CN105073128A - 用于诱导对疾病的免疫应答的组合疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及两种或更多种用于诱导对癌症或传染病的免疫应答的药剂的组合。药剂可以包括白细胞重定向复合物、抗体-药物缀合物、干扰素(优选干扰素-a)和/或检查点抑制子抗体。白细胞重定向复合物具有至少一个针对白细胞抗原的结合位点和至少一个针对患病细胞或病原体上的抗原的结合位点。优选地，所述复合物是DNLTM复合物。更优选地，所述复合物包含双特异性抗体(bsAb)。最优选地，所述bsAb是抗CD3×抗CD19双特异性抗体，但可以使用针对其它白细胞抗原和/或疾病相关抗原的抗体。所述复合物能够靶向效应子T细胞、NK细胞、单核细胞或嗜中性粒细胞，以诱导与癌症或传染病相关的细胞的白细胞介导的细胞毒性。通过共同施用干扰素、检查点抑制子抗体和/或ADC来增强所述细胞毒性免疫应答。

Description

用于诱导对疾病的免疫应答的组合疗法
相关申请的交叉引用
本申请是2013年8月14日提交的美国专利申请序列号13/966,450的部分接续，该专利申请根据35U.S.C.119(e)第要求2013年4月3日提交的临时美国专利申请61/807,998的权益，各优先权申请是以全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式经由EFS-Web提交且以全文引用的方式并入在此。所述ASCII副本创建于2013年12月10日，命名为IBC138WO2_SL.txt，且大小为49,084字节。
发明领域
本发明涉及两种或更多种用于诱导对诸如癌症或传染病等疾病的免疫应答的药剂的组合。示例性药剂可以包括：(i)白细胞重定向双特异性抗体；(ii)抗体-药物缀合物；(iii)干扰素，诸如干扰素α、干扰素β或干扰素λ(最优选干扰素-α)；和/或(iv)检查点抑制子抗体。两种或更多种此类药剂的任何组合均可用于标的目标方法和组合物中。所述组合可以同时或相继施用。此类组合可以包含任两种药剂、任三种药剂或所有四种类型药剂。
在某些实施方案中，本发明涉及使用白血球白细胞重定向复合物的组合物和方法。所使用的白血球白细胞可以包括T细胞、NK细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞。优选地，所述复合物包含一个结合位点针对T细胞、NK细胞、单核细胞或嗜中性粒细胞上所表达的抗原且另一个结合位点针对患病细胞或病原体上所表达的抗原的双特异性抗体。在更优选的实施方案中，所述复合物被制造为DOCK-AND-LOCKTM复合物，其中使用来自人蛋白激酶A(PKA)的二聚和对接结构域(DDD)部分与来自AKAP(A激酶锚定蛋白)的锚定域锚定结构域(AD)部分之间的结合相互作用将所述组分连接在一起。然而，已知并且可以使用制造双特异性抗体复合物的其它方法。标的目标复合物可以包含一种或多种可结合诸如CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69或CD90(最优选CD3)等表达于T细胞上的抗原的抗体或抗原结合抗体片段和一种或多种可结合诸如CD19、CD20、CD22、CD33、CD66e(CEACAM5)、CEACAM6、EpCAM、HER2/neu、EGF受体、Trop-2、MUC5ac或另一种肿瘤相关抗原(TAA)等处于靶细胞上的抗原或表达于不同的患病细胞或病原微生物上的抗原的抗体或抗原结合抗体片段。以下更详细地论述所使用的特定靶抗原。所述双特异性抗体重新定向效应子T细胞、单核细胞、NK细胞或嗜中性粒细胞以靶向患病的细胞、组织或病原体，且诱导针对靶标的目标免疫应答。
其它实施方案涉及诸如干扰素α、干扰素β或干扰素λ(最优选干扰素α)的使用。干扰素是可以通过活化NK细胞和巨噬细胞来增强免疫系统功能的细胞激素型免疫调节剂。干扰素还可以具有作为拮抗剂的直接效应且通过诱导靶抗原或其它效应蛋白的表达而起作用。
检查点抑制子抗体主要用于癌症疗法。免疫检查点是指免疫系统中负责维持自体耐受性和调节免疫系统反应度反应从而将周围组织损伤减至最小的抑制途径。然而，肿瘤细胞还可以活化免疫系统检查点以降低针对肿瘤组织的免疫应答的有效性。针对细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4，也称为CD152)、程序性细胞死亡蛋白1(，PD1，也称为CD279)和程序性细胞死亡1配体1(PD-L1，也称为CD274)的示例性检查点抑制子抗体描述如下并且可以与一种或多种其它药剂组合用于提高对疾病细胞、组织或病原体的免疫应答的有效性。
可以通过与例如能在施用免疫调节剂之前降低肿瘤负担或使免疫原性抗原从被杀死的肿瘤细胞中释放的其它药剂组合来提高疾病疗法的免疫系统诱导效力。在许多种类型的癌症中，抗体-药物缀合物(ADC)可以有效地降低肿瘤负担。本领域中已知许多种示例性ADC，诸如IMMU-130(拉贝珠单抗-SN-38)、IMMU-132(hRS7-SN-38)和米拉珠单抗-多柔比星或pro-2-吡咯啉并多柔比星(Pro2PDox)抗体缀合物，如以下所论述。任何此类已知ADC均可与一种、两种或三种如本文中所描述的免疫调节剂组合施用。
所使用的不同组合可以包括白血球白细胞重定向双特异性抗体(bsAb)加干扰素(例如干扰素α)；白血球白细胞重定向bsAb加检查点抑制子抗体；白血球白细胞重定向bsAb加IFN加检查点抑制子抗体；ADC加检查点抑制子抗体；ADC加IFN加检查点抑制子抗体；ADC加白血球白细胞重定向bsAb加检查点抑制子抗体；或ADC加白血球白细胞重定向bsAb加IFN加检查点抑制子抗体。如上文所论述，本文中所公开的不同类型药剂的任何组合均可用于疾病治疗。
发明背景
使用双特异性抗体(bsAb)重定向效应子T细胞以便靶向杀死肿瘤细胞已经显示出了可观的临床前和临床前景(参见例如Topp等，2012，Blood120：5185-87；Bargou等，2008，Science321：974-77)。迄今为止所开发的双特异性抗体含有对用于T细胞募集和活化的CD3具有特异性的第一结合位点和针对诸如CD19等目标疾病相关抗原的第二结合位点(Bassan，2012，Blood120：5094-95)。双特异性抗体使CD3+T细胞与所靶向的疾病细胞直接接触且诱导细胞介导的细胞毒性(Bassan，2012)。已经报告了抗CD3X抗CD19双特异性抗体在大约70％的成年MRD+ALL患者中在极低浓度下即产生完全而又持久的分子缓解(Topp等，2012，Blood120：5185-87)。识别T细胞上的神经胶质瘤和CD3表位的双特异性抗体已经成功地用于治疗人类患者的脑肿瘤(Nitta等，Lancet1990；355：368-371)。
白细胞重新定向bsAb不局限于T细胞。包含针对NK细胞抗原CD16和肿瘤相关抗原(例如CD19、CD22、CD33)的scFv的双特异性杀伤衔接子(BiKE)亦显示有效的抗癌活性(例如，Miller，HematologySocHematolEducPogram2013：247-53)。其它替代方案包括三特异性杀伤衔接子(TriKE)，诸如抗CD16×抗CD19×抗CD22(Miller，2013；Gleason等，2012，MolCancerTher11：2674-84)。抗CD16×抗CD33BiKE被用于治疗AML和脊髓发育不良综合征(Miller，2013；Wiernik等，2013，ClinCancerRes19：3844-55)。在难治性AML中，CD16×CD33BiKE引起有效的肿瘤细胞杀死和NK细胞的细胞因子产生。对ADAM17的抑制增强了CD16×CD33BiKE反应(Miller，2013)。已经报告了针对例如CD16/CD19/HLA-DR的其它三特异性三价构建体(Schubert等，2012，mAbs4：45-56)。
用于产生双特异性抗体的许多方法是已知的(参见例如美国专利号7,405,320)。可以通过四价体瘤法产生双特异性抗体，这涉及使两个不同的杂交瘤融合，各杂交瘤产生识别不同的抗原位点的单克隆抗体(Milstein和Cuello，Nature1983；305：537-540)。融合的杂交瘤能够合成两个不同的重链和两个不同的轻链，它们可以随机缔合，得到具有10种不同的抗体结构的异源群体，其中仅一种(达总抗体分子的1/8)将是双特异性的，且因此必须进一步提纯而与其它形成分离。融合杂交瘤的细胞基因稳定性通常弱于亲本杂交瘤，使得生产细胞系的产生更成问题。
另一种用于产生双特异性抗体的方法使用杂双官能交联剂来化学系栓两个不同的单株抗体，使得所得混合缀合物将结合于两个不同的靶标(Staerz等，Nature1985；314：628-631；Perez等，Nature1985；316：354-356)。通过这种方法产生的双特异性抗体本质上是两个IgG分子的异源缀合物，其缓慢扩散至组织中且快速从循环中去除。双特异性抗体还可以通过将两个亲本单株抗体各自还原成相应的半分子，最后混合且允许再氧化以获得杂合结构来产生(Staerz和Bevan.ProcNatlAcadSciUSA1986；83：1453-1457)。替代方法包括使用适当的连接子使两种或三种分开纯化的Fab′片段化学交联。所有这些化学方法对于商业开发来说由于高制造成本、费力的生产工艺、广泛的纯化步骤、低产率(＜20％)和不均质产物而不合需要。
通过重组DNA技术产生的抗体的离散VH和VL结构域可以彼此配对以形成具有结合能力的二聚体(重组Fv片段)(美国专利号4,642,334)。然而，此类非共价缔合分子在生理条件下的稳定性不足以具有任何实际用途。同源VH和VL结构域可以利用具有适当组成和长度(通常由多于12个氨基酸残基组成)的肽连接子连接以形成具有结合活性的单链Fv(scFv)。通过改变连接子长度来制造基于scFv的多价多特异性药剂的方法公开于美国专利号5,844,094、美国专利号5,837,242和WO98/44001中。往往与产生基于scFv的多价多特异性药剂相关的常见问题是低表达水平、不均质产物、在溶液中不稳定从而产生聚集物、在血清中不稳定和亲和力受到削弱。
若干种靶向CD3和CD19的双特异性抗体正在临床开发中。被称作的基于scFv的双特异性抗体构建体(双特异性T细胞衔接子)采用含有2个抗原结合特异性的单个多肽，各抗原结合特异性由经由挠性连接子串联连接的同源VH和VL贡献(参见例如Nagorsen等，2009，Leukemia&Lymphoma50：886-91；Amann等，2009，JImmunother32：453-64；Baeuerle和Reinhardt，2009，CancerRes69：4941-44)。被称为(的另一种双特异性抗体(双亲和力再靶向)利用经二硫化物稳定的双功能抗体设计(参见例如Moore等，2011，Blood117：4542-51；Veri等人，2010，ArthritisRheum62：1933-43)。和两者由于其小尺寸(～55kDa)均展现快速血液清除率，这需要频繁施用以维持双特异性抗体的治疗水平。
干扰素在抗癌和抗微生物宿主防御中起重要作用，并且已经作为癌症和传染病治疗剂而被广泛探究(Billiau等，2006，CytokineGrowthFactorRev17：381-409；Pestka等，2004，ImmunolRev202：8-32)。尽管用I型和II型干扰素(IFN-α/β和γ)进行了大量工作，但其在临床处置中的使用由于在患者中的短循环半衰期、全身毒性和次最佳反应而受到限制(Pestka等，2004，ImmunolRev202：8-32；Miller等，2009，AnnNYAcadSci1182：69-79)。2003初发现IFN-λ家族为开发用于这些未被满足的临床适应症的替代性IFN药剂带来了令人激动的新机遇(Kotenko等，2003，NatImmunol4：69-77；Sheppard等，2003，NatImmunol4：63-8)。
迄今为止已经通过批准IFN-α2用于治疗毛细胞白血病、慢性髓性白血病、恶性黑色素瘤、滤泡性淋巴瘤、尖锐湿疣、AID相关卡波西肉瘤和慢性乙型和丙型肝炎；IFN-β用于治疗多发性硬化；和IFN-γ用于治疗慢性肉芽肿病和恶性骨硬化病而验证了IFN的疗效。尽管关于这组自分泌和旁分泌细胞激素有大量文献，但仍阐述其在健康和疾病中的功能，包括临床上引入的更为有效而又新颖的形式(Pestka，2007，J.Biol.Chem282：20047-51；Vilcek，2006，Immunity25：343-48)。还持续调查各种干扰素与基于抗体的疗法的组合的效果。
抗体-药物缀合物(ADC)是一类有效的治疗构建体，其允许将细胞毒性剂靶向递送至靶细胞，诸如癌细胞。由于靶向功能，这些化合物与同样全身递送的药剂相比显示出高得多的治疗指数。已经开发了呈完整抗体或诸如scFv等抗体片段形式的ADC。所述抗体或片段经由在生理条件下稳定但一旦在靶细胞内后就可能裂解的连接子连接于药物的一个或多个拷贝。批准用于治疗性用途的ADC包括用于AML的吉姆单抗-奥佐米星(随后退出市场)、用于ALCL和何杰金氏淋巴瘤的贝伦妥单抗-维多汀和用于HER2阳性转移性乳腺癌的曲妥单抗-安坦辛(Verma等，2012，NEnglJMed367：1783-91；Bross等，2001，ClinCancerRes7：1490-96；Francisco等，2003，Blood102：1458-65)。许多其它候选ADC目前在临床试验中，诸如伊珠单抗-奥佐米星(Pfizer)、格巴妥莫单抗-维多汀(CelldexTherapeutics)、SAR3419(Sanofi-Aventis)、SAR56658(Sanofi-Aventis)、AMG-172(Amgen)、AMG-595(Amgen)、BAY-94-9343(Bayer)、BIIB015(BiogenIdec)、BT062(Biotest)、SGN-75(SeattleGenetics)、SGN-CD19A(SeattleGenetics)、伏司妥珠单抗-马佛多汀(SeattleGenetics)、ABT-414(AbbVie)、ASG-5ME(Agensys)、ASG-22ME(Agensys)、ASG-16M8F(Agensys)、IMGN-529(ImmunoGen)、IMGN-853(ImmunoGen)、MDX-1203(Medarex)、MLN-0264(Millenium)、RG-7450(Roche/Genentech)、RG-7458(Roche/Genentech)、RG-7593(Roche/Genentech)、RG-7596(Roche/Genentech)、RG-7598(Roche/Genentech)、RG-7599(Roche/Genentech)、RG-7600(Roche/Genentech)、RG-7636(Roche/Genentech)、抗PSMAADC(Progenics)、洛妥珠单抗-默坦辛(ImmunoGen)、米拉珠单抗-多柔比星(Immunomedics)、IMMU-130(Immunomedics)、IMMU-132(Immunomedics)和pro-2-吡咯啉并多柔比星的抗体缀合物。(参见例如Li等，2013，DrugDiscTher7：178-84；Firer和Gellerman，JHematolOncol5：70；Beck等，2010，DiscovMed10：329-39；Mullard，2013，NatureRevDrugDiscovery12：329，临时美国专利申请61/761,845。)由于ADC充当具有降低的系统毒性的有效抗癌剂的潜力，它们可以单独或作为附属疗法用以减少肿瘤负担。
另一种有前景的免疫疗法涉及使用针对免疫检查点蛋白质的拮抗性抗体(例如，Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-64)。免疫检查点充当用于维持自体耐受性和调节对抗原刺激的免疫应答的持续时间和程度的免疫系统功能的内源性抑制途径(Pardoll，2012)。然而，似乎肿瘤组织和可能某些病原体可以指派检查点系统以降低宿主免疫应答的有效性，从而导致肿瘤生长和/或慢性感染(参见例如Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-64；Nirschl和Drake，2013，ClinCancerRes19：4917-24)。检查点分子包括CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞抗原-4)、PD1(程序性细胞死亡蛋白1)、PD-L1(程序性细胞死亡配位体配体1)、LAG-3(淋巴细胞活化基因-3)、TIM-3(T细胞免疫球蛋白和粘蛋白-3)和若干种其它检查点分子(Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-64；Nirschl和Drake，2013，ClinCancerRes19：4917-24)。针对若干种检查点蛋白质(CTLA4、PD1、PD-L1)的抗体正在临床试验中，并且对耐标准治疗性肿瘤显示了出乎意料的效力。
需要用于产生具有更长T1/2、更佳药代动力学性质、增加的体内稳定性和/或改良的体内效力的经改良双特异性抗体复合物的方法和组合物。还需要用于改良涉及诱导针对诸如癌症或传染病等各种疾病的免疫应答的治疗的效力的组合疗法。
发明概要
本发明涉及利用选自白细胞重新定向复合物、干扰素、检查点抑制子抗体和抗体-药物缀合物(ADC)的两种或更多种药剂的组合疗法。前三种类型的药剂可以用来诱导或增强对诸如肿瘤相关抗原(TAA)或病原体(微生物)表达的抗原等疾病相关抗原的免疫应答。ADC可以与任何或所有免疫调节剂组合用于减少肿瘤负担和提高总体治疗效力。
在利用白细胞重新定向复合物的实施方案中，所述复合物优选地是双特异性抗体(bsAb)，其中一个结合位点针对白细胞表达的抗原，且第二结合位点结合于肿瘤细胞或病原体(即，微生物)上的靶抗原。示例性T细胞抗原是选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69和CD90。NK细胞上表达的示例性抗原是选自CD8、CD16、CD56、CD57、ADAM17、KIR和CD137。示例性单核细胞抗原是选自CD74、HLA-DRα链、CD14、CD16、CD64和CD89。示例性嗜中性粒细胞抗原是选自CEACAM6、CEACAM8、CD16b、CD32a、CD89、CD177、CD11a、CD11b和SLC44A2。优选地，T细胞抗原是CD3，或NK细胞抗原是CD16。第二抗体的靶抗原可以选自甲胎蛋白(AFP)、α4整合素、B7、碳酸酐酶IX、补体因子C1q、C1r、C1s、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5a、C5aR、C5b、C5、C6、C7、C8、C9n、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3R、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD86、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM-5、CEACAM-6、CSAp、纤连蛋白的ED-B、EGFR、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ErbB2、因子H、FHL-1、纤维蛋白、Flt-3、叶酸受体、糖蛋白IIb/IIIa、gp41、gp120、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、HM1.24、HMGB-1、低氧可诱导因子(HIF)、Ia、ICAM-1、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ、IgE、IGF-1R、IL-1、IL-1Ra、IL-2、IL-4R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-13R、IL-15R、IL-15、IL-17、IL-17R、IL-18、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、胰岛素样生长因子1(ILGF-1)、IP-10、KIR、Le(y)、脂多糖(LPS)、MAGE、MCP-1、mCRP、MIF、MIP-1A、MIP-1B、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、NCA-90、NCA-95、NF-κB、PlGF、PSMA、RANTES、T101、TAC、TAG-72、腱生蛋白、汤姆森-弗里德里希抗原、凝血酶、组织因子、Tn抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、肿瘤坏死抗原、VEGF、VEGFR和致癌基因产物。
以下实施例中所公开的白细胞重新定向bsAb的示例性设计组合了抗CD3scFv与抗CD19F(ab)2，以形成被命名为(19)-3s的构建体，其特异性靶向B细胞。以下更详细地论述的组合抗CD3与针对其它肿瘤相关抗原的抗体片段的其它bsAb用于各种实性肿瘤的靶向白细胞免疫疗法。这种设计的优势包括与肿瘤细胞二价结合、阻止快速肾清除的大尺寸(～130kDa)和有效的白细胞介导的细胞毒性。bsAb介导白细胞白细胞与同源靶细胞之间的免疫学突触的形成，在靶细胞存在下诱导白细胞活化和增殖，重新定向有效的白细胞介导的体外靶细胞杀死，且抑制体内人类肿瘤生长。
优选的实施方案涉及所产生的呈三价DNLTM复合物形式的白细胞重新定向双特异性抗体，其具有更久T1/2、更佳药代动力学性质和增加的体内稳定性。用于产生和使用包含与来自AKAP的AD部分结合的来自人类PKA调节亚单位RIα、RIβ、RIIα或RIIβ的DDD部分的二聚体的DNLTM复合物的方法是熟知的(参见例如美国专利号7,550,143、7,521,056、7,534,866、7,527,787、7,666,400、7,906,118、7,901,680、8,003,111和8,034,352，各专利的实施例部分是以引用的方式并入本文中)。通过将不同的效应部分，诸如抗体或抗体片段，连接于DDD和AD部分，可以构建并使用实际上包含效应因子的任何组合的DNLTM复合物。
所使用的抗体可以具有各种同型，优选地人类人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，更优选地包含人类人IgG1铰链和恒定区序列。所述抗体或其片段可以是嵌合人类-小鼠、人源化(人类架构和鼠类高变(CDR)区)或完全人类的以及其变异形式，诸如半IgG4抗体(称为“单抗体”)，如vanderNeutKolfschoten等所描述(Science2007；317：1554-1557)。更优选地，抗体或其片段可以经过设计或选择而包含属于特定同种异型的恒定区序列，这在施用于人类受试者时可以降低免疫原性。所施用的优选同种异型包括非G1m1同种异型(nG1m1)，诸如G1m3、G1m3，1、G1m3，2或G1m3，1，2。更优选地，所述同种异型是选自nG1m1、G1m3、nG1m1，2和Km3同种异型。
其它优选实施方案涉及白细胞重新定向复合物与一种或多种检查点抑制子抗体组合的组合物和/或用途。此类抗体对检查点抑制剂功能具有拮抗性。许多此类抗体在本领域中是已知的，诸如兰利珠单抗(MK3475，Merck)、尼鲁单抗(BMS-936558，Bristol-MyersSquibb)、皮地珠单抗(CT-011，CureTechLtd.)、AMP-224(Merck)、MDX-1105(Medarex)、MEDI4736(MedImmune)、MPDL3280A(Genentech)、BMS-936559(Bristol-MyersSquibb)、伊匹单抗(Bristol-MyersSquibb)和曲美目单抗(Pfizer)。诸如利利单抗(InnatePharma)和IPH2101(InnatePharma)等抗KIR抗体可以在NK细胞中执行类似的功能。任何已知的检查点抑制子抗体均可与一种或多种其它药剂组合使用。
可以组合使用的另一种药剂是干扰素。可用的干扰素在本领域中是已知的，并且可以包括干扰素α、干扰素β、干扰素λ1、干扰素λ2或干扰素λ3。优选地，所述干扰素是干扰素α。标的目标干扰素可以作为游离干扰素、PEG化干扰素、干扰素融合蛋白质或与抗体缀合的干扰素来施用。
在替代实施方案中，以上所论述的一种或多种免疫调节剂可以与抗体-药物缀合物(ADC)组合使用。ADC对于在无显著系统毒性的情况下减少肿瘤负担特别有效，并且可以用于提高由白细胞重新靶向bsAb、干扰素和/或检查点抑制子抗体所诱导的免疫应答的有效性。有用的示例性ADC可以包括批准用于治疗性用途的ADC，包括用于AML的吉姆单抗-奥佐米星(随后退出市场)、用于ALCL和何杰金氏淋巴瘤的贝伦妥单抗-维多汀和用于HER2阳性转移性乳腺癌的曲妥单抗-安坦辛(Verma等，2012，NEnglJMed367：1783-91；Bross等，2001，ClinCancerRes7：1490-96；Francisco等，2003，Blood102：1458-65)。许多其它候选ADC目前正在临床试验中，诸如伊珠单抗-奥佐米星(Pfizer)、格巴妥莫单抗-维多汀(CelldexTherapeutics)、SAR3419(Sanofi-aventis)、SAR56658(Sanofi-Aventis)、AMG-172(Amgen)、AMG-595(Amgen)、BAY-94-9343(Bayer)、BIIB015(BiogenIdec)、BT062(Biotest)、SGN-75(SeattleGenetics)、SGN-CD19A(SeattleGenetics)、伏司妥珠单抗-马佛多汀(SeattleGenetics)、ABT-414(AbbVie)、ASG-5ME(Agensys)、ASG-22ME(Agensys)、ASG-16M8F(Agensys)、IMGN-529(ImmunoGen)、IMGN-853(ImmunoGen)、MDX-1203(Medarex)、MLN-0264(Millenium)、RG-7450(Roche/Genentech)、RG-7458(Roche/Genentech)、RG-7593(Roche/Genentech)、RG-7596(Roche/Genentech)、RG-7598(Roche/Genentech)、RG-7599(Roche/Genentech)、RG-7600(Roche/Genentech)、RG-7636(Roche/Genentech)、抗PSMAADC(Progenics)、洛妥珠单抗-默坦辛(ImmunoGen)、米拉珠单抗-多柔比星(Immunomedics)、IMMU-130(Immunomedics)和IMMU-132(Immunomedics)。(参见例如Li等，2013，DrugDiscTher7：178-84；Firer和Gellerman，JHematolOncol5：70；Beck等，2010，DiscovMed10：329-39；Mullard，2013，NatureRevDrugDiscovery12：329。)优选地，在ADC与免疫调节剂组合使用的情况下，ADC是在免疫调节剂之前施用。
在某些实施方案中，标的目标组合疗法可用于治疗癌症。预期可以靶向任何类型的肿瘤和任何类型的肿瘤抗原。可以靶向的示例性癌症类型包括急性淋巴母细胞性白血病、急性髓性白血病、胆癌、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、何杰金氏淋巴瘤、肺癌、骨髓甲状腺癌、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和膀胱癌。然而，熟练的技术人员应认识到，已知肿瘤相关抗原实际上用于任何类型的癌症。
可以被白细胞重新定向bsAb和/或被ADC靶向的肿瘤相关抗原包括但不限于甲胎蛋白(AFP)、α-辅肌动蛋白-4、A3、A33抗体特异性抗原、ART-4、B7、Ba733、BAGE、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、碳酸酐酶IX、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CTLA4、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-Met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1(TROP-2)、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、成纤维细胞生长因子(FGF)、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GRO-β、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和其亚单位、HER2/neu、HMGB-1、低氧可诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、PAM4抗原、胰腺癌粘蛋白、PD1受体、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活蛋白、存活蛋白2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原、肿瘤坏死抗原、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标记物、bcl-2、bcl-6、Kras、致癌基因标记物和致癌基因产物(参见例如Sensi等，ClinCancerRes2006，12：5023-32；Parmiani等，JImmunol2007，178：1975-79；Novellino等，CancerImmunolImmunother2005，54：187-207)。
可以用于癌症疗法的示例性抗体包括但不限于hA19(抗CD19，美国专利号7,109,304)、hR1(抗IGF-1R，美国专利申请序列号12/722,645，2010年12月3日提交)、hPAM4(抗MUC5ac，美国专利号7,282,567)、hA20(抗CD20，美国专利号7,251,164)、hIMMU31(抗AFP，美国专利号7,300,655)、hLL1(抗CD74，美国专利号7,312,318)、hLL2(抗CD22，美国专利号7,074,403)、hMu-9(抗CSAp，美国专利号7,387,773)、hL243(抗HLA-DR，美国专利号7,612,180)、hMN-14(抗CEACAM5，美国专利号6,676,924)、hMN-15(抗CEACAM6，美国专利号7,541,440)、hRS7(抗EGP-1，美国专利号7,238,785)、hMN-3(抗CEACAM6，美国专利号7,541,440)、Ab124和Ab125(抗CXCR4，美国专利号7,138,496)，各引用专利或申请的实施例部分是以引用的方式并入本文中。
已经报告了利用免疫调节抗体的组合疗法用于提高例如对抗肿瘤细胞的效力。Morales-Kastresana等(2013，ClinCancerRes19：6151-62)显示抗PD-L1(10B5)抗体与抗CD137(1D8)和抗OX40(OX86)抗体的组合在肝细胞癌转基因小鼠模型中提供提高的效力。还报告了抗CTLA4与抗PD1抗体的组合是高度有效的(Wolchok等，2013，NEnglJMed369：122-33)。利妥昔单抗与诸如利利单抗(InnatePharma)或IPH2101(InnatePharma)等抗KIR抗体的组合对造血肿瘤也更有效(Kohrt等，2012)。技术人员应认识到标的目标组合疗法可以包括与作为免疫刺激性抗肿瘤或抗感染剂的多种抗体的组合。
可用于治疗各种疾病状态的替代抗体包括但不限于阿昔单抗(抗糖蛋白IIb/IIIa)、阿仑单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉姆单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(抗CD20)、帕尼单抗(抗EGFR)、利妥昔单抗(抗CD20)、托西莫单抗(抗CD20)、曲妥单抗(抗ErbB2)、兰利珠单抗(抗PD1受体)、尼鲁单抗(抗PD1受体)、伊匹单抗(抗CTLA4)、阿巴伏单抗(抗CA-125)、阿德目单抗(抗EpCAM)、阿利珠单抗(抗IL-6受体)、贝那利珠单抗(抗CD125)、奥妥珠单抗(GA101、抗CD20)、CC49(抗TAG-72)、AB-PG1-XG1-026(抗PSMA，美国专利申请11/983,372，作为ATCCPTA-4405和PTA-4406寄存)、D2/B(抗PSMA，WO2009/130575)、托珠单抗(抗IL-6受体)、巴利昔单抗(抗CD25)、达克珠单抗(抗CD25)、依法利珠单抗(抗CD11a)、GA101(抗CD20；GlycartRoche)、那他珠单抗(抗α4整合素)、奥玛珠单抗(抗IgE)；抗TNF-α抗体，诸如CDP571(Ofei等，2011，Diabetes45：881-85)、MTNFAI、M2TNFAI、M3TNFAI、M3TNFABI、M302B、M303(ThermoScientific，Rockford，IL)、英夫利昔单抗(Centocor，Malvern，PA)、聚乙二醇化赛妥珠单抗(UCB，Brussels，Belgium)、抗CD40L(UCB，Brussels，Belgium)、阿达木单抗(Abbott，AbbottPark，IL)、(HumanGenomeSciences)；抗CD38抗体，诸如MOR03087(MorphoSysAG)、MOR202(Celgene)、HuMax-CD38(Genmab)或达拉木单抗(Johnson&Johnson)；抗HIV抗体，诸如P4/D10(美国专利8,333,971)、Ab75、Ab76、Ab77(Paulik等，1999，BiochemPharmacol58：1781-90)以及由Polymun(Vienna，Austria)所描述和出售、还描述于美国专利5,831,034、美国专利5,911,989和Vcelar等，AIDS2007；21(16)：2161-2170和Joos等，Antimicrob.AgentsChemother.2006；50(5)：1773-9中的抗HIV抗体。
在其它实施方案中，标的目标组合疗法可用于治疗感染了诸如细菌、病毒或真菌等致病生物体的受试者。可以治疗的示例性真菌包括小孢霉、发癣菌、表皮癣菌、申克孢子丝菌、新型隐球菌、粗球孢子菌、荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌或白色念珠菌。示例性病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、流感病毒、人类乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病毒、Reo病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革热病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人类T细胞白血病毒白血病病毒、埃-巴二氏病毒、鼠类白血病毒白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口膜炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒或蓝舌病病毒。示例性细菌包括炭疽杆菌、无乳链球菌、嗜肺军团菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、肺炎球菌属、B型流感嗜血杆菌、苍白密螺旋体、莱姆病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产布鲁氏菌、结核分枝杆菌或支原体。ADC对抗传染物的示例性用途公开于Johannson等(2006，AIDS20：1911-15)和Chang等，2012，PLosOne7：e41235中。
针对病原体的已知抗体包括但不限于P4D10(抗HIV)、CR6261(抗流感)、艾韦单抗(抗乙型肝炎)、泛维珠单抗(抗呼吸道合胞病毒)、夫瑞韦如(抗狂犬病病毒)、莫维珠单抗(抗呼吸道合胞病毒)、帕利珠单抗(抗呼吸道合胞病毒)、帕诺库单抗(抗假单胞菌)、瑞非韦鲁(抗狂犬病病毒)、瑞加韦单抗(抗巨细胞病毒)、司韦单抗(抗巨细胞病毒)、替韦卢单抗(抗乙型肝炎)和乌珠单抗(抗大肠杆菌)。
目标药剂可以与一种或多种其它免疫调节剂组合施用以增强免疫应答。免疫调节剂可以包括但不限于细胞因子、趋化因子、干细胞生长因子、淋巴细胞毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子α(TNF)、TNF-β、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素λ、被命名为“S1因子的”干细胞生长因子、人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体生成激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、苗勒氏管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整合素、NGF-β、血小板生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子II、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、FLT-3、制管张素、血小板反应蛋白、内皮抑素或淋巴毒素。在某些实施方案中，白细胞重新定向双特异性抗体或抗体片段可以连接于免疫调节剂，诸如细胞因子。细胞因子复合物公开于例如美国专利号7,906,118和8,034,3522中，各专利的实施例部分是以引用的方式并入本文中。
虽然在优选的实施方案中白细胞重新定向bsAb的T细胞结合组件结合于CD3抗原，但效应子T细胞上所表达的其它抗原是已知的，并且可以被白细胞重新定向复合物靶向。示例性T细胞抗原包括但不限于CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69和CD90。对于NK细胞，其它示例性抗原可以选自CD8、CD16、CD56、CD57、ADAM17和CD137；对于单核细胞，CD74、HLA-DRα链、CD14、CD16、CD64和CD89；且对于嗜中性粒细胞，CEACAM6、CEACAM8、CD16b、CD32a、CD89、CD177、CD11a、CD11b和SLC44A2。
图式简单描述
以下图式形成本说明书的一部分且包括在内以进一步说明本发明的某些实施方案。通过参考这些图式中的一个或多个，结合对本文中所提供的特定实施方案的详细描述，可以更透彻地理解所述实施方案。
图1.形成包含抗CD19F(ab)2×抗CD3scFv的DOCK-AND-LOCKTM复合物的示意图。
图2A.由(19)-3s介导的Daudi伯基特淋巴瘤与T细胞之间的免疫突触形成。将新分离的T细胞与Daudi细胞以2.5∶1的E∶T比组合。在室温下用0、1或5μg/mL(19)-3s将细胞处理30分钟，随后通过流式细胞术进行分析。分别使用抗CD20-FITC和抗CD7-APC来鉴别Daudi细胞和T细胞。共同结合表示为CD20+/CD7+事件的％。在用(19)-3s处理之后，45.5％的流动事件是CD20/CD7双阳性，表明形成突触的Daudi细胞和T细胞。
图2B.条件如图2(A)中，但不存在(19)-3s抗体。与图2(A)相比，在无抗体的情况下，仅2％的流动事件是无抗体的CD20/CD7双阳性的。
图2C.加入(19)-3s导致＞90％的Daudi细胞与T细胞缔合。
图3A.将Jurkat(T细胞)和Daudi(B细胞)以1∶1比率组合，用0.1μg/mL(19)-3s处理30分钟，且用抗CD20-FITC染色，随后通过荧光显微术进行分析。
图3B.将Jurkat(T细胞)和Daudi(B细胞)以1∶1比率组合，用0.1μg/mL(19)-3s处理30分钟，且用抗CD20-FITC和抗CD3-PE染色，随后通过荧光显微术进行分析。
图3C.图3A和图3B的合并图像显示绿色染色的Daudi细胞与红色染色的Jurkat细胞之间的突触形成。
图3D.在不存在(19)-3s的情况下，突触形成不明显。
图4.对(19)-3s介导的Daudi细胞和Jurkat细胞的细胞与细胞缔合随(19)-3s浓度增加而变化的剂量反应分析。
图5A.由和DARTTM介导的细胞与细胞缔合的比较。和DARTTM的数据是从Moore等，(2011)，Blood117：4542-4551获得。
图5B.由(19)-3s介导的细胞与细胞缔合的比较。
图6A.由(19)-3s对照bsAb介导的T细胞和Capan-1胰腺癌细胞之间的突触形成。将经CFSE标记的Capan-1细胞与经PKH26标记的Jurkat在所述bsAb存在下共同孵育。
图6B.由(M1)-3sMUC5ACbsAb介导的T细胞和Capan-1胰腺癌细胞之间的突触形成。将经CFSE标记的Capan-1细胞与经PKH26标记的Jurkat在所述bsAb存在下共同孵育。
图6C.由(E1)-3sTROP-2靶向bsAb介导的T细胞和Capan-1胰腺癌细胞之间的突触形成。将经CFSE标记的Capan-1细胞与经PKH26标记的Jurkat在所述bsAb存在下共同孵育。
图7A.由(19)-3s引起的T细胞活化。CD69表达上调是T细胞活化中的早期事件。用所指示的抗体将与PBMC组合的Daudi细胞处理过夜，且用抗CD3-PE和抗CD69-APC染色，随后通过流式细胞术进行分析。在通过正面对比侧面散射和抗CD3染色闸选T细胞之后评估CD69表达。Daudi细胞与相等数目的PBMC组合产生1.6％CD69+T细胞。加入3ng/mL(19)-3s诱导27％CD69+T细胞。包含与非靶向F(ab)2融合的Okt3-scFv-AD2模块的对照构建体[(M1)-3s]或hA19-Fab-DDD2模块都不诱导T细胞活化。
图7B.由(19)-3s引起的T细胞活化。用所指示的抗体将与经纯化的T细胞组合的Daudi细胞处理过夜，且用抗CD3-PE和抗CD69-APC染色，随后通过流式细胞术进行分析。在通过正面对比侧面散射和抗CD3染色闸选T细胞之后评估CD69表达。与未经处理的细胞混合物相比，用(M1)-3s或hA19-Fab-DDD2处理Daudi和经纯化的T细胞不增加CD69+T细胞的数目(＜4％)。替代地，(19)-3s诱导稳定T细胞活化，产生80％CD69+细胞。
图7C.由(19)-3s引起的T细胞活化。用所指示的抗体将单独的经纯化的T细胞处理过夜，且用抗CD3-PE和抗CD69-APC染色，随后通过流式细胞术进行分析。在通过正面对比侧面散射和抗CD3染色闸选T细胞之后评估CD69表达。在不加入Daudi(靶标)细胞的情况下，(19)-3s不诱导CD69表达和T细胞活化。这些结果显示(19)-3s介导的T细胞与靶细胞之间的突触形成都为T细胞活化所需要且足以进行T细胞活化。
图8A.由(19)-3s诱导T细胞增殖。将PBMC与3nM或30pM(19)-3s一起孵育，与IL-2/PHA阳性对照和(14)-3s(非靶标结合对照)相比较。
图8B.由(19)-3s诱导T细胞增殖。在消耗B细胞的PBMC中未观察到T细胞增殖，表明T细胞活化和增殖需要靶细胞(B细胞)。
图9A.(19)-3sT细胞重新定向bsAb的体外细胞毒性。测定(19)-3sDNLTMbsAb复合物对Nalm-6、Raji、Ramos和Namalwa癌细胞的细胞毒性的剂量反应曲线。
