MXPA05009837A - Anticuerpos para el receptor del factor de crecimiento tipo insulina-i, para el tratamiento de canceres. - Google Patents

Abstract

Se proveen anticuerpos especificos para el receptor del factor de crecimiento tipo insulina I (IGF-IR); los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden bloquear la union del IGF-I al IGF-IR; pueden usarse anticuerpos antagonistas para bloquear la union del IGF-I al IGF-IR o inhibir sustancialmente la activacion del IGF-IR; los anticuerpos del IGF-IR pueden incluirse en composiciones farmaceuticas, articulos de fabricacion o equipos; se proveen tambien metodos para el tratamiento de cancer, inflamacion y condiciones patologicas del higado, usando los anticuerpos del IGF-IR.

Description

ANTICUERPOS PARA EL RECEPTOR DEL FACTOR DE CRECIMIENTO TIPO INSULINA-I, PARA EL TRATAMIENTO DE CANCERES CAMPO DE LA INVENCION Esta solicitud se refiere a anticuerpos del receptor del factor de crecimiento tipo insulina I (IGF-I), en particular antagonistas de la unión del IGF-I y el IGF-II al receptor del IGF-I. La solicitud se refiere también al uso de los anticuerpos en terapia o diagnóstico de condiciones patológicas particulares en mamíferos, incluyendo cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El factor de crecimiento tipo insulina I (IGF-I; denominado también somatomedina-C), es un miembro de una familia de hormonas polipeptídicas relacionadas que incluyen también insulina, factor de crecimiento tipo insulina II (IGF-II), y más distantemente factor de crecimiento nervioso. Cada uno de estos factores de crecimiento hormonal tiene un receptor cognado al cual se une con alta afinidad, pero algunos pueden unirse también (aunque con menor afinidad) a los otros receptores (para una revisión, véase Rechler y Nissley, Ann. Rev. Physiol. 47: 425-42 (1985). El IGF-I estimula la diferenciación celular y proliferación celular, inhibe la apoptosis, y es requerido por la mayoría de los tipos de células de mamífero para proliferación sostenida. Estos tipos de células incluyen, entre otros, fibroblastos diploides humanos, células epiteliales, células de músculo liso, linfocitos T, células neurales, células mieloides, condrocitos, osteoblastos y células madre de médula ósea. Para una revisión de la amplia variedad de tipos de células para los cuales la interacción del IGF-I/receptor del IGF-I media la proliferación celular, véase Goldring et al., Eukar, Gene Express., 1 : 31-326 (1991). El primer paso en la vía de transducción que lleva a la diferenciación o proliferación celular estimulada por el IGF-I, es la unión del IGF-I o !GF-II (o insulina a concentraciones suprafisiológicas) al receptor del IGF-I. El receptor del IGF-I se forma de dos tipos de subunidades: una subunidad alfa (una proteína de 130-135 kDa que es enteramente extracelular y funciona en la unión al ligando) y una subunidad beta (una proteína de transmembrana de 95 kDa, con dominios citoplásmico y de transmembrana). El IGF-IR pertenece a la familia de receptores del factor de crecimiento de tirosina cinasa (Ulrich et al., Ce// 61 : 203-212, 1990), y es estructuralmente bastante similar al receptor de insulina (Ulrich et al., EMBO J. 5: 2503-2512, 1986). Otros miembros de la familia incluyen al receptor relacionado con la insulina, y los denominados receptores híbridos formados cada uno de una subunidad del receptor de. insulina e IGF-IR. El IGF-IR es sintetizado inicialmente como un polipéptido pro-receptor de cadena sencilla, el cual es además modificado post-traducción mediante glucosilación, digestión proteolítica por convertasas de pre-proteína, y formación de enlaces disulfuro, para ensamblar un heterotetrámero maduro de 460 kDa formado de dos subunidades alfa extracelulares de 130-135 kDa y dos subunidades beta de transmembrana de 90-95 kDa (Massague y Czech, J. Biol. Chem. 257: 5038-6045, 1982). Las subunidades beta poseen actividad intrínseca de tirosina cinasa del receptor requerida para todas las funciones del IGF-IR (Kato et al., Mol. Endocrínol. 8: 40-50, 1994), mientras que las subunidades alfa son enteramente extracelulares y poseen la actividad de unión al ligando del IGF-IR. In vivo, los niveles del IGF-I en suero dependen de la presencia de la hormona de crecimiento (GH) de la pituitaria. Aunque el hígado es el sitio principal de la síntesis del IGF-I dependiente de GH, un gran número de tejidos extrahepáticos producen también IGF-I (Daughaday y Rotwein, Endocrine Rev. 10: 68-91 (1989). Una variedad de tejidos neoplásicos puede producir también IGF-I (Werner y LeRoith, Adv. Cáncer Res. 68: 183-223 (1996). De esta manera, el IGF-I puede actuar como un regulador de la proliferación celular normal y anormal mediante mecanismos autocrinos o paracrinos, así como endocrinos. El IGF-I y el IGF-I I se unen a proteínas de unión al IGF (IGFBPs) in vivo. Después de la unión a IGFs, las IGFBPs transportan IGFs a través de la circulación, o pueden proteger a los IGFs de la inactivación y digestión proteolítica. La disponibilidad de IGF libre para interacción con el IGF-IR, es modulada por las IGFBPs. Para una revisión de IGFBPs e IGF-I, véase Grimberg, et al., J. Cell. Physiol. 183: 1-9, 2000. Existe evidencia considerable para una función del IGF-I y/o el IGF-IR en el mantenimiento de células tumorales in vitro e in vivo. Los niveles del IGF-IR están elevados en tumores de pulmón (Kaiser eí al., J. Cáncer. Res. Clin. Oncol. 119: 665-668, 1993; Moody et al., Life Sciences 52: 1161-1 173, 1993; Macauley et al., Cáncer Res., 50: 2511 2517, 1990), mama (Pollak et al., Cáncer Lett. 38: 223-230, 1987; Foekens eí al., Cáncer Res. 49: 7002-7009, 1989, Cullen et al., Cáncer Res. 49: 7002-7009, 1990; Arteaga eí al., J. Clin. Invest. 84: 1418-1423, 1989), próstata (HellaweII eí al., Cáncer Res. 62: 2942-2950, 2002) y colon (Remaole-Bennet eí al., J. Clin. Endocrínol. Metab. 75: 609-616, 1992; y Guo et al., Gastroenterol. 102: 1 101-1108, 1992). Además del IGF-IR de tipo silvestre, las células transformadas y las células tumorales pueden expresar también los denominados receptores híbridos formados de una subunidad alfa y beta individual, cada una del IGF-IR y el receptor de insulina (Soos eí al., Biochem. J. 270: 383-390, 1990) y Bailyes eí al., Biochem. J. 327: 209-215, 1997). Se ha detectado fosforilación intensificada de tirosina del IGF-IR en meduloblastoma humano (Del Valle eí al., Clin. Cáncer Res. 8: 1822-1830, 2002) y en cáncer de mama humano (Resnik et al., Cáncer Res. 58: 1159-1164, 1998). La expresión desregulada del IGF-I en epitelio de próstata, lleva a neoplasia en ratones transgénicos (DiGiovanni eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97: 3455-60, 2000). Además, el IGF-I parece ser un estimulador autocrino de gliomas humanos (Sandberg-Nordqvist eí al., Cáncer Res. 53: 2475-2478, 1993), mientras que el IGF-I estimula el crecimiento de fibrosarcomas que sobreexpresaron el IGF-IR (Butier eí al., Cáncer Res. 58: 3021-27, 1998). Además, los individuos con niveles "altos normales" de IGF-I tienen un riesgo incrementado de cánceres comunes en comparación con individuos con niveles de IGF-I en la escala "baja normal" (Rosen eí al., Trends Endocrinol. Metab. 10: 136-41 , 1999). Muchos de estos tipos de células tumorales responden al IGF-I con una señal proliferativa en cultivo (Nakanishi eí al., J. Clin. Invest. 82: 354-359, 1988; Freed et al., J. Mol. Endocrinol. 3: 509-514, 1998), y se han postulado bucles autocrinos o paracrinos para proliferación in vivo (LeRoith et al., Endocríne Revs. 16: 143-163, 1995; Yee er a/., Mol. Endocrinol. 3: 509-514, 1989). Se ha encontrado sobreexpresión del IGF-IR en carcinomas colorrectaies (Weber eí al., Cáncer 95: 2086-2095, 2002). Para una revisión del sistema del factor de crecimiento tipo insulina como un objetivo terapéutico en cáncer colorrectal, véase Hassan A. B. & Macaulay (Anals of Oncology 13: 349-356, 2002). Para una revisión de la función que tiene la interacción del IGF-l/receptor del IGF-I en el crecimiento de una variedad de tumores humanos, véase Macaulay, Br. J. Cáncer, 65: 311-320, 1992, y Werner y LeRoith, Adv. Cáncer Res. 68: 183-223, 1996. Muchos procedimientos que interfieren con la actividad y/o la expresión del IGF-IR se han usado in vitro e in vivo para demostrar la función crítica de este receptor en la biología de células tumorales. Mediante el uso de vectores de expresión antisentido u oligonucleótidos antisentido para el ARN del IGF-IR, se ha mostrado que la interferencia con el IGF-IR lleva a inhibición del crecimiento celular mediado por el IGF-I o mediado por el IGF-I I (véase, por ejemplo, Wraight eí al., Nat. Biotech. 18: 521-526, 2000). La estrategia antisentido fue útil para inhibir la proliferación celular en varios tipos de células normales y en líneas de células tumorales humanas. Puede inhibirse también el crecimiento usando análogos de péptidos cíclicos del IGF-I (Pietrzkowski ef al., Cell Growth & Diff. 3: 199-205, 992; y Pietrzkowski eí ai, Mol. Cell. Biol., 12: 3883-3889, 1992), o un vector que exprese un ARN antisentido para el ARN del IGF-I (Trojan ef al., Science 259: 94-97, 1992). Además, anticuerpos para el IGF-IR, especialmente un anticuerpo monoclonal de lgG1 de ratón designado como lR3 (Kull ef al., J. Biol. Chem. 258: 6561-6566, 1983), puede inhibir la proliferación de muchas líneas de células tumorales in vitro e in vivo (Arteaga et al., Breast Cáncer Res. Treat, 22: 101-106, 1992; Rohlik eí al., Biochem Biophys. Res. Commun. 149: 276-281 ; Arteaga ef al., J. Clin. Invest 84: 1418-1423, 1989; Kalebic ef al., Cáncer Res. 54: 5531-5534, 1994). Además, se ha mostrado también que anticuerpos de cadena sencilla contra el IGF-IR inhiben el crecimiento de células de cáncer de mama humano MCF-7 en modelos de xenoinjertos (Li ef al., Cáncer Immunol. Immunother. 49: 243-252, 2000), y llevan a subregulación de los receptores de la superficie de la célula (Sachdev ef al., Cáncer Res. 63: 627-635 (2003). En una estrategia alternativa, la interferencia con la actividad de cinasa del IGF-IR por co-expresión en células de mutantes negativos-dominantes del IGF-IR (Prager ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 91 : 2181-2185, 1994; Li et al., J. Biol. Chem., 269: 32558-32564, 1994 y Jiang et al., Oncogene 18: 6071-77, 1999), puede revertir también el fenotipo transformado, inhibir la tumorigénesis, e inducir pérdida del fenotipo metastásico.

La actividad del IGF-IR favorece también la regulación de la apoptosis. La apoptosis, conocida también como muerte celular programada, interviene en una amplia variedad de procesos del desarrollo, incluyendo maduración y regulación de linfocitos y maduración del sistema nervioso. Además de su función en el desarrollo, se ha implicado también a la apoptosis como una garantía celular importante contra la tumorigénesis (Williams, Cell 65: 1097-1098, 1991 ; Lañe, Nature 362: 786-787, 1993). La supresión del programa apoptótico por una variedad de lesiones genéticas, puede favorecer el desarrollo y la progresión de malignidades. El IGF-I protege a las células hematopoyéticas de la apoptosis inducida por el retiro de IL-3 (Rodríguez-Tarduchy, G. et al., J. Immunol. 149: 535-540, 1992) y del retiro del suero en células Rat-1/mycER (Harrington, E., et ai. EMBO J. 13: 3286-3295, 1994). La función anti-apoptótica del IGF-l es importante en la etapa de post-compromiso del ciclo celular, y también en células bloqueadas en la progresión del ciclo celular por etopósido o timidina. La demostración de que fibroblastos dirigidos por c-myc dependen del IGF-I para su supervivencia, sugiere que existe una función importante para el IGF-IR en el mantenimiento de células tumorales inhibiendo específicamente la apoptosis, una función distinta de los efectos proliferativos del IGF-I o IGF-IR. Esto sería similar a una función que se piensa es ejercida por otros genes anti-apoptóticos, tales como Bcl-2, en la promoción de la supervivencia de células tumorales (McDonnell eí al., Cell 57: 79-88, 1989; Hockenberry et al., Nature 348: 334-336, 1990).

Los efectos protectores del IGF-I sobre la apoptosis, dependen de que tengan el IGF-IR presente sobre células que ¡nteractúan con el IGF-I (Resnicoff et al., Cáncer Res. 55: 3739-3741 , 1995). El apoyo para una función anti-apoptótica del IGF-IR en el mantenimiento de células tumorales, fue provisto también por un estudio usando oligonucleótidos antisentido para el IGF-IR que identificó una relación cuantitativa entre los niveles del IGF-IR, el grado de apoptosis y el potencial tumorigénico de un tumor singénico de rata (Resnicoff et al., Cáncer Res. 55: 3739-3741 , 1995). Se ha encontrado que un IGF-IR sobreexpresado protege a las células tumorales in vitro de la apoptosis inducida por etopósido (Sell et al., Cáncer Res. 55: 303-306, 1995) y, aún más dramáticamente, que una disminución en los niveles del IGF-IR abajo de los niveles de tipo silvestre, causó apoptosis masiva de células tumorales in vivo (Resnicoff et al., Cáncer Res. 55: 24632469, 1995). Estrategias potenciales para la inducción de apoptosis o para la inhibición de la proliferación celular asociada con niveles del receptor del IGF-I incrementados, IGF-II incrementados y/o IGF-IR incrementados, incluyen supresión de los niveles del IGF-I o los niveles del IGF-II, o prevención de la unión del IGF-I al IGF-IR. Por ejemplo, el análogo de somatostatina de acción duradera octeótrido, se ha usado para reducir la síntesis y/o secreción del IGF. Se ha usado IGF-IR soluble para inducir apoptosis en células tumorales in vivo, y para inhibir tumorigénesis en un sistema de animales experimentales (D'Ambrosio et al., Cáncer Res. 56: 4013-20, 1996). Además, se han usado oligonucleótidos antisentido del IGF-IR, análogos de péptidos del IGF-I y anticuerpos para el IGF-IR, para disminuir la expresión del IGF-I o IGF-IR (véase anteriormente). Sin embargo, ninguno de estos compuestos ha sido adecuado para administración a largo plazo a pacientes humanos. Además, aunque se ha administrado el IGF-I a pacientes para el tratamiento de estatura corta, osteoporosis, masa muscular disminuida, neuropatía o diabetes, la unión del IGF-I a IGFBPs ha hecho con frecuencia que el tratamiento con IGF-I sea difícil o ineficaz. Por consiguiente, en vista de las funciones que el IGF-I y el IGF-IR tienen en trastornos tales como cáncer y otros trastornos proliferativos cuando el IGF-I y/o el IGF-IR son sobreexpresados, sería deseable generar anticuerpos para el IGF-IR que pudieran inhibir la expresión y/o actividad del IGF-IR. Aunque se han reportado anticuerpos anti-IGF-IR presentes en ciertos pacientes con enfermedades autoinmunes, ninguno de estos anticuerpos ha sido purificado, y ninguno se ha mostrado que es adecuado para inhibir la actividad del IGF-I para procedimientos clínicos o de diagnóstico. Véase, por ejemplo, Thompson et al., Pediat, Res. 32: 455-459, 1988; Tappy et al., Diabetes 37: 1708-1714, 1988; Weightman et al., Autoimmunity 16: 251-257, 1993; Drexhage eí al., Nether. J. oí. Med. 45: 285-293, 1994. Además, se han reportado anticuerpos monoclonales contra el IGF-IR que pueden estimular la proliferación celular (Xiong et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 5356-5360, 1992). El documento WO 02/053596 describe hibridomas que expresan anticuerpos de IgG anti-IGF-IR obtenidos usando XENOMICE™, y métodos para tratar cánceres usando dichos anticuerpos. De esta manera, sería deseable obtener anticuerpos anti-IGF-IR humanos de alta afinidad que pudieran usarse para tratar enfermedades en humanos. En la presente, los presentes inventores describen anticuerpos totalmente humanos para el IGF-IR obtenidos usando colecciones de presentación visual de fagos, y métodos de uso de los anticuerpos para tratar cánceres en animales.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las figuras 1a-1s muestran alineaciones de las secuencias de aminoácidos de las regiones ligera y pesada de anticuerpos scFvs PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-1 1A3, PINT-11A4, PINT-1 1A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1, PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y anticuerpos scFv PINTEAS del IGF-IR para la secuencia de la línea germinal. Las diferencias entre la secuencia en cuestión y la primera secuencia de la línea germinal, están en negritas y subrayadas. Las secuencias de CDR están resaltadas en cuadros grises. La figura 2a y 2b muestra la inhibición de la unión del IGF-I a fibroblastos NIH 3T3 que expresan el IGF-IR humano por anticuerpos del ÍGF-ÍR 7A6, 9A2 y 12A1 , y la inhibición de la unión del IGF-II a fibroblastos NIH 3T3 que expresan el IGF-IR humano por anticuerpos del IGF-IR 7A4, 8A1 y 9A2, respectivamente. La figura 3 muestra que anticuerpos del IGF-IR 8A1, 9A2 y 11A4 no inhiben la unión de la insulina a células CHO que expresan el receptor de insulina humano. La figura 4 muestra que varios de los anticuerpos del IGF-IR de la invención no bloquean la activación del receptor de insulina en respuesta a la unión al ligando. La figura 5 muestra unión saturable y específica de anticuerpos del IGF-IR 8A1 y 11A4 a fibroblastos NIH 3T3 que expresan el IGF-IR humano. Las figuras 6a-6b muestran que los anticuerpos del IGF-IR 8A1 , 9A2 y 11A4 inhiben la proliferación celular dirigida por el IGF-IR de fibroblastos NIH 3T3 que expresan el IGF-IR humano. La figura 7 muestra capacidad mínima o ninguna capacidad de los anticuerpos del IGF-IR de la invención para inducir fosforilación de tirosina del IGF-IR en fibroblastos NIH 3T3 que expresan el IGF-IR humano mediante análisis Western blot. Las figuras 8a-8d muestran capacidad mínima o ninguna capacidad de los anticuerpos del IGF-IR de la invención para inducir fosforilación de tirosina del IGF-IR en fibroblastos NIH 3T3 que expresan el IGF-IR humano usando un formato de ELISA. Las figuras 9a-9d muestran la capacidad relativa de anticuerpos del IGF-IR 7A2, 7A4, 8A1 , 1 A5, 11A11 y 11 A12 para inhibir la fosforilación de tirosina del dominio de cinasa del IGF-IR dirigida por el IGF-I. La figura 10 muestra que los anticuerpos del IGF-IR 8A1 , 9A2 y 11A4 disminuyen la cantidad de expresión del IGF-IR en la superficie con el tiempo en fibroblastos NIH 3T3 que expresan el IGF-IR humano mediante FACS. La figura 11 muestra que los anticuerpos del IGF-IR 8A1 y 11A4 pueden disminuir la expresión total del IGF-IR asociada a las células con el tiempo en fibroblastos NIH 3T3 que expresan el IGF-IR humano mediante análisis Western blot. Las figuras 12a-12b muestran que los anticuerpos del IGF-IR 8A1 , 9A2 y 11A4 pueden disminuir el nivel del IGF-IR en la superficie en células NIH-3T3 que expresan el IGF-IR humano (subregulación del receptor). La figura 13 muestra que los anticuerpos del IGF-IR 8A1 , 9A2 y 1 A4 pueden disminuir el nivel del IGF-IR expresado por células A549 NSCLC (subregulación del receptor). Las figuras 14a-14d muestran la velocidad de acumulación ¡ntracelular del IGF-IR, midiendo indirectamente la acumulación ¡ntracelular de los anticuerpos monoclonales 8A1 , 9A2 y 11 A4 de la invención, marcados con [125l], en comparación con el IGF-I marcado con [125l] usando células de cáncer de próstata humano que expresan el IGF-IR humano. Las figuras 15a-15f muestran que los anticuerpos del IGF-IR de la invención se unen a los mismos epítopes o epítopes diferentes del IGF-IR en fibroblastos NIH 3T3 que expresan el IGF-IR humano.

Las figuras 16a-16c muestran que los anticuerpos del IGF-IR 8A1 , 9A2 y 11A4 tienen distintos epítopes de unión en el IGF-IR. La figura 17 muestra que los anticuerpos del IGF-IR 8A1 y 11A4 inhiben el crecimiento de tumores, y disminuyen la expresión del IGF-IR en fibroblastos NIH 3T3 que expresan el IGF-IR humano. La figura 18 muestra que el anticuerpo del IGF-IR 8A1 inhibe el crecimiento de tumores y disminuye la expresión del IGF-IR de tumores en fibroblastos NIH 3T3 que expresan el IGF-IR humano. La figura 19 muestra que el anticuerpo del IGF-IR 1 A4 inhibe el crecimiento de tumores y disminuye la expresión del IGF-IR de tumores en fibroblastos NIH 3T3 que expresan el IGF-IR humano.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee un anticuerpo aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une al IGF-IR, de preferencia uno que se une a IGF-IRs de ratón, rata, primate y humano, y más preferiblemente uno que es un anticuerpo humano. La invención provee anticuerpos del IGF-IR que inhiben la unión del IGF-I y el IGF-II al IGF-IR, y provee también anticuerpos del IGF-IR que activan la fosforilación de la tirosina del IGF-IR. La invención provee una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender además otro componente, tal como un agente antitumoral o un reactivo de formación de imágenes. La invención provee también métodos de diagnóstico y terapéuticos. Los métodos de diagnóstico incluyen un método para diagnosticar la presencia o ubicación de un tejido que expresa el IGF-IR usando un anticuerpo del IGF-IR. Un método terapéutico comprende administrar el anticuerpo a un sujeto que necesita del mismo, de preferencia en conjunto con la administración de otro agente terapéutico. La invención provee una línea de células aislada, tal como un hibridoma, que produce un anticuerpo del IGF-IR. La invención provee también moléculas de ácido nucleico que codifican para la cadena pesada y/o ligera o porciones de unión a antígeno de las mismas de un anticuerpo del IGF-IR. La invención provee vectores y células hospederas que comprenden las moléculas de ácido nucleico, así como métodos para producir en forma recombinante los polipéptidos codificados por las moléculas de ácido nucleico. Se proveen también animales transgénicos no humanos que expresan la cadena pesada y/o ligera o porciones de unión a antígeno de las mismas de un anticuerpo del IGF-IR. La invención provee también un método para tratar a un sujeto que necesita del mismo con una cantidad efectiva de una molécula de ácido nucleico que codifica para la cadena pesada y/o ligera o porciones de unión a antígeno de las mismas de un anticuerpo del IGF-IR.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Definiciones v técnicas generales A menos que se defina de otra manera en la presente, los términos científicos y técnicos usados con relación a la presente invención tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por contexto, los términos singulares incluirán pluralidades, y los términos plurales incluirán el singular. En general, la nomenclatura usada con respecto a las técnicas de cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación que se describen en la presente, es la que se conoce bien y se usa comúnmente en la técnica. Los métodos y las técnicas de la presente invención se llevan a cabo en general de acuerdo a métodos convencionales bien conocidos en la técnica, y se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y se discuten a lo largo de la presente especificación, a menos que se indique de otra manera. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), y Ausubel et al., Current Protocols ¡n Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lañe Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1999), citas que se incorporan en la presente como referencia.

Se llevan a cabo reacciones enzimáticas y técnicas de purificación de acuerdo a las especificaciones del fabricante, como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. Las nomenclaturas usadas con respecto a, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica de síntesis y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente, son las que se conocen bien y se usan comúnmente en la técnica. Se usan técnicas estándar para síntesis química, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y suministro, y tratamiento de pacientes. Se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique de otra manera, tienen los siguientes significados: Como se usa en la presente, los términos "factor de crecimiento tipo insulina I" o "IGF-I" y "factor de crecimiento tipo insulina II" o "IGF-II", se refieren a un factor de crecimiento que tiene típicamente los dominios A a D. Los fragmentos del IGF-I o IGF-II constituyen el IGF-I o IGF-II con menos dominios, y variantes del IGF-I o IGF-II pueden tener algunos de los dominios del IGF-I o IGF-II repetidos; ambos incluyen si retienen aún su capacidad respectiva para unirse a un receptor del IGF-I. Los términos "IGF-I" e "IGF-II" incluyen factor de crecimiento de humanos y cualquier especie de mamífero no humano, y en particular IGF-I y el IGF-II humano. Los términos como se usan en la presente, incluyen la forma madura, así como las pre-, pre-pro- y pro-formas, purificadas de una fuente natural, sintetizadas químicamente o producidas en forma recombinante. El IGF-I humano es codificado por la secuencia de ADNc publicada por Jensen M. ef al. {Nature 306: 609-6 1 , 1983). El IGF-II humano es codificado por la secuencia de ADNc publicada por Jensen . eí al. (FEBS 179: 243-246, 1985). Se entenderá que existen y pueden ocurrir variaciones alélicas naturales entre los individuos, según se demuestra mediante una o más diferencias de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de cada individuo. Los términos "receptor del IGF-I" e "IGF-IR", cuando se usan en la presente, se refieren a un receptor celular para el IGF-I y el IGF-II, el cual incluye típicamente un dominio extracelular, un dominio de transmembrana y un dominio intracelular, así como variantes y fragmentos del mismo, que retienen la capacidad para unirse al IGF-I o al IGF-II. Los términos "receptor del IGF-I" e "IGF-IR" abarcan formas solubles de fuentes naturales, producidas en forma sintética in vitro u obtenidas mediante manipulación genética, incluyendo métodos de tecnología de ADN recombinante. Las variantes o fragmentos del IGF-IR comparten de preferencia por lo menos aproximadamente 65% de homología de secuencias, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 75% de homología de secuencias, con cualquier dominio de la secuencia de aminoácidos del IGF-IR humano publicada en Ulrich et al. {EMBO, 5: 2503-2512, 1986). El término "actividad biológica del IGF-I o IGF-II", cuando se usa en la presente, se refiere a cualquier actividad mitogénica, motogénica, anti-apoptótica o morfogénica del IGF-I o IGF-II, o cualquier actividad que ocurra como resultado de la unión del IGF-I o IGF-II al IGF-IR. El término "activación del IGF-IR", se refiere a actividad de tirosina cinasa inducida por el IGF-I o IGF-II dentro de la subunidad beta del IGF-IR. La activación del IGF-IR puede ocurrir como resultado de unión del IGF-I o el IGF-II al IGF-IR, y aunque no descrita hasta la fecha, puede ocurrir en forma alternativa independientemente de la unión del IGF-I o el IGF-II al IGF-IR. Además, puede ocurrir "activación del IGF-IR" después de la unión de un anticuerpo monoclonal del IGF-IR al IGF-IR. Puede determinarse actividad biológica del IGF-I o IGF-II, por ejemplo, en una prueba in vitro o in vivo de proliferación celular, dispersión celular o migración celular inducida por el IGF-I o el IGF-II. El efecto de un antagonista del receptor del IGF-IR puede determinarse en una prueba adecuada para poner a prueba la capacidad del IGF-I o IGF-II para inducir síntesis de ADN en células que expresan el IGF-IR, tales como los fibroblastos 3T3 de ratón transfectados con el IGF-IR humano (descritos en el ejemplo 8). La síntesis de ADN puede ponerse a prueba, por ejemplo, midiendo la incorporación de 3H-timidina en el ADN. La eficacia del antagonista del IGF-IR puede determinarse por su capacidad para bloquear la proliferación e incorporación de la 3H-timidina en el ADN en respuesta al IGF-I o IGF-II. El efecto de antagonistas del IGF-IR puede ponerse a prueba también in vivo en modelos en animales. El término "polipéptido" abarca proteínas nativas o artificiales, fragmentos de proteína y análogos de polipéptido de una secuencia de proteína. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico. El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado", es una proteína o polipéptido que en virtud de su origen o fuente de derivación, ( ) no se asocia con componentes asociados naturalmente que lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza. De esta manera, un polipéptido que es sintetizado químicamente o sintetizado en un sistema celular diferente de la célula del cual se origina naturalmente, estará "aislado" de sus componentes asociados en forma natural. Puede hacerse también que una proteína esté sustancialmente libre de componentes asociados naturalmente mediante aislamiento, usando técnicas de separación y purificación de proteínas bien conocidas en la materia. Una proteína o polipéptido es "sustancialmente puro", "sustancialmente homogéneo" o "sustancialmente purificado", cuando por lo menos aproximadamente 60 a 75% de una muestra exhibe una sola especie de polipéptido. El polipéptido o la proteína pueden ser monoméricos o multiméricos. Una proteína o polipéptido sustancialmente puro comprenderá típicamente aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en p/p de una muestra de proteína, más usualmente aproximadamente 95%, y de preferencia será más de 99% puro. La pureza u homogeneidad de la proteína puede indicarse mediante muchos medios bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguida de visualización de una banda de polipéptido individual tras tinción del gel con un colorante bien conocido en la técnica. Para ciertos propósitos, puede proveerse mayor resolución usando CLAR u otros medios bien conocidos en la técnica para purificación. El término "fragmento de polipéptido", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero en donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de ocurrencia natural. Los fragmentos tienen típicamente por lo menos 5, 6, 8 o más aminoácidos de longitud, de preferencia por lo menos 14 aminoácidos de longitud, más preferiblemente por lo menos 18 aminoácidos de longitud, usualmente por lo menos 20 aminoácidos de longitud, aún más preferiblemente por lo menos 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud. El término "análogo de polipéptido", como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que se forma de un segmento de por lo menos un número de aminoácidos que tiene identidad sustancial con una porción de una secuencia de aminoácidos, y que tiene por lo menos una de las siguientes propiedades: (1) unión específica al IGF-IR bajo condiciones de unión adecuadas, (2) capacidad para bloquear la unión del IGF-I y el IGF-II al IGF-IR, o (3) capacidad para reducir la expresión en la superficie de la célula o la fosforilación de la tirosina ¡n vitro o in vivo del IGF-IR. Típicamente, los análogos de polipéptido comprenden una sustitución (o inserción o deleción) conservativa de aminoácidos con respecto a la secuencia de ocurrencia natural. Los análogos tienen típicamente por lo menos 20 aminoácidos de longitud, de preferencia por lo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud o más, y pueden ser con frecuencia tan largos como un polipéptido de longitud completa de ocurrencia natural. Las sustituciones preferidas de aminoácidos son aquellas que, (1 ) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para la formación de complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión, y (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de dichos análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia diferente de la secuencia de péptidos de ocurrencia natural. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (de preferencia sustituciones conservativas de aminoácidos) en la secuencia de ocurrencia natural (de preferencia en la porción del polipéptido fuera de los dominios que forman contactos ¡ntermoleculares). Una sustitución conservativa de aminoácidos no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia precursora (por ejemplo, un reemplazo de aminoácido no debe tender a romper una hélice que ocurra en la secuencia precursora, o interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caracterizan a la secuencia precursora). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidos en la técnica, se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton,. ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991 )); y Thornton et al. Nature 354: 105 (1991 ), citas que se incorporan en la presente como referencia. Se usan comúnmente análogos no peptídicos en la industria farmacéutica como fármacos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "péptidos miméticos" o "peptidomiméticos". Véase Fauchere, J. Adv. Drug. Res. 15: 29 (1986); Veber y Freidinger TINS p. 392 (1985); y Evans et al. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987), citas que se incorporan en la presente como referencia. Dichos compuestos se desarrollan con frecuencia con ayuda de elaboración de modelos moleculares computarizados. Pueden usarse peptidomiméticos que sean estructural mente similares a péptidos terapéuticamente útiles, para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica deseada), tal como un anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces peptídicos reemplazados opcionalmente por un enlace seleccionado del grupo que consiste de --CH2NH~, --CH2S~, -CH2-CH2--, -CH=CH- (cis y trans), --COCH2-, -CH(OH)CH2- y -CH2SO-, mediante métodos bien conocidos en la técnica. Puede usarse también sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina), para generar péptidos más estables. Además, pueden generarse péptidos constreñidos que comprendan una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso sustancialmente idéntica mediante métodos conocidos en la técnica (véase Rizo y Gierasch Ann. Rev. Bioc em. 61: 387 (1992), cita incorporada en la presente como referencia), por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclicen el péptido. Una "¡nmunoglobulina" es una molécula tetrámera. En una ¡nmunoglobulina de ocurrencia natural, cada tetrámero se forma de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par teniendo una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 1 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como µ, ?, ?, o e, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante se unen mediante una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, en donde la cadena pesada incluye también una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácidos. Véase en general, Fundamental Immunology, capítulo 7 (Paul, W., ed., 2a. ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (cita incorporada en su totalidad en la presente como referencia para todos los propósitos). Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión al anticuerpo, tal que una ¡nmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión.

