐ＜０．０００１）な腫瘍の退縮（５つの腫瘍のうち２つが０．１ｃｍ３未満）および／または腫瘍の増殖阻害を伴って治療効果が見られた。したがって、驚くべきことに、より少ない投薬量の治療剤で、ゲムシタビンと放射免疫療法の併用の相乗効果があるように思われる。さらに留意すべきは、体重の点で、毒性が見られなかったことである。この併用治療プロトコルは、必要であれば、上記の放射免疫療法単独試験で行なったように、４週目に２回目の治療サイクルを開始して、複数回行なうことができる。
実施例７．二重特異性ｃＰＡＭ４×７３４と９９ｍＴｃまたは１１１Ｉｎ標識ペプチドハプテンを用いるプレターゲッティング
プレターゲッティングアプローチを用いる膵癌のイメージングのために、本発明者らは、キメラＰＡＭ４（ｃＰＡＭ４）Ｆａｂ’とマウス７３４（ｍ７３４）Ｆａｂ’からなる二重特異性Ｆ（ａｂ’）２抗体（ｂｓＭＡｂ）を調製した。マウス７３４抗体はＩｎ−ＤＴＰＡ錯体を認識する。このｂｓＭＡｂを１２５Ｉ（７μＣｉ）で標識し、ヒト膵癌異種移植片（ＣａＰａｎ１）を担持する無胸腺ヌードマウスに注射した。キメラリツキシマブ（抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）とｍ７３４から作製した非ターゲッティングＦ（ａｂ’）２ ｂｓＭＡｂを１３１Ｉで標識し、対照として同時注射した。様々な時点（注射後４、２４、３６、４８、および７２時間）でマウスを解剖し、組織を摘出し、計数してグラム当たりの注射量パーセント（％ＩＤ／ｇ）を測定した。対照ｂｓリツキシマブと比較して、各時点でのｂｓＰＡＭ４の腫瘍取込みは有意に多かった（ｐ＜０．０３２またはそれより良い）。このタイプのプレターゲッティング系を用いた本発明者らのこれまでの実験から、良好な腫瘍：非腫瘍比を得るには１％ＩＤ／ｇ未満の血液レベルが必要であることが示唆された。ｂｓＰＡＭ４の投与後３６時間では、血中１．１０±０．４０％ＩＤ／ｇであったが、注射後４８時間では０．５６±０．０８％ＩＤ／ｇまで下がった。これら２つの時点での腫瘍取込みは、それぞれ６．４３±１．５０％ＩＤ／ｇおよび５．３７±２．３８％ＩＤ／ｇであった。これらの値は、３６時間および４８時間の時点で、それぞれ腫瘍中０．６５±０．３３％ＩＤ／ｇおよび０．４７±０．１９％ＩＤ／ｇ（ｐ＜０．０１８およびｐ＜０．００９８）であった対照ｂｓリツキシマブよりも有意に高かった。しかしながら、血液クリアランス速度は非常によく似ており、有意な差はなかった。
これらのデータに基づき、ＣａＰａｎ１腫瘍を担持するマウスでプレターゲッティング実験を行なった。このマウスには、放射性標識ペプチド−ハプテンをｂｓＭＡｂ投与の４０時間後に投与した。２つのペプチドＩＭＰ−１９２およびＩＭＰ−１５６を使用し、これらは各々、７３４ＭＡｂによる認識のための二価ＤＴＰＡを含んでいたが、一方は、９９ｍＴｃを安定に結合させるために特異的な付加的な基を含んでいた（ＩＭＰ−１９２）。担腫瘍マウス（腫瘍体積は約０．３０ｃｍ３）に１２５Ｉ−ｂｓＰＡＭ４（６μＣｉ）を投与し、４０時間後に放射性標識ペプチド−ハプテン（３４．５μＣｉ；１．５×１０−１１モル；ｂｓＭＡｂ：ペプチド＝１０：１）を投与した。一方のマウス群に９９ｍＴｃ標識ＩＭＰ１９２を投与し、もう一方のマウス群には１１１Ｉｎ標識ＩＭＰ１５６を投与した。非特異的ターゲッティングの対照には、放射性標識ペプチドの投与前に１２５Ｉ−ｂｓリツキシマブを投与した２つの群と、１１１Ｉｎまたは９９ｍＴｃ標識ペプチド単独を投与した別の２つの群とが含まれた。
ペプチドを投与してから３時間および２４時間後にマウスを屠殺し、腫瘍および様々な組織について％ＩＤ／ｇを測定した。本発明者らのこれまでの知見と一致して、非ターゲッティング対照ｂｓリツキシマブと比較して腫瘍におけるｂｓＰＡＭ４は有意に多く、それぞれ８．２±３．４％および０．３±０．０８％ＩＤ／ｇ（ｐ＜０．０００１）であった。これは、有意に多い１１１Ｉｎ−ＩＭＰ１５６の腫瘍取込みに換算された（２０．２±５．５％ＩＤ／ｇ対０．９±０．１％ＩＤ／ｇ、ｐ＜０．０００１）。ｂｓＰＡＭ４でプレターゲッティングしたマウスにおける９９ｍＴｃ−ＩＭＰ１９２の腫瘍取込みも、ｂｓリツキシマブでプレターゲッティングしたマウスにおける腫瘍取込みよりも有意に多かった（１６．８±４．８％ＩＤ／ｇ対１．１±０．２％ＩＤ／ｇ、ｐ＜０．０００５）。単独で投与した場合の各ペプチドの腫瘍取込みは、ｂｓＰＡＭ４を投与したマウスの場合よりも有意に少なかった（９９ｍＴｃ−ＩＭＰ１９２および１１１Ｉｎ−ＩＭＰ１５６について、０．２±０．０５％ＩＤ／ｇおよび０．１±０．０３％ＩＤ／ｇ、それぞれ、ｐ＜０．０００４およびｐ＜０．０００１）。
３時間の時点と同様、ペプチド注射から２４時間後（ｂｓＭＡｂ投与から６４時間後）の腫瘍中のｂｓＰＡＭ４は、ｂｓリツキシマブよりも有意に多かった（それぞれ、６．４±２．２％ＩＤ／ｇ対０．２±０．０９％ＩＤ／ｇ；ｐ＜０．０００１）。この時点で、ｂｓＰＡＭ４でプレターゲッティングされたマウスの腫瘍では１１．１±３．５％ＩＤ／ｇ １１１Ｉｎ−ＩＭＰ１５６および１２．９±４．２％ＩＤ／ｇ ９９ｍＴｃ−ＩＭＰ１９２であったのに対して、ｂｓリツキシマブでプレターゲッティングされた腫瘍では０．５±０．２％ＩＤ／ｇおよび０．４±０．０３％ＩＤ／ｇであった（それぞれ、ｐ＜０．０００８およびｐ＜０．０００２）。ペプチド単独を投与したマウスでは、ｂｓＰＡＭ４でプレターゲッティングしたペプチドと比較して、腫瘍における９９ｍＴｃ−ＩＭＰ１９２（０．０６±０．０２％ＩＤ／ｇ、ｐ＜０．０００７）および１１１Ｉｎ−ＩＭＰ１５６（０．０９±０．０２％ＩＤ／ｇ、ｐ＜０．０００２）は有意に少なかった。
Figure 0005919604
表５は、これらの群について、各々、放射性標識産物の投与後の早い時点での、様々な組織の腫瘍：非腫瘍比（Ｔ：ＮＴ）を示している。ｂｓＰＡＭ４×ｍ７３４Ｆ（ａｂ’）２の投与後４時間で、腫瘍：血液比が２：１より小さかったことに注目することが重要である。しかしながら、投与後３時間では、プレターゲッティングされた１１１Ｉｎ−ＩＭＰ１５６および９９ｍＴｃ−ＩＭＰ１９２は、調べた全ての組織について有意により高い腫瘍：非腫瘍比を示し、特に、腫瘍：血液比は３６：１および９：１に相当した（それぞれ、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０１１）。本発明者らが２４時間の時点の腫瘍：血液比を調べたところ、１２５Ｉ−ｂｓＰＡＭ４単独では４：１であるのに対し、プレターゲッティングされた１１１Ｉｎ−ＩＭＰ１５６および９９ｍＴｃ−ＩＭＰ１９２は、それぞれ２７４：１および８０：１と、有意に高い値を示した（ｐ＜０．０００２）。これらのデータは、このプレターゲッティングｂｓＰＡＭ４アプローチを、非腫瘍組織には最小の線量としながら腫瘍には高い線量を送達する、半減期の短い高エネルギーの放射性同位体とともに使用することができることを強く裏付けるものである。
実施例８．トランスフェクトされた細胞株に対するＰＡＭ４抗体の結合
トランスフェクトされた膵臓細胞
ＭＵＣ−１ムチンを発現しないＰａｎＣ１ヒト膵腺癌細胞に、ＭＵＣ−１をコードするｃＤＮＡ（これは、Ｈｕｄｓｏｎら（Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４８，３：９５１−６０，１９９６）に開示されており、Ｍ．Ａ．Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ博士（Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｎｅｂｒａｓｋａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｏｍａｈａ，ＮＥ）から得られたものである）をトランスフェクトした。このＭＵＣ−１ ｃＤＮＡは、３０タンデムリピート（３０ＴＲ）型か、または４２タンデムリピート（４２ＴＲ）型のいずれかのＭＵＣ−１をコードしていた（Ｈｕｄｓｏｎら，１９９６；Ｌｉｄｅｌｌら，ＦＥＢＳ Ｊ．２７５：４８１−８９，２００８）。このＭＵＣ−１配列は、コードされたタンデムリピート配列の数以外の点では同じであった。
細胞培養物由来の上清の酵素免疫アッセイにより、ＰＡＭ４抗体との反応性について、３０ＴＲもしくは４２ＴＲ ＭＵＣ−１または対照ベクター（インサートなし、もしくは逆向きのインサート）のいずれかをトランスフェクトされたＰａｎＣ１細胞あるいはトランスフェクトされていないＰａｎＣ１細胞を調べた。免疫アッセイにより、トランスフェクトされていないＰａｎＣ１細胞も対照をトランスフェクトされたＰａｎＣ１細胞も検出可能なレベルのＰＡＭ４反応性ムチンを産生しなかった（図示せず）。しかしながら、３０ＴＲ ＭＵＣ−１をトランスフェクトされた細胞と４２ＴＲ ＭＵＣ−１をトランスフェクトされた細胞は両方とも、ＰＡＭ４抗体と極めてよく反応した（図示せず）。
トランスフェクトされたＰａｎＣ１細胞を、より感度の高い免疫アッセイを用いて再検討した。簡潔に述べると、約８０％〜９０％コンフルエンシーに達するまで（最初の播種から約４〜５日）、細胞をＴ７５フラスコで増殖させた。この時点で、使用済み培地を回収し、高速で遠心分離し、酵素免疫アッセイによるＰＡＭ４反応性ムチンの定量に用いた。細胞も回収し、計数した。Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ博士から得たＰａｎｃ１親細胞株とＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した別のＰａｎｃ１細胞の両方、およびベクター対照が、わずかではあるけれども検出可能な量のＰＡＭ４反応性ムチンを産生した（それぞれ、０．８７±０．１７、０．５４±０．１７、および０．０２±０．０２μｇ／ｍＬ／１０６細胞）のに対し、３０ＴＲ−ＭＵＣ−１遺伝子をトランスフェクトされた細胞は、１４．１７±２．２２μｇ／ｍＬ／１０６細胞を産生した（他の全ての試料と比較した、３０ＴＲ−ＭＵＣ−１遺伝子をトランスフェクトした培地と比較した場合、Ｐ＜０．０００３またはそれより良い）。
ＭＵＣ−１ ｃＤＮＡによるＰａｎＣ１細胞のトランスフェクションは、トランスフェクトされたＰａｎＣ１細胞によるＭＵＣ−１の発現が増大するのに加えて、トランスフェクトされた細胞におけるサイトケラチン８および１８のレベルの増大などの、細胞タンパク質発現に対する２次的影響も有するが（Ｈｕｄｓｏｎら，１９９６，要旨）、これは、より長い（４２ＴＲ）ＭＵＣ−１ ｃＤＮＡをトランスフェクトされた細胞のみに見られることが報告されている（Ｈｕｄｓｏｎら．１９９６，ｐｇ．９５６，ｃｏｌ．第１、第３段落）。
トランスフェクトされた腎臓細胞
ＭＵＣ−１遺伝子をトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３（ヒト胎児腎臓細胞）は、ＭＡ５モノクローナル抗体と反応するが、ＰＡＭ４とは反応しないＭＵＣ−１を産生した（図示せず）。しかしながら、上で論じたように、非常に低レベルの内在性ＭＵＣ−１を発現するＭＵＣ−１トランスフェクトＰａｎＣ１細胞は、ＰＡＭ４と強く反応し、ＭＡｂ−ＭＡ５とは反応しないＭＵＣ−１を合成した。異種サンドイッチ免疫アッセイ（ＰＡＭ４→ＭＡ５およびＭＡ５→ＰＡＭ４キャプチャー／プローブ）は、いくつかの細胞株由来の上清でシグナルを生じさせるように機能しなかった。ＰＡＭ４またはＭＡ５ ＭＡｂをキャプチャー試薬として使用しながら、ポリクローナル抗ムチン抗血清をプローブとして使用すると、効果的な免疫アッセイが実際に得られた。ポリクローナルをプローブとして用いるそれぞれの免疫アッセイにおけるこれら２つのＭＡｂの交差遮断により、これらのＭＡｂが独立したエピトープと反応することが示唆された。
このデータから、ＰＡＭ４およびＭＡ５エピトープは同じ抗原性分子内で共発現されていないこと、ならびにＰａｎＣ１細胞株はＰＡＭ４エピトープを作り出す生合成過程を有する可能性があるが、ＨＥＫ−２９３細胞は有していないことが示唆される。ＭＵＣ−１タンパク質コアの翻訳後修飾（特定の糖転移酵素の発現／活性）の相違がこうした発見の原因である可能性がある。
実施例９．ＰＡＭ４抗原の免疫反応性に対する試薬処理の影響
膵臓ムチンＰＡＭ４抗原をＤＴＴで処理すると（室温で１５分間）、ＰＡＭ４との反応性が完全に消失した（ＤＴＴ−ＥＣ５０、０．６０±０．００μＭ）。ＭＵＣ−１の唯一のシステイン（シスチン架橋）は膜貫通ドメインに存在し、ＤＴＴが接近できるはずがない。分泌型のＭＵＣ−１は膜貫通ドメインを含まず、それゆえ、分子内シスチン架橋を有さない。０．０５Ｍの過ヨウ素酸ナトリウムを用いて室温で２時間、ＰＡＭ４抗原を過ヨウ素酸酸化処理して得られたデータから、ＰＡＭ４抗体との免疫反応性が４０％失われたことが示された（図示せず）。さらなる過ヨウ素酸研究により、ＰＡＭ４抗体との免疫反応性が６０％も失われたことが示されている（図示せず）。過ヨウ素酸研究とＤＴＴ研究の結果から、ＰＡＭ４エピトープが、何らかの最小形態のグリコシル化に立体構造的に依存しており、分子間ジスルフィド結合形成によって影響され得ることが示唆されている。
実施例１０．ＰＡＭ４抗原の分布および交差反応性
ＰａｎＩＮでのＰＡＭ４エピトープの発現は、ＭＵＣ−１に典型的なものと違っている。この発現は、市販のＭＡｂ−ＣＬＨ２−２で検出されるＭＵＣ−５ａｃについて報告されている発現によく似ている。しかしながら、ＰＡＭ４キャプチャーとＭＡｂ−ＣＬＨ２−２をプローブとして用いてサンドイッチ免疫アッセイを試みると、ネガティブな結果が得られた。これは、ＰＡＭ４エピトープとＣＬＨ２−２エピトープが重なり、したがって互いに遮断し合う可能性があることを示唆するものであると思われるが、ＣＬＨ２−２が４２／６６（６４％）の胃癌と反応するのに対し、ＰＡＭ４ ＭＡｂは、わずか６／４０（１５％）の胃癌、かつこのうち、局所的に反応するものとの反応性しか示さないことが報告された。
ＥＩＡで（ＰＡＭ４をキャプチャーとして用いて）市販の４５Ｍ１という抗ＭＵＣ−５ａｃ ＭＡｂ抗体をプローブ試薬として用いると、ポジティブな結果が得られ、この２つのエピトープが同じ抗原性分子上に存在する可能性があることが示される。（両方向の）遮断研究により、遮断は見られなかったので、４５Ｍ１が結合するエピトープとＰＡＭ４が結合するエピトープが、実際には２つの別々のエピトープであることが示された。浸潤性膵癌由来のコアからなる組織マイクロアレイの標識により、個々の患者標本における４５Ｍ１エピトープとＰＡＭ４エピトープの発現に顕著な相違が示された。２８標本のうち、一致は１７症例（６１％）でしか見られなかった。ＰＡＭ４が２８症例中２４症例（８６％）と反応したのに対し、４５Ｍ１は２８症例中１３症例（４６％）と反応した（図示せず）。
ＭＵＣ−１遺伝子トランスフェクションに関する上記の研究（実施例８）で、ＭＵＣ−１の発現は別のムチンの発現を上方調節したか、または何らかの他の方法でＰＡＭ４エピトープの曝露に影響を及ぼした可能性があり得る。過ヨウ素酸研究の結果は、ＰＡＭ４抗原のＰＡＭ４抗体との免疫反応性における因子としてのグリコシル化と一致している。したがって、アポムチンを用いた研究の結果は、抗原決定を確定するものではない可能性がある。
ＥＩＡキャプチャーに基づくと、ＰＡＭ４抗体は、４５Ｍ１という抗ＭＵＣ−５ａｃ ＭＡｂと同じ抗原性タンパク質に結合するように見えるが、ＭＵＣ−５ａｃは膵癌に特異的なものではなく、いくつかの正常組織（ＰＡＭ４が反応する胃粘膜以外）に見られることに留意する。例えば、ＭＵＣ−５ａｃは、正常な肺、結腸、および他の組織で見られる。ＰＡＭ４抗体は、少数の試料において、限られた量または最低限の量まで、上で示されている場合を除き、正常肺組織に結合しない。
ＤＴＴおよび過ヨウ素酸の効果に関して、ペプチドコアのジスルフィド架橋は、どのような組織がタンパク質を産生しても同一であると思われる。特定のアミノ酸配列は、組織源とは無関係に、特定の方法で折り畳まれるはずである。しかしながら、グリコシル化のパターンは、組織源によって異なる可能性がある。
実施例１１．ＰＡＭ４抗体のファージディスプレイペプチド結合
２つの異なるファージディスプレイペプチドライブラリーを用いてＰＡＭ４抗体結合を調べた。第１のものは、１２個のアミノ酸配列からなる線状ペプチドライブラリーであり、第２のものは、ジスルフィド架橋で環化した７個のアミノ酸配列からなる環状ペプチドであった。本発明者らは、合わせて合計４ラウンドの間、個々のライブラリーを交互にｈＰＡＭ４とｈＬＬ２に対してパニングし（抗ＣＤ２２抗体によるネガティブ選択）、その後、ファージディスプレイされたペプチドを、ｈＬＬ２に対する反応性が皆無かそれに近く、ｈＰＡＭ４とｍＰＡＭ４の両方と反応するかどうかついてスクリーニングした。非特異的な形でのファージ結合（すなわち、エプラツズマブ［ｈＬＬ２］に対する結合）を廃棄した。
線状ペプチドディスプレイペプチドについては、配列 ＷＴＷＮＩＴＫＡＹＰＬＰ（配列番号２９）が（３５個のシーケンシングされたファージ中）３０回同定され、その各々にＰＡＭ４抗体との反応性があることが示された。突然変異解析を行なったが、この解析では、この配列をベースとし、各位置で７．５％の縮重を有するライブラリーを先に述べた通りに構築し、パニングし、スクリーニングした。変動性は、ＰＡＭ４結合が陽性の得られた１９個のペプチド配列で認められ、７個はもとの配列と同一であり、５個は配列ＷＴＷＮＩＴＫＥＹＰＱＰ（配列番号３１）を有し、残りは独特のものとして存在していた。表６は、この突然変異解析の結果を示す。上の列に同定された配列を示し、下の列に各々のアミノ酸がその位置で同定された頻度を示す。もとの配列が最も頻度が高く（太字）、次ぎに多い変動は、位置８のＡがＥに置換されたものおよび位置１１のＬがＱに置換されたものであった。これらの置換は免疫反応性に何ら大きな影響を与えなかったようである。
Figure 0005919604
ファージディスプレイ環状ライブラリーでの結果は、線状ライブラリーとは顕著に異なっていた（表７）。配列ＡＣＰＥＷＷＧＴＴＣ（配列番号３０）は、調べた３５個のペプチド中３３個で存在していた。環状ライブラリーの解析は以下の結果示した（アステリスクの付いた位置は不変であり、ライブラリーでの選択圧を受けなかった）。
Figure 0005919604
（位置２および１０の）２つのシステインはジスルフィド架橋を形成した。任意のアミノ酸による位置９のＴの置換は、免疫反応性に大いに影響を及ぼした。配列ＧＴＴＧＴＴＣ（配列番号３２）は、上で示した環状ペプチド配列と比較した場合、ＭＵＣ−５ａｃタンパク質中にアミノ末端に向かって存在するが、これは、コンセンサスペプチド配列のＣ末端において相同性を示す。しかしながら、環状ペプチドは、線状配列とＰＡＭ４抗体の免疫反応性の約１０％を示すに過ぎない。線状コンセンサス配列と環状コンセンサス配列は両方ともシステインを伴うが、これは、ＰＡＭ４抗原免疫反応性に対するＤＴＴの影響と関係する場合もあるし、関係しない場合もある。
本明細書に報告された結果は、ＰＡＭ４エピトープが、ジスルフィド架橋、および特定のグリコシル化パターンによって生じ得る、特定の立体構造によって決まることを示している。
実施例１２．膵炎標本における膵癌の免疫組織学
膵炎、糖尿病、喫煙などのような、いくつかの病理学的条件によって、患者に膵癌が発生しやすくなる。この予め選択された患者群において、スクリーニング手段は、膵臓新生物の早期検出に特に重要である。本発明者らは、この疾患の一次診断を受けた患者由来の９つの慢性膵炎組織標本を検討した。本発明者らは、抗ＣＤ７４ ＭＡｂと、炎症性浸潤の指標としてのＬＬ１と、膵管細胞および膵腺房細胞の陽性対照としてのＭＡｂ−ＭＡ５とを用いた。２つの対照ＭＡｂが膵炎と一致する免疫組織学的証拠を提供したのに対し、ＰＡＭ４が炎症を起こした膵組織と反応した例はなかった。しかしながら、１つの症例で、中分化膵腺癌も組織標本中に存在していた。ＰＡＭ４は、この腫瘍内の新生物細胞を強く染色した。２つめの症例では、炎症を起こした組織はＰＡＭ４で陰性であったが、ＰＡＭ４で標識される小さなＰａｎＩＮ前駆病変が同定された。この後者の標本内でのＰａｎＩＮの標識は、非悪性疾患と診断された患者の膵臓新生物の早期検出と一致する。これらの結果は、ＰＡＭ４抗体を用いた検出および／または診断を、良性膵組織のバックグラウンドと対照させて膵臓新生物に対して高感度および高選択性に実施し得るを示している。
実施例１３．手術不能かつ転移性の膵癌を有する患者の治療
患者１１８−００１、ＣＷＧは、複数の肝転移があるステージＩＶの膵腺癌を有する６３歳の男性であり、２００７年１１月に診断を受けた。この患者は、第１の治療戦略として放射免疫療法とゲムシタビン化学療法の併用を開始することに同意し、その後、６．５ｍＣｉ／ｍ２の９０Ｙ−ｈＰＡＭ４を２００ｍｇ／ｍ２のゲムシタビンと併用した最初の治療サイクルを投与され、このサイクルに従って、ゲムシタビンが週１回で１〜４週目に投与され、９０Ｙ−ｈＰＡＭ４が週１回で２〜４週目に（３用量）投与された。最初のサイクルの後、大きな毒性が認められなかったので、２カ月後、同じ治療サイクルを繰り返した。驚くことに、最初の治療サイクルから４週間後にすでに、ＣＴによる原発腫瘍と３つのうち２つの肝転移の直径の減少の証拠が認められ、これは、ＦＤＧ−ＰＥＴスキャンのＳＵＶ値の顕著な減少と一致しており、４つの腫瘍のうち３つが、この時点で通常のバックグラウンドレベルに戻っていた（図６および図７）。患者の治療前の１，２９７というＣＡ−１９．９レベルは、７７という低いレベルにまで落ち、治療が効果的であることをさらに裏付けた。表８は、この患者における９０Ｙ−ｈＰＡＭ４を用いた放射免疫療法とゲムシタビン化学療法の併用の効果を示す。抗体にコンジュゲートされた、このような低い用量の放射性核種を、このような低く、毒性のない用量のゲムシタビンと併用することで、わずか１クールのこの治療の後ですら、このような抗腫瘍活性が示されたのは、驚くべきことであり、また予期しないことであった。
