JP2015157832A - 二重特異性免疫サイトカインドック−アンド−ロック(dnl)複合体及びその治療的使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2010年4月6日に出願された米国特許出願第12/754,740号、2010年4月5日に出願された米国特許出願第12/754,140号;2010年4月1日に出願された米国特許出願第12/752,649号、2010年3月25日に出願された米国特許出願第12/731,781号、2009年12月22日に出願された米国特許出願第12/644,146号、2009年8月31日に出願された米国特許仮出願第61/238,424号の優先権を主張する。各優先出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本研究は、国立癌研究所、国立衛生研究所からの助成金2R44CA108083−02A2により部分的に支援された。連邦政府は、本発明にある種の権利を有する場合がある。
別様の指示がない限り、「1つの(a)」又は「1つの(an)」は、「1つ又は複数」を意味する。
「ドックアンドロック」(DNL)法では、cAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)の制御(R)サブユニットと、Aキナーゼアンカータンパク質(AKAP)のアンカードメイン(AD)との間に生じる特異的タンパク質間相互作用が活用される(Baillie et al., FEBS Letters. 2005; 579: 3264。Wong and Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004; 5: 959)。PKAは、Rサブユニットに対するセカンドメッセンジャーcAMPの結合により引き起こされる、最もよく研究されているシグナル伝達経路の1つに中心的な役割を果たしており、1968年にウサギ骨格筋から最初に単離された(Walsh et al., J. Biol. Chem. 1968;243:3763)。ホロ酵素の構造は、Rサブユニットにより不活性形態に保持される2つの触媒サブユニットで構成される(Taylor, J. Biol. Chem. 1989;264:8443)。PKAのアイソザイムは、2つのタイプのRサブユニット(RI及びRII)に見出され、各タイプは、α及びβアイソフォームを有する(Scott, Pharmacol. Ther. 1991;50:123)。Rサブユニットは、安定した二量体としてのみ単離されており、二量体化ドメインは、最初の44個アミノ末端残基で構成されることが示されている(Newlon et al., Nat. Struct. Biol. 1999;6:222)。Rサブユニットに対するcAMPの結合は、広域性セリン/トレオニンキナーゼ活性の活性触媒サブユニットを解放することに結び付き、それは、AKAPとのドッキングによるPKAの区画化により、選択された基質に向かって配向される(Scott et al., J. Biol. Chem. 1990;265;21561)。
本発明者らは、以降A及びBと呼ぶ任意の組み合わせの物質とドッキングして非共有結合性複合体になり、ジスルフィド結合の形成を容易にする戦略的位でDDD及びADの両方にシステイン残基を導入することにより安定した係留構造に更にロックすることができる優れた一対のリンカーモジュールとして、ヒトRIIαのDDD及びAKAPタンパク質のADを使用するプラットフォーム技術を開発した。「ドックアンドロック」手法の一般的な方法は、以下の通りである。物質Aは、DDD配列をAの前駆体に結合することにより構築され、以降aと呼ぶ第1の成分がもたらされる。DDD配列は、二量体の自然形成を生じさせることになるため、従ってAは、a2で構成されることになる。物質Bは、AD配列をBの前駆体に結合することにより構築され、以降bと呼ぶ第2の成分がもたらされる。a2に含まれるDDDの二量体モチーフは、bに含まれるAD配列と結合するためのドッキング部位を生成し、それによりa2及びbの容易な結合を促進し、a2bで構成される三量体複合体を形成することになる。この結合事象は、ジスルフィド架橋により2つの物質を共有結合で固定するその後の反応により不可逆的となり、これは、最初の結合相互作用が、DDD及びADの両方に配置された反応性チオール基を接近させ(Chmura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001;98:8480)、部位特異的にライゲーションするはずであるため、有効局所濃度の原理に基づき非常に効率的に生じる。ある実施形態では、a2サブユニットは、2つの同一エフェクター部分を含有していてもよいが、下記に記載の好ましい実施形態では、a2サブユニットは、各々が同一のDDD配列に結合されている2つの異なるエフェクター部分を含んでいてもよい。従って、三量体a2b複合体は、3つの異なるエフェクター部分を含んでいてもよい。
ある実施形態では、免疫サイトカインDNL複合体に組み込まれたAD及びDDD配列は、以下のDDD1及びAD1のアミノ酸配列を含む。より好ましい実施形態では、AD及びDDD配列は、DDD部分とAD部分との間のジスルフィド結合形成を容易にするように設計されているDDD2及びAD2のアミノ酸配列を含む。
DDD1
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号13)
DDD2
CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号14)
AD1
QIEYLAKQIVDNAIQQA(配列番号15)
AD2
CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(配列番号16)
DDD3
SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(配列番号17)
DDD3C
MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(配列番号18)
AD3
CGFEELAWKIAKMIWSDVFQQGC(配列番号19)
ヒトPKA RIβアミノ酸配列
MASPPACPSE EDESLKGCEL YVQLHGIQQV LKDCIVHLCI SKPERPMKFL REHFEKLEKE ENRQILARQK SNSQSDSHDE EVSPTPPNPV VKARRRRGGV SAEVYTEEDA VSYVRKVIPK DYKTMTALAK AISKNVLFAH LDDNERSDIF DAMFPVTHIA GETVIQQGNE GDNFYVVDQG EVDVYVNGEW VTNISEGGSF GELALIYGTP RAATVKAKTD LKLWGIDRDS YRRILMGSTL RKRKMYEEFL SKVSILESLE KWERLTVADA LEPVQFEDGE KIVVQGEPGD DFYIITEGTA SVLQRRSPNE EYVEVGRLGP SDYFGEIALL LNRPRAATVV ARGPLKCVKL DRPRFERVLG PCSEILKRNI QRYNSFISLT V(配列番号20)
