JP2013516996A - インスリン様増殖因子i型受容体(igf−1r)を標的とする新規クラスの単一特異性ヒト化抗体および二重特異性ヒト化抗体 - Google Patents
インスリン様増殖因子i型受容体(igf−1r)を標的とする新規クラスの単一特異性ヒト化抗体および二重特異性ヒト化抗体 Download PDFInfo
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Abstract
DYYMY(配列番号:1)、YITNYGGSTYYPDTVKG(配列番号:2)および
QSNYDYDGWFAY(配列番号:3)および軽鎖CDR配列KASQEVGTAVA(配列番号:4)、WASTRHT(配列番号:5)およびQQYSNYPLT(配列番号:6)を含む、マウスR1抗体、キメラR1抗体、ヒト化R1抗体またはヒトR1抗体とすることができる。好ましくは、この抗体は、IGF−1Rのシステインリッチドメインの前半部(残基151−222)を含む、IGF−1Rのエピトープに結合する。
抗IGF−1R抗体は、癌などの種々の疾患の診断または治療に利用することができる。
【選択図】図13B
Description
本出願はEFS−Webを通じて提出され、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。2010年3月9日作成の前記ASCIIコピーはIMM316WO2.txtと命名され、サイズは19,152バイトである。
および抗P1GFペプチドまたは抗体)および/またはトリホスチン(たとえば、AG1024、AG538)、ピロロ[2,3−d]−ピリミジン誘導体(たとえば、NVP−AEW541)もしくはその他の抗IGF−1R抗体などのその他のIGF−1R阻害剤、またはその他の腫瘍関連抗原(TAA)に対する抗体などと組み合せて組成物中および治療方法として使うことができる。抗IGF−1R抗体
は、裸の抗体であってもよく、あるいは1つまたは複数の治療薬および/または診断薬とコンジュゲートさせてもよい。抗体はマウス、キメラ、ヒト化またはヒト抗IGF−1R抗体とすることができる。
に対抗するために開発された阻害剤はインスリン受容体との交差反応性を示す傾向があり、この種の化合物の毒性プロフィールの少なくとも一部の原因となっている(MillerおよびYee、2005、Cancer Res.65:10123−27;RiedemannおよびMacaulay、2006)。
(たとえば、カスパーゼ、メタロプロテイナーゼ、前立腺特異抗原)の大きなグループはIGFに結合したIGFBPを加水分解し、遊離IGFを放出するが、その後、遊離IGFはIGF−1R
およびIGF−2Rと相互作用する。
(131、1135および1136のTyr残基)の活性化により、 触媒効果が増加し、IRS−1およびShcアダプタータンパク質などの基質のドッキングとリン酸化が引き起こされる。これらの基質の活性化は、生存(PI3K、AKT、TOR、S6)および/または
増殖(マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、p42/p44)のシグナル伝達系に関与する他のタンパク質のリン酸化を引き起こす(Pollakら、Nature Reviews Cancer.2004、4:505−516;Basergaら、Biochim Biophys Acta.1997.1332:F105−F126;Basergaら、Int.J.Cancer.2003、107:873−77)。
化学療法剤、放射性核種およびEGFR阻害剤など、多種多様な細胞毒性薬に対する抵抗の発現が顕著であることが報告されている(Jonesら、Endocr Relat Cancer 2004、11:793−814;Warshamana−Greeneら、2005、Clin. Cancer Res、11:1563−71;RiedemannおよびMacaulay、2006;Lloretら、2007,Gynecol. Oncol、106:8−11)。IGF−1Rは、メラノーマ、神経芽細胞腫、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌、乳癌および膵臓癌など、広い範囲の
腫瘍株で過剰発現される(Ellisら、1998、Breast Cancer Treat.52:175−84;van Golenら、2000、Cell Death Differ.7:654−65;Zhangら、2001、Breast Cancer Res.2:170−75;Jonesら、2004;RiedemannおよびMacaulay、2006)。機能性IGF−1R
は形質転換に必要であり、癌細胞の増殖、生存および転移を促進する(RiedmannおよびMacaulay、2006)。
ピクロポドフィリン(picropodophyllin)、抗IGF−1R抗体 およびsiRNA阻害剤など、抗癌剤として使用する目的でIGF−1R阻害剤を開発する試みが行なわれてきた(Arteagaら、1998、J Clin Invest、84:1418−23;Warshamana−Greeneら、2005;Klein
およびFischer、2002、Carcinogenesis 23:217−21;Blumら、2000、Biochemistry 39:15705−12;Garcia−Echeverriaら、2004、Cancer Cell 5:231−39;Garber、2005、JNCI97:790−92;Bellら、2005、Biochemistry 44:930−40;Wuら、2005、Clin Cancer Res 11:3065−74;Wangら、2005、Mol Cancer Ther 4:1214−21;Singhおよび
Agarwal、2006、Mol Carinog、45:436−42;Gableら、2006、Mol Cancer Ther 5:1079−86;Niuら、Cell Biol Int.、2007、31:156−64;Blechaら、2007、Biorg Med Chem Lett、17:4026−29;Qianら、2007、Acta Biochim Biopys Sin、39:137−47;Fangら、2007、Carcinogenesis 28:713−23;Cohenら、2005、Clin Cancer Res 11:2063−73;Sekineら、Biochem Biophys Res Commun.、2008、25:356−61;Haluskaら、2008、J Clin Oncol、26:5月20日増補;アブストラクト14510;米国特許公報第2006−233810号
、その各々の実施例のセクションを参照により本明細書に組み込む)。通常、これらの薬剤は、IGF−1R
とIRの両方に程度の差はあれ、交差反応し、および/または IGF−1Rアゴニストとして作用する傾向を示した。癌治療にこのような薬剤を利用することは、それらの毒性によって制限を受けてきた(RiedemannおよびMacaulay、2006)。当分野では、(i)インスリン受容体と交差反応しない;(ii)より低い毒性プロフィールを示す;(iii)IGF−1R発現細胞においてIGF−1およびIGF−2の効果を中和する;(iv)好ましくは、IGF−1Rアゴニストとして効果しない;および(v単離したIGF−1Rへの結合にIGF−1
またはIGF−2と競合しなくてよい抗IGF−1R抗体の必要が存在している。
はIGF−1Rのアゴニストではない。最も好ましい実施形態において、抗IGF−1R抗体はヒトIGF−1R配列のアミノ酸残基151から222の間のIGF−1Rのシステインリッチドメインの前半部を含むIGF−1Rのエピトープに結合する(たとえば、Adamsら、Cell Mol Life Sci 57:1050−93、2000;NCBI Accession No.AAB22215を参照されたい)。フューリンによるプロテアーゼ開裂は、残基1−706から成るα鎖と残基
711−1337から成るβ鎖との産生をもたらす。 残基151−222は、システインリッチドメイン(残基151−300)のN末端側の半分から成る。
配列CDR1(KASQEVGTAVA、 配列番号:4)、CDR2(WASTRHT、 配列番号:5)およびCDR3(QQYSNYPLT、配列番号:6)を含む、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体またはそれらの抗原結合フラグメントである。代替実施形態では、抗IGF−1R抗体は、同一のエピトープに結合するおよび/または重鎖CDR配列CDR1(DYYMY、
配列番号:1)、CDR2(YITNYGGSTYYPDTVKG、 配列番号:2)およびCDR3(QSNYDYDGWFAY、配列番号:3)ならびに軽鎖CDR配列のCDR1(KASQEVGTAVA、配列番号:4)、CDR2(WASTRHT、配列番号:5)およびCDR3(QQYSNYPLT、配列番号:6)を含む、マウスR1抗体のIGF−1Rへの結合をブロックするキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である。抗IGF−1R抗体は、裸の抗体であっても、少なくとも1つの治療薬および/または診断薬に結合したイムノコンジュゲートであってもよい。
IL−18、IL−25、IP−10、 MAGE、 mCRP、MCP−1、MIP−1A、 MIP−1B、 MIF、 MUC1、
MUC2、 MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA−95、
NCA−90、Ia、HM1.24、EGP−1、EGP−2、HLA−DR、テネイシン、Le(y)、RANTES、
T101、 TAC、 Tn 抗原、Thomson−Friedenreich 抗原、 腫瘍壊死抗原、TNF−α、TRAIL受容体(R1およびR2)、VEGFR、EGFR、P1GF、補体因子
C3、C3a、C3b、C5a、C5および癌遺伝子産物を含め、第2の MAbによって標的にすることができる。
7,074,403号)、hMu−9(米国特許第7,387,773号)、hL243(米国特許第7,612,180号)、hMN−14(米国特許第6,676,924号)、hMN−15(米国特許第7,541,440号)、hR1(米国特許仮出願第61/145,896号)、hRS7(米国特許第7,238,785号)、
hMN−3(米国特許第7,541,440号)、AB−PG1−XG1−026(ATCC PTA−4405およびPTA−4406として預けられている米国特許出願第11/983,372号)およびD2/B(WO2009/130575)を含め、当業で公知の多種多様の抗癌抗体のいずれもから選択することができ、第2のMAbは、以下に限定されないが、その各々の本文が参照により本明細書に組み込まれる、h679(米国特許第7,429,381号)および734(米国特許第7,405,320号)または
h734も含め、当業で公知の抗ハプテン抗体から選択することができる。特定の実施形態においては、臨床開発中の任意の抗IGF−1R抗体など、異なる抗IGF−1R抗体を使用することができる(たとえば、RyanおよびGoss、The Oncologist、2008、13:16−24を参照されたい)
MAbは、裸の抗体として、または1つもしくは複数の治療薬および/または診断薬に結合したイムノコンジュゲートとして使うことができる。裸の抗IGF−1R MAbまたはイムノコンジュゲートは、1つまたは複数の他の治療薬の前、同時または後に投与される併用療法で使うことができる。以下でより詳細に論じるとおり、当業で公知の治療薬であればいずれも、以下に限定されないが、放射性核種、免疫調節剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、薬物、プロドラッグ、酵素、オリゴヌクレオチド、siRNA、アポトーシス促進剤、光活性治療薬、細胞毒性薬、化学療法剤、毒素、その他の抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを含め、抗IGF−1R MAbと組み合せてまたは結合して活用することができる。好ましい実施形態において、
他の治療薬はEGFR阻害剤(たとえば、エルロチニブまたはエルビタックスなどの抗EGFR抗体)および/またはトリホスチン(たとえば、AG1024、AG538)、ピロロ[2,3−d]−ピリミジン誘導体(たとえば、NVP−AEW541)またはその他の抗IGF−1R抗体などの他のIGF−1R
阻害剤とすることができる。
慢性骨髄性白血病、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、ホジキンリンパ腫、甲状腺髄様癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、神経膠腫および膀胱癌が挙げられる。
キメラ抗体はマウス抗体ほど強いヒト抗マウス抗体(HAMA)応答を引き起こさないため、キメラ抗体の使用が好ましい。HAMA反応を引き起こす可能性をさらに減少させるためには、ヒト化抗体の使用がさらにいっそう好ましい。以下で論じるように、マウスフレームワークと定常領域との配列を対応するヒト抗体フレームワークと定常領域との配列で置換することにより、マウス抗体をヒト化する技法は、当業で周知であり、数多くのマウス抗癌抗体に適用されてきた。抗体のヒト化には、1つまたは複数のヒトフレームワークアミノ酸残基を親マウスフレームワーク領域配列からの対応する残基で置換することも必要とする場合もある。
融合タンパク質および/またはそのフラグメントを組み込む、ドック・アンド・ロック(DNL)技術を用いて作成される多価で、多重特異性および/または多機能の構築体に関する。DNL構築体の製造および使用のための組成物および方法は報告されている(たとえば、米国特許第
7,521,056号;第7,550,143号;第7,534,866号;第7,527,787号および2007年10月26日出願の米国特許出願連番第11/925,408号および2009年4月6日出願の第12/418,877号を参照されたい。この各々の実施例のセクションは参照により本明細書に組み込まれる)。
本明細書で用いるように、用語「1つの(a、an)」および「該(the)」は、文脈で単数を意味していることが明らかにされている場合を除き、単数と複数のいずれも意味しうる。
抗原結合活性がない抗体の部分、たとえばFcフラグメントまたは単一のアミノ酸残基などは含まれない。
部分にコンジュゲートすることのできる、検出可能な分子または原子である。有用な診断薬としては、以下に限定されないが、放射性同位元素、色素、造影剤、蛍光化合物もしくは蛍光性分子および増強剤(たとえば磁気共鳴画像法用の常磁性イオン)が挙げられる。ある種の実施形態において、診断薬は
F−18標識化部分とすることができる(たとえば、米国特許出願第11/960,262号;第12/112,289号;PCT特許出願PCT/US08/62108号;その各々の実施例のセクションを参照により本明細書に組み込む)。
IL−6,
IL−8,
IL−12、IL−15、IL−17、IL−18、IL−25、IP−10、MAGE、 mCRP、MCP−11、MIP−1A、MIP−1B、MIF、MUC1,
MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA−95、NCA−900、PSMA、EGP−1、EGP−2、AFP、Ia、HM1.24、 HLA−DR、テネイシン、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson−Friedenrich抗原、腫瘍壊死抗原、TNF−α、TRAIL受容体(R1およびR2)、VEGFR、EGFR、P1GF、補体因子C3、C3a、C3b、C5a、C5および癌遺伝子産物から成る群から選択することができる。多重特異性で多価の抗体は、結合部位を複数有する構築体であり、それらの結合部位は異なる特異性を有する。
および(v)ヒトIGF−1R配列のアミノ酸残基151から222の間のIGF−1Rのシステインリッチドメインの前半部を含む、IGF−1Rのエピトープに結合する。
軽鎖可変領域CDR配列CDR1 (KASQEVGTAVA、配列番号:4)、CDR2(WASTRHT、配列番号:5)およびCDR3(QQYSNYPLT、配列番号:6)を含む。最も好ましい実施形態において、
抗IGF−1R抗体またはそのフラグメントはhR1である。
抗原への結合を増強するために必要な場合は、可変の軽鎖および重鎖のヒトFR 領域 で置換することができる。より好ましくは、ヒト化抗IGF−1R MAbまたはそのフラグメントは、hR1 VH(配列番号:9)およびhR1 VK(配列番号:10)のアミノ酸配列を含む。
抗IGF−1R抗体の可変領域配列を含んでもよい。好ましい実施形態において、キメラ 抗IGF−1R MAbは、マウスR1 VH(配列番号:7)および R1 VK(配列番号:8)の重鎖および 軽鎖可変領域配列を含む。