图9B.(19)-3sT细胞重新定向bsAb的体外细胞毒性。测定(14)-3s(非靶向)DNLTMbsAb复合物对Nalm-6、Raji、Ramos和Namalwa癌细胞的细胞毒性的剂量反应曲线。
图9C.使用PBMC或获自两个不同的供体的T细胞和Nalm-6癌细胞观察到了一致的结果。
图10A.(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3sT细胞重新定向bsAb的体外细胞毒性。测定由(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3sT细胞重新定向bsAb诱导的对Namalwa细胞的细胞毒性的剂量反应曲线。
图10B.(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3sT细胞重新定向bsAb的体外细胞毒性。测定由(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3sT细胞重新定向bsAb诱导的对Jeko细胞的细胞毒性的剂量反应曲线。
图10C.(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3sT细胞重新定向bsAb的体外细胞毒性。测定由(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3sT细胞重新定向bsAb诱导的对Daudi细胞的细胞毒性的剂量反应曲线。
图11A.T细胞重新定向bsAb在实性肿瘤细胞系中的体外细胞毒性。测定(14)-3sbsAb对LS174T结肠腺癌细胞系的细胞毒性的剂量反应曲线，与非靶向(19)-3sbsAb相比较。
图11B.T细胞重新定向bsAb在实性肿瘤细胞系中的体外细胞毒性。测定(E1)-3sbsAb对Capan-1胰腺癌细胞系的细胞毒性的剂量反应曲线，与非靶向(19)-3sbsAb相比较。
图11C.T细胞重新定向bsAb在实性肿瘤细胞系中的体外细胞毒性。测定(E1)-3s和(15)-3sbsAb对NCI-N87胃癌细胞系的细胞毒性的剂量反应曲线，与非靶向(19)-3sbsAb相比较。
图12.T细胞重新定向bsAb在癌细胞系中的体外细胞毒性数据的汇总。
图13A.使用(19)-3sbsAb体内重新靶向Raji淋巴瘤异种移植物。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1×106个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类PBMC(5×106个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。以未经处理的细胞作为对照。
图13B.使用(19)-3sbsAb体内重新靶向Raji淋巴瘤异种移植物。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1×106个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类PBMC(5×106个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。用130μg单次剂量处理细胞。
图13C.使用(19)-3sbsAb体内重新靶向Raji淋巴瘤异种移植物。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1×106个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类人PBMC(5×106个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。用每剂量43μg将细胞处理3次。
图13D.使用(19)-3sbsAb体内重新靶向Raji淋巴瘤异种移植物。将带有Raji伯基特淋巴瘤(1×106个细胞)异种移植物的NOD/SCID小鼠与人类人PBMC(5×106个细胞)一起复原，且用(19)-3s处理仅1周，如箭头所指示来施用。用每剂量26μg将细胞处理5次。
图14A.使用(19)-3sbsAb重复给药对体内重新靶向Raji淋巴瘤异种移植物的效应。如图13的图例中所指示来制备NOD/SCID小鼠异种移植物。如箭头所指示来施用(19)-3s。图14A显示未经处理的对照。
图14B.使用(19)-3sbsAb重复给药对体内重新靶向Raji淋巴瘤异种移植物的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。用i.v.经静脉内施用的每剂量130μg(19)-3s将细胞处理2次。
图14C.使用(19)-3sbsAb重复给药对体内重新靶向Raji淋巴瘤异种移植物的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。用s.c经皮下施用的每剂量130μg(19)-3s将细胞处理2次。
图14D.使用(19)-3sbsAb重复给药对体内重新靶向Raji淋巴瘤异种移植物的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。用i.v.经静脉内施用的每剂量65μg(19)-3s将细胞处理4次。
图14E.使用(19)-3sbsAb重复给药对体内重新靶向Raji淋巴瘤异种移植物的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。用经静脉内i.v.施用的每剂量43μg(19)-3s将细胞处理6次。
图14F.使用(19)-3sbsAb重复给药对体内重新靶向Raji淋巴瘤异种移植物的效应。如箭头所指示来施用(19)-3s。用经静脉内i.v.施用的每剂量43μg对照(M1)-3s将细胞处理6次。
图15A.T细胞重新靶向bsAb在实性肿瘤异种移植物中的体内效力。用LS174T结肠腺癌制备NOD/SCID小鼠异种移植物。对小鼠施用仅T细胞而无bsAb。
图15B.T细胞重新靶向bsAb在实性肿瘤异种移植物中的体内效力。用LS174T结肠腺癌制备NOD/SCID小鼠异种移植物。如所指示用(E1)-3sbsAb处理小鼠。
图15C.T细胞重新靶向bsAb在实性肿瘤异种移植物中的体内效力。用Capan-1胰腺癌制备NOD/SCID小鼠异种移植物。对小鼠施用仅PBMC而无bsAb。
图15D.T细胞重新靶向bsAb在实性肿瘤异种移植物中的体内效力。用Capan-1胰腺癌制备NOD/SCID小鼠异种移植物。如所指示用(14)-3sbsAb处理小鼠。
图16A.在存在或不存在干扰素α的情况下通过(E1)-3sDNLTM复合物体内抑制肿瘤生长。在有或无加入的干扰素α的情况下用抗TROP-2×抗CD3bsAb处理NOD/SCID小鼠中的Capan-1胰腺癌异种移植物。干扰素α是以TROP-2靶向DNLTM复合物的形式加入。
图16B.在存在或不存在干扰素α的情况下通过(E1)-3sDNLTM复合物体内抑制肿瘤生长。在有或无加入的干扰素α的情况下用抗TROP-2×抗CD3bsAb处理NOD/SCID小鼠中的Capan-1胰腺癌异种移植物。干扰素α是以市售(聚乙二醇化干扰素α-2a)的形式加入。
图17.在有或无干扰素α的情况下经(E1)-3s处理的NOD/SCID小鼠的存活曲线。对照未经处理或仅经干扰素α处理。
图18.在有或无干扰素α的情况下通过(E1)-3sDNLTM复合物体内抑制肿瘤生长，与TF12对照相比较。在有或无加入的干扰素α(以形式加入)的情况下用抗TROP-2×抗CD3bsAb处理NOD/SCID小鼠中的Capan-1胰腺癌异种移植物，与未经处理的对照、TF12对照或单独相比较。
图19.在有或无干扰素α()的情况下经(E1)-3s处理的NOD/SCID小鼠的存活曲线。对照未经处理或经单独或单独TF12处理。
图20.在有或无干扰素α的情况下通过(E1)-3sDNLTM复合物体内抑制肿瘤生长，与TF12对照相比较。在有或无加入的干扰素α(以形式加入)的情况下用抗TROP-2×抗CD3bsAb处理NOD/SCID小鼠中的NCI-N87人胃癌异种移植物，与未经处理的对照、TF12对照或单独相比较。
图21.在有或无干扰素α()的情况下经(E1)-3s处理的具有NCI-N87胃癌异种移植物的NOD/SCID小鼠的存活曲线。对照未经处理或经单独或单独TF12处理。
详细描述
定义
除非另外说明，否则“一个(种)”意指“一个(种)或多个(种)”。
如本文中所使用，术语“和”和“或”可用来指连词或反意连词。也就是说，除非另外说明，否则两个术语都应该理解为相当于“和/或”。
“治疗剂”是可用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、光敏剂、染料和放射性同位素。
如本文中所使用的“抗体”是指全长(即，天然存在的或由正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分，如抗体片段。“抗体”包括单克隆、多克隆、双特异性、多特异性、鼠类、嵌合、人源化和人类抗体人抗体。
“裸抗体”是未与治疗剂或诊断剂连接的抗体或其抗原结合片段。完整裸抗体的Fc部分可以提供效应因子功能，诸如补体固定和ADCC(参见例如Markrides，PharmacolRev50：59-87，1998)。裸抗体诱导细胞死亡的其它机制可能包括细胞凋亡。(Vaswani和Hamilton，AnnAllergyAsthmaImmunol81：105-119，1998。)。
“抗体片段”是完整抗体的一部分，诸如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、scFv、dAb等等。无论结构如何，抗体片段结合与全长抗体所识别的相同抗原。举例来说，抗体片段包括由可变区组成的经分离片段，诸如由重链或轻链可变区组成的“Fv”片段或轻链与重链可变区通过肽连接子连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。“单链抗体”通常缩写为“scFv”，由包含VH和VL结构域的多肽链组成，所述结构域相互作用以形成抗原结合位点。VH和VL结构域通常通过具有1至25个氨基酸残基的肽连接。抗体片段还包括双功能抗体、三功能抗体和单结构域抗体(dAb)。
“嵌合抗体”是含有包括来源于一个物种的抗体，优选地啮齿动物抗体的互补性决定区(CDR)的可变结构域的重组蛋白质，而所述抗体分子的恒定结构域来源于人类抗体人抗体的恒定域恒定结构域。对于兽医应用，所述嵌合抗体的恒定结构域可以来源于诸如猫或狗等其它物种的恒定结构域。
“人源化抗体”是来自一个物种的抗体(例如，啮齿动物抗体)的CDR从所述啮齿动物抗体的重链和轻链可变区被转移到人重链和轻链可变结构域(包括人类框架区(FR)中的重组蛋白质。所述抗体分子的恒定域恒定结构域来源于人抗体的恒定域恒定结构域。为了维持结合活性，来自亲本(例如，鼠类)抗体的有限数目的FR氨基酸残基可以取代为相应的人类FR残基。
“人类抗体人抗体”是例如从经过基因工程改造以响应于抗原激发而产生特定人类抗体人抗体的转基因小鼠获得的抗体。在这种技术中，将人重链和轻链基因座的元件引入来源于含有内源性重链和轻链基因座的靶向断裂的胚胎干细胞系的小鼠品系中。转基因小鼠可以合成对人类抗原具有特异性的人类抗体人抗体，且所述小鼠可用于产生分泌人类抗体人抗体的杂交瘤。Green等，NatureGenet.7：13(1994)、Lonberg等，Nature368：856(1994)和Taylor等，Int.Immun.6：579(1994)描述了从转基因小鼠获得人类抗体人抗体的方法。还可以通过基因或染色体转染方法，以及噬菌体呈现技术来构建人类抗体人抗体，所有方法均为本领域中已知的。(关于由得自未免疫供体的免疫球蛋白可变域可变结构域基因谱系体外产生人类抗体人抗体和其片段，参见例如McCafferty等，1990，Nature348：552-553)。在这种技术中，将抗体可变域可变结构域基因同框克隆到丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并且在噬菌体颗粒表面上呈现为功能抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体的功能性质进行选择还引起对编码展现那些性质的抗体的基因进行选择。这样，噬菌体模拟了B细胞的一些性质。噬菌体呈现可以用多种形式进行，关于综述，参见例如Johnson和Chiswell，CurrentOpinioninStructuralBiology3：5564-571(1993)。人类抗体人抗体还可以通过体外活化B细胞来产生。(参见美国专利号5,567,610和5,229,275)。
如本文中所使用，术语“抗体融合蛋白质”是重组产生的抗原结合分子，其中抗体或抗体片段连接于另一个蛋白质或肽，诸如相同或不同的抗体或抗体片段或者DDD或AD肽。融合蛋白质可以包含单个抗体组分、不同的抗体组分的多价或多特异性组合或同一抗体组分的多拷贝。融合蛋白质可以另外包含抗体或抗体片段和治疗剂。适合于此类融合蛋白质的治疗剂的实例包括免疫调节剂和毒素。一种优选的毒素包含核糖核酸酶(RNA酶)，优选地重组RNA酶。优选的免疫调节剂可以是干扰素，诸如干扰素α、干扰素β或干扰素λ。
“多特异性抗体”是可以同时结合至少两个具有不同结构的靶标，例如两个不同的抗原、同一抗原上的两个不同的表位或半抗原和/或抗原或表位的抗体。“多价抗体”是可以同时结合至少两个具有相同或不同结构的靶标的目标抗体。原子价指示抗体具有多少个针对单个抗原或表位的结合臂或位点；即，单价、二价、三价或多价。抗体的多价意指它在结合抗原时可以利用多种相互作用，从而增加与抗原结合的亲合力。特异性指示抗体能够结合多少个抗原或表位；即，单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些定义，自然抗体(例如IgG)是二价的，因为它具有两个结合臂，但是单特异性的，因为它结合于一个表位。多特异性多价抗体是具有多于一个具有不同的特异性的结合位点的构建体。
“双特异性抗体”是可以同时结合于两个具有不同结构的靶标的抗体。双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)可以具有至少一个特异性结合于例如T细胞、NK细胞、单核细胞或嗜中性粒细胞的臂和至少一个特异性结合由患病细胞、组织、器官或病原体产生或与其相关的抗原(例如肿瘤相关抗原)的其它臂。可以使用分子工程来产生多种双特异性抗体。
如果施用量具有生理学显著性，则称本文中所描述的抗体制剂或组合物是以“治疗有效量”施用。如果药剂的存在在受体受试者的生理学方面产生可检测的变化，则它具有生理学显著性。在特定实施方案中，若抗体制剂的存在引起抗癌反应或缓解传染病状态的体征和症状，则其具有生理学显著性。生理学上显著的效应还可以是在受体受试者中引起体液和/或细胞免疫应答，从而引起靶细胞的生长抑制或死亡。
白细胞重新定向双特异性抗体复合物
各种实施方案涉及包含与针对疾病相关抗原的抗体或其片段连接的抗白细胞抗体或其片段的bsAb。示例性T细胞抗原包括CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69和CD90。对于NK细胞，其它示例性抗原可以选自CD8、CD16、CD56、CD57、ADAM17和CD137；对于单核细胞，CD74、HLA-DRα链、CD14、CD16、CD64和CD89；而对于嗜中性粒细胞，CEACAM6、CEACAM8、CD16b、CD32a、CD89、CD177、CD11a、CD11b和SLC44A2。在优选的实施方案中，抗T细胞抗体结合于CD3，或抗NK抗体结合于CD16。如以下所论述，疾病相关抗原，诸如肿瘤相关抗原(TAA)或病原体表达的抗原的许多实例是已知的。示例性优选TAA是CD19。
各种双特异性抗CD3×抗CD19抗体在本领域中是已知的和目前正在临床开发中的，诸如(双特异性T细胞衔接子)(例如，Nagorsen等，2009，Leukemia&Lymphoma50：886-91；Amann等，2009，JImmunother32：453-64；Baeuerle和Reinhardt，2009，CancerRes69：4941-44)和(参见例如Moore等，2011，Blood117：4542-51；Veri等，2010，ArthritisRheum62：1933-43)。布利莫单抗是抗体，其所包含的抗CD3和抗CD19抗体片段的VH和VL结构域与5-氨基酸连接子连接且表达为与自身粘接以形成抗原结合位点的单多肽链。人们认为布利莫单抗通过使T细胞特异性CD3和B细胞特异性CD19抗原紧密相邻，以引发针对毗邻B细胞的T细胞细胞毒性反应而起作用，这不需要T细胞对癌细胞的特异性(例如Portell等，2013，ClinPharmacol5(Suppl1)：5-11)。由于其短半衰期，布利莫单抗需要连续静脉内输注来生效(Portell等，2013)。对伴随持续或复发性轻微残余疾病的B细胞ALL患者的II期试验报告了大约80％的完全缓解率(Portell等，2013)。
据报告布利莫单抗低达0.005mg/m2/天的剂量能有效消除非何杰金氏淋巴瘤患者的癌细胞(Bargou等，2008，Science321：974-77)。观察到部分和完全缓解起始于0.015mg的剂量水平且所有六名测试患者在0.06mg的剂量下均经历肿瘤消退(Bargou等，2008)。在体外，布利莫单抗在10pg/mL的浓度下诱导MEC-1细胞50％细胞溶解(Topp等，2012，Blood120：5185-87；Bassan等，2012，Blood120：5094-95)。
布利莫单抗的抗CD19部分来源于HD37杂交瘤(参见例如美国专利号7,575,923，其实施例部分是以引用的方式并入本文中)，所述杂交瘤是公开可获得的(例如，SantaCruzBiotechnology目录号sc-18894)。布利莫单抗的抗CD3部分来源于TR66杂交瘤(美国专利号7,575,923；Traunecker等，1991，EMBOJ.10：3655-59)，也是公开可获得的(例如，EnzoLifeSciences，目录号ALX-804-822-C100)。
可用于要求保护的方法和组合物中的多种针对CD3的抗体是公开已知的和/或市售的，诸如得自LSBio(目录号LS-B6698、LS-B8669；LS-B8765、LS-C96311、LS-C58677等)；(目录号ab5690、ab16669、ab699、ab828、ab8671等)；SantaCruzBiotechnology(目录号sc-20047、sc-20080、sc-19590、sc-59008、sc-101442等)；和许多其它供应商。
在一个优选的实施方案中，用作DNLTM复合物的一部分的抗CD3部分的氨基酸序列如以下SEQIDNO：96至SEQIDNO：101中所公开。然而，一般技术人员应认识到，任何已知的抗CD3抗体均可用于要求保护的方法和组合物中。优选地，可用的抗体部分是人源化的或人类的。
可用于要求保护的方法和组合物中的多种针对CD19的抗体是公开已知的和/或市售的，诸如得自SantaCruzBiotechnology(目录号sc-390244、sc-373897、sc-18894、sc-18896等)；(目录号ab25232、ab134114、ab140981、ab1255等)；ABBIOTECTM(目录号252262、252248、250585、251063等)和许多其它供应商。
在一个优选的实施方案中，抗CD19抗体部分是人源化A19抗体，其包含轻链CDR序列CDR1KASQSVDYDGDSYLN(SEQIDNO：90)、CDR2DASNLVS(SEQIDNO：91)和CDR3QQSTEDPWT(SEQIDNO：92)和重链CDR序列CDR1SYWMN(SEQIDNO：93)、CDR2QIWPGDGDTNYNGKFKG(SEQIDNO：94)和CDR3RETTTVGRYYYAMDY(SEQIDNO：95)。
其它抗CD3×抗CD19双特异性抗体是已知的，诸如其还并入了HD37的抗CD19Fv序列和TR66的抗CD3Fv序列(Moore等，2011，Blood117：4542-51；Veri等.，2010，ArthritisRheum62：1933-43)。Moore等(2011)报告了双特异性抗体在诱导B细胞溶解时比带有同一的抗CD19和抗CD3可变区序列的单链双特异性抗体()更有效，EC50值在pg/mL范围内(Moore等，2011)。已经报告了除和以外的其它抗CD3×抗CD19双特异性抗体(参见例如Wei等，2012，CellOncol35：423-34；Portner等，2012，CancerImmunolImmunother61：1869-75；Zhou等，2012，BiotechnolLett.34：1183-91)。在某些实施方案中，任何已知的抗CD3×抗CD19双特异性抗体均可用来诱导针对疾病相关细胞或病原体的免疫应答。
卡妥索单抗是抗CD3×抗EpCAM双特异性抗体，在欧洲已经批准其用于治疗与转移的癌症相关的恶性腹水(Chames和Baty，2009，MAbs1：539-47)。在小鼠模型系统中，卡妥索单抗在10pM的浓度范围下能够杀死肿瘤细胞，且据报告产生了黑素瘤肿瘤的总体根除(Chames和Baty，2009)。伴随恶性腹水的卵巢癌患者的人类临床试验也显示了统计上显著的效力(Chames和Baty，2009)。然而，大鼠/小鼠杂合bsAb的高免疫原性可能限制经静脉内i.v.施用抗体(Chames和Baty，2009)。抗肿瘤bsAb的使用不局限于抗CD3×抗CD19，而是还包括抗HER2×抗CD64(MDX-210、MDX-H210)、抗EGFR×抗CD64(MDX-447)、抗CD30×抗CD16(HRS-3/A9)、抗HER2×抗CD3(Her2Bi)、抗CD20×抗CD3(CD20Bi、Bi20)、抗EpCAM×抗CD3(卡妥索单抗、MT110)、抗HER2×抗CD3(厄妥索单抗)和抗NG2×抗CD28(rM28)(Chames和Baty,2009)。
在一个最优选的实施方案中，抗CD3×抗CD19双特异性抗体或其它白细胞重新定向bsAb被制成如以下实施例1中所公开的DNLTM构建体。熟练技术人员应认识到标的目标白细胞重新定向双特异性抗体不局限于抗CD3×抗CD19构建体，而是可能包含与抗CD3抗体部分连接的针对任何已知疾病相关抗原的抗体。替代地，还可以使用针对除CD3以外的其它T细胞抗原或NK细胞、单核细胞或嗜中性粒细胞上所表达的其它抗原的抗体。示例性T细胞抗原包括但不限于CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD69和CD90。对于NK细胞，其它示例性抗原可以选自CD8、CD16、CD56、CD57、ADAM17、KIR和CD137；对于单核细胞，CD74、HLA-DRα链、CD14、CD16、CD64和CD89；且对于嗜中性粒细胞，CEACAM6、CEACAM8、CD16b、CD32a、CD89、CD177、CD11a、CD11b和SLC44A2。针对各白细胞抗原的抗体是公开已知的和/或公开可获得的(参见例如目录号ab131276、ab139266、ab8360、ab51312、ab846、ab133616、ab75877、ab133255、ab109217、ab93278、ab17147、ab115851、ab128955、ab13463、ab85986；SantaCruzBiotechnology目录号sc-46683、sc-59047；EnzoLifeSciences，Inc.目录号ALX-805-037-C100；SinoBiologicalInc.目录号12211-RP02、11150-R074；Millipore目录号04-1102、04-1102、MAB1406)。这些和许多其它抗白细胞抗体是公开可获得的，并且可以用于标的目标白细胞重新定向bsAb。如以下所论述，许多针对多种疾病相关抗原的抗体是公开是已知的和/或市售的，并且可用于标的目标白细胞重新定向双特异性抗体。可能使用的其它示例性白细胞重新定向bsAb包括FBTA05(抗CD20×抗CD3)和TRBS07(抗GD2×抗CD3)。
干扰素疗法
在各种实施方案中，白细胞重新定向bsAb、抗体-药物缀合物和/或检查点抑制子抗体可以与一种或多种诸如干扰素α、干扰素β或干扰素λ等干扰素组合使用。人类干扰素人干扰素在本领域中是熟知的且人类干扰素人干扰素的氨基酸序列可以从公开数据库容易地获得(例如GenBank登录号AAA52716.1、AAA52724、AAC41702.1、EAW56871.1、EAW56870.1、EAW56869.1)。人类干扰素人干扰素还可以购自多种供应商(例如CellSignalingTechnology,Inc.，Danvers，MA；Genentech，SouthSanFrancisco，CA、；EMDMillipore，Billerica，MA)。
已经报告了干扰素α(IFNα)在癌症的动物模型(Ferrantini等，1994，JImmunol153：4604-15)和人类癌症患者(Gutterman等，1980，AnnInternMed93：399-406)中具有抗肿瘤活性。IFNα可以发挥多种直接抗肿瘤效应，包括下调致癌基因、上调肿瘤抑制因子、经由增加肿瘤表面MHCI类蛋白的表达来增强免疫识别、促进细胞凋亡和对化疗剂敏感(Gutterman等，1994，PNASUSA91：1198-205；Matarrese等，2002，AmJPathol160：1507-20；Mecchia等，2000，GeneTher7：167-79；Sabaawy等，1999，IntJOncol14：1143-51；Takaoka等，2003，Nature424：516-23)。对于一些肿瘤，IFNα可以通过活化STAT1而具有直接和有效的抗增殖效应(Grimley等，1998Blood91：3017-27)。干扰素α2b在体外和体内与诸如hL243抗HLA-DR抗体等抗肿瘤抗体缀合且消耗淋巴瘤和骨髓瘤细胞(Rossi等，2011，Blood118：1877-84)。
间接地，IFNα可以抑制血管生成(Sidky和Borden，1987，CancerRes47：5155-61)和刺激宿主免疫细胞，这对总体抗癌反应是必需的但在很大程度上被低估了(Belardelli等，1996，ImmunolToday17：369-72)。IFNα通过对骨髓细胞(Raefsky等，1985，JImmunol135：2507-12；Luft等，1998，JImmunol161：1947-53)、T细胞(Carrero等，2006，JExpMed203：933-40；Pilling等，1999，EurJImmunol29：1041-50)和B细胞(Le等，2001，Immunity14：461-70)的作用而对免疫应答具有多效性影响。作为先天免疫系统的重要调节剂，IFNα诱导树状细胞的快速分化和活化(Belardelli等，2004，CancerRes64：6827-30；Paquette等，1998，JLeukocBiol64：358-67；Santini等，2000，JExpMed191：1777-88)且增强NK细胞的细胞毒性、迁移、细胞因子产生和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(Biron等，1999，AnnRevImmunol17：189-220；Brunda等，1984，CancerRes44：597-601)。
已经报告了干扰素β对于治疗多种实性肿瘤是有效的。每周两次经6百万单位的IFN-β治疗36个月的患者显示在患有HCV相关肝癌的患者中完全切除或摘除原发肿瘤后肝细胞癌复发减少(Ikeda等，2000，Hepatology32：228-32)。利用干扰素β的基因疗法诱导神经胶质瘤、黑素瘤和肾细胞癌的细胞凋亡(Yoshida等，2004，CancerSci95：858-65)。已经观察到内源性IFN-β通过抑制体内血管生成而抑制肿瘤生长(Jablonska等，2010，JClinInvest.120：1151-64)。
被命名为III型干扰素的IFN-λ是一组新描述的细胞因子，其由位于染色体19上的三个不同的基因所编码的IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3(分别也称为白介素-29、28A和28B)组成(Kotenko等，2003，NatImmunol4：69-77；Sheppard等，2003，NatImmunol4：63-8)。在蛋白层面上，IFN-λ2和IFN-λ3高度同源，具有96％氨基酸同一性，而IFN-λ1与IFN-λ2和IFN-λ3具有大约81％同源性(Sheppard等，2003，NatImmunol4：63-8)。IFN-λ经由JAK/STAT途径活化信号转导，类似于I型IFN所诱导的途径，包括JAK1和TYK2激酶活化、STAT蛋白磷酸化和IFN刺激的基因因子3(ISGF3)的转录复合物活化(Witte等，2010，CytokineGrowthFactorRev21：237-51；Zhou等，2007，JVirol81：7749-58)。
III型与I型IFN系统之间的主要差异是其相应受体复合物的分布。IFN-α/β通过两种广泛表达的I型干扰素受体进行信号转导，且与IFN-α/β施用相关的所产生的系统毒性已经限制了其用作治疗剂(Pestka等，2007，JBiolChem282：20047-51)。相反，IFN-λ通过由独特的IFN-λ受体1(IFN-λR1)和IL-10受体2(IL-10R2)组成的异源二聚受体复合物进行信号传导。如先前所报告(Witte等，2009，GenesImmun10：702-14)，IFN-λR1具有非常局限的表达模式，在上皮细胞、黑素细胞和肝细胞中的水平最高，且在原代中枢神经系统(CNS)细胞中的水平最低。血液免疫系统细胞表达高水平的能抑制IFN-λ作用的短IFN-λ受体剪接变异体(sIFN-λR1)。神经元细胞和免疫细胞的有限反应性暗示在IFN-λ的情况下可能不存在或显著减少往往与IFN-α疗法相关的严重毒性(Witte等，2009，GenesImmun10：702-14；Witte等，2010，CytokineGrowthFactorRev21：237-51)。近期出版物报告了尽管IFN-α和IFN-λ在肝细胞中诱导一组常见ISG(干扰素刺激的基因)的表达，不同于IFN-α，但施用IFN-λ在经纯化的淋巴细胞或单核细胞中不诱导STAT活化或ISG表达(Dickensheets等，2013，JLeukocBiol.93，12/20/12在线出版)。据建议，对于治疗慢性HCV感染，IFN-λ可能优于IFN-α，因为其诱导通常与IFN-α疗法相关的白血球白细胞减少症的可能性较低(Dickensheets等，2013)。
IFN-λ显示类似于IL-10相关细胞因子的结构特征，但在功能上具有I型IFN样抗病毒和抗增殖活性(Witte等，2009，GenesImmun10：702-14；Ank等，2006，JVirol80：4501-9；Robek等，2005，JVirol79：3851-4)。IFN-λ1和IFN-λ2已经显示减少各种病毒的病毒复制或细胞病变效应，包括DNA病毒(乙型肝炎病毒(Robek等，2005，JVirol79：3851-4；Doyle等，2006，Hepatology44：896-906)和单纯疱疹病毒2(Ank等，2008，JImmunol180：2474-85))、ss(+)RNA病毒(EMCV；Sheppard等，2003，NatImmunol4：63-8)和丙型肝炎病毒(Robek等，2005，JVirol79：3851-4；Doyle等，2006，Hepatology44：896-906；Marcello等，2006，Gastroenterol131：1887-98；Pagliaccetti等，2008，JBiolChem283：30079-89)、ss(-)RNA病毒(水泡性口膜炎病毒；Pagliaccetti等，2008，JBiolChem283：30079-89)和流感A病毒(Jewell等，2010，JVirol84：11515-22)和双链RNA病毒，诸如轮状病毒(Pott等，2011，PNASUSA108：7944049)。已经由基因研究鉴别了IFN-λ3在HCV感染中作为关键细胞因子(Ge等，2009，Nature461：399-401)，并且还显示针对EMCV的有效活性(Dellgren等，2009，GenesImmun10：125-31)。据报告，鼻病毒诱导的IFN-λ产生缺陷与鼻病毒诱导的哮喘恶化的严重程度高度相关(Contoli等，2006，NatureMed12：1023-26)，且已经建议IFN-λ疗法作为治疗变应性哮喘的新方法(Edwards和Johnston，2011，EMBOMolMed3：306-8；Koltsida等，2011，EMBOMolMed3：348-61)。
已经在若干种人类癌细胞系中确定了IFN-λ的抗增殖活性，包括神经内分泌癌瘤BON1(Zitzmann等，2006，BiochemBiophysResCommun344：1334-41)、成胶质细胞瘤LN319(Meager等，2005，Cytokine31：109-18)、永生化角质细胞HaCaT(Maher等，2008，CancerBiolTher7：1109-15)、黑素瘤F01(Guenterberg等，2010，MolCancerTher9：510-20)和食道癌TE-11(Li等，2010，EurJCancer46：180-90)。在动物模型中，IFN-λ通过先天性和适应性免疫应答来诱导肿瘤细胞凋亡和破坏，表明IFN-λ的局部递送在治疗人类恶性肿瘤时可以是有用的附加策略(Numasaki等，2007，JImmunol178：5086-98)。Fab连接的干扰素-λ显示在靶细胞中具有有效的抗肿瘤和抗病毒活性(Liu等，2013，PLoSOne8：e63940)。
在临床处置中，PEG化IFN-λ1(PEG-IFN-λ1)已经临时用于慢性丙型肝炎病毒感染的患者。在Ib期研究(n＝56)中，在所有剂量水平(0.5-3.0μg/kg)下观察到抗病毒活性，且当PEG-IFN-λ1施用于IFN-α疗法后复发的基因型1HCV患者时病毒负载减少2.3至4.0个对数(Muir等，2010，Hepatology52：822-32)。IIb期研究(n＝526)显示HCV基因型1和4患者对PEG-IFN-λ1治疗的反应率显著高于PEG-IFN-α。同时，通常与I型干扰素治疗相关的不利事件率在PEG-IFN-λ1的情况下低于PEG-IFN-α。不常观察到中性白细胞减少症和血小板减少症，且流感样症状、贫血和肌肉骨骼症状的比率降至在PEG-IFN-α治疗时所见的约1/3。然而，PEG-IFN-λ1与PEG-IFN-α之间的严重不利事件、抑郁和其它常见不利事件率(≥10％)类似。与PEG-IFN-α相比，在最高剂量PEG-IFN-λ1下观察到较高肝毒性率(“InvestigationalCompoundPEG-InterferonLambdaAchievedHigherResponseRateswithFewerFlu-likeandMusculoskeletalSymptomsandCytopeniasThanPEG-InterferonAlfainPhaseIIbStudyof526Treatment-NaiveHepatitisCPatients”，2011年4月2日，由Bristol-MyersSquibb新闻发布)。
在各种实施方案中，标的目标白细胞重新定向双特异性抗体、ADC和/或检查点抑制剂mAb可以与一种或多种诸如干扰素α、干扰素β、干扰素λ1、干扰素λ2或干扰素λ3等干扰素组合使用。当与其它药剂一起使用时，干扰素可以在另一种药剂之前、同时或之后施用。当同时施用时，干扰素可以与另一种药剂缀合或分开。
检查点抑制子抗体
以检查点抑制子抗体用于癌症疗法的研究已经在先前认为对癌症治疗具有抗性的癌症中产生了前所未有的反应率(参见例如Ott和Bhardwaj，2013，FrontiersinImmunology4：346；Menzies和Long，2013，TherAdvMedOncol5：278-85；Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-64；Mavilio和Lugli，)。利用针对诸如CTLA4、PD1和PD-L1等免疫系统检查点的拮抗性检查点阻断抗体的疗法是用于癌症和其它疾病的免疫疗法的最有前景的新手段之一。与大多数抗癌剂相反，检查点抑制剂不直接靶向肿瘤细胞，而是靶向淋巴细胞受体或其配位体配体，以提高免疫系统的内源性抗癌活性。(Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-264)因为此类抗体主要通过调节对患病细胞、组织或病原体的免疫应答起作用，所以它们可以与其它治疗形态组合使用，诸如标的目标白细胞重新定向双特异性抗体、ADC和/或干扰素，以提高此类药剂的抗肿瘤效果。因为检查点活化还可能与慢性感染相关(Nirschl和Drake，2013，ClinCancerRes19：4917-24)，所以此类组合疗法还可以用于治疗传染病。
现在已经清楚，肿瘤可以通过强占某些免疫检查点途径而逃避免疫监测，特别是在肿瘤抗原特异性T细胞中(Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-264)。因为许多此类免疫检查点由配位体配体-受体相互作用引发，所以相互作用它们可以通过针对所述配位体配体和/或其受体的抗体容易地容易地阻断(Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-264)。虽然针对CTLA4、PD1和PD-L1的检查点抑制子抗体是临床上最先进的，但其它潜在检查点抗原是已知的，并且可以用作诸如LAG3、B7-H3、B7-H4和TIM3等治疗抗体的靶标(Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-264)。
程序性细胞死亡蛋白1(PD1，也称为CD279)编码B细胞和NK细胞中所表达的免疫球蛋白超家族的细胞表面膜蛋白(Shinohara等，1995，Genomics23：704-6；Blank等，2007，CancerImmunolImmunother56：739-45；Finger等，1997，Gene197：177-87；Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-264)。PD1之主要作用在于限制T细胞在响应于感染而发炎期间在周围组织中之活性以及限制自体免疫性(Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-264)。在活化的T细胞中诱导PD1表达，且PD1与其内源性配位体配体之一结合藉由抑制刺激性激酶而起抑制T细胞活化的作用(Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-264)。PD1还起抑制TCR“停止信号”的作用(Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-264)。PD1高度表达于Treg细胞上，且可在配位体配体存在下增加其增殖(Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-264)。
抗PD1抗体已用于治疗黑素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌、结肠直肠癌、头颈癌、三阴性乳腺癌、白血病、淋巴瘤及肾细胞癌(Topalian等，2012，NEnglJMed366：2443-54；Lipson等，2013，ClinCancerRes19：462-8；Berger等，2008，ClinCancerRes14：3044-51；Gildener-Leapman等，2013，OralOncol49：1089-96；Menzies及Long，2013，TherAdvMedOncol5：278-85)。因为PD1/PD-L1及CTLA4通过不同的途径起作用，所以利用针对各抗原的检查点抑制子抗体的组合疗法可以提供增强的免疫应答是有可能的。
示例性抗PD1抗体包括兰利珠单抗(MK-3475，MERCK)、尼鲁单抗(BMS-936558，BRISTOL-MYERSSQUIBB)、AMP-224(MERCK)及皮地珠单抗(CT-011，CURETECHLTD.)。抗PD1抗体可购自市面，例如购自(AB137132)、(EH12.2H7、RMP1-14)及AFFYMETRIXEBIOSCIENCE(J105、J116、MIH4)。
程序性细胞死亡1配位体配体1(PD-L1，也称为CD274及B7-H1)是在活化的T细胞、B细胞、骨髓细胞和巨噬细胞上发现的PD1的配位体配体。虽然PD1存在两种内源性配位体配体，即PD-L1和PD-L2，但抗肿瘤疗法已经集中于抗PD-L1抗体。PD1和PD-L1的复合物抑制CD8+T细胞增殖且减少免疫应答(Topalian等，2012，NEnglJMed366：2443-54；Brahmer等，2012，NEngJMed366：2455-65)。抗PD-L1抗体已用于治疗非小细胞肺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌和血液恶性肿瘤(Brahmer等，NEngJMed366：2455-65；Ott等，2013，ClinCancerRes19：5300-9；Radvanyi等，2013，ClinCancerRes19：5541；Menzies及Long，2013，TherAdvMedOncol5：278-85；Berger等，2008，ClinCancerRes14：13044-51)。
示例性抗PD-L1抗体包括MDX-1105(MEDAREX)、MEDI4736(MEDIMMUNE)、MPDL3280A(GENENTECH)和BMS-936559(BRISTOL-MYERSSQUIBB)。抗PD-L1抗体也可购自市面，例如购自AFFYMETRIXEBIOSCIENCE(MIH1)。
细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA4，也称为CD152)也是专门表现在T细胞上的免疫球蛋白超家族的成员。CTLA4起抑制T细胞活化的作用且据报告能抑制辅助T细胞活性和提高调节T细胞免疫抑制活性(Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-264)。虽然CTL4-A的确切作用机制仍在研究中，但已经提出其藉由在竞争结合CD80和CD86方面胜出CD28以及积极向T细胞递送抑制信号而抑制T细胞活化(Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-264)。抗CTL4A抗体已用于临床试验中用于治疗黑素瘤、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(Robert和Ghiringhelli，2009，Oncologist14：848-61；Ott等，2013，ClinCancerRes19：5300；Weber，2007，Oncologist12：864-72；Wada等，2013，JTranslMed11：89)。抗CTL4A的显著特征是抗肿瘤效应的动力学性质，其中生理反应所需的初步治疗后停滞期多达6个月(Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-264)。在一些情况下，治疗开始之后肿瘤尺寸实际上可能增加，随后可见减小(Pardoll，2012，NatureReviewsCancer12：252-264)。