Las cadenas de inmuno-globulina exhiben la misma estructura general de las regiones de estructura (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, denominadas también regiones determinantes de complementariedad o CDRs. Las CDRs de las dos cadenas de cada par son alineadas por las regiones de estructura, que permiten la unión a un epítope específico. Del N-terminal al C-terminal, las cadenas ligera y pesada comprenden los dominios FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991 )), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987); y Chothia er al. Nature 342: 878-883 (1989). Un "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una porción de unión a antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto por unión específica. Pueden producirse porciones de unión a antígeno mediante técnicas de ADN recombinante o mediante digestión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno incluyen, entre otras, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb, y fragmentos de la región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, cuerpos completos y poüpéptidos que contengan por lo menos una porción de una inmunoglobulina que sea suficiente para conferir unión específica del antígeno al polipéptido. Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1 ; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región de gozne; un fragmento Fd consiste de los dominios VH y CH1 ; un fragmento Fv consiste de los dominios VL y VH de un brazo individual del anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward et al. Nature 341 : 544-546, 1989) consiste de un dominio VH. Un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), es un anticuerpo en el cual las regiones VL y VH están apareadas para formar una molécula monovalente mediante un enlazador sintético que les permite formarse como una cadena de proteína sencilla (Bird et al., Science 242: 423-426, 1988, y Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883, 1988). Los cuerpos completos son anticuerpos biespecíficos bivalentes en los cuales los dominios VH y VL se expresan en una cadena polipeptídica sencilla, pero usando un enlazador que sea bastante corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera a los dominios para que se apareen con dominios complementarios de otra cadena, y creando dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 64446448, 993, y Poljak, R. J., et al., Structure 2: 1121 - 123, 1994). Una o más CDRs pueden incorporarse en una molécula ya sea covalentemente o no covalentemente para hacerla una inmunoadhesina. Una inmunoadhesina puede incorporar las CDRs como parte de una cadena polipeptídica más larga, puede enlazar covalentemente las CDRs a otra cadena polipeptídica, o puede incorporar las CDRs no covalentemente. Las CDRs permiten que la inmunoadhesina se una específicamente a un antígeno particular de interés. Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si existe más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos a algún otro, o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina de ocurrencia natural tiene dos sitios de unión idénticos; un anticuerpo de cadena sencilla o fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene dos sitios de unión diferentes. Un "anticuerpo aislado", es un anticuerpo que (1) no se asocia con componentes asociados en forma natural, incluyendo otros anticuerpos asociados naturalmente, que lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza. Ejemplos de anticuerpos aislados incluyen un anticuerpo del IGF-IR que ha sido purificado por afinidad usando al IGF-IR como un antígeno, un anticuerpo anti-IGF-IR que ha sido sintetizado por un hibridoma u otra línea de células in vitro, y un anticuerpo del IGF-IR humano derivado de un ratón transgénico. El término "anticuerpo humano", incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. En una modalidad preferida, todos los dominios variables y constantes se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana (un anticuerpo totalmente humano). Estos anticuerpos pueden prepararse en una variedad de formas, como se describe a continuación. Un "anticuerpo humanizado", es un anticuerpo que se deriva de una especie no humana, en ei cual ciertos aminoácidos en la estructura y los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera han sido mutados para evitar o anular una respuesta inmune en humanos. En forma alternativa, un anticuerpo humanizado puede producirse fusionando los dominios constantes de un anticuerpo humano con los dominios variables de una especie no humana. Ejemplos de cómo obtener anticuerpos humanizados, pueden encontrarse en las patentes de los Estados Unidos Nos. 6,054,297, 5,886,152 y 5,877,293. El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo, y una o más regiones de uno o más de otros anticuerpos. En una modalidad preferida, una o más de las CDRs se derivan de un anticuerpo del IGF-IR humano. En una modalidad más preferida, todas las CDRs se derivan de un anticuerpo del IGF-IR humano. En otra modalidad preferida, las CDRs de más un anticuerpo del IGF-IR humano se mezclan y se aparean en un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo del IGF-IR humano, y puede combinarse con CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo del IGF-IR humano, y las CDRs de la cadena pesada pueden derivarse de un tercer anticuerpo del IGF-IR. Además, las regiones de estructura pueden derivarse de uno de los mismos anticuerpos del IGF-IR, de uno o más anticuerpos diferentes, tales como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado. Un "anticuerpo neutralizante" o un "anticuerpo inhibidor", es un anticuerpo que inhibe la unión del IGF-IR al IGF-I y el IGF-ll cuando un exceso del anticuerpo del IGF-IR reduce la cantidad del IGF-I y el IGF-ll unidos al IGF-IR por cuando menos aproximadamente 20%. En una modalidad preferida, el anticuerpo reduce la cantidad del IGF-I y el IGF-ll unidos al IGF-IR por cuando menos 40%, más preferiblemente 60%, aún más preferiblemente 80%, o aún más preferiblemente 85%. La reducción de la unión puede medirse mediante cualquier medio conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se mide en una prueba de unión competitiva in vitro. Un ejemplo de medición de la reducción en la unión del IGF-I y el IGF-ll al IGF-IR, se presenta más adelante en el ejemplo 4. Un "anticuerpo de activación", es un anticuerpo que activa al IGF-IR por cuando menos aproximadamente 20% cuando se añade a una célula, tejido u organismo que expresa el IGF-IR, cuando se compara con la activación lograda por una cantidad molar equivalente del IGF-I y el IGF-ll. En una modalidad preferida, el anticuerpo activa la actividad del IGF-IR por cuando menos 40%, más preferiblemente 60%, aún más preferiblemente 80%, o aún más preferiblemente 85% del nivel de activación logrado por una cantidad molar equivalente del IGF-I y el IGF-ll. En una modalidad más preferida, el anticuerpo de activación se añade en presencia del IGF-I y el IGF-ll. En otra modalidad preferida, la actividad del anticuerpo de activación se mide determinando la cantidad de fosforilación de tirosina y la activación del IGF-IR. Los expertos en la técnica pueden preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos, siguiendo las enseñanzas de esta especificación. Extremos amino y carboxi preferidos de fragmentos o análogos ocurren cerca de los límites de los dominios funcionales. Pueden identificarse dominios estructurales y funcionales, comparando los datos de secuencias de aminoácidos y/o nucleótidos con bases de datos de secuencias públicas o patentadas. De preferencia, se usan métodos de comparación computarizados para identificar motivos de secuencias o dominios de conformación de proteínas predichos que ocurren en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Métodos para identificar secuencias de proteína que se pliegan en una estructura tridimensional conocida, han sido descritos por Bowie et al. Science 253: 164 (1991 ). El término "resonancia de plasmones de superficie", como se usa en la presente, se refiere a un fenómeno óptico que permite que el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real detectando alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de la matriz de un biosensor, por ejemplo, usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.). Para otras descripciones, véase Johnsson, U., et al. Ann. Biol. Clin. 51 : 19-26 (1993); Johnsson, U., et al. Biotechniques 11 : 620-627 (1991 ); Johnsson, B., et al. J. Mol. Recognit. 8: 125-131 (1995); y Johnsson, B., et al. Anal. Biochem. 198: 268-277 (1991 ). El término " de disociación" se refiere a la constante de la velocidad de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno. El término "Kd" se refiere a la constante de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno. El término "epítope" incluye cualquier determinante molecular capaz de unión específica a una inmunoglobulina o receptor de células T. Los epítopes consisten usualmente de grupos de moléculas de superficie químicamente activas, tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen usualmente características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno, cuando la constante de disociación es menor de 1 M, de preferencia menor de 100 mM, de preferencia menor de 10 nM, y más preferiblemente menor de 1 nM. Como se usa en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2a. edición, E. S. Golub y D. R. Gren, eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991 )), cita incorporada en la presente como referencia. Estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a-,a-2,5 disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales, pueden ser también componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?,?,?-trimetil lisina, e-?-acetil lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-h¡droxilisina, s-N-metil arginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos que se usa en la presente, la dirección hacia la izquierda es la dirección amino-terminal, y la dirección hacia la derecha es la dirección carboxi-terminal, de acuerdo con el uso y la convención estándar. El término "polinucleótido", como se refiere en la presente, significa una forma polimérica de nucleótidos de por lo menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN de cadena sencilla y doble. El término "polinucleótido aislado", como se usa en la presente, significará un polinucleótido de origen genómico, ADNc o sintético, o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen como el "polinucleótido aislado", (1 ) no se asocia con un polinucleótido completo o una porción del mismo en el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está enlazado operablemente a un polinucleótido el cual no está enlazado en la naturaleza, o (3) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. El término "oligonucleótidos" referido en la presente, incluye nucleótidos de ocurrencia natural, y nucleótidos modificados enlazados entre sí por enlaces de oligonucleótidos de ocurrencia natural y no de ocurrencia natural. Los oligonucleótidos son un subgrupo de polinucleótidos que comprenden en general una longitud de 200 bases o menos. De preferencia, los oligonucleótidos tienen de 10 a 60 bases de longitud, y más preferiblemente 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o hasta 40 bases de longitud. Los oligonucleótidos son usualmente de cadena sencilla, por ejemplo, para sondas, aunque los oligonucleótidos pueden ser de doble cadena, por ejemplo, para su uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos de la invención pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido. El término "nucleótidos de ocurrencia natural" referido en la presente, incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" referido en la presente, incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos, y similares. El término "enlaces de oligonucleótidos" referido en la presente, incluye enlaces de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforoamidato, y similares. Véase, por ejemplo, LaPlanche eí al. Nucí. Acids. Res. 14: 9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Stein eí al. Nucí. Acids. Res. 16: 3209 (1988); Zon eí al. Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991 ); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, ed., Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (1991)); Stec eí al. patente de E.U.A. No. 5,151 ,510; y Uhlmann y Peyman Chemical Reviews 90: 543 (1990), cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. Un oligonucleótido puede incluir una marca para detección, si se desea. Las secuencias "enlazadas operablemente" incluyen secuencias de control de la expresión que son contiguas con el gen de interés, y secuencias de control de la expresión que actúan en la posición trans o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de la expresión", como se usa en la presente, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las cuales están ligadas. Secuencias de control de la expresión incluyen secuencias adecuadas de inicio de la transcripción, terminación, de promotor e intensificador; señales de procesamiento del ARN eficientes, tales como señales de empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARN mensajero citoplásmico; secuencias que intensifican la eficiencia de la traducción (es decir, secuencia consenso de Kozak); secuencias que intensifican la estabilidad de las proteínas; y, cuando se desee, secuencias que intensifican la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere, dependiendo del organismo hospedero; en procariontes, dichas secuencias de control incluyen en general promotor, sitio de unión ribosomal y secuencia de terminación de la transcripción; en eucariontes, en general, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, a un mínimo, todos los componentes cuya presencia sea esencial para expresión y procesamiento, y puede incluir también componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias guía y secuencias de miembro de fusión. Se pretende que el término "vector", como se usa en la presente, se refiera a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha estado enlazada. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual se refiere a un bucle de ADN de cadena doble circular en el cual pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedera en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedera tras introducción en la célula hospedera, y se replican de esta manera junto con el genoma del hospedero. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes con los cuales están enlazados operativamente. Dichos vectores son referidos en la presente como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante, están con frecuencia en la forma de plásmidos. En la presente especificación, los términos "plásmido" y "vector" pueden usarse recíprocamente, ya que el plásmido es la forma de vector que se usa más comúnmente. Sin embargo, se pretende que la invención incluya dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), los cuales cumplen funciones equivalentes. Se pretende que el término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera"), como se usa en la presente, se refiera a una célula en la cual un vector de expresión recombinante ha sido introducido. Debe entenderse que se pretende que dichos términos se refieran no sólo a la célula sujeto particular, sino también a la progenie de dicha célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede de hecho no ser idéntica a la célula progenitora, pero se incluyen aún dentro del alcance del término "célula hospedera" como se usa en la presente. El término "que híbrida selectivamente" referido en la presente, significa que se une detectablemente y específicamente. Polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos de conformidad con la invención, hibridan selectivamente con cadenas de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación y de lavado que reducen al mínimo cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de "alta severidad" o "altamente severas" para lograr condiciones de hibridación selectiva como se sabe en la técnica y se discute en la presente. Un ejemplo de condiciones "de alta severidad" o "altamente severas", es un método de incubación de un polinucleótido con otro polinucleótido, en donde un polinucleótido puede adherirse a una superficie sólida tal como una membrana, en un regulador de pH de hibridación de 6X SSPE o SSC, formamida a 50%, 5X reactivo de Denhardt, SDS a 0.5%, 100 µ9 ??? de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado a una temperatura de hibridación de 42°C durante 12-16 horas, seguido de doble lavado a 55°C usando un regulador de pH de lavado de 1X SSC, SDS a 0.5%. Véase también Sambrook et al., citado anteriormente, pp. 9.50-9.55. El término "por ciento de identidad de secuencias" en el contexto de secuencias de ácido nucleico, se refiere a los residuos en dos secuencias que son iguales cuando se alinean para correspondencia máxima. La longitud de la comparación de identidad de secuencias puede ser sobre un tramo de por lo menos aproximadamente nueve nucleótidos, usualmente por lo menos aproximadamente 18 nucleótidos, más usualmente por lo menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente por lo menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente por lo menos aproximadamente 32 nucleótidos, y de preferencia por lo menos aproximadamente 36, 48 o más nucleótidos. Existen muchos algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, pueden compararse secuencias de polinucleótidos usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en el paquete Wisconsin versión 10.0, del Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, provee alineaciones y por ciento de identidad de secuencias de las regiones del mejor traslape entre las secuencias de consulta y búsqueda (véase Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); y Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71-84 (1998), citas incorporadas en la presente como referencia). A menos que se especifique de otra manera, se usan parámetros predeterminados para un programa o algoritmo particular. Por ejemplo, puede determinarse el por ciento de identidad de secuencias entre secuencias de ácido nucleico, usando FASTA con sus parámetros predeterminados (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación), o usando Gap con sus parámetros predeterminados, como se provee en GCG versión 6.1 , incorporados en la presente como referencia. Una referencia a una secuencia de ácido nucleico abarca su complemento, a menos que se especifique de otra manera. De esta manera, debe entenderse que una referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia particular abarca su cadena complementaria, con su secuencia complementaria. En la técnica de biología molecular, los investigadores usan los términos "por ciento de identidad de secuencias", "por ciento de similitud de secuencias" y "por ciento de homología de secuencias", recíprocamente. En esta solicitud, estos términos tendrán el mismo significado sólo con respecto a las secuencias de ácido nucleico. El término "similitud sustancial" o "similitud de secuencias sustancial", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo indica que, cuando se alinea óptimamente con inserciones o deleciones de nucleótidos adecuadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencias de nucleótidos en por lo menos aproximadamente 85%, de preferencia por lo menos aproximadamente 90%, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las bases de nucleótidos, medida mediante cualquier algoritmo de identidad de secuencias bien conocido, tales como FASTA, BLAST o Gap, como se discutió anteriormente. Como se aplica a polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean óptimamente, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando pesos de espacio predeterminados, comparten por lo menos 75 u 80% de identidad de secuencias, de preferencia por lo menos 90% o 95% de identidad de secuencias, aún más preferiblemente por lo menos 98% o 99% de identidad de secuencias. De preferencia, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren en las sustituciones conservativas de aminoácidos. Una "sustitución conservativa de aminoácidos", es una en la cual un residuo de aminoácido es sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o carácter hidrofóbico). En general, una sustitución conservativa de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos en donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el por ciento de identidad de secuencias o el grado de similitud pueden ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 24: 307-31 (1994), cita incorporada en la presente como referencia. Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares, incluyen 1 ) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; y 6) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Grupos preferidos de sustitución conservativa de aminoácidos, son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. En forma alternativa, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad de registro PA 250 descrita en Gonnet et al., Science 256: 1443-45 (1992), cita incorporada en la presente como referencia. Un reemplazo "moderadamente conservativo", es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad de registro PAM250. La similitud de secuencias para polipéptidos, la cual es referida también como identidad de secuencias, se mide típicamente usando el software de análisis de secuencias. El software de análisis de proteínas compara secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a varias sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" o "Bestfit" que pueden usarse con parámetros predeterminados para determinar la homología de secuencias o identidad de secuencias entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como homólogos. Para polipéptidos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma véase, por ejemplo, GCG versión 6.1. Pueden compararse también secuencias polipeptídicas usando FASTA que usa parámetros predeterminados o recomendados; un programa en GCG versión 6.1 FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) provee alineaciones y por ciento de identidad de secuencias de las regiones del mejor traslape entre las secuencias de consulta y búsqueda (véase Pearson (1990); y Pearson (2000)). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos, es el programa de cómputo BLAST, especialmente blastp o tblastn, que usa parámetros predeterminados. Véase, por ejemplo, Altschul et al., J. Mol. Blol. 215: 403410 (1990); y Altschul ef al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997); citas incorporadas en la presente como referencia. La longitud de las secuencias polipeptídicas comparadas para homología, será en general de por lo menos aproximadamente 16 residuos de aminoácido, usualmente por lo menos aproximadamente 20 residuos, más usualmente por lo menos aproximadamente 24 residuos, típicamente por lo menos aproximadamente 28 residuos, y de preferencia más de aproximadamente 35 residuos. Cuando se busca una base de datos que contenga secuencias de un gran número de diferentes organismos, se prefiere comparar las secuencias de aminoácidos. Como se usa en la presente, los términos "marca" o "marcado" se refiere a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. En una modalidad, la marca es un marcador detectable, por ejemplo, incorporación de un aminoácido marcado radiactivamente o unión a un polipéptido de porciones de biotinilo que puedan detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contenga un marcador fluorescente, o actividad enzimática que pueda detectarse mediante métodos ópticos o calorimétricos). En otra modalidad, la marca o marcador puede ser terapéutico, por ejemplo, un conjugado de fármaco o toxina. Varios métodos para marcar polipéptidos y glucoproteínas se conocen en la técnica, y pueden usarse. Ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no están limitadas a, las siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 5N, 35S, 90Y, "Te, 1 ln, 125l, 131I), marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fosfores de lantánidos), marcas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopes de polipéptido predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias del par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcas de epítope), agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio, toxinas tales como toxina de pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, antinomicína D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos. En algunas modalidades, las marcas son unidas por brazos separadores de varias longitudes que reducen la obstrucción estérica potencial. El término "agente" se usa en la presente para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto obtenido de materiales biológicos. El término "agente o fármaco farmacéutico", como se usa en la presente, se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra adecuadamente a un paciente. Otros términos de química se usan en la presente de acuerdo al uso convencional en la técnica, como se ejemplifica mediante The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)), cita incorporada en la presente como referencia). El término "agente antineoplásico", se usa en la presente para referirse a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir un desarrollo o progresión de un neoplasma en un humano, en particular una lesión maligna (cancerosa), tal como un carcinoma, sarcoma, linfoma o leucemia. La inhibición de la metástasis es con frecuencia una propiedad de los agentes antineoplásicos. El término "paciente", incluye sujetos humanos y veterinarios.

Anticuerpos del IGF-IR humano, v caracterización de los mismos Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes de ratón o rata. La presencia de dichas secuencias derivadas de ratón o rata puede llevar a la depuración rápida de los anticuerpos, o puede llevar a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo por un paciente. Por lo tanto, en una modalidad, la invención provee anticuerpos anti-IGF-IR humanizados. En una modalidad preferida, la invención provee anticuerpos del IGF-IR totalmente humanos, introduciendo genes de inmunoglobulina humana en un roedor, de modo que el roedor produzca anticuerpos, totalmente humanos. Más preferidos son anticuerpos del IGF-IR anti-humanos totalmente humanos. Se espera que los anticuerpos del IGF-IR totalmente humanos dirigidos contra el IGF-IR humano, reduzcan al mínimo las respuestas inmunógenas y alérgicas intrínsecas a los anticuerpos monoclonales (Mabs) de ratón o derivatizados de ratón, y de esta manera aumenten la eficacia y seguridad de los anticuerpos administrados. Puede esperarse que el uso de anticuerpos totalmente humanos provea una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como Inflamación y cáncer, las cuales pueden requerir administraciones repetidas de anticuerpos. En otra modalidad, la invención provee un anticuerpo del IGF-i que no se une al complemento. En una modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR se selecciona de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5, o un fragmento de cualquiera de los mismos. En una modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR se selecciona de PINT-7A4, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 y PINT-11A4, o un fragmento de cualquiera de los mismos. En una modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR se selecciona de PINT-8A1 , PINT-9A2 y PINT-11A4, o un fragmento de cualquiera de los mismos. El cuadro 1 muestra la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos scFvs PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1, PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5 anteriores.

CUADRO 1 ???? 6A1 EVQLVQSGAEVKKPGESLTISCKGSGYNFFNYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPTDSD TRYSPSFQGQVTI SVDKS ISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARSIRYCPGGRCYSGYYG MDVWGRGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRS YYASWYQQKPGQAPVLVIYG NKRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYY CHSRDSSGNHVLFGGGTKLTVLG SEQ ID NO: 1 , PINT 7A2 GVQLVQSGAEVKKPGESLTISCKGSGYNFFNYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPTDSD TRYSPSFQGQVTISVDKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARSIRYCPGGRCYSGYYG MDVWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRS YYTNWFQQKPGQAPLINVYAKNKRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYY CNSRDSSGNHWFGGGTKLTVLG SEQ ID NO: 2, P!NT 7A4 EVQLVQSGAEV KPGESLTISCKGSGYNFFNYWIGWVRQMPGKDLEW GIIYPTDSD TRYSPSFQGQVTISVDKSISTAYLQ SSLKASDTAMYYCARSIRYCPGGRCYSGYYG MDVWGQGTMVTVSSGGGSSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCRGDSLRN YYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYY CNSRDSSGNHMVFGGGTKLTVLG SEQ ID NO: 3, PINT 7A5 GVQLVESGAEVKKPGESLTISCKGSGYNFFNYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPTDSD TRYSPSFQGQVTISVD SISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARSIRYCPGGRCYSGYYG MDVWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRS YYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYY CNSRDSSGNHWFGGGTKLTVLG SEQ ID NO: 4, PINT 7A6 EVQLVQSGAEVK PGESLTISC GSGYNFFNYWIGWVRQMPGKGLEWMGliYPTDSD TRYSPSFQGQVTISVDKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARSIRYCPGGRCYSGYYG MDVWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRS ITTNWFQQKPGQAPLLWYAKNKRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYY CNSRDSSGNHWFGGGTKLTVLG SEQ ID NO: 5, PINT 8A1 EVQLVQSGAEVKKPGESLTISCKGPGYNFFNYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPTDSD TRYSPSFQGQVTISVDKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARSIRYCPGGRCYSGYYG, MDVWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRS YYTASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYY CNSRDSSGNHWFGGGTKLTVLG SEQ ID NO: 6, CUADRO 1 (CONTINUACION) PINT 9A2 QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKTSGYTFRNYDINWVRQAPGQGLEW GRISGHYGN TDHAQKFQGRFTMT DTSTSTAYMELRSLTFDDTAVYYCARSQWNVDYWGRGTLVTV SSGGGGSGGGGSGGGGSALNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSIASNYVQWYQ QRPGSSPTTVIFEDNRRPSGVPDRFSGSIDTSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSFD STNLWFGGGT VTVLG SEQ ID NO: 7, PINT 11 A1 EVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSDFAMHWVRQIPGKGLEWLSGLRHDGST AITAGSV GRFTISRDNSRNTVYLQMNSLRAEDTATTICVTGSGSSGPHAFPVWGKG TLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALSYVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSNSNIGTYT VNWFQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASI-AISGLQSEDEADYYCA A WDDSLNGPVFGGGTKVTVLG SEQ ID NO: 8, PINT 11 A2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPG GLEWVSAISGSGGS TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGMGYYGSGGYYPDDAF DW GQGTMV SSGGGGSGGGGSGGGGSALSSELTQDPDVS ALGQTVTISCRGDSL KRFYASWYHQKPGQAPVLVFYGKENRPSGIPDRFSGSDSGDTASLTITGAQAEDEGD YYCHTQDTSARQYVFGSGT VTVLG SEQ ID NO: 9, PINT 11 A3 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTNYGLNWVRQAPGQGLEWMGWISPYTGY TNYAQKFQGRVTMTTDKSTSTAYMDLRSLRSDDTAVYYCAREIFSHCTGGSCYPFDS WGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRN YYASWYQQ PGQAPLLV FGRNNRPSEIPGRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYY CNSRDRNSHQWVFGGGTKLTVLG SEQ ID NO: 10, PINT 11 A4 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYA SWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGS TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSPYSSRWYSFDPWGQG TMVTVSSGGGGSGQGGSGGGGSALSYELTQPPSVSVSPGQTATITCSGDDLGNKYVS WYQQKPGQSPVLYIYQDT RPSGIPERFSGSNSGNIATLTISGTQAVDEADYYCQVW DTGTWFGGGTKLTVLG SEQ I D NO: 11 , PINT 11 A5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTNYGLNWVRQAPGQGLEW GWISPYTGY TNYAQKFQGRVT .TTDKSTSTAYMDLRSLRSDDTAVYYCAREIFSHCTGGSCYPFDS WGKGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRS YYASWYQQ PGQAPVLVIYG NNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYY CNSRDSSGNHHWVFGGGTKVTVLG SEQ ID NO: 12, CUADRO 1 (CONTINUACION) PINT 1A7 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC ASGYSFTNYGLDWVRQAPGQGLEWMGWISPYTGY TNYAQKFQGRVTMTTDKSTSTAY DLRSLRSDDTAVYYCAREIFSHCTGGSCYPFDS WGRGTMVTVS SGGGGSGGGGSGGGGSALSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRS YYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYY CNSRDSSGNH RNWVFGGGTKVTVLG SEQ ID NO: 13, PINT 11A11 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSHT NWVRQAQGKGLEWVSSISGSGRY lYYSDSVKGRFTISRDAAKNSLYLQ NNLRAEDTAVYYCTRAKFGDYLFDSWGQGTL VTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALNFMLTQPHSVSQSPGKTVTISCTRSSGRIASNFVQ WYQQRPGSAPTTVIYEDNRRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQ SYDARYQVFGTGT VTVLG SEQ ID NO: 14, PINT 11A12 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGS TYYADSVKGRFTISRDMSKNTLYLQ NSLRAEDTAVYYCARSPVPPWADWYYFDYWG RGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAQAVLTQPSSVSGAPGQRVTISCTGSRSNFGAG YDVHWYQQFPGTAPKLLIYGNTNRPSGVPDRFSGSRSGTSASLAITGLQAEDEADYY CQSYDSNLSGSVFGGGTKVTVLG SEQ ID NO: 15, PINT 11A3 EVQLVQSGAEVK PGASVKVSCKASGYSFTNYGLNWVRQAPGQGLEW GWISPYTGY TNYAQKFQGRVTM.TTDKSTSTAYMDLRSLRSDDTAVYYCAREIFSHCTGGSCYPFDS WGKGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRN YYASWYQQKPGQAPVLVLYSKNSRPSGVPDRFSGSSSGTTASLTISGAQAEDEADYY CNSRPTSGDLRWVFGGGTKLTVLG SEQ ID NO: 16, PINT 12A2 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTNYGLNWVRQAPGQGLEWMGWISPYTGY TNYAQKFQGRVT TTDKSTSTAYMDLRSLRSDDTAVYYCAREIFSHCTGGSCYPFDS WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRN YYASWYQQKPGQAPLLV FGRNNRPSEIPGRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYY CNSRDSNSHQWVFGGGTRLTVLG SEQ ID NO: 17, PINT 12A3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTNYGLNWVRQAPGQGLEWMGWISPYTGY TNYAQKFQGRVT TSD STSTAY DLRSLRSDDTAIYYCAREIFSHCSGGSCYPFDY WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRS YYASWYQQKPGQAPLLVIYGRNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYY CNSRDSSTNHGNWVFGGGTQLTVLS SEQ ID NO: 18 y CUADRO 1 (CONTINUACION) P1NT 12A4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCRASGYSFTNYGLNWVRQAPGQGLEWMGWISPYTGY TNYAQKFQGRVTMTTDKSTSTAY DLRSLRSDDTAVYXCAREIFSHCTGGSCYPFDS WGRGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSALSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRS YYASWYQQKPGQAPVLVIYGRNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYY CNSRDSSGNLNWVFGGGTQLTVLS SEQ ID NO: 19.

En otra modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR comprende una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO:19, o una o más CDRs de estas secuencias de aminoácidos. En otra modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19, o una o más CDRs de estas secuencias de aminoácidos.

Clase v subclase de anticuerpos del IGF-IR El anticuerpo puede ser una molécula de IgG, una molécula de IgM, una molécula de IgE, una molécula de IgA o una molécula de IgD. En una modalidad preferida, el anticuerpo es una IgG, y es un subtipo de lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4. En una modalidad más preferida, el anticuerpo del IGF-IR es de la subclase lgG1. En otra modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR es de la misma clase y subclase que el anticuerpo PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1, PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINT-12A5, que es lgG1. La clase y subclase de los anticuerpos del IGF-IR pueden determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica. En general, la clase y subclase de un anticuerpo pueden determinarse usando anticuerpos que sean específicos para una clase y subclase particular de anticuerpo. Dichos anticuerpos están disponibles comercialmente. La clase y subclase pueden determinarse mediante ELISA, Western Blot, así como otras técnicas. En forma alternativa, la clase y subclase pueden determinarse secuenciando dominios constantes completos o una porción de los mismos de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos conocidas de varias clases y subclases de ¡nmunoglobulinas, y determinando la clase y subclase de los anticuerpos.

Selectividad molecular En otra modalidad, el anticuerpo del IGF-IR tiene una selectividad por el IGF-IR que es por lo menos 50 veces mayor que su selectividad por los receptores de insulina, Ron, AxI, NGF y Mer. En una modalidad preferida, la selectividad del anticuerpo del IGF-IR es más de 100 veces mayor que por el receptor de insulina, Ron, AxI, NGF y Mer. En una modalidad aún más preferida, el anticuerpo del IGF-IR no exhibe unión específica apreciable alguna por la insulina. En una modalidad aún más preferida, el anticuerpo del IGF-IR no exhibe unión específica apreciable alguna por alguna otra proteína diferente del IGF-IR. Puede determinarse la selectividad del anticuerpo del IGF-IR por el IGF-IR usando métodos bien conocidos en la técnica, siguiendo las enseñanzas de la especificación. Por ejemplo, puede determinarse la selectividad usando Western blot, FACS, ELISA o RIA. En una modalidad preferida, puede determinarse la selectividad molecular usando Western blot.

Afinidad de unión del anticuerpo del IGF-IR por el IGF-IR En otro aspecto de la invención, los anticuerpos del IGF-IR se unen al IGF-IR con alta afinidad. En una modalidad, el anticuerpo del IGF-IR se une al IGF-IR con una Kd de 1 x 10"8 M o menos. En una modalidad más preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con una Kd de 1 x 10"9 o menos. En una modalidad aún más preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con una Kd de 5 x 10"10 M o menos. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con una Kd de 1 x 10"10 M o menos. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo seleccionado de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT- 7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, P1NT-11A4, PINT-11A5, P1NT-1 1A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se une al ÍGF-IR con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo que comprende una o más CDRs de un anticuerpo seleccionado de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-1 1A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO:19. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con sustancialmente la misma Kd que un anticuerpo que comprende una o más CDRs de un anticuerpo que comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO:19. En otro aspecto de la invención, el anticuerpo del IGF-IR tiene una baja velocidad de disociación. En una modalidad, el anticuerpo del IGF-IR tiene una Kde disociación de 1 x 10"1 s"1 o menor. En una modalidad preferida, la de disociación es de 5 X 10"5 s" o menor. En otra modalidad preferida, la Kde disociación es sustancial mente igual a la de un anticuerpo seleccionado de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-1 1A2, PINT-1 1A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-1 1A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con sustancialmente la misma Kde disociación que un anticuerpo que comprende una o más CDRs de un anticuerpo seleccionado de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-1 1A2, P1NT-11A3, PINT-11A4, PINT-1 1A5, PINT-1 1A7, PINT-1 1A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con sustancialmente la misma Kde disociación que un anticuerpo que comprende una o más secuencias de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO:19. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se une al IGF-IR con sustancialmente la misma Kde disociación que un anticuerpo que comprende una o más CDRs de un anticuerpo que comprende una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO:19, o un fragmento de las mismas. La afinidad de unión y la velocidad de disociación de un anticuerpo del IGF-IR por el IGF-IR, pueden determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica. En una modalidad, la afinidad de unión puede medirse mediante ELISAs competitivas, RIAs, o resonancia de plasmones de superficie, tal como BIAcore. La velocidad de disociación puede medirse también mediante resonancia de plasmones de superficie. En una modalidad más preferida, la afinidad de unión y la velocidad de disociación se miden mediante resonancia de plasmones de superficie. En una modalidad aún más preferida, la afinidad de unión y la velocidad de disociación se miden usando un BIAcore. Un ejemplo para determinar la afinidad de unión y la velocidad de disociación para la unión de anticuerpos del IGF-IR al dominio extracelular del IGF-IR humano usando BIAcore, se describe más adelante en el ejemplo 10.

Vida media de los anticuerpos del IGF-IR De conformidad con otro objetivo de la invención, el anticuerpo del IGF-IR tiene una vida media de por lo menos un día in vitro o in vivo. En una modalidad preferida, el anticuerpo o porción del mismo tiene una vida media de por lo menos tres días. En una modalidad más preferida, el anticuerpo o porción del mismo tiene una vida media de cuatro días o más. En otra modalidad, el anticuerpo o porción del mismo tiene una vida media de ocho días o más. En otra modalidad, el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo es derivatizado o modificado de modo que tenga una vida media más larga, como se discute a continuación. En otra modalidad preferida, el anticuerpo puede contener mutaciones puntuales que aumentan la vida media en suero, como se describe en el documento WO 00/09560, publicado en febrero 24 de 2000. La vida media del anticuerpo puede medirse mediante cualquier medio conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la vida media del anticuerpo puede medirse mediante Western blot, ELISA o RIA durante un período adecuado. La vida media del anticuerpo puede medirse en cualquier animal adecuado, por ejemplo, un mono, tal como un mono Cynomolgus, un primate o un humano. La invención provee también un anticuerpo del IGF-IR que une el mismo antígeno o epítope que un anticuerpo del IGF-IR humano de la presente invención. Además, la invención provee un anticuerpo del IGF-IR que compite en forma cruzada con un anticuerpo del IGF-IR que se sabe bloquea la unión al IGF-I y el IGF-II. En una modalidad altamente preferida, el anticuerpo del IGF-IR conocido es otro anticuerpo humano. En una modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR humano tiene el mismo antígeno o epítope de PINT-6A1, PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, P1NT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINT- 12A5. En otra modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR humano comprende una o más CDRs de un anticuerpo que une el mismo antígeno o epítope de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1, PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1, PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINT-12A5. En otra modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR humano que une el mismo antígeno o epítope comprende una de las secuencias de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, o un fragmento de las mismas. En otra modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR humano que une el mismo antígeno o epítope comprende una o más CDRs de un anticuerpo de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO:19. Puede determinarse si un anticuerpo del IGF-IR se une al mismo antígeno, usando una variedad de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede determinarse si un anticuerpo del IGF-IR de prueba se une al mismo antígeno usando un anticuerpo del IGF-IR para capturar un antígeno que se sabe se une al anticuerpo del IGF-IR, tal como el IGF-IR, eluyendo el antígeno del anticuerpo, y determinando si el anticuerpo de prueba se unirá al antígeno eluido. Puede determinarse si el anticuerpo se une al mismo epítope que un anticuerpo del IGF-IR uniendo el anticuerpo del IGF-IR al IGF-IR bajo condiciones de saturación, y midiendo entonces la capacidad del anticuerpo de prueba para unirse al IGF-IR. Si el anticuerpo de prueba es capaz de unirse al IGF-IR al mismo tiempo que el anticuerpo del IGF-IR, entonces el anticuerpo de prueba se une a un epítope distinto del anticuerpo del IGF-IR. Sin embargo, si el anticuerpo de prueba no es capaz de unirse al IGF-IR al mismo tiempo, entonces el anticuerpo de prueba se une al mismo epítope, o comparte un sitio de unión a epítope traslapante, como el anticuerpo del IGF-IR humano. Este experimento puede llevarse a cabo usando ELISA, RIA, o resonancia de plasmones de superficie. En una modalidad preferida, el experimento se lleva a cabo usando resonancia de plasmones de superficie. En una modalidad más preferida, se usa BIAcore. Puede determinarse también si un anticuerpo del IGF-IR compite en forma cruzada con otro anticuerpo del IGF-IR. En una modalidad preferida, puede determinarse si un anticuerpo del IGF-IR compite en forma cruzada con otro, usando el mismo método que se usa para medir si el anticuerpo del IGF-IR es capaz de unirse al mismo epítope que otro anticuerpo del IGF-IR.