配列番号:6)を含む、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト 抗体のIGF−1Rへの結合をブロックする抗IGF−1R MAbまたはそのフラグメントに関しうる。
第1の 抗IGF−1R MAbまたはそのフラグメントと少なくとも1つの第2のMAbまたはそのフラグメントとを含んでもよい。より好ましくは、第2のMAbは、B7、CD4、CD5、CD8
、CD14、CD15、CD16、CD19, IGF−1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD66a−3、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD95、CD126、CD133、CD138、CD154、CEACAM5、CEACAM6、PAM4抗原、PSMA、AFP、EGP−1、EGP−2、MIF、ED−Bフィブロネクチン、IL−2、IL−6、IL−25、MUC1、MUC2、
MUC3、 MUC4、 MUC5、NCA−90、 NCA-95、Ia、HM1.24、HLA−DR、テネイシン、T101、TAC、TRAIL−R1、TRAIL−R2、VEGFR、EGFR、P1GF、 Flt−3、ILGF、補体因子C5、および癌遺伝子産物から成る群から選択される抗原に結合する。あるいは、第2のMAbは、本明細書に記述の抗IGF−1R
MAbとは異なる抗IGF−1R MAbとすることもできる。
ある種の実施形態において、開示した方法および組成物は、1つまたは複数の置換アミノ酸残基を有する抗体またはその抗原結合フラグメンットの製造および使用を含んでよい。後述するように、実質的にどのような標的抗原に対してもモノクローナル抗体を作製する方法は当該技術分野で周知である。通常、これらの方法は標的抗原に対するマウス抗体の産生をもたらす。当該技術分野で周知のように、マウスモノクローナル抗体の抗原結合特異性は、主に超可変領域の相補性決定領域(CDR)配列で決定される。マウス抗体は、一般に、抗体軽鎖上に3つ、重鎖上に3つの計6つのCDR配列を含む。以下に詳細に述べるように、マウス抗体のキメラバージョン、ヒト化バージョンまたはヒトバージョンは、たとえば、ヒト抗体フレームワーク領域配列および定常領域配列にマウスCDR配列を挿入するCDR移植などの技法によって、またはマウス可変領域配列全体をヒト抗体定常領域配列に結合させることによって構築されてもよい。代替実施形態では、抗体の可変領域配列は、たとえば、抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域全体をコードするオリゴヌクレオチドを化学合成し組立てることよって構築されうる。
これはフレームワーク領域アミノ酸残基がCDR残基の近傍にあるときに、特にあてはまる。
残基の場合、遊離抗体中の残基は、通常、想定されるであろう。内部残基の場合、同類置換として以下が挙げられる:AspとAsn;SerとThr;SerとAla;ThrとAla;AlaとGly;IleとVal;ValとLeu;
LeuおよびIle;LeuとMet;PheとTyr;TyrとTrp。( たとえば、rockefeller.eduのPROWLウェブサイトを参照されたい)。溶媒露出残基の場合、同類置換として以下が挙げられる:AspとAsn;AspとGlu;GluとGln;GluとAla;GlyとAsn;AlaとPro;
AlaとGly;AlaとSer;AlaとLys;SerとThr;LysとArg;ValとLeu;LeuとIle;IleとVal;PheとTyr(同書)。PAM250スコアリングマトリックス、Dayhoffマトリックス、Granthamマトリックス、McLachlanマトリックス、Doolittleマトリックス、Henikoffマトリックス、Miyataマトリックス、Fitchマトリックス、Jonesマトリックス、Raoマトリックス、LevinマトリックスおよびRislerマトリックスなど、種々のマトリックスが構築され、アミノ酸置換の選択に役立っている(同書)。
実質的にいかなる標的抗原に対するモノクローナル 抗体を調製する技法も当該技術分野で周知である。 たとえば、KohlerおよびMilstein、Nature 256:495(1975)およびColiganら(編)、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY、第1巻、2.5.1−2.6.7頁 (John WileyおよびSons 1991)を参照されたい。簡単に言うと、モノクローナル 抗体は、抗原を含有する組成物をマウスに注射し、脾臓を摘出して、Bリンパ球を得、得たBリンパ球を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマを作製し、作製したハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養して、ハイブリドーマ培養物から抗体を単離することにより取得することができる。
タンパク質−G セファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。たとえば、Coligan、2.7.1−2.7.12頁および2.9.1−2.9.3頁を参照されたい。また、Bainesら「Purification of Immunoglobulin G(IgG)」、METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY、第10巻、79−104頁(The
Humana Press,Inc. 1992)も参照されたい。
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、たとえば、マウス抗体の相補性決定領域(CDR)を含むマウス抗体の可変領域と置換された組換えタンパク質である。被験者への投与時、キメラ抗体は免疫原性の低下と安定性の増加を示す。マウス免疫グロブリンの可変ドメインをクローニングするための一般的な技法は、たとえば、Orlandiら、Proc. Nat’l Acad.Sci、USA 6:3833(1989)に開示されている。キメラ抗体を構築する技法は、当業者に周知である。1つの例としては、Leungら(Hybridoma 13:469(1994))は、マウスLL2のVκおよびVHドメインをコードするDNA配列、抗CD22モノクローナル抗体とヒトκおよびIgG1それぞれの定常領域ドメインとを組み合わせることによってLL2キメラを作製した。
ヒト化MAbを作製する技法は、当該技術分野で周知ある(たとえば、Jonesら、Nature 321:522(1986)、Riechmannら、Nature 332:323(1988)、Verhoeyenら,Science
239:1534(1988)、Carter ら、Proc.Nat.Acad.Sci USA 89:4285(1992)、Sandhu、Crit.Rev.Biotech、12:437(1992)、およびSinger
ら、J.Immun、150:2844(1993)を参照されたい)。キメラモノクローナル抗体またはマウスモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重可変鎖および軽可変鎖由来のマウスCDRをヒト抗体の対応する可変ドメインに移入することによってヒト化することができる。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域(FR)は、ヒトFR配列とも置換される。単純にマウスCDRをヒトFRに移入するだけでが、抗体親和性の減少または損失さえもたされることが多いため、マウス抗体の本来の親和性を回復させるためにさらなる修飾を必要とすることもある。この修飾は、その抗体のエピトープに良好な結合親和性を有する抗体を得るため、1つ以上のヒト残基の一部をFR領域にてマウスのそれらのカウンターパートと置換することで達成される。たとえば、Tempestら、Biotechnology 9:266(1991)およびVerhoeyenら、Science 239:1534(1988)を参照されたい。置換のための好ましい残基としては、CDRの1、2または3オングストローム内に位置するFR残基、CDR配列に隣接する位置に存在するFR残基、またはCDR残基と相互作用することが予想されるFR残基が挙げられる。
組み合わせのアプローチまたはヒト免疫グロブリン遺伝子座で形質転換されたトランスジェニック動物のいずれかを用いて完全ヒト抗体を作製する方法は、当該技術分野で既知である(たとえば、Mancini
ら、2004、New Microbiol、27:315−28;ConradおよびScheller、2005、Comb.Chem.High
Throughput Screen、8:117−26;Brekkeおよび Loset、2003、Curr.Opin.Phamacol、3:544−50)。完全ヒト抗体も、遺伝子または染色体のトランスフェクション法、ならびにファージディスプレイ技法によって構築されうる。これらの方法はすべて、当該技術分野で既知である。たとえば、McCafferty
ら、Nature 348:552−553(1990)を参照されたい。この完全ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体よりさらに少ない副効果を示し、かつin
vivoで本質的に内在性のヒト抗体として機能することが期待される。
Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor、NY、9.1頁−9.22頁)に従って行なわれた。最終的なFabフラグメントを、制限酵素で消化し、バクテリオファージゲノムに挿入してファージディスプレイライブラリーを作製した。当該技術分野で既知のように、このライブラリーは標準ファージディスプレイ方法でスクリーニングすることができる。ファージディスプレイは、種々のフォーマットで行なうことができ、フォーマットのレビューに関しては、たとえば、JohnsonおよびChiswell、Current Opinion in Structural Biology 3:5564−571(1993)を参照されたい。
特異的なエピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の技法によって作製することができる。抗体フラグメントは、F(ab’)2、Fab’、F(ab)2、Fab、Fv、sFvなどの抗体の抗原結合部分である。F(ab’)2フラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって作製することができ、Fab’フラグメントは、F(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることによって作製することができる。あるいは、Fab’発現ライブラリーを構築(Huseら、1989、Science、246:1274−1281)することで、所望の特異性を有するモノクローナルFab’フラグメントの同定が迅速かつ簡単に実施される。
Biochem.Biophys、89:230(1960);Porter、Biochem、J.73:119(1959),Edelmanら、
METHODS IN ENZYMOLOGY第1巻、422頁(Academic Press 1967)、ならびにColigan、2.8.1−2.8.10頁および2.10.−2.10.4頁を参照されたい。
二重特異性抗体は、多くの生物医学的用途において有用である。たとえば、腫瘍細胞表面抗原の結合部位およびT細胞表面受容体の結合部位を有する二重特異性抗体は、T細胞によって特定の腫瘍細胞の溶解を導くことができる。T細胞上でグリオーマおよびCD3エピトープを認識する二重特異性抗体を用いた、ヒト患者の脳腫瘍治療は成功を収めている(Nittaら、Lancet、1990;355:368−371)。腫瘍関連抗原(TAA)または他の疾患標的のための少なくとも1つの結合部位、ならびに治療薬または診断薬にコンジュゲートした標的設定可能な構築体のための少なくとも1つの結合部位を含む二重特異性抗体によるプレターゲッティング法は、当該技術分野でも周知ある(たとえば、米国特許第7,300,644号;第7,138,103号;第7,074,405号;第7,052,872号;第6,962,702号;第6,458,933号を参照されたい。各特許の実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる)。
多重特異性抗体を産生するための数多くの方法が周知である。二重特異性抗体は、各々が異なる抗原部位を認識するモノクローナル抗体を産生する2つの異なるハイブリドーマの融合を包含するクアドローマ法により産生されうる(Milstein
およびCuello、Nature、1983;305:537−540)。
す。さらに近年、以下でさらに詳細に考察される「ドック・アンド・ロック(DNL)」として知られている技法は、効果的に任意の所望の抗体、抗体フラグメントおよび
その他のエフェクター分子の組合せを産生するために利用されてきた(例えば、米国特許第7,521,056号;第7,550,143号;第7,534,866号;第7,527,787号および2007年10月26日出願の米国特許出願第11/925,408号および2009年4月6日出願の米国特許出願第12/418,877号を参照されたい;これらの各々の 実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる)。この技法は、アンカードメイン(AD)と称される相補的タンパク質結合ドメインおよび二量体形成ドメインならびにドッキングドメイン(DDD)を利用する。これらは互いに結合して、二量体から三量体、四量体、五量体および六量体に及ぶ複合構造の構築を可能にする。これらは、大量の精製を必要とせず、高収率で安定な複合体を形成する。DNL技法は、裸の抗体部分として、または、たとえば、免疫調節剤、酵素、化学療法剤、ケモカイン、サイトカイン、診断薬、治療薬、放射性核種、造影剤、抗血管新生剤、増殖因子、オリゴヌクレオチド、ホルモン、ペプチド、毒素、プロアポトーシス剤もしくはそれらの組み合わせなどの広範な他のエフェクター分子との組み合わせとしてのいずれかで、単一特異性抗体、二重特異性抗体、または多重特異性抗体の構築を可能にする。二重特異性抗体または多重特異性抗体を作製するための当該技術分野で既知のどのような技法も、現在特許請求する方法を実施する際に利用することができる。
米国特許第7,312,318号;第7,282,567号;第7,151,164号;第7,074,403号;第7,060,802号;第7,056,509号;第7,049,060号;第7,045,132号;第7,041,803号;第7,041,802号;第7,041,293号;第7,038,018号;第7,037,498号;第7,012,133号;第7,001,598号;第6,998,468号;第6,994,976号;第6,994,852号;第6,989,241号;第6,974,863号;第6,965,018号;第6,964,854号;第6,962,981号;第6,962,813号;第6,956,107号;第6,951,924号;第6,949,244号;第6,946,129号;第6,943,020号;第6,939,547号;第6,921,645号;第6,921,645号;第6,921,533号;第6,919,433号;第6,919,078号;第6,916,475号;第6,905,681号;第6,899,879号;第6,893,625号;第6,887,468号;第6,887,466号;第6,884,594号;第6,881,405号;第6,878,812号;第6,875,580号;第6,872,568号;第6,867,006号;第6,864,062号;第6,861,511号;第6,861,227号;第6,861,226号;第6,838,282号;第6,835,549号;第6,835,370号;第6,824,780号;第6,824,778号;第6,812,206号;第6,793,924号;第6,783,758号;第6,770,450号;第6,767,711号;第6,764,688号;第6,764,681号;第6,764,679号;第6,743,898号;第6,733,981号;第6,730,307号;第6,720,15号;第6,716,966号;第6,709,653号;第6,693,176号;第6,692,908号;第6,689,607号;第6,689,362号;第6,689,355号;第6,682,737号;第6,682,736号;第6,682,734号;第6,673,344号;第6,653,104号;第6,652,852号;第6,635,482号;第6,630,144号;第6,610,833号;第6,610,294号;第6,605,441号;第6,605,279号;第6,596,852号;第6,592,868号;第6,576,745号;第6,572,856号;
