CN102481348A - 双特异性免疫细胞因子停靠-和-加锁(dnl)复合物及其治疗性用途 - Google Patents

双特异性免疫细胞因子停靠-和-加锁(dnl)复合物及其治疗性用途 Download PDF

Info

Publication number
CN102481348A
CN102481348A CN2010800385485A CN201080038548A CN102481348A CN 102481348 A CN102481348 A CN 102481348A CN 2010800385485 A CN2010800385485 A CN 2010800385485A CN 201080038548 A CN201080038548 A CN 201080038548A CN 102481348 A CN102481348 A CN 102481348A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
antibody
ifn
cell
people
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2010800385485A
Other languages
English (en)
Inventor
C-H·张
D·M·戈登堡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IBC Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
IBC Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US12/644,146 external-priority patent/US7981398B2/en
Priority claimed from US12/731,781 external-priority patent/US8003111B2/en
Priority claimed from US12/752,649 external-priority patent/US8034352B2/en
Priority claimed from US12/754,140 external-priority patent/US8722047B2/en
Priority claimed from US12/754,740 external-priority patent/US8562988B2/en
Application filed by IBC Pharmaceuticals Inc filed Critical IBC Pharmaceuticals Inc
Priority to CN201510830780.7A priority Critical patent/CN105566498A/zh
Publication of CN102481348A publication Critical patent/CN102481348A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/249—Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Abstract

本发明涉及使用停靠-和-加锁技术形成细胞因子-抗体复合物的方法和组合物。在优选的实施方案中，双特异性免疫细胞因子DNL构建体包含连接至Fab抗体片段和细胞因子的IgG抗体，其中IgG和Fab结合可在相同靶细胞上表达的不同靶抗原。双特异性免疫细胞因子DNL构建体与单独的细胞因子、单独的抗体、未缀合的细胞因子+抗体或甚至其它类型的细胞因子-抗体DNL构建体相比较显示提高的药代动力学、具有更长的血清半衰期和显著更强的效力。在最优选的实施方案中，所述构建体包含缀合至抗HLA-DR Fab和IFNα2b的抗CD20 IgG抗体，虽然抗体、抗体片段和细胞因子的其它组合可用于形成所述本发明的DNL复合物。