示例性抗CTLA4抗体包括伊匹单抗(Bristol-MyersSquibb)和曲美目单抗(PFIZER)。抗PD1抗体可购自市面，例如购自(AB134090)、SINOBIOLOGICALINC.(11159-H03H、11159-H08H)和THERMOSCIENTIFICPIERCE(PA5-29572、PA5-23967、PA5-26465、MA1-12205、MA1-35914)。伊匹单抗最近已经接到FDA批准用于治疗转移性黑素瘤(Wada等，2013，JTranslMed11：89)。
本领域技术人员应认识到，确定检查点抑制子抗体单独或与一种或多种其它药剂组合施用于需要其的患者的最佳剂量的方法可以通过本领域中熟知的标准剂量-反应和毒性研究来确定。在一个示例性实施例中，检查点抑制子抗体可能优选地以约0.3-10mg/kg或最大耐受剂量施用，约每三周或约每六周施用一次。替代地，检查点抑制子抗体可以通过升高的剂量方案施用，包括施用约3mg/kg的第一剂量、约5mg/kg的第二剂量和约9mg/kg的第三剂量。替代地，逐步升高的剂量方案包括施用检查点抑制子抗体约5mg/kg的第一剂量和约9mg/kg的第二剂量。另一个逐步升高的剂量方案施用可以包括施用检查点抑制子抗体约3mg/kg的第一剂量、约3mg/kg的第二剂量、约5mg/kg的第三剂量、约5mg/kg的第四剂量和约9mg/kg的第五剂量。在另一个方面，逐步升高的剂量方案可以包括施用5mg/kg的第一剂量、5mg/kg的第二剂量和9mg/kg的第三剂量。检查点抑制剂mAb的示例性报告剂量包括3mg/kg伊匹单抗，每三周施用一次，持续四个剂量；10mg/kg伊匹单抗，每三周一次持续八个循环；10mg/kg，每三周一次持续四个循环，随后每12周一次总计三年；10mg/kgMK-3475，每两周或每三周一次；2mg/kgMK-3475，每三周一次；15mg/kg曲美目单抗，每三个月一次；0.1、0.3、1、3或10mg/kg尼鲁单抗，每两周一次持续多达96周；0.3、1、3或10mg/kgBMS-936559，每两周一次持续多达96周(Kyi和Postow，2013年10月23日，FEBSLett[印刷前电子版]；Callahan和Wolchok，2013，JLeukocBiol94：41-53)。
刺激针对肿瘤及/或病原体的免疫应答的这些和其它已知药剂可以与单独或进一步与诸如干扰素α的干扰素和/或用于改良癌症疗法的抗体-药物缀合物组合的白细胞重新定向双特异性抗体组合使用。可以组合使用的其它已知共刺激途径调节剂包括但不限于阿托莫德、贝拉西普、布利莫单抗、CD40配体、抗B7-1抗体、抗B7-2抗体、抗B7-H4抗体、AG4263、依立托仑、抗OX40抗体、ISF-154和SGN-70；B7-1、B7-2、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD48、LFA-3、CD30配位体配体、CD40配位体配体、耐热抗原、B7h、OX40配体、LIGHT、CD70和CD24。
在某些实施例中，抗KIR抗体也可以与白细胞重新定向bsAb、干扰素、ADC和/或检查点抑制子抗体组合使用。当被抗体活化时NK细胞通过自发性细胞毒性和通过ADCC介导抗肿瘤和抗感染剂活性(Kohrt等，2013，Blood，[印刷前电子版12/10/13])。细胞毒性反应程度由NK细胞接到的抑制信号与活化信号的平衡来决定(Kohrt等人，2013)。杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)介导能降低NK细胞反应的抑制信号。抗KIR抗体，诸如利利单抗(InnatePharma)和IPH2101(InnatePharma)，已在多发性骨髓瘤中显示抗肿瘤活性(Benson等，2012，Blood120：4324-33)。在体外，抗KIR抗体防止NK细胞与靶细胞的致耐受性相互作用，且增加NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性反应(Kohrt等，2013)。在体内，在与利妥昔单抗(抗CD20)组合时，抗KIR抗体在0.5mg/kg的剂量下诱导的针对淋巴瘤的NK细胞介导的利妥昔单抗依赖性细胞毒性有所增强(Kohrt等，2013)。抗KIRmAb可以与ADC、白细胞重新定向bsAb、干扰素和/或检查点抑制子抗体组合以增强对肿瘤细胞或致病生物体的细胞毒性。
一般抗体技术
用于制备实际上针对任何靶抗原的单克隆抗体的技术在本领域中是熟知的。参见例如Kohler和Milstein，Nature256：495(1975)，和Coligan等(编)，CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY，第1卷，第2.5.1-2.6.7页(JohnWiley&Sons1991)。简而言之，单克隆抗体可以通过以下方式获得：向小鼠注射包含抗原的组合物，取出脾脏以获得B淋巴细胞，使该B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆所述杂交瘤，选择能产生针对所述抗原的抗体的阳性克隆，培养能产生针对所述抗原的抗体的克隆，和从杂交瘤培养物中分离抗体。
可以通过多种大家公认的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化MAb。此类分离技术包括利用蛋白A琼脂糖凝胶的亲和色谱法、尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法。参见例如Coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。还参见Baines等，“PurificationofImmunoglobulinG(IgG)”，METHODSINMOLECULARBIOLOGY，第10卷，第79-104页(TheHumanaPress，Inc.1992)。
在初步产生针对免疫原的抗体之后，可以对抗体进行测序且随后藉由重组技术制备。鼠类抗体和抗体片段的人源化和嵌合对于本领域技术人员是熟知的。使用来源于人源化、嵌合或人类抗体人抗体的抗体组分能回避与鼠类恒定区的免疫原性相关的潜在问题。
嵌合抗体
嵌合抗体为其中人类抗体人抗体的可变区已经被例如小鼠抗体的可变区，包括小鼠抗体的互补性决定区(CDR)置换的重组蛋白质。当施用于受试者时，嵌合抗体展现出降低的免疫原性和增加的稳定性。用于克隆鼠类免疫球蛋白可变域可变结构域的一般技术公开于例如Orlandi等，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA86：3833(1989)中。用于构建嵌合抗体的技术对于本领域技术人员是熟知的。举例来说，Leung等，Hybridoma13：469(1994)通过组合编码抗CD22单克隆抗体鼠类LL2的Vκ和VH结构域的DNA序列与相应的人类κ和IgG1恒定区结构域来产生LL2嵌合体。
人源化抗体
用于产生人源化MAb的技术在本领域中是熟知的(参见例如Jones等，Nature321：522(1986)；Riechmann等，Nature332：323(1988)；Verhoeyen等，Science239：1534(1988)；Carter等，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA89：4285(1992)；Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)；和Singer等，J.Immun.150：2844(1993))。嵌合或鼠类单克隆抗体可以通过将来自于小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的小鼠CDR转移至人类抗体人抗体的对应可变域可变结构域而得以人源化。嵌合单克隆抗体中的小鼠架构区(FR)也置换为人类FR序列。因为简单地将小鼠CDR转移至人类FR中往往导致抗体亲和力降低或甚至丧失，所以可能需要额外修饰以恢复鼠类抗体的原始亲和力。这可以通过将FR区中的一个或多个人类残基置换成其鼠类对应物以获得对其表位具有良好结合亲和力的抗体来实现。参见例如Tempest等人，Biotechnology9：266(1991)和Verhoeyen等人，Science239：1534(1988)。一般来说，与其鼠类对应物不同且位于接近或接触一个或多个CDR胺基酸氨基酸残基处的那些人类FR胺基酸氨基酸残基将为取代候选者。
人类抗体人抗体
使用组合法或经人类免疫球蛋白基因座转化过的转基因动物来产生完全人类抗体人抗体的方法在本领域中是已知的(例如，Mancini等，2004，NewMicrobiol.27：315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.HighThroughputScreen.8：117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin.Phamacol.3：544-50)。还可以通过基因或染色体转染方法，以及噬菌体呈现技术来构筑完全人抗体，所有方法均为本领域中已知的。参见例如McCafferty等，Nature348：552-553(1990)。预计此类完全人类抗体人抗体与嵌合或人源化抗体相比展现甚至更少的副作用且在体内充当本质上内源性人类抗体人抗体。在某些实施方案中，要求保护的方法和程序可以利用由此类技术产生的人类抗体人抗体。
在一个替代方案中，可以使用噬菌体呈现技术来产生人类抗体人抗体(例如Dantas-Barbosa等，2005，Genet.Mol.Res.4：126-40)。人类抗体人抗体可以由正常人或展现特定疾病状态(诸如癌症)的人产生(Dantas-Barbosa等，2005)。由患病个体构建人类抗体人抗体的优势在于循环抗体谱系可能偏向于针对疾病相关抗原的抗体。
在这种方法的一个非限制性实施例中，Dantas-Barbosa等(2005)构建了来自于骨肉瘤患者的人类Fab抗体片段的噬菌体呈现库。一般来说，从循环血液淋巴细胞获得总RNA(Id.)。从μ、γ和κ链抗体谱系克隆重组Fab且插入噬菌体呈现库中(Id.)。将RNA转化成cDNA且用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特定引物制造FabcDNA库(Marks等，1991，J.Mol.Biol.222：581-97)。根据Andris-Widhopf等(2000，PHAGEDISPLAYLABORATORYMANUAL，Barbas等(编)，第1版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY第9.1至9.22页)进行库构建。用限制内切酶消化最终的Fab片段且插入细菌噬菌体基因组中以制造噬菌体呈现库。可以通过如本领域中已知的标准噬菌体呈现方法来筛选这样的库(参见例如Pasqualini和Ruoslahti，1996，Nature380：364-366；Pasqualini，1999，TheQuart.J.Nucl.Med.43：159-162)。
噬菌体呈现可以用多种形式进行，关于其综述，参见例如Johnson和Chiswell，CurrentOpinioninStructuralBiology3：5564-571(1993)。还可以通过体外活化的B细胞来产生人类抗体人抗体。参见美国专利第5,567,610号和第5,229,275号，所述专利以全文引用的方式并入本文中。熟练技术人员应意识到，这些技术是示例性的并且可利用制造和筛选人类抗体人抗体或抗体片段的任何已知方法。
在另一替代方案中，可以使用已经过基因工程改造以产生人类抗体人抗体的转基因动物，使用标准免疫方案来产生本质上针对任何免疫原性靶标的目标抗体。Green等，NatureGenet.7：13(1994)；Lonberg等，Nature368：856(1994)；和Taylor等，Int.Immun.6：579(1994)公开了从转基因小鼠获得人类抗体人抗体的方法。此类系统的一个非限制性实例是得自Abgenix(Fremont，CA)的(例如Green等，1999，J.Immunol.Methods231：11-23)。在和类似的动物中，小鼠抗体基因已经被灭活并且被功能人类抗体人抗体基因置换，而小鼠免疫系统的其余部分保持完好。
用经种系配置的YAC(酵母人工染色体)转化所述YAC含有部分人IgH和Igκ基因座，包含大多数可变区序列以及辅助基因和调节序列。人可变区谱系可用于产生能产生抗体的B细胞，所述细胞可通过已知技术加工成杂交瘤。经靶抗原免疫的将通过正常免疫应答产生人类抗体人抗体，可以收集和/或通过上文所论述的标准技术产生所述抗体。可利用多种品系的各品系能够产生不同类别的抗体。转基因产生的人类抗体人抗体已经显示出具有治疗潜力，同时保留正常人类抗体人抗体的药代动力学性质(Green等，1999)。熟练技术人员应认识到，要求保护的组合物和方法不限于使用系统，而是可以利用经基因工程改造以产生人类抗体人抗体的任何转基因动物。
抗体克隆和产生
各种技术，诸如产生嵌合或人源化抗体，可能涉及抗体克隆和构建程序。目标抗体的抗原结合Vκ(可变轻链)和VH(可变重链)序列可以通过多种分子克隆程序来获得，诸如RT-PCR、5′-RACE和cDNA文库筛选。来自表达鼠类抗体的细胞的抗体的V基因可以通过PCR扩增进行克隆并测序。为证实其可靠性，可以使所克隆的VL和VH基因在细胞培养物中表达为嵌合Ab，如Orlandi等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：3833(1989))所描述。基于V基因序列，随后可以如Leung等(Mol.Immunol.，32：1413(1995))所描述来设计和构建人源化抗体。
可以通过一般分子克隆技术从产生鼠类抗体的任何已知杂交瘤细胞系或经过转染的细胞系制备cDNA(Sambrook等，MolecularCloning，Alaboratorymanual，第2版(1989))。抗体的Vκ序列可以使用引物VK1BACK和VK1FOR(Orlandi等，1989)或Leung等(BioTechniques，15：286(1993))所描述的延伸引物组进行扩增。VH序列可以使用引物对VH1BACK/VH1FOR(Orlandi等，1989)或Leung等(Hybridoma，13：469(1994))所描述的与鼠类IgG恒定区退火的引物进行扩增。可如Leung等(Mol.Immunol.，32：1413(1995))所描述通过组合长寡核苷酸模版合成和PCR扩增来构建人源化V基因。
Vκ的PCR产物可亚克隆到阶段载体中，诸如基于pBR327的阶段载体VKpBR，其含有Ig启动子、信号肽序列和适宜的限制位点。VII的PCR产物可亚克隆到类似阶段载体中，诸如基于pBluescript的VHpBS。含有Vκ和VH序列连同启动子和信号肽序列的表达盒可从VKpBR和VHpBS中切除且分别连接于适当的表达载体中，诸如pKh和pG1g(Leung等Hybridoma，13：469(1994))。所述表达载体可以共转染于适当的细胞中且监测上清液的嵌合、人源化或人类抗体人抗体产生。替代地，可以切除Vκ和VH表达盒并亚克隆于单一表达载体中，诸如pdHL2，诸如Gillies等(J.Immunol.Methods125：191(1989)所描述且还示于Losman等，Cancer，80：2660(1997)中。
在一个替代实施方案中，可将表达载体转染于已预先适应在无血清培养基中转染、生长和表达的宿主细胞中。可使用的示例性细胞系包括Sp/EEE、Sp/ESF和Sp/ESF-X细胞系(参见例如美国专利号7,531,327、7,537,930和7,608,425，各自的实施例部分以引用的方式并入本文)。这些示例性细胞系是基于以突变型Bcl-EEE基因转染、暴露于甲氨蝶呤以扩增经过转染的基因序列且预先适应无血清细胞系以进行蛋白质表达的Sp2/0骨髓瘤细胞系。
抗体片段
可以通过已知的技术来产生识别特定表位的抗体片段。抗体片段是抗体的抗原结合部分，诸如F(ab′)2、Fab′、F(ab)2、Fab、Fv、scFv等等。F(ab′)2片段可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化来产生且Fab′片段可以通过还原F(ab′)2片段的二硫桥来产生。替代地，可以构建Fab′表达库(Huse等，1989，Science，246：1274-1281)以允许快速而又容易地鉴别具有所需特异性的单克隆Fab′片段。可以通过抗体的木瓜蛋白酶消化来产生F(ab)2片段。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域缔合以形成靶结合位点。这两个结构域通过肽连接子(L)进一步共价连接。用于制造scFv分子和设计合适的肽连接子的方法描述于以下文献中：美国专利第4,704,692号；美国专利第4,946,778号；Raag和Whitlow，FASEB9：73-80(1995)；以及Bird和Walker，TIBTECH，9：132-137(1991)。
用于产生单结构域抗体(DAB或VHH)的技术在本领域中也是已知的，如例如Cossins等(2006，ProtExpressPurif51：253-259)中所公开，该文献以引用的方式并入本文中。单结构域抗体可以例如通过标准免疫技术获自骆驼、羊驼或美洲驼。(参见例如Muyldermans等，TIBS26：230-235，2001；Yau等，JImmunolMethods281：161-75，2003；Maass等，JImmunolMethods324：13-25，2007)。VHH可以具有有效抗原结合能力并且可以与常规VH-VL对不可接近的新颖表位相互作用。(Muyldermans等，2001)。羊驼血清IgG含有约50％仅有重链的骆驼IgG抗体(HCAb)(Maass等，2007)。羊驼可用诸如TNF-α的已知抗原免疫并且可分离结合并中和靶抗原的VHH(Maass等，2007)。已经鉴别了实际上扩增所有羊驼VHH编码序列的PCR引物并且可用于构建羊驼VHH噬菌体呈现文库，所述文库可用于通过本领域中熟知的标准生物淘选技术来分离抗体片段(Maass等，2007)。在某些实施方案中，抗胰腺癌VHH抗体片段可用于所主张的方法和组合物中。
抗体片段可藉由全长抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或另一个宿主中表达编码所述片段的DNA来制备。可以通过用常规方法对全长抗体进行胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化来获得抗体片段。这些方法描述于例如Goldenberg的美国专利第4,036,945号和第4,331,647号以及其中所含的参考文献中。还参见Nisonoff等，ArchBiochem.Biophys.89：230(1960)；Porter，Biochem.J.73：119(1959)；Edelman等，METHODSINENZYMOLOGY第1卷，第422页(AcademicPress1967)；及Coligan第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。
抗体同种异型
治疗抗体的免疫原性与输注反应的风险增加和治疗反应的持续时间减少相关(Baert等，2003，NEnglJMed348：602-08)。治疗抗体在宿主中诱导免疫应答的程度可能部分由抗体的同种异型决定(Stickler等人，2011，GenesandImmunity12：213-21)。抗体同种异型涉及抗体恒定区序列中特定位置上的胺基酸氨基酸序列变异。含有重链γ型恒定区的IgG抗体的同种异型被命名为Gm同种异型(1976，JImmunol117：1056-59)。
对于常见IgG1人抗体，最流行的同种异型是G1m1(Stickler等，2011，GenesandImmunity12：213-21)。然而，G1m3同种异型通常也存在于白种人中(Stickler等，2011)。已经报告G1m1抗体含有当施用于非G1m1(nG1m1)受体，诸如G1m3患者时倾向于诱导免疫应答的同种异型序列(Stickler等，2011)。当施用于G1m1患者时，非G1m1同种异型抗体同样的免疫原性(Stickler等，2011)。
人类G1m1同种异型包含重链IgG1的CH3序列中Kabat位置356上的氨基酸天冬氨酸和Kabat位置358上的亮氨酸。nG1m1同种异型包含Kabat位置356上的氨基酸谷氨酸和Kabat位置358上的甲硫氨酸。G1m1和nG1m1同种异型都包含Kabat位置357上的谷氨酸残基，且所述同种异型有时被称为DEL和EEM同种异型。G1m1和nG1m1同种异型抗体的重链恒定区序列的非限制性实例如针对示例性抗体利妥昔单抗(SEQIDNO：85)和维妥珠单抗(SEQIDNO：86)所显示。
利妥昔单抗重链可变区序列(SEQIDNO：85)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAIHNHYTQKSLSLSPGK
维妥珠单抗重链可变区(SEQIDNO：86)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Jefferis和Lefranc(2009，mAbs1：1-7)回顾了IgG同种异型的序列变异特征和其对免疫原性的影响。其报告G1m3同种异型的特征在于Kabat位置214上的精氨酸残基，相当比于G1m17同种异型中Kabat214上的赖氨酸残基。nG1m1，2同种异型的特征在于Kabat位置356上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸和Kabat位置431上的丙氨酸。G1m1，2同种异型的特征在于Kabat位置356上的天冬氨酸、Kabat位置358上的亮氨酸和Kabat位置431上的甘氨酸。除重链恒定区序列变异体以外，Jefferis和Lefranc(2009)还报告了K轻链恒定区的同种异型变异体，其中Km1同种异型的特征在于Kabat位置153上的缬氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，Km1，2同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，且Km3同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨酸和Kabat位置191上的缬氨酸。
关于治疗抗体，维妥珠单抗和利妥昔单抗分别是用于治疗多种血液恶性病和/或自体免疫疾病的针对CD20的人类化人源化和嵌合IgG1抗体。表1比较了利妥昔单抗对比维妥珠单抗的同种异型序列。如表1中所示，利妥昔单抗(G1m17，1)为DEL同种异型IgG1，其中Kabat位置214(重链CH1)上的额外序列变异在于利妥昔单抗中的赖氨酸对比维妥珠单抗中的精氨酸。已经报告了维妥珠单抗在受试者中的免疫原性弱于利妥昔单抗(参见例如Morchhauser等，2009，JClinOncol27：3346-53；Goldenberg等，2009，Blood113：1062-70；Robak和Robak，2011，BioDrugs25：13-25)，这种效果归因于人类化人源化抗体与嵌合抗体之间的差异。然而，EEM同种异型与DEL同种异型之间的差异可能也解释了维妥珠单抗的较低免疫原性。
表1.利妥昔单抗对比维妥珠单抗的同种异型
为了降低治疗抗体在nG1m1基因型个体中的免疫原性，需要选择抗体的同种异型以对应于以Kabat214上的精氨酸为特征的G1m3同种异型和以Kabat位置356上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸和Kabat位置431上的丙氨酸为特征的nG1m1，2null同种异型。令人惊讶的是，发现重复皮下施用G1m3抗体持续较长时间段未产生显著免疫应答。在替代实施方案中，人IgG4重链和G1m3同种异型一样具有Kabat214上的精氨酸、Kabat356上的谷氨酸、Kabat359上的甲硫氨酸和Kabat431上的丙氨酸。因为免疫原性看似至少部分涉及那些位置上的残基，所以将人IgG4重链恒定区序列用于治疗抗体也是一个优选的实施方案。G1m3IgG1抗体与IgG4抗体的组合还可以用于治疗性施用。
已知的抗体
靶抗原和示例性抗体
在一个优选的实施方案中，使用能识别和/或结合于以高水平表达于靶细胞上且对比正常组织主要或专门表达于患病细胞上的抗原的抗体。用于治疗例如癌症的示例性抗体包括但不限于LL1(抗CD74)、LL2或RFB4(抗CD22)、维妥珠单抗(hA20、抗CD20)、利妥昔单抗(抗CD20)、奥妥珠单抗(GA101、抗CD20)、兰利珠单抗(抗PD1)、尼鲁单抗(抗PD1)、MK-3475(抗PD1)、AMP-224(抗PD1)、皮地珠单抗(抗PD1)、MDX-1105(抗PD-L1)、MEDI4736(抗PD-L1)、MPDL3280A(抗PD-L1)、BMS-936559(抗PD-L1)、伊匹单抗(抗CTLA4)、曲维珠单抗(抗CTL4A)、RS7(抗上皮糖蛋白-1(EGP-1，也称为TROP-2))、PAM4或KC4(均为抗粘蛋白)、MN-14(抗癌胚抗原(CEA，也称为CD66e或CEACAM5)、MN-15或MN-3(抗CEACAM6)、Mu-9(抗结肠特异性抗原-p)、Immu31(抗甲胎蛋白)、R1(抗IGF-1R)、A19(抗CD19)、TAG-72(例如CC49)、Tn、J591或HuJ591(抗PSMA(前列腺特异性膜抗原))、AB-PG1-XG1-026(抗PSMA二聚体)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶IXMAb)、L243(抗HLA-DR)、阿仑单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉姆单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(抗CD20)；帕尼单抗(抗EGFR)；托西莫单抗(抗CD20)；PAM4(又名克里伏单抗，抗粘蛋白)、BWA-3(抗组蛋白H2A/H4)、LG2-1(抗组蛋白H3)、MRA12(抗组蛋白H1)、PR1-1(抗组蛋白H2B)、LG11-2(抗组蛋白H2B)、LG2-2(抗组蛋白H2B)和曲妥单抗(抗ErbB2)。此类抗体在本领域中是已知的(例如美国专利号5,686,072、5,874,540、6,107,090、6,183,744、6,306,393、6,653,104、6,730,300、6,899,864、6,926,893、6,962,702、7,074,403、7,230,084、7,238,785、7,238,786、7,256,004、7,282,567、7,300,655、7,312,318、7,585,491、7,612,180、7,642,239；和美国专利申请公布号20050271671、20060193865、20060210475、20070087001；各自的实施例部分以引用的方式并入本文中)。可用的特定已知抗体包括hPAM4(美国专利号7,282,567)、hA20(美国专利号7,251,164)、hA19(美国专利号7,109,304)、hIMMU-31(美国专利号7,300,655)、hLL1(美国专利号7,312,318)、hLL2(美国专利号7,074,403)、hMu-9(美国专利号7,387,773)、hL243(美国专利号7,612,180)、hMN-14(美国专利号6,676,924)、hMN-15(美国专利号7,541,440)、hR1(美国专利申请12/772,645)、hRS7(美国专利号7,238,785)、hMN-3(美国专利号7,541,440)、AB-PG1-XG1-026(美国专利申请11/983,372，作为ATCCPTA-4405和PTA-4406寄存)和D2/B(WO2009/130575)，各所述专利或申请的关于图和实施例部分的正文以引用的方式并入本文中。
可以使用所描述的缀合物靶向的其它可用抗原包括碳酸酐酶IX、B7、CCCL19、CCCL21、CSAp、HER-2/neu、BrE3、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20(例如，C2B8、hA20、1F5MAb)、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM5、CEACAM6、CTLA4、甲胎蛋白(AFP)、VEGF(例如纤连蛋白剪接变异体)、ED-B纤连蛋白(例如，L19)、EGP-1(TROP-2)、EGP-2(例如，17-1A)、EGF受体(ErbB1)(例如，)、ErbB2、ErbB3、因子H、FHL-1、F1t-3、叶酸受体、Ga733、GRO-β、HMGB-1、低氧可诱导因子(HIF)、HM1.24、HER-2/neu、胰岛素样生长因子受体(ILGF)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IFN-λ、IL-2R、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、IGF-1R、Ia、HM1.24、神经节苷脂、HCG、L243结合的HLA-DR抗原、CD66抗原(即，CD66a-d或其组合)、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、胎盘生长因子(P1GF)、PSA(前列腺特异性抗原)、PSMA、PAM4抗原、PD1受体、NCA-95、NCA-90、A3、A33、Ep-CAM、KS-1、Le(y)、间皮素、S100、腱生蛋白、TAC、Tn抗原、托马斯-弗里德里希抗原、肿瘤坏死抗原、肿瘤血管生成抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、TROP-2、VEGFR、RANTES、T101，以及癌症干细胞抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和致癌基因产物。
如通过流式细胞术所示，并且可以指导选择适用于免疫疗法的抗体的对造血恶性细胞上的合适的抗原(群集名称或CD)靶标的综合分析是Craig和Foon，Blood，2008年1月15日在线预出版；DOL10.1182/blood-2007-11-120535。
CD66抗原由分别由癌胚抗原(CEA)基因家族成员BCG、CGM6、NCA、CGM1和CEA编码的五种具有类似结构的不同糖蛋白CD66a-e组成。这些CD66抗原(例如CEACAM6)主要表达于粒细胞、消化道的正常上皮细胞和各种组织的肿瘤细胞中。合适的癌症靶标还包括癌症睾丸抗原，诸如NY-ESO-1(Theurillat等，Int.J.Cancer2007；120(11)：2411-7)以及骨髓性白血病(Kozlov等，CancerGenet.Cytogenet.2005；163(1)：62-7)还有B细胞疾病中的CD79a，和非何杰金淋巴瘤的CD79b(Poison等，Blood110(2)：616-623)。许多上述抗原公开于2002年11月15日提交的名为“UseofMulti-specific，Non-covalentComplexesforTargetedDeliveryofTherapeutics”的美国临时申请序列号60/426,379中。归于治疗抗性更大的前驱恶性细胞群体(Hill和Perris，J.Natl.CancerInst.2007；99：1435-40)的癌症干细胞具有在某些癌症类型中可靶向的抗原，诸如前列腺癌(Maitland等，ErnstScheringFound.Sympos.Proc.2006；5：155-79)、非小细胞肺癌(Donnenberg等，J.ControlRelease2007；122(3)：385-91)和成胶质细胞瘤(Beier等，CancerRes.2007；67(9)：4010-5)中的CD133，和结肠直肠癌(Dalerba等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2007；104(24)10158-63)、胰腺癌(Li等，CancerRes.2007；67(3)：1030-7)和头颈部鳞状细胞癌(Prinee等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2007；104(3)973-8)中的CD44。
抗癌症抗体已经显示在一些情况下可结合于组蛋白。Kato等(1991，HumAntibodiesHybridomas2：94-101)报告了肺癌特异性人类单克隆抗体HB4C5结合于组蛋白H2B。Garzelli等(1994，ImmunolLett39：277-82)观察到经过埃-巴二氏病毒转化的人B淋巴细胞产生针对组蛋白的天然抗体。在某些实施方案中，针对组蛋白的抗体可用于目标组合中。已知的抗组蛋白抗体包括但不限于BWA-3(抗组蛋白H2A/H4)、LG2-1(抗组蛋白H3)、MRA12(抗组蛋白H1)、PR1-1(抗组蛋白H2B)、LG11-2(抗组蛋白H2B)和LG2-2(抗组蛋白H2B)(参见例如Monestier等，1991，EurJImmunol21：1725-31；Monestier等，1993，MolecImmunol30：1069-75)。
对于多发性骨髓瘤疗法，已经描述了针对例如CD38和CD138(Stevenson，MolMed2006；12(11-12)：345-346；Tassone等，Blood2004；104(12)：3688-96)、CD74(Stein等，出处同上)、CS1(Tai等，Blood2008；112(4)：1329-37)和CD40(Tai等，2005；CancerRes.65(13)：5898-5906)的合适的靶向抗体。
巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是先天性和适应性免疫性和细胞凋亡的重要调节因子。已经报告了CD74是MIF的内源性受体(Leng等，2003，JExpMed197：1467-76)。拮抗性抗CD74抗体对MIF介导的细胞内途径的治疗效果可用于治疗多种疾病状态，诸如膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌和慢性淋巴细胞性白血病(例如Meyer-Siegler等，2004，BMCCancer12：34；Shachar和Haran，2011，LeukLymphoma52：1446-54)。米拉珠单抗(hLL1)是具有治疗MIF介导的疾病的治疗性用途的示例性抗CD74抗体。
最优选的抗体/抗原对的一个实例是LL1，抗CD74MAb(不变链，II类特异性侣伴蛋白，Ii)(参见例如美国专利号6,653,104、7,312,318；各自的实施例部分以引用的方式并入本文中)。CD74抗原是高度表达于B细胞淋巴瘤(包括多发性骨髓瘤)和白血病、某些T细胞淋巴瘤、黑素瘤、结肠癌、肺癌和肾癌、成胶质细胞瘤和某些其它癌症上(Ong等，Immunology98：296-302(1999))。CD74抗体用于癌症中的用途的综述包含于Stein等，ClinCancerRes.2007年9月15日；13(18Pt2)：5556s-5563s中，该文献以引用的方式并入本文中。优选用抗CD74抗体治疗的疾病包括但不限于非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏病、黑素瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、多形性成胶质细胞瘤、组织细胞瘤、骨髓性白血病和多发性骨髓瘤。
在另一个优选的实施方案中，可以使用针对病原体的治疗组合，因为针对病原体的抗体是已知的。举例来说，已经公开了特异性结合由感染性病变，包括例如由诸如细菌、立克次氏体、支原体、原生动物、真菌和病毒的病原体造成的病毒、细菌、真菌和寄生虫感染，以及与此种微生物相关的抗原和产物产生的或与其相关的标记物的抗体和抗体片段，尤其在以下文献中：Hansen等，美国专利号3,927,193以及Goldenberg美国专利号4,331,647、4,348,376、4,361,544、4,468,457、4,444,744、4,818,709和4,624,846，各自的实施例部分以引用的方式并入本文中；以及Reichert和Dewitz(NatRevDrugDiscovery2006；5：191-195)。列出了针对感染性生物体(抗毒素和抗病毒抗体)以及其它靶标的抗体的综述包含在Casadevall，ClinImmunol1999；93(1)：5-15中，该文献以引用的方式并入本文中。可利用针对多种人类病原体的市售抗体(例如KPL，Inc.，Gaithersburg，MD)，包括金黄色葡萄球菌(目录号011-90-05)、无乳链球菌(目录号011-90-08)、酿脓链球菌(目录号01-90-07)、幽门螺旋杆菌(目录号01-93-94)、伯氏疏螺旋体(目录号05-97-91)、大肠杆菌(目录号01-95-91；01-95-96)、军团菌属(目录号01-90-03)、李斯特菌属(目录号01-90-90)、霍乱弧菌(目录号01-90-50)、志贺氏菌属(目录号16-90-01)和弯曲杆菌属(目录号01-92-93)。
在一优选的实施方案中，病原体选自HIV病毒、结核分支杆菌、无乳链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、嗜肺性军团病菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎球菌、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、B型流感嗜血杆菌、苍白密螺旋体、莱姆病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产布鲁氏菌、狂犬病病毒、流感病毒、巨细胞病毒、I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、人血清细小样病毒、呼吸道合胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、埃-巴二氏病毒、鼠类白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口膜炎病毒、辛德比斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、猿猴病毒40、鼠乳房肿瘤病毒、登革热病毒、风疹病毒、西尼罗河病毒、恶性疟原虫、间日疟原虫、刚地弓形虫、让氏锥虫、克氏锥虫、罗德西亚锥虫、布氏锥虫、曼氏裂体吸虫、日本裂体吸虫、牛巴贝虫、艾美耳球虫、旋盘尾丝虫、热带利什曼虫、旋毛虫、小泰勒虫、泡状带绦虫、羊绦虫、牛肉绦虫、细粒棘球绦虫、科氏中殖孔绦虫、关节炎支原体、鼻支原体、口腔支原体、精氨酸支原体、拉氏无胆甾原体、唾液支原体和肺炎支原体，如美国专利号6,440,416中所公开，该专利的实施例部分以引用的方式并入本文中。
在各种实施方案中，要求保护的方法和组合物可以利用本领域中已知的多种抗体中的任一种。所使用的抗体可从许多已知来源商购获得。举例来说，多种抗体分泌杂交瘤系可从美国典型培养物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)获得。针对各种疾病靶标，包括但不限于肿瘤相关抗原的大量抗体寄存在ATCC和/或已经公布了可变区序列，且可用于要求保护的方法和组合物中。参见例如美国专利号7,312,318、7,282,567、7,151,164、7,074,403、7,060,802、7,056,509、7,049,060、7,045,132、7,041,803、7,041,802、7,041,293、7,038,018、7,037,498、7,012,133、7,001,598、6,998,468、6,994,976、6,994,852、6,989,241、6,974,863、6,965,018、6,964,854、6,962,981、6,962,813、6,956,107、6,951,924、6,949,244、6,946,129、6,943,020、6,939,547、6,921,645、6,921,645、6,921,533、6,919,433、6,919,078、6,916,475、6,905,681、6,899,879、6,893,625、6,887,468、6,887,466、6,884,594、6,881,405、6,878,812、6,875,580、6,872,568、6,867,006、6,864,062、6,861,511、6,861,227、6,861,226、6,838,282、6,835,549、6,835,370、6,824,780、6,824,778、6,812,206、6,793,924、6,783,758、6,770,450、6,767,711、6,764,688、6,764,681、6,764,679、6,743,898、6,733,981、6,730,307、6,720,155、6,716,966、6,709,653、6,693,176、6,692,908、6,689,607、6,689,362、6,689,355、6,682,737、6,682,736、6,682,734、6,673,344、6,653,104、6,652,852、6,635,482、6,630,144、6,610,833、6,610,294、6,605,441、6,605,279、6,596,852、6,592,868、6,576,745、6,572；856、6,566,076、6,562,618、6,545,130、6,544,749、6,534,058、6,528,625、6,528,269、6,521,227、6,518,404、6,511,665、6,491,915、6,488,930、6,482,598、6,482,408、6,479,247、6,468,531、6,468,529、6,465,173、6,461,823、6,458,356、6,455,044、6,455,040、6,451,310、6,444,206、6,441,143、6,432,404、6,432,402、6,419,928、6,413,726、6,406,694、6,403,770、6,403,091、6,395,276、6,395,274、6,387,350、6,383,759、6,383,484、6,376,654、6,372,215、6,359,126、6,355,481、6,355,444、6,355,245、6,355,244、6,346,246、6,344,198、6,340,571、6,340,459、6,331,175、6,306,393、6,254,868、6,187,287、6,183,744、6,129,914、6,120,767、6,096,289、6,077,499、5,922,302、5,874,540、5,814,440、5,798,229、5,789,554、5,776,456、5,736,119、5,716,595、5,677,136、5,587,459、5,443,953、5,525,338，各专利的实施例部分以引用的方式并入本文中。这些仅是示例性的，且多种其它抗体和它们的杂交瘤在本领域中是已知的。技术人员将认识到，几乎针对任何疾病相关抗原的抗体序列或抗体分泌杂交瘤可以通过在ATCC、NCBI和/或USPTO数据库对针对所选疾病相关靶标的相关抗体进行简单搜索来获得。克隆抗体的抗原结合域可以使用本领域中熟知的标准技术进行扩增、切除、结扎于表达载体中、转染至经改造的宿主细胞中，且用于蛋白质产生(参见例如美国专利号7,531,327、7,537,930、7,608,425和7,785,880，各专利的实施例部分以引用的方式并入本文中)。
