CN102725000A - 靶向胰岛素-样生长因子i型受体(igf-1r)的新型单特异性和双特异性人源化抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了抗-IGF-1R抗体或抗体片段的组合物和使用方法。优选抗体结合于IGF-1R但不结合于IR;不是IGF-1R的激动剂;不阻断IGF-1或IGF-2与分离的IGF-1R的结合;有效地中和IGF-1在完整细胞中对IGF-1R的激活;和阻断R1抗体与IGF-1R的结合。抗体可以是鼠、嵌合、人源化或人R1抗体,其包含重链CDR序列DYYMY(SEQ ID NO:1)、YITNYGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO:2)和QSNYDYDGWFAY(SEQ ID NO:3)和轻链CDR序列KASQEVGTAVA(SEQ ID NO:4)、WASTRHT(SEQ ID NO:5)和QQYSNYPLT(SEQ ID NO:6)。优选地抗体结合于IGF-1R表位,所述IGF-1R表位包含IGF-1R的半胱氨酸富集结构域的前半部分(残基151-222)。抗-IGF-1R抗体可用于诊断或治疗各种疾病例如癌症。
Description
发明领域
本申请要求2010年1月19日提交的PCT专利申请序列No.PCT/US10/21345的优先权,其通过引用整体并入本文。
序列表
本申请包括已通过EFS-Web提交的并且通过引用整体并入本文的序列表。2010年3月9日创建的所述ASCII拷贝命名为IMM316WO2.txt并且大小为19,152个字节。
发明背景
发明领域
本发明涉及结合于胰岛素-样生长因子I型受体(IGF-1R)但不结合于胰岛素受体(IR)的抗体和抗原结合抗体片段。在优选的实施方案中,抗-IGF-1R抗体不是IGF-1R的激动剂。在更优选的实施方案中,抗-IGF-1R抗体结合于IGF-1R表位,所述表位IGF-1R包含IGF-1R的半胱氨酸富集结构域的前半部分,在氨基酸残基151与222之间。在最优选的实施方案中,抗-IGF-1R抗体不阻断IGF-1或IGF-2与分离的IGF-1R的结合,但在完整细胞或组织中原位有效地中和IGF-1对IGF-1R的激活。在其它实施方案中,小鼠抗-IGF-1R抗体(称为R1)包含重链可变区互补决定区(CDR)序列CDR1(DYYMY,SEQ IDNO:1)、CDR2(YITNYGGSTYYPDTVKG,SEQ ID NO:2)和CDR3(QSNYDYDGWFAY,SEQ ID NO:3)和轻链可变区CDR序列CDR1(KASQEVGTAVA,SEQ ID NO:4)、CDR2(WASTRHT,SEQ IDNO:5)和CDR3(QQYSNYPLT,SEQ ID NO:6)。在更优选的实施方案中,抗-IGF-1R抗体是包含如上所述的CDR序列的人源化、嵌合或人R1抗体(称为hR1)。在最优选的实施方案中,抗-IGF-R1抗体是包含所述的CDR序列和人抗体恒定区和构架区(FR)序列的人源化抗体。
此类抗体和片段用于多种其中IGF-1R表达对于癌细胞转化、生长、存活、转移或抵抗其它治疗剂而言是重要的的癌症的检测和/或治疗,所述癌症包括但不限于维尔姆斯瘤、尤因肉瘤、成神经细胞瘤、神经内分泌系统瘤、黑素瘤、成胶质细胞瘤、皮肤癌、乳腺癌、头颈癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌和/或肺癌以及淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。抗-IGF-1R抗体和/或抗体片段可单独地或与以下结合用于组合物和治疗方法:其它细胞毒性剂例如癌症化疗剂、促细胞凋亡剂、放射性核素、EGFR抑制剂(例如厄洛替尼或抗-EGFR抗体)、抗-血管发生剂(例如,抗-VEGF和抗-PlGF肽或抗体)和/或其它IGF-1R抑制剂例如酪氨酸蛋白激酶抑制剂(tryphostin)(例如,AG1024、AG538)、吡咯并[2,3-d]-嘧啶衍生物(例如,NVP-AEW541)或其它抗-IGF-1R抗体或针对其它肿瘤相关抗原(TAA)的抗体。抗-IGF-1R抗体可以是裸抗体或可缀合于一种或多种治疗剂和/或诊断剂。抗体可以是鼠、嵌合、人源化或人抗-IGF-1R抗体。
其它实施方案可涉及多特异性抗体、双特异性抗体、抗体融合蛋白或其片段,包含至少一个抗-IGF-1R单克隆抗体(MAb)或其片段,在一些情况下与第二、不同的抗体或片段组合。抗体、片段或抗体融合蛋白可作为治疗性免疫缀合物单独地施用或可与一种或多种治疗剂、与其它裸抗体或其它免疫缀合物组合地施用。另外其它实施方案涉及编码抗-IGF-1R抗体或抗体融合蛋白的DNA序列、包含DNA序列的载体和宿主细胞,以及制备抗-IGF-1R抗体的方法。其它实施方案涉及通过并入抗-IGF-1R抗体、融合蛋白和/或其片段的停靠和锁定(DNL)技术制备的多价、多特异性和/或多功能构建体。
相关领域
胰岛素-样生长因子I型受体(IGF-1R)是一大类酪氨酸激酶受体的成员,其调节多种细胞内途径。IGF-1R结合IGF-1,一种在结构上与胰岛素类似的多肽激素(Laron,Mol Pathol.2001,54:311-16)。IGF-1受体与胰岛素受体(IR)同源,与IR共有约70%整体序列同源性(Riedemann和Macaulay,Endocrine-Related Cancer,2006,13:S33-43)。不令人惊讶的是,针对IGF-1R开发的抑制剂趋于显示与胰岛素受体的交叉反应性,说明此类化合物具有至少部分毒性特征(Miller和Yee,2005,Cancer Res.65:10123-27;Riedemann和Macaulay,2006)。
IGF系统在调节细胞增殖、分化、凋亡和转化方面起重要的作用(Jones等人,Endocrinology Rev.1995.16:3-34)。IGF系统包含两个受体,胰岛素样生长因子受体1(IGF-1R;CD221)和胰岛素样生长因子受体2(IGF-2R;CD222);两个配体,胰岛素样生长因子1(IGF-1)和IGF-2;以及数个IGF结合蛋白(IGFBP-1至IGFBP-6)。此外,一大组IGFBP蛋白酶(例如,半胱天冬酶、金属蛋白酶、前列腺特异性抗原)将IGF结合的IGFBP水解以释放游离IGF,游离IGF然后与IGF-1R和IGF-2R相互作用。
IGF-1R包含包含胞浆酪氨酸激酶结构域的两个细胞外α亚单元(130-135kD)和两个跨膜β-亚单元(95kD)。IGF-1R像胰岛素受体(IR)一样,与其它受体酪氨酸激酶家族成员的不同之处在于具有共价二聚(α2β2)结构。IGF-1R与IR在激酶结构域中包含84%序列同一性,同时膜和C末端区域分别共有61%和44%序列同一性(Ulrich等人,EMBO J.,1986,5:2503-12;Blakesley等人,Cytokine Growth FactorRev.,1996.7:153-56)。
IGF-1和IGF-2是IGF-1R的激活配体。IGF-1和IGF-2与α-链的结合诱导构象变化,这引起每个β-链在特定酪氨酸残基发生自磷酸化,将受体从非磷酸化失活状态转化成磷酸化活性状态。激酶结构域的激活环中3个酪氨酸残基(在1131、1135和1136的Tyr残基)的激活导致催化活性的增加,这触发底物例如IRS-1和Shc衔接蛋白的停靠和磷酸化。这些底物的激活导致参与存活信号级联的额外蛋白的磷酸化(PI3K、AKT、TOR、S6)和/或增殖(促分裂原活化蛋白激酶,p42/p44)(Pollak等人,Nature Reviews Cancer.2004.4:505-516;Baserga等人,Biochim Biophys Acta.1997.1332:F105-F126;Baserga等人,Int.J.Cancer.2003.107:873-77)。
IGF-1R在正常细胞和癌细胞两者中具有抗-细胞凋亡效应(Resnicoff等人,1995,Cancer Res.55:2463-69;Kang等人,Am JPhysiol Renal Physiol.,2003,285:F1013-24;Riedemann和Macaulay,2006)。已报道IGF-1R激活在抵抗多种细胞毒性剂例如化疗剂、放射性核素和EGFR抑制剂的发展方面是重要的(Jones等人,Endocr RelatCancer 2004,11:793-814;Warshamana-Greene等人,2005,Clin.CancerRes.11:1563-71;Riedemann和Macaulay,2006;Lloret等人,2007,Gynecol.Oncol.106:8-11)。IGF-1R在多种肿瘤系例如黑素瘤、成神经细胞瘤、结肠癌、前列腺癌、肾癌、乳腺癌和胰腺癌中过表达(Ellis等人,1998,Breast Cancer Treat.52:175-84;van Golen等人,2000,Cell Death Differ.7:654-65;Zhang等人,2001,Breast Cancer Res.2:170-75;Jones等人,2004;Riedemann和Macaulay,2006)。功能IGF-1R对于转化是必需的并且促进癌细胞生长、存活和转移(Riedemann和Macaulay,2006)。
已尝试开发用作抗癌剂的IGF-1R抑制剂,例如酪氨酸磷酸化抑制剂、吡咯并[2,3-d]-嘧啶衍生物、去甲二氢愈创木酸类似物、二芳基脲、AG538、AG1024、NVP-AEW541、NVP-ADW742、BMS-5326924、BMS-554417、OSI-906、INSM-18、藤黄菌素、辛伐他汀、水飞蓟素、红茶多酚、鬼臼苦、抗-IGF-1R抗体和siRNA抑制剂(Arteaga等人,1998,J Clin Invest.84:1418-23;Warshamana-Greene等人,2005;Klein和Fischer,2002,Carcinogenesis 23:217-21;Blum等人,2000,Biochemistry 39:15705-12;Garcia-Echeverria等人,2004,Cancer Cell5:231-39;Garber,2005,JNCI 97:790-92;Bell等人,2005,Biochemistry44:930-40;Wu等人,2005,Clin Cancer Res 11:3065-74;Wang等人,2005,Mol CancerTher 4:1214-21;Singh和Agarwal,2006,Mol Carinog.45:436-42;Gable等人,2006,Mol CancerTher 5:1079-86;Niu等人,Cell Biol Int.,2007,31:156-64;Blecha等人,2007,Biorg Med ChemLett.17:4026-29;Qian等人,2007,Acta Biochim Biophys Sin,39:137-47;Fang等人,2007,Carcinogenesis 28:713-23;Cohen等人,2005,Clin Cancer Res 11:2063-73;Sekine等人,Biochem Biophys ResCommun.,2008,25:356-61;Haluska等人,2008,J Clin Oncol.26:May20 suppl;abstr 14510;美国专利申请公布No.2006-233810,每篇文献的实施例部分通过引用并入本文)。通常,这些试剂已趋于在更大或更小的程度上与IGF-1R和IR两者交叉反应和/或趋于用作IGF-1R激动剂。此类试剂用于癌症治疗的用途由于其毒性而已经受到限制(Riedemann和Macaulay,2006)。在本领域中存在对这样的抗-IGF-1R抗体的需要:(i)不与胰岛素受体发生交叉反应,(ii)展示出较低的毒性特征,(iii)中和IGF-1和IGF-2对表达IGF-1R的细胞的效应;(iv)优选不用作IGF-1R激动剂;和(v)可以不与IGF-1或IGF-2竞争结合于分离的IGF-1R。
发明概述
本发明提供了抗-IGF-1R抗体或其抗原结合片段的组合物和使用方法。在优选的实施方案中,抗-IGF-1R抗体结合于IGF-1R但不结合于IR。在更优选的实施方案中,抗-IGF-1R抗体不是IGF-1R的激动剂。在最优选的实施方案中,抗-IGF-1R抗体结合于IGF-1R表位,该表位包含IGF-1R的半胱氨酸富集结构域的前半部分,在人IGF-1R序列的氨基酸残基151与222之间(参见,例如Adams等人,Cell MolLife Sci 57:1050-93,2000;NCBI登记号AAB22215)。通过弗林蛋白酶的蛋白酶裂解导致生成包含残基1-706的α-链和包含残基711-1337的β-链。残基151-222由半胱氨酸富集结构域(残基151-300)的N末端一半组成。
优选地,抗-IGF-1R抗体是鼠、嵌合、人源化或人抗体或其抗原-结合片段,其包含重链CDR序列CDR1(DYYMY,SEQ ID NO:1)、CDR2(YITNYGGSTYYPDTVKG,SEQ ID NO:2)和CDR3(QSNYDYDGWFAY,SEQ ID NO:3)和轻链CDR序列CDR1(KASQEVGTAVA,SEQ ID NO:4)、CDR2(WASTRHT,SEQ IDNO:5)和CDR3(QQYSNYPLT,SEQ ID NO:6)。在替代实施方案中,抗-IGF-1R抗体是嵌合、人源化或人抗体,其结合于同一表位和/或阻断与包含重链CDR序列CDR1(DYYMY,SEQ ID NO:1)、CDR2(YITNYGGSTYYPDTVKG,SEQ ID O:2)和CDR3(QSNYDYDGWFAY,SEQ ID NO:3)和轻链CDR序列CDR1(KASQEVGTAVA,SEQ ID NO:4)、CDR2(WASTRHT,SEQ IDNO:5)和CDR3(QQYSNYPLT,SEQ ID NO:6)的鼠R1抗体的IGF-1R的结合。抗-IGF-1R抗体可以是裸抗体或可以是与至少一种治疗剂和/或至少一种诊断剂连接的免疫缀合物。
各种实施方案可涉及多特异性抗体、双特异性抗体或抗体融合蛋白,其包含至少一个抗-IGF-1R MAb或其片段或第一抗-IGF-1R MAb或其片段和第二Mab。其它实施方案可涉及用于治疗癌症的第一抗-IGF-1R MAb或其片段和第二Mab的药物组合物或使用方法。第二Mab可例如在可靶向构建体上结合于肿瘤相关抗原(TAA)或半抗原。多种肿瘤相关抗原在本领域是已知的并且任何此类已知的TAA可由第二Mab靶向,所述第二Mab包括但不限于碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤连蛋白ED-B、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素-样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、Ia、HM1.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。
第二MAb可选自本领域已知的多种抗-癌抗体中的任一种,包括但不限于hPAM4(美国专利No.7,282,567)、hA20(美国专利No.7,251,164)、hA19(美国专利No.7,109,304)、hIMMU31(美国专利No.7,300,655)、hLL1(美国专利No.7,312,318)、hLL2(美国专利No.7,074,403)、hMu-9(美国专利No.7,387,773)、hL243(美国专利No.7,612,180)、hMN-14(美国专利No.6,676,924)、hMN-15(美国专利No.7,541,440)、hR1(美国临时专利申请61/145,896)、hRS7(美国专利No.7,238,785)、hMN-3(美国专利No.7,541,440)、AB-PG1-XG1-026(美国专利申请11/983,372,以ATCC PTA-4405和PTA-4406保藏)和D2/B(WO 2009/130575),每篇引用的专利或申请的文本中关于附图和实施例部分通过引用并入本文。第二MAb还可选自本领域已知的任何抗-半抗原抗体,包括但不限于h679(美国专利No.7,429,381)和734(美国专利No.7,405,320)或h734,每篇专利的文本通过引用并入本文。在某些实施方案中,可以使用第二、不同的抗-IGF-1R抗体,例如临床开发中的抗-IGF-1R抗体中的任一种(参见,例如Ryan和Goss,The Oncologist,2008,13:16-24)。
其它实施方案可涉及结合于至少一种治疗剂或至少一种诊断剂的抗-IGF-1R MAb或其片段或抗体融合蛋白的治疗或诊断缀合物。也包括具有相同或不同的类型的多种治疗剂的抗体和融合蛋白。在替代实施方案中,抗体、片段或融合蛋白可用于治疗或诊断预靶向方法,例如使用一个臂特异性结合于肿瘤相关抗原且另一个臂结合于与一种或多种诊断剂或治疗剂连接的可靶向构建体的双特异性抗体。用双特异性抗体预靶向的方法是本领域所熟知的(参见,例如美国专利No.7,300,644、7,138,103、7,074,405、7,052,872、6,962,702、6,458,933,每篇专利的实施例部分通过引用并入本文)。
各种实施方案涉及使用单独地或与一种或多种其它治疗剂组合的抗-IGF-1R MAb或其片段或抗体融合蛋白以用于治疗或诊断的方法。抗-IGF-1R MAb可用作裸抗体或用作与一种或多种治疗剂和/或诊断剂连接的免疫缀合物。裸抗-IGF-1R MAb或免疫缀合物可用于在一种或多种其它治疗剂之前、同时或之后施用的组合治疗。如下文更详细论述的本领域已知的任何治疗剂可用于与抗-IGF-1R MAb组合或与抗-IGF-1R MAb连接,所述抗-IGF-1R MAb包括但不限于放射性核素、免疫调节剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、药物、前药、酶、寡核苷酸、siRNA、促细胞凋亡剂、光活性治疗剂、细胞毒性剂、化疗剂、毒素、其它抗体或其抗原结合片段。在优选的实施方案中,其它治疗剂可以是EGFR抑制剂(例如,厄洛替尼或抗-EGFR抗体、例如erbitux)和/或其它IGF-1R抑制剂例如tryphostin(例如,AG1024,AG538)、吡咯并[2,3-d]-嘧啶衍生物(例如,NVP-AEW541)或其它抗-IGF-1R抗体。
表达IGF-1R的任何癌或患病细胞可用抗-IGF-1R抗体治疗和/或诊断,包括但不限于维尔姆斯瘤、尤因肉瘤、神经内分泌系统瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、皮肤癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胰腺癌和/或肺癌以及淋巴瘤、白血病和骨髓瘤。可被治疗的其它癌症形式包括但不限于急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、胆管癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、霍奇金氏淋巴瘤、甲状腺髓样癌、非霍奇金氏淋巴瘤、卵巢癌、神经胶质瘤和泌尿膀胱癌。
某些实施方案可包含嵌合、人源化或人R1抗体的治疗和/或诊断用途,所述嵌合、人源化或人R1抗体包含重链CDR序列CDR1(DYYMY,SEQ ID NO:1)、CDR2(YITNYGGSTYYPDTVKG,SEQ ID NO:2)和CDR3(QSNYDYDGWFAY,SEQ ID NO:3)和轻链CDR序列CDR1(KASQEVGTAVA,SEQ ID NO:4)、CDR2(WASTRHT,SEQ ID NO:5)和CDR3(QQYSNYPLT,SEQ ID NO:6)。优选使用嵌合抗体,因为它们不会引起像鼠抗体一样强烈的人抗-小鼠抗体(HAMA)响应。甚至更优选使用人源化抗体,以便进一步降低诱导HAMA反应的可能性。如下所述,通过用相应的人抗体构架区和恒定区序列替代鼠构架区和恒定区序列对鼠抗体人源化的技术是本领域熟知的并且已用于许多鼠抗-癌抗体。抗体人源化也可包括用来自亲代鼠构架区序列的相应残基取代一个或多个人构架区氨基酸残基。
另外其它实施方案涉及编码抗-IGF-1R抗体或抗体融合蛋白的DNA序列、包含该DNA序列的载体和宿主细胞以及制备抗-IGF-1R抗体的方法。在优选的实施方案中,该DNA序列可包含编码hR1VH(SEQ ID NO:9)和hR1 VK(SEQ ID NO:10)可变区氨基酸序列的序列。其它实施方案涉及通过停靠和锁定(DNL)技术来制备的并入抗-IGF-1R抗体、融合蛋白和/或其片段的多价、多特异性和/或多功能构建体。已报道组合物和用于生产和使用DNL构建体的方法(参见,例如美国专利No.7,521,056、7,550,143、7,534,866、7,527,787和2007年10月26日提交的美国专利申请序列No.11/925,408以及2009年4月6日提交的12/418,877;每篇专利的实施例部分通过引用并入本文)。
附图简述
图1.质粒cR1pdHL2的示意图。
图2.嵌合R1(cR1)抗体与固定化重组人IGF-1R和重组人IR的结合特异性。cR1从两个不同的克隆-709.2D2和710.2G2获得。cR1抗体结合于人IGF-1R但不结合于人胰岛素受体(IR)。
图3.cR1与固定化重组人IGF-1R的结合亲和力。
图4.鼠R1(ML04R1)和嵌合R1(cR1)抗体与固定化重组人IGF-1R的竞争性结合。
图5.人源化R1(hR1)、嵌合R1(cR1)和鼠R1(ML04R1)抗体与固定化重组人IF-1R的结合的比较。
图6.嵌合R1(cR1)不阻断IGF-1或IGF-2与固定化重组人IGF-1R的结合。将125I-标记的IGF-1或IGF-2与未标记的IGF-1、IGF-2或cR1一起孵育。
图7.人源化R1(hR1)和鼠R1不阻断IGF-1与固定化重组人IGF-1R的结合。将125I-标记的IGF-1与未标记的IGF-1、MAb391、hR1或R1一起孵育。
图8.R1抗体的结合不与MAB391竞争。在竞争性鼠R1抗体(ML04R1)、MAB391或结合于CD20的对照非特异性抗体hA20存在下测定荧光标记的R1抗体(A)或MAB391(B)与固定化rhIGF-1R的结合。R1抗体不与MAB391竞争结合于IGF-1R。
图9.人源化R1不是IGF-1R受体的激动剂。与IGF-1不同,hR1不刺激无血清培养基中MCF-7细胞的增殖。
图10.通过Guava Express分析使用Zenon-标记的抗体来测定细胞系中的IGF-1R表达。IGF-1R的表达通过hR1与MCF-7(乳腺癌)、CaPan1(胰腺癌)和DU-145(前列腺癌)的结合来确认。
图11.包含hR1抗体或其Fab片段的DNL构建体与表达IGF-1R的细胞系的结合。将Hep G2肝癌细胞与DNL构建体TF-18(人源化抗-AFP)、1R-31(人源化抗-AFP/人源化抗-IGF-1R)、1R-15(人源化抗-IGF-1R/人源化抗-CEACAM6)、31-1R(人源化抗-AFP IgG和hR1-IgG-AD2)一起孵育。
图12.DNL构建体与MCF-7细胞(A)、DU-145细胞(B)或ME-180细胞(C)的结合用DNL构建体或完整抗体在FACScan上测定。Hex是指六价DNL构建体。hRS7是人源化抗-EGP-1抗体。
图13.DNL构建体对中和IGF-1在表达IGF-1R和EGP-1两者的DU-145(A)和ME-180(B,C)细胞中的生长刺激活性的效应。包含抗-IGF-1R的Hex-hR1构建体抑制DU-145(A)和ME-180(B)的增殖。包含抗-IGF-1R和抗-EGP-1的1R-E1构建体抑制ME-180(C)的增殖。
图14.IGF-1R在用hR1、MAB391和24-60抗体但不用hLL2对照抗体处理的MCF-7和HT-29细胞中的下调。
图15.IGF-1R在(A)用Hex-hR1处理的MCF-7和DU-145细胞;(B)用Hex-hR1和1R-E1DNL构建体处理的MCF-7、DU-145和LNCaP细胞中的下调。
图16.Hex-hR1阻断ERK1/2磷酸化在MCF-7细胞中的IGF-1激活。将Hex-hR1和对照DNL构建体Hex-hRS7以10nM加至用100ng/ml IGF-1处理的细胞。
图17.1R-E1、E1-1R和hR1阻断IGF-1R磷酸化在ME-180细胞中的IGF-1激活。将所示浓度的DNL构建体1R-E1、E1-R1、hR1和对照hRS7抗体加至用100nM IGF-1处理的细胞。
图18.Hex-hR1阻断IGF-1R、Akt和ERK1/2的磷酸化在MCF-7细胞中的IGF-1激活。将所示浓度的DNL构建体Hex-hR1、对照Hex-hRS7或hR1抗体加至用100ng/ml IGF-1处理的细胞。
图19.双特异性六价构建体1R-E1或E1-1R抑制在用100ng/mlIGF-1刺激的MCF-7细胞中的IGF-1R、Akt和ERK1/2的磷酸化。
图20.Hex-hR1抑制在用100ng/ml IGF-1刺激的DU-145细胞中IGF-1R、Akt和ERK1/2的磷酸化。
发明详述
定义
如本文所用的,术语“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该(the)”可以是指单数或复数,除非上下文另有明确指出仅仅表示单数。
如本文所用的,术语“约”表示数值加或减百分之十(10%)。例如,“约100”将是指90至110的任何数字。
抗体是指全长(即,天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如,IgG抗体)或免疫上活性的、免疫球蛋白分子的抗原结合部分如抗体片段。
抗体片段是抗体的一部分例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、scFv等。不管结构如何,抗体片段与由完整抗体识别的相同抗原结合。例如,抗-IGF-1R单克隆抗体片段结合于IGF-1R。术语“抗体片段”还包括由可变区组成的分离的片段,例如由重链和轻链以及其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)的可变区组成的“Fv”片段。如本文所用的,术语“抗体片段”不包括不具有抗原结合活性的抗体部分,例如Fc片段或单个氨基酸残基。