ヒトPKA RIIβアミノ酸配列
MSIEIPAGLT ELLQGFTVEV LRHQPADLLE FALQHFTRLQ QENERKGTAR FGHEGRTWGD LGAAAGGGTP SKGVNFAEEP MQSDSEDGEE EEAAPADAGA FNAPVINRFT RRASVCAEAY NPDEEEDDAE SRIIHPKTDD QRNRLQEACK DILLFKNLDP EQMSQVLDAM FEKLVKDGEH VIDQGDDGDN FYVIDRGTFD IYVKCDGVGR CVGNYDNRGS FGELALMYNT PRAATITATS PGALWGLDRV TFRRIIVKNN AKKRKMYESF IESLPFLKSL EFSERLKVVD VIGTKVYNDG EQIIAQGDSA DSFFIVESGE VKITMKRKGK SEVEENGAVE IARCSRGQYF GELALVTNKP RAASAHAIGT VKCLAMDVQA FERLLGPCME IMKRNIATYE EQLVALFGTN MDIVEPTA(配列番号21)
タンパク質キナーゼAに由来するヒトDDD配列
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号13)
XXIXIXXXLXXLLXXYXVXVLXXXXXXLVXFXVXYFXXLXXXXX(配列番号22)
AKAP−IS配列
QIEYLAKQIVDNAIQQA(配列番号15)
XXXXXAXXIVXXAIXXX(配列番号23)
SuperAKAP−IS
QIEYVAKQIVDYAIHQA(配列番号24)
代替的AKAP配列
QIEYKAKQIVDHAIHQA(配列番号25)
QIEYHAKQIVDHAIHQA(配列番号26)
QIEYVAKQIVDHAIHQA(配列番号27)
RII特異的AKAP
AKAP−KL
PLEYQAGLLVQNAIQQAI(配列番号28)
AKAP79
LLIETASSLVKNAIQLSI(配列番号29)
AKAP−Lbc
LIEEAASRIVDAVIEQVK(配列番号30)
RI特異的AKAP
AKAPce
ALYQFADRFSELVISEAL(配列番号31)
RIAD
LEQVANQLADQIIKEAT(配列番号32)
PV38
FEELAWKIAKMIWSDVF(配列番号33)
二重特異性AKAP
AKAP7
ELVRLSKRLVENAVLKAV(配列番号34)
MAP2D
TAEEVSARIVQVVTAEAV(配列番号35)
DAKAP1
QIKQAAFQLISQVILEAT(配列番号36)
DAKAP2
LAWKIAKMIVSDVMQQ(配列番号37)
Ht31
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(配列番号38)
RIAD
LEQYANQLADQIIKEATE(配列番号39)
PV−38
FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(配列番号40)
AKAP−IS
QIEYLAKQIVDNAIQQA(配列番号15)
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号13)
XHIXIPXGLXELLQGYTXEVLRXQPXDLVEFAXXYFXXLXEXRX(配列番号59)
(L)
QKSLSLSPGLGSGGGGSGGCG(配列番号60)
(A)
QKSLSLSPGAGSGGGGSGGCG(配列番号61)
(−)
QKSLSLSPGGSGGGGSGGCG(配列番号62)
ある実施形態では、開示された方法及び組成物には、1つ又は複数の置換アミノ酸残基を有するタンパク質又はペプチドの産生及び使用が伴っていてもよい。天然、キメラ、ヒト化、若しくはヒト抗体、又はAD若しくはDDD配列の構造的、物理的、及び/又は治療的特徴は、1つ又は複数のアミノ酸残基の置換により最適化することができる。例えば、ヒト化抗体の機能的特徴は、限定された数のヒトフレームワーク領域(FR)アミノ酸を、親マウス抗体の対応するFRアミノ酸で置換することにより向上させることができることは、当技術分野で周知である。フレームワーク領域アミノ酸残基がCDR残基に近接している場合、これは特に当てはまる。
ある好ましい実施形態では、エフェクター部分は、免疫調節物質であってもよい。免疫調節物質は、存在すると、体内の免疫系を変更、抑制、刺激する作用剤である。使用される免疫調節物質には、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子(CSF)、インターフェロン(IFN)、エリトロポイエチン、トロンボポイエチン、及びそれらの組み合わせが含まれていてもよい。特に有用なのは、腫瘍壊死因子(TNF)等のリンホトキシン、インターロイキン(IL)等の造血因子、果粒球コロニー刺激因子(G−CSF)又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)等のコロニー刺激因子、インターフェロン−α、−β、又は−γ等のインターフェロン、及び「S1因子」と命名されているもの等の幹細胞増殖因子である。
事実上あらゆる標的抗原に対してモノクローナル抗体を調製する技術は、当技術分野で周知である。例えば、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)、及びColigan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5.1−2.6.7 (John Wiley & Sons 1991)を参照されたい。手短に言えば、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物をマウスに注射し、脾臓を取り出してBリンパ球を取得し、Bリンパ球をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを産生し、ハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、ハイブリドーマ培養から抗体を単離することにより得ることができる。