Figure 0005919604
実施例１４．手術不能な転移性膵癌を有する患者の治療
広範囲の手術不能膵腺癌を有し、直径１〜４ｃｍに及ぶいくつかの肝転移、大幅な体重減少（体重３０ｌｂ以上）、軽度の黄疸、無気力、および衰弱、ならびに投薬が必要な腹痛を有する５６歳の男性に、各々２００ｍｇ／ｍ２の用量でゲムシタビン注入を４週投与する。最後の３回のゲムシタビン注入時に、９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ｈＰＡＭ４放射性標識ヒト化抗体を、２時間のｉ．ｖ．注入で、１０ｍＣｉ／ｍ２の９０Ｙおよび２０ｍｇ抗体タンパク質の用量で投与する。２週間後、患者に、ｉ．ｖ．注入による６００ｍｇ／ｍ２の３週用量からなる１クールのゲムシタビン化学療法を投与する。次に、患者を４週間後に評価すると、患者は、軽度の白血球減少（グレード２）を示し、ベースラインを超える大きな血液または酵素の変化は他に見られないが、５，７００から１，２００への血液ＣＡ１９．９力価の改善と黄疸の軽減とを示し、全体的な主観的改善がある。３週間後、より低い用量のゲムシタビン（週１回×４）と、３用量の９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ｈＰＡＭ４のサイクルを繰り返す。４週間後、患者を再評価し、ＣＴスキャンとＰＥＴスキャンにより、全腫瘍塊（原発癌と転移）が約４０％低下したことと、ＣＡ１９．９力価が８７０までさらに低下したことが確認される。患者は食欲と活動を取り戻し、痛み止めを必要とせずに、より普通の日常活動に復帰することができる。この患者は、この実験的治療を開始してから１２ｌｂ太った。スキャンと血液値の繰り返しにより、この応答が６週後まで維持されることが示されている。
実施例１５．プレターゲッティング用のドック・ロック（ＤＮＬ）構築物の調製
ＤＤＤ融合タンパク質およびＡＤ融合タンパク質
ＤＮＬ技術を用いて、ほとんど全ての抗体もしくはその断片または他のエフェクター部分を含む、二量体、三量体、四量体、六量体などを作製することができる。特定の好ましい実施形態のために、ＩｇＧ抗体またはＦａｂ抗体断片を、二量体化・ドッキングドメイン（ＤＤＤ）配列またはアンカリングドメイン（ＡＤ）配列のいずれかを含む融合タンパク質として産生し得る。好ましい実施形態では、ＤＤＤ部分とＡＤ部分は融合タンパク質として産生されるが、当業者であれば、化学的架橋などの、他のコンジュゲーション方法を特許請求された方法および組成物の範囲内で利用し得ることを理解するであろう。
二重特異性抗体を、第１の抗体のＦａｂ−ＤＤＤ融合タンパク質と第二の抗体のＦａｂ−ＡＤ融合タンパク質を組み合わせることによって形成してもよい。あるいは、ＩｇＧ−ＡＤ融合タンパク質とＦａｂ−ＤＤＤ融合タンパク質を組み合わせた構築物を作製してもよい。この技術は限定的なものではなく、任意の有用なタンパク質またはペプチドを、ＤＮＬ構築物に組み込むためのＡＤ融合タンパク質またはＤＤＤ融合タンパク質として産生してもよい。化学的架橋を利用する場合、ＡＤコンジュゲートまたはＤＤＤコンジュゲートは、タンパク質またはペプチドに限定されず、当該技術分野で公知の任意の架橋技術を用いてＡＤ配列またはＤＤＤ配列に架橋し得る任意の分子を含んでいてもよい。特定の例示的な実施形態では、以下でさらに詳細に記載されるように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他のポリマー部分をＤＮＬ構築物に組み込んでもよい。
プレターゲッティング用途のために、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）などの、罹患組織と関連する抗原への結合部位を含む抗体または断片を、治療剤および／または診断剤が付加されているターゲッティング可能な構築物上のハプテンに結合する第２の抗体または断片と組み合わせてもよい。ＤＮＬベースの二重特異性抗体を対象に投与し、循環抗体を身体からクリアランスさせ、標的組織に局在化させて、コンジュゲートしたターゲッティング可能な構築物を加え、これが、局在化した診断または治療用の抗体に結合する。
独立のトランスジェニック細胞株を、各々のＦａｂまたはＩｇＧ 融合タンパク質用に開発してもよい。ひとたび産生されれば、これらのモジュールを、必要に応じて精製するか、または細胞培養上清液中で維持することができる。産生後、任意のＤＤＤ−融合タンパク質モジュールを任意のＡＤ−融合タンパク質モジュールと組み合わせて、二重特異性ＤＮＬ構築物を作製することができる。様々なタイプの構築物のために、様々なＡＤ配列またはＤＤＤ配列を利用してもよい。例示的なＤＤＤ配列とＡＤ配列を以下に示す。
ＤＤＤ１：ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３３）
ＤＤＤ２：ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３４）
ＡＤ１：ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３５）
ＡＤ２：ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号３６）
発現ベクター
プラスミドベクターｐｄＨＬ２は、いくつかの抗体および抗体ベースの構築物を産生するのに使用されている。Ｇｉｌｌｉｅｓら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８９），１２５：１９１−２０２；Ｌｏｓｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ（Ｐｈｉｌａ）（１９９７），８０：２６６０−６を参照されたい。このジシストロン性の哺乳動物発現ベクターはＩｇＧの重鎖と軽鎖の合成を導く。ベクター配列は、多くの様々なＩｇＧ−ｐｄＨＬ２構築物とほとんど同じであり、唯一の違いは可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）配列に存在する。当業者に公知の分子生物学のツールを用いて、これらのＩｇＧ発現ベクターをＦａｂ−ＤＤＤまたはＦａｂ−ＡＤ発現ベクターに変換することができる。Ｆａｂ−ＤＤＤ発現ベクターを作製するために、重鎖のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインのコード配列を、ヒンジの最初の４残基、１４残基のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー、およびヒトＲＩＩαの最初の４４残基をコードする配列と置き換えた（ＤＤＤ１と表す）。Ｆａｂ−ＡＤ発現ベクターを作製するために、ＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの配列を、ヒンジの最初の４残基、１５残基のＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー、およびバイオインフォマティックスとペプチドアレイ技術を用いて作製され、ＲＩＩα二量体と極めて高い親和性（０．４ｎＭ）で結合することが示された、ＡＫＡＰ−ＩＳと呼ばれる１７残基の合成ＡＤをコードする配列と置き換えた（ＡＤ１と表す）。Ａｌｔｏら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ（２００３），１００：４４４５−５０を参照されたい。
ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターをＦａｂ−ＤＤＤ１発現ベクターまたはＦａｂ−ＡＤ１発現ベクターのいずれかに変換しやすくするために、２つのシャトルベクターを以下に記載するように設計した。
ＣＨ１の調製
ｐｄＨＬ２プラスミドベクターを鋳型として用いてＣＨ１ドメインをＰＣＲで増幅した。左側のＰＣＲプライマーは、ＣＨ１ドメインの上流（５’）末端と、ＣＨ１コード配列の５’にあるＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位とからなっていた。右側のプライマーは、ヒンジ（ＰＫＳＣ）の最初の４残基、続いて４つのグリシンと１つのセリンをコードする配列からなり、最後の２つのコドン（ＧＳ）はＢａｍＨＩ制限部位を含んでいた。４１０ｂｐのＰＣＲ増幅物をＰＧＥＭＴ（登録商標）ＰＣＲ クローニングベクター（ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標），Ｉｎｃ．）にクローニングし、クローンをＴ７（５’）方向での挿入についてスクリーニングした。
（Ｇ４Ｓ）２ＤＤＤ１の構築（（Ｇ４Ｓ）２は配列番号３７として開示されている）
（Ｇ４Ｓ）２ＤＤＤ１（配列番号３７として開示された（Ｇ４Ｓ）２）と表される二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＤＤ１のアミノ酸配列と、その前の１１残基のリンカーペプチドをコードし、最初の２つのコドンがＢａｍＨＩ制限部位を含むように、 Ｓｉｇｍａ ＧＥＮＯＳＹＳ（登録商標）（Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ，ＵＫ）により合成された。終止コドンとＥａｇＩ制限部位は３’末端に付加されている。コードされたポリペプチド配列を以下に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３８）
それらの３’末端で３０塩基対だけ重複する、ＲＩＩＡ１−４４上およびＲＩＩＡ１−４４下と表される２つのオリゴヌクレオチドは、１７４ｂｐのＤＤＤ１配列の中央の１５４塩基対を含むように合成され（Ｓｉｇｍａ ＧＥＮＯＳＹＳ（登録商標））、組み合わされた。これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、Ｔａｑポリメラーゼによるプライマー伸張反応にかけた。プライマー伸張後、二重鎖をＰＣＲで増幅した。増幅物をＰＧＥＭＴ（登録商標）にクローニングし、Ｔ７（５’）方向での挿入についてスクリーニングした。
（Ｇ４Ｓ）２−ＡＤ１の構築（（Ｇ４Ｓ）２は配列番号３７として開示されている）
（Ｇ４Ｓ）２−ＡＤ１（配列番号３７として開示された（Ｇ４Ｓ）２）と表される二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＡＤ１のアミノ酸配列と、その前の１１残基のリンカーペプチドをコードし、最初の２つのコドンがＢａｍＨＩ制限部位を含むように、合成された（Ｓｉｇｍａ ＧＥＮＯＳＹＳ（登録商標））。終止コドンとＥａｇＩ制限部位は３’末端に付加されている。コードされたポリペプチド配列を以下に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３９）
ＡＫＡＰ−ＩＳトップおよびＡＫＡＰ−ＩＳボトムと表される、上記のペプチド配列をコードする２つの相補的な重複オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングさせた。この二重鎖をＰＣＲで増幅した。増幅物をＰＧＥＭＴ（登録商標）ベクターにクローニングし、Ｔ７（５’）方向での挿入についてスクリーニングした。
ＤＤＤ１とＣＨ１の連結
ＤＤＤ１配列をコードする１９０ｂｐの断片を、ＢａｍＨＩ制限酵素とＮｏｔＩ制限酵素を用いてＰＧＥＭＴ（登録商標）から切り出し、その後、ＣＨ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）中の同じ部位に連結して、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を作製した。
ＡＤ１とＣＨ１の連結
ＡＤ１配列を含む１１０ｂｐの断片を、ＢａｍＨＩ制限酵素とＮｏｔＩ制限酵素を用いてＰＧＥＭＴ（登録商標）から切り出し、その後、ＣＨ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）中の同じ部位に連結して、シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を作製した。
ＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のｐｄＨＬ２ベースのベクターへのクローニング
このモジュール設計を用いて、ＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のいずれかをｐｄＨＬ２ベクター中の任意のＩｇＧ構築物に組み込むことができる。ｐｄＨＬ２からＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ制限断片（ＣＨ１−ＣＨ３）を除去し、それを、それぞれのｐＧｅｍＴシャトルベクターから切り出される、ＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ断片と置き換えることによって、重鎖定常ドメイン全体が上記の構築物のうちの１つと置き換えられる。
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２の構築
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２は、１４アミノ酸残基から構成された柔軟なＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドスペーサーを介してＡＤ１がＦｄのＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に結合したｈ６７９ Ｆａｂを産生するための発現ベクターである。ｈ６７９の可変ドメインを含むｐｄＨＬ２ベースのベクターは、ＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ断片を、ＳａｃＩＩとＥａｇＩを用いてＣＨ１−ＡＤ１−ＳＶ３シャトルベクターから切り出されたＣＨ１−ＡＤ１断片と置き換えることにより、ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２に変換された。
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２の構築
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、柔軟なペプチドスペーサーを介してＣＨ１ドメインのカルボキシル末端でＤＤＤ１がｈＭＮ−１４ Ｆａｂに結合している２コピーの融合タンパク質Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を含む安定な二量体を産生するための発現ベクターである。ｈＭＮ−１４ ＩｇＧを産生するために使用されている、プラスミドベクターｈＭＮ−１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２は、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩ制限エンドヌクレアーゼで消化してＣＨ１−ＣＨ３ドメインを除去することと、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩを用いてＣＨ１−ＤＤＤ１−ＳＶ３シャトルベクターから切り出されたＣＨ１−ＤＤＤ１断片を挿入することにより、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２に変換された。
同じ技術は、ｈＬＬ１、ｈＬＬ２、ｈＰＡＭ４、ｈＲ１、ｈＲＳ７、ｈＭＮ−１４、ｈＭＮ−１５、ｈＡ１９、ｈＡ２０、および多くの他のものなどの、多種多様な既知抗体のＦａｂ発現用のプラスミドを産生するために利用されている。通常、抗体可変領域コード配列は、ｐｄＨＬ２発現ベクター中に存在し、この発現ベクターは、上記のようなＡＤ融合タンパク質またはＤＤＤ融合タンパク質を産生するために変換された。このような抗体のいずれかのＦａｂ断片を含むＡＤ融合タンパク質またはＤＤＤ融合タンパク質を、１つのＡＤ融合タンパク質につき２つのＤＤＤ融合タンパク質というおよその割合で組み合わせて、第１の抗体の２つのＦａｂ断片と第２の抗体の１つのＦａｂ断片とを含む三量体ＤＮＬ構築物を作製してもよい。
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、１４アミノ酸残基のＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してｈＭＮ−１４のＦｄのカルボキシル末端に付加されたＤＤＤ２の二量体化・ドッキングドメイン配列を有するＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４を産生するための発現ベクターである。分泌されるこの融合タンパク質は、ＤＤＤ２ドメインの非共有結合的相互作用によって結合している２つの同一コピーのｈＭＮ−１４ Ｆａｂから構成されている。
発現ベクターを以下のように人工作製した。リンカーペプチド（ＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧ、配列番号４０）の一部とＤＤＤ２の残基１〜１３のコード配列を含む、２つの重複する相補的オリゴヌクレオチドを合成により作製した。これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、Ｔ４ ＰＮＫでリン酸化して、それぞれ制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとＰｓｔＩで消化したＤＮＡとのライゲーションに適合する５’末端および３’末端上の突出を生じさせた。
二重鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩによる消化により調製したシャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）と連結して、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ２−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を作製した。ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩを用いて、ＣＨ１−ＤＤＤ２−ＰＧＥＭＴ（登録商標）から５０７ｂｐ断片を切り出し、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩによる消化により調製したＩｇＧ発現ベクターｈＭＮ−１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２と連結した。最終的な発現構築物はＣ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２と表した。同様の技術は、いくつかの異なるヒト化抗体のＦａｂ断片のＤＤＤ２−融合タンパク質を作製するのに利用されている。
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（Ａ）と対を成してＢとなるように、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を設計した。ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２は、１４アミノ酸残基のＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加されたＡＤ２のアンカリングドメイン配列を有するｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を産生するための発現ベクターである。ＡＤ２は、その前に１つのシステイン残基と、ＡＤ１のアンカードメイン配列の後にもう１つのシステイン残基とを有する。
発現ベクターを以下のように人工作製した。ＡＤ２のコード配列とリンカー配列の一部を含む、２つの重複する相補的オリゴヌクレオチド（ＡＤ２上およびＡＤ２下）を合成により作製した。これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、Ｔ４ ＰＮＫでリン酸化して、それぞれ制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとＳｐｅＩで消化したＤＮＡとのライゲーションに適合する５’末端および３’末端上の突出を生じさせた。