裸抗体或裸抗体片段是指不缀合于治疗剂的抗体或其抗原结合片段。裸抗体可包括鼠单克隆抗体以及重组抗体,例如嵌合、人源化或人抗体。
治疗剂是单独施用、与抗体部分同时或相继施用或缀合于抗体部分(即抗体或抗体片段)并且可用于治疗疾病的分子或原子。治疗剂的非限制性实例包括抗体、抗体片段、药物、毒素、核酸酶、激素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光敏试剂、寡核苷酸(例如反义寡核苷酸或RNAi)和放射性同位素。
诊断剂是可缀合于抗体、抗体片段、可靶向构建体或其它部分以用于递送至细胞、组织、病原体或与疾病或医学疾患相关的其它靶的可检测分子或原子。有用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料、造影剂、荧光化合物或分子和增强剂(例如用于核磁共振成像的顺磁离子)。在某些实施方案中,诊断剂可以是F-18标记部分(例如,美国专利申请序列No.11/960,262、12/112,289;PCT专利申请序列No.PCT/US08/62108;每篇专利的实施例部分通过引用并入本文)。
免疫缀合物是抗体组分与至少一种治疗剂或诊断剂的缀合物。抗体组分可缀合于多种治疗剂和/或诊断剂以形成免疫缀合物。
术语抗体融合蛋白可以是指重组产生的抗原结合分子,其中连接具有相同或不同的特异性的相同或不同的单链抗体或抗体片段区段中的一个或多个。融合蛋白的化合价表明融合蛋白有多少个针对单个抗原或表位的结合臂或位点;即单价、双价、三价或多价。抗体融合蛋白的多价表示其可在结合抗原方面利用多种相互作用,由此增加结合于抗原的亲合力。特异性表明抗体融合蛋白能够结合多少个抗原或表位;即,单特异性、双特异性、三特异性、多特异性。使用这些定义,天然抗体例如IgG是二价的(因为其具有两个结合臂),但是单特异性的(因为其结合于一个表位)。单特异性多价融合蛋白具有一个以上的表位结合位点但仅与一个表位结合。融合蛋白可包含单个抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性组合或同一抗体组分的多个拷贝。融合蛋白还可包含抗体或抗体片段和治疗剂。适合于此类融合蛋白的治疗剂的实例包括免疫调节剂和毒素。一种优选的毒素包含核糖核酸酶(RNA酶),优选重组RNA酶。然而,术语是非限定性的并且多种蛋白或肽效应子可并入融合蛋白中。在另一个非限定性实例中,融合蛋白可包含产生本下文论述的DNL构建体的AD或DDD序列。
多特异性抗体是可同时结合于至少两个具有不同结构的靶(例如两个不同抗原、同一抗原上的两个不同表位、或半抗原和/或抗原或表位)的抗体。一种特异性可以是针对B-细胞、T-细胞、骨髓样-、血浆-或肥大-细胞抗原或表位。另一种特异性可以是针对同一细胞类型的不同抗原,例如B-细胞上的IGF-1R、CD19、CD20、CD21、CD23、CD45、CD80、HLA-DR、CD74、MUC1和CD22。然而,第二抗原是非限定性的并且使用的其它靶抗原可选自:碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、IGF-1R、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM5、CEACAM6、B7、ED-B纤连蛋白、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素-样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、PSMA、EGP-1、EGP-2、AFP、Ia、HM1.24、HLA-DR、生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。多特异性、多价抗体是具有一个以上的结合位点的构建体,并且结合位点是不同特异性的。
在各种实施方案中,本发明提供了人源化、嵌合或人抗-IGF-1R抗体及其抗体融合蛋白,可单独地、作为缀合物或与其它治疗剂(包括其它裸抗体和抗体治疗缀合物)组合施用的用于治疗哺乳动物受试者、人和家畜。
优选地,抗-IGF-1R抗体展示一种或多种选自以下功能特征:(i)结合于IGF-1R但不结合于IR;(ii)不是IGF-1R的激动剂;(iii)不阻断IGF-1或IGF-2与分离的IGF-1R的结合;(iv)有效地中和IGF-1在完整细胞或组织中对IGF-1R的激活;和(v)结合于IGF-1R表位,所述IGF-1R表位包含IGF-1R的半胱氨酸富集结构域的前半部分,在人IGF-1R序列的氨基酸残基151至222之间。
在其它优选的实施方案中,抗-IGF-1R MAb或其片段包含重链可变区互补决定区(CDR)序列CDR1(DYYMY,SEQ ID NO:1)、CDR2(YITNYGGSTYYPDTVKG,SEQ ID NO:2)和CDR3(QSNYDYDGWFAY,SEQ ID NO:3)以及轻链可变区CDR序列CDR1(KASQEVGTAVA,SEQ ID NO:4)、CDR2(WASTRHT,SEQ IDNO:5)和CDR3(QQYSNYPLT,SEQ ID NO:6)。在最优选的实施方案中,抗-IGF-1R抗体或其片段是hR1。
人源化抗-IGF-1R MAb或其片段可包含鼠抗-IGF-1R MAb的CDR以及一种或多种人抗体的轻链和重链可变区的构架区(FR)和恒定区,同时保留亲代鼠抗-IGF-1R MAb的IGF-1R靶向特异性。人源化抗-IGF-1R MAb或其片段还可包含来自亲代鼠Mab的相应FR的至少一个氨基酸。如有必要,鼠框架氨基酸残基可在可变轻链和重链的的人FR区域中被取代以维持与IGF-1R抗原的适当结合或增强与IGF-1R抗原的结合。更优选地,人源化抗-IGF-1R MAb或其片段包含hR1 VH(SEQ ID NO:9)和hR1 VK(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。
嵌合抗-IGF-1R MAb或其片段可包含与人抗体恒定区序列连接的、鼠抗-IGF-1R抗体的可变区序列。在优选的实施方案中,嵌合抗-IGF-1R MAb包含鼠R1 VH(SEQ ID NO:7)和R1 VK(SEQ ID NO:8)的重链和轻链可变区序列。
某些实施方案可涉及阻断与鼠、嵌合、人源化或人抗体的IGF-1R结合的抗-IGF-1R MAb或其片段,所述鼠、嵌合、人源化或人抗体包含重链互补决定区(CDR)序列CDR1(DYYMY,SEQ ID NO:1)、CDR2(YITNYGGSTYYPDTVKG,SEQ ID NO:2)和CDR3(QSNYDYDGWFAY,SEQ ID NO:3)以及轻链CDR序列CDR1(KASQEVGTAVA,SEQ ID NO:4)、CDR2(WASTRHT,SEQ IDNO:5)和CDR3(QQYSNYPLT,SEQ ID NO:6)。
其它实施方案可包括抗体融合蛋白,所述抗体融合蛋白包含至少一个如上所述的抗-IGF-1R MAb或其片段。抗体融合蛋白可包含至少一个第一抗-IGF-1R MAb或其片段和至少一个地儿MAb或其片段。更优选地,第二MAb结合于选自以下抗原:B7、CD4、CD5、CD8 CD14、CD15、CD16、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD66a-e、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD95、CD126、CD133、CD138、CD154、CEACAM5、CEACAM6、PAM4抗原、PSMA、AFP、EGP-1、EGP-2、MIF、ED-B纤连蛋白、IL-2、IL-6、IL-25、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、NCA-90、NCA-95、Ia、HM1.24、HLA-DR、生腱蛋白、T101、TAC、TRAIL-R1、TRAIL-R2、VEGFR、EGFR、PlGF、Flt-3、ILGF、补体因子C5和癌基因产物。可选地第二Mab可以是不同于本文所述的抗-IGF-1RMab的抗-IGF-1R Mab。
氨基酸取代
在某些实施方案中,所公开的方法和组合物可涉及具有一个或多个取代的氨基酸残基的抗体或其抗原结合片段的产生和用途。如下文论述,用于制备针对实质上任何靶抗原的单克隆抗体的方法是本领域熟知的。通常,这导致针对靶抗原的鼠抗体的产生。如本领域所熟知,主要由高变互补决定区(CDR)序列确定鼠单克隆抗体的抗原结合特异性。鼠抗体一般包含6个CDR序列,3个在抗体轻链上且3个在重链上。如下文详细描述,嵌合、人源化或人形式的鼠抗体可通过诸如CDR移植(其中鼠CDR序列被插入到例如人抗体构架区和恒定区序列)的技术,或通过将整个鼠可变区序列连接至人抗体恒定区序列来构建。在替代实施方案中,抗体的可变区序列可例如通过化学合成和装配编码抗体的整个轻链和重链可变区的寡核苷酸来构建。
在各种实施方案中,天然、嵌合、人源化或人抗体的结构、物理和/或治疗特征可通过替代一个或多个氨基酸残基来优化。例如,本领域熟知的是,人源化抗体的功能特征可通过用亲代鼠抗体的相应FR氨基酸取代有限数量的人构架区(FR)氨基酸来改善。这当构架区氨基酸残基紧密邻近CDR残基时尤其正确。
在其它情况下,抗体的治疗特性例如对靶抗原的结合亲和性、抗体从其靶抗原的离解速率或解离速率或者甚至抗体诱导CDC(补体依赖性细胞毒性)或ADCC(抗体依赖性细胞的细胞毒性)的效力可通过有限数量的氨基酸取代来优化。此类取代甚至可例如在抗体的CDR部分中发生。然而,氨基酸取代不限于抗体的CDR或构架区序列并且也可例如在抗体的Fc部分中发生。
熟练技术人员将意识到,一般而言,氨基酸取代通常涉及用另一个具有相对类似性质的氨基酸替代氨基酸(即,保守性氨基酸取代)。不同氨基酸的性质和氨基酸取代对蛋白结构和功能的影响已经是本领域广泛研究和知识的主题。
例如,可考虑氨基酸的亲疏水性指数(Kyte&Doolittle,1982,J.Mol.Biol.,157:105-132)。氨基酸的相对亲疏水性特征促成所生成蛋白的二级结构,这反过来定义该蛋白与其它分子的相互作用。基于每个氨基酸的疏水性和电荷特征,已赋予其亲疏水性指数(Kyte&Doolittle,1982),它们是:异亮氨酸(+4.5)、缬氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、蛋氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、苏氨酸(-0.7)、丝氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、组氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。在制备保守性取代中,优选使用亲疏水性指数在±2内的氨基酸,更优选亲疏水性指数在±1内的氨基酸,进一步更优选亲疏水性指数在±0.5内的氨基酸。
氨基酸取代也可考虑氨基酸残基的亲水性(例如,美国专利No.4,554,101)。已给氨基酸残基赋予亲水性值:精氨酸(+3.0)、赖氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0)、谷氨酸(+3.0)、色氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、苏氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5.+-.1)、丙氨酸(-0.5)、组氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、蛋氨酸(-1.3)、缬氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、异亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。优选用其它具有类似亲水性的氨基酸替代氨基酸。
其它考虑包括氨基酸侧链的大小。例如,一般不优选用具有庞大侧链的氨基酸例如色氨酸、酪氨酸替代具有紧凑侧链的氨基酸例如甘氨酸或丝氨酸。还考虑不同氨基酸残基对蛋白二级结构的影响。通过实验研究,不同氨基酸残基对蛋白结构域趋向于采用α-螺旋、β-折叠或回折二级结构的影响已被测定并且是本领域熟知的(参见,例如Chou&Fasman,1974,Biochemistry,13:222-245;1978,Ann.Rev.Biochem.,47:251-276;1979,Biophys.J.,26:367-384)。
基于此类考虑和广泛的实验研究,已构建保守性氨基酸取代的表并且在本领域是已知的。例如:精氨酸和赖氨酸;谷氨酸和天冬氨酸;丝氨酸和苏氨酸;谷氨酰胺和天冬酰胺;以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。可选地:Ala(A)leu、ile、val;Arg(R)gln、asn、lys;Asn(N)his、asp、lys、arg、gln;Asp(D)asn、glu;Cys(C)ala、ser;Gln(Q)glu、asn;Glu(E)gln、asp;Gly(G)ala;His(H)asn、gln、lys、arg;Ile(I)val、met、ala、phe、leu;Leu(L)val、met、ala、phe、ile;Lys(K)gln、asn、arg;Met(M)phe、ile、leu;Phe(F)leu、val、ile、ala、tyr;Pro(P)ala;Ser(S)、thr;Thr(T)ser;Trp(W)phe、tyr;Tyr(Y)trp、phe、thr、ser;Val(V)ile、leu、met、phe、ala。
氨基酸取代的其它考虑包括该残基是位于蛋白质的内部还是暴露于溶剂。对于CDR残基,通常假定游离抗体中的残基是暴露于溶剂的。对于内部残基,保守性取代将包括:Asp和Asn;Ser和Thr;Ser和Ala;Thr和Ala;Ala和Gly;Ile和Val;Val和Leu;Leu和Ile;Leu和Met;Phe和Tyr;Tyr和Trp(参见,例如rockefeller.edu的PROWL网站)。对于溶剂暴露的残基,保守性取代将包括:Asp和Asn;Asp和Glu;Glu和Gln;Glu和Ala;Gly和Asn;Ala和Pro;Ala和Gly;Ala和Ser;Ala和Lys;Ser和Thr;Lys和Arg;Val和Leu;Leu和Ile;Ile和Val;Phe和Tyr(同上)。已构建各种矩阵以有助于氨基酸取代的选择,例如PAM250评分矩阵、Dayhoff矩阵、Grantham矩阵、McLachlan矩阵、Doolittle矩阵、Henikoff矩阵、Miyata矩阵、Fitch矩阵、Jones矩阵、Rao矩阵、Levin矩阵和Risler矩阵(同前)。
在确定氨基酸取代中,还可考虑分子间或分子内键的存在,例如在带正电的残基(例如,His、Arg、Lys)和带负电的残基(例如,Asp、Glu)之间离子键(盐桥)的形成或邻近半胱氨酸残基之间的二硫键。
在编码蛋白序列中将任何氨基酸取代为任何其它氨基酸的方法是熟知的并且是熟练技术人员的常规实验的主题,例如通过定向诱变的技术或通过合成和装配编码氨基酸取代和剪接成表达载体构建体的寡核苷酸。
包括嵌合、人源化和人抗体的单克隆抗体的制备
用于制备针对实质上任何靶抗原的单克隆抗体的技术是本领域熟知的。参见,例如Kohler和Milstein,Nature 256:495(1975)和Coligan等人(编),CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,VOL.1,第2.5.1-2.6.7页(John Wiley&Sons 1991)。简言之,可通过如下获得单克隆抗体:用包含抗原的组合物注射小鼠,取出脾脏以获得B淋巴细胞,将所述B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤,克隆杂交瘤,选择产生针对所述抗原的抗体的阳性克隆,培养产生针对所述抗原的抗体的克隆以及从杂交瘤培养物分离抗体。
可利用多种成熟的技术从杂交瘤培养物分离和纯化MAb。此类分离技术包括利用蛋白A或蛋白G琼脂糖的亲和层析、体积排阻层析和离子交换层析。参见,例如,Coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。此外,参见Baines等人,“Purification of ImmunoglobulinG(IgG)”,于METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,第10卷,第79-104页(The Humana Press,Inc.1992)中。
在初始产生针对免疫原的抗体后,可对抗体进行测序,随后通过重组技术进行制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合化对于本领域技术人员来说是熟知的,如下所论述的。
嵌合抗体
嵌合抗体为重组蛋白质,其中人抗体的可变区被例如包括小鼠抗体的互补性决定区(CDR)的小鼠抗体的可变区替代。当给受试者施用时,嵌合抗体显示出减小的免疫原性和增加的稳定性。用于克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术公开于例如Orlandi等人,Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 86:3833(1989)中。用于构建嵌合抗体的技术对于本领域技术人员而言是熟知的。作为例子,Leung等人,Hybridoma13:469(1994)通过将编码鼠LL2(抗-CD22单克隆抗体)的Vκ和VH结构域的DNA序列与相应的人κ和IgG1恒定区结构域组合来产生LL2嵌合体。
人源化抗体
用于产生人源化Mab的技术是本领域熟知的(参见,例如Jones等人,Nature 321:522(1986),Riechmann等人,Nature 332:323(1988),Verhoeyen等人,Science 239:1534(1988),Carter等人,Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89:4285(1992),Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437(1992)和Singer等人,J.Immun.150:2844(1993))。可通过将小鼠CDR自小鼠免疫球蛋白的可变重链和可变轻链转移入人抗体的相应可变结构域来人源化嵌合或鼠单克隆抗体。嵌合单克隆抗体中的小鼠构架区(FR)也用人FR序列替代。由于简单地将小鼠CDR转移入人FR中通常导致抗体亲和力的减少或甚至丧失,所以为了恢复鼠抗体的原始亲和力可能需要额外的修饰。这可通过将FR区中的一个或多个人残基用它们的鼠对应物替代以获得对其表位具有良好结合亲和力的抗体来实现。参见,例如Tempest等人,Biotechnology 9:266(1991)和Verhoeyen等人,Science 239:1534(1988)。用于取代的优选残基包括位于CDR残基侧链的1、2或3埃内的FR残基,与CDR序列邻近的FR残基,或经预测与CDR残基相互作用的FR残基。
人抗体
使用重组方法或利用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物产生完全人抗体的方法在本领域是已知的(例如,Mancini等人,2004,New Microbiol.27:315-28;Conrad和Scheller,2005,Comb.Chem.HighThroughput Screen.8:117-26;Brekke和Loset,2003,Curr.Opin.Phamacol.3:544-50)。完全人抗体还可通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体展示技术(其全部在本领域是已知的)来构建。参见,例如McCafferty等人,Nature 348:552-553(1990)。预期此类完全人抗体展示甚至比嵌合或人源化抗体更小的副作用以及在体内基本上用作内源人抗体。
在一个替代方案中,噬菌体展示技术可用于产生人抗体(例如,Dantas-Barbosa等人,2005,Genet.Mol.Res.4:126-40)。可由正常人或由展示特定疾病状态例如癌症的人产生人抗体(Dantas-Barbosa等人,2005)。由患病个体构建人抗体的有利方面在于可使循环抗体库(repertoire)偏向于针对疾病相关抗原的抗体。
在该方法的一个非限定性实例中,Dantas-Barbosa等人(2005)构建了来自骨肉瘤患者的人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。通常,从循环血液淋巴细胞(同上)获得总RNA。由μ、γ和κ链抗体库克隆重组Fab,且将其插入噬菌体展示文库(同上)。将RNA转化成cDNA并且使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物将其用于制备Fab cDNA文库(Marks等人,1991,J.Mol.Biol.222:581-97)。按照Andris-Widhopf等人(2000,于:Phage Display Laboratory Manual,Barbas等人(编),第1版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY pp.9.1至9.22中)进行文库构建。用限制性核酸内切酶消化终Fab片段,且将其插入噬菌体基因组以制备噬菌体展示文库。此类文库可通过本领域已知的标准噬菌体展示方法来筛选。可以以多种方式进行噬菌体展示,关于它们的综述,参见例如Johnson和Chiswell,Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571(1993)。
还可通过体外激活的B-细胞来产生人抗体。参见美国专利No.5,567,610和5,229,275,其通过引用整体并入本文。本领域技术人员将了解,这些技术是示例性的并且可使用任何已知的用于制备和筛选人抗体或抗体片段的方法。
在另一个替代方案中,可使用标准免疫方案,将已对其进行了遗传工程化以产生人抗体的转基因动物用于产生针对基本上任何免疫原性靶的人抗体。用于从转基因小鼠获得人抗体的方法公开于Green等人,Nature Genet.7:13(1994),Lonberg等人,Nature 368:856(1994)和Taylor等人,Int.Immun.6:579(1994)中。这样的系统的非限定性实例为来自Abgenix(Fremont,CA)的(例如,Green等人,1999,J.Immunol.Methods 231:11-23,通过引用并入本文)。在和类似动物中,已使小鼠抗体基因失活并且由功能性人抗体基因替换,然而小鼠免疫系统的其余部分仍然保持完整。
利用包含人IgH和Igκ基因座的部分(包括大部分可变区序列以及附加基因和调控序列)的种系构造的(germline-configured)YCA(酵母人工染色体)转化可将人可变区组成成分用于产生抗体产生性B-细胞,通过已知技术可将所述B-细胞加工成杂交瘤。利用靶抗原免疫的将通过正常免疫响应产生人抗体,可通过上文中论述的标准技术收获和/或产生所述抗体。多个品系是可获得的,其每个品系能够产生不同种类的抗体。已显示转基因产生的人抗体具有治疗潜能,同时保持正常人抗体的药代动力学性质(Green等人,1999)。本领域技术人员将了解,要求保护的组合物和方法不限于系统的使用,而且还可利用已被遗传工程化以产生人抗体的任何转基因动物。
抗体片段的产生
可利用已知技术产生识别特定表位的抗体片段。抗体片段是抗体的抗原结合部分例如F(ab')2、Fab'、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等。可通过胃蛋白酶降解抗体分子来产生F(ab’)2片段,并且可通过还原F(ab’)2片段的二硫桥来产生Fab′片段。可选择地,可构建Fab′表达文库(Huse等人,1989,Science,246:1274-1281)以允许快速且容易地鉴定具有期望的特异性的单克隆Fab′片段。
单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域缔合以形成靶结合位点。这两个结构域通过肽接头(L)进一步共价连接。用于制备scFv分子和设计适当的肽接头的方法描述于美国专利No.4,704,692、美国专利No.4,946,778、R.Raag和M.Whitlow,“SingleChain Fvs.”FASEB第9卷:73-80(1995)以及R.E.Bird和B.W.Walker,“Single Chain Antibody Variable Regions,”TIBTECH,第9卷:132-137(1991)中,所述文献和专利均通过引用并入本文。
可通过蛋白水解全长抗体或通过在大肠杆菌(E.coli)或另一种宿组中表达编码所述片段的DNA来制备抗体片段。可利用常规方法通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶降解全长抗体来获得抗体片段。例如,使用木瓜蛋白酶的酶促裂解产生两个单价Fab片段和一个Fc片段。此类方法由例如Goldenberg,美国专利No.4,036,945和4,331,647以及在其中所包含的参考资料描述,所述专利通过引用整体并入本文。此外,参见Nisonoff等人,Arch Biochem.Biophys.89:230(1960);Porter,Biochem.J.73:119(1959),Edelman等人,于METHODS INENZYMOLOGY,第1卷,第422页(Academic Press 1967)中以及Coligan第2.8.1-2.8.10和2.10.-2.10.4页。