Uso de la cadena ligera y pesada La invención provee también un anticuerpo del IGF-IR que comprende secuencias variables codificadas por un gen humano ? (Williams S. C. et al., J. Mol. Biol. 246: 220-232, 1996) o ? (Kawasaki K. et al., Eur. J. Immunol. 31 : 1017-1028, 2001 ). En una modalidad preferida, las secuencias variables de cadena ligera son codificadas por la familia de genes \/? 1 e, 1 c, 3r, 3i o 6a. En una modalidad, las secuencias variables son codificadas por la familia de genes VK A27, A30 u 012. En una modalidad más preferida, la cadena ligera comprende no más de diez sustituciones de aminoácidos de la línea germinal, de preferencia no más de seis sustituciones de aminoácidos, y más preferiblemente no más de tres sustituciones de aminoácidos. En una modalidad preferida, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservativas. SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, proveen las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligeras ? del anticuerpo del IGF-IR. Siguiendo las enseñanzas de esta especificación, el experto en la técnica podría determinar la secuencia de aminoácidos codificada de las cadenas ligeras del anticuerpo del IGF-IR y las cadenas ligeras de la línea germinal, y determinar las diferencias entre las secuencias de la línea germinal y las secuencias del anticuerpo. En una modalidad preferida, la VL del anticuerpo del IGF-IR contiene las mismas sustituciones de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos de la línea germinal, como cualquiera de una o más de las VL de los anticuerpos PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, P1NT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINT-12A5. Por ejemplo, la VL del anticuerpo del IGF-IR puede contener una o más sustituciones de aminoácidos que sean iguales a las presentes en el anticuerpo PGIA-03-A9, otra sustitución de aminoácido que sea igual a la presente en el anticuerpo PGIA-03-B2, y otra sustitución de aminoácido que sea igual a la del anticuerpo PGIA-01-A8. De esta forma, pueden mezclarse y equipararse diferentes características de la unión del anticuerpo para alterar, por ejemplo, la afinidad del anticuerpo por el IGF-IR o su velocidad de disociación del antígeno. En otra modalidad, se hacen sustituciones de aminoácidos en la misma posición que las que se encuentran en cualquiera de una o más de las VL de los anticuerpos PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1, PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5, pero se hacen sustituciones conservativas de aminoácidos, más que usando el mismo aminoácido. Por ejemplo, si la sustitución de aminoácido comparada con la línea germinal en uno de los anticuerpos PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, P1NT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , P1NT-11A2, P1NT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT- 12A4 o PINT-12A5 es glutamato, puede sustituirse aspartato conservativamente. En forma similar, si la sustitución de aminoácidos es serina, puede sustituirse conservativamente treonina. En otra modalidad preferida, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos de la VL de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-1 1A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINT-12A5. En otra modalidad altamente preferida, la cadena ligera comprende secuencias de aminoácidos que son iguales a las regiones de CDR de la cadena ligera de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-1 1A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINT-12A5. En otra modalidad preferida, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos una CDR de la cadena ligera de PINT-6A1 , PINT-7A2, P1NT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1, PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINTEAS, PINT-12A4 o PINT-12A5. En otra modalidad preferida, la cadena ligera comprende secuencias de aminoácidos de CDRs de diferentes cadenas ligeras. En una modalidad más preferida, las CDRs de diferentes cadenas ligeras se obtienen de P1NT-6A1 , PINT-7A2, P1NT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT- 11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINT-12A5. En otra modalidad preferida, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de la VL seleccionada de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19. En otra modalidad, la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38, fragmentos de las mismas, o una secuencia de ácido nucleico que codifique para una secuencia de aminoácidos que tenga de 1 a 10 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos de la misma. De preferencia, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservativas de aminoácidos. En otra modalidad, el anticuerpo o porción del mismo comprende una cadena ligera lambda. La presente invención provee también un anticuerpo del IGF-IR o porción del mismo, que comprende una cadena pesada humana o una secuencia derivada de una cadena pesada humana. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada se deriva de una familia de genes del VH humano DP-14, DP-47, DP-50, DP-73 o DP-77. En una modalidad más preferida, la cadena pesada comprende no más de ocho cambios de aminoácido de la línea germinal, más preferiblemente no más de seis cambios de aminoácido, y aún más preferiblemente no más de tres cambios de aminoácido. SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, proveen las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas del anticuerpo del IGF-IR. Siguiendo las enseñanzas de esta especificación, el experto en la técnica podría determinar la secuencia de aminoácidos codificada de las cadenas pesadas del anticuerpo del IGF-IR y las cadenas pesadas de la línea germinal, y determinar las diferencias entre las secuencias de la línea germinal y las secuencias del anticuerpo. En una modalidad preferida, el VH del anticuerpo del IGF-IR contiene las mismas sustituciones de aminoácidos, respecto a la secuencia de aminoácidos de la línea germinal, como cualquiera de uno o más de los VH de los anticuerpos PINT-6A1, PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o P1NT-12A5. Similar a lo que se discutió anteriormente, el VH del anticuerpo del IGF-IR puede contener una o más sustituciones de aminoácidos que son iguales a las presentes en el anticuerpo PINT-8A1 , otra sustitución de aminoácido que es igual a la presente en el anticuerpo PINT-9A2, y otra sustitución de aminoácido que es igual al anticuerpo PINT-11A4. De esta forma, pueden mezclarse y equiparse diferentes características de unión del anticuerpo para alterar, por ejemplo, la afinidad del anticuerpo por el IGF-IR o su velocidad de disociación del antígeno. En otra modalidad, las sustituciones de aminoácido se hacen en la misma posición que las presentes en cualquiera de uno o más de los VH de los anticuerpos PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11 A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-1 A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5, pero se hacen sustituciones conservativas de aminoácidos más que usando el mismo aminoácido. En otra modalidad preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos del VH de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINTEAS. En otra modalidad altamente preferida, la cadena pesada comprende secuencias de aminoácidos que son iguales a las regiones CDR de la cadena pesada de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1, PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, P1NT-11A3, P1NT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINT-12A5. En otra modalidad preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de por lo menos una CDR de la cadena pesada de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, P1NT-11A1 , P1NT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-1 1A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINT-12A5. En otra modalidad preferida, la cadena pesada comprende secuencias de aminoácidos de CDRs de diferentes cadenas pesadas. En una modalidad más preferida, las CDRs de diferentes cadenas pesadas se obtienen de PINT-6A , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINT-12A5. En otra modalidad preferida, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos del VH seleccionada de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19. En otra modalidad, la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos del VH codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38, un fragmento de las mismas, o una secuencia de ácido nucleico que codifique para una secuencia de aminoácidos que tenga de 1 a 10 inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos de las mismas. En otra modalidad, sustituciones son sustituciones conservativas de aminoácidos. El cuadro 2 muestra secuencias de ácido nucleico que codifican para los scFvs PGIA-01-A1 a PGIA-05-A1.

CUADRO 2 PINT 6A1 GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTG.AAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGACA ATCTCCTGTAAGGGTTCTGGGTACAAC I I I I I CAACTACTGGATCGGCTGGGTGCGC CAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTACTGACTCTGAT ACCAGATATAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATTTCAGTCGACAAGTCCATT AGCACCGCCTATCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCCGACACCGCCATGTATTAC TGTGCGAGATCCATTAGATACTGTCCTGGTGGTAGGTGCTACTCCGGTTACTACGGT ATGGACGTCTGGGGCCGGGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGTGGAGGCGGTTCA GGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGATCGTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTG TCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGC TATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTAT GGTAAAAATAAGCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGA AACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTAC TGTCATTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATGTGCTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTG ACCGTCCTAGGT SEQ ID NO: 20, PINT 7A2 GGGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGACA ATCTCCTGTMGGGTTCTGGATACMCTTTTTCAACTACTGGATCGGCTGGGTGCGC CAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTACTGACTCTGAT ACCAGATATAGCCCGTCCTTCCAAGGCTAGGTCACCATCTCAGTCGACAAGTCCATT AGCACCGCCTATCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCCGACACCGCCATGTATTAC TGTGCGAGATCCATTAGATACTGTCCTGGTGGTAGGTGCTACTCCGGTTACTACGGT ATGGAGGTCTGGGGCCAGGGGACAATGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCGGTTCA GGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGATCGTCTGAGTTGACTCAGGACCCTGCTGTG TCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACTTGCCAAGGAGACAGTCTCAGAAGC TATTACACAAACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTCTACTTGTCGTCTAT GCTAAAAATAAGCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGA AACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTAC TGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTG ACCGTCCTAGGT SEQ ID NO: 21 , CUADRO 2 (CONTINUACION) PINT 7A4 GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGACA ATCTCCTGCAAGGGTTCTGGATACAACTTTTTCAACTACTGGATCGGCTGGGTGCGC CAGATGCCCGGGAAAGACCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTACTGACTCTGAT ACCAGATATAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACGATTTCAGTCGACAAGTCCATT AGCACCGCCTATCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCCGACACCGCCATGTATTAC TGTGCGAGATCCATTAGATACTGTCCTGGTGGTAGGTGCTACTCCGGTTACTACGGT ATGGACGTCTGGGGCCAGGGGACAATGGTCACCGTCTCGAGTGGTGGAGGCAGTTCA GGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGATCGTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTG TCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCGAGGAGACAGCCTCAGAAAC TATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTAT GGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGA AACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTAC TGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATATGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTG ACCGTCCTAGGT SEQ ID NO: 22, PINT 7A5 GGGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGACA ATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAAC I I ? I CAACTACTGGATCGGCTGGGTGCGC CAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTACTGACTCTGAT ACCAGATATAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGTCGACAAGTCCATT AGCACCGCCTATCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCCGACACCGCCATGTATTAC TGTGCGAGATCCATTAGATACTGTCCTGGTGGTAGGTGCTACTCCGGTTACTACGGT ATGGACGTCTGGGGCCGGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCA GGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGATCGTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTG TCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGC TATTATGCAAGCTGGTACC AG CAG AAG CCAG G ACAG G CCCCTGTACTTGTC ATCTAT GGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGA AACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTAC TGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTG ACCGTCCTAGGT SEQ ID NO: 23, PINT 7A6 GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGACA ATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAAC I I G?? CAACTACTGGATCGGCTGGGTGCGC CAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTACTGACTCTGAT ACCAGATATAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATTTCAGTCGACAAGTCCATT AGCACCGCCTATCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCCGACACCGCCATGTATTAC TGTGCGAGATCCATTAGATACTGTCCTGGTGGTAGGTGCTACTCCGGTTACTACGGT ATGGACGTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCA GGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGATCGTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTG TCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACTTGCCAAGGAGACAGTCTCAGTAAGC TATTACACAAACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTCTACTTGTCGTCTAT GCTAAAAATAAGCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGA AACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTAC TGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTG ACCGTCCTAGGT SEQ ID NO: 24, CUADRO 2 (CONTINUACION) PINT 8A1 GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGACA ATCTCCTGTAAGGGTCCTGGATACAACTT I I I CAACTACTGGATCGGCTGGGTGCGC CAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTACTGACTCTGAT ACCAGATATAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGTCGACAAGTCCATT AGCACCGCCTATCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCCGACACCGCCATGTATTAC TGTGCGAGATCCATTAGATACTGTCCTGGTGGTAGGTGCTACTCCGGTTACTACGGT ATGGACGTCTGGGGCCAAGGAACCATGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCA GGCGGAGGTGGCAGCGGCGGTGGCGGATCGTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTG TCTGTGGCCTTGGGACAGACGGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGC TATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTAT GGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGA AACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTAC TGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATGTGGTATTCGGCGGGACCAAGCTG ACCGTCCTAGGT SEQ ID NO: 25, PINT 9A2 CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGAGGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAG GTCTCCTGCAAGACTTCAGGTTACACCTTTAGGAACTATGATATCAACTGGGTGCGA CAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCAGTGGTCACTATGGCAAC ACAGACCATGCACAGAAATTCCAGGGCAGATTCACCATGACCAAAGACACATCCACG AGCACAGCCTACATGGAACTGAGGAGCCTGACATTTGACGACACGGCCGTATATTAC TGTGCGAGAAGTCAGTGGAACGTTGACTACTGGGGCCGAGGAACCCTGGTCACCGTC TCGAGTGGAGGCGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGAAGTGCACTT AATTTTATGCTGACTCAGCCCCACTCTGTGTCGGAGTCTCCGGGGAAGACGGTGACC ATCTCCTGC ACCCG CAGCAGTG G C AG CATTG CTAGC AATTATGTGCAGTG GTACCAG CAGCGCCCGGGCAGTTCCCCCACCACTGTGATCTTTGAAGATAACCGAAGACCCTCT GGGGTCCCTGATCGGTTTTCTGGCTCCATCGACACCTCCTCCAACTCTGCCTCCCTC ACCATCTCTGGACTGAAGACTGAGGACGAGGCTGACTACTACTGTCAGTCTTTTGAT AGCACCAATCTTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGT SEQ ID NO: 26, PINT 11 A1 GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGA CTCTCCTGTGCAGCGTCTGGCTTCACTTTCAGTGATTTTGCCATGCACTGGGTCCGC CAGATTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGCTGTCAGGATTACGGCATGATGGAAGTACG GCTTACTATGCAGGGTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAGG AATACTGTATATCTCCAAATGAATAGCCTGAGGGCCGAGGACACGGCTACGTATTAC TGTGTGACAGGGAGCGGTAGCTCCGGTCCCCACGCTTTTCCTGTCTGGGGCAAAGGC ACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGAGGCGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT GGCGGAAGTGCACTTTCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCC GGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAACTCCAACATCGGGACTTATACT GTAAATTGGTTCCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTACAGTAAT AATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCA GCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCA GCAATGGGATGACAGCCTGAATGGTCCGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTCACCGT CCTAG GTGCGGCCGCACATCATCATCAC CATC A SEQ ID NO: 27, CUADRO 2 (CONTINUACION) PINT 11A2 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGA CTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGC CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGC ACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAG AACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTAC 5 TGTGCGAAAGGAATGGGATACTATGGTTCGGGAGGTTATTATCCGGATGATGCTTTT GATGTCTGGGGCCAGGGGACAATGGTCACCGTCTCGAGTGGAGGCGGCGTTCAGGC GGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGAAGTGCACTTTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCT GATGTGTCTATGGCCTTGGGTCAGACAGTCACCATTTCATGCCGAGGAGACAGCCTC AAAAGATTTTATGCAAGTTGGTATCACCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTCCTTGTC TTCTATGGTAAAGAAAATCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGGTTCTCTGGCTCCGAC TCTGGAGACACAGCCTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGGTGAC TATTACTGTCACACTCAGGACACCAGTGCTCGCCAATATGTCTTCGGGAGTGGGACC AAGGTCACCGTCCTAGGT SEQ ID NO: 28, PINT 11A3 •f A GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCGGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAG GTCTCCTGTA AG G CCTCTGGTTACTCTTTTACCAACTATGGTCTCAACTG G GTG C G A CAGGCCCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCCCTTACACTGGTTAC ACAAATTATGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATGACCACAGATAAATCCACG AGCACAGCCTACATGGACCTGAGGAGTCTGAGATCTGACGACACCGCCGTTTATTAC TGTGCGAGAGAGA I G???' I CTCATTGTACTGGTGGCAGTTGCTACCCTTTTGACTCC TGGGGCCGAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGAGGCGGCGGTTCAGGCGGAGGT GGCTCTGGCGGTGGCGGAAGTGCACTTTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTG TCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAAC TACTATGCAAGTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCCCCTCTCCTTGTCATGTTT GGTAAGAACAACCGGCCCTCAGAGATCCCAGGCCGATTCTCTGGCTCCAGTTCGGGA AACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTAC TGTAATTCTCGAGACAGAAACAGTCATCAATGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTG . ._ ACCGTCCTAGGT SEQ ID NO: 29, 1 O PINT 11A4 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGA CTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGC CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGC ACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAG AACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTAC TGTGCGAGTAGTCCCTATAGCAGCAGGTGGTACTCGTTCGACCCCTGGGGCCAAGGG ACAATGGTCACCGTCTCGAGTGGAGGCGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGT GGCGGAAGTGCACTTTCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCA GGACAGACAGCCACCATCACCTGCTCTGGAGATGACTTGGGGAATAAATATGTTTCG TGGTATCAACAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTATCAAGATACCAAG 20 CGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACATAGCCACT CTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTGTGGATGAGGCTGACTATTATTGTCAGGTGTGG GACACCGGCACTGTGGTTTTCGGCGGCGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT SEQ ID NO: 30, CUADRO 2 (CONTINUACION) PINT 11A5 CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAG GTCTCCTGTAAGGCCTCTGGTTACTCTTTTACCAACTATGGTCTCAACTGGGTGCGA CAGGCCCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCCCTTACACTGGTTAC ACAAATTATGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATAAATCCACG AGCACAGCCTACATGGACCTGAGGAGTCTGAGATCTGACGACACCGCCGTTTATTAC 5 TGTGCGAGAGAGA I I I I I I CTCATTGTACTGGTGGCAGTTGCTACCCTTTTGACTCC TGGGGCAAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGAGGCGGCGGTTCAGGCGGAGGT GGCTCTGGCGGTGGCGGAAGTGCACTTTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTG TCTGTG G CCTTGG G ACAG ACAGTCAGG ATC ACATG CCAAGG AGAC AG CCTCAG AAGC TATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTAT G GTAAAAACAACCGG CCCTCAG GG ATC CCAG ACCG ATTCTCTGGCTCC AG CTCAG G A AACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTAC TGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATCATTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAG GTCACCGTCCTAGGT SEQ ID NO: 31 , PINT 11A7 GAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAG 10 GTCTCCTGTAAGGCCTCTGGTTACTCTTTTACCAACTATGGTCTCGACTGGGTGCGA CAGGCCCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCCCTTACACTGGTTAC ACAAATTATGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATAAATCCACG AGCACAGCCTACATGGACCTGAGGAGTCTGAGATCTGACGACACCGCCGTTTATTAC TGTGCGAGAGAGA I l i l i I CTCATTGTACTGGTGGCAGTTGCTACCCTTTTGACTCC TGGGGCAGAGGGACAATGGTCACCGTCTCGAGTGGAGGCGGCGGTTCAGGCGGAGGT GGCTCTGGCGGTGGCGGAAGTGCACTTTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTG TCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGC TATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTAT GGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGA AACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTAC TGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCATCGGAATTGGGTGTTCGGCGGAGGGACC , c AAGGTCACCGTCCTAGGT SEQ ID NO: 32, 15 PINT 11A11 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGA CTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGCAGCCACACCATGAACTGGGTCCGC CAGGCTCAAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTGGTAGTGGTCGTTAC ATTTACTATTCAGACTCAGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACGCCGCCAAG AACTCTCTGTATCTGCAAATGAACAACCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTCTATTAC TGTACGAGAGAGAAATTCGGTGACTACCTCTTTGACTCCTGGGGCCAGGGCACCCTG GTCACCGTCTCGAGTGGAGGCGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGA GTGCACTTAATTTTATGCTGACTCAGCCCCACTCTGTGTCGCAGTCTCCGGGGAAG ACGGTAACCATCTCCTGCACCCGCAGTAGTGGCAGAATTGCCAGCAACTTTGTGCAG TGGTACCAGCAGCGCCCGGGCAGTGCCCCCACCACTGTGATCTATGAGGATAACCGA 20 CGACCCTCTGGGGTCCCTGATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGCTCCTCCAACTCT GCCTCCCTCACCATCTCTGGACTAAAGACTGAGGACGAGGCTGACTACTATTGTCAG TCTTATGATGACCAGATATCAAGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGG SEQ ID NO: 33, CUADRO 2 (CONTINUACION) PINT 11A12 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGA CTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGC CAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGCGGTGGTAGC c ACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAG ° AACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTAC TGTGCGAGGTCGCCTGTCCCGCCGTGGGCGGACTGGTACTACTTTGATTATTGGGGC CGGGGGACAATGGTCACCGTCTCGAGTGGAGGCGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCT GGCGGTGGCGGAAGTGCACAGGCTGTGCTGACTCAGCCGTCCTCAGTGTCTGGGGCC CCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGGTCCAACTTCGGGGCAGGT TATGATGTACACTGGTACCAGCAGTTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTAT GGTAACACCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAGGTCTGGC ACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTAC TGCCAGTCATATGACAGCAACCTGAGTGGTTCGGTGTTCGGCGGCGGGACCAAGGTC ACCGTCCTAGGT SEQ ID NO: 34, PINT 12A1 0 GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAG GTCTCCTGTAAGGCCTCTGGTTACTCTTTTACCAACTATGGTCTCAAGTGGGTGCGA CAGGCCCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCCCTTACACTGGTTAC ACAAATTATGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATAAATCCACG AGCACAGCCTACATGGACCTGAGGAGTCTGAGATCTGACGACACCGCCGTTTATTAC TGTGCGAGAGAGATTTTTTCTCATTGTACTGGTGGCAGTTGCTACCCTTTTGACTCC TGGGGCAAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGAGGCGGCGGTTCAGGCGGAGGT GGCTCTGGCGGTGGCGGAAGTGCACTTTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTG TCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAAC TATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCCCCTGTCCTTGTCCTCTAC AGTAAAAACAGCCGGCCCTCTGGGGTCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGA ACCACAGCTTCCTTGACAATCAGTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGGCTGACTATTAC TGTAATTCTCGG G AC ACC AGTG GTGACCTTCG CTGG GTGTTCG G CGG AG G G ACCAAG CTGACCGTCCTAGGT SEQ ID NO: 35, PINT 12A2 GAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAG GTCTCCTGTAAGGCCTCTGGTTACTCTTTTACCAACTATGGTCTCAACTGGGTGCGA CAGGCCCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCCCTTACACTGGTTAC ACAAATTATGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATAAATCCACG AGCACAGCCTACATGGACCTGAGGAGTCTGAGATCTGACGACACCGCCGTTTATTAC TGTGCGAGAGAGATTTTTTGTCATTGTACTGGTGGCAGTTGCTACCCTTTTGACTCC TGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGAGGCGGCGGTTCAGGCGGAGGT Q GGCTCTGGCGGTGGCGGAAGTGCACTTTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTG TCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAMC TACTATGCAAGTTGGTACCAGCAGAAGCCAGGGCAGGCCCCTCTCCTTGTCATGTTT GGTAAGAACAACCGGCCCTCAGAGATCCCAGGCCGATTCTCTGGCTCCAGTTCGGGA AACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTAC TGTAATTCTCGAGACAGTAACAGTCATCAATGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTG ACCGTCCTAGGT SEQ ID NO: 36, CUADRO 2 (CONTINUACION) P1NT 12A3 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAG GTCTCCTGTAAGGCCTCTGGTTACTCTTTTACCAACTATGGTCTCAACTGGGTGCGA CAGGCCCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCCCTTACACTGGTTAC ACAAATTATGCACAGAAGTTCGAGGGCAGAGTCACCATGACTTCAGATAAATCCACG AGCACAGCCTACATGGACCTGAGGAGTCTGAGATCTGACGACACGGCCATTTATTAT TGTGCGAGAGAGATTTTCTCCCATTGTAGTGGTGGTAGTTGCTACCCTTTTGACTAC TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGGAGGCGGCGGTTCAGGCGGAGGT GGCTCTGGCGGTGGCGGAAGTGCACTTTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTG TCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGC TATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTCTACTTGTCATCTAT GGTAGAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGA AACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTAC TGTAACTCCCGGGACAGCAGTACTAACCATGGGAATTGGGTGTTCGGCGGAGGGACC CAGCTCACCGTTTTAAGT SEQ ID NO: 37, y PINT 12A4 CAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAG GTCTCCTGTAAGGCCTCTGGTTACTCTTTTACCAACTATGGTCTCAACTGGGTGCGA CAGGCCCCTGGACAGGGACTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCCCTTACACTGGTTAC ACAAATTATGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGATAAATCG AGCACAGCCTACATGGACCTGAGGAGTCTGAGATCTGACGACACCGCCGTTTATTAC TGTGCGAGAGAGA I I I I I I CTC ATTGTACTGGTG GC AGTTG CTACCCTTTTG ACTCC TGGGGCAGGGGGACAATGGTCACCGTCTCGAGTGGAGGCGGCGGTTCAGGCGGAGGT GGCTCTGGCGGTGGCGGAAGTGCACTTTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTG TCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGC TATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTAT GGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGA AACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTATTAC TGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACCTCAATTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCCAG CTCACCGTTTTAAGT SEQ ID NO: 38.

Inhibición de la unión del IGF-I v el IGF-II al IGF-IR En otra modalidad, la invención provee un anticuerpo del IGF-IR que inhibe la unión del IGF-I al IGF-IR y/o la unión del IGF-II al IGF-IR. En una modalidad preferida, el IGF-IR es humano. En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR es un anticuerpo humano. En otra modalidad, el antígeno o porción del mismo inhibe la unión entre IGF-IR y el IGF-I y/o el IGF-II con una IC50 no mayor de 100 nM. En una modalidad preferida, la IC50 es no mayor de 10 nM. En una modalidad más preferida, la IC50 es no mayor de 1 nM. La IC50 puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Típicamente, puede medirse una IC50 mediante ELISA, RIA o una prueba basada en células, en donde el anticuerpo se evalúa por su capacidad para inhibir la unión de IGFs marcados radiactivamente. En una modalidad preferida, la IC50 se mide mediante una prueba de unión competitiva al ligando basada en células. En otra modalidad, la invención provee un anticuerpo anti-IGF-IR que previene la activación del IGF-IR en presencia del IGF-I y/o el IGF-II. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-IGF-IR inhibe la fosforilación de tirosina inducida por el IGF-IR dentro del dominio citoplásmico de la subunidad beta del IGF-IR tras la ocupación del receptor. En una modalidad más preferida, el anticuerpo del IGF-IR inhibe la fosforilación de tirosina inducida por el IGF-IR que ocurre en las tirosinas 1131 , 1135 y 1136 dentro del dominio de cinasa de la subunidad beta del IGF-IR en respuesta a la unión extracelular del IGF-I y/o el IGF-II. En otra modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR Inhibe la ocurrencia de eventos celulares corriente abajo. Por ejemplo, el anti-IGF-IR puede inhibir la fosforilación de tirosina de Shc y el substrato del receptor de insulina (IRS) 1 y 2, Akt 1 o Akt 2 o Erk1/2, los cuales son fosforilados normalmente cuando las células se tratan con IGF-I (Kim et al., J. Biol. Chem. 273: 4543-4550, 1998). Puede determinarse si un anticuerpo del IGF-IR puede prevenir la activación del IGF-IR en presencia del IGF-I y/o el IGF-II, determinando los niveles de fosforilación de tirosina en la subunidad beta del IGF-IR mediante Western blot, inmunoprecipitación, ELISA o FACS. En otro aspecto de la invención, el anticuerpo causa la subregulación del IGF-IR de una célula tratada con el anticuerpo. En una modalidad, el IGF-IR es incorporado en la vía endosómica de la célula, y catabolizado. Después de que el anticuerpo del IGF-IR se une al IGF-IR, el anticuerpo unido al IGF-IR es incorporado. Puede medirse la subregulación del IGF-IR mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo inmunoprecipitación, microscopía confocal o Western blot. En una modalidad preferida, el anticuerpo se selecciona de PINT-6A1, PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1, PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5, o comprende una cadena pesada, cadena ligera o región de unión a antígeno del mismo.

Activación del IGF-IR mediante unión del anticuerpo del IGF-IR Otro aspecto de la presente invención incluye la activación de anticuerpos del IGF-IR. Un anticuerpo de activación difiere de un anticuerpo inhibidor debido a que amplifica o sustituye los efectos del IGF-I y el IGF-II sobre el IGF-IR. En una modalidad, el anticuerpo de activación es capaz de unirse al IGF-IR, y hacer que sea activado en ausencia del IGF-I y el IGF-II. Este tipo de anticuerpo de activación es esencialmente un mimético parcial o completo del IGF-I y el IGF-II. En otra modalidad, el anticuerpo de activación amplifica el efecto del IGF-I y el IGF-II sobre el IGF-IR. Este tipo de anticuerpo no activa al IGF-IR por sí mismo, sino más bien aumenta la activación del IGF-IR en presencia del IGF-I y el IGF-il. Un anticuerpo anti-IGF-IR mimético puede distinguirse fácilmente de un anticuerpo del IGF-IR de amplificación tratando las células in vitro con un anticuerpo en presencia o ausencia de bajos niveles del IGF-I y el IGF-II. Si el anticuerpo es capaz de causar la activación del IGF-IR en ausencia del IGF-I y el IGF-II, por ejemplo, aumenta la fosforilación de tirosina del IGF-IR, y entonces el anticuerpo es un anticuerpo mimético. Si el anticuerpo no puede causar la activación del IGF-IR en ausencia del IGF-I y el IGF-II, pero es capaz de amplificar la cantidad de activación del IGF-IR, entonces el anticuerpo es un anticuerpo de amplificación.

Inhibición de la fosforilación de tirosina del IGF-IR, niveles del IGF-IR y desarrollo de células tumorales in vivo mediante anticuerpos del IGF- Otra modalidad de la invención provee un anticuerpo del IGF-IR que inhibe la fosforilación de tirosina del IGF-IR y ios niveles del receptor in vivo. En una modalidad, la administración del anticuerpo del IGF-IR a un animal causa una reducción en la señal de fosfotirosina del IGF-IR en tumores que expresan el IGF-IR. En una modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR causa una reducción en la señal de fosfotirosina por cuando menos 20%. En una modalidad más preferida, el anticuerpo del IGF-IR causa una disminución en la señal de fosfotirosina por cuando menos 50%, más preferiblemente 60%. En una modalidad aún más preferida, el anticuerpo causa una disminución en la señal de fosfotirosina de por lo menos 70%, más preferiblemente 80%, aún más preferiblemente 90%. En una modalidad preferida, el anticuerpo se administra aproximadamente 24 horas antes de que se midan los niveles de fosforilación de tirosina. Los niveles de fosforilación de tirosina pueden medirse mediante cualquier método conocido en la técnica, tales como los que se describen más adelante. Véase, por ejemplo, el ejemplo 5 y las figuras 4 y 6a-6b. En una modalidad preferida, el anticuerpo se selecciona de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1, PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1, PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5, o comprende una cadena pesada, cadena ligera o porción de unión a antígeno del mismo. En otra modalidad, la administración del anticuerpo del IGF-IR a un animal causa una reducción en los niveles del IGF-IR en tumores que expresan el IGF-IR. En una modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR causa una reducción en los niveles del receptor por cuando menos 20% en comparación con un animal no tratado. En una modalidad más preferida, el anticuerpo del IGF-IR causa una disminución en los niveles del receptor de por lo menos 50%, más preferiblemente 60% de los niveles del receptor en un animal no tratado. En una modalidad aún más preferida, el anticuerpo causa una disminución en los niveles del receptor por cuando menos 70%, más preferiblemente 80%. En una modalidad preferida, el anticuerpo se administra casi 24 horas antes de que se midan los niveles del IGF-IR. Los niveles del IGF-IR pueden medirse mediante cualquier método conocido en la técnica, tales como los que se describen más adelante. En una modalidad preferida, el anticuerpo se selecciona de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-1 1A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-1 1A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINTEAS, PINT-12A4 y PINT-12A5, o comprende una cadena pesada, cadena ligera o porción de unión a antígeno del mismo. En otra modalidad, un anticuerpo del IGF-IR inhibe el crecimiento de células tumorales in vivo. La célula tumoral puede derivarse de cualquier tipo de célula que incluya, sin limitación, células epidérmicas, epiteliales, endoteliales, leucémicas, de sarcoma, de mieloma múltiple, o mesodérmicas. Ejemplos de líneas de células tumorales comunes para su uso en estudios de tumores de xenoinjerto, incluyen células A549 (carcinoma pulmonar de células no pequeñas), células DU-145 (próstata), células MCF-7 (mama), células Coló 205 (colon), células 3T3/IGF-IR (fibroblastos de ratón), células NCI H441 , células HEP G2 (hepatoma), células MDA MB 231 (mama), células HT-29 (colon), células MDA-MB-435s (mama), células U266, células SH-SY5Y, células Sk-Mel-2, NC1-H929, RPMI8226 y células A431. En una modalidad preferida, el anticuerpo inhibe el crecimiento de células tumorales en comparación con el crecimiento del tumor en un animal no tratado. En una modalidad más preferida, el anticuerpo inhibe el crecimiento de células tumorales por 50%. En una modalidad aún más preferida, el anticuerpo inhibe el crecimiento de células tumorales por 60%, 65%, 70% o 75%. En una modalidad, la inhibición del crecimiento de celulares tumorales se mide por lo menos 7 días después de que se ha iniciado el tratamiento de los animales con el anticuerpo. En una modalidad más preferida, la inhibición del crecimiento de células tumorales se mide por lo menos 14 días después de que se ha iniciado el tratamiento de los animales con el anticuerpo. En otra modalidad preferida, se administra otro agente antineoplásico al animal con el anticuerpo del IGF-IR. En una modalidad preferida, el agente antineoplásico es capaz de inhibir además el crecimiento de células tumorales. En una modalidad aún más preferida, el agente antineoplásico es adriamicina, taxol, tamoxifeno, 5-fluorodesoxiuridina (5-FU) o CP-358,774. En una modalidad preferida, la co-administración de un agente antineoplásico y el anticuerpo del IGF-IR inhibe el crecimiento de células tumorales, por cuando menos 50%, más preferiblemente 60%, 65%, 70% o 75%, muy preferiblemente 80%, 85% o 90% después de un período de 22 a 24 días.

Inducción de apoptosis mediante anticuerpos del IGF-IR Otro aspecto de la invención provee un anticuerpo del IGF-IR que induce muerte celular. En una modalidad, el anticuerpo causa apoptosis. El anticuerpo puede inducir apoptosis in vivo o in vitro. En general, las células tumorales son más sensibles a la apoptosis que las células normales, de modo que de preferencia la administración de un anticuerpo del IGF-IR causa apoptosis de una célula tumoral más que de una célula normal. En otra modalidad, la administración de un anticuerpo del IGF-IR efectúa la activación de una serina-treonina cinasa Akt, la cual interviene en la vía de fosfatidil inositol (Pl) cinasa. La vía de Pl cinasa, a su vez, interviene en la proliferación celular y prevención de apoptosis. De esta manera, la inhibición de la Akt puede causar apoptosis. En una modalidad más preferida, el anticuerpo se administra in vivo para causar la apoptosis de una célula que expresa el IGF-I y el IGF-II. En una modalidad preferida, el anticuerpo se selecciona de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-1 1A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5, o comprende una cadena pesada, cadena ligera, o porción de unión a antígeno del mismo.