二重鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩによる消化により調製したシャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ＰＧＥＭＴ（登録商標）に連結して、シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ２−ＰＧＥＭＴ（登録商標）を作製した。ＳａｃＩＩ制限酵素とＥａｇＩ制限酵素を用いて、このシャトルベクターからＣＨ１コード配列とＡＤ２コード配列を含む４２９塩基対断片を切り出し、それらの同じ酵素による消化により調製したｈ６７９−ｐｄＨＬ２ベクターに連結した。最終的な発現ベクターは、ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２である。
ＴＦ２ ＤＮＬプレターゲッティング構築物の作製
ＴＦ２と表される三量体ＤＮＬ構築物は、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４をｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２と反応させることにより得られた。ＴＦ２の試験バッチを以下のように、＞９０％収率で作製した。プロテインＬで精製したＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（２００ｍｇ）をｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２（６０ｍｇ）と１．４：１のモル比で混合した。総タンパク質濃度は、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中に１．５ｍｇ／ｍｌであった。その後の工程は、ＴＣＥＰ還元、ＨＩＣクロマトグラフィー、ＤＭＳＯ酸化、およびＩＭＰ２９１親和性クロマトグラフィーを含んだ。ＴＣＥＰを添加する前、ＳＥ−ＨＰＬＣにより、ａ２ｂ形成の形跡は示されていなかった。５ｍＭのＴＣＥＰを添加すると、この二成分構造に予想される１５７ｋＤａのタンパク質と一致するａ２ｂ複合体が速やかに形成された。ＩＭＰ２９１親和性クロマトグラフィーによって、ＴＦ２をほぼ均一なるまで精製した（図示せず）。ＩＭＰ２９１は、６７９ Ｆａｂが結合するＨＳＧハプテンを含む合成ペプチドである（Ｒｏｓｓｉら，２００５，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１：７１２２ｓ−２９ｓ）。ＩＭＰ２９１未結合画分のＳＥ−ＨＰＬＣ解析により、生成物からのａ４、ａ２、および遊離カッパ鎖の除去が示された（図示せず）。
非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、大部分のＴＦ２は、ＩｇＧの相対移動度に近い相対移動度を有する大きな共有結合的構造として存在することが示された（図示せず）。追加のバンドは、ジスルフィド形成がこれらの実験条件下では不完全であることを示唆している（図示せず）。ＴＦ２の成分ポリペプチドに相当するバンドのみが明らかである（図示せず）ので、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、非還元ゲル中に現れている追加のバンドが全て、生成物と関連するものであることを示している（図示せず）。しかしながら、４つのポリペプチドの各々の相対移動度は近過ぎて分離することができなかった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（図示せず）により、１５６，４３４Ｄａの単一ピークが明らかとなったが、これは、ＴＦ２の計算された質量（１５７，３１９Ｄａ）の９９．５％範囲内にある。
ＴＦ２の機能性をＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイで明らかにした。ＴＦ２、Ｃ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤ１（非共有結合的なａ２ｂ複合体の対照試料として使用）、またはＣ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤ２（還元されていないａ２成分とｂ成分の対照試料として使用）を１μｇ／ｍｌ（総タンパク質）に希釈し、ＨＳＧで固相化したセンサーチップ上を通過させた。ＴＦ２の応答は、２つの対照試料の応答の約２倍であり、対照試料中のｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ成分のみがセンサーチップに結合し、このチップ上に残ることが示された。次に、ｈＭＮ−１４の抗イディオタイプ抗体であるＷＩ２ ＩｇＧを注入することにより、ＴＦ２だけが、さらなるシグナル応答により示されるような、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤと強固に会合したＤＤＤ−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４成分を有することが示された。センサーチップ上に固相化されたＴＦ２に対するＷＩ２の結合から生じた応答単位のさらなる増加は、２つの完全に機能的な結合部位に対応しており、各々、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の１つのサブユニットによってもたらされるものである。これは、ＷＩ２の２つのＦａｂ断片に対するＴＦ２の結合能によって確認された（図示せず）。
プレターゲッティング用のＴＦ１０二重特異性抗体の作製
同様のプロトコルを用いて、２コピーのＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＰＡＭ４と１コピーのＣ−ＡＤ２−Ｆａｂ−６７９を含む三量体ＴＦ１０ ＤＮＬ構築物を作製した。ＴＦ１０中の癌を標的とする抗体成分は、放射性標識ＭＡｂとして詳細に研究されている（例えば、Ｇｏｌｄら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：７３８０−７３８７，２００７）ヒト化抗膵癌ムチンＭＡｂのｈＰＡＭ４から得られた。ハプテン結合成分は、ヒト化抗ヒスタミニル−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）ＭＡｂのｈ６７９から得られた。ＴＦ１０二重特異性（［ｈＰＡＭ４］２×ｈ６７９）抗体は、上記のように、（抗ＣＥＡ）２×抗ＨＳＧ ｂｓＡｂ ＴＦ２の作製について開示された方法を用いて作製した。ＴＦ１０構築物は、２つのヒト化ＰＡＭ４ Ｆａｂと１つのヒト化６７９ Ｆａｂを含む。
２つの融合タンパク質（ｈＰＡＭ４−ＤＤＤおよびｈ６７９−ＡＤ２）を、安定にトランスフェクトされた骨髄腫細胞で独立に発現させた。組織培養上清液を合わせて、２倍モル過剰のｈＰＡＭ４−ＤＤＤが得られた。反応混合物を、１ｍＭ還元グルタチオンを用いる穏やかな還元条件の下、室温で２４時間インキュベートした。還元後、２ｍＭ酸化グルタチオンを用いる穏やかな酸化により、ＤＮＬ反応を完了させた。ｈ６７９ Ｆａｂに高い特異性で結合するＩＭＰ２９１−アフィゲル樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーで、ＴＦ１０を単離した。
ｈＰＡＭ４ ＩｇＧと、臨床試験に入っている抗ＣＥＡ×抗ＨＳＧ ｂｓＭＡｂについて、組織の組織学および血液細胞結合の完全なパネルを検討した。ｈＰＡＭ４結合は、３つの標本のうちの１つの標本の膀胱と胃に対する非常に弱い結合に限定されており（インビボでは結合が見られなかった）、抗ＣＥＡ×抗ＨＳＧ ｂｓＭＡｂに起因する正常組織への結合はなかった。さらに、Ｈ１およびＨ２ヒスタミン受容体を有する細胞株に対するインビトロでの研究では、ＩＭＰ２８８ジ−ＨＳＧペプチドとのアンタゴニスト活性またはアゴニスト活性が示されず、２つの異なる種での動物試験では、イメージングに使用される用量よりも２０，０００倍高い用量で、ヒスタミン成分と関連するペプチドの薬理学的活性が示されなかった。したがって、ＨＳＧ−ヒスタミン誘導体には薬理学的活性がない。
実施例１６．ＴＦ１０二重特異性抗体および１１１Ｉｎ標識ペプチドによるプレターゲッティングを用いたイメージング研究
以下の研究は、ｈＰＡＭ４を組み込んだ二重特異性抗体と標識ペプチドを用いるプレターゲッティング技術を用いたインビボイメージングの実行可能性を示すものである。２コピーのＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＰＡＭ４と１コピーのＣ−ＡＤ２−Ｆａｂ−６７９を含む、ＴＦ１０二重特異性抗体を前述の実施例に記載したように調製した。ＴＦ１０および１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８ペプチドによるプレターゲッティングを用いて、０．２〜０．３ｇのヒト膵癌異種移植片を担持するヌードマウスをイメージングした。図８に示す結果は、１１１Ｉｎ標識ジ−ＨＳＧペプチドのＩＭＰ−２８８とともに、ｂｓＭＡｂプレターゲッティング法を用いる動物モデルで、輪郭が描かれた腫瘍をどれほど明瞭に検出することができるかということを示している。図８の上の６匹の動物に、２つの異なる用量のＴＦ１０（投与したペプチドのモルに対して１０：１および２０：１のモル比）を投与し、翌日、これらの動物に１１１Ｉｎ標識ジＨＳＧペプチド（ＩＭＰ２８８）を投与した。図８の下の他の３匹の動物には、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８のみを投与した（プレターゲッティングなし）。標識ペプチドを注入してから３時間後に画像を撮影した。これらの画像から、プレターゲッティングした動物では、０．２〜０．３ｇの腫瘍がはっきりと局在しているが、１１１Ｉｎ−ペプチドのみを投与した動物では局在が見られないことが示されている。腫瘍取込みは、平均して２０〜２５％ＩＤ／ｇであり、腫瘍／血液比は２０００：１超、腫瘍／肝臓比は１７０：１、腫瘍／腎臓比は１８／１であった。
実施例１７．プレターゲッティングおよび１８Ｆ標識で使用するターゲッティングペプチドの作製
種々の実施形態で、１８Ｆ標識タンパク質またはペプチドを新規の技術により調製し、診断研究および／またはＰＥＴイメージングなどのイメージング研究に使用する。１８Ｆ標識のための新規の技術は、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、もしくはＮＥＴＡまたはそれらの誘導体などの、キレート化部分に錯化した、１８Ｆ−金属錯体、好ましくは、１８Ｆ−アルミニウム錯体の調製を含む。キレート化部分を、当該技術分野で周知のコンジュゲーション技術を用いて、タンパク質、ペプチド、または任意の他の分子に付加してもよい。特定の好ましい実施形態では、１８Ｆ−Ａｌ錯体を、まず溶液中で形成させ、その後、既にタンパク質またはペプチドにコンジュゲートしているキレート化部分に付加する。しかしながら、代わりの実施形態では、アルミニウムをまずキレート化部分に付加し、後で１８Ｆを付加してもよい。
ペプチド合成
ペプチドは、Ｆｍｏｃ戦略を用いて固相ペプチド合成によって合成した。Ｆｍｏｃ／Ａｌｏｃ保護基を用いて基をジアミノアミノ酸の側鎖に付加し、示差的に脱保護した。使用する酢酸に対して１：１の比でピペリジンを添加することを除き、Ｄａｎｇｌｅｓら（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８７，５２：４９８４−４９９３）の方法によって、Ａｌｏｃ基を除去した。非対称テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡは、ＭｃＢｒｉｄｅら（米国特許出願公開第２００５／０００２９４５号、この実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている通りに作製した。
トリ−ｔ−ブチルＤＯＴＡ、対称テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡ、ＩＴＣ−ベンジルＤＴＰＡ、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡ、およびＴＡＣＮは、ＭＡＣＲＯＣＹＣＬＩＣＳ（登録商標）（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）から入手した。ＤｉＢｏｃＴＡＣＮ、ＮＯＤＡ−ＧＡ（ｔＢｕ）３、およびＮＯ２ＡｔＢｕは、ＣｈｅＭａｔｅｃｈ（Ｄｉｊｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。Ａｌｏｃ／ＦｍｏｃリジンおよびＤａｐ（ジアミノプロピオン酸誘導体（Ｄｐｒとも呼ばれる））は、ＣＲＥＯＳＡＬＵＳ（登録商標）（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）またはＢＡＣＨＥＭ（登録商標）（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）から入手した。Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂は、ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。残りのＦｍｏｃアミノ酸は、ＣＲＥＯＳＡＬＵＳ（登録商標）、ＢＡＣＨＥＭ（登録商標）、ＰＥＰＴＥＣＨ（登録商標）（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、ＥＭＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（登録商標）（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＣＨＥＭＩＭＰＥＸ（登録商標）（ＷｏｏｄＤａｌｅ，ＩＬ）、またはＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）から入手した。塩化アルミニウム六水和物は、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。残りの溶媒および試薬は、ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標）（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）またはＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。１８Ｆは、ＩＢＡ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ（登録商標）（Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ）により供給された。
ＩＭＰ２７２の１８Ｆ標識
調製し、１８Ｆ標識した最初のペプチドは、ＩＭＰ２７２であった。
ＤＴＰＡ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２ ＭＨ＋ １５１２
記載されている通りにＩＭＰ２７２を合成した（ＭｃＢｒｉｄｅら，米国特許出願第２００４０２４１１５８号、この実施例の節は、参照により本明細書に組み込まれる）。
酢酸緩衝溶液 − 酢酸１．５０９ｇを約１６０ｍＬの水に希釈し、１Ｍ ＮａＯＨの添加によってｐＨを調整し、その後、２５０ｍＬまで希釈すると、０．１Ｍ溶液（ｐＨ４．０３）が得られた。
酢酸アルミニウム緩衝溶液 − ０．１０２８ｇのＡｌＣｌ３六水和物を４２．６ｍＬのＤＩ水に溶かすことによって、アルミニウム溶液を調製した。このアルミニウム溶液の４ｍＬアリコートを、１６ｍＬの０．１Ｍ ＮａＯＡｃ溶液（ｐＨ４）と混合すると、２ｍＭ Ａｌストック溶液が得られた。
ＩＭＰ２７２酢酸緩衝溶液 − ペプチド（０．００１１ｇ、７．２８×１０−７ｍｏｌ ＩＭＰ２７２）を、３６４μＬの０．１Ｍ酢酸緩衝溶液（ｐＨ４）に溶かすと、２ｍＭのペプチドストック溶液が得られた。
ＩＭＰ２７２のＦ−１８標識 − アルミニウムストック溶液の３μＬアリコートをＲＥＡＣＴＩ−ＶＩＡＬ（商標）中に入れ、５０μＬの１８Ｆ（受け取ったままの状態）および３μＬのＩＭＰ２７２溶液と混合した。この溶液を加熱ブロック中、１１０℃で１５分間加熱し、逆相ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析（図示せず）により、９３％が遊離の１８Ｆ標識であり、７％がペプチドに結合していることが示された。この反応液に、さらに１０μＬのＩＭＰ２７２溶液を添加し、それを再び加熱し、逆相ＨＰＬＣで分析した（図示せず）。ＨＰＬＣトレースにより、８％の１８Ｆがボイド容量にあり、９２％の活性がペプチドに付着していることが示された。このペプチド溶液の残りを、１５０μＬのＰＢＳとともに、室温で約１時間インキュベートし、その後、逆相ＨＰＬＣで調べた。ＨＰＬＣ（図示せず）により、５８％の１８Ｆがペプチドに結合しておらず、４２％が依然としてペプチドに付着していることが示された。このデータから、リン酸塩と混合した場合、１８Ｆ−Ａｌ−ＤＴＰＡ錯体が不安定となり得るということが示されている。
標識ペプチドの溶液を１ｃｃ（３０ｍｇ）ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＨＬＢカラム（品番１８６００１８７９）に適用し、３００μＬの水で洗浄して、未結合のＦ−１８を除去することにより、標識ペプチドを精製した。このカラムを１００μＬのＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）で２回洗浄することにより、ペプチドを溶出した。精製ペプチドを水中、２５℃でインキュベートし、逆相ＨＰＬＣで分析した（図示せず）。ＨＰＬＣ分析により、１８Ｆ標識ＩＭＰ２７２が水中で安定でないことが示された。水中で４０分インキュベートした後、８３％は保持されたが、約１７％の１８Ｆがペプチドから放出された（図示せず）。
ペプチド（１６μＬの２ｍＭ ＩＭＰ２７２、４８μｇ）を１８Ｆで標識し、抗体結合についてサイズ排除ＨＰＬＣで分析した。サイズ排除ＨＰＬＣにより、このペプチドは、ｈＭＮ−１４×６７９に結合するが、無関係な二重特異性抗体ｈＭＮ−１４×７３４に結合しないということが示された（図示せず）。
他の金属を用いたＩＭＰ２７２の１８Ｆ標識
金属ストック溶液の約３μＬアリコート（６×１０−９ｍｏｌ）を、ポリプロピレン円錐形バイアル中に入れ、７５μＬの１８Ｆ（受け取ったままの状態）と混合し、室温で約２分間インキュベートした後、０．１Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）中の２０μＬの２ｍＭ（４×１０−８ｍｏｌ）ＩＭＰ２７２溶液と混合した。この溶液を、加熱ブロック中、１００℃で１５分間加熱し、逆相ＨＰＬＣで分析した。ＩＭＰ２７２は、インジウム（２４％）、ガリウム（３６％）、ジルコニウム（１５％）、ルテチウム（３７％）、およびイットリウム（２％）で標識された（図示せず）。これらの結果から、１８Ｆ金属標識技術は、アルミニウム配位子に限定されるものではなく、他の金属も同様に利用することができることが示されている。異なる金属配位子を用いる場合、Ｆ−１８−金属コンジュゲートの結合を最適化するために、異なるキレート化部分を利用してもよい。
血清安定性１８Ｆ標識ペプチドＩＭＰ４４９の産生および使用
以下のアミノ酸を以下に示す順序でＳｉｅｂｅｒアミド樹脂に付加することによって、この樹脂上でペプチドＩＭＰ４４８ Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（ＭＨ＋１００９）を作製した。すなわち、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨを付加し、最後にＦｍｏｃを切断して、所望のペプチドを作製した。次に、このペプチドを樹脂から切断し、ＨＰＬＣで精製すると、ＩＭＰ４４８が生成され、次に、これをＩＴＣベンジルＮＯＴＡに結合させた。このペプチドＩＭＰ４４８、０．０７５７ｇ（７．５×１０−５ｍｏｌ）を、０．０５０９ｇ（９．０９×１０−５ｍｏｌ）のＩＴＣベンジルＮＯＴＡと混合し、１ｍＬの水に溶かした。次に、撹拌したペプチド／ＮＯＴＡ溶液に、無水炭酸カリウム（０．２１７１ｇ）をゆっくりと添加した。炭酸塩を全て添加した後、この反応溶液はｐＨ１０．６であった。この反応液を室温で一晩撹拌させておいた。１４時間後、この反応液を１Ｍ ＨＣｌで注意深くクエンチし、ＨＰＬＣで精製すると、４８ｍｇのＩＭＰ４４９が得られた。
ＩＭＰ４４９の１８Ｆ標識