在其它实施方案中，抗体复合物结合于I类MHC、II类MHC或辅助分子，诸如CD40、CD54、CD80或CD86。抗体复合物还可以结合于白细胞活化细胞因子，或结合细胞因子介质，例如NF-κB。
在某些实施方案中，两个不同的靶标之一可以是癌细胞受体或癌症相关抗原，特别选自以下的抗原：B细胞系抗原(CD19、CD20、CD21、CD22、CD23等)、VEGF、VEGFR、EGFR、癌胚抗原(CEA)、胎盘生长因子(PlGF)、腱生蛋白、HER-2/neu、EGP-1、EGP-2、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD45、CD52、CD74、CD80、CD138、NCA66、CEACAM1、CEACAM6(癌胚抗原相关细胞粘连分子6)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、IL-6、甲胎蛋白(AFP)、A3、CA125、结肠特异性抗原-p(CSAp)、叶酸受体、HLA-DR、人绒膜促性腺激素(HCG)、Ia、EL-2、胰岛素样生长因子(IGF)和IGF受体、KS-1、Le(y)、MAGE、坏死抗原、PAM-4、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、Pr1、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、S100、T101、TAC、TAG72、TRAIL受体和碳酸酐酶IX。
可使用的其它抗体包括针对诸如细菌、病毒、支原体或其它病原体的感染性疾病因素的抗体。许多针对此类感染性因素的抗体在本领域中是已知的，并且任何此类已知抗体都可以用于要求保护的方法和组合物中。举例来说，针对人免疫缺陷病毒I(HIV-1)的gpl20糖蛋白抗原的抗体是已知的，且某些此类抗体可以对人具有免疫保护作用。参见例如Rossi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86：8055-8058，1990。已知的抗HIV抗体包括由Johansson等(AIDS，2006年10月3日；20(15)：1911-5)描述的抗包膜抗体，以及由Polymun(Vienna，Austria)描述并出售、还描述于美国专利5,831,034、美国专利5,911,989和Vcelar等，AIDS2007；21(16)：2161-2170和Joos等，Antimicrob.AgentsChemother.2006；50(5)：1773-9中的抗HIV抗体，所有参考文献以引用方式并入本文中。
针对疟疾寄生虫的抗体可以针对子胞子阶段、裂殖子阶段、裂殖体阶段和配子体阶段。已经产生了针对子孢子(环子孢子抗原)的单克隆抗体，并且已显示可在体外和啮齿动物内中和子孢子(N.Yoshida等，Science207：71-73，1980)。若干个小组已经开发了针对刚地弓形虫，即涉及弓形体病的原生寄生虫的抗体(Kasper等，J.Immunol.129：1694-1699，1982；Id.，30：2407-2412，1983)。已开发出针对血吸虫童虫表面抗原的抗体，且已发现在体内或体外对血吸虫童虫起作用(Simpson等，Parasitology，83：163-177，1981；Smith等，Parasitology，84：83-91，1982；Gryzch等，J.Immunol.，129：2739-2743，1982；Zodda等，J.Immunol.129：2326-2328，1982；Dissous等，J.Immunol.，129：2232-2234，1982)。
克氏锥虫是恰加斯氏病的致病因素，并且通过吸血的食虫椿象科昆虫传播。已经产生在体外特异抑制寄生虫的一种形式向另一种形式(上鞭毛体向锥鞭毛体阶段)分化且与细胞表面糖蛋白反应的抗体；然而，哺乳动物(血流)形式的寄生虫不存在此抗原(Sher等，Nature，300：639-640，1982)。
抗真菌抗体在本领域中是已知的，诸如抗核盘菌抗体(美国专利7,910,702)；抗葡萄糖醒酸木糖甘露聚糖抗体(Zhong和Priofski，1998，ClinDiagLabImmunol5：58-64)；抗假丝酵母抗体(Matthews和Burnie，2001，CurrOpinInvestigDrugs2：472-76)；以及抗鞘糖脂抗体(Toledo等，2010，BMCMicrobiol10：47)。
已经开发了针对大部分造成大多数人感染的微生物(细菌、病毒、原生生物、真菌、其它寄生虫)的合适的抗体，且许多先前已用于体外诊断目的。这些抗体和可以通过常规方法产生的更新的抗体适用于本发明。
免疫缀合物
在某些实施方案中，抗体或其片段可以与一种或多种治疗剂和/或诊断剂缀合。治疗剂不需要是相同的，而是可以有所不同，例如药物和放射性同位素。举例来说，131I可以并入抗体或融合蛋白质的酪氨酸中且药物与赖氨酸残基的ε氨基连接。治疗剂和诊断剂还可以连接于例如经还原的SH基团和/或碳水化合物侧链。用于制造治疗剂或诊断剂与抗体或融合蛋白质的共价或非共价缀合物的许多方法在本领域中是已知的，并且可以利用任何此类已知方法。
治疗剂或诊断剂可以经由二硫键形成而连接在经过还原的抗体组分的铰链区。替代地，此类试剂可以使用异双官能交联剂，诸如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰酯(SPDP)连接。Yu等，Int.J.Cancer56：244(1994)。用于此类缀合的一般技术在本领域中是众所周知的。参见例如Wong，CHEMISTRYOFPROTEINCONJUGATIONANDCROSS-LINKING(CRCPress1991)；Upeslacis等，“ModificationofAntibodiesbyChemicalMethods”，MONOCLONALANTIBODIES：PRINCIPLESANDAPPLICATIONS，Birch等(编)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，“ProductionandCharacterizationofSyntheticPeptide-DerivedAntibodies”，MONOCLONALANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATION，Ritter等(编)，第60-84页(CambridgeUniversityPress1995)。替代地，可以经由抗体Fc区中的碳水化合物部分缀合治疗剂或诊断剂。碳水化合物基团可用于增加与硫醇基结合的相同试剂的负载，或碳水化合物部分可用于结合不同的治疗剂或诊断剂。
经由抗体碳水化合物部分将肽缀合于抗体组分的方法是本领域技术人员熟知的。参见例如Shih等，Int.J.Cancer41：832(1988)；Shih等，Int.J.Cancer46：1101(1990)；和Shih等，美国专利号5,057,313，所述文献以全文引用的方式并入本文中。一般方法涉及使具有经氧化的碳水化合物部分的抗体组分与具有至少一个游离胺官能的载剂聚合物反应。此反应产生初步希夫碱(亚胺)键联，其可以通过还原成仲胺而加以稳定，以便形成最终缀合物。
在用作免疫缀合物的抗体组分的抗体是抗体片段的情况下，可能不存在Fc区。然而，有可能将碳水化合物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区中。参见例如Leung等，J.Immunol.154：5919(1995)；Hansen等，美国专利号5,443,953(1995)；Leung等，美国专利号6,254,868，所述文献以全文引用的方式并入本文中。使用经过工程改造的碳水化合物部分来连接治疗剂或诊断剂。
在一些实施方案中，螯合剂可连接于抗体、抗体片段或融合蛋白质且用于螯合治疗剂或诊断剂，如放射性核素。示例性螯合剂包括但不限于DTPA(诸如Mx-DTPA)、DOTA、TETA、NETA或NOTA。缀合并使用螯合剂将金属或其它配体连接于蛋白质的方法在本领域中是熟知的(参见例如美国专利号7,563,433，其实施例部分以引用的方式并入本文中)。
在某些实施方案中，放射性金属或顺磁性离子可通过与具有可能连接有多个螯合基团用于结合离子的长尾部的试剂反应而连接于蛋白质或肽。此类尾部可以是具有可结合螯合基团的侧基的聚合物，例如聚赖氨酸、多糖或其它衍生化或可衍生链，所述螯合基团为诸如，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、聚胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟和已知可用于此目的的类似基团。
螯合物可直接连接于抗体或肽，例如，如美国专利4,824,659中所公开，该专利以全文引用的方式并入本文中。特别有用的金属螯合物组合包括2-苯甲基-DTPA及其单甲基和环己基类似物，其与大体能量范围为60至4,000keV的诊断同位素，诸如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、11C、13N、15O、76Br一起用于放射成像。相同的螯合物在与非放射性金属，诸如锰、铁和钆复合时可用于MRI。诸如NOTA、DOTA和TETA的巨环螯合剂可与各种金属和放射性金属，最特别地分别与放射性核素镓、钇和铜一起使用。可以通过根据目标金属调整环尺寸而使此类金属螯合物复合物变得非常稳定。涵盖其它环型螯合物，诸如大环聚醚，其对于稳定地结合核素，诸如用于RAIT的223Ra感兴趣。
最近，已经公开了用于PET扫描技术中的18F标记法，例如通过使F-18与金属或诸如铝的其它原子反应。18F-Al缀合物可与直接连接于抗体或用于在预靶向方法中标记可靶向构建体的螯合基团，诸如DOTA、NOTA或NETA复合。此类F-18标记技术公开于美国专利号7,563,433中，其实施例部分以引用的方式并入本文中。
另一种示例性免疫缀合物公开于Johannson等(2006，AIDS20：1911-15)中，其中发现多柔比星缀合的P4/D10(抗gp120)抗体在治疗感染HIV的细胞方面非常有效。
喜树碱缀合物
在某些优选的实施方案中，免疫缀合物可以包含喜树碱药物，诸如SN-38。喜树碱(CPT)和其衍生物是一类有效的抗肿瘤剂。伊立替康(也称为CPT-11)和托泊替康是作为经过批准的癌症治疗剂的CPT类似物(Iyer和Ratain，CancerChemother.Phamacol.42：S31-S43(1998))。CPT通过稳定拓扑异构酶I-DNA复合物来抑制拓扑异构酶I酶而起作用(Liu等，TheCamptothecins：UnfoldingTheirAnticancerPotential，LiehrJ.G.，Giovanella，B.C.和Verschraegen(编)，NYAcadSci.，NY922：1-10(2000))。
免疫缀合物的优选的最佳给药可以包括介于3mg/kg与20mg/kg之间的剂量，优选地每周、每周两次或每隔一周给予。最佳给药时程可以包括以下治疗循环：治疗连续两周随后停止一、二、三或四周；或交替数周治疗和停止；或治疗一周，随后停止二、三或四周；或治疗三周，随后停止一、二、三或四周；或治疗四周，随后停止一、二、三或四周；或治疗五周，随后停止一、二、三、四或五周；或每两周一次，每三周一次或每月一次施用。治疗可以延续任何循环数目，优选地至少2个、至少4个、至少6个、至少8个、至少10个、至少12个、至少14个或至少16个循环。剂量可以是至多24mg/kg。可用的示例性剂量可以包括1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、20mg/kg、22mg/kg和24mg/kg。优选的剂量是4、6、8、9、10、12、14、16或18mg/kg。本领域技术人员应认识到，在选择免疫缀合物的最佳剂量时可能考虑多种因素，诸如年龄、一般健康状况、特定器官功能或体重以及先前疗法对特定器官系统(例如骨髓)的效应，且在治疗过程中可以增减施用剂量和/或频率。需要时可以重复所述剂量，在少达4至8个剂量之后即观察到肿瘤收缩的证据。本文中所公开的经过优化的施用剂量和时程在人类受试者中显示出乎意料的优越效力和降低的毒性，这无法由动物模型研究预测。令人惊讶的是，所述优越的效力允许治疗先前发现对一或多种标准抗癌疗法具有抗性的肿瘤，包括在体内衍生出SN-38的亲本化合物CPT-11。
一个示例性优选实施方案涉及通式1的药物衍生物与抗体缀合物，
MAb-[L2]-[L1]-[AA]m-[A′]-药物(1)
其中MAb为疾病靶向抗体；L2为包含抗体偶联部分和一个或多个乙炔(或叠氮)基团的交联剂组分；L1包含在一端具有与L2中的乙炔(或叠氮)部分互补的叠氮(或乙炔)且在另一端具有诸如羧酸或羟基的反应基团的确定的PEG；AA是L-氨基酸；m是值为0、1、2、3或4的整数；且A′选自乙醇胺、4-羟基苯甲醇、4-氨基苯甲醇或者经取代或未经取代的乙二胺的额外间隔基。‘AA’的L氨基酸选自丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。若A′基团含有羟基，则其分别呈碳酸盐或氨基甲酸盐形式连接于药物的羟基或氨基。
在式1的优选实施方案中，A′为来源于L-氨基酸的经取代乙醇胺，其中所述氨基酸的羧酸基经羟甲基部分置换。A′可以来源于以下L-氨基酸中的任一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
在式1的优选实施方案的缀合物的一个实例中，m是0，A′是L-缬氨醇，且药物以SN-38示例。所得结构示于式2中。
在式1的优选实施方案的缀合物的另一个实例中，m是1且由经过衍生化的L-赖氨酸表示，A′是L-缬氨醇，且药物以SN-38示例。所得结构示于式3中。
在这个实施方案中，使用针对赖氨酸氨基的正交保护基，首先在诸如赖氨酸的氨基酸的羧酸与缬氨醇的氨基之间形成酰胺键。去除赖氨酸N末端上的保护基，保持赖氨酸侧链上的保护基完整，并且使N末端与另一端具有叠氮(或乙炔)的确定的PEG上的羧基偶联。然后将缬氨醇的羟基连接于10-羟基经保护的SN-38的20-氯甲酸酯衍生物，且将这一中间物与携带靶向载体-结合部分以及涉及点击环加成化学的互补乙炔(或叠氮)基的L2组分偶联。最后，去除赖氨酸侧链和SN-38两处的保护基得到本实例的产物，示于式2中。
在另一个优选的实施方案中，通式2的A′是A-OH，其中A-OH是可折叠部分，诸如4-氨基苯甲醇或在苯甲基位置上经C1-C10烷基取代的经取代4-氨基苯甲醇，后者经由其氨基连接于L-氨基酸或包含最多4个L-氨基酸部分的多肽；其中N末端连接于以抗体结合基团为末端的交联剂。
以下提供优选实施方案的一个实例，其中通式(1)的A′的A-OH实施方案衍生自经取代的4-氨基苯甲醇，且‘AA’包括单个L-氨基酸(通式(1)中m＝1)，且药物以SN-38示例。结构表示如下(式2，称为MAb-CLX-SN-38)。AA的单个氨基酸选自以下L-氨基酸中的任一种：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。4-氨基苯甲醇部分(A′的A-OH实施方案)上的取代基R是氢或选自C1-C10烷基的烷基。
式4的MAb-CLX-SN-38的一个实施方案，其中单个氨基酸AA是L-赖氨酸且R＝H，且药物以SN-38示例(式5；称为MAb-CL2A-SN-38)。用于制备CL2A-SN-38以及用于制备和使用其抗体缀合物的方法在本领域中是已知的(参见例如美国专利号7,999,083和8,080,250，各自的实施例部分以引用的方式并入本文中)。
Pro-2-吡咯啉并多柔比星结合物
1996年沙利小组首先描述了化合物2-吡咯啉并多柔比星，稍后使用其与许多受体靶向肽缀合以用于临床前探测(Nagy等，1996，ProcNatlAadSciUSA93：7269-73；Nagy等，1996，ProcNatlAcadSciUSA96：2464-29)。这是多柔比星的衍生物，其中柔红糖胺氮并入5元烯胺中，使其成为非常有效的烷基化剂，细胞毒性是多柔比星的500至1000倍。药物的超毒性使得为安全起见，必需在隔离器中专门处理。其前药形式为N-(4，4-二乙酰氧基丁基)多柔比星，其在体内转化成2-吡咯啉并多柔比星。可如本文中所公开制备Pro-2-吡咯啉并多柔比星(Pro-2-P-Dox)，且与抗体或抗体片段缀合以用于ADC疗法中。
以下流程显示了Dox、2-PDox、Pro-2-P-Dox(P2PDox)和活化的Pro-2-P-Dox的结构。为了与IgG偶联，可以用SMCC-酰肼活化Pro-2-P-Dox，此程序引入了酸不稳定腙以及马来酰亚胺基，后者用于与经适度还原的抗体的硫醇缀合。
目前在临床研究的大部分ADC并入了具有细胞周期阶段特异性的微管蛋白作用超毒性类美登素和奥里斯他汀。说来有趣，除了曲妥单抗-DM1以外，这些ADC看似在实体癌症中在临床上展现了相对狭窄的治疗指数。DNA烷基化剂，诸如2-PDox，不具细胞周期阶段特异性并且将提供改良的治疗指数。在胰腺癌和胃癌的2个侵袭性异种移植模型中的初步研究(未示出)显示hRS7-6缀合物在低且安全的剂量(例如，2.25mg/kg蛋白质剂量或0.064mg/kg药物剂量)下极具活性，从而引起完全消退。
使用氰基硼氢钠，用4，4-二乙酰氧基丁醛对多柔比星进行还原性烷基化产生P2PDox(以下流程)。对市售4-苯甲氧基丁醛进行脱乙酰氧基，随后对与多柔比星还原性偶联的醛进行氢解和氧化处理，获得P2PDox。用SMCC-酰肼活化后者。
在PBS中混合缀合物制剂从而适度还原IgG与TCEP的链间二硫键，随后与10倍过量的活化P2PDox偶联。在离心SEC上在于25mM组氨酸pH7中平衡过的上纯化缀合物，随后通过疏水性柱。将产物与海藻糖和吐温80一起配制，并且冻干。具有6-7个药物/IgG的典型取代的缀合产物通过尺寸排阻HPLC作为单峰洗脱，且典型地含有＜1％的未缀合游离药物(逆相HPLC)。
本领域技术人员应认识到，P2PDox可与任何已知的抗体或其片段缀合以便与本文中所论述的免疫调节剂组合用于肿瘤和/或感染性疾病的ADC治疗。
双特异性抗体
在各种实施方案中，目标组合疗法可以利用一种或多种双特异性抗体(bsAb)，诸如白细胞重定向bsAb。尽管以下部分论述了优选的实施方案，其中bsAb是以DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)构建体的形式制造，但许多其它类型的bsAb在本领域中是已知的并且在要求保护的组合疗法的范围内可以使用。如本文中所使用的双特异性抗体是含有针对两个不同的抗原或同一抗原上的两个不同表位的结合位点的抗体。尽仅可结合于单一抗原上的单一表位的抗体是单特异性的，不考虑抗体分子上的抗原结合位点数目。
如背景部分中所论述，双特异性抗体构建的早期尝试利用化学交联或杂合杂交瘤或四价体瘤以便将两种不同的抗体的两半接合在一起(例如Staerz等，1985，Nature314：628-31；Milstein和Cuello，Nature1983；305：537-540；Karpovsky等，1984，JExpMed160：1686-701)。虽然所述技术用于制造bsAb，但各种产生问题使得此类复合物难以使用，诸如产生含有抗原结合位点的不同组合的混合群体、蛋白质表现方面的困难、需要纯化目标bsAb、低产率、生产费用等。
最近的方法利用经过基因工程改造的构建体，其能够产生单一bsAb的均质产物而无需彻底纯化以去除不需要的副产物。此类构建体包括串联scFv、二抗体、串联二抗体、双可变结构域抗体和使用诸如Ch1/Ck结构域或DNLTM的基元的异源二聚(Chames和Baty，2009，CurrOpinDrugDiscovDevel12：276-83；Chames和Baty，mAbs1：539-47)。
三功能单抗是四价体瘤方法的变化形式，与大鼠/大鼠或小鼠/小鼠四价体瘤中常见的随机配对相比，其使用小鼠IgG2a与大鼠IgG2b抗体的组合以抗体优先产生重组抗体(Chames和Baty，mAbs1：539-47)。由此技术产生的抗CD3×抗EpCAMbsAb(卡妥索单抗)能够有效地征募巨噬细胞和NK细胞且活化T细胞(Chames和Baty，mAbs1：539-47)。如上文所论述，欧洲已批准卡妥索单抗用于治疗EpCAM阳性癌瘤患者的恶性腹水(Chames和Baty，mAbs1：539-47)。令人惊讶的是，据报告重组bsAb在人类中仅诱导中度抗小鼠和抗大鼠反应(Chames和Baty，mAbs1：539-47)，大概至少部分是由于i.p.施用于腹水的途径。厄妥索单抗是靶向HER2的另一种三功能单抗，其可用于转移性乳腺癌。Bi20是靶向CD20的另一种三功能单抗。在体外，Bi20展现得自CLL患者的B细胞的有效溶解(Chames和Baty，mAbs1：539-47)。
是指由短肽连接子接合的串联scFv(Chames和Baty，mAbs1：539-47)。布利莫单抗是抗CD19×抗CD3其在极低浓度下在诸如非何杰金氏淋巴瘤和ALL的血液学癌症中具有所报告的效力(Nagorsen等，2009，Leukemia&Lymphoma50：886-91；Chames和Baty，mAbs1：539-47；Topp等，2012，Blood120：5185-87；Bargou等，2008，Science321：974-77)。对EpCAM具有特异性的另一种已经用于胃肠癌、卵巢癌、结肠直肠癌和肺癌(Amann等，2009，JImmunother32：452-64；Chames和Baty，mAbs1：539-47)。已经提出靶向CEACAM5的另一种(MEDI-565)用于黑素瘤、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、子宫癌和乳腺癌(Sanders等，1994，JPathol172：343-8)。已经报告了在皮摩尔或甚至飞摩尔浓度下展现抗肿瘤活性(Chames和Baty，mAbs1：539-47)。
涉及组装来源于两种不同的之前存在的抗体的两个重链和两个轻链的另一种bsAb形成方法是基于钮入穴法，其有助于异源二聚体形成且防止同源二聚体形成(Schaefer等，2011，ProcNatl.AcadSciUSA108：11187-92)。“CrossMab”技术进一步涉及交换双特异性抗体中一半的Fab内的重链和轻链结构域，从而产生两个不同所以不会发生轻-重链错配的臂(Schaefer等，2011)。钮入穴法将具有庞大侧链的氨基酸引入一个重链的CH3结构域中，从而配合另一个重链的CH3结构域中适当设计的穴。方法组合预防重链与重链和重链与轻链相互作用错配，从而主要产生单一产物。所产生的针对血管生成素-2(Ang-2)和VEGF-A的最初CrossMab展现与亲本mAb相当的结合特征，具有强效的抗血管生成和抗肿瘤活性(Schaefer等，2011，ProcNatl.AcadSciUSA108：11187-92；Kienast等，ClinCancerRes，2013年10月25日，印刷前电子版)。
除上文所论述的DARTTM技术以外，其它bsAb产生方法包括四价IgG-scFv融合(Dong等，2011，MAbs3：273-88)；双作用Fab(DAF)抗体(Bostrom等，2009，Science323：1610-14)；Igg样双可变结构域抗体(DVD-Ig)(Wu等，2007，NatBiotechnol25：1290-97)；和使用IgG4分子之间的动态交换(vanderNeutKolfschoten等，2007，Science317：1554-57)。虽然优选以下所论述的DNLTM技术用于形成白细胞重定向bsAb，但本领域技术人员应认识到，其它类型bsAb也可用于要求保护的方法和组合物中。
DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)
在优选的实施方案中，单独或与一种或多种诸如细胞因子的效应因子复合的双特异性抗体形成为DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合物(参见例如美国专利号7,521,056、7,527,787、7,534,866、7,550,143、7,666,400、7,901,680、7,906,118、7,981,398、8,003,111，各自的实施例部分以引用的方式并入本文中)。一般来说，该技术利用cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)调节(R)亚单位的二聚和对接结构域(DDD)序列与来源于多种AKAP蛋白中任一种的锚定结构域(AD)之间发生的特异性高亲和力结合相互作用(Baillie等，FEBSLetters.2005；579：3264；Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.CellBiol.2004；5：959)。DDD和AD肽可以连接于任何蛋白质、肽或其它分子。因为DDD序列自发二聚且结合于AD序列，所以该技术允许可连接于DDD或AD序列的任何选定分子之间形成复合物。
虽然标准DNLTM复合物包含两个DDD连接的分子连接于一个AD连接的分子的三聚体，但复合物结构的变化允许形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体和其它多聚体。在一些实施方案中，DNLTM复合物可以包含结合于同一抗原决定子或者两个或更多个不同的抗原的两个或更多个抗体、抗体片段或融合蛋白质。DNLTM复合物还可以包含一种或多种其它效应因子，诸如蛋白质、肽、免疫调节剂、细胞因子、白介素、干扰素、结合蛋白、肽配体、载体蛋白、毒素、诸如豹蛙酶的核糖核酸酶、诸如siRNA的抑制性寡核苷酸、抗原或异种抗原、诸如PEG的聚合物、酶、治疗剂、激素、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂或任何其它分子或聚集物。
1968年，首次从兔骨骼肌中分离出PKA，其在受到最透彻研究的由第二信使cAMP与R亚单元结合触发的信号转导途径之一中起重要作用(Walsh等，J.Biol.Chem.1968；243：3763)。全酶的结构由通过R亚单元保持为非活性形式的两个催化亚单元组成(Taylor，J.Biol.Chem.1989；264：8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚单元(RI和RII)，并且各类型具有α和β同种型(Scott，Pharmacol.Ther.1991；50：123)。因此，PKA调控亚单元的四个同种型是RIα、RIβ、RIIα和RIIβ，其各自包括DDD部分氨基酸序列。R亚单元仅分离为稳定二聚体且显示二聚结构域由RIIα的前44个氨基端残基组成(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6：222)。如下文所论述，其它调控亚单元的氨基酸序列的类似部分涉及二聚和对接，其各自位于调控亚单元的N-末端附近。cAMP与R亚单元结合造成用于广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚单元释放，所述活性催化亚单元通过PKA区室化经由其与AKAP对接而面向所选择的底物(Scott等，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。
自从1984年表征第一种AKAP微管相关蛋白-2以来(Lohmann等，Proc.Natl.Acad.SciUSA1984；81：6723)，又在从酵母到人范围内的物种中鉴别出具有多样性结构的超过50种AKAP，其定位于各种亚细胞位点，包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网(Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.CellBiol.2004；5：959)。AKAP中针对PKA的AD是具有14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等，J.Biol.Chem.1991；266：14188)。AD的氨基酸序列在个别AKAP之间不同，其中针对RII二聚体所报告的结合亲和力在2至90nM范围内(Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2003；100：4445)。AKAP仅结合于二聚R亚单元。对于人RIIα而言，AD结合于由23个氨基末端残基形成的疏水性表面(Colledge和Scott，TrendsCellBiol.1999；6：216)。因此，人RIIα的二聚结构域和AKAP结合结构域都位于相同N末端的44个氨基酸的序列内(Newlon等，Nat.Struct.Biol.1999；6：222；Newlon等，EMBOJ.2001；20：1651)，其在本文中称为DDD。
我们已发展出一种平台技术，其利用人PKA调控亚单元的DDD和AKAP的AD作为一对优良的连接子模块用于对接任何两个实体(在下文称为A和B)于非共价复合物中，所述复合物可通过在DDD与AD的战略位置上引入半胱氨酸残基以促进形成二硫键而进一步锁定于DNLTM复合物中。所述途径的一般方法如下。通过将DDD序列连接于A的前体来构建实体A，从而产生第一组分，在下文中称为a。因为DDD序列将实现二聚体的自发形成，因此A将由a2构成。通过将AD序列连接于B的前体来构建实体B，从而产生第二组分，在下文中称为b。a2中所含的DDD的二聚基元将产生用于结合b中所含的AD序列的对接位点，由此促进a2与b容易地缔合形成由a2b构成的二元三聚复合物。此结合事件通过随后经由二硫桥共价固定两个实体的反应而加以稳定，这基于有效局部浓度的原则而非常有效地发生，因为初始结合相互作用会使置于DDD和AD两者上的反应性硫醇基靠近(Chmura等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2001；98：8480)从而位点特异性地连接。通过使用连接子、衔接子模块和前体的各种组合，可产生并使用具有不同化学计量关系的多种DNLTM构建体(参见例如美国专利号7,550,143、7,521,056、7,534,866、7,527,787和7,666,400)。
通过在远离两个前体的官能团处连接DDD和AD，还预期所述位点特异性连接将保留两个前体的原始活性。此方法本质上是模块化的并且可能应用于位点特异性共价连接多种物质，包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段和具有多种活性的其它效应子部分。利用构建以下实施例中所描述的AD和DDD缀合效应子的融合蛋白法，实际上可将任何蛋白质或肽并入DNLTM构建体中。然而，该技术不具限制性且可利用其它缀合方法。
已知用于制备融合蛋白的多种方法，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成双链核酸。可通过标准分子生物学技术将所述双链核酸插入用于制造融合蛋白的表达载体中(参见例如Sambrook等，MOLECULARCLONING，ALABORATORYMANUAL，第2版，1989)。在此类优选实施方案中，AD和/或DDD部分可连接于效应蛋白或肽的N-末端或C-末端。然而，熟练技术人员应认识到，AD或DDD部分与效应子部分的连接位点可根据效应子部分的化学性质和效应子部分中参与其生理活性的部分而改变。多种效应子部分的位点特异性连接可使用本领域中已知的技术来进行，诸如使用二价交联试剂和/或其它化学偶联技术。
Dock-and-LockTM(DNLTM)技术用于产生不同格式的多种复合物(Rossi等，2012，BioconjugChem23：309-23)。通过将与二聚和对接结构域(DDD)融合的经稳定的(Fab)2与含有附接于各重链C-末端的锚定结构域(AD)的IgG(CH3-AD2-IgG)组合来构建基于维妥珠单抗(抗-CD20)和依帕珠单抗(抗-CD22)的双特异性六价抗体(bsHexAb)(Rossi等，2009，Blood113，6161-71)。与其亲本mAb的混合物相比，这些基于Fc的bsHexAb，下文称为“Fc-bsHexAb”，诱导独特信号转导事件(Gupta等人，2010，Blood116：3258-67)，且在体外展现有效的细胞毒性。然而，Fc-bsHexAb从小鼠循环中清除的速率比亲本mAb快大约两倍(Rossi等，2009，Blood113，6161-71)。虽然Fc-bsHexAb离体高度稳定，但在体内可能发生一定程度的解离，例如通过细胞内加工。此外，Fc-bsHexAb缺乏CDC活性。
基于Fc的免疫细胞因子也组装为DNLTM复合物，其包括融合于CH3-AD2-IgGFc的C-末端的二或四分子的干扰素α2b(IFNα2b)(Rossi等，2009，Blood114：3864-71；Rossi等，2010，CancerRes70：7600-09；Rossi等，2011，Blood118：1877-84)。Fc-IgG-IFNα维持接近于重组IFNα的高比活性，且在体外和体内针对非何杰金氏淋巴瘤(NHL)异种移植物显著有效。Fc-IgG-IFNα在小鼠中的T1/2长于PEG化IFNα，但为亲本mAb的一半长。与Fc-bsHexAb相似，Fc-IgG-IFNα在体内随着时间推移而解离且展示降低的CDC，但ADCC增强。
AD和DDD部分中的结构功能关系
对于不同类型的DNLTM构建体，可以利用不同的AD或DDD序列。示例性DDD和AD序列提供如下。
DDD1
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：1)
DDD2
CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：2)
AD1
QTEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：3)
AD2
CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQIDNO：4)
熟练技术人员应认识到，DDD1和DDD2是基于蛋白激酶A的人RIIα同种型的DDD序列。然而，在替代实施方案中，DDD和AD部分可以基于蛋白激酶A的人RIα形式的DDD序列和相应的AKAP序列，如以下DDD3、DDD3C和AD3中所例示。
DDD3
SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQIDNO：5)
DDD3C
MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQIDNO：6)
AD3
CGFEELAWKIAKMIWSDVFQQGC(SEQIDNO：7)
在其它替代实施方案中，在DNLTM复合物的构建中可利用AD和/或DDD部分的其它序列变异体。举例来说，人PKADDD序列仅存在4种变异体，对应于PKARIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分。RIIαDDD序列是上文所公开的DDD1和DDD2的基础。四种人PKADDD序列示于下文中。所述DDD序列表示RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIα的残基12-61和RIβ的残基13-66。(应注意，DDD1的序列相对于人PKARIIαDDD部分稍有改变。)
PKARIα
SLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK(SEQIDNO：8)
PKARIβ
SLKGCELYVQLHGIQQVLKDCIVHLCISKPERPMKFLREHFEKLEKEENRQILA(SEQIDNO：9)
PKARHα
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVGQQPPDLVDFAVEYFTRLREARRQ(SEQIDNO：10)
PKARIIβ
SIEIPAGLTELLQGFTVEVLRHQPADLLEFALQHFTRLQQENER(SEQIDNO：11)
AD和DDD结构域的结构功能关系是研究目标。(参见例如Burns-Hamuro等，2005，ProteinSci14：2982-92；Carr等，2001，JBiolChem276：17332-38；Alto等，2003，ProcNatlAcadSciUSA100：4445-50；Hundsrucker等，2006，BiochemJ396：297-306；Stokka等，2006，BiochemJ400：493-99；Gold等，2006，MolCell24：383-95；Kinderman等，2006，MolCell24：397-408，各自的整个正文以引用的方式并入本文中。)
举例来说，Kinderman等(2006，MolCell24：397-408)检查了AD-DDD结合相互作用的晶体结构，且得出结论：人DDD序列含有许多在二聚体形成或AKAP结合中非常重要的保守氨基酸残基，在以下SEQIDNO：1中以加下划线示出。(参见Kinderman等，2006的图1，以引用的方式并入本文中)。熟练技术人员应将认识到，在设计DDD序列的序列变异体时，将需要避免改变任何加下划线的残基，而对于二聚和AKAP结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：1)
如以下更详细论述，已对于二十个常见L-氨基酸中的每一种表征保守氨基酸取代。因此，基于Kinderman(2006)的数据和保守氨基酸取代，基于SEQIDNO：1的潜在替代性DDD序列示于表2中。在制定表2时，仅考虑高度保守氨基酸取代。举例来说，带电残基仅取代相同电荷的残基，具有较小侧链的残基经类似大小的残基取代，羟基侧链仅经其它羟基取代等。因为脯氨酸对于氨基酸次级结构具有独特的效应，因此没有其它残基取代脯氨酸。有限数目的此类潜在替代性DDD部分序列示于以下SEQIDNO：12至SEQIDN0：31中。本领域技术人员应认识到DDD部分种类内的替代物质可通过标准技术来构建，例如使用市售肽合成器或熟知的定点诱变技术。氨基酸取代对AD部分结合的效应还可以通过标准结合测定容易地确定，例如，如Alto等(2003，ProcNatlAcadSciUSA100：4445-50)中所公开。
表2.DDD1(SEQIDNO：1)中的保守氨基酸取代。共有序列公开为SEQIDNO：87。
THIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：12)
SKIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：13)
SRIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：14)
SHINIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：15)
SHIQIPPALTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：16)
SHIQIPPGLSELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：17)
SHIQIPPGLTDLLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：18)
SHIQIPPGLTELLNGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：19)
SHIQIPPGLTELLQAYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：20)
SHIQIPPGLTELLQGYSVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：21)
SHIQIPPGLTELLQGYTVDVLRQQPPDLVEFAVEYPTRLREARA(SEQIDNO：22)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLKQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：23)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRNQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：24)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQNPPDLVEPAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：25)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPELVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：26)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVDEAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：27)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFLVEYFTRLREARA(SEQIDNO：28)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFIVEYFTRLREARA(SEQIDNO：29)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFVVEYFTRLREARA(SEQIDNO：30)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEPAVDYFTRLREARA(SEQIDNO：31)
Alto等(2003，ProcNatlAcadSciUSA100：4445-50)对各种AKAP蛋白的AD序列进行生物信息学分析，以设计RII选择性AD序列，称为AKAP-IS(SEQIDNO：3)，其对DDD的结合常数为0.4nM。AKAP-IS序列设计为AKAP与PKA结合的肽拮抗剂。AKAP-IS序列中取代倾向于使与DDD的结合减弱的残基在以下SEQIDNO：3中以下划线示出。熟练技术人员应认识到，在设计AD序列的序列变异体时，将需要避免改变任何加下划线的残基，而对DDD结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。表3示出了AKAP-IS(AD1，SEQIDNO：3)序列中的潜在保守氨基酸取代，类似于以上表2中的针对DDD1(SEQIDNO：1)所示的氨基酸取代。
有限数目的此类潜在替代性AD部分序列示于以下SEQIDNO：32至SEQIDNO：49中。基于Alto等(2003)的数据，可能的AD部分序列种类内的其它物质可由熟练技术人员制备、测试并使用。应注意，Alto(2003)的图2示出了可基于实际结合实验在保留对DDD部分的结合活性的同时进行的许多氨基酸取代。
AKAP-IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：3)
表3.AD1(SEQIDNO：3)中的保守氨基酸取代。共有序列公开为SEQIDNO：88。
NIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：32)
QLEYIAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：33)
QVEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：34)
QIDYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：35)
QIEPLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：36)
QIETLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：37)
QIESLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：38)
QIEYIAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：39)
QIEYVAKQTVDNAIQQA(SEQIDNO：40)
QIEYLARQIVDNAIQQA(SEQIDNO：4)
QIEYLAKNIVDNAIQQA(SEQIDNO：42)
QIEYLAKQIVENAIQQA(SEQIDNO：43)
QIEYLAKQIVDQAIQQA(SEQIDNO：44)
QIEYLAKQIVDNAINQA(SEQIDNO：45)
QIEYLAKQIVDNAIQNA(SEQIDNO：46)
QIEYLAKQIVDNAIQQL(SEQIDNO：47)
QIEYLAKQIVDNAIQQI(SEQIDNO：48)
QIEYLAKQIVDNAIQQV(SEQIDNO：49)
Gold等(2006，MolCell24：383-95)利用结晶学和肽筛选开发了SuperAKAP-IS序列(SEQIDNO：50)，其对PKA的RII同种型表现出与RI同种型相比高出5个数量级的选择性。加下划线的残基指示相对于AKAP-IS序列的氨基酸取代位置，所述氨基酸取代增强与RIIα的DDD部分的结合。在此序列中，N-末端Q残基编号为第4号残基且C-端A残基为第20号残基。可以进行取代以影响对RIIα的亲和性的残基是残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等，2006)。预期在某些替代实施方案中，可用SuperAKAP-IS序列取代AKAP-ISAD部分序列来制备DNLTM构建体。可用来取代AKAP-ISAD序列的其它替代序列示于SEQIDNO：51-53中。相对于AKAP-IS序列的取代以下划线示出。预期如同SEQIDNO：4中所示的AD2序列，AD部分也可以包括额外N-末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C-末端残基甘氨酸和半胱氨酸。
SuperAKAP-IS
QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQIDNO：50)
替代性AKAP序列
QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO：51)
QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO：52)
QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQIDNO：53)
Gold等的图2公开了来自以下所示的多种AKAP蛋白的额外DDD结合序列。
RII特异性AKAP
AKAP-KL
PLEYQAGLLVQNAIQQAI(SEQIDNO：54)
AKAP79
LLIETASSLVKNAIQLSI(SEQIDNO：55)
AKAP-Lbc
LIEEAASRIVDAVIEQVK(SEQIDNO：56)
RI特异性AKAP
AKAPce
ALYQFADRFSELVISEAL(SEQIDNO：57)
RLAD
LEQVANQLADQIIKEAT(SEQIDNO：58)
PV38
FEELAWKIAKMIWSDVF(SEQIDNO：59)
双特异性AKAP
AKAP7
ELVRLSKRLVENAVLKAV(SEQIDNO：60)
MAP2D
TAEEVSARIVQVVTAEAV(SEQIDNO：61)
DAKAP1
QIKQAAFQLISQVILEAT(SEQIDNO：62)
DAKAP2
LAWKIAKMIVSDVMQQ(SEQIDNO：63)
Stokka等(2006，BiochemJ400：493-99)也开发了AKAP结合PKA的肽竞争剂，其示于SEQIDNO：64-66中。肽拮抗剂命名为Ht31(SEQIDNO：64)、RIAD(SEQIDNO：65)和PV-38(SEQIDNO：66)。Ht-31肽对PKA的RII同种型展现较高亲和力，而RIAD和PV-38对RI显示较高亲和力。
Ht31
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQIDNO：64)
RIAD
LEQYANQLADQIIKEATE(SEQIDNO：65)
PV-38
FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQIDNO：66)
Hundsrucker等(2006，BiochemJ396：297-306)开发了AKAP与PKA结合的其它肽竞争剂，与PKA的RII形式的DDD的结合常数低至0.4nM。各种AKAP拮抗性肽的序列提供于Hundsrucker等的表1中，复制于以下表4中。AKAPIS代表一种合成RII亚单元结合肽。所有其它肽都来源于所指示的AKAP的RII结合结构域。
表4.AKAP肽序列
肽序列
AKAPISQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：3)
AKAPIS-PQIEYLAKQIPDNAIQQA(SEQIDNO：67)
Ht31KGADLIEEAASRIVDAVIEQVKAAG(SEQIDNO：68)
Ht31-PKGADLIEEAASRIPDAPIEQVKAAG(SEQIDNO：69)
AKAP7δ-wt-pepPEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY(SEQIDNO：70)
AKAP7δ-L304T-pepPEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY(SEQIDNO：71)
AKAP7δ-L308D-pepPEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY(SEQIDNO：72)
AKAP7δ-P-pepPEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY(SEQIDNO：73)
AKAP7δ-PP-pepPEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY(SEQIDNO：74)
AKAP7δ-L314E-pepPEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY(SEQIDNO：75)
AKAP1-pepEEGLDRNEEIKRAAFQIISQVISEA(SEQIDNO：76)
AKAP2-pepLVDDPLEYQAGLLVQNAIQQAIAEQ(SEQIDNQ：77)
AKAP5-pepQYETLLIETASSLVKNAIQLSIEQL(SEQIDNO：78)
AKAP9-pepLEKQYQEQLEEEVAKVIVSMSIAFA(SEQIDNO：79)
AKAP10-pepNTDEAQEELAWKIAKMIVSDIMQQA(SEQIDNO：80)
AKAP11-pepVNLDKKAVLAEKIVAEAIEKAEREL(SEQIDNO：81)
AKAP12-pepNGILELETKSSKLVQNIIQTAVDQF(SEQIDNO：82)
AKAP14-pepTQDKNYEDELTQVALALVEDVINYA(SEQIDNO：83)
Rab32-pepETSAKDNINIEEAARFLVEKILVNH(SEQIDNO：84)
以下通过参考AKAPIS序列(SEQIDNO：3)以下划线指示在不同的AKAP蛋白的AD结构域间高度保守的残基。所述残基与Alto等(2003)所观察的相同，其中添加C-末端丙氨酸残基。(参见Hundsrucker等(2006)的图4，以引用的方式并入本文中。)。对RIIDDD序列有特别高的亲和力的肽拮抗剂的序列是AKAP-IS、AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep的序列。
AKAP-IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：3)
Carr等(2001，JBiolChem276：17332-38)检查了来自人和非人蛋白质的不同AKAP结合DDD序列之间的序列同源性程度，且鉴别了DDD序列中似乎在不同的DDD部分间最高度保守的残基。这些残基在以下通过参考SEQIDNO：1的人PKARIIαDDD序列以下划线示出。特别保守的残基进一步以斜体指示。所述残基与Kinderman等(2006)提出的对于结合AKAP蛋白质非常重要的那些残基重叠但不相同。熟练技术人员应认识到，在设计DDD的序列变异体时，最优选的是避免改变最保守的残基(斜体)，且优选还避免改变保守残基(加下划线)，而既未加下划线也不是斜体的残基可考虑进行保守氨基酸取代。
SHIQIPPGETELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：1)
基于Carr等(2001)的数据，DDD1(SEQIDNO：1)序列的一组经修饰保守氨基酸取代示于表5中。即使在这一组经取代序列有所减少的情况下，本领域技术人员也在不进行过度实验的情况下产生、测试并使用了超过65,000个可能的替代性DDD部分序列。熟练技术人员可以容易获得此类替代性DDD氨基酸序列，如以上表2和表3所公开。
表5.DDD1(SEQIDNO：1)中的保守氨基酸取代。共有序列公开为SEQIDNO：89。
熟练技术人员应将认识到，使用本领域中标准的技术和仅常规的实验，DDD或AD氨基酸序列中的这些和其它氨基酸取代可用于产生AD或DDD部分种类内的替代物质。
氨基酸取代
在替代实施方案中，所公开的方法和组合物可涉及产生和使用具有一个或多个取代氨基酸残基的蛋白质或肽。举例来说，用于制备DNLTM构建体的DDD和/或AD序列可如以上所论述加以修饰。
熟练技术人员应意识到，一般来说，氨基酸取代典型地涉及将氨基酸置换为具有相对类似性质的另一种氨基酸(即，保守氨基酸取代)。各种氨基酸的性质和氨基酸取代对蛋白质结构和功能的效应在本领域中是广泛研究和知识的主题。
举例来说，可以考虑氨基酸的亲水性指数(Kyte和Doolittle，1982，J.Mol.Biol.，157：105-132)。氨基酸的相对亲水性特征有助于所得蛋白质的次级结构，这又限定了蛋白质与其它分子的相互作用。已经基于其疏水性和电荷特征来指定各氨基酸的亲水性指数(Kyte和Doolittle，1982)，这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。在进行保守取代时，使用其亲水性指数在±2内的氨基酸是优选的，在±1内是更优选的，且在±0.5内是甚至更优选的。
氨基酸取代还可考虑氨基酸残基的亲水性(例如，美国专利号4,554,101)。已指定氨基酸残基的亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0)；谷氨酸(+3.0)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。将氨基酸置换为具有类似亲水性的其它氨基酸是优选的。
其它考虑因素包括氨基酸侧链的大小。举例来说，用诸如甘氨酸或丝氨酸的紧凑侧链、用例如色氨酸或酪氨酸的具有庞大侧链的氨基酸置换氨基酸总体上不是优选的。还考虑了各种氨基酸残基对于蛋白质次级结构的效应。通过实验研究，已经确定了不同的氨基酸残基对蛋白质结构域采用α-螺旋、β-薄片或反转次级结构的倾向性的效应，且在本领域中是已知的(参见例如Chou和Fasman，1974，Biochemistry，13：222-245；1978，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276；1979，Biophys.J.，26：367-384)。
基于此类考虑因素和广泛实验研究，已经构建了保守氨基酸取代的表格且在本领域中是已知的。举例来说：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。替代地：Ala(A)leu、ile、val；Arg(R)gln、asn、lys；Asn(N)his、asp、lys、arg、gln；Asp(D)asn、glu；Cys(C)ala、ser；Gln(Q)glu、asn；Glu(E)gln、asp；Gly(G)ala；His(H)asn、gln、lys、arg；Ile(I)val、met、ala、phe、leu；Leu(L)val、met、ala、phe、ile；Lys(K)gln、asn、arg；Met(M)phe、ile、leu；Phe(F)leu、val、ile、ala、tyr；Pro(P)ala；Ser(S)、thr；Thr(T)ser；Trp(W)phe、tyr；Tyr(Y)trp、phe、thr、ser；Val(V)ile、leu、met、phe、ala。
氨基酸取代的其它考虑因素包括残基是位于蛋白质内部或是暴露于溶剂。对于内部残基，保守取代将包括：Asp和Asn；Ser和Thr；Ser和Ala；Thr和Ala；Ala和Gly；Ile和Val；Val和Leu；Leu和Ile；Leu和Met；Phe和Tyr；Tyr和Trp。(参见例如PROWL网站rockefeller.edu)对于溶剂暴露残基，保守取代将包括：Asp和Asn；Asp和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和Asn；Ala和Pro；Ala和Gly；Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr；Lys和Arg；Val和Leu；Leu和Ile；Ile和Val；Phe和Tyr。(同上)已经构建了有助于选择氨基酸取代的各种矩阵，诸如PAM250评分矩阵、Dayhoff矩阵、Grantham矩阵、McLachlan矩阵、Doolittle矩阵、Henikoff矩阵、Miyata矩阵、Fitch矩阵、Jones矩阵、Rao矩阵、Levin矩阵和Risler矩阵(同上)。在确定氨基酸取代时，还可能考虑分子间或分子内键的存在，诸如形成带正电残基(例如，His、Arg、Lys)与带负电残基(例如，Asp、Glu)之间的离子键(盐桥)或相邻半胱氨酸残基之间的二硫键。
将任何氨基酸取代为所编码的蛋白质序列中的任何其它氨基酸的方法对于熟练技术人员是熟知的且实际上是常规实验，例如通过定点诱变技术或通过合成并组装编码氨基酸取代的寡核苷酸并剪接于表达载体构建体中。
治疗剂
在替代实施方案中，可使用治疗剂，诸如细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前药、毒素、酶或其它药剂，其与标的目标bsAb、ADC和/或抗体缀合，或在bsAb、ADC和/或抗体之前、同时或之后个别地施用。所使用的药物可具有选自以下的药学性质：抗有丝分裂剂、抗激酶剂、烷基化剂、抗代谢物剂、抗生素剂、生物碱、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂和其组合。
可用的示例性药物可以包括但不限于5-氟尿嘧啶、阿法替尼、阿普立定、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类、阿西替尼、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀、争光霉素、硼替佐米、博舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、亚硝脲氮芥、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、camptothecans、克唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、地尼西宝、多西他赛、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、2-吡咯啉并多柔比星(2P-DOX)、氰基吗啉基多柔比星、多柔比星葡萄糖醛酸苷、表柔比星葡萄糖醛酸苷、埃罗替尼、雌氮芥、表鬼臼毒素、埃罗替尼、恩替诺特、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡萄糖醛酸苷、依托泊苷磷酸盐、依西美坦、芬戈莫德、氟尿苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度、福他替尼、吉尼替比、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼、伊达比星、艾代拉利司、异环磷酰胺、伊马替尼、L-天冬酰胺酶、拉帕替尼、来那度胺、甲酰四氢叶酸、LFM-A13、环己亚硝脲、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、氨甲蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、来那替尼、尼罗替尼、亚硝基脲、奥拉帕尼、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、索拉非尼、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼、它莫西芬、替莫唑胺(DTIC的水溶液形式)、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶芥、瓦他拉尼、长春瑞滨、长春花碱、长春新碱、长春花生物碱和ZD1839。
所使用的毒素可包括蓖麻毒素、相思子毒素、肥皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)(例如豹蛙酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。
有用的趋化因子可以包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。
在某些实施方案中，可以使用抗血管生成剂，诸如制管张素、杆抑素、癌抑素、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体、抗PlGF肽和抗体、抗血管生长因子抗体、抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体和肽、抗Kras抗体、抗-cMET抗体、抗MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)抗体、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素-12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白质、羧胺三唑、CM101、马立马司他、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素-2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺(罗喹美克)、沙利度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑素、紫杉醇、蛇毒解离素、制管张素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。
所使用的免疫调节剂可以选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素和其组合。特别适用者为淋巴毒素，诸如肿瘤坏死因子(TNF)；造血因子，诸如白介素(IL)；集落刺激因子，诸如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；干扰素，诸如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-λ；和干细胞生长因子，诸如称为“S1因子”者。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝细胞生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒氏管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整合素；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；红细胞生长素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，诸如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit配体或FLT-3、制管张素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子和LT。
有用的放射性核素包括但不限于-111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au、211Pb和227Th。治疗性放射性核素优选具有在20keV至6,000keV范围内的衰变能量，对于俄歇发射体，优选在60keV至200keV范围内；对于β发射体，100keV至2,500keV；且对于α发射体，4,000keV至6,000keV。可用β粒子发射核素的最大衰变能优选为20-5,000keV，更优选为100-4,000keV，且最优选为500-2,500keV。实质上随俄歇发射粒子衰变的放射性核素也是优选的。举例来说，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。可用β粒子发射核素的衰变能优选地＜1,000keV，更优选地＜100keV，且最优选地＜70keV。实质上随α粒子产生而衰变的放射性核素也是优选的。此类放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213、Th-227和Fm-255。可用α粒子发射放射性核素的衰变能优选为2,000-10,000keV，更优选为3,000-8,000keV，且最优选为4,000-7,000keV。额外的潜在可用放射性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等等。一些可用的诊断核素可包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94Tc、94mTc、99mTc或111In。
治疗剂可以包括光活性剂或染料。荧光组合物(诸如荧光体)和其它色原体或染料(诸如对可见光敏感的卟啉)已经通过将适合的光引导至病变而用来检测并治疗病变。在治疗中，这被称为光辐射、光疗法或光动力学疗法。参见Jori等(编)，PHOTODYNAMICTHERAPYOFTUMORSANDOTHERDISEASES(LibreriaProgetto1985)；vandenBergh，Chem.Britain(1986)，22：430。此外，已经将单克隆抗体与光活化的染料偶联以实现光疗法。参见Mew等，J.Immunol.(1983)，130：1473；同上，CancerRes.(1985)，45：4380；Oseroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)，83：8744；同上，Photochem.Photobiol.(1987)，46：83；Hasan等，Prog.Clin.Biol.Res.(1989)，288：471；Tatsuta等，LasersSurg.Med.(1989)，9：422；Pelegrin等，Cancer(1991)，67：2529。
其它可用治疗剂可以包含寡核苷酸，尤其是优选地针对诸如bcl-2或p53的致癌基因和致癌基因产物的反义寡核苷酸。治疗性寡核苷酸的优选形式是siRNA。熟练技术人员应认识到任何siRNA或干扰RNA种类都可以连接于抗体或其片段用于递送至所靶向的组织。针对多种标靶的许多siRNA物质在本领域中是已知的，且在要求保护的方法和组合物中可利用任何此类已知siRNA。
有可能使用的已知siRNA物质包括对以下各项具有特异性的那些：IKK-γ(美国专利7,022,828)；VEGF、Flt-1和Flk-1/KDR(美国专利7,148,342)；Bcl2和EGFR(美国专利7,541,453)；CDC20(美国专利7,550,572)；转导蛋白(β)样蛋白3(美国专利7,576,196)；KRAS(美国专利7,576,197)；碳酸酐酶II(美国专利7,579,457)；补体组分3(美国专利7,582,746)；白介素-1受体相关激酶4(IRAK4)(美国专利7,592,443)；存活蛋白(美国专利7,608,7070)；超氧化物歧化酶1(美国专利7,632,938)；MET原癌基因(美国专利7,632,939)；淀粉样蛋白β驱体前体蛋白(APP)(美国专利7,635,771)；IGF-1R(美国专利7,638,621)；ICAM1(美国专利7,642,349)；补体因子B(美国专利7,696,344)；p53(7,781,575)和载脂蛋白B(7,795,421)，各参考专利的实施例部分以引用的方式并入本文中。
其它siRNA物质可得自已知的商业来源，诸如Sigma-Aldrich(StLouis，MO)、Invitrogen(Carlsbad，CA)、SantaCruzBiotechnology(SantaCruz，CA)、Ambion(Austin，TX)、Dharmacon(ThermoScientific，Lafayette，CO)、Promega(Madison，WI)、MirusBio(Madison，WI)和Qiagen(Valencia，CA)以及许多其它来源。siRNA物质的其它可公开获得的来源包括位于斯德哥尔摩生物信息学中心的siRNAdb数据库、MIT/ICBPsiRNA数据库、位于博得研究院的RNAi联合shRNA文库和位于NCBI的探针数据库。举例来说，在NCBI探针数据库中存在30,852种siRNA物质。熟练技术人员应认识到，对于任何目标基因，或者已对siRNA物质进行了设计，或者其可使用可公开获得的软件工具进行容易地设计。任何此类siRNA物质都可以使用标的目标DNLTM复合物进行递送。
治疗性治疗方法
各种实施方案涉及治疗受试者，诸如哺乳动物，包括人、驯养或伴侣宠物，诸如犬和猫的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的细胞毒性剂和/或免疫调节剂的组合。
施用细胞毒性bsAb、ADC和/或检查点抑制子抗体可补充以同时或依序施用治疗有效量的与靶细胞表面上的另一个抗原结合或反应的另一种抗体。优选额外MAb包括选自以下的至少一种人源化、嵌合或人类MAb：与CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD70、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD95、CD126、CD133、CD138、CD154、CEACAM5、CEACAM6、B7、AFP、PSMA、EGP-1、EGP-2、碳酸酐酶IX、PAM4抗原、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、Ia、MIF、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、Flt-3、VEGFR、PlGF、ILGF、IL-6、IL-25、腱生蛋白、TRAIL-R1、TRAIL-R2、补体因子C5、致癌基因产物或其组合反应的MAb。所使用的各种抗体，诸如抗CD19、抗CD20和抗CD22，是本领域技术人员已知的。参见例如Ghetie等，CancerRes.48：2610(1988)；Hekman等，CancerImmunol.Immunother.32：364(1991)；Longo，Curr.Opin.Oncol.8：353(1996)；美国专利号5,798,554、6,187,287、6,306,393、6,676,924、7,109,304、7,151,164、7,230,084、7,230,085、7,238,785、7,238,786、7,282,567、7,300,655、7,312,318、7,501,498、7,612,180、7,670,804；以及美国专利申请公布号20080131363、20070172920、20060193865和20080138333，各自的实施例部分以引用的方式并入本文中。
组合疗法可进一步补充以同时或依序施用至少一种其它治疗剂。举例来说，“CVB”(1.5g/m2环磷酰胺、200-400mg/m2依托泊苷和150-200mg/m2卡莫司汀)是用于治疗非何杰金氏淋巴瘤的方案。Patti等，Eur.J.Haematol.51：18(1993)。其它合适的组合化学治疗方案是本领域技术人员所熟知的。参见例如Freedman等，“Non-Hodgkin′sLymphomas”，CANCERMEDICINE，第2卷，第3版，Holland等(编)，第2028-2068页(Lea&Febiger1993)。作为说明，用于治疗中级非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化学治疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和泼尼松)和CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)。可用的第二代化学治疗方案是m-BACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和甲酰四氢叶酸)，而合适的第三代方案是MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和甲酰四氢叶酸)。其它可用药物包括丁酸苯酯、苯达莫司汀和苔藓抑素-1。
治疗剂组合可根据已知方法进行配制以制备药学上可用的组合物，由此将bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制子抗体与药学上合适的赋形剂组合成混合物。无菌磷酸盐缓冲生理盐水是药学上合适的赋形剂的一个实例。其它合适的赋形剂是本领域技术人员熟知的。参见例如Ansel等，PHARMACEUTICALDOSAGEFORMSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS，第5版(Lea&Febiger1990)；和Gennaro(编)，REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES，第18版(MackPublishingCompany1990)和其修订版。
目标bsAb、ADC、干扰素和/或抗体可以经配制以经由例如推注或连续输注用于静脉内施用。优选地，bsAb、ADC和/或抗体输注持续少于约4个小时的时间，且更优选地持续少于约3个小时的时间。举例来说，第一次推注可在30分钟，优选地甚至15分钟内输注，且其余部分在接下来的2-3小时内输注。注射制剂可以呈单位剂型提供，例如，在安瓿或多剂量容器中，其中添加防腐剂。组合物可采用诸如于油性或水性媒剂中的混悬液、溶液或乳液的形式，并且可含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。替代地，活性成分可呈在使用前用合适的媒剂(例如无菌无热原质水)复原的粉末形式。
可以采用额外药学方法来控制治疗组合的作用持续时间。可以通过使用聚合物以复合或吸附欲施用的药剂来制备控制释放制剂。举例来说，生物相容性聚合物包括聚(乙烯-乙酸乙烯酯)共聚物基质和硬脂酸二聚体与癸二酸的聚酐共聚物基质。Sherwood等，Bio/Technology10：1446(1992)。从此类基质释放的速率取决于治疗剂的分子量、基质内的药剂的量，和分散粒子的大小。Saltzman等，Biophys.J.55：163(1989)；Sherwood等，同上。其它固体剂型描述于以下文献中：Ansel等，PHARMACEUTICALDOSAGEFORMSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS，第5版(Lea&Febiger1990)；以及Gennaro(编)，REMINGTON’SPHARMACEUTICALSCIENCES，第18版(MackPublishingCompany1990)和其修订版。
bsAb、干扰素和/或检查点抑制子抗体可以经皮下或甚至通过其它肠胃外途径，诸如经静脉内、肌肉内、腹膜内或血管内施用于哺乳动物。ADC可以经静脉内、腹膜内或血管内施用。此外，施用可以通过连续输注或通过单次或多次推注来进行。优选地，bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制子抗体输注持续少于约4个小时的周期，且更优选持续少于约3个小时的周期。
更一般来说，bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制子抗体用于人类的施用剂量将取决于诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般医学病状和既往病史的因素而变化。可能需要给接受者提供在约1mg/kg至25mg/kg范围内的作为单次静脉输注的bsAb、ADC素和/或抗体剂量，但也可以施用较低或较高的剂量，视情况决定。举例来说，对于70kg患者，1-20mg/kg的剂量是70-1,400mg，或对于1.7m患者，41-824mg/m2。需要时剂量可以重复，例如每周一次持续4-10周、每周一次持续8周或每周一次持续4周。在维持疗法中，需要时其还可以较低频率给予，诸如每隔一周一次持续若干个月，或者每月或每季度一次持续许多个月。
替代地，bsAb、ADC和/或检查点抑制子抗体可以按照每2周或3周一个剂量施用，总共重复至少3个剂量。或者，所述组合可以每周施用2次，持续4至6周。如果使剂量降至约200-300mg/m2(对于1.7m患者是每剂340mg，或对于70kg患者是4.9mg/kg)，则其可每周施用一次或甚至两次持续4至10周。替代地，给药时程可减少，即，每2或3周一次持续2-3个月。然而已经确定，甚至可通过缓慢i.v.输注施用甚至更高的剂量，诸如20mg/kg每周一次或每2-3周一次，用于重复给药循环。给药时程可任选地以其它间隔重复，且剂量可在对剂量和时程进行适当调节的情况下通过各种胃肠外途径给予。
本领域技术人员应认识到，尽管上文所论述的给药时程是关于ADC、bsAb和/或mAb，但干扰素药剂应以实质上较低的剂量施用以避免全身毒性。干扰素(诸如PEGINTERFERON)用于人类的剂量更典型地在微克范围内，例如可以使用180μgs.c.每周一次，或100至180μg，或135μg，或135μg/1.73m2，或90μg/1.73m2，或250μgs.c.每隔一天一次，视干扰素类型而定。
尽管bsAb、干扰素、ADC和/或检查点抑制子抗体可以周期性推注形式施用，但在替代实施方案中，bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制子抗体可以通过连续输注来施用。为了增加Cmax且延伸治疗剂在血液中的PK，连续输注可以例如通过留置导管来施用。此类设备在本领域中是已知的，诸如或导管(参见例如Skolnik等，TherDrugMonit32：741-48，2010)，并且可以使用任何此类已知留置导管。各种连续输注泵在本领域中也是已知的并且可使用任何此类已知输注泵。连续输注的剂量范围可以在0.1与3.0mg/kg/天之间。更优选地，bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制子抗体可以通过在2至5小时，更优选地2-3小时的相对较短周期内经静脉内输注来施用。
在优选的实施方案中，药剂组合对癌症疗法是有用的。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血病、骨髓瘤或淋巴恶性疾病。此类癌症的更特定实例如下所述且包括：鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、尤因氏肉瘤、韦尔姆斯氏肿瘤、星形细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌或胃部癌症(包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、肝细胞癌瘤、神经内分泌肿瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺分化癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、阴门癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如细胞未迁移至受试者体内除原始恶性病或肿瘤部位以外的部位的肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如由转移，即，恶性细胞或肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的次级部位而产生的肿瘤)。得益于本发明的治疗方法的癌症涉及表达、过度表达或异常表达IGF-1R的细胞。
癌症或恶性病的其它实例包括但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人何杰金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性淋巴瘤、成人非何杰金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关性淋巴瘤、AIDS相关性恶性病、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外胚细胞瘤、儿童何杰金氏病、儿童何杰金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非何杰金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤因氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、高歇氏病、胆囊癌、胃部癌、胃肠道良性肿瘤、胃肠道肿瘤、胚细胞瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、何杰金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波济氏肉瘤、肾癌、喉癌、唇口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性原发灶隐匿性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、骨髓发育不良综合症、髓细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非何杰金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、转移性原发灶隐匿性鳞状颈癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨骼的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢胚细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、病变蛋白血症、真性红细胞增多症、副甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉状瘤病肉瘤、塞扎里综合症、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行迁移细胞癌、移行迁移肾盂和输尿管癌、滋养层细胞瘤、输尿管和肾盂细胞癌、输尿管癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、阴门癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、韦尔姆斯氏瘤和位于以上所列出的器官系统中的除赘瘤以外任何其它过度增生性疾病。
本文中所描述和要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或恶变前病状和预防进展成赘生性或恶性状态，包括但不限于上文所描述的那些病症。指示此类用途用于已知或疑似提前进展成赘瘤或癌症的病状，特别是在已发生由增生、化生或最特别的是发育不良组成的非赘生性细胞生长的情况下(关于此类异常生长病状的综述，参见Robbins和Angell，BASICPATHOLOGY，第2版，W.B.SaundersCo.，Philadelphia，第68-79页(1976))。
发育不良往往是癌症的前兆，并且主要发现于上皮中。它是非赘生性细胞生长的最无序形式，涉及个别细胞一致性和细胞结构定向的丧失。在存在慢性刺激或炎症的情况下，特征性地发生发育不良。可以治疗的发育不良病症包括但不限于：无汗性外胚层发育不良、前面部发育不良、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良、支气管肺发育不良、大脑发育不良、宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不良、先天性外胚层发育不良、颅骨干发育不良、颅腕跗发育不良、颅骨干骺端发育不良、牙本质发育不良、骨干结构不良、外胚层发育不良、牙釉质发育不良、脑性眼球发育不全、偏侧骨骺发育不良、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮异常增生、面指生殖器发育不良、家族性颌骨纤维性发育不良、家族性白色皱褶性发育不良、纤维肌肉发育不良、骨纤维性结构不良、旺盛骨性发育不良、遗传性肾视网膜发育不良、有汗性外胚层发育不良、少汗性外胚层发育不良、淋巴细胞减少性胸腺发育不良、乳腺发育不良、下颌骨颜面发育不良、干骺端发育不良、蒙蒂尼氏发育不良、单骨纤维性骨发育不良、粘液上皮发育不良、多发性骨骺发育不良、眼耳脊椎发育不良、眼齿指发育不良、眼椎骨发育不全、牙原性发育不良、眼下颌骨发育不良、根尖周牙骨质结构不良、多骨纤维性结构不良、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良、视网膜发育不良、中隔-眼发育不良、脊椎骨骺发育不良和脑室径向发育不良。
可以治疗的其它赘生前病症包括但不限于良性异常增生性病症(例如良性肿瘤、纤维囊性病状、组织肥大、肠息肉或腺瘤和食道发育不良)、粘膜白斑病、角化病、博文氏病、农夫皮肤、日光性唇炎和日光性角化病。
在优选的实施方案中，使用本发明的方法抑制癌症，特别是上文所列出的癌症的生长、进展和/或转移。