Métodos para producir anticuerpos y líneas de células que producen anticuerpos Inmunización En una modalidad de la presente invención, se producen anticuerpos humanos inmunizando a un animal no humano que comprenda el locus de inmunoglobulina humana entero, o parte del mismo, con un antígeno del IGF-IR. En una modalidad preferida, el animal no humano es un XENOMOUSE , el cual es una cepa de ratón diseñada que comprende grandes fragmentos de los loci de inmunoglobulina humana, y es deficiente en la producción de anticuerpos de ratón. Véase, por ejemplo, Green ef al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994) y las patentes de los Estados Unidos 5,916,771 , 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181 , 6,091 ,001 , 6,114,598 y 6,130,364. Véase también los documentos WO 91/10741 , publicado en julio 25 de 1991 , WO 94/02602, publicado en febrero 3 de 1994, WO 96/34096 y WO 96/33735, publicados en octubre 31 de 1996, WO 98/16654, publicado en abril 23 de 1998, WO 98/24893, publicado en junio 11 de 1998, WO 98/50433, publicado en noviembre 12 de 1998, WO 99/45031 , publicado en septiembre 10 de 1999, WO 99/53049, publicado en octubre 21 de 1999, WO 00/09560, publicado en febrero 24 de 2000 y WO 00/037504, publicados en junio 29 de 2000. El XENOMOUSE™ produce un repertorio de anticuerpos totalmente humanos tipo humano adulto, y genera anticuerpos monoclonales humanos específicos del antígeno. Un XENOMOUSE™ de segunda generación contiene aproximadamente 80% del repertorio de anticuerpos humanos a través de la introducción de fragmentos de YAC de configuración de la línea germinal de tamaño en megabases de los loci de la cadena ligera ? y loci de la cadena pesada humana. Véase Méndez et al. Nature Genetics 15: 146-156 (1997), y Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998), cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. La invención provee también un método para producir anticuerpos del IGF-IR de animales no humanos, diferentes del ratón, inmunizando a animales transgénicos no humanos que comprendan Ioci de inmunoglobulina humana. Pueden producirse dichos animales usando los métodos descritos anteriormente. Los métodos descritos en estas patentes pueden modificarse como se describe en la patente de los Estados Unidos 5,994,619. En una modalidad preferida, los animales no humanos pueden ser ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. En otra modalidad, el animal no humano que comprende Ioci del gen de inmunoglobulina humana, son animales que tienen un "minilocus" de inmunoglobulinas humanas. En el procedimiento del minilocus, un locus de Ig exógeno es imitado a través de la inclusión de genes individuales del locus de Ig. De esta manera, uno o más genes del VH, uno o más genes de DH, uno o más genes de JH, una región constante mu y una segunda región constante (de preferencia una región constante gamma), se forman en una construcción para su inserción en un animal. Este procedimiento se describe, entre otras, en las patentes de E.U.A. No. 5,545,807, 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661 ,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591 ,669, 5,612,205, 5,721 ,367, 5,789,215 y 5,643,763, incorporadas en la presente como referencia. Una ventaja del procedimiento del minilocus, es la rapidez con la cual construcciones que incluyen porciones del locus de Ig pueden generarse e introducirse en animales. Sin embargo, una desventaja potencial del procedimiento del minilocus, es que puede no haber suficiente diversidad de inmunoglobulinas para sustentar el desarrollo completo de células B, de modo que puede haber una menor producción de anticuerpos. Para producir un anticuerpo del IGF-IR humano, un animal no humano que comprenda todos los loci de inmunoglobulina humana, o algunos de los mismos, es inmunizado con un antígeno del IGF-IR, y el anticuerpo o la célula que produce anticuerpos se aisla del animal. El antígeno del IGF-IR puede ser IGF-IR aislado y/o purificado, y es de preferencia un IGF-IR humano. En otra modalidad, el antígeno del IGF-IR es un fragmento del IGF-IR, de preferencia el dominio extracelular del IGF-IR. En otra modalidad, el antígeno del IGF-IR es un fragmento que comprende por lo menos un epítope del IGF-IR. En otra modalidad, el antígeno del IGF-IR es una célula que expresa el IGF-IR sobre su superficie, de preferencia una célula que sobreexpresa el IGF-IR sobre su superficie. La inmunización de los animales puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Métodos para la inmunización de animales no humanos tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado vacuno y caballos, son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, citado anteriormente, y la patente de los Estados Unidos 5,994,619. En una modalidad preferida, el antígeno del IGF-IR se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Dichos adyuvantes incluyen adyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (dipéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos de inmunoestimulación). Dichos adyuvantes pueden proteger al polipéptido de la dispersión rápida secuestrándolo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulan al hospedero para que secrete factores que son quimiotácticos para macrófagos y otros componentes del sistema inmune. De preferencia, si se está administrando un polipéptido, el programa de inmunización incluirá dos o más administraciones del polipéptido, extendidas por varias semanas.

Producción de anticuerpos y líneas de células que producen anticuerpos Después de la inmunización de un animal con un antígeno del IGF-IR, pueden obtenerse anticuerpos y/o células que producen anticuerpos del animal. Un suero que contiene anticuerpos del IGF-IR se obtiene del animal, sangrando o sacrificando al animal. El suero puede usarse como se obtiene del animal, puede obtenerse una fracción de inmunoglobulina del suero, o pueden purificarse los anticuerpos del IGF-IR del suero. Las inmunoglobulinas o el suero que se obtienen de esta manera son policlonales, lo cual es desventajoso porque la cantidad de anticuerpos que puede obtenerse es limitada, y el anticuerpo policlonal tiene una gama heterogénea de propiedades. En otra modalidad, pueden prepararse hibridomas inmortalizados que producen anticuerpos a partir del animal inmunizado. Después de la inmunización, el animal es sacrificado, y las células B esplénicas son fusionadas a células de mieloma inmortalizadas como es bien sabido en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, citado anteriormente. En una modalidad preferida, las células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea de células no secretoria). Después de la fusión y selección con antibióticos, los hibridomas se seleccionan usando el IGF-IR, una porción del mismo, o una célula que expresa el IGF-IR. En una modalidad preferida, la selección inicial se lleva a cabo usando un inmunoensayo ligado a enzima (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), de preferencia una ELISA. Un ejemplo de selección mediante ELISA se provee en el documento WO 00/37504, incorporado en la presente como referencia. En otra modalidad, pueden prepararse células que producen anticuerpos de un humano que tenga un trastorno autoinmune y que exprese anticuerpos del IGF-IR. Las células que expresan los anticuerpos del IGF-IR pueden aislarse aislando glóbulos blancos y sometiéndolos a distribución de células activada por fluorescencia (FACS) o mediante toma panorámica sobre placas recubiertas con el IGF-IR o una porción del mismo. Estas células pueden fusionarse con un mieloma no secretorio humano que produzca hibridomas humanos que expresen anticuerpos del IGF-IR humano. En general, esta es una modalidad menos preferida, debido a que es probable que los anticuerpos del IGF-IR tengan una baja afinidad por el IGF-IR. Los hibridomas que producen anticuerpos del IGF-IR son seleccionados, clonados y tamizados además para características deseables, incluyendo crecimiento vigoroso del hibridoma, alta producción de anticuerpos y características deseables del anticuerpo, como se discute más adelante. Los hibridomas pueden cultivarse y expandirse in vivo en animales singénicos, en animales que carezcan de un sistema inmune, por ejemplo, ratones desnudos, o en cultivo de células in vitro. Métodos de selección, clonación y expansión de hibridomas, son bien conocidos por los expertos en la técnica. De preferencia, el animal inmunizado es un animal no humano que expresa genes de inmunoglobulina humana, y las células B esplénicas son fusionadas a un mieloma derivado de la misma especie que el animal no humano. Más preferiblemente, el animal inmunizado es un XENOMOUSE™, y la línea de células de mieloma es un mieloma de ratón no secretorio, tal como la línea de células de mieloma NSO-bcl-2. En un aspecto, la invención provee hibridomas que producen anticuerpos del IGF-IR humano. En una modalidad preferida, los hibridomas son hibridomas de ratón, como se describió anteriormente. En otra modalidad preferida, los hibridomas se producen en una especie no humana, diferente del ratón, tales como ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. En otra modalidad, los hibridomas son hibridomas humanos en los cuales un mieloma no secretorio de humano es fusionado con una célula humana que exprese un anticuerpo del IGF-IR.

Acidos nucleicos, vectores, células hospederas y métodos recombinantes para producir anticuerpos Acidos nucleicos Se proveen moléculas de ácido nucleico que codifican para anticuerpos del IGF-IR de la invención. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica para una cadena pesada y/o ligera de una ¡nmunoglobulina del IGF-IR. En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico individual codifica para una cadena pesada de una ¡nmunoglobulina del IGF-IR, y otra molécula de ácido nucleico codifica para la cadena ligera de una ¡nmunoglobulina del IGF-IR. En una modalidad más preferida, la ¡nmunoglobulina codificada es una ¡nmunoglobulina humana, de preferencia una IgG humana. La cadena ligera codificada puede ser una cadena ? o una cadena ?, de preferencia una cadena ?. La molécula de ácido nucleico que codifica para la región variable de la cadena ligera puede derivarse del gen de V A30, A27 u 012. En otra modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica para la cadena ligera comprende la región de unión derivada de JK1 , JK2 O JK4. En una modalidad aún más preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica para la cadena ligera contiene no más de diez cambios de aminoácido de la línea germinal, de preferencia no más de seis cambios de aminoácido, y aún más preferiblemente no más de tres cambios de aminoácido. La invención provee una molécula de ácido nucleico que codifica para una región variable de la cadena ligera (VL) que contiene por lo menos tres cambios de aminoácido en comparación con la secuencia de la línea germinal, en donde los cambios de aminoácido son idénticos a los cambios de aminoácido de la secuencia de la línea germinal de la VL de uno de los anticuerpos PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-1 1A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5. La invención provee también una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-1 1A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-1 1A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINT-12A5. La invención provee también una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de cualquiera de las cadenas ligeras de P1NT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, P1NT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, P1NT-12A3, PINT-12A4 o PINT-12A5. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de todas las CDRs de cualquiera de las cadenas ligeras de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-1 1A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-1 1A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINT-12A5. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos dé la VL de una de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19, o comprende una secuencia de ácido nucleico de una de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38, o un fragmento de la misma. En otra modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de cualquiera de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, o comprende una secuencia de ácido nucleico de una o más de las CDRs de cualquiera de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38. En una modalidad más preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de todas las CDRs de cualquiera de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, o comprende una secuencia de ácido nucleico de todas las CDRs de cualquiera de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38. La invención provee también una molécula de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de una VL que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una VL descrita anteriormente, en particular a una VL que comprende una secuencia de aminoácidos de una de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19. La invención provee también una secuencia de ácido nucleico que es por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico de una de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38, o un fragmento de la misma. En otra modalidad, la invención provee una molécula de ácido nucleico que codifica para una VL que híbrida bajo condiciones altamente severas con una molécula de ácido nucleico que codifica para una VL como se describió anteriormente, en particular una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de VL de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19. La invención provee también una secuencia de ácido nucleico que codifica para una VL que híbrida bajo condiciones altamente severas con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de una de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38, o una secuencia de ácido nucleico que hibridaría salvo por la degeneración del código genético. La invención provee también una molécula de ácido nucleico que codifica para la región variable de la cadena pesada (VH) que se deriva del gen de VH DP-14, DP-47, DP-50, DP-73 o DP-77. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica para la VH comprende la región de unión derivada de JH6 o JH5. En otra modalidad preferida, el segmento D se deriva de 3-3, 6-19 ó 4-17. En una modalidad aún más preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica para la VH contiene no más de diez cambios de aminoácido del gen de la línea germinal, de preferencia no más de seis cambios de aminoácido, y aún más preferiblemente no más de tres cambios de aminoácido. En una modalidad altamente preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica para la VH contiene por lo menos un cambio de aminoácido en comparación con la secuencia de la línea germinal, en donde el cambio de aminoácido es idéntico al cambio de aminoácido de la secuencia de la línea germinal de la cadena pesada de uno de los anticuerpos PINT-6A1 , PINT-7A2, P1NT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1, PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o P1NT-12A5. En una modalidad aún más preferida, la VH contiene por lo menos tres cambios de aminoácido en comparación con las secuencias de la línea germinal, en donde los cambios son idénticos a los cambios de la secuencia de la línea germinal de la VH de uno de los anticuerpos PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, P1NT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINT-12A5. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de la VH de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, P1NT-7A6, PINT-8A1, PINT-9A2, PINT-11A1, PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5, o un fragmento de cualquiera de las mismas. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de PINT-7A4, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A4, o un fragmento de cualquiera de las mismas. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de PINT-8A1 , PINT-9A2 y PINT- 1A4, o un fragmento de cualquiera de las mismas. El cuadro 2 muestra las secuencias de ácido nucleico de los scFvs PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, P1NT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 PINT-12A5. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de la cadena pesada de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT- 7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-1 1A1, PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-1 1A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINT-12A5. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para las secuencias de aminoácidos de todas las CDRs de la cadena pesada de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-1 1A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 o PINT-12A5. En otra modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de la VH de una de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, o que comprende una secuencia de ácido nucleico de una de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38. En otra modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de una o más de las CDRs de cualquiera de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, o comprende una secuencia de ácido nucleico de una o más de las CDRs de cualquiera de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de todas las CDRs de cualquiera de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO:19, o comprende una secuencia de ácido nucleico de todas las CDRs de cualquiera de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica para una secuencia de aminoácidos de una VH que es por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una de las secuencias de aminoácidos que codifica para una VH como se describió anteriormente, en particular a una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de una de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19. La invención provee también una secuencia de ácido nucleico que es por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de ácido nucleico de una de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica para una VH es una que híbrida bajo condiciones altamente severas con una secuencia de ácido nucleico que codifica para una VH como se describió anteriormente, en particular con una VH que comprende una secuencia de aminoácidos de una de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO:19. La invención provee también una secuencia de ácido nucleico que codifica para una VH que híbrida bajo condiciones altamente severas con una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de una de SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38, o una secuencia de ácido nucleico que hibridaría salvo por la degeneración del código genético. La molécula de ácido nucleico que codifica para las cadenas pesada y ligera enteras, o cualquiera de las mismas, de un anticuerpo del IGF-IR o las regiones variables de las mismas, puede obtenerse de cualquier fuente que produzca un anticuerpo del IGF-IR. Métodos de aislamiento de ARN mensajero que codifica para un anticuerpo, son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. El ARN mensajero puede usarse para producir ADNc para su uso en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) o clonación de ADNc de genes de los anticuerpos. En una modalidad de la invención, las moléculas de ácido nucleico pueden obtenerse de un hibridoma que exprese un anticuerpo del IGF-IR, como se describió anteriormente, de preferencia un hibridoma que tenga como uno de sus miembros de fusión una célula animal transgénica que exprese genes de inmunoglobulina humana, tales como un XENOMOUSE™, animal transgénico no humano (ratón), o un animal transgénico no humano diferente del ratón. En otra modalidad, el hibridoma se deriva de un animal no humano no transgénico el cual puede usarse, por ejemplo, para anticuerpos humanizados. Una molécula de ácido nucleico que codifica para la cadena pesada entera de un anticuerpo del IGF-IR puede construirse fusionando una molécula de ácido nucleico que codifica para el dominio variable de una cadena pesada o un dominio de unión a antígeno de la misma, con un dominio constante de una cadena pesada. Asimismo, una molécula de ácido nucleico que codifique para la cadena ligera de un anticuerpo del IGF-IR puede construirse fusionando una molécula de ácido nucleico que codifique para el dominio variable de una cadena ligera o un dominio de unión a antígeno de la misma, con un dominio constante de una cadena ligera. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para la cadena VH y VL pueden ser convertidas a genes de anticuerpos de longitud completa, insertándolas en vectores de expresión que codifican ya para las regiones constantes de cadena pesada y regiones constantes de cadena ligera, respectivamente, de modo que el segmento VH sea enlazado operablemente a los segmentos de la región constante de la cadena pesada (CH) dentro del vector, y el segmento VL sea enlazado operablemente al segmento de la región constante de la cadena ligera (CL) dentro del vector. En forma alternativa, las moléculas de ácido nucleico que codifican para las cadenas VH o VL son convertidas en genes de anticuerpos de longitud completa enlazando, por ejemplo, ligando la molécula de ácido nucleico que codifica para una cadena VH a una molécula de ácido nucleico que codifica para una cadena CH usando técnicas estándar de biología molecular. Lo mismo puede lograrse usando moléculas de ácido nucleico que codifiquen para las cadenas VL y CL. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera y la cadena pesada humanas, se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. edición, NIH Publ. No. 91-3242, 1991. Moléculas de ácido nucleico que codifiquen para las cadenas pesada y/o ligera de longitud completa, pueden ser expresadas entonces de una célula en la cual hayan sido introducidas y el anticuerpo del IGF-IR se haya aislado. En una modalidad preferida, el ácido nucleico que codifica para la región variable de la cadena pesada codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19, y la molécula de ácido nucleico que codifica para la región variable de las cadenas ligeras codifica para la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o SEQ ID NO: 19. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico que codifique para la cadena pesada de un anticuerpo del IGF-IR o un dominio de unión a antígeno del mismo, o la cadena ligera de un anticuerpo del IGF-IR o un dominio de unión a antígeno del mismo, puede aislarse de un animal no humano diferente del ratón que exprese genes de inmunoglobulina humana y haya sido inmunizado con un antígeno del IGF-IR. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico puede aislarse de una célula que produce anticuerpos del IGF-IR derivada de un animal no transgénico o de un paciente humano que produce anticuerpos del IGF-IR. Las células que producen anticuerpos del IGF-IR pueden aislarse mediante técnicas estándar, pueden clonarse y/o amplificarse usando PCR y técnicas de construcción de colecciones, y pueden seleccionarse usando protocolos estándar para obtener moléculas de ácido nucleico que codifican para las cadenas ligera y pesada del IGF-IR. Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para expresar en forma recombinante grandes cantidades de anticuerpos del IGF-IR como se describe más adelante. Las moléculas de ácido nucleico pueden usarse también para producir anticuerpos quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, inmunoadhesinas, cuerpos completos, anticuerpos mutados y derivados de anticuerpo, como se describe más adelante. Si las moléculas de ácido nucleico se derivan de un animal no humano no transgénico, las moléculas de ácido nucleico pueden usarse para la humanización de anticuerpos, también como se describe más adelante. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden usarse como sondas o iniciadores de PCR para secuencias de anticuerpo específicas. Por ejemplo, una sonda de molécula de ácido nucleico puede usarse en métodos de diagnóstico, o un iniciador de PCR de molécula de ácido nucleico puede usarse para amplificar regiones de ADN que pudieran usarse, entre otras cosas, para aislar secuencias de ácido nucleico para su uso en la producción de dominios variables de anticuerpos del IGF-IR. En una modalidad preferida, las moléculas de ácido nucleico son oligonucleótidos. En una modalidad más preferida, los oligonucleótidos son de regiones altamente variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo de interés. En una modalidad aún más preferida, los oligonucleótidos codifican para una o más de las CDRs completas, o una parte de las mismas.

Vectores La invención provee vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican para la cadena pesada o la porción de unión a antígeno de la misma. La invención provee también vectores que comprenden las moléculas de ácido nucleico de la invención que codifican para la cadena ligera o porción de unión a antígeno de la misma. La invención provee también vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpo, y sondas de los mismos. Para expresar los anticuerpos, o porciones de anticuerpo de la invención, moléculas de ADN que codifican para cadenas ligeras y pesadas de longitud parcial o completa, obtenidas como se describió anteriormente, se insertan en vectores de expresión, de modo que los genes sean enlazados operablemente a secuencias de control de la transcripción y traducción. Vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, YACs, episomas derivados de EBV, y similares. El gen del anticuerpo es ligado en un vector, de modo que las secuencias de control de la transcripción y traducción dentro del vector cumplen su función deseada de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se seleccionan para que sean compatibles con la célula hospedera de expresión usada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y e! gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en un vector separado. En una modalidad preferida, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos estándar (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o ligación de extremos rasurados si no están presentes sitios de restricción). Un vector conveniente, es uno que codifique para una secuencia de inmunoglobulina de CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción adecuados diseñados de modo que cualquier secuencia de la VH o la VL pueda ser fácilmente insertada y expresada, como se describió anteriormente. En dichos vectores, ocurre usualmente empalme entre el sitio donador de empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de empalme que precede a la región C humana, y también en las regiones de empalme que ocurren dentro de los exones de CH humanos. Ocurren poliadenilación y terminación de la transcripción en sitios cromosómicos nativos corriente abajo de las diez regiones codificantes. El vector de expresión recombinante puede codificar también para un péptido de señal que facilite la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula hospedera. El gen de la cadena de anticuerpo puede ser clonado en el vector, de modo que el péptido de señal sea enlazado en el marco de lectura al amino-terminal del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína diferente de inmunoglobulina). Además de los genes de la cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención poseen secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena de anticuerpo en una célula hospedera. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Secuencias reguladoras preferidas para expresión en células hospederas de mamífero, incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamífero, tales como promotores y/o intensificadores derivados de LTRs retrovirales, citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/intensificador del CMV), virus simiano 40 (SV40) (tal como el promotor/intensificador del SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores fuertes de mamífero tales como promotores de actina e inmunoglobulina nativos. Para una mejor descripción de elementos reguladores virales, y secuencias de los mismos véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,168,062, por Stinski, patente de E.U.A. No. 4,510,245 por Bell er a/., y patente de E.U.A. No. 4,968,615 por Schaffner et al. Además de los genes de la cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden poseer otras secuencias, tales como secuencias que regulen la replicación del vector en células hospederas (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionares. El gen marcador seleccionare facilita la selección de las células hospederas en las cuales el vector ha sido introducido (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,399,2 6, 4,634,665 y 5,179,017, por Axel et al.). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato en una célula hospedera en la cual el vector ha sido introducido. Genes marcadores seleccionabas preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células hospederas dhfr con selección/amplificación de metotrexato), y el gen neo (para selección de G418).

Células hospederas diferentes de hibridoma, v métodos para producir proteínas en forma recombinante Moléculas de ácido nucleico que codifiquen para la cadena pesada o una porción de unión a antígeno de las mismas y/o la cadena ligera o una porción de unión a antígeno de las mismas de un anticuerpo del IGF-IR, y vectores que comprenden estas moléculas de ácido nucleico, pueden usarse para la transformación de una célula hospedera de mamífero adecuada. La transformación puede ser mediante cualquier método conocido para la introducción de poiinucleótidos en una célula hospedera. Métodos para la introducción de poiinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica, e incluyen transfección mediada por dextrán, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación y encapsulación de los poiinucleótidos en liposomas, inyección biolística y microinyección directa del ADN en núcleos. Además, pueden introducirse moléculas de ácido nucleico en células de mamífero mediante el uso de vectores virales. Métodos para la transformación de células son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455 (las cuales se incorporan en la presente como referencia). Líneas de células de mamífero disponibles como hospederos para expresión son bien conocidas en la técnica, e incluyen muchas líneas de células inmortalizadas disponibles de The American Type Culture Collection (ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), células NSO, células SP2, células HeLa, células de riñon de cría de hámster (BHK), células de riñon de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, células 3T3, y muchas otras líneas de células. Células hospederas de mamífero incluyen células de humano, ratón, rata, perro, mono, cerdo, cabra, bovino, caballo y hámster. Las líneas de células de preferencia particular se seleccionan a través de la determinación de qué líneas de células tienen altos niveles de expresión. Otras líneas de células que pueden usarse son líneas de células de insecto, tales como células Sf9, células de anfibio, células bacterianas, células vegetales y células de hongos. Cuando vectores de expresión recombinantes que codifican para la cadena pesada o porción de unión a antígeno de la misma, o la cadena ligera y/o porción de unión a antígeno de la misma, se introducen en las células hospederas de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospederas por un período suficiente que permita la expresión del anticuerpo en las células hospederas o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual las células hospederas se desarrollan. Pueden recuperarse anticuerpos del medio de cultivo usando métodos estándar de purificación de proteínas. Además, la expresión de los anticuerpos de la invención (u otras porciones de los mismos) a partir de líneas de células de producción, puede intensificarse usando muchas técnicas conocidas. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de glutamina sintetasa (el sistema GS), es un procedimiento común que se usa para intensificar la expresión bajo ciertas condiciones. El sistema GS se discute totalmente o en parte con relación a la patente europea Nos. 0 216 846, 0 256 055 y 0 323 997 y la solicitud de patente europea No. 89303964.4. Es probable que los anticuerpos expresados por diferentes líneas de células o en animales transgénicos tengan diferente glucosilación entre sí. Sin embargo, todos los anticuerpos codificados por las moléculas de ácido nucleico provistas en la presente, o que comprenden las secuencias de aminoácidos provistas en la presente, son parte de la presente invención, sin importar la glucosilación de los anticuerpos.

Animales transgénicos La invención provee también animales no humanos transgénicos que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico de la invención que pueden usarse para producir los anticuerpos de la invención. Pueden producirse anticuerpos en, y recuperarse de, tejido o fluidos corporales, tales como leche, sangre u orina, de cabras, vacas, caballos, cerdos, ratas, ratones, conejos, hámsteres u otros mamíferos. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 y 5,741 ,957. Como se describió anteriormente, pueden producirse animales transgénicos no humanos que comprendan loci de inmunoglobulina humana, mediante inmunización con el IGF-IR, o una porción del mismo. En otra modalidad, se producen animales transgénicos no humanos introduciendo una o más moléculas de ácido nucleico de la invención en un animal mediante técnicas transgénicas estándar. Véase Hogan, citado anteriormente. Las células transgénicas usadas para obtener el animal transgénico pueden ser células madre embrionarias o células somáticas. Los organismos no humanos transgénicos pueden ser quiméricos, heterocigotos no quiméricos y homocigotos no quiméricos. Véase, por ejemplo, Hogan ef al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2a. ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson ef al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); y Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). En otra modalidad, los organismos no humanos transgénicos pueden tener un reemplazo e interrupción elegida como objetivo que codifique para una cadena pesada y/o cadena ligera de interés. En una modalidad preferida, los animales transgénicos comprenden y expresan moléculas de ácido nucleico que codifican para cadenas pesada y ligera que se unen específicamente al IGF-IR, de preferencia el IGF-IR humano. En otra modalidad, los animales transgénicos comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican para un anticuerpo modificado tal como un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos del IGF-IR pueden producirse en cualquier animal transgénico. En una modalidad preferida, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. El animal transgénico no humano expresa dichos polipéptidos codificados en sangre, leche, orina, saliva, lágrimas, moco y otros fluidos corporales.

Colecciones de presentación visual de fagos La invención provee un método para producir un anticuerpo del IGF-IR o porción de unión a antígeno del mismo, el cual comprende los pasos de sintetizar una colección de anticuerpos humanos en un fago, seleccionando la colección con un IGF-IR o una porción del mismo, aislando el fago que se une al IGF-IR, y obteniendo el anticuerpo del fago. Un método para preparar la colección de anticuerpos, comprende los pasos de inmunizar a un animal hospedero no humano que comprenda un locus de inmunoglobulina humana con el IGF-IR o una porción antigénica del mismo para crear una respuesta inmune, extrayendo células del animal hospedero que son responsables de la producción de los anticuerpos; aislando ARN de las células extraídas, transcribiendo en forma inversa el ARN para producir ADNc, amplificando el ADNc usando un iniciador, e insertando el ADNc en el vector de la presentación visual de fagos, de modo que se expresen los anticuerpos en el fago. De esta manera, pueden obtenerse anticuerpos del IGF-IR recombinantes de la invención. Anticuerpos humanos del IGF-IR recombinantes de la invención además de los anticuerpos del IGF-IR descritos en la presente, pueden aislarse seleccionando una colección de anticuerpos combinatoria recombinante, de preferencia una colección de presentación visual de fagos de scFv preparada usando moléculas de ADN de la VL y VH humanas, preparadas a partir de ARN mensajero derivado de linfocitos humanos. Metodologías para la preparación y selección de dichas colecciones se conocen en la técnica. Existen equipos disponibles comercialmente para la generación de colecciones de presentación visual de fagos (por ejemplo, el sistema de anticuerpos de fagos recombinantes de Pharmacia, número de catálogo 27-9400-01 ; y el equipo de presentación visual de fagos SurZap™ de Stratagene, número de catálogo 240612). Existen también otros métodos y reactivos que pueden usarse para generar y seleccionar colecciones de presentación visual de anticuerpos (véase, por ejemplo, Ladner eí al. patente de E.U.A. No. 5,223,409; Kang eí al., publicación del PCT No. WO 92/18619; Dower eí al., publicación del PCT No. WO 91/17271 ; Winter eí al., publicación del PCT No. WO 92/20791 ; arkland eí al., publicación del PCT No. WO 92/15679; Breitling eí al., publicación del PCT No. WO 93/01288; McCafferty eí al., publicación del PCT No. WO 92/01047; Garrard eí al., publicación del PCT No. WO 92/09690; Fuchs et al. (1991), Bio Technology 9: 1370-1372; Hay eí al. (1992), Hum. Antibody. Hybridomas 3: 81-85; Huse eí al. (1989), Science 246: 1275-1281 ; McCafferty eí al., Nature (1990) 348: 552-554; Griffiths eí al. (1993), EMBO J 12: 725-734; Hawkins eí al. (1992), J. Mol. Biol. 226: 889-896; Clackson et al. (1991 ), Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580; Garrad eí al. (1991), Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom eí al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; y Barbas eí al. (1991 ), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982. En una modalidad preferida, para aislar anticuerpos del IGF-IR humano con las características deseadas, un anticuerpo del IGF-IR humano como se describe en la presente se usa primero para seleccionar secuencias de cadena pesada y ligera humanas que tengan actividad de unión similar hacia el IGF-IR, usando los métodos de imprimación de epítopes descritos en Hoogenboom et al., publicación del PCT No. WO 93/06213. Las colecciones de anticuerpos usadas en este método son de preferencia colecciones de scFv preparadas y seleccionadas como se describe en McCafferty et al., publicación del PCT No. WO 92/01047, McCafferty ef al., Nature 348: 552-554 (1990); y Griffiths et al., EMBO J 12: 725-734 (1993). Las colecciones de anticuerpos scFv se seleccionan de preferencia usando el IGF-IR humano como el antígeno. Una vez que se seleccionan segmentos de VL y VH humanos iniciales, se llevan a cabo experimentos de "mezcla y correspondencia", en los cuales diferentes pares de los segmentos de VL y VH seleccionados inicialmente se seleccionan para unión al IGF-IR, para seleccionar combinaciones de pares de VL/VH preferidas. Además, para mejorar además la calidad del anticuerpo, ios segmentos de VL y VH de los pares de VL/VH preferidos pueden mutarse aleatoriamente, de preferencia dentro de la región CDR3 de la VH y/o VL, en un procedimiento análogo al procedimiento de mutación somática ¡n vivo que determina la maduración por afinidad de anticuerpos durante una respuesta inmune natural. Esta maduración por afinidad in vitro puede lograrse amplificando regiones de VH y VL usando iniciadores de PCR complementarios a la CDR3 de la VH o la CDR3 de la VL, respectivamente, cuyos iniciadores hayan sido "no seleccionados" con una mezcla aleatoria de las cuatro bases de nucleótidos en ciertas posiciones, de modo que los productos de PCR resultantes codifiquen para segmentos de la VH y VL en los cuales se han introducido mutaciones aleatorias en las regiones CDR3 de la VH y/o VL. Estos segmentos de la VH y VL mutados aleatoriamente, pueden seleccionarse otra vez para unión al IGF-IR. Después de la selección y el aislamiento de un anticuerpo del IGF-IR de la invención a partir de una colección de presentación visual de inmunoglobulina recombinante, puede recuperarse ácido nucleico que codifique para el anticuerpo seleccionado del empaque de presentación visual (por ejemplo, del genoma del fago), y puede subclonarse en otros vectores de expresión mediante técnicas estándar de ADN recombinante. Si se desea, el ácido nucleico puede manipularse adicionalmente para crear otras formas de anticuerpo de la invención, como se describe más adelante. Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado seleccionando una colección combinatoria, el ADN que codifica para el anticuerpo es clonado en un vector de expresión recombinante, e introducido en células hospederas de mamífero como se describió anteriormente.

Cambio de clase Otro aspecto de la presente invención, es proveer un mecanismo por el cual la clase de un anticuerpo del IGF-IR pueda cambiarse con otra. En un aspecto de la invención, una molécula de ácido nucleico que codifica para la VH o VL es aislada usando métodos bien conocidos en la técnica, de modo que no incluya secuencias de ácido nucleico que codifiquen para la CH o CL.

La molécula de ácido nucleico que codifica para la VL o VH es entonces enlazada operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica para una CL o CH de una clase diferente de molécula de ¡nmunoglobulina. Esto puede lograrse usando un vector o molécula de ácido nucleico que comprenda una cadena CL o CH, como se describió anteriormente. Por ejemplo, un anticuerpo del IGF-IR que fue originalmente IgM, puede ser cambiado de clase a una IgG. Además, el cambio de clase puede usarse para convertir una subclase de IgG en otra, por ejemplo, de lgG1 a lgG2. Un método preferido para producir un anticuerpo de la invención que comprenda un isotipo deseado, comprende los pasos de aislar un ácido nucleico que codifique para la cadena pesada de un anticuerpo del IGF-IR, y un ácido nucleico que codifique para la cadena ligera de un anticuerpo del IGF-IR, obtener la región variable de la cadena pesada, ligar la región variable de la cadena pesada con el dominio constante de una cadena pesada del isotipo deseado, expresar la cadena ligera y la cadena pesada ligada en una célula, y colectar el anticuerpo del IGF-IR con el isotipo deseado.

Derivados de anticuerpos Pueden usarse las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente, para generar derivados de anticuerpos usando técnicas y métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Anticuerpos humanizados Como se discutió anteriormente con respecto a la generación de anticuerpos humanos, existen ventajas de producir anticuerpos con inmunogenicidad reducida. Esto puede lograrse hasta cierto grado usando técnicas de humanización y técnicas de presentación visual usando colecciones adecuadas. Se apreciará que anticuerpos de murino o anticuerpos de otras especies, pueden ser humanizados o primatizados usando técnicas bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, Winter y Harris Immunol Today 14: 43-46 (1993) y Wright et al. Crít. Reviews ¡n Immunol. 12125-168 (1992). El anticuerpo de interés puede diseñarse mediante técnicas de ADN recombinante para sustituir la CH1 , CH2, CH3, dominios de gozne y/o el dominio de estructura, con la secuencia humana correspondiente (véase el documento WO 92/02190 y las patentes de E.U.A. Nos. 5,530,101 , 5,585,089, 5,693,761 , 5,693,792, 5,714,350 y 5,777,085). En una modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR puede ser inmunizado sustituyendo CH , CH2, CH3, dominios de gozne y/o el dominio de estructura con la secuencia humana correspondiente, mientras se mantienen todas las CDRs de la cadena pesada, la cadena ligera y las cadenas pesada y ligera.

Anticuerpos mutados En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico, vectores y células hospederas pueden usarse para producir anticuerpos del IGF-IR mutados. Los anticuerpos pueden ser mutados en los dominios variables de las cadenas pesada y/o ligera para alterar una propiedad de unión del anticuerpo. Por ejemplo, puede hacerse una mutación en una o más de las CDRs para aumentar o disminuir la Kd del anticuerpo para el IGF-IR, para aumentar o disminuir la Kde disociación, o para alterar al carácter específico de unión del anticuerpo. Técnicas en mutagénesis dirigida a sitio son bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook eí al. y Ausubel et al., citados anteriormente. En una modalidad preferida, se hacen mutaciones en un residuo de aminoácido que se sabe es cambiado en comparación con la línea germinal, en una región variable de un anticuerpo del IGF-IR. En una modalidad más preferida, se hacen una o más mutaciones en un residuo de aminoácido que se sabe es cambiado en comparación con la línea germinal, en una región variable o CDR de uno de los anticuerpos del IGF-IR PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , P1NT-9A2, PINT- 1A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-1 1A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5. En otra modalidad, se hacen una o más mutaciones en un residuo de aminoácido que se sabe es cambiado en comparación con la línea germinal, en una región variable o CDR cuya secuencia de aminoácidos se presenta en SEQ ID NO: , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: I , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, o cuya secuencia de ácido nucleico se presenta en SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico son mutadas en una o más de las regiones de estructura. Puede hacerse una mutación en una región de estructura o dominio constante para aumentar la vida media del anticuerpo del IGF-IR. Véase, por ejemplo, el documento WO 00/09560, publicado en febrero 24 de 2000, incorporado en la presente como referencia. En una modalidad, puede haber una, tres o cinco mutaciones puntuales y no más de diez mutaciones puntuales. Puede hacerse también una mutación en una región de estructura o dominio constante para alterar la inmunogenicidad del anticuerpo, para proveer un sitio para unión covalente o no covalente a otra molécula, o para alterar propiedades tales como la fijación del complemento. Pueden hacerse mutaciones en cada una de las regiones de estructura, el dominio constante, y las regiones variables en un anticuerpo mutado individual. En forma alternativa, pueden hacerse mutaciones en sólo una de las regiones de estructura, las regiones variables, o el dominio constante en un anticuerpo mutado individual. En una modalidad, existen no más de diez cambios de aminoácido en las regiones VH o VL del anticuerpo del IGF-IR mutado en comparación con el anticuerpo del IGF-IR antes de la mutación. En una modalidad más preferida, no existen más de cinco cambios de aminoácido en las regiones VH o VL del anticuerpo del IGF-I mutado, más preferiblemente no más de tres cambios de aminoácido. En otra modalidad, no existen más de quince cambios de aminoácido en los dominios constantes, más preferiblemente, no más de diez cambios de aminoácido, aún más preferiblemente, no más de cinco cambios de aminoácido.