ペプチドＩＭＰ４４９（０．００２ｇ、１．３７×１０−６ｍｏｌ）を、６８６μＬ（２ｍＭペプチド溶液）の０．１Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０２）に溶かした。２ｍＭ Ａｌの酢酸緩衝液（ｐＨ４）溶液３μＬを、１．３ｍＣｉの１８Ｆ １５μＬと混合した。次に、この溶液を２ｍＭ ＩＭＰ４４９溶液２０μＬと混合し、１０５℃で１５分間加熱した。逆相ＨＰＬＣ分析により、放射能の３５％（ｔＲ約１０分）がペプチドに付着し、放射能の６５％がカラムのボイド容量（３．１分、図示せず）で溶出されることが示され、放射能の大部分がペプチドと結合しないことが示された。粗標識混合物（５μＬ）をヒトプール血清と混合し、３７℃でインキュベートした。１５分後にアリコートを取って、ＨＰＬＣで分析した。このＨＰＬＣにより、放射能の９．８％が依然としてペプチドに付着している（３５％から減少）ことが示された。１時間後に別のアリコートを取って、ＨＰＬＣで分析した。このＨＰＬＣにより、放射能の７．６％が依然としてペプチドに付着している（３５％から減少）ことが示されたが、これは１５分での量と本質的に同じであった（データは示さない）。
高線量１８Ｆ標識
精製ＩＭＰ４４９を用いたさらなる研究により、１８Ｆ標識ペプチドが、ヒト血清中、３７℃で少なくとも１時間、極めて安定であり（９１％、図示せず）、かつヒト血清中、３７℃で少なくとも４時間、ある程度安定である（７６％、図示せず）ことが示された。さらなる研究を行ない、その場合には、ＩＭＰ４４９を安定化剤としてのアスコルビン酸の存在下で調製した。これらの研究（図示せず）では、金属−１８Ｆ−ペプチド錯体は、３７℃で４時間後、血清中での検出可能な分解を示さなかった。１８Ｆ標識ペプチドを注射してから３０分後のマウスの尿にはペプチドに結合した１８Ｆが含まれることが分かった（図示せず）。これらの結果から、本明細書に開示された１８Ｆ標識ペプチドが、１８Ｆイメージング研究に使用されるインビボに近似した条件下で十分な安定性を示すことが示されている。
約４００μＬの水中の１８Ｆ（約２１ｍＣｉ）を、０．１Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中の９μＬの２ｍＭ ＡｌＣｌ３と混合した。ペプチドＩＭＰ４４９、６０μＬ（０．５ ＮａＯＨ（ｐＨ４．１３）中に０．０１Ｍ、６×１０−７ｍｏｌ）を添加し、この溶液を１１０℃まで１５分間加熱した。次に、この反応溶液を１ｃｃ ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＨＬＢカラム筒に入れ、水で溶出して、未結合の１８Ｆを除去し、次いでＥｔＯＨ／Ｈ２０（１：１）で１８Ｆ標識ペプチドを溶出することによって、粗標識ペプチドを精製した。この粗反応溶液をカラムに通して廃棄バイアルに入れ、カラムを１ｍＬずつの水で３回洗浄した（１８．９７ｍＣｉ）。次に、ＨＬＢカラムを新しいバイアルの上に置き、２００μＬのＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）で２回溶出し、標識ペプチドを回収した（１．８３ｍＣｉ）。全ての溶出が終了した後、カラムは０．１ｍＣｉの放射能を保持していた。精製された１８Ｆ標識ペプチドのアリコート（２０μＬ）を、２００μＬのヒトプール血清と混合し、３７℃で加熱した。逆相ＨＰＬＣでアリコートを分析した。これらの結果から、ヒト血清中でインキュベートしてから０時間、１時間（９１％標識ペプチド）、２時間（７７％標識ペプチド）、および４時間（７６％標識ペプチド）の時点における１８Ｆ標識された精製ＩＭＰ４４９の３７℃での相対的な安定性が示された（図示せず）。１８Ｆ標識ＩＭＰ４４９は、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーで使用されることもあるＴＦＡ溶液中で安定であることも観察された。本明細書に記載の例示的な１８Ｆ標識分子について観察されたＴＦＡ中での安定性とヒト血清中での安定性の間には一般的相関があるように思われる。これらの結果から、本明細書に開示された方法によって生成される１８Ｆ標識ペプチドが、例えば、ＰＥＴ走査を用いて標識細胞または組織を検出する、インビボでの標識およびイメージング研究に首尾よく使用されるのに十分なヒト血清中での安定性を示すことが示されている。最後に、ＩＭＰ４４９ペプチドは、放射線分解に感受性のあるチオウレア結合を含むので、いくつかの産物がＲＰ−ＨＰＬＣで観察される。しかしながら、反応混合物にアスコルビン酸を添加すると、生成される副産物は顕著に減少した。
実施例１８．プレターゲッティングＴＦ１０ ＤＮＬ構築物と１８Ｆ標識ペプチドを用いたインビボ研究
１８Ｆ標識ＩＭＰ４４９を以下のように調製した。約０．５ｍＬ中の１８Ｆ、５４．７ｍＣｉを０．１Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）中の２ｍＭ Ａｌ ３μＬと混合した。３分後、０．５Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）中の０．０５Ｍ ＩＭＰ４４９ １０μＬを添加し、反応液を９６℃の加熱ブロック中で１５分間加熱した。この反応液の中身をシリンジで取り除いた。次に、Ｃ１８カラムを用いるＨＰＬＣで粗標識ペプチドを精製した。流速は３ｍＬ／分であった。緩衝液Ａは水中の０．１％ＴＦＡであり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含む水中の９０％アセトニトリルであった。勾配は、１００％のＡから７５／２５のＡ：Ｂへと１５分かけて移行した。最初に溶出する標識ペプチドと未標識ペプチドとの間に保持時間（ｔＲ）の差が約１分あった。ＨＰＬＣ溶出物を０．５分（ｍＬ）ずつの画分で回収した。使用したカラムにもよるが、標識ペプチドは６〜９分のｔＲを有していた。目的の画分を水に２倍希釈し、その溶液を１ｃｃ Ｗａｔｅｒｓ（登録商標）ＨＬＢカラム筒に入れることによって、ＨＰＬＣ精製したペプチド試料をさらに処理した。このカートリッジを３×１ｍＬの水で溶出して、アセトニトリルとＴＦＡを除去し、次いで４００μＬのＥｔＯＨ／Ｈ２０（１：１）で１８Ｆ標識ペプチドを溶出した。精製された［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９は、分析的ＨＰＬＣ Ｃ１８カラムで単一のピークとして溶出した（図示せず）。
４つの増殖の遅い皮下ＣａＰａｎ１異種移植片を担持するＴＡＣＯＮＩＣ（登録商標）ヌードマウスをインビボ研究に使用した。３匹のマウスにＴＦ１０（１６２μｇ）、次いで１８時間後に［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９を注射した。ＴＦ１０は、腫瘍イメージング研究に有用なヒト化二重特異性抗体であり、ＰＡＭ−４で規定されるＭＵＣ１腫瘍抗原に二価結合し、ＨＳＧに一価結合する（例えば、Ｇｏｌｄら，２００７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５（１８Ｓ）：４５６４参照）。１匹のマウスにはペプチドのみを注射した。ペプチドを注射してから１時間後に、全てのマウスを解剖した。すぐに組織をカウントした。動物＃２は、大腿骨に高いカウントを示した。この大腿骨を新しいバイアルに移し、古い空のバイアルとともに再カウントした。再カウントにより、このカウントが組織に含まれることが示された。この大腿骨を破砕すると、それには大きな筋肉片が付着していた。平均分布を比較することにより、腫瘍ターゲッティング二重特異性抗体の存在下では、どの正常組織よりも大幅に高いレベルの１８Ｆ標識ペプチドが腫瘍に局在化することが示された。
組織取込みは、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９のみを投与された動物またはプレターゲッティング設定の動物で同様であった（表９）。１時間でのヒト膵癌異種移植片ＣａＰａｎ１への取込みは、ペプチドのみと比較して、プレターゲッティング動物で５倍増加した（４．６±０．９％ＩＤ／ｇ対０．８９％ＩＤ／ｇ）。並外れた腫瘍／非腫瘍比はこの時点で達成された（例えば、腫瘍／血液比および腫瘍／肝臓比は、それぞれ、２３．４±２．０および２３．５±２．８であった）。
Figure 0005919604
これらの結果から、ＴＦ１０ ＤＮＬ構築物などのＰＡＭ４含有抗体構築物とともに用いた１８Ｆ標識ペプチドによって、ＰＥＴイメージング解析などのインビボイメージングを実施するための１８Ｆ標識の好適なターゲッティングがもたらされることが示されている。
実施例１９．ＴＦ１０を用いたさらなるイメージング研究
要約
前臨床試験および臨床試験により、膵癌の核イメージングや放射免疫療法への放射性標識ｍＡｂ−ＰＡＭ４の適用が示されている。本発明者らは、本明細書において、イメージングや治療を改善するための放射性標識ペプチドをプレターゲッティングするために、ＰＡＭ４をベースとする新規の二重特異性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）構築物であるＴＦ１０の能力を検討した。ＴＦ１０は、ｍＡｂ−ＰＡＭ４については二価、ｍＡｂ−６７９については一価であり、ヒスタミン−スクシニル−グリシンハプテンに対して反応性があるヒト化二重特異性ｍＡｂである。放射性標識されたＴＦ１０および／またはＴＦ１０でプレターゲッティングされたハプテン−ペプチド（ＩＭＰ−２８８）の生体分布研究および核イメージングを、ＣａＰａｎ１ヒト膵癌異種移植片を担持するヌードマウスで行なった。１２５Ｉ−ＴＦ１０は血液から速やかにクリアランスされ、１６時間までに、グラム当たりの注射用量（ＩＤ／ｇ）の１％未満にまでレベルが低下した。腫瘍取込みは、この時点で３．４７±０．６６％ＩＤ／ｇであり、どの正常組織にも蓄積していなかった。プレターゲッティングアプローチの有用性を示すために、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８をＴＦ１０の１６時間後に投与した。放射性標識ペプチドを投与してから３時間で、腫瘍内への強い取込みがイメージングで示され、正常組織への付着の形跡は見つからなかった（実施例１６）。１１１Ｉｎ−ペプチドのみを投与した動物ではターゲッティングが見られなかった（実施例１６）。ＴＦ１０でプレターゲッティングされた１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８の腫瘍取込みが２４．３±１．７％ＩＤ／ｇであったのに対し、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８単独では、腫瘍取込みは、１６時間でわずか０．１２±０．００２％ＩＤ／ｇであった。腫瘍／血液比は、１１１Ｉｎ−ＰＡＭ４−ＩｇＧ（２４時間で約５：１；Ｐ＜０．０００３）と比較して、プレターゲッティング群（３時間で約１，０００：１）では有意に大きかった。放射線量の推定から、ＴＦ１０／９０Ｙ−ペプチドのプレターゲッティングによって、９０Ｙ−ＰＡＭ４−ＩｇＧよりも大きい抗腫瘍効果がもたらされることが示唆された。したがって、これらの結果から、直接放射性標識したＰＡＭ４−ＩｇＧと比較して、ＴＦ１０プレターゲッティングが、膵癌の早期検出、診断、および治療のためのイメージングの向上をもたらし得ることが裏付けられている（Ｇｏｌｄら，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ２００８，６８（１２）：４８１９−２６）。
本発明者らは、初期のステージＩ疾患、ならびに前駆病変、膵上皮内腫瘍、および膵管内乳頭粘液性腫瘍を含む、浸潤性膵腺癌の＞８５％で発現されるムチン上に存在する独特のバイオマーカーを同定した（Ｇｏｌｄら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７，１３：７３８０−８７）。ｍＡｂ−ＰＡＭ４で検出される、この特異的なエピトープ（Ｇｏｌｄら，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９４，５７：２０４−１０）は、正常膵組織および炎症を起こした膵組織、ならびにほとんどの他の悪性組織には存在しない。したがって、このエピトープの検出により、膵臓新生物が存在する高い診断的可能性が与えられる。それぞれ、１３１Ｉおよび９９ｍＴｃで標識されたマウスＰＡＭ４ ＩｇＧまたはＦａｂ’を用いた初期の臨床研究では、１０人の浸潤性膵腺癌患者のうちの８人で特異的ターゲッティングが示された（Ｍａｒｉａｎｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９５，５５：５９１１ｓ−１５ｓ；Ｇｏｌｄら，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ ２００１，３９：１４７−５４）。２人の陰性の患者のうち、１人がＰＡＭ４−エピトープを発現しない低分化膵癌を有していたのに対し、もう１人の患者は、悪性病変ではなく、膵炎を有していたことが後から分かった。
したがって、膵癌に対するＰＡＭ４の高い特異性は、初期疾患の検出と診断に有用である。検出の改善の他に、９０Ｙ−ＰＡＭ４ ＩｇＧは、ヌードマウス中の大きなヒト膵癌異種移植片の治療に効果的であることも分かり（Ｃａｒｄｉｌｌｏら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００１，７：３１８６−９２）、ゲムシタビンと併用したとき、治療応答のさらなる改善が見られた（Ｇｏｌｄら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４，１０：３５５２−６１；Ｇｏｌｄら，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４，１０９：６１８−２６）。ゲムシタビン治療から脱落する患者での第Ｉ相治療試験が最近終了し、９０Ｙ−ヒト化ＰＡＭ４ ＩｇＧの最大認容量が２０ｍＣｉ／ｍ２であることが分かった（Ｇｕｌｅｃら，Ｐｒｏｃ Ａｍｅｒ Ｓｏｃ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃ，第４３回年次総会，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００７，２５（１８Ｓ）：６３６ｓ）。全ての患者が８週目でまたは８週目以降に疾患の進行を示したが、いくつかの症例では腫瘍の初期収縮が見られた。放射線増感用量のゲムシタビンと併用した９０Ｙ−ｈＰＡＭ４ ＩｇＧの分割投与レジメンを評価する臨床研究が現在進行中である。
本発明者らは、ＰＡＭ４の膵癌に対するターゲッティング特異性に基づいて、新規の組換えヒト化二重特異性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＴＦ１０の開発を本明細書で報告している。この構築物は、独特の合成ハプテンであるヒスタミン−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）にも結合する。このハプテンは、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）および陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングに、ならびに治療目的に好適な広範な放射性核種で放射性標識することができるいくつかの小ペプチドに組み入れられている（Ｋａｒａｃａｙら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００５，１１：７８７９−８５；Ｓｈａｒｋｅｙら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００５，１９：１０６４−９；Ｒｏｓｓｉら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００６，１０３：６８４１−６；ＭｃＢｒｉｄｅら，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２００６，４７：１６７８−８８）。これらの研究は、イメージングまたは治療用途のために膵腺癌をターゲッティングするこの新しい構築物の可能性を示している。
方法および材料
ＴＦ２およびＴＦ１０二重特異性ＤＮＬ構築物とＩＭＰ２８８ターゲッティングペプチドとを上記のように調製した。ヨウ化ナトリウム（１２５Ｉ）および塩化インジウム（１１１Ｉｎ）はＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ（登録商標）から入手した。ＴＦ１０をヨードゲン法により１２５Ｉで通常通り標識し、サイズ排除スピンカラムの使用により精製した。ＤＯＴＡ−ペプチドおよびＤＯＴＡ−ＰＡＭ４−ＩｇＧの１１１ＩｎＣｌでの放射性標識を以前に記載されているように行なった（Ｒｏｓｓｉら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００６，１０３：６８４１−６；ＭｃＢｒｉｄｅら，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２００６，４７：１６７８−８８）。サイズ排除高速液体クロマトグラフィーで放射性標識産物の精製を調べ、遊離の未結合同位体の量を即時ＴＬＣで測定した。
ＴＦ１０分布研究のために、皮下にＣａＰａｎ１ヒト膵癌異種移植片を担持する、雌の無胸腺ヌードマウス約２０ｇ（ＴＡＣＯＮＩＣ（登録商標）Ｆａｒｍｓ）に１２５Ｉ−ＴＦ１０（１０μＣｉ；４０μｇ、２．５０×１０−１０ｍｏｌ）を注射した。様々な時点で、マウスの群（ｎ＝５）を解剖し、腫瘍組織と非腫瘍組織を摘出し、ガンマカウンターでカウントして、組織のグラム当たりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）を測定し、これらの値を用いて血液クリアランス速度と腫瘍／非腫瘍比を計算した。
プレターゲッティング生体分布研究にために、１０：１の二重特異性ｍＡｂ／放射性標識ペプチドモル比を用いた。例えば、皮下にＣａＰａｎ１ヒト膵癌異種移植片を担持する無胸腺ヌードマウスの群にＴＦ１０（８０μｇ、５．０７×１０−１０ｍｏｌ）を投与し、一方、第２の群は未処置のままにした。ＴＦ１０の注射後１６時間で、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８ハプテン−ペプチド（３０μＣｉ、５．０７×１０−１１ｍｏｌ）を投与した。いくつかの時点でマウスを解剖し、腫瘍組織と非腫瘍組織を摘出し、ガンマカウンターでカウントして、％ＩＤ／ｇを測定した。これらのデータから腫瘍／非腫瘍比を計算した。別の研究で、生体分布、核イメージング、および潜在的治療活性を比較する目的で、マウスの群に１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＰＡＭ４−ＩｇＧ（２０μＣ、５０μｇ、３．１３×１０−１０ｍｏｌ）を投与した。ゼロ時間で活性がないと仮定して、時間−活性曲線から放射線量の推定値を計算した。スチューデントのｔ検定を用いて有意差を評価した。
核免疫シンチグラフィーを実施するために、放射性標識ペプチドの注射後３時間または放射性標識ｈＰＡＭ４−ＩｇＧの注射後２４時間で、１１１Ｉｎ用の中エネルギーコリメーター（ＡＤＡＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を取り付けたデュアルヘッドＳｏｌｕｓガンマカメラを用いて、担腫瘍マウスをイメージングした。計１００，０００ｃｐｍか、または１０分間かのどちらか早い方が来るまで、マウスをイメージングした。
結果
二重特異性ｍＡｂ ＴＦ１０のインビトロでの特徴解析。標的ムチン抗原に対するＴＦ１０の結合をＥＬＩＳＡで解析した（図９）。これらの結果から、二価ＴＦ１０、ＰＡＭ４−ＩｇＧ、およびＰＡＭ４−Ｆ（ａｂ’）２についてのほとんど同一の結合曲線が示されたが（半最大結合は、それぞれ、１．４２±０．１０、１．３１±０．１２、および１．８３±０．１６ｎｍｏｌ／Ｌと計算された；全てについてＰ＞０．０５）、一価ｂｓＰＡＭ４化学的コンジュゲート（ＰＡＭ４−Ｆａｂ’×抗ＤＴＰＡ−Ｆａｂ’）は有意により低い結合力を有し（半最大結合、３０．６１±２．０５ｎｍｏｌ／Ｌ；ＴＦ１０と比較して、Ｐ＝０．０３７９）、ＴＦ１０が二価の様式で結合することが示唆された。ムチンに結合した１２５Ｉ−ＴＦ１０の免疫反応性画分は８７％であり、未結合のＴＦ１０が９％、遊離のヨウ素が３％であることが分かった（図示せず）。１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８の９０％はＴＦ１０に結合した（図示せず）。ＴＦ１０に結合した全ての１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８のうちで、過剰のムチン（２００μｇ）を添加したときに、９２％がより高い分子量で溶出し、わずか３％がムチン非反応性のＴＦ１０画分とともに溶出した。さらに５％の放射性標識ペプチドが、遊離ペプチド容量に溶出された。ＴＦ１０の非存在下でムチン抗原に結合した放射性標識ペプチドはなかった（図示せず）。