第6,566,076号;第6,562,618号;第6,545,130号;第6,544,749号;第6,534,058号;第6,528,625号;第6,528,269号;第6,521,227号;第6,518,404号;第6,511,665号;第6,491,915号;第6,488,930号;第
6,482,598号;第6,482,408号;第6,479,247号;第6,468,531号;第6,468,529号;第6,465,173号;第6,461,823号;第6,458,356号;第6,455,044号;第6,455,040号;第6,451,310号;第6,444,206号;第6,441,143号;第6,432,404号;第6,432,402号;第6,419,928号;第6,413,726号;第6,406,694号;第6,403,770号;第6,403,091号;第6,395,276号;第6,395,274号;第6,387,350号;第6,383,759号;第6,383,484号;第6,376,654号;第6,372,215号;第6,359,126号;第6,355,481号;第6,355,444号;第6,355,245号;第6,355,244号;第6,346,246号;第6,344,198号;第6,340,571号;第6,340,459号;第6,331,175号;第6,306,393号;第6,254,868号;第6,187,287号;第6,183,744号;第6,129,914号;第6,120,767号;第6,096,289号;第6,077,499号;第5,922,302号;第5,874,540号;第5,814,440号;第5,798,229号;第5,789,554号;第5,776,456号;第5,736,119号;第5,716,595号;第5,677,136号;第5,587,459号;第5,443,953号;第5,525,338号を参照されたい(その各々の図および実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる)。これらは単に例示的なものであって、種々の他の抗体およびそれらのハイブリドーマが、当該技術分野において既知である。当業者は、関心の対象である、選択した疾患関連標的に対する抗体についてATCC、NCBIおよび/またはUSPTOデータベースを簡単に検索するだけで、いずれの疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマのほとんどを得られることを理解する。クローン化抗体の抗原結合ドメインを、当該技術分野で周知の標準的技法を用いて、増幅し、切除し、発現ベクターに連結し、適合した宿主細胞に導入し、タンパク質産生のために使用することができる。
好ましい実施形態において、二重特異性または多重特異性抗体または他の構築物を、ドック・アンド・ロック技法を用いて産生し得る(たとえば、米国特許第7,521,056号;第7,550,143号;第7,534,866号;第7,527,787号および2007年10月26日出願の米国特許出願第11/925,408号および2009年4月6日出願の米国特許出願第12/418,877号を参照されたい;これらの各々の実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる)。DNL法は、cAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)の調節(R)サブユニットとA−キナーゼアンカータンパク質(AKAP)のアンカードメイン(AD)との間に起こる特異的タンパク質/タンパク質相互作用を利用する(Baillieら、FEBS Letters、2005;579:3264;WongおよびScott、Nat.Rev.Mol.Cell Biol、2004;5:959)。二次メッセンジャーcAMPとRサブユニットとの結合により誘発される最良の試験されたシグナル伝達経路のうちの1つにおいて中心的役割を果たすPKAは、1968年にウサギ骨格筋から最初に単離された(Walshら、J.Biol.Chem、1968;243:3763)。ホロ酵素の構造は、Rサブユニットにより不活性形態で保持される2つの触媒性サブユニットからなる(Taylor、J.Biol.Chem、1989
;264:8443)。PKAのアイソザイムは2つの型のRサブユニット(RIおよびRII)と一緒に見出され、各型は、αおよびβアイソフォームを有する(Scott、Pharmacol.TheR1991;50:123)。Rサブユニットは、安定二量体としてのみ単離されており、二量体化ドメインは最初の44個のアミノ末端残基からなることが示されている(Newlonら、Nat.Struct.Biol.1999;6:222)。cAMPとRサブユニットとの結合は、広範囲のセリン/トレオニンキナーゼ活性に関する活性触媒性サブユニットの放出をもたらし、これは、AKAPとのそのドッキングを介してPKAを区画分けすることにより選定基質に向けられる(Scottら、J.Biol.Chem.1990;265:21561)。
Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004;5:959)。PKAに対するAKAPのADは、14〜18残基の両親媒性らせんである(Carrら、J.Biol.Chem.1991;266:14188)。ADのアミノ酸配列は、個々のAKAPの間でかなり異なり、RII二量体に関して報告された結合親和性は2−90nMの範囲である(Altoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003;100:4445)。興味深いことに、AKAPは、二量体Rサブユニットのみと結合する。ヒトRIIαに関しては、ADは、23アミノ末端残基により形成される疎水性表面と結合する(ColledgeおよびScott、
Trends Cell Biol.1999;6:216)。したがって、ヒトRIIαの二量体化ドメインおよびAKAP結合ドメインはどちらも、本明細書中でDDDと呼ばれる同一のN末端44アミノ酸配列内に位置する(Newlonら、Nat.Struct.Biol.1999;Newlonら、EMBOJ.2001;20:1651)。
laboratory manual、第2版、1989を参照されたい)。このような好ましい実施形態においては、ADおよび/またはDDD部分は、エフェクタータンパク質またはペプチドのN末端またはC末端のいずれにも付着されうる。しかしながら、当業者は、エフェクター部分へのADまたはDDD部分の付着の部位は、エフェクター部分の化学的性質ならびにその生理学的活性に関与するエフェクター部分の一部(単数または複数)によって変わりうると理解する。種々のエフェクター部分の部位特異的付着は、当該技術分野で既知の技法を用いて、たとえば、二価架橋試薬および/またはその他の化学的共役技法の使用により、実施されうる。
代替実施形態において、DNL複合体の構築にAD部分および/またはDDD部分の配列バリアントを活用してもよい。ADおよびDDDドメインの構造と機能の関係は、調査の対象になってきた(たとえば、Burns−Hamuroら、2005、タンパク質 Sci 14:2982−92;
Carrら、2001、J Biol Chem 276:17332-38; Altoら、2003、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 100:4445−50;
Hundsruckerら、2006、Biochem J 396:297−306; Stokkaら、2006、Biochem J 400:493−99;
Gold ら、2006、Mol Cell 24:383−95;Kindermanら、
2006、Mol Cell 24:397−408を参照されたい)。
プロテインキナーゼA由来のヒトDDD配列
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号:15)
AKAP-IS配列
QIEYLAKQIVDNAIQQA(配列番号:17)
SuperAKAP−IS
QIEYVAKQIVDYAIHQA(配列番号:39)
代替AKAP配列
QIEYKAKQIVDHAIHQA(配列番号:40)
QIEYHAKQIVDHAIHQA(配列番号:41)
QIEYVAKQIVDHAIHQA (配列番号:42)
Ht31
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(配列番号:43)
RIAD
LEQYANQLADQIIKEATE(配列番号:44)
PV−38
FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(配列番号:45)
AKAP−IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(配列番号:17)
AKAP7δ−wt−pep
PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY(配列番号:46)
AKAP7δ−L304T−pep
PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY(配列番号:47)
AKAP7δ−L308D−pep
PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY(配列番号:48)
ら(2006)がAKAPタンパク質への結合に重要であると示唆した残基と重なるが、同一ではない。
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号:15)
代替実施形態は、より小さいDNLコンジュゲートを産生する目的でのDDD2(配列番号:16)をベースとするサイトカインまたはRNaseとの対合のためのscFVベースのADモジュールの使用に関しうる。サイズのより小さいDNL構築体は、固形腫瘍への浸透を促進する可能性がある。われわれは、各ポリペプチド鎖のカルボキシル末端において、6−Hisタグ(配列番号:51)を有する相補可変ドメインを含む、2つの別個のポリペプチド鎖を発現することにより、scFvベースの二重特異性抗体を数種類製造した。同一のアプローチを使って、一方または両方の6−Hisタグ(配列番号:51)をAD配列またはAD−HHHHHH配列(配列番号:51)のいずれかで置換することにより、scFvベースのADモジュールを生成してもよい。われわれは、さらに、各ポリペプチド鎖を異なるAD配列(たとえば、AD2(配列番号:18) and AD3(配列番号:49))に融合することもできる。融合した場合、その同族配列により特定の認識が可能となり、したがって、最終的なDNLコンジュゲートの複雑性がさらに増加する。以下の表1に、このようなscFvベースのDNL構築体を列挙するが、すべてを完全に包括したリストではない。
(配列番号:50)モジュールを連結するように設計されている。2つのポリペプチド鎖は、逆平行な形で結び付くように設計されている。
二重特異性抗体または多重特異性抗体を、プレターゲッティング技法で利用してもよい。プレターゲッティングは当初は、直接、抗体を標的設定する遅い血液クリアランスを解決するために開発された多段階方法である。この遅れは骨髄など正常組織に対する望ましくない毒性の一因となる。プレターゲッティングでは、血液から数分内に除去される小型の送達分子(標的可能な構築体または標的可能な構築体)に、放射性核種または他の治療薬を付着させる。標的可能な構築体ならびに標的抗原との結合部位を有するプレターゲッティング二重特異性抗体または多重特異性抗体が最初に投与されることで、遊離抗体が血液循環から除去され、次いで標的可能な構築体が投与される。
ら、J.Nucl.Med.29:1951,1988;Sinitsynら、J.Nucl.Med.30:66、1989;Kalofonosら、J.Nucl.Med.31:1791、1990;Schechterら、Int.J.
Cancer 48:167,1991;Paganelliら、Cancer Res.51:5960、1991;Paganelliら、Nucl.Med.Commun.12:211、1991;米国特許第5,256,395号;Stickneyら、Cancer Res.51:6650、1991;Yuanら、Cancer Res.51:3119、1991;米国特許第6,077,499号;第7,011,812号;第7,300,644号;第7,074,405号;第6,962,702号;第7,387,772号;第7,052,872号;第7,138,103号;第6,090,381号;第6,472,511号;第6,962,702号;第6,962,702号;第7,074,405号;および米国特許出願第10/114,315(現在、放棄された)に開示されている;これらの各々の実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる。
ある種の実施形態において、本明細書に記載の結合部分は、1つまたは複数のアビマー配列を含んでもよい。アビマーは、種々の標的分子に対する親和性および特異性において、抗体とやや類似する結合タンパク質の1つのクラスである。アビマーはin vitroでのエキソン・シャッフリングおよびファージ提示法により、ヒト細胞外受容体ドメインから開発された(Silvermanら、2005、Nat.Biotechnol.23:1493−94;Silvermanら、2006、Nat.Biotechnol.24:220)。得られる多ドメイン・タンパク質は、複数の独立した結合ドメインを含むことができ、単一エピトープ結合タンパク質に比較して、親和性(場合によっては、サブナノモル)および特異性に改善が見られる可能性がある(同書)。種々の実施形態において、アビマーは、特許請求された方法および組成物で使用するための、たとえば、DDDおよび/またはAD配列に付加してもよい。アビマーの構築および使用の方法に関する補足詳細情報は、たとえば、米国特許出願第20040175756号(現在、放棄されている)、第20050048512号(現在、放棄されている)、第20050053973号(現在、放棄されている)、第20050089932号および20050221384号(現在、放棄されている)に開示されている。これらの各々の実施例のセクションは、引用により本明細書に組み込まれる。
特許請求対象の組成物および/または方法の特定の実施形態は、種々の標的分子、細胞または組織の結合ペプチドおよび/またはペプチド模倣薬に関しうる。結合ペプチドは、ファージ提示法を含め(ただし、これに限定されない)、当業で既知の任意の方法によって同定することができる。ペプチドの多種多様なペプチド群を製造するための種々のファージ提示法および技法が当業で周知である。たとえば、米国特許第5,223,409号;第5,622,699号および第6,068,829号は、ファージライブラリーを作製するための方法を開示している。ファージ提示技法は、一般に、小型ペプチドがバクテリオファージの表面上に発現できるようにバクテリオファージを操作することを伴う(SmithおよびScott、1985、Science 228:1315−1317;SmithおよびScott、1993、
Meth.Enzymol.21:228−257)。ペプチド以外に、一本鎖抗体などの、より大型のタンパク質をファージ分子の表面上に提示することもできる(Arapら、1998、Science 279:377−380)。
1999、The Quart.J.Nucl.Med.43:159−162)。簡単に説明すると、推定標的設定ペプチドを含むファージのライブラリーを無傷の器官または単離された器官、組織、細胞型または標的分子に投与し、結合したファージを含む試料を採取する。標的に結合したファージを標的器官、組織、細胞型または標的分子から溶出した後、宿主細菌中で増殖することにより、増幅させることができる。
ある種の実施形態において、有用な標的設定部分はアプタマーになりうる。アプタマーの結合特性を構築および決定する方法は、当業で周知である。たとえば、そのような技法が米国特許第5,582,981号、
第5,595,877号および第5,637,459号に記載されており、その各々の実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる。関心対象の特定の標的に結合するアプタマーを調製およびスクリーニングするための方法は周知であり、たとえば、米国特許第
5,475,096号および米国特許第5,270,163号に記載されており、その各々の実施例のセクションは、参照により本明細書に組み込まれる。
ある種の実施形態において、本明細書に記述した抗体、 抗体フラグメントまたは
融合タンパク質は単独で、「裸の」抗体フラグメントまたは 融合タンパク質として投与することができる。代替実施形態において、抗体フラグメントまたは 融合タンパク質は少なくとも1つの他の治療薬の投与前、同時または投与後のいずれかに投与することができる。その他の実施形態では、 抗体フラグメントまたは融合タンパク質は、治療薬および/または診断薬と共有または非共有結合させ、イムノコンジュゲートを形成することができる。.