Anticuerpos modificados En otra modalidad, puede producirse un anticuerpo de fusión o inmunoadhesina que comprenda un anticuerpo anti-IGF-IR completo, o una porción del mismo, enlazado a otro polipéptido. En una modalidad preferida, sólo las regiones variables del anticuerpo del IGF-IR son enlazadas al polipéptido. En otra modalidad preferida, el dominio VH de un anticuerpo del IGF-IR es enlazado a un primer polipéptido, mientras que el dominio VL de un anticuerpo del IGF-IR es enlazado a un segundo polipéptido que se asocia con el primer polipéptido en una forma en la cual los dominios VH o VL puedan interactuar con algún otro para formar un sitio de unión a anticuerpo. En otra modalidad preferida, el dominio VH es separado del dominio VL por un enlazador, de modo que los dominios VH y VL pueden interactuar con algún otro (véase más adelante la sección de anticuerpos de cadena sencilla). El anticuerpo de VL-enlazador-VH, es enlazado entonces al polipéptido de interés. El anticuerpo de fusión es útil para dirigir un polipéptido hacia una célula o tejido que exprese el IGF-IR. El polipéptido puede ser un agente terapéutico, tal como una toxina, factor de crecimiento u otra proteína reguladora, o puede ser un agente de diagnóstico, tal como una enzima que pueda visualizarse fácilmente, tal como peroxidasa de rábano picante. Además, pueden crearse anticuerpos de fusión en los cuales dos (o más) anticuerpos de cadena sencilla son enlazados a algún otro. Esto es útil si se desea crear un anticuerpo divalente o polivalente en una cadena polipeptídica individual, o si se desea crear un anticuerpo biespecífico. Para crear un anticuerpo de cadena sencilla, (svFv), los fragmentos de ADN que codifican para VH y VL son enlazados operablemente a otro fragmento que codifique para un enlazador flexible, por ejemplo, que codifique para la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser3) (SEQ ID NO: 39), de modo que las secuencias de VH y VL puedan expresarse como una proteína de cadena sencilla contigua, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (véase, por ejemplo, Bird eí al. (1988) Science 242: 423-426; Huston ef al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sel. USA 85: 5879-5883; McCafferty eí a/., Nature (1990) 348: 552-554). El anticuerpo de cadena sencilla puede ser monovalente, si sólo se usa una VH y una VL; bivalente, si se usan dos VH y VL; o polivalente, si se usan más de dos VH y VL. En otra modalidad, pueden prepararse otros anticuerpos modificados usando moléculas de ácido nucleico que codifiquen para el ÍGF-IR. Por ejemplo, pueden prepararse "cuerpos kappa" (lil et al., Protein Eng 10: 949-57 (1997)), "Minibodies" (Martin ef al., EMBO J 13: 5303 9 (1994)), "Diabodies" (Holliger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993)), o "Janusins" (Traunecker eí al., EMBO J 10: 3655-3659 (1991) y Traunecker eí al. "Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J Cáncer Supl. 7: 51-52 (1992)), usando técnicas estándar de biología molecular siguiendo las enseñanzas de esta especificación. En otro aspecto, pueden generarse anticuerpos quiméricos y biespecíficos. Puede generarse un anticuerpo quimérico que comprenda CDRs y regiones de estructura, a partir de anticuerpos diferentes. En una modalidad preferida, las CDRs del anticuerpo quimérico comprenden todas las CDRs de la región variable de una cadena ligera o cadena pesada de un anticuerpo del IGF-IR, mientras que las regiones de estructura se derivan de uno o más anticuerpos diferentes. En una modalidad más preferida, las CDRs del anticuerpo quimérico comprenden todas las CDRs de las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo del IGF-IR. Las regiones de estructura pueden ser de otra especie, y en una modalidad preferida, pueden ser humanizadas. En forma alternativa, las regiones de estructura pueden ser de otro anticuerpo humano. Puede generarse un anticuerpo biespecífico que se une específicamente al IGF-IR a través de un dominio de unión, y a una segunda molécula a través de un segundo dominio de unión. El anticuerpo biespecífico puede producirse a través de técnicas de biología molecular recombinante, o pueden conjugarse físicamente en conjunto. Además, puede generarse un anticuerpo de cadena sencilla que contenga más de una VH y VL, que se una específicamente al IGF-IR y a otra molécula. Dichos anticuerpos biespecíficos pueden generarse usando técnicas que son bien conocidas; por ejemplo, con respecto a (i) y (ii) véase, por ejemplo, Fanger eí al. Immunol. Methods 4: 72-81 ( 994) y Wright y Harris, citado anteriormente, y con respecto a (iii) véase, por ejemplo, Traunecker eí al. Int. J. Cáncer (Supl.) 7: 51-52 (1992). En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico se une al IGF-IR y a otra molécula expresada a alto nivel en células cancerosas o tumorales. En una modalidad más preferida, la otra molécula es RON, c-Met, receptor de erbB2, VEGF-2 o 3, CD20 o EGF-R. En otra modalidad, los anticuerpos modificados descritos anteriormente se preparan usando una o más de las regiones variables o una o más CDRs de uno de los anticuerpos seleccionados de P1NT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, P1NT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, P1NT-12A3, PINT-12A4 y P1NT-12A5. En otra modalidad, los anticuerpos modificados se preparan usando una o más de las regiones variables o una o más CDRs cuya secuencia de aminoácidos se presenta en SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, o cuya secuencia de ácido nucleico se presenta en SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38.

Anticuerpos derivatizados y marcados Un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede derivatizarse o enlazarse a otra molécula (por ejemplo, otro péptido o proteína). En general, los anticuerpos o porción de los mismos se derivatizan de modo que la unión al IGF-IR no sea afectada adversamente por la derivatización o marcación. Por consiguiente, se pretende que los anticuerpos o porciones de anticuerpo de la invención incluyan formas intactas y modificadas de los anticuerpos del IGF-IR humano descritos en la presente. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede enlazarse funcionalmente (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más de otras entidades moleculares, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un cuerpo completo), un agente de detección, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que pueda mediar la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región de núcleo de estreptavidina o una cola de polihistidina). Un tipo de anticuerpo derivatizado se produce entrelazando dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Entrelazadores adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, teniendo dos grupos distintamente reactivos separados por un separador adecuado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida), u homobifuncional (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo). Dichos enlazadores están disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, III. Otro tipo de anticuerpo derivatizado es un anticuerpo marcado.

Agentes de detección útiles con los cuales un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede derivatizarse, incluyen compuestos fluorescentes, que incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimet¡lam¡na-1-naftalensulfonilo, ficoeritrina, fosfores de lantánidos, y similares. Un anticuerpo puede marcarse también con enzimas que sean útiles para detección, tales como peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa, y similares. Cuando un anticuerpo se marca con una enzima detectable, se detecta añadiendo otros reactivos que la enzima usa, y produce un producto de reacción que puede discernirse. Por ejemplo, cuando el agente peroxidasa de rábano picante está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina lleva a un producto de reacción café, el cual es detectable. Un anticuerpo puede marcarse también con biotina, y detectarse a través de medición indirecta de unión a avidina o estreptavidina. Puede marcarse un anticuerpo con un agente magnético, tal como gadolinio. Puede marcarse también un anticuerpo con epítopes de polipéptido predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias del par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, colas de epítope). En algunas modalidades, las marcas son unidas por brazos separadores de varias longitudes que reducen la obstrucción estérica potencial. Un anticuerpo del IGF-IR puede marcarse también con un aminoácido marcado radiactivamente. La marca radiactiva puede usarse para propósitos de diagnóstico o terapéuticos. Por ejemplo, la marca radiactiva puede usarse para detectar tumores que expresen el IGF-IR mediante técnicas de rayos X u otras técnicas de diagnóstico. Además, la marca radiactiva puede usarse terapéuticamente como una toxina para células o tumores cancerosos. Ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no están limitadas a, los siguientes radioisótopos o radionúclidos: 3H, 4C, 15N, 35S i 90?> 99Tc 11 12B, y 131L Un anticuerpo del IGF-IR puede derivatizarse también con un grupo químico tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo o un grupo carbohidrato. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la vida media en suero, o para aumentar la unión a tejidos.

Composiciones y equipos farmacéuticos La invención se refiere también a una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero, la cual comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, dicha composición farmacéutica es para el tratamiento de cáncer, tal como cáncer de cerebro, pulmón, escamocelular, vejiga, gástrico, pancreático, mama, cabeza, cuello, renal, riñon, ovario, próstata, coiorrectal, esofágico, ginecológico o de tiroides. En otra modalidad, dicha composición farmacéutica se relaciona con trastornos hiperproliferativos no cancerosos tales como, sin limitación, restenosis después de angioplastía y psoriasis. En otra modalidad, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas para el tratamiento de un mamífero que requiere activación del IGF-IR, en donde la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de activación de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos de activación pueden usarse para tratar a animales que carecen de suficientes IGF-IR e IGF-II, o pueden usarse para tratar osteoporosis, debilidad o trastornos en los cuales el mamífero secreta muy poca hormona de crecimiento activa, o es incapaz de responder a la hormona de crecimiento. Los anticuerpos del IGF-IR de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y retardadores de absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina regulada en su pH con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol, y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Sustancias farmacéuticamente aceptables tales como agentes mojantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes mojantes o emulsificant.es, conservadores o reguladores de pH, mejoran la vida de almacenamiento o la eficacia del anticuerpo o porción de anticuerpo. Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración deseado y la aplicación terapéutica. Composiciones preferidas típicas están en la forma de soluciones inyectables o infusibles, tales como composiciones similares a las que se usan para inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, subcutánea, ¡ntrapentoneal, intramuscular). En una modalidad preferida, el anticuerpo se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea.

Típicamente, las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármaco. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles, incorporando el anticuerpo del IGF-IR en la cantidad requerida en un solvente adecuado, con uno o una combinación de ios ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos, son secado al vacío y deshidratación por congelación que dé un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada previamente estéril del mismo. La fluidez adecuada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión, y mediante el uso de agentes tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede llevarse a cabo incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse mediante un variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la vía/modo de administración preferido, es intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, o por infusión. Como lo apreciarán los expertos en la técnica, la vía y/o el modo de administración variarán, dependiendo de los resultados deseados. En una modalidad, los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse como una dosis individual, o pueden administrarse como dosis múltiples. En ciertas modalidades, el compuesto activo puede prepararse con un vehículo que proteja al compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables biocompatibles, tales como acetato etilenvinílico, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágena, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados, o son conocidos generalmente por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. En ciertas modalidades, el IGF-IR de la invención puede administrarse oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) puede incluirse también en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, puede comprimirse en tabletas, o puede incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse con excipientes, y pueden usarse en la forma de tabletas digeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención mediante otra vía diferente a la administración parenteral, puede ser necesario recubrir o co-ad ministrar el compuesto con un material que prevenga su inactivación. Pueden incorporarse también compuestos activos complementarios en las composiciones. En ciertas modalidades, un anticuerpo del IGF-IR de la invención es co-formulado y/o co-administrado con uno o más de otros agentes terapéuticos, tales como un agente quimioterapéutico, un agente antineoplásico o un agente antitumoral. Por ejemplo, puede co-formularse y/o co-administrarse un anticuerpo del IGF-IR con uno o más de otros agentes terapéuticos. Estos agentes incluyen, sin limitación, anticuerpos que unen otros agentes (por ejemplo, anticuerpos que unen uno o más factores de crecimiento o citocinas, sus receptores de la superficie de la célula o el IGF-I y el IGF-II), proteínas de unión al IGF-I y al IGF-II, agentes antineoplásicos, agentes quimioterapéuticos, agentes antitumorales, oligonucleótidos antisentido contra el IGF-IR o el IGF-I y el IGF-II, análogos peptídicos que bloqueen la activación del IGF-IR, IGF-IR soluble, y/o uno o más agentes químicos que inhiban la producción o actividad del IGF-I y el IGF-II, los cuales se conocen en la técnica, por ejemplo, octeótrido. Para una composición farmacéutica que comprenda un anticuerpo de activación, el anticuerpo del IGF-IR puede formularse con un factor que aumente la proliferación celular o prevenga la apoptosis. Dichos factores incluyen factores de crecimiento tales como el IGF-I y el ÍGF-II, y/o análogos del IGF-I y el IGF-II que activen el IGF-IR. Dichas terapias de combinación pueden requerir dosificaciones menores del anticuerpo del IGF-IR, así como los agentes co-administrados, evitando de esta manera toxicidades posibles o complicaciones asociadas con las varias monoterapias. En una modalidad, la composición comprende el anticuerpo y uno o más agentes terapéuticos adicionales. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y durante periodos necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o porción de anticuerpo puede variar de acuerdo a factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual cualquier efecto perjudicial tóxico del anticuerpo o porción de anticuerpo es excedido por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y durante períodos necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, puesto que una dosis profiláctica se usa en sujetos antes de una etapa temprana de enfermedad o durante la misma, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. Pueden ajustarse los regímenes de dosificación para proveer la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, puede administrarse un bolo individual, pueden administrarse con el tiempo varias dosis divididas, o la dosis puede reducirse o incrementarse proporcionalmente, según sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o que comprende una terapia de combinación que comprende el anticuerpo y uno o más agentes terapéuticos adicionales, puede formularse para dosis individuales o múltiples. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma unitaria de dosificación, como se usa en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se van a tratar, cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención es determinada por, y depende directamente de, (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se va a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la combinación de dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos. Una formulación particularmente útil es 5 mg/ml de anticuerpo del IGF-IR en un regulador de pH de citrato de sodio a 20 mM, pH 5.5, NaCI a 140 mM y 0.2 mg/ml de polisorbato 80. Un ejemplo de escala no limitativa para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención, es 0.1-100 mg/kg, más preferiblemente 0.5-50 mg/kg, muy preferiblemente 1-20 mg/kg, y aún más preferiblemente 1-10 mg/kg. Se notará que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la severidad de la condición que se va a aliviar. Se entenderá además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo de acuerdo a la necesidad del individuo y el juicio profesional de la persona que administre o que supervise la administración de las composiciones, y que las escalas de dosificación expuestas en la presente son sólo un ejemplo, y no se pretende que limiten el alcance o la práctica de la composición reclamada. En una modalidad, la cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, se administra junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Otro aspecto de la presente invención provee equipos que comprenden los anticuerpos del IGF-IR y las composiciones farmacéuticas que comprenden estos anticuerpos. Un equipo puede incluir, además del anticuerpo o composición farmacéutica, agentes de diagnóstico o terapéuticos. Un equipo puede incluir también instrucciones de uso en un método de diagnóstico o terapéutico. En una modalidad preferida, el equipo incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y un agente de diagnóstico que puede usarse en un método descrito más adelante. En otra modalidad preferida, el equipo incluye al anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y uno o más agentes terapéuticos, tales como un agente antineoplásico, agente antitumoral o agente quimioterapéutico adicional, el cual puede usarse en un método descrito más adelante. Esta invención se refiere también a composiciones farmacéuticas para la inhibición del crecimiento celular anormal en un mamífero, que comprenden una cantidad de un compuesto de la invención en combinación con una cantidad de un agente quimioterapéutico, en donde las cantidades del compuesto, sal, solvato o profármaco, y del agente quimioterapéutico, son efectivas para inhibir el crecimiento celular anormal. Muchos agentes quimioterapéuticos se conocen actualmente en la técnica. En una modalidad, los agentes quimioterapéuticos se seleccionan del grupo que consiste de inhibidores mítóticos, agentes alquilantes, antimetabolitos, antibióticos de intercalación, inhibidores del factor de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, agentes antisupervivencia, modificadores de respuesta biológica, antihormonas, por ejemplo, antiand régenos y agentes antiangiogénesis. Agentes antiangiogénicos, tales como inhibidores de MMP-2 (metaloproteinasa de matriz 2), inhibidores de MMP-9 (metaloproteinasa de matriz 9) e inhibidores de COX-II (ciclooxigenasa II), pueden usarse en conjunto con un compuesto de la invención. Ejemplos de inhibidores de COX- II útiles, incluyen CELEBREX (celecoxib), B EXTRA (valdecoxib) y rofecoxib. Ejemplos de inhibidores de metaloproteinasa de matriz útiles se describen en el documento WO 96/33172 (publicado en octubre 24 de 1996), WO 96/27583 (publicado en marzo 7 de 1996), solicitud de patente europea No. 97304971.1 (presentada en julio 8 de 1997), solicitud de patente europea No. 99308617.2 (presentada en octubre 29 de 1999), WO 98/07697 (publicado en febrero 26 de 1998), WO 98/03516 (publicado en enero 29 de 1998), WO 98/34918 (publicado en agosto 13 de 1998), WO 98/34915 (publicado en agosto 13 de 1998), WO 98/33768 (publicado en agosto 6 de 1998), WO 98/30566 (publicado en julio 6 de 1998), publicación de patente europea 606,046 (publicada en julio 13 de 1994), publicación de patente europea 931 ,788 (publicada en julio 28 de 1999), WO 90/05719 (publicado en mayo 31 de 1990), WO 99/52910 (publicado en octubre 21 de 1999), WO 99/52889 (publicado en octubre 21 de 1999), WO 99/29667 (publicado en junio 17 de 1999), solicitud internacional del PCT No. PCT/IB98/01113 (presentada en julio 21 de 1998), solicitud de patente europea No. 99302232.1 (presentada en marzo 25 de 1999), solicitud de patente de Gran Bretaña número 9912961.1 (presentada en junio 3 de 1999), solicitud provisional de los Estados Unidos No. 60/148,464 (presentada en agosto 12 de 1999), patente de los Estados Unidos 5,863,949 (expedida en enero 26 de 1999), patente de los Estados Unidos 5,861 ,510 (expedida en enero 19 de 1999) y publicación de patente europea 780,386 (publicada en junio 25 de 1997), los cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia.

Inhibidores de MMP preferidos, son aquellos que no demuestran artralgia. Más preferidos son aquellos que inhiben selectivamente a MMP-2 y/o MMP-9 respecto a las otras metaloproteinasas de matriz (es decir, MMP-1 , MMP-3, MMP-4, MMP-5, MMP-6, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-11, MMP-12 y MMP- 3). Algunos ejemplos específicos de inhibidores de MMP útiles en la presente invención, son AG-3340, RO 32-3555, RS 13-0830, y los compuestos reclamados en la siguiente lista: ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenox¡)-bencensulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-ciclopentil)amino]-propiónico; hidroxiamida de ácido 3-exo-3-[4-(4-fluoro-fenox¡)-bencensulfonilamino]-8-oxa biciclo[3.2.1]octan-3-carboxílico; hidroxiamida de ácido (2R.3R) 1 -[4-(2-cloro-4-fluoro-benciloxi)bencensulfonil]-3-hidroxi-3-metil-piperidin-2-carboxílico; hidroxiamida de ácido 4-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencensulfonilamino]-tetrahidro piran-4-carboxílico; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)bencensulfonil](1 -hidroxicarbamoil-ciclobutil)-amino]-propiónico; hidroxiamida de ácido 4-[4-(4-cloro-fenoxi)bencensulfonilamino]-tetrahidro-piran-4-carboxílico; hidroxiamida de ácido (R)3-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencensulfonilamino)tetrahidro-piran-3-carboxílico; hidroxiamida de ácido (2R.3R) 1-[4-(4-fluoro-2-metil-bencilox¡)-bencensulfonil]-3-hidroxi-3-metil-piperidin-2-carboxílico; ácido 3-[[4-(4-fluorofenoxi)-bencensulfonil]-(1-hidroxicarbamoil-1-metil-etil)-amino]-propiónico; ácido 3-[[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencensulfonil]-(4-hidroxicarbamoil-tetrahidropiran-4-il)-amino]propiónico; hidroxiamida de ácido 3-exo-3-[4-(4-cloro-fenoxi)-bencensulfonilamino]-8-oxa-iciclo[3.2.1]octan-3-carboxíl¡co; hidroxiamida de ácido 3-endo-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencensulfonilamino]-8- oxaiciclo[3.2.1]octan-3-carboxíl¡co; e hidroxiamida de ácido (R)-3-[4-(4-fluoro-fenoxi)-bencensulfonilamino]-tetrahidro-furan-3-carboxíl¡co; y sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos. Un compuesto de la invención puede usarse también con inhibidores de la transducción de señales, tales como agentes que puedan inhibir respuestas del EGF-R (receptor del factor de crecimiento epidérmico), tales como anticuerpos del EGF-R, anticuerpos del EGF, y moléculas que sean inhibidores del EGF-R; inhibidores del VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), tales como receptores del VEGF y moléculas que puedan inhibir al VEGF; e inhibidores del receptor de erbB2, tales como moléculas orgánicas o anticuerpos que se unen al receptor de erbB2, por ejemplo, HERCEPTIN™ (Genentech, Inc.). Inhibidores del EGF-R se describen, por ejemplo, en el documento WO 95/19970 (publicado en julio 27 de 1995), WO 98/14451 (publicado en abril 9 de 998), WO 98/02434 (publicado en enero 22 de 1998), y en la patente de los Estados Unidos 5,747,498 (expedida en mayo 5 de 1998), y dichas sustancias pueden usarse en la presente invención como se describe en la presente. Agentes inhibidores del EGFR incluyen, pero no están limitados a, los anticuerpos monoclonales C225 y anticuerpo monoclonal 22 anti-EGFR (ImClone Systems Incorporated), ABX-EGF (Abgenix Cell Genesys), EMD-7200 (Merck KgaA), EMD-5590 (Merck KgaA), MDX-447/H-477 (Medarex Inc. y Merck KgaA), y los compuestos ZD 1834, ZD-1838 y ZD-1839 (AstraZeneca), PKI-166 (Novartis), PKI-166/CGP 75166 (Novartis), PTK 787 (Novartis), CP 701 (Cephalon), leflunomida (Pharmacia/Sugen), CI-1033 (Warner Lambert Parke Davis), CI-1033/PD 183,805 (Warner Lambert Parke Davis), CL-387,785 (Wyeth-Ayerst), BBR-1611 (Boehringer Mannheim GmbH/Roche), Naamidine A (Bristol Myers Squibb), RC-3940-II (Pharmacia), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim), OLX-103 (Merck & Co.), VRCTC 310 (Ventech Research), toxina de fusión del EGF (Seragen Inc.), DAB-389 (Seragen/Ligand), ZM-252808 (Imperial Cáncer Research Fund), RG-50864 (INSEAM), LFM-A12 (Parker Hughes Cáncer Center), WHI-P97 (Parker Hughes Cáncer Center), GW-282974 (Glaxo), KT-8391 (Kyowa Hakko), y vacuna del EGF-R (York Medical/Centro de Inmunología Molecular (CIM)). Estos y otros agentes inhibidores del EGF-R pueden usarse en la presente invención. Inhibidores del VEGF, por ejemplo, SU-11248 (Sugen Inc.), SH-268 (Schering) y NX-1838 (NeXstar), pueden combinarse también con el compuesto de la presente invención. Inhibidores del VEGF se describen, por ejemplo, en el documento WO 99/24440 (publicado en mayo 20 de 1999), solicitud internacional del PCT PCT/IB99/00797 (presentada en mayo 3 de 1999), en el documento WO 95/21613 (publicado en agosto 17 de 1995), documento WO 99/61422 (publicado en diciembre 2 de 1999), patente de los Estados Unidos 5,834,504 (expedida en noviembre 10 de 1998), documento WO 98/50356 (publicado en noviembre 12 de 1998), patente de los Estados Unidos 5,883, 13 (expedida en marzo 16 de 1999), patente de los Estados Unidos 5,886,020 (expedida en marzo 23 de 1999), patente de los Estados Unidos 5,792,783 (publicada en agosto 11 de 1998), documento WO 99/10349 (publicado en marzo 4 de 1999), documento WO 97/32856 (publicado en septiembre 12 de 1997), documento WO 97/22596 (publicado en junio 26 de 1997), documento WO 98/54093 (publicado en diciembre 3 de 1998), documento WO 98/02438 (publicado en enero 22 de 1998), documento WO 99/16755 (publicado en abril 8 de 1999) y documento WO 98/02437 (publicado en enero 22 de 1998), todos los cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Otros ejemplos de algunos inhibidores del VEGF específicos útiles en la presente invención, son IM862 (Cytran Inc.); anticuerpo monoclonal anti-VEGF de Genentech, Inc.; y angiozima, una ribozima sintética de Ribozyme y Chiron. Estos y otros inhibidores del VEGF pueden usarse en la presente invención como se describe en la presente. Los inhibidores del receptor de ErbB2, tales como GW-282974 (Glaxo Wellcome, compañía pública limitada), y los anticuerpos monoclonales AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc.) y 2B-I (Chiron), pueden combinarse además con el compuesto de la invención, por ejemplo, los indicados en los documentos WO 98/02434 (publicado en enero 22 de 1998), WO 99/35146 (publicado en julio 15 de 1999), WO 99/35132 (publicado en julio 15 de 1999), WO 98/02437 (publicado en enero 22 de 1998), WO 97/13760 (publicado en abril 17 de 1997) y WO 95/19970 (publicado en julio 27 de 1995), y en la patente de los Estados Unidos 5,587,458 (expedida en diciembre 24 de 1996) y la patente de los Estados Unidos 5,877,305 (expedida en marzo 2 de 1999), todos los cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia.

Inhibidores del receptor de ErbB2 útiles en la presente invención, se describen también en la solicitud provisional de los Estados Unidos No. 60/1 17,341 , presentada en enero 27 de 1999, y en la solicitud provisional de los Estados Unidos No. 60/117,346, presentada en enero 27 de 1999, las cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Los compuestos inhibidores del receptor de erbB2 y sustancias descritas en las solicitudes del PCT mencionadas anteriormente, patentes de E.U.A. y solicitudes provisionales de E.U.A., así como otros compuestos y sustancias que inhiben al receptor de erbB2, pueden usarse con el compuesto de la presente invención de conformidad con la presente invención. Otro componente de la combinación de la presente invención, es un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2. Los términos "inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2" o "inhibidor selectivo de Cox-2", los cuales pueden usarse recíprocamente en la presente, abarcan compuestos que inhiben selectivamente a la ciclooxigenasa-2 sobre la ciclooxigenasa-1 , e incluyen también sales farmacéuticamente aceptables de esos compuestos. En la práctica, la selectividad de un inhibidor de Cox-2 varía, dependiendo de la condición bajo la cual la prueba se lleva a cabo y de los inhibidores que se están poniendo a prueba. Sin embargo, para los propósitos de esta especificación, la selectividad de un inhibidor de Cox-2 puede medirse como una relación del valor de IC50 in vitro o ¡n vivo para la inhibición de Cox-1 , dividida entre el valor de IC50 para la inhibición de Cox-2 (IC5o de Cox-1/lC50 de Cox-2). Un inhibidor selectivo de Cox-2 es cualquier inhibidor para el cual la relación de IC50 de Cox-1 a IC50 de Cox-2, es mayor de 1. En modalidades preferidas, esta relación es mayor de 2, más preferiblemente mayor de 5, aún más preferiblemente mayor de 10, todavía más preferiblemente mayor de 50, y muy preferiblemente aún mayor de 100. Como se usa en la presente, el término "IC50" se refiere a la concentración de un compuesto que se requiere para producir 50% de inhibición de la actividad de ciclooxigenasa. Los inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2 preferidos de la presente invención, tienen una IC50 de ciclooxigenasa-2 menor de aproximadamente 1 µ?, más preferiblemente menor de aproximadamente 0.5 µ?, y aún más preferiblemente menor de aproximadamente 0.2 µ?. Los inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2 preferidos, tienen una IC50 de ciclooxigenasa- 1 mayor de aproximadamente 1 µ?, y más preferiblemente mayor de 20 µ?. Dicha selectividad preferida puede indicar una capacidad para reducir la incidencia de efectos secundarios inducidos por AINES comunes. Incluidos también dentro del alcance de la presente invención, están compuestos que actúan como profármacos de inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2. Como se usa en la presente con relación a inhibidores selectivos de Cox-2, el término "profármaco" se refiere a un compuesto químico que puede ser convertido en un inhibidor selectivo de Cox-2 activo mediante procedimientos metabólicos o químicos simples dentro del cuerpo del sujeto. Un ejemplo de un profármaco para un inhibidor selectivo de Cox-2 es parecoxib, el cual es un profármaco terapéuticamente efectivo del inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 tricíclico veldecoxib. Un ejemplo de un profármaco inhibidor selectivo de Cox-2 preferido, es parecoxib sódico. Una clase de profármacos de inhibidores de Cox-2 se describe en la patente de E.U.A. No. 5,932,598. El inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención puede ser, por ejemplo, el inhibidor selectivo de Cox-2 meloxicam, fórmula B-1 (número de registro de CAS 71125-38-7), o una sal o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo. F.1/p.85 En otra modalidad de la invención, el inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 puede ser el inhibidor selectivo de Cox-2 RS 57067, 6-[[5-(4-clorobenzoil)-1 ,4-dimetil-1 H-pirrol-2-il]metil]-3(2H)-piridazinona, fórmula B-2 (número de registro de CAS 179382-91-3), o una sal o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo. f.2/p.85 En otra modalidad de la invención, el inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 es de la clase estructural de cromeno/cromano que es un benzopirano sustituido o un análogo de benzopirano sustituido, y aún más preferiblemente seleccionado del grupo que consiste de benzotiopiranos, dihidroquinolinas o dihidronaftalenos sustituidos. Benzopiranos que pueden servir como un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen derivados de benzopirano sustituidos que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,271 ,253. Otros inhibidores selectivos de Cox-2 de benzopirano útiles en la práctica de la presente invención, se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 6,034,256 y 6,077,850. En otra modalidad preferida de la invención, el inhibidor de ciclooxigenasa puede seleccionarse de la clase de inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2 tricíclicos representados por la estructura general de fórmula I: F/p.86 en donde: Z1 se selecciona del grupo que consiste de heterociclilo insaturado o parcialmente ¡nsaturado y anillos carbocíclicos insaturados o parcialmente insaturados; R24 se selecciona del grupo que consiste de heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo y arilo, en donde R24 es sustituido opcionalrnente en una posición sustituible con uno o más radicales seleccionados de alquilo, haloalquilo, ciano, carboxilo, alcoxicarbonilo, hidroxilo, hidroxialquilo, haloalcoxi, amino, alquilamino, arilamino, nitro, alcoxialquilo, alquilsulfinilo, halo, alcoxi y alquiltio; R25 se selecciona del grupo que consiste de metilo o amino; y R2S se selecciona del grupo que consiste de un radical seleccionado de H, halo, alquilo, alquenilo, alquinilo, oxo, ciano, carboxilo, cianoalquilo, heterocicliloxi, alquiloxi, alquiltio, alquilcarbonilo, cicloalquilo, arilo, haloalquilo, heterociclilo, cicloalquenilo, aralquilo, heterociclilalquilo, acilo, alquiltioalquilo, hidroxialquilo, alcoxicarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, aralquenilo, alcoxialquilo, ariltioalquilo, ariloxialquilo, aralquiltioalquilo, aralcoxialquilo, alcoxiaralcoxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, aminocarbonilo, aminocarbonilalquilo, alquilaminocarbonilo, N-arilaminocarbonilo, N-alquil-N-arilaminocarbonilo, alquilaminocarbonilalquilo, carboxialquilo, alquilamino, N-arilamino, N-aralquilamino, N-alquil-N-aralquilamino, N-alquil-N-arilamino, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, N-arilaminoalquilo, N-aralquilaminoalquilo, N-alquil-N-aralquilaminoalquilo, N-alquil-N-arilaminoalquilo, ariloxi, aralcoxi, ariltio, aralquiltio, alqutlsulfinilo, alquilsulfonilo, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo, N-arilaminosulfonilo, arilsulfonilo, N-alquil-N-arilaminosulfonilo; o un profármaco de los mismos. En una modalidad preferida de la invención, el inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 representado por la fórmula I anterior, se selecciona del grupo de compuestos, ¡lustrados en el cuadro 3, que incluyen celecoxib (B-3), valdecoxib (B-4), deracoxib (B-5), rofecoxib (B-6), etoricoxib (MK-663; B-7), JTE-522 (B-8), o un profármaco de los mismos. Más información acerca de ejemplos seleccionados de los inhibidores selectivos de Cox-2 discutidos anteriormente, puede encontrarse a continuación: celocoxib (número de registro de CAS 169590-42-5, C-2779, SC-58653, y en la patente de E.U.A. No. 5,466,823); deracoxib (número de registro de CAS 169590-41-4); rofecoxib (número de registro de CAS 1620 1-90-7); compuesto B-24 (patente de E.U.A. No. 5,840,924); compuesto B-26 (WO 00/25779); y etoricoxib (número de registro de CAS 202409-33-4, MK- 663, SC-86218; y en el documento WO 98/03484).

CUADRO 3 En una modalidad más preferida de la invención, el inhibidor selectivo de Cox-2 se selecciona del grupo que consiste de celecoxib, rofecoxib y etoricoxib. En una modalidad preferida de la invención, parecoxib (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,932,598), que tiene la estructura mostrada en B-9, el cual es un profármaco terapéuticamente efectivo del inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 tricíclico valdecoxib, B-4 (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,633,272), puede usarse en forma ventajosa como una fuente de un inhibidor de ciclooxigenasa. F/p.88 Una forma preferida de parecoxib, es parecoxib sódico. En otra modalidad de la invención, el compuesto ABT-963 que tiene la fórmula B-10 que se ha descrito previamente en la publicación internacional número WO 00/24719, es otro inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 tricíclico, el cual puede usarse en forma ventajosa. f.1/p.89 En otra modalidad de la invención, el inhibidor de ciclooxigenasa puede seleccionarse de la clase de inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2 derivados de ácido feniiacético descritos en los documentos WO 99/ 1605 y WO 02/20090, y es un compuesto que es referido como COX-189 (denominado también lumiracoxib), que tiene el número de registro de CAS 220991-20-8. Compuestos que tienen una estructura similar, pueden servir como el inhibidor selectivo de Cox-2 de la presente invención, y se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 6,310,099, 6,291 ,523 y 5,958,978. Más información sobre las aplicaciones del inhibidor selectivo de Cox-2, N-(2-ciclohexiloxinitrofenil)metano sulfonamida (NS-398, número de registro de CAS 123653-1 -2), que tiene una estructura como se muestra en la fórmula B-11 ha sido descrita, por ejemplo, por Yoshimi, N. et al., en Japanese J. Cáncer Res., 90(4): 406-412 (1999); Falgueyret, J. P. et al., en Science Specfra disponible en: http://www.gbhap.com/Science Spectra/20-1-article.htm (06/06/2001 ); e Iwata, K. et al., en Jpn. J. PharmacoL, 75 (2): 191-194 (1997). f.2/p.89 Una evaluación de la actividad inflamatoria del inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2, RWJ 63556, en un modelo de inflamación en caninos, fue descrita por Kirchner ef a/., en J Pharmacol Exp Ther 282, 1094- 101 (1997).