Description

双特异性免疫细胞因子停靠-和-加锁(DNL)复合物及其治疗性用途
交叉参考相关申请
本申请要求2010年4月6日提交的第12/754,740号美国专利申请；2010年4月5日提交的第12/754,140号美国专利申请；2010年4月1日提交的第12/752,649号美国专利申请；2010年3月25日提交的第12/731,781号美国专利申请；2009年12月22日提交的第12/644,146号美国专利申请；和2009年8月31日提交的第61/238,424号美国临时专利申请的优先权。每一个优先权申请通过引用整体并入本文。
政府资助
本工作部分由来自美国国立卫生研究院的美国国家癌症研究所的基金2R44CA108083-02A2支持。联邦政府可具有本发明的某些权利。
领域
本发明涉及双特异性抗体免疫细胞因子DNL构建体的组合物和使用方法，所述构建体包含第一和第二抗体或抗原结合抗体片段以及一个或多个拷贝的细胞因子。更常见地，本发明涉及任何DNL构建体的组合物和使用方法，在所述构建体中使用下面描述的DDD(二聚化和停靠结构域)和AD(锚定结构域)缀合技术将3种不同效应物部分连接在一起。第一和第二抗体或其片段优选结合两种不同的靶抗原。包含治疗性细胞因子的双特异性免疫细胞因子DNL构建体的施用将细胞因子高效地递送至靶细胞、组织或器官，同时允许提高药代动力学、给药方案和/或功效。双特异性免疫细胞因子构建体显示比单独的亲代抗体、单独的细胞因子、抗体与细胞因子的非缀合组合以及缀合至对照抗体的细胞因子更强的针对靶细胞的效力。在更优选的实施方案中，DNL构建体可包含与抗-CD20 IgG和抗-HLA-DR Fab连接的干扰素-α2b。在最优选的实施方案中，抗-CD20IgG是veltuzumab并且抗-HLA-DR Fab衍生自人源化L243抗体。所述DNL复合物在体外和体内显示对人淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞和其它造血癌症(hematopoietic cancer)的高毒性。然而本领域技术人员将了解，本发明的DNL复合物可包含具有针对可由任何肿瘤、自身免疫性疾病细胞或其它患病细胞表达的靶抗原的特异性的抗体或抗体片段的任何组合。类似地，本发明的DNL复合物可用于递送用于治疗许多种疾病例如癌症、免疫功能失调或自身免疫性疾病的任何治疗性细胞因子。本领域技术人员将进一步了解，本发明的双特异性复合物不限于细胞因子的递送，而且还可提供任何治疗性蛋白质、肽或本领域内已知的其它治疗性效应物部分的高效递送。
发明背景
在美国，2009年有65,980例非-何杰金氏淋巴瘤(NHL)的新发病例并且有19,500人死于该疾病(Jemal等人，CA Cancer J Clin2009；59：225-49)。约一半NHL患者的一线治疗未获成功并且鲜有治愈的(McLaughlin等人，J Clin Oncol 1998；16：2825-33)。除了NHL外，还存在20,580例多发性骨髓瘤(MM)新病例并且有10,580人死于该疾病(Jemal等人，CA Cancer J Clin 2009；59：225-49)。干扰素-α(IFNα)的临床活性在NHL治疗中得到确定(Amitage等人，Bone MarrowTransplant 2006；38：701-2；Ann Oncol 2000；11：359-61)，并且将IFNα添加至利妥昔单抗免疫疗法已显示某些临床有利方面(Davis等人，Clin Cancer Res 2000；6：2644-52；Kimby等人，Leuk Lymphoma2008；49：102-12)。可获得的数据表明IFNα提高了MM患者的无疾病进展存活率，但益处很小并且其使用因毒性而仍有争议(Gisslinger和Kees，Wien Klin Wochenschr 2003；115：451-61)。
已报导干扰素-α(IFNα)在癌症的动物模型(Ferrantini等人，1994，J Immunol 153：4604-15)和人癌症患者(Gutterman等人，1980，AnnIntern Med 93：399-406)中都具有抗-肿瘤活性。IFNα可产生多种直接抗-肿瘤效应，包括癌基因的下调、肿瘤抑制基因的上调、经增加的肿瘤表面MHC I型蛋白质的表达产生的免疫识别的增强、细胞凋亡的增强以及对化学治疗剂的敏化(Gutterman等人，1994，PNAS USA91：1198-205；Matarrese等人，2002，Am J Pathol 160：1507-20；Mecchia等人，2000，Gene Ther 7：167-79；Sabaawy等人，1999，Int J Oncol14：1143-51；Takaoka等人，2003，Nature 424：516-23)。
对于某些肿瘤，IFNα可通过STAT1的激活而具有直接且有力的抗-增殖效应(Grimley等人，1998 Blood 91：3017-27)。间接地，IFNα可抑制血管生成(Sidky和Borden，1987，Cancer Res 47：5155-61)并且刺激宿主免疫细胞，这对于总体抗肿瘤反应是至关重要的但一直被大大低估(Belardelli等人，1996，Immunol Today 17：369-72)。IFNα通过对髓样细胞(Raefsky等人，1 985，J Immunol 135：2507-1 2；Luft等人，1998，J Immunol 161：1947-53)、T细胞(Carrero等人，2006，J Exp Med203：933-40；Pilling等人，1999，Eur J Immuol 29：1041-50)和B细胞(Le等人，2001，Immunity 14：461-70)的效应而具有对免疫反应的多效性影响。作为天然免疫系统的重要调节剂，IFNα诱导树突细胞的快速分化和活化(Belardelli等人，2004，Cancer Res 64：6827-30；Paquette等人，1998，J Leukoc biol 64：358-67；Santini等人，2000，JExp med 191：1777-88)并且增强NK细胞的细胞毒性、迁移、细胞因子产量和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(Biron等人，1999，Annu RevImmunol 17：189-220；Brunda等人1984，Cancer Res 44：597-601)。
IFNα作为癌症治疗剂的希望一直以来主要因其短暂的循环半衰期和全身性毒性而受到阻碍。IFNα2的PEG化形式显示增加的循环时间，这增加了它们的生物功效(Harris和Chess，2003，Nat Rev DrugDiscov 2：214-21；Osborn等人，2002，J Pharmacol Exp Ther 303：540-8)。IFNα与单克隆抗体(MAb)的融合可提供与PEG化相似的益处，包括减少的肾清除率、提高的溶解度和稳定性以及显著增加的循环半衰期。该融合的直接临床益处是需要更低的频率和更低的剂量，从而允许延长的治疗浓度。
使用针对肿瘤相关抗原(TAA)的MAb将IFNα靶向肿瘤可显著增加其肿瘤粘连(accretion)和贮留(retention)同时限制其全身性浓度，从而增加治疗指数。IFNα的增加的肿瘤浓度可增加其直接抗增殖、细胞凋亡和抗-血管生成活性，以及引发和集中抗肿瘤免疫反应。事实上，使用同基因型鼠IFNα-分泌性转基因肿瘤的小鼠的研究显示了由IFNα的局部浓度引发的增强的免疫反应(Ferrantini等人，2007，Biochimie 89：884-93)。
CD20是用于使用MAb-IFNα进行的B细胞淋巴瘤的治疗的吸引人的候选TAA。利用利妥昔单抗的抗-CD20免疫疗法是抗淋巴瘤的最成功疗法之一，其具有相对低的毒性(McLaughlin等人，1998，J ClinOncol 16：2825-33)。由于利妥昔单抗是可在某些患者群体中显示免疫原性并且对于最初施用具有相当长的输注时间的嵌合抗体(Cheson等人，2008，NEJM 359：613-26)，所以更好的用于CD20-靶向的候选物是人源化MAb，veltuzumab(Stein等人，2004，Clin Cancer Res10：2868-78)。
目前处于临床评定下的使用利妥昔单抗和IFNα的联合治疗已显示高于单独的利妥昔单抗的提高的功效(Kimby等人，2008，LeukLymphoma 49：102-12；Salles等人，2008，Blood 112：4824-31)。这些研究显示该组合的某些有利方面以及与IFNα相关的缺点。除了每周一次利用利妥昔单抗的输注外，患者通常还要在数月时间中每周施用IFNα3次，遭受流感样症状，所述症状为与IFNα疗法相关的常见副作用并且限制可耐受剂量。抗体-IFNα缀合物可允许以更少的剂量以更低的频率施用单一试剂，限制或消除了副作用，并且可产生高得多的功效。然而，几乎不表达或不表达CD20的淋巴瘤和白血病预期对利用免疫缀合的抗-CD20-IFNα构建体的治疗有抗性。在本领域存在对可将IFN-α或其它治疗性细胞因子靶向两种或更多种不同的肿瘤相关抗原例如CD20和HLA-DR，提供更有效的抗许多种造血恶性肿瘤和其它恶性肿瘤的治疗的双特异性免疫细胞因子构建体的需要。
人白细胞抗原-DR(HLA-DR)是主要组织相容性复合体(MHC)II型抗原的3种同种型之一。HLA-DR在多种造血恶性肿瘤和某些实体瘤上高度表达，并且已被活跃地用于基于抗体的淋巴瘤治疗(Brown等人，2001，Clin Lymphoma 2：188-90；DeNardo等人，2005，Clin CancerRes 11：7075s-9s；Stein等人，2006，Bloood 108：2736-44)。初步研究显示抗-HLA-DR mAb在淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤的体外和体内实验中比具有当前临床益处的其它裸mAb明显更有效力(Stein等人，未公布的结果)。HLA-DR也在一组正常免疫细胞(包括B细胞、单核细胞/巨噬细胞、郎格尔汉斯细胞、树突细胞和活化的T细胞)上表达(Dechant等人，2003，Semin Oncol 30：465-75)。
概述
本发明涉及包含三种或更多种不同效应物部分例如抗原、抗体片段和细胞因子的停靠-加锁(DNL)构建体(复合物)的组合物及使用方法。然而，本领域技术人员知道DNL构建体不限定于此并且使用的效应物部分可包含可被连接至DDD或AD部分的任何蛋白质、肽或其它分子。用于DNL构建体中的效应物部分包括但不限于蛋白质、肽、抗体、抗体片段、免疫调节剂、细胞因子、激素、酶、反义寡核苷酸例如siRNA、毒素例如核糖核酸酶、异种抗原、聚乙二醇(PEG)和其它聚合物、抗-血管生成剂、细胞毒素剂、促细胞凋亡剂和其它已知的治疗剂。
优选的实施方案涉及包含三种不同效应物部分-第一和第二抗体或抗体片段以及一个或多个拷贝的细胞因子的DNL构建体。在最优选的实施方案中，DNL构建体包含抗-CD20抗体，例如veltuzumab、抗-HLA-DR抗体片段例如hL243和细胞因子例如IFN-α2b。此类DNL构建体对于造血恶性肿瘤和表达CD20、HLA-DR或两者的其它肿瘤的治疗是高度有效的。虽然多功能复合物的每一种组分(veltuzumab、抗-HLA-DR Fab和IFN-α2b)独立地具有抗-肿瘤活性，但所述组合的构建体显示比任何单一成分或以未缀合的形式施用的单一成分的混合物更大的功效。
在具体的实施方案中，DNL构建体可包含人源化抗-HLA-DR抗体或其片段，例如hL243抗体，其包含连接至人抗体构架(FR)和恒定区序列的重链CDR序列CDR1(NYGMN，SEQ ID NO：1)、CDR2(WINTYTREPTYADDFKG，SEQ ID NO：2)和CDR3(DITAVVPTGFDY，SEQ ID NO：3)以及轻链CDR序列CDR1(RASENIYSNLA，SEQ ID NO：4)、CDR2(AASNLAD，SEQ IDNO：5)和CDR3(QHFWTTPWA，SEQ ID NO：6)(参见人，例如，第7,612,180号美国专利，其实施例部分通过引用并入本文)。在优选的实施方案中，人源化L243抗体还可包含来自鼠L243(mL243)重链的替代的构架残基27、38、46、68和91的一个或多个残基和/或来自mL243轻链的替代的构架残基37、39、48和49的一个或多个残基。可在美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD(参见登录号ATCCHB55)获得mL243。
在其它具体的实施方案中，DNL构建体可包含人源化抗-CD20抗体或其片段，例如veltuzumab，其包含轻链可变区CDR1(RASSSVSYIH，SEQ ID NO：7)；CDR2(ATSNLAS，SEQ IDNO：8)；和CDR3(QQWTSNPPT，SEQ ID NO：9)；以及重链可变区CDR1(SYNMH，SEQ ID NO：10)；CDR2(AIYPGNGDTSYNQKFKG，SEQ ID NO：11)和CDR3(STYYGGDWYFDV或VVYYSNSYWYFDV，SEQ ID NO：12)(参见，例如，第7,435,803号美国专利，其实施例部分通过引用并入本文)。
在更具体的实施方案中，DNL构建体可包含人IFN-α2b氨基酸序列。包含此类序列的克隆可从多个来源商购获得，例如全长人IFNα2b cDNA克隆(Ultimate ORF人克隆cat# HORF01Clone IDIOH35221，Invitrogen，Carlsbad，CA)。
在各种实施方案中，DNL构建体可包含一种或多种结合除CD20和/或HLA-DR外的抗原的抗体或其片段。在优选的实施方案中，所述抗原可选自碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤连蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。
可利用的示例性抗体包括但不限于hR1(抗-IGF-1R，2010年12月3日提交的第12/722,645号美国专利申请)、hPAM4(抗-粘蛋白，第7,282,567号美国专利)、hA20(抗-CD20，第7,251,164号美国专利)、hA19(抗-CD19，第7,109,304号美国专利)、hIMMU31(抗-AFP，第7,300,655号美国专利)、hLL1(抗-CD74，第7,312,318号美国专利)、hLL2(抗-CD22，第7,074,403号美国专利)、hMu-9(抗-CSAp，第7,387,773号美国专利)、hL243(抗-HLA-DR，第7,612,180号美国专利)、hMN-14(抗-CEACAM5，第6,676,924号美国专利)、hMN-15(抗-CEACAM6，第7,541,440号美国专利)、hRS7(抗-EGP-1，第7,238,785号美国专利)和hMN-3(抗-CEACAM6，第7,541,440号美国专利申请)，每一个引用的专利或申请的实施例部分通过引用并入本文。本领域技术人员将了解，该列表不是限制性的并且可使用任何已知的抗体，如在下面更详细地论述的。
可被整合进入DNL构建体的示例性细胞因子包括但不限于MIF(巨噬细胞游走抑制因子)、HMGB-1(高迁移率族框蛋白1)、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-23、IL-24、CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1、RANTES、MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-1、IP-10、Gro-β、嗜酸细胞活化趋化因子(Eotaxin)、干扰素-α、-β、-λ、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配体、红细胞生成素、血小板生成素、CNTF、瘦素、制癌蛋白M、VEGF、EGF、FGF、PlGF、胰岛素、hGH、降钙素、因子VIII、IGF、促生长素抑制素、组织型纤溶酶原激活物和LIF。每一个引用的细胞因子的人形式的序列在本领域内是已知的(参见例如NCBI数据库)并且编码许多示例性细胞因子的克隆可从Invitrogen、美国典型培养物保藏中心和本领域内已知的其它来源商购获得。
多种实施方案可涉及本发明的DNL构建体用于治疗或诊断疾病的用途，所述疾病包括但不限于非-何杰金氏淋巴瘤、B细胞急性和慢性淋巴性白血病、伯基特淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、多毛细胞白血病，急性和慢性髓样白血病、T细胞淋巴瘤和白血病、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、癌症、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤和皮肤癌。癌症可选自口腔癌、胃肠道癌、肺道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌、宫颈癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、胆囊癌、肾癌、皮肤癌和睾丸癌。此外，本发明的DNL构建体可用于治疗自身免疫性疾病例如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham′s chorea)、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、链球菌感染后的肾炎(post-streptococcal nephritis)、结节性红斑、高安(氏)动脉炎(Takayasu′sarteritis)、艾迪生病(Addison′s disease)、类风湿性关节炎、多发性硬化、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、关节强硬性脊椎炎、古德帕斯丘综合征(Goodpasture′s syndrome)、血栓闭塞性脉管炎(thromboangitisubiteran)、斯耶格伦综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳氏肉芽肿(Wegener′s granulomatisis)、膜性肾病、肌萎缩侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、银屑病或纤维性肺泡炎。在某些实施方案中，受试抗体可用于治疗白血病例如慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性髓样白血病或急性髓样白血病。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物可用于治疗患有代谢疾病例如淀粉样变性或神经退行性疾病例如阿尔茨海默病的受试者。此外，本发明的药物组合物可用于治疗患有免疫失调障碍的受试者。
附图简述
下列附图形成本说明书的部分并且被用于进一步说明本发明的某些实施方案。通过参考与本文中提供的具体实施方案的详细描述结合的这些附图的一个或多个，可更好地理解所述实施方案。
图1.显示细胞因子-MAb DNL构建体与PEG化或天然IFNα相比较的体外IFNα活性。如实施例中所述测量的比活性(IU/pmol)。从rhIFNα2b标准曲线推断已知浓度的每一种试验品的活性。在浓度递增的20-2b(●)、734-2b(■)、v-mab(○)、v-mab+734-2b(□)、PEGASYS(▼)、PEG-Intron(▲)或1R-2b(▽)存在的情况下生长培养物，并且利用MTS测量相对活细胞密度。将获自未处理的细胞的信号％对摩尔浓度的对数作图。使用Prism软件产生剂量-反应曲线和EC50值。误差棒，SD。(A)基于细胞的报告基因测定。(B)利用EMC病毒和A549细胞的病毒保护测定。(C)使用Daudi细胞的体外淋巴瘤增殖测定。(D)使用Jeko-1细胞的体外淋巴瘤增殖测定。
图2.显示Swiss-Webster小鼠的药代动力学分析的结果。给小鼠施用20-2b、α2b-413、佩乐能(PEGINTRON)或派罗欣(PEGASYS)，并且在96个小时内中利用ELISA分析血清样品的IFNα2b浓度。显示血清消除曲线。血清半衰期(T1/2)消除速率和平均滞留时间(MRT)概述于插入的表中。
图3.(A)举例说明20-2b的ADCC效应子功能。在细胞裂解的定量之前，在新鲜分离的PBMC存在的情况下，利用5μg/ml的20-2b、22-2b、v-mab、依帕珠单抗(e-mab)或h734温育Daudi或Raji细胞4小时。(B)显示20-2B的CDC效应子功能。在人补体存在的情况下，利用系列稀释的20-2b(●)、734-2b(■)或v-mab(○)温育Daudi细胞。将补体对照％(与只利用补体处理的细胞相比较的测试样品的活细胞的数目)对nM浓度的对数作图。误差棒，SD。
图4.显示20-2b增强来自全血的NHL细胞的消耗。将新鲜的肝素化人血与Daudi或Ramos混合并且利用0.01、0.1或1nM的20-2b(●)、v-mab(○)、734-2b(■)或v-mab+734-2b(□)温育2天。使用流式细胞术评估所示处理对淋巴瘤和外周血淋巴细胞的作用。误差棒，SD。
图5.(A)举例说明显示20-2b在播散性伯基特淋巴瘤(disseminatedBurkitt’s lymphoma)(Daudi)异种移植模型中的治疗功效。在第0天给雌性C.B.17 SCID小鼠静脉内施用Daudi细胞。处理由以单次皮下剂量提供的20-2b(●)、734-2b(■)、v-mab(○)、PEGASYS(▼)或盐水(X)组成。处理的天数用箭头指示。使用Prism软件分析存活曲线。在早期Daudi模型中。在第1天给10只小鼠的组施用0.7pmol(实线)或0.07pmol(虚线)的单次剂量。(B)显示与图6(A)的相似但在晚期Daudi模型中进行的研究。在第7天给10只小鼠的组施用0.7pmol(实线)、7pmol(虚线)或70pmol(灰色线)的单次剂量。
图6.(A)显示20-2b在播散性伯基特淋巴瘤(Raji和NAMALWA)异种移植模型中的治疗功效的存活曲线。在第0天给雌性C.B.17SCID小鼠静脉内施用NHL细胞。处理由以皮下剂量给予的20-2b(●)、734-2b(■)、v-mab(○)或盐水(X)组成。处理的天数用箭头指示。使用Prism软件分析存活曲线。在晚期Raji模型中。10只小鼠的组在第5、7、9、12、14和16天接受250pmol的剂量。(B)显示与图7(A)的相似但在早期NAMALWA模型中的研究。6只小鼠的组在第1、3、5、8、10和127天接受250pmol剂量的20-2b或734-2b或在第1、5、9、13、17、21和25天接受3.5nmol剂量的v-mab。
图7.显示使用EPO标准、734-EPO或EPO-DDD2处理72小时的TF1细胞的EPO活性的基于细胞的测定的结果。使用Graph PadPrism软件产生剂量反应曲线和EC50值。
图8.20-C2-2b的生物活性。A和B，显示MAb和MAb-IFNα对活NHL细胞(Raji或RL)的结合的间接免疫荧光。在用PE-缀合的山羊-抗人Fc探测之前，在5nM(A)或0.2-50nM(B)的所示构建体存在的情况下于4℃温育细胞1小时。MFI，平均荧光强度；误差棒，95％CI。(C)使用基于细胞的报告基因测定法测定的IFNα2比活性显示为IU/pmol的完整分子和IU/pmol的IFNα2b。
图9.NHL和MM细胞的细胞凋亡。在利用流式细胞数定量膜联蛋白-V-阳性细胞％之前处理细胞48小时。(A)对于Daudi：v-mab和hL243γ4p为10pM；20-C2-2b、20-2b-2b和V+L243+2b(v-mab、hL243γ4p和734-2b-2b的混合物)为1pM。对于Jeko-1，全部处理在0.5nM上进行。(B)以1、0.1和0.01nM处理CAG。(C)以20和2nM处理KMS12-BM。V+L243，v-mab和hL243γ4p的混合物；L243+2b、hL243γ4p和734-2b-2b的混合物。
图10.多发性骨髓瘤细胞系的表征。(A)所选择的骨髓瘤细胞系上的HLA-DR和CD20的抗原密度。在利用hL243γ4p、v-mab或hMN-14(同种型对照MAb)温育30分钟后，利用PE-山羊抗-人IgG(Fab)探测细胞，利用流式细胞术分析细胞。(B)黑素瘤细胞系对IFNα2的相对敏感性。在利用MTS定量活细胞之前，在3nM聚乙二醇干扰素α-2b存在或不存在的情况下温育细胞4天。
图11.多发性骨髓瘤的体外细胞毒性。在浓度递增的所示构建体或组合存在的情况下培养所示细胞系，利用MTS测量相对活细胞密度。将获自未处理的细胞的信号％对摩尔浓度的对数作图。使用Prism软件产生剂量-反应曲线和EC50值。误差棒，SD。
图12.增强的来自全血的NHL细胞的消耗。将新鲜的肝素化人血与Daudi混合，与1nM的所示Mab-IFNα或MAb一起温育2天。利用流式细胞术评估对Daudi、B细胞、T细胞和单核细胞的作用。误差棒，SD。
发明详述
定义
除非另外明确地指出，否则″一″或″一个″可指“一个或多个”。
本文所使用的术语“和”与“或”可用于合取(conjunctive)或析取(disjunctive)。也就是说，除非另有说明，否则这两个术语应当理解为等同于“和/或”。
“治疗剂”是可用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、光敏剂、染料和放射性同位素。
“诊断剂”是可用于诊断疾病的原子、分子或化合物。有用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料(例如带有生物素-链霉抗生物素蛋白复合物)、造影剂、荧光化合物或分子以及用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如顺磁离子)。
本文所使用的“抗体”是指全长(即天然存在的或经标准免疫球蛋白基因片段重组方法而形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即特异性结合)部分，如抗体片段。“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
“裸抗体”是未与治疗剂或诊断剂连接的抗体或其抗原结合片段。完整裸抗体的Fc部分可提供效应子功能，例如补体结合和ADCC(参见，例如，Markrides，Pharmacol Rev 50：59-87，1998)。裸抗体籍以诱导细胞死亡的其它机制可包括细胞凋亡。(Vaswani和Hamilton，AnnAllergy Asthma Immunol 81：105-119，1998.)。
“抗体片段”是完整抗体的部分，例如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv、sFv、scFv等。无论其结构如何，抗体片段所结合的抗原与完整抗体所识别的抗原相同。抗体片段包括由可变区组成的分离的片段(例如由重链和轻链可变区组成的“Fv”片段)或重组单链多肽分子(其中轻链和重链可变区由肽连接体连接(“scFv蛋白”))。“单链抗体”(通常缩写为“scFv”)由包含相互作用以形成抗原结合部位的VH和VL结构域的多肽链组成。VH和VL结构域通常由1至25个氨基酸残基的肽连接。抗体片段还包括双链抗体、三链抗体和单结构域抗体(dAb)。
如果所施用的剂量具有生理上的意义时，就可以说是以“治疗有效量”施用抗体或免疫缀合物制剂或本文所述的组合物。如果试剂的存在导致受体受试者的生理状态的可检测的变化，则该试剂就具有生理上的意义。在具体的实施方案中，如果抗体制剂的存在引起抗肿瘤反应或减轻自身免疫性疾病状态的体征和症状时，该抗体制剂就具有生理上的意义。生理意义的效果也可以是诱发受体受试者的体液和/或细胞免疫反应，导致靶细胞的生长抑制或死亡。
停靠和加锁(DNL)法
“停靠-和-加锁”(DNL)法利用cAMP依赖的蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚基与A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定结构域(AD)之间发生的特定的蛋白质间相互作用(Baillie等人，FEBS Letters.2005；579：3264.Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。PKA(在被最详尽研究的通过第二信使cAMP与R亚基的结合触发的信号传导途径之一中起着主要作用)于1968年首次从兔子分离(Walsh等人，J.Biol.Chem.1968；243：3763)。全酶的结构由两个催化亚基组成，这两个亚基通过R亚基维持无活性形式(Taylor，J.Biol.Chem.1989；264：8443)。发现PKA的同功酶类具有两类R亚基(RI和RII)，并且每一类具有α和β同种型(Scott，Pharmacol.Ther.1991；50：123)。R亚基只以稳定的二聚体被分离，而且已显示二聚化结构域由前44个氨基端残基组成(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：222)。cAMP与R亚基的结合导致用于广谱丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚基的释放，所述释放通过PKA经由其与AKAP的停靠的区室化被定向至所选择的底物(Scott等人，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。
由于第一AKAP，微管缔合蛋白2，于1984年得以表征(Lohmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984；81：6723)，在酵母至人类的物种范围中已鉴定出了超过50种具有不同结构的定位至不同亚细胞位置(包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网)的AKAP(Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。PKA的AKAP的AD是14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等人，J.Biol.Chem.1991；266：14188)。AD的氨基酸序列在个体AKAP中是相当多变的，所报道的对RII二聚体的结合亲和力范围为2至90nM(Alto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100：4445)。有趣地，AKAP将只结合二聚R亚基。对于人RII，AD结合由23个氨基末端残基形成的疏水表面(Colledge和Scott，Trends Cell Biol.1999；6：216)。因此，人RIIα的二聚化结构域和AKAP结合结构域都位于相同的N末端44个氨基酸序列中(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：222；Newlon等人，EMBO J.2001；20：1651)，所述氨基酸序列在本文中称为DDD。
作为连接模块(Linker Module)的人RIIα的DDD和AKAP的AD
我们已开发了这样的平台技术，其利用人RIIα的DDD和AKAP蛋白的AD作为一对优良的连接模块以用于将在下文中称为A和B的实体的任何组合停靠至非共价复合物中，非共价复合物可通过将半胱氨酸残基引入DDD和AD两者的战略位置上以促进二硫键的形成而进一步锁入稳定束缚的结构中。“停靠-和-加锁”法的一般方法如下。通过将DDD序列与A的前体连接(结果产生在下文中称为a的第一组分)来构建的实体A。因为DDD序列可引起二聚体的自发形成，因此A可由a2组成。可通过将AD序列与B的前体连接(结果产生在下文中称为b的第二组分)来构建实体B。a2中包含的DDD的二聚基元可产生用于与b中包含的AD序列结合的停靠位点，从而促进a2与b的容易缔合以形成由a2b组成的三聚复合物。这样的结合事件因后续反应而不可逆地进行，所述后续反应通过二硫桥共价保护了所述两个实体，所述反应基于有效的局部浓缩的原理非常有效地发生，因为起始结合相互作用应当使置于DDD和AD上的反应性硫醇基靠近(Chmura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98：8480)以便进行位点特异性连接。虽然在某些实施方案中，a2亚基可包含两个相同的效应物部分，但在下文中描述的优选的实施方案中，a2亚基可包含不同的效应物部分，每一个效应物与相同的DDD序列连接。因此，三聚a2b复合物可包含三种不同的效应物部分。
在优选的实施方案中，免疫细胞因子DNL构建体可基于a2b结构的变化，其中第一和第二效应物与DDD部分连接并且第三效应物与AD部分连接。每一个AD部分能够结合以二聚体形式存在的两个DDD部分。通过连接远离前体的官能团的DDD和AD，此类位点特异性连接也预期保持前体的原始活性。该方法本质上是模块并且潜在地可用于位点特异性和共价地连接许多种物质。DNL法公开于第7,550,143号；第7,521,056号；第76,534,866号；第7,527,787号和第7,666,400号美国专利中，每一个专利的实施例部分通过引用并入本文。
在优选的实施方案中，效应物部分是可与DDD或AD部分连接与形成融合蛋白或肽的蛋白质或肽，更优选抗体、抗体片段或细胞因子。用于制备融合蛋白的多种方法是已知的，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目的融合蛋白的合成双链核酸。可利用标准分子生物学技术(参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning，Alaboratory manual，第2版，1989)将此类双链核酸插入用于融合蛋白产生的表达载体。在此类优选的实施方案中，可将AD和/或DDD部分与效应蛋白或肽的N末端或C末端连接。然而，本领域技术人员将会知道，AD或DDD部分至效应物部分的连接的位点可取决于效应物部分的化学性质而变化，并且效应物部分的部分牵涉其生理活性。在最优选的实施方案中，AD或DDD部分至抗体或抗体片段的连接可在重链亚单位的C末端、来自抗原结合部位的分子的相对末端上发生。然而，如下文中所论述的，也可使用至抗体或抗体片段的N末端连接，同时保持抗原结合活性。可使用本领域已知的技术例如使用二价交联试剂和/或其它化学缀合技术来进行多种效应物部分的位点特异性连接。
DDD和AD序列变体
在某些实施方案中，整合入免疫细胞因子DNL复合物的AD和DDD序列包含下文中的DDD1和AD1的氨基酸序列。在更优选的实施方案中，AD和DDD序列包含DDD2和AD2的氨基酸序列，所述序列经设计促进DDD与AD部分之间二硫键的形成。
DDD1
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：13)
DDD2
CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：14)
AD1
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：15)
AD2
CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：16)
本领域技术人员将会了解，DDD1和DDD2包含蛋白激酶A的人RIIα形式的DDD序列。然而，在可选择的实施方案中，DDD和AD部分可基于蛋白激酶A的人RIIα形式的DDD序列和相应的AKAP序列，如下文中的DDD3、DDD3C和AD3中所举例说明的。
DDD3
SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO：17)
DDD3C
MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO：18)
AD3
CGFEELAWKIAKMIWSDVFQQGC(SEQ ID NO：19)
还可设计和利用基于已知的人RIβ和RIIβ氨基酸序列的其它可选择的DDD部分(参见，例如，NCBI登录号NP_001158233和NP_002727，下文中的序列)。
人PKA RIβ氨基酸序列
MASPPACPSE EDESLKGCEL YVQLHGIQQV LKDCIVHLCI SKPERPMKFL
REHFEKLEKE ENRQILARQK SNSQSDSHDE EVSPTPPNPV VKARRRRGGV
SAEVYTEEDA VSYVRKVIPK DYKTMTALAK AISKNVLFAH LDDNERSDIF
DAMFPVTHIA GETVIQQGNE GDNFYVVDQG EVDVYVNGEW VTNISEGGSF
GELALIYGTP RAATVKAKTD LKLWGIDRDS YRRILMGSTL RKRKMYEEFL
SKVSILESLE KWERLTVADA LEPVQFEDGE KIVVQGEPGD DFYIITEGTA
SVLQRRSPNE EYVEVGRLGP SDYFGEIALL LNRPRAATVV ARGPLKCVKL
DRPRFERVLG PCSEILKRNI QRYNSFISLT V(SEQ ID NO：20)
人PKA RIβ氨基酸序列
MSIEIPAGLT ELLQGFTVEV LRHQPADLLE FALQHFTRLQ QENERKGTAR
FGHEGRTWGD LGAAAGGGTP SKGVNFAEEP MQSDSEDGEE EEAAPADAGA
FNAPVINRFT RRASVCAEAY NPDEEEDDAE SRIIHPKTDD QRNRLQEACK
DILLFKNLDP EQMSQVLDAM FEKLVKDGEH VIDQGDDGDN FYVIDRGTFD
IYVKCDGVGR CVGNYDNRGS FGELALMYNT PRAATITATS PGALWGLDRV
TFRRIIVKNN AKKRKMYESF IESLPFLKSL EFSERLKVVD VIGTKVYNDG
EQIIAQGDSA DSFFIVESGE VKITMKRKGK SEVEENGAVE IARCSRGQYF
GELALVTNKP RAASAHAIGT VKCLAMDVQA FERLLGPCME IMKRNIATYE
EQLVALFGTN MDIVEPTA(SEQ IDNO：21)
在其它可选择的实施方案中，AD和/或DDD部分的不同序列变体可用于双特异性免疫细胞因子DNL复合物的构建。AD与DDD结构域的结构-功能关系一直是调查研究的主题。(参见，例如，Burns-Hamuro等人，2005，Protein Sci 14：2982-92；Carr等人，2001，J Biol Chem 276：17332-38；Alto等人，2003，Proc Natl Acad Sci USA100：4445-50；Hundsrucker等人，2006，Biochem J 396：297-306；Stokka等人，2006，Biochem J 400：493-99；Gold等人，2006，Mol Cell24：383-95；Kinderman等人，2006，Mol Cell 24：397-408，每一个文献的完整文本通过引用并入本文)。
例如，Kinderman等人(2006)检验了AD-DDD结合相互作用的晶体结构并且得出人DDD序列包含许多保守氨基酸残基(所述氨基酸残基在二聚体形成和AKAP结合中特别重要)，在下列的序列中加下划线。(参见Kinderman等人，2006的图1，所述文献通过引用并入本文)。本领域技术人员将理解在设计DDD序列的序列变体中，期望地避免改变任何加下划线的残基，然而可对对于二聚化和AKAP结合不太紧要的残基进行保守氨基酸替代。因此，用于构建DNL复合物的潜在可选择的DDD序列示于下列序列中，其中“X”表示保守氨基酸替代。保守氨基酸序列替代在下文中进行更详细的论述，但可包括例如天冬氨酸残基替代谷氨酸残基或者亮氨酸或缬氨酸残基替代异亮氨酸残基等。此类保守氨基酸替代在本领域是公知的。
来自蛋白激酶A的人DDD序列
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：13)
XXIXIXXXLXXLLXXYXVXVLXXXXXXLVXFXVXYFXXLXXXXX(SEQ ID NO：22)
Alto等人(2003)进行了多种AKAP蛋白的AD序列的生物信息学分析以设计下文中显示的称为AKAP-IS的RII选择性AD序列，其具有0.4nM的对DDD的结合常数。AKAP-IS序列被设计为结合PKA的AKAP的肽拮抗剂。其中替代倾向于减少与DDD的结合的AKAP-IS序列中的残基在下列的序列中加下划线。因此，本领域技术人员将会了解，可发挥DNL构建体的功能的变体由下列序列指示，其中“X”是保守氨基酸替代。
AKAP-IS序列
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：15)
XXXXXAXXIVXXAIXXX(SEQ ID NO：23)
类似地，Gold(2006)利用晶体学和肽筛选来开发下文中显示的SuperAKAP-IS序列，其显示对PKA的RII同种型的选择性高出对RI同种型的选择性5个数量级。加下划线的残基表示相对于AKAP-IS序列的氨基酸替代的位置，所述替代增加与RIIα的DDD部分的结合。在该序列中，N末端Q残基被编号为残基号4并且C末端A残基是残基号20。其中可进行替代以影响对RIIα的亲和力的残基为残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等人，2006)。预期在某些可选择的实施方案中，可用SuperAKAP-IS序列替代AKAP-IS AD部分序列以制备双特异性免疫细胞因子DNL构建体。可被用于替代AKAP-IS AD序列的其它可选择的序列示于下文中。加下划线相对于AKAP-IS序列的替代。预期，关于AKAP-IS序列，AD部分还可包括额外的N末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C末端残基甘氨酸和半胱氨酸。
SuperAKAP-IS
QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ ID NO：24)
可选择的AKAP序列
QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：25)
QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：26)
QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：27)
Gold等人的图2公开了下文中显示的来自多种AKAP蛋白的额外DDD-结合序列。
RII-特异性AKAP
AKAP-KL
PLEYQAGLLVQNAIQQAI(SEQ ID NO：28)
AKAP79
LLIETASSLVKNAIQLSI(SEQ ID NO：29)
AKAP-Lbc
LIEEAASRIVDAVIEQVK(SEQ ID NO：30)
RI-特异性AKAP
AKAPce
ALYQFADRFSELVISEAL(SEQ ID NO：31)
RIAD
LEQVANQLADQIIKEAT(SEQ ID NO：32)
PV38
FEELAWKIAKMIWSDVF(SEQ ID NO：33)
Dual-特异性AKAP
AKAP7
ELVRLSKRLVENAVLKAV(SEQ ID NO：34)
MAP2D
TAEEVSARIVQVVTAEAV(SEQ ID NO：35)
DAKAP1
QIKQAAFQLISQVILEAT(SEQ ID NO：36)
DAKAP2
LAWKIAKMIVSDVMQQ(SEQ ID NO：37)
Stokka等人(2006)还开发了下文中显示的结合PKA的AKAP的肽竞争剂。所述肽拮抗剂被命名为Ht31、RIAD和PV-38。Ht-31肽显示更大的对PKA的RII同种型的亲和力，而RIAD和V-38显示更大的对RI的亲和力。
Ht31
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO：38)
RIAD
LEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO：39)
PV-38
FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQ ID NO：40)
Hundsrucker等人(2006)还开发了结合PKA的AKAP的其它肽竞争剂，具有低至0.4nM的对PKA的RII形式的DDD的结合常数。多种AKAP拮抗性肽的序列提供于下文中复制的Hundsrucker等人的表1中。
表1AKAP肽序列
AKAPIS表示合成RII亚基结合肽。所有其它肽衍生自所示AKAP的RII结合结构域。
肽序列
Figure BDA0000139375980000231
在不同AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基通过参考下列AKAP IS序列在下文中由加下划线标示。除了C末端丙氨酸残基的添加外，所述残基与由Alto等人(2003)观察到的相同。(参见Hundsrucker等人(2006)的图4，将所述文献通过引用并入本文)。具有特别高的对RII DDD序列的亲和力的肽拮抗剂的序列是AKAP-IS、AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep的序列。
AKAP-IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：15)
Carr等人(2001)检验了来自人和非人蛋白质的不同AKAP结合DDD序列之间的序列同源性程度并且鉴定了DDD序列中似乎在不同DDD部分中最高度保守的残基。这些可通过参考人PKA RIIα DDD序列在下文中由加下划线标示。特别保守的残基进一步由斜体字标示。所述残基与由Kinderman等人(2006)提出的对于结合AKAP蛋白重要的那些残基重叠，但不与其相同。因此，下文中指示潜在的DDD序列，其中“X”表示保守氨基酸替代。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：13)
XHIXIPXGLXELLQGYTXEVLRXQPXDLVEFAXXYFXXLXEXRX(SEQ ID NO：59)
本领域技术人员将会了解，一般而言，这些在来自不同蛋白质的DDD和AD序列中高度保守的氨基酸残基是可以优选在产生氨基酸替代中保持恒定的残基，然而不太高度保守的残基可以被更容易改变以产生本文中描述的AD和/或DDD序列的序列变体。
除了DDD和/或AD部分的序列变体外，在某些实施方案中，可以优选在抗体部分或连接抗体与AD序列的连接体肽序列中引入序列变异。在一个举例说明性实例中，融合蛋白序列的3个可能变体示于下面。
(L)
QKSLSLSPGLGSGGGGSGGCG(SEQ ID NO：60)
(A)
QKSLSLSPGAGSGGGGSGGCG(SEQ ID NO：61)
(-)
QKSLSLSPGGSGGGGSGGCG(SEQ ID NO：62)
氨基酸替代
在某些实施方案中，所公开的方法和组合物可包括具有一个或多个替代的氨基酸残基的蛋白质或肽的产生和使用。可通过取代一个或多个氨基酸残基来最优化天然抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体或AD或DDD序列的结构、物理和/或治疗特征。例如，众所周知可通过用亲代鼠抗体的相应FR氨基酸替代有限数目的人构架区(FR)氨基酸来改善人源化抗体的功能特征。当构架区氨基酸残基与CDR残基十分靠近时，这种情况尤其正确。
在其它情况下，可通过有限数目的氨基酸替代最优化抗体的治疗特性，例如对靶抗原的结合亲和力、抗体与其靶抗原的离解或解离速率或甚至抗体对CDC(补体依赖细胞毒性)或ADCC(抗体依赖性细胞毒性)的诱导的效率。
在可选择的实施方案中，可进一步最优化用于产生本发明的DNL构建体的DDD和/或AD序列，例如以增加DDD-AD结合亲和力。上文中论述了DDD或AD序列中的潜在序列变异。
本领域技术人员将会意识到，一般而言，氨基酸替代通常包括用具有相对相似的性质的另一种氨基酸替代氨基酸(即，保守氨基酸替代)。不同氨基酸的性质和氨基酸替代对蛋白质结构和功能的影响一直以来是本领域内广泛研究和知识的主题。
例如，可考虑氨基酸的亲水指数(Kyte&Doolittle，1982，J.Mol.Biol.，157：105-132)。氨基酸的相对亲水特征促成了所得蛋白质的二级结构，这反过来确定了蛋白质与其它分子的相互作用。每一种氨基酸基于其疏水性和电荷特征被赋予亲水指数(Kyte&Doolittle，1982)，这些氨基酸是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。在产生保守替代中，其亲水性指数在±2内的氨基酸的使用是优选的，其亲水性指数在±1内的是更优选的，其亲水性指数在±0.5内的是进一步更优选的。
氨基酸替代也可考虑氨基酸残基的亲水性(例如，第4,554,101号美国专利)。亲水性值已被赋予给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0)；谷氨酸(+3.0)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。用具有相似亲水性的其它氨基酸来替代氨基酸是优选的。
其它考虑包括氨基酸侧链的大小。例如，用具有体积大的侧链的氨基酸例如色氨酸或酪氨酸替代具有紧凑侧链的氨基酸例如甘氨酸或丝氨酸通常不是优选的。也要考虑不同氨基酸残基对蛋白质二级结构的影响。通过经验研究，不同氨基酸残基对蛋白质结构域采取α-螺旋、β-折叠片或反转二级结构的倾向的影响已被确定并且在本领域内是已知的(参见，例如，Chou&Fasman，1974，Biochemistry，13：222-245；1978，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276；1979，Biophys.J.，26：367-384)。
基于这样的考虑和广泛的经验研究，保守氨基酸替代的表达已被构建并且在本领域内是已知的。例如，精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。可选择地：Ala(A)leu、ile、val；Arg(R)gln、asn、lys；Asn(N)his、asp、lys、arg、gln；Asp(D)asn、glu；Cys(C)ala、ser；Gln(Q)glu、asn；Glu(E)gln、asp；Gly(G)ala；His(H)asn、gln、lys、arg；Ile(I)val、met、ala、phe、leu；Leu(L)val、met、ala、phe、ile；Lys(K)gln、asn、arg；Met(M)phe、ile、leu；Phe(F)leu、val、ile、ala、tyr；Pro(P)ala；Ser(S)、thr；Thr(T)ser；Trp(W)phe、tyr；Tyr(Y)trp、phe、thr、ser；Val(V)ile、leu、met、phe、ala。
对于氨基酸替代的其它考虑包括残基是否位于蛋白质的内部或是否暴露于溶剂。对于内部残基，保守替代可包括：Asp和Asn；Ser和Thr；Ser和Ala；Thr和Ala；Ala和Gly；Ile和Val；Val和Leu；Leu和Ile；Leu和Met；Phe和Tyr；Tyr和Trp.(参见，例如，rockefeller.edu上的PROWL网站)。对于暴露于溶剂的残基，保守替代可包括：Asp和Asn；Asp和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和Asn；Ala和Pro；Ala和Gly；Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr；Lys和Arg；Val和Leu；Leu和Ile；Ile和Val；Phe和Tyr.(Id.)。已构建多种矩阵来帮助选择氨基酸替代，例如PAM250评分矩阵、Dayhoff矩阵、Grantham矩阵、McLachlan矩阵、Doolittle矩阵、Henikoff矩阵、Miyata矩阵、Fitch矩阵、Jones矩阵、Rao矩阵、Levin矩阵和Risler矩阵(Idem.)。
在测定氨基酸替代中，也可考虑分子间或分子内键的存在，例如带正电荷的残基(例如，His、Arg、Lys)与带负电荷的残基(例如，Asp、Glu)之间离子键的形成或附近半胱氨酸残基之间二硫键的形成。
用任何氨基酸替代编码的蛋白质序列中的任何其它氨基酸的方法是公知的并且对于本领域技术人员来说只不过是常规实验，例如通过定点诱变的技术或通过合成和装配编码氨基酸替代的寡核苷酸，然后将其拼接入表达载体构建体来进行。
细胞因子和其它免疫调节剂
在某些优选的实施方案中，效应物部分可以是免疫调节剂。免疫调节剂是当存在时改变、抑制或刺激身体的免疫系统的试剂。使用的免疫调节剂可包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素及其组合。特别有用的是淋巴细胞毒素例如肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子例如白细胞介素(IL)、集落刺激因子例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素例如干扰素-α、-β或-γ以及干细胞生长因子例如命名为“S1因子”的干细胞生长因子。