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域(CDR)を含むマウス抗体の可変領域と置換されている組換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象体に投与した際に、免疫原性の減少及び安定性の増加を示す。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的技術は、例えば、Orlandi et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989)に開示されている。キメラ抗体を構築するための技術は、当業者に周知である。一例として、Leung et al., Hybridoma 13:469 (1994)では、マウスLL2、抗CD22モノクローナル抗体のVκ及びVHドメインをコードするDNA配列を、それぞれのヒトκ及びIgG1定常領域ドメインと組み合わせることによるLL2キメラが産生された。
ヒト化MAbを産生するための技術は、当技術分野で周知である(例えば、Jones et al., Nature 321: 522 (1986)、Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988)、Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)、Carter et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992)、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992)、及びSinger et al., J. Immun. 150: 2844 (1993)を参照)。キメラ又はマウスモノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変鎖に由来するマウスCDRを、ヒト抗体の対応する可変ドメインに移植することによりヒト化することができる。キメラモノクローナル抗体のマウスフレームワーク領域(FR)も、ヒトFR配列と置換される。マウスCDRを単にヒトFRに移植することでは、抗体親和性の低減がもたらされることが多く、又は喪失がもたらされることさえあり、マウス抗体の元々の親和性を回復するには、追加的な修飾が必要な場合がある。これは、FR領域の1つ又は複数のヒト残基を、それらのマウス対応物と置換して、そのエピトープに対する良好な結合親和性を有する抗体を得ることにより達成することができる。例えば、Tempest et al., Biotechnology 9:266 (1991)及びVerhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)を参照されたい。一般的に、それらのマウス対応物とは異なっており、1つ又は複数のCDRアミノ酸残基に接近して位置するか又は接しているヒトFRアミノ酸残基が、置換の候補になるだろう。
コンビナトリアル手法又はヒト免疫グロブリン遺伝子座で形質転換されたトランスジェニック動物のいずれかを使用して完全ヒト抗体を産生する方法は、当技術分野で公知である(例えば、Mancini et al., 2004, New Microbiol. 27:315−28;Conrad and Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8:117−26;Brekke and Loset, 2003, Curr. Opin. Phamacol. 3:544−50)。完全ヒト抗体は、遺伝子又は染色体形質移入法、並びにファージディスプレイ技術によっても構築することができ、それらは全て当技術分野で公知である。例えば、McCafferty et al., Nature 348:552−553 (1990)を参照されたい。そのような完全ヒト抗体は、キメラ又はヒト化抗体よりも更に少ない副作用を示し、本質的に内因的なヒト抗体としてin vivoで機能すると予測される。ある実施形態では、特許請求されている方法及び手順には、そのような技術により産生されるヒト抗体が使用されてもよい。
特定のエピトープを認識する抗体断片を、公知の技術により産生することができる。抗体断片は、F(ab’)2、Fab’、F(ab)2、Fab、Fv、及びsFv等の、抗体の抗原結合部分である。F(ab’)2断片は、抗体分子のペプシン消化により産生することができ、Fab’断片は、F(ab’)2断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成することができる。或いは、Fab’発現ライブラリーを構築して(Huse et al., 1989, Science, 246:1274−1281)、所望の特異性を有するモノクローナルFab’断片の迅速で容易な特定を可能にすることができる。F(ab)2断片は、抗体のパパイン消化により生成することができ、Fab断片は、ジスルフィド還元により得ることができる。
使用される抗体は、幅広く多様な公知の供給源から商業的に取得することができる。例えば、様々な抗体分泌ハイブリドーマ系統が、アメリカ培養細胞系統保存機関(ATCC、マナッサス、バージニア州)から入手可能である。腫瘍関連抗原を含むがそれに限定されない種々の疾患標的に対する多数の抗体が、ATCCに寄託されており、及び/又は可変領域配列が公表されており、特許請求されている方法及び組成物で使用するために入手可能である。例えば、以下を参照されたい:米国特許第7,312,318号;第7,282,567号;第7,151,164号;第7,074,403号;第7,060,802号;第7,056,509号;第7,049,060号;第7,045,132号;第7,041,803号;第7,041,802号;第7,041,293号;第7,038,018号;第7,037,498号;第7,012,133号;第7,001,598号;第6,998,468号;第6,994,976号;第6,994,852号;第6,989,241号;第6,974,863号;第6,965,018号;第6,964,854号;第6,962,981号;第6,962,813号;第6,956,107号;第6,951,924号;第6,949,244号;第6,946,129号;第6,943,020号;第6,939,547号;第6,921,645号;第6,921,645号;第6,921,533号;第6,919,433号;第6,919,078号;第6,916,475号;第6,905,681号;第6,899,879号;第6,893,625号;第6,887,468号;第6,887,466号;第6,884,594号;第6,881,405号;第6,878,812号;第6,875,580号;第6,872,568号;第6,867,006号;第6,864,062号;第6,861,511号;第6,861,227号;第6,861,226号;第6,838,282号;第6,835,549号;第6,835,370号;第6,824,780号;第6,824,778号;第6,812,206号;第6,793,924号;第6,783,758号;第6,770,450号;第6,767,711号;第6,764,688号;第6,764,681号;第6,764,679号;第6,743,898号;第6,733,981号;第6,730,307号;第6,720,15号;第6,716,966号;第6,709