双特异性和多特异性抗体
双特异性抗体可用于许多生物医学应用。例如,具有肿瘤细胞表面抗原和T-细胞表面受体的结合位点的双特异性抗体可引导T细胞溶解特异性肿瘤细胞。识别神经胶质瘤和T细胞上的CD3表位的双特异性抗体已成功地用于治疗人患者中的脑肿瘤(Nitta等人Lancet.1990;355:368-371)。利用包含肿瘤相关抗原或其它疾病靶的至少一个结合位点以及缀合于治疗剂或诊断剂的可靶向构建体的至少一个结合位点的双特异性抗体的预靶向方法也是本领域熟知的(参见,例如美国专利No.7,300,644、7,138,103、7,074,405、7,052,872、6,962,702、6,458,933,每篇文献的实施例部分通过引用并入本文)。
产生双特异性或多特异性抗体的许多方法是已知的,如例如在美国专利No.7,405,320中公开的,其实施例部分通过引用并入本文。双特异性抗体可通过细胞杂交瘤方法来产生,所述方法包括融合两个不同的杂交瘤,每个杂交瘤产生识别不同抗原位点的单克隆抗体(Milstein和Cuello,Nature,1983;305:537-540)。
用于产生双特异性抗体的另一种方法使用异双功能交联试剂以化学上栓系两个不同的单克隆抗体(Staerz等人Nature.1985;314:628-631;Perez等人Nature.1985;316:354-356)。双特异性抗体的产生还可通过将两个亲代单克隆抗体中的每一个还原成各自的半分子,然后将所述半分子混合并且使其再氧化以获得杂种结构(Staerz和Bevan.Proc Natl Acad Sci U S A.1986;83:1453-1457)。另一个替代方案包括使用适当接头将两个或三个分别纯化的Fab’片段进行化学交联(参见,例如欧洲专利申请0453082)。
其它方法包括通过将不同可选标记经由逆转录病毒源性穿梭载体基因转移到各自亲代杂交瘤(其随后融合)中(DeMonte等人ProcNatl Acad Sci U S A.1990,87:2941-2945);或用包含不同抗体的重链和轻链基因的表达质粒转染杂交瘤细胞系来提高产生杂种杂交瘤的效率。
同源VH和VL结构域可与具有适当组成和长度的肽接头(通常由12个以上的氨基酸残基组成)连接以形成具有结合活性的单链Fv(scFv)。制备scFvs的方法公开于美国专利No.4,946,778和美国专利No.5,132,405中,每篇专利的实施例部分通过引用并入本文。肽接头长度减少至12个以下的氨基酸残基,防止VH和VL结构域在同一链上配对并且促进具有互补结构域的VH和VL结构域在其它链上配对,导致功能性多聚体的形成。与3至12个氨基酸残基的接头连接的VH和VL结构域的多肽链主要形成二聚体(称为双抗体)。使用0至2个氨基酸残基的接头,有利于形成三聚体(称为三抗体)和四聚体(称为四抗体),但是寡聚化的确切模式除了取决于接头长度以外,似乎取决于V-结构域的组成和取向(VH-接头-VL或VL-接头-VH)。
这些用于产生多特异性或双特异性抗体的技术表现出在低收率、纯化必需性、低稳定性或技术的劳动密集程度的方面的各种困难。最近,称为“停靠和锁定”(DNL)的技术已用于产生实质上任何所需抗体、抗体片段和其它效应分子的组合(参见,例如美国专利No.7,521,056、7,550,143、7,534,866、7,527,787和2007年10月26日提交的美国专利申请序列No.11/925,408和2009年4月6日提交的12/418,877,每篇专利和专利申请的实施例部分通过引用并入本文)。该技术利用互补蛋白结合结构域(称为锚定结构域(AD)和二聚化和停靠结构域(DDD)),其彼此结合并且允许装配复合物结构,范围包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体。这些以高收率形成稳定的复合物而不需广泛的纯化。DNL技术允许将单特异性、双特异性或多特异性抗体装配成裸抗体部分或与多种其它效应分子组合,所述效应分子例如免疫调节剂、酶、化疗剂、趋化因子、细胞因子、诊断剂、治疗剂、放射性核素、成像剂、抗血管生成剂、生长因子、寡核苷酸、激素、肽、毒素、促细胞凋亡剂或其组合。本领域已知的用于制备双特异性或多特异性抗体的任何技术可用于实施本文所要求保护的方法。
双特异性或多特异性抗体可并入具有治疗用途的任何已知抗体。所使用的抗体可以由多种已知来源市售获得。例如,多种分泌杂交瘤细胞系的抗体由美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)得到(ATCC,Manassas,VA)。大量针对不同疾病靶抗体(包括但不限于肿瘤相关抗原)的抗体已保藏在ATCC和/或具有公布的可变区序列,并且可获得用于所要求保护的方法和组合物。参见,例如美国专利No.7,312,318、7,282,567、7,151,164、7,074,403、7,060,802、7,056,509、7,049,060、7,045,132、7,041,803、7,041,802、7,041,293、7,038,018、7,037,498、7,012,133、7,001,598、6,998,468、6,994,976、6,994,852、6,989,241、6,974,863、6,965,018、6,964,854、6,962,981、6,962,813、6,956,107、6,951,924、6,949,244、6,946,129、6,943,020、6,939,547、6,921,645、6,921,645、6,921,533、6,919,433、6,919,078、6,916,475、6,905,681、6,899,879、6,893,625、6,887,468、6,887,466、6,884,594、6,881,405、6,878,812、6,875,580、6,872,568、6,867,006、6,864,062、6,861,511、6,861,227、6,861,226、6,838,282、6,835,549、6,835,370、6,824,780、6,824,778、6,812,206、6,793,924、6,783,758、6,770,450、6,767,711、6,764,688、6,764,681、6,764,679、6,743,898、6,733,981、6,730,307、6,720,15、6,716,966、6,709,653、6,693,176、6,692,908、6,689,607、6,689,362、6,689,355、6,682,737、6,682,736、6,682,734、6,673,344、6,653,104、6,652,852、6,635,482、6,630,144、6,610,833、6,610,294、6,605,441、6,605,279、6,596,852、6,592,868、6,576,745、6,572;856、6,566,076、6,562,618、6,545,130、6,544,749、6,534,058、6,528,625、6,528,269、6,521,227、6,518,404、6,511,665、6,491,915、6,488,930、6,482,598、6,482,408、6,479,247、6,468,531、6,468,529、6,465,173、6,461,823、6,458,356、6,455,044、6,455,040、6,451,310、6,444,206’6,441,143、6,432,404、6,432,402、6,419,928、6,413,726、6,406,694、6,403,770、6,403,091、6,395,276、6,395,274、6,387,350、6,383,759、6,383,484、6,376,654、6,372,215、6,359,126、6,355,481、6,355,444、6,355,245、6,355,244、6,346,246、6,344,198、6,340,571、6,340,459、6,331,175、6,306,393、6,254,868、6,187,287、6,183,744、6,129,914、6,120,767、6,096,289、6,077,499、5,922,302、5,874,540、5,814,440、5,798,229、5,789,554、5,776,456、5,736,119、5,716,595、5,677,136、5,587,459、5,443,953、5,525,338,每篇专利的附图和实施例部分通过引用并入本文。这些仅是示例性的并且许多种其它抗体和它们的杂交瘤在本领域是已知的。本领域技术人员将会了解,针对几乎任何疾病相关抗原的抗体序列或抗体分泌型杂交瘤可通过就针对所选择的疾病相关目标靶的抗体简单地搜索ATCC、NCBI和/或USPTO数据库来获得。可使用本领域熟知的标准技术扩增经克隆的抗体的抗原结合结构域,将其切除,然后连接入表达载体,转染入适当的宿主细胞,并且用于蛋白质生产。
停靠和锁定(DNL)
在优选的实施方案中,双特异性或多特异性抗体或其它构建体可以使用停靠和锁定技术产生(参见,例如美国专利No.7,521,056、7,550,143、7,534,866、7,527,787和2007年10月26日提交的美国专利申请序列No.11/925,408和2009年4月6日提交的12/418,8779;每篇专利和专利申请的实施例部分通过引用并入本文)。DNL方法利用cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚基与A-激酶锚定蛋白(AKAP)的锚定结构域(AD)之间发生的特异性蛋白质/蛋白质相互作用(Baillie等人,FEBS Letters.2005;579:3264.Wong和Scott,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004;5:959)。在1968年首次从兔骨骼肌中分离PKA,所述PKA在研究最充分的通过第二信使cAMP与R亚基结合而触发的信号转导途径之一中起核心作用(Walsh等人,J.Biol.Chem.1968;243:3763)。全酶结构由两个催化亚基组成,通过R亚基保持为非活性形式(Taylor,J.Biol.Chem.1989;264:8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚基(RI和RII),且每种类型具有α和β同种型(Scott,Pharmacol.Ther.1991;50:123)。已将R亚基仅作为稳定二聚体分离,并且已经显示二聚化结构域由前44个氨基末端残基组成(Newlon等人,Nat.Struct.Biol.1999;6:222)。cAMP与R亚基的结合导致广谱的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的活性催化亚基的释放,所述亚基经由其与AKAP停靠通过PKA区室化而定向于选定的底物(Scott等人,J.Biol.Chem.1990;265;21561)
自从1984年表征了首个AKAP(微管相关蛋白-2)以后(Lohmann等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984;81:6723),已经在范围从酵母到人的物种中鉴定了具有多样结构的超过50种AKAP,其定位于各种亚细胞位点,包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体和内质网(Wong和Scott,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004;5:959)。AKAP针对PKA的AD是14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等人,J.Biol.Chem.1991;266:14188)。个体AKAP中AD的氨基酸序列有很大不同,其中对RII二聚体报道的结合亲和力范围为2至90nM(Alto等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003;100:4445)。有意思的是,AKAP将仅结合二聚体R亚基。对于人RIIα,AD结合到由23个氨基末端残基形成的疏水表面(Colledge和Scott,Trends Cell Biol.1999;6:216)。因此,人RIIα的二聚化结构域和AKAP结合结构域都定位于相同N末端44个氨基酸序列内(Newlon等人,Nat.Struct.Biol.1999;6:222;Newlon等人,EMBO J.2001;20:1651),其在本文称为DDD。
我们已经开发了利用DDD(例如,SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:16)和AD(例如,SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18)序列作为优良的接头模块对用于将在下文称为A和B的两个实体停靠成非共价复合物的平台技术,所述非共价复合物可以通过将半胱氨酸残基在策略位置引入DDD和AD以促进二硫键形成而被进一步锁定成稳定拴系的结构。“停靠和锁定”方法的一般方法如下。实体A通过将DDD序列与A的前体连接来构建,产生在下文称为a的第一组分。因为DDD序列将影响二聚体的自发形成,因此A由a2构成。实体B通过将AD序列与B的前体连接来构建,产生在下文称为b的第二组分。a2中含有的DDD的二聚体基序将产生用于结合b中含有的AD序列的停靠位点,从而促进a2和b的易于缔合以形成由a2b构成的二组分三聚体复合物。该结合事件通过随后反应以经由二硫桥共价束缚两个实体而成为不可逆的,这基于有效局部浓度的原理而非常有效地发生,因为最初的结合相互作用将使置于DDD和AD上的反应性硫醇基靠近(Chimura等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001;98:8480)以位点特异性地连接。
通过连接远离两个前体的官能团的DDD和AD,这种位点特异性连接也预期保留两个前体的原始活性。该方法在性质上是模块化的,并且可潜在地应用于位点特异性且共价地连接多种物质,包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段和具有广泛活性的其它效应物部分。利用下文实施例中描述的构建AD和DDD缀合的效应物的融合蛋白方法,可以将实际上任何蛋白或肽并入DNL构建体。然而,该技术不是限制性的并且可以利用其它缀合方法来将其它类型的分子连接在一起。
已知多种方法用于制备融合蛋白,包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成双链核酸。此类双链核酸可以通过标准分子生物学技术插入用于产生融合蛋白的表达载体(参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning,A laboratory manual,第2版,1989)。在此类优选实施方案中,AD和/或DDD部分可以连接至效应蛋白或肽的N末端或C末端。然而,本领域技术人员将了解,AD或DDD部分与效应物部分的连接位点可以改变,取决于效应物部分的化学性质以及效应物部分中参与其生理活性的部分。多种效应物部分的位点特异性连接可以使用本领域已知的技术来进行,例如使用二价交联试剂和/或其它化学缀合技术。
DNL序列变体
在替代实施方案中,AD和/或DDD部分的序列变体可以用于构建DNL复合物。AD和DDD结构域的结构-功能关系已经成为考察的主题(参见,例如Burns-Hamuro等人,2005,Protein Sci 14:2982-92;Carr等人,2001,J Biol Chem 276:17332-38;Alto等人,2003,ProcNatl Acad Sci USA 100:4445-50;Hundsrucker等人,2006,Biochem J396:297-306;Stokka等人,2006,Biochem J 400:493-99;Gold等人,2006,Mol Cell 24:383-95;Kinderman等人,2006,Mol Cell24:397-408)。
例如,Kinderman等人(2006)检查了AD-DDD结合相互作用的晶体结构,并且得出结论:人DDD序列含有许多对于二聚体形成或AKAP结合而言重要的保守氨基酸残基,在下文SEQ ID NO:15中加下划线(参见Kinderman等人,2006的图l,通过引用并入本文)。本领域技术人员将了解,在设计DDD序列的序列变体时,将期望避免改变任何加下划线的残基,而可以对二聚化和AKAP结合不太重要的残基进行保守的氨基酸取代。
来自蛋白激酶A的人DDD序列
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO:15)
Alto等人(2003)进行各种AKAP蛋白的AD序列的生物信息分析以设计称为AKAP-IS(SEQ ID NO:17)的RII选择性AD序列,对DDD的结合常数为0.4nM。将AKAP-IS序列设计为AKAP结合至PKA的肽拮抗剂。当取代趋向于减弱对DDD结合的AKAP-IS序列中的残基在SEQ ID NO:17中加下划线。
AKAP-IS序列
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:17)
同样,Gold(2006)利用了结晶学和肽筛选来开发SuperAKAP-IS序列(SEQ ID NO:39),其对PKA的RII同种型表现出与RI同种型相比高5个数量级的选择性。加下划线的残基指示相对于AKAP-IS序列的氨基酸取代位置,所述氨基酸取代增加了对RIIα的DDD部分的结合。在该序列中,将N末端Q残基编号为残基号4,而C末端A残基是残基号20。可以被取代以影响对RIIα亲和力的残基是残基8、11、15、16、18、19和20(Gold等人,2006)。在某些替代实施方案中,预期可以用SuperAKAP-IS序列取代AKAP-IS AD部分序列以制备DNL构建体。可以取代AKAP-IS AD序列的其它替代序列显示于SEQ ID NO:40-42。相对于AKAP-IS序列的取代被加下划线。与AKAP-IS序列(SEQ ID NO:17)一样,预期AD部分还可以包括其它N末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C末端残基甘氨酸和半胱氨酸,如示于SEQ ID NO:18中。
SuperAKAP-IS
QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ ID NO:39)
替代的AKAP序列
QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO:40)
QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO:41)
QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO:42)
Stokka等人(2006)还开发了AKAP与PKA结合的肽竞争剂,示于SEQ ID NO:43-45。肽拮抗剂被命名为Ht31(SEQ ID NO:43)、RIAD(SEQ ID NO:44)和PV-38(SEQ ID NO:45)。Ht-31肽表现出对PKA的RII同种型更高的亲和力,而RIAD和PV-38显示对RI更高的亲和力。
Ht31
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO:43)
RIAD
LEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO:44)
PV-38
FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQ ID NO:45)
Hundsrucker等人(2006)还开发了AKAP与PKA结合的其它肽竞争剂,对PKA的RII形式的DDD的结合常数低至0.4nM。各种AKAP拮抗肽的序列提供于Hundsrucker等人的表1(通过引用并入本文)。不同AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基在下文通过参考AKAPIS序列加下划线来指示。残基与Alto等人(2003)观察到的相同,添加了C末端丙氨酸残基(参见Hundsrucker等人(2006)的图4,通过引用并入本文)。对RII DDD序列具有特别高的亲和力的肽拮抗剂的序列示于SEQ ID NO:46-48。
AKAP-IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:17)
AKAP7δ-wt-pep
PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO:46)
AKAP7δ-L304T-pep
PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO:47)
AKAP7δ-L308D-pep
PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY(SEQ ID NO:48)
Carr等人(2001)检查了来自人和非人蛋白质的不同AKAP-结合DDD序列之间的序列同源性程度和DDD序列中鉴定了在不同DDD部分中表现出最高度保守的残基。这些在下文通过参考SEQ IDNO:15的人PKARIIαDDD序列加下划线来指示。特别保守的残基通过斜体来进一步指示。与Kinderman等人(2006)提出的那些重叠但不相同的残基对于AKAP蛋白的结合是重要的。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEF4VEYFTRLREARA(SEQ ID NO:15)
本领域技术人员将了解,一般而言,这些在来自不同蛋白质的DDD和AD序列中高度保守的氨基酸残基是可以优选在制备氨基酸取代中保持恒定的残基,然而不太高度保守的残基可以更容易改变以产生本文所述的AD和/或DDD序列的序列变体。
基于scFv的AD模块
替代实施方案可涉及将基于scFV的AD模块用于与基于DDD2(SEQ ID NO:16)的细胞因子或RNA酶配对以产生较小的DNL缀合物。较小尺寸的DNL构建体可促进进入实体瘤的渗透。我们已通过用在每个多肽链的羧基末端的6-His标记(SEQ ID NO:51)表达包含互补可变结构域的两个分离的多肽链来制备数种基于scFv的双特异性抗体类型。相同方法可用于产生基于scFv的AD模块,通过用AD序列或AD-HHHHHH序列(SEQ ID NO:51)替代一个或两个6-His标记(SEQ ID NO:51)。我们也可融合具有不同AD序列(例如AD2(SEQ ID NO:18)和AD3(SEQ ID NO:49))的每种多肽链,其允许其同源DDD序列的特异性识别,由此提供最终DNL缀合物的更多复合性。下表1提供了此类基于scFv的DNL构建体的非详尽性列表。
表1.基于scFv的DNL构建体
构型 | ScFv-AD | MW(kDa) | 注释 | |
BS2 | I | VH1-VL2-AD2 | 30 | 双特异性,1x1 |
VH2-VL1 | 25 | |||
II | VH1-VL2-AD2 | 30 | ||
VH2-VL1-AD2 | 30 | |||
III | VH1-VL2-AD2 | 30 | ||
VH2-VL1-AD3 | 30 | |||
“DVD” | I | VH1-VH2-AD2 | 30 | 双特异性,1x1 |
VL1-VL2 | 25 | |||
II | VH1-VH2-AD2 | 30 | ||
VL2-VL1-AD2 | 30 | |||
III | VH1-VH2-AD2 | 30 | ||
VL2-VL1-AD3 | 30 | |||
BS6 | I | VH1-VL1-VH2-AD2 | 45 | 双特异性,2x1 |
VL2-VH1-VL1 | 40 | |||
II | VH1-VL1-VH2-AD2 | 45 | ||
VL2-VH1-VL1-AD2 | 45 | |||
III | VH1-VL1-VH2-AD2 | 45 | ||
VL2-VH1-VL1-AD3 | ||||
BS8 | I | VH1-VH1-VH2-AD2 | 45 | 双特异性,2x1 |
VL2-VL1-VL1 | 40 | |||
II | VH1-VH1-VH2-AD2 | 45 | ||
VL2-VL1-VL1-AD2 | 45 | |||
III | VH1-VH1-VH2-AD2 | 45 | ||
VL2-VL1-VL1-AD3 | 45 | |||
BS18 | I | VH1-CH1-VH2-AD2 | 55 | |
VL1-CL-VL2 | 50 | |||
II | VH1-CH1-VH2-AD2 | 55 | ||
VL1-CL-VL2-AD2 | 55 | |||
III | VH1-CH1-VH2-AD2 | 55 | ||
VL1-CL-VL2-AD3 | 55 | |||
TS | I | VH1-VH2-VH3-AD2 | 45 | 三特异性,1x1x1 |
VL3-VL2-VL1 | 40 | |||
II | VH1-VH2-VH3-AD2 | 45 | ||
VL3-VL2-VL1-AD2 | 45 | |||
III | VH1-VH2-VH3-AD2 | 45 | ||
VL3-VL2-VL1-AD3 | 45 |
设计I型以连接一个DDD2(SEQ ID NO:16)模块对。设计II型以连接两个相同或不同的DDD2模块对。设计III型以连接一个DDD2模块对和一个DDD3(SEQ ID NO:50)模块对。设计两个多肽链以用反平行方式缔合。
预靶向