其它过度增生性疾病、病症和/或病状包括但不限于恶性病和相关病症的进展和/或转移，诸如白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓细胞性白血病(包括成骨髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例如慢性骨髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如何杰金氏病和非何杰金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体肿瘤，包括但不限于肉瘤和癌瘤，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、韦尔姆斯氏瘤、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
表达载体
其它实施方案可以涉及包含编码抗体、抗体片段、细胞因子或诸如DNLTM构建体的bsAb组成融合蛋白质的核酸的DNA序列。融合蛋白质可以包含连接于例如AD或DDD部分的抗体或片段或细胞因子。
各种实施方案涉及包含编码DNA序列的表达载体。载体可以含有编码人免疫球蛋白的轻链和重链恒定区和铰链区的序列，其可以连接嵌合、人源化或人可变区序列。载体可另外含有在选定宿主细胞中表达所编码的蛋白质的启动子、增强子和信号或前导序列。尤其适用的载体是pdHL2或GS。更优选地，轻链和重链恒定区和铰链区可以来自人EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中任选地，同种异型位置上的至少一个氨基酸变成在不同的IgG1同种异型中发现的氨基酸，且其中任选地，基于EU编号系统的EU重链氨基酸253可置换成丙氨酸。参见Edelman等，Proc.Natl.Acad.SciUSA63：78-85(1969)。在其它实施方案中，IgG1序列可转化成IgG4序列。
本领域技术人员应认识到基因工程改造表达构建体且插入宿主细胞中以表达经过工程改造的蛋白质的方法在本领域中是熟知的且实际上是常规实验。宿主细胞和克隆抗体或片段的表达方法描述于例如美国专利号7,531,327、7,537,930、7,785,880、8,076,410、8,153,433和8,372,603中，各自的实施例部分以引用的方式并入本文中。
试剂盒
各种实施方案可涉及含有适合治疗或诊断患者的患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可以含有如本文中所描述的一种或多种bsAb、ADC、干扰素和/或检查点抑制子抗体。如果未配制含有供施用的多种组分的组合物以便经由消化道递送，诸如通过口服递送，则可以包括能够通过一些其它途径递送试剂盒组分的装置。用于诸如肠胃外递送的应用的一种类型装置是注射器，其用于将组合物注入受试者体内。还可以使用吸入装置。在某些实施方案中，治疗剂可以呈含有无菌液体制剂或冻干制剂的预填充式注射器或自动注射笔形式提供。
试剂盒组分可以包装在一起或分隔于两个或更多个容器中。在一些实施方案中，容器可以是含有适合于复原的组合物的无菌冻干制剂的小瓶。试剂盒还可以含有一种或多种适合于复原和/或稀释其它试剂的缓冲液。可以使用的其它容器包括但不限于袋、盘、盒、管等等。试剂盒组分可以无菌包装和维持于容器中。可以包括的另一个组件是给试剂盒使用者的说明书。
实施例
提供以下实施例以说明但不限制本发明的权利要求。
实施例1.T-细胞重定向双特异性抗体DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合物
若干种类的示例性白细胞重定向双特异性抗体制备为DNLTM复合物，如以下所描述。所述复合物有效诱导针对适当靶细胞的免疫应答。
材料和方法
用于制备和使用DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合物的一般技术描述于以下实施例中。具有CD3和CD19结合位点的示例性白细胞重新定向双特异性抗体制备为DNLTM复合物，其被称为(19)-3s(图1)。通过Fd链的羧基末端上的二聚和对接结构域(DDD2)的重组融合来构建抗CD19F(ab)2DNL模块。在添加锚定结构域(AD2)的情况下由Okt3mAb来设计抗CD3-scFv模块，且以格式VH-L1-VK-L2-6H-L3-AD2(公开为SEQIDNO：105的“6H”)组装，其中经由柔性肽连接子融合V结构域且AD2肽前面是6-His连接子(SEQIDNO：105)。抗CD3可变区、连接子和AD2的序列如下所示。
抗CD3scFv的VH序列
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSS(SEQIDNO：96)
L1连接子
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO：97)
抗CD3scFv的VK序列
DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWTYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIKR(SEQIDNO：98)
L2连接子
GGGGS(SEQIDNO：99)
Poly-His-L3连接子
HHHHHHGGGSG(SEQIDNO：100)
AD2
CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQIDNO：101)
表达载体和DNL TM 模块-构建包含连接于抗CD3抗体部分的针对各种疾病相关抗原的抗体部分的DNLTM复合物，一般缩写为(X)-3sbsAb。对于用于制备(X)-3sbsAb的各DNLTM模块，在SpESFX-10小鼠骨髓瘤细胞中开发独立生产细胞系(Rossi等，2011，BiotechnolProg27：766-75)。合成编码Okt3scFv-AD2多肽的cDNA序列(SEQIDNO：96-101)且经由5′XbaI和3′EagI限制位点克隆至pdHL2表达载体中。所述构建体包含与scFv中的VL融合的VH结构域，其具有结构VH-L1-VK-L2-6H-L3-AD2(公开为SEQIDNO：105的“6H”)。所表达的蛋白质具有来自原始Okt3mAb的两个氨基酸取代。将CDR-H3中的半胱氨酸残基变成丝氨酸(Kipryanov，1997，JImmunolMethods200：69-77)。将VL中倒数第二个残基由天冬氨酸变成赖氨酸。
将Okt3scFv-AD2模块与各种CH1-DDD2-Fab模块组合以产生一组(X)-3s三价bsAb(表6)。如先前针对类似构建体所描述来构建CH1-DDD2-Fab-pdHL2表达载体(Rossi等，2008，CancerRes68：8384-92)。简而言之，通过用SacII和EagI限制酶切除CH1-铰链-CH2-CH3结构域的编码序列且置换为用相同酶从CH1-DDD2-Fab-hA20-pdHL2表达载体(Rossi等，2008，CancerRes68：8384-92)切下的CH1-DDD2的507bp编码序列而由相应的IgG-pdHL2表达载体产生编码CH1-DDD2-Fab的表达载体。CH1-DDD2-Fab模块来源于人源化mAbhA19(抗CD19)、拉贝珠单抗(hMN-14、抗CEACAM5)、克里伏单抗(hPAM4、抗粘蛋白)、hMN-15(抗CEACAM6)、hRS7(抗TROP-2)、维妥珠单抗(hA20、抗CD20)、hL243(抗HLA-DR)和依帕珠单抗(hLL2、抗CD22)。被称为hA19的mAb是由小鼠抗CD19mAbB43人源化(Uckun等，1988，Blood71：13-29)。各表达载体通过用SalI限制酶消化来进行线性化，且用于通过电穿孔来转染SpESFX-10细胞。
在含有0.2μM甲氨喋呤(MTX)的培养基中选择克隆且通过ELISA筛选蛋白质表达。将Okt3scFv-AD2俘获在Ni-NTAHisSorb板(Qiagen)上，且用抗-AD2mAb检测。用山羊抗人κ链捕获CH1-DDD2-Fab模块，且用山羊抗人F(ab′)2-HRP检测。通过逐步增加MTX浓度直至3μM来扩增蛋白质表达的生产力。通过亲和色谱法，分别使用和κ选择树脂将Okt3scFv-AD2和CH1-DDD2-Fab模块从滚瓶培养物的肉汤中纯化至均质。使用DNLTM法经由摩尔当量Okt3scFv-AD2与CH1-DDD2-Fab模块的位点特异性缀合来组装(X)-3sbsAb。举例来说，通过将22mgOkt3scFv-AD2与80mgCH1-DDD2-Fab-hA19组合来产生大约100mg(19)-3s。在室温下用1mM还原型谷胱甘肽将混合物还原过夜，随后加入2mM氧化谷胱甘肽。通过使用κ选择和的连续亲和色谱法从反应混合物中纯化(19)-3s。按照类似方法，在不同的规模下组装其它(X)-3s构建体。
表6.(X)-3sDNLTM构建体
代码 靶标 CH1-DDD2-Fab AD2-抗-CD3
(19)-3s CD19 CH1-DDD2-Fab-hA19 scFv-AD2-Okt3
(20)-3s CD20 CH1-DDD2-Fab-hA20 scFv-AD2-Okt3
(22)-3s CD22 CH1-DDD2-Fab-hLL2 scFv-AD2-Okt3
(C2)-3s HLA-DR CH1-DDD2-Fab-hL243 scFv-AD2-Okt3
(M1)-3s MUC5AC CH1-DDD2-Fab-hPAM4 scFv-AD2-Okt3
(14)-3s CEACAM5 CH1-DDD2-Fab-hMN-14 scFv-AD2-Okt3
(15)-3s CEACEAM6 CH1-DDD2-Fab-hMN-15 scFv-AD2-Okt3
(E1)-3s TROP-2 CH1-DDD2-Fab-hRS7 scFv-AD2-Okt3
分析方法-使用具有BioSuiteTM250、4μmUHRSEC柱的AllianceHPLC系统(WatersCorp)进行尺寸排阻高效液相色谱(SE-HPLC)。利用1200系列HPLC联合6210TOFMS(AgilentTechnologies，SantaClara，CA)来进行电喷雾电离飞行时间(ESI-TOF)液相色谱/质谱法(LC-MS)。在60℃下，使用30-80％乙腈/0.1％甲酸水溶液的14分钟梯度，利用Aeris宽孔3.6μmC4柱(Phenomenex)，通过逆相HPLC(RP-HPLC)拆分(19)-3s。对于TOFMS，毛细管和碰撞电压分别设定于5500和300V。
细胞系和试剂-Raji、Ramos、Daudi、LS174T和Capan-1细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，MD)，且Nalm-6细胞购自DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellinien(DSMZ，Braunchweig，Germany)。除了Capan-1以外，所有细胞系都维持于含有10％FBS、1％L-谷氨酰胺、1％青霉素-链霉素和1％MEM非必需氨基酸的RPMI-1640中。用20％FBS维持Capan-1细胞。所有细胞培养基和补充物都购自LifeTechnologies(Carlsbad，CA)。
PBMC和T细胞分离-使用UNI-SEPMAXI管(Novamed，Ltd，Jerusalem，Israel)从供体全血(NJ血站，EastOrange，NJ)纯化人外周血单核细胞(PBMC)。根据制造商方案，通过使用PanT细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec，Auburn，CA)进行阴性选择而从PBMC中分离CD3阳性T细胞。在用抗CD3-PE抗体将经过富集的T细胞染色之后，通过FACS评估T细胞分离效率。在一些情况下，还用CD-19和CD-14进行进一步染色来鉴别污染细胞。
T细胞活化-将分离的T细胞以2.25×106个细胞/孔的最终密度涂覆于6孔组织培养板中。将Daudi细胞以1.5×106个细胞/孔的最终密度加入一些孔，其它孔保持仅含T细胞。替代地，将PBMC以6×106个细胞/孔的最终细胞密度加入6孔组织培养板。使各孔的体积达到3mL。向适当的孔中加入3ng/mL的(19)-3s、(M1)-3s或(19)-DDD2。在37℃下孵育过夜之后，取出1mL的各样品。使细胞球团化且在冰上用CD69-APC和CD3-PE标记20分钟。用含1％BSA的PBS将细胞洗涤2次且使用FACSCALIBERTM流式细胞仪(BDBiosciences，SanJose，CA)加以分析。
T细胞增殖-将PBMC以1×106个细胞/毫升的浓度播种于含有指定试剂的T25烧瓶中。对于B细胞耗竭的烧瓶，根据制造商方案通过使用得自Miltenyi的B细胞分离试剂盒进行阴性选择来移除B细胞。在选择当天，从各烧瓶中取出100μL培养基，在冰上用抗CD7-APC标记20分钟，洗涤一次且再悬浮于含7-AAD的300μL1％BSA/PBS中。对于各样品，使用FACSCALIBERTM流式细胞仪来分析整个体积。各样品重复计数两次。使用FlowJo软件进行分析。对于各样品，去除死亡(7-AAD+)细胞和残骸(基于前向相比于侧向分散)。最后，选择活的CD7+细胞且使用Prism软件作图。
细胞结合测定(Jurkat/Capan-1)-用PKH26红色荧光细胞连接子试剂盒(Sigma)根据制造商方案将Jurkat细胞染色。用5μMCFSE(羧基荧光素双乙酸琥拍酰亚胺基酯，LifeTechnologies)根据制造商方案将Capan-1细胞染色。将经过标记的Capan-1细胞加入8孔腔室载玻片(ThermoWaltham，MA)且允许连接过夜。第二天，取出培养基且加入处于含有0.1μg/mL(E1)-3s、(M1)-3s或(19)-3s的培养基中的经PKH26-标记的Jurkat细胞。在37℃下孵育1小时之后，用PBS洗涤载玻片以移除任何未结合的细胞且通过荧光显微术来观察。
细胞结合测定(Jurkat/Daudi)-分别用抗CD3-PE和抗CD20-FITC来标记Jurkat和Daudi细胞。随后在室温下将经过标记的细胞以2.5∶1比率与0.1μg/mL(19)-3s共同孵育30分钟。随后通过荧光显微术来观察细胞的等分试样。
细胞毒性测定(血液肿瘤细胞系)-用PKH67绿色荧光细胞连接子试剂盒(Sigma)根据制造商方案来标记靶细胞。简而言之，使5×106个靶细胞再悬浮于250μL稀释剂C中。在第二个管中，将1μLPKH26染料加入250μL稀释剂C。随后将细胞悬浮液加入染料溶液，充分混合且在室温下孵育2分钟。通过加入相等体积的FBS淬灭反应物。随后用完全RPMI将经过标记的细胞洗涤3次。在未刺激的情况下，使用经分离的T细胞作为效应细胞。将效应细胞和经PKH67标记的靶细胞以10∶1比率组合且涂覆于含有(19)-3s或(14)-3s的连续稀释的48孔板中。各孔含有5×104个靶细胞和5×105个效应细胞。在20％RPMI中进行Jeko-1测定。在含有5％CO2的37℃孵育箱中将板孵育18-24小时。在孵育之后，将所有细胞从48孔板中移入流式细胞仪管中，且再悬浮于含有1μg/mL7AAD(以区分活细胞与死细胞)和30,000个COUNTBRIGHTTM绝对计数珠粒(LifeTechnologies)的1％BSA/PBS中。在FACSCALIBERTM流式细胞仪上分析细胞。对于各样品，8,000个COUNTBRIGHTTM珠粒计数作为标准化参考。使用FlowJo软件(Treestar，Inc.，Ashland，OR)来分析数据。对于各样品，排除死细胞和残骸且对总活靶细胞进行计数。
细胞毒性测定(实体肿瘤细胞系)-按照与用PKH23染色相同的程序，用PKH67绿色荧光细胞连接子试剂盒(Sigma)来标记靶细胞。所使用的效应细胞如下：对于Capan-1测定，使用从CD8+富集柱(R&DSystems，Minneapolis，MN)纯化之后的CD8+富集T细胞。对于LS174T细胞：使用在含有25U/mLIL-2和50ng/mLOkt3Mab的培养基将PBMC孵育5天之后，随后在含有单独25U/mLIL-2的培养基中孵育2天的经过刺激的T细胞。将效应细胞和经PKH67标记靶细胞以3∶1比率组合(5×104个靶细胞和1.5×105个效应细胞/孔)，且涂覆于含有(E1)-3s、(14)-3s或(19)-3s的连续稀释液的48孔板上。在20％RPMI中进行Capan-1测定。在含有5％CO2的37℃孵育箱中将板孵育42-48小时。孵育之后，将悬浮细胞与来自所有孔的经胰酶消化的连接细胞组合且转移至流式细胞仪管中。将细胞洗涤一次且再悬浮于含有1ug/mL7AAD(以区分活细胞与死细胞)和30,000个COUNTBRIGHTTM绝对计数珠粒的1％BSA/PBS中。在FACSCALIBERTM流式细胞仪上分析细胞。对于各样品，8,000个COUNTBRIGHTTM珠粒计数为标准化参考。使用FlowJo软件(Treestar，Inc.，Ashland，OR)来分析数据。对于各样品，排除死细胞和残骸且对总活靶细胞进行计数。
体内效力-8周龄雌性NOD/SCID小鼠是购自CharlesRiver(Wilmington，MA)。向小鼠s.c.注射Raji(1×106)和人PBMC(5×106个细胞)与基质胶1∶1混合的混合物。1小时后开始治疗。各实验中的治疗方案、剂量和动物数目描述于结果中。每日监测动物的肿瘤长出迹象。一旦肿瘤出现，则对其每周测量两次。通过使用卡尺进行二维测量来确定肿瘤体积(TV)，体积定义为：L×w2/2，其中L是肿瘤的最长尺寸且w是最短的。使用PrismGraphPad软件(v5；LaJolla，CA)通过对数秩检验在Kaplan-Meier曲线上使用存活替代端点作为达到1.0cm3的肿瘤进展时间(TTP)来确定效力。在P＜0.05时认为显著。
结果
白细胞重定向双特异件抗体的构建和生物化学分析。使用DNLTM方法产生一组白细胞重定向bsAb即(X)-3s用于靶向各种肿瘤相关抗原，包括CD19、CD20、HLA-DR、TROP-2、CEACAM5和MUC5AC。通过SE-HPLC和SDS-PAGE分析来证明这些结构的纯度，其中仅代表三种组成多肽(Okt3scFv-AD2、hA19-Fd-DDD2和hA19κ)的谱带是明显的(数据未示出)。LC-MS分析鉴别了单个RP-HPLC峰，其具有与来自于其推断氨基酸序列的(19)-3s的计算质量(137432.37Da)一致(质量精确度＝11ppm)的解卷积质谱，包括Okt3scFv-AD2和两个CH1-DDD2-hA19Fd链中的每一个上的预测氨基末端焦谷氨酸盐(数据未示出)。未指示其它翻译后修饰，包括糖基化。
由(19)-3s介导的Daudi伯基特淋巴瘤与T细胞之间的免疫突触 形成。检杳白细胞重新定向(19)-3sDNLTM复合物对效应子T细胞靶向CD19+淋巴瘤细胞的效应(图2)。将新鲜分离的T细胞以2.5∶1的E∶T比与Daudi细胞组合。在室温下用0、1或5μg/mL的(19)-3sDNLTM复合物将细胞处理30分钟，随后通过流式细胞术加以分析。分别使用抗CD20-FITC和抗CD7-APC来鉴别Daudi和T细胞。共结合指示为CD20+/CD7+事件的％。用(19)-3处理之后，45.5％的流动事件是CD20/CD7双阳性的，表明Daudi与T细胞形成突触(图2A)，与对不含抗体的混合细胞所测量的2％(图2B)形成对比。加入(19)-3s导致＞90％的Daudi与T细胞缔合(图2C)。这些结果表明(19)-3sDNLTM复合物可有效地将T细胞引导至表达目标抗原的淋巴瘤细胞。
通过荧光显微术来证明T细胞与靶淋巴瘤细胞之间的突触形成(图3)。将Jurkat(T细胞)和Daudi(B细胞)以1∶1比率组合，用0.1μg/mL(19)-3sDNLTM复合物处理30分钟，且用抗CD20-FITC(图3A)和抗CD3-PE(图3B)染色，随后通过荧光显微术加以分析。合并的图像(图3C)显示经绿色染色Daudi与经红色染色Jurkat细胞之间的突触形成。在不存在(19)-3s的情况下突触形成不明显(图3D)。图3C显示靶淋巴瘤细胞与目标T细胞直接接触。
对于(19)-3s介导的T细胞与示例性B细胞淋巴瘤细胞系缔合，进行剂量反应系列(图4)。如图4中所示，在本实验的条件下，(19)-3s介导的T细胞与靶细胞的细胞与细胞缔合在介于0.037与0.111μg/ml之间的DNLTM复合物浓度下达到饱和。
图5示出了(图5A)、DARTTM(图5A)和DNLTM(图5B)抗CD3×抗CD19复合物使T细胞重新定向于目标CD19+B细胞的相对效力的比较。和DARTTM的数据是获自Moore等(2011，Blood117：4542-51)。在0.0005μg/ml的最低测试浓度下，(19)-3sDNLTM复合物比或DARTTM更有效地使T细胞靶向B细胞淋巴瘤(图5)。与相当的和DARTTM复合物相比，(19)-3sDNLTM复合物也诱导稍高最大水平的细胞与细胞缔合(图5A)。虽然难以从(19)-3sDNLTM复合物产生的单个数据点来推断，但DARTTM和DNLTM的EC50水平似乎是相似的(图5)。
(19)-3s、(E1)-3s和(M1)-3s介导的T细胞与靶肿瘤细胞的细胞- 细胞缔合。为了评估T-细胞重新定向BsAb促进T细胞与其靶肿瘤细胞缔合的能力，将JurkatT细胞与含有(X)-3s的靶肿瘤细胞共同孵育，且通过流式细胞术和荧光显微术加以评估。JurkatT细胞是CD4+T细胞白血病细胞系，针对其在各种浓度的(19)-3s的存在下显示T细胞结合而不耗竭经FITC标记的Daudi细胞的能力加以选择，且通过流式细胞术加以分析，以检测指示T细胞-B细胞缔合复合物的双阳性(CD3+CD20+)群体。在用0.5ng/mL(19)-3s处理之后可见明显细胞-细胞缔合，且用0.1μg/m处理之后，超过25％的细胞群体存在于细胞-细胞缔合中(图5)。荧光显微术支持此数据，因为在用0.1μg/mL(19)-3s处理之后，免疫突触是明显的(图4)。在不存在(19)-3s的情况下，未见突触形成(数据未示出)。
胰腺肿瘤细胞系Capan-1中也观察到了这种细胞-细胞缔合(图6)。Capan-1表达高水平的TROP2和中等水平的MUC5AC。因此，将TROP2靶向bsAb(E1)-3s(图6C)和MUC5AC靶向bsAb(M1)-3s(图6B)与非靶向对照bsAb(19)-3s(图6A)相比较。在这些bsAb存在下将经CFSE标记的Capan-1细胞与经PKH26标记的Jurkat共同孵育。如预期，荧光显微术显示由(E1)-3s介导的大T细胞/Capan复合物，随后为由(M1)-3s介导的较小但大量的复合物和(19)-3s处理后相对较低的复合物形成(图6)。
(19)-3s特异性诱导T细胞活化和增殖。在PBMC中(图7A)或在与DaudiB细胞共同孵育的T细胞中(图7B)，通过测量T细胞活化早期标记物CD69的表达水平来评估(19)-3s活化T细胞的能力。用3ng/mL(19)-3s处理在与DaudiB细胞共同孵育的T细胞中诱导T细胞活化，如与非靶向对照抗体(19)-DDD2和(M1)-3s以及在无Daudi靶细胞的情况下用(19)-3s处理的T细胞相比，CD69表达增加＞50倍所指示(图7B)。在抗体与含有T和B细胞的PBMC一起孵育时，观察到相似结果；(19)-3s刺激CD69表达水平比非靶向对照高＞20倍(图7A)。在不存在靶细胞的情况下，经(19)-3s处理的纯化T细胞不显示活化(图7C)。
在用各种CD3靶向抗体处理PBMC之后评估T细胞增殖作为T细胞活化的另一个指示。(19)-3s在3nM或30pM下诱导的T细胞增殖类似于阳性对照IL-2/PHA(图8A)。非靶向对照抗体(14)-3s在最高(3nM)浓度下显示一些非特异性T细胞增殖(图8A)。然而，在耗竭B细胞的PBMC中未观察到T细胞增殖(图8B)，表明靶细胞对特异性(19)-3s诱导的T细胞增殖是必需的。
(X)-3s重定向的T-细胞介导的杀灭恶性肿瘤细胞系。各白细胞靶向分子的细胞毒性是通过其介导特定肿瘤靶细胞溶解的能力加以评估。对于血液肿瘤细胞系，在18-24小时测定中，使用未受刺激的富集T细胞群体作为效应细胞的10∶1E∶T比显示最佳测定条件。CD19靶向bsAb(19)-3s诱导相对较低CD19表达的细胞系Ramos(IC50＝0.17pM，溶解Max＝79％)、Daudi(IC50＝1pM，溶解Max＝60％)和Nalm6(IC50＝6pM，溶解Max＝93％)的最有效特异性杀灭(图9A)。令人感兴趣的是，高CD19表达细胞系Namalwa(IC50＝63pM，溶解Max＝60％)和Raji(IC50＝3nM，溶解Max＝41％)对于(19)-3s的敏感性最小(图9A)。非靶向(14)-3sDNLTM构建体在所测试的任何细胞系中均具有极小细胞毒性效应(图9B)。用获自两个不同的供体的PBMC来获得(19)-3s构建体对于Nalm-6ALL细胞系的一致细胞毒性效应(图9C)。
在若干个细胞系中测定(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3sT细胞重新定向bsAb的体外细胞毒性效应(图10)。CD22靶向bsAb(22)-3s在CD22阳性Daudi细胞系中显示有效的(IC50＝5pM，溶解Max＝60％)特异性T细胞介导的溶解(图10C)，但在CD22阴性Namalwa细胞中不显示(图10A)。
与较低CD20表达Namalwa细胞系(IC50＝30pM，溶解Max＝53％)(图10A)相比，CD20靶向bsAb(20)-3s在较高表达CD20细胞系Daudi(IC50＝＜0.3pM，溶解Max＝90％)(图10C)和Jeko(IC50＝1pM，溶解Max＝90％)(图10B)中显示最高效力。
在表达HLA-DR的Jeko-1细胞系(IC50＝20pM，溶解Max＝88％)中测试HLA-DR靶向bsAb(C2)-3s(图10B)。
在10∶1的E∶T比下，使用分离的T细胞作为效应细胞，bsAb在各种B细胞恶性病中诱导有效T细胞介导的细胞毒性，包括伯基特淋巴瘤(Daudi、Ramos、Namalwa)、套细胞淋巴瘤(Jeko-1)和急性淋巴细胞性白血病(Nalm-6)(表7)。非肿瘤结合对照(14)-3s在＞10nM下仅诱导中度T-细胞杀灭。对于T细胞重新靶向效力，抗原/表位的性质，尤其是其尺寸和与细胞表面的接近程度，似乎比抗原密度更重要(表7)。可能(20)-3s始终比(19)-3s和(C2)-3s更有效，即使在CD19或HLA-DR的表达大大高于CD20时，分别如在Namalwa和Jeko-1的情况下所见(表7)。这可能是因为CD20表位包括紧密邻近细胞表面的小细胞外环。当使用Daudi直接比较时，(22)-3s具有最低有效性。与CD19和CD20相比，以最低密度表达的CD22是快速内在化抗原，且其表位更远离细胞表面。这些因素中的每一个都可能造成其效力下降。最后，对T细胞重新靶向杀灭的敏感性具有细胞系依赖性，如使用(19)-3s所观察，其中Raji(IC50＞3nM)在很大程度上无反应，而Ramos(IC50＝2pM)具有高敏感性，尽管前者表达较高CD19抗原密度(表7)。
总之，(19)-3s、(20)-3s、(22)-3s和(C2)-3s同时结合于T细胞和靶B细胞，且在体外诱导T细胞介导的杀灭。DNL方法的模块化性质允许快速产生若干种相关缀合物以用于各种B细胞恶性病的重新定向白细胞杀灭，而无需额外重组工程改造和蛋白质产生。CD20细胞外表位与细胞表面的紧密邻近性导致(20)-3s的效力最高。
表7.离体重定向的T细胞灭杀
ＢＬ，伯基特淋巴瘤；ALL急性淋巴细胞性白血病；MCL，套细胞淋巴瘤。通过流式细胞术测定表达水平且相对于Daudi的表达水平进行标准化。IC50，实现50％靶细胞杀灭的皮摩尔浓度。
白细胞重定向bsAb的体外细胞毒性效应也在实体肿瘤细胞中确定(图11)。对于实体肿瘤细胞系，最佳测定条件确定为在42-48小时测定中使用经过刺激的T细胞的3∶1E∶T比。各bsAb诱导肿瘤靶细胞的特异性T细胞介导的溶解。在用(14)-3s处理之后，表达CEACAM5的人类结肠腺癌细胞系LS-174T显示有效特异性溶解(IC50＝2pM)(图11A)。(E1)-3s介导了表达Capan-1人胰腺癌细胞系的TROP2的有效特异性溶解(IC50＝29pM)(图11B)。表达高水平的CEACAM6和TROP2的胃癌细胞系NCI-N87对T细胞靶向分子(15)-3s和(E1)-3s显示非常有效的特异性溶解(分别IC50＝3pM和0.85pM)(图11C)。对于Capan-1和LS174T，非靶向对照抗体(19)-3s在＞1nM的浓度下诱导低(＜20％)非特异性溶解，且在NCI-N87细胞中诱导中度(～40％)非特异性溶解(图11A-C)。各种白细胞重定向bsAb在各种肿瘤细胞系中的体外细胞毒性数据的汇总示于图12中。各种构建体显示目标肿瘤细胞的最大细胞溶解高达90％或更大，其中表达目标抗体的细胞系的IC50值一般在低皮摩尔范围内(图12)。
实施例2.白细胞重定向DNLTM复合物的体内研究
较小(＜60kDa)基于scFv的构建体，诸如和DARTTM的一个潜在限制是需要通过长期连续输注来施用，这是因于其毒性和从循环中快速清除。因为DNLTMbsAb的分子尺寸高于典型地与肾清除率相关联的阈值，所以它应展现从循环中较慢清除。在单次静脉内推注5mg/kg(19)-3sbsAb之后，我们测量小鼠的药代动力学参数(数据未示出)。观察到双阶段清除，t1/2α和t1/2β分别是1.1和5.1h，从而产生1880pmol*h/mL的曲线下面积(数据未示出)，比在相同摩尔浓度下施用的MT103(抗-CD19×抗-CD3)所报告的结果大几乎6倍(美国专利US2010/0303827A1)。主要差异显然是(19)-3s的t1/2α更长(数据未示出)。因为(19)-3s的潜在有利性质，我们评估使用较低频率给药方案而非动物研究中典型地用于的每日给药的可能性。
在用人PBMC重构的NOD/SCID小鼠中使用Raji人伯基特淋巴瘤异种移植物来进行前瞻性研究(图13、图14)。将Raji细胞(1×106个细胞/小鼠)与自单一健康供体新鲜分离的PBMC(5×106个细胞/小鼠)组合，与基质胶1∶1混合，且在第0天经SC注入所有研究动物体内。5只小鼠的群组接受i.v.注射的(19)-3s，共计第0天130μg作为单剂量(图13B)、三个剂量的43μg(第0、2和4天)(图13C)或五个每日剂量的26μg(第0至5天)(图13D)。接种相同细胞混合物但未接受(19)-3s的未处理组(图13A)的中值存活时间(MST)是31天。各治疗方案改善存活时间(p≤0.05)，其中三个剂量(每隔一天)方案提供最大的存活益处(MST＝91天；P＝0.0018，通过对数秩分析)。
开始随访研究以确定较低频率给药的效力(图14)。9只NOD/SCID小鼠的群组以与上述类似的方式接种Raji和PBMC。在此项研究中，与第一个研究中的一周相比，治疗延长两周。群组接受i.v.注射(19)-3s，共计360μg，作为2×130-μg(图14B)、4×65-μg(图14D)或两周内6×43-μg剂量(图14E)。经SC而非i.v.向另一群组施用2×130-μg剂量(图14C)。为了比较，制备未经处理小鼠(图14A)或经非靶向(M1)-3s抗体处理的小鼠(图14F)的对照组。截至第28天，各(19)-3s治疗组具有比未治疗的对照显著更小的AUC(P＜0.05)。令人惊讶的是，经由皮下途径的两个每周剂量显然与更大频率i.v.给药-样有效。
还使用实体肿瘤进行体内研究(图15)。对于LS174T结肠腺癌(图15A、图15B)或Capan-1胰腺癌(图15C、图15D)，如上所述来制备NOD/SCID小鼠异种移植物。在各情况下，与对照相比，施用靶向(E1)-3s(图15B)或(14)-3s(图15D)bsAbDNLTM构建体的小鼠显示改善的存活时间。
总之，白细胞重新靶向bsAb，包括(19)-3s、(E1)-3s和(M1)-3sDNLTM构建体经由分别与CD3和CD19的一价和二价结合来介导T细胞分别与B细胞、结肠腺癌或胰腺癌细胞之间的突触形成。通过在pM浓度下的DNLTMbsAb在离体环境中诱导T细胞活化、增殖和靶细胞杀灭。与在动物模型中每日i.v.施用且在临床上连续输注的或DARTTM构建体相比，DNLTMbsAb的有利性质，包括二价肿瘤结合和较慢清除，将允许较低频率给药和可能经SC施用。DNLTM方法的模块化性质允许快速产生很多相关缀合物以便重新定向的白细胞杀灭各种恶性病，而无需进行额外重组工程改造和蛋白质产生。
本领域技术人员应认识到结合于CD3或其它白细胞抗原的其它抗体以及结合于CD19或其它疾病相关抗原的其它抗体在本领域中是已知的，且任何此类抗体均可用于使用本领域中熟知的技术制备F(ab)2、scFv或其它抗体片段。此类替代抗体或其片段可用于本发明方法和组合物中。如以下所论述，制造DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合物的方法可用于将任何已知抗体或抗体片段并入稳定的生理活性复合物中。
实施例3.干扰素-α增强白细胞重定向双特异性抗体的细胞毒性效应
针对由hRS7和OKT3制备为DNLTM复合物的抗人Trop-2×抗人CD3双特异性抗体(E1)-3s)在与人T细胞混合且注入小鼠中时延迟Capan-1人胰腺癌肿瘤细胞的肿瘤生长的能力来测试其治疗效力。还评估了干扰素-0(呈E1*-2b或形式)在与此疗法组合时的效应。
方法
向五周龄雌性NOD/SCID小鼠s.c注射Capan-1(5×106个)和人T细胞(2.5×106个细胞)与基质胶1∶1混合的混合物(E∶T比1∶2)。存在六个不同的治疗组，各有8只小鼠。治疗由在施用Capan-1/T细胞混合物之后1小时开始每天i.v.接收47μg(E1)-3s持续五天的一个群组组成。两个群组用等摩尔量的IFN治疗，一组接受由IFN-α2b-DDD2-CK-hRS7IgG1制备的DNL分子(E1*-2b；每周s.c2.5μg×4周)，而另一组接受(Roche；每周s.c0.6μg×4周)。其它两组接受(E1)-3s加E1*2b或(E1)-3s加的组合。最后一组对照组保持未处理。表8汇总了各个治疗组。
表8.(E1)-3s疗法的治疗组
每日监测小鼠的肿瘤长出迹象。一旦肿瘤开始出现，所有动物的肿瘤每周测量两次。如果其肿瘤体积大小超过1.0cm3，则对小鼠施以安乐死以获得疾病进展。
结果
各个组的平均肿瘤体积示于图16中。为了清楚起见，含有组的数据(图16B)与E1*2b组(图16A)分开示于图中。直至第29天，当与未治疗小鼠相比时，所有治疗就曲线下面积(AUC)而言在控制肿瘤生长方面显著较好，此时对未治疗组中的第一只小鼠施以安乐死以获得疾病进展(P＜0.0009；AUC29天)。(E1)-3s与的组合在肿瘤长出方面引起最佳总体抗肿瘤反应(图16B)。此治疗比任何个别治疗显著更好(P＜0.042；AUC)，以及优于(E1)-3s加E1*-2b的组合(P＝0.0312；AUC53天)(图16A)。当与单独E1*2b或相比时，(E1)-3s加E1*2b的组合可显著控制肿瘤生长(P＜0.0073；AUC46天)，但与单独(E1)-3s相比则不然(图16A-B)。经(E1)-3s、或E1*-2b治疗的小鼠之间无显著差异(图16A-B)。
就存活时间而言，当与未治疗的小鼠相比时，所有治疗均提供显著存活益处(P＜0.0112；对数秩)(图17)。截至第81天，在经(E1)-3s加E1*-2b的组合治疗的小鼠与经(E1)-3s加治疗的小鼠之间不存在显著中值存活时间(MST)差异(分别MST＝79.5和＞81天)(图17)。与任何个别治疗相比，经(E1)-3s加治疗的小鼠具有显著改善的存活结果(P＜0.0237)(图17)。经(E1)-3s加E1*2b治疗的小鼠在与经单独E1*-2b治疗的小鼠相比时具有存活益处(MST＝53天；P＜0.0311)，但在与仅经(E1)-3s或治疗的小鼠相比时则不然(分别MST＝68天和53天)(图17)。用(E1)-3s治疗在与用E1*-2b治疗的小鼠相比时显著改善存活时间(P＝0.0406)，但在与用单独治疗的小鼠相比时则不然(图17)。在仅用E1*2b治疗的小鼠与用单独治疗的小鼠之间无显著差异(图17)。
结果显示加入干扰素-α在与白细胞重定向bsAb组合时大幅增加存活时间且削弱肿瘤生长。本领域技术人员应认识到，在加入I型或III型干扰素(干扰素-α、干扰素-β或干扰素-λ)的情况下所观察到的改善功效不限于特定(E1)-3sbsAb，而是在制备为DNLTM复合物或其它形式的其它白细胞重定向bsAb，诸如或DARTTM的情况下都将观察到。
实施例4.对含白细胞重定向双特异性抗体的干扰素-α组合疗法的进一步研究
在以上实施例中，(E1)-3s加的组合被证明在控制肿瘤生长方面是非常有效的治疗。为了证实这些结果且对其进行延伸，进行了研究，其中加入两个新群组。首先包括(E1)-3s对照组，其中向动物施用等摩尔量的TF12。TF12由与一个非靶向679Fab(抗HSG)连接的两个hRS7-Fab分子组成。另外，因为Capan-1对IFN敏感，所以加入另一组，其中在不利用T细胞的情况下评估对Capan-1肿瘤生长的效应。
在给小鼠(40)注射Capan-1/T细胞混合物之后，将其随机分成五个治疗组。一小时后，一个11只小鼠的群组每天i.v.接受47μg(E1)-3s，肿瘤细胞注射后1h开始且持续连续四天(qdx5)。一个7只动物的群组每周经皮下接受呈形式的干扰素持续四周。另一组接受i.v.(E1)-3s加s.c.的组合。未处理的对照动物接受Capan-1/T细胞但无治疗。另一对照组接受用量以摩尔数计相当于(E1)-3s的TF12(57μgqdx5)。第6组小鼠(8只动物)接受单独注射仅Capan-1细胞(即，无T细胞)且经治疗。所有疗法注射都是以100μL的体积进行。表9汇总了各个组。
表9.(E1)-3s和TF12疗法的治疗组
每日监测小鼠中肿瘤长出的迹象。一旦肿瘤开始出现后，每周两次测量所有动物的肿瘤。若其肿瘤体积尺寸超过1.0cm3，则对小鼠施以安乐死以获得疾病进展。
结果
示出了平均肿瘤生长(图18)和存活曲线(图19)。尽管彼此并无不同，但当与TF12和未治疗对照组相比时经(E1)-3s、或(无T细胞)治疗的小鼠显示了显著的抗肿瘤效应(P＜0.0102；AUC)。在本实验结束当天(第59天)，经(E1)-3s加组合治疗的小鼠的平均肿瘤体积是0.083±0.048cm3。总体上，该处理组在与所有其它治疗组相比时显示显著的抗肿瘤效应(P＜0.0072；AUC)。
与TF12和未处理对照组相比，各个别治疗( 无T细胞和(E1)-3s)显著提高了存活时间(P＜0.0059；对数秩)(图18、图19)。除了(E1)-3s加组合，所有群组都达到了它们相应的MST。在该组合组中，未对动物施以安乐死以获得疾病进展(TV＞1.0cm3)。重要的是，当与所有其它治疗相比时，(E1)-3s加组合提供显著的存活效益(P＜0.0007；对数秩)(图18、图19)。
实施例5.含T细胞重定向双特异性抗体的干扰素-α组合疗法在人胃癌中的效应
使用前两个实施例中所公开的方法和组合物来研究单独或与干扰素-α()组合的白细胞重定向bsAb在IFN难治性NCI-N87人胃肿瘤细胞系中的效应。对小鼠s.c注射与基质胶混合的5×106个NCI-N87细胞+2.5×106个T细胞(1∶2E∶T比)且在1h后开始治疗。治疗组示于表10中。
表10.(E1)-3s和TF12疗法的治疗组
单独或与干扰素组合的白细胞重定向bsAb(E1)-3s的效应示于图20和图21中。(E1)-3sbsAb能有效减缓胃癌的肿瘤生长且增加存活时间。与干扰素-α组合甚至显著增强了白细胞重定向bsAb在干扰素抗性肿瘤中的效应。组合疗法比单独添加任一药剂更有效。与未处理的动物相比，经单独或与干扰素-α组合的TF12bsAb治疗的小鼠对照显示对肿瘤生长或死亡率具有极小的效应。
实施例6.抗体-药物缀合物(ADC)在人胰腺癌或结肠癌的临床前模型中的体内治疗性用途
如先前所描述来制备CL2A-SN-38抗体缀合物(参见例如美国专利号7,999,083和8,080,250)。将带有皮下人类胰腺或结肠肿瘤异种移植物的免疫受损无胸腺裸鼠(雌性)用特定CL2A-SN-38缀合物或对照缀合物治疗，或保持未处理。观察特定缀合物的治疗效力。在Capan1胰腺肿瘤模型中，与对照hA20-CL2A-SN-38缀合物(抗CD20)和未处理对照(未示出)相比，hRS7(抗TROP2)、hPAM4(抗MUC5ac)和hMN-14(抗CEACAM5)抗体的特定CL2A-SN-38缀合物显示更好的效力。类似地，在人胰腺癌的BXPC3模型中，与对照治疗(未示出)相比，特定hRS7-CL2A-SN-38显示更好的治疗效力。同样，在人结肠癌的侵袭性LS174T模型中，用特定hMN-14-CL2A-SN-38治疗比不治疗(未示出)更有效。
实施例7.使用ADChMN-14-[CL2-SN-38]、IMMU-130在体内治疗裸鼠中的GW-39人结肠肿瘤肺转移
通过i.v.注射GW-39人结肠肿瘤悬浮液在裸鼠中建立结肠癌的肺转移模型，且在14天后开始治疗。使用不同的剂量，以q4d×8剂量方案注射特定抗CEACAM5抗体缀合物hMN14-CL2-SN-38以及非靶向抗CD22MAb对照缀合物hLL2-CL2-SN-38和hMN14与SN-38的等剂量混合物。在hMN-14ADC情况下观察选择性治疗效应(未示出)。在250μg剂量下，经hMN14-CL2-SN-38治疗的小鼠显示大于107天的中值存活时间。经不特异性靶向肺癌细胞的对照缀合抗体hLL2-CL2-SN-38治疗的小鼠显示77天的中值存活时间，而经未缀合hMN14IgG和游离SN-38治疗的小鼠显示45天的中值存活时间，与未处理的生理盐水对照(43.5天)相当。实质上比未缀合抗体和单独游离化学治疗剂更有效的缀合癌细胞靶向抗体-SN-38缀合物的有效性的显著且令人惊讶的增加清楚可见(未示出)。还观察到了缀合抗体的治疗效应的剂量反应性(未示出)。这些结果显示在同一体内人类肺癌系统中SN-38抗体缀合物与未缀合抗体和游离SN-38的组合效应相比具有明显的优越性。
实施例8.ADC(IMMU-132或hRS7-SN-38)用于治疗疗法难治性转移性结肠癌(mCRC)的用途
患者是患有mCRC的62岁妇女，其最初在2012年1月呈现转移性疾病。她在诊断后数周进行了腹腔镜回肠横向结肠切除术作为第一疗法，且随后在新辅助情形下接受4个循环的FOLFOX(甲酰四氢叶酸、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂)化学疗法，随后在2012年3月进行了右侧肝切除术以去除右肝叶中的转移性病变。这之后在2012年6月恢复辅助FOLFOX方案，持续总计12个FOLFOX循环。8月份由于神经毒性加剧而从该方案中减去奥沙利铂。她的最后一个5-FU循环是在2012年09月25日。
2013年1月进行的CT显示转移至肝脏。她随后被评估为参与IMMU-132(hRS7-SN-38)调查型研究的良好候选人。她的病历中的并存病包括哮喘、糖尿病、高血压、高胆固醇血症、心杂音、食管裂孔疝、甲状腺机能减退、腕管综合征、青光眼、抑郁、不宁腿综合征和神经病。她的手术史包括输卵管结扎(1975年)、甲状腺切除术(1983年)、胆囊切除术(2001年)、腕管解除(2008年)和青光眼手术。
在进入本疗法时，她的目标病变是左肝叶中的3.1cm肿瘤。非目标病变包括肝脏中的若干个低衰减块。她的基线CEA是781ng/mL。
按照每周一次的方案通过输注连续2周给予IMMU-132，随后停止一周，由此构成治疗循环。在耐受时重复这些循环。第一次IMMU-132输注(8mg/kg)开始于2013年2月15日，且在无值得注意的事件的情况下完成。她在第一个循环过程中经历了恶心(2级)和疲劳(2级)，且继续治疗，从那以后没有重大不利事件。她在2013年3月报告了脱发和便秘。通过计算机断层扫描(CT)，2013年4月8日进行(在6个剂量之后)的第一次反应评估显示目标病变收缩29％。2013年3月25日，她的CEA水平降至230ng/mL。在2013年5月23日的第二次反应评估(10个剂量之后)中，目标病变收缩39％，因而根据RECIST标准构成部分响应。她继续治疗，接受了由12个剂量的8mg/kghRS7-SN-38(IMMU-132)构成的6个循环。她的总体健康状况和临床症状自开始该调查型研究开始得到了相当大的改良。