,653号;第6,693,176号;第6,692,908号;第6,689,607号;第6,689,362号;第6,689,355号;第6,682,737号;第6,682,736号;第6,682,734号;第6,673,344号;第6,653,104号;第6,652,852号;第6,635,482号;第6,630,144号;第6,610,833号;第6,610,294号;第6,605,441号;第6,605,279号;第6,596,852号;第6,592,868号;第6,576,745号;第6,572,856号;第6,566,076号;第6,562,618号;第6,545,130号;第6,544,749号;第6,534,058号;第6,528,625号;第6,528,269号;第6,521,227号;第6,518,404号;第6,511,665号;第6,491,915号;第6,488,930号;第6,482,598号;第6,482,408号;第6,479,247号;第6,468,531号;第6,468,529号;第6,465,173号;第6,461,823号;第6,458,356号;第6,455,044号;第6,455,040号、第6,451,310号;第6,444,206号、第6,441,143号;第6,432,404号;第6,432,402号;第6,419,928号;第6,413,726号;第6,406,694号;第6,403,770号;第6,403,091号;第6,395,276号;第6,395,274号;第6,387,350号;第6,383,759号;第6,383,484号;第6,376,654号;第6,372,215号;第6,359,126号;第6,355,481号;第6,355,444号;第6,355,245号;第6,355,244号;第6,346,246号;第6,344,198号;第6,340,571号;第6,340,459号;第6,331,175号;第6,306,393号;第6,254,868号;第6,187,287号;第6,183,744号;第6,129,914号;第6,120,767号;第6,096,289号;第6,077,499号;第5,922,302号;第5,874,540号;第5,814,440号;第5,798,229号;第5,789,554号;第5,776,456号;第5,736,119号;第5,716,595号;第5,677,136号;第5,587,459号;第5,443,953号、第5,525,338号。これらは例示に過ぎず、幅広く多様な他の抗体及びそれらのハイブリドーマが、当技術分野で公知である。当業者であれば、ほとんど全ての疾患関連抗原に対する抗体配列又は抗体分泌ハイブリドーマは、選択された目的の疾患関連標的に対する抗体について、ATCC、NCBI、及び/又はUSPTOデータベースを単に検索することにより得ることができることを理解するだろう。クローニングされた抗体の抗原結合ドメインは、当技術分野で周知の標準的技術を使用して、増幅し、切断し、発現ベクターにライゲーションし、適した宿主細胞に形質移入し、タンパク質産生に使用することができる。
ある実施形態では、抗体又はその断片は、1つ又は複数の治療薬又は診断薬に結合されていてもよい。治療薬は同じである必要はなく、異なっていてもよく、例えば薬物及び放射性同位元素であってもよい。例えば、131Iを抗体又は融合タンパク質のチロシンに組み込み、薬物をリジン残基のイプシロンアミノ基に結合することができる。また、治療薬及び診断薬を、例えば、還元型SH基及び/又は糖側鎖に結合させることができる。治療薬又は診断薬と抗体又は融合タンパク質との共有結合又は非共有結合による結合体を製作するための多数の方法が、当技術分野で公知であり、任意のそのような公知の方法を使用することができる。
代替的な実施形態では、細胞毒性薬、抗血管新生作用剤、アポトーシス促進剤、抗生物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ケモカイン、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、又は他の作用剤等の治療薬を、主題のDNL複合体に結合させるか、又は抗体の前に、同時に、若しくは後で別々に投与するかのいずれかで使用することができる。使用される薬物は、抗有糸分裂剤、抗キナーゼ剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、アルカロイド、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される医薬品特性を有していてもよい。
診断薬は、好ましくは、放射性核種、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤、及び光活性剤からなる群から選択される。そのような診断薬は周知であり、任意のそのような公知の診断薬を使用することができる。診断薬の非限定的な例には、以下のもの等の放射性核種が含まれていてもよい:110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154〜158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、又は他のガンマ−、ベータ−、又はポジトロン−放射体。使用される常磁性イオンには、以下のものが含まれていてもよい:クロム(III)、マンガン(II)、鉄(III)、鉄(II)、コバルト(II)、ニッケル(II)、銅(II)、ネオジム(III)、サマリウム(III)、イッテルビウム(III)、ガドリニウム(III)、バナジウム(II)、テルビウム(III)、ジスプロシウム(III)、ホルミウム(III)、又はエルビウム(III)。金属造影剤には、ランタン(III)、金(III)、鉛(II)、又はビスマス(III)が含まれていてもよい。超音波造影剤は、ガス入りリポソーム等のリポソームを含んでいてもよい。放射線不透過性診断薬は、化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、及びタリウム化合物から選択されてもよい。幅広く多様な蛍光標識が当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリテリン(phycoerytherin)、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタアルデヒド(o−phthaldehyde)、及びフルオレサミンが含まれる。使用される化学発光標識には、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、又はシュウ酸エステルが含まれていてもよい。
種々の実施形態は、ヒト、イヌ及びネコ等の家庭内又は伴侶ペットを含む哺乳動物等の対象体の癌を治療する方法であって、治療上有効量の二重特異性免疫サイトカインDNL構築体を対象体に投与することを含む方法に関する。