在某些优选的实施方案中，效应物部分是细胞因子例如淋巴因子、单核细胞激活素、生长因子和常规多肽激素。细胞因子包括：生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；胎盘生长因子(PIGF)、肝细胞生长因子；前列腺素、成纤维生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒抑制物质(mullerian inhibiting substance)；鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子例如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素例如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白介素(II)例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit配体或FLT-3、血管生长抑素、血小板反应蛋白、内皮生长抑素、肿瘤坏死因子(TNF，例如TNF-α)和LT。
蛋白质或肽免疫调节剂例如细胞因子的氨基酸序列在本领域是公知的并且任何此类已知的序列可用于实施本发明。本领域技术人员知道关于细胞因子序列的公共信息的众多来源。例如，NCBI数据库包含大量细胞因子和免疫调节剂的蛋白质和编码核酸序列，所述细胞因子和免疫调节剂是例如红细胞生成素(GenBank NM 000799)、IL-1β(GenPept AAH08678)、GM-CSF(GenPept AAA52578)、TNF-α(GenPept CAA26669)、干扰素-α(GenPept AAA52716.1)、干扰素-α2b(GenPept AAP20099.1)和上文中所列的实际上任何肽或蛋白质免疫调节剂。鉴定基本上任何目的蛋白质或肽效应物部分的适当的氨基酸和/或核酸序列对于本领域技术人员来说是常规的事情。
抗体和抗体片段
用于制备实际上抗任何靶抗原的单克隆抗体的技术在本领域是公知的。参见，例如，Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)，和Coligan等人(编)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第1卷，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley&Sons 1991)。简而言之，可通过如下获得单克隆抗体：用包含抗原的组合物注射小鼠，取出脾脏以获得B淋巴细胞，将所述B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生针对所述抗原的抗体的克隆，培养产生针对所述抗原的抗体的克隆以及从杂交瘤培养物分离抗体。
可利用多种完善的技术从杂交瘤培养物分离和纯化MAb。此类分离技术包括利用蛋白A琼脂糖的亲和层析、大小排阻层析和离子交换层析。参见，例如，第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页的Coligan。此外，参见Baines等人，“Purification of Immunoglobulin G(IgG)，”inMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第10卷，第79-104页(TheHumana Press，Inc.1992)。
在初始产生针对免疫原的抗体后，可测定抗体的序列，随后通过重组技术进行制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和表征对于本领域技术人员来说是公知的。衍生自人源化抗体、嵌合抗体或人抗体的抗体成分的使用排除了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。
嵌合抗体
嵌合抗体为重组蛋白质，其中人抗体的可变区被例如包括小鼠抗体的互补性决定区(CDR)的小鼠抗体的可变区取代。当给受试者施用时，嵌合抗体显示出免疫原性降低而稳定性增加。用于克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术公开于例如Orlandi等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：3833(1989)中。用于构建嵌抗体的技术对于本领域技术人员来说是公知的。作为例子，Leung等人，Hybridoma 13：469(1994)通过将编码鼠LL2(抗-CD22单克隆抗体)的Vκ和VH结构域的DNA序列与分别的人κ和IgG1恒定区结构域组合来产生LL2嵌合抗体。
人源化抗体
用于产生人源化MAb的技术在本领域内是公知的(参见，例如，Jones等人，Nature 321：522(1986)，Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)，Carter等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)和Singer等人，J.Immun.150：2844(1993))。可通过将小鼠CDR自小鼠免疫球蛋白的可变重链和可变轻链转移入人抗体的相应可变结构域来人源化嵌合或鼠单克隆抗体。嵌合单克隆抗体中的小鼠构架区(FR)也用人FR序列取代。由于简单地将小鼠CDR转移入人FR中通常导致抗体亲和力的减少或甚至丧失，因此为了恢复鼠抗体的原始亲和力可能需要额外的修饰。这可通过将FR区中的一个或多个人残基用它们的鼠对应物替代以获得对其表位具有良好结合亲和力的抗体来实现。参见，例如Tempest等人，Biotechnology9：266(1991)和Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)。通常，与它们的鼠对应物不同并且紧位于或接触一个或多个CDR氨基酸残基的那些人FR氨基酸残基可以是替代的候选者。
人抗体
用组合方法或经人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来产生完整人抗体的方法是本领域已知的(例如，Mancini等人，2004，NewMicrobiol.27：315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.HighThroughput Screen.8：117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin.Phamacol.3：544-50)。还可利用基因或染色体转染法以及噬菌体显示技术(所有所述技术在本领域内都是已知的)构建完整人抗体。参见例如McCafferty等人，Nature 348：552-553(1990)。这样的完整人抗体预期表现出比嵌合抗体或人源化抗体更少的副作用并且如基本上内源的人抗体一样在体内起作用。在某些实施方案中，要求保护的方法和过程可使用通过此类技术而产生的人抗体。
在一个替代实施方案中，噬菌体显示技术可用于产生人抗体(例如，Dantas-Barbosa等，2005，Genet.Mol.Res.4：126-40)。人抗体可从正常人或表现出特定疾病状态如癌症的人中制备(Dantas-Barbosa等，2005)。从患病个体中构建人抗体的有利方面在于循环抗体全库可能对针对疾病相关抗原的抗体具有偏好性。
在此方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体显示文库。一般而言，总RNA获自循环血淋巴细胞(Id.)。从μ、γ和κ链抗体全库中克隆重组Fab，并将其插入噬菌体显示文库(Id.)。RNA可通过使用对重链和轻链免疫球蛋白序列特异的引物转化为cDNA，并用于制备FabcDNA文库(Marks等人，1991，J.Mol.Biol.222：581-97)。文库构建按Andris-Widhopf等(2000，在Phage Display Laboratory Manual，Barbas等(编著)，第1版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY pp.9.1至9.22中)进行。最终的Fab片段用限制性核酸内切酶消化，然后插入噬菌体基因组以制备所述噬菌体显示文库。此类文库可使用本领域已知的标准噬菌体显示方法进行筛选(参见，例如，Pasqualini and Ruoslahti，1996，Nature 380：364-366；Pasqualini，1999，The Quart.J.Nucl.Med.43：159-162)。
可以以多种形式实施噬菌体显示，关于它们的综述，参见例如Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology3：5564-571(1993)。还可利用体外活化的B细胞产生人抗体。参见，第5,567,610号和第5,229,275号美国专利，将所述专利通过引用整体并入本文。本领域技术人员将会了解，这些技术是示例性的并且可利用用于制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。
在另一替代实施方案中，使用标准的免疫实验方案，经过基因工程改造以产生人抗体的转基因动物可用于产生针对基本上任何免疫靶的抗体。用于从转基因动物获得人抗体的方法由Green等人，NatureGenet.7：13(1994)，Lonberg等人，Nature 368：856(1994)和Taylor等人，Int.Immun.6：579(1994)公开。此系统的非限制性示例为Abgenix(Fremont，CA)的XenoMouse
Figure BDA0000139375980000321
(例如，Green等人，1999，J.Immunol.Methods 231：11-23)。在XenoMouse
Figure BDA0000139375980000322
和相似动物中，小鼠抗体基因已被失活，并替换为功能性人抗体基因，但是鼠免疫系统的剩余部分仍保持完整。
XenoMouse已转化了种系配置的YAC(酵母人工染色体)，该YAC包含部分人IgH和Igκ基因座，包括可变区序列的大部分区域，以及辅助基因和调控序列。人可变区全库可用于制备产生抗体的B细胞，而B细胞可通过已知技术融合至杂交瘤。用靶抗原免疫的XenoMouse
Figure BDA0000139375980000324
将通过正常的免疫反应产生人抗体，所述人抗体可通过上述标准技术进行收获和/或产生。有多个种系的XenoMouse
Figure BDA0000139375980000325
可用，每个种系均能产生不同类别的抗体。转基因产生的人抗体已显示出治疗潜力，并保留了正常人抗体的药代动力学特性(Green等，1999)。本领域技术人员将会了解，要求保护的组合物和方法并不限于使用XenoMouse
Figure BDA0000139375980000326
系统，而是可以使用已经过基因工程改造来产生人抗体的任何转基因动物。
抗体片段
可利用已知技术产生识别特定表位的抗体片段。抗体片段是抗体的抗原结合部分例如F(ab′)2、Fab′、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等。可通过胃蛋白酶降解抗体分子来产生F(ab’)2片段，并且可通过还原F(ab’)2片段的二硫桥来产生Fab′片段。可选择地，可构建Fab′表达文库(Huse等人，1989，Science，246：1274-1281)以允许快速且容易地鉴定具有期望的特异性的单克隆Fab′片段。可通过木瓜蛋白酶消化抗体来产生F(ab)2片段，并且通过二硫化物还原来获得Fab片段。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域缔合以形成靶结合部位。这两个结构域通过肽连接体(L)进一步共价连接。用于制备scFv分子和设计适当的肽连接体的方法公开于第4,704,692号美国专利，第4,946,778号美国专利，R.Raag和M.Whitlow，“Single Chain Fvs.”FASEB第9卷：73-80(1995)以及R.E.Bird和B.W.Walker，“Single Chain Antibody Variable Regions，”TIBTECH，第9卷：132-137(1991)中。
用于产生单结构域抗体(DAB)的技术在本领域也是已知的，如例如Cossins等人(2006，Prot Express Purif 51：253-259)(通过引用并入本文)中公开的。
可通过蛋白水解全长抗体或通过在大肠杆菌(E.coli)或另一种宿组中表达编码所述片段的DNA来制备抗体片段。可利用常规方法通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶降解全长抗体来获得抗体片段。此类方法由例如Goldenberg，第4,036,945号和第4,331,647号美国专利以及本文中包括的参考资料描述。此外，参见Nisonoff等人，Arch Biochem.Biophys.89：230(1960)；Porter，Biochem.J.73：119(1959)，Edelman等人，in METHODS IN ENZYMOLOGY第1卷，第422页(AcademicPress 1967)和第2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4页的Coligan。
已知抗体
使用的抗体可从许多已知的来源商购获得。例如，多个抗体分泌型杂交瘤品系可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。大量抗不同疾病靶(包括但不限于肿瘤相关抗原)的抗体已保藏在ATCC和/或具有公布的可变区序列，并且可获得用于要求保护的方法和组合物。参见，例如，第7,312,318；7,282,567；7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803；7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547；6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226；6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；6,733,981；6,730,307；6,720,15；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908；6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572；856；6,566,076；6,562,618；6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；6,455,040，6,451,310；6,444,206’6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244；6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595；5,677,136；5,587,459；5,443,953、5,525,338号美国专利。这些仅是示例性的并且许多种其它抗体和它们的杂交瘤在本领域是已知的。本领域技术人员将会了解，抗几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或抗体分泌型杂交瘤可通过就抗所选择的疾病相关目标靶的抗体简单地搜索ATCC、NCBI和/或USPTO数据库来获得。可使用本领域公知的标准技术扩增克隆的抗体的抗原结合结构域，将其切割，然后连接入表达载体，转移入适当的宿主细胞，并且用于蛋白质生产。
免疫缀合物
在某些实施方案中，可将抗体或其片段缀合至一种或多种治疗剂或诊断剂。治疗剂不必相同而是可以不同，例如药物和放射性同位素。例如，可将131I掺入抗体或融合蛋白的酪氨酸和连接至赖氨酸残基的ε氨基的药物。还可将治疗剂和诊断剂连接至例如还原型SH基团和/或糖类侧链。用于制备治疗剂或诊断剂与抗体或融合蛋白的共价或非共价缀合物的许多方法在本领域是已知的并且可利用任何这样已知的方法。
可通过二硫键的形成在还原型抗体成分的铰链区上连接治疗剂或诊断剂。可选择地，可使用异双功能交联剂例如N-琥珀酰基3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)连接此类试剂。Yu等人，Int.J.Cancer 56：244(1994)。用于这样的缀合的一般技术在本领域是公知的。参见，例如，Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION ANDCROSS-LINKING(CRC Press 1991)；Upeslacis等人，“Modification ofAntibodies by Chemical Methods，”in MONOCLONAL ANTIBODIES：PRINCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等人(编)，第187-230页(Wiley-Liss，Inc.1995)；Price，“Production and Characterization ofSynthetic Peptide-Derived Antibodies，”in MONOCLONALANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICALAPPLICATION，Ritter等人(编)，第60-84页(Cambridge UniversityPress 1995)。可选择地，可通过抗体的Fc区中的糖类部分缀合治疗剂或诊断剂。糖基可用于增加与巯基结合的相同试剂的装载，或糖类部分可用于结合不同的治疗剂或诊断剂。
用于将肽经由抗体的糖类部分缀合至抗体成分的方法对于本领域技术人员来说是公知的。参见，例如，Shih等人，Int.J.Cancer 41：832(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer 46：1101(1990)和Shih等人，U.S.Patent No.5,057,313，将所述文献通过引用整体并入本文。一般方法包括使具有氧化型糖类部分的抗体组分与具有至少一个游离胺功能的载体聚合物反应。该反应导致产生最初的希夫碱(亚胺)键合，其可通过还原成仲胺以形成最终的缀合物来获得稳定。
如果用作免疫缀合物的抗体成分的抗体是抗体片段，那么Fc区可以不存在。然而，可能将糖类部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区。参见，例如，Leung等人，J.Immunol.154：5919(1995)；Hansen等人，U.S.Patent No.5,443,953(1995)，Leung等人，第6,254,868号美国专利，将所述文献和专利通过引用整体并入本文。将基因工程改造的糖类部分用于连接治疗剂或诊断剂。
在某些实施方案中，可将螯合剂连接至抗体、抗体片段或融合蛋白，然后用于螯合治疗剂或诊断剂例如放射性核素。示例性螯合剂包括但不限于DTPA(例如Mx-DTPA)、DOTA、TETA、NETA或NOTA。用于螯合剂的缀合和使用其将金属或其它配体连接至蛋白质的方法在本领域是公知的(参见，例如，第12/112,289号美国专利申请，将其通过引用整体并入本文)。
在某些实施方案中，可通过与具有长尾的试剂反应来将放射性金属或顺磁离子连接至蛋白质或肽，可将多个用于结合离子的螯合基团连接至所述长尾。这样的尾可以是聚合物例如多聚赖氨酸、多糖或其它具有侧基的衍生多聚物或可衍生链，所述侧基可结合已知可用于此用途的螯合基团，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双-缩氨基硫脲、聚肟(polyoxime)等。
可将螯合剂直接连接至抗体或肽，例如如第4,824,659号美国专利(其通过引用并入本文)中公开的。特别有用的金属-螯合剂组合包括与在60至4,000keV的一般能量范围内的用于放射性成像(radioimaging)的诊断同位素(例如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、11C、13N、15O、76Br)一起使用的2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物。当与非放射性金属例如锰、铁和钆络合时，相同螯合剂可用于MRI。大环螯合剂，如NOTA、DOTA和TETA，可用于多种金属和射电金属，特别是分别用于镓、钇和铜放射性核素。通过根据目标金属调节环的大小，可使此类金属-螯合剂络合物非常稳定。可包括其它环类型的螯合剂，例如大环聚酯，其被关注用于稳定地结合核素例如223Ra(对于RAIT)。
最近，已公开了用于PET扫描技术的18F-标记的方法，例如通过F-18与金属或其它原子例如铝的反应来进行。可将18F-Al缀合物与螯合基团例如DOTA、NOTA或NETA络合，所述螯合基被直接连接至抗体或在预靶向方法中被用于标记可靶向的构建体。这样的F-18标记技术公开于第7,563,433美国专利中，将其实施例部分通过引用并入本文。
治疗剂
在可选择的实施方案中，可使用治疗剂，将其缀合至本发明的DNL复合物，或在抗体施用之前、同时或之后分开地施用其，所述治疗剂是例如细胞毒素剂、抗-血管生成剂、促细胞凋亡剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前体药物、毒素、酶或其它试剂。使用的药物可具有选自抗有丝分裂剂、抗激酶、烷化剂、抗代谢物、抗生素、生物碱、抗-血管生成剂、促细胞凋亡剂和其组合的药物特性。
使用的示例性药物可包括5-氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素1、白消安、加利车霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、COX-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、2-二氢吡咯多柔比星(2P-DOX)、氰基-吗啉代多柔比星、葡糖苷酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、雌莫司汀、表鬼臼毒素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基蛋白转化酶抑制剂、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天门冬酰胺酶、来那度胺、亚叶酸钙、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链佐星(streptozocin)、他莫昔芬、泰素、替莫唑胺(DTIC的含水形式)、反铂(transplatinum)、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、乌拉莫司汀、长春瑞滨、长春碱、长春新碱和长春花生物碱。
使用的毒素可包括蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)，例如豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。
使用的趋化因子可包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10。
在某些实施方案中，可使用抗-血管生成剂例如血管生长抑素(angiostatin)、baculostatin、血管能抑素(canstatin)、乳腺丝抑蛋白(maspin)、抗VEGF抗体、抗-PlGF肽和抗体、抗-血管生长因子抗体、抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体和肽、抗-Kras抗体、抗-cMET抗体、抗-MIF(巨噬细胞迁移-抑制因子)抗体、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧酰胺三唑(carboxiamidotriazole)、CM101、马立马司他(Marimastat)、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素-2、干扰素α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、Linomide(利诺胺)、沙利度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、accutin、血管生长抑素、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。
使用的免疫调节剂可选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素和其组合。特别有用的是淋巴毒素例如肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子例如白细胞介素(IL)、集落刺激因子例如粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素例如干扰素-α、-β或-γ以及干细胞生长因子例如命名为“S1因子”的干细胞生长因子。细胞因子中包括生长激素例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素例如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝细胞生长因子；前列腺素、成纤维生长因子；催乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒抑制物质(mullerian inhibiting substance)；鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子例如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EP0)；骨诱导因子；干扰素例如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白细胞介素(IL)例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit配体或FLT-3、血管生长抑素、血小板反应蛋白、内皮抑制素、肿瘤坏死因子和LT。
使用的放射性核素包括但不限于111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。治疗性放射性核素优选具有在60至6,000keV范围内的衰变能，俄歇发射体的衰变能优选为60至200keV范围内，β发射体的衰变能优选为100-2,500keV，α发射体的衰变能优选为4,000-6,000keV。有用的β粒子辐射核素的最大衰变能优选为20-5,000keV，更优选地为100-4,000keV，最优选地为500-2,500keV。基本上通过辐射俄歇粒子进行衰变的放射性核素也是优选的。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、1-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有用的β粒子辐射核素的衰变能优选为＜1,000keV，更优选地为＜100keV，最优选地为＜70keV。基本上通过产生α粒子进行衰变的放射性核素也是优选的。此类放射性核素包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有用的α粒子辐射的放射性核素的衰变能优选为2,000-10,000keV，更优选地为3,000-8,000keV，最优选地为4,000-7,000keV。使用的其它潜在放射性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等。某些有用的诊断核素可包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94Tc、94mTc、99mTc或111In。
治疗剂可包括光敏剂或染料。已使用荧光组合物例如荧光染料和其它发色团或染料(例如对可见敏感的卟啉)来检测和治疗病变，即用合适的光照射病变部位。在治疗中，这被称为光辐射、光疗或光动力疗法。参见Jori等人(编)，PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORSAND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985)；van den Bergh，Chem.Britain(1986)，22：430。此外，已将单克隆抗体与光敏染料偶联，用于进行光疗。参见Mew等人，J.Immunol.(1983)，130：1473；idem.，Cancer Res.(1985)，45：4380；Oseroff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)，83：8744；idem.，Photochem.Photobiol.(1987)，46：83；Hasan等人，Prog.Clin.Biol.Res.(1989)，288：471；Tatsuta等人，LasersSurg.Med.(1989)，9：422；Pelegrin等人，Cancer(1991)，67：2529。
其它有用的治疗剂可包括寡核苷酸，特别是优选导向抗癌基因和癌基因产物例如bcl-2或p53的反义寡核苷酸。治疗性寡核苷酸的优选形式为siRNA。
诊断剂
诊断剂优选选自放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记物、化学发光标记物、超声造影剂和光敏试剂。此类诊断剂是公知的并且可使用任何此类已知的诊断剂。诊断剂的非限定性实例可包括放射性核素例如110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其它γ、β或正电子发射体。使用的顺磁离子包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(III)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、铷(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。超声造影剂可包括脂质体例如气体填充的脂质体。不透射线的诊断剂可选自化合物、钡化合物、镓化合物和铊化合物。许多种荧光标记物在本领域是已知的，包括但不限于异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。使用的化学发光标记物可包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶盐或草酸酯。
治疗性治疗的方法
不同的实施方案涉及治疗受试者例如哺乳动物(包括人、驯养或伴侣宠物例如狗和猫)的癌症的方法，包括给所述受试者施用治疗有效量的双特异性免疫细胞因子DNL构建体。
在一个实施方案中，可利用本发明的DNL构建体治疗的免疫疾病可包括例如关节疾病例如强直性脊柱炎、幼年型类风湿关节炎、类风湿关节炎；神经疾病例如多发性硬化和重症肌无力；胰腺疾病例如糖尿病，特别是青少年型糖尿病；胃肠道疾病例如慢性活动型肝炎、乳糜泻、溃疡性结肠炎、克罗恩病、恶性贫血；皮肤病例如银屑病或硬皮病；变应性疾病例如哮喘和移植相关病症例如移植物抗宿主病和同种异体移植物排斥。
可通过同时或相继地施用治疗有效量的另一种抗体(所述抗体结合靶细胞表面上的另一种抗原或与所述抗原反应)来补充双特异性免疫细胞因子DNL构建体的施用。优选的其它MAb包含至少一种人源化MAb、嵌合MAb或人MAb，其选自与如下物质反应的MAb：CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD95、CD126、CD133、CD138、CD154、CEACAM5、CEACAM6、B7、AFP、PSMA、EGP-1、EGP-2、碳酸酐酶IX、PAM4抗原、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、Ia、MIF、HM1.24、HLA-DR、生腱蛋白、Flt-3、VEGFR、PlGF、ILGF、IL-6、IL-25、生腱蛋白、TRAIL-R1、TRAIL-R2、补体因子C5、癌基因产物或其组合。使用的不同抗体例如抗-CD19、抗-CD20和抗-CD22抗体对于本领域技术人员来说是已知的。参见，例如，Ghetie等人，Cancer Res.48：2610(1988)；Hekman等人，Cancer Immunol.Immunother.32：364(1991)；Longo，Curr.Opin.Oncol.8：353(1996)，第5,798,554；6,187,287；6,306,393；6,676,924；7,109,304；7,151,164；7,230,084；7,230,085；7,238,785；7,238,786；7,282,567；7,300,655；7,312,318号美国专利；和第20080131363；20080089838；20070172920；20060193865；20060210475；20080138333和20080146784号美国专利申请公布，将上述每一篇的实施例部分通过引用并入本文。
还可通过同时或相继地施用至少一种治疗剂来进一步补充DNL构建体疗法。例如“CVB”(1.5g/m2环磷酰胺，200-400mg/m2依托泊苷和150-200mg/m2卡莫司汀)是用于治疗非-何杰金氏淋巴瘤的方案。Patti等人，Eur J.Haematol.51：18(1993)。其它适当的联合化学治疗方案对于本领域技术人员来说是公知的。参见，例如，Freedman等人，″Non-Hodgkin′s lymphomas，″in CANCER MEDICINE，第2卷，第3版，Holland等人(编)，第2028-2068页(Lea&Febiger 1993)。作为举例说明，用于治疗中度非-何杰金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化学治疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和泼尼松)和CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)。有用的第二代化学治疗方案是m-BACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和亚叶酸)，而适当的第三代方案是MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和亚叶酸)。其它有用的药物包括苯基丁酸盐、苯达莫司汀和苔藓抑素-1。
可按已知方法配制本发明的DNL构建体以制备药学上有用的组合物，由将DNL构建体与药学上适宜的赋形剂组合在混合物中。无菌的磷酸盐缓冲液即为药学上适宜的赋形剂的一个实例。其它适当的赋形剂对本领域技术人员为公知。参见，例如，Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS(药物剂型和药物递送系统)，第5版(Lea&Febiger 1990)，和Gennaro(编)，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(雷明顿氏药物科学)，第18版(Mack Publishing Company 1990)，及其修订版本。
可将本发明的DNL构建体配制用于静脉内施用，通过例如推注注射或连续输注。优选，在短于约4小时的时期内，更优选短于约3小时的时期内输注DNL构建体。例如，可在30分钟内，优选甚至15分钟内输注前25-50mg，在随后的2-3小时内输注剩余部分。注射用制剂可呈单位剂型，例如装在安瓿中，或者装在多剂量容器中并且添加防腐剂。组合物可采用例如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可含有配方剂(formulatory agents)例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选择地，活性成分可呈粉剂形式，用于在使用前用适当的媒介物(例如无菌无热原水)配制。
可将其它制药方法用于控制DNL构建体的作用持续时间。控释制剂可通过使用生物相容性聚合物络合或者吸附DNL构建体来实现。例如，生物相容性聚合物包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物基质。Sherwood等人，Bio/Technology 10：1446(1992)。从此基质上释放的速率取决于该DNL构建体的分子量、基质内的DNL构建体的量和分散粒子的大小。Saltzman等人，Biophys.J.55：163(1989)；Sherwood等人，同上。其它固体剂型描述于Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGEFORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS(药物剂型和药物递送系统)，第5版(Lea&Febiger 1990)，和Gennaro(编)，REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES(雷明顿氏药物科学)，第18版(MackPublishing Company 1990)，及其修订版本。
还可将DNL构建体皮下或甚至通过其它胃肠外途径施用至哺乳动物。此外，可通过连续输注或通过单次或多次推注进行施用。优选，在短于约4小时的时期内，更优选在短于约3小时的时期内输注DNL构建体。
更常见，用于人的DNL构建体的施用剂量取决于诸如患者年龄、体重、身高、性别、总体健康状况和先前的治疗历史等因素而变化。可能需要向受者提供约1mg/kg至25mg/kg范围内的DNL构建体的剂量作为单次静脉内输注，但是也可根据情况需要施用更低或更高的剂量。对于70kg患者按1-20mg/kg施用的剂量例如为70-1,400mg，或对于1.7米的患者，剂量为41-824mg/m2。可按需要重复此剂量，例如，每周一次，持续4-10周，或每周一次，持续8周或每周一次，持续4周。还可以更低的频率给药，例如每隔一周一次，持续数月，或每月一次或每季度一次，持续多月，如维持疗法中所需的。
可选择地，以每2或3周一个剂量施用DNL构建体，重复总共至少3个剂量。或者，每周两次施用所述构建体，持续4-6周。如果将剂量减少至约200-300mg/m2(每个剂量340mg(对于1.7米的患者)或4.9mg/kg(对于70kg的患者)，可每周施用一次或甚至二次，持续4至10周。可选择地，可减少疗程剂量，即每2或3周一次，持续2-3个月。然而，已确定甚至可以通过缓慢的静脉内输注施用更高的剂量(例如每周一次或每2-3周一次20mg/kg)，进行重复的给药循环。可以任选地以其它间隔重复给药方案，并且可通过不同胃肠外途径(对剂量和治疗方案进行适当的调整)提供剂量。
在优选的实施方案中，DNL构建体用于癌症的治疗。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤以及白血病、骨髓瘤或淋巴样恶性肿瘤(lymphoid malignancies)。下文中指出此类癌症的更具体的实例，包括：鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、尤因肉瘤、Wilms瘤、星形细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌(gastriccancer)或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、肝细胞癌、神经内分泌瘤、甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer)、分化的甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌症或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾癌(renalcancer)、前列腺癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，其细胞还未迁移至除了原始恶性肿瘤或肿瘤的位置外的受试者的身体的位置的恶性细胞或肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如，通过恶性细胞或肿瘤细胞至与原始肿瘤的位置不同的继发性位置的转移、迁移产生的恶性细胞或肿瘤)。适合于本发明的治疗方法的癌症包括表达、过表达或异常表达IGF-1R的细胞。
癌症或恶性肿瘤的其它实例包括但不限于：儿童急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病(AcuteLymphocytic Leukemia)、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性髓样白血病、成人何杰金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞白血病、成人非-何杰金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS-相关淋巴瘤、AIDS-相关恶性肿瘤、直肠癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管的癌症、原发性中枢神经系统淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤(Cerebellar Astrocytoma)、脑星形细胞瘤(Cerebral Astrocytoma)、宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性淋巴母细胞白血病(Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia)、儿童急性髓样白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤(ChildhoodCerebellar Astrocytoma)、儿童小脑星形细胞瘤Childhood CerebralAstrocytoma)、儿童颅外生殖细胞肿瘤(Childhood Extracranial GermCell Tumors)、儿童何杰金氏病(Childhood Hodgkin′s Disease)、儿童何杰金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童淋巴细胞白血病(Childhood Lymphoblastic Leukemia)、儿童髓母细胞瘤(ChildhoodMedulloblastoma)、儿童非-何杰金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌症、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外胚细胞瘤(Extracranial Germ Cell Tumor)、性腺外胚细胞瘤(Extragonadal Germ Cell Tumor)、肝外胆管癌、眼癌、雌性乳腺癌、高歇氏病(Gaucher′s Disease)、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌(Gastrointestinal Carcinoid Tumor)、胃肠瘤(Gastrointestinal Tumors)、生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、何杰金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症(Hypergammaglobulinemia)、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴组织增殖性疾病(Lymphoproliferative Disorders)、巨球蛋白血症、雄性乳腺癌、恶性间皮瘤(Malignant Mesothelioma)、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性原发性鳞状颈癌(Metastatic Occult Primary SquamousNeck Cancer)、转移性原发性鳞状颈癌(Metastatic Primary SquamousNeck Cancer)、转移性鳞状颈癌(Metastatic Squamous Neck Cancer)、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、髓性白血病(Myelogenous Leukemia)、髓样白血病(Myeloid Leukemia)、骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻窦癌(Nasal Cavity and Paranasal SinusCancer)、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非-何杰金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌(Occult PrimaryMetastatic Squamous Neck Cancer)、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮性癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤(Ovarian LowMalignant Potential Tumor)、胰腺癌、副蛋白血症(Paraproteinemias)、真性红细胞增多症、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(Primary Central Nervous SystemLymphoma)、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌(Renal Pelvis and Ureter Cancer)、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、涎腺癌、肉状瘤病肉瘤、赛扎里氏综合征(Sezary Syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌(Squamous NeckCancer)、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌(Transitional CellCancer of the Renal Pelvis and Ureter)、肾盂和输尿管移行细胞癌(Transitional Ren al Pelvis and Ureter Cancer)、滋养细胞肿瘤(Trophoblastic Tumors)、输尿管和肾盂细胞癌(Ureter and Renal PelvisCell Cancer)、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、肾母细胞瘤和任何其它过度增殖性疾病，除新生物形成外，都位于上面所列的器官系统中。
本文中描述的和要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或恶化前状态以及用于阻止至瘤形成状态(neoplastic state)或恶性状态(包括但不限于上述那些障碍)的进展。此类用途适用于已知或怀疑进行至瘤形成或癌症，特别是其中由超常增生、化生(metaplasia)或最特别地发育不良组成的非瘤形成细胞生长已发生的疾病(关于此类异常生长条件的综述，参见Robbins和Angell，Basic Pathology，第2版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-79(1976))的进展的状态。
发育不良通常是癌症的先兆，并且主要见于上皮中。其为非瘤形成细胞生长的最紊乱形式，包括个体细胞一致性和细胞的构造朝向(architectural orientation)的损失。当存在慢性刺激或炎症时，发育不良特征性地发生。可被治疗的发育不良障碍包括但不限于无汗性外胚层发育不良(anhidrotic ectodermal dysplasia)、异侧发育不良(anterofacial dysplasia)、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良(atriodigital dysplasia)、支气管肺发育不良、脑发育不良(cerebraldysplasia)、宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不全、先天性外胚叶发育不良、颅骨骨干发育异常(craniodiaphysialdysplasia)、颅腕跖骨发育不全(craniocarpotarsal dysplasia)、颅骨干骺端发育不全(craniometaphysial dysplasia)、牙本质发育异常(dentindysplasia)、骨干发育不全(diaphysial dysplasia)、外胚层发育不良(ectodermal dysplasia)、釉质发育不全(enamel dysplasia)、脑性眼球发育不全(encephalo-ophthalmic dysplasia)、偏侧骨骺发育不良(dysplasiaepiphysialis hemimelia)、多发性骨骺发育不良(dysplasia epiphysialismultiplex)、点状骨骺发育不良(dysplasia epiphysialis punctata)、上皮发育不良(epithelial dysplasia)、面-指(趾)-生殖器发育不良(faciodigitogenital dysplasia)、家族性颌骨纤维性发育异常(familialfibrous dysplasia of jaws)、家族性白色皱襞发育异常(familial whitefolded dysplasia)、肌纤维发育不良(fibromuscular dysplasia)、骨纤维异常增殖症(fibrous dysplasia of bone)、旺盛骨性发育不良(florid osseousdysplasia)、遗传性肾脏-视网膜发育不良(hereditary renal-retinaldysplasia)、出汗性外胚层发育不良(hidrotic ectodermal dysplasia)、少汗性外胚层发育不良(hypohidrotic ectodermal dysplasia)、淋巴细胞减少性胸腺发育不全(lymphopenic thymic dysplasia)、乳房发育不良(mammary dysplasia)、下颌面发育不良(mandibulofacial dysplasia)、干骨后端发育不良(metaphysial dysplasia)、蒙底尼发育异常(Mondinidysplasia)、单骨纤维性发育不良(monostotic fibrous dysplasia)、粘膜上皮发育不良(mucoepithelial dysplasia)、多发性骨骺发育不良(multiple epiphysial dysplasia)、眼-耳-脊椎综合征(oculoauriculovertebral dysplasia)、眼-牙-指(趾)发育不良(oculodentodigital dysplasia)、眼椎骨发育不全(oculovertebraldysplasia)、牙体发育异常(odontogenic dysplasia)、opthalmomandibulomelic dysplasia、根尖周牙骨质结构不良(periapicalcemental dysplasia)、多骨纤维发育不良(polyostotic fibrous dysplasia)、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良(pseudoachondroplasticspondyloepiphysial dysplasia)、视网膜发育不良(retinal dysplasia)、隔-视神经发育不良(septo-optic dysplasia)、脊椎骨骺发育不全(spondyloepiphysial dysplasia)和ventriculoradial dysplasia。