ＣａＰａｎ１担腫瘍ヌードマウスにおける １２５ Ｉ−ＴＦ１０の生体分布。ＴＦ１０は血液からの速やかなクリアランスを示し、１時間で２１．０３±１．９３％ＩＤ／ｇから始まり、１６時間で実に０．１３±０．０２％ＩＤ／ｇまで減少した。生物学的半減期は２．１９時間と計算された［９５％信頼区間（９５％ＣＩ）、２．１１〜２．２７時間］。組織取込みによって、１時間での肝臓、脾臓、および腎臓における放射能の増強が明らかとなったが、これは、１６時間までに即座にクリアランスされた［肝臓、脾臓、および腎臓について、それぞれ、Ｔ１／２＝２．０９ 時間（９５％ＣＩ、２．０８〜２．１０）、２．８４時間（９５％ＣＩ、２．４９〜３．２９）、および２．４４時間（９５％ＣＩ、２．２８〜２．６３）］。胃における放射能は、放射性ヨウ素の沈着と排出を反映する可能性が最も高く、放射性ヨウ化ＴＦ１０が、おそらくは肝臓と脾臓で活発に異化され、それにより血液からのその速やかなクリアランスを説明するものであることが示唆された。それにもかかわらず、１６時間までに、胃内での放射性ヨウ素の濃縮は１％ＩＤ／ｇ未満であった。１２５Ｉ−ＴＦ１０を投与され、１６時間で解剖された５匹の非担腫瘍ヌードマウスの群は、同様の組織分布を示し、腫瘍が二重特異性ｍＡｂ分布と正常組織からのクリアランスに影響を及ぼしていなかったことを示唆した（データは示さない）。もちろん、調べた最初の時点より前に、違いが生じた可能性がある。ＴＦ１０の腫瘍取込みは注射後６時間でピークに達し（７．１６±１．１０％ＩＤ／ｇ）、１６時間で最大結合の半分にまで減少していた（３．４７±０．６６％ＩＤ／ｇ）。腫瘍取込みは、次の３２時間の間、再びほぼ２倍減少したが、その後、次の２４時間の間、安定であった。
ＴＦ１０でプレターゲッティングされた １１１ Ｉｎ標識ペプチドの生体分布。ＴＦ１０の最大の腫瘍取込みは６時間で起こったが、これまでの経験から、放射性標識ペプチドは、ＴＦ１０の血液レベルが＜１％ＩＤ／ｇにまでクリアランスされた時点（すなわち、１６時間）で投与される必要があることが示された。より高レベルの血中ＴＦ１０が、血中での受け入れ難いほど高い放射性標識ペプチドの結合（すなわち、低い腫瘍／血液比）をもたらしたのに対し、もっと遅い時点でのペプチドの投与は、腫瘍内のＴＦ１０の濃度が低下し、その結果として、腫瘍内の放射性標識ペプチドの濃度が低下することを意味した。したがって、初期のプレターゲッティング研究は、１６時間の間隔を用いて行なわれた。１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８の量を一定（３０μＣｉ、５．０７×１０−１１ｍｏｌ）に保ちながら、モル比で表されるＴＦ１０とＩＭＰ−２８８の投与量が５：１から２０：１まで変化するように、増加量のＴＦ１０を投与した（表１０）。
Figure 0005919604
３時間で、血液中の１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８の量は、ほとんど検出されなかった（０．０１％）。腫瘍取込みは、投与された二重特異性ｍＡｂの量が４倍増加するにつれて、１９．０±３．４９％ＩＤ／ｇから２８．５５±０．７３％ＩＤ／ｇに増加した（ある群から別の群へと、各ＴＦ１０／ペプチド比を比較した場合、統計学的に有意な差が見られた；Ｐ＜０．０３またはそれより良い）が、正常組織取込みの増加は全く認められなかった。ＴＦ１０を投与した動物での腫瘍取込みは、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８を単独投与したときよりも＞１００倍高かった。ＴＦ１０の投与前に、投与を受けたかまたは投与を受けていない動物の正常組織での１１１Ｉｎ活性の比較は、ほとんどの場合、有意差のない同様の絶対値を示した。これは、二重特異性ｍＡｂが、１６時間までに、全ての正常組織から十分にクリアランスされてしまい、これらの組織での感知され得るペプチド取込みが防がれたことを示唆している。腫瘍／血液比は＞２，０００：１であり、他の組織比は１００：１を超えた。腫瘍／腎臓比ですら１０：１を超えた。非腫瘍組織に対するターゲッティングが最小の、放射性同位体の最大腫瘍取込みは、２０：１の比によりもたらされた。しかしながら、いずれのＴＦ１０／ペプチド比も、シグナル強度とコントラスト比の両方に関して、腫瘍に対する並外れたターゲッティングを達成するために用いることができた。放射性標識ペプチドの腫瘍取込みの絶対差が、１０：１の比（２４．３±１．７１％ＩＤ／ｇ）と２０：１（２８．６±０．７３％ＩＤ／ｇ）の比の間でそれほど差がないので、１０：１の比をさらなる研究のために選んだ。
１０：１の二重特異性ｍＡｂ／ペプチド比の、ＴＦ１０でプレターゲッティングした１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８、または１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８ペプチドのみのいずれかを投与された動物の画像を図１０に示す。これらの腫瘍の大部分は、直径≦０．５ｃｍ、重さ約０．２５ｇであった。これらの画像は、ＴＦ１０をプレターゲッティングした動物の腫瘍における極めて強い取込みを示している（図１０Ａ）。ＴＦ１０をプレターゲッティングした動物の画像バックグラウンドの強度を増加させて、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８のみを投与した動物の撮影画像の強度と一致させた（図１０Ｂ）。しかしながら、画像を、ＴＦ１０をプレターゲッティングしたマウスに最適化したとき、シグナル強度とコントラストが非常に高かったので、さらなる放射能は体内に認められなかった。１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８のみを投与した動物では、画像強度を上げても、腫瘍局在が見られなかった（図１０Ｃ）。
ＴＦ１０でプレターゲッティングされる１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８ペプチドの動態と比較したターゲッティング１１１Ｉｎ−ｈＰＡＭ４全ＩｇＧの動態を評価するために、さらなる実験を行なった。１１１Ｉｎ−ペプチドの腫瘍取込みが、調べた最初の時点の３時間で最も高かった（１５．９９±４．１１％ＩＤ／ｇ）のに対し、放射性標識ペプチドの血液濃度は、わずか０．０２±０．０１％ＩＤ／ｇでしかなく、平均腫瘍／血液比は９４６．３±３８３．０であった。時間とともに、放射性標識ペプチドは、７６．０４時間の生物学的半減期で、腫瘍からクリアランスされた。非腫瘍組織の中では、腎臓での取込みが最も高く、３時間で平均して１．８９±０．４２％ＩＤ／ｇであり、時間とともに着実に減少した（生物学的半減期、３３．６時間）。肝臓取込みは、０．１５±０．０６％ＩＤ／ｇで始まり、時間とともに本質的に変化しないままであった。ＴＦ１０でプレターゲッティングした１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８とは対照的に、１１１Ｉｎ−ｈＰＡＭ４−ＩｇＧは、最初の２４時間以内で大幅にクリアランスされ、３時間での３０．１％ＩＤ／ｇから２４時間での実に１１．５±１．７％ＩＤ／ｇまで減少したにもかかわらず、血液からのクリアランスがより遅かった。脾臓での取込み上昇のばらつきから、脾臓内に取り込まれるようになった分泌ムチンのターゲッティングによって、抗体が血液から除去されている可能性が高いことが示唆された。腫瘍取込みは、４８時間で８０．４±６．１％ＩＤ／ｇとピークに達し、モニタリング期間中ずっと、高いレベルのままであった。高い腫瘍取込みは、ＩｇＧについて予想されていた血液クリアランスよりも速いことと相まって、２４時間以内に５．２±１．０の腫瘍／血液比をもたらした。図１０Ｃは、１１１Ｉｎ−ＰＡＭ４−ＩｇＧの投与後２４時間での動物の画像を示しており、これは、この早い時点で腫瘍を可視化することができるが、腹部内にまだかなりの放射能があることを示している。１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８と１１１Ｉｎ−ｈＰＡＭ４−ＩｇＧについての腫瘍／腎臓比が後で同じとなる腎臓を除き、腫瘍／非腫瘍比は、１１１Ｉｎ−ｈＰＡＭ４−ＩｇＧと比較して、ＴＦ１０でプレターゲッティングした１１１Ｉｎ標識ハプテン−ペプチドで、ほとんど高かった。しかしながら、ＴＦ１０でプレターゲッティングした１１１Ｉｎ−ＩＭＰ−２８８の腫瘍／腎臓比は、３時間で腫瘍と正常組織を容易に識別することができるほど十分に高かった（例えば、約７：１）。
図１１は、放射性核種（９０Ｙ）を送達する直接法およびプレターゲッティング法の潜在的治療能力を示す。腫瘍内の放射性同位体の濃度（％ＩＤ／ｇ）は、そのそれぞれの最大認容量（９０Ｙ−ｈＰＡＭ４について０．１５ｍＣｉおよびＴＦ１０でプレターゲッティングした９０Ｙ−ＩＭＰ−２８８について０．９ｍＣｉ）で、プレターゲッティングしたＴＦ１０よりもＰＡＭ４−ＩｇＧで送達したときに遥かに大きいように思われるが、腫瘍に対する放射線量は似ていた（９０Ｙ−ＰＡＭ４−ＩｇＧおよびＴＦ１０でプレターゲッティングした９０Ｙ−ＩＭＰ−２８８について、それぞれ、１０，０８０および９，２２９ｃＧｙ）。プレターゲッティング法の利点は、並外れて低い血中放射能（９ｃＧｙ）であり、９０Ｙ−ｈＰＡＭ４ ＩｇＧ（１，６２３ｃＧｙ）の場合よりもほぼ２００倍少なかった。肝臓、およびその他の非腫瘍臓器に対する放射線量が、ＴＦ１０でプレターゲッティングした９０Ｙ−ＩＭＰ−２８８の場合よりも遥かに低かったことに留意するのも重要である。例外は腎臓であり、腎臓では、放射線量が、そのそれぞれの最大線量（９０Ｙ−ＰＡＭ４−ＩｇＧおよびＴＦ１０−９０Ｙ−ＩＭＰ−２８８のｃＧｙについて、それぞれ、６１２および７８４）で、両方のプロトコルについて同じであった。これらのデータから、９０Ｙ−ＰＡＭ４−ＩｇＧについて、他のほとんどの放射性標識された全ＩｇＧ ｍＡｂの場合と同様に、線量制限毒性は血液学的であるが、ＴＦ１０プレターゲッティングプロトコルでは、線量制限毒性は腎臓であることが示唆される。
考察
解剖学的画像を提供する、超音波検査技術、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）技術、および磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）技術などの、現在の診断モダリティーは、代謝環境のＰＥＴイメージングとともに、膵臓腫瘤の検出において高い感度を提供することが当たり前のように分かっている。しかしながら、これらのデータは、大部分、既に臨床症状を呈している集団での＞２ｃｍの病変の検出に基づくものである。膵癌の進行のこの時点では、予後はかなり悲惨なものである。患者の転帰を改善するために、無症状の患者での小さな初期の膵臓新生物の検出が必要である。
ｍＡｂ−ＰＡＭ４に関して本明細書で記載されているような、ターゲッティングアプローチを用いるイメージングによって、こうした小さい初期癌の診断が提供され得る。最も重要なのは、ｍＡｂの特異性である。本発明者らは、ｍＡｂ−ＰＡＭ４が、存在すると膵癌新生物の診断可能性が高くなるバイオマーカーと極めて反応性が高いことを示すために、組織標本の免疫組織化学的研究（Ｇｏｌｄら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；１３：７３８０−７；Ｇｏｌｄら，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９４；５７：２０４−１０）や患者血清の免疫アッセイ（Ｇｏｌｄら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００６；２４：２５２−８）を含む、相当なデータを提示してきた。さらに、本発明者らは、ＰＡＭ４が、正常な成人膵組織とも活動性膵炎とも反応しないが、膵臓内の最も初期の段階の腫瘍進行（膵上皮内腫瘍性病変１および膵管内乳頭粘液性腫瘍）と反応すること、およびバイオマーカーが、この進行から浸潤性膵腺癌に至るまでずっと高い発現レベルのままであることを明らかにした（Ｇｏｌｄら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；１３：７３８０−７）。ヒト膵腫瘍異種移植片を担持する無胸腺ヌードマウスを用いた前臨床研究により、放射性標識されたマウス型、キメラ型、およびヒト化型のＰＡＭ４の特異的ターゲッティングが示されている。
今回の研究で、本発明者らは、ＰＡＭ４アームについては二価で、抗ＨＳＧハプテンアームについては一価の、次世代の組換え二重特異性ＰＡＭ４ベースの構築物ＴＦ１０を検討した。ドック・ロックと名付けられた、このプレターゲッティング系の構築物のいくつかの重要な特徴があり、これには、その一般的な適用性や合成のしやすさが含まれる。しかしながら、本考察の場合、これまでに報告された化学的構築物との主な違いは、腫瘍抗原に対する結合の向上をもたらす価数、および重要なことであるが、その薬物動態である。非腫瘍組織からのＴＦ１０クリアランスは、化学的コンジュゲートで見られたものよりも遥かに速かった。二重特異性構築物の血液レベルが１％ＩＤ／ｇ未満に達する時間は、ＴＦ１０の場合の１６時間に対して、化学的コンジュゲートの場合は注射後４０時間であった。プレターゲッティング剤のより速やかなクリアランスは、腫瘍部位での高いシグナル強度（％ＩＤ／ｇ）を維持しつつ、腫瘍／血液比を大幅に改善させる。
早期検出と早期診断の手段を提供することに加え、これらの結果は、癌治療に対するＴＦ１０プレターゲッティング系の使用を支持する。腫瘍および非腫瘍組織に対する効果的な放射線量の考察により、直接放射性標識されたＰＡＭ４−ＩｇＧよりもプレターゲッティング法が好まれる。線量推定により、２つの送達系が異なる線量制限毒性（すなわち、直接放射性標識されたＰＡＭ４の骨髄毒性に対して、ＴＦ１０プレターゲッティング系の腎臓）を有することが示唆された。これは、放射性標識ＰＡＭ４を治療剤としてさらに臨床開発するのに重要なことである。ゲムシタビンは、膵癌に対して現場で使用される第一選択薬であるが、これは、腫瘍細胞の顕著な放射線増感をもたらすことができる。これまでの研究で、本発明者らは、ゲムシタビンと直接放射性標識されたＰＡＭ４−ＩｇＧの組合せが、どちらかのアームのみの場合と比較して、相乗的な抗腫瘍効果をもたらすことを示した（Ｇｏｌｄら，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４，１０：３５５２−６１；Ｇｏｌｄら，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００４，１０９：６１８−２６）。この組合せの線量制限因子は血液毒性と重複していた。しかしながら、ＴＦ１０プレターゲッティングの線量制限臓器は、血液組織ではなく、腎臓であるように思われるので、ゲムシタビンとの組合せはあまり毒性がないはずであり、したがって、放射性同位体の投与の増加が可能となり、その結果として、抗腫瘍効力がより大きくなる。
前臨床モデルでＴＦ１０プレターゲッティングを用いて達成される優れたイメージングは、直接放射性標識されたＤＯＴＡ−ＰＡＭ４−ＩｇＧと比較して、このイメージングシステムを用いて臨床試験へと進むための説得力のある論拠を与える。膵臓新生物に対する腫瘍ターゲッティングｍＡｂの特異性は、ＳＰＥＣＴ（１１１Ｉｎ）、ＰＥＴ（６８Ｇａ）、超音波検査（Ａｕ）、もしくは他の造影剤、またはさらに言えば、９０Ｙもしくは他の治療用放射性核種に対して様々なイメージング化合物をＨＳＧ−ハプテン−ペプチドにコンジュゲートする能力を与える二重特異性抗体プラットフォーム技術と相まって、全体的な患者転帰を改善させる高い可能性を提供する（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ２００８，４９：１５８−６３）。特に、本発明者らは、ＴＦ１０ベースの免疫ＰＥＴ法が、膵癌発症のリスクが高い個体（例えば、遺伝的素因、慢性膵炎、喫煙者など）をスクリーニングするための大きな臨床的価値、ならびに従来技術から得られる疑わしい腹部画像および／または特定のバイオマーカーの存在もしくは腹部の生化学的所見による兆候が見られる患者の経過観察の手段を有することになると考えている。これらの患者を追跡するための進行中の医療計画の一部として使用されるときに、膵癌の早期検出が実現される可能性がある。最後に、ゲムシタビンとの組合せで、ＴＦ１０プレターゲッティングにより、直接放射性標識されたＰＡＭ４−ＩｇＧよりも良い腫瘍増殖制御の機会が与えられる可能性がある。
実施例２０．ゲムシタビンとＴＦ１０を用いてプレターゲッティングした９０Ｙ−標識ペプチドとによる膵癌異種移植片の治療
要約
９０Ｙ−ｈＰＡＭ４ ＩｇＧは、現在、ステージＩＩＩ／ＩＶ膵癌の患者におけるゲムシタビンと併用した第Ｉ／ＩＩ相試験で検討中である。本発明者らは、同様の量の放射能を膵癌異種移植片に送達することができるが、血液毒性があまりない放射性核種をプレターゲッティングする新しいアプローチであって、ゲムシタビンとの併用により適しているものを開示している。約０．４ｃｍ３の皮下ＣａＰａｎ１ヒト膵癌を担持するヌードマウスに、組換えｂｓＭＡｂであるＴＦ１０を投与し、１日後に、９０Ｙ−標識ハプテン−ペプチド（ＩＭＰ−２８８）を投与した。様々な線量とスケジュールのゲムシタビンをこの治療に加えて、腫瘍進行を２８週までモニタリングした。０．７ｍＣｉ ＰＴ−ＲＡＩＴ単独により、血球数が一時的に６０％失われたに過ぎず、０．９ｍＣｉ ＰＴ−ＲＡＩＴ単独および０．７ｍＣｉ ＰＴ−ＲＡＩＴ＋６ｍｇゲムシタビン（ヒト当量約１０００ｍｇ／ｍ２）を投与した動物では、９カ月後に腎毒性の組織学的証拠が見られなかった。単回用量の０．２５または０．５ｍＣｉ ＰＴ−ＲＡＩＴ単独で、それぞれ、腫瘍の２０％および８０％を完全に除去することができる。標準的なゲムシタビンレジメン（週１回６ｍｇ×３；１週休み；３回繰り返す）に加えられた月１回の分割ＰＴ−ＲＡＩＴ（各ゲムシタビンサイクルの開始時に０．２５ｍＣｉ／投与で投与）によって、腫瘍が３．０ｃｍ３に達するまでの時間中央値がＰＴ−ＲＡＩＴ単独を上回って有意に増加した。ＰＴ−ＲＡＩＴに加えるゲムシタビンの細胞傷害性のない放射性増感用量レジメンを検討する他の治療計画もまた、ＰＴ−ＲＡＩＴ単独を上回って治療応答の有意な改善を示した。これらの結果は、ＰＴ−ＲＡＩＴが膵癌治療のための有望な新しいアプローチであることを示している。今回のデータは、ＰＴ−ＲＡＩＴとゲムシタビンを併用することによって治療応答が増強されることを示している。
方法
ＴＦ１０二重特異性抗体を上記のように調製した。プレターゲッティングのために、ＴＦ１０を、ヒト膵腺癌細胞株ＣａＰａｎを担持するヌードマウスに投与した。ＴＦ１０が血液からクリアランスされるのに十分な時間（１６ｈ）を取った後、放射性標識された二価ＨＳＧ−ペプチドを投与した。低分子量のＨＳＧ−ペプチド（約１．４ｋＤ）は、数分以内に血液からクリアランスされて、血管外スペースに入り、そこで、プレターゲッティングされたＴＦ１０ ｂｓＭＡｂの抗ＨＳＧアームに結合することができる。数時間以内に、放射性標識ＨＳＧ−ペプチドの＞８０％が尿中に排出され、腫瘍にペプチドが局在したまま残り、正常組織中には微量しか残らない。
結果
図１２は、０．１５ｍＣｉの９０Ｙ−ｈＰＡＭ４ ＩｇＧ、またはＴＦ１０でプレターゲッティングした０．２５もしくは０．５０ｍＣｉの９０Ｙ−ＩＭＰ−２８８による、樹立された（約０．４ｃｍ３）ＣａＰａｎ１腫瘍の単一治療から得られた治療活性を示している。同様の抗腫瘍活性が０．５ｍＣｉのプレターゲッティング線量と０．１５ｍＣｉ線量の直接放射性標識されたＩｇＧでも見られたが、直接コンジュゲートのこのレベルで血液毒性が重篤であった（図示せず）のに対し、プレターゲッティング線量は中程度の毒性しかなかった（図示せず）。実際、９０Ｙ−ＩＭＰ−２８８を用いるプレターゲッティングのＭＴＤは、ヌードマウスにおいて少なくとも０．９ｍＣｉである。
図１３は、ゲムシタビンとＰＴ−ＲＡＩＴの併用に、抗腫瘍治療に対する相乗効果があることを示している。ヒト当量のゲムシタビン（ＧＥＭ） １０００ｍｇ／ｍ２（６ｍｇ）を週１回、３週間、マウスに腹腔内投与し、次に、１週間休止した後、このレジメンを２回繰り返した。ＰＴ−ＲＡＩＴ（ＴＦ１０でプレターゲッティングした０．２５ｍＣｉの９０Ｙ−ＩＭＰ−２８８）を、３サイクルの治療の各々の最初のＧＥＭ投与の１日後に投与した。Ｇｅｍ単独では、腫瘍進行（３．０ｃｍ３に進行するまでの時間に基づく生存）に大した影響がなかった。ＰＴ−ＲＡＩＴ単独により、治療していない動物と比較して生存が改善したが、ＧＥＭとＰＴ−ＲＡＩＴの併用レジメンにより、ほぼ１０週まで生存中央値が増加した。血液毒性は、ＰＴ−ＲＡＩＴでは線量制限的でないが、ゲムシタビン療法の制限の１つであるので、これらの研究は、ＰＴ−ＲＡＩＴを、応答の増強の可能性を伴って、標準的なＧＥＭ療法に加えることができることを示唆している。ゲムシタビン＋ＰＴ−ＲＡＩＴの顕著な相乗効果は驚くべきことであり、また予期しないものであった。
さらなる研究では、ゲムシタビン＋ＰＴ−ＲＡＩＴの抗腫瘍効果増強に対する投与タイミングの影響を検討した。ＴＦ１０でプレターゲッティングした０．２５ｍＣｉの９０Ｙ−ＩＭＰ−２８８の１日前または１日後に、単一の６ｍｇ用量のＧＥＭを投与した（図示せず）。この研究により、ＧＥＭについて既によく知られていること、すなわち、放射性増感は、放射線照射の前に最も良く得られることが確認された。治療したマウスの生存パーセントは、ＰＴ−ＲＡＩＴ単独と、放射性標識ペプチドの２２時間後に投与されたゲムシタビンとＰＴ−ＲＡＩＴの併用との間の生存期間にほとんど差を示さなかった。しかしながら、ＰＴ−ＲＡＩＴの１９時間前にゲムシタビンを投与することにより、生存が大幅に増加した（図示せず）。