更に他の実施形態は、抗体、抗体断片、サイトカイン、又はDNL構築体の構成融合タンパク質をコードする核酸を含むDNA配列に関していてもよい。融合タンパク質は、例えばAD又はDDD部分に結合された抗体又は断片又はサイトカインを含んでいてもよい。
種々の実施形態は、患者の疾患組織を治療又は診断するのに好適な成分を含有するキットに関していてもよい。例示的なキットは、本明細書に記載の1つ又は複数のDNL構築体を含有していてもよい。投与成分を含有する組成物が、経口送達等による消化管を介した送達用に製剤化されていない場合、幾つかの他の経路によりキット成分を送達することが可能なデバイスが含まれていてもよい。非経口送達等の適用用の1つのタイプのデバイスは、対象体の体内に組成物を注射するために使用される注射器である。吸入器を使用することもできる。ある実施形態では、治療薬は、滅菌の液体製剤又は凍結乾燥調製物を含有する事前充填の注射器又はペン型自動注射器の形態で提供することができる。
以下の例は、例示のために提供されており、本発明の特許請求の範囲を制限するものではない。
Fabモジュールは、DDD又はAD配列のいずれかを含有する融合タンパク質として産生することができる。独立したトランスジェニック細胞系を、各融合タンパク質について開発した。産生したら、必要に応じてモジュールを精製してもよく、又は細胞培養上清液中で維持してもよい。産生後、任意のDDD2モジュールを任意のADモジュールと組み合わせて、三価DNL構築体を生成することができる。
pdHL2プラスミドベクターをテンプレートとして使用して、CH1ドメインをPCRで増幅した。左PCRプライマーは、CH1ドメインの上流(5’)及びCH1コード配列の5’のSacII制限エンドヌクレアーゼ部位で構成される。右プライマーは、ヒンジの最初の4残基をコードする配列、その後の短いリンカーで構成されており、最後の2つのコドンはBamHI制限部位を含む。
CH1 Leftプライマーの5’
5’GAACCTCGCGGACAGTTAAG−3’(配列番号63)
CH1+G4S−Bam Right
5’GGATCCTCCGCCGCCGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGG−3’(配列番号64)
リンカーペプチドの11残基が先行するDDD1のアミノ酸配列をコードし、最初の2つのコドンがBamHI制限部位を含む、(G4S)2DDD1と称する二本鎖オリゴヌクレオチドは、Sigma Genosys社(ヘーヴァリル、英国)により合成された。終止コドン及びEagI制限部位は、3’末端に付加されている。コードされたポリペプチド配列を下記に示す。
GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号65)
RIIA1−44 Top
5’GTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCAGGGCTACACGGTGGAGGTGCTGCGACAG−3’(配列番号66)
RIIA1−44 Bottom
5’GCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTGAAGTACTCCACTGCGAATTCGACGAGGTCAGGCGGCTGCTGTCGCAGCACCTCCACCGTGTAGCCCTG−3’(配列番号67)
G4S Bam−Left
5’−GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT−3’(配列番号68)
1−44 stop Eag Right
5’−CGGCCGTCAAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCG−3’(配列番号69)
リンカーペプチドの11残基が先行するAD1のアミノ酸配列をコードし、最初の2つのコドンがBamHI制限部位を含む、(G4S)2−AD1と称する二本鎖オリゴヌクレオチドを合成した(Sigma Genosys社)。終止コドン及びEagI制限部位は、3’末端に付加されている。コードされたポリペプチド配列を下記に示す。
GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA(配列番号70)
AKAP−IS Top
5’GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCTGACGGCCG−3’(配列番号71)
AKAP−IS Bottom
5’CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCTGCCACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCGGATCC−3’(配列番号72)
G4S Bam−Left
5’−GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT−3’(配列番号73)
AKAP−IS stop Eag Right
5’−CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATG−3’(配列番号74)
DDD1配列をコードする190bp断片を、BamHI及びNotI制限酵素を用いてpGemTから切り出し、その後CH1−pGemTの同じ部位にライゲーションして、シャトルベクターCH1−DDD1−pGemTを生成した。
AD1配列を含有する110bp断片を、BamHI及びNotIを用いてpGemTから切り出し、その後CH1−pGemTの同じ部位にライゲーションして、シャトルベクターCH1−AD1−pGemTを生成した。
DDD又はADの位置は、CH1のカルボキシル末端に限定されない。DDD1配列がVHドメインのアミノ末端に結合された構築体を作り上げた。
h679−Fd−AD1−pdHL2の構築
h679−Fd−AD1−pdHL2は、14個アミノ酸残基で構成される可撓性Gly/Serペプチドスペーサーを介してFdのCH1ドメインのカルボキシル末端に結合されたAD1を有するh679 Fabを産生するための発現ベクターである。SacII及びEagIを用いてCH1−AD1−SV3シャトルベクターから切り出したCH1−AD1断片を有するSacII/EagI断片の置換により、h679の可変ドメインを含有するpdHL2に基づくベクターを、h679−Fd−AD1−pdHL2に変換した。
C−DDD1−Fd−hMN−14−pdHL2は、DDD1が、可撓性ペプチドスペーサーを介してCH1のカルボキシル末端のhMN−14 Fabに結合されている融合タンパク質C−DDD1−Fab−hMN−14を産生するための発現ベクターである。SacII及びEagI制限エンドヌクレアーゼで消化してCH1−CH3ドメインを取り除き、SacII及びEagIを用いてCH1−DDD1−SV3シャトルベクターから切り出したCH1−DDD1断片を挿入することにより、hMN−14 IgGを産生するために使用されたプラスミドベクターhMN14(I)−pdHL2を、C−DDD1−Fd−hMN−14−pdHL2に変換した。