可被治疗的另外的肿瘤前障碍包括但不限于良性过度增生性障碍(例如，良性肿瘤、纤维囊性状态、组织肥大、肠息肉或腺瘤以及食道发育不良)、白斑、角化病、鲍温病、农民皮肤病(Farmer′s Skin)、日光性唇炎和日光性角化病。
在优选的实施方案中，本发明的方法用于抑制癌症特别是上文所列的那些癌症的生长、进展和/或转移。
其它过度增殖性疾病、障碍和/或状态包括但不限于恶性肿瘤和相关障碍的进展和/或转移，所述恶性肿瘤和相关障碍是例如白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(包括成髓细胞白血病、前髓细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞白血病和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，何杰金氏病和非何杰金氏病)、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌症例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤(hepatoma)、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤((Wilm′s tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮细胞癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤(emangioblastoma)、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
表达载体
其它实施方案可涉及包含编码DNL构建体的抗体、抗体片段、细胞因子或组成融合蛋白的核酸的DNA序列。融合蛋白可包括连接至例如AD或DDD部分的抗体或片段或细胞因子。
各种实施方案涉及包含编码DNA序列的表达载体。所述载体可包含编码人免疫球蛋白的轻链和重链恒定区以及铰链区的序列，可将该序列与嵌合、人源化或人可变区序列连接。所述载体可额外地包含在所选择的宿主细胞中表达编码的蛋白质的启动子、增强子和信号序列或前导序列。特别有用的载体是pdHL2或GS。更优选地，轻链和重链恒定区及铰链区可来自人EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中任选地将同种异型位置上的氨基酸的至少一个改变成在不同IgG1同种异型中发现的氨基酸，并且其中任选地可用丙氨酸替代基于EU编号系统的EU的重链的氨基酸253。参见Edelman等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA 63：78-85(1969)。在其它实施方案中，可将IgG1序列转变成IgG4序列。
本领域技术人员将会了解，基因工程改造表达载体和插入宿主细胞以表达工程蛋白质的方法在本领域是公知的并且只不过是常规实验。已在例如第7,531,327号和第7,537,930号美国专利(其各自的实施例部分通过引用并入本文)中描述了用于表达克隆的抗体或片段的宿主细胞和方法。
试剂盒
各种实施方案可涉及含有适合用于治疗或诊断患者的患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可包含一种或多种本文中描述的DNL构建体。如果包含施用组分的组合物未制成通过消化道(如通过口服递送)递送，则试剂盒还可包括能够通过一些其它途径递送试剂盒组分的设备。一种用于施用例如肠胃外递送的设备类型为注射器，其用于将所述组合物注射到受试者体内。也可使用吸入设备。在某些实施方案中，可以以装有无菌液体制剂或冻干制剂的预装注射器或自动注射笔(autoinjection pen)的形式提供治疗剂。
所述试剂盒组分可包装在一起或者分开包装在两个或更多个容器中。在某些实施方案中，所述容器可以是包含适合重建(reconstitution)的组合物的无菌、冻干制剂的管形瓶。试剂盒还可包含适用于重建和/或稀释其它试剂的一种或多种缓冲液。其它可使用的容器包括但不限于：袋、盘、盒、管等。试剂盒组分可无菌包装并保存在所述容器中。可包括的另一组成部分为给使用试剂盒的人员的使用说明。
实施例
下列实施例被提供用以举例说明，但不限定本发明的权利要求。
实施例1.用于产生模块Fab亚单位的一般策略
Fab模块可制备成包含DDD或AD序列的融合蛋白。为每个Fab融合蛋白开发独立的转基因细胞系。当制备时，如果需要，模块可进行纯化或保存在细胞培养物的上清液中。制备之后，任何DDD2模块与任何AD模块之间可任意组合，以产生三价DNL构建体。
质粒载体pdHL2已用于产生多种抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等人，J Immunol Methods(1989)，125：191-202；Losman等人，Cancer(Phila)(1997)，80：2660-6。双顺反子哺乳动物表达载体介导IgG重链和轻链的合成。许多不同IgG-pdHL2构建体的载体序列绝大部分都是相同的，仅在可变区(VH和VL)序列存在差异。使用本领域技术人员已知的分子生物学工具，可将这些IgG表达载体转化为Fab-DDD或Fab-AD表达载体。为了产生Fab-DDD表达载体，重链的铰链区、CH2和CH3结构域的编码序列替换为编码所述铰链的前4个残基、14个残基的Gly-Ser连接体和人RIIα的前44个残基的序列(称为DDD1)。为了产生Fab-AD表达载体，IgG的铰链区、CH2和CH3结构域的序列替换为编码所述铰链的前4个残基、15个残基的Gly-Ser连接体和名为AKAP-IS的17个残基的合成AD的序列(称为AD1)，该序列系使用生物信息学和肽阵列技术产生，并显示非常高的与RIIα二聚体结合的亲和力(0.4nM)。参见Alto等人Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A(2003)，100：4445-50。
设计了两个穿梭载体，以利于将IgG-pdHL2载体转化为Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体，如下所述。
CH1的制备
CH1结构域系使用pdHL2质粒载体作为模板，通过PCR扩增获得。左侧PCR引物由CH1结构域的上游(5’)和SacII限制性核酸内切酶位点(即CH1编码序列的5’)组成。右侧引物由编码铰链的前4个残基以及短连接体(最后两个密码子包含Bam HI限制性酶切位点)的序列组成。
CH1左侧引物的5’
5’GAACCTCGCGGACAGTTAAG-3’(SEQ ID NO：63)
CH1+G 4 S-Bam右侧
5’GGATCCTCCGCCGCCGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGG-3’(SEQ ID NO：64)
将410bp PCR扩增引物克隆入pGemT PCR克隆载体(Promega，Inc.)，然后筛选克隆以获得T7(5’)方向的插入物。
(G4S)2DDD1的构建
使用Sigma Genosys(Haverhill，UK)合成双链体寡核苷酸(命名为(G4S)2DDD1)，以编码DDD1的氨基酸序列，所述DDD1前面有连接肽的11个残基，其中前两个密码子包含Bam HI限制性酶切位点。终止密码予和EagI限制性酶切位点位于3’端。编码的多肽序列如下所示。
GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTFLLQGYTVFVLRQQPPDLVFFA VEYFTRLREARA(SEQ ID NO：65)
合成两个寡核苷酸(命名为RIIA1-44上和RIIA1-44下，它们的3’端有30个碱基对的重叠)(Sigma Genosys)，并将它们组合在一起以包含174bp DDD1序列的154个居中碱基对。对寡核苷酸进行退火，然后使用Taq聚合酶进行引物延伸反应。
RIIA1-44上
5’GTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCAGGGCTACACGGTGGAGGTGCTGCGACAG-3’(SEQ ID NO：66)
RIIA1-44下
5’GCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTGAAGTACTCCACTGCGAATTCGACGAGGTCAGGCGGCTGCTGTCGCAGCACCTCCACCGTGTAGCCCTG-3’(SEQ ID NO：67)
引物延伸之后，使用以下引物对所述双链体进行扩增：
G4S Bam-左
5’-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3’(SEQ IDNO：68)
1-44终止Eag右
5’-CGGCCGTCAAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCG-3’(SEQ IDNO：69)
将此扩增引物克隆入pGemT，然后筛选T7(5’)方向的插入物。
(G4S)2-AD1的构建
合成双链体寡核苷酸(命名为(G4S)2-AD1)(Sigma Genosys)，以编码AD1的氨基酸序列，所述AD1前面有连接肽的11个残基，其中前两个密码子包含Bam HI限制性酶切位点。终止密码子和EagI限制性酶切位点位于3’端。编码的多肽序列如下所示。
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：70)
合成两个互补并有重叠的寡核苷酸(命名为AKAP-IS上和AKAP-IS下)。
AKAP-IS上
5’GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCTGACGGCCG-3’(SEQ ID NO：71)
AKAP-IS下
5’CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCTGCCACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCGGATCC-3’(SEQ ID NO：72)
使用下列引物对所述双链体进行PCR扩增：
G4S Bam-左
5’-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3’(SEQ IDNO：73)
AKAP-IS终止Eag右
5’-CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATG-3’(SEQ ID NO：74)
将此扩增引物克隆至pGemT载体，然后筛选T7(5’)方向的插入物。
连接DDD1和CH1
使用BamHI和NotI限制性内切酶将编码DDD1序列的190bp片段从pGemT上切下，然后将该片段连接至CH1-pGemT的相同位点，以产生穿梭载体CH1-DDD1-pGemT。
连接AD1和CH1
使用BamHI和NotI将含有AD1序列的110bp片段从pGemT上切下，然后将该片段连接至CH1-pGemT的相同位点，以产生穿梭载体CH1-AD1-pGemT。
将CH1-DDD1或CH1-AD1克隆入基于pdHL2的载体
使用此模块化设计，CH1-DDD1或CH1-AD1均可包含于pdHL2载体中的任何IgG构建体。通过去除pdHL2的SacII/EagI限制性片段(CH1-CH3)，并将其替换为从相应pGemT穿梭载体上切下的CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI片段，整个重链恒定区即替换为上述构建体之一。
N-末端DDD结构域
DDD或AD的位置并不限于CH1的羧基末端。已改造了其中DDD1序列连接至VH结构域的氨基末端的构建体。
实施例2：表达载体
h679-Fd-AD1-pdHL2的构建
h679-Fd-AD1-pdHL2是用于产生h679Fab的表达载体，其中AD1通过由14个氨基酸残基组成的柔性Gly/Ser肽间隔区偶联至Fd的CH1结构域的羧基末端。将包含h679的可变区的基于pdHL2的载体的SacII/EagI片段替换为CH1-AD1片段(由SacII和EagI从CH1-AD1-SV3穿梭载体上切下)，该载体即转化为h679-Fd-AD1-pdHL2。
C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2的构建
C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生融合蛋白C-DDD1-Fab-hMN-14的表达载体，在所述融合蛋白中，DDD1通过柔性肽间隔区连接至hMN-14 Fab的CH1羧基末端。质粒载体hMN14(I)-pdHL2(已用于产生hMN-14 IgG)通过用SacII和EagI限制性核酸内切酶消化以去除CH1-CH3结构域，然后插入CH1-DDD1片段(由SacII和EagI从CH1-DDD1-SV3穿梭载体上切下)，即转化为C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2。
N-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2的构建
N-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生包含两个拷贝的融合蛋白N-DDD1-Fab-hMN-14的稳定二聚体的表达载体，在所述融合蛋白中，DDD1通过柔性肽间隔区连接至hMN-14Fab的VH的氨基末端。如下对所述表达载体进行改造。使用下面所示的两个引物对DDD1结构域进行PCR扩增。
DDD1 Nco左
5’CCATGGGCAGCCACATCCAGATCCCGCC-3’(SEQ IDNO：75)
DDD1-G 4 S Bam右
5’GGATCCGCCACCTCCAGATCCTCCGCCGCCAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTG-3’(SEQ ID NO：76)
作为PCR的结果，NcoI限制性酶切位点和连接体中包含BamHI限制性酶切位点的部分的编码序列即分别连接至5’和3’末端。将170bp PCR扩增引物克隆至pGemT载体，然后筛选克隆以获得T7(5’)方向的插入物。194bp插入物由NcoI和SalI限制性内切酶从所述pGemT载体上切下，并克隆入所述SV3穿梭载体(使用相同的酶消化制备而成)，以生成中间载体DDD1-SV3。
使用下面所示的寡核苷酸引物对hMN-14Fd序列进行PCR扩增。
hMN-14VH左G4S Bam
5’-GGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGAGGTCCAACTGGTGGAGAGCGG-3’(SEQ ID NO：77)
CH1-C终止Eag
5’-CGGCCGTCAGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTC-3’(SEQ IDNO：78)
作为PCR的结果，BamHI限制性酶切位点和连接体的部分的编码序列即连接到扩增引物的5’端。终止密码子和EagI限制性酶切位点则连接至3’端。将该1043bp扩增引物克隆入pGemT。使用BamHI和EagI限制性内切酶将hMN-14-Fd插入物从pGemT上切下，然后将该插入物连接至DDD1-SV3载体(使用相同的酶消化制备而成)，以产生构建体N-DDD1-hMN-14Fd-SV3。
使用XhoI和EagI限制性内切酶将N-DDD1-hMN-14Fd序列切下，然后将该1.28kb插入片段连接至经相同酶消化C-hMN-14-pdHL2制备的载体片段。最终的表达载体即为N-DDD1-Fd-hMN-14-pDHL2。
实施例3.h679-Fab-AD1的产生和纯化
679抗体结合HSG靶抗原并且可利用亲和层析进行纯化。h679-Fd-AD1-pdHL2载体用Sal1限制性核酸内切酶消化而被线性化，然后通过电穿孔方法转染Sp/EEE骨髓瘤细胞。该双顺反子表达载体介导h679κ轻链和h679Fd-AD1两者的合成和分泌，它们结合形成h679Fab-AD1。电穿孔之后，用所述细胞涂布96孔组织培养板，并用0.05μM甲氨蝶呤(MTX)选择转染克隆。使用涂布BSA-IMP-260(HSG)缀合物的微量滴定板通过ELISA筛选克隆的蛋白质表达，并使用缀合HRP的山羊抗人Fab进行检测。将使用HSG(IMP-239)传感器芯片的BIAcore分析用于通过测量获自注射的稀释培养基样品的初始斜率来确定产率。产量最高的克隆具有约为30mg/L的初始产率。使用单步IMP-291亲和层析，从4.5升转瓶培养物中纯化出总计230mg h679-Fab-AD1。在加至IMP-291-affigel柱之前，培养基用超滤方法浓缩了约10倍。使用PBS将该柱洗脱至基线，然后使用1M咪唑、1mM EDTA、0.1M NaAc、pH 4.5洗脱h679-Fab-AD1。对洗脱液的SE-HPLC分析表明存在保留时间(9.63分钟)对应于50kDa蛋白(未显示)的单一锐峰。在还原SDS-PAGE分析中，仅有代表h679-AD1的多肽组分的两个条带可见(未显示)。
实施例4.N-DDD1-Fab-hMN-14和C-DDD1-Fab-hMN-14的产生和纯化
C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2和N-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2载体通过电穿孔转染入Sp2/0衍生的骨髓瘤细胞。C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2为双顺反子表达载体，其介导hMN-14κ轻链和hMN-14 Fd-DDD1两者的合成和分泌，它们组合形成C-DDD1-hMN-14Fab。N-DDD1-hMN-14-pdHL2为双顺反子表达载体，其介导hMN-14κ轻链和N-DDD1-Fd-hMN-14两者的合成和分泌，它们组合形成N-DDD1-Fab-hMN-14。每个融合蛋白均通过DDD1结构域的相互作用形成稳定的同型二聚体。
电穿孔之后，用所述细胞涂布96孔组织培养板，并用0.05μM甲氨蝶呤(MTX)选择转染克隆。使用涂布WI2(针对hMN-14的大鼠抗id单克隆抗体)的微量滴定板通过ELISA筛选克隆的蛋白质表达，并使用缀合HRP的山羊抗人Fab进行检测。产量最高的C-DDD1-Fab-hMN14 Fab和N-DDD1-Fab-hMN14 Fab克隆的初始产率分别为60mg/L和6mg/L。
使用AD1-Affigel亲和纯化N-DDD1-hMN-14和C-DDD1-hMN-14
使用DDD/AD相互作用对包含DDD1的构建体进行亲和纯化。AD1-C是通过合成制备的由ADI序列和羧基末端半胱氨酸残基组成的肽，所述半胱氨酸残基用于将该肽偶联至Affigel(根据巯基与氯乙酸酐的反应)。包含DDD的a2结构在中性pH下特异性结合AD1-C-Affigel树脂，并可在低pH(例如，pH 2.5)下洗脱。
使用单步AD1-C亲和层析，从1.2升转瓶培养物中纯化出总计81mg C-DDD1-Fab-hMN-14。在加至AD1-C-affigel柱之前，培养基用超滤方法浓缩了约10倍。使用PBS将该柱洗脱至基线，然后使用0.1M甘氨酸、pH 2.5洗脱C-DDD1-Fab-hMN-14。对洗脱液的SE-HPLC分析表明存在保留时间(8.7分钟)与107kDa蛋白(未显示)一致的单一蛋白峰。纯度还经还原SDS-PAGE分析确认，仅显示预期为C-DDD1-Fab-hMN-14的两个多肽组分的分子大小的两个条带(未显示)。
如上所述，使用单步ADI-C亲和层析，从1.2升转瓶培养物中纯化出总计10mg N-DDD1-hMN-14。对洗脱液的SE-HPLC分析表明存在类似于C-DDD1-Fab-hMN-14的保留时间(8.77分钟)并与107kDa蛋白(未显示)一致的单一蛋白峰。还原SDS-PAGE分析仅显示对应于N-DDD1-Fab-hMN-14的多肽组分的两个条带(未显示)。
C-DDD1-Fab-hMN-14的结合活性通过样品的SE-HPLC分析确定，在所述样品中，该试验品与不同量的WI2混合。WI2 Fab和C-DDD1-Fab-hMN-14按0.75∶1的摩尔比混合制成的样品显示三个峰，对应于未结合的C-DDD1-Fab-hMN14(8.71分钟)、结合一个WI2Fab的C-DDD1-Fab-hMN-14(7.95分钟)和结合两个WI2 Fab的C-DDD1-Fab-hMN14(7.37分钟)(未显示)。当分析的样品包含的WI2Fab和C-DDD1-Fab-hMN-14的摩尔比为4时，仅观察到7.36分钟的单峰(未显示)。这些结果证明，hMN14-Fab-DDD1为二聚体，并且有两个活性结合位点。使用N-DDD1-Fab-hMN-14重复此实验，得到的结果非常相似。
竞争性ELISA证明，C-DDD1-Fab-hMN-14和N-DDD1-Fab-hMN-14均以和hMN-14 IgG相似的亲和力与CEA结合，并且亲和力显著强于单价hMN-14 Fab(未显示)。使用包含hMN-14特异的CEA表位(A3B3)的融合蛋白涂布ELISA平板。
实施例5.a2b复合物的形成
a2b复合体形成的证据是由包含等摩尔的C-DDD1-Fab-hMN-14(作为a2)和h679-Fab-AD1(作为b)的混合物的SE-HPLC分析首先提供的。对此样品进行分析时，观察到保留时间为8.40分钟的单一峰，这与形成了大于任何单独的h679-Fab-AD1(9.55分钟)或C-DDD1-Fab-hMN-14(8.73分钟)的新蛋白一致(未显示)。当hMN-14F(ab’)2与h679-Fab-AD1混合，或者C-DDD1-Fab-hMN-14与679-Fab-NEM混合时，均未观察到此高磁场位移，证明相互作用明确地通过DDD1和AD1结构域介导。使用h679-Fab-AD1和N-DDD1-Fab-hMN-14获得非常相似的结果(未显示)。
使用BIAcore进一步证明和鉴定了DD1与AD1融合蛋白之间的特异性相互作用。此实验过程如下：首先将h679-Fab-AD1或679-Fab-NEM结合到高密度的HSG偶联的(IMP239)传感器芯片的表面，然后注射C-DDD1-Fab-hMN-14或hMN-14F(ab’)2来进行实验。如所预期的，当注射后者时，仅有h679-Fab-AD1和C-DDD1-Fab-hMN-14组合造成响应单元的进一步增加(未显示)。使用h679-Fab-AD1与C-DDD1-Fab-hMN-14得到了相似的结果(未显示)。
进行平衡SE-HPLC实验以测定存在于各融合蛋白中的AD1与DDD1之间的特异性相互作用的结合亲和力。发现h679-Fab-AD1与C-DDD1-Fab-hMN-14、N-DDD1-hMN-14和重组人RIIα的商业样品的结合的解离常数(Kd)分别为15nM、8nM和30nM。
实施例6.DDD或AD融合蛋白的亲和纯化
通过产生具有更低亲和力停靠的DDD或AD蛋白来开发通用亲和层析系统。由RIα二聚体形成的DDD以与RIIα相比较1/500的亲和力(225nM)结合AKAP-IS(AD1)。因此，可产生从前44个氨基酸残基形成的RIα二聚体并且将其偶联至树脂以产生用于纯化任何含AD1的融合蛋白的亲和基质。
自然界存在许多较低亲和力(0.1μM)AKAP锚定结构域。如果需要，可引入高度可预测的氨基酸替代以进一步降低所述结合亲和力。低亲和力AD可通过合成或生物学方法制备，并可偶联至树脂以用于任何DDD1融合蛋白的亲和纯化。
实施例7.用于产生二硫键稳定结构的载体
N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2
N-DDD2-hMN-14-pdHL2是用于产生N-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体，其拥有与Fd的氨基末端连接的DDD2的二聚化和停靠结构域序列。DDD2通过15个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接体偶联至VH结构域。DDD2具有与DDD1的序列相同的二聚化序列和停靠序列，但是在它们之前具有半胱氨酸残基。
如下对所述表达载体进行改造。通过合成制备两个包含DDD2的1-13位残基的重叠的互补寡核苷酸(DDD2上和DDD2下)。将所述寡核苷酸退火，并用T4多核苷酸激酶(PNK)磷酸化，以在5’和3’端形成适合与分别用限制性核酸内切酶NcoI和PstI消化的DNA连接的悬突。
DDD2上
5’CATGTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3’(SEQ ID NO：79)
DDD2下
5’GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCA-3’(SEQ ID NO：80)
所述双链体DNA与载体片段DDD1-hMN14 Fd-SV3(通过用NcoI和PstI消化制备)连接，以生成中间构建体DDD2-hMN14 Fd-SV3。使用XhoI和EagI限制性核酸内切酶，将包含DDD2-hMN14 Fd编码序列的1.28kb插入片段从所述中间构建体上切下，然后将该片段连接至使用相同酶消化制备的hMN14-pdHL2载体DNA。最终的表达载体即为N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是用于产生C-DDD2-Fab-hMN-14的表达载体，其具有通过14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接体连接至Fd的羧基末端的DDD2的二聚化和停靠结构域序列。如下对所述表达载体进行改造。通过合成制备两个包含连接体肽的部分的编码序列(GGGGSGGGCG，SEQ ID NO：81)和DDD2的1-13位残基的重叠的互补寡核苷酸。将所述寡核苷酸退火，并用T4 PNK磷酸化，以在5’和3’端形成适合与分别用限制性核酸内切酶BamHI和PstI消化的DNA连接的悬突。
G4S-DDD2上
5’GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3’(SEQ IDNO：82)
G4S-DDD2下
5’GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCAACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3’(SEQ ID NO：83)
所述双链DNA与穿梭载体CH1-DDD1-pGemT(逦过用BamHI和PstI消化制备)连接，以生成穿梭载体CH1-DDD2-pGemT。使用SacII和EagI将507bp片段从CH1-DDD2-pGemT上切下，然后将该片段连接至使用SacII和EagI消化制备的IgG表达载体hMN14(I)-pdHL2。最终的表达构建体即为C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。
h679-Fd-AD2-pdHL2
h679-Fd-AD2-pdHL2是用于产生h679-Fab-AD2的表达载体，其具有通过14个氨基酸残基的Gly/Ser肽连接体连接至CH1的羧基末端的AD2的锚定结构域序列。AD2在AD1锚定结构域序列的前后各有一个半胱氨酸残基。
如下对所述表达载体进行改造。通过合成制备两个包含AD2的编码序列和部分连接体序列的重叠的互补寡核苷酸(AD2上和AD2下)。将所述寡核苷酸退火，并用T4 PNK磷酸化，在5’和3’端形成适合与分别用限制性核酸内切酶BamHI和SpeI消化的DNA连接的悬突。
AD2上
5’GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGATGTGGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCGGCTGCTGAA-3’(SEQ ID NO：84)
AD2下
5’TTCAGCAGCCGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCCACATCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3’(SEQ ID NO：85)
所述双链体DNA与穿梭载体CH1-AD1-pGemT(通过用BamHI和Spel消化制备)连接，以生成穿梭载体CH1-AD2-pGemT。使用SacII和EagI限制性内切酶将包含CH1和AD2编码序列的429碱基对片段从所述穿梭载体上切下，然后将该片段连接至使用相同酶消化制备的h679-pdHL2载体。最终的表达载体即为h679-Fd-AD2-pdHL2。
实施例8.TF1的产生
如下进行三价DNL构建体(称为TF1)的大规模制备。首先按照大致的化学计量浓度将N-DDD2-Fab-hMN-14(蛋白L-纯化的)与h679-Fab-AD2(IMP-291-纯化的)在1mM EDTA，PBS，pH 7.4中混合。加入TCEP之前，SE-HPLC未显示出a2b形成的任何证据(未显示)。而是具有代表a4(7.97分钟；200kDa)、a2(8.91分钟；100kDa)和B(10.01分钟；50kDa)的峰。加入5mM TCEP快速导致a2b复合物的形成，与150kDa蛋白一致的、在8.43分钟的新峰证明了这一点(未显示)。该实验中显然有过量的B，因为对应于h679-Fab-AD2(9.72分钟)的峰仍是明显的，但是对应于a2或a4则未见明显的峰。还原反应1小时后，针对几次更换的PBS进行透析过夜，除去TCEP。所得溶液加入10％DMSO并在室温下保存过夜。
当用SE-HPLC分析时，代表a2b的峰明显变尖，保留时间稍微降低了0.1分钟，变为8.31分钟(未显示)，根据我们先前的发现，这表示结合亲和性的提高。该复合物通过IMP-291亲和层析进一步纯化以除去κ链杂质。如所预期的，过量h679-AD2一起被纯化出来，然后用制备型SE-HPLC除去(未显示)。
TF1是高度稳定的复合物。当测定TF1与HSG(IMP-239)传感器芯片结合时，在样品注射结束之后所观察的响应未见明显降低，相比之下，当在相似条件下测定含有等摩尔混合物的C-DDD1-Fab-hMN-14和h679-Fab-AD1的溶液时，在样品注射期间和刚注射完后，所观察到的响应单元的增加伴随着可检测的下降，表明开始形成的a2b结构不稳定。此外，尽管随后注射WI2在针对TF1的响应单元中引起大幅度的增加，但是对于C-DDD1/AD1混合物来说没有明显增加。
因WI2与固定在传感器芯片上的TF1结合而导致的响应单元的额外增加，对应于两个完整的功能性结合位点，其各自是由N-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚基引起的。TF1与WI2的两个Fab片段的结合能力证实了这一点(未显示)。在含有h679-AD2和N-DDD1-hMN14的混合物被正确还原和氧化成为TF1后，当用BIAcore分析时，WI2几乎没有额外结合(未显示)，表明二硫键稳定的a2b复合物(例如TF1)仅通过DDD2与AD2的相互作用而形成。
对该过程进行了两个改进，以减少过程的时间和效率。首先，以a4/a2结构混合物形式存在的稍微摩尔过量的N-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应，使得没有游离的h679-Fab-AD2存在，而未束缚至h679-Fab-AD2的任何a4/a2结构以及轻链，都用IMP-291亲和层析除去。第二，疏水作用层析(HIC)代替透析或渗滤，在还原反应后用于除去TCEP，这不仅缩短过程时间，而且还增加了潜在病毒的去除步骤。将N-DDD2-Fab-hMN-14与679-Fab-AD2混合，用5mM TCEP在室温下还原1小时。向溶液加入0.75M硫酸铵，然后上样到ButylFF HIC柱上。用含0.75M硫酸铵、5mM EDTA的PBS洗柱，以除去TCEP。用PBS从HIC柱上洗脱还原蛋白，加入10％DMSO。在室温下孵育过夜后，用IMP-291亲和层析分离出高度纯化的TF1(图22)。无需额外的纯化步骤，例如凝胶过滤。
实施例9.TF2的产生
成功产生TF 1之后，将C-DDD2-Fab-hMN-14与h679-Fab-AD2反应，也得到一种类似物，称为TF2。如下产生具有超过90％的收率的试验批量的TF2。将蛋白L-纯化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)与h679-Fab-AD2(60mg)以1.4∶1的摩尔比混合。在含有1mM EDTA的PBS中，总蛋白质浓度为1.5mg/ml。后续步骤包括TCEP还原、HIC层析、DMSO氧化和IMP-291亲和层析，都与针对TF1所述的相同。加入TCEP之前，SE-HPLC未显示出a2b形成的任何证据(未显示)。而是存在对应于a4(8.40分钟；215kDa)、a2(9.32分钟；107kDa)和b(10.33分钟；50kDa)的峰。加入5mM TCEP快速导致a2b复合物的形成，正如在8.77分钟的新峰所证明的那样(未显示)，该峰与二元结构所预期的157kDa蛋白是一致的。用IMP-291亲和层析将TF2纯化至接近均质(未显示)。对IMP-291未结合级分进行的SE-HPLC分析证明从产物中除去了a4、a2和游离κ链(未显示)。
按照对于TF1所述的利用BIACORE测定TF2的功能。将TF2、C-DDD1-hMN-14+h679-AD1(用作非共价a2b复合物的对照样品)或C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作非还原a2和b组分的对照样品)稀释至1μg/ml(总蛋白质)并且通过固定了HSG的传感器芯片。对TF2的响应是两个对照样品反应的约2倍，表明对照样品中仅有h679-Fab-AD组分与传感器芯片结合并保留在其上。随后注射WI2IgG，证明仅有TF2具有与h679-Fab-AD紧密结合的DDD-Fab-hMN-14组分，正如额外的信号响应所示。因WI2与固定在传感器芯片上的TF2结合而导致的响应单元增加，也对应于两个完整的功能性结合位点，每个都是由C-DDD2-Fab-hMN-14的一个亚基引起。TF2与WI2的两个Fab片段的结合能力证实了这一点(未显示)。
通过竞争性ELISA测定TF2的相对CEA-结合亲合力。用含有CEA的A3B3结构域的融合蛋白包被各板(0.5μg/孔)，所述蛋白被hMN-14识别。连续稀释TF1、TF2和hMN-14IgG，一式四份，在含有缀合HRP的hMN-14IgG(1nM)的孔中温育。数据显示TF2以与IgG的亲合力至少相等的亲合力结合CEA，比TF1强2倍(未显示)。
实施例10.TF1和TF2的血清稳定性
将TF1和TF2设计成可用于体内的稳定束缚结构，其中在血液和组织中会发生大量稀释。用BIACORE评估人血清中TF2的稳定性。将TF2用新鲜人血清(是从4个供体合并而获得的)稀释至0.1mg/ml并在5％CO2、37℃温育7天。每天样品按1∶25进行稀释，然后通过BIACORE进行分析，使用IMP-239HSG传感器芯片。注射WI2IgG，用于定量测定完整而完全活性的TF2的量。将血清样品与直接从原液稀释的对照样品相比较。TF2在血清中高度稳定，7天后保持98％的其双特异性结合活性(未显示)。在人或小鼠血清中对于TF1观察到相似的结果(未显示)。
实施例11.C-H-AD2-IgG-pdHL2表达载体的产生
pdHL2哺乳动物表达载体已被用于介导许多重组IgG的表达(Qu等人，Methods 2005，36：84-95)。产生质粒穿梭载体以利于将任何IgG-pdHL2载体转化为C-H-AD2-IgG-pdHL2载体。使用pdHL2载体作为模板以及寡核苷酸Fc BglII左和Fc Bam-EcoRI右作为引物扩增Fc(CH2和CH3结构域)的基因。
Fc BglII左
5’-AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG-3’(SEQ ID NO：86)
Fc Bam-EcoRI右
5’-GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’(SEQID NO：87)
将扩增引物克隆入pGemT PCR克隆载体。使用XbaI和BamHI限制性内切酶从pGemT切下Fc插入物片段，然后将其连接至用XbaI和BamHI消化h679-Fab-AD2-pdHL2而制备的AD2-pdHL2载体，以产生穿梭载体Fc-AD2-pdHL2。
为了将任何IgG-pdHL2表达载体转化成C-H-AD2-IgG-pdHL2表达载体，从前者切下861bp BsrGI/NdeI限制性片段，将其替换为从Fc-AD2-pdHL2载体切下的952bp BsrGI/NdeI限制性片段。BsrGI在CH3结构域内切割并且NdeI在表达盒的下游(3’)切割。
实施例12.C-H-AD2-hLL2 IgG的产生
依帕珠单抗(或hLL2 IgG)是人源化抗-人CD22 MAb。如实施例11中所述的，从hLL2 IgG-pdHL2产生C-H-AD2-hLL2 IgG的表达载体，通过电穿孔将其用于转染Sp2/0骨髓瘤细胞。转染后，用所述细胞涂布96孔板，在含有甲氨蝶呤的培养基中选择转基因克隆。通过使用涂布hLL2-特异性抗-独特型MAb的微量滴定板的夹心ELISA以及缀合过氧化物酶的抗-人IgG的检测筛选克隆的C-H-AD2-hLL2 IgG产率。将克隆扩增至转瓶以制备蛋白质，并在使用蛋白质-A亲和层析的单步骤中从耗尽的培养基纯化C-H-AD2-hLL2 IgG。SE-HPLC分析对两个蛋白峰进行解析(未显示)。慢洗脱峰的保留时间(8.63分钟)与hLL2 IgG相似。快洗脱峰的保留时间(7.75分钟)对应于约300kDa蛋白质。后来确定此峰代表C-H-AD2-hLL2-IgG的二硫键连接二聚体。此二聚体在DNL反应中被还原为单体形式。SDS-PAGE分析表明，纯化的C-H-AD2-hLL2-IgG由模块的两种单体和二硫键连接的二聚体形式组成(未显示)。代表这两种形式的蛋白质条带在非还原性条件下的SDS-PAGE中清晰可见，但是在还原条件下，所有形式均被还原为代表组成性多肽(重链-AD2和κ链)的两个条带(未显示)。未检测到其它污染条带。
实施例13.C-H-AD2-hA20IgG的产生
hA20IgG为人源化抗人CD20MAb。按实施例27所述，从hA20IgG-pDHL2产生C-H-AD2-hA20 IgG的表达载体，然后将该载体通过电穿孔转染Sp2/0骨髓瘤细胞。转染之后，用所述细胞涂布96孔板，并在包含甲氨蝶呤的培养基上筛选转基因克隆。通过使用涂布hA20特异性抗独特型MAb的96孔微量滴定板的夹心ELISA以及使用缀合过氧化物酶的抗人IgG的检测筛选克隆的C-H-AD2-hA20 IgG产率。将克隆扩增至转瓶以制备蛋白质，并在使用蛋白质-A亲和层析的单步骤中从耗尽的培养基纯化C-H-AD2-hA20 IgG，SE-HPLC和SDS-PAGE分析得到的结果与实施例28中获得的C-H-AD2-hLL2 IgG的结果非常相似。
实施例14.AD-和DDD-连接的来自多个抗体的Fab与IgG融合蛋白的产生
通过使用前述实施例中描述的技术，构建下列IgG或Fab融合蛋白，并将其整合入DNL构建体。所述融合蛋白保持亲代抗体的抗原结合特征并且DNL构建体显示被整合的抗体或抗体片段的抗原结合活性。
表2.包含IgG或Fab部分的融合蛋白
  融合蛋白   结合特异性
  C-AD1-Fab-h679   HSG
  C-AD2-Fab-h679   HSG
  C-(AD2)2-Fab-H679   HSG
  C-AD2-IgG-h734   铟-DTPA
  C-AD2-IgG-hA20   CD20
  C-AD2-IgG-hA20L   CD20
  C-AD2-IgG-h L243   HLA-DR
  C-AD2-IgG-hLL2   CD22
  N-AD2-IgG-hLL2   CD22
  C-AD2-IgG-hMN-14   CEA
  C-AD2-IgG-hR1   IGF-1R
  C-AD2-IgG-hRS7   EGP-1
  C-AD2-IgG-hPAM4   MUC1
  C-AD2-IgG-hLL1   CD74
  C-DDD1-Fab-hMN-14   CEACAM5
  C-DDD2-Fab-hMN-14   CEACAM5
  C-DDD2-Fab-h679
  C-DDD2-Fab-hA19   CD19
  C-DDD2-Fab-hA20   CD20
  C-DDD2-Fab-hAFP   AFP
  C-DDD2-Fab-hL243   HLA-DR
  C-DDD2-Fab-hLL1   CD74
  C-DDD2-Fab-hLL2   CD22
  C-DDD2-Fab-hMN-3   CEACAM6
  C-DDD2-Fab-hMN-15   CEACAM6
  C-DDD2-Fab-hPAM4   MUC1
  C-DDD2-Fab-hR1   IGF-1R
  C-DDD2-Fab-hRS7   IGP-1
  N-DDD2-Fab-hMN-14   CEACAM5
实施例15.基于干扰素(IFN)-α2b的DDD模块的产生
用于在哺乳动物细胞中表达的IFN-α2b-DDD2-pdHL2的构建
利用PC扩增IFN-α2b的cDNA序列，从而产生包含在其C末端融合至下列序列的多肽的IFN-α2b的序列：
KSHHHHHHGSGGGGSGGGCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：88).
使用全长人IFNα2b cDNA克隆(Invitrogen Ultimate ORF人克隆cat#HORF01Clone ID IOH35221)作为模板以及下列寡核苷酸作为引物来实现PCR扩增：
IFNA2Xba左
TCTAGACACAGGACCTCATCATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGG(SEQ ID NO：89)
IFNA2 BamHI右
GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGC(SEQ ID NO：90)
将PCR扩增引物克隆入pGemT载体。如下制备DDD2-pdHL2哺乳动物表达载体以与IFN-α2b连接。使用Xba I和Bam HI消化CH1-DDD2-Fab-hMN-14-pdHL2(Rossi等人，Proc Natl Acad Sci USA2006，103：6841-6)载体，这去除了所有Fab基因序列但留下DDD2编码序列。使用Xba I和Bam HI从pGemT切下IFN-α2b扩增引物，然后将其连接入DDD2-pdHL2载体以产生表达载体IFN-α2b-DDD2-pdHL2。
IFN-α2b-DDD2的哺乳动物细胞表达
IFN-α2b-DDD2-pdHL2用Sal I消化而被线性化，然后通过电穿孔方法转染Sp/ESF骨髓瘤细胞。通过ELISA发现两个克隆具有可检测水平的IFN-α2b。使两个克隆之一(命名为95)适应在无血清培养基中生长而无显著的产率减少。随后在5周内用从0.1至0.8μM的递增的MTX浓度扩增克隆。在该阶段，通过有限稀释对其进行亚克隆，扩增具有最高产量的亚克隆(95-5)。使用商业rIFN-α2b(ChemiconIF007，Lot 06008039084)作为标准，在摇瓶中生长的95-5的产率据估计为2.5mg/L。
从在转瓶中培养的分批培养物纯化IFN-α2b-DDD2
将克隆95-5在34个装有总共20L的无血清杂交瘤SFM和0.8μMMTX的转瓶中进行扩增，将其达到终末培养。如下处理培养液，然后利用固定化金属亲和层析(IMAC)纯化IFN-α2b-DDD2。通过离心澄清上清液，进行0.2μM过滤，渗滤至1X结合缓冲液(10mM咪唑、0.5MNaCl、50mM NaH2PO4、pH 7.5)中，浓缩至310mL，加入Tween 20至0.1％的终浓度，然后加至30-mL Ni-NTA柱上。在上样后，用500mL0.02％的于1X结合缓冲液中的Tween 20洗涤柱子，随后用290mL的30mM咪唑、0.02％Tween 20、0.5M NaCl、50mM NaH2PO4、pH 7.5进行洗涤。用110mL的250mM咪唑、0.02％Tween 20、150mM NaCl、50mM NaH2PO4、pH 7.5洗脱产物。纯化出大约6mg的IFNα2b-DDD2。
在大肠杆菌细胞中产生IFN-α2b-DDD2
将IFN-α2b-DDD2在大肠杆菌中通过微生物发酵表达为可溶性蛋白质。使用IFN-α2b-DDD2-pdHL2DNA作为模板，通过PCR扩增编码基因。使用Nde I和Xho I限制酶切位点将扩增引物克隆入pET26b大肠杆菌表达载体。通过在18℃下用100μM IPTG诱导LB摇瓶进行12小时来在BL21pLysS宿主细胞中细胞内表达蛋白质。如上所述利用IMAC从细胞裂解物纯化可溶性IFN-α2b-DDD2。
实施例16.包含连接至CH3-AD2-IgG的IFN-α2b-DDD2的DNL缀合物的产生
命名为20-2b的DNL构建体(包含4个拷贝的连接至一个CH3-AD2-IgG的IFNα2b-DDD2)由DNL通过两个DNL模块CH3-AD2-IgG-v-mab和IFNα2b-DDD2的组合产生，所述DNL模块各自在Sp/ESF中表达。将具有为20-2b(人源化IgG1+4IFNα2b)的相似名称但具有不同靶向Mab的其它DNL-产生的MAb-IFNα构建体在几个实验中用作对照：22-2b以CH3-AD2-IgG-e-mab(依帕珠单抗)作为其AD2模块，该模块抗CD22并且结合淋巴瘤；734-2b以CH3-AD2-IgG-h734作为其AD2模块，该模块抗肝素、In-DTPA并且不结合任何动物蛋白质或组织；以及R1-2b使用CH3-AD2-IgG-hR1，其结合人胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)。
如下制备20-2b DNL构建体。将选择的CH3-AD2-IgG与约2摩尔当量的IFN-α2b-DDD2组合，在加入1mM EDTA和2mM还原型谷胱甘肽(GSH)后在室温下在温和条件下还原混合物。加入氧化型谷胱甘肽至2mM，使混合物在室温下保持另外12-24小时。将DNL缀合物在蛋白A亲和柱上进行纯化。制备称为20-2b、22-2b、hR1-2b和243-2b的4种此类DNL缀合物(各自包含4个拷贝的分别锚定在CH3-AD2-IgG-hA20(具有对CD20的特异性)、CH3-AD2-IgG-hLL2(具有对CD22的特异性)、CH3-AD2-IgG-hR1(具有对IGF-1R的特异性)和CH3-AD2-IgG-hL243(具有对HLA-DR的特异性)上的IFN-α2b)。对从哺乳动物(m)或大肠杆菌(e)产生的IFN-α2b-DDD2的20-2b的SE-HPLC分析各自显示具有与由IgG和4个IFN-α2b基团组成的共价复合物一致的保留时间的主峰(未显示)。对于其它3个IFN-IgG缀合物观察到相似的SE-HPLC特征谱。
IFN-IgG缀合物的体外活性
使用基于细胞的报告子、病毒保护和淋巴瘤增殖测定将20-2b的体外IFNα生物活性与商业PEG化IFNα2试剂PEGASYS和PEG-Intron的体外生物活性相比较。使用基于细胞的试剂盒测定比活性，所述试剂盒使用携带融合至干扰素刺激的应答元件的报告基因的转基因人前单核细胞系(图1A-1D)。20-2b的比活性(5300IU/pmol)大于PEGASYS(170IU/pmol)和PEG-Intron(3400IU/pmol)(图1A)。类似于20-2b产生的734-2b、1R-2b和5个其它MAb-IFNα构建体(数据未显示)各自显示相似的比活性(4000-8000IU/pmol)，这证明用于产生此类结构的DNL方法的一致性(图1A)。4个IFNα2b基团都引起增强的MAb-IFNα的效力。当针对IFNα等同物标准化时，比活性/IFNα为PEGASYS的约10倍并且只为PEG-Intron的1/2。
MAb-IFNα、PEGASYS和PEG-Intron在体外病毒保护测定中的比较证明MAb-IFNα保持IFNα2b抗病毒活性，具有与PEG-Intron相似并且为PEGASYS的约10倍的比活性(图1B)。
IFNα2b可对某些肿瘤品系具有直接抗增殖或细胞毒性效应。在体外增殖测定中，利用对IFNα高度敏感的伯基特淋巴瘤细胞系(Daudi)测量20-2b的活性(图1C)。各IFNα2试剂在体外以高效力(EC50＝4-10pM)高效地抑制(＞90％)Daudi。然而，20-2b(EC50＝0.25pM)的效力为非靶向MAb-IFNα构建体的约30倍。
20-2b的亲代抗-CD20MAb在体外在显著更高的浓度(EC50＞10nM)上对许多淋巴瘤细胞系(包括Daudi(Rossi等人，2008，Cancer Res 68：8384-92))具有抗-增殖活性。
还使用Jeko-1评估20-2b的体外活性，所述细胞是对IFNα和抗-CD20都具有更低的敏感性的套细胞淋巴瘤品系(图1D)。Jeko-1对亲代抗-CD20 MAb只有适度敏感性，具有10％的最大抑制(Imax)，EC50约为1nM。如对于734-2b所显示的，Jeko-1(Imax＝43％；EC50＝23pM)对IFNα2b的反应不如Daudi(Imax＝90％；EC50＝7.5pM)强。与734-2b相比较，20-2b在更大的程度上(Imax＝65％)抑制Jeko-1并且显示二相性剂量反应曲线(图1D)。在浓度＜10pM时，观察到归因于IFNα2b的低浓度反应，其Imax＝43％达到平台，与734-2b相似。在100pM以上高浓度反应很明显，此时Imax达到65％。20-2b的低浓度IFNα2b反应(EC50＝0.97pM)的效力为734-2b的25倍，与对于Daudi的结果相似。
测定亲代抗-CD20抗体与734-2b(v-mab+734-2b)的组合以阐明20-2b的增强的效力归因于CD20和IFNα信号传导的累积/协同效应。除了＞1nM的浓度之外(其中对于前者抑制增加但对于后者没有该效应)，v-mab+734-2b的剂量反应曲线与单独的734-2b大体上相似。这些结果表明MAb靶向是导致20-2b的更低EC50的原因，但其更大的Imax明显归因于IFNα2b和CD-20信号传导的累积活性。CD20信号传导的效应仅在20-2b的高浓度反应(EC50＝0.85nM)中是显著的，该效应与对v-mab的反应(EC50＝1.5nM)相当。对于v-mab+734-2b二相性剂量反应曲线是不明显的，因为两个反应重叠。然而，累积效应在浓度＞1nM时是显著的。20-2b的Imax(65％)比IFNα2b(Imax＝43％)和v-mab(Imax＝10％)的累积反应大，这暗示着IFNα2b与v-mab的作用之间可能存在协同作用。
ADCC活性
IFNα可通过激活NK细胞和巨噬细胞来增强ADCC活性，这是抗-CD20免疫疗法的基本作用机制(MOA)。我们使用外周血单核细胞(PBMC)作为效应细胞，利用两个NHL细胞来比较20-2b与v-mab的ADCC。使用来自多个供体的PBMC，重复测定一致地显示20-2b与v-mab相比较具有增强的ADCC，如对于Daudi和Raji细胞所显示的(图3A)。对于22-2b(包含抗-CD22MAb的MAb-IFNα)、依帕珠单抗也显示了该效应，其显示适度的ADCC(Carnahan等人，2007，MolImmunol 44：1331-41)。
CDC活性
CDC被认为是I型抗-CD20MAb(包括v-mab和利妥昔单抗)的重要MOA。然而，II型MAb(由托西莫单抗代表)中缺乏该功能(Cardarelli等人，2002，Cancer Immunol Immunother 51：15-24)，但其具有抗-淋巴瘤活性。与v-mab不同，20-2b在体外不显示CDC活性(图3B)。这些结果与基于CH3-AD2-IgG-v-mab模块的其它DNL的结果一致，其中补体结合可能因空间干扰而明显受损(Rossi等人，2008)。
实施例17.20-2b的药代动力学(PK)分析
在雄性Swiss-Webster小鼠中评估20-2b的药代动力学(PK)性质，将其与PEGASYS、PEG-INTRON和α2b-413(通过DNL制备的PEG化IFN，参见第11/925,408号美国专利申请)的药代动力学性质相比较。利用ELISA测定不同时间点上血清样品中的IFN-α浓度。按照制造商建议的方案(PBL Interferon Source)使用iLite Human InterferonAlpha Cell-Based Assay试剂盒测定IFNα2b的比活性。图2表示PK分析的结果，其显示20-2b具有比其他试剂显著更慢的消除和更长的血清贮留。在210pmol的注射剂量时，以小时表示的经计算的药代动力学血清半衰期为8.0小时(20-2b)、5.7小时(α2b-413)、4.7小时(PEGASYS)和2.6小时(PEG-INTRON)。消除率(1/h)为0.087(20-2b)、0.121(α2b-413)、0.149(PEGASYS)和0.265(PEG-INTRON)。经计算的MRT0.08→∞(hr)为22.2(20-2b)、12.5(α2b-413)、10.7(PEGASYS)和6.0(PEG-INTRON)。因为通过复合物而非个体抗体或细胞因子的性质测定药代动力学参数，因此预期细胞因子-DNL复合物的PK特征可归于其他细胞因子部分和抗体部分而不限定于上述特定的20-2b构建体。