双特异性或多特异性抗体可以用于预靶向技术。预靶向是多步骤过程,最初被发展来解决直接靶向抗体的缓慢血液清除,这种缓慢血液清除促成对正常组织(例如骨髓)的不期望的毒性。使用预靶向,放射性核素或其它治疗剂与在数分钟内从血液中清除的小的递送分子(可靶向构建体或可靶向构建体)连接。首先施用具有可靶向构建体以及靶抗原的结合位点的预靶向双特异性或多特异性抗体,使得游离抗体从循环中清除,然后施用可靶向构建体。
预靶向方法公开于例如Goodwin等人,美国专利No.4,863,713;Goodwin等人,J.Nucl.Med.29:226,1988;Hnatowich等人,J.Nucl.Med.28:1294,1987;Oehr等人,J.Nucl.Med.29:728,1988;Klibanov等人,J.Nucl.Med.29:1951,1988;Sinitsyn等人,J.Nucl.Med.30:66,1989;Kalofonos等人,J.Nucl.Med.31:1791,1990;Schechter等人,Int.J.Cancer 48:167,1991;Paganelli等人,Cancer Res.51:5960,1991;Paganelli等人,Nucl.Med.Commun.12:211,1991;美国专利No.5,256,395;Stickney等人,Cancer Res.51:6650,1991;Yuan等人,Cancer Res.51:3119,1991;美国专利No.6,077,499、7,011,812、7,300,644、7,074,405、6,962,702、7,387,772、7,052,872、7,138,103、6,090,381、6,472,511、6,962,702、6,962,702、7,074,405和美国序列No.10/114,315(现在已弃权);将所述每篇专利的实施例部分通过引用并入本文。
治疗或诊断受试者中疾病或病症的预靶向方法可以通过以下步骤提供:(1)向受试者施用双特异性抗体或抗体片段;(2)任选地向受试者施用清除组合物,并使得组合物从循环中清除抗体;和(3)向受试者施用可靶向构建体,所述可靶向构建体含有一种或多种螯合的或化学结合的治疗剂或诊断剂。该项技术通过施用缀合于可靶向构建体的酶、然后施用可被酶转化成活性形式的前药,还可用于抗体依赖性酶前药疗法(ADEPT)。
Avimer
在某些实施方案中,本文所述的结合部分可包含一个或多个avimer序列。Avimer是一类在对各种靶分子的亲和力和特异性方面与抗体几分类似的结合蛋白。其通过体外外显子改组和噬菌体展示由人胞外受体结构域发展(Silverman等人,2005,Nat.Biotechnol.23:1493-94;Silverman等人,2006,Nat.Biotechnol.24:220)。所得多结构域蛋白可包含多个独立结合结构域,其相比于单表位结合蛋白可表现出提高的亲和力(在一些情况下,亚纳摩尔)和特异性(同上)。在各种实施方案中,avimer可连接至例如用于所要求保护的方法和组合物的DDD和/或AD序列。涉及构建和使用avimer的方法的额外细节公开于例如美国专利申请公布No.20040175756(现在已弃权)、20050048512(现在已弃权)、20050053973(现在已弃权)、20050089932和20050221384(现在已弃权),每篇专利申请的实施例部分通过引用并入本文。
噬菌体展示
所要求保护的组合物和/或方法的某些实施方案可涉及各种靶分子、细胞或组织的结合肽和/或肽模拟物。结合肽可通过本领域已知的任何方法来鉴定,所述方法包括但不限于噬菌体展示技术。噬菌体展示的各种方法和产生不同群体的肽的技术是本领域熟知的。例如,美国专利No.5,223,409、5,622,699和6,068,829公开了用于制备噬菌体库的方法。噬菌体展示技术包括基因操作噬菌体以使小肽可在其表面上表达(Smith和Scott,1985,Science 228:1315-1317;Smith和Scott,1993,Meth.Enzymol.21:228-257)。除肽之外,较大蛋白结构域例如单链抗体也可展示在噬菌体颗粒的表面上(Arap等人,1998,Science279:377-380)。
对给定器官、组织、细胞类型或靶分子有选择性的靶向氨基酸序列可通过淘选来分离(Pasqualini和Ruoslahti,1996,Nature380:364-366;Pasqualini,1999,The Quart.J.Nucl.Med.43:159-162)。简言之,将包含假定靶向肽的噬菌体文库施用于完整器官或离体器官、组织、细胞类型或靶分子并且收集包含结合噬菌体的样品。结合于靶的噬菌体可从靶器官、组织、细胞类型或靶分子洗提并且然后通过使它们生长在宿主细菌中来扩增。
在某些实施方案中,可在宿主细菌中于淘选轮次之间繁殖噬菌体。未被噬菌体溶解,相反,细菌可分泌展示出特定插入物的多个噬菌体拷贝。如果需要,可将经扩增的噬菌体再次暴露于靶器官、组织、细胞类型或靶分子,并且收集用于另外的淘选轮次。可进行多个淘选轮次直至获得选择性或特异性结合剂群体。肽的氨基酸序列可通过对相应于噬菌体基因组中的靶向肽插入物的DNA进行测序来确定。然后所鉴定的靶向肽可通过标准蛋白化学技术以合成肽形式产生(Arap等人,1998,Smith等人,1985)。
在一些实施方案中,削减方案可用于进一步减少背景噬菌体结合。削减的目的是为了从结合于靶而不是目标靶的文库中去除噬菌体。在替代实施方案中,可针对对照细胞、组织或器官预筛选噬菌体文库。例如,可在针对对照正常细胞系的文库预筛选后鉴定肿瘤-结合肽。削减后,可针对目标分子、细胞、组织或器官筛选文库。削减方案的其它方法是已知的并且可用于实施所要求保护的方法,例如如公开于美国专利No.5,840,841、5,705,610、5,670,312和5,492,807中的方法。
适体
在某些实施方案中,使用的靶向部分可以是适体。构建和测定适体的结合特性的方法是本领域熟知的。例如,此类技术描述于美国专利No.5,582,981、5,595,877和5,637,459中,每篇专利的实施例部分通过引用并入本文。用于制备和筛选结合于特定的目标靶的适体的方法是熟知的,例如美国专利No.5,475,096和美国专利No.5,270,163,每篇专利的实施例部分通过引用并入本文。
适体可通过任何已知方法(包括合成、重组和纯化方法)来制备,并且可单独使用或与对同一靶具有特异性的其它适体组合使用。一般而言,最小为约3个核苷酸、优选至少5个核苷酸对于实现特异性结合是必需的。短于10个碱基的序列的适体可以是适宜的,尽管10、20、30或40个核苷酸的适体是优选的。
适体可被分离、测序和/或扩增或合成为常规DNA或RNA分子。可选地,目标适体可包含经修饰的寡聚体。通常存在于适体中的任何羟基基团可被膦酸基、磷酸基替换,可被标准保护基团保护,或被激活以制备与其它核苷酸的另外键合,或可缀合于固体载体。一个或多个磷酸二酯键合可被替代性连接基团替换,例如P(O)O被P(O)S、P(O)NR2、P(O)R、P(O)OR'、CO或CNR2替换,其中R是H或烷基(1-20C)且R'是烷基(1-20C);此外,该基团可经由O或S连接至相邻核苷酸。寡聚体中的所有键合不必是相同的。
治疗剂和诊断剂
在某些实施方案中,本文所述的抗体、抗体片段或融合蛋白可作为“裸”抗体、片段或融合蛋白单独地施用。在替代实施方案中,抗体、片段或融合蛋白可在至少一种其它治疗剂之前、同时或之后施用。在其它替代实施方案中,抗体、片段或融合蛋白可共价地或非共价地连接至至少一种治疗剂和/或诊断剂以形成免疫缀合物。
治疗剂优选选自:放射性核素、免疫调节剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、药物、前药、酶、寡核苷酸、促细胞凋亡剂、干扰RNA、光活性治疗剂、细胞毒性剂(可为化疗剂或毒素)及其组合。使用的药物可具有选自抗有丝分裂剂、抗激酶、烷基化、抗代谢物、抗生素、生物碱、抗-血管生成剂、促细胞凋亡剂及其组合的药物性质。
使用的示例性药物包括但不限于5-氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、COX-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱(camptothecan)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、2-二氢吡咯多柔比星(2P-DOX)、氰基-吗啉代多柔比星、葡糖苷酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、雌莫司汀、表鬼臼毒素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基蛋白转化酶抑制剂、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天门冬酰胺酶、来那度胺、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨喋呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、亚硝基脲(nitrosurea)、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链佐星(streptozocin)、他莫昔芬、泰素、替莫唑胺(DTIC的含水形式)、反铂(transplatinum)、沙利度胺、硫鸟嘌呤、硫替派、替尼泊苷、托泊替康、乌拉莫司汀、长春瑞滨、长春碱、长春新碱和长春花生物碱。
使用的毒素可包括蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶),例如豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。
使用的免疫调节剂可选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素及其组合。特别有用的是淋巴毒素例如肿瘤坏死因子(TNF)、造血因子例如白细胞介素(IL)、集落刺激因子例如粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素例如干扰素-α、-β或-γ以及干细胞生长因子例如命名为“S1因子”的干细胞生长因子。细胞因子中包括生长激素例如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素;甲状旁腺激素;甲状腺素;胰岛素;胰岛素原;松弛素;松弛素原;糖蛋白激素例如卵泡刺激素(FSH)、甲状腺刺激素(TSH)和黄体生成素(LH);肝细胞生长因子;前列腺素、成纤维生长因子;催乳素;胎盘催乳素、OB蛋白;肿瘤坏死因子-α和-β;苗勒抑制物质(mullerian inhibiting substance);鼠促性腺激素相关肽;抑制素;激活素;血管内皮生长因子;整合素;血小板生成素(TPO);神经生长因子例如NGF-β;血小板生长因子;转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β;胰岛素样生长因子-I和-II;红细胞生成素(EPO);骨诱导因子;干扰素例如干扰素-α、-β和-γ;集落刺激因子(CSF)例如巨噬细胞-CSF(M-CSF);白细胞介素(IL)例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12;IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit配体或FLT-3、血管生长抑素、血小板反应蛋白、内皮抑制素、肿瘤坏死因子和LT。如本文所用的,术语细胞因子包括来自天然来源或重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等效形式。
使用的趋化因子包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-Β和IP-10。
可用于治疗患病组织的放射性同位素包括但不限于111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、99Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、198Au、199Au和211Pb。治疗性放射性核素优选具有在20至6,000keV范围内的衰变能,俄歇发射体的衰变能优选为60至200keV范围内,β发射体的衰变能优选为100-2,500keV,α发射体的衰变能优选为4,000-6,000keV。有用的β粒子辐射核素的最大衰变能优选为20-5,000keV,更优选地为100-4,000keV,最优选地为500-2,500keV。基本上通过辐射俄歇粒子进行衰变的放射性核素也是优选的。例如,Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、1-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有用的β粒子辐射核素的衰变能优选为<1,000keV,更优选地为<100keV,最优选地为<70keV。基本上通过产生α粒子进行衰变的放射性核素也是优选的。此类放射性核素包括但不限于:Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有用的α粒子辐射的放射性核素的衰变能优选为2,000-10,000keV,更优选地为3,000-8,000keV,最优选地为4,000-7,000keV。使用的其它潜在放射性同位素包括11C、13N、15O、75Br、198Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、225Ac、76Br、169Yb等。某些有用的诊断核素可包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94Tc、94mTc、99mTc或111In。在某些实施方案中,抗-IGF-1R抗体例如hR1可用于与使肿瘤对放射疗法致敏的治疗性放射性核素组合(参见,例如Allen等人,2007,Cancer Res.67:1155)。
治疗剂可包括光敏试剂或染料。已使用荧光组合物例如荧光染料和其它发色团或染料(例如对可见敏感的卟啉)来检测和治疗病变,即用合适的光照射病变部位。在治疗中,这称为光辐射、光疗或光动力疗法。参见Jori等人(编),PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORSAND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985);van den Bergh,Chem.Britain(1986),22:430。此外,已将单克隆抗体与光敏染料偶联,用于进行光疗。参见Mew等人,J.Immunol.(1983),130:1473;idem.,Cancer Res.(1985),45:4380;Oseroff等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986),83:8744;idem.,Photochem.Photobiol.(1987),46:83;Hasan等人,Prog.Clin.Biol.Res.(1989),288:471;Tatsuta等人,LasersSurg.Med.(1989),9:422;Pelegrin等人,Cancer(1991),67:2529。
皮质类固醇激素可增加其它化疗剂的效力,由此它们常用于组合治疗。泼尼松和地塞米松是皮质类固醇激素的实例。
在某些实施方案中,还可使用抗血管生成剂例如血管生长抑素(angiostatin)、baculostatin、血管能抑素(canstatin)、乳腺丝抑蛋白(maspin)、抗-胎盘生长因子(PlGF)肽和抗体、抗-血管生长因子抗体(例如抗-VEGF和抗-PlGF)、抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体和肽、抗-Kras抗体、抗-cMET抗体、抗-MIF(巨噬细胞迁移-抑制因子)抗体、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白介素-12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相关蛋白、羧酰胺三唑(carboxiamidotriazole)、CM101、马立马司他(Marimastat)、戊聚糖多硫酸盐、血管生成素-2、干扰素α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利诺胺(Linomide)、沙利度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑制素、紫杉醇、accutin、血管生长抑素、西多福韦、长春新碱、博莱霉素、AGM-1470、血小板因子4或米诺环素。
其它有用的治疗剂可包括寡核苷酸,特别是优选针对癌基因和癌基因产物例如bcl-2的反义寡核苷酸。
诊断剂优选选自放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记物、化学发光标记物、超声造影剂和光敏试剂。此类诊断剂是熟知的并且可使用任何此类已知的诊断剂。诊断剂的非限定性实例可包括放射性核素例如110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr或其它γ、β或正电子发射体。使用的顺磁离子可包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。超声造影剂可包括脂质体例如气体填充的脂质体。不透射线的诊断剂可选自化合物、钡化合物、镓化合物和铊化合物。许多种荧光标记物在本领域是已知的,包括但不限于异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。使用的化学发光标记物可包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶盐或草酸酯。
免疫缀合物
本文所述的任何抗体、抗体片段或抗体融合蛋白可缀合于一种或多种治疗剂或诊断剂。治疗剂不需要相同但可以不同,例如药物和放射性同位素。例如,131I可并入到抗体或融合蛋白的酪氨酸和连接至赖氨酸残基的ε氨基的药物。治疗剂和诊断剂也可连接至例如还原型SH基团和/或连接至碳水化合物侧链。很多利用抗体或融合蛋白制备治疗剂或诊断剂的共价或非共价缀合物的方法是本领域已知的并且可以利用任何此类已知方法。
例如,可经由二硫键形成在还原的抗体组分的铰链区连接治疗剂或诊断剂。可选地,可使用异型双功能交联试剂例如N-琥珀酰基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)连接此类试剂。Yu等人,Int.J.Cancer56:244(1994)。用于这样的缀合的一般技术在本领域是熟知的。参见,例如Wong,CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION ANDCROS S-LINKING(CRC Press 1991);Upeslacis等人,“Modification ofAntibodies by Chemical Methods”,于MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS,Birch等人(编),第187-230页(Wiley-Liss,Inc.1995);Price,“Production and Characterization ofSynthetic Peptide-Derived Antibodies”,于MONOCLONALANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERING AND CLINICALAPPLICATION,Ritter等人(编),第60-84页(Cambridge UniversityPress 1995)。可选地,可经由抗体的Fc区域中的碳水化合物部分缀合治疗剂或诊断剂。碳水化合物基团可用于增加与巯基结合的相同试剂的载量,或碳水化合物部分可用于结合不同的治疗剂或诊断剂。
用于经由抗体碳水化合物部分将肽缀合至抗体组分的方法对于本领域技术人员而言是熟知的。参见,例如Shih等人,Int.J.Cancer41:832(1988);Shih等人,Int.J.Cancer46:1101(1990);和Shih等人,美国专利No.5,057,313,所述专利的实施例部分通过引用并入本文。一般方法包括将具有氧化的碳水化合物部分的抗体组分与具有至少一个游离胺功能的载体聚合物反应。该反应产生初始希夫碱(亚胺)键合,可通过还原成仲胺而稳定所述连接以形成终缀合物。
如果用作免疫缀合物的抗体组分的抗体为抗体片段,则Fc区域可以不存在。然而,可能将碳水化合物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区。参见,例如Leung等人,J.Immunol.154:5919(1995);美国专利No.5,443,953和6,254,868,所述专利的实施例部分通过引用并入本文。使用工程化的碳水化合物部分连接治疗剂或诊断剂。
在一些实施方案中,螯合剂可连接至抗体、抗体片段或融合蛋白或连接至可靶向构建体并且用于螯合治疗或诊断剂例如放射性核素。示例性螯合剂包括但不限于DTPA(例如Mx-DTPA)、DOTA、TETA、NETA或NOTA。缀合和使用螯合剂以连接金属或其它配体和蛋白质的方法是本领域熟知的(参见,例如美国专利申请No.7,563,433,所述专利的实施例部分通过引用并入本文)。
在某些实施方案中,可通过与具有长尾的试剂反应来将放射性金属或顺磁离子连接至蛋白质或肽,可将多个用于结合离子的螯合基团连接至所述长尾。这样的尾可以是聚合物例如多聚赖氨酸、多糖或其它具有侧基的衍生或可衍生链,所述侧基可结合螯合基团,例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双-缩氨基硫脲、聚肟(polyoxime)和已知可用于此用途的类似基团。
可将螯合剂直接连接至抗体或肽,例如如美国专利4,824,659(其通过引用并入本文)中公开的。特别有用的金属-螯合剂组合包括与在60至4,000keV的一般能量范围内的用于放射性成像(radioimaging)的诊断同位素(例如125I、131I、123I、124I、62Cu、64Cu、18F、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、11C、13N、15O、76Br)一起使用的2-苄基-DTPA及其单甲基和环己基类似物。当与非放射性金属例如锰、铁和钆复合时,相同螯合剂可用于MRI。大环螯合剂,如NOTA、DOTA和TETA,可用于多种金属和射电金属,特别是分别用于镓、钇和铜放射性核素。通过根据目标金属调节环的大小,可使此类金属-螯合剂复合物非常稳定。可包括其它环类型的螯合剂,例如大环聚酯,其被关注用于稳定地结合核素例如223Ra(对于RAIT)。
最近,已公开了用于PET扫描技术的18F-标记的方法,例如通过F-18与金属或其它原子例如铝的反应来进行。可将18F-Al缀合物与螯合基团例如DOTA、NOTA或NETA复合,所述使螯合基直接连接至抗体或在预靶向方法中用于标记可靶向构建体。这样的F-18标记技术公开于美国专利No.7,563,433中,所述专利的实施例部分通过引用并入本文。
治疗性治疗的方法
各种实施方案涉及治疗受试者例如哺乳动物(包括人、家养或伴侣宠物,如狗和猫)中的癌症的方法,该方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体、片段或融合蛋白。在优选的实施方案中,该抗体或片段是抗-IGF-1R MAb。在某些实施方案中,该疗法可利用不具有与其结合的治疗剂的“裸抗体”。
“裸”抗-IGF-1R抗体的施用可通过同时或相继施用治疗有效量的另一个“裸抗体”(其结合于靶细胞表面上的另一个抗原或与所述另一个抗原具有反应性)来加以补充。优选的另外MAb包含至少一个选自以下的人源化、嵌合或人Mab:与CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD95、CD126、CD133、CD138、CD154、CEACAM5、CEACAM6、B7、AFP、PSMA、EGP-1、EGP-2、碳酸酐酶IX、PAM4抗原、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、Ia、MIF、HM1.24、HLA-DR、生腱蛋白、Flt-3、VEGFR、PlGF、ILGF、IL-6、IL-25、生腱蛋白、TRAIL-R1、TRAIL-R2、补体因子C5、癌基因产物或其组合具有反应性的MAb。
单独或与其它裸Mab组合的裸抗-IGF-1R疗法可进一步通过同时或相继施用至少一种治疗剂加以补充,如上所论述的。多重模型疗法可包括用裸抗-IGF-1R抗体的疗法,其通过施用裸抗体、融合蛋白的形式或作为免疫缀合物的抗-CD22、抗-CD19、抗-CD20、抗-CD21、抗-CD74、抗-CD80、抗-CD23、抗-CD45、抗-CD46、抗-MIF、抗-EGP-1、抗-CEACAM5、抗-CEACAM6、PAM4或抗-HLA-DR(包括不变链)抗体加以补充。裸抗-IGF-1R抗体或其片段还可补充有针对MUC1或MUC5抗原的裸抗体。使用的各种抗体例如抗-CD19、抗-CD20和抗-CD22抗体对于本领域技术人员而言是已知的。参见,例如Ghetie等人,Cancer Res.48:2610(1988);Hekman等人,Cancer Immunol.Immunother.32:364(1991);Longo,Curr.Opin.Oncol.8:353(1996),美国专利No.5,798,554、6,187,287、6,306,393、6,676,924、7,109,304、7,151,164、7,230,084、7,230,085、7,238,785、7,238,786、7,282,567、7,300,655、7,312,318、7,612,180、7,501,498和美国专利申请公布No.20080131363、20080089838、20070172920、20060193865和20080138333;每篇的实施例部分通过引用并入本文。