N−DDD1−Fd−hMN−14−pdHL2は、DDD1が、可撓性ペプチドスペーサーを介してVHのアミノ末端のhMN−14 Fabに結合されている2つのコピーの融合タンパク質N−DDD1−Fab−hMN−14を含む安定した二量体を産生するための発現ベクターである。発現ベクターを以下のように操作した。下記に示されている2つのプライマーを使用して、DDD1ドメインをPCRで増幅した。
DDD1 Nco Left
5’CCATGGGCAGCCACATCCAGATCCCGCC−3’(配列番号75)
DDD1−G4S Bam Right
5’GGATCCGCCACCTCCAGATCCTCCGCCGCCAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCGGGTG−3’(配列番号76)
hMN−14VH left G4S Bam
5’−GGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGAGGTCCAACTGGTGGAGAGCGG−3’(配列番号77)
CH1−C stop Eag
5’−CGGCCGTCAGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTC−3’(配列番号78)
679個の抗体がHSG標的抗原に結合し、アフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。h679−Fd−AD1−pdHL2ベクターを、SalI制限エンドヌクレアーゼで消化することにより線形化し、エレクトロポレーションでSp/EEEミエローマ細胞に形質移入した。2シストロン性発現ベクターは、合わせてh679Fab−AD1を形成するh679カッパ軽鎖及びh679Fd−AD1の両方の合成及び分泌を指図する。エレクトロポレーションした後、細胞を96ウェル組織培養プレートに播種し、形質移入クローンを、0.05μMメトトレキサート(MTX)で選択した。BSA−IMP−260(HSG)結合体でコーティングされたマイクロタイタープレートを使用し、HRP結合ヤギ抗ヒトFabで検出したELISAにより、クローンをタンパク質発現についてスクリーニングした。HSG(IMP−239)センサーチップを使用したBIAcore分析を使用して、希釈培地試料の注入から得られる初期傾きを測定することにより生産性を決定した。生産性が最も高いクローンは、およそ30mg/Lの初期生産性を示した。合計230mgのh679−Fab−AD1を、一段階のIMP−291アフィニティークロマトグラフィーで、4.5リットルの回転ボトル培養から精製した。培地を、IMP−291−affigelカラムに負荷する前に、限外ろ過によりおよそ10倍に濃縮した。基線に達するまでカラムをPBSで洗浄し、h679−Fab−AD1を、1Mイミダゾール、1mM EDTA、0.1M NaAc、pH4.5で溶出した。溶出液のSE−HPLC分析は、50kDaタンパク質と一致する滞留時間(9.63分)を示す単一の鋭いピークを示した(非表示)。還元SDS−PAGE分析では、h679−AD1のポリペプチド成分を表す2つのバンドのみが明白だった(非表示)。
C−DDD1−Fd−hMN−14−pdHL2及びN−DDD1−Fd−hMN−14−pdHL2ベクターを、エレクトロポレーションによりSp2/0由来ミエローマ細胞に形質移入した。C−DDD1−Fd−hMN−14−pdHL2は、2シストロン性発現ベクターであり、合わせてC−DDD1−hMN−14 Fabを形成するhMN−14カッパ軽鎖及びhMN−14 Fd−DDD1の両方の合成及び分泌を指図する。N−DDD1−hMN−14−pdHL2は、2シストロン性発現ベクターであり、合わせてN−DDD1−Fab−hMN−14を形成するhMN−14カッパ軽鎖及びN−DDD1−Fd−hMN−14の両方の合成及び分泌を指図する。各融合タンパク質は、DDD1ドメインの相互作用により、安定したホモ二量体を形成する。
DDD/AD相互作用を使用して、DDD1含有構築体を親和性精製した。AD1−Cは、AD1配列、及びスルフヒドリル基とクロロ酢酸無水物を反応させた後でペプチドをAffigelに結合するのに使用したカルボキシル末端システイン残基で構成される合成的に製作されたペプチドである。DDD含有a2構造は、中性pHでAD1−C−Affigel樹脂と特異的に結合し、低pH(例えば、pH2.5)で溶出することができる。
a2b複合体形成の根拠は、C−DDD1−Fab−hMN−14(a2として)及びh679−Fab−AD1(bとして)を等モル量で含有する混合物のSE−HPLC分析により提供された。そのような試料を分析すると、h679−Fab−AD1(9.55分)又はC−DDD1−Fab−hMN−14(8.73分)のいずれよりも大きな新しいタンパク質の形成と一致する8.40分の滞留時間を有する単一のピークが観察された(非表示)。hMN−14F(ab’)2をh679−Fab−AD1と混合したか、又はC−DDD1−Fab−hMN−14を679−Fab−NEMと混合した場合には、アップフィールドシフトは観察されず、相互作用が、DDD1及びAD1ドメインを介して特異的に媒介されることが実証された。非常に類似した結果が、h679−Fab−AD1及びN−DDD1−Fab−hMN−14を使用して得られた(非表示)。
より低い親和性ドッキングを示すDDD又はADタンパク質を産生することにより、汎用親和性精製系を開発することができる。RIα二量体により形成されたDDDは、RIIαと比較して、500倍弱い親和性(225nM)でAKAP−IS(AD1)と結合する。従って、最初の44個アミノ酸残基で形成されるRIα二量体を産生し、樹脂に結合させて、任意のAD1含有融合タンパク質を精製するための親和性マトリックスを製作することができる。
N−DDD2−Fd−hMN−14−pdHL2
N−DDD2−hMN−14−pdHL2は、Fdのアミノ末端に付加されたDDD2の二量体化及びドッキングドメイン配列を有するN−DDD2−Fab−hMN−14を産生するための発現ベクターである。DDD2は、15個アミノ酸残基のGly/Serペプチドリンカーを介してVHドメインに結合される。DDD2は、二量体化及びドッキング配列に先行するシステイン残基を有し、それはDDD1のものと同一だった。
DDD2 Top
5’CATGTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA−3’(配列番号79)
DDD2 Bottom
5’GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCA−3’(配列番号80)