Materiales que pueden servir como el inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen derivados de diarilmetilidenofurano que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,180,651. Materiales particulares que se incluyen en esta familia de compuestos, y que pueden servir como el inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 en la presente invención, incluyen N-(2-ciclohexiloxinitrofenil)metano sulfonamida y (E)-4-[(4-metilfenil)(tetrah¡dro-2-oxo-3-furanilideno)metil]bencensulfonamida. Inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2 que son útiles en la presente invención, incluyen darbufelona (Pfizer), CS-502 (Sankyo), LAS 34475 (Almirall Profesfarma), LAS 34555 (Almirall Profesfarma), S-33516 (Servier) y SD 8381 (Pharmacia, descritos en la patente de E.U.A. No. 6,034,256), BMS-347070 (Bristol Myers Squibb, descritos en la patente de E.U.A. No. 6,180,651 ), MK-996 (Merck), L-783003 (Merck), T-614 (Toyama), D-1367 (Chiroscience), L-748731 (Merck), CT3 (Atlantic Pharmaceutical), CGP-28238 (Novartis), BF-389 (Biofor/Scherer), GR-253035 (Glaxo Wellcome), ácido 6-dioxo-9H-purin-8-il-cinám¡co (Glaxo Wellcome), y S-2474 (Shionogi). Información sobre el compuesto S-33516 mencionado anteriormente, puede encontrarse en Current Drugs Headline, News, en http://www.current-druqs.com/NEWS/lnflam1.htm. 10/04/2001 , en donde se reportó que S-33516 es un derivado de tetrahidroisoindol que tiene valores de ÍC50 de 0.1 y 0.001 mM, contra ciclooxigenasa-1 y ciclooxigenasa-2, respectivamente. En sangre entera humana, se reportó que S-33516 tiene una Compuestos que pueden actuar como inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2, incluyen compuestos de unión múltiple que contienen de 2 a 10 ligandos unidos covalentemente a uno o más enlazadores, como se describe en la patente de E.U.A. No. 6,395,724. Compuestos que pueden actuar como inhibidores de ciclooxigenasa-2 incluyen ácido linoleico conjugado, que se describe en la patente de E.U.A. No. 6,077,868. Materiales que pueden servir como un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen compuestos de oxazol aromáticos heterocíclicos que se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,994,381 y 6,362,209. Inhibidores selectivos de Cox-2 que son útiles en el método y las composiciones de la presente, pueden incluir compuestos que se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 6,080,876 y 6, 33,292. Materiales que pueden servir como inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2, incluyen piridinas que se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 6,369,275, 6,127,545, 6,130,334, 6,204,387, 6,071 ,936, 6,001 ,843 y 6,040,450. Materiales que pueden servir como el inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen derivados de diarilbenzopirano que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,340,694. Materiales que pueden servir como el inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen 1-(4-sulfamilaril)-5-aril-2-pirazolinas 3-sustituidas que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,376,519.

Materiales que pueden servir como el inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen heterociclos que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,153,787. Materiales que pueden servir como el inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen piridinas 2,3,5-trisustituidas que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,046,217. Materiales que pueden servir como el inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen heterociclos bicíclicos de diarilo que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,329,421. Compuestos que pueden actuar como inhibidores de ciclooxigenasa-2, incluyen sales de compuestos de 5-amino o compuestos de amino 1 ,2,3-triazol sustituidos que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,239,137. Materiales que pueden servir como un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen derivados de pirazol que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,136,831. Materiales que pueden servir como un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen derivados sustituidos de benzosulfonamidas que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,297,282. Materiales que pueden servir como un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen compuestos de carbonil indol bicíclicos que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,303,628. Materiales que pueden servir como un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen compuestos de bencimidazol que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,310,079. Materiales que pueden servir como un inhibidor selectivo de c¡cloox¡genasa-2 de la presente invención, incluyen compuestos de indol que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,300,363. Materiales que pueden servir como un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen aril fenilhidrazidas que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,077,869. Materiales que pueden servir como un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen 2-ariloxi, 4-aril furan-2-onas que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,140,515. Materiales que pueden servir como un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen compuestos de bisarilo que se describen en la patente de E.U.A. No. 5,994,379. Materiales que pueden servir como un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen ,5-diarilpirazoles que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,028,202. Materiales que pueden servir como un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen imidazoles 2-sustituidos que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,040,320. Materiales que pueden servir como un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen 1,3-y 2,3-diarilcicloalcano y cicloalqueno pirazoies que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,083,969. Materiales que pueden servir como un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen ésteres derivados de indol alcanoles y amidas novedosas derivadas de indolalquilamidas que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,306,890. Materiales que pueden servir como un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen compuestos de piridazinona que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,307,047. Materiales que pueden servir como un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 de la presente invención, incluyen derivados de benzosulfonamida que se describen en la patente de E.U.A. No. 6,004,948. Inhibidores selectivos de Cox-2 que son útiles en el método y las composiciones de la presente invención, pueden incluir los compuestos que se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 6,169,188, 6,020,343 y 5,981,576 ((metilsulfonil)fenil furanonas); patente de E.U.A. No. 6,222,048 (diaril-2-(5H)-furanonas); patente de E.U.A. No. 6,057,319 (3,4-diaril-2-hidroxi-2,5-dihidrofuranos); patente de E.U.A. No. 6,046,236 (sulfonamidas carbocíclicas); patentes de E.U.A. Nos. 6,002,014 y 5,945,539 (derivados de oxazol); y en la patente de E.U.A. No. 6,359,182 (compuestos de C-nitroso). Los inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2 que son útiles en la presente invención pueden proveerse mediante cualquier fuente, en tanto el inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 sea farmacéuticamente aceptable. Inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2 pueden aislarse y purificarse de fuentes naturales, o pueden sintetizarse. Los inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2 deben ser de una calidad y pureza que sea convencional en el comercio para su uso en productos farmacéuticos. Agentes antisupervivencia incluyen anticuerpos del IGF-IR y agentes anti-integrina, tales como anticuerpos anti-integrina.

Métodos de uso en diagnóstico Los anticuerpos del IGF-IR pueden usarse para detectar al IGF-IR en una muestra biológica in vitro o in vivo. Los anticuerpos del IGF-IR pueden usarse en un inmunoensayo convencional que incluye, sin limitación, una ELISA, un RIA, FACS, inmunohistoquímica de tejidos, Western blot o inmunoprecipitación. Los anticuerpos del IGF-IR de la invención pueden usarse para detectar al IGF-IR de humanos. En otra modalidad, los anticuerpos del IGF-IR pueden usarse para detectar al IGF-IR de primates del Viejo Mundo, tales como monos Cynomolgus y rhesus, chimpancés y simios. La invención provee un método para la detección del IGF-IR en una muestra biológica, que comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo del IGF-IR de la invención, y detectar el anticuerpo unido al IGF-IR, para detectar al IGF-IR en la muestra biológica. En una modalidad, el anticuerpo del IGF-IR es marcado directamente con una marca detectable. En otra modalidad, el anticuerpo del IGF-IR (el primer anticuerpo) es no marcado, y un segundo anticuerpo u otra molécula que puede unirse al anticuerpo del IGF-IR, es marcado. Como es bien sabido por los expertos en la técnica, se elige un segundo anticuerpo que sea capaz de unir específicamente la especie y la clase específica del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el anticuerpo del IGF-IR es una IgG humana, entonces el anticuerpo secundario puede ser una IgG anti-humano. Otras moléculas que pueden unirse a muchos anticuerpos incluyen, sin limitación, proteína A y proteína G, las cuales están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Amersham Pharmacia Biotech. Marcas adecuadas para el anticuerpo o anticuerpos de detección secundarios se han descrito anteriormente, e incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, agentes magnéticos y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos adecuados de grupos prostéticos incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; un ejemplo de un agente magnético incluye gadolinio; y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125l, 13 1, 35S o 3H. En una modalidad alternativa, puede ponerse a prueba el IGF-IR en una muestra biológica mediante un ¡nmunoensayo competente que use estándares del IGF-IR marcados con una sustancia detectable, y un anticuerpo del IGF-IR no marcado. En esta prueba, la muestra biológica, los estándares del IGF-IR marcados y el anticuerpo del IGF-IR se combinan, y se determina la cantidad de estándar del IGF-IR marcado unido al anticuerpo no marcado. La cantidad del IGF-IR en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de estándar del IGF-IR marcado unido al anticuerpo del IGF-IR. Pueden usarse los ¡nmunoensayos descritos anteriormente para muchos propósitos. En una modalidad, los anticuerpos del IGF-IR pueden usarse para detectar al IGF-IR presente en células en cultivo de células. En una modalidad preferida, los anticuerpos del IGF-IR pueden usarse para determinar el nivel de fosforilación de tirosina, autofosforilación de tirosina del IGF-IR, y/o la cantidad del IGF-IR sobre la superficie de la célula después del tratamiento de las células con varios compuestos. Este método puede usarse para poner a prueba compuestos que pueden usarse para activar o inhibir el IGF-IR, o resulta en una redistribución del IGF-IR sobre la superficie de la célula o intracelularmente. En este método, una muestra de células se trata con un compuesto de prueba por un período, mientras que otra muestra se deja sin tratar. Si se va a medir la autofosforilación de tirosina, las células son lisadas, y se mide la fosforilación de tirosina del IGF-IR usando un inmunoensayo descrito anteriormente, o como se describe en el ejemplo III, que usa una ELISA. Si se va a medir el nivel total del IGF-IR, las células son lisadas, y se mide el nivel total del IGF-IR usando uno de los inmunoensayos descritos anteriormente. El nivel del IGF-IR de la superficie de la célula puede determinarse usando anticuerpos de la invención, tiñendo células de cultivo de tejidos después de la fijación de las células. Prácticas estándar de los expertos en la técnica, permiten que se use distribución de células activada por fluorescencia (FACS) con un anticuerpo de detección secundario para determinar la cantidad de unión del anticuerpo primario (IGF-IR) a la superficie de la célula. Pueden permeabilizarse también células con detergentes o toxinas que permitan la penetración de anticuerpos normalmente impermeables, para marcar ahora sitios intracelulares en donde se localiza el IGF-IR. Un inmunoensayo preferido para la determinación de la fosforilación de tirosina del IGF-IR, o para medir los niveles totales del IGF-IR, es una ELISA o Western blot. Si sólo se va a medir el nivel del IGF-IR de la superficie de la célula, las células no son lisadas, y los niveles del IGF-IR de la superficie de la célula se miden usando uno de los inmunoensayos descritos anteriormente (por ejemplo, FACS). Un inmunoensayo preferido para la determinación de los niveles del IGF-IR de la superficie de la célula, incluye los pasos de marcar exclusivamente las proteínas de la superficie de la célula con una marca detectable, tal como biotina o 25l, inmunoprecipitar una fracción soluble en detergente de las células que contienen proteínas de membrana integrales con un anticuerpo del IGF-IR, y detectar entonces la fracción total del IGF-IR que contiene la marca detectable. Otro inmunoensayo preferido para determinar la ubicación del IGF-IR, por ejemplo, niveles en la superficie de la célula, es mediante el uso de ¡nmunofluorescencia o inmunohistoquímica. Métodos tales como ELISA, RIA, Western blot, inmunohistoquímica, marcación de proteínas de membrana integrales de la superficie de la célula e inmunoprecipitación, son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, citado anteriormente. Además, los inmunoensayos pueden ampliarse en proporción para selección de alto rendimiento para poner a prueba un gran número de compuestos para activación o inhibición del IGF-IR.

Los anticuerpos del IGF-IR de la invención pueden usarse también para determinar los niveles del IGF-IR en un tejido o en células derivadas del tejido. En una modalidad preferida, el tejido es un tejido enfermo. En una modalidad más preferida, el tejido es un tumor o una biopsia del mismo. En una modalidad preferida del método, se extirpa un tejido o biopsia del mismo de un paciente. El tejido o biopsia se usa entonces en un inmunoensayo para determinar, por ejemplo, niveles del IGF-IR, niveles del IGF-IR de la superficie de la célula, niveles de fosforilación de tirosina del IGF-IR, o ubicación del IGF-IR mediante los métodos discutidos anteriormente. El método puede usarse para determinar si un tumor expresa el IGF-IR a un alto nivel. El método de diagnóstico descrito anteriormente puede usarse para determinar si un tumor expresa altos niveles del IGF-IR, lo cual puede ser indicativo de que el tumor responderá bien al tratamiento con anticuerpos del IGF-IR. El método de diagnóstico puede usarse también para determinar si un tumor es potencialmente canceroso si expresa altos niveles del IGF-IR, o si es benigno si expresa bajos niveles del IGF-IR. Además, el método de diagnóstico puede usarse también para determinar si el tratamiento con anticuerpos del IGF-IR (véase más adelante) está haciendo que un tumor exprese menores niveles del IGF-IR y/o exprese menores niveles de autofosforilación de tirosina, y puede usarse de esta manera para determinar si el tratamiento es exitoso. En general, un método para determinar si un anticuerpo del IGF-IR disminuye la fosforilación de tirosina, comprende los pasos de medir el nivel de fosforilación de tirosina en una célula o tejido de interés, incubar la célula o el tejido con un anticuerpo del IGF-IR o porción de unión a antígeno del mismo, y volver a medir entonces el nivel de fosforilación de tirosina en la célula o el tejido. Puede medirse la fosforilación de tirosina del IGF-IR o de otra proteína. El método de diagnóstico puede usarse también para determinar si una célula o tejido no está expresando niveles bastante altos del IGF-IR o niveles bastante altos del IGF-IR activado, lo cual puede ser el caso para individuos con enanismo, osteoporosis o diabetes. Un diagnóstico de que los niveles del IGF-IR o el IGF-IR activo son demasiado bajos, podría usarse para el tratamiento con anticuerpos del IGF-IR de activación, el IGF-I y el IGF-II u otros agentes terapéuticos para aumentar los niveles o la actividad del IGF-IR. Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse también in vivo para localizar tejidos y órganos que expresan el IGF-IR. En una modalidad preferida, los anticuerpos del IGF-IR pueden usarse para localizar tumores que expresan el IGF-IR. La ventaja de los anticuerpos del IGF-IR de la presente invención, es que no generarán una respuesta inmune tras la administración. El método comprende los pasos de administrar un anticuerpo del IGF-IR o una composición farmacéutica del mismo, a un paciente que necesita de dicha prueba de diagnóstico, y someter al paciente a análisis de formación de imágenes para determinar la ubicación de los tejidos que expresan el IGF-IR. El análisis de la formación de imágenes es bien conocido en la técnica médica e incluye, sin limitación, análisis de rayos X, formación de imágenes de resonancia magnética (MRl) o tomografía computada (CE). En otra modalidad del método, se obtiene una biopsia del paciente para determinar si el tejido de interés expresa el IGF-IR, más que someter al paciente a análisis de formación de imágenes. En una modalidad preferida, los anticuerpos del IGF-IR pueden marcarse con un agente detectable del que puedan formarse imágenes en un paciente. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un agente de contraste, tal como bario, el cual puede usarse para análisis de rayos X, o un agente de contraste magnético, tal como un quelato de gadolinio, el cual puede usarse para MRl o CE. Otros agentes de marcación incluyen, sin limitación, radioisótopos, tales como "Te. En otra modalidad, el anticuerpo del IGF-IR no será marcado, y se formarán imágenes del mismo administrando un segundo anticuerpo u otra molécula que sea detectable y que pueda unir el anticuerpo del IGF-IR.

Métodos de uso terapéuticos En otra modalidad, la invención provee un método para inhibir la actividad del IGF-IR administrando un anticuerpo del IGF-IR a un paciente que necesita del mismo. Cualquiera de los tipos de anticuerpos descritos en la presente, puede usarse terapéuticamente. En una modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR es un anticuerpo humano, quimérico o humanizado. En otra modalidad preferida, el IGF-IR es humano, y el paciente es un paciente humano. En forma alternativa, el paciente puede ser un mamífero que exprese un IGF-IR con el cual el anticuerpo del IGF-IR reacciona en forma cruzada. El anticuerpo puede administrarse a un mamífero no humano que exprese un IGF-IR, con el cual el anticuerpo reacciona en forma cruzada (es decir, un primate, o un mono Cynomolgus o rhesus) para propósitos veterinarios, o como un modelo de enfermedad humana en animales. Dichos modelos en animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de esta invención. Como se usa en la presente, se pretende que el término "un trastorno en el cual la actividad del IGF-IR es perjudicial", incluya enfermedades y otros trastornos en los cuales la presencia de altos niveles del IGF-IR en un sujeto que sufre del trastorno se ha mostrado o se sospecha es responsable de la fisiopatología del trastorno, o un factor que favorece un empeoramiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en el cual los altos niveles de actividad del IGF-IR son perjudiciales, es un trastorno en el cual se espera que la inhibición de la actividad del IGF-IR alivie los síntomas y/o la progresión del trastorno. Dichos trastornos pueden evidenciarse, por ejemplo, mediante un incremento en los niveles del IGF-IR sobre la superficie de la célula o en autofosforilación de tirosina incrementada del IGF-IR en las células o los tejidos afectados de un sujeto que sufre del trastorno. El incremento en los niveles del IGF-IR puede detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo del IGF-IR como se describió anteriormente. En una modalidad preferida, un anticuerpo del IGF-IR puede administrarse a un paciente que tenga un tumor que exprese el IGF-IR. Un tumor puede ser un tumor sólido, o puede ser un tumor no sólido, tal como un linfoma. En una modalidad más preferida, puede administrarse un anticuerpo anti-IGF a un paciente que tenga un tumor que exprese el IGF-IR que sea canceroso. En una modalidad aún más preferida, el anticuerpo del IGF-IR se administra a un paciente que tenga un tumor del pulmón, mama, próstata o colon. En una modalidad altamente preferida, el método hace que el tumor no aumente en peso o volumen, o que disminuya en peso o volumen. En otra modalidad, el método hace que el IGF-IR en el tumor sea incorporado. En una modalidad preferida, el anticuerpo se selecciona de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-1 1A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5, o comprende una cadena pesada, cadena ligera o región de unión a antígeno del mismo. En otra modalidad preferida, el anticuerpo del IGF-IR puede administrarse a un paciente que exprese niveles inadecuadamente altos del IGF-I y el IGF-II. Se sabe en la técnica que la expresión de alto nivel del IGF-I y el IGF-II puede llevar a una variedad de cánceres comunes. En una modalidad más preferida, el anticuerpo del IGF-IR se administra a un paciente con cáncer de próstata, glioma o fibrosarcoma. En una modalidad aún más preferida, el método hace que el cáncer deje de proliferar anormalmente, o no aumente en peso o volumen, o que disminuya en peso o volumen. En una modalidad, dicho método se refiere al tratamiento de cáncer, tal como cáncer de cerebro, escamocelular, vejiga, gástrico, pancreático, de mama, cabeza, cuello, esofágico, próstata, colorrectal, pulmón, renal, riñon, ovario, ginecológico o de tiroides. Los pacientes que pueden tratarse con los compuestos de la invención de conformidad con el método de esta invención incluyen, por ejemplo, pacientes a los que se les ha diagnosticado tienen cáncer de pulmón, cáncer de hueso, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza y cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer ovárico, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, tumores ginecológicos (por ejemplo, sarcomas uterinos, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cerviz, carcinoma de la vagina o carcinoma de la vulva), enfermedad de Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino (por ejemplo, cáncer de la tiroides, paratiroides o glándulas suprarrenales), sarcomas de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, leucemia crónica o aguda, tumores sólidos de la niñez, linfomas linfocíticos, cáncer de la vejiga, tumor de Wilm, mesotelioma, neuroblastoma, sarcoma de Ewing, cáncer del riñon o uréter (por ejemplo, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal), o neoplasmas del sistema nervioso central (por ejemplo, linfoma primario del SNC, tumores del eje espinal, giiomas del tallo cerebral o adenomas de la glándula pituitaria). El anticuerpo puede administrarse una vez, pero más preferiblemente se administra veces múltiples. El anticuerpo puede administrarse de tres veces diariamente a una vez cada seis meses. La administración puede ser sobre un plan tal como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses. El anticuerpo puede administrarse mediante una vía oral, mucosa, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, intratumoral o tópica. El anticuerpo puede administrarse en un sitio distante del sitio del tumor. El anticuerpo puede administrarse también continuamente mediante una minibomba. El anticuerpo puede administrarse una vez, por lo menos dos veces o por lo menos el período hasta que la condición se trate, mejore o cure. El anticuerpo se administrará en general en tanto el tumor esté presente, siempre que el anticuerpo haga que el tumor o cáncer deje de crecer o que disminuya en peso o volumen. El anticuerpo se administrará en general como parte de una composición farmacéutica como se describió anteriormente. La dosificación de anticuerpo estará en general en la escala de 0.1-100 mg/kg, más preferiblemente de 0.5-50 mg/kg, muy preferiblemente de 1-20 mg/kg, y aún más preferiblemente de 1-10 mg/kg. La concentración del anticuerpo en suero puede medirse mediante cualquier método conocido en la técnica. El anticuerpo puede administrarse también profilácticamente para prevenir que un cáncer o tumor ocurra. Esto puede ser especialmente útil en pacientes que tienen un nivel "alto normal" del IGF-I y el IGF-II, debido a que se ha mostrado que estos pacientes tienen un mayor riesgo de desarrollar cánceres comunes. Véase Rosen er a/., citado anteriormente. En otro aspecto, el anticuerpo del IGF-IR puede co-administrarse con otros agentes terapéuticos, tales como fármacos o moléculas antineoplásicas, a un paciente que tiene un trastorno hiperproliferativo, tal como cáncer o un tumor. En un aspecto, la invención se refiere a un método para el tratamiento del trastorno hiperproliferativo en un mamífero, el cual comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención en combinación con un agente antitumoral seleccionado del grupo que consiste de, pero que no está limitado a, inhibidores mitóticos, agentes alquilantes, antimetabolitos, agentes de intercalación, inhibidores del factor de crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas, inhibidores de topoisomerasa, modificadores de respuesta biológica, antihormonas, inhibidores de cinasa, inhibidores de metaloproteinasa de matriz, agentes terapéuticos genéticos y antiandrógenos. En una modalidad más preferida, el anticuerpo puede de administrarse con un agente antineoplásico, tal como adriamicina o taxol. En otra modalidad preferida, el anticuerpo o terapia de combinación se administra junto con radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinámica, cirugía u otra inmunoterapia. En otra modalidad más preferida, el anticuerpo se administrará con otro anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo del IGF-IR puede administrarse con un anticuerpo u otro agente que se sabe inhibe el tumor o la proliferación de células cancerosas, por ejemplo, un anticuerpo o agente que inhiba al receptor de erbB2, EGF-R, CD20 o VEGF. La co-administración del anticuerpo con un agente terapéutico adicional (terapia de combinación) abarca administrar una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo del IGF-IR y el agente terapéutico adicional, y administrar dos o más composiciones farmacéuticas separadas, una que comprenda el anticuerpo del IGF-IR y las otras que comprendan los agentes terapéuticos adicionales. Además, aunque la co-administración o terapia de combinación significa en general que el anticuerpo y los agentes terapéuticos adicionales se administran al mismo tiempo que algún otro, abarca también casos en los cuales el anticuerpo y los agentes terapéuticos adicionales se administran en tiempos diferentes. Por ejemplo, el anticuerpo puede administrarse una vez cada tres días, mientras que el agente terapéutico adicional se administra una vez al día. En forma alternativa, el anticuerpo puede administrarse antes del tratamiento del trastorno con el agente terapéutico adicional, o después del mismo. Asimismo, la administración del anticuerpo del IGF-IR puede llevarse a cabo antes de otra terapia, o después de la misma, tal como radioterapia, quimioterapia, terapia fotodinámica, cirugía u otra inmunoterapia. El anticuerpo y uno o más agentes terapéuticos adicionales (la terapia de combinación) pueden administrarse una vez, dos veces o por lo menos el período hasta que la condición se trate, mejore o cure. De preferencia, la terapia de combinación se administra veces múltiples. La terapia de combinación puede administrarse de tres veces al día a una vez cada seis meses. La administración puede ser sobre un plan tal como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez por mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses, o puede realizarse continuamente mediante una minibomba. La terapia de combinación puede administrarse mediante una vía oral, mucosa, bucal, intranasal, inhalable, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, intratumoral o tópica. La terapia de combinación puede administrarse en un sitio distante del sitio del tumor. La terapia de combinación se administrará en general en tanto el tumor esté presente, siempre que el anticuerpo haga que el tumor o cáncer deje de crecer o que disminuya en peso o volumen. En otra modalidad, el anticuerpo del IGF-IR es marcado con una marca radiactiva, una inmunotoxina o una toxina, o es una proteína de fusión que comprende un péptido tóxico. El anticuerpo del IGF-IR o proteína de fusión del anticuerpo del IGF-IR dirige la marca radiactiva, inmunotoxina, toxina o péptido tóxico hacia la célula cancerosa o tumor que expresa el IGF-IR. En una modalidad preferida, la marca radiactiva, inmunotoxina, toxina o péptido tóxico, es incorporado después de que el anticuerpo del IGF-IR se une al IGF-IR sobre la superficie del tumor o célula cancerosa. En otro aspecto, el anticuerpo del IGF-IR puede usarse terapéuticamente para inducir apoptosis de células específicas en un paciente que necesita del mismo. En muchos casos, las células elegidas como objetivo para apoptosis son células cancerosas o tumorales. De esta manera, en una modalidad preferida, la invención provee un método para inducir apoptosis administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo del IGF-IR a un paciente que necesita del mismo. En una modalidad preferida, el anticuerpo se selecciona de PINT-6A1 , PINT-7A2, P1NT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, P1NT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT-12A5, o comprende una cadena pesada, cadena ligera o región de unión a antígeno del mismo. En otro aspecto, el anticuerpo del IGF-IR puede usarse para tratar estados no cancerosos en los cuales altos niveles del IGF-I y el IGF-ll y/o el IGF-IR se han asociado con la enfermedad o estado no canceroso. En una modalidad, el método comprende el paso de administrar un anticuerpo del IGF-IR a un paciente que tenga un estado patológico no canceroso causado o exacerbado por altos niveles del IGF-I y el IGF-ll y/o niveles o actividad del IGF-IR. En una modalidad preferida, el estado patológico no canceroso es psoriasis, aterosclerosis, restenosis del músculo liso de vasos sanguíneos o proliferación microvascular inadecuada, tal como la que se encuentra como una complicación de diabetes, especialmente del ojo. En una modalidad más preferida, el anticuerpo del IGF-IR disminuye el progreso del estado patológico no canceroso. En una modalidad más preferida, el anticuerpo del IGF-IR detiene o revierte, por lo menos en parte, el estado patológico no canceroso. Los anticuerpos de la presente invención serían también útiles en el tratamiento o prevención de enfermedades oftálmicas, por ejemplo, glaucoma, retinitis, retinopatías (por ejemplo, retinopatía diabética), uveítis, fotofobia ocular, degeneración macular (por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad, degeneración macular de tipo húmedo y degeneración macular de tipo seco), y de inflamación y dolor asociados con lesión aguda al tejido ocular. Los compuestos serían además útiles en el tratamiento o prevención de inflamación y dolor oftálmico post-quirúrgicos. En otro aspecto, la invención provee un método para administrar un anticuerpo del IGF-IR de activación a un paciente que necesita del mismo. En una modalidad, el anticuerpo de activación o composición farmacéutica se administra a un paciente que necesita del mismo en una cantidad efectiva para aumentar la actividad del IGF-IR. En una modalidad más preferida, el anticuerpo de activación es capaz de restaurar la actividad normal del IGF-IR. En otra modalidad preferida, el anticuerpo de activación puede administrarse a un paciente que tenga estatura pequeña, neuropatía, una disminución en la masa muscular u osteoporosis. En otra modalidad preferida, el anticuerpo de activación puede administrarse con uno o más de otros factores que aumenten la proliferación celular, prevengan la apoptosis o aumenten la actividad del IGF-IR. Dichos factores incluyen factores del crecimiento tales como el IGF-I y el IGF-II, y/o análogos del IGF-I y el IGF-II que activan al IGF-IR.

Terapia qénica Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden administrarse a un paciente que necesita de las mismas mediante terapia génica. La terapia puede ser in vivo o ex vivo. En una modalidad preferida, se administran moléculas de ácido nucleico que codifican para una cadena pesada y una cadena ligera a un paciente. En una modalidad más preferida, las moléculas de ácido nucleico se administran de modo que sean integradas establemente en el cromosoma de células B, debido a que estas células están especializadas en la producción de anticuerpos. En una modalidad preferida, células B precursoras son transfectadas o infectadas ex vivo, y retrasplantadas en un paciente que necesita de las mismas. En otra modalidad, células B precursoras u otras células son infectadas in vivo usando un virus que se sabe infecta al tipo de célula de interés. Vectores típicos usados para terapia génica incluyen liposomas, plásmidos o vectores virales, tales como retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados. Después de infección in vivo o ex vivo, los niveles de expresión del anticuerpo pueden monitorearse tomando una muestra del paciente tratado, y usando cualquier inmunoensayo conocido en la técnica y discutido de la presente. En una modalidad preferida, el método de terapia génica comprende los pasos de administrar una cantidad efectiva de una molécula de ácido nucleico aislada que codifique para la cadena pesada o la porción de unión a antígeno de la misma del anticuerpo humano o porción del mismo, y que exprese la molécula de ácido nucleico. En otra modalidad, el método de terapia génica comprende los pasos de administrar una cantidad efectiva de una molécula de ácido nucleico aislada que codifique para la cadena ligera o la porción de unión a antígeno de la misma del anticuerpo humano o porción del mismo, y que exprese la molécula de ácido nucleico. En un método más preferido, ei método de terapia génica comprende los pasos de administrar una cantidad efectiva de una molécula de ácido nucleico aislada que codifique para la cadena pesada o la porción de unión a antígeno de la misma del anticuerpo humano o porción del mismo, y una cantidad efectiva de una molécula de ácido nucleico aislada que codifique para la cadena ligera o la porción de unión a antígeno de la misma del anticuerpo humano o porción del mismo, y que exprese las moléculas de ácido nucleico. El método de terapia génica puede comprender también el paso de administrar otro agente anticanceroso, tal como taxol, tamoxifeno, 5-FU, adriamicina o CP-358,774. Para que esta invención pueda entenderse mejor, se dan los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se dan sólo para propósitos de ilustración, y de ninguna manera deberá considerarse que limitan el alcance de la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Selección de ScFvs de unión al IGF-IR Se usó una colección de fagémidos de scFv, que es una versión expandida de la colección de 1.38x1010 descrita por Vaughan et al. {Nature Biotech. (1996) 14: 309-314), para seleccionar anticuerpos específicos para el IGF-IR humano. Se usaron tres metodologías de selección: selección por toma panorámica, selección de materiales solubles y selección sobre la superficie de una línea de células transfectadas. Para el método de toma panorámica, se recubrió proteína de fusión del dominio extracelular (ECD) del IGF-IR soluble (a 10 µ?/??? en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS)) o proteína de fusión control (a 10 g/ml en PBS) sobre las cavidades de una placa de microtítulo durante la noche a 4°C. Además, se acopló covalentemente el ECD del IGF-IR soluble (a 5 µg!m\ en PBS) a las cavidades de una placa de microtítulo durante la noche a 4°C. En ambos casos, las cavidades se lavaron en PBS y fueron bloqueadas durante 1 hora a 37°C en MPBS (leche en polvo a 3% en PBS). Los fagos purificados (1012 unidades de transducción (tu)) fueron bloqueados durante 1 hora en un volumen final de 100 µ? de MPBS a 3%. Para las selecciones de la proteína de fusión del ECD del IGF-IR, se añadieron fagos bloqueados a las cavidades de proteínas de fusión control bloqueadas, y se incubaron durante 1 hora. Los fagos bloqueados y deseleccionados se transfirieron entonces a las cavidades bloqueadas que fueron recubiertas con la proteína de fusión del ECD del IGF-IR, e incubadas durante una hora más. Para las selecciones con el ECD del IGF-IR acoplado covalentemente, se añadieron fagos bloqueados directamente a las cavidades bloqueadas que contenían al ECD del IGF-IR acoplado, y se incubaron durante 1 hora. En ambos casos, las cavidades se lavaron cinco veces con PBST (PBS que contenía Tween 20 a 0.1 % en v/v) y entonces 5 veces con PBS. Las partículas de fago unidas fueron eluidas y se usaron para infectar 10 mi de TG1 de E. coli que crecía exponencialmente. Las células infectadas se desarrollaron en caldo 2TY durante 1 hora a 37°C, se extendieron entonces sobre placas de 2TYAG, y se incubaron durante la noche a 30°C. Se rasparon las colonias de las placas en 10 mi de caldo 2TY, y se añadió solución de glicerol a 15% para almacenamiento a -70°C. Cultivos de surtido de glicerol de la primera ronda de selección por toma panorámica, fueron superinfectados con fago auxiliar, y rescatados para dar partículas de fago que expresan anticuerpos scFv para la segunda ronda de toma panorámica. De esta forma, se llevó a cabo un total de tres rondas de toma panorámica para el aislamiento de partículas de fago que expresan anticuerpo específicas para el IGF-IR humano. Para el método de selección doble, se usó proteína de fusión del ECD del IGF-IR humano biotinilado a una concentración final de 50 nM con colección de fagémidos de scFv, como se describió anteriormente. Los fagos de scFv purificados (1012 tu) en 1 mi de MPBS a 3%, fueron bloqueados durante 30 minutos, y entonces se añadió el antígeno biotinilado y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadieron fagos/antígenos a 50 µ? de perlas magnéticas de estreptavidina Dynal M280 que habían sido bloqueadas durante 1 hora a 37°C en 1 mi de MPBS a 3%, y se incubaron durante otros 15 minutos a temperatura ambiente. Se capturaron las perlas usando una rejilla magnética, y se lavaron 5x en 1 mi de MPBS a 3%/Tween 20 a 0.1 % (v/v), seguido de 2 lavados en PBS. Después del último lavado con PBS, las perlas se resuspendieron en 100 µ? de PBS, y se usaron para infectar 5 mi de células TG1 de E. coli que crecían exponencialmente. Las células infectadas se incubaron durante 1 hora a 37°C (30 minutos en reposo, agitación durante 30 minutos a 250 rpm), y se extendieron entonces sobre placas de 2TYAG y se incubaron durante la noche a 30°C. Se rasparon las colonias producidas de las placas, y se rescató al fago como se describió anteriormente. Se llevaron a cabo otras dos rondas de selección de materiales solubles como se describió anteriormente. Para las selecciones de la superficie de la célula, se sembraron células NIH3T3 transfectadas con el IGF-IR humano, y células NIH3T3 control no transfectadas a 4x105 células por cavidad, y se dejó que alcanzaran la confluencia. Los fagos purificados (1012 unidades de transducción (tu)) fueron bloqueados durante 1 hora en un volumen final de 500 µ? de leche en polvo a 4% en medio de cultivo (DMEM/FCS). Los fagos bloqueados se añadieron a células control bloqueadas no transfectadas, y se incubaron durante 1 hora. Los fagos bloqueados y deseleccionados se transfirieron entonces a células NIH3T3 bloqueadas transfectadas con el IGF-IR humano, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las cavidades se lavaron dos veces con PBST (PBS que contenía Tween 20 a 0.1 % en v/v), y entonces 2 veces con PBS. Las partículas de fagos unidas fueron eluidas y se usaron para infectar 10 mi de TG1 de E. cotí que crecía exponencialmente. Las células infectadas se desarrollaron en caldo 2TY durante 1 hora a 30°C, se extendieron entonces sobre placas de 2TYAG, y se incubaron durante la noche a 30°C. Se rasparon las colonias de las placas en 10 mi de caldo 2TY, y se añadió solución de glicerol a 15% para almacenamiento a -70°C.