化学療法剤または毒素、およびその組合せとすることができる)から成る群から選択される。
使用する薬物は、抗有糸分裂、 抗キナーゼ、アルキル化、代謝拮抗、抗生、アルカロイド、
抗血管形成、アポトーシス促進、およびこれらの組合せから成る群から適切に選択される薬物学的性質を所有しうる。
I、ブドウ球菌エンテロトキシン−A、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、および緑膿菌内毒素が挙げられる。
抗IGF−1R抗体は、放射線治療の腫瘍の感作のための治療用放射性核種と組み合せることで有用になりえる(たとえば、Allenら、2007、Cancer Res. 67:1155を参照されたい)。
DISEASES(Libreria Progetto 1985);van den Bergh、Chem.Britain(1986),22:430を参照されたい。さらに、モノクローナル抗体は光線療法を達成するために、光活性化色素に結合されてきた。Mew
ら、J.Immunol.(1983)、130:1473;(同書)、Cancer Res.(1985)、45:4380;Oseroffら、Proc.Natl.Acad.Sci..USA(1986)、83:8744;(同書)、Photochem.Photobiol.(1987)、46:83;Hasanら、Prog.Clin.Biol.Res.(1989),288:471;Tatsuta
et al.,Lasers Surg.Med.(1989)、9:422;Pelegrinら、Cancer(1991)、67:2529を参照されたい。
本明細書に記載の抗体、抗体フラグメントまたは抗体融合タンパク質のいずれも、1つまたは複数の治療薬または診断薬とコンジュゲートしてよい。複数の治療薬は同一である必要はなく、たとえば、薬物と放射性同位元素のように、異なっていてもよい。たとえば、131Iを抗体または融合タンパク質のチロシン中に組み込み、薬物をリジン残基のイプシロンアミノ基に付加してもよい。治療薬および診断薬を、たとえば、還元SH基および/または炭化水素側鎖に付加してもよい。治療薬または診断薬と抗体または融合タンパク質との共有結合的または非共有結合的コンジュゲートを作製するための多くの方法が当該分野で公知であり、任意のこのような既知の方法を用いてもよい。
OF タンパク質 CONJUGATION AND CROSS‐LINKING(CRC Press 1991);Birchら編、(Wiley‐Liss、Inc.、1995)に掲載の、Upeslacisら、Modification of Antibodies by Chemical
Methods、187頁‐230頁;MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION,
ENGINEERING AND
CLINICAL APPLICATION、Ritterら編、(Cambridge University Press、1995)に掲載の、Price、Production and Characterization of Synthetic Peptide‐Derived Antibodies
、60頁‐84頁 を参照されたい。あるいは、治療薬または診断薬を、抗体のFc領域中の炭水化物部分を介して、コンジュゲートしてもよい。チオール基と結合した同一薬剤の装薬量を増大させるために炭水化物基を用いてもよく、あるいは異なる治療薬または診断薬を結合させるために炭水化物部分を用いてもい。
種々の実施形態は、ヒト、家畜、コンパニオンペット(イヌおよびネコなど)を含む哺乳類などの被験者における癌を治療する方法に関し、この方法には該被験者に治療有効量の抗体、フラグメントまたは融合タンパク質を投与することを含む。好ましい実施形態において、この抗体またはフラグメントは、抗IGF−1R MAbである。特定の実施形態においは、治療は、治療薬が結合されていない「裸の抗体」を利用することもある。
MEDICINE,第2、3版2028頁−2068頁に掲載されたFreedmanら"Non−Hodgkin’s Lymphomas"(Lea&Febiger 1993)を参照されたい。例示として、中悪性度の非ホジキンリンパ腫(NHL)治療のための第一世代の化学療法レジメンには、C−MOPP(シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン)ならびにCHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン)が挙げられる。有用な第二世代の化学療法レジメンは、m−BACOD(メトトレキセート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロフォスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾンおよびロイコボリン)であリ、適切な第三世代のレジメンは、MACOP−B(メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン)である。さらなる有用な薬物として、フェニル酪酸塩、ベンダムスチンおよびブリオスタチン−1が挙げられる。好ましい集学的療法では、化学療法薬およびサイトカインのどちらも、本発明に従って、抗体、イムノコンジュゲートまたは融合タンパク質と共投与される。サイトカイン、化学療法薬および抗体またはイムノコンジュゲートは、どのような順序でも、または一緒に投与されてもよい。
SYSTEMS、第5版(Lea&Febiger 1990),およびGennaro(編)、REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES、第18版(Mack Publishing
Company 1990)およびその改訂版に記載がある。
癌の治療に有用である。 癌の例としては、
以下に限定されないが、癌腫、リンパ腫、膠芽細胞腫、 メラノーマ、肉腫および白血病、骨髄腫または リンパ性悪性疾患が挙げられる。このような癌のより具体的な例を下記で言及し、以下が含まれる:扁平上皮癌(たとえば、扁平上皮細胞癌)、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、星状細胞腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、消化管癌を含む胃の癌つまり胃癌、膵臓癌、多形性膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、肝細胞癌腫、神経内分泌腫瘍、甲状腺髄様癌、分化甲状腺癌、乳癌、卵巣癌、
結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌つまり腎癌、前立腺癌、外陰癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌が挙げられる。用語「癌」には、原発性悪性細胞または腫瘍(たとえば、細胞が元々悪性または腫瘍である部位以外の被験者の身体部位に遊走しなかった細胞または腫瘍)、および二次的な悪性細胞または腫瘍(たとえば、転移により発症した腫瘍、最初の腫瘍部位と異なる二次的部位への悪性細胞または腫瘍細胞の転移)を含む。本発明の治療方法の対象となる癌には、IGF−1Rを発現する、過剰発現する、または異常に発現する細胞が必要である。
成人(原発性)肝臓癌、成人急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄(性)白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、
成人原発性肝臓癌、成人軟部肉腫、AIDS関連リンパ腫、AIDS関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、
膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂癌および尿管癌、中枢神経系(原発性)リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児(原発性)肝細胞癌、小児(原発性)肝臓癌、小児急性リンパ性白血病、小児急性骨髄(性)白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視覚路神経膠腫、小児急性リンパ性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視覚路および視床下部神経膠腫、神経膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、膵内分泌部島細胞細胞腫、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、外分泌膵癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌、女性の乳癌、ゴーシェ病、胆汁膀胱癌、胃癌、眼癌、女性の乳癌、ゴーシェ病、胆汁膀胱癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚細胞性腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキンリンパ腫、ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内メラノーマ、島細胞癌、島細胞膵癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇癌および口腔癌、肝癌、肺癌、リンパ球増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性の乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、メラノーマ、中皮腫、転移性潜在性原発性の扁平上皮性頸部癌、転移性原発性の扁平上皮性頸部癌、転移性の扁平上皮性頸部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、骨髄性の白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔癌および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性の扁平上皮性頸部癌、中咽頭癌、骨/悪性線維性肉腫、骨肉種/悪性線維性組織球腫、骨の骨肉種/悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、パラプロテイン血症、真性多血症、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂癌および尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮性頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉および松果体腫瘍、T細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、移行細胞性腎盂癌および尿管癌、移行性腎盂癌および尿管癌、絨毛性腫瘍、尿管および腎盂の細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、腟癌、視覚路および視床下部性神経膠腫、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに、腫瘍症に加え、先に記載した臓器系にある、他の任意の過剰増殖性疾患を含む。
Co.、Philadelphia、68頁−79頁(1976)を参照されたい)。
頭蓋骨幹異形成、頭蓋骨軟骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳−眼部異形成、骨端欠損異形成、多発性骨端、点状軟骨異形成症、上皮異形成、顔面生殖異形成、下顎の家族性線維性異形成、家族性白色襞性異形成、線維筋性異形成、骨の線維性異形成、セメン
ト質骨異形成、遺伝性腎臓−網膜異形成、発汗外胚葉性異形成、無汗性外胚葉異形成、リンパ性減少性胸腺異形成、乳腺異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形
成、Mondini異形成、単骨性線維性骨異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯原性異形成、眼下
顎異形成(opthalmomandibulomelic dysplasia)、根尖性セメント質異形成、多発性線維性異形成、偽軟骨発育不全性脊椎骨端異形成、網膜異形成、中隔視神経異形成、脊椎骨端異形成、および心室橈骨異形成が挙げられる。
種々の実施形態は、患者における患部組織の治療または診断に適した成分を含むキットに関することがある。例示的なキットは、本明細書に記述するように、少なくとも1つの抗体、フラグメントまたは融合タンパク質を含んでもよい。投与のための成分を含む組成物が、経口送達によるなど消化管を介する送達用に製剤化されていない場合、別の経路を介してキット成分を送達しうる装置を含むこともできる。非経口送達などの適用の場合、装置の1つの種類は、組成物を被験者の体内に注射するために用いられる注射器である。吸入装置を用いてもよい。
さらに他の実施形態は、抗体、フラグメント、融合タンパク質または二重特異性抗体をコードする核酸を含むDNA配列に関することがある。コードされて発現されうる例示的な配列として、抗IGF−1R−MAbもしくはそのフラグメント、少なくとも1つの抗IGF−1R抗体もしくはそのフラグメントを含む融合タンパク質、少なくとも1つの第1の抗体もしくはフラグメントおよび少なくとも1つの第2の抗体もしくはフラグメントを含む融合タンパク質が挙げられる。第1の抗体および第2の抗体は、抵IGF−1R抗体、腫瘍関連抗原に対する抗体、および/または標的設定可能な構築体上のハプテンを含んでもよい。融合タンパク質は、下記の実施例でより詳細に論じるように、DNL構築体の形成に活用するADおよびDDDペプチドなど、異なるペプチドまたはタンパク質に付加された抗体または抗体フラグメントを含んでもよい。
抗IGF−1R抗体のVκ (可変軽鎖)およびVH (可変重鎖)配列は、RT−PCR、5’−RACEおよびCDNAライブラリースクリーニングなどの多種多様な分子クローニング手法により獲得することができる。マウス抗IGF−1R
MAbを発現する細胞由来の抗IGF−1R MAbの V遺伝子は、PCR増幅によりクローニングし、配列を決定することができる。配列の確実性を確認するために、クローン化したVL
およびVH遺伝子をOrlandiら (Proc.Natl.Acad.Sci. USA、86:3833(1989))が記述しているように、キメラAbとして細胞培養中で発現させることができる。その後、V遺伝子配列に基いて、ヒト化抗IGF−1R
MAbを 、Leungら(Mol.Immunol.32:1413(1995))によって記述されているように、設計して構築することができる。
Cetus)を5単位含有するPCR反応混合物を,30サイクルのPCRにかけることができる。各PCRサイクルは、94℃で1分間の変性、50℃で1.5分間のアニーリング、および72℃で1.5分間の重合で構成されることが好ましい。増幅したVκおよびVHのフラグメントは2%アガロース上で精製することができる(BioRad、Richmond、CA)。Leung
ら(Mol.Immunol.、32:1413(1995))によって記述されているように、ヒト化V遺伝子は長いオリゴヌクレオチド鋳型合成とPCR増幅との組み合わせによって構築することができる。
PCR産物のインフレームライゲーションを容易にする便利な制限酵素認識部位を含む、pBR327をベースとするステージングベクター、VKpBRなどのステージングベクター中にサブクローニングすることができる。VHのPCR産物は、pBluescriptをベースとするVHpBSなど同様のステージングベクター中にサブクローニングすることができる。それぞれのPCR産物を含んでいる個々のクローンは、たとえば、Sanger
ら(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,74:5463(1977))の方法によって配列を決定することができる。
32:109−123(2000)に記述されるように、有用な別のベクターは、GSベクターである。他の適切な哺乳類発現系は、Wernerら、Arzneim.−Forsch./Drug Res.48(II)、Nr.8、870−880(1998)に記述されている。