C−DDD2−Fd−hMN−14−pdHL2は、14個アミノ酸残基のGly/Serペプチドリンカーを介してFdのカルボキシル末端に付加されたDDD2の二量体化及びドッキングドメイン配列を有するC−DDD2−Fab−hMN−14を産生するための発現ベクターである。発現ベクターを以下のように操作した。リンカーペプチドの一部(GGGGSGGGCG、配列番号81)及びDDD2の残基1〜13のコード配列を含む2つの重複する相補的オリゴヌクレオチドを、合成的に製作した。オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、T4 PNKでリン酸化し、制限エンドヌクレアーゼBamHI及びPstIでそれぞれ消化されたDNAとのライゲーションに適合する5’及び3’末端突出をもたらした。
G4S−DDD2 top
5’GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA−3’(配列番号82)
G4S−DDD2 bottom
5’GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCAACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCG−3’(配列番号83)
h679−Fd−AD2−pdHL2は、14個アミノ酸残基のGly/Serペプチドリンカーを介してCH1ドメインのカルボキシル末端に付加されたAD2のアンカードメイン配列を有するh679−Fab−AD2を産生するための発現ベクターである。AD2は、AD1のアンカードメイン配列の前に1つシステイン残基、及び後に別のシステイン残基を有する。
AD2 Top
5’GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGATGTGGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCGGCTGCTGAA−3’(配列番号84)
AD2 Bottom
5’TTCAGCAGCCGGCCTGCTGGATGGCGTTGTCCACGATCTGCTTGGCCAGGTACTCGATCTGGCCACATCCGCCAGACCCGCCACCTCCG−3’(配列番号85)
TF1と称する三価DNL構築体の大規模調製を、以下のように実施した。最初に、N−DDD2−Fab−hMN−14(タンパク質Lで精製)及びh679−Fab−AD2(IMP−291で精製)を、1mM EDTA、PBS、pH7.4で、おおよそ化学量論的な濃度に混合した。TCEPを添加する前では、SE−HPLCは、a2b形成の痕跡を一切示さなかった(非表示)。その代りに、a4(7.97分;200kDa)、a2(8.91分;100kDa)、及びB(10.01分;50kDa)を表すピークが存在した。5mM TCEPを添加すると、150kDaタンパク質と一致する8.43分の新しいピークにより示されるa2b複合体の形成が、迅速にもたらされた(非表示)。この実験では、h679−Fab−AD2(9.72分)に起因するピークが依然として明白だったため、Bが過剰に存在していたことは明らかだったが、a2又はa4のいずれに対応する明白なピークも観察されなかった。1時間の還元後、PBSを数回交換して一晩透析することにより、TCEPを除去した。その結果生じた溶液を10%DMSOに調整し、室温で一晩保持した。
TF1の生成に成功した後、TF2と称する類似体を、C−DDD2−Fab−hMN−14をh679−Fab−AD2と反応させることにより得た。TF2の試験的バッチを、90%を超える収率で以下のように生成した。タンパク質Lで精製したC−DDD2−Fab−hMN−14(200mg)を、1.4:1のモル比でh679−Fab−AD2(60mg)と混合した。総タンパク質濃度は、1mM EDTAを含有するPBS中で1.5mg/mlだった。TCEP還元、HICクロマトグラフィー、DMSO酸化、及びIMP−291アフィニティークロマトグラフィーを伴うその後のステップは、TF1についての記載と同じだった。TCEPを添加する前、SE−HPLCは、a2b形成の痕跡を一切示さなかった(非表示)。その代りに、a4(8.40分;215kDa)、a2(9.32分;107kDa)、及びb(10.33分;50kDa)に対応するピークが存在した。5mM TCEPを添加すると、二元構造の場合に予想される157kDaタンパク質と一致する8.77分の新しいピーク(非表示)により示されるa2b複合体の形成が、迅速にもたらされた。TF2を、IMP−291アフィニティークロマトグラフィーで、ほぼ均質に精製した(非表示)。IMP−291未結合画分をSE−HPLCで分析することにより、a4、a2、及び遊離カッパ鎖が産物から除去されたことを実証した(非表示)。
TF1及びTF2は、血液及び組織で広範な希釈が生じるin vivoで使用することができる安定的に係留された構造であるように設計されていた。ヒト血清中でのTF2の安定性を、BIACOREを使用して評価した。TF2を、4人の供与者から貯溜した新鮮なヒト血清で0.1mg/mlに希釈し、5%CO2下で7日間37℃にてインキュベートした。連日試料を1:25に希釈し、その後IMP−239HSGセンサーチップを使用してBIACOREで分析した。WI2 IgGの注入を使用して、完全で十分に活性なTF2の量を定量化した。血清試料を、原液から直接希釈した対照試料と比較した。TF2は、血清中で高度に安定しており、7日後にその二重特異性結合活性の98%を保持する(非表示)。ヒト又はマウス血清のいずれにおいても、TF1に関して同様の結果が得られた(非表示)。
pdHL2哺乳動物発現ベクターは、多数の組換えIgGの発現を媒介するために使用されている(Qu et al., Methods 2005, 36:84−95)。任意のIgG−pdHL2ベクターの、C−H−AD2−IgG−pdHL2ベクターへの変換を容易にするために、プラスミドシャトルベクターを生成した。pdHL2ベクターをテンプレートとして、オリゴヌクレオチドFc BglII Left及びFc Bam−EcoRI Rightをプライマーとして使用して、Fc(CH2及びCH3ドメイン)の遺伝子を増幅した。
Fc BglII Left
5’−AGATCTGGCGCACCTGAACTCCTG−3’(配列番号86)
Fc Bam−EcoRI Right
5’−GAATTCGGATCCTTTACCCGGAGACAGGGAGAG−3’(配列番号87)