实施例18.20-2b的体内活性
血清稳定性
20-2b在37℃下在人血清(≥10天)或全血(≥6天)中是稳定的(未显示)。使用双特异性ELISA测定法测定20-2b复合物的浓度。随着测定的时期过去全血或血清中血清20-2b水平基本上没有可检测的变化。
20-2b抗来自人血的淋巴瘤细胞的离体功效
我们比较20-2b、v-mab、734-2b或v-mab+734-2b在离体环境中从全血消除淋巴瘤或正常B细胞的能力(图4)。裸抗-CD20 MAb的治疗功效据认为通过3个作用机制(MOA)-信号传导诱导的细胞凋亡或生长停滞、ADCC和CDC来实现(Glennie等人，2007，Mol Immunol44：3823-37)。在该测定中，v-mab可利用所有3个MOA，同时基于体外发现，20-2b可潜在利用信号传导并且增强ADCC但非CDC。在该短期模型中，20-2b和734-2b的IFNα2b基团可直接作用于肿瘤细胞，增强v-mab的ADCC活性，并且可能具有一定的免疫刺激作用。然而，在该2天的离体测定中未能获得可能在体内发生的天然免疫系统和适应性免疫系统的IFNα-介导的激活的全谱。
在0.01nM上，20-2b排除Daudi细胞(60.5％)的能力比v-mab(22.8％)、734-2b(38.6％)或v-mab+734-2b(41.7％)显著更强(图4)。在0.1nM上，20-2b和v-mab+734-2b以相似的程度(88.9％)消耗Daudi，这比v-mab(82.4％)或734-2b(40.7％)更强(图4)。在1nM上，除了734-2b(55.7％)外，各试剂排除消耗95％的Daudi(图4)。指示的每一个差异在统计上是显著的(P＜0.01)。
Ramos与Daudi相比较对IFNα2b和v-mab都不太敏感。734-2b的效应仅为中等，在每一个浓度上导致少于20％的Ramos消耗(图4)。在0.01和0.1nM上，20-2b与v-mab+734-2b相比较消耗更多的Ramos，v-mab+734-2b依次比v-mab消耗更多的细胞(图4)。在1nM上，除了734-2b以外，所有处理都导致相似的Ramos消耗(75％)(图4)。指示的每一个差异在统计上是显著的(P＜0.02)。
如对于734-2b所显示的，单独的IFNα2b在该测定中不排除正常B细胞。在这些低浓度上，20-2b、v-mab和v-mab+734-2b各自显示相似的B细胞的剂量反应性消耗，其显著低于对Daudi或Ramos的消耗。没有一个处理导致T细胞的显著消耗(数据未显示)。
20-2b在SCID小鼠中的体内功效
小鼠模型的限制是鼠细胞对人IFNα2b的极低敏感性。可在人中实现的20-2b的总体治疗有利方面可包括天然免疫和适应性免疫的增强。记住这些限制，我们在SCID小鼠中研究20-2b抗播散性伯基特淋巴瘤模型的抗-淋巴瘤体内功效。我们最初在早期Daudi模型中测试到高度敏感性(图5A)。在接种后第二天，给组施用单次低剂量的20-2b、v-mab或734-2b。当与盐水(对于v-mab而非对于无关MAb-IFNα对照，734-2b)相比较时，0.7pmol(170ng)的单次剂量的v-mab或734-2b导致存活率的显著提高(P＜0.0001)(图5A)。该提高是适度的，中位存活期(MST)从27天(对于盐水)增加至34天(对于v-mab)。然而，0.7pmol(170ng)的单次剂量的20-2b相对于盐水对照和v-mab组将MST增加100多天(P＜0.0001)(图5A)。在19周后结束研究，此时0.7pmol 20-2b处理组中的7个长期存活者(LTS)经尸检未发现疾病的可见证据(治愈的)(图5A)。令人惊讶地，甚至0.07pmol(17ng)的最低剂量的20-2b也使MST延长2倍以上(图5A)。
接下来，我们在更具挑战性的晚期Daudi模型中评估20-2b的功效，在所述模型中，使小鼠在处理前产生显著更大的肿瘤负荷(图5B)。在肿瘤接种后7天，给组施用单次低剂量(0.7、7.0或70pmol)的20-2b、v-mab、734-2b或PEGASYS。盐水对照小鼠的MST为21天(图5B)。最高剂量(70pmol)的PEGASYS或734-2b(其各自具有增强的Pk(与重组IFNα2b相比较)但不靶向肿瘤)使MST加倍(42天；P＜0.0001)(图5B)。利用1/100的剂量(0.7pmol)的20-2b的处理产生与最高剂量(70pmol)的PEGASYS或734-2b相似的结果(38.5天)(图5B)。利用1/10的剂量(7pmol)的20-2b的处理导致与利用70pmol的PEGASYS或734-2b的处理相比较显著提高的存活时间(80.5天，20％LTS)(P＜0.0012)(图5B)。在测试的最高剂量(70pmol)上，20-2b使100％LTS的MST提高至超过105天(图5B)。我们先前已利用早期模型证明v-mab可在相对低的剂量(3.5pmol)上增加荷Daudi小鼠的存活时间，而更高的剂量导致LTS。然而，在该晚期肿瘤模型中，单次剂量的70pmol的v-mab对存活时间只具有中等效应(虽然是显著的)(MST＝24天，P＝0.0001)(图5B)。
我们随后在更具挑战性的模型中测定20-2b，所述模型与Daudi相比较对IFNα引起的直接抑制不太敏感并且对利用v-mab的免疫疗法反应不太强。与Daudi相比较，Raji对IFNα2b的直接作用的敏感性约为1/100。然而，Raji与Daudi具有相似的CD20抗原密度(Stein等人，2006，Blood 108：2736-44)并且对v-mab起反应，虽然明显不如Daudi强(Goldenberg等人，2009，Blood 113，1062-70)。在晚期Raji模型中研究20-2b的功效，在肿瘤接种后5天开始治疗(图6A)。在2周的时间内给组施用总共6次注射(每次250pmol)。734-2b相对于盐水未增加存活时间(MST＝16天)，与Raji对IFNα的不敏感性一致(图6A)。V-mab相对于盐水显著增加存活时间(MST＝26天，P＜0.0001)(图6A)。20-2b优于所有其他处理(MST＝33天，P＜0.0001)(图6A)。
最后，我们利用NAMALWA，具有低的对IFNα的直接作用的敏感性(与Daudi或Raji相比较具有约1/25的CD20抗原密度并且被认为对抗-CD20免疫疗法有抗性(Stein等人，2006))的人淋巴瘤，研究20-2b的功效(图6B)。给组施用总共6个剂量(每个剂量250pmol)的20-2b或734-2b。给另一组施用总共7个剂量(每个剂量3.5nmol)的v-mab。利用盐水处理的组具有17天的MST(图6B)。利用734-2b的处理非常温和(虽然显著)地增加存活时间(MST＝20天，P＝0.0012)(图6B)。20-2b(MST＝34天)优于以14倍剂量给予的734-2b(P＝0.0004)以及v-mab(MST＝24天，P＝0.0026)(图6B)。
结论
结果明确地显示具有抗-CD20MAb的IFNα的靶向使免疫细胞因子比单独的或组合的试剂更具效力和效率。IFNα对肿瘤的MAb靶向可允许进行频率更低的单一试剂的给药方案，减少或消除与IFN疗法相关的副作用，并且导致显著增强的功效。此外，靶向IFNα可诱导急性肿瘤介导的免疫反应和可能通过天然免疫和适应性免疫的多效性刺激引发免疫记忆(Belardelli等人，2002，Cytokine Growth FactorRev 12：119-34)。其他研究小组已产生通过化学缀合制备的MAb-IFNα，所述MAb-IFNα显示此类构建体的某些潜在临床益处(Pelham等人，1983，Cancer Immunol Immunother 15：210-16；Ozzello等人，1998，Breast Cancer Res Treat 48：135-47)。包含鼠IFNα和抗-HER2/neu MAb的重组MAb-IFNα在具有免疫能力的小鼠中显示对转基因(HER2/neu)鼠B细胞瘤的强有力抑制并且还能够通过免疫记忆诱导保护性适应性免疫反应(Huang等人，2007，J Immunol179：6881-88)。
我们预期利用20-2b的治疗将刺激许多免疫免疫细胞(包括NK、T4、T8和树突细胞)的局部募集和活化，从而导致增强的细胞毒性和ADCC，并且可潜在地诱导肿瘤介导的免疫记忆。然而，鼠细胞与人细胞相比较对人IFNα2b极度不敏感(对数值约为4)(Kramer等人，1983，J Interferon Res 3：425-35；Weck等人，1981，J Gen Virol57：233-37)。因此，在上述小鼠模型体内研究中几乎没有(如果有的话)20-2b的抗-淋巴瘤活性可归因于小鼠免疫反应的IFNα2b激活。相反地，杀伤主要归因于IFNα2b对淋巴瘤细胞的直接作用。
我们已显示20-2b具有增强的ADCC，这可以是抗-CD20免疫疗法的最重要的MOA。然而，由于人IFNα2b只是非常弱的鼠宿主效应细胞的刺激剂，因此当其存在于人中时，IFNα-增强的ADCC可能未得到实现。即使具有这些限制，体内结果仍然显示20-2b可以是高效抗-淋巴瘤试剂，在IFNα-敏感性Daudi模型中显示为v-mab或非靶向MAb-IFNα的100倍的效力。即使对于对IFNα的直接作用相对不太敏感(Raji/NAMALWA)或对抗-CD20免疫疗法(NAMALWA)有抗性的淋巴瘤模型，20-2b仍然显示优于v-mab或非靶向MAb-IFNα的功效。
IFNα2b至v-mab的融合通过延长循环时间和使得能够肿瘤靶向来增强其体内效力。Pk的治疗意义在Daudi模型中得到证明，在所述模型中更慢地清除EGASYS优于更快地清除PEG-Intron，其具有更高的特异性活性(数据未显示)。20-2b明显比PEGASYS或734-2b更有效力，表明通过抗-CD20 MAb的淋巴瘤靶向对于其优异的效力和功效是至关重要的。令人惊讶地，靶向的影响即使在体外测定中也是明显的。在体外增殖实验(只允许通过信号传导进行淋巴瘤抑制)中，20-2b与非靶向MAb-IFNα(单独地或当与v-mab组合时)相比较在1/25的浓度上显示活性。离体环境允许所有3个抗-CD20 MOA都起作用。即使无CDC活性，20-2b在排除来自血液的淋巴瘤中也比IFNα或v-mab(单独地或组合地)更有效率，这证明了靶向的重要性。在体外/离体研究中，MAb靶向的影响有点令人惊讶，因为MAb、效应子和靶细胞在整个实验过程中都被限制。我们预期20-2b在人患者中将具有显著更大的体内影响。
20-2b的IFNα2b和v-mab组分可明显地以累积或协同方式作用，导致其增强的效力。体外增殖测定表明存在至少累积效应，这被其中v-mab与734-2b的组合优于任-单独的试剂的离体研究的结果证实。这可通过作为20-2b的部分的v-mab的增加的ADCC或当与734-2b组合时来离体实现，然而ADCC在体外增殖测定中不具有功能，这表明存在另外的机制。通过v-mab-结合的CD20传导的信号可增加IFNα信号，从而导致增强的效力。可选择地，作为缓慢中和MAb的v-mab的结合可阻止I型IFN受体的内化/下调，从而导致更长时间和更有效的IFNα-诱导的信号。
实施例19.基于红细胞生成素(EPO)的DDD模块的产生
用于在哺乳动物细胞中表达的EPO-DDD2-pdHL2的构建
通过PCR扩增EPO的cDNA序列，产生在其C末端融合至由如下序列组成的多肽的EPO：
KSHHHHHHGSGGGGSGGGCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：88)
使用全长人PCR EPO cDNA克隆作为模板和下列寡核苷酸作为引物来进行PCR扩增：
EPO Xba I左
TCTAGACACAGGACCTCATCATGGGGGTGCACGAATGTCC(SEQ ID NO：91)
EPO BamHI右
GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTTCTGTCCCCTGTCCTGCAG(SEQ ID NO：92)
将PCR扩增引物克隆入pGemT载体。制备DDD2-pdHL2哺乳动物表达载体，通过用XbaI和Bam HI限制性核酸内切酶消化来将其与EPO连接。使用XbaI和Bam HI从pGemT切下EPO扩增引物，将其连接入DDD2-pdHL2载体以产生表达载体EPO-DDD2-pdHL2。
EPO-DDD2的哺乳动物细胞表达
EPO-pdHL2用SalI消化而被线性化，然后通过电穿孔方法将其稳定地转染入Sp/ESF骨髓瘤细胞。用含有0.15μM MTX的培养基选择克隆。通过使用Nunc Immobilizer镍-螯合物板捕获His-标记的融合蛋白的ELISA和利用抗-EPO抗体的检测显示克隆#41、49和37各自产生约0.5mg/L的EPO。利用IMAC从9.6升无血清转瓶培养物纯化出约2.5mg的EPO-DDD2。
实施例20.734-EPO，包含4个连接至CH3-AD2-IgG-h734的EPO-DDD2部分的DNL缀合物的产生
如上对于20-2b所描述的产生734-EPO。蛋白A-纯化的734-EPO的SE-HPLC分析显示更大的分子大小的主峰和肩(未显示)。主峰的保留时间与由IgG和4个EPO基团组成的共价复合物一致。肩可能归因于IgG-EPO缀合物的非共价二聚体。利用考马斯蓝染色的DS-PAGE分析和抗-EPO免疫印迹分析显示在非还原条件下，所述产物具有大于260kDa的Mr(未显示)，与推导的约310kDa的MW一致。在还原条件下，代表734-EPO的3个组成性多肽(EPO-DDD2、重链-AD2和轻链)的条带清晰可见并且在量上似乎相似(未显示)。未检测到非产物污染物。
使用重组人EPO(Calbiochem)作为阳性对照测定EPO-DDD2和734-EPO的刺激EPO-反应性TF1细胞生长的能力(ATCC)。将TF1细胞在含有1×104个细胞/孔的96孔板中培养在补充有20％FBS而无GM-CSF补充的RPMI 1640培养基中。使用商业试剂盒(Humanerythropoietin ELISA试剂盒，Stem Cell Research，Cat#01630)测定EPO构建体的浓度(单位/ml)。在rhEPO、EPO-DDD2或734-EPO存在的情况下以900u/ml至0.001U/ml的浓度培养细胞，进行72小时。在于96孔板读出计中测量OD490之前，使用20μl MTS试剂/孔温育6小时来通过MTS测定比较活细胞密度。使用Graph Pad Prism软件产生剂量反应曲线和EC50值(图7)。EPO-DDD2和734-EPO都显示为约10％的rhEPO的体外生物活性。
实施例21.基于粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)的DDD模块的产生
用于在哺乳动物细胞中表达的G-CSF-DDD2-pdHL2的构建
通过PCR扩增G-CSF的cDNA序列，产生在其C末端融合至由SEQ ID NO：88组成的多肽的G-CSF。使用全长人G-CSF cDNA克隆(Invitrogen IMAGE人cat#97002RG Clone ID 5759022)作为模板和下列寡核苷酸作为引物来进行PCR扩增：
G-CSF XbaI左
TCTAGACACAGGACCTCATCATGGCTGGACCTGCCACCCAG(SEQ ID NO：93)
G-CSF BamHI-右
GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG(SEQ ID NO：94).
将PCR扩增引物克隆入pGemT载体。制备DDD2-pdHL2哺乳动物表达载体，通过用XbaI和Bam HI限制性核酸内切酶消化来将其与G-CSF连接。使用XbaI和Bam HI从pGemT切下G-CSF扩增引物，将其连接入DDD2-pdHL2载体以产生表达载体G-CSF-DDD2-pdHL2。
G-CSF-DDD2的哺乳动物细胞表达
G-CSF-pdHL2用SalI酶消化而被线性化，然后通过电穿孔方法将其稳定地转染入Sp/ESF骨髓瘤细胞。用含有0.15μM MTX的培养基选择克隆。通过夹心ELISA显示克隆#4产生约0.15mg/L的G-CSF-DDD2。
从在转瓶中培养的分批培养物纯化G-CSF-DDD2
将克隆#4在34个装有总共20L的杂交瘤SFM和0.4μM MTX的转瓶中进行扩增，将其达到终末培养。通过离心澄清上清液，进行过滤(0.2μM)，透析至1X结合缓冲液(10mM咪唑、0.5M NaCl、50mMNaH2PO4、pH 7.5)中，浓缩。通过IMAC纯化浓缩物。
G-CSF-DDD2的构建和在大肠杆菌中的表达
也将G-CSF-DDD2在大肠杆菌中通过微生物发酵表达为可溶性蛋白质。使用G-CSF-DDD2-pdHL2 DNA作为模板，通过PCR扩增编码序列。使用Nde I和Xho I限制酶切位点将扩增引物克隆入pET26b大肠杆菌表达载体。通过在18℃下用100μM IPTG诱导LB摇瓶进行12小时来在BL21pLysS宿主细胞中细胞内表达蛋白质。利用IMAC从细胞裂解物纯化可溶性G-CSF-DDD2。
N-DDD2-G-CSF(C17S)的构建和在大肠杆菌中的表达
通过在G-CSF(C17S)的N末端融合DDD2序列与肽间隔区来制备可替代的G-CSF-DDD2模块，其与野生型相异在于用丝氨酸替代第17个位置上的未配对半胱氨酸。将N-DDD2-G-CSF(C17S)在大肠杆菌中表达，利用IMAC进行纯化。
实施例22.hR1-17S，包含4个连接至CH3-AD2-IgG-hR1的N-DDD2-G-CSF(C17S)部分的DNL缀合物的产生
在利用蛋白A亲和层析纯化后，通过在氧化还原条件下将CH3-AD2-IgG-hR1与过量N-DDD2-G-CSF(C17S)组合来产生hR1-17S。对蛋白A-纯化的hR1-17S的SE-HPLC分析显示更大分子量的主峰和肩(未显示)。主峰的保留时间与由IgG和4个G-CSF基团组成的共价复合物一致。肩可能归因于IgG-G-CSF缀合物的非共价二聚体。利用考马斯蓝染色的DS-PAGE分析和抗-G-CSF免疫印迹分析显示在非还原条件下，所述产物具有对应于约260kDa的推导的MW的Mr。在还原条件下，检测到代表hR1-17S的3个组成性多肽(N-DDD2-G-CSF(C17S)、重链-AD2和轻链)的条带(未显示)。
实施例23.包含两个不同抗体部分和细胞因子的DNL构建体的产生和用途
如上所述，20-2b(通过停靠-和-加锁(DNL)法(以包含共价连接至veltuzumab、人源化抗-CD20mAb的四聚IFN-α2b)产生的单特异性免疫细胞因子)在体外和在人淋巴瘤异种移植物中显示极强的抗-肿瘤活性。然而，几乎不表达或不表达CD20的淋巴瘤和白血病预期对利用20-2b的治疗有抗性。HLA-DR在多种造血肿瘤和某些实体癌上表达。可将IFN-α靶向CD20和HLA-DR的双特异性免疫细胞因子可能是更有效的抗广泛造血恶性肿瘤(包括表达CD20、HLA-DR或两者的那些肿瘤)的治疗剂。由于多功能复合物的各组分(veltuzumab、抗-HLA-DR F(ab)2和IFN-α2b)独特地具有抗肿瘤活性，我们估计双特异性免疫细胞因子是否潜在地甚至比单特异性细胞因子20-2b更有效力。
我们在此处报导了命名为20-C2-2b的第一双特异性MAb-IFNα的产生和鉴定，其包含位点特异性地连接至veltuzumab(人源化抗-CD20)的两个拷贝的IFN-α2b和hL243(人源化抗-HLA-DR；IMMU-114)的稳定的F(ab)2。在体外，20-C2-2b抑制4个淋巴瘤和8个骨髓瘤细胞系的每一个细胞系，并且在除了一个(HLA-DR-/CD20-)骨髓瘤品系以外的其余品系中比单特异性CD20-靶向MAb-IFNα或包含亲代抗体和IFNα的混合物更有效，这表明20-C2-2b在各种造血恶性肿瘤的治疗中应当是有用的。20-C2-2b显示比只靶向HLA-DR或CD20的单特异性MAb-IFNα更大的抗KMS12-BM(CD20+/HLA-DR+骨髓瘤)细胞毒性，表明20-C2-2b的所有3种组分可引起细胞毒性。我们的发现表明给定的细胞对MAb-IFNα的反应性取决于其对IFNα和特定抗体的敏感性以及被靶向的抗原的表达和密度。
因为20-C2-2b具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)但非CDC，并且可靶向CD20和HLA-DR，所以其对于众多表达任一种或两种抗原的造血癌症的治疗是有用的。双特异性免疫细胞因子似乎在消除与骨髓瘤相关的假定的癌症干细胞(所述细胞对目前的治疗方案有抗性并且据报导表达CD20)的消除中特别有用。
材料和方法
抗体和细胞培养下列论述中所使用的缩写是：20(CH3-AD2-IgG-v-mab，抗-CD20 IgG DNL模块)；C2(CH1-DDD2-Fab-hL243，抗-HLA-DR Fab2 DNL模块)；2b(二聚IFNα2B-DDD2DNL模块)；734(抗-in-DTPA IgG DNL模块，用作非靶向对照)。下列MAb由Immunomedics，Inc.提供：veltuzumab或v-mab(抗-CD20 IgG1)、hL243γ4p(Immu-114，抗-HLA-DR IgG4)、鼠抗-IFNα MAb和针对v-mab(WR2)和hL243(WT)的大鼠抗-独特型MAb。热失活的FBS获自Hyclone(Logan，UT)。所有其他细胞培养基和补充物购自Invitrogen Life Technologies(Carlsbad，CA)。
将Sp/ESF细胞(具有优良生长特性的衍生自Sp2/0的细胞系)维持在杂交瘤无血清培养基中。将NHL和MM细胞培养在含有10％FBS，1mM丙酮酸钠、10mM L-谷氨酰胺和25mM HEPES的RPMI 1640培养基中。Daudi、Ramos、Raji、Jeko-1、NCI-H929和U266人淋巴瘤细胞系购自ATCC(Manassas，VA)。MM细胞系的来源如下：Dr.TakemiOtsuki(Kawasaki Medical School，Okayama，Japan)KMS11、KMS12-PE和KMS 12-BM；分别来自Dr.Joshua Epstein(University of Arkansas，Little Rock，AK)、Dr.Kenji Oritani(Osaka University，Osaka，Japan)和Dr.Steven Rosen(Northwestern University，Chicago，IL)的CAG、OPM-6和MM.1R。所有细胞系都由提供者验证，在它们使用的6个月内获得并且传代不超过50次。我们未重新验证所述细胞系。
DNL构建体如先前实施例中所述，使用DNL法，通过将IgG-AD2-模块与DDD2-模块组合来产生单特异性MAb-IFNα(20-2b-2b、734-2b-2b和C2-2b-2b)和双特异性HexAb(20-C2-C2)。将包含四聚IFNα2b和MAb h734[抗-铟-DTPAIgG1]的734-2b-2b用作非靶向对照MAb-IFNα。
哺乳动物表达载体的构建以及生产性克隆的随后产生和CH3-AD2-IgG-v-mab的纯化公开于先前的实施例中。所表达的重组融合蛋白具有通过15个氨基酸长的柔性连接体肽连接至v-mab的CH3结构域的羧基端的AD2肽。重链AD2与轻链多肽的共表达导致组装有两个AD2肽的IgG结构的形成。通过电穿孔将表达载体转染入Sp/ESF细胞(Sp2/0的基因工程改造的细胞系)。pdHL2载体包含四氢叶酸还原酶的基因，从而允许克隆选择以及利用甲氨蝶呤(MTX)进行基因扩增。从96孔板分离稳定的克隆，利用含有0.2μM MTX的培养基进行选择。通过夹心ELISA筛选克隆的CH3-AD2-IgG-vmab产率。在具有无血清培养基的转瓶中产生所述模块。
如实施例16中所论述的，通过将DDD2肽经18个氨基酸长的柔性连接体肽重组地融合至人IFNα2b的羧基端来产生DDD-模块，IFNα2b-DDD2。对于所有DDD-模块也是如此，所表达的融合蛋白自发地形成稳定的同型二聚体。
如实施例1-7中所论述的进行多种CH1-DDD2-Fab模块的产生、鉴定和使用。如下从hL243-IgG-pdHL2载体产生CH1-DDD2-Fab-hL243表达载体：用SacII和EagI限制性内切酶切下CH1-铰链-CH2-CH3结构域的序列，然后将其替代为用相同的酶从C-DDD2-hMN-14-pdHL2表达载体切下的编码CH1-DDD2的507bp序列。在通过电穿孔将CH1-DDD2-Fab-hL243-pdHL2转染入Sp/ESF细胞后，通过使用用小鼠抗-人κ链包被的96孔微量滴定板以捕获融合蛋白的夹心ELISA筛选抗MTX的克隆的产率，所述融合蛋白使用缀合辣根过氧化物酶的山羊抗-人Fab进行检测。在转瓶培养物中产生所述模块。
无血清H-SFM培养基中的转瓶培养物和分批补料生物反应器生产导致与迄今为止产生其他产生的其他IgG-AD2模块和细胞因子-DDD2模块相当的收率。分别如先前所述(Rossi等人，Blood 2009，114：3864-71)，使用MAbSelect(GE Healthcare)和His-Select HF镍亲和凝胶(Sigma)，通过亲和层析从培养液中纯化CH3-AD2-IgG-v-mab和IFNα2b-DDD2。将含有CH1-DDD2-Fab-hL243模块的培养液直接用于KappaSelect亲和凝胶(GE-Healthcare)，用PBS将其洗涤至基线，然后用0.1M甘氨酸(pH 2.5)进行洗脱。
使用SDS-PAGE和SE-HPLC评估DNL模块的纯度(未显示)。在非还原条件下的分析显示，在DNL反应之前，IFNα2b-DDD2和CH1-DDD2-Fab-hL243以二硫键连接的二聚体形式存在(未显示)。对于DDD模块总是看到的该现象是有益的，因为其保护反应性巯基免受不可逆氧化。相比较之下，CH3-AD2-IgG-v-mab(未显示)以单体和二硫键连接的二聚体形式存在，并且在DNL反应中被还原为单体。SE-HPLC分析与非还原性SDS-PAGE结果一致，表明单体种类以及在还原后被转化为单体形式的二聚体模块。巯基通过参与AD2半胱氨酸残基之间的二硫键而在两种形式中得到保护。还原SDS-PAGE显示每一种模块被纯化至接近均质并且被定义为包含每一种模块的组分多肽(未显示)。对于CH3-AD2-IgG-v-mab，鉴定了重链-AD2和κ轻链。解析了CH1-DDD2-Fab-hL243的hL243-Fd-DDD2和κ轻链多肽(未显示)。解析了IFN α2b-DDD2的一个主带和一个次带(未显示)，所述条带经确定分别为非糖化和O-糖基化种类。
通过DNL产生20-C2-2b将3种DNL模块(CH3-AD2-IgG-v-mab、CH1-DDD2-Fab-hL243和IFN-α2b-DDD2)以等摩尔的量组合以产生bsMAb-IFNα，20-C2-2b。在室温下于温和的还原条件(1mM还原型谷胱甘肽)下进行停靠步骤过夜后，加入氧化型谷胱甘肽(2mM)以有利于二硫键形成(加锁)。使用3个连续亲和层析步骤将20-C2-2b纯化至接近均质。一开始，利用蛋白A(MAbSelect)纯化DNL混合物，所述蛋白A结合CH3-AD2-IgG-v-mab基团并且消除未反应的IFNα2b-DDD2或CH1-DDD2-Fab-hL243。使用His-Select HF镍亲和凝胶通过IMAC进一步纯化蛋白A结合的材料，所述亲和凝胶特异性结合IFNα2b-DDD2部分并且消除不存在该基团的任何结构。使用hL243-抗-独特型亲和凝胶，最终的处理步骤可除去不存在CH1-DDD2-Fab-hL243的任何分子。
本领域技术人员将会了解，可使用亲和层析纯化包含效应物部分的任何组合的DNL复合物，只要可获得3种效应物部分的每一种的配体并且将其连接至柱材料即可。所选择的DNL构建体是结合包含3种效应部分的每一种的配体的3个柱子的每一个的DNL构建体，并且可在洗涤以除去未结合复合物后被洗脱。
下列实例代表几种相似的20-C2-2b制剂。将等摩尔量的CH3-AD2-IgG-v-mab(15mg)、CH1-DDD2-Fab-hL243(12mg)和IFN-α2b-DDD2(5mg)于30-mL反应体积中组合，向溶液中加入1mM还原型谷胱甘肽。在于室温下进行16小时后，向混合物中加入2mM氧化型谷胱甘肽，将其在室温下保持另外6小时。将反应混合物用于5-mL蛋白A亲和柱，用PBS将该柱子洗涤至基线，然后使用0.1M甘氨酸(pH 2.5)进行洗脱。使用3M Tris-HCl(pH 8.6)中和含有约20mg蛋白质的洗脱液，在用于5-mL HisSelect IMAC柱之前将其透析至HisSelect结合缓冲液(10mM咪唑、300mM NaCl、50mM NaH2PO4、pH 8.0)。用HisSelect结合缓冲液将该柱子洗涤至基线，然后用250mM咪唑、150mM NaCl、50mM NaH2PO4、pH 8.0进行洗脱。
将含有约11.5mg蛋白质的IMAC洗脱液直接用于WP(抗-hL243)亲和柱，用PBS将该柱子洗涤至基线，然后使用0.1M甘氨酸(pH 2.5)进行洗脱。该过程产生7mg的高度纯化的20-C2-2b。这约为20-C2-2b的理论收率的44％，为总起始材料(在本实例中16mg)的50％，产生各自25％的副产品20-2b-2b和20-C2-C2。
分析方法使用Alliance HPLC系统，利用BioSuite 250，4μmUHR SEC柱子(Waters Corp.，Milford MA)进行大小排阻HPLC(SE-HPLC)。通过在利用SE-HPLC分析所得的免疫复合物之前，将过量的WT、抗-IFNα或WR2与20-C2-2b混合来评估免疫反应性。在还原和非还原条件下，分别使用12％和4-20％梯度Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen，Gaithersburg，MD)进行SDS-PAGE。
使用与6210 TOF MS(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)偶联的1200-系列HPLC进行电喷雾离子化飞行时间(ESI-TOF)液相色谱/质谱(LC/MS)。在60℃下用10mM tris(2-羧乙基)膦还原20-C2-2b，进行30分钟，然后利用Poroshell 300SB，5μm C8柱子(Agilent)，使用10-分钟的20-90％的在0.1％含水甲酸中的乙腈梯度，通过反相HPLC(RP-HPLC)进行解析。对于TOF MS，将毛细管和碎裂器电压(fragmentor voltage)分别设置至5500和200V。
使用iLite Human Interferon Alpha Cell-Based Assay试剂盒(PBLInterferon Source，Piscataway，NJ)测定IFNα2b的比活性。聚乙二醇干扰素α-2b(Schering Corp)用作阳性对照。
细胞结合和细胞凋亡使用Guava PCA和试剂、软件以及所建议的分别用于Guava Express和Guava Nexin的方案(Millipore，Billerica，MA)，通过流式细胞术评估细胞结合和细胞凋亡。对于结合测定，将活细胞在4℃下与稀释在1％BSA-PBS中的MAb或MAb-IFNα一起温育1小时。沉淀细胞，在于4℃下与2μg/mL缀合PE的小鼠-抗人IgG-Fc(Southern Biotech，Birmingham，AL)一起温育1小时之前，用1％BSA-PBS洗涤所述细胞。在3次洗涤后，通过流式细胞术测量结合。对于细胞凋亡测定，在定量膜联蛋白-V-阳性细胞％之前，将细胞(5×105/mL)与指定的MAb或MAb-IFNα在24孔板中一起温育48小时。
体外细胞毒性在浓度不断增加的指定试剂存在的情况下将细胞以预定的最佳初始密度(1-2.5×105个细胞/mL)接种在48孔板(300μL/孔)中，在37℃下进行温育，直至未处理的细胞的密度增加为10倍以上(4-7天)。使用CellTiter 96细胞增殖测定法(Promega，Madison，WI)确定测定结束时的相对活细胞密度。
从全血离体消耗Daudi在由新英格兰机构审查委员会(Wellesley，MA)批准的方案下收集血液样本。将Daudi(5×104)细胞与来自健康志愿者的肝素化全血(150L)混合，将其与1nM的MAb或MAb-IFNα在37℃和5％CO2下一起温育2天。细胞用FITC-抗-CD19、FITC-抗-CD14、APC-抗-CD3或APC-小鼠IgG1同种型对照MAb(BDBiosciences，San Jose，CA)进行染色，然后使用FACSCalibur(BDBiosciences)通过流式细胞术进行分析。Daudi细胞是CD19+并且处于单核细胞门控中。正常B和T细胞分别为CD19+和CD3+细胞，处于单核细胞门控中。单核细胞是处于单核细胞门控中的CD14+细胞。
结果
20-C2-2b的产生和鉴定通过将IgG-AD2模块、CH3-AD2-IgG-v-mab与两种不同的二聚DDD-模块CH1-DDD2-Fab-hL243和IFNα2b-DDD2组合产生双特异性MAb-IFNα。由于任一DDD-模块与两个AD2基团的随机结合，预期除了20-C2-2b外，还形成两种副产品20-C2-C2和20-2b-2b。
非还原SDS-PAGE(未显示)将20-C2-2b(～305kDa)解析为一簇位于20-C2-C2(～365kDa)与20-2b-2b(255kDa)的条带之间的条带。还原SDS-PAGE解析出包含20-C2-2b的5种多肽(v-mab HC-AD2、hL243Fd-DDD2、IFNα2b-DDD2和共迁移v-mab和hL243κ轻链)(未显示)。IFNα2b-DDD2和hL243Fd-DDD2不存在于20-C2-C2和20-2b-2b中。MAbSelect结合在DNL反应中产生的所有3种主要种类，但除去了任何过量的IFNα2b-DDD2和CH1-DDD2-Fab-hL243。His-Select未结合级分主要包含20-C2-C2(未显示)。来自WT亲和层析的未结合级分包含20-2b-2b(未显示)。将每一种样品经历SE-HPLC和免疫反应性分析，这修正SDS-PAGE分析的结果和结论。
在还原20-C2-2b后，通过RP-HPLC解析其5种组成多肽，每一个峰产生单个ESI-TOF重叠合质谱图(deconvoluted mass spectra)(未显示)。天然的而非细菌表达的重组IFNα2在Thr-106上被O-糖基化(Adolf等人，Biochem J 1991；276(Pt 2)：511-8)。我们确定约15％的包含IFNα2b-DDD2模块的多肽被O-糖基化，并且可通过RP-HPLC和SDS-PAGE由非糖基化多肽解析(未显示)。对20-C2-2b的LC/MS分析分别以15ppm和2ppm的质量精确度鉴定了IFNα2b-DDD2的O-糖基化和非糖基化种类(未显示)。观察到的O-糖基化形式的质量显示O-连接的聚糖具有结构NeuGc-NeuGc-Gal-GalNAc，对于20-2b-2b(＜1ppm)也预测到这一点(未显示)。LC/MS将v-mab和hL243κ链以及hL243-Fd-DDD2(未显示)鉴定为单一未修饰的种类，所观察的质量匹配经计算的质量(＜35ppm)。v-mab HC-AD2的两种主要糖形式被鉴定为具有53，714.73(70％)和53,877.33(30％)的质量，分别表示G0F和G1F N-聚糖，所述聚糖通常与IgG结合(未显示)。分析还确认HC-AD2的氨基端被修饰为焦谷氨酸，如对于具有氨基末端谷氨酰胺的多肽所预测的。
对20-C2-2b的SE-HPLC分析解析出与其经计算的质量一致的且在更大的20-C2-C2(6.6分钟)与更小的20-2b-2b(6.85分钟)的质量之间的保留时间(6.7分钟)的主要蛋白峰，以及某些可能代表经IFNα2b的自我缔合形成的非共价二聚体更高的分子量峰(未显示)。
免疫反应性测定显示20-C2-2b(每一个分子包含3种功能性基团)的均质性(未显示)。20-C2-2b与过量的针对三种组成分子的任一种的抗体的温育导致高分子量免疫复合物的定量形成和20-C2-2b峰的消失。His-Select和WT亲和未结合级分分别未与WT和抗-IFNα免疫反应(未显示)。
细胞结合MAb-IFNα显示与它们的亲代MAb相似的结合亲合力(图8A)。在亚饱和浓度上，对于20-C2-2b和hL243γ4p观察到相似的结合水平。HLA-DR的抗原密度为这些细胞中的CD20的约6倍，从而允许与20-2b-2b相比较更多的20-C2-2b的结合。使用单位点结合非线性回归模型分析的结合曲线证明20-C2-2b可获得与20-2b-2b相比较为4倍的Bmax，在它们的结合亲和力之间未观察到显著差异(Kd约4nM)(图8B)。
IFNα的生物活性使用基于细胞的报告基因测定法测量多种MAb-IFNα的比活性，将其与聚乙二醇干扰素α-2b相比较(图8C)。不出所料，具有两个IFNα2b基团的20-C2-2b的比活性(2454IU/pmol)显著低于20-2b-2b(4447IU/pmol)或734-2b-2b(3764IU/pmol)的比活性，然后仍然高于聚乙二醇干扰素α-2b(P＜0.001)。20-2b-2b与734-2b-2b之间的差异不显著。当针对总IFNα的IU/pmol标准化时，所有试剂之间的比活性变化最小。基于这些数据，MAb-IFNα的各IFNα2b基团的比活性为重组IFNα2b(～4000IU/pmol)的约30％。
体外细胞毒性：NHL使用B细胞NHL的体外细胞毒性的结果概述于表3中。已报导了各细胞系的HLA-DR和CD20的相对抗原密度(Stein等人，Blood 2010，即将出版)。靶向指数(targeting index)(TI)表示与非靶向MAb-IFNα(734-2b-2b)相比较靶向MAb-IFNα的效力的倍数增加，将EC50值转化为总IFNα浓度(I-EC50)。Daudi对IFNα2引起的细胞杀伤非常敏感，如利用非靶向MAb-IFNα、734-2b-2b(I-EC50＝14pM)证明的。用单特异性20-2b-2b(I-EC50＝0.4pM)靶向Daudi上的CD20进一步使效力增强至25倍(TI＝25)，与先前的结果(Rossi等人，Blood 2009；114：3864-71)相符。双特异性20-C2-2b(I-EC50＝0.08pM；TI＝125)的效力增强至20-2b-2b的5倍，这可归因于HLA-DR的增加的抗原密度和可能地其高亲合力四价肿瘤结合。hL243-诱导的信号传导不太可能在这些低浓度上引起额外的细胞毒性。v-mab、hL243γ4p和734-2b-2b(v-mab+hL243+734-2b)的混合物等同于单独的734-2b-2b，这支持结论：hL243-诱导的信号传导不引起20-C2-2b的高TI。
只用1pM的任何MAb-IFNα而不用10pM的v-mab或hL243γ4p诱导Daudi的细胞凋亡(图9A)。利用20-2b-2b或20-C2-2b的处理产生比734-2b-2b或v-mab+hL243+734-2b更显著的细胞凋亡细胞(P＜0.0005)。在734-2b-2b与所述混合物之间未观察到显著差异。
734-2b-2b对Raji(I-EC50＝32nM)和Ramos(I-EC50＞80nM)影响不太大，分别产生仅62％和35％的最大抑制(Imax)。在这些条件下，hL243γ4p而非v-mab(未显示)抑制这些伯基特淋巴瘤品系。对于Raji，观察到的20-C2-2b(TI＝118)的效力的增强为20-2b-2b(TI＝2)的50多倍，所述Raji的HLA-DR抗原密度比CD20密度大得多。与Daudi和Raji不同，Ramos上的HLA-DR和CD-20的密度相似，然而20-C2-2b的TI为20-2b-2b的15倍，表明hL243和IFNα2b的累积活性。
对于Raji和Ramos，v-mab+hL234+734-2b混合物比任何一种单独的单一试剂更有效力。靶向IFNα2b对于获得最大效力是至关重要的。在3种伯基特淋巴瘤品系的每一种品系中，20-C2-2b比v-mab+hL234+734-2b更有效，所述v-mab+hL234+734-2b包含相同数目的抗-CD20和抗-HLA-DR Fab以及两倍量(和活性)的IFNα2b。
外套细胞淋巴瘤Jeko-1对hL243γ4p的反应相当强(EC50＝0.4nM)，但对IFNα2b不太敏感(对于734-2b-2b，效应最低)。包含hL243的任何处理优于20-2b-2b(EC50＝1nM)。20-C2-2b与hL243γ4p或v-mab+hL243+734-2b相比较显示增强至2倍的效力。在0.5nM上，hL243γ4p和734-2b-2b诱导相似水平的细胞凋亡并且它们的效应明显是累积的，因为利用v-mab+hL243+734-2b的处理导致与任一单独的试剂相比较约2倍数量的膜联蛋白-V-阳性细胞(图9A)。可假定，v-mab在混合物几乎无贡献，因为其单独地只具有微弱的效应。20-C2-2b和混合物因hL243的作用而优于20-2b-2b(P＜0.002)。
体外细胞毒性：骨髓瘤虽然8个MM细胞系在HLA-DR水平(并且只有KMS12-BM表达CD20)上和对IFNα2b的敏感性不同(FIG.10)，但全都对20-C2-2b起反应。所测试的8个MM细胞系的每一个的剂量-反应曲线示于图11中，并且结果概述于表3中。例如，5种对IFNα2呈高度反应(对于734-2b-2b，I-EC50＜1nM)，但HLA-DR抗原密度不同。当然，只有具有高HLA-DR密度的CAG被hL243γ4p抑制(＞1nM)，并且在更高的浓度上显示增强的(增加的)对hL243γ4p和734-2b-2b的混合物(hL243+734-2b)的反应。20-C2-2b(I-EC50＝10pM)对于CAG显示显著增强的效力(TI＝55)。
在用1nM而非用0.1或0.01nM的hL243γ4p、20-2b-2b、734-2b-2b或hL243+734-2b处理后，CAG的细胞凋亡很明显(图9B)。甚至0.01nM的20-C2-2b诱导细胞凋亡，并且对于0.1nM 20-C2-2b观察到水平与由10倍(1nM)浓度的任何其他处理产生的水平相等或比之更高。
20-C2-2b的增强的效力是显著的，但对于OPM6(TI＝2)、U266(TI＝7)和MM.1R(TI＝10)(各自为高度-IFNα-反应性的但具有更低的HLA-DR密度并且不被hL243γ4p抑制)效力更低。未观察到20-C2-2b对NCI-H929(其为高度IFNα-反应性的但为HLA-DR)的增强的效力。
KMS12-BM具有高HLA-DR和CD20抗原密度，并且令人惊讶地，被20-2b-2b(I-EC50＝31nM)而非734-2b-2b(I-EC50＞100nM)或v-mab抑制。KMS12-BM对v-mab+hL243+734-2b(EC50＝3nM)的反应与对hL243+734-2b(EC50＝0.7nM)的反应相比较更强，从而优于单独的hL243γ4p(EC50＝3.5nM)。这些处理的每一个处理导致细胞凋亡的强诱导，相对水平与体外细胞毒性结果相符(图9C)。此外，v-mab+hL243与单独的hL243γ4p相比较诱导更多的细胞凋亡，但与v-mab+hL243+734-2b相比较诱导更少的细胞凋亡。这些结果表明对于HLA-DR+/CD20+MM细胞，20-C2-2b(EC50＝0.1nM)的所有3种组分的活性当组合时可引起细胞毒性，即使它们中的两个当单独使用时实际上没有效应。
在KMS12-BM中评估两个额外的DNL构建体帮助阐明20-C2-2b的增强的效力。包含hL243IgG1和四聚IFNα2b(为20-C2-2b的IFNα2b的两倍)的MAb-IFNα(命名为C2-2b-2b)显示与20-C2-2b相比较不太强的细胞毒性(EC50＝0.4nM)和微弱的细胞凋亡诱导，从而支持v-mab的贡献。进一步揭示的是发现：20-C2-C2(包含v-mab和4个HLA-DRFab)的双特异性MAb与hL243γ4p相比较显示高水平的细胞凋亡诱导和增强至50多倍的效力(EC50＝0.06nM)，表明存在的HLA-DR和CD20与20-C2-2b交联可能通过独特的信号传导级联有效地诱导细胞毒性。虽然每一种构建体是有力的(EC50＜0.5nM)，但20-C2-C2(Imax＝67％)和C2-2b-2b(Imax＝70％)不如20-C2-2b(Imax＝99％)一样有效地杀伤KMS12-BM，从而支持为了获得最大效应需要所有三种组分。v-mab+hL243+734-2b(Imax＝87％)混合物为仅有的导致超过70％的杀伤的处理支持该假说。
综合起来，这些数据证明抗原密度和对IFNα2b的作用以及靶向MAb的作用的敏感性都是特定细胞系对不同MAb-IFNα的体外反应的重要决定因素。然而，体外肿瘤杀伤可通过ADCC和免疫效应细胞的作用来增强，所述效应细胞可被局部高浓度的IFNα2b刺激。
在人血清中的效应子功能和稳定性我们先前已报导20-2b-2b与其亲代v-mab相比较显示增强的ADCC(Rossi等人，Blood2009；114：3864-71)。通过设计，hL243γ4p具有减弱的ADCC(Stein等人，Blood 2006；108：2736-44)。然而，20-C2-C2与v-mab相比较诱导显著(P＝0.0091)更强的ADCC(未显示)。值得注意地，20-C2-2b与20-2b-2b(P＝0.0040)或20-C2-C2(P＝0.0115)相比较诱导显著更强的ADCC，表明IFNα2b的存在增强效应子功能。如先前对于20-2b-2b所证明的一样(Rossi等人，Blood 2009；114：3864-71)，20-C2-2b在体外不诱导CDC(未显示)。
用于测定20-C2-2b在人血清中的稳定性的两种不同的测定法给出非常相似的结果，显示约3.5％/天的损失，在37℃下进行11天后剩下约65％(未显示)。
从人全血离体消耗NHL如图12中所显示的，与20-2b-2b(69％)、v-mab(49％消耗)、hL243γ4p(46％)或734-2b-2b(10％)相比较，20-C2-2b(91％)更有效地从全血(离体)消耗Daudi细胞。两种靶向MAb-IFNα对正常B细胞的毒性比对Daudi的毒性更小。在这些条件下，B细胞被20-C2-2b(57％)和hL243γ4p(41％)大量排除，但不被v-mab、734-2b或20-2b-2b排除。单核细胞被hL243γ4p(48％)、734-2b-2b(30％)和20-2b-2b(21％)排除，但不被v-mab排除。20-C2-2b(98％)对单核细胞具有高毒性。没有一种试剂对T细胞具有显著作用。利用学生氏t检验确定每一个上文中指定的消耗％的差异的统计显著性(P＜0.001)。
讨论
我们和其它研究人员已报导包含CD20-靶向MAb和IFNα的融合蛋白在异种移植和同基因型小鼠模型中与MAb和IFNα的组合相比较更有效地抗NHL，这表明MAb-IFNα可克服与IFNα相关的毒性和Pk限制(Rossi等人，Blood 2009；114：3864-71；Xuan等人，Blood2010；115：2864-71)。虽然CD20是B细胞淋巴瘤的靶向MAb-IFNα疗法的吸引人的候选者，但其表达主要限定于该谱系的恶性肿瘤，某些个体显示低抗原密度。此处，我们报导了将IFNα2b特异性靶向CD20和HLA-DR的第一双特异性免疫细胞因子20-C2-2b，从而潜在地扩展了适于该免疫细胞因子疗法的血液肿瘤种类。
抗-HLA-DR MAb高效地诱导细胞凋亡(所述凋亡由直接的信号传导介导而无需额外的交联)并且也是ADCC和CDC的有效诱导物(Stein等人，Blood 2006；108：2736-44；Rech等人，Leuk Lymphoma2006；47：2147-54)。在ADCC可增强治疗潜能的情况下，CDC主要负责与MAb输注相关的副作用的发病机制(van der Kolk等人，Br JHaematol 2001；15：807-11)。通过使用人IgG4同种型的恒定区对在本研究中用作对照的人源化抗-HLA-DR MAb(hL243γ4p)进行基因工程改造(以提高临床安全性)，从而导致减小的ADCC和CDC。20-C2-2b在抗-HLA-DR MAb中是独特的，因为其与hL243γ4p相似，不存在CDC，但具有有力的(增强的)ADCC，这使得该试剂成为免疫疗法的具有吸引力的候选者。
在离体环境中，v-mab可以通过信号传导诱导的细胞凋亡、ADCC和CDC消耗细胞。MAb-IFNα可利用增强的ADCC以及MAb-和IFNα2b-诱导的信号传导，但不能利用CDC；并且hL243-γ4p仅限于直接信号传导(Stein等人，Blood 2006；108：2736-44)。虽然未能在该环境中获得可能在体内发生的天然免疫和适应性免疫的IFNα-介导的激活的全谱，但其提供了药代动力学数据。20-C2-2b消耗的淋巴瘤细胞比对正常B细胞的消耗效率更高，并且对T细胞无作用。然而，其确实有效率地消除单核细胞。在v-mab对单核细胞无作用的情况下，在利用hL243α4p和MAb-IFNα处理后观察到消耗，20-2b-2b与734-2b-2b显示相似的细胞毒性。因此，20-C2-2b的可预测的更高效力归因于抗-HLA-DR和IFNα的组合作用，该作用可被HLA-DR靶向增强。这些数据表明单核细胞消耗可以是与抗-HLA-DR以及IFNα疗法相关的药代动力学效应；然而，该副作用可能是短暂的，因为单核细胞群体应当从造血干细胞重新住入。
我们研究的4个NHL和8个MM细胞系包括HLA-DR和CD20的表达和抗原密度以及对IFNα、hL243和v-mab的作用的反应的天然存在的异质性，其全都影响MAb-IFNα免疫疗法。6个和8个细胞系(12个细胞系中的)分别被hL243γ4p和734-2b-2b不同程度地抑制(Imax＞30％)。20-C2-2b有力地抑制(EC50＜1nM)12个细胞系中的11个细胞系，对于5个细胞系具有EC50≤0.01nM。即使不被734-2b-2b抑制的受影响最小的MM品系(KMS11)也对20-C2-2b有反应(EC50＝17nM)。
除了为HLA-DR-/CD20-的NCI-H929外，在所有细胞系中观察到20-C2-2b相对于734-2b-2b的效力的增强。更高水平的HLA-DR抗原密度以及对hL243的反应与更大的20-C2-2b的TI相关，这证明了IFNα和hL243的累积活性以及靶向的重要性，即使在体外。20-C2-2b在10个品系中优于v-mab+hL243+734-2b的混合物，进-步突出了肿瘤靶向的影响，该影响在体内要大得多，如先前对于20-2b-2b所证明的(Rossi等人，Blood 2009；114：3864-71)。此外，体内靶向MAb-IFNα可能引发有效力的抗-肿瘤免疫反应。
虽然绝大部分包含细胞的原发性MM样本是非克隆性的并且具有血浆细胞表型(CD138+/CD19-/CD20-)，但假定的MM癌症干细胞为CD138-并且表达B细胞表面抗原，包括暗示为记忆B细胞的CD45、CD19、CD20和CD22(Matsui等人，Blood 2004；103：2332-6)。虽然多种临床方法已产生反应，但MM仍然因被认为由癌症干细胞介导的复发而大体上是不能治愈的，所述MM对各种疗法有抗性。假定的干细胞的B细胞表型促进了在MM中进行的利妥昔单抗的临床研究。然而，实现对结果的有限影响(Treon等人，J Immunother2002；25：72-81)。
关于KMS12-BM的体外结果是急需的，因为其与提及的MM干细胞相似，为CD20+。20-C2-2b显示有力的细胞毒性和强劲诱导的KMS12-BM的细胞凋亡。即使非靶向MAb-IFNα和v-mab作为单一试剂是无效的，但当与hL243组合使用时，它们都明显地引起细胞毒性。所述结果也表明CD20和HLA-DR的双特异性结合可诱导进一步增强对这些细胞的细胞毒性以及可使它们对IFNα敏感的额外的(有力的)信号。
由DNL产生的MAb-IFNα显示与重组IFNα相当的活性。最近，Xuan等人报导了由常规重组基因工程制备的抗-CD20-IFNα融合蛋白显示减小至1/300的IFNα活性(Xuan等人，Blood 2010；115：2864-71)。这在相似的Daudi异种移植研究的比较中是值得注意的，其中单次17ng剂量的20-2b-2b与用于重组抗-CD20-hIFNα的3次30μg的剂量(5000多倍)(Xuan等人，Blood 2010；115：2864-71)相比较显著提高存活率(Rossi等人，Blood 2009；114：3864-71)。使用分泌IFNα的肿瘤的研究显示了由局部浓集的IFNα引发的增强的免疫反应(Ferrantini等人，Biochimie 2007；89：884-93)。在这也可能利用高活性MAb-IFNα获得的情况下，常规重组MAb-IFNα的减小的活性可能不能有效地招募和刺激抗-肿瘤免疫反应，如由Xuan等人所报导的(Blood2010；115：2864-71)。
双特异性MAb-IFNα20-C2-2b在治疗NHL方面是吸引人的，因为3个成分的每一个成分活跃地抗该疾病。本研究显示20-C2-2b对于MM和其它造血恶性肿瘤的治疗也是有用的。
本领域技术人员将会了解，可将此处描述的用以产生和使用双特异性免疫因子或其它DNL构建体(包含3种不同效应物部分)的方法与可被整合入DNL构建体的抗体、抗体片段、细胞因子或其它效应物的任何组合一起使用。
***
可根据本公开内容制备和使用本文中公开的和要求保护的所有组合物和方法而无需过度实验。虽然已通过优选的实施方案描述了组合物和方法，但对于本领域技术人员很显然的是可对组合物和方法或在本文中描述的方法的顺序或步骤进行改变而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地，在化学和生理学上都相关的某些试剂可用于替代本文中描述的试剂而可获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员很显然的是所有此类相似的替代和修饰被认为在如由所附权利要求所确定的本发明的精神、范围和概念内。