Island、NY)中で増殖させてもよい。選択プロセスは2日後、ハイグロマイシン選択培地(Calbiochem、San
Diego、CA)を、ハイグロマイシンの最終濃度500単位/mLで加えることによって、開始することができる。コロニーは、通常、エレクトロポレーションから2−3週間後に出現する。次いでこの培養物をさらなる分析のために成長させることができる。キメラ重鎖、ヒト化重鎖またはヒト重鎖の分泌に陽性のトランスフェクトーマクローンをELISAアッセイによって同定することができる。
Tris(pH8.6)を含む管に収集し、タンパク質濃度を、280/260nmの吸光度で測定する。ピーク画分をプールして、PBSに対して透析し、抗体を、たとえばCentricon
30(Amicon、Beverly、MA)で濃縮する。抗体濃度をELISAによって測定し、PBSを用いて約1mg/mLに調整する。アジ化ナトリウム(0.01%(w/v))を、保存剤として試料に加えると都合が良い。
完全フロイントアジュバント中にヒトIGF−1Rの処理済みおよび未処理
の両方の細胞外ドメインの混合物を含む、15 μgの組換えヒトIGF−1R(R&D Systems、カタログ#391−GR)をBALB/cマウス3匹のそれぞれの腹腔内に接種し、免疫を施した。初回免疫の14日後、21日後および28日後に、不完全フロイントアジュバントで追加免疫を施した。標準プロトコルに従い、
免疫を施したマウスからの脾細胞をP3X63Ag8.653細胞と融合し、ハイブリドーマを生成した。 抗IGF−1R活性を発現しているが、抗IR(インスリン受容体)活性は発現していない1つのクローン(C−11)を単離し、培地で展開させ、ML04R1またはR1と命名されたマウス抗体を取得した。このマウス抗体は、市販のマウス抗IGF−1R
モノクローナル抗体(MAb)MAB391に匹敵する、ヒト乳癌細胞株MCF−7L(MCF−7のサブライン)を発現しているIGF−1R
への放射性ヨウ化IGF−1の結合を阻害する能力を有するIgG1/k
であることが明らかになった(表2)。
R&Dクローン33255.111
および VK
遺伝子のクローニングを5’−RACEにより行なった。 くローン化したVH および VK 遺伝子の信頼性は、DNA配列から推定される対応するアミノ酸と最初の15個のN末端アミノ酸が正確に一致することを示すN末端
タンパク質配列決定により確認された(表3)。クローン化したVH および
VK 遺伝子をpdHL2 ベクターに挿入し、 cR1pdHL2 (図1)、cR1の発現ベクターを生成した。
bDNA配列から推定。
米国特許第7,531,327号)、成長特性の改善を示したSp2/0−Ag14のバリアントを宿主細胞として使って、cR1産生クローンを精製した。簡単に説明すると、およぞ30
μgのcR1pdHL2をSalI 制限エンドヌクレアーゼを使用して消化により線形化し、エレクトロポレーションにより、SpE−26細胞に導入した。トランスフェクタントを0.075μMのメトトレキサート(MTX)を使って選択し、ヒトFc結合活性についてELISAでスクリーニングした。比較的高い産生クローンをさらに展開し、2つの最も良いクローン(709.2D2および710.2G2)を選び、それらをもとにcR1をバッチ培地で産生させ、タンパク質Aで精製し、各々が図3に示すように、固定化したrhIGF−1Rに同じく高い親和性(KD
〜0.1 nM)を持って、図2に示すように、固定化したrhIGF−1Rに特異的に結合するが、固定化したrhIRには結合しないことが、ELISAにより確認された。驚くべきことに、様々な濃度のcR1または
R1の存在下で 、蛍光プローブでタグを付けたR1の結合をフローサイトメトリーで測定した競合アッセイ(図4)で示されているように、cR1は、ポリスチレンビーズに固定化したrhIGF−1Rに対して、R1より高い親和性を有するように見える。
特定のヒトフレームワーク残基を対応する位置でR1のマウスの対応残基で置換する、hMN−14のヒトフレームワーク
領域へのCDRの移植(米国特許第5,874,540号および第6,676,924号;各々の実施例のセクションは参照により本明細書に組み込まれる)により成功した。他の選択した残基をクローニングの目的のために置換し、hR1 VHおよび
hR1 VKのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号:9および配列番号:10で示されているとおりになった。続いて、hR1 VHおよび
hR1 VKをコードしている遺伝子を合成し、pdHL2に操作し、hR1pdHL2(hR1の発現ベクター)を得た。hR1の産生クローン(711.3C11)を確保するためにその後、行なった努力は、cR1について上述した内容と同様だった。rhIGF−1Rへの結合活性について陽性クローンを選別した。 図5に示すように、hR1は、 ポリスチレンビーズ上に固定化されたrhIGF−1Rに対して、cR1とほぼ同じ結合親和性を示した。
放射能をカウントした。図6に示す結果は、cR1は上記の条件のもとで、このような固定化されたrhIGF−1RへのIGF−1またはIGF−2のいずれの結合もブロックできなかったことを示している。図7に示す同様の実験の結果も、ビーズに固定化したIGF−1Rへの125I−IGF−1の結合はIGF−1または
MAB391によって効果的にブロックされたが、hR1またはR1ではブロックされなかったことを示している。これらの発見は、IGF−1および
MAB391は同一のエピトープに結合するか、あるいはIGF−1Rにオーパーラップするエピトープを有しているが、hR1
は MAB391またはIGF−1とは異なるIGF−1Rの領域を標的にしていることを示唆している。IGF−1に対するIGF−1Rの第1の結合部位は、アミノ酸(aa)223から274までのシステインリッチ(CR)ドメインに位置し、同一の領域(aa223〜274)がαIR−3へのエピトープとして割り当てられていて、MAB391と同様、IGF−1結合で競合することが報告されている(Gustafson TA、Rutter WJ.J Biol
Chem 1990;265:18663−7)ため、MAB391も同一の領域に結合するか、あるいは近傍の部位と相互作用するようだった。
hR1が結合するIGF−1Rの領域をさらに特定するために、IGF−1Rへのエピトープがマッピングされている市販の抗IGF−1R
MAbのパネルについて、IGF−1Rをコーティングしたビーズへの結合を互いにクロスブロックする能力を評価した。代表的な2つの実験の結果を図8A(蛍光プローブ(PE)でタグを付けたR1の結合は、100μg/mLでもMAB391による影響を受けなかったことを示している)および図8B(PEでタグ付けされたMAB391の結合は、100μg/mLでR1により一部だけ(50〜60%)阻害されたことを示している)で提供する。表3Aに要約した追加結果は、R1のエピトープがaa151から282までのCRドメインに位置し、aa151から222までのCRドメインの前半部にあるとさらに詳しく特定できることを表している(表3B)。
IGF−1は、無血清培地で生育されたMCF−7細胞の増殖を刺激し、48時間目に未処置の対照と比較すると、100
ng/mLで生存細胞数を最大50%増加する効果を達成するのに対し、hR1はそうしない(図9)。
したがって、hR1は、IGF−1Rへの結合時にアゴニスト的ではない。hR1のMCF−7への内在化は37℃で観察されたが、4℃では観察されなかった(図示されていない)。
IgG4遺伝子を含有するB13−24
細胞をATCC (ATCC番号CRL−11397)から購入し、ゲノムDNAを単離した。簡単に説明すると、細胞をPBSを使って洗浄し、
消化緩衝液(NaCl 100mM、Tris−HCl 10mM(pH8.0)、EDTA 25 mMの(pH8.0)、0.5% SDS、プロテイナーゼK 0.1 mg/mL)で再懸濁し、50℃で
18時間培養した。 試料を等容量のフェノール/クロロフォルム/イソアミルアルコールで抽出し、
7.5MのNH4Ac/100%エタノールを使って沈殿させた。ゲノムDNAを遠心分離で回収し、TE緩衝液に溶解した。ゲノムDNAを鋳型として使い、IgG4遺伝子を以下のプライマーを使ってPCRで増幅した。
プライマー−SacII
CCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCTTCCACCAAGGGCCC(配列番号:11)
プライマー−EagI:
CCGGCCGTCGCACTCATTTACCCAGAGACAGGG(配列番号:12)
(Invitrogen)にクローニングし、DNA配列決定により確認した。hR1pdHL2にIgG1の重鎖定常領域を含むSacII−EagI フラグメントをTOPO−TA−IgG4プラスミドのSacII−EagIで置換し、hR1−pdHL2−IgG4(hR1pdHL2-γ4)ベクターを生成した。
IgG4−プロリン変異
上部
GAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAACCCAGG((配列番号:13);
下部:
CCTGGGTTGGCTTACCTGGGCACGGTGGGCATGGGGGACCATATTTGGACTCTGCA(配列番号:14)
アニールして、IgG4のPstI−StuIフラグメントで置換した。この構築の結果、最終的にベクターhR1pdHL2-γ4Pが生成された。
DNL技法を使って、様々なフォーマットで単一特異性または二重特異性のいずれかの多価hR1ベース抗体を作製することができる。特定の好ましい実施形態において、Fab抗体フラグメントをDDD配列またはAD配列のいずれかを含む融合タンパク質として製作することができる。二重特異性抗体は、最初の抗体のFab−DDD
融合タンパク質をもう1つの抗体のFab-AD 融合タンパク質と組み合せることで形成することができる。あるいは、IgG−ADモジュールを
融合タンパク質として製作し、同一または異なる特異性のFab−DDDモジュールと組み合わせる。抗体の標的化能力を任意の他のタンパク質またはペプチドのエフェクター機能と併せ持つ追加の種類の構築体を作製することもできる。
製作後、Fab−DDDモジュールのどれもADモジュールのどれと組み合せてもよい。DDDモジュールADモジュールは、AD配列をポリエチレングリコールに、またはDDD配列
をオリゴヌクレオチドに連結するなど、合成的に製造することができる。異なる種類の構築体に対して、異なるAD配列またはDDD配列を利用することができる。
DDD1:SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号:15)
DDD2:CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号:16)
AD1:QIEYLAKQIVDNAIQQA(配列番号:17)
AD2:CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(配列番号:18)
2シストロン性哺乳類発現ベクターは、 IgGの重鎖および軽鎖の合成を指示する。ベクター配列は多数の異なるIgG-pdHL2構築体に対してほとんど同一であり、可変ドメイン(VHおよびVL)配列のみに違いが存在する。当業者に公知の分子生物学ツールを使って、Fab−DDD1およびFab−AD1について以下で詳しく記述するように、これらのIgG
発現ベクターをFab−DDD、Fab-ADまたはIgG−AD発現ベクターに変換することができる。Fab−DDD1の発現ベクターを生成するには、重鎖のヒンジ部、CH2およびCH3ドメインのコード配列をヒンジ部の最初の4
残基、14 残基Gly−Serリンカー、およびDDD1 (ヒトRIIαの最初の44 残基)をコードする配列で置換する。Fab−AD1の発現ベクターを生成するには、IgGのヒンジ部、CH2およびCH3ドメインの配列をヒンジの最初の4
残基、15 残基Gly−Serリンカー、およびAD1(AKAP−ISと呼ばれる17残基合成AD)をコードする配列で置換する。このAKAP−ISと呼ばれる17残基合成ADは、バイオインフォマティックとペプチドアレイ技術を使って生成され、RIIα二量体を極めて高い親和性(0.4 nM)で結合することが示されている。Altoら、Proc.Natl.Acad.Sci.、USA(2003)、100:4445−50)を参照されたい)。
dHL2プラスミドベクターを鋳型として使い、CH1ドメインをPCRで増幅した。左側のPCRプライマーは、CH1ドメインの上流(5’)端部とSacII
制限エンドヌクレアーゼ部位とから成る。これはCH1のコード配列の5’である。右側のプライマーは、ヒンジ部(PKSC)の最初の4残基をコードする配列と、これに続くグリシン4個とセリン1個から成り、最後の2つのコドン(GS)には、BAM HI制限酵素認識部位を含まれる。
5’側のCH1左側プライマー
5’GAACCTCGCGGACAGTTAAG−3’(配列番号:19)
CH1+G4S−Bam 右側(「G4S」は配列番号:54として開示されている)
5’GGATCCTCCGCCGCCGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGG−3’(配列番号:20)
アンプライマーをpGemT PCR クローニングベクター(Promega社)内にクローニングし、
T7(5’)の配向にある挿入についてクローンのスクリーニングを行なった。
(「(G4S)2」は 配列番号:55として開示されている)
最初の2つのコドンにBamHI制限酵素認識部位が含まれる状態で、リンカーペプチドの11残基の下流に、DDD1のアミノ酸配列がコードするように、Sigma Genosys(Haverhill、UK)
によってニ本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、(G4S)2DDD1(「(G4S)2」は
配列番号:55として開示されている)と命名した。終始コドンおよびEagI制限酵素認識部位を3’末端に付加した。コードしたポリペプチド配列を以下に示す。
GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA
(配列番号:21)
bpのDDD1配列の中心にある154塩基対を含むように結合した。オリゴヌクレオチドをアニールし、Taqポリメラーゼによるプライマー伸張反応に供した。
RIIA1−44上部
5’GTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCAGGGCTACACGGTGGAGGTGCTGCGACAG−3’(配列番号:34)
RIIA1−44下部
5’GCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTGAAGTACTCCACTGCGAATTCGACGAGGTCAGGCGGCTGCTGTCGCAGCACCTCCACCGTGTAGCCCTG−3’(配列番号:35)
G4S Bam−左側(「G4S」は配列番号:54として開示されている)
5’−GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT−3’(配列番号:36)
1−44 終止 Eag右側
5’−CGGCCGTCAAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCG−3’(配列番号:37)
最初の2つのコドンにBamHI制限酵素認識部位が含まれる状態で、リンカーペプチドの11残基の下流に、AD1のアミノ酸配列がコードするようにニ本鎖オリゴヌクレオチド合成し(Sigma Genosys)、(G4S)2−AD1(「G4S2」は、配列番号:55として開示されている)と命名した。
終始コドンおよびEagI制限酵素認識部位を3’末端に付加した。コードしたポリペプチド配列を以下に示す。
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA((配列番号:38)
AKAP−IS上部
5’GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCTGACGGCCG−3’(配列番号:22)
AKAP−IS下部
5’CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCTGCCACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCGGATCC−3’(配列番号:23)
G4S Bam−左側 (「G4S」は配列番号:54として開示されている)