EJEMPLO 2 Expresión y purificación de anticuerpos del IGF-IR Se convirtieron clones en el formato de IgG como se describe más adelante. El reformateo incluye la subclonación del dominio VH del scFv en un vector que contiene los dominios constantes de cadena pesada humana, y elementos reguladores para expresión adecuada en células de mamífero. Asimismo, el dominio VL es subclonado en un vector de expresión que contiene al dominio constante de cadena ligera humana (clase lambda o kappa) junto con los elementos reguladores adecuados. Se amplificó la secuencia de ácido nucleico que codifica para el dominio adecuado del clon de scFv, seguido de digestión con enzimas de restricción, y ligación en el vector de expresión adecuado. La cadena pesada (dominio constante de igG1 ) fue clonada en pEU1 , la cadena ligera (clase lambda) fue clonada en pEU4, y la cadena ligera (clase kappa), fue clonada en pEU3 (Persic, L. et al., Gene 187: 9-18 (1997)).

Mutaqénesis dirigida a sitio Antes del reformateo, se observó que varios scFvs (incluyendo PGIA-03-A1 1 ) contenían un sitio de restricción BstEII interno dentro del dominio VH que interfería con la clonación del dominio VH en el vector de cadena pesada de IgGl El sitio de restricción interno se removió mediante mutagénesis dirigida a sitio Quikchange™ (Invitrogen), usando el método descrito en el equipo. Se diseñaron oligonucieótidos para remover el sitio de restricción, pero manteniendo la misma secuencia de aminoácidos. Se llevó a cabo secuenciación para garantizar que el sitio fuese mutado correctamente. Los iniciadores de mutagénesis se muestran en el cuadro 4.

CUADRO 4 Nombre del Función del Secuencia de nucleótidos (5'-3') oligonucleótido oiigonucleótido Cambio rápido del codón de GTCCTTCCAAGGCCAGGTCACGATCTC 7A2 MF detención 7A2VH SEQ ID NO: 40 a iniciador delantero Q Cambio rápido del GAGATCGTGACCTGGCCTTGGAAGGAC codón de 7A2 MR detención 7A2VH SEQ ID NO: 41 a iniciador inverso Q CCAAGCTGACCGTCCTAGGTGAG Cambio rápido del 7A4 MF iniciador delantero SEQ ID NO: 42 7A4VL S/A Cambio rápido del CTCACCTAGGACGGTCAGCTTGG 7A4 MR iniciador inverso SEQ ID NO: 43 7A4VL S/A CGTCCTTCCAAGGCCAAGTCACCATCTCAG Remueve el sitio 8A1-MF TCG BstEII de 8A1 VH, SEQ ID NO: 44 iniciador delantero CGACTGAGATGGTGACTTGGCCTTGGAAG Remueve el sitio 8A1-MR GACG BstEII de 8A1 VH, SEQ ID NO: 45 iniciador inverso PCR para clonación de VH VL Una vez que se verificaron todas las secuencias para la ausencia de sitios de restricción, la secuencia de ácido nucleico que codifica para los dominios VH y VL se amplificó en reacciones de PCR separadas. Se establecieron 100 µ? de reacciones de PCR para cada dominio VH y VL usando 50 µ? de 2x mezcla maestra de PCR, 5 pl de iniciador delantero (a 10 µ?), 5 µ? de iniciador inverso (a 10 µ?) y 40 µ? de agua. Se distribuyeron los iniciadores de acuerdo a la secuencia de scFv, y se muestran en el cuadro 5.

CUADRO 5 Iniciador Iniciador Iniciador Iniciador Clon de scFv delantero de delantero de inverso de VH inverso de VL VH VL 7A2 7A2VHF 7A2VHR AF32 AF23 7A4 7A4VHF 7A4VHR 7A4VLF 7A4VLR 7A5 7A5VHF 7A5VHR AF32 AF23 7AG 7AGVHF 7A6VHR AF32 AF23 8A1 8A1VHF 8A1VHR 8A1VLF 8A1VLR 9A1 9A1VHF 9A1VHR 9A1VLF 9A1VLR 9A2 9A2VHF 9A2VHR 9A2VLF 9A2VLR 11A1 11A1VHF 11A1VHR 11A1VLF 11A1VLR 11A2 11A2VHF 11A2VHR 11A2VLF 1AIVLR 11A3 11A3VHF 1 1A3VHR 11A3VLF 1 A3VLR 11A4 11A4VHF 1 1A4VHR 11A4VLF 1 1A4VLR 11A5 11A5VHF 1 1A5VHR 11A5VLF 1A5VLR 11A7 1 1A7VHF 11A7VHR 11A7VLF A7VLR 11A11 11A11VHF 11A11VHR 1 A11VLF 11A11VLR 11A12 11A12VHF 11A12VHR 11A12VLF 1A11VLR 12A1 12A1VHF 12A1VHR 12A1VLF 2A1VLR 12A2 12A2VHF 12A2VHR 12A2VLF 12A2VLR Se escogió una colonia bacteriana individual que contuviera el ácido nucleico adecuado que codificara para el scFv en pCANTAB6 (véase documento WO 94/13804, figuras 19 y 20) en cada reacción de PCR, y la muestra se amplificó usando los siguientes parámetros: 94°C durante 5 minutos, 94°C durante 1 minuto, 30 ciclos de 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto, y 72°C durante 5 minutos.

Digestión Se depuraron los productos de PCR usando un equipo de purificación de 8 cavidades QIAquick™ (número de catálogo 28144, Qiagen, Valencia CA), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se digirió con BssHIl y BstEII una alícuota de 25 µ? de los productos de PCR de VH amplificados. Se digirió con ApaLI y Pací una alícuota de 25 µ? de los productos de PCR de VL amplificados. Se depuraron los productos de PCR de VH y VL digeridos, usando un equipo de purificación QIAquick.

Ligación y transformación Una alícuota del producto de PCR depurado digerido, fue ligada en el vector adecuado digerido con las mismas enzimas de restricción. Los dominios de VH fueron ligados en pMON27816 (pEU1), y los dominios VL fueron ligados en p ON27820 (pEU3) o pMON278 9 (pEU4), dependiendo de la clase de cadena ligera (Persic et al., Gene 187: 9-18, 1997). Una porción de cada una de las reacciones de ligación fue transformada en DH5a de E. coli químicamente competente y preparada previamente mediante choque térmico, y desarrollada durante la noche sobre placas de agar 2xTY que contenían ampicilina.

Selección Se seleccionaron colonias individuales resistentes a ampicilina en medio 2TY líquido (que contenía ampicilina) en una placa de 96 cavidades, y se desarrollaron durante la noche. Una vez cultivadas, las colonias se seleccionaron mediante PCR para determinar si los vectores contenían los dominios adecuados. Se seleccionaron plásmidos que contenían VH usando los iniciadores PECSEQ1 y p95, y se seleccionaron plásmidos que contenían VL usando los iniciadores PECSEQ1 y p156. Se analizaron colonias que contenían inserciones mediante secuenciación de ADN, usando los mismos iniciadores que se usaron para la PCR de selección. El cuadro 6 muestra los oligonucleótidos iniciadores usados para amplificar los dominios VH y VL.

CUADRO 6 Nombre del Función de! Secuencia del oligonucleótido (5'-3') oligonucleótido oligonucleótido CTCTCCACAGGCGTGCACTCCTCGTCG AF32 Iniciador de PCR de AGCTGACTCAGGA SEQ ID NO: 46 VL delantero para 7Ax CTATTCCTTAATTAAGTTAGATCTATTCTGACTCAC AF23 CTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTC SEQ ID NO: 47 Iniciador de PCR de VL inverso para 7Ax CTCTCCACAGGCGCGCACTCCGGGGTCAGCTGGT Iniciador de PCR de 7A2-VH-F GCAGTC SEQ ID NO: 48 VH delantero TGAGGAGACGGTGACCATTGTCCCCTG SEQ Iniciador de PCR de 7A2-VH-R ID NO: 49 VH inverso CTTTCTCTCCACAGGCGTGCACTCCTCTGAGCTGA Iniciador de PCR de 7A4 VL-F CTCAGGACCCTGCT SEQ ID NO: 50 VL delantero CTATTCCTTAATTAAGTTAGATCTATTCTGACTCAC CTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCC SEQ Iniciador de PCR de 7A4 VL-R ID NO: 51 VL inverso CTCTCCACAGGCGCGCACTCCGGGGTGCTAGCTG Iniciador de PCR de 7A5-VH-F GTGGAGTC SEQ ID NO: 52 VH delantero TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCCCCG Iniciador de PCR de 7A5-VH-R SEQ ID NO: 53 VH inverso CTCTCCACAGGCGCGCACTCCGAAGCAGCAGTC Iniciador de PCR de 7A6-VH-F SEQ ID NO: 54 VH delantero TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCCCTG SEQ Iniciador de PCR de 7A6-VH-R ID NO: 55 VH inverso GATCGATCGCGCGCACTCCGAGGTGCGCTGGTGC Iniciador de PCR de 8A1-VH F AGTCTG SEQ ID NO: 56 VH delantero GATCGATCGGTGACCATGGTTCCTTGCCCC Iniciador de PCR de 8A1-VH R SEQ ID NO: 57 VH inverso 8A1-VL F GATCGATCGTGCACTCCTCTGAGCTGCTCAGGACC Iniciador de PCR de CTG SEQ ID NO: 58 VL delantero GATCGATCTTAATTAAGTTAGATCTATTCTGACTCA Iniciador de PCR de 8A1-VL R CCTAGGACGGTCAGCTTGTCCCTCCGCC VL inverso SEQ ID NO: 59 GGATCTTGGCGCGCACTCCGAGGTGCGCTGGTGG Iniciador de PCR de 9A1-VH F AGTCTGG SEQ ID NO: 60 VH delantero GATCGATCGGTGACCATTGTCCCTCGGCCCCAGAT Iniciador de PCR de 9A1-VH-R ATC SEQ ID NO: 61 VH inverso GATCGATCGTGCACTCCCAGTCTGTGCTGACTCAG Iniciador de PCR de 9A1-VL-F CCACC SEQ ID NO: 62 VL delantero GATCGATCTTAATTAAGTTAGATCTATTCTGACTCA Iniciador de PCR de 9A1-VL-R CCTAGGACGGTCAGCTTGTCCCTCC SEQ VL inverso ID NO: 63 GATCGATCGCGCGCACTCCCAGGTCCAGCTGGTG Iniciador de PCR de 9A2-VH F CAGTCT SEQ ID NO: 64 VH delantero CUADRO 6 (CONTINUACION GATCGATCGGTGACCCAGGGTTCCTCGGCCCCAG Iniciador de PCR de A2-VH R TAG SEQ ID NO: 65 VH inverso GA I CÜA I CÜ'I CAC I CCGCAC I I AAI I I l'AI GG I G Iniciador de PCR de A2-VL F ACT SEQ ID NO: 66 VL delantero GATCGATCTTAATTAAGTTAGATCTATTCTGACTCA Iniciador de PCR de A2-VL R CCTAGGACGGTGACCTTGTCC SEQ ID NO: 67 VL inverso GATCGATCGCGCGCACTCCGAGGTGCAGCTGGTG Iniciador de PCR de A1-VH F GAGTCT SEQ ID NO: 68 VH delantero GATCGATCGGTGACCAGGGTGCCTTTCCCCAGAC Iniciador de PCR de A1-VH R AG SEQ ID NO: 69 VH inverso GATCGATCGTGCACTCCGCACTTTCCTATGTGCTG Iniciador de PCR de 1A1-VL F ACTC SEQ ID NO: 70 VL delantero GATCGATCTTAATTAAAAGTTAGATCTATTCTGACT Iniciador de PCR de 1A1-VL R CACCTAGGACGGTGACCTTGGTCCCTC SEQ VL inverso ID NO: 71 GATCGATCGCGCGCACTCCGAGGTGCAGCTGTTG Iniciador de PCR de 1A2-VH F GAGTCTG SEQ ID NO: 72 VH delantero GATCGATCGGTGACCATTGTCCCCTGGCCCCAGA Iniciador de PCR de A2-VH R CATC SEQ ID NO: 73 VH inverso GATCGATCGTGCACTCCGCACTTTCTTCTGAGCTG Iniciador de PCR de 1A2-VL F ACTC SEQ ID NO: 74 VL delantero GATCGATCTTAATTAAGTTAGATCTATTCTGACTCA Iniciador de PCR de 1A2-VL R CCTAGGACGGTGACCTTGGTCCCAC VL inverso SEQ ID NO: 75 GATCGATCGCGCGCACTCCGAGGTGCAGCTGGTG Iniciador de PCR de 1A3-VH F CAGTCGGGGGC SEQ ID NO: 76 VH delantero GATCGATCGGTGACCAGGGTGCCTCGGCCCCAGG Iniciador de PCR de 1A3-VH R SEQ ID NO: 77 VH inverso GATCGATCGTGCACTCCGCACTTTCTTCTGAGCTG Iniciador de PCR de 1A3-VL F ACTCAGG SEQ ID NO: 78 VL delantero GATCGATCTTAATTAAGTTAGATCTATT Iniciador de PCR de 1A3-VL CTGACTCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCC VL inverso GCCGAACACC SEQ ID NO: 79 GATCGATCGCGCGCACTCCGAGGTGCAGCTGTTG Iniciador de PCR de 1A4-VH F GAGTCTG SEQ ID NO: 80 VH delantero GATCGATCGGTGACCATTGTCCCTTGCCCCAGGG Iniciador de PCR de 1A4-VH R G SEQ ID NO: 81 VH inverso GATCGATCGTGCACTCCGCACTTTCCATGAGCTGA Iniciador de PCR de 1A4-VL F CTC SEQ ID NO: 82 VL delantero GATCGATCTTAATTAAGTTAGATCTATTCTGACTCA Iniciador de PCR de 1A4-VL R CCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCGCCGCC SEQ VL inverso ID NO: 83 GATCGATCGCGCGCACTCCCAGGTCCAGCTGGTG Iniciador de PCR de 1A5-VH F CAGTC SEQ ID NO: 84 VH delantero GATCGATCGGTGACCAGGGTTCCTTTGCCCCAGG Iniciador de PCR de 1A5-VH-R AGTC SEQ ID NO: 85 VH inverso GATCGATCGTGCACTCCGCACTTTCTTCTGAGCTG Iniciador de PCR de 1A5-VL-F ACTC SEQ ID NO: 86 VL delantero CUADRO 6 (CONTINUACION) GATCGATCTTAATTAAGTTAGATCTATTGTGACTCA Iniciador de PCR de 11A5-VL-R CCTAGGACGGTGACCTTGGTCCCTCCGCCGAACA VL inverso CC SEQ ID NO: 87 GATCGATCGCGCGCACTCCGAGGTCCAGCTGGTG Iniciador de PCR de 11A7-VH F CAGTCTG SEQ ID NO: 88 VH delantero GATCGATCGGTGACCATTGTCCCTCTGCCCCAGGA Iniciador de PCR de 1A7-VH R GTC SEQ ID NO: 89 VH inverso GATCGATCGTGCACTCCGCACTTTCTTCTGSGCTG Iniciador de PCR de 11A7-VL F ACTCAG SEQ ID NO: 90 VL delantero GATCGATCTTAATTAAGTTAGATCTATTCTGACTCA Iniciador de PCR de 11A7-VL R CCTAGGACGGTGACCTTGGT CCCTCCGCCG VL inverso SEQ ID NO: 91 GATCGATCGCGCGCACTCCAGGTGCACTGGTGGA Iniciador de PCR de 1A11-VH F GTCTGG SEQ ID NO: 92 VH delantero GATCGATCGGTGACCAGGGTGCCCTGCCCCAGGA Iniciador de PCR de 1A11-VH R GTC SEQ ID NO: 93 VH inverso GATCGATCGTGCACTCCGCACTTAATTTATGCTGA Iniciador de PCR de 1A11-VL F CTC SEQ ID NO: 94 VL delantero GATCGATCTTAATTAAGTTAGATCTATCTGACTCAC Iniciador de PCR de 1A11-VL R CTAGGACGGTGACCTTGTCCCAGTTCCGA SEQ VL inverso ID NO: 95 GATCGATCGCGCGCACTCCGAGGTGCGCTGTTGG Iniciador de PCR de 1A12-VH F AGTCTG SEQ ID NO: 96 VH delantero GATCGATCGGTGACCATTGTCCCCCGCCCCAATAA Iniciador de PCR de 1A12-VH-R TCAAG SEQ ID NO: 97 VH inverso GATCGATCGTGCACTCCGCACAGGCTTGCTGACTC Iniciador de PCR de 1A12-VL F AGC SEQ ID NO: 98 VL delantero GATCGATCTTAATTAAGTTAGATCTATCTGACTCAC Iniciador de PCR de 1A12-VL R CTAGGACGGTGACCTTGTCCCOCCGCCGAACACG VL inverso SEQ ID NO: 99 GATCGATCGCGCGCACTCCGAGGTCCGCTGGTAC Iniciador de PCR de 12A1-VH-F AGTCTG SEQ ID NO: 100 VH delantero GATCGATCGGTGACCAGGGTTCCTTTCCCCAGG Iniciador de PCR de 12A1-VH-R SEQ ID NO: 101 VH inverso GATCGATCGTGCACTCCGCACTTTCTCTGAGCTGA Iniciador de PCR de 12A1-VH-F CTCAGGAC SEQ ID NO: 102 VL delantero GATCGATCTTAATTAAGTTAGATCTATCTGACTCAC Iniciador de PCR de 12A1-VL-R CTAGGACGGTCAGCTTGTCCCTCC SEQ ID NO: VL inverso 103 GATCGATCGCGCGCACTCCGAGGTCCGCTGGTGC Iniciador de PCR de 12A2-VH-F AGTCTG SEQ ID NO: 104 VH delantero GATCGATCGGTGACCAGGGTGCCCTCCCCAGG Iniciador de PCR de 12A2-VH-R SEQ ID NO: 105 VH inverso GATCGATCGTGCACTCCGCACTTTCTCTG5GCTG5 Iniciador de PCR de 12A2-VL-F CTCAG SEQ ID NO: 106 VL delantero GATCGATCTTAATTAAGTTAGATCTATCTGACTCAC Iniciador de PCR de 12A2-VL-R CTAGGACGGTCAGCTTGTCCCTCC VL inverso SEQ ID NO: 107 Después de que los scFvs fueron convertidos a IgGs o Fabs, los anticuerpos resultantes fueron referidos, por ejemplo, como IgG de PINT-7A2 y Fab de PINT-7A2.

Expresión de anticuerpos monoclonales del IGF-IR La expresión del cassette del gen de la cadena pesada funcional fue dirigida por el promotor de GV, y terminada por la señal de poliadenilación del SV40. El promotor de GV es un promotor sintético formado de cinco repeticiones de la secuencia de activación hacia el extremo 5' de Gal4 de levadura, más un promotor de C V mínimo (véase Carey, . et al., Nature 345 (1990), 361-364). El vector contenía también el cassette de expresión dhfr de pSV2dhfr. Células de ovario de hámster chino (CHO/GV) transformadas para expresar un transactivador quimérico (GV) derivado de la fusión del dominio de unión a ADN de Gal4 de levadura y el dominio de transactivación VP16 (véase Carey, M. ef al., Nature 345 (1990), 361-364), fueron transfectadas simultáneamente con vectores de expresión de cadena ligera y de cadena pesada usando Lipofectamine 2000 (Gibco), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las células se desarrollaron a 37°C, C02 a 5% en I DM (Invitrogen) + FBS a 10% (Invitrogen) + 1x complemento de HT (Invitrogen) durante 48 horas después de la transfección, y entonces las células se pusieron bajo selección removiendo hipoxantina y timidina de los medios (IMDM + FBS a 10% dializado (invitrogen)). Después de 10 días, el grupo de células fue clonado en placas de 96 cavidades, y después de 14 días en cultivo, las placas de 96 cavidades fueron seleccionadas y se expandieron los clones de expresión más alta. La expresión se hizo en botellas giratorias, poniendo un matraz T75 confluente en una botella giratoria de 1700 cm2 que contenía 400 mi de IMDM + FBS a 10% dializado.

Purificación de anticuerpos monoclonales del IGF-IR La purificación de inmunoglobulinas del IGF-IR se logró mediante cromatografía de afinidad usando 1 mi de columnas de proteína A recombinante de flujo rápido Amersham. Las columnas fueron equilibradas con 20 mi de PBS (Gibco), pH 7.4 (#12388-013) a 1 mi por minuto. Los medios acondicionados que contenían IgG anti-IGF-IR fueron filtrados con filtros de 0.2 mieras, y aplicados entonces a la columna equilibrada a 0.5 mi por minuto. La proteína no unida se lavó de la columna con 60 mi de PBS a 1 mi por minuto. La IgG fue eluida con 20 mi de glicina a 0.1 M más NaCI a 0.15 M, pH 2.8, a 1 mi por minuto. El eluato se recogió en 2 mi de Tris-HCI a 1 M, pH 8.3, con agitación. Se usaron unidades de filtración Amicon Centriprep YM-30 para concentrar los eluatos (22 mi) hasta aproximadamente 1.5 mi. Los concentrados se dializaron en cassettes Slide-A-lyzer 10K WCO de Pierce, contra 2X1 L de PBS. Después de la diálisis, la IgG se hizo pasar a través de un filtro de 0.2 mieras, se distribuyó en alícuotas, y se almacenó congelada a -80°C. La IgG se caracterizó mediante SDS-PAGE reductora y no reductora y cromatografía de exclusión por tamaño, y se cuantificó mediante absorbancia a 280 nm usando un coeficiente de extinción calculado de .45 unidades de DO equivalentes a 1 mg/ml. Se caracterizó adicionalmente un subgrupo mediante secuenciación de aminoácidos N-terminales y análisis de composición de aminoácidos.

EJEMPLO 3 Determinación de las constantes de afinidad (Kd) de anticuerpos monoclonales del IGF-I mediante resonancia de plasmones de superficie (BIAcore) Los presentes inventores midieron la cinética de unión de los anticuerpos al IGF-IR usando resonancia de plasmones de superficie o tecnología BIAcore. Los anticuerpos fueron capturados indirectamente sobre el chip de un sensor de calidad investigación BIAcore CM5, mediante dos métodos. El regulador de pH de fase móvil fue solución salina regulada en su pH con Hepes (NaCI a 150 mM, Hepes a 10 mM, EDTA a 3.4 mM, agente tensioactivo P-20 a 0.05%, pH 7.4) para todos los experimentos, y la captura se llevó a cabo a una velocidad de flujo de 5 µ????????. En el primer método de captura, el chip del sensor fue activado con una mezcla 1 :1 de N-etil-N-(dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) a 400 nM y N-hidroxisuccinimida (NHS) a 100 mM durante siete minutos. Después de la activación, se inyectó proteína A, a 50 µg/mL en acetato a 10 mM (pH 4.8) por hasta siete minutos, y los grupos que no reaccionaron se extinguieron con etanolamina a 1 M durante siete minutos. Para este método, se capturó anticuerpo fresco sobre proteína A unida covalentemente antes de cada determinación. En un método de captura alternativo, se aplicó al chip IgG anti-humano de ratón como se describió anteriormente para la proteína A. Cada inyección experimental se llevó a cabo a una velocidad de flujo de 40 µ????????. Se diluyó el dominio extracelular del IGF-IR a 1-10 pg/ml en siete tubos de muestra, a concentraciones entre 50 p y 50 nM en fase móvil. Cada inyección tuvo un minuto de duración, seguida de cinco minutos de regulador de pH de fase móvil para la medición de la fase de disociación. Después de la inyección y disociación, el chip fue regenerado con 1 a 2 minutos de cloruro de magnesio a 2.25 a 4.5 M en agua. El cuadro 7 muestra resultados corregidos restando el control de la célula de flujo blanco de cada inyección, calculando entonces simultáneamente la cinética para las siete concentraciones usando el software BlAevaluation. Se usó un ajuste de Langmuir con modelo de ajuste de la curva de transferencia de masa, de acuerdo a la naturaleza de la interacción del ligando del anticuerpo siendo puesto a prueba.

CUADRO 7 ND = no determinado.

EJEMPLO 4 Bloqueo de la unión del IGF-I/IGF-II al IGF-IR mediada por anticuerpos Se llevaron a cabo experimentos para determinar la capacidad de los anticuerpos de la invención para inhibir la unión del IGF-l o el IGF-II al IGF-IR en placas de cultivo de tejidos de 48 cavidades (Corning, #3548). Se sembraron fibroblastos NIH-3T3 que expresan el IGF-IR humano, o fibroblastos NIH-3T3 no transfectados a 6 x 104 células por cavidad en 0.5 mi de D EM (Gibco, #11960-044) complementado con suero de bovino fetal a 10% inactivado con calor (Gibco, #16140-071 ), L-glutamina a 2 m (Gibco, #25030-081 ) y 50 U/ml de penicilina-estreptomicina (Gibco, #15070-063). Las células NIH-3T3 se usaron como control para unión no específica a las células. Las placas se incubaron a 37°C/C02 a 5% durante 24 horas, para permitir que las células se unieran y llegaran a ser 80-90% confluentes. Se reemplazó entonces el medio de recubrimiento con 0.5 mi por cavidad de medio de inanición que consistía de DMEM, Hepes a 20 mM (Gibco, #15630-080), L-glutamlna a 2 mM y albúmina de suero de bovino a 0.1% (Equitech-Bio, libre de proteasa, Kerrville, TX), y las placas se incubaron a 37°C, CO2 a 5% durante la noche. Todos los pasos de unión subsecuentes se llevaron a cabo a 4°C. Los anticuerpos de prueba se diluyeron en medio de inanición enfriado en hielo hasta la concentración final deseada, y se añadieron 100 µ? por cavidad. Todas las muestras se llevaron a cabo por triplicado. Después de 30 minutos, se inició la unión del radioligando del IGF-l (Perkin-Elmer, #NEX241) o IGF-II (Amersham, #I 238) mediante de la adición de radioligando a 200 pM en 100 µ? por cavidad, y se llevó a cabo la unión por otras 2.5 horas. Las monocapas de células se lavaron tres veces con PBS enfriada en hielo (Gibco, #14040- 17), y las células y la radiactividad asociada fueron liberadas añadiendo 0.5 mi de dodeciisulfato de sodio a 2%/NaOH a 0.2N a cada cavidad, y calentando las placas a 60°C durante 15 minutos. La radiactividad asociada con el lisado se cuantificó mediante espectrometría de escintilación gamma. En forma alternativa, el mismo experimento descrito se llevó a cabo con preincubación con los anticuerpos de prueba a 37°C durante 10 minutos, seguido de 10 minutos de incubación a 37°C después de la adición de 400 pM del radioligando yodado. La figura 2 muestra gráficas representativas del experimento de unión competitiva con los anticuerpos del IGF-IR 7A6, 9A2 y 12A1 inhibiendo la unión del IGF-I marcado con [ 25l], y los anticuerpos del IGF-IR 7A4, 8A1 y 9A2 inhibiendo la unión del IGF-2 marcado con [125] a 4°C en fibroblastos NIH 3T3 que expresan el IGF-IR humano. El cuadro 8 muestra los valores de IC50 obtenidos para los anticuerpos del IGF-IR. Se usaron como controles anticuerpos 24-57 del IGF-IR disponibles comercialmente (#MS-643-PABX, NeoMarkers, Fremont CA y oclR3 (#GR11SP2, Oncogene Research Products, San Diego, CA). Se usó MOPC-21 (#M-7894, Sigma) como control de ¡sotipos de lgG1 , y se usó UPC-10 (#F-0528) como control de isotipos de lgG2a.

CUADRO 8 EJEMPLO 5 Bloqueo de la unión de la insulina al receptor de insulina mediada por anticuerpos Se llevaron a cabo experimentos para poner a prueba la capacidad de los anticuerpos monoclonales de la invención para inhibir la unión de la insulina al receptor de insulina, en una prueba basada en células de placas de cultivo de fondo plano de 48 cavidades (Corning, #3548) tratadas. Se sembraron células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con IGF-IR humano o células CHO precursoras (no transfectadas) a 6 x 104 células por cavidad en 500 µ? de IMDM (Gibco, #12440-053) complementado con suero de bovino fetal a 10% inactivado con calor (Gibco, #16140-071), L-glutamina a 2 mM (Gibco, #25030-081), hipoxantina de sodio a 100 µ + timidina a 1.6 µ ; complemento de HT (Gibco, #11067-030). Las células 3T3 precursoras se usaron como control para radiactividad de fondo. Entonces, se incubaron las placas a 37°C, C02 a 5% durante 24 horas, para permitir que las células se unieran y llegaran a ser 80-90% confluentes. El medio se decantó de las placas, se reemplazó con 500 µ? por cavidad de medio de inanición o de prueba que consistía de IMDM, Hepes a 20 mM (Gibco, #15630-080), L-glutamina a 2 mM y albúmina de suero de bovino a 0.1% (Equitech-Bio, libre de proteasa, Kerryville, TX), y las placas se incubaron a 37°C, CO2 a 5% durante la noche. Los anticuerpos se diluyeron en medio de prueba frío a la concentración final deseada, y se añadieron 100 µ? por cavidad. Todas las muestras se llevaron a cabo por duplicado. Las placas se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Se diluyó receptor de insulina de porcino-[125l] (Perkin Elmer, #NEX104) hasta una concentración de 100 pM en medio de prueba frío, y se añadieron 100 µ? por cavidad. Las placas se incubaron durante 2.5 horas a 4°C, se aspiró entonces el medio y se lavó 3X con DPBS fría (Gibco, #14040-117). Las células fueron lisadas añadiendo 500 µ? de NaOH a 0.2, SDS a 2%, e incubando las placas durante 15 minutos a 60°C. Las muestras se transfirieron a tubos de 12 x 75 (Sarsted, #55.476, 5 mi), y la señal se leyó en un contador gamma. La figura 3 muestra que los anticuerpos del IGF-IR 8A1, 9A2 y A4 no inhiben la unión de la insulina a las células CHO que expresan el receptor de insulina humana. Todos los anticuerpos de la invención se pusieron a prueba, y todos tuvieron valores de IC50 mayores de 200 mM. Se usó anticuerpo monoclonal de ratón 47-9 del receptor de insulina (# S-633-PABX, NeoMarkers, Fremont, CA) como control positivo en el experimento.

EJEMPLO 6 Inhibición de la activación del receptor de insulina por anticuerpos del IGF-IR Aunque ninguno de los anticuerpos de la invención bloquea significativamente la unión de la insulina a las células de ovario de hámster chino (CHO) que sobreexpresan el receptor de insulina humana de longitud completa, los presentes inventores quisieron asegurarse de que los anticuerpos de la invención no previnieran la activación y fosforilación de la tirosina del receptor de insulina inducidas por la insulina. Para este fin, se sembraron células CHO que expresan el receptor de insulina humana en grupos de 6 cavidades en medio completo de IMDM (Gibco, #12440-053) complementado con suero de bovino fetal a 10% inactivado con calor (Gibco, #16140-071), L-glutamina a 2 mM (Gibco, #25030-081), hipoxantina de sodio a 100 µ? + timidina a 1.6 µ?; complemento de HT (Gibco, #1 067-030), y las cavidades casi 80% confluentes fueron expuestas a privación durante la noche a 37°C/C02 a 5% con los medios anteriores conteniendo BSA a 0.5% contra suero de bovino fetal. Las placas se pusieron en un baño de agua circulante a 37°C, y se añadieron 2 mi de medio de inanición fresco sin insulina, o insulina humana (Sigma, concentración final de 1 nM) junto con 100 nM de anticuerpos de prueba. Después de 15 minutos a 37°C, las placas se enfriaron sobre agua de hielo y se lavaron tres veces con PBS enfriada en hielo. Las células fueron lisadas, y se cosecharon por raspadura en 0.3 mi de regulador de pH de lisis (Nonidet P-40 a 1%, Tris-HCl a 25 mM, pH 7.5, glicerol a 10%, NaCI a 0.15 M, EDTA a 5 mM, coctel de inhibidores de fosfatasa (Sigma P-2850, P-5726) y coctel de inhibidores de proteasa (Sigma P-8340). Los lisados fueron clarificados mediante centrifugación a 10,000 xg durante 20 minutos, y entonces se separaron alícuotas equivalentes de la fracción del sobrenadante mediante SDS-PAGE (geles Nu-PAGE a 4-12%, Bis-Tris, regulador de pH de MOPS, Invitrogen) bajo condiciones reductoras, y se transfirieron a nitrocelulosa (BA-83, Schleicher y Schuell). Las membranas se sondearon con anticuerpo para cadena beta del receptor de insulina (sc-71 1 , Santa Cruz Biotechnology), dominio de fosfotirosina cinasa del receptor de insulina (#44-802, Biosource) o actina (Sigma A-2066), para carga de proteínas totales. Como se muestra en la figura 4, bajo condiciones de carga de proteínas equivalentes para actina y fosforilación total del receptor de insulina del dominio de cinasa de la insulina, se observó el receptor tras la adición de insulina a las células, y sólo el anticuerpo de bloqueo del receptor de insulina de control positivo ( S-633-PABX, Lab Vision) inhibió significativamente la fosforilación de tirosina del receptor de insulina a 1000 veces más el exceso molar para la insulina. Por consiguiente, los anticuerpos de la invención ni inhiben la unión de la insulina, ni la fosforilación de la tirosina cinasa del receptor mediada por la insulina en el receptor intacto de insulina humana in vitro.

EJEMPLO 7 Unión saturable y específica de anticuerpos monoclonales del 1GF-IR- fibroblastos 3T3 hu-lGF-lR Se llevaron a cabo en una forma saturable y específica, experimentos para poner a prueba la capacidad de los anticuerpos monoclonales de la invención para unirse directamente a células NIH-3T3 de ratón transfectadas con el receptor del IGF-I humano: anticuerpos monoclonales 1 A4 y 8A1 e IgG humana, como control negativo, yodados con [125] internamente con lodogen para actividades específicas de 19.2 µ?'?µ?} de proteína, 17.5 µ??^ de proteína y 16.1 µ???µ^ de proteína, respectivamente. Se usaron células N1H-3T3 transfectantes del receptor del IGF-I humano que crecían exponencialmente. Para determinar la unión total, se mezclaron varias concentraciones de anticuerpos monoclonales yodados con [125l] o IgG control con 104 células NIH-3T3 transfectantes del receptor del IGF-I que habían sido disociadas de matraces de cultivo de tejidos (Costar, número de catálogo 3151 ) con solución no enzimática de disociación de células (Gibco, número de catálogo 13151-014), en 50 µ? de solución salina balanceada de Hanks enfriada en hielo (Glbco, número de catálogo 14170-112) que contenía BSA a 0.2% (Sigma, número de catálogo A-7888) y Hepes a 20 mM (Gibco, número de catálogo 15630-106) en tubos de microcentrífuga sin adhesivo (VWR, número de catálogo 20170-650) por triplicado. Las mezclas se incubaron en hielo durante 70 minutos. Después de la incubación, los tubos se centrifugaron a 1000 rpm durante 1 minuto, y las fracciones del sobrenadante se removieron mediante aspiración. Las pellas de células se lavaron con 50 µ? de solución salina balanceada de Hanks enfriada en hielo que contenía BSA a 0.2% y Hepes a 20 mM, y se centrifugaron a 1000 rpm durante 1 minuto, y las fracciones del sobrenadante se removieron mediante aspiración. Las pellas de células resultantes se contaron en un contador gamma Cobra Quantum de Perkin Elmer. La unión no específica se determinó en forma idéntica a la determinación de unión total salvo que, además de las concentraciones correspondientes de anticuerpos monoclonales yodados con [ I] o IgG control, 200 veces más el exceso de anticuerpos monoclonales fríos o IgG control se mezclaron con 104 células de las células NIH-3T3 transfectantes del receptor del IGF-I humano. La unión específica se obtuvo restando los conteos de la unión no específica, de los conteos de unión totales en pares correspondientes. La figura 5 es una gráfica representativa que muestra la unión saturable y específica de los anticuerpos monoclonales 11A4 y 8A1 a las células NIH-3T3 transfectantes del receptor del IGF-I humano en contraste a la IgG control. Los valores de Kd para el control de isotipos de 1A4, 8A1 e IgG fueron 2.238, 4.008 y 186.2, respectivamente.