实施例9.IMMU-132用于转移性实体癌症的ADC疗法
IMMU-132是包含通过pH值敏感性连接子与hRS7抗Trop-2人源化单克隆抗体缀合的CPT-11活性代谢物SN-38的ADC(平均药物-抗体比＝7.6)，当与Trop-2结合时，其展现快速内在化。IMMU-132靶向以高流行率和特异性表达于许多癌瘤中的I型跨膜蛋白Trop-2。此本实施例报告了在3种(中值)先前治疗(一些包括拓扑异构酶I和拓扑异构酶II抑制药物)失败后的25名不同的转移性癌症(胰腺癌，7例；三阴性乳腺癌[TNBC]，4例；结肠直肠癌[CRC]，3例；胃癌，3例；食道癌、前列腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌[SCLC]、肾癌、扁桃体癌、膀胱癌，各1例)患者的I期临床试验。
IMMU-132以重复21天循环施用，在第1天和第8天给予各治疗。在3+3试验设计中，起始剂量为8mg/kg/剂量(即，16mg/kg/循环)，且升高至18mg/kg直至遇到剂量限制性中性粒细胞减少症。疲劳、脱发和偶尔轻度至中度腹泻是较常见的非血液学毒性中的一些，其中2名患者还报告了皮疹。通过CT，在各种转移性癌症中，24名可评估患者中超过80％具有稳定的疾病或肿瘤收缩(SD和PR)作为最佳反应。通过RECIST，三名患者(CRC、TNBC、SCLC)具有PR；所有患者的中值TTP＞18周，不包括胰腺癌患者。通过剂量减至8-10mg/kg/剂量(16-20mg/kg/循环)来控制中性粒细胞减少症。
免疫组织化学显示Trop-2强表达于大部分存档患者肿瘤中，但在血清中未检测到它。血液肿瘤标记物效价(例如CEA、CA19-9)的相应降低体现了肿瘤反应。尽管重复给药，但未检测到抗抗体或抗SN-38抗体。血清中IMMU-132浓度的峰和谷评估值显示缀合物在7天内完全清除，这是基于体外研究的意料之中的发现，所述研究显示每天在血清中释放50％的SN-38。这些结果表明，以介于16-24mg/kg/循环范围内的剂量给予的这种新颖ADC在多样性转移性实体癌症中显示高治疗指数。
实施例10.IMMU-130(靶向CEACAM5的SN-38ADC)在转移性结肠直肠癌(mCRC)中具有治疗活性
IMMU-130(由pH值敏感性连接子(7.6平均药物-抗体比)缀合于人源化抗CEACAM5抗体(拉贝珠单抗)的SN-38的ADC)正在完成两个I期试验。在两者中，要求患有晚期mCRC的合格患者进行过失败/复发标准治疗，即拓扑异构酶I抑制药物CPT-11(伊立替康)且具有升高的血浆CEA(＞5ng/mL)。
在第一种方案(IMMU--130-01)中，每14天(EOW)以始于2.0mg/kg的剂量施用IMMU-130。在24mg/kg下，三分之二的患者中出现了发热性中性粒细胞减少症；另外，在≤16mg/kg下，在7名患者中观察到中性粒细胞减少症(≥2级)，其中一名还经历血小板减少症。一名患者[在接受≥4个剂量(2个循环)的8名患者中]显示肝脏(起始于7cm)和肺目标病变在4.7个月内减少40.6％(PR，通过RECIST)，无重大毒性，耐受总计18个16mg/kg剂量。该研究以12mg/kgEOW继续进行。
因为SN-38在S期细胞中最有效，所以进一步延长暴露可以提高效力。因此，在第二个I期试验(IMMU-130-02)中，给药加强至每周两次，在3+3试验设计中，起始于6mg/kg/剂量持续2周(4个剂量)，停止1周，作为一个治疗循环。中性粒细胞减少症和易控制腹泻是主要副作用，直至剂量减至4.0mg/kg每周两次，早期结果表明充分耐受多个循环。目前，在完成≥4个剂量(1个循环)的6名患者中，3名患者中出现了肿瘤收缩，其中1名继续PR(-46％，通过RECIST)。在两个试验中，CEA血液效价与肿瘤反应相关，且高水平不干扰疗法。基于ELISA测试，还没有抗抗体或抗SN-38抗体反应。在各研究中，ADC在前24h内被清除50％，该暴露比亲本分子CPT-11的典型剂量长得多。这些结果表明，以平均～16-24mg/kg/循环的不同方案给予的这种新颖ADC在晚期mCRC患者中显示高治疗指数。因为CEACAM5在乳腺癌和肺癌以及其它上皮细胞肿瘤中的表达有所升高，所以它也可能是其它癌症的可用靶标。
实施例11.单独或与T细胞重定向bsAb、IFN-α或ADC组合的检查点抑制子抗体的抗肿瘤活性
为了确定示例性检查点抑制子抗体伊匹单抗(抗CTLA4)的抗肿瘤活性是与其它治疗剂协同还是因加入其它治疗剂而受到抑制，在鼠类肿瘤模型中评估了单独或与示例性T细胞重定向bsAb(E1)-3s、与干扰素-α或与示例性ADChRS7-SN-38(IMMU-132)组合的CTLA4mAb。基于对各种药剂和CTLA4封锁的不同敏感性而选择了M109肺癌、SA1N纤维肉瘤和CT26结肠癌模型。将人T细胞与所述抗体共同施用。
所有化合物均在其最佳剂量和时程下进行测试。当组合使用时，在IMMU-132、(E1)-3s或干扰素-α的第一个剂量之后一天开始CTLA4mAb。使用肿瘤生长抑制百分比和达到目标肿瘤尺寸的天数来评估效力。抗肿瘤活性评分为：完全消退(CR；非可感知肿瘤)或部分消退(PR；肿瘤体积减小50％)。协同定义为抗肿瘤活性显著(p＜0.05)优于各药剂的单一疗法的活性。
在对CTLA4封锁敏感且对(E1)-3s、干扰素-α和IMMU-132适度敏感的SA1N纤维肉瘤肿瘤模型中，界线协同作用在CTLA4mAb与(E1)-3s组合的情况下是明显的，而在干扰素-α下未观察到效应。IMMU-132单一疗法不产生显著的SA1N抗肿瘤活性。然而，组合IMMU-132与CTLA4mAb产生协同作用。在M109肺转移模型和CT26结肠癌模型中，在CTLA4mAb与IMMU-132、(E1)-3s和干扰素-α中的每一者组合时检测到协同作用。
总之，向干扰素-α、IMMU-132或(E1)-3s中加入CTLA4mAb产生了模型依赖性协同活性。在不考虑肿瘤的免疫原性和仅当至少一种疗法具有活性时观察到了协同作用。所有组合方案都被充分耐受且组合疗法看似不抑制CTLA4mAb活性。在对单独CTLA4mAb无反应的肿瘤中观察到协同作用，表明其它治疗剂可能诱导免疫原性细胞死亡。
实施例12.用于治疗难治性转移性非小细胞肺癌的含ADC(IMMU-132)和干扰素-α的组合疗法
患者是经诊断患有非小细胞肺癌的60岁男性。给予该患者卡铂、贝伐单抗的化学疗法方案持续6个月，且显示了反应，且随后在进展之后，在接下来的2年内接受含卡铂、依托泊苷、吉西他滨的其它化学疗法疗程，偶然反应持续不超过2个月。所述患者随后呈现测量为6.5×4cm的左纵隔块和胸腔积液。
在签署知情同意书之后，每隔一周以18mg/kg的剂量给予所述患者IMMU-132。在治疗第一周之后，给予所述患者含IMMU-132和的组合疗法。在前两次注射期间，经历了短期中性粒细胞减少症和腹泻，在4小时内有4次排便，但这些在2天内被对症用药解决或作出反应。在总计6次IMMU-132输注和5次输注之后，指数病变的CT评估显示22％减少，刚好在部分反应部分响应以下但存在明确的肿瘤收缩。患者再继续该疗法两个月，此时通过CT注意到指数病变直径总和的45％肿瘤收缩的部分反应，因而根据RECIST准则构成部分反应。与分开施用两种药剂相比，组合疗法看似提供了协同反应。
实施例13.用于治疗晚期结肠癌的含ADC(IMMU-130)和T细胞重定向bsAb(MT100)的组合疗法
患者是初步诊断为患有转移性结肠癌(IV期)的75岁妇女。她进行了右部半结肠切除术和小肠切除术，且随后接受FOLFOX、FOLFOX+贝伐单抗、FOLFIRI+雷莫芦单抗和FOLFIRI+西妥昔单抗疗法持续一年半，此时她显示疾病进展，疾病扩散至后穹窿、网膜，骨盆中出现腹水且胸腔右侧出现胸腔积液。就在此疗法之前，她的基线CEA效价是15ng/mL。她被连续2周每周两次给予6mg/kgIMMU-130(抗CEACAM5-SN-38)，然后休息一周(3周的周期)。在第一个循环之后，给予所述患者含IMMU-132和白细胞重定向bsAbMT110的组合疗法，按照同样的3周循环通过连续输注施用。在耐受性非常良好而无任何主要血液学或非血液学毒性的5个循环之后，她的血浆CEA效价适度降至1.3ng/mL，但在8周评估中，她显示了指数肿瘤病变的21％收缩，这在13周时增至27％收缩。令人惊讶的是，此时患者的腹水和胸腔积液均减少(后者消失)，因而显著改良了患者的总体状态。与分开施用两种药剂相比，组合疗法看似提供了协同反应。
实施例14.用于治疗具有IV期转移性疾病的胃癌患者的含ADC(IMMU-130)、T细胞重定向bsAb((E1)-3s)和干扰素-α的组合疗法
患者是由于与进食相关的胃部不适和疼痛持续约6年且在过去的12个月期间伴随体重损失而求医的52岁男性。对胃部区域的触诊显示硬块，随后进行胃镜检查，显示他的胃下部存在溃疡块。对此进行活组织检查且诊断为胃腺癌。实验室测试显示无特定异常变化，但在肝功能测试中，LDH和CEA升高，后者是10.2ng/mL。本专利随后进行了全身PET扫描，除胃部肿瘤以外，还显露了左腋下和右肝叶中的转移性疾病(2个小转移)。切除患者的胃部肿瘤，且随后获得他的转移性肿瘤的基线CT测量值。手术后四周，他接受3个疗程的由顺铂和5-氟尿嘧啶(CF)方案组成的组合化学疗法，但对此耐受不良，所以转而用多西他赛治疗。基于CT扫描，看起来疾病稳定了约4个月，随后患者抱怨又出现体重损失、腹痛、食欲不振和极度疲劳导致重复CT研究，显示转移尺寸增加合计20％且在原始胃切除术部位出现位点疑似病变。
随后按照8mg/kg的每周方案给予患者含IMMU-130(抗CEACAM5-SN-38)的实验治疗。在第一周之后，开始含IMMU-130、(E1)-3s和干扰素-α的组合疗法。患者在随后的4周内未展现腹泻或中性粒细胞减少症的证据。随后对患者进行CT研究以测量其转移性肿瘤尺寸和察看原始胃切除术区域。根据RECIST准则，放射科医师测量转移性病变总和与治疗前基线相比减少23％。原始胃切除术区域内似乎不存在任何明确的病变。此时患者的CEA效价是7.2ng/mL，相对于基线值14.5ng/mL大幅降低。患者继续每周一次组合疗法，且在总计13次输注之后，他的CT研究显示一个肝脏转移已经消失且所有转移性病变的总和减少41％，从而构成部分反应(通过RECIST)。患者的一般状况得到改善，且恢复其日常活动，同时继续每三周接受维持疗法。在最后一次测量血液CEA时，值是4.8ng/mL，这对于吸烟者(这是该患者的情况)来说在正常范围内。
实施例15.DOCK-AND-LOCKTM的一般技术
以下所论述的一般技术可用于使用所公开的方法和组合物来产生具有连接于任何抗体或抗原结合抗体片段的AD或DDD部分的DNLTM复合物。
表达载体
已使用质粒载体pdHL2来产生多种抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等，JImmunolMethods(1989)，125：191-202；Losman等，Cancer(Phila)(1997)，80：2660-6。双顺反子哺乳动物表达载体引导IgG重链和轻链的合成。许多不同IgG-pdHL2构建体的载体序列大部分相同，仅有的差异存在于可变结构域(VH和VL)序列中。使用本领域技术人员已知的分子生物学工具，可将这些IgG表达载体转化成Fab-DDD或Fab-AD表达载体。
为了产生Fab-DDD表达载体，将重链铰链、CH2和CH3结构域的编码序列用编码铰链的前4个残基、具有14个残基的连接子和诸如人RIIα的DDD部分的前44个残基(称为DDD1，SEQIDNO：1)的序列置换。为了产生Fab-AD表达载体，将IgG的铰链、CH2和CH3结构域的序列用编码铰链的前4个残基、具有15个残基的连接子和诸如使用生物信息学和肽阵列技术产生且显示以极高亲和性(0.4nM)结合RIIα二聚体的具有17个残基的合成AD(称为AKAP-IS)的AD部分(称为AD1，SEQIDNO：3)的序列置换。参见Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A(2003)，100：4445-50。设计两个穿梭载体以促进IgG-pdHL2载体转化为Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体，如以下所秒述。
CH1的制备
使用pdHL2质粒载体作为模板，通过PCR扩增CH1结构域。左侧PCR引物由CH1结构域的上游(5′)端和作为CH1编码序列的5′的SacII限制核酸内切酶位点组成。右侧引物由编码铰链(PKSC，SEQIDNO：102)前4个残基的序列组成，随后是4个甘氨酸和丝氨酸，其中最后两个密码子(GS)包含BamHI限制位点。将410bpPCR扩增引物克隆到PCR克隆载体(Inc.)中，且针对T7(5′)方向上的插入片段来筛选克隆。
合成双链寡核苷酸，以编码DDD1的氨基酸序列，所述氨基酸序列前面是连接子肽的11个残基，其中前两个密码子包含BamHI限制位点。终止密码子和EagI限制位点附接于3′端。所编码的多肽序列示于以下。
GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO：103)
合成了在其3′端上有30个碱基对重叠两种寡核苷酸，命名为RIIA1-44顶部和RIIA1-44底部，且对其进行组合从而包含174bpDDD1序列的中心154个碱基对。使所述寡核苷酸退火且用Taq聚合酶进行引物延伸反应。引物延伸后，通过PCR扩增双链体。将扩增引物克隆到中，且针对T7(5′)方向上的插入片段进行筛选。
合成双链寡核苷酸，以编码AD1的氨基酸序列，所述氨基酸序列前面是连接子肽的11个残基，其中前两个密码子包含BamHI限制位点。终止密码子和EagI限制位点附接于3′端。所编码的多肽序列示于以下。
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQIDNO：104)
合成编码上述肽序列的两个互补重叠寡核苷酸，命名为AKAP-IS顶部和AKAP-IS底部，且使其退火。通过PCR扩增双链体。将扩增引物克隆到载体中且针对T7(5′)方向上的插入片段进行筛选。
连接DDD1与CH1
用BamHI和NotI限制酶将编码DDD1序列的190bp片段从中切除，且随后连接于中的相同位点中以产生穿梭载体
连接AD1与CH1
利用BamHI和NotI从中切除含有AD1序列的110bp片段，且随后将其连接于中的相同位点中以产生穿梭载体
利用这种模块设计，可以将CH1-DDD1或CH1-AD1并入pdHL2载体中的任何IgG构建体中。通过从pdHL2移除SacII/EagI限制片段(CH1-CH3)且将其置换为从相应穿梭载体中切除的CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI限制片段而将整个重链恒定域恒定结构域置换为上述构建体之一。
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生C-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体，其所具有的二聚和对接结构域序列DDD2(SEQIDNO：2)经由具有14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接子附接于hMN-14的Fd的羧基末端。所分泌的融合蛋白由通过DDD2结构域的非共价相互作用保持在一起的hMN-14Fab的两个相同拷贝构成。
表达载体如下进行工程改造。合成制备包含连接子肽的一部分和DDD2的残基1-13的编码序列的两个重叠互补寡核苷酸。使所述寡核苷酸退火且用T4PNK磷酸化，从而在5′和3′端上产生与跟分别经限制核酸内切酶BamHI和PstI消化的DNA连接相容的悬突。
将双链体DNA与通过用BamHI和PstI消化制备的穿梭载体连接，以产生穿梭载体用SacII和EagI从中切除507bp片段，且将其与通过用SacII和EagI消化而制备的IgG表达载体hMN-14(I)-pdHL2连接。最终表达构建体命名为C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。已利用类似技术产生了多种不同的人源化抗体的Fab片段的DDD2融合蛋白。
h679-Fd-AD2-pdHL2
h679-Fab-AD2经设计与C-DDD2-Fab-hMN-14配对。h679-Fd-AD2-pdHL2是用于产生h679-Fab-AD2的表达载体，所述h679-Fab-AD2具有经由具有14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接子接附于CH1结构域的羧基末端的锚定域锚定结构域序列AD2(SEQIDNO：4)。AD2的一个半胱氨酸残基在AD1的锚定域锚定结构域序列之前且另一个半胱氨酸残基在其之后。
表达载体如下进行工程改造。合成制备包含AD2和连接子序列的一部分的编码序列的两个重叠互补寡核苷酸(AD2顶部和AD2底部)。将所述寡核苷酸退火且用T4PNK磷酸化，从而在5′和3′端上产生与跟分别经限制性核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA连接相容的悬突。
将双链体DNA连接到通过用BamHI和SpeI消化制备的穿梭载体中，以产生穿梭载体利用SacII和EagI限制酶从所述穿梭载体中切除含有CH1和AD2编码序列的429碱基对片段，且将其连接于通过用这些相同的酶消化制备的h679-pdHL2载体中。最终表达载体是h679-Fd-AD2-pdHL2。
TF2DNL TM 构筑体的产生
通过使C-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应获得了三聚DNLTM构建体，命名为TF2。如下产生TF2的试验批次，产率＞90％。将经蛋白质L纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)与h679-Fab-AD2(60mg)以1.4∶1摩尔比混合。以总蛋白质浓度1.5mg/ml处于1mMEDTA的PBS中。后续步骤包括TCEP还原、HIC色谱、DMSO氧化和IMP291亲和色谱。在加入TCEP之前，SE-HPLC未显示a2b形成的任何证据。加入5mMTCEP快速引起a2b复合物形成，与对二元结构所预期的157kDa蛋白质一致。通过IMP291亲和色谱将TF2纯化至接近均质(未示出)。IMP291是含有与679Fab结合的HSG半抗原的合成肽(Rossi等，2005，ClinCancerRes11：7122s-29s)。对IMP291未结合级分的SE-HPLC分析显示自产物移除a4、a2和游离κ链(未示出)。
通过测定法测定TF2的功能性。将TF2、C-DDD1-hMN-14+h679-AD1(用作非共价a2b复合物的对照样品)或C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作未还原的a2和b组分的对照样品)稀释至1μg/ml(总蛋白质)且流过经HSG固定的感测芯片。对TF2的反应大约是两个对照样品的两倍，表明对照样品中仅h679-Fab-AD组分将结合并保留在感测芯片上。随后注入针对hMN-14的抗独特型抗体WI2IgG显示证明仅TF2具有与h679-Fab-AD紧密缔合的DDD-Fab-hMN-14组分，如另一信号反应所指示。由WI2与固定于感测芯片上的TF2结合引起的反应单位额外增加对应于各自由C-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚单元贡献的两个完全功能性结合位点。这通过TF2能够结合WI2的两个Fab片段而得以证实(未示出)。
TF10DNL TM 构建体的产生
使用类似方案产生包含C-DDD2-Fab-hPAM4的两个拷贝和C-AD2-Fab-679的一个拷贝的三聚TF10DNLTM构建体。使用针对产生(抗CEA)2×抗HSGbsAbTF2所公开的方法，如上文所描述来产生TF10双特异性([hPAM4]2×h679)抗体。TF10构建体带有两个人源化PAM4Fab和一个人源化679Fab。
在稳定转染的骨髓瘤细胞中独立地表达两个融合蛋白(hPAM4-DDD2和h679-AD2)。合并组织培养物上清液，得到两倍摩尔过量的hPAM4-DDD2。在室温下在使用1mM还原型谷胱甘肽的温和还原条件下将反应混合物孵育24小时。还原后，通过使用2mM氧化型谷胱甘肽轻微氧化而完成反应。通过亲和色谱使用IMP291-亲和凝胶树脂分离TF10，所述树脂以高特异性结合h679Fab。
实施例16.由多个抗体产生AD和DDD连接的Fab和IgG融合蛋白
使用前一实施例中所描述的技术，构建表11中所示的IgG和Fab融合蛋白，且将其并入DNLTM构建体中。所述融合蛋白保留了亲本抗体的抗原结合特征，且所述DNLTM构建体展现所并入的抗体或抗体片段的抗原结合活性。
表11.包含IgG或Fab的融合蛋白
融合蛋白 结合特异性
C-AD1-Fab-h679 HSG
C-AD2-Fab-h679 HSG
C-(AD)2-Fab-h679 HSG
C-AD2-Fab-h734 铟-DTPA
C-AD2-Fab-hA20 CD20
C-AD2-Fab-hA20L CD20
C-AD2-Fab-hL243 HLA-DR
C-AD2-Fab-hLL2 CD22
N-AD2-Fab-hLL2 CD22
C-AD2-IgG-hMN-14 CEACAM5
C-AD2-IgG-hR1 IGF-1R
C-AD2-IgG-hRS7 EGP-1
C-AD2-IgG-hPAM4 MUC
C-AD2-IgG-hLL1 CD74
C-DDD1-Fab-hMN-14 CEACAM5
C-DDD2-Fab-hMN-14 CEACAM5
C-DDD2-Fab-h679 HSG
C-DDD2-Fab-hA19 CD19
C-DDD2-Fab-hA20 CD20
C-DDD2-Fab-hAFP AFP
C-DDD2-Fab-hL243 HLA-DR
C-DDD2-Fab-hLL1 CD74
C-DDD2-Fab-hLL2 CD22
C-DDD2-Fab-hMN-3 CEACAM6
C-DDD2-Fab-hMN-15 CEACAM6
C-DDD2-Fab-hPAM4 MUC
C-DDD2-Fab-hR1 IGF-1R
C-DDD2-Fab-hRS7 EGP-1
N-DDD2-Fab-hMN-14 CEACAM5
实施例17.包含两个不同抗体部分和一个细胞因子的DNLTM构建体的产生和使用
在某些实施方案中，三聚体DNLTM构建体可包括三个不同效应部分，例如两个不同的抗体部分和一个细胞因子部分。我们在此报告了称为20-C2-2b的双特异性MAb-IFNα的产生和表征，其包括IFN-α2b的两个拷贝和位点特异性连接于维妥珠单抗(人源化抗CD20)的hL243(人源化抗-HLA-DR；IMMU-114)的经稳定F(ab)2。在体外，20-C2-2b抑制四个淋巴瘤和八个骨髓瘤细胞系中的每一个，且在除一个(HLA-DR-/CD20-)以外的所有骨髓瘤细胞系中比单特异性CD20靶向MAb-IFNα或包含亲本抗体和IFNα的混合物更有效(未示出)，表明20-C2-2b可用于治疗各种造血病症。与只靶向HLA-DR或CD20的单特异性MAb-IFNα相比，20-C2-2b显示更大的针对KMS12-BM(CD20+/HLA-DR+骨髓瘤)的细胞毒性(未示出)，表明20-C2-2b中的所有三个组分均可造成毒性。
抗体
以下论述中所使用的缩写是：20(CH3-AD2-IgG-v-mab，抗-CD20IgGDNLTM模块)；C2(CH1-DDD2-Fab-hL243，抗HLA-DRFab2DNLTM模块)；2b(二聚IFNα2B-DDD2DNLTM模块)；734(抗in-DTPAIgGDNLTM模块，用作非靶向对照)。以下MAb由Immunomedics，Inc.提供：维妥珠单抗或v-mab(抗-CD20IgG1)、hL243γ(4p(Immu-114，抗-HLA-DRIgG4)、鼠类抗IFNαMAb和针对v-mab(WR2)和hL243(WT)的大鼠抗独特型MAb。
DNL TM 构建体
使用DNLTM方法，通过将IgG-AD2模块与DDD2模块组合来产生单特异性MAb-IFNα(20-2b-2b、734-2b-2b和C2-2b-2b)和双特异性HexAb(20-C2-C2)，如前述实施例中所述。包括四聚IFNα2b和MAbh734[抗-铟-DTPAIgG1]的734-2b-2b用作非靶向对照MAb-IFNα。
哺乳动物表达载体的构建以及产生克隆的后续产生和CH3-AD2-IgG-v-mab的纯化公开于前述实施例中。所表达的重组融合蛋白质的AD2肽经由15个氨基酸长的柔性连接子肽连接于v-mab的CH3结构域的羧基末端。重链AD2和轻链多肽的共同表达形成了配备有两个AD2肽的IgG结构。通过电穿孔将表达载体转染于Sp/ESF细胞(经工程改造的细胞系Sp2/0)中。pdHL2载体含有针对二氢叶酸还原酶的基因，因而允许克隆选择以及使用甲氨喋呤(MTX)进行基因扩增。从用含有0.2μMMTX的培养基选择的96孔板分离稳定克隆。经由夹心ELISA筛选克隆的CH3-AD2-IgG-vmab生产力。在含无血清培养基的滚瓶培养物中产生模块。
如以上所论述通过使DDD2肽经由18个氨基酸长的柔性连接子肽与人IFNα2b的羧基末端重组融合来产生DDD模块IFNα2b-DDD2。如所有DDD模块的情况，所表达的融合蛋白质自发形成稳定同源二聚体。
通过用SacII和EagI限制酶切除CH1-铰链-CH2-CH3结构域序列且置换为编码用相同酶从C-DDD2-hMN-14-pdHL2表达载体中切除的CH1-DDD2的507bp序列而由hL243-IgG-pdHL2载体产生CH1-DDD2-Fab-hL243表达载体。通过电穿孔将CH1-DDD2-Fab-hL243-pdHL2转染至Sp/ESF细胞中之后，使用涂布有小鼠抗人κ链以俘获融合蛋白质的96孔微量滴定板经由夹心ELISA筛选稳定抗MTX性克隆的生产力，所述融合蛋白质用辣根过氧物酶缀合山羊抗人Fab来检测。在滚瓶培养物中产生所述模块。
在无血清H-SFM培养基中进行滚瓶培养物和分批馈料生物反应器产生使得产率与迄今为止所产生的其它IgG-AD2模块和细胞因子-DDD2模块相当。通过亲和色谱法，分别使用MABSELECTTM(GEHealthcare)和HF镍亲和力凝胶(Sigma)从培养液中纯化CH3-AD2-IgG-v-mab和IFNα2b-DDD2，如先前所描述(Rossi等，Blood2009，114：3864-71)。将含有CH1-DDD2-Fab-hL243模块的培养液直接应用于亲和凝胶(GE-Healthcare)，用PBS洗涤至基线且用0.1M甘氨酸pH2.5来洗脱。
通过DNL TM 产生20-C2-2b
将三个DNLTM模块(CH3-AD2-IgG-v-mab、CH1-DDD2-Fab-hL243和IFN-α2b-DDD2)以等摩尔数量组合以产生bsMAb-IFNα、20-C2-2b。在室温下、在温和还原条件(1mM还原型谷胱甘肽)下进行过夜对接步骤之后，加入氧化型谷胱甘肽(2mM)以促进二硫键形成(锁定)。使用三个连续亲和色谱步骤将20-C2-2b纯化至接近于均质。最初，用结合CH3-AD2-IgG-v-MAb基团且消除未反应的IFNα2b-DDD2或CH1-DDD2-Fab-hL243的蛋白A(MABSELECTTM)纯化DNLTM混合物。通过IMAC使用特异性结合IFNα2b-DDD2部分且消除缺乏此基团的任何构建体的HF镍亲和力凝胶进一步纯化蛋白A结合的材料。使用hL243-抗独特型亲和力凝胶的最终方法步骤移除缺乏CH1-DDD2-Fab-hL243的任何分子。
本领域技术人员应认识到亲和色谱可用于纯化包括效应部分的任何组合的DNLTM复合物，只要可获得三个效应部分各自的配体且连接于柱材料即可。选定的DNLTM构建体是结合于含有三个效应部分各自的配体的三个柱中的每一个并且可在洗涤之后洗脱以移除未结合的复合物的构建体。
以下实施例代表20-C2-2b的若干种类似制备。将等摩尔量的CH3-AD2-IgG-v-mab(15mg)、CH1-DDD2-Fab-hL243(12mg)和IFN-α2b-DDD2(5mg)组合于30mL反应体积中，且将1mM还原型谷胱甘肽加入溶液中。在室温下16h之后，将2mM氧化型谷胱甘肽加入混合物，在室温下再保持6h。将反应混合物应用于5mL蛋白A亲和力柱，用PBS洗涤至基线且用0.1M甘氨酸pH2.5来洗脱。用3MTris-HClpH8.6中和包含～20mg蛋白质的洗脱液且渗析至结合缓冲液(10mM咪唑、300mMNaCl、50mMNaH2PO4，pH8.0)中，随后应用于5mLIMAC柱。用结合缓冲液将柱洗涤至基线且用250mM咪唑、150mMNaCl、50mMNaH2PO4pH8.0洗脱。
将包含～11.5mg蛋白质的IMAC洗脱液直接应用于WP(抗hL243)亲和力柱，用PBS洗涤至基线且用0.1M甘氨酸pH2.5来洗脱。所述方法产生7mg高度纯化的20-C2-2b。这是20-C2-2b理论产量的大约44％，占总起始材料(在此实施例中为16mg)的50％，其中20-2b-2b和20-C2-C2各自的25％以副产物形式产生。
20-C2-2b的产生和表征
通过将IgG-AD2模块CH3-AD2-IgG-v-mab与两个不同二聚DDD模块CH1-DDD2-Fab-hL243和IFNα2b-DDD2组合来产生双特异性MAb-IFNα。由于DDD模块与两个AD2基团随机缔合，所以预期除了20-C2-2b以外还会形成两个副产物，即20-C2-C2和20-2b-2b。
非还原SDS-PAGE(未示出)将20-C2-2b(～305kDa)拆分为位于20-C2-C2(～365kDa)与20-2b-2b(255kDa)的谱带之间的谱带簇。还原SDS-PAGE拆分了包含20-C2-2b的五种多肽(v-mabHC-AD2、hL243Fd-DDD2、IFNα2b-DDD2和共迁移v-mab和hL243κ轻链)(未示出)。20-C2-C2和20-2b-2b中不存在IFNα2b-DDD2和hL243Fd-DDD2。MABSELECTTM结合于DNLTM反应中产生的所有三种主要物质，但去除任何过量IFNα2b-DDD2和CH1-DDD2-Fab-hL243。未结合级分主要含有20-C2-C2(未示出)。来自WT亲和色谱的未结合部分包含20-2b-2b(未示出)。对各样品进行SE-HPLC和免疫应答性分析，证实了SDS-PAGE分析的结果和结论。
还原20-C2-2b之后，通过RP-HPLC来拆分其五个组分多肽，且产生各峰的个别ESI-TOF解卷积质谱(未示出)。原生但非细菌表达的重组IFNα2在Thr-106处经O-糖基化(Adolf等，BiochemJ1991；276(Pt2)：511-8)。我们确定包含IFNα2b-DDD2模块的多肽中～15％经O-糖基化，且可通过RP-HPLC和SDS-PAGE从非糖基化多肽拆分(未示出)。20-C2-2b的LC/MS分析分别以15ppm和2ppm的质量精度鉴别了IFNα2b-DDD2的O-糖基化和非糖基化物质(未示出)。O-糖基化形式的观察质量指示O-连接多糖具有结构NeuGc-NeuGc-Gal-GalNAc，其也是对20-2b-2b所预测的(＜1ppm)(未示出)。LC/MS将v-mab和hL243κ链以及hL243-Fd-DDD2(未示出)鉴别为单一未修饰物质，且观察质量匹配计算质量(＜35ppm)。v-mabHC-AD2的两种主要糖型鉴别为具有53，714.73(70％)和53，877.33(30％)的质量，分别指示典型地与IgG缔合的G0F和G1FN-多糖(未示出)。该分析还证实HC-AD2的氨基末端被修饰成焦谷氨酸，如对具有氨基末端谷氨酰胺的多肽所预测。
20-C2-2b的SE-HPLC分析拆分了滞留时间(6.7分钟)与其计算质量一致且在较大20-C2-C2的滞留时间(6.6分钟)与较小20-2b-2b的滞留时间(6.85分钟)之间的主要蛋白质峰，以及可能表示经由IFNα2b的自缔合形成的非共价二聚体的一些较高分子量峰(未示出)。
免疫应答性测定显示20-C2-2b的均质性，其中各分子含有三个官能团(未示出)。20-C2-2b与针对三个组成模块中任一个的过量抗体一起孵育引起高分子量免疫复合物的定量形成和20-C2-2b峰消失(未示出)。和WT亲和力未结合级分分别不与WT和抗IFNα具有免疫应答性(未示出)。MAb-IFNα示出了与其亲本MAb类似的结合亲合力(未示出)。
IFNα生物活性
使用基于细胞的报告基因测定法来测量各种MAb-IFNα的比活性，且与聚乙二醇化干扰素α-2b相比较(未示出)。正如所料，具有两个IFNα2b基团的20-C2-2b的比活性(2454IU/pmol)显著低于20-2b-2b的比活性(4447IU/pmol)或734-2b-2b的比活性(3764IU/pmol)，却大于聚乙二醇化干扰素α-2b(P＜0.001)(未示出)。20-2b-2b与734-2b-2b之间的差异不显著。所有试剂的比活性在相对于总IFNα的IU/pmol进行标准化时最少变化。基于这些数据，MAb-IFNα的各IFNα2b基团的比活性是重组IFNα2b(～4000IU/pmol)的大约30％。
在离体环境中，20-C2-2bDNLTM构建体比正常B细胞更有效地耗竭淋巴瘤细胞，且对T细胞无效应(未示出)。然而，它确实有效地消除单核细胞(未示出)。在v-mab对单核细胞无效应时，在经hL243α4p和MAb-IFNα治疗之后观察到耗竭，且20-2b-2b和734-2b-2b展现类似的毒性(未示出)。因此，20-C2-2b的可预见的较高效力归因于抗-HLA-DR与IFNα的组合作用，其可以通过HLA-DR靶向来增强。这些数据表明单核细胞耗竭可能是与抗-HLA-DR以及IFNα疗法相关的药效学效应；然而，此副作用可能是瞬时的，因为单核细胞群体将由造血干细胞恢复。
本领域技术人员应认识到，本文中所描述的产生和使用双特异性免疫细胞因子，或包括三个不同的效应部分的其它DNLTM构建体的方法可以与可并入DNLTM构建体中的抗体、抗体片段、细胞因子或其它效应子的任何组合，例如抗CD3与抗CD19或其它抗TAA与IFNα2b的组合一起利用。
实施例18.NK靶向的白细胞重定向bsAb的用途
使用bsAb重新靶向白细胞不限于针对T细胞的抗体。在替代实施方案中，结合于单核细胞、NK细胞或嗜中性粒细胞的bsAb也可以用于重新靶向目的。
CD16是针对由NK细胞的CD56dim子集高度表达的IgG的活化低亲和力Fc-γ受体(Gleason等，2012，MolCancerTher11：2674-84)。除其在NK细胞重新靶向方面的用途以外，包含抗CD16抗体组分的bsAb能够通过CD16的直接信号转导来活化NK介导的细胞毒性，从而诱导溶解性颗粒定向分泌和靶细胞死亡(Gleason等，2012)。
使用如先前所报告的DNA改组和连接技术(Vallera等，2005，ClinCancerRes11：3879-88)，根据Gleason等，2012，MolCancerTher11：2674-84制备CD16/CD19双特异性杀伤细胞衔接子(BiKE)和CD16/CD19/CD22三特异性杀伤细胞衔接子(TriKe)。通过相继进行离子交换和尺寸排阻柱色谱法来纯化所表达的BiKE和TriKE。在CD16/CD19BiKE或CD16/CD19/CD22TriKE存在(10μg/mL)下将其余PBMC暴露于原发性ALL和CLL肿瘤细胞。与无重新靶向抗体时的细胞相比，在BiKE或TriKE存在下观察到对肿瘤细胞的细胞毒性显著增加。肿瘤细胞在不存在PBMC的情况下暴露于BiKE或TriKE时未观察到效应。相对于BiKE，TriKE对肿瘤细胞毒性具有较大作用，表明与额外肿瘤细胞抗原结合可以增强重新靶向效应。使用经过纯化的NK细胞代替PBMC观察到了类似的结果。
如Wiernik等(2013)，ClinCancerRes19：3844-55中所公开来制备CD16/CD33BiKE。将BiKE施用于已注入与人PBMC共同施用的人HL60早幼粒细胞性白血病异种移植细胞的裸鼠。与经对照bsAb治疗的小鼠相比，经BiKE治疗的小鼠显示死亡率和肿瘤生长率降低。加入抗CD33-SN-38ADC进一步增强了BiKE的细胞毒性效应。
实施例19.使用缀合的抗HIV抗体在体外和体内抑制HIV感染
概述
为了显示免疫缀合物对HIV-1的效力，使针对HIV包被抗原的鼠类单克隆抗体(Mab)(P4/D10)与常规抗癌药物多柔比星缀合，且在体外和体内针对感染性病毒和受感染细胞进行测试。将P4/D10抗体与游离病毒(中和)或感染HIV的细胞(抑制)一起孵育，且通过p24俘获酶联免疫吸附测定来测量所产生的感染。在HIV-1/MuLV小鼠攻击模型中，测量缀合物在体内抑制感染的能力。
多柔比星缀合的P4/D10在体外中和HIV-1IIIB且消除受感染的Jurkat细胞中的细胞间传播和HIV复制。它还能在比游离抗体所需低八倍的浓度下防止小鼠被HIV-1IIIB/MuLV攻击，而对于游离药物或无关缀合物对照则未或观察到效应。
这些结果显示，多柔比星被P4/D10抗体集中于受HIV感染的细胞，显著(P＝0.0001)有助于HIV消除。相同的组合物和方法可用于消除经ART(抗逆转录病毒疗法)治疗的患者的其余抗原表达T细胞。
在本研究中，我们利用已知的药理学、毒理学和在患者中的抗肿瘤活性缀合了抗癌蒽环类多柔比星与针对HIV-1外包被gp120(第三可变环区)开发的中和性和ADCC介导性单克隆抗体(Mab)。
在体外测试与多柔比星缀合的P4/D10抗体在通过从腹腔内去除受HIV-1/MuLV(鼠类白血病病毒)感染的同基因细胞而消除未受感染细胞和小鼠模型中的受HIV-1感染的细胞方面的效力。抗gp120抗体P4/D10中和了HIV-1病毒且介导ADCC(Broliden等，1990)。它还以未缀合形式用于晚期HIV-1感染个体的I期临床试验，其中其在较长时间段内减少HIV抗原(Hinkula等，1994)。本发明的研究首先在临床前HIV模型中研究呈药物缀合形式的P4/D10组合，与游离Mab、游离药物以及以类似方式与多柔比星缀合的无关抗体hRS7(Stein等，IntJCancer1993，55：938-946)和hLL1(Griffiths等，ClinCancerRes2003，9：6567-6571；Sapra等，ClinCancerRes2005，11：5257-5264)相比较。
材料和方法
抗体和药物缀合。多柔比星与IgG1κ抗gp120抗体P4/D10(Broliden等，1990)和对照抗体缀合以及具有马来酰亚胺基的双功能多柔比星腙衍生物的制备是根据Griffiths等(2003)进行。简而言之，在含有5mMEDTA的PBS(pH7.5)中，使用对应于还原剂相对于抗体38倍摩尔过量的约2.2mM最终DTT浓度，用DTT(二硫苏糖醇)温和地还原最终浓度是大约9mg/ml的抗体P4/D10、hLL1(人源化抗CD74)和hRS7(人源化抗EGP-1)。在37℃下将溶液孵育40分钟。在SephadexG50/80旋转柱上在含有150mMNaCl和2mMEDTA的50mM乙酸钠缓冲液(pH5.3)中纯化经过还原的Mab。通过埃尔曼氏测定法来测定抗体上所产生的硫醇基数目。对于缀合，将经温和还原的抗体以6.5mg/ml与双功能多柔比星混合。将孵育物保持在冰上15分钟，且在G50/80旋转柱上在0.1M乙酸钠(pH6.5)中纯化，随后通过在相同缓冲液中平衡的Bio-BeadsSM2短柱(Bio-Rad，Hercules，CA)。通过测量吸光度来分析产物的多柔比星/Mab取代比。在分析型BioSil250柱上进行尺寸排阻HPLC分析。
将得自HIV感染患者的IgG(HIVIgG)的由GMP产生的批次(Guay等，AIDS2002，16：1391-1400)用作阳性对照且得自HIV阴性个体的血清用作阴性对照。包括游离多柔比星以及以类似方式与多柔比星缀合的抗癌人源化MabLL1和RS7作为缀合的P4/D10抗体的对照。
HIV-1中和测定。将多柔比星P4/D10、未经标记的P4/D10、HIV免疫球蛋白(HIVIgG)和HIV阴性血清与HIV-1孤立HIV-1IIIB(LAI)混合且在37℃孵育1h，随后加入50,000个JurkatT细胞/孔。孵育1h之后，用培养基洗涤细胞且加入新的完全培养基(200μl/孔)。在培养7天之后，通过p24俘获ELISA(酶联免疫吸附测定)测量所产生的p24的量，且计算对HIV-1p24产生的抑制百分比。
体外HIV-1抑制。通过将5-10×106个细胞与100×TCID50HIV-1IIIB混合用HIV-1IIIB感染JurkatT细胞，且在37℃下孵育1h。在培养基中洗涤细胞且在37℃下孵育。每三天更换培养基且检查上清液的p24产生。当接近100％细胞被感染时，将不同比例的HIV-1IIIB感染细胞与未感染细胞混合。用100至0.00001μg/ml的抗体、血清或游离多柔比星连续稀释处理细胞。在37℃下培养七天之后，测量HIV-1p24抑制且收集先前经0.1-10μg/ml多柔比星-P4/D10、未缀合P4/D10和0.05-0.5mg/mlHIV阴性血清处理的细胞的上清液，并且转移至新鲜JurkatT细胞中以测试p24ELISA在培养开始后第3天、第7天、第10天、第12天和第15天是否能鉴别感染性HIV。
HIV-1/MuLV攻击模型。用HIV-1IIIB感染具有基因整合的MuLV基因组的人T细胞系CEM-1B，由此产生具有HIV-1基因组和MuLV包被的假病毒(Adang等，PNASUSA1999，96：12749-753；Hinkula等，CellsTissuesOrgans2004，177：169-184)。使用这些病毒上清液来感染得自HLA-A201转基因C57B1/6xDBAF1Kb/d小鼠的脾细胞。用HIV-1IIIB/MuLV感染的脾细胞i.p.攻击等基因小鼠，且立即i.p.给予缀合抗体、游离抗体或游离多柔比星。攻击之后十天，将小鼠处死且收集腹壁细胞。使腹壁细胞形成球团且加入在24孔板中生长的1×106个HIV易感性JurkatT细胞或人PBMC中。从这些次级培养物取出上清液且每3-4天加入新鲜培养基。通过p24ELISA测量上清液中所回收的感染性HIV的量，持续3周。
统计分析。为了比较抗gp120Mab和对照抗体的体外HIV-1中和能力，使用斯氏t检验和非参数克鲁斯凯-沃利斯检验。使用非参数曼-惠特尼U检验和克鲁斯凯-沃利斯检验进行经不同的抗体处理的小鼠群组之间的统计比较。当获得＜0.05的p值时认为差异显著。使用GraphPadPrism版本4.0a(GraphPadSoftware，SanDiego，CA)进行非参数单向ANOVA检验，且用于比较研究群组之间的HIV-1分离和p24抗原阳性。
结果
通过温和还原在相应抗体上产生的硫醇基数目以及最终经纯化的缀合物中的多柔比星/Mab取代比介于8.8(P4/D10、hRS7)与9.4(hLL1)之间的范围内，得到每个IgG大约9个药物分子的比率。高压液相色谱显示缀合物和天然Mab具有类似的滞留时间，存在零至极小聚集(数据未示出)。
多柔比星缀合的P4/D10Mab与未缀合P4/D10Mab或HIVIgG抗体之间可以显示游离HIV-1病毒的HIV-1中和能力无显著差异(未示出)。然而，在中和HIV-1IIIB方面，所有抗HIV-1特异性抗体与阴性对照血清相比显著更佳(p＝0.001)。
当将3％经HIV-1IIIB感染的Jurkat细胞与97％未经感染的细胞混合时，在0.5或0.05μg/ml的浓度下，与游离P4/D10、多柔比星缀合的对照抗体hLL1或游离多柔比星相比，多柔比星-P4/D10介导显著(p＝0.002)更强的HIV-1感染细胞间传播抑制(未示出)。在所有其它浓度的经感染和未经感染细胞下可见类似的结果。特别感兴趣的是与用多柔比星-P4/D10作为中和剂所获得的效应相比，细胞间感染传播看似受到甚至更有力的抑制。而且，在经高剂量多柔比星-P4/D10处理的培养物中未发现感染性病毒，这是因为在得自这些细胞培养物的上清液转移至未经感染的Jurkat细胞之后未检测到p24产生(数据未示出)。根据中和游离HIV-1病毒的结果无法预测多柔比星-P4/D10与未缀合的P4/D10之间的显著效应差异(未示出)。