5’−GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT−3’(配列番号:24)
AKAP−S 終止 Eag右側
5’−CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATG−3’(配列番号:25)
DDD1配列をコードしている190bpフラグメントを、BamHIおよびNotI制限酵素を使ってpGemTから切り離した後、CH1−pGemT内の同じ部位にライゲーションして、シャトルベクターCH1−DDD1−pGemTを生成した。
AD1配列を含有する110bpフラグメントを、BamHIおよびNotI制限酵素を使ってpGemTから切り離した後、CH1−pGemT内の同じ部位にライゲーションして、シャトルベクターCH1−AD1−pGemTを生成した。
このモジュラー設計を利用して、CH1−DDD1またはCH1−AD1は任意のIgG−pdHL2
ベクターに組み込むことができる。pdHL2からSacII−EagI制限フラグメント(CH1−CH3)を除去し、それをCH1−DDD1またはCH1−AD1のSacII−EagI
フラグメント(それぞれのpGemTシャトルベクターから切り離す)で置換することにより、重鎖定常ドメイン全体を上記の構築体の1つで置換する。
CH1−DDD2−Fab−hR1−pdHL2は、
CH1−DDD2−Fab−hR1の産生の発現ベクターである。CH1−DDD2−Fab−hR1は、14アミノ酸残基のGly/Serペプチドリンカーを通じて、Fdのカルボキシル末端に付加されたDDD2の二量化およびドッキングドメイン配列を有している。
配列番号:26)の一部およびDDD2の残基1−13をコードする配列を含む、2種類の重なる相補的オリゴヌクレオチドを合成的に作製した。オリゴヌクレオチドをアニールして、T4 PNKでリン酸化した結果、それぞれ制限エンドヌクレアーゼBamHI
およびPstIで消化されるDNAとのライゲーションに適合する5末端と3末端にオーバーハングが生じた。
G4S−DDD2上部 ((「G4S」は 配列番号:54として開示されている)
5’GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA−3’(配列番号:27)
G4S−DDD2下部 ((「G4S」は 配列番号:54として開示されている)
5’GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCAACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCG−3’(配列番号:28)
発現ベクターhR1pdHL2 とライゲーションした。最終発現構築体は、CH1−DDD2−Fab−hR1−pdHL2である。
CH1−AD2−Fab−h679−pdHL2は、CH1−AD2−Fab−h679の産生のための発現ベクターであり、AD2をコードするDNA配列の鋳型として有用である。この発現ベクターは下記のように設計する。AD2をコードする配列およびリンカー配列の一部を含む、2種類の重なる相補的オリゴヌクレオチド (AD2上部およびAD2下部)を合成的に作製した。オリゴヌクレオチドをアニールし、
T4ポリヌクレオチド・キナーゼでリン酸化した結果、それぞれ制限エンドヌクレアーゼBamHI
およびPstIで消化されるDNAとのライゲーションに適合する5末端と3末端にオーバーハングが生じた。
AD2上部
5’GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGATGTGGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCGGCTGCTGAA−3’(配列番号:29)
AD2下部
5’TTCAGCAGCCGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCCACATCCGCCAGACCCGCCACCTCCG−3’(配列番号:30)
とライゲーションし、その結果、CH1−AD2−Fab−h679−pdHL2を生じた。
CH3−AD2−IgGモジュール
には、9アミノ酸残基ペプチドリンカーを通じて、IgGの重鎖のカルボキシル末端にAD2ペプチドが融合されている。AD2ペプチド(CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC、配列番号:18)が後に続くリンカーペプチドのDNAコード配列(GSGGGGSGG、
配列番号:31)を標準組換えDNA方法でCH3(重鎖定常ドメイン3)コード配列の3’末端に連結し、連続的なオープン・リーディング・フレームを生成した。重鎖AD2ポリペプチドを軽鎖ポリペプチドと共発現させると、IgG分子が形成され、2つのAD2ペプチドが処理され、したがって、2つのFab−DDD2二量体を結合することができる。CH3−AD2−IgGモジュールは任意のCH1−DDD2−Fabモジュールと組み合わせることができ、Fcフラグメント1個とFabフラグメント6個とから成る、
種々多様な六価構造体を生成することができる。CH3−AD2−IgGモジュールおよびCH1−DDD2−Fabモジュールが同一の親モノクローナル抗体(MAb)に由来する場合、生じる複合体は単一特異性となり、同一抗体への結合腕を6本有する。モジュールが2つの異なるMAbに由来する場合、生じる複合体は二重特異性となり、CH3−AD2−IgGモジュールの特異性に対応する結合腕を2本とCH1−DDD2−Fabモジュールの特異性に対応する結合腕を4本有する。
ベクターのCH3−AD2−IgG−pdHL2ベクターへの変換を容易にするために、プラスミドシャトルベクターを製造した。鋳型としてpdHL2
ベクターを、プライマーとしてオリゴヌクレオチドFc BglII左側とFc Bam−EcoRI右側 を使って、Fcの遺伝子(CH2およびCH3ドメイン)を増幅した。
Fc BglII 左側
5’−AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG−3’ (配列番号:32)
Fc Bam−EcoRI 右側
5’−GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG−3’(配列番号:33)
制限酵素を使ってpGemTから切り離し、XbaIおよびBamHIを使ってCH1−AD2−Fab−h679−pdHL2を消化することで調製したAD2−pdHL2
ベクターとライゲートし、シャトルベクターFc−AD2−pdHL2を生成した。
発現ベクターをCH3−AD2−IgG−pdHL2発現ベクターに変換するために、861bpのBsrGI/NdeI制限フラグメントを前者から切り離し、Fc−AD2−pdHL2ベクターから切り離した952bpのBsrGI/NdeI制限フラグメントで置換した。BsrGIは、CH3ドメイン中にカットインし、NdeIは発現カセットの下流(3’)をカットする。
DNL法を用いて、CH3−AD2−IgGhR1をCH1−DDD2−Fab−hR1と組み合せることにより。1つのFcと6つのFabを有する単一特異性
抗IGF−1RであるHex−hR1を作製した。 Hex−hR1 は4工程で作製した。
工程1 組合せ: CH3−AD2−IgG−hR1上の各AD2につき2つのCH1−DDD2−Fab−hR1が存在するように、モル比4.2で、pH
7.4のリン酸緩衝食塩水(PBS)中で、CH1−DDD2−Fab−hR1を1mMのEDTAと混合し、CH1−DDD2−Fab−hR1をある程度過剰にすることで、結合反応が確実に完了するようにした。
工程2 穏やかな還元: 還元型のグルタチオン(GSH)を1 mMの終濃度で添加し、この溶液を室温(16−25℃)で1−24時間保持した。
工程3 穏やかな酸化: 還元の後、酸化型グルタチオン(GSSH)を2
mMの終濃度で反応混合物に直接加え、この溶液を室温で1−24時間保持した。
工程4 DNL産物の単離: 酸化の後、反応混合物を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラム上に直接ローディングした。カラムをPBSで洗浄し、Hex−hR1を0.1 Mのグリシン(pH 2.5)で溶離した。反応しなかったCH1−DDD2−Fab−hR1を結合していない部分中の所望の生成物から除去した。他の六価のDNL構築体も、CH3−AD2−IgG
とCH1−DDD2−Fabの選択した対を混合することにより同様に調製することができる。
Zenon標識を付けた種々の親抗体ならびにこれらの抗体から派生した多価抗体を使って、Guava計器でフローサイトメトリーを実施し、複数の癌細胞株の同種抗原の発現レベルを評価した。図10に示すように、IGF−1Rの発現はhR1のMCF−7(乳癌)、CaPan1(膵臓癌)およびDU−145(前立腺癌)への結合により確認した。図11では、ヒト化抗AFP
IgGおよびTF18(hAFPの2つのFabフラグメントが含まれるように、CH1−DDD2−Fab−hAFPをCH1−AD2−Fab−h679
と組み合せることで作製した)の結合ならびにhR1−IgG−AD2(CH3−AD2−IgG−hR1の二量体)および1R−31の結合増加により、HepG2(肝臓癌)におけるIGF−1R
およびAFPの二重発現も示されており、これらの多価DNL構築体は親和性が高くなることを示唆している。Hep G2におけるCEACAM6の発現を、1R15の結合増加を観察することにより認識した。図12に、FACScan上でMCF−7、DU−145およびME−180(子宮頸癌)を使って実施した追加調査を示してあり、表5はその調査の要約である。これらは多価の
DNL構築体はそれぞれの親抗体に比較して、標的細胞株に対して結合増加を示すという、Guavaによる発見を裏付けている。興味深いことに、
多価二重特異性構築体は、問題の抗原を種々のレベルで発現している細胞株において、それぞれの対応する多価単一特異性構築体に比べて、より高い親和性で結合するように見える。
DU−145およびME−180(どちらもIGF−1RおよびEGP−1を発現する)において、IGF−1の増殖刺激活性を中和するHex−hR1または1R−E1の効果を測定するために次の実験を実施した。標的細胞を2000/ウェルで96ウェルプレート内に播種し、完全培地で一晩培養した。細胞を無血清培地で2回洗浄し、0.8、
4、20および100μg/mLで、無血清培地で2時間、選択した多価抗体に暴露した後、IGF−1を添加して、最終濃度を10ng/mLにした。細胞を72時間培養した後、MTSアッセイに供した。以上の条件下では、Hex−hR1はDU−145(図13A)およびME−180(図13B)の増殖を用量依存的に、統計的有意に抑止した。ME−180で1R−E1を使った場合も、同様の結果を得た(図13C)。
抗IGF−1R抗体により誘導される抗癌効果の1つの主要な機構は、抗IGF−1R抗体がアゴニストとアンタゴニストのいずれであるかに関係なく、エンドサイトーシスを通じてIGF−1R
を下方制御し、後にエンドソーム小胞において分解を引き起こすことである。図14に示すように、MCF−7またはHT−29(結腸直腸癌)におけるIGF−1R
の効率的な下方制御が、100nMでのhR1、ならびに陽性対照として使われる市販の2つの抗IGF−1R抗体(MAB391および24−60)によって明確に示されたが、抗CD22抗体であるhLL2(エプラツズマブ)では示されなかった。hLL2は陰性対象として使われる。さらなる研究によって、Hex−hR1および1R−E1は、図15AおよびBで示すように、MCF−7、DU−145およびLnCap(アンドロゲン依存性前立腺癌)において、最低0.1nMの濃度でIGF−1Rのレベルを実質的に減少させることが可能であることが明らかになった。
hR1は、ビーズに固定されたrhIGF−1RへのIGF−1の結合を防止していないように見えるかもしれないが、図16から20にまとめて示してあるように、リン酸化IGF−1R(pIGF−1R)、リン酸化Akt(pAkt)およびリン酸化ERK1/2(pERK1/2)のレベルを減少させ、IGF−1が3つの細胞株(MCF−7、DU−145および
ME−180)で種々の信号伝達分子を活性化するのを効果的にブロックしている。
抗EGFR(C25)または抗HER2(ハーセプチン)などの他の抗体と併用することも、上記のように、治療的に有用である。
乳癌異種移植モデルにおける種々のhR1 構築体の効果
4週齢の雌の 無胸腺(nu/nu)マウスに、0.5mgの17βエストラジオールの60日放出ペレットを移植し(Sachdevら、Cancer Res.2003;63:627−35)
、その後、1,000万個のMCF−7ヒト乳癌細胞を皮下注射した。腫瘍容積を測定し、平均200mm3
に達したら、連続4週間にわたり、1週間に2回、以下の薬剤を投与する腹腔内治療の対象として9匹のマウスの群をランダム抽出した:(1)試験物質と同量の対照生理食塩水;(2)400μgのhR1
IgG;(3)800μgのhR1 IgG; (4)400μgのhRS7 IgG(抗−EGP−1);(5)800μgのhRS7 IgG;(6)300μgの1R−E1 六価構築体(hR1
IgG−hRS7−4個のFab);(7)600μgの1R−E1;および(8)800μgの1R−E1。腫瘍容積の測定は、ランダム抽出と治療を実施した日から始めて、週に2回、測径器を使って双方向で測定した;動物の体重も週に2回測定した。マウスが瀕死状態になるか、20%を超える体重減があったとき、または腫瘍の大きさが2.5cm3達したときに、マウスを犠牲にし、腫瘍および正常組織を除去し、組織学的および免疫組織化学的分析のために、ホルマリンで保存した。60日目までに実験は終了し、対照群での継続的な腫瘍増殖が明らかになった。対照群は治療の開始後、最も早いマウスは5週目で、その後も次の2週のうちに犠牲になった。腫瘍増殖の阻害の証拠は、治療終了後1週間で、第1群については(対照を基準として)20%、第2群については35%、第3群については54%、第4群については11%、第5群については26%、第6群については32%、第7群については51%、第8群については68%
と測定された。これらの結果は、以上の用量のhR1抗体 は、hRS7 (抗−EGP−1)抗体よりも腫瘍増殖の阻害性があることを示しているが、後者の抗体もある程度の抗癌活性を示した。しかし、hR1
およびhRS7の六価の二重特異性抗体構築体は、比較的低い用量で、対応する親抗体に匹敵またはそれより高い抗癌効果を示し、DNLを使って作製される二重特異性抗体構築体のより高い有効性を示唆している。治療に関係する毒性、特に20%を超える体重減は治療群では観察されなかった。
の用量で腹腔投与する、六価hR1群および六価hRS7群を入れて、同一の実験をMCF−7を有する同様のマウスで繰り返し、腫瘍増殖阻害は、六価hR1の場合は25−46%、六価hRS7の場合は20−33%の範囲であることを算出した。これは6価構築体は、対応する2価の親抗体よりも有効性が高いことを示唆している。
ヒト 結腸癌の異種移植におけるhR1構築体の効果
5−6週齢の雌のnu/nu無胸腺マウスの腫瘍異種移植片に、マトリゲルで混合した200万個のBxPC3ヒト膵臓癌またはColo205
ヒト 結腸癌の細胞を皮下注射し、大きさが約200mm3
になるまで放置し、各々11匹の群にランダムに分類した。連続する4週間にわたり、週に2回、様々な用量で食塩水ビヒクル(対照)または試験物質をマウスの腹腔注射することにより処置した。直前の実施例と同じように、腫瘍を測定し、動物の体重を測定し、観察した。腫瘍モデルのそれぞれにつき、以下の用量を投与した。腫瘍増殖阻害率GI(腫瘍増殖の進行のために対照群の20%を超えるマウスが犠牲になる前の処置群対対照群の平均容積を比較している)を括弧内に示す:
BxPC3ヒト膵臓癌モデル
(1)0.5mgのhR1(39%GI)
(2)1.0mgのhR1(68%GI)
(3)0.5mgのhPAM4(15%GI)
(4)1.0mgのhPAM4 (24%GI)
(5)0.5mgのhRS7(18%GI)
(6)1.0mgのhRS7(29%GI)
(7)0.5mgの1R−E1(63%GI)
(8)0.5mgの1R−1M(48%GI)
(9)1.0mgのhLL2(抗CD22 IgG)アイソタイプ対照
Colo205ヒト結腸癌モデル
(1) 0.5mgのhR1(46%GI)
(2) 1.0mgのhR1(70%GI)
(3) 0.5mgのhMN−14(14%GI)
(4) 1.0mgのhMN−14(29%GI)
(5) 0.5mgの14−1R(58%GI)
(6) 1.0mgの14−1R (83%GI)
(7) 1.0mgのhLL2対照.