在另一种多重模型疗法的形式中,受试者接受与标准癌症化疗相结合的裸抗-IGF-1R抗体和/或免疫缀合物。例如,"CVB"(1.5g/m2环磷酰胺、200-400mg/m2依托泊苷和150-200mg/m2卡莫司汀)是用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的方案。Patti等人,Eur.J.Haematol.51:18(1993)。其它适合的组合化疗方案对于本领域技术人员而言是熟知的。参见,例如Freedman等人,"Non-Hodgkin's Lymphomas",于CANCER MEDICINE,第2卷,第3版,Holland等人(编),第2028-2068页(Lea&Febiger 1993)。作为例子,用于治疗中度非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化学治疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、丙卡巴肼和泼尼松)和CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)。有用的第二代化学治疗方案是m-BACOD(甲氨喋呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松和亚叶酸),而适当的第三代方案是MACOP-B(甲氨喋呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素和亚叶酸)。其它有用的药物包括苯基丁酸盐、苯达莫司汀和苔藓抑素-1。在优选的多重模型疗法中,化疗药物和细胞因子两者与根据本发明的抗体、免疫缀合物或融合蛋白共施用。细胞因子、化疗药物和抗体或免疫缀合物可以任意顺序施用或一起施用。
可按已知方法配制免疫缀合物或裸抗体以制备药学上有用的组合物,由将免疫缀合物或裸抗体与药学上适宜的赋形剂组合在混合物中。无菌的磷酸盐缓冲液即为药学上适宜的赋形剂的一个实例。其它适当的赋形剂对本领域技术人员而言是熟知的。参见,例如,Ansel等人,PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUGDELIVERY SYSTEMS,第5版(Lea&Febiger 1990),和Gennaro(编),REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版(MackPublishing Company 1990),及其修订版本。
可将本发明的免疫缀合物或裸抗体配制用于静脉内施用,通过例如推注注射或连续输注。优选在短于约4小时的时期内,更优选短于约3小时的时期内输注本发明的抗体。例如,可在30分钟内,优选甚至15分钟内输注前25-50mg,在随后的2-3小时内输注剩余部分。注射用制剂可以单位剂量形式,例如在安瓿中或者在多剂量容器中提供并且添加防腐剂。组合物可采用例如在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式,并且可含有配制剂(formulatory agent)例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选择地,活性成分可呈粉剂形式,用于在使用前用适当的媒介物(例如无菌无热原水)配制。
可将其它制药方法用于控制治疗或诊断缀合物或裸抗体的作用持续时间。控释制剂可通过使用聚合物复合或者吸附免疫缀合物或裸抗体来制备。例如,生物相容性聚合物包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物基质和硬脂酸二聚体和癸二酸的聚酸酐共聚物基质。Sherwood等人,Bio/Technology 10:1446(1992)。免疫缀合物或抗体从此基质上释放的速率取决于该免疫缀合物或抗体的分子量、基质内的免疫缀合物或抗体的量和分散粒子的大小。Saltzman等人,Biophys.J.55:163(1989);Sherwood等人,同上。其它固体剂型描述于Ansel等人,PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS,第5版(Lea&Febiger 1990),和Gennaro(编),REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版(MackPublishing Company 1990),及其修订版本。
还可将免疫缀合物、抗体融合蛋白或裸抗体皮下或甚至通过其它胃肠外途径施用至哺乳动物。此外,可通过连续输注或通过单次或多次推注进行施用。优选,在短于约4小时的时期内,更优选在短于约3小时的时期内输注抗体。
更常见,用于人的免疫缀合物、抗体融合蛋白或裸抗体的施用剂量取决于诸如患者年龄、体重、身高、性别、一般医疗条件和既往医疗史等因素而变化。可能需要向接受者提供约1mg/kg至25mg/g范围内的免疫缀合物、抗体融合蛋白或裸抗体的剂量作为单次静脉内输注,但是也可根据情况需要施用更低或更高的剂量。对于70kg患者按1-20mg/kg施用的剂量例如为70-1,400mg,或对于1.7米的患者,剂量为41-824mg/m2。可按需要重复此剂量,例如,每周一次,持续4-10周,或每周一次,持续8周或每周一次,持续4周。还可以更低的频率给药,例如每隔一周一次,持续数月,或每月一次或每季度一次,持续多个月,如维持疗法中所需的。
可选择地,可以每2或3周作为一个剂量施用抗体例如裸抗-IGF-1R,重复总共至少3个剂量。或者,每周施用两次所述抗体,持续4-6周。如果将剂量减少至约200-300mg/m2(每个剂量340mg(对于1.7米的患者)或4.9mg/kg(对于70kg的患者)),可每周施用一次或甚至二次,持续4至10周。可选择地,可减少疗程剂量,即每2或3周一次,持续2-3个月。然而,已确定可以通过缓慢的静脉内输注施用甚至更高的剂量(例如每周一次或每2-3周一次20mg/kg),进行重复的给药循环。可以任选地以其它间隔重复给药方案,并且可通过不同胃肠外途径(对剂量和治疗方案进行适当的调整)提供剂量。
在优选的实施方案中,抗-IGF-1R抗体用于癌症的治疗。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤以及白血病、骨髓瘤或淋巴样恶性肿瘤(lymphoid malignancies)。下文中指出此类癌症的更具体的实例,包括:鳞状细胞癌(例如,上皮鳞状细胞癌)、尤因肉瘤、维尔姆斯瘤、星形细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌(gastric cancer)或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、肝细胞癌、神经内分泌瘤、甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer)、分化的甲状腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌症或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾癌(renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如,其细胞还未迁移至除了原始恶性肿瘤或肿瘤的位置外的受试者的身体的位置的恶性细胞或肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如,通过恶性细胞或肿瘤细胞至与原始肿瘤的位置不同的继发性位置的转移、迁移产生的恶性细胞或肿瘤)。适合于本发明的治疗方法的癌症包括表达、过表达或异常表达IGF-1R的细胞。
癌症或恶性肿瘤的其它实例包括但不限于:儿童急性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病(AcuteLymphocytic Leukemia)、急性髓样白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性髓样白血病、成人霍奇金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞白血病、成人非-霍奇金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS-相关淋巴瘤、AIDS-相关恶性肿瘤、直肠癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、肾盂和输尿管的癌症、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤(Cerebellar Astrocytoma)、脑星形细胞瘤(Cerebral Astrocytoma)、宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性淋巴母细胞白血病(Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia)、儿童急性髓样白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤(ChildhoodCerebellar Astrocytoma)、儿童小脑星形细胞瘤、儿童颅外生殖细胞肿瘤(Childhood Extracranial Germ Cell Tumors)、儿童霍奇金氏病(Childhood Hodgkin's Disease)、儿童霍奇金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童淋巴细胞白血病(Childhood LymphoblasticLeukemia)、儿童髓母细胞瘤(Childhood Medulloblastoma)、儿童非-霍奇金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌症、室管膜瘤、上皮癌、食管癌、尤因肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外胚细胞瘤(ExtracranialGerm Cell Tumor)、性腺外生殖细胞瘤(Extragonadal Germ CellTumor)、肝外胆管癌、眼癌、雌性乳腺癌、高歇氏病(Gaucher's Disease)、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌(Gastrointestinal Carcinoid Tumor)、胃肠瘤(Gastrointestinal Tumors)、生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、多毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症(Hypergammaglobulinemia)、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波西氏肉瘤、肾癌、喉癌、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴组织增殖性疾病(Lymphoproliferative Disorders)、巨球蛋白血症、雄性乳腺癌、恶性间皮瘤(Malignant Mesothelioma)、恶性胸腺瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、转移性原发性鳞状颈癌(Metastatic Occult Primary Squamous Neck Cancer)、转移性原发性鳞状颈癌(Metastatic Primary Squamous Neck Cancer)、转移性鳞状颈癌(Metastatic Squamous Neck Cancer)、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、髓细胞性白血病(MyelogenousLeukemia)、髓样白血病(Myeloid Leukemia)、骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻窦癌(Nasal Cavity and Paranasal Sinus Cancer)、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非-霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌(Occult Primary Metastatic Squamous NeckCancer)、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮性癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤(Ovarian Low Malignant PotentialTumor)、胰腺癌、副蛋白血症(Paraproteinemias)、真性红细胞增多症、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(Primary Central Nervous System Lymphoma)、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌(Renal Pelvis and UreterCancer)、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、涎腺癌、肉状瘤病肉瘤、赛扎里氏综合征(Sezary Syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌(Squamous Neck Cancer)、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌(Transitional Cell Cancer of the Renal Pelvisand Ureter)、肾盂和输尿管移行细胞癌(Transitional Renal Pelvis andUreter Cancer)、滋养细胞肿瘤(Trophoblastic Tumors)、输尿管和肾盂细胞癌(Ureter and Renal Pelvis Cell Cancer)、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、肾母细胞瘤和任何其它过度增殖性疾病,除瘤形成外,都位于上面所列的器官系统中。
本文中描述的和要求保护的方法和组合物可用于治疗恶性或恶变前状态以及用于阻止至瘤形成状态(neoplastic state)或恶性状态(包括但不限于上述那些病症)的进展。此类用途适用于已知或怀疑进展至瘤形成或癌症,特别是其中由超常增生、化生(metaplasia)或最特别地发育不良组成的非瘤形成细胞生长已发生的疾病(关于此类异常生长条件的综述,参见Robbins和Angell,Basic Pathology,第2版,W.B.Saunders Co.,Philadelphia,pp.68-79(1976))的进展的状态。细胞开始表达、过表达或异常表达IGF-1R的此类状态特别可通过所公开的方法和组合物来治疗。
发育不良通常是癌症的先兆,并且主要见于上皮中。其为非瘤形成细胞生长的最紊乱形式,包括个体细胞一致性和细胞的构造朝向(architectural orientation)的丧失。当存在慢性刺激或炎症时,发育不良特征性地发生。可治疗的发育不良病症包括但不限于无汗性外胚层发育不良(anhidrotic ectodermal dysplasia)、异侧发育不良(anterofacialdysplasia)、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良(atriodigitaldysplasia)、支气管肺发育不良、脑发育不良(cerebral dysplasia)、宫颈发育不良、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不良、先天性外胚叶发育不良、颅骨骨干发育异常(craniodiaphysial dysplasia)、颅腕跖骨发育不良(craniocarpotarsal dysplasia)、颅骨干骺端发育不良(craniometaphysial dysplasia)、牙本质发育异常(dentin dysplasia)、骨干发育不良(diaphysial dysplasia)、外胚层发育不良(ectodermaldysplasia)、釉质发育不良(enamel dysplasia)、脑性眼球发育不良(encephalo-ophthalmic dysplasia)、偏侧骨骺发育不良(dysplasiaepiphysialis hemimelia)、多发性骨骺发育不良(dysplasia epiphysialismultiplex)、点状骨骺发育不良(dysplasia epiphysialis punctata)、上皮发育不良(epithelial dysplasia)、面-指(趾)-生殖器发育不良(faciodigitogenital dysplasia)、家族性颌骨纤维性发育异常(familialfibrous dysplasia of jaws)、家族性白色皱襞发育异常(familial whitefolded dysplasia)、肌纤维发育不良(fibromuscular dysplasia)、骨纤维异常增殖症(fibrous dysplasia of bone)、旺盛骨性发育不良(florid osseousdysplasia)、遗传性肾脏-视网膜发育不良(hereditary renal-retinaldysplasia)、出汗性外胚层发育不良(hidrotic ectodermal dysplasia)、少汗性外胚层发育不良(hypohidrotic ectodermal dysplasia)、淋巴细胞减少性胸腺发育不良(lymphopenic thymic dysplasia)、乳房发育不良(mammary dysplasia)、下颌面发育不良(mandibulofacial dysplasia)、干骨后端发育不良(metaphysial dysplasia)、蒙底尼发育异常(Mondinidysplasia)、单骨纤维性发育不良(monostotic fibrous dysplasia)、粘膜上皮发育不良(mucoepithelial dysplasia)、多发性骨骺发育不良(multiple epiphysial dysplasia)、眼-耳-脊椎综合征(oculoauriculovertebral dysplasia)、眼-牙-指(趾)发育不良(oculodentodigital dysplasia)、眼椎骨发育不良(oculovertebraldysplasia)、牙体发育异常(odontogenic dysplasia)、opthalmomandibulomelic dysplasia、根尖周牙骨质结构不良(periapicalcemental dysplasia)、多骨纤维发育不良(polyostotic fibrous dysplasia)、假性软骨发育不良性脊椎骨骺发育不良(pseudoachondroplasticspondyloepiphysial dysplasia)、视网膜发育不良(retinal dysplasia)、隔-视神经发育不良(septo-optic dysplasia)、脊椎骨骺发育不良(spondyloepiphysial dysplasia)和ventriculoradial dysplasia。
可治疗的另外的肿瘤前病症包括但不限于良性过度增生性病症(例如,良性肿瘤、纤维囊性状态、组织肥大、肠息肉或腺瘤以及食道发育不良)、白斑、角化病、鲍温病、慢性光化性皮炎(Farmer's Skin)、日光性唇炎和日光性角化病。
在优选的实施方案中,本发明的方法用于抑制癌症特别是上文所列的那些癌症的生长、进展和/或转移。
其它过度增殖性疾病、病症和/或状态包括但不限于恶性肿瘤和相关病症的进展和/或转移,所述恶性肿瘤和相关病症是例如白血病(包括急性白血病(例如,急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病(包括成髓细胞白血病、前髓细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、单核细胞白血病和红白血病))和慢性白血病(例如,慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如,霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体瘤,包括但不限于肉瘤和癌症例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤(hepatoma)、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤(Wilm's tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮细胞癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤(emangioblastoma)、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
试剂盒
各种实施方案可涉及包含适用于在患者中治疗或诊断患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可以含有至少一种本文所述的抗体、片段或融合蛋白。如果含有施用组分的组合物未被配制为经消化道递送,例如通过口服递送,则可以包括能够通过一些其它途径递送试剂盒组分的装置。一种用于施用例如胃肠外递送的装置类型是用于将组合物注射入受试者体内的注射器。还可使用吸入装置。
可以将试剂盒组分包装在一起或者分装在两个或更多个容器中。在一些实施方案中,容器可以是管形瓶,含有适合复原的组合物的无菌冻干制剂。试剂盒还可以含有适合复原和/或稀释其它试剂的一种或多种缓冲液。可以使用的其它容器包括但不限于袋、盘、盒、管等。可以将试剂盒组分无菌包装或保持在容器内。可以包括的另一种组分是供使用试剂盒的人的使用说明书。
表达载体
另外其它实施方案可涉及包含编码抗体、片段、融合蛋白或双特异性抗体的核酸的DNA序列。可被编码且表达的示例性序列包括抗-IGF-1R MAb或其片段、包含至少一个抗-IGF-1R抗体或其片段的融合蛋白、包含至少一种第一抗体或片段和至少一种第二抗体或片段的融合蛋白。第一抗体和第二抗体可包含抗-IGF-1R抗体、针对在可靶向构建体上的肿瘤相关抗原和/或半抗原的抗体。融合蛋白可包含连接至不同肽或蛋白(例如在下面实施例更详细论述的用于DNL构建体形成的AD和DDD肽)的抗体或抗体片段。
各种实施方案涉及包含编码DNA序列的表达载体。所述载体可包含编码人免疫球蛋白的轻链和重链恒定区以及铰链区的序列,可将该序列与嵌合、人源化或人可变区序列连接。所述载体可额外地包含在所选择的宿主细胞中表达Mab的启动子、免疫球蛋白增强子和信号序列或前导序列。特别有用的载体是pdHL2或GS。更优选地,轻链和重链恒定区及铰链区可来自人EU骨髓瘤免疫球蛋白,其中任选地将同种异型位置上的氨基酸的至少一个改变成在不同IgG1同种异型中发现的氨基酸,并且其中任选地可用丙氨酸替代基于EU编号系统的EU的重链的氨基酸253。参见Edelman等人,Proc.Natl.Acad.SciUSA 63:78-85(1969)。在其它实施方案中,可将IgG1序列转变成IgG4序列,如下所论述的。
还包括表达抗体或其片段或融合蛋白的方法。本领域技术人员将了解,基因工程化表达构建体和插入宿主细胞以表达工程化蛋白质的方法是本领域熟知的并且只不过是常规实验。已在美国专利No.7,531,327、7,537,930和7,608,425(每篇专利的实施例部分通过引用并入本文)中描述了用于表达经克隆的抗体或片段的宿主细胞和方法。
用于构建抗-IGF-1R抗体的一般技术
抗-IGF-1R抗体的Vκ(可变轻链)和VH(可变重链)序列可通过多种分子克隆程序获得,例如RT-PCR、5’-RACE和cDNA文库筛选。来自表达鼠抗-IGF-1R MAb的细胞的抗-IGF-1R MAb的V基因可以通过PCR扩增来克隆并被测序。为了证实其可靠性,克隆的VL和VH基因可以作为嵌合Ab在细胞培养物中表达,如Orlandi等人,(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:3833(1989))所述。基于V基因序列,人源化抗-IGF-1R MAb则可如Leung等人(Mol.Immunol.,32:1413(1995))所描述来设计并构建。
cDNA可通过一般分子克隆技术从任何已知产生鼠抗-IGF-1RMAb的杂交瘤细胞系或转染的细胞系制备(Sambrook等人,MolecularCloning,A laboratory manual,第2版(1989))。MAb的Vκ序列可使用引物VK1BACK和VK1FOR(Orlandi等人,1989)或者Leung等人(BioTechniques,15:286(1993))所述的延伸引物组来扩增。VH序列可使用引物对VH1BACK/VH1FOR(Orlandi等人,1989)或Leung等人所述的与鼠IgG恒定区退火的引物(Hybridoma,13:469(1994))来扩增。