ＣａＰａｎ１を担持する動物における、単一のＰＴ−ＲＡＩＴ（０．２５ｍＣｉ）とセツキシマブ（週１回１ｍｇ腹腔内；７週間）またはセツキシマブ＋ＧＥＭ（週１回６ｍｇ×３）との併用によって、ＰＴ−ＲＡＩＴとＧＥＭ＋セツキシマブの併用は、より良好な初期応答をもたらすが（図１４）、単にセツキシマブのみをＰＴ−ＲＡＩＴに加えることに伴う応答が、ＰＴ−ＲＡＩＴ＋ＧＥＭと同じぐらいかまたはＰＴ−ＲＡＩＴ＋ＧＥＭよりも良好なので、有望である（図１４）ことが示された。この研究での全生存は極めて良く、研究が終わる２４週後に＞２．０ｃｍ３まで進行した腫瘍は各群に２つしかなかったので、これらの結果は、ＰＴ−ＲＡＩＴに加えられた場合のセツキシマブの潜在的役割を示している。
実施例２１．膵癌治療に対する分割プレターゲッティング放射免疫療法（ＰＴ−ＲＡＩＴ）の効果
本発明者らは、９０Ｙ−ＤＯＴＡ−ジ−ＨＳＧペプチド（ＩＭＰ−２８８）とＴＦ１０による分割療法を評価した。皮下にＣａＰａｎ１ヒト膵癌異種移植片０．３２〜０．５４ｃｍ３を担持するヌードマウスで、ＴＦ１０と放射性標識ＩＭＰ−２８８を用いた研究を行なった。治療のために、ＴＦ１０でプレターゲッティングされる９０Ｙ−ＩＭＰ−２８８を、［Ａ］一度に（０週目に０．６ｍＣｉ）または［Ｂ］分割して（０週目と１週目に０．３ｍＣｉ）、［Ｃ］分割して（０週目と１週目と２週目に０．２ｍＣｉ）、もしくは［Ｄ］分割して（０週目と１週目と４週目に０．２ｍＣｉ）、投与した。
大部分のマウスで腫瘍退縮（＞９０％）が見られた（［Ａ］群、［Ｂ］群、［Ｃ］群、および［Ｄ］群において、それぞれ、９／１０、１０／１０、９／１０、および８／１０）。［Ａ］群において、マウスの５０％における最大腫瘍退縮は、［Ｂ］群、［Ｃ］群、および［Ｄ］群の、それぞれ、６．１週、８．１週、および７．１週と比較して、３．７週に達した。いくつかの腫瘍は再増殖を示した。１４週で、分割群（２×０．３ｍＣｉ）において最良の治療応答が見られ、３×０．２ｍＣｉ群の３／１０や１×０．６ｍＣｉ群の１／１０と比較して、６／１０のマウスに腫瘍が見られなかった（ＮＴ）。大きな体重減少は見られなかった。分割ＰＴ−ＲＡＩＴは、毒性を最小限に抑えて膵癌を治療する別の代替法を提供する。
実施例２２．進行性膵癌（ＰＣ）における９０Ｙ−ｈＰＡＭ４放射免疫療法（ＲＡＩＴ）＋放射性増感ゲムシタビン（ＧＥＭ）治療
ＰＣに極めて特異的なヒト化抗体である９０Ｙ−ｈＰＡＭ４は、進行性疾患を有する患者において一過性の活性を示し、ＧＥＭは、前臨床研究で、ＲＡＩＴを増強した。この研究では、未治療の、切除不能ＰＣを有する患者における９０Ｙ−ｈＰＡＭ４＋ＧＥＭの反復治療サイクルを評価した。進行するかまたは許容できない毒性が現れるまで、コホート単位で９０Ｙ線量を増量し、患者は４週サイクルを繰り返した（週１回、２００ｍｇ／ｍ２のＧＥＭ、９０Ｙ−ｈＰＡＭ４、週１回、２〜４週目）。応答評価には、ＣＴ、ＦＤＧ−ＰＥＴ、およびＣＡ１９．９血清レベルを用いた。
１回目の２線量レベル（６．５および９．０ｍＣｉ／ｍ２の９０Ｙ−ｈＰＡＭ４×３）の８人の患者（女性３人／男性５人、５６〜７２歳）について、血液毒性は一過性のグレード１〜２であった。２人の患者はＦＤＧ ＳＵＶによる初回治療に応答し、ＣＡ１９．９が減少し、ＣＴで病変退縮が見られる。両患者は、それぞれ、９カ月および１１カ月、合計３サイクルおよび４サイクルを経た現在、良好な一般状態のままであり、さらなる毒性が見られない。初回治療後にＰＥＴおよびＣＴで安定な応答が見られ、ＣＡ１９．９レベルが低下している３人目の患者は、現在、２回目のサイクルを受けている。他の４人の患者では初期に疾患が進行していた。残りの患者は今なお評価中である。９０Ｙ−ｈＰＡＭ４＋低用量ゲムシタビンによる分割ＲＡＩＴが、初回９０Ｙ線量レベルで治療活性を示し、４回の治療サイクルの後でも血液毒性が最小限であるので、線量増量を継続している。
実施例２３．Ｍａｂ−ＰＡＭ４を用いた膵癌の早期検出およびインビトロ免疫アッセイ
ＰＡＭ４抗体を用いて免疫組織化学研究を行なった。染色組織切片で得られた結果は、ＰＡＭ４と正常な膵管、膵導管、および膵腺房組織の反応を示さなかった（図示せず）。対照的に、同じ組織試料に適用されるＭＡ５抗体の使用により、正常な膵管および膵腺房組織のびまん性の陽性染色が示された（図示せず）。高分化または中分化膵腺癌を有する組織切片では、ＰＡＭ４染色が陽性であり、大半は細胞質の染色であったが、細胞表面での増強が見られた。同じ組織切片中の正常膵組織は染色されなかった。
表１１に、様々な分化段階の膵腺癌試料におけるＰＡＭ４ ＭＡｂを用いた免疫組織化学的解析の結果を示す。全体としては、全膵癌試料について８７％の検出率が見られ、高分化膵癌に関しては１００％の検出、および中分化膵癌に関してはほぼ９０％の検出であった。
Figure 0005919604
表１２は、ＰＡＭ４免疫組織化学的染色によって、ＰａｎＩｎ−１ＡからＰａｎＩＮ−３、ＩＰＭＮ（膵管内乳頭粘液性腫瘍）、およびＭＣＮ（粘液性嚢胞腫瘍）までを含む、非常に高いパーセンテージの膵癌前駆病変も検出されたことを示す。全体としては、ＰＡＭ４染色によって、全膵臓前駆病変８９％が検出された。これらの結果は、ＰＡＭ４抗体に基づく免疫検出が、インビトロ解析で膵癌と前駆病変のほぼ９０％を検出することができることを示している。ＰＡＭ４発現は、ＰａｎＩＮ発症の最も早い時期に見られた。強い染色がＩＰＭＮ試料とＭＣＮ試料で見られた（図示せず）。ＰＡＭ４エピトープは、大部分の膵腺癌で高濃度（強いびまん性染色）に存在していた。ＰＡＭ４は、ＰａｎＩＮ−１、ＩＰＭＮ、およびＭＣＮを含む、最も初期の膵癌前駆病変とのびまん性の、強い反応性を示したが、正常膵組織とは反応しなかった。総合すると、これらの結果は、ＰＡＭ４抗体を用いた診断および／または検出が、極めて高い特異性で、最も初期の膵癌発症を検出することができることを示している。
Figure 0005919604
血清試料中のＰＡＭ４抗原に対する酵素ベースの免疫アッセイを開発した。図１５は、膵癌と正常組織および他の種類の癌に対するＰＡＭ４免疫アッセイを用いた示差診断の結果を示している。これらの結果により、膵癌（ｎ＝５３）を、膵炎ならびに乳癌、卵巣癌、および結腸直腸癌、ならびにリンパ腫をはじめとする他の全ての標本（ｎ＝２３３）と比較して、７７．４％の膵癌検出感度、９４．３％の検出特異性が示された。図１５のデータを表形式で示す。
Figure 0005919604
表１３のデータを用いてＲＯＣ曲線（図示せず）を構築した。膵癌患者５３人を含む、計２８３人の患者を検討し、膵癌患者の循環ＰＡＭ４抗原の存在を他の全ての試料と比較すると、ＲＯＣ曲線から、０．８８±０．０３（９５％ｃｉ、０．８４〜０．９２）（Ｐ値＜０．０００１）のＡＵＣが得られ、膵癌試料と非膵癌試料の識別に極めて有意な差が見られた。膵臓ＣＡを他の腫瘍や正常組織と比較すると、ＰＡＭ４ベースの血清アッセイによって、７７％の感度と９５％の特異性が示された。
健常患者、「初期」（ステージ１）膵癌、および全膵癌試料由来の血清試料中のＰＡＭ４抗原濃度の比較を行なった。これらの標本には、健常ボランティア由来の１３の血清、ステージ１由来の１２の血清、ステージ２由来の１３の血清、およびステージ３／４（進行性）膵癌由来の２５の血清が含まれていた。ＲＯＣ曲線統計解析で決定される、８．８ユニット／ｍｌのカットオフ値（赤線）を用いた。ＰＡＭ４抗原濃度の頻度分布を図１６に示す。この図は、「初期」ステージ１膵癌の９２％が、膵癌の診断について、カットオフ値を超えていることを示している。ＰＡＭ４ベースのアッセイのＲＯＣ曲線を図１７に示す。この図は、膵癌の検出におけるＰＡＭ４アッセイの８１．６％の感度と８４．６％の特異性を示している。
これらの結果から、ＰＡＭ４抗体結合に基づく酵素免疫アッセイによって、膵癌患者血清中のＰＡＭ４反応性抗原を検出および定量することができることが確認される。この免疫アッセイは、膵癌に対する高い特異性と感度を示している。ステージ１疾患を有する患者の大部分は、ＰＡＭ４免疫アッセイを用いて検出可能であった。
結論として、ＰＡＭ４抗体を用いる免疫組織学的方法により、浸潤性膵癌、ならびにその前駆病変、ＰａｎＩＮ、ＩＰＭＮ、およびＭＣＮの約９０％が同定された。ヒト患者血清中のＰＡＭ４抗原を定量するＰＡＭ４ベースの酵素免疫アッセイにより、初期膵癌の検出に対する高い感度と特異性が示された。膵癌に対するＰＡＭ４の特異性が高いので、ムチンバイオマーカーもイメージング剤や治療剤のインビボターゲッティングの標的としての役割を果たすことができる。「早期」膵癌の検出のための免疫ＰＥＴイメージングは、膵癌をより効果的に治療することができる場合、膵癌の早期診断に有用である。好ましくは放射線増感剤と組み合わせた、ヒト化ＰＡＭ４抗体構築物とともに、放射免疫療法を使用するのは、膵癌の治療に有用である。
実施例２４．ＰＥＧ化ＤＮＬ構築物
特定の実施形態では、ＰＥＧ化形態の抗体または免疫コンジュゲートを含む構築物を調製することが好ましい場合がある。このようなＰＥＧ化構築物はＤＮＬ技術によって調製し得る。
好ましい方法では、ｈＰＡＭ４ ＦａｂなどのＰＥＧ化されるエフェクター部分をＤＤＤ配列に連結し、ＤＤＤモジュールを作製する。望ましい分子サイズのＰＥＧ試薬を相補的なＡＤ配列で誘導体化し、結果として得られるＰＥＧ−ＡＤモジュールをＤＤＤモジュールと組み合わせて、ＤＤＤとＡＤの間で形成されるジスルフィド結合を介して２コピーのＦａｂまたは他のエフェクター部分と部位特異的につながった１つのＰＥＧからなるＰＥＧ化コンジュゲートを生じさせる。これらのＰＥＧ試薬は、メトキシ基（ｍ−ＰＥＧ）を用いて一方の末端でキャッピングし得、線状または分岐状であることができ、また以下の官能基、すなわち、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、オルト−ピリジルチオエステル（ＯＰＴＥ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、チアゾリジン−２−チオン、スクシニミジルカルボネート（ＳＣ）、マレイミドまたはオルト−ピリジルジスルフィド（ＯＰＰＳ）のうちの１つを含み得る。ＰＥＧ化の対象となり得るエフェクター部分には、酵素、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ペプチド、アプタマー、ヘモグロビン、抗体、および抗体断片がある。本方法は限定的なものではなく、開示された方法および組成物を用いて、多種多様な薬剤をＰＥＧ化し得る。様々な大きさで、かつ種々の反応性部分で誘導体化されたＰＥＧを、以下でより詳細に論じるような商業的供給源から入手してもよい。
ＰＥＧ−ＡＤ２モジュールの作製
ＩＭＰ３５０：ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（ＳＳ−ｔｂｕ）−ＮＨ２（配列番号４１）
ＡＤ２の配列を組み入れたＩＭＰ３５０を、ペプチド合成機でＦｍｏｃ法を用いて、Ｓｉｅｂｅｒ Ａｍｉｄｅ樹脂を用いて０．１ｍｍｏｌスケールで作製した。Ｃ末端から順に、使用された保護アミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨであった。ペプチドを樹脂から切断し、逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣで精製した。
ＰＥＧ２０−ＩＭＰ３５０の合成
ＩＭＰ３５０（０．０１０４ｇ）を、７ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８１）中で、０．１０２２ｇのｍＰＥＧ−ＯＰＴＥ（２０ｋＤａ、ＮＥＫＴＡＲ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）と混合した。次に、アセトニトリル（１ｍＬ）を添加して、懸濁された材料をいくぶん溶解した。この反応液を室温で３時間撹拌し、次に、０．０５４９ｇのシステインとともに０．０５２７ｇのＴＣＥＰを添加した。この反応混合物を１．５時間撹拌し、次に、水中の２０％エタノールで平衡化したＰＤ−１０脱塩カラムで精製した。この試料を溶出させ、凍結させ、凍結乾燥させて、０．０９２４ｇの粗ＰＥＧ２０−ＩＭＰ３５０（ＭＡＬＤＩでＭＨ＋ ２３５０８）を得た。
ＩＭＰ３６２（ＰＥＧ２０−ＩＭＰ３６０）の合成
ＩＭＰ３６０：ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（ＳＳ−ｔｂｕ）Ｇ−ＥＤＡＮＳ（配列番号４２）ＭＨ＋ ２６６０
ＡＤ２配列を組み入れたＩＭＰ３６０を、ペプチド合成機でＦｍｏｃ法を用いて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＥＤＡＮＳ樹脂を用いて０．１ｍｍｏｌスケールで合成した。０．２３ｇのＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、０．２９ｇのＨＡＴＵ、２６μＬのＤＩＥＡ、７．５ｍＬのＤＭＦ、および０．５７ｇのＥＤＡＮＳ樹脂（ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標））を用いて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを樹脂に手作業で添加した。これらの試薬を混合し、樹脂に添加した。反応液を室温で２．５時間混合し、樹脂をＤＭＦおよびＩＰＡで洗浄して、余分な試薬を除去した。Ｃ末端から順に、使用された保護アミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨであった。ペプチドを樹脂から切断し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。
ＩＭＰ３６２の合成のために、ＩＭＰ３６０（０．０１１５ｇ）を、７ｍＬの１Ｍ ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８１）中で０．１２７２ｇのｍＰＥＧ−ＯＰＴＥ（２０ｋＤａ、ＮＥＫＴＡＲ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）と混合した。次に、アセトニトリル（１ｍＬ）を添加して、懸濁された材料をいくぶん溶解した。この反応液を室温で４時間撹拌し、次に、０．０４３１ｇのシステインとともに０．０４１０ｇのＴＣＥＰを添加した。この反応混合物を１時間撹拌し、水中の２０％エタノールで平衡化したＰＤ−１０脱塩カラムで精製した。この試料を溶出させ、凍結させ、凍結乾燥させて、０．１４７１ｇの粗ＩＭＰ３６２（ＭＨ＋ ２３７１３）を得た。
ＩＭＰ４１３（ＰＥＧ３０−ＭＰ３６０）の合成
ＩＭＰ４１３の合成のために、ＩＭＰ３６０（０．０１０３ｇ）を、７ｍＬの１Ｍ ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．８１）中で０．１６０１ｇのｍＰＥＧ−ＯＰＴＥ（３０ｋＤａ、ＮＥＫＴＡＲ（登録商標）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）と混合した。次に、アセトニトリル（１ｍＬ）を添加して、懸濁された材料をいくぶん溶解した。この反応液を室温で４．５時間撹拌し、次に、０．０４７３ｇのシステインとともに０．０４２３ｇのＴＣＥＰを添加した。この反応混合物を２時間撹拌した後、２日間透析した。透析した材料を凍結させ、凍結乾燥させて、０．１５５２ｇの粗ＩＭＰ４１３（ＭＨ＋ ３４４９９）を得た。
ＩＭＰ４２１の合成
ＩＭＰ４２１ Ａｃ−Ｃ−ＰＥＧ３−Ｃ（Ｓ−ｔＢｕ）ＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（Ｓ−ｔＢＵ）Ｇ−ＮＨ２（配列番号４３）
以下のアミノ酸を以下に示す順序で樹脂に添加することによって、ペプチドＩＭＰ４２１（ＭＨ＋ ２８９１）をＮＯＶＡＳＹＮ（登録商標）ＴＧＲ樹脂（４８７．６ｍｇ、０．１１２ｍｍｏｌ）上に作製した：Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔ−Ｂｕｔｈｉｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ３−ＣＯＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ。Ｎ末端アミノ酸はアセチル誘導体として保護された。次に、ペプチドを樹脂から切断し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製して、３２．７ｍｇの白色固体を生じた。
ＩＭＰ４５７の合成
ＡＤ２の配列を組み入れたＩＭＰ４２１（配列番号４３）を、標準的な化学的手段で合成した。１５．２ｍｇ（５．２６μｍｏｌ）のＩＭＰ４２１（Ｆ．Ｗ．２８９０．５０）と２７４．５ｍｇ（６．８６μｍｏｌ）のｍＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋのアセトニトリル溶液１ｍＬに、１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８） ７ｍＬを添加し、室温で３時間反応させておいた。余分なｍＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋを４９．４ｍｇのＬ−システインでクエンチした後、５９．１ｍｇのＴＣＥＰを用いて１時間かけてＳ−Ｓ−ｔＢｕ脱保護を行なった。この反応混合物を、２つの３〜１２ｍＬの限度容量の１０Ｋ ＳＬＩＤＥ−Ａ−ＬＹＺＥＲ透析カセット（各カセットに４ｍｌ）を用いて、５Ｌの５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）中に２〜８℃で一晩透析した。次の日、５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）の５Ｌの緩衝液交換をさらに３回行ない、各透析を少なくとも２．５時間続けた。精製産物（１９．４ｍＬ）を２つの２０ｍＬシンチレーションバイアルに移し、凍結し、凍結乾燥して、２４６．７ｍｇの白色固体が得られた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより、ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０Ｋ ４２，９８２およびＩＭＰ−４５７ ４５，５００という結果が得られた。
実施例２５．ＤＮＬによるＰＥＧ化ｈＰＡＭ４の作製
２０ｋＤａ ＰＥＧに結合した２コピーのｈＰＡＭ４ Ｆａｂを有するＤＮＬ構造物を調製する。還元および凍結乾燥したＩＭＰ３６２を、２５０ｍＭ イミダゾール、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５中のｈＰＡＭ４ Ｆａｂ−ＤＤＤ２に１０倍モル過剰で添加することにより、ＤＮＬ反応を行なう。室温暗所で６時間後、反応混合物を、暗所４℃で、ＣＭローディング緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．５）に対して透析する。この溶液を、ＣＭローディング緩衝液で予め平衡化した１ｍＬ Ｈｉ−Ｔｒａｐ ＣＭ−ＦＦカラム（ＡＭＥＲＳＨＡＭ（登録商標））に充填する。試料を充填した後、カラムをＣＭローディング緩衝液でベースラインまで洗浄し、続いて、１５ｍＬの０．２５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．５で洗浄する。ＰＥＧ化ｈＰＡＭ４を１２．５ｍＬの０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．５で溶出させる。
コンジュゲーション過程を、クマシーブルー染色を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析する。非還元条件では、クマシーブルー染色したゲルによって、未結合画分または０．２５Ｍ ＮａＣｌ洗浄画分には存在しないが、０．５Ｍ ＮａＣｌ画分にははっきりと表れる、反応混合物中の主要バンドの存在が明らかになる。蛍光イメージングは、ＩＭＰ３６２上のＥＤＡＮＳタグを検出するために使用されるが、これにより、バンドがＩＭＰ３６２ならびに反応混合物および未結合画分中の過剰なＩＭＰ３６２の存在を含むことが示される。このＤＮＬ反応によって、ＩＭＰ３６２とｈＰＡＭ４ Ｆａｂ二量体の部位特異的でかつ共有結合的なコンジュゲーションが生じる。ジスルフィド結合を破壊する還元条件下では、ＤＮＬ構造物の構成要素が分離する。（ｈＰＡＭ４ Ｆａｂ）２−ＰＥＧ構築物の計算ＭＷは、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦで測定されるものと一致する。全体として、ＤＮＬ反応により、陽イオン交換クロマトグラフィーで精製した後、＞９０％純粋となる均一な産物がほぼ定量的に生じる。