EJEMPLO 8 Inhibición de la proliferación celular dependiente de IGF-l Para evaluar si o no la adición de versiones de IgG de anticuerpos monoclonales del IGF-IR podrían bloquear la síntesis de ADN de fibroblastos 3T3-hu-IGFR-IR, se sembraron células NIH-3T3 transfectadas con IGF-IR a una densidad de células de 2x 04/cavidad en una placa de fondo en U de 96 cavidades en 100 µ? de medio de inanición, medio de DMEM de alto contenido de glucosa (Gibco, #11960-051) complementado con L-glutamina a 2 mM (Gibco, #25030-081), ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetansulfón¡co a 20 mM (Gibco, #15630-080; Hepes) y albúmina de suero de bovino a 0.1% libre de proteasa (Equitech-Bio, libre de proteasa, Kerrville, TX). Las placas se incubaron a 37°C/C02 a 5% durante la noche, para permitir que las células se unieran. Se removieron 50 µ? del medio de inanición de las placas usando canales múltiples, y se reemplazó con 50 pl de medio de inanición precalentado fresco/cavidad. Los anticuerpos del IGF-IR y el factor de crecimiento de insulina humana recombinante -1 (rHu IGF-I, Equitech-Bio, #HIG-1 100, lote #HIG90-139), fueron diluidos hasta cuatro veces la concentración final deseada en medio de inanición, y se añadieron 25 µ? de cada uno por cavidad. Todas las muestras se llevaron a cabo por duplicado. Las placas se incubaron a 37°C durante 48 horas. Durante las últimas 16 horas de estímulo, se añadieron 10 µ? de solución de marcación de BrdU diluida (Roche, # de catálogo 1647229, Cell Proliferation Elisa, BrdU, colorimétrica) a las cavidades (concentración final de 10 µ?). El medio se decantó invirtiendo las placas y por transferencia suave sobre una toalla de papel. Las placas se secaron entonces a 60°C durante 1 hora. Se añadió entonces solución Fix Denat (Roche, # de catálogo 1647229) a 200 pl por cavidad, y se incubaron durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente. Las placas se decantaron entonces de nuevo sobre la toalla de papel, y se añadieron 200 µ? de PBS de Dulbecco (Gibco, #14040-117) que contenía BSA a 2% (Equitech-Bio) a cada cavidad para bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se decantó la PBS, y se añadieron 100 pl de anti-BrdU-POD (anticuerpo monoclonal, clon BMG 6H8, fragmento Fab conjugado con peroxidasa) por cavidad, y se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente. La decantación y el golpeo ligero de la placa sobre una toalla de papel, removió el conjugado del anticuerpo. Las placas se enjuagaron 3X con 275 µ?/cavidad de solución de lavado (Roche, # de catálogo 1647229). Se añadieron a las cavidades 100 µ?/cavidad de solución de substrato de TMB (tetrametil-bencidina, Roche, número de catálogo 1647229), y se incubó a temperatura ambiente durante 5 a 30 minutos. Se añadieron 25 µ? de H2S04 a 1M (VWR, #VW3232-1 ), y se incubaron durante aproximadamente 1 minuto con mezcla completa para detener el desarrollo adicional de la placa. La densidad óptica se midió en un lector de placa de ELISA (Bio-Rad, modelo # 3550) a 450 nm contra una longitud de onda de referencia de 595 nm. Las figuras 6a-6b son una gráfica representativa que presenta visualmente la capacidad de los anticuerpos del IGF-IR 8A1 , 9A2 y 11A4 para inhibir la proliferación de fibroblastos NIH 3T3 dirigidos por el ÍGF-I que expresan el IGF-IR humano. El cuadro 9 indica la capacidad de los anticuerpos del IGF-IR de la invención para inhibir la proliferación de estas células dependiente del IGF-I bajo las condiciones de prueba.

CUADRO 9 EJEMPLO 9 Inhibición de la fosforilación de tirosina inducida por el IGF-I mediada por anticuerpos, o intensificación de la fosforilación de tirosina del IGF- IR mediada por anticuerpos Se llevaron a cabo experimentos de ELISA para determinar si los anticuerpos de la invención eran capaces de bloquear la fosforilación de tirosina/activación del IGF-IR mediada por el IGF-I, o si los anticuerpos del IGF-IR de la invención podrían intensificar la fosforilación/activación del IGF-IR en ausencia de IGF-I. La activación del IGF-IR mediada por el ÍGF-I se detectó mediante fosforilación incrementada de tirosina asociada con el receptor.

Preparación de placas de ELISA Se prepararon placas de captura de ELISA de 96 cavidades, recubriendo las cavidades con 200 ng de anticuerpo monoclonal anti-IGF-IR de ratón (NeoMarkers, #MS-641-PABX) en 100 pl de solución salina regulada en su pH con fosfato [PBS] durante la noche a 4°C. Los sitios de unión no ocupados, fueron bloqueados añadiendo 200 µ? de regulador de pH de bloqueo (albúmina de suero de bovino [BSA] a 1 % en solución salina regulada en su pH con Tris [TBS]) durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con regulador de pH de lavado (TBS + Tween 20 a 0.05%), transfiriendo las placas sobre toallas de papel entre los lavados.

Preparación de lisados de células que expresan el IGF-IR Se sembraron células N1H-3T3 que expresan el IGF-IR humano a 3 x 104/cavidad en 100 pl de medio libre de suero (DMEM de alto contenido de glucosa complementado con L-glutamina a 2 mM, Hepes a 20 mM y BSA a 0.1 %) en placas de 96 cavidades. Las placas se incubaron a 37°C, C02 a 5% durante la noche, para permitir la unión de las células. El medio se decantó y se reemplazó con 100 µ? de medio libre de suero que contenía la concentración deseada de anticuerpos anti-IGF-IR. Todas las determinaciones se llevaron a cabo por triplicado. Las placas se incubaron a 37°C durante una hora. Se estimularon las células mediante la adición de 20 µ? por cavidad del IGF-I humano a 60 nM (Equitech-Bio; Kerrville, TX) o, en forma alternativa, incubadas sin la adición del IGF-I humano para poner a prueba el agonismo de los anticuerpos en ausencia del IGF-I. Las placas se incubaron a 37°C durante 10 minutos. El medio se decantó invirtiendo las placas y por transferencia suave sobre toallas de papel las células se lavaron tres veces con PBS a 4°C. Las células fueron lisadas añadiendo 150 µ? por cavidad de regulador de pH de lisis (reactivo de extracción de proteínas de mamífero M-PER [Pierce] que contenía EDTA a 5 mM y cocteles de inhibidor de proteasa (Sigma, P-8340) y fosfatasa (Sigma, P-2850 y P-5726). Los Usados se mezclaron mediante pipeteo múltiple antes de transferir 100 pl del lisado de cada cavidad a las placas de captura de ELISA como se describió anteriormente. Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente.

ELISA con anticuerpos anti-fosfotirosina El lisado de células se removió invirtiendo las placas, y las placas se lavaron tres veces con regulador de pH de lavado y se transfirieron sobre toallas de papel. Se añadieron 100 µ? por cavidad de una dilución 1/1000 de anticuerpo anti-fosfotirosina conjugado con peroxidasa de rábano picante (4G10-HRP) a las placas durante una hora a temperatura ambiente.

Las placas se lavaron seis veces con regulador de pH de lavado, y se transfirieron sobre toallas de papel. Los presentes inventores detectaron la unión de 4G10-HRP de las placas añadiendo 100 µ? por cavidad de TMB (Sigma, T-4444), y se permitió que procediera el desarrollo de las placas durante 2 a 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Se detuvo la reacción de desarrollo de color añadiendo 100 µ? de HCI a 1N a cada cavidad. Se determinó la densidad óptica a 450 nm contra 595 nm como una longitud de onda de referencia usando un lector de placa de ELISA (Bio-Rad, Hercules, CA). Los resultados para la versión agonista de la prueba, se muestran en las figuras 8a-8d. Los anticuerpos del IGF-IR de la invención muestran capacidad mínima a ninguna capacidad para fosforilar el receptor en fibroblastos NIH 3T3 que expresan el IGF-IR humano. Los resultados de por lo menos dos experimentos de ELISA independientes con varios anticuerpos de la invención, se muestran en el cuadro 10. Estos experimentos demostraron la capacidad de los anticuerpos anti-IGF-IR de la invención para bloquear la fosforilación de tirosina del IGF-IR mediada por el IGF-I. Las figuras 9a-9d muestran gráficas representativas con los anticuerpos del IGF-IR de la invención 7A2, 7A4, 8A1 , 11A5, 11A11 y 11A12, y la inhibición vista en esta prueba.

CUADRO 10 EJEMPLO 10 Efecto de los anticuerpos monoclonales del IGF-IR sobre la fosforilación de tirosina del IGF-IR Habiendo mostrado la capacidad de los anticuerpos de la invención para bloquear la fosforilación de tirosina del IGF-IR dependiente del ligando, los presentes inventores evaluaron la capacidad de los anticuerpos de la invención para estimular directamente la fosforilación de tirosina del IGF-IR tras la unión al IGF-IR en las células. Para este propósito, se desarrollaron grupos de 12 cavidades de fibroblastos NIH-3T3 que expresaban el IGF-IR humano hasta aproximadamente 80% de confluencia, en placas de cultivo de tejidos de 12 cavidades en DMEM que contenía Hepes a 20 mM y FBS a 10%. Se reemplazó el medio la noche anterior con el medio anterior que contenía BSA a 0.1 % en lugar de suero. Se pusieron las placas en un baño de agua a 37°C, y se estimularon con 10 nM del IGF-I o anticuerpos monoclonales de prueba durante 10 minutos. Entonces, las placas se colocaron sobre agua enfriada en hielo, se lavaron tres veces con PBS enfriada en hielo, y se prepararon lisados de células cosechando por raspadura las células de cada cavidad en 75 µ? de Nonidet P40 a 1 %, Tris-HCI a 25 mM (pH 7.5), NaCI a 0.15 M, EDTA a 5 mM, glicerol a 10% y cocteles de inhibidores de proteasa y fosfatasa. Los lisados fueron clarificados centrifugando la suspensión raspada a 10,000 xg durante 20 minutos a 5°C, y entonces se pusieron a prueba 2 µ? de cada fracción del sobrenadante para proteínas totales, mediante el método de Bradford, usando BSA como estándar. Volúmenes conocidos de los lisados de células clarificados se sometieron entonces a SDS-PAGE sobre geles Nu-PAGE a 4-12% (Novex), y se transfirieron a nitrocelulosa. Se detectó IGF-IR fosforilado, mediante incubación de Western blots con anti-pY-IGF-IR de conejo (Biosource #44-804) y detección con IgG-HRP anti-conejo de cabra (Jackson Immunoresearch) y Supersignal, siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Exposiciones de 20 segundos sobre película BioMax MR-1 , fueron exploradas para intensidad de banda usando un densitómetro láser de Molecular Dynamics, y se analizaron con el software ImageQuant. La intensidad de banda (volumen) se dividió entre las proteínas totales cargadas para cada muestra, para determinar el grado de fosforilación de tirosina del ÍGF-IR contra sin tratamiento o anticuerpos control de isotipos. La figura 7 muestra capacidad mínima a ninguna capacidad de los anticuerpos del IGF-IR para fosforilar el receptor en fibroblastos NIH-3T3 que expresan el IGF-IR humano. Los resultados de este experimento indicaron que la mayoría de los anticuerpos de la invención no mostró capacidad detectable para inducir fosforilación del IGF-IR en comparación con anticuerpos control. Los anticuerpos del IGF-IR que mostraron actividad agonista mensurable contra el IGF-IR (por ejemplo, 11 A1 , 24-57), fueron mucho menos efectivos que el IGF-I para estimular la fosforilación de tirosina del IGF-IR.

EJEMPLO 11 Endocitosis del IGF-IR por el IGF-l o anticuerpos monoclonales Los presentes inventores examinaron la velocidad de acumulación ¡ntracelular del IGF-IR, midiendo indirectamente la acumulación intracelular de los anticuerpos monoclonales de la invención marcados con [125l], en comparación con el IGF-I marcado con [125l]. Enfocaron estos experimentos en un subgrupo de anticuerpos de la invención, en particular 8A1 , 9A2 y 1 A4. Para este propósito, se cultivaron durante la noche grupos de 24 cavidades que contenían 5.0x células de cáncer de próstata humano E5 DU145 que expresaban el IGF-IR humano, en 0.5 mi por cavidad de medio del RPMI-1640 que contenía Hepes a 20 mM y BSA a 0.2%. Se incubaron monocapas en un baño de agua a 37°C durante hasta una hora con 0.3 nM de anticuerpos monoclonales de prueba o IGF-I. Las placas se colocaron sobre agua enfriada en hielo para inhibir la incorporación adicional de anticuerpo o ligando, y las monocapas de células se lavaron cuatro veces durante un período de 20 minutos con PBS enfriada en hielo ajustada a pH a 2.0 con HCI concentrado, o con PBS enfriada en hielo a pH 7.4 como control. El paso de lavado a pH bajo remueve efectivamente más de 95% de los anticuerpos marcados radiactivamente unidos a la superficie de la célula o el IGF-I de las células a 4°C. Después, se recogieron las células y la reactividad asociada a las cavidades, en 0.75 mi por cavidad de dodecilsulfato de sodio a 2% complementado con NaOH a 0.2 N, y se cuantificó la radiactividad del lisado de células mediante espectrometría de escintilación gamma. Se definió la unión del ligando o anticuerpo monoclonal total, como la radiactividad asociada a las células retenida después del lavado de las células con PBS a pH 7.4. Se definió la unión del ligando o anticuerpo monoclonal intracelular, como la radiactividad asociada a las células retenida después del lavado de las células con PBS a pH 2.0. Se definió la unión del ligando o anticuerpo monoclonal asociado a la superficie de la célula, como la diferencia entre la unión total e intracelular. Las figuras 14a-14d muestran la velocidad de acumulación intracelular del IGF-IR midiendo indirectamente la acumulación intracelular de los anticuerpos monoclonales 8A1 , 9A2 y 1A4 marcados con [125l], en comparación con el IGF-I marcado con [125l]. Las isotermas de unión mostradas en las figuras 14a-14d, indican que la endocitosis y la acumulación ¡ntracelular del IGF-I y los anticuerpos monoclonales de prueba siguen la unión del receptor a 37°C, aunque a diferentes velocidades.

EJEMPL0 2 Subregulación del IGF-IR Los presentes inventores pusieron a prueba el efecto de los anticuerpos monoclonales sobre la subregulación por el IGF-IR, de células NIH-3T3 transfectadas con el IGF-IR, 1) midiendo los niveles del receptor de superficie usando citometría de flujo, y 2) midiendo los niveles totales del receptor usando análisis Western blot. El experimento se llevó a cabo con anticuerpos de la invención, en particular 8A1 , 9A2 y 11A4. Se observó subregulación del IGF-IR en estas células. Véase, por ejemplo, las figuras 11 y 12a-12b. Los niveles del IGF-IR fueron reducidos más de 50% tres horas después de la adición de un anticuerpo de la invención. Para la preparación de células para análisis mediante FACS, los presentes inventores sembraron células NIH-3T3 transfectadas con el IGF-IR en 4 mi de medio de crecimiento (DMEM de alto contenido de glucosa complementado con FBS a 10% inactivado con calor, 0.29 mg/ml de L-glutamina, 1000 pg/ml de penicilina y estreptomicina) por cavidad en placas de 6 cavidades. Se incubaron las placas a 37°C, C02 a 5% durante la noche, para permitir que las células se unieran. Una hora antes de la realización de la prueba, se removió el medio de las placas; se añadieron 4 mi de medio libre de suero; se removió el medio libre de suero mediante succión con vacío parcial con pipetas; y se añadieron otros 4 mi de medio libre de suero por cavidad. Para la realización de la prueba, se diluyeron los anticuerpos del 1GF-IR en medio libre de suero hasta una concentración final de 1 pg/ml, y se reemplazó el medio libre de suero en placas con 4 mi de medio con o sin anticuerpos por cavidad en los puntos de tiempo deseados. Se incubaron entonces las placas a 37°C por el tiempo restante.' AI momento de la cosecha de las células, se removió el medio de cultivo, se lavaron las placas una vez con PBS enfriada, sin Ca/Mg, y se reemplazó entonces con 2 mi de tripsina a 0.25%/EDTA (tripsina a 0.25% - EDTA a 1 mM) por cavidad a 37°C durante 3 minutos. Se recogieron entonces las muestras de células tripsinizadas en tubos que contenían 5 mi de medio de crecimiento completo sobre hielo. Los tubos se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos, y las pellas de células se lavaron entonces una vez con regulador de pH de FACS (BSA a 0.1 % y azida de sodio a 0.1 % en PBS libre de calcio y magnesio). Se determinó el número de células. Se sembraron 0.5-2 x 105 células/cavidad en placas de fondo redondo de 96 cavidades. Las placas se centrifugaron, y se decantó de las mismas el regulador de pH de FACS, y se reemplazó con 50 µ? de regulador de pH de FACS que contenía los anticuerpos control de IgG o los anticuerpos anti-IGF-IR a una concentración final de 10 µ p\\ como los anticuerpos primarios. Se incubaron las placas a 4°C durante 30 minutos. Se lavaron entonces las placas dos veces con regulador de pH de FACS. Se lavaron las células decantando el regulador de pH, invirtiendo las placas y transfiriendo las placas suavemente sobre toallas de papel, y reemplazado entonces con nuevo regulador de pH para la suspensión de células, y entonces se recogió la pella de células. Las células se incubaron entonces con anticuerpos anti-humano de asno o anti-ratón de asno conjugados con FITC diluidos en regulador de pH de FACS, hasta una concentración de 10 g/ml durante 30 minutos a 4°C. Las células teñidas se lavaron dos veces con regulador de pH de FACS, se resuspendieron en 200 µ? de regulador de pH de FACS, y se extendieron de inmediato en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company, San José, CA), y se analizaron usando el software FlowJo (Tree Star, Inc, San Carlos, CA). Se analizó la intensidad de fluorescencia sólo en células vivas, las cuales se identificaron mediante dispersión de luz. Se calcularon las medias geométricas de la intensidad de fluorescencia (fluorescencia media de los canales o MCF), y se usaron para determinar la expresión relativa del IGF-IR sobre la superficie de la célula. Además de evaluar el efecto de los anticuerpos de la invención sobre los niveles del IGF-IR en células transfectadas, se quiso poner a prueba la capacidad de estos anticuerpos para subregular el IGF-IR de líneas de células tumorales. Se sembraron células A549 (líneas de células de cáncer pulmonar de células no pequeñas, ATCC) en grupos de 6 cavidades con DMEM/medio F12 de Ham (1:1 ) que contenía L-glutamina a 2 mM, penicilina-estreptomicina y suero de bovino fetal a 10%. Después de que se alcanzó 90% de confluencia, el medio de cultivo se reemplazó con 2 mi por cavidad de medio fresco que contenía 10 nM de los anticuerpos de prueba o IGF-l. En tiempos seleccionados después de la adición de anticuerpos o ligando, las monocapas de células se enjuagaron con PBS enfriada en hielo, y entonces se cosecharon por raspadura en 0.3 mi por cavidad de Nonidet P40 a 1%, Tris-HCI a 25 mM, pH 7.5, que contenía NaCI a 0.15 M, glicerol a 10%, EDTA a 5 mM y cocteles de inhibidores de proteasa y fosfatasa. Después de clarificación mediante centrifugación a 10,000 xg/20 minutos, se analizaron cantidades equivalentes de proteína de la fracción del sobrenadante mediante SDS-PAGE y Western blotting para IGF-IR total, usando sc-713 (Santa Cruz Biotechnology) y actina (Sigma A-2066) para carga total de proteínas. Como se muestra en la figura 13, se observó una pérdida preferencia! del IGF-IR total dependiente del tiempo cuando se trataron células tumorales A549 con los anticuerpos del IGF-IR 8A1 , 9A2 y 11A4 contra IgG o IGF-l humanos control. A este respecto, los resultados obtenidos concuerdan bien con los observados usando fibroblastos NIH-3T3 que sobreexpresan el IGF-IR humano. De esta manera, los presentes inventores fueron capaces de demostrar subregulación del IGF-IR total de fibroblastos que sobreexpresan el IGF-IR humano, así como líneas de células tumorales humanas que expresan IGF-IR endógeno.

EJEMPLO 13 Subregulación de IGF-IR por anticuerpos monoclonales, evaluada mediante FACS Los presentes inventores pusieron a prueba la capacidad de los anticuerpos monoclonales para disminuir el nivel del IGF-IR de la superficie de las células, usando fibroblastos NIH-3T3 transfectados con el IGF-IR humano. Estos experimentos se llevaron a cabo con anticuerpos de la invención, en particular 8A1 , 9A2, 11A4, y un anticuerpo monoclonal del IGF-IR de ratón disponible comercialmente (alfa-IR3). Se desarrollaron células en grupos de 6 cavidades hasta aproximadamente 80% de confluencia, en DMEM que contenía suero de bovino fetal a 10%. Una hora antes de que se iniciaran los experimentos, el medio de cultivo se reemplazó con DMEM sin suero (medio de unión), y las células se incubaron en medio de unión que contenía 1 µ9/?t?? de anticuerpos de prueba por hasta 8 horas a 370C/CC>2 a 5%. El grado de subregulación del IGF-IR por los anticuerpos monoclonales de prueba, se determinó mediante análisis por FACS. En los puntos de tiempo seleccionados, las células se lavaron una vez con PBS que carecía de Ca++/Mg++, y se removieron entonces de las placas con tripsina a 0.25%/EDTA. Las células de cada cavidad se recogieron en 5 mi de DMEM que contenía suero de bovino fetal a 10%, y se recogieron mediante centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos. La pella de células se resuspendió en regulador de pH de FACS (PBS que carecía de Ca++/Mg++ y que contenía BSA a 0.1 % y azida de sodio a 0.1 %). Las células (0.5 - 2.0xE5) se sembraron en placas de fondo redondo de 96 cavidades, se centrifugaron para transformar las células a pellas como se indicó anteriormente, y se resuspendieron en 50 µ? de regulador de pH de FACS que contenía IgG control o su anticuerpo del IGF-IR cognado a 10 µg/ml. Después de 30 minutos sobre hielo, las células se transformaron de nuevo a pellas y se lavaron dos veces con regulador de pH de FACS. Las células se incubaron entonces durante 30 minutos sobre hielo con 10 g/ml de IgG anti-humano de asno o IgG anti-ratón de asno conjugadas con FITC diluido en regulador de pH de FACS. Las células teñidas se lavaron dos veces en regulador de pH de FACS, se resuspendieron en un volumen final de 200 µ? de regulador de pH de FACS, y se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CA) con el software FlowJo (Tree Star Inc., San Carlos, CA). Se analizó la intensidad de fluorescencia sólo en células vivas, las cuales se identificaron mediante dispersión de luz. Se calculó la fluorescencia media de los canales (MCF), y se usó para determinar la expresión relativa del IGF-IR sobre la superficie de las células como una función del tiempo a 37°C. Los resultados dados en la figura 10, indican que todos los anticuerpos de la invención puestos a prueba fueron efectivos para disminuir el nivel del IGF-IR en la superficie de las células.

EJEMPLO 14 Estudios de mapeo de epítopes Habiendo demostrado que los anticuerpos de la invención reconocen el IGF-IR y bloquean la unión del ligando al IGF-IR, se llevaron a cabo estudios de mapeo de epítopes con un subgrupo de los anticuerpos de la invención. Se enfocaron estos experimentos en particular en los anticuerpos 7A4, 8A1 , 9A2, 1 1A4 y 1 1A11. Se llevaron a cabo pruebas de unión competitiva en fibroblastos NIH-3T3 que expresan el IGF-IR humano, para evaluar si los anticuerpos de la invención se unen al mismo sitio o a sitios diferentes en el IGF-IR, y se compararon sus epítopes reconocidos con los ya mapeados sobre el IGF-IR, usando anticuerpos monoclonales del IGF-IR de ratón disponibles comercialmente. Para este propósito, los presentes inventores radioyodaron anticuerpos de la invención a una actividad específica de 17.4-20.3 µC\/µg usando lodogen, y técnicas estándar conocidas por los expertos en la materia. Se adquirió IGF-I radioyodado de una fuente comercial (Perkin-Elmer; #NEX241 ). Se sembraron células NIH-3T3 que expresan establemente el IGF-IR humano a 2xE4 células/cavidad, en placas de cultivo de tejidos de 24 cavidades en 1 ml/cavidad de DMEM (Gibco, #11995-040, Grand Island, NY) complementado con L-glutamina a 2 mM (Gibco, #25030-081 ) y suero de bovino fetal a 10% (Hyclone, #SH30070.03, Logan UT). Las células se incubaron durante 2 días a 37°C/C02 a 5% hasta aproximadamente 80% de confluencia, y entonces el medio de crecimiento se reemplazó con 1.0 ml/cav¡dad de DMEM que contenía Hepes a 20 mM (Gibco, #15630-080) y BSA a 0.5% (Equitech Bio, solución a 30%, libre de proteasa, Kerrville, TX), y la incubación se continuó durante la noche a la temperatura anterior en este medio de inanición. Para iniciar la prueba de unión, se pusieron las placas en agua enfriada en hielo, y el medio de cultivo se reemplazó con 0.25 ml/cavidad de medio de inanición enfriado en hielo que contenía 60 nM del competidor seleccionado, seguido inmediatamente de la adición de un volumen igual de medio de inanición enfriado en hielo que contenía 0.6 nM de cada anticuerpo monoclonal de prueba marcado radiactivamente o IGF-l. Se dejó que la unión procediera durante 3 horas a 4°C, y entonces las monocapas de células se lavaron tres veces con 0.75 ml/cavidad de PBS de Dulbecco enfriada en hielo (Gibco, #14070-117). Las células y la radiactividad asociada se liberaron de las placas con 0.75 mi de dodecilsulfato de sodio a 2% (Gibco, #24730-020) complementado con NaOH a 0.2N, y calentando las placas a 50°C durante 15 minutos. La radiactividad del lisado se cuantificó entonces mediante espectrometría de escintilación gamma. Cada cavidad contenía en promedio 1.8xE5 células, y los conteos por minuto (CPM) del lisado fueron transformados a femtomoles de radioligando unido por millones de células con base en la actividad específica conocida del radioligando. Los resultados mostrados en las figuras 15a-15f, indican que los anticuerpos 8A1 y 7A4 de la invención son competidores más efectivos por la unión del IGF-l que los otros anticuerpos puestos a prueba bajo estas condiciones de prueba. Además, 8A1 y 7A4 parecen compartir un epítope del IGF-IR común posiblemente idéntico que se traslapa con los epítopes reportados (Adams, eí al., Cell Mol. Life Sci. 57: 1050-1093, 2000) reconocidos por todos los anticuerpos monoclonales anti-lGF-IR de ratón disponibles comercialmente puestos a prueba (24-57, #MS-643-PABX, NeoMarkers, Fremont, CA; alfa IR3, #GR11SP2, Oncogene Research Products, San Diego, CA; 24-31 , #MS-641-PABX, NeoMarkers; 24-60, # S-644-PABX, NeoMarkers). En contraste, 9A2, 11 A4 y 11A 1 del IGF-IR humano parecen reconocer un epítope del ÍGF-IR distinto, pero posiblemente compartido o traslapante, que el reconocido por 7A4 y 8A1. Estos experimentos permiten asignar los anticuerpos de la invención a diferentes grupos de unión. Indican también que varios anticuerpos de la invención parecen reconocer epítopes idénticos o similares, que los anticuerpos de ratón disponibles comercialmente para el IGF-IR humano. Las figuras 16a- 6c indican que existen epítopes distintos para los anticuerpos anti-IGF-IR 8A , 9A2 y 1 A4.

EJEMPLO 15 Inhibición del crecimiento de tumores/expresión del IGF-IR con anticuerpos del IGF-IR Establecimiento del modelo Se usó en este experimento la línea de células 3T3/IGF-IR-S. Se inocularon subcutáneamente 1x106 células/ratón en ratones desnudos hembras por 10 µ? de solución de matrigel/PBS a 60%. 6 días después de la inyección de las células, se dividió aleatoriamente a 70 ratones (con tumores de 60~70 mm3) en siete grupos (10 ratones/grupo) como se indica a continuación. Los compuestos se administraron en los días 7, 10 y 13. Grupo 1, PBS. 200 µ?, IP Grupo 2, IgG humana, 500 µg, IP Grupo 3, 24-57, 500 pg, IP Grupo 4, 8A1 , 100 µg, IP Grupo 5, 8A1 , 500 pg, IP Grupo 6, 11A4, 100 ng, IP Grupo 7, 11A4, 500 \¡g, IP Monitoreo Se registró el tamaño de los tumores dos veces por semana usando calibres de vernier. Se calculó el volumen mediante la fórmula: mm3 = longitud x (ancho)2 x 0.52. Se registró el peso corporal una vez por semana. La figura 17 muestra los resultados, en donde se inocularon subcutáneamente 1x106 células 3T3/IGF-IR-S/ratón en ratones desnudos hembras por 10 mi de solución de PBS/matrigel a 60%. Los ratones que tenían tumores fueron divididos aleatoriamente, y los compuestos se administraron en los días 7, 10 y 13. Todos los ratones murieron en el día 16. Se registró el tamaño de los tumores dos veces por semana usando calibres de vernier. Se calculó el volumen mediante la fórmula: mm3 = longitud x (ancho)2 x 0.52. Se registró el peso corporal una vez por semana.

Los anticuerpos monoclonales humanos 8A1 y 11A4 tienen efectos significativos de demora de tumores. Los efectos de inhibición del crecimiento de tumores, son comparables con el anticuerpo monoclonal sustituido de ratón, 24-57. La figura 18 muestra los resultados, en donde se inocularon subcutáneamente 1x106 células 3T3/IGF-IR-S/ratón en ratones desnudos hembras por 10 mi de solución de PBS/matrigel a 60%. Los ratones que tenían tumores fueron divididos aleatoriamente, y los compuestos se administraron en los días 7, 10 y 13. Todos los ratones murieron en el día 16. Se registró el tamaño de los tumores dos veces por semana usando calibres de vernier. Se calculó el volumen mediante la fórmula: mm3 = longitud x (ancho)2 x 0.52. Se registró el peso corporal una vez por semana. La cantidad del IGF-IR que quedó en el día 15 fue de 97.2% para el control de PBS, 102.8% para el control de IgG humana, 18.6% para IgG 8A1 al nivel de 100 µg, y 24.6% para IgG 8A1 al nivel de 500 µg. La IgG 8A1 inhibió el crecimiento de tumores in vivo a 100 µ9 (45% de demora de tumores) o 500 µ9 (56% de demora de tumores). La diferencia entre los dos grupos de tratamiento, no es significativa (P>0.1). Estos resultados indican que dosis mayores de 100 µ9 pueden no ser más eficaces. La figura 19 muestra los resultados, en donde se inocularon subcutáneamente 1x106 células 3T3/IGF-IR-S/ratón en ratones desnudos hembras por 10 mi de solución de PBS/matrigel a 60%. Los ratones que tenían tumores fueron divididos aleatoriamente, y los compuestos se administraron en los días 7, 10 y 13. Todos los ratones murieron en el día 16. Se registró el tamaño de los tumores dos veces por semana usando calibres de vemier. Se calculó el volumen mediante la fórmula: mm3 = longitud x (ancho)2 x 0.52. Se registró el peso corporal una vez por semana. La cantidad del IGF-IR que quedó en el día 15 fue de 97.3% para el control de PBS, 102.7% para el control de IgG humana, 15.1 % para IgG 8A1 al nivel de 100 g, y 11.9% para IgG 11A4 al nivel de 500 g. Esta gráfica mostró la respuesta de 11A4 a la dosis. De nuevo, no se encontró eficacia adicional alguna con una dosis más allá de 00 µg.

Claims (14)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al IGF-IR, en donde dicho anticuerpo comprende un anticuerpo del IGF-IR seleccionado del grupo que consiste de PINT-6A1 , PINT-7A2, PINT-7A4, PINT-7A5, PINT-7A6, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 , PINT-11A2, PINT-11A3, PINT-11A4, PINT-11A5, PINT-11A7, PINT-11A12, PINT-12A1 , PINT-12A2, PINT-12A3, PINT-12A4 y PINT- 2A5, o un fragmento de cualquiera de los mismos.

2. - El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho anticuerpo del IGF-IR se selecciona del grupo que consiste de PINT-7A4, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 y PINT-11A4, o un fragmento de cualquiera de los mismos.

3. - El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho anticuerpo del IGF-IR se selecciona del grupo que consiste de PINT-8A1 , PINT-9A2 y PINT-1 A4, o un fragmento de cualquiera de los mismos.

4. - El anticuerpo o porción de unión a antígeno de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 ó 3, caracterizado además porque dicho anticuerpo comprende por lo menos una cadena ligera de dicho anticuerpo del IGF-IR y/o por lo menos una cadena pesada de dicho anticuerpo del IGF-IR.

5.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho anticuerpo comprende por lo menos una CDR de dicho anticuerpo del IGF-IR.

6.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho anticuerpo comprende CDRs de diferentes cadenas ligeras de dicho anticuerpo del IGF-IR, y/o CDRs de cadenas pesadas diferentes de dicho anticuerpo del IGF-IR.

7.- El anticuerpo o porción de unión a antígeno de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2 ó 3, caracterizado además porque dicho anticuerpo comprende por lo menos una región variable VL o VH de dicho anticuerpo del IGF-IR.

8. - El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque el anticuerpo o porción del mismo tiene por lo menos una propiedad seleccionada del grupo que consiste de: a) compite en forma cruzada por la unión al IGF-IR humano; b) se une al mismo epitope del IGF humano; c) se une al IGF-IR humano con sustancialmente la misma Kd; y d) se une al IGF-IR humano con sustancialmente la misma velocidad de disociación.

9. - El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque es a) una inmunoglobulina G (IgG) o una molécula de IgM, IgE, IgA o IgD; b) un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un anticuerpo de cadena sencilla; o c) un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo biespecífico.

10.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho anticuerpo del IGF-IR es una IgG seleccionada del grupo que consiste de PINT-7A4, PINT-8A1 , PINT-9A2, PINT-11A1 y PINT- A4.

11. - Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o porción del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. - Una línea de células aislada que produce un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

13. - El uso de un anticuerpo específico del IGF-IR de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 10, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o tumor.

14. - Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una cadena pesada o porción de unión a antígeno del mismo, o una cadena ligera o porción de unión a antígeno del mismo de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.