Charles River Laboratories(Frederick、MD)から入手した6−8週齢の雌のSCIDマウスに移植するために、100万個の細胞を収穫できる密度まで、AGヒト骨髄腫細胞を細胞培養で増殖した。Steinら(Blood、2004;104:3705−11)が記述しているように、5−10x166
の骨髄腫細胞を静脈注射する3日前に、マウスにはフルダラビンおよびシクロホスファミドで事前に処置を施し、免疫を抑制した。マウスは毎日検査して、苦痛または後ろ肢麻痺の兆候がないかを調べ、毎週、体重を測定した。後ろ肢麻痺または
> 20%の体重減を生存終点として用い、その状態になると、動物を安楽死させた。8−10匹のマウスから成る群を使った。hR1の用量を100、
300、600および1,000μgとして、4週間にわたり、週に2回、 hR1を腹腔内投与する用量反応研究では、生理食塩水ビヒクルまたは未反応性のアイソタイプ対照抗体を使って処置されたマウス(平均生存期間は40日だった)に比べて生存の大幅な向上(P<0.03)が見られた。hR1で処置したマウスの平均生存期間は80日から100日に及び、用量反応を示している。hR1とボルテゾミブを併用する効果について、同じ骨髄腫モデルで評価した。骨髄腫細胞の注入後5日目から開始して、3週間にわたり、週に2回、腹腔投与として処置を施した。
単一薬剤として与えた場合、0.5mg/kgボルテゾミブでは体重減が起こらず、良好に耐えられた。未処置の対照マウスにおける平均生存期間は33日で、ボルテゾミブのみを40日間与えた場合は40日(21.2%の増加)だった。3週間、週に2回、マウス1匹につき0.6mgでhR1での処置を繰り返した群では、平均生存期間は60日に増加した。ボルテゾミブとhR1の処置を併用した群では、0.5mgのボルテゾミブ+0.6mgのhR1の場合、平均生存期間はさらに79日という有意な増加(p=0.04)を示した。したがって、骨髄腫の治療において活性のある薬剤は、この抗IGFR1抗体と併用することにより、活性の増加を示す。
YSは、2ヵ月前に、ステージIII/IVの転移性で手術不可能な膵臓腺癌と診断された61歳の男性で、膵臓の先端部に直径6cmの膵臓病変と肝臓に直径約3cmと約4cmの2つの転移がある。この患者はCA19.9の滴定濃度の上昇(7,200)を示しているが、他の臨床検査値のほとんどは境界線または正常範囲内にある。男性は活発だが、疲労しやすく、
最小量の薬物投与を必要とする腹痛に時々襲われ、診断以降、体重が約10kg減少した。男性は、1週間に1回200mg/m2でゲミシタビン(GEMZAR(登録商標))を静脈から注入すること、免疫シンチグラフィーによって抗体局在を評価するために、(Sharkeyらによる[J Nucl Med.2003年12月;44(12):2000−18]の記述に従って標識を付けた)111In−DOTA−hPAM4抗体も1週目に注入した後、次の連続する3週間、毎週(Sharkeyらによる同書の記述に従って標識を付けた)12mCi/m2の90Y−DOTA−h PAM4を注入することから成る、4週間の治療を必要とする治験中の治療を選んだ。1日目、7日目、14日目および21日目に、hR1を
10mg/kg、16mg/kg、16 mg/kgおよび20mg/kgの用量で 静脈注入した。患者はグレード1−2の悪心、背痛、低血圧、食欲不振および疲労を注入の各回後に経験したが、回を重ねるごとに重症度は減少し、軽度だった。これは注入反応を抑制するために、50mgのヒドロコルチゾン、アセトアミノフェンおよびジフェニルヒドラミンを前投与しておいたことによる。治療後4週間目に、患者にFDG−PETおよびCTスキャンを実施し、治療前と治療後の膵臓癌病変の代謝および大きさを比較し、血液を採取して、CA19−9腫瘍バイオマーカー滴定濃度を測定した。原発癌のSUVは、8.9から3.3に変化し、肝臓の2箇所の転移性病変はそれぞれ6.1と5.3から5.3と3.5にそれぞれ大幅に減少していた。CTの測定値は、原発腫瘍は1cmの減少を、2箇所の肝臓転移性病変は約33%の減少を示した。このとき、CA19.9の滴定濃度は930で、7,200から大きく低下したことを示した。4週間後の経過観察では、SUV値の連続した低下および腫瘍の大きさの安定化または多少の減少がCT測定により確認された。患者の疾患が安定していたため、3ヶ月後、治療を繰り返し、患者は良好に耐え、再度安定した疾患を示し、
次の4週後の経過観察でCA19.9の滴定濃度の増加は見られなかった。この併用療法は、最低でも、疾患を安定化させ、腫瘍の代謝活性を低下させ、膵臓癌の血液バイオマーカーであるCA19−9を著しく減少させると結論づけられる。この患者はこの期間、通常、活発であり、疲労または苦痛を感じず、体重を4kg取り戻した。血液学的異常もその他の検査所見の異常もなかった。
RSは、重病歴のない71歳の女性で、6ヶ月前のS状結腸B3腺癌の切除後に転移性結腸癌を示していた。女性は術後の放射線療法も化学療法も拒否していた。女性の血液CEA滴定濃度は11ng/mLで上昇していた。FDG−PET/CT撮影で、原発切除部位での再発は見つからなかったが、肝臓の右葉に別々の病変3つ(直径2−4cm)と肝臓の左葉に比較的大きな病変(6cm)1つが見つかった。サルベージ肝臓切除の候補ではなかったため、患者はhR1治療と組み合わせたFOLFIRI併用療法を受けた。1日目に、1, 180mg/m2のイリノテカンを2時間の注入で、500mlの生理食塩水で与え、1日目および2日目に、400mg/m2
のフォリン酸を2時間かけて、静脈内ボーラスで注入した後、2週間ごとに、連続46時間注入で
フルオロウラシル(2,400mg/m2)を投与した。抗IGF−1R抗体、hR1を10mg/kgで、2週間、週に1回、遅い注入速度で与え、直前の患者の実施例と同様、前投薬も行なった。この併用療法を8サイクル実施した。治療完了の6週間後、FDG−PET/CTスキャンによって、左葉の転移病変の大きさは60%減少して、SUVも減少し、右葉の3つの転移病変のうちの2つは直径1cmに見え、3つ目の病変は大きさが変わっていないことが分かった。3つの病変のうち、2つのSUV値はほぼ0まで減少し、3つ目は3.2になった。CEAの循環に変化は見られなかった。さらに6週間後、右葉の転移病変の3つのうちの2つは見えなくなり、3つ目は直径約1.5cmになった。左葉の腫瘍は、現在、直径3cmと測定される。この患者は、部分反応状態にあるとみなされ、治療終了の8ヶ月後、この状態が継続している。
黄疸、不快感、体重減、全身の脱力感のある57歳の男性が、コンピュータ断層撮影により、手術不可能な肝細胞癌と診断された。癌は肝臓の右葉に直径約6cmに及ぶように見え、左葉にも3cmの病変と見えるものが1つあった。右葉の病変は生検により肝細胞癌と確認された。
患者はこの後、治療後4−8週間ごとに、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンを繰り返し、さらに血中AFP、ビリルビン、アミノ酸転移酵素およびLDHの濃度により、反応をモニタリングした。
ng/mLで、これも改善していた。肝臓疾患のCT測定では、左葉病変のほぼ完全な消失と右葉の比較的大きな塊の40%の減少が示された。左葉に残っている小さな病変は癌ではなく、瘢痕組織であると判断されるため、この後、患者は右葉の外科的切除の候補になった。
62歳の男性は、3年前にデュークスC直腸癌を切除した後、放射線治療および5−フルオロウラシル/フォリン酸化学療法を受けた病歴を持つ。患者は血漿CEA
滴定濃度の上昇を示し始めていて、濃度は30ng/mLに到達しようとしている。再発が疑われるため、患者に様々な診断手順を実施した。コンピュータ断層撮影により、肝臓に転移病変が2つあり、一方は右葉に存在し、直径3cmに及び、他方は左葉で、葉間間膜付近に存在し、多少小さいことが分かった。患者には、まず10mg/kgのhR1抗体を週に1回、3回投与した後、裸のhR1治療の3週目、3回目のhR1注入の前に、hR1抗体にコンジュゲートした用量の25mCiの90Yを、50mgのタンパク質量で2時間かけて、静脈内注入によって投与した。この治療を2ヵ月後に繰り返した。最後の治療注入の2−4週後に測定したところ、患者は白血球の数と血小板の低下を示したが、
治療8週間後の評価では回復していた。治療の3ヶ月後でのコンピュータ断層撮影では、肝臓の右葉の一番大きな腫瘍転移は40%縮小し、左葉の腫瘍もそれより低い割合で縮小していることが分かった。
乳腺癌の再発歴がある56歳の女性が、頸部リンパ節および左肺に転移を示している。女性は化学療法とホルモン療法の後に2回、再発した。その後、女性には100mgの抗体のタンパク質量で、各々15mCiの90Yの投与量で、90YにコンジュゲートしたhR1
MAbをそれぞれ1週間の間隔をあけて、3回治療的に静脈内注入した。治療の4週間後、女性の白血球および血小板の数は約50%減少したが、治療の9週間後に回復した。治療の12週間後の再ステージング(restaging)では、肺および節の転移病変は、コンピュータ断層撮影で、約30%減少していると測定された。したがって、患者は各々4時間をかけて、裸のhR1抗体の注入を週に1回、4回受けた。患者は一時的にやや悪寒や寒気を感じたことを除き、治療に良好に耐え、血球の数にも、血液の化学的性質にも一切副作用はなかった。1回に注入する裸の抗体の用量は12mg/kgであった。約8週間後、コンピュータ断層撮影による再ステージングでは、測定可能な病変が約20パーセントさらに縮小したことが示された。3ヶ月後の追跡検査で、患者の疾患は安定しているように見えた(すなわち、追加的増殖および進行的増殖の証拠はなかった)。
Claims (55)
- ヒトIGF−1Rのアミノ酸残基151から222の間のIGF−1Rのシステインリッチドメインの前半部を含むIGF−1Rのエピトープに結合する抗IGF−1R(インスリン様増殖因子1型受容体)抗体またはその抗原結合フラグメント。
- 前記抗体が、(i)ヒトIGF−1Rには結合するが、ヒトインスリン受容体
(IR)には結合しない;(ii)IGF−1Rのアゴニストではない;(iii)IGF−1またはIGF−2の単離されたIGF−1Rへの結合をブロックしない;
(iv)無傷細胞において、IGF−1によるIGF−1Rの活性化を中和する;および(v)可変領域配列の配列番号:9および配列番号:10を含むhR1抗体のIGF−1Rへの結合をブロックする、から成る群から選択される機能特性を少なくとも1つ発揮する請求項1に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。 - 前記抗IGF−1R抗体が、単離されたIGF−1Rへの結合について、
抗IGF−1R抗体24−31、24−57、17−69、1−2、1H7、2C8または3B7と競合しない、請求項1に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。 - 前記抗IGF−1R抗体が、単離されたヒトIGF−1Rのアミノ酸残基1−150、223−274、184−283、
283−440、440−514、514−586 または1323−1337に結合しない、請求項1に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。 - 前記抗IGF−1R抗体が、重鎖可変領域相補性決定領域(CDR)配列CDR1(DYYMY、配列番号:1)、CDR2(YITNYGGSTYYPDTVKG、
配列番号:2)およびCDR3(QSNYDYDGWFAY、配列番号:3)ならびに軽鎖可変領域CDR配列CDR1(KASQEVGTAVA、
配列番号:4)、CDR2(WASTRHT、配列番号:5)およびCDR3(QQYSNYPLT、配列番号:6)を含む、請求項1に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。 - 重鎖可変領域CDR配列CDR1(DYYMY、配列番号:1)、CDR2
(YITNYGGSTYYPDTVKG、配列番号:2)およびCDR3 (QSNYDYDGWFAY、配列番号:3)、ならびに軽鎖可変領域CDR配列CDR1(KASQEVGTAVA、 配列番号:4)、CDR2(WASTRHT、配列番号:5)およびCDR3(QQYSNYPLT、 配列番号:6)を含む、R1抗体の単離されたヒトIGF−1Rへの結合をブロックする、抗IGF−1R抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 前記抗IGF−1R抗体が、ヒトIGF−1Rのアミノ酸残基151から222の間の、IGF−1Rのシステインリッチドメインの前半部を含むIGF−1Rのエピトープに結合する、請求項6に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。
- 前記抗体が、(i)ヒトIGF−1Rには結合するが、ヒトインスリン受容体(IR)には結合しない;(ii)IGF−1Rのアンタゴニストではない;(iii)単離されたIGF−1RへのIGF−1またはIGF−2の結合をブロックしない;(iv)無傷細胞においてIGF−1によるIGF−1Rの活性化を中和する、から成る群から選択される機能的特性を少なくとも1つ発揮する、請求項6に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。
- 前記抗体またはフラグメントが、裸の抗体またはフラグメントであるか、あるいは少なくとも1つの診断薬または治療薬にコンジュゲートしている、請求項6に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。
- 重鎖可変領域CDR配列CDR1(DYYMY、配列番号:1)、CDR2(YITNYGGSTYYPDTVKG、配列番号:2)およびCDR3(QSNYDYDGWFAY、
配列番号:3)ならびに軽鎖可変領域CDR配列CDR1(KASQEVGTAVA、配列番号:4)、CDR2(WASTRHT、配列番号:5)およびCDR3 (QQYSNYPLT、 配列番号:6)を含む、抗IGF−1R抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体が、(i)ヒトIGF−1Rには結合するが、ヒトインスリン受容体 (IR)には結合しない;(ii)IGF−1Rのアゴニストではない;(iii)単離されたIGF−1RへのIGF−1またはIGF−2の結合をブロックしない;(iv)無傷細胞におけるIGF−1によるIGF−1Rの活性化を中和する;(v)可変領域配列の配列番号:9および配列番号:10を含むhR1抗体のIGF−1Rへの結合をブロックする;および(vi)ヒトIGF−1Rのアミノ酸残基151から222の間のIGF−1Rのシステインリッチドメインの前半部を含むIGF−1Rのエピトープに結合する、から成る群から選択される機能的特性を少なくとも1つ発揮する、請求項10に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。