为了测试多柔比星-P4/D10抗体的体内效力，经腹膜内给予小鼠同基因HIV/MuLV感染细胞连同缀合物。10天后收集腹壁细胞且所有对照中均显示感染性HIV，类似于先前的研究(Hinkula等，2004)。多柔比星-P4/D10抗体防止小鼠完全对抗经HIV-1感染的原代淋巴细胞攻击(p＝0.0001)(未示出)。在用100μg多柔比星-P4/D10抗体攻击和处理之后从腹壁细胞中未回收到感染性HIV。当用100μg未缀合P4/D10抗体处理小鼠时，对于p24产生都是阳性。单独抗体的完全保护仅在剂量增加八倍达到每只小鼠800μg未缀合P4/D10时可见。多柔比星缀合的对照抗体(hLL1或hRS7)在100-200μg剂量下无一提供任何保护，100-400μg游离多柔比星剂量也不提供。
讨论
以上结果显示抗体针对HIV-1包被的总病毒抑制性质可以通过与多柔比星偶联而显著扩增。多柔比星-P4/D10能够在体外以及在实验体内攻击模型中消除HIV-1感染细胞。未缀合的P4/D10Mab介导针对HIV-1感染靶细胞的ADCC以及中和HIV-1的能力(Broliden等，1990；Hinkula等，1994)可以用无毒方式增强其作为药物免疫缀合物的效力。
以类似方式与多柔比星缀合的抗癌抗CD74MabLL1已在极低剂量下在体外和非何杰金氏淋巴瘤或多发性骨髓瘤的人异种移植模型中显示显著活性(Griffiths等，2003；Sapra等，2005)。这些研究以及在猴子中的毒理学指示仅极高剂量的免疫缀合物将产生骨髓抑制的证据，但未观察到与多柔比星有关的心脏毒性(Sapra等，2005)。为了避免病毒逃逸，应一起测试针对HIV中可达表位的保守和可变位点的抗体(Trkola等，2005；Ferrantelli等，JInfectDis2004，189：2167-2173)。
在先前的体外研究中，与假单胞菌外毒素A(PE40)缀合的HIV-1特异性免疫球蛋白去除了HIV-1感染细胞(Pincus等，2003；Ashorn等，ProcNatlAcadSciUSA1990，87：8889-8893)。然而，在临床试验中，PE40与CD4细胞偶联被证明具有免疫原性和肝毒性(Davey等，1994；Ramachandran等，1994)。因此，本发明的结果显示多柔比星-Mab缀合物的效力且具有极小或不具有副作用，这是令人惊讶且出乎意料的。PE40-CD4的毒性可以由与以高浓度存在于未经ART治疗的高病毒负载患者中的游离gp120形成毒性复合物来解释(Berger等，1998)。为了避免与高病毒负载相关的潜在毒性问题，靶向HIV包被特异性表位的分子将优选用于病毒负担较低的情形，诸如在ART期间、HIV感染早期或甚至已知或可能暴露于HIV感染后不久。举例来说，可以根据所公开的方法用缀合抗体处理暴露于含被HIV污染或可能被污染的血液或其它体液的意外针刺的健康护理工作者。作为多柔比星-P4/D10缀合物的抗细胞活性的结果，对经ART处理的患者增加药物缀合物可以消除携带抗原的细胞以及游离的病毒粒子，且因此甚至进一步减少病毒负载。熟练技术人员应认识到，要求保护的组合物和方法不限于P4/D10的多柔比星缀合物，而是可以利用与P4/D10或与其它已知抗HIV抗体缀合的其它已知细胞毒性剂。
在其它实施方案中，为了避免非特异性毒性，可以使用双特异性抗体和其它预靶向策略，其中抗体靶向和毒性剂递送分开进行(Wu等，2005)。此策略已经在临床前和临床癌症试验中显示出有前景的结果(Forero等，Blood2004，104：227-236；Rossi等，ClinCancerRes2005，11：7122s-7129s)。对于在人类受试者中的体内使用，优选人类或人源化形式的抗体用于重复临床使用。
实施例20.用ADC和T细胞重定向bsAb治疗感染HIV的患者
47岁男性患者测定为HIV血清阳性。所述患者的CD4计数小于200/mm3。用非核苷类逆转录酶抑制剂奈韦拉平的标准方案治疗所述患者。CD4细胞计数提高至300/mm3，但所述患者仍呈HIV血清阳性。依序用人源化多柔比星-P4/D10抗体和白细胞重定向(P4/D10)-3sbsAb治疗所述患者。所述患者的CD4计数提高至超过350/mm3，且所述患者不再呈HIV血清阳性。一年后，所述患者仍无症状且不存在可检测的HIV感染。
实施例21.用于治疗性用途的三价抗体
如专利EP1309795B1中所描述来制造三价三特异性细胞靶向构建体，包括：(i)对如专利US618728中所描述的衍生出EP1309795的技术方案1的Fab的小鼠抗CD16mab进行嵌合或人源化；(ii)构建由US7512189中所描述的人源化抗HLA-DR抗体的Fv构成的单链抗体，且通过连接子将所述scFv接合于(i)的抗CD16Fab的轻链的羧基末端；和(iii)构建由US8486395中所描述的人源化抗CD19抗体的Fv构成的单链抗体，且通过连接子将所述scFv接合于(ii)的抗CD16Fab的CH1的羧基末端。
将所述三价构建体与hLL2-SN38组合施用于患有非何杰金氏淋巴瘤的受试者。观察到部分反应且肿瘤显示尺寸消退，持续12个月。
***
根据本公开内容，不需要过度实验就可以制备和使用本文中所公开和要求保护的所有组合物和方法。尽管已经就优选实施方案描述了组合物和方法，但本领域技术人员应显而易见，可在不背离本发明的理念、精神和范围的情况下对本文中所描述的组合物和方法以及方法中的步骤或步骤序列施加变化。更具体地说，化学上和生理学上相关的某些试剂可以取代本文中所描述的试剂，同时实现相同或类似的结果。认为对本领域技术人员显而易见的所有此类相似的取代和修改都在如由所附权利要求所限定的本发明精神、范围和理念之内。

Claims (47)

1.一种诱导对癌症或传染病的免疫应答的方法，其包括向患有癌症或传染病的受试者施用两种或更多种药剂的组合，所述药剂是选自(i)白细胞重新定向双特异性抗体；(ii)选自干扰素α、干扰素β、干扰素λ1、干扰素λ2和干扰素λ3的干扰素；(iii)检查点抑制子抗体；和(iv)抗体-药物缀合物(ADC)；
其中所述两种或更多种药剂的施用诱导针对所述癌症或传染病的白细胞介导的免疫应答。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述白细胞重新定向双特异性抗体包含：
a)结合于白细胞抗原的第一抗体或其抗原结合片段，所述白细胞抗原是选自ADAM17、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11a、CD11b、CD14、CD16、CD16b、CD25、CD28、CD30、CD32a、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD56、CD57、CD64、CD69、CD74、CD89、CD90、CD137、CD177、CEACAM6、CEACAM8、HLA-DRα链、KIR和SLC44A2；和
b)结合于靶抗原或病原体的第二抗体或其抗原结合片段，所述靶抗原或病原体是选自：碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、α-辅肌动蛋白-4、A3、A33抗体特异性抗原、ART-4、B7、Ba733、BAGE、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD79b、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GROB、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和其亚单位、HER2/neu、HMGB-1、低氧可诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、胰腺癌粘蛋白、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活蛋白、存活蛋白-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原、肿瘤坏死抗原、TROP-2、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A-抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标记物、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、致癌基因产物、HIV病毒、结核分枝杆菌（mycobacteriumtuberculosis）、无乳链球菌（Streptococcusagalactiae）、抗甲氧西林性金黄色葡萄球菌(meticillin-resistantStaphylococcusaureus)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophilia)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、B型流感嗜血杆菌(HemophilisinfluenzaeB)、苍白密螺旋体(Treponemapallidum)、莱姆病螺旋体(Lymediseasespirochetes)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)、流产布鲁氏菌(Brucellaabortus)、狂犬病病毒、流感病毒、巨细胞病毒、I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、人血清细小样病毒、呼吸道合胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、埃-巴二氏病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口膜炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病病毒、仙台病毒、猫白血病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、猿猴病毒40、小鼠乳腺瘤病毒、登革热病毒、风疹病毒、西尼罗河病毒、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(Plasmodiumvivax)、刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)、让氏锥虫(Trypanosomarangeli)、克氏锥虫(Trypanosomacruzi)、罗德西亚锥虫(Trypanosomarhodesiensei)、布氏锥虫(Trypanosomabrucei)、曼森氏裂体吸虫(Schistosomamansoni)、日本裂体吸虫(Schistosomajaponicum)、牛巴贝虫(Babesiabovis)、艾美耳球虫(Elmeriatenella)、旋盘尾丝虫(Onchocercavolvulus)、热带利什曼虫(Leishmaniatropica)、旋毛虫(Trichinellaspiralis)、小泰勒虫(Theileriaparva)、泡状带绦虫(Taeniahydatigena)、羊绦虫(Taeniaovis)、牛肉绦虫(Taeniasaginata)、细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)、科氏中殖孔绦虫(Mesocestoidescorti)、关节炎支原体(Mycoplasmaarthritidis)、鼻支原体(M.hyorhinis)、口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginini)、拉氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii)、唾液支原体(M.salivarium)和肺炎支原体(M.pneumoniae)。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述第一抗体或其片段结合于CD3或CD16。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述第二抗体或其片段结合于选自CD19、CD20、CD22、CD74、HLA-DR、TROP-2、MUC5ac、CEACAM5、CEACAM6、甲胎蛋白(AFP)和IGF-1R的抗原。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述第二抗体选自hR1(抗IGF-1R)、hPAM4(抗粘蛋白)、KC4(抗粘蛋白)、hA20(抗CD20)、hA19(抗CD19)、hIMMU31(抗AFP)、hLL1(抗CD74)、hLL2(抗CD22)、RFB4(抗CD22)、hMu-9(抗CSAp)、hL243(抗HLA-DR)、hMN-14(抗CEACAM5)、hMN-15(抗CEACAM6)、hRS7(抗TROP-2)、hMN-3(抗CEACAM6)、CC49(抗TAG-72)、J591(抗PSMA)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶IX)、英夫利昔单抗(抗TNF-α)、聚乙二醇化赛妥珠单抗（certolizumabpegol）(抗TNF-α)、阿达木单抗(抗TNF-α)、阿仑单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉姆单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(抗CD20)、帕尼单抗(panitumumab)(抗EGFR)、利妥昔单抗(抗CD20)、托西莫单抗(抗CD20)、GA101(抗CD20)、曲妥单抗(抗HER2/neu)、托珠单抗(tocilizumab)(抗IL-6受体)、巴利昔单抗(抗CD25)、达克珠单抗(抗CD25)、依法利珠单抗（efalizumab）(抗CD11a)、莫罗单抗（muromonab）-CD3(抗CD3受体)、那他珠单抗(抗α4整合素)、BWA-3(抗组蛋白H2A/H4)、LG2-1(抗组蛋白H3)、MRA12(抗组蛋白H1)、PR1-1(抗组蛋白H2B)、LG11-2(抗组蛋白H2B)、LG2-2(抗组蛋白H2B)、P4/D10(抗gp120)和奥玛珠单抗(omalizumab)(抗IgE)。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述第二抗体选自hA19、hR1、hPAM4、hA20(维妥珠单抗(veltuzumab))、hIMMU31、hLL1(米拉珠单抗(milatuzumab))、hLL2(依帕珠单抗)、hMu-9、hL243、hMN-14、hMN-15、hRS7和hMN-3。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述白细胞重定向bsAb选自布利莫单抗(blinatumomab)、MT110、卡妥索单抗(catumaxomab)、厄妥索单抗、FBTA05和TRBS07。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述干扰素是干扰素α。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述检查点抑制子抗体选自兰利珠单抗(lambrolizumab)(MK-3475)、尼鲁单抗(nivolumab)(BMS-936558)、皮地珠单抗(pidilizumab)(CT-011)、AMP-224、MDX-1105、MEDI4736、MPDL3280A、BMS-936559、伊匹单抗(ipilimumab)、利利单抗(lirlumab)、IPH2101和曲美目单抗(tremelimumab)。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述检查点抑制子抗体结合于选自CTLA4、PD1、PD-L1、LAG3、B7-H3、B7-H4、KIR和TIM3的抗原。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体-药物缀合物选自hLL1-多柔比星、hRS7-SN-38、hMN-14-SN-38、hLL2-SN-38、hA20-SN-38、hPAM4-SN-38、hLL1-SN-38、hRS7-Pro-2-P-Dox、hMN-14-Pro-2-P-Dox、hLL2-Pro-2-P-Dox、hA20-Pro-2-P-Dox、hPAM4-Pro-2-P-Dox、hLL1-Pro-2-P-Dox、P4/D10-多柔比星、吉姆单抗-奥佐米星、贝伦妥单抗（brentuximab)-维多汀(vedotin）、曲妥单抗-安坦辛(emtansine)、伊珠单抗(inotuzumab)-奥佐米星、格巴妥莫单抗(glembatumomab)-维多汀、SAR3419、SAR566658、BIIB015、BT062、SGN-75、SGN-CD19A、AMG-172、AMG-595、BAY-94-9343、ASG-5ME、ASG-22ME、ASG-16M8F、MDX-1203、MLN-0264、抗-PSMAADC、RG-7450、RG-7458、RG-7593、RG-7596、RG-7598、RG-7599、RG-7600、RG-7636、ABT-414、IMGN-853、IMGN-529、伏司妥珠单抗(vorsetuzumab)-马佛多汀(mafodotin)和洛妥珠单抗(lorvotuzumab)-默坦辛(mertansine)。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述组合包含选自以下各项的两种或更多种药剂：(i)白细胞重定向双特异性抗体；(ii)干扰素α；和(iii)检查点抑制子抗体。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述组合选自：白细胞重新定向双特异性抗体(bsAb)加IFN-α；白细胞重定向bsAb加检查点抑制子抗体；白细胞重新定向bsAb加IFN-α加检查点抑制子抗体；抗体-药物缀合物(ADC)加检查点抑制子抗体；ADC加白细胞重定向bsAb；ADC加IFN-α加检查点抑制子抗体；ADC加IFN-α加白细胞重定向bsAb；ADC加白细胞重定向bsAb加检查点抑制子抗体；和ADC加白细胞重定向bsAb加IFN-α加检查点抑制子抗体。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述两种或更多种药剂是同时或相继施用。
15.如权利要求1所述的方法，其中ADC是在任何其它药剂之前施用。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述干扰素是作为游离干扰素、PEG化干扰素、干扰素融合蛋白质或与抗体缀合的干扰素来施用。
17.如权利要求2所述的方法，其中所述第一抗体片段和所述第二抗体片段选自scFv、Fab和dAb。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述白细胞重定向双特异性抗体包含：
a)与AD(锚定结构域)部分缀合的第一抗体或其抗原结合片段，其中所述AD部分的氨基酸序列来自于AKAP蛋白质；和
b)与DDD(二聚和对接结构域)部分缀合的第二抗体或其抗原结合片段，其中所述DDD部分的氨基酸序列来自于蛋白激酶A(PKA)调节亚单位RIα、RIβ、RIIα或RIIβ；
其中所述DDD部分的两个拷贝形成二聚体，所述二聚体与所述AD部分的一个拷贝结合以形成复合物。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述DDD部分的氨基酸序列选自RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIα的残基12-61和RIβ的残基13-66。
20.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症选自非何杰金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、伯基特淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、毛细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、华氏巨球蛋白血症、癌瘤、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤、皮肤癌、口腔癌、胃肠道癌、结肠癌、胃癌、肺道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、胆囊癌、肾癌和睾丸癌。
21.如权利要求1所述的方法，其中所述传染病是感染有选自以下的病原体：小孢霉属(Microsporumspp.)、发癣菌属(Trichophytonspp.)、表皮癣菌属(Epidermophytonspp.)、申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)、新型隐球菌、粗球孢子菌(Coccidioidesimmitis)、荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、白色念珠菌(Candidaalbican)、人类免疫缺陷性病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、流感病毒、人类乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、Reo病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革热病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、埃-巴二氏病毒、鼠类白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口膜炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、蓝舌病病毒、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、无乳链球菌、嗜肺军团菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、肺炎球菌属(Pneumococcusspp.)、B型流感嗜血杆菌、苍白密螺旋体、莱姆病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产布鲁氏菌、结核分枝杆菌和支原体属(Mycoplasmaspp)。
22.如权利要求1所述的方法，其还包括向所述受试者施用治疗剂。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述治疗剂是选自抗体、抗体片段、药物、毒素、酶、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、抗生素、激素、免疫调节剂、细胞因子、趋化因子、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、硼化合物和放射性同位素。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述药物是选自5-氟尿嘧啶、阿法替尼（afatinib）、阿普立定(aplidin)、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类、阿西替尼(axitinib)、AVL-101、AVL-291、苯达莫司汀、争光霉素、硼替佐米(bortezomib)、博舒替尼、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、亚硝脲氮芥、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、camptothecans、克唑替尼(crizotinib)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼(dasatinib)、地尼西宝(dinaciclib)、多西他赛、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、2-吡咯啉并多柔比星(2P-DOX)、氰基吗啉基多柔比星、多柔比星葡萄糖醛酸苷、表柔比星葡萄糖醛酸苷、埃罗替尼(erlotinib)、雌氮芥、表鬼臼毒素(epidophyllotoxin)、埃罗替尼、恩替诺特(entinostat)、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡萄糖醛酸苷、依托泊苷磷酸盐、依西美坦、芬戈莫德（fingolimod）、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基蛋白转移酶抑制剂、夫拉平度(flavopiridol)、福他替尼(fostamatinib)、吉尼替比(ganetespib)、GDC-0834、GS-1101、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨、羟基脲、依鲁替尼(ibrutinib)、伊达比星、艾代拉利司(idelalisib)、异环磷酰胺、伊马替尼(imatinib)、L-天冬酰胺酶、、拉帕替尼（lapatinib）、来那度胺(lenolidamide)、甲酰四氢叶酸、LFM-A13、环己亚硝脲、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、氨甲蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、来那替尼(neratinib)、尼罗替尼(nilotinib)、亚硝基脲、奥拉帕尼(olaparib)、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、PCI-32765、喷司他丁、Pro-2-P-Dox、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、索拉非尼（sorafenib）、链脲霉素、SU11248、舒尼替尼(sunitinib)、它莫西芬、替莫唑胺(DTIC的水溶液形式)、反铂(transplatinum)、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、尿嘧啶芥(uracilmustard)、瓦他拉尼(vatalanib)、长春瑞滨、长春花碱、长春新碱、长春花生物碱和ZD1839。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述趋化因子是选自RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述免疫调节剂是选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴细胞毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、促红细胞生成素和促血小板生成素。
27.如权利要求23所述的方法，其中所述细胞因子是选自人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体生成激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、苗勒氏管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整合素、血小板生成素(TPO)、神经生长因子(NGF)、NGF-β、血小板生长因子、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素、干扰素α、干扰素β、干扰素λ、集落刺激因子(CSF)、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、粒细胞-CSF(G-CSF)、白介素-1(IL-1)、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、kit配体、FLT-3、制管张素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子和LT(淋巴毒素)。
28.一种治疗癌症或传染病的方法，其包括向患有癌症或传染病的受试者施用选自以下各项的两种或更多种药剂的组合：(i)白细胞重新定向双特异性抗体；(ii)选自干扰素α、干扰素β、干扰素λ1、干扰素λ2和干扰素λ3的干扰素；(iii)检查点抑制子抗体；和(iv)抗体-药物缀合物(ADC)；
其中所述两种或更多种药剂的施用诱导白细胞介导的针对所述疾病的免疫应答。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述癌症是选自非何杰金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、伯基特淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、毛细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、华氏巨球蛋白血症、癌瘤、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤、皮肤癌、口腔癌、胃肠道癌、结肠癌、胃癌、肺道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、胆囊癌、肾癌和睾丸癌。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述传染病是感染有选自以下的病原体：小孢霉属、发癣菌属、表皮癣菌属、申克孢子丝菌、新型隐球菌、粗球孢子菌、荚膜组织胞浆菌、皮炎芽生菌、白色念珠菌、人类免疫缺陷性病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、流感病毒、人类乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病毒、Reo病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革热病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病毒白血病病毒、埃-巴二氏病毒、鼠类白血病毒白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口膜炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、蓝舌病病毒、炭疽杆菌、无乳链球菌、嗜肺军团菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、肺炎球菌属、B型流感嗜血杆菌、苍白密螺旋体、莱姆病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产布鲁氏菌、结核分枝杆菌和支原体属。
31.如权利要求28所述的方法，其还包括向所述受试者施用治疗剂。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述治疗剂是选自抗体、抗体片段、药物、毒素、酶、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、抗生素、激素、免疫调节剂、细胞因子、趋化因子、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、硼化合物和放射性同位素。
33.如权利要求28所述的方法，其还包括向所述受试者施用靶结合蛋白，其包含：
(a)第一多肽，其包含由第一肽连接子连接于VL-CL免疫球蛋白结构域的CL的第一单链Fv结合位点(scFv)；和
(b)第二多肽，其包含由第二肽连接子连接于VH-CH1免疫球蛋白结构域的CH1的第二单链Fv结合位点(scFv)，其中所述CH1是人类IgG1CH1；
其中所述第一scFv和所述第二scFv各自独立地形成靶结合位点，且其中所述VL区和所述VH区缔合以形成靶结合位点；其中所述第二肽连接子中的半胱氨酸残基与所述CL区形成二硫键；且其中所述三个靶结合位点结合于选自肿瘤相关抗原、病原体表达的抗原和由效应子T细胞、NK细胞、单核细胞或嗜中性粒细胞表达的抗原的抗原。
34.一种组合物，其包含选自以下各项的两种或更多种药剂：(i)白细胞重新定向双特异性抗体；(ii)选自干扰素α、干扰素β、干扰素λ1、干扰素λ2和干扰素λ3的干扰素；(iii)检查点抑制子抗体；和(iv)抗体-药物缀合物(ADC)；
其中所述组合物的施用诱导白细胞介导的针对所述疾病的免疫应答。
35.如权利要求34所述的组合物，其中所述白细胞重新定向双特异性抗体包含：
a)结合于选自以下各项的白细胞抗原的第一抗体或其抗原结合片段：ADAM17、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11a、CD11b、CD14、CD16、CD16b、CD25、CD28、CD30、CD32a、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD56、CD57、CD64、CD69、CD74、CD89、CD90、CD137、CD177、CEACAM6、CEACAM8、HLA-DRα链、KIR和SLC44A2；和
b)结合于选自以下各项的靶抗原或病原体的第二抗体或其抗原结合片段：碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、α-辅肌动蛋白-4、A3、A33抗体特异性抗原、ART-4、B7、Ba733、BAGE、BrE3抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1α、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-met、DAM、EGFR、EGFRvIII、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt-1、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、gp100、GROB、HLA-DR、HM1.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和其亚单位、HER2/neu、HMGB-1、低氧可诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、Ia、IGF-1R、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、KC4抗原、KS-1抗原、KS1-4、Le-Y、LDR/FUT、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC13、MUC16、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、胰腺癌粘蛋白、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、PlGF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活蛋白、存活蛋白-2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn抗原、汤姆森-弗里德里希抗原、肿瘤坏死抗原、TROP-2、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A-抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5、血管生成标记物、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、致癌基因产物、HIV病毒、结核分枝杆菌、无乳链球菌、抗甲氧西林性金黄色葡萄球菌、嗜肺军团菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、肺炎球菌、新型隐球菌、荚膜组织胞浆菌、B型流感嗜血杆菌、苍白密螺旋体、莱姆病螺旋体、铜绿假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产布鲁氏菌、狂犬病病毒、流感病毒、巨细胞病毒、I型单纯疱疹病毒、II型单纯疱疹病毒、人血清细小样病毒、呼吸道合胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、埃-巴二氏病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口膜炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒、蓝舌病病毒、仙台病毒、猫白血病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒、猿猴病毒40、小鼠乳腺瘤病毒、登革热病毒、风疹病毒、西尼罗河病毒、恶性疟原虫、间日疟原虫、刚地弓形虫、让氏锥虫、克氏锥虫、罗德西亚锥虫、布氏锥虫、曼森氏裂体吸虫、日本裂体吸虫、牛巴贝虫、艾美耳球虫、旋盘尾丝虫、热带利什曼虫、旋毛虫、小泰勒虫、泡状带绦虫、羊绦虫、牛肉绦虫、细粒棘球绦虫、科氏中殖孔绦虫、关节炎支原体、鼻支原体、口腔支原体、精氨酸支原体、拉氏无胆甾原体、唾液支原体和肺炎支原体。
36.如权利要求35所述的组合物，其中所述第一抗体或其片段结合于CD3。
37.如权利要求35所述的组合物，其中所述第二抗体或其片段结合于选自CD19、CD20、CD22、CD74、HLA-DR、TROP-2、MUC5ac、CEACAM5、CEACAM6、甲胎蛋白(AFP)和IGF-1R的抗原。
38.如权利要求35所述的组合物，其中所述第二抗体选自hR1(抗IGF-1R)、hPAM4(抗粘蛋白)、KC4(抗粘蛋白)、hA20(抗CD20)、hA19(抗CD19)、hIMMU31(抗AFP)、hLL1(抗CD74)、hLL2(抗CD22)、RFB4(抗CD22)、hMu-9(抗CSAp)、hL243(抗HLA-DR)、hMN-14(抗CEACAM5)、hMN-15(抗CEACAM6)、hRS7(抗TROP-2)、hMN-3(抗CEACAM6)、CC49(抗TAG-72)、J591(抗PSMA)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶IX)、英夫利昔单抗(抗TNF-α)、聚乙二醇化赛妥珠单抗(抗TNF-α)、阿达木单抗(抗TNF-α)、阿仑单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗EGFR)、吉姆单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(抗CD20)、帕尼单抗(抗EGFR)、利妥昔单抗(抗CD20)、托西莫单抗(抗CD20)、GA101(抗CD20)、曲妥单抗(抗HER2/neu)、托珠单抗(抗IL-6受体)、巴利昔单抗(抗CD25)、达克珠单抗(抗CD25)、依法利珠单抗(抗CD11a)、莫罗单抗-CD3(抗CD3受体)、那他珠单抗(抗α4整合素)、P4/D10(抗gp120)和奥玛珠单抗(抗IgE)。
39.如权利要求35所述的组合物，其中所述第二抗体选自hA19、hR1、hPAM4、hA20(维妥珠单抗)、hIMMU31、hLL1(米拉珠单抗)、hLL2(依帕珠单抗)、hMu-9、hL243、hMN-14、hMN-15、hRS7和hMN-3。
40.如权利要求34所述的组合物，其中所述干扰素是干扰素α。
41.如权利要求34所述的组合物，其中所述检查点抑制子抗体选自兰利珠单抗(MK-3475)、尼鲁单抗(BMS-936558)、AMP-224、MDX-1105、MEDI4736、MPDL3280A、BMS-936559、伊匹单抗、利利单抗、IPH2101(InnatePharma)和曲美目单抗。
42.如权利要求34所述的组合物，其中所述检查点抑制子抗体结合于选自CTLA4、PD1、PD-L1、LAG3、B7-H3、B7-H4、KIR和TIM3的抗原。
43.如权利要求34所述的组合物，其中所述抗体-药物缀合物是选自hLL1-多柔比星、hRS7-SN-38、hMN-14-SN-38、hLL2-SN-38、hA20-SN-38、hPAM4-SN-38、hLL1-SN-38、hRS7-Pro-2-P-Dox、hMN-14-Pro-2-P-Dox、hLL2-Pro-2-P-Dox、hA20-Pro-2-P-Dox、hPAM4-Pro-2-P-Dox、hLL1-Pro-2-P-Dox、P4/D10-多柔比星、吉姆单抗-奥佐米星、贝伦妥单抗-维多汀、曲妥单抗-安坦辛、伊珠单抗-奥佐米星、格巴妥莫单抗-维多汀、SAR3419、SAR566658、BIIB015、BT062、SGN-75、SGN-CD19A、AMG-172、AMG-595、BAY-94-9343、ASG-5ME、ASG-22ME、ASG-16M8F、MDX-1203、MLN-0264、抗PSMAADC、RG-7450、RG-7458、RG-7593、RG-7596、RG-7598、RG-7599、RG-7600、RG-7636、ABT-414、IMGN-853、IMGN-529、伏司妥珠单抗-马佛多汀和洛妥珠单抗-默坦辛。
44.如权利要求34所述的组合物，其中所述组合物包含选自以下各项的两种或更多种药剂：(i)白细胞重新定向双特异性抗体；(ii)干扰素α；和(iii)检查点抑制子抗体。
45.如权利要求34所述的组合物，其中所述组合物是选自：白细胞重新定向双特异性抗体(bsAb)加IFN-α；白细胞重新定向bsAb加检查点抑制子抗体；白细胞重新定向bsAb加IFN-α加检查点抑制子抗体；抗体-药物缀合物(ADC)加检查点抑制子抗体；ADC加白细胞重新定向bsAb；ADC加IFN-α加检查点抑制子抗体；ADC加IFN-α加白细胞重新定向bsAb；ADC加白细胞重新定向bsAb加检查点抑制子抗体；和ADC加白细胞重新定向bsAb加IFN-α加检查点抑制子抗体。
46.如权利要求34所述的组合物，其中所述白细胞重新定向双特异性抗体包含：
a)与AD(锚定结构域)部分缀合的第一抗体或其抗原结合片段，其中所述AD部分的氨基酸序列来自于AKAP蛋白质；和
b)与DDD(二聚和对接结构域)部分缀合的第二抗体或其抗原结合片段，其中所述DDD部分的氨基酸序列来自于蛋白激酶A(PKA)调节亚单位RIα、RIβ、RIIα或RIIβ；
其中所述DDD部分的两个拷贝形成二聚体，所述二聚体与所述AD部分的一个拷贝结合以形成复合物。
47.如权利要求46所述的组合物，其中所述DDD部分的氨基酸序列是选自RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIα的残基12-61和RIβ的残基13-66。
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