包含10μl第一链cDNA产物、10μl 10X PCR缓冲液[500mMKCl、100mM Tris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl2和0.01%(w/v)明胶](Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT)、250μM每种dNTP、200nM引物和5单位Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)的PCR反应混合物可经受30个PCR循环。每个PCR循环优选由以下组成:在94℃变性1min,在50℃退火1.5min和在72℃聚合1.5min。扩增的Vκ和VH片段可在2%琼脂糖(BioRad,Richmond,CA)上纯化。人源化V基因可通过长寡核苷酸模板合成和PCR扩增的组合来构建,如由Leung等人(Mol.Immunol.,32:1413(1995))所述的。
可将Vκ的PCR产物亚克隆至分期载体,例如基于pBR327的分期载体VKpBR(包含Ig启动子、信号肽序列和适当的限制位点),以促进VκPCR产物的框内连接。可将VH的PCR产物亚克隆至类似分期载体,例如基于pBluescript的VHpBS。包含各自PCR产物的单独克隆可通过例如Sanger等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,74:5463(1977))测序。
包含Vκ和VH序列以及启动子和信号肽序列的表达盒可通过双重限制消化成HindIII-BamHI片段分别从VKpBR和VHpBS切除。Vκ和VH表达盒可连接到适当的表达载体例如分别pKh和pG1g中(Leung等人,Hybridoma,13:469(1994))。表达载体可共转染到适当的细胞例如骨髓瘤Sp2/0-Ag14(ATCC,VA)中,针对潮霉素抗性选择菌落,通过例如ELISA测定来监控上清液以用于制备嵌合、人源化或人抗-IGF-1R MAb。可选地,可将Vκ和VH表达盒装配到经修饰的分期载体VKpBR2和VHpBS2中,分别作为XbaI/BamHI和XhoI/BamHI片段切除,并且亚克隆到单一表达载体例如pdHL2中,如由Gillies等人(J.Immunol.Methods 125:191(1989)所述并且也示于Losman等人,Cancer,80:2660(1997))中。另一种可用的载体是GS载体,如Barnes等人,Cytotechnology 32:109-123(2000)中所述的。其它适当的哺乳动物表达系统描述于Werner等人,Arzneim.-Forsch./Drug Res.48(II),Nr.8,870-880(1998)中。
共转染和通过ELISA对抗体分泌克隆的测定可如下进行。约10μgVKpKh(轻链表达载体)和20μg VHpG1g(重链表达载体)可用于通过电穿孔转染5X106个SP2/0骨髓瘤细胞(BioRad,Richmond,CA)根据Co等人,J.Immunol.,148:1149(1992)。转染后,可于37℃、5%CO2下将细胞在96孔微量滴定板中生长于完全HSFM培养基(Life Technologies,Inc.,Grand Island,NY)中。可在通过以500单位/ml潮霉素的终浓度添加潮霉素选择培养基(Calbiochem,San Diego,CA)两天后,起始选择过程。电穿孔2-3周后通常出现菌落。然后可扩展培养物以用于进一步分析。对于嵌合、人源化或人重链的分泌呈阳性的转染瘤克隆可通过ELISA测定来鉴定。
抗体可如下从细胞培养基分离。使转染瘤培养物适应无血清培养基。对于制备嵌合抗体,使用HSFM将细胞以500ml培养物在滚瓶中生长。将培养物离心并且将上清液滤过0.2μ膜。将滤过的培养基以1ml/min的流速通过蛋白A柱(1x3cm)。然后用约10倍柱体积的PBS洗涤树脂,用0.1M包含10mM EDTA的柠檬酸盐缓冲液(pH 3.5)将结合蛋白A的抗体从柱中洗脱。将1.0ml级分收集于包含10μl 3MTris(pH 8.6)的管中,在280/260nm吸光度测定蛋白浓度。将峰级分汇集,用PBS透析,例如用Centricon 30(Amicon,Beverly,MA)浓缩抗体。在280nm由吸光度测定抗体浓度,并且使用PBS将其浓度调节至约1mg/ml。适宜地将0.01%(w/v)叠氮化钠加至样品中作为防腐剂。
实施例
实施例1.抗-IGF-1R抗体:R1、cR1和hR1的产生和初步表征
用15μg重组人IGF-1R(R&D Systems,Catalog#391-GR)腹膜内免疫3只BALB/c小鼠的每一只,所述重组人GF-1R在完全弗氏佐剂中包含人IGF-1R的加工的和未加工的细胞外结构域。在初次免疫后第14、21和28天进行不完全弗氏佐剂中的另外免疫。根据标准方案将来自经免疫的小鼠的脾细胞与P3X63Ag8.653细胞融合以产生杂交瘤。分离一个表达抗-IGF-1R但不表达抗-IR(胰岛素受体)活性的克隆(C-11),将其在培养中扩增以获得称为ML04R1或R1的小鼠抗体,所述抗体经显示为具有抑制放射性碘化的IGF-1与表达IGF-1R人乳腺癌细胞系MCF-7L(MCF-7的亚系)的结合的能力的IgG1/k,其可与商购可得的小鼠抗-IGF-1R单克隆抗体(mAb)MAB391相当(表2)。
表2.在MAB391或R1存在的情况下125I-IGF-1与MCF-7L的结合
[Ab] | MAB391a | R1 |
1000ng/mL | 38% | 58% |
100ng/mL | 54% | 71% |
10ng/mL | 95% | 97% |
0ng/mL | 100% | 100% |
aR&D克隆33255.111
为了获得cR1,利用5’-RACE克隆R1的小鼠-人嵌合mAb、R1的VH和VK基因。通过N-末端蛋白测序确认克隆的VH和VK基因的真实性,所述测序显示前15个N-末端氨基酸与从DNA序列推导的对应氨基酸精确匹配(表3)。将克隆的VH和VK基因插入pdHL2载体以产生cR1pdHL2(图1),cR1的表达载体。
表3.R1的N-末端蛋白测序
a将纯化的R1经N-末端蛋白测序(15个循环)。在埃德曼降解的每个循环后检测两个残基。
b从DNA序列推导的。
使用SpE-26(例如,美国专利专利No.7,531,327)(显示改善的生长性质的Sp2/0-Ag14的变体)作为宿主细胞来产生cR1-产生性克隆。简言之,通过利用SalI限制核酸内切酶降解来线性化约30μg的cR1pdHL2,然后通过电穿孔将其转染入SpE-26细胞。利用0.075μM甲氨喋呤(MTX)选择转染子,然后通过ELISA筛选它的人Fc结合活性。将更高的产生性克隆进一步扩增以挑选两个最好的克隆(709.2D2和710.2G2),在分批培养中从所述最好的克隆产生cR1,通过蛋白A纯化cR1,通过ELISA确认每种cR1特异性结合固定的rhIGF-1R,但不以相同的对于固定的rhIGF-1R的高亲和力(KD~0.1nM)(如图3中显示的)结合于固定的rhIR,如图2中显示的。令人惊讶地,cR1似乎具有比R1更高的对于固定在聚苯乙烯珠子上的rhIGF-1R的亲和力,如通过竞争测定法显示的,在所述测定法中,在不同浓度的cR1或R1存在的情况下,通过流式细胞术测量利用荧光探针标记的R1的结合(图4)。
通过将CDR移植至hMN-14的人框架区(其中在对应位置上用R1的鼠对应物替代某些人构架残基)来实现cR1至hR1的成功人源化(美国专利No.5,874,540和6,676,924,将每篇专利的实施例部分通过引用并入本文)。为了克隆目的置换其它选择的残基,从而产生分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中显示的hR1 VH和hR1 VK的氨基酸序列。随后合成编码hR1 VH和hR1 Vk的基因,将其通过基因工程导入pdHL2以获得hR1pdHL2(hR1的表达载体)。随后确保hR1的产生性克隆(711.3C11)的努力与上述对于cR1的相似。选择阳性克隆的与rhIGF-1R的结合活性。如图5中显示的,hR1实际上展示与cR1对于固定在聚苯乙烯珠子上的rhIGF-1R的结合亲和力相同的结合亲和力。
为了确定cR1是否可阻断IGF-1或IGF-2对IGF-1R的结合,我们使用固定有rhIGF-1R的聚苯乙烯珠子作为表达IGF-1R的细胞的替代物,如下进行珠竞争测定。简言之,将不同浓度(0至670nM)的cR1、IGF-1或IGF-2与恒定量的125I-IGF-1或125I-IGF-2混合。随后加入rhIGF-1-涂覆的珠子,在温和振荡的条件下于室温下孵育1小时,洗涤并且对放射性进行计数。图6中显示的结果表明cR1不能在此类条件下阻断IGF-1或IGF-2与此类固定的rhIGF-1R的结合。图7中显示的相似实验的结果也表明125I-IGF-1与珠子固定的IGF-1R的结合被IGF-1或MAB391有效阻断,但不被hR1或R1阻断。这些发现表明IGF-1和MAB391结合于相同表位,或具有重叠的IGF-1R的表位,和hR1靶向与MAB391或IGF-1不同的IGF-1R的区域。由于IGF-1R对于IGF-1的主要结合位点据报道位于氨基酸(aa)223与274之间的富含半胱氨酸(CR)结构域,并且已将相同的区域(aa 223-274)指定为针对αIR-3的表位,所述αIR-3与MAB391一样,竞争IGF-1结合(Gustafson TA,Rutter WJ.J Biol Chem 1990;265:18663-7),因此MAB391似乎也结合于相同区域或与邻近位点相互作用。
实施例2.R1、cR1和hR1的表位作图研究
为了进一步定位hR1结合的IGF-1R的区域,评估一组商购可得的已将它们针对IGF-1R的表位作图的抗-IGF-1R mAb的彼此交叉阻断与IGF-1R涂覆的珠子的结合的能力。图8A中提供了两个典型实验的结果,显示利用荧光探针(PE)标记的R1的结合不受即使100μg/mL的MAB391影响,图8B显示利用PE标记的MAB391的结合仅被100μg/mL的R1部分抑制(50至60%)。表3A中概述的其它结果表明R1的表位位于aa 151与282之间的CR结构域并且可被进一步定位于aa 151与222之间的CR结构域的前半部分(表3B)。
表3A在未标记的抗体(24-31,24-57,17-69,1-2,1H7,2C8,3B7)存在的情况下每个标记的抗体(*)与rhIGF-1R涂覆的珠子的结合%
表3B:在未标记抗体(R1,cR2,hR1,24-60,αIR-3,MAB391)存在的情况下每个标记的抗体(*)与rhIGF-1R涂覆的珠子的结合%
抗-IGF-1R | R1 | cR1 | hR1 | 24-60 | αIR-3 | MAB391 |
表位 | (151-282) | (151-282) | (151-282) | 184-283 | 223-274 | (184-283) |
151-222 | ||||||
R1* | 0 | 0 | 0 | 43 | 143 | 100 |
cR1* | 0 | 0 | 0 | 40 | 128 | 108 |
hR1* | 0 | 0 | 0 | 71 | 136 | 121 |
24-60* | 0 | 0 | 0 | 0 | 21 | 0 |
αIR-3* | 86 | 97 | 107 | 0 | 0 | 0 |
MAB391* | 40 | ND | ND | ND | ND | 0 |
实施例3.R1、cR1和hR1的其它表征
虽然IGF-1刺激在无血清培养基中生长的MCF-7细胞的增殖,从而当在第48小时与未处理的对照相比较时在100ng/mL下活细胞计数的50%增加的最大效应,hR1不具有该效应(图9)。因此hR1不拮抗与IGF-1R的结合。在37℃观察到hR1至MCF-7内的内化,但在4℃未观察到(未示出)。
实施例4.hR1-IgG4(S228P)变体的表达载体的构建
包含IgG4基因的B13-24细胞购自ATCC(ATCC编号CRL-11397),分离基因组DNA。简言之,用PBS洗涤细胞,将其重悬浮于降解缓冲液(100mM NaCl,10mM Tris-HCl pH8.0,25mMEDTApH8.0,0.5%SDS,0.1mg/ml蛋白酶K)中,在50℃下孵育18小时。利用等体积的酚/氯仿/异戊醇提取样品,利用7.5MNH.sub.4Ac/100%EtOH进行沉淀。通过离心回收基因组DNA,将其溶解在TE缓冲液中。使用基因组DNA作为模板,利用以下引物通过PCR扩增IgG4基因。
引物-SacII
CCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCTTCCACCAAGGGCCC(SEQ ID NO:11)
引物-EagI:
CCGGCCGTCGCACTCATTTACCCAGAGACAGGG(SEQ IDNO:12)
将扩增的PCR产物克隆入TOPO-TA测序载体(Invitrogen),通过DNA测序进行确认。用TOPO-TA-IgG4质粒的SacII-EagI替代hR1pdHL2中的包含IgG1的重链恒定区的SacII-EagI片段以产生hR1-pdHL2-IgG4(hR1pdHL2-γ4)载体。
IgG4-脯氨酸突变
将Ser228Pro突变引入IgG4的铰链区以避免形成半分子。合成56bp的突变铰链区片段(PstI-StuI)
上侧:
GAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAACCCAGG(SEQ ID NO:13);
下侧:
CCTGGGTTGGCTTACCTGGGCACGGTGGGCATGGGGGACCATATTTGGACTCTGCA(SEQ ID NO:14)
退火,用IgG4的PstI-StuI片段进行替代。该构建产生最终的载体hR1pdHL2-γ4P。
实施例5.通过DNL产生多价基于hR1的抗体
DNL技术可用于制备以多种形式存在的多价、基于hR1的抗体,其为单特异性或双特异性的。对于某些优选实施方案,可将Fab抗体片段产生为包含DDD或AD序列的融合蛋白。可通过将第一抗体的Fab-DDD融合蛋白与第二抗体的Fab-AD融合蛋白组合来形成双特异性抗体。可选地,可将IgG-AD模块产生为融合蛋白,与相同或不同的特异性的Fab-DDD模块组合。可制备其它类型的组合抗体的靶向能力与任何其它蛋白质或肽的效应子功能的构建体。
开发每种DDD-或AD-融合蛋白的独立转基因细胞系。一旦产生,必要时可纯化所述模块或将其维持在细胞培养上清液中。在产生后,可将任何Fab-DDD模块与任何AD-模块组合。可合成产生DDD-或AD-模块,例如将AD-序列连接于聚乙二醇或将DDD-序列连接于寡核苷酸。对于不同类型的构建体,可利用不同的AD或DDD序列。
DDD1:SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO:15)
DDD2:CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO:16)
AD1:QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:17)
AD2:CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO:18)
质粒载体pdHL2已经用于产生许多抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等人,J Immunol Methods(1989),125:191-202;Losman等人,Cancer(Phila)(1997),80:2660-6。双顺反子哺乳动物表达载体指导IgG的重链和轻链的合成。载体序列对于许多不同的IgG-pdHL2构建体而言大部分相同,而仅在可变结构域(VH和VL)序列中存在差异。使用本领域技术人员已知的分子生物学工具,可将这些IgG表达载体转化成Fab-DDD、Fab-AD或IgG-AD表达载体,如下面对于Fab-DDD1和Fab-AD1详细描述。为了产生Fab-DDD1的表达载体,重链的铰链、CH2和CH3结构域的编码序列用编码铰链的前4个残基、14个残基的Gly-Ser接头和DDD1(人RIIα的前44个残基)的序列替代。为了产生Fab-AD1的表达载体,IgG的铰链、CH2和CH3结构域的序列用编码铰链的前4个残基、15个残基的Gly-Ser接头和AD1(称为AKAP-IS的17个残基的合成AD)的序列替代,其使用生物信息学和肽阵列技术产生并显示以非常高的亲和力(0.4nM)结合RIIα二聚体。参见Alto等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A(2003),100:4445-50)。
为了帮助IgG-pdHL2载体转化为Fab-DDD1或Fab-AD1表达载体,两个穿梭载体被设计并且被如下构建。
CH1的制备
使用pdHL2质粒载体作为模板通过PCR扩增CH1结构域。左侧PCR引物由CH1结构域的上游(5’)末端和SacII限制核酸内切酶位点组成,其为CH1编码序列的5’。右侧引物由编码铰链(PKSC)的前4个残基的序列、随后四个甘氨酸和丝氨酸以及包括Bam HI限制位点的最后两个密码子(GS)组成。
CH1的5’的左侧引物
5’GAACCTCGCGGACAGTTAAG-3’(SEQ ID NO:19)
CH1+G4S-Bam右侧(公开为SEQ ID NO:54的"G4S")
5’GGATCCTCCGCCGCCGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGG-3’(SEQ ID NO:20)
将410bp的PCR扩增引物克隆入pGemT PCR克隆载体(Promega,Inc.),筛选克隆的以T7(5’)定向的插入物。
(G4S)2DDD1(公开为SEQ ID NO:55的"(G4S)2")的构建
由Sigma Genosys(Haverhill,UK)合成称为(G4S)2DDD1(公开为SEQ ID NO:55的"(G4S)2")的双链体寡核苷酸以编码DDD1的氨基酸序列,所述氨基酸序列之前为接头肽的11个残基,前两个密码子包含BamHI限制位点。将终止密码子和EagI限制位点连接至3’末端。下面显示编码的多肽序列。
GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFA VEYFTRLREARA(SEQ ID NO:21)
合成在它们的3’末端重叠30个碱基对的两个寡核苷酸(称为RIIA1-44上侧和RIIA1-44下侧),将其组合以包含174bp DDD1序列的中间154个碱基对。将寡核苷酸退火并且经历利用Taq聚合酶的引物延伸反应。
RIIA1-44上侧
5’GTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCAGGGCTACACGGTGGAGGTGCTGCGACAG-3’(SEQ ID NO:34)
RIIA1-44下侧
5’GCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTGAAGTACTCCACTGCGAATTCGACGAGGTCAGGCGGCTGCTGTCGCAGCACCTCCACCGTGTAGCCCTG-3’(SEQ ID NO:35)
在引物延伸后,使用下列引物通过PCR扩增双链体:
G4S Bam-左侧(公开为SEQ ID NO:54的"G4S")
5’-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3’(SEQ IDNO:36)
1-44终止Eag右侧
5’-CGGCCGTCAAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCG-3’(SEQ IDNO:37)
将该扩增引物克隆入pGemT并且筛选其的以T7(5’)定向的插入物。
(G4S)2-AD1(公开为SEQ ID NO:55的"(G4S)2")的构建
合成(Sigma Genosys)称为(G4S)2-AD1(公开为SEQ ID NO:55的"(G4S)2")的双链体寡核苷酸以编码AD1的氨基酸序列,所述氨基酸序列之前为接头肽的11个残基,前两个密码子包含BamHI限制位点。将终止密码子和EagI限制位点连接至3’末端。下面显示编码的多肽序列。
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO:38)
合成两个互补重叠的寡核苷酸(称为AKAP-IS上侧和AKAP-IS下侧)。
AKAP-IS上侧
5’GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCTGACGGCCG-3’(SEQ ID NO:22)
AKAP-IS下侧
5’CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCTGCCACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCGGATCC-3’(SEQ ID NO:23)
使用下列引物通过PCR扩增双链体:
G4SBam-左侧(公开为SEQ ID NO:54的"G4S")
5’-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3’(SEQ IDNO:24)
AKAP-IS终止Eag右侧
5’-CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATG-3’(SEQ ID NO:25)
将该扩增引物克隆入pGemT载体并且筛选其以T7(5’)取向的插入物。
连接DDD1与CH1
使用BamHI和NotI限制性内切酶从pGemT切除编码DDD1序列的190bp片段,随后将其连接入CH1-pGemT的相同位点以产生穿梭载体CH1-DDD1-pGemT。
连接AD1与CH1
使用BamHI和NotI从pGemT切除编码AD1序列的110bp片段,随后将其连接入CH1-pGemT的相同位点以产生穿梭载体CH1-AD1-pGemT。
将CH1-DDD1或CH1-AD1克隆入基于pdHL2的载体
利用该模块设计可将CH1-DDD1或CH1-AD1并入任何IgG-pdHL2载体。通过从pdHL2除去SacII/EagI限制性片段(CH1-CH3)并且利用从各自pGemT穿梭载体切除的CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/EagI片段替代其来利用上述构建体之一替代完整重链恒定结构域。
CH1-DDD2-Fab-hR1-pdHL2
CH1-DDD2-Fab-hR1-pdHL2是用于产生CH1-DDD2-Fab-hR1的表达载体,其具有通过14个氨基酸残基的Gly/Ser肽接头连接至Fd的羧基端的DDD2的二聚化和停靠域序列。
如下对表达载体进行工程化。合成性制备两个重叠的互补寡核苷酸,所述寡核苷酸包含接头肽(GGGGSGGGCG,SEQ ID NO:26)的部分和DDD2的残基1-13的编码序列。将寡核苷酸退火,用T4 PNK进行磷酸化,从而分别在5’和3’末端上产生与与利用限制核酸内切酶BamHI和PstI降解的DNA的连接相容的突出端。
G4S-DDD2上侧(公开为SEQ ID NO:54的”G4S”)
5’GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3’(SEQ IDNO:27)
G4S-DDD2下侧(公开为SEQ ID NO:54的”G4S”)
5’GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCAACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3’(SEQ ID NO:28)
将所述双链体DNA与利用BamHI和PstI降解产生的穿梭载体CH1-DDD1-pGemT连接,产生穿梭载体CH1-DDD2-pGemT。利用SacII和EagI从CH1-DDD2-pGemT切除507bp片段,将其与利用SacII和EagI降解制备的IgG表达载体hR1pdHL2连接。最终的表达构建体为CH1-DDD2-Fab-hR1-pdHL2。
CH1-AD2-Fab-h679-pdHL2的产生
CH1-AD2-Fab-h679-pdHL2为用于产生CH1-AD2-Fab-h679的表达载体,将其用作编码AD2的DNA序列的模板。如下工程化表达载体。合成性制备两个重叠的互补寡核苷酸(AD2上侧和AD2下侧),其包含AD2和接头序列的部分的编码序列。将寡核苷酸退火,利用T4多核苷酸激酶磷酸化,从而在5’和3’末端上分别产生与利用限制核酸内切酶BamHI和SpeI降解的DNA的连接相容的突出端。
AD2上侧
5’GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGATGTGGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCGGCTGCTGAA-3’(SEQ ID NO:29)
AD2下侧
5’TTCAGCAGCCGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCCACATCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3’(SEQ ID NO:30)
将双链体DNA连接入利用BamHI和SpeI降解制备的穿梭载体CH1-AD1-pGemT,以产生穿梭载体CH1-AD2-pGemT。利用SacII和EagI限制性内切酶从穿梭载体切除包含CH1和AD2编码序列的429个碱基对的片段,将其连接入利用相同的酶降解制备的h679-pdHL2载体,从而产生CH1-AD2-Fab-h679-pdHL2。