Claims (25)

1.一种包含3种不同效应物部分的DNL(停靠和加锁)构建体，其中所述效应物部分被连接至两个来自蛋白激酶A(PKA)的DDD(二聚化和停靠结构域)部分和一个来自AKAP蛋白的AD(锚定结构域)部分，以及其中所述两个DDD部分形成二聚体并且与AD部分结合以形成DNL构建体。
2.权利要求1所述的DNL构建体，其中所述DDD部分具有来自人RIα、RIβ、RIIα或RIIβPKA的氨基酸序列。
3.权利要求1所述的DNL构建体，其中所述效应物部分包含第一抗体或抗体片段、第二抗体或抗体片段以及一个或多个拷贝的细胞因子。
4.权利要求3所述的DNL构建体，其中所述第一抗体或抗体片段和第二抗体或抗体片段结合两种不同的抗原。
5.权利要求4所述的DNL构建体，其中所述第一和第二抗体或抗体片段结合抗原，所述抗原选自碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤连蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。
6.权利要求5所述的DNL构建体，其中所述第一和第二抗体或抗体片段选自hR1(抗-IGF-1R)、hPAM4(抗-粘蛋白)、hA20(抗-CD20)、hA19(抗-CD19)、hIMMU31(抗-AFP)、hLL1(抗-CD74)、hLL2(抗-CD22)、hMu-9(抗-CSAp)、hL243(抗-HLA-DR)、hMN-14(抗-CEACAM5)、hMN-15(抗-CEACAM6)、hRS7(抗-EGP-1)和hMN-3(抗-CEACAM6)。
7.权利要求4所述的DNL构建体，其中所述细胞因子选自人MIF(巨噬细胞游走抑制因子)、HMGB-1(高迁移率族框蛋白1)、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-23、IL-24、CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1、RANTES、MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-1、IP-10、Gro-β、嗜酸细胞活化趋化因子、干扰素-α、-β、-λ、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配体、红细胞生成素、血小板生成素、CNTF、瘦素、制癌蛋白M、VEGF、EGF、FGF、PlGF、胰岛素、hGH、降钙素、因子VIII、IGF、促生长素抑制素、组织型纤溶酶原激活物和LIF。
8.权利要求4所述的DNL构建体，其中所述第一抗体或抗体片段是veltuzumab，所述第二抗体或抗体片段是hL243，并且所述细胞因子是人干扰素-α2b。
9.权利要求8所述的DNL构建体，其中所述hL243抗体或抗体片段包含重链CDR序列CDR1(NYGMN，SEQ ID NO：1)、CDR2(WINTYTREPTYADDFKG，SEQ ID NO：2)和CDR3(DITAVVPTGFDY，SEQ ID NO：3)以及轻链CDR序列CDR1(RASENIYSNLA，SEQ ID NO：4)、CDR2(AASNLAD，SEQ IDNO：5)和CDR3(QHFWTTPWA，SEQ ID NO：6)。
10.权利要求1所述的DNL构建体，其中所述3种效应物部分是融合蛋白，每一种融合蛋白包含AD或DDD部分。
11.权利要求1所述的DNL构建体，其中所述效应物部分选自蛋白质、肽、抗体、抗原结合抗体、免疫调节剂、细胞因子、激素、酶、反义寡核苷酸、siRNA、毒素、核糖核酸酶、异源抗原、聚乙二醇(PEG)、抗-血管生成剂、细胞毒素剂和促细胞凋亡剂。
12.权利要求1所述的DNL构建体，其中所述DDD部分具有SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18的氨基酸序列、SEQ ID NO：20的前44个氨基酸、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22或SEQ ID NO：59的前44个氨基酸。
13.权利要求1所述的DNL构建体，其中所述AD部分具有SEQID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ IDNO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ IDNO：48、M SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ IDNO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ IDNO：56、SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：58的氨基酸序列。
14.一种给受试者施用细胞因子的方法，包括给受试者施用根据权利要求4的DNL复合物。
15.权利要求14所述的方法，其中所述第一和第二抗体或抗体片段结合抗原，所述抗原选自碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤连蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。
16.权利要求15所述的方法，其中所述第一和第二抗体或抗体片段选自hR1(抗-IGF-1R)hPAM4(抗-粘蛋白)、hA20(抗-CD20)、hA19(抗-CD19)、hIMMU31(抗-AFP)、hLL1(抗-CD74)、hLL2(抗-CD22)、hMu-9(抗-CSAp)、hL243(抗-HLA-DR)、hMN-14(抗-CEA)、hMN-15(抗-CEA)、hRS7(抗-EGP-1)和hMN-3(抗-CEA)。
17.权利要求14所述的方法，其中所述细胞因子选自人MIF(巨噬细胞游走抑制因子)、HMGB-1(高迁移率族框蛋白1)、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-23、IL-24、CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1、RANTES、MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-1、IP-10、Gro-β、嗜酸细胞活化趋化因子、干扰素-α、-β、-λ、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配体、红细胞生成素、血小板生成素、CNTF、瘦素、制癌蛋白M、VEGF、EGF、FGF、PlGF、胰岛素、hGH、降钙素、因子VIII、IGF、促生长素抑制素、组织型纤溶酶原激活物和LIF。
18.权利要求14所述的方法，其中所述第一抗体或抗体片段是veltuzumab，所述第二抗体或抗体片段是hL243，并且所述细胞因子是人干扰素-α2b。
19.一种治疗选自癌症、免疫功能失调和自身免疫性疾病的疾病的方法，包括给患有所述疾病的受试者施用根据权利要求1的DNL构建体。
20.权利要求19所述的方法，其中所述癌症选自非何杰金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞白血病、急性淋巴样白血病、慢性淋巴样白血病、伯基特淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤、多毛细胞白血病、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、癌、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤、皮肤癌、口腔癌、胃肠道癌、肺道癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、子宫内膜癌症、宫颈癌、膀胱癌、胰腺癌、骨癌、肝癌、胆囊癌、肾癌和睾丸癌。
21.权利要求19所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、链球菌感染后的肾炎、结节性红斑、高安(氏)动脉炎、艾迪生病、类风湿性关节炎、多发性硬化、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、关节强硬性脊椎炎、古德帕斯丘综合征、血栓闭塞性脉管炎、斯耶格伦综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常性天疱疮、韦格纳氏肉芽肿、膜性肾病、肌萎缩侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、银屑病或纤维性肺泡炎。
22.权利要求19所述的方法，其中所述第一和第二抗体或抗体片段结合抗原，所述抗原选自碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤连蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。
23.权利要求19所述的方法，其中所述第一和第二抗体或抗体片段选自hR1(抗-IGF-1R)hPAM4(抗-粘蛋白)、hA20(抗-CD20)、hA19(抗-CD19)、hIMMU31(抗-AFP)、hLL1(抗-CD74)、hLL2(抗-CD22)、hMu-9(抗-CSAp)、hL243(抗-HLA-DR)、hMN-14(抗-CEA)、hMN-15(抗-CEA)、hRS7(抗-EGP-1)和hMN-3(抗-CEA)。
24.权利要求19所述的方法，其中所述细胞因子选自人MIF(巨噬细胞游走抑制因子)、HMGB-1(高迁移率族框蛋白1)、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-23、IL-24、CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1、RANTES、MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-1、IP-10、Gro-β、嗜酸细胞活化趋化因子、干扰素-α、-β、-λ、G-CSF、GM-CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt-3配体、红细胞生成素、血小板生成素、CNTF、瘦素、制癌蛋白M、VEGF、EGF、FGF、PlGF、胰岛素、hGH、降钙素、因子VIII、IGF、促生长素抑制素、组织型纤溶酶原激活物和LIF。
25.权利要求19所述的方法，其中第一抗体或抗体片段是veltuzumab，所述第二抗体或抗体片段是hL243，并且所述细胞因子是人干扰素-α2b。
CN2010800385485A 2009-08-31 2010-08-27 双特异性免疫细胞因子停靠-和-加锁(dnl)复合物及其治疗性用途 Pending CN102481348A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510830780.7A CN105566498A (zh) 2009-08-31 2010-08-27 双特异性免疫细胞因子停靠-和-加锁(dnl)复合物及其治疗性用途