還元および凍結乾燥したＩＭＰ４５７を、２５０ｍＭイミダゾール、０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５中のｈＰＡＭ４ Ｆａｂ−ＤＤＤ２に１０倍モル過剰で添加することにより、別のＤＮＬ反応を行なう。室温で６０時間後、１ｍＭの酸化グルタチオンを反応混合物に添加し、次に、これをさらに２時間静置する。この混合物をＣＭローディング緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．５）を用いて１：２０に希釈し、酢酸でｐＨ４．５に滴定する。この溶液を、ＣＭローディング緩衝液で予め平衡化した１ｍＬ Ｈｉ−Ｔｒａｐ ＣＭ−ＦＦカラム（ＡＭＥＲＳＨＡＭ（登録商標））に充填する。試料を充填した後、カラムをＣＭローディング緩衝液でベースラインまで洗浄し、続いて、１５ｍＬの０．２５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．５で洗浄する。ＰＥＧ化産物を２０ｍＬの０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．５で溶出させる。ＤＮＬ構築物を２ｍＬに濃縮し、０．４Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に透析濾過する。最終的なＰＥＧ化ｈＰＡＭ４ Ｆａｂ２構築物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合、約９０％純度である。
３０ｋＤａ ＰＥＧに結合した２コピーのｈＰＡＭ４ Ｆａｂを有するＤＮＬ構築物を、ＩＭＰ３６２の代わりにＩＭＰ４１３を用いて、すぐ上で記載したように調製する。ＰＥＧ化ｈＰＡＭ４ Ｆａｂ２ ＤＮＬ構築物を上記のように精製し、約９０％純度で得る。ＰＥＧ化ＤＮＬ構築物は、ＰＥＧ化されていない形態のｈＰＡＭ４について上で記載したように、治療方法に使用してもよい。
実施例２６．インターフェロン（ＩＦＮ）−α２ｂをベースにしたＤＤＤモジュールの作製
ＩＦＮ−α２ｂのｃＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅し、以下の特徴、すなわち、ＸｂａＩ−−−シグナルペプチド−−−ＩＦＮα２ｂ−−−６ Ｈｉｓ−−−ＢａｍＨＩ（６ Ｈｉｓは配列番号５９として開示されている）を含む配列（配列中、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩは制限部位であり、シグナルペプチドはＩＦＮ−α２ｂ由来のものであり、６ Ｈｉｓはヘキサヒスチジンタグ（配列番号５９）である）が得られた。結果として生じる分泌タンパク質は、そのＣ末端で配列番号４４からなるポリペプチドに融合したＩＦＮ−α２ｂからなる。
ＫＳＨＨＨＨＨＨＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号４４）
全長ヒトＩＦＮα２ｂ ｃＤＮＡクローン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）Ｕｌｔｉｍａｔｅ ＯＲＦヒトクローン カタログ番号ＨＯＲＦ０１ クローン番号ＩＯＨ３５２２１）を鋳型とし、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ増幅を行なった。
ＩＦＮＡ２ ＸｂａＩ 左
５'−ＴＣＴＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＡＣＴＧＧ−３'（配列番号４５）
ＩＦＮＡ２ ＢａｍＨＩ 右
５'−ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＧＣ−３'（配列番号４６）
ＰＣＲ増幅物をＰＧＥＭＴ（登録商標）ベクター（ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標））にクローニングした。ＩＦＮ−α２ｂとのライゲーションのために、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターを調製した。ＩＦＮ−α２ｂ増幅物を、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐＧＥＭＴから切り出し、ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターに連結して、発現ベクターＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２を作製した。
ＳａｌＩ酵素で消化することによって、ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２を線状化し、エレクトロポレーションでＳｐ／ＥＥＥ骨髄腫細胞に安定的にトランスフェクトした（例えば、米国特許第７，５３７，９３０号参照）。２つのクローンが検出可能なレベルのＩＦＮ−α２ｂを有することがＥＬＩＳＡで分かった。２つのクローンのうちの１つ（９５と表す）を、生産性を大幅に減少させることなく、無血清培地中での増殖に適合させた。次に、このクローンを、０．１〜０．８μＭの増加するメトトレキサート（ＭＴＸ）濃度で５週間にわたって増幅させた。この段階で、クローンを限界希釈によりサブクローニングし、最も生産性の高いサブクローン（９５−５）を拡大した。市販のｒＩＦＮ−α２ｂ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ（登録商標）ＩＦ００７、ロット０６００８０３９０８４）を標準品として用いて、振盪フラスコで増殖させた９５−５の生産性が、２．５ｍｇ／Ｌであると推定した。
クローン９５−５を、０．８μＭ ＭＴＸを含む計２０Ｌの無血清Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭを含む３４個のローラーボトルに拡大し、最終培養物に到達させた。この上清液を遠心分離で清澄化し、濾過（０．２μＭ）した。この濾過物を１×結合緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）中に透析濾過し、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製に備えて３１０ｍＬに濃縮した。この濃縮物を３０ｍＬ Ｎｉ−ＮＴＡカラムに充填し、これを５００ｍＬの１×結合緩衝液中の０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、その後、２９０ｍＬの３０ｍＭイミダゾール、０．０２％Ｔｗｅｅｎ ２０、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５で洗浄した。この産物を１１０ｍＬの２５０ｍＭイミダゾール、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５で溶出させた。約６ｍｇのＩＦＮα２ｂ−ＤＤＤ２が精製された。
ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２の純度を還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した（図示せず）。ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２は最も強く染色されたバンドであり、総タンパク質の約５０％を占めた（図示せず）。この産物は、分子量約２６ｋＤａのダブレットとして分離したが、これは、ＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２−ＳＰの計算分子量（２６ｋＤａ）と一致している。分子量３４ｋＤａの１つの主要な汚染物質と多くの微かな汚染バンドがあった（図示せず）。
実施例２７．ＤＮＬによるｈＰＡＭ４ Ｆａｂ−（ＩＦＮ−α２ｂ）２の作製
Ｃ−Ｈ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターの作製
ｐｄＨＬ２哺乳動物発現ベクターは、多くの組換えＩｇＧの発現を仲介するために使用されている。任意のＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターをＣ−Ｈ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターに変換しやすくするために、プラスミドシャトルベクターを産生した。Ｆｃ（ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）の遺伝子を、ｐｄＨＬ２ベクターを鋳型とし、オリゴヌクレオチドＦｃ ＢｇｌＩＩ左およびＦｃ Ｂａｍ−ＥｃｏＲＩ右をプライマーとして用いて増幅した。
Ｆｃ ＢｇｌＩＩ 左
５'−ＡＧＡＴＣＴＧＧＣＧＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧ−３'（配列番号４７）
Ｆｃ Ｂａｍ−ＥｃｏＲＩ 右
５'−ＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ−３'（配列番号４８）
この増幅物をＰＧＥＭＴ（登録商標）ＰＣＲクローニングベクターにクローニングした。Ｆｃインサート断片をＰＧＥＭＴ（登録商標）から切り出し、ＡＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターと連結して、シャトルベクターＦｃ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２を作製した。
ｈＰＡＭ４ ＩｇＧ−ＡＤ２の作製
任意のＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターをＣ−Ｈ−ＡＤ２−ＩｇＧ−ｐｄＨＬ２発現ベクターに変換するために、８６１ｂｐのＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限断片を前者から切り出し、Ｆｃ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２ベクターから切り出される９５２ｂｐのＢｓｒＧＩ／ＮｄｅＩ制限断片と置き換える。ＢｓｒＧＩはＣＨ３ドメイン中で切断し、ＮｄｅＩは発現カセットの下流（３’）で切断する。この方法を用いて、ｈＰＡＭ４ ＩｇＧ−ＡＤ２タンパク質を作製する。
ｈＰＡＭ４ ＩｇＧ−（ＩＦＮ−α２ｂ）２構築物の作製
還元および凍結乾燥したｈＰＡＭ４ ＩｇＧ−ＡＤ２を、２５０ｍＭ イミダゾール、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５中のＩＦＮ−α２ｂ−ＤＤＤ２に添加することにより、ＤＮＬ反応を行なう。室温暗所で６時間後、反応混合物を、暗所４℃で、ＣＭローディング緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．５）に対して透析する。この溶液を、ＣＭローディング緩衝液で予め平衡化した１ｍＬ Ｈｉ−Ｔｒａｐ ＣＭ−ＦＦカラム（ＡＭＥＲＳＨＡＭ（登録商標））に充填する。試料を充填した後、カラムをＣＭローディング緩衝液でベースラインまで洗浄し、続いて、１５ｍＬの０．２５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．５で洗浄する。産物を１２．５ｍＬの０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．５で溶出させる。このＤＮＬ反応によって、ｈＰＡＭ４ ＩｇＧとＩＦＮ−α２ｂ二量体の部位特異的でかつ共有結合的なコンジュゲーションが生じる。ＩｇＧ部分とＩＦＮ−α２ｂ部分は両方とも、ＤＮＬ構築物中でそれらのそれぞれの生理活性を保持している。膵癌またはＰＡＭ４抗原を発現する他の癌への標的送達のために、この技術を用いて、任意のサイトカインまたは他の生理活性タンパク質もしくはペプチドをｈＰＡＭ４に付加し得る。
実施例２８．ＡＤ配列変異体およびＤＤＤ配列変異体
特定の好ましい実施形態では、ＤＮＬ複合体に組み込まれたＡＤ配列とＤＤＤ配列は、上記のように、ＡＤ２（配列番号３６）とＤＤＤ２（配列番号３４）のアミノ酸配列を含む。しかしながら、代わりの実施形態では、ＡＤ部分および／またはＤＤＤ部分の配列変異体をサイトカイン−ＭＡｂ ＤＮＬ複合体の構築で利用してもよい。ＡＤドメインとＤＤＤドメインの構造−機能関係は研究の主題となっている（例えば、Ｂｕｒｎｓ−Ｈａｍｕｒｏら，２００５，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １４：２９８２−９２；Ｃａｒｒら，２００１，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：１７３３２−３８；Ａｌｔｏら，２００３，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １００：４４４５−５０；Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３９６：２９７−３０６；Ｓｔｏｋｋａら，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ４００：４９３−９９；Ｇｏｌｄら，２００６，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４：３８３−９５；Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら，２００６，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２４：３９７−４０８を参照されたい）。
例えば、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）は、ＡＤ−ＤＤＤ結合相互作用の結晶構造を検討し、ヒトＤＤＤ配列は、以下の配列番号３３中で下線が付された、二量体形成またはＡＫＡＰ結合のいずれかに重要ないくつかの保存されたアミノ酸残基を含むと結論付けた（Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら，２００６の図１参照）。当業者であれば、ＤＤＤ配列の配列変異体を設計する際に、望ましくは下線が付された残基をどれも変化させず、その一方で、二量体化とＡＫＡＰ結合にあまり重要でない残基に保存的アミノ酸置換を行ない得ることを理解するであろう。
タンパク質キナーゼＡ由来のヒトＤＤＤ配列
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３３）
Ａｌｔｏら（２００３）は、様々なＡＫＡＰタンパク質のＡＤ配列のバイオインフォマティック解析を行ない、ＤＤＤに対する０．４ｎＭという結合定数を有する、ＡＫＡＰ−ＩＳ（配列番号３５）と呼ばれるＲＩＩ選択的ＡＤ配列を設計した。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列は、ＰＫＡに対するＡＫＡＰ結合のペプチド拮抗薬として設計された。置換するとＤＤＤに対する結合が低下する傾向にあるＡＫＡＰ−ＩＳ配列中の残基に、以下の配列番号３５中で下線を付す。
ＡＫＡＰ−ＩＳ配列
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３５）
同様に、Ｇｏｌｄ（２００６）は、結晶学とペプチドスクリーニングを利用して、ＲＩアイソフォームと比較してＰＫＡのＲＩＩアイソフォームの場合に５桁高い選択性を示す、スーパーＡＫＡＰ−ＩＳ配列（配列番号４９）を開発した。下線が付された残基は、ＲＩＩαのＤＤＤ部分に対する結合を増大させる、ＡＫＡＰ−ＩＳ配列と比べた、アミノ酸置換の位置を指す。この配列において、Ｎ末端のＱ残基は残基番号４と付番され、Ｃ末端のＡ残基は残基番号２０と付番されている。ＲＩＩαに対する親和性に影響を与えるために置換することができる残基は、残基８、１１、１５、１６、１８、１９、および２０であった（Ｇｏｌｄら，２００６）。特定の代わりの実施形態では、サイトカイン−ＭＡｂ ＤＮＬ構築物を調製するために、スーパーＡＫＡＰ−ＩＳ配列をＡＫＡＰ−ＩＳ ＡＤ部分配列と置き換え得ることが企図される。ＡＫＡＰ−ＩＳ ＡＤ配列と置き換え得る他の代わりの配列を配列番号５０〜５２に示す。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列と比べた置換に下線を付す。配列番号４９に示すＡＫＡＰ−ＩＳ配列に関して、ＡＤ部分は、追加のＮ末端残基システインおよびグリシンならびにＣ末端残基グリシンおよびシステインも含み得ることが予想される。
スーパーＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＹＡＩＨＱＡ（配列番号４９）
代わりのＡＫＡＰ配列
ＱＩＥＹＫＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号５０）
ＱＩＥＹＨＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号５１）
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号５２）
Ｓｔｏｋｋａら（２００６）は、配列番号５３〜５５に示す、ＰＫＡに対するＡＫＡＰ結合のペプチド競合物も開発した。これらのペプチド拮抗薬をＨｔ３１（配列番号５３）、ＲＩＡＤ（配列番号５４）、およびＰＶ−３８（配列番号５５）と表した。Ｈｔ−３１ペプチドは、ＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに対するより大きい親和性を示したが、ＲＩＡＤとＰＶ−３８はＲＩに対するより高い親和性を示した。
Ｈｔ３１
ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ（配列番号５３）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ（配列番号５４）
ＰＶ−３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＣ（配列番号５５）
Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６）は、ＲＩＩ形態のＰＫＡのＤＤＤに対する結合定数が０．４ｎＭ程度でしかない、ＰＫＡに対するＡＫＡＰ結合のさらに他のペプチド競合物を開発した。様々なＡＫＡＰ拮抗性ペプチドの配列は、（参照により本明細書に組み込まれる）Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒらの表１に示されている。ＡＫＡＰ ＩＳ配列（配列番号３５）に関して下線を付すことにより、様々なＡＫＡＰタンパク質のＡＤドメイン間で高度に保存されている残基を以下に示す。これらの残基はＡｌｔｏら（２００３）により観察されたものと同じであるが、Ｃ末端にアラニン残基が付加されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕｎｄｓｒｕｃｋｅｒら（２００６）の図４を参照されたい）。ＲＩＩ ＤＤＤ配列に特に高い親和性を有するペプチド拮抗薬の配列を配列番号５６〜５８に示す。
ＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号３５）
ＡＫＡＰ７δ−ｗｔ−ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号５６）
ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０４Ｔ−ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＴＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号５７）
ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０８Ｄ−ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＤＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号５８）
Ｃａｒｒら（２００１）は、ヒトおよび非ヒトタンパク質由来の様々なＡＫＡＰ結合ＤＤＤ配列間の配列相同性の程度を検討し、様々なＤＤＤ部分の間で最も高度に保存されていると思われるＤＤＤ配列中の残基を同定した。配列番号３３のヒトＰＫＡ ＲＩＩα ＤＤＤ配列に関して下線を付すことにより、これらを以下に示す。特に保存されている残基をイタリック体でさらに示す。これらの残基は、Ｋｉｎｄｅｒｍａｎら（２００６）によりＡＫＡＰタンパク質への結合に重要であると示唆された残基と重複するが、同一ではない。
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３３）
当業者であれば、様々なタンパク質由来のＤＤＤ配列とＡＤ配列で高度に保存されているアミノ酸残基は、通常、アミノ酸置換を行なうときに変わらないままにしておくことが望ましい残基である可能性があるが、あまり高度に保存されていない残基は、本明細書に記載されるＡＤ配列および／またはＤＤＤ配列の配列変異体を産生するためにより容易に変化させ得ることを理解するであろう。