- 前記抗IGF−1R抗体が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項10に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。
- 前記抗IGF−1R抗体が、ヒト抗体由来のフレームワークおよび定常領域配列を含むヒト化抗体である、請求項12に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。
- 前記ヒト化抗IGF−1R抗体が、配列番号:9(hR1 VH)および配列番号:10(hR1 VK)のアミノ酸配列を含むヒト化R1(hR1)抗体である、請求項13に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。
- 前記ヒト化抗IGF−1R抗体の可変領域配列が、配列番号:9および
配列番号:10に対して、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%の配列相同性を有する、請求項13に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。 - 配列番号:9および配列番号:10の配列において保存的アミノ酸置換が20個以下である場合を除き、前記ヒト化抗IGF−1R抗体の可変領域配列が、配列番号:9および配列番号:10のアミノ酸配列を含む、請求項13に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。
- 前記抗IGF−1R抗体が、ヒト抗体定常領域配列に付加された配列番号:7(R1 VH)および配列番号:8(R1 VK)のアミノ酸配列を含むキメラR1(cR1)抗体である、請求項13に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。
- 前記キメラ抗IGF−1R抗体の可変領域配列が、配列番号:7および
配列番号:8に対して、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または少なくとも99%の配列相同性を有する、請求項13に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。 - 配列番号:7および 配列番号:8の配列において保存的アミノ酸置換が20個以下である場合を除き、前記キメラ抗IGF−1R抗体の可変領域配列が、配列番号:7および
配列番号:8のアミノ酸配列を含む、請求項13に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。 - 前記抗体が裸の抗体である、請求項10に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。
- 前記抗体が(i)少なくとも1つの治療薬、(ii)少なくとも1つの診断薬、または(iii)少なくとも1つの治療薬と少なくとも1つの診断薬である、請求項10に記載の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。
- 前記治療薬が、放射性核種、免疫調節剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、薬物、プロドラッグ、酵素、オリゴヌクレオチド、アポトーシス促進剤、干渉RNA、光活性治療薬、細胞毒性剤、
化学療法剤および毒物から成る群から選択される、請求項21の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。 - 前記診断薬が、放射線同位体、色素、放射線造影剤、超音波造影剤、蛍光標識、化学発光標識、酵素、増強剤および常磁性イオンから成る群から選択される、請求項21の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメント。
- 前記抗体がヒトIgG1またはIgG4抗体の定常領域配列を含む、請求項10に記載の抗IGF−1R抗体。
- 請求項1の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメントを含む融合タンパク質。
- 少なくとも1つの他の抗体またはそのフラグメントに付加された請求項1の抗IGF−1R抗体またはそのフラグメントを含む、多重特異性抗体。
- 他方の抗体が腫瘍関連抗原に結合する、請求項26に記載の多重特異性抗体。
- 前記腫瘍関連抗原が、炭酸脱水酵素IX、CCCL19、CCCL21、
CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20, IGF−1R、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CEACAM5、
CEACAM6、B7、ED−Bフィブロネクチン、因子H、FHL−1、Flt−3、葉酸受容体、
GROB、HMGB−1、低酸素誘導因子(HIF)、HM1.24、インスリン様増殖因子−1(ILGF−1)、IFN−γ、 IFN−α、IFN−β、IL−2、IL−4R、IL−6R、IL−13R、IL−15R, IL−17R、IL−18R、IL−6、IL−8、IL−12、IL−15、IL−17、 IL−18、IL−25、IP−10、MAGE、mCRP、MCP−1、 MIP−1A、
MIP−1B、 MIF、 MUC1、 MUC2、 MUC3、
MUC4、 MUC5、PAM4 抗原、NCA-95、NCA-90、PSMA、EGP−1、EGP−2、AFP、Ia、HM1.24, HLA−DR、テネイシン、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn 抗原、Thomson−Friedenreich抗原、腫瘍壊死抗原、TNF−α、
TRAIL受容体(R1およびR2)、VEGFR、EGFR、P1GF、補体因子 C3、C3a、C3b、C5a、C5、および癌遺伝子産物から成る群から選択される、請求項27に記載の多重特異性抗体。 - 他方の抗体が標的化可能な構築体上のハプテンに結合する、請求項26に記載の多重特異性抗体。
- 他方の抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項26に記載の多重特異性抗体。
- 他方の抗体が、hPAM4、hA20、hA19、hIMMU31, hLL1、hLL2、hMu-9、hL243、hMN−14、hMN−15、hMN−3、hRS7、h679およびh734 抗体から成る群から選択される、請求項26に記載の多重特異性抗体。
- 多重特異性抗体が二重特異性抗体である、請求項26に記載の多重特異性抗体。
- IGF−1Rを発現する癌を罹患した個人への、請求項1に記載の抗IGF−1R抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を含む、癌の診察または治療の方法。
- 前記抗IGF−1R抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項33に記載の方法。
- 前記抗IGF−1R抗体が、重鎖CDR配列CDR1(DYYMY、 配列番号:1)、CDR2(YITNYGGSTYYPDTVKG、配列番号:2)およびCDR3(QSNYDYDGWFAY、 配列番号:3)ならびに軽鎖CDR配列CDR1(KASQEVGTAVA、 配列番号:4)、CDR2(WASTRHT、
配列番号:5)およびCDR3(QQYSNYPLT、配列番号:6)を含む、請求項33に記載の方法。 - 前記抗IGF−1R抗体が、配列番号:9 (hR1 VH)および 配列番号:10(hR1 VK)のアミノ酸配列を含むヒト化R1抗体である、請求項33に記載の方法。
- 前記抗IGF−1R抗体が裸の抗体である、請求項33に記載の方法。
- 前記方法が癌の治療方法であり、少なくとも1つの他の治療薬を個人に投与することをさらに含む、請求項37に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの他の治療薬が、放射性核種、 免疫調節剤、血管新生阻害剤、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、ホルモン、薬物、プロドラッグ、酵素、オリゴヌクレオチド、干渉RNA、アポトーシス促進剤、光活性
治療薬、 細胞毒性剤、 化学療法剤、抗体、抗原結合抗体フラグメントおよび毒物から成る群から選択される、請求項38の方法。 - 前記少なくとも1つの他の治療薬が、EGFR阻害剤、エルロチニブ、抗EGFR抗体、IGF−1R阻害剤、トリホスチン、AG1024、
AG538、ピロロ[2,3−d]−ピリミジン誘導体、NVP−AEW541および第2の抗IGF−1R抗体から成る群から選択される、請求項39に記載の方法。 - 前記少なくとも1つの他の治療薬が、5‐フルオロウラシル、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−1、ブスルファン、カリチアマイシン、カンプトセシン、カルボプラチン、10−ヒドロキシカンプトセシン、カルムスチン、セレブレックス、クロラムブシル、シスプラチン(CDDP)、コックス−2阻害剤、イリノテカン(CPT−11)、SN−38、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、2−ピロリノドキソルビシン(2P−DOX)、シアン−モルフォリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エピルビシン・グルクロニド、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エストロジェン受容体結合剤、エトポシド(VP16)、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、フロキシウリジン(FUdR)、3′,5′−O−ジオレオイル−FudR(FUdR−dO)、フルダラビン、フルタミド、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、L−アスパラギナーゼ、レナリダミド、ロイコボリン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、6−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリコマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ペントスタチン、PSI−341、ラロキシフェン、セムスチン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド、DTIC、トランスプラチナ、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビンカアルカロイドから成る群から選択される、請求項39に記載の方法。
- 前記方法が癌治療方法であり、前記抗IGF−1R抗体が少なくとも1つの治療薬に付加される、請求項33に記載の方法。
- 前記方法が癌の診断方法であり、前記抗IGF−1R抗体が少なくとも1つの診断薬に付加される、請求項33に記載の方法。
- 前記診断薬が、放射線同位体、色素、放射線造影剤、超音波造影剤、蛍光標識、化学発光標識、酵素、増強剤および常磁性イオンから成る群から選択される、請求項43に記載の方法。
- 前記抗IGF−1R抗体またはそのフラグメントが融合タンパク質または二重特異性抗体の一部になっている、請求項43に記載の方法。
- 免疫調節剤が、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−21、IL−25、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、TNF−アルファおよび「S1因子」と命名された肝細胞増殖因子から成る群から選択される、請求項39に記載の方法。
- ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、メラノーマ、膠芽細胞腫、胸部、結腸、直腸、胃、前立腺、肝臓、腎臓、胆管、膵臓、肺、子宮内膜、頸部、卵巣、食道、甲状腺髄様、膀胱、頭頸部、皮膚癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、星状細胞腫および神経膠腫から成る群から癌が選択される、請求項33に記載の方法。
- IGF−1Rを発現する癌を罹患した個人への、請求項6に記載の抗IGF−1R抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を含む、癌の治療方法。
- IGF−1Rを発現する前癌または異形成病変を罹患した個人への、請求項10に記載の抗IGF−1R抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を含む、前癌または異形成病変の治療方法。
- IGF−1Rを発現する癌を罹患した個人への、請求項10に記載の抗IGF−1R抗体またはその抗原結合フラグメントの投与を含む、癌の治療方法。
- 請求項1に記載の抗IGF−1R抗体をコードする単離された核酸。
- 配列番号:9および配列番号:10の配列をコードする、請求項51の単離された核酸。
- 請求項51に記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
- 請求項53に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- a)請求項53に記載の発現ベクターを含む宿主を取得すること;および
b)抗IGF−1R抗体またはフラグメントを発現するために培地で宿主細胞を培養すること
を含む、抗IGF−1R抗体またはそのフラグメントを製造する方法。
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