Applications Claiming Priority (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23842409P 2009-08-31 2009-08-31
US61/238,424 2009-08-31
US12/644,146 US7981398B2 (en) 2005-04-06 2009-12-22 PEGylation by the dock and lock (DNL) technique
US12/644,146 2009-12-22
US12/731,781 2010-03-25
US12/731,781 US8003111B2 (en) 2005-04-06 2010-03-25 Dimeric alpha interferon pegylated site-specifically shows enhanced and prolonged efficacy in vivo
US12/752,649 US8034352B2 (en) 2005-04-06 2010-04-01 Tetrameric cytokines with improved biological activity
US12/752,649 2010-04-01
US12/754,140 US8722047B2 (en) 2005-03-03 2010-04-05 Humanized anti-HLA-DR antibodies
US12/754,140 2010-04-05
US12/754,740 US8562988B2 (en) 2005-10-19 2010-04-06 Strategies for improved cancer vaccines
US12/754,740 2010-04-06
PCT/US2010/046889 WO2011025904A1 (en) 2009-08-31 2010-08-27 Bispecific immunocytokine dock-and-lock (dnl) complexes and therapeutic use thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510830780.7A Division CN105566498A (zh) 2009-08-31 2010-08-27 双特异性免疫细胞因子停靠-和-加锁(dnl)复合物及其治疗性用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102481348A true CN102481348A (zh) 2012-05-30