当業者であれば、ＤＮＬ構築物の抗体部分またはリンカー部分中のこれらのおよび他のアミノ酸置換を利用して、得られるＤＮＬ構築物の治療特性および／または薬物動態特性を強化し得ることを理解するであろう。
実施例２９．ヒト血清中のＰＡＭ４抗原のインビトロ検出
特定の実施形態では、血液、血漿、または血清試料などの、非侵襲的な技術によって得ることができる試料のインビトロ解析により、対象のＰＡＭ４抗原の存在を検出することおよび／または対象の膵癌の存在を診断することが好ましい。このようなエクスビボ解析は、例えば、ある個人が特定の場所に膵腫瘍を有すると考えるアプリオリな理由がないスクリーニング法において好ましいものであり得る。
研究は当初、解析前に何年間も凍結して保存されていた患者血清試料を用いて行なわれた（Ｇｏｌｄら，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２００６，２４：２５２−５８）。インビトロ酵素免疫アッセイは、モノクローナル抗体ＰＡＭ４をキャプチャー試薬として、およびポリクローナル抗ムチン抗体をプローブとして用いて確立された。患者血清を、急性膵炎および慢性膵炎の健常成人患者と、膵癌およびその他の形態の癌を有する患者とから入手し、ＰＡＭ４抗原について測定した。
方法
試薬−無胸腺ヌードマウスの異種移植片として増殖したヒト膵癌である、ＣａＰａｎ１からヒト膵臓ムチン調製物を単離した。簡潔に述べると、組織１ｇを０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ重炭酸アンモニウム１０ｍＬ中でホモジナイズした。次に、試料を遠心分離して上清を得、これをＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）−４Ｂ−ＣＬカラムで分画し、ボイド容量物質をハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーにかけた。非吸着画分を脱イオン水に対して大規模に透析した後、凍結乾燥させた。１ｍｇ／ｍＬ溶液を、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（リン酸緩衝化生理食塩水［ＰＢＳ］）中に調製し、免疫アッセイ標準のストック溶液として用いた。ポリクローナル抗ムチン抗血清を、以前に記載されたように、ウサギの免疫化により調製した（Ｇｏｌｄら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４３：２３５−３８，１９８３）。ＩｇＧ画分を精製し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）と分子ふるい高速液体クロマトグラフィーとで純度について評価した。ＣＡ１９−９の定量用のキットは、ＰＡＮＯＭＩＣＳ（登録商標）Ｉｎｃ（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から購入した。
酵素免疫アッセイ−血清は、ガーデンステート癌センター（Ｂｅｌｌｅｖｉｌｌｅ，ＮＪ）により実施される、施設内治験審査委員会が承認した治験に登録された患者から、およびコーポレイティブ・ヒューマン・ティシュー・ネットワーク（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ）（米国国立癌研究所［ＮＣＩ］，米国国立衛生研究所，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）の東部部門（Ｅａｓｔｅｒｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）から得た。免疫アッセイを行なうために、９６ウェルポリビニルプレートをＰＢＳ中２０μｇ／ｍＬのＰＡＭ４抗体１００μＬでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌朝、キャプチャー抗体をプレートから除去した。次に、カゼイン−ナトリウム塩の１％（重量／容量［ｗ／ｖ］）ＰＢＳ溶液２００μＬを添加することによってウェルをブロッキングし、４℃で一晩インキュベートした。カゼインをウェルから除去し、プレートを、０．０５％（容量／容量［ｖ／ｖ］）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ ２５０μＬで５回洗浄した。標準、または未知標本を、１％（ｗ／ｖ）カゼインを含むＰＢＳに１：２で希釈し、１００μＬを適当なウェルに添加し、プレートを３７℃で１．５時間インキュベートした。この時点で、プレートを、既に述べたように、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄した。０．１％（ｗ／ｖ）カゼインを含むＰＢＳ中で５μｇ／ｍＬに希釈した、ポリクローナルウサギ抗ムチン抗体を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。次に、ポリクローナル抗体を、本明細書に記載のウェルから洗浄し、０．１％（ｗ／ｖ）カゼインを含むＰＢＳ中で１：１０００希釈したペルオキシダーゼ標識ロバ抗ウサギＩｇＧをウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。既に記載したようにプレートを洗浄した後、オルト−フェニレンジアミン（０．８ｍｇ／ｍＬ）と過酸化水素（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］中０．３％ｖ／ｖ）からなる溶液１００μＬをウェルに添加し、プレートを室温暗所で３０分間インキュベートした。４．０Ｎ硫酸２５μＬを添加して反応を停止させ、ＳＰＥＣＴＲＡ−ＭＡＸ（登録商標）２５０分光光度計を用いて４９０ｎｍの波長で光学密度を読み取った。ＣＡ１９−９測定は、製造元の手順に従って行なった。標準曲線を作成し、未知試料の濃度を決定するために、回帰分析を行なった。ＭＥＤ−ＣＡＬＣ（登録商標）統計ソフトウェアパッケージ（バージョン７．５；ＭＥＤ−ＣＡＬＣ（登録商標），Ｍａｒｉａｋｅｒｋｅ Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した。
結果
ＰＡＭ４ベースの免疫アッセイの開発および特徴解析−本発明者らは、異種移植したＣａＰａｎ１ヒト膵腫瘍から精製したムチンの初期参照標準に基づく任意ユニット／ｍＬで結果を報告することを選んだ。免疫アッセイの検出下限は１．０ユニット／ｍＬであり、１００ユニット／ｍＬを上回るムチン濃度で飽和が生じた。線形範囲は、抗原１．５ユニット／ｍＬ〜２５ユニット／ｍＬであると決定された（図示せず）。アッセイ（ｎ＝５）間の変動係数（ＣＶ）を、２０ユニット／ｍＬ（ＣＶ＝８．０％）と８ユニット／ｍＬ（ＣＶ＝３．８％）の参照標準について算出した。平均回収は、２０ユニット／ｍＬ標準と８ユニット／ｍＬ標準について、それぞれ１７．５±２．８と７．１±１．９であった。
患者標本中のＰＡＭ４反応性ムチンのレベル−膵癌患者５３人を含む計２８３人の患者由来の血清をＰＡＭ４抗原の存在について検討した。様々な疾患群についての血清ムチン濃度の頻度分布を測定した（図１６）。受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を計算し（図示せず）、曲線下面積（ＡＵＣ）が０．８８±０．０３（９５％ＣＩ、０．８４〜０．９２）、Ｐ＜０．０００１（膵癌と非膵癌標本の識別についての非常に有意な差）であると決定した（実施例２３参照）。カットオフ値１０．２ユニット／ｍＬでは、感度および特異性は、それぞれ７７％および９５％と算出され（実施例２３）、健常群、良性群、および非膵癌群と比較した場合、陽性診断尤度比（ＤＬＲ）は１３．７であった。
表１３に示すデータにより、非膵癌症例の圧倒的大部分が後期疾患であるにもかかわらず、膵癌群の中央値と平均値は、他の全ての群よりも１０倍を超えて大きいことが示された。膵癌患者５３人のうち、４１人（７７％）が、カットオフ値１０．２ユニット／ｍＬで陽性であった。この同じカットオフ値で、健常標本が陽性であることはなく、膵炎患者８７人のうちの４人（５％）しか陽性でなかった。ＲＯＣ曲線解析から、膵癌と正常患者群および膵炎患者群の識別に有意差のある高い特異性が示された（図示せず）。
ＰＡＭ４免疫アッセイとＣＡ１９．９免疫アッセイの比較−特定の試料の容量が足りなかったので、５３個の膵癌標本のうち、ＰＡＭ４反応性ムチンとＣＡ１９−９の両方についてアッセイできたものは４１個しかなかった。これらのうち、２４個（５９％）は（カットオフ３５ユニット／ｍＬで）ＣＡ１９−９陽性とみなされた。ＰＡＭ４免疫アッセイの場合と同様に、健常標本がＣＡ１９−９陽性であることはなかった。しかしながら、８７個の膵炎試料のうち、ＣＡ１９−９は３７％で陽性であった（図示せず）。膵癌血清標本と膵炎血清標本の識別についてのＲＯＣ解析から、ＣＡ１９−９検査について、ＡＵＣ ０．６７±０．０５（９５％ＣＩ、０．５８〜０．７５）、特異性６３％、＋ＤＬＲ １．６であることが示された（図示せず）。この同じ膵癌血清と膵炎血清のサブセット中のＰＡＭ４反応性ムチンの統計解析は、先に論じた群解析とあまり変わらず、このサブセットの感度はわずかに低下した（７１％）が、＋ＤＬＲ（１５．４）と同様に、特異性は高い（９６％）ままであった（図示せず）。ＰＡＭ４値とＣＡ１９−９値の間に相関はなかった。４つのＰＡＭ４陽性膵炎標本のうちの２つもＣＡ１９−９陽性であった。直接的なＲＯＣ曲線の一対比較から統計的に有意な差（Ｐ＜０．００３）が得られ、ＰＡＭ４免疫アッセイにより、膵癌患者と膵炎患者の識別に対する優れた感度と特異性が示された（図示せず）。
−８０℃で凍結されていた血清試料および解析前に何年も凍結されていた血清試料で得られた結果は、当初、より新鮮な血清試料で再現性がなかった。膵癌と分かっている個人から得られた新鮮な血清試料、または膵癌ムチンを添加した新鮮な血清試料に対して行なわれた、ＰＡＭ４抗体を用いる免疫アッセイによって、偽陰性の結果が決まって得られた。解凍後、凍結試料または保存試料は、通常、脂質成分と水性成分に分離することが観察された。脂質成分を遠心分離で除去した後、残りの水性成分に対してＰＡＭ４免疫アッセイを行なった。より新鮮な血清試料を用いた初期の研究では、血清が分離することはなく、免疫アッセイを全血清に対して行なった。
凍結と長期保存の効果を再現するために、より新鮮な血清試料を有機相抽出に供して、血清脂質や他の疎水性成分を除去した。相抽出はブタノールを用いて行なわれたが、当業者であれば、この技術はそのように限定されるものではなく、当該技術分野で公知の代わりの有機溶媒を用いて行ない得ることを理解するであろう。当該技術分野で公知の例示的な有機溶媒としては、水と混ざらない他のアルコール、クロロホルム、ヘキサン、ベンゼン、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、およびエーテルが挙げられる。
血清試料の有機相抽出行なうために、３００μＬの血清を１．５ｍＬ微小遠心チューブに入れ、次に、３００μＬのｎ−ブタノールを添加し、チューブをしっかりと閉じて、５分の抽出期間中、数回激しく撹拌した。抽出の最後に、チューブを開け、３００μＬのクロロホルムを添加した。チューブをしっかりと閉じ、チューブを激しく撹拌した後、卓上遠心分離機で、高速で５分間回転させた。チューブを開け、２００μＬの上部の水相をきれいなチューブに移した。等量の免疫アッセイ希釈液（２％カゼイン）を添加し（未知血清の１：２希釈）、上記の免疫アッセイプロトコルでの抗原として用いた。有機相抽出を用いて、上記の長期凍結や長期保存に供した試料で見られた結果に相当するＰＡＭ４抗原検出と膵癌診断の結果を得た（図示せず）。
新鮮な血清試料で見られたＰＡＭ４ベースの免疫アッセイへの有機成分の妨害は、免疫アッセイの前に通常は有機溶媒抽出で処理される、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片に対するＰＡＭ４免疫組織学では観察されなかった。妨害成分は、血清への分布に限定されているようであり、固形膵癌内腫瘍に対するＰＡＭ４抗体結合を妨害することは観察されていない。
実施例３０．ＰＡＭ４に対する交差遮断抗体の調製およびアッセイ
異種移植されたＲＩＰ１ ヒト膵癌の腫瘍をヌードマウスで増殖させ、摘出する。ヒト膵癌ムチンをＧｏｌｄら（Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １９９４，１５：２０４−１０）に従って抽出し、標準的なプロトコル（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第５章，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．）に従ってマウスを免疫化するのに用いる。抗体産生ハイブリドーマ細胞を免疫化マウスから調製し、ヒト膵癌ムチン抽出物に対する結合についてスクリーニングする。陽性クローンを拡大し、モノクローナル抗体を、実施例１に記載したような競合的結合アッセイを用いて、ｃＰＡＭ４に対する交差遮断活性について試験する。ｃＰＡＭ４に対する交差遮断抗体をヒト膵癌ムチンに対する結合の競合によって同定する。
本発明の生成物、組成物、方法、およびプロセスに対して様々な修正や変更を行なうことができることが当業者には明白であろう。したがって、そのような修正や変更が、添付の特許請求の範囲やその等価物の範囲内に収まるならば、本発明はそれらを含むことが意図される。

Claims (12)

  1. 抗膵癌抗体またはその抗原結合断片を含む膵癌の診断剤であって、
    前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、キメラＰＡＭ４（ｃＰＡＭ４）抗体とヒト膵癌ムチンに対する結合を競合し、前記ｃＰＡＭ４抗体が、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＹ、配列番号１）、ＣＤＲ２（ＳＴＳＮＬＡＳ、配列番号２）、およびＣＤＲ３（ＨＱＷＮＲＹＰＹＴ、配列番号３）、ならびに重鎖可変領域ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＳＹＶＬＨ、配列番号４）、ＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＱＹＮＥＫＦＫＧ、配列番号５）、およびＣＤＲ３（ＧＦＧＧＳＹＧＦＡＹ、配列番号６）を含み、
    前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、アミノ酸配列ＷＴＷＮＩＴＫＡＹＰＬＰ（配列番号２９）を含む線状ペプチドまたはアミノ酸配列ＡＣＰＥＷＷＧＴＴＣ（配列番号３０）を含む環状ペプチドに結合し、
    前記診断剤は、膵癌を有することが疑われる個体から採取された試料にインビトロで曝露され、その後、前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が膵癌抗原に結合したことが検出されるように用いられ、
    前記試料が、前記個体から採取された血清試料に対して有機相抽出を行なうことで得られた水相であり、
    前記有機相がブタノールである、診断剤。
  2. 前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、軽鎖可変領域ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＹ、配列番号１）、ＣＤＲ２（ＳＴＳＮＬＡＳ、配列番号２）、およびＣＤＲ３（ＨＱＷＮＲＹＰＹＴ、配列番号３）、ならびに重鎖可変領域ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＳＹＶＬＨ、配列番号４）、ＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＱＹＮＥＫＦＫＧ、配列番号５）、およびＣＤＲ３（ＧＦＧＧＳＹＧＦＡＹ、配列番号６）を含む、請求項１に記載の診断剤。
  3. 前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、膵癌細胞に結合し、正常膵組織または膵炎または良性膵組織に結合せず、
    前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、ＰａｎＩＮ−１Ａ、ＰａｎＩＮ−１Ｂ、ＰａｎＩＮ−２、浸潤性膵腺癌、膵癌、粘液性嚢胞腫瘍（ＭＣＮ）、膵管内粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、および膵管内乳頭粘液性腫瘍に結合する、請求項１又は２に記載の診断剤。
  4. 前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、８０％以上のヒトの浸潤性膵腺癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍、ＰａｎＩＮ−１Ａ、ＰａｎＩＮ−１Ｂ、およびＰａｎＩＮ−２に結合し、
    前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、ＰａｎＩＮ−１Ａ、ＰａｎＩＮ−１Ｂ、およびＰａｎＩＮ−２に結合するが、膵炎には結合しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の診断剤。
  5. 前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、放射性核種、造影剤、蛍光剤、化学発光剤、生物発光剤、常磁性イオン、酵素、および光活性診断剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤にコンジュゲートされている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の診断剤。
  6. 前記放射性核種が、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、並びに、その他のガンマ線放射体、ベータ線放射体、及び陽電子放射体からなる群から選択される、請求項５に記載の診断剤。
  7. 前記常磁性イオンが、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、およびエルビウム（ＩＩＩ）からなる群から選択される、請求項５に記載の診断剤。
  8. 前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、ＭＵＣ−５ａｃに結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の診断剤。
  9. 膵癌の検出用の医薬品を製造するための請求項１〜８のいずれか一項に記載の診断剤の使用。
  10. 膵癌を検出する方法であって、
    ａ）個体から得られた血清試料に対して有機相抽出を行ない、水相を得る工程と、
    ｂ）得られた前記水相を抗膵癌抗体またはその抗原結合断片に曝露し、膵癌抗原を検出する工程であって、前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が軽鎖可変領域ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＹ、配列番号１）、ＣＤＲ２（ＳＴＳＮＬＡＳ、配列番号２）、およびＣＤＲ３（ＨＱＷＮＲＹＰＹＴ、配列番号３）、ならびに重鎖可変領域ＣＤＲ配列のＣＤＲ１（ＳＹＶＬＨ、配列番号４）、ＣＤＲ２（ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＱＹＮＥＫＦＫＧ、配列番号５）、およびＣＤＲ３（ＧＦＧＧＳＹＧＦＡＹ、配列番号６）を含む、工程と、
    を含み、
    前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、アミノ酸配列ＷＴＷＮＩＴＫＡＹＰＬＰ（配列番号２９）を含む線状ペプチドまたはアミノ酸配列ＡＣＰＥＷＷＧＴＴＣ（配列番号３０）を含む環状ペプチドに結合し、
    前記有機相がブタノールである、方法。
  11. 前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、８０％以上のヒトの浸潤性膵腺癌、膵管内乳頭粘液性腫瘍、ＰａｎＩＮ−１Ａ、ＰａｎＩＮ−１Ｂ、およびＰａｎＩＮ−２に結合し、
    前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、ＰａｎＩＮ−１Ａ、ＰａｎＩＮ−１Ｂ、およびＰａｎＩＮ−２に結合するが、膵炎には結合しない、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記抗膵癌抗体またはその抗原結合断片が、ＭＵＣ−５ａｃに結合する、請求項１０又は１１に記載の方法。
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