用于表达CH3-AD2-IgG的CH3-AD2-IgG-pdHL2的产生
CH3-AD2-IgG模块具有通过9个氨基酸残基的肽接头融合至IgG的重链的羧基端的AD2肽。利用标准重组DNA法,将接头肽(GSGGGGSGG,SEQ ID NO:31)和紧接其后的AD2肽(CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC,SEQ ID NO:18)的DNA编码序列偶联至CH3(重链恒定结构域3)编码序列的3’末端,从而产生连续的开放阅读框架。当将重链-AD2多肽与轻链多肽共表达时,形成具有两个AD2肽的IgG分子,因此可其结合两个Fab-DDD2的二聚体。可将CH3-AD2-IgG模块与任何CH1-DDD2-Fab模块组合以产生多种由Fc片段和6个Fab片段组成的六价结构。如果CH3-AD2-IgG模块和CH1-DDD2-Fab模块来源于相同的亲代单克隆抗体(MAb),则所得的复合物为单特异性,具有6个结合臂针对相同抗原。如果模块相反来源于两种不同的MAb,则所得的复合物为双特异性的,两个结合臂具有CH3-AD2-IgG模块的特异性,4个结合臂具有CH1-DDD2-Fab模块的特异性。
产生质粒穿梭载体以帮助任何IgG-pdHL2载体至CH3-AD2-IgG-pdHL2载体的转化。使用pdHL2载体作为模板以及寡核苷酸Fc BglII左侧和Fc Bam-EcoRI右侧作为引物扩增Fc(CH2和CH3结构域)的基因。
Fc BglII左侧
5’-AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG-3’(SEQ ID NO:32)
Fc Bam-EcoRI右侧
5’-GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’(SEQID NO:33)
将扩增引物克隆到pGemT PCR克隆载体中。使用XbaI和BamHI限制性内切酶从pGemT切除Fc插入片段,将其与利用XbaI和BamHI降解CH1-AD2-Fab-h679-pdHL2制备的AD2-pdHL2载体连接,以产生穿梭载体Fc-AD2-pdHL2。
为了将任何IgG-pdHL2表达载体转化成CH3-AD2-IgG-pdHL2表达载体,从前者切除861bp BsrGI/NdeI限制性片段,将其用从Fc-AD2-pdHL2载体切除的952bp BsrGI/NdeI限制性片段替代。BsrGI切割在CH3结构域内并且NdeI切割在表达盒的下游(3’)。
Hex-hR1的产生
使用DNL法,通过组合CH3-AD2-IgGhR1与CH1-DDD2-Fab-hR1产生Hex-hR1,具有一个Fc和6个Fab的单特异性抗-IGF-1R。在4个步骤中制备Hex-hR1。
步骤1,组合:将CH1-DDD2-Fab-hR1与CH3-AD2-IgG-hR1以4.2的摩尔比于具有1mM EDTA的磷酸缓冲盐溶液pH 7.4(PBS)中混合,以便对于CH3-AD2-IgG-hR1上的每个AD2存在两个CH1-DDD2-Fab-hR1,从而使得少许过量的CH1-DDD2-Fab-hR1能够确保偶联反应完成。
步骤2,温和还原:添加还原型谷胱甘肽(GSH)至1mM的终浓度,将溶液在室温(16-25℃)下保持1至24小时。
步骤3,温和氧化:在还原后,直接向反应混合物中添加氧化型谷胱甘肽(GSSH)至2mM的终浓度,将溶液在室温下保持1至24小时。
步骤4,DNL产物的分离:在氧化后,将反应混合物直接加载至蛋白-A亲和层析柱上。用PBS洗涤柱子,用0.1M甘氨酸、pH 2.5洗脱Hex-hR1。在未结合的级分中从期望的产物除去未反应的CH1-DDD2-Fab-hR1。可类似地通过将选择的一对CH3-AD2-IgG和CH1-DDD2-Fab混合来制备其它六价DNL构建体。
与本发明相关的此类DNL构建体和结构对照的列表提供于表4中。已显示此类构建体的每一种保持组成型抗体的结合活性。
表4.包含hR1的DNL构建体和结构对照
DNL代码 | IgG-AD2 | Fab-DDD2 | 化合价 | ||
2 | 4 | 6 | |||
Hex-hR1 | hR1 | hR1 | - | - | IGF-1R |
Hex-hRS7 | hRS7 | hRS7 | - | - | EGP-1 |
Hex-hPAM4 | hPAM4 | hPAM4 | - | - | MUC1 |
Hex-hMN-14 | hMN-14 | hMN14 | - | - | CEACAM5 |
Hex-hLL1 | hLL1 | hLL1 | - | - | CD74 |
Hex-hL243 | hL243 | hL243 | - | - | HLA-DR |
1R-E1 | hR1 | hRS7 | IGF-1R | EGP-1 | - |
1R-14 | hR1 | hMN-14 | IGF-1R | CEACAM5 | - |
1R-15 | hR1 | hMN-15 | IGF-1R | CEACAM6 | - |
1R-31 | hR1 | hAFP | IGF-1R | AFP | - |
1R-74 | hR1 | hLL1 | IGF-1R | CD74 | - |
1R-C2 | hR1 | hL243 | IGF-1R | HLA-DR | - |
1R-M1 | hR1 | hPAM4 | IGF-1R | MUC1 | |
E1-1R | hRS7 | hR1 | EGP-1 | IGF-1R | - |
M1-1R | hPAM4 | hR1 | MUC1 | IGF-1R | - |
14-1R | hMN-14 | hR1 | CEACAM5 | IGF-1R | - |
74-1R | hLL1 | hR1 | CD74 | IGF-1R | - |
C2-1R | hL243 | hR1 | HLA-DR | IGF-1R | - |
22-20 | hLL2 | hA20 | CD22 | CD20 | - |
实施例7.癌细胞系的IGF-1R表达
利用在Guava仪上进行的流式细胞术,将Zenon-标记的多种亲代抗体以及来源于此类抗体的多价抗体用于评估几个癌细胞系的同源抗原的表达水平。通过hR1与MCF-7(乳腺癌)、CaPan1(胰腺癌)和DU-145(前列腺癌)的结合确认IGF-1R的表达,如图10中显示的。IGF-1R和AFP在HepG2(肝癌)中的双重表达也示于图11中,通过人源性抗-AFP IgG与TF18的结合(通过将CH1-DDD2-Fab-hAFP与CH1-AD2-Fab-h679组合以包含hAFP的两个Fab片段来制备)以及通过增强的hR1-IgG-AD2(CH3-AD2-IgG-hR1的二聚体)与1R-31的结合显示的,这表明这类多价DNL构建体的更高的亲和力。通过观察增强的1R-15的结合显示CEACAM6在Hep G2中的表达。在FACScan上利用MCF-7、DU-145和ME-180(宫颈癌)进行的其它研究示于图12中并且概述于表5中,所述研究确证了通过Guava产生的发现:多价DNL构建体展示与它们的亲代抗体相比较增强的与靶细胞系的结合。有趣地,所述多价、双特异性构建体似乎比它们的多价、单特异性对应物更强烈地结合表达差异水平的相关抗原的细胞系。
表5.获自FACScan的流式细胞术数据
实施例8.Hex-hR1和1R-E1的中和活性
进行下列实验以测定Hex-hR1或1R-E1对中和IGF-1在DU-145和ME-180(所述两者都表达IGF-1R和EGP-1)中的生长刺激活性的作用。将靶细胞以2000/细胞接种在96孔板内,在完全培养基中生长过夜。用无血清培养基洗涤细胞2次,将所述细胞暴露于0.8、4、20和100μg/mL的无血清培养基中的选择的多价抗体,进行2小时,然后添加IGF-1至10ng/ml的终浓度。将细胞孵育72小时,随后经历MTS测定。在这些条件下,Hex-hR1以剂量依赖性方式统计上显著地抑制DU-145(图13A)和ME-180(图13B)的增殖。利用1R-E1在ME-180中获得相似结果(图13C)。
实施例9.IGF-1R的下调
由抗-IGF-1R抗体(尽管其为激动剂或拮抗剂)诱导的抗-肿瘤作用的一个主要机制是通过导致内体小泡(endosomal vesicle)中的随后降解的胞吞作用下调IGF-1R。如图14中显示的,通过100nM的hR1以及用作阳性对照的两种商购可得的抗-IGF-1R抗体(MAB391和24-60)而非通过用作阴性对照的抗-CD22抗体、hLL2(依帕珠单抗)明确地证明了IGF-1R在MCF-7或HT-29(结肠直肠癌)中的高效下调。其它研究显示Hex-hR1和1R-E1能够在低至0.1nM的浓度下显著降低MCF-7、DU-145和LnCap(雄激素依赖型前列腺癌)中的IGF-1R水平,如图15A和B中显示的。
实施例10.阻断通过IGF-1诱导的信号转导途径
虽然hR1可能未显示出阻止IGF-1与珠子固定的rhIGF-1R的结合,但其有效地阻止了IGF-1激活3种细胞系(MCF-7、DU-145和ME-180)的多种信号转导分子,如图16至20中共同显示的,通过降低的磷酸化IGF-1R(pIGF-1R)、磷酸化Akt(pAkt)和磷酸化ERK1/2(pERK1/2)的水平显示的。
所述方法和组合物用于治疗前列腺癌。上述公开的实施例提供了体外结果,显示hR1以及通过DNL(Hex-hR1、1R-E1和E1-1R)制备的六价衍生物可有效地下调IGF-1R,从而抑制IGF-1刺激不依赖于雄激素的DU-145细胞的增殖。对于DNL构建体观察到的更高的效力经推测归因于它们的增强的亲合力,对于双特异性对应物,该亲合力可被进一步放大,因为细胞表面上的可靶向抗原增加。当IGF-1R在各种固体肿瘤和恶性血液病中表达时,本领域技术人员将理解,所要求保护的组合物和方法也可用于治疗其它已知的表达IGF-1R的癌症,例如多发性骨髓瘤和肝细胞瘤。hR1与其它抗体,例如抗-EGFR(C225)或抗-HER2(赫赛汀)的组合也具有治疗用途,如上文中论述的。
实施例11.多种hR1构建体在MCF-7乳腺癌异种移植物模型中的作用
将0.5mg 17β-雌二醇的60天的释放微丸(Sachdev等人,CancerRes.2003;63:627-35)植入4周龄雌性无胸腺(nu/nu)小鼠,随后皮下注射1千万MCF-7人乳腺癌细胞。当肿瘤测量为200mm3的平均体积时,将成组的9只小鼠随机化以利用下列试剂进行腹膜内处理,每周处理2次,进行连续4周;(1)盐水对照,与测试物质的体积相同;(2)400μg hR1 IgG;(3)800μg hR1 IgG;(4)400μg hRS7 IgG(抗-EGP-1);(5)800μg hRS7 IgG;(6)300μg 1R-E1六价构建体(hR1IgG-hRS7-4 Fab’s);(7)600μg 1R-E1;和(8)800μg 1R-E1。利用测径器双向测量肿瘤体积,每周2次,始于随机化和处理当天;也测量动物体重,每周2次。当小鼠变得垂死或失去超过20%的体重时,或当肿瘤达到2.5cm3的尺寸时,处死它们,取出肿瘤和正常组织,保持在福尔马林中以待组织学和免疫组织化学分析。到60天时,终止实验,实验显示对照的连续肿瘤生长,所述对照早在治疗开始后5周被处死,然后持续随后2周。肿瘤生长的抑制证据在治疗结束后1周经测量为20%(相对于对照)(对于组1)、35%(对于组2)、54%(对于组3)、11%(对于组4)、26%(对于组5)、32%(对于组6)、51%(对于组7)和68%(对于组8)。这些结果表明hR1抗体的剂量对肿瘤生长的抑制确实比hRS7(抗-EGP-1)抗体(但其也显示一些抗肿瘤活性)对肿瘤生长的抑制强,然而,更低剂量hR1和hRS7的六价双特异性抗体构建体在相对更低的剂量上显示等同于比相应的与亲代抗体更高的抗肿瘤作用,这表明通过DNL制备的双特异性抗体构建体的更大的效力。在处理组中未观察到处理相关毒性,特别是超过20%的体重减轻。
当利用相似的具有MCF-7的小鼠,使用无关同种型对照抗体(包括六价hR1和六价hRS7组,各自以400μg和800μg的剂量腹膜内施用,每周2次,进行4周)而非盐水重复相同实验时,测定肿瘤生长抑制为25-46%(对于六价hR1)和20-33%(对于六价hRS7),表明所述六价构建体比它们的二价亲代对应物效力更大。
实施例12.hR1构建体在BxPC3人胰腺癌和Colo205人结肠癌异种移植物的作用
用混合在基质胶中的2百万个BxPC3人胰腺癌或Colo205人结肠癌细胞皮下注射5-6周龄雌性nu/nu无胸腺小鼠的肿瘤异种移植物,使其生长至尺寸为约200mm3,将其随机分组,每组11只小鼠。通过以不同剂量腹膜内注射盐水媒介物(对照)或测试物质(每周2次,进行连续4周)来处理小鼠。测量肿瘤,称取动物的体重,按照先前的实施例观察动物。对于每个肿瘤模型,提供下列剂量,括号内为肿瘤生长-抑制的百分比,GI(在超过20%的对照小鼠因晚期肿瘤生长而被处死之前,比较处理组与对照组的平均体积):
BxPC3人胰腺癌模型
(1)0.5mg hR1(39%GI)
(2)1.0mg hR1(68%GI)
(3)0.5mg hPAM4(15%GI)
(4)1.0mg hPAM4(24%GI)
(5)0.5mg hRS7(18%GI)
(6)1.0mg hRS7(29%GI)
(7)0.5mg 1R-E1(63%GI)
(8)0.5mg 1R-1M(48%GI)
(9)1.0mg hLL2(抗-CD22IgG)同种型对照
结果显示hR1在抑制人胰腺癌异种移植物的生长中的剂量依赖性效应,其显示优于hRS7或hPAM4抗体,但hR1和hRS7的双特异性构建体(1R-E1)似乎显示分别超过相同剂量的给定的亲代抗体的增强的活性,和比hR1和hPAM4的双特异性抗体(1R-1M)略低的增强的功效。
Colo205人结肠癌模型
(1)0.5mg hR1(46%GI)
(2)1.0mg hR1(70%GI)
(3)0.5mg hMN-14(14%GI)
(4)1.0mg hMN-14(29%GI)
(5)0.5mg 14-1R(58%GI)
(6)1.0mg 14-1R(83%GI)
(7)1.0mg hLL2对照。
对于抗-IGFR1和抗-CEACAM5(hMN-14)人源性抗体都观察到剂量依赖性生长-抑制,前者在该模型中效力更大,但通过DNL制备的各个双特异性抗体构建体与等剂量的双价亲代抗体相比较显示提高的效力。
实施例13.单独的和与硼替佐米组合的hR1构建体在多发性骨髓瘤异种移植物模型中的作用
将CAG人骨髓瘤细胞在细胞培养中生长至使得能够收获1百万个细胞以用于移植至获自Charles River Laboratories(Frederick,MD)的6-8周龄雌性SCID小鼠的密度。如Stein等人(Blood.2004;104:3705-11)中所述,在静脉内注射5-10x166个骨髓瘤细胞之前3天,通过利用氟达拉滨和环磷酰胺预处理来免疫抑制小鼠。每天检查小鼠的不良应激或后肢麻痹的体征一次,每周称量体重一次。后肢麻痹或>20%的体重减轻用作存活终点,此时使动物安乐死。使用8-10只小鼠的组。利用腹膜内注射(以100、300、600和1,000μghR1每周2次,进行4周)提供的hR1进行的剂量-反应研究显示与利用盐水媒介物或利用不起反应的同种型对照抗体处理的小鼠(所述小鼠具有40天的中位生存期(median survival))相比较的显著的(P<0.03)存活益处。hR1-处理的小鼠的中位生存期范围为80天至100天,并且显示剂量-反应。在相同的骨髓瘤模型中评估组合硼替佐米与hR1的作用。通过以两次腹膜内注射剂量/周进行3周来提供处理,所述处理始于注射骨髓瘤细胞后第5天。以单一试剂提供的0.5mg/kg硼替佐米可被良好耐受,无体重减轻。未处理的对照小鼠的中位生存期为33天,对于单独的硼替佐米处理,小鼠的中位生存期为40天(21.2%的增加)。每周以0.6mg/小鼠重复两次,进行3周的hR1处理将中位生存时间增加至60天。当组合硼替佐米和hR1处理时,中位存活时间进一步增加至79天(对于0.5mg硼替佐米+0.6mg hR1),这是显著的(P=0.04)。因此,在处理骨髓瘤中具有活性的试剂当与该抗-IGFR1抗体组合时显示增强的活性。
实施例14.90Y-hPAM4放射免疫疗法与吉西他滨和抗-IGFR1抗体(hR1)免疫疗法的组合治疗在胰腺癌中的作用
YS为2个月前经诊断患有III/IV期转移性不能手术的胰腺癌的61岁男性,其在胰头具有6cm直径的胰脏损伤和2个直径约3和4cm的至肝的转移瘤。所述患者具有为7,200的升高的CA19.9滴度,但大多数其它实验室值在正常范围的界线上或内部。他是活跃的,但容易疲劳,不时具有腹痛,需要最低限度的药物治疗,并且自诊断以来已减轻约10kg。他选择研究治疗,包括由如下方面组成的4周治疗:每周一次以200mg/m2静脉内提供吉西他滨也在第1周通过输注提供111In-DOTA-hPAM4抗体(如Sharkey等人[J Nucl Med.2003 Dec;44(12):2000-18]中所述标记的)(以利用免疫闪烁成像评估抗体的定位),然后在接下来的连续3周每周一次输注12mCi/m2的90Y-DOTA-hPAM4(按照Sharkey等人(如上)标记的)。在第1、7、14和21天,通过静脉内输注提供10mg/kg、16mg/kg、16mg/g和20mg/kg的hR1的剂量。患者在每次输注后经历一定等级1-2的恶心、背痛、低血压、厌食症和疲劳,每次严重度都在减轻,由于用50mg氢化可的松、醋氨酚和苯海拉明进行前驱用药以控制输液反应,因此这是温和的。在治疗后4周,患者经历FDG-PET和CT扫描以比较治疗前后胰腺癌损伤的代谢和大小,采集血液以测量CA19-9肿瘤生物标志滴度。原发性癌症的SUV从8.9变成3.3,并且肝中的两个转移瘤损伤显示分别从6.1和5.3至5.3和3.5的更大下降。CT测量显示原发性肿瘤减小1-cm,以及两个肝转移瘤减小约33%。此时,CA19.9滴度测量为930,表示从7,200的极大下降。随访研究4周后确认SUV值的持续下降和肿瘤大小的稳定或略微减少,如通过CT测量的。3个月后,由于患者具有稳定的疾病,因此重复治疗,所述治疗被良好地耐受,并且再次显示稳定的疾病,在下一个4周的随访中CA19.9滴度没有增加。由此得出结论:该组合治疗已在最低限度稳定了疾病,降低了肿瘤的代谢活性,以及显著地减少胰腺癌血液生物标志CA19-9。患者在该时期是正常活跃的,无疲劳或疼痛,并且体重回升4kg。不存在血液学或其它实验室异常。
实施例15.利用hR1的转移性结肠直肠癌的组合FOLFIRI治疗
RS为先前不具有严重疾病并且在6个月前乙状结肠B3腺癌切除后呈现转移性结肠癌的71岁妇女。她拒绝术后放射或化学治疗。她的血液CEA滴度升高为11ng/ml。FDG-PET/CT成像在初期切除(primary resection)时未显示复发,但在右肝叶中显示3个分开的损伤(直径为2-4cm)和在左肝叶中显示1个更大的损伤(6cm)。由于不是补救性肝切除术的候选者,她经历与hR1治疗组合的FOLFIRI的组合。第1天,以2小时的输注在500ml生理盐水中提供180mg/m2的伊立替康,在第1和第2天,在2小时内以静脉内推注方式提供2,400mg/m2的亚叶酸,然后每2周一次以连续46小时的输注施用氟尿嘧啶(2,400mg/m2)。以每周一次的缓慢输注以10mg/kg施予抗-IGF-1R抗体、hR1,进行2周,包括术前用药,如先前患者实施例中一样。施予8个周期的该联合治疗。完成治疗6周后,FDG-PET/CT扫描显示左叶转移瘤的大小减小60%并且SUV也下降,虽然3个右叶转移瘤中有两个显示直径为约1cm,然而第3个未改变。3个转移瘤中的2个的SUV值下降至几乎0,第3个为3.2。循环CEA的变化不明显。再过6周后,3个右叶转移瘤中的2个看不见了,并且第3个直径约为1.5cm。左叶肿瘤现测量为直径3cm。患者被认为处于部分反应中,所述反应从治疗结合后第8个月发生。
实施例16.利用放射标记的hR1单克隆抗体治疗肝细胞癌患者
显示黄疸、转移瘤、体重减轻和一般虚弱的57岁男性被诊断为患有不可手术的肝细胞癌,通过计算机体层摄影术,所述癌症在肝右叶中显示在直径上延伸约6cm,并且在左叶中也出现单个3-cm的损伤。右叶损伤通过活组织检查被确认为肝细胞癌。
如Sharkey等人((J Nucl Med.2003 Dec;44(12):2000-18)中所描述的,给患者施用2个周期的缀合有具有90Y的DOTA的hR1单克隆抗体,以便施用每一个治疗剂量为25mCi(100mg抗体蛋白)的输注。第一治疗在门诊中给予,6周后重复所述治疗。在每一次治疗之前,也注射诊断剂量的通过DOTA缀合于抗体的111In(如Sharkey等人,2003,同上中所述标记)以显示肿瘤靶向和估计被递送至肿瘤和其它正常组织例如肝、肾和骨髓的辐射剂量,以便可调整1周后给予的90Y的治疗剂量,以不诱导超过被认为可耐受的正常组织/器官毒性(例如,对于肾2000cGy)。随后在治疗后每4-8周通过重复计算机体层摄影术以及通过血清AFP、胆红素、转氨酶和LDH水平监测患者的反应。
在90Y标记抗体的第2次治疗施用后8周,他的胆红素、转氨酶和LDH的血清水平降低至高于正常水平约20%,并且他的血清AFP滴度经测量处于60ng/mL,这也构成改善。他的肝病的CT测量显示左叶损伤几乎完全消失,以及右叶的更大肿块减小40%。随后患者成为进行其右叶手术切除的候选者,因为左叶剩下的小损伤被认为不是癌症而是瘢痕组织。
实施例17.利用与裸hR1抗体组合的90Y标记的hR1抗体治疗患者
62岁男性具有3年前切除,然后进行放射治疗和5-氟尿嘧啶/亚叶酸化疗的Dukes'C期直肠癌史。患者开始显示其血浆CEA滴度的升高,达到30ng/mL的水平。患者因怀疑的复发而经历不同诊断方法。通过计算机体层摄影术发现在他的肝中存在2个转移瘤,一个在他的右叶,直径3cm,另一个在左叶(接近叶间系带),直径略小。首先给予患者3周10mg/kg hR1抗体的输注(每周1次),然后在裸hR1治疗的第3周在2小时的时间内通过静脉内输注以50mg的蛋白质剂量施予缀合有25mCi 90Y的hR1抗体,然后进行第三hR1注射。两个月后重复该治疗。如在最后一次治疗输注后2-4周测量的,患者显示他的白细胞和血小板下降,但在治疗后8周评估时恢复。治疗后第3个月的计算机体层摄影术发现显示右肝叶的主要肿瘤转移收缩40%,左叶肿瘤减小较少。
在6个月的随防中,他的肿瘤损伤在两直径CT测量(two-diameterCT-measurement)中减小约70%,他的血浆CEA处于8ng/mL,并且他的一般状况得到改善,没有与治疗相关的明显毒性或不利事件。
实施例18.用Y-90 hR1 MAb和用裸hR1 MAb治疗乳腺癌患者
具有复发性乳腺癌史的56岁妇女显示具有颈淋巴结和左肺转移瘤。她在化疗和激素治疗后复发两次。随后以每次15mCi 90Y的剂量(在100mg抗体的蛋白质剂量中)给她静脉内注射缀合有90Y的hR1MAb三次(每一次相隔一周)进行治疗。治疗后4周,她的白细胞和血小板计数减少约50%,但在治疗后9周恢复。在术后12周再分期时,通过计算机体层摄影术测得肺和结节转移瘤减小约30%。此后,她接受4周的裸hR1抗体输注,每一次持续4小时,除一些短暂的寒颤和寒冷外,所述抗体被良好地耐受,并且对她的血细胞计数或血液化学无任何不利影响。每次输注的裸抗体剂量为12mg/kg。约8周后,通过计算机体层摄影术进行的再分期显示可测量的损伤进一步减少至约20%。3个月后在随访检查时,她的疾病似乎稳定(即,无进一步或进行性生长的证据)。
可根据本公开内容制备和使用本文中公开的和要求保护的所有组合物和方法而无需过度实验。虽然已通过优选的实施方案描述了组合物和方法,但对于本领域技术人员很显然的是可对组合物和方法或在本文中描述的方法的步骤或步骤的顺序进行改变而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地,在化学和生理学上都相关的某些试剂可用于替代本文中描述的试剂而可获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员很显然的是所有此类相似的替代和修饰被认为在如由所附权利要求所确定的本发明的精神、范围和概念内。
Claims (55)
1.一种结合IGF-1R表位的抗-IGF-1R(胰岛素-样生长因子1型受体)抗体或其抗原-结合片段,所述IGF-1R表位包含IGF-1R的半胱氨酸富集结构域的前半部分,在人IGF-1R的氨基酸残基151至222之间。
2.权利要求1所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述抗体展示至少一种选自以下功能特征:(i)结合于人IGF-1R并且不结合于人胰岛素受体(IR);(ii)不是IGF-1R的激动剂;(iii)不阻断IGF-1或IGF-2与分离的IGF-1R的结合;(iv)中和IGF-1在完整细胞中对IGF-1R的激活;和(v)阻断包含所述可变区序列SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的hR1抗体的IGF-1R结合。
3.权利要求1所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述抗-IGF-1R抗体不与抗-IGF-1R抗体24-31、24-57、17-69、1-2、1H7、2C8或3B7竞争结合于分离的IGF-1R。
4.权利要求1所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述抗-IGF-1R抗体不结合于分离的人IGF-1R的氨基酸残基1-150、223-274、184-283、283-440、440-514、514-586或1323-1337。
5.权利要求1所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述抗-IGF-1R抗体包含重链可变区互补决定区(CDR)序列CDR1(DYYMY,SEQ ID NO:1)、CDR2(YITNYGGSTYYPDTVKG,SEQ ID NO:2)和CDR3(QSNYDYDGWFAY,SEQ ID NO:3)和轻链可变区CDR序列CDR1(KASQEVGTAVA,SEQ ID NO:4)、CDR2(WASTRHT,SEQ IDNO:5)和CDR3(QQYSNYPLT,SEQ ID NO:6)。