Family

ID=43628394

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800385485A Pending CN102481348A (zh) 2009-08-31 2010-08-27 双特异性免疫细胞因子停靠-和-加锁(dnl)复合物及其治疗性用途

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP2473186A4 (zh)
JP (2) JP5740772B2 (zh)
CN (1) CN102481348A (zh)
AU (1) AU2010286642B2 (zh)
CA (1) CA2772572A1 (zh)
IN (1) IN2012DN01331A (zh)
WO (1) WO2011025904A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105073128A (zh) * 2013-04-03 2015-11-18 Ibc药品公司 用于诱导对疾病的免疫应答的组合疗法
CN108699121A (zh) * 2015-12-23 2018-10-23 格林诺瓦森生物技术股份有限公司 用于抑制补体激活的多肽
CN109071663A (zh) * 2016-02-05 2018-12-21 奥里尼斯生物科学公司 双特异性信号传导剂及其用途
CN109513003A (zh) * 2012-08-14 2019-03-26 Ibc药品公司 用于治疗疾病的t-细胞重定向双特异性抗体

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9481878B2 (en) 2004-02-13 2016-11-01 Immunomedics, Inc. Compositions and methods of use of immunotoxins comprising ranpirnase (Rap) show potent cytotoxic activity
CN102596235A (zh) * 2009-08-31 2012-07-18 免疫医疗公司 显示有效细胞毒活性的包含豹蛙酶(rap)的免疫毒素的组合物和使用方法
CA2794499A1 (en) * 2010-04-01 2011-10-06 Immumomedics, Inc. Antibody-based depletion of antigen-presenting cells and dendritic cells
CA2861335A1 (en) * 2012-01-26 2013-08-01 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Targeting interferon-lambda with antibodies potently enhances anti-tumor and anti-viral activities
EP2870475B1 (en) * 2012-07-06 2017-06-07 Innovative Technologies in Biological Systems S.L. Fluorescent fusion polypeptide, biosensor comprising said polypeptide and uses thereof
US9682143B2 (en) 2012-08-14 2017-06-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
US20150231241A1 (en) 2012-08-14 2015-08-20 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for inducing immune response to disease
US9382329B2 (en) 2012-08-14 2016-07-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
WO2015138638A1 (en) 2014-03-11 2015-09-17 Theraly Pharmaceuticals, Inc. Long acting trail receptor agonists for treatment of autoimmune diseases
GB201409558D0 (en) 2014-05-29 2014-07-16 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201412659D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
GB201601075D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies molecules
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
GB201521391D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521383D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl And Ucb Celltech Method
GB201521389D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Method
GB201521382D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201521393D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
EA038551B1 (ru) 2015-12-17 2021-09-14 Дзе Джонс Хопкинс Юниверсити Способ лечения или профилактики системного склероза
WO2017177148A1 (en) 2016-04-07 2017-10-12 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating pancreatitis and pain with death receptor agonists
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
JP2021527077A (ja) * 2018-06-13 2021-10-11 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 新規構造成分を含有するナノ粒子ワクチン
US11767353B2 (en) 2020-06-05 2023-09-26 Theraly Fibrosis, Inc. Trail compositions with reduced immunogenicity

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060210475A1 (en) * 2005-03-03 2006-09-21 Goldenberg David M Humanized L243 antibodies
US20060228357A1 (en) * 2005-04-06 2006-10-12 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
US20070086942A1 (en) * 2005-10-19 2007-04-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US20090202487A1 (en) * 2005-04-06 2009-08-13 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Modular Method to Prepare Tetrameric Cytokines with Improved Pharmacokinetics by the Dock-and-Lock (DNL) Technology

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7527787B2 (en) * 2005-10-19 2009-05-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
US7666400B2 (en) * 2005-04-06 2010-02-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. PEGylation by the dock and lock (DNL) technique
US6958214B2 (en) * 2000-07-10 2005-10-25 Sequenom, Inc. Polymorphic kinase anchor proteins and nucleic acids encoding the same
EP1501863A4 (en) * 2002-05-03 2007-01-24 Sequenom Inc KINASE ANCHOR PROTEIN, PEPTIDES AND RELATED METHODS THEREOF
CA2497254A1 (en) * 2002-09-06 2004-03-18 Forschungsverbund Berlin E. V. Akap18 delta, a novel splicing variant of a protein kinase a anchor protein and the use of the same
AU2006232310B9 (en) * 2005-04-06 2011-07-21 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Improved stably tethered structures of defined compositions with multiple functions or binding specificities
JP5231231B2 (ja) * 2005-10-19 2013-07-10 アイビーシー・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 複雑性が増大した生理活性アセンブリーを生成するための方法および組成物ならびに使用
KR101410521B1 (ko) * 2005-12-16 2014-06-20 아이비씨 파마슈티컬스, 인코퍼레이티드 다가 면역글로불린-계 생동성 어셈블리들
EP2016173A4 (en) * 2006-05-15 2010-06-09 Immunomedics Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING HUMAN IMMUNODEFECT VIRUS INFECTIONS WITH CONJUGATED ANTIBODIES OR ANTIBODY FRAGMENTS

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060210475A1 (en) * 2005-03-03 2006-09-21 Goldenberg David M Humanized L243 antibodies
US20060228357A1 (en) * 2005-04-06 2006-10-12 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
US20090202487A1 (en) * 2005-04-06 2009-08-13 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Modular Method to Prepare Tetrameric Cytokines with Improved Pharmacokinetics by the Dock-and-Lock (DNL) Technology
US20070086942A1 (en) * 2005-10-19 2007-04-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIEN-HSING CHANG ET.AL.: ""The dock and lock method：a novel platform technology for building multivalent，multifunctional structures of defined composition with retained bioactivity"", 《CLINICAL CANCER RESEARCH》, vol. 13, no. 18, 15 September 2007 (2007-09-15) *
DAVID M.GOLDENBERG: "Multifunctional antibodies by the Dock-and-Lock method for improved cancer imaging and therapy by pretargeting", 《THE JOURNAL OF NUCLEAR MEDICINE》, vol. 49, no. 1, 31 January 2008 (2008-01-31), pages 158 - 163, XP055028152, DOI: doi:10.2967/jnumed.107.046185 *
EDMUND A.ROSSI: "Stably tethered multifunctional structures of defined composition made by the dock and lock method for use in cancer targeting", 《PNAS》, vol. 103, no. 18, 2 May 2006 (2006-05-02), pages 6841 - 6846, XP008123542, DOI: doi:10.1073/PNAS.0600982103 *
PHUONG H.NGUYEN: "Monomer adds to preformed structured oligomers of Aβ-peptides by a two-stage dock–lock mechanism", 《PNAS》, vol. 104, no. 1, 2 January 2007 (2007-01-02), pages 111 - 116 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109513003A (zh) * 2012-08-14 2019-03-26 Ibc药品公司 用于治疗疾病的t-细胞重定向双特异性抗体
CN105073128A (zh) * 2013-04-03 2015-11-18 Ibc药品公司 用于诱导对疾病的免疫应答的组合疗法
CN107252485A (zh) * 2013-04-03 2017-10-17 Ibc药品公司 用于诱导对疾病的免疫应答的组合疗法
CN108699121A (zh) * 2015-12-23 2018-10-23 格林诺瓦森生物技术股份有限公司 用于抑制补体激活的多肽
US11591378B2 (en) 2015-12-23 2023-02-28 eleva GmbH Polypeptides for inhibiting complement activation
CN108699121B (zh) * 2015-12-23 2023-07-04 艾丽法有限责任公司 用于抑制补体激活的多肽
CN109071663A (zh) * 2016-02-05 2018-12-21 奥里尼斯生物科学公司 双特异性信号传导剂及其用途
CN109071663B (zh) * 2016-02-05 2023-07-04 奥里尼斯生物科学私人有限公司 双特异性信号传导剂及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP2473186A1 (en) 2012-07-11
AU2010286642B2 (en) 2016-03-10
JP2013503184A (ja) 2013-01-31
AU2010286642A1 (en) 2012-02-16
JP5740772B2 (ja) 2015-07-01
WO2011025904A1 (en) 2011-03-03
CA2772572A1 (en) 2011-03-03
JP5999217B2 (ja) 2016-09-28
IN2012DN01331A (zh) 2015-06-05
EP2473186A4 (en) 2013-07-10
JP2015157832A (ja) 2015-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5999217B2 (ja) 二重特異性免疫サイトカインドック−アンド−ロック（ｄｎｌ）複合体及びその治療的使用
US10385139B2 (en) Murine, chimeric, humanized or human anti-TNF-alpha antibodies
US9498542B2 (en) Tetrameric cytokines with improved biological activity
US9617531B2 (en) Modular method to prepare tetrameric cytokines with improved pharmacokinetics by the dock-and-lock
US20110020273A1 (en) Bispecific Immunocytokine Dock-and-Lock (DNL) Complexes and Therapeutic Use Thereof
CA2720748C (en) Modular method to prepare tetrameric cytokines with improved pharmacokinetics by the dock-and-lock (dnl) technology
CN102186499A (zh) 用于癌症治疗的对接和锁定(dnl)疫苗
JP6114936B2 (ja) 強力な細胞毒性活性を示すランピルナーゼ（ｒａｐ）を含む免疫毒素の組成物及び使用方法
CN102725000A (zh) 靶向胰岛素-样生长因子i型受体(igf-1r)的新型单特异性和双特异性人源化抗体
US9931413B2 (en) Tetrameric cytokines with improved biological activity
US9481878B2 (en) Compositions and methods of use of immunotoxins comprising ranpirnase (Rap) show potent cytotoxic activity
CN105566498A (zh) 双特异性免疫细胞因子停靠-和-加锁(dnl)复合物及其治疗性用途
AU2010286496B2 (en) Compositions and methods of use of immunotoxins comprising ranpirnase (Rap) show potent cytotoxic activity

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20120530