6.一种阻断与R1抗体的分离的人IGF-1R结合的抗-IGF-1R抗体或其抗原-结合片段,其包含重链可变区CDR序列CDR1(DYYMY,SEQ ID NO:1)、CDR2(YITNYGGSTYYPDTVKG,SEQ ID NO:2)和CDR3(QSNYDYDGWFAY,SEQ ID NO:3)和轻链可变区CDR序列CDR1(KASQEVGTAVA,SEQ ID NO:4)、CDR2(WASTRHT,SEQ IDNO:5)和CDR3(QQYSNYPLT,SEQ ID NO:6)。
7.权利要求6所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述抗-IGF-1R抗体结合于IGF-1R表位,所述IGF-1R表位包含IGF-1R的半胱氨酸富集结构域的前半部分,在人IGF-1R的氨基酸残基151与222之间。
8.权利要求6所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述抗体展示至少一种选自以下功能特征:(i)结合于人IGF-1R并且不结合于人胰岛素受体(IR);(ii)不是IGF-1R的激动剂;(iii)不阻断IGF-1或IGF-2与分离的IGF-1R的结合;和(iv)中和IGF-1在完整细胞中对IGF-1R的激活。
9.权利要求6所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述抗体或片段是裸抗体或片段或缀合于至少一种诊断剂或治疗剂。
10.一种抗-IGF-1R抗体或其抗原-结合片段,其包含重链可变区CDR序列CDR1(DYYMY,SEQ ID NO:1)、CDR2(YITNYGGSTYYPDTVKG,SEQ ID NO:2)和CDR3(QSNYDYDGWFAY,SEQ ID no:3)和轻链可变区CDR序列CDR1(KASQEVGTAVA,SEQ ID no:4)、CDR2(WASTRHT,SEQ IDNO:5)和CDR3(QQYSNYPLT,SEQ ID NO:6)。
11.权利要求10所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述抗体展示至少一种选自以下功能特征:(i)结合于人IGF-1R并且不结合于人胰岛素受体(IR);(ii)不是IGF-1R的激动剂;(iii)不阻断IGF-1或IGF-2与分离的IGF-1R的结合;(iv)中和IGF-1在完整细胞中对IGF-1R的激活;(v)阻断与包含所述可变区序列SEQ ID NO:9和SEQID NO:10的hR1抗体的IGF-1R结合;和(vi)结合于IGF-1R表位,所述IGF-1R表位包含IGF-1R的半胱氨酸富集结构域的前半部分,在人IGF-1R的氨基酸残基151与222之间。
12.权利要求10的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述抗-IGF-1R抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
13.权利要求12所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述抗-IGF-1R抗体是包含来自人抗体的构架区和恒定区序列的人源化抗体。
14.权利要求13所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述人源化抗-IGF-1R抗体是包含SEQ ID NO:9(hR1VH)和SEQ ID NO:10(hR1VK)的氨基酸序列的人源化R1(hR1)抗体。
15.权利要求13所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述人源化抗-IGF-1R抗体的可变区序列与SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性。
16.权利要求13所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述人源化抗-IGF-1R抗体的所述可变区序列包含SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10的氨基酸序列,除了在SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的序列中具有20个或更少的保守性氨基酸取代。
17.权利要求13所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述抗-IGF-1R抗体是包含连接至人抗体恒定区序列的SEQ ID NO:7(R1VH)和SEQ ID NO:8(R1VK)的氨基酸序列的嵌合R1(cR1)抗体。
18.权利要求13所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述嵌合抗-IGF-1R抗体的所述可变区序列与SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性。
19.权利要求13所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述嵌合抗-IGF-1R抗体的所述可变区序列包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的氨基酸序列,除了在SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列中具有20个或更少的保守性氨基酸取代。
20.权利要求10所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述抗体是裸抗体。
21.权利要求10所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述抗体连接至(i)至少一种治疗剂、(ii)至少一种诊断剂或(iii)至少一种治疗剂和至少一种诊断剂。
22.权利要求21所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述治疗剂选自:放射性核素、免疫调节剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、药物、前药、酶、寡核苷酸、促细胞凋亡剂、干扰RNA、光活性治疗剂、细胞毒性剂、化疗剂和毒素。
23.权利要求21所述的抗-IGF-1R抗体或其片段,其中所述诊断剂选自:放射性同位素、染料、放射性造影剂、超声造影剂、荧光标记、化学发光标记、酶、增强剂和顺磁离子。
24.权利要求10所述的抗-IGF-1R抗体,其中所述抗体包含人IgG1或IgG4抗体的恒定区序列。
25.一种融合蛋白,其包含权利要求1所述的抗-IGF-1R抗体或其片段。
26.一种多特异性抗体,其包含连接于至少一个其它抗体或其片段的权利要求1所述的抗-IGF-1R抗体或其片段。
27.权利要求26所述的多特异性抗体,其中所述其它抗体结合于肿瘤相关抗原。
28.权利要求27所述的多特异性抗体,其中所述肿瘤相关抗原选自:碳酸酐酶IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、IGF-1R、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM5、CEACAM6、B7、ED-B纤连蛋白、因子H、FHL-1、Flt-3、叶酸受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HM1.24、胰岛素-样生长因子-1(ILGF-1)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA-95、NCA-90、PSMA、EGP-1、EGP-2、AFP、Ia、HM1.24、HLA-DR、生腱蛋白、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TNF-α、TRAIL受体(R1和R2)、VEGFR、EGFR、PlGF、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5和癌基因产物。
29.权利要求26所述的多特异性抗体,其中所述其它抗体结合于在可靶向构建体上的半抗原。
30.权利要求26所述的多特异性抗体,其中所述其它抗体是嵌合、人源化或人抗体。
31.权利要求26所述的多特异性抗体,其中所述其它抗体选自:hPAM4、hA20、hA19、hIMMU31、hLL1、hLL2、hMu-9、hL243、hMN-14、hMN-15、hMN-3、hRS7、h679和h734抗体。
32.权利要求26所述的多特异性抗体,其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。
33.一种诊断或治疗癌症的方法,其包括给患有表达IGF-1R的癌症的个体施用根据权利要求1所述的抗-IGF-1R抗体或其抗原结合片段。
34.权利要求33所述的方法,其中抗-IGF-1R抗体是嵌合、人源化或人抗体。
35.权利要求33所述的方法,其中抗-IGF-1R抗体包含重链CDR序列CDR1(DYYMY,SEQ ID NO:1)、CDR2(YITNYGGSTYYPDTVKG,SEQ ID NO:2)和CDR3(QSNYDYDGWFAY,SEQ ID no:3)和轻链CDR序列CDR1(KASQEVGTAVA,SEQ ID no:4)、CDR2(WASTRHT,SEQ IDNO:5)和CDR3(QQYSNYPLT,SEQ ID NO:6)。
36.权利要求33所述的方法,其中抗-IGF-1R抗体是包含SEQ IDNO:9(hR1VH)和SEQ ID NO:10(hR1VK)的氨基酸序列的人源化R1抗体。
37.权利要求33所述的方法,其中所述抗-IGF-1R抗体是裸抗体。
38.权利要求37所述的方法,其中所述方法是治疗癌症的方法并且所述方法还包括给所述个体施用至少一种其它治疗剂。
39.权利要求38所述的方法,其中所述至少一种其它治疗剂选自:放射性核素、免疫调节剂、抗血管生成剂、细胞因子、趋化因子、生长因子、激素、药物、前药、酶、寡核苷酸、干扰RNA、促细胞凋亡剂、光活性治疗剂、细胞毒性剂、化疗剂、抗体、抗原结合抗体片段和毒素。
40.权利要求39所述的方法,其中所述至少一种其它治疗剂选自:EGFR抑制剂、厄洛替尼、抗-EGFR抗体、IGF-1R抑制剂、tryphostin、AG1024、AG538、吡咯并[2,3-d]-嘧啶衍生物、NVP-AEW541和第二抗-IGF-1R抗体。
41.权利要求39所述的方法,其中所述至少一种其它治疗剂选自:5-氟尿嘧啶、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、苯丁酸氮芥、顺铂(CDDP)、COX-2抑制剂、伊立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、多西他赛、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、2-二氢吡咯多柔比星(2P-DOX)、氰基-吗啉代多柔比星、葡糖苷酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、雌莫司汀、表鬼臼毒素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基蛋白转化酶抑制剂、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天门冬酰胺酶、来那度胺、亚叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨喋呤、米托蒽醌、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、亚硝基脲(nitrosurea)、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链佐星、他莫昔芬、泰素、替莫唑胺、DTIC、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、硫替派、替尼泊苷、托泊替康、乌拉莫司汀、长春瑞滨、长春碱、长春新碱和长春花生物碱。
42.权利要求33所述的方法,其中所述方法是治疗癌症的方法并且所述抗-IGF-1R抗体与至少一种治疗剂连接。
43.权利要求33所述的方法,其中所述方法是诊断癌症的方法并且所述抗-IGF-1R抗体与至少一种诊断剂连接。
44.权利要求43所述的方法,其中所述诊断剂选自:放射性同位素、染料、放射性造影剂、超声造影剂、荧光标记、化学发光标记、酶、增强剂和顺磁离子。
45.权利要求43所述的方法,其中所述抗-IGF-1R抗体或其片段是融合蛋白或双特异性抗体的部分。
46.权利要求39所述的方法,其中所述免疫调节剂选自:IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、TNF-α和命名为"S1因子的干细胞生长因子。
47.权利要求33所述的方法,其中所述癌症选自:维尔姆斯瘤、尤因肉瘤、成神经细胞瘤、神经内分泌系统瘤、黑素瘤、成胶质细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、胆道癌、胰腺癌、肺癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、卵巢癌、食道癌、甲状腺髓样癌、膀胱癌、头颈癌、皮肤癌、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、星形细胞瘤和神经胶质瘤。
48.一种治疗癌症的方法,其包括给患有表达IGF-1R的癌症的个体施用根据权利要求6所述的抗-IGF-1R抗体或其抗原结合片段。
49.一种治疗恶变前或发育不良损伤的方法,其包括给患有表达IGF-1R的恶变前或发育不良损伤的个体施用根据权利要求10所述的抗-IGF-1R抗体或其抗原结合片段。
50.一种治疗癌症的方法,其包括给患有表达IGF-1R的癌症的个体施用根据权利要求10所述的抗-IGF-1R抗体或其抗原结合片段。
51.一种分离的核酸,其编码根据权利要求1所述的抗-IGF-1R抗体。
52.权利要求51所述的分离的核酸,其编码SEQ ID NO:9和SEQID NO:10的序列。
53.一种表达载体,其包含根据权利要求51所述的分离的核酸。
54.一种宿主细胞,其包含根据权利要求53所述的表达载体。
55.一种产生抗-IGF-1R抗体或其片段的方法,其包括:
a)获得包含根据权利要求53所述的表达载体的宿主;和
b)在培养基中孵育所述宿主细胞以表达抗-IGF-1R抗体或片段。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107484416A (zh) * | 2014-09-26 | 2017-12-15 | 宏观基因有限公司 | 能够结合cd19和cd3的双特异性单价双抗体及其用途 |
CN109563128A (zh) * | 2016-08-16 | 2019-04-02 | 国立研究开发法人产业技术总合研究所 | 恶性肿瘤靶向肽 |
CN113061191A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-07-02 | 托比康尔生物科技(武汉)有限公司 | 一种IgG样三功能抗体及其应用 |
WO2021203861A1 (zh) * | 2020-04-10 | 2021-10-14 | 苏州普乐康医药科技有限公司 | 一种抗igf-1r抗体及其应用 |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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AU2013202693B2 (en) * | 2012-04-16 | 2015-01-22 | Baxalta GmbH | Combination Therapy of Anti-MIF Antibodies and Chemotherapeutics |
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GB201501930D0 (en) | 2015-02-05 | 2015-03-25 | Univ London Queen Mary | Biomarkers for pancreatic cancer |
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KR20200004861A (ko) * | 2017-05-05 | 2020-01-14 | 퓨전 파마슈티칼즈 인크. | Igf-1r 모노클로날 항체 및 그의 용도 |
JP2020518673A (ja) | 2017-05-05 | 2020-06-25 | フュージョン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 二官能性キレートの薬物動態増強及びその使用 |
AU2018298063A1 (en) | 2017-07-03 | 2020-02-20 | Torque Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding immunostimulatory fusion molecules and uses thereof |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090291088A1 (en) * | 2008-04-11 | 2009-11-26 | Biogen Idec Ma Inc. | Therapeutic combinations of anti-igf-1r antibodies and other compounds |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5252296A (en) | 1990-05-15 | 1993-10-12 | Chiron Corporation | Method and apparatus for biopolymer synthesis |
US5492807A (en) | 1993-11-19 | 1996-02-20 | Santi; Daniel V. | Method of obtaining diagnostic reagents, assays and therapeutics based on clinical manifestations of a disease |
US6310185B1 (en) * | 1994-03-08 | 2001-10-30 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Recombinant human anti-Lewis Y antibodies |
US6068829A (en) | 1995-09-11 | 2000-05-30 | The Burnham Institute | Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo |
US5622699A (en) | 1995-09-11 | 1997-04-22 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo |
US6737249B1 (en) * | 1997-08-22 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Agonist antibodies |
US7279160B2 (en) * | 2000-05-02 | 2007-10-09 | The Uab Research Foundation | Combinations of DR5 antibodies and other therapeutic agents |
US7329745B2 (en) * | 2000-06-13 | 2008-02-12 | City Of Hope | Single-chain antibodies against human insulin-like growth factor I receptor: expression, purification, and effect on tumor growth |
WO2004009805A1 (ja) * | 2002-07-19 | 2004-01-29 | Japan Science And Technology Agency | 新規抗体酵素生産方法、新規抗体酵素、およびその利用 |
MXPA05009837A (es) * | 2003-03-14 | 2005-12-05 | Pharmacia Corp | Anticuerpos para el receptor del factor de crecimiento tipo insulina-i, para el tratamiento de canceres. |
EP1737493B1 (en) * | 2004-02-25 | 2011-06-29 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Inhibitors of insulin-like growth factor receptor -1 for inhibiting tumor cell growth |
MY146381A (en) * | 2004-12-22 | 2012-08-15 | Amgen Inc | Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies |
US8003108B2 (en) * | 2005-05-03 | 2011-08-23 | Amgen Inc. | Sclerostin epitopes |
US20080233118A1 (en) * | 2005-07-28 | 2008-09-25 | Novartis Ag | Uses Of Antibody To M-Csf |
JP5231231B2 (ja) * | 2005-10-19 | 2013-07-10 | アイビーシー・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド | 複雑性が増大した生理活性アセンブリーを生成するための方法および組成物ならびに使用 |
EA200802061A1 (ru) * | 2006-03-28 | 2009-04-28 | Байоджен Айдек Эмэй Инк. | Антитело или его фрагмент, специфично связывающееся с рецептором 1 инсулиноподобного фактора роста (igf-r1) (варианты), композиция на его основе, полинуклеотид, кодирующий вариабельную область антитела (варианты), содержащие полинуклеотид композиция (варианты) и вектор, содержащая вектор клетка-хозяин (варианты), способ продуцирования антитела или его фрагмента (варианты) и способ лечения гиперпролиферативного заболевания у животного организма |
GB0702888D0 (en) * | 2007-02-14 | 2007-03-28 | Glaxo Group Ltd | Novel Antibodies |
-
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090291088A1 (en) * | 2008-04-11 | 2009-11-26 | Biogen Idec Ma Inc. | Therapeutic combinations of anti-igf-1r antibodies and other compounds |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107484416A (zh) * | 2014-09-26 | 2017-12-15 | 宏观基因有限公司 | 能够结合cd19和cd3的双特异性单价双抗体及其用途 |
CN109563128A (zh) * | 2016-08-16 | 2019-04-02 | 国立研究开发法人产业技术总合研究所 | 恶性肿瘤靶向肽 |
CN109563128B (zh) * | 2016-08-16 | 2023-02-28 | 国立研究开发法人产业技术总合研究所 | 恶性肿瘤靶向肽 |
WO2021203861A1 (zh) * | 2020-04-10 | 2021-10-14 | 苏州普乐康医药科技有限公司 | 一种抗igf-1r抗体及其应用 |
CN113061191A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-07-02 | 托比康尔生物科技(武汉)有限公司 | 一种IgG样三功能抗体及其应用 |
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