エピラツズマブ、又はhLL2 IgGは、ヒト化抗ヒトCD22 MAbである。C−H−AD2−hLL2 IgGの発現ベクターを、実施例11に記載のようにhLL2 IgG−pdHL2から生成し、エレクトロポレーションによりSp2/0ミエローマ細胞を形質移入するために使用した。形質移入した後、細胞を96ウェルプレートに播種し、トランスジェニッククローンを、メトトレキサートを含有する培地中で選択した。hLL2特異的抗イディオタイプMAbでコーティングされた96ウェルマイクロタイタープレートを使用し、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトIgGで検出するサンドイッチELISAにより、C−H−AD2−hLL2 IgG生産性についてクローンをスクリーニングした。クローンをタンパク質産生用の回転ボトルで増殖させ、C−H−AD2−hLL2 IgGを、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを使用して、一段階で使用済培地から精製した。SE−HPLC分析により、2つのタンパク質ピークが分離された(非表示)。より遅い溶出ピークの滞留時間(8.63分)は、hLL2 IgGに類似していた。より迅速に溶出したピークの滞留時間(7.75分)は、約300kDaタンパク質と一致した。後に、このピークは、ジスルフィドで結合されたC−H−AD2−hLL2−IgGの二量体であることが判明した。この二量体は、DNL反応中にモノマー形態に還元される。SDS−PAGE分析は、精製されたC−H−AD2−hLL2−IgGが、モジュールの単量体形態及びジスルフィドで結合されたモジュールの二量体形態の両方で構成されることを示した(非表示)。これら2つの形態を表すタンパク質バンドは、非還元条件下におけるSDS−PAGEで明白だったが、還元条件下では、全ての形態が、成分ポリペプチド(重鎖−AD2及びカッパ鎖)を表す2つのバンドに還元された(非表示)。他の夾雑物バンドは検出されなかった。
hA20 IgGは、ヒト化抗ヒトCD20 MAbである。C−H−AD2−hA20 IgGの発現ベクターを、実施例27に記載のようにhA20 IgG−pDHL2から生成し、エレクトロポレーションによりSp2/0ミエローマ細胞を形質移入するために使用した。形質移入した後、細胞を96ウェルプレートに播種し、トランスジェニッククローンを、メトトレキサートを含有する培地中で選択した。hA20特異的抗イディオタイプMAbでコーティングされた96ウェルマイクロタイタープレートを使用し、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトIgGで検出するサンドイッチELISAにより、C−H−AD2−hA20 IgG生産性についてクローンをスクリーニングした。クローンをタンパク質産生用の回転ボトルで増殖させ、C−H−AD2−hA20 IgGを、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを使用して、一段階で使用済培地から精製した。SE−HPLC及びSDS−PAGE分析は、実施例28でC−H−AD2−hLL2 IgGについて得られた結果と非常に類似した結果をもたらした。
上記の実施例に記載の技術を使用して、以下のIgG又はFab融合タンパク質を構築し、DNL構築体に組み込んだ。融合タンパク質は、親抗体の抗原結合特徴を保持し、DNL構築体は、組み込んだ抗体又は抗体断片の抗原結合活性を示した。
哺乳動物細胞での発現用IFN−α2b−DDD2−pdHL2の構築
IFN−α2bのcDNA配列をPCRで増幅して、そのC末端で以下の配列のポリペプチドに融合されたIFN−α2bを含む配列がもたらされた:
KSHHHHHHGSGGGGSGGGCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号88)。
IFNA2 Xba I Left
TCTAGACACAGGACCTCATCATGGCCTTGACCTTTGCTTTACTGG(配列番号89)
IFNA2 BamHI right
GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTTTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGC(配列番号90)
IFN−α2b−DDD2−pdHL2を、SalIで消化することにより線形化し、エレクトロポレーションによりSp/ESFミエローマ細胞に安定的に形質移入した。ELISAにより、2つのクローンが、検出可能なレベルのIFN−α2bを有することを見出した。95と称する、2つのクローンのうちの1つは、無血清培地での増殖に適しており、生産性を実質的に減少させなかった。その後そのクローンを、0.1〜0.8μMの増加するMTX濃度で5週間にわたって増幅させた。この段階で、それを限界希釈法によりサブクローニングし、最も多く産生するサブクローン(95−5)を増殖させた。振とうフラスコで増殖させた95−5の生産性は、標準物質として市販のrIFN−α2b(Chemicon社製 IF007、ロット06008039084)を使用して、2.5mg/Lであると推定した。
クローン95−5を、0.8μM MTXを有する合計20Lの無血清ハイブリドーマSFMを含有する34個の回転ボトルで増殖して、最終培養に到達させた。培養ブロスを処理し、IFN−α2b−DDD2を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)で以下のように精製した。上清液を遠心分離で清澄化し、0.2μMろ過し、1×結合緩衝液(10mMイミダゾール、0.5M NaCl、50mM NaH2PO4、pH7.5)にダイアフィルトレーションし、310mLに濃縮し、Tween20を終濃度が0.1%になるように添加し、30mL Ni−NTAカラムに負荷した。試料を負荷した後、カラムを、500mLの1×結合緩衝液中0.02%Tween20で洗浄し、その後290mLの30mMイミダゾール、0.02%Tween20、0.5M NaCl、50mM NaH2PO4、pH7.5で洗浄した。産物を、110mLの250mMイミダゾール、0.02%Tween20、150mM NaCl、50mM NaH2PO4、pH7.5で溶出した。およそ6mgのIFNα2b−DDD2を精製した。
また、IFN−α2b−DDD2を、微生物発酵により大腸菌中の可溶性タンパク質として発現させた。IFN−α2b−DDD2−pdHL2 DNAをテンプレートとして使用して、コード配列をPCRで増幅した。アンプライマーを、NdeI及びXhoI制限部位を使用して、pET26b大腸菌発現ベクターにクローニングした。LB振とうフラスコを18℃にて12時間100μMのIPTGで誘導することにより、タンパク質をBL21pLysS宿主細胞で細胞内発現させた。可溶性IFN−α2b−DDD2を、上述のように細胞溶解産物からIMACで精製した。
1つのCH3−AD2−IgGに結合された4つのコピーのIFNα2b−DDD2を含む20−2bと称するDNL構築体を、各々がSp/ESFで発現された2つのDNLモジュール、CH3−AD2−IgG−v−mab及びIFNα2b−DDD2を組み合わせることによるDNLで産生した。20−2b(ヒト化IgG1+4IFNα2b)と設計が類似しているが、異なる標的化MAbを有する追加的なDNLで生成したMAb−IFNα構築体を、幾つかの実験で対称として使用した。22−2bは、そのAD2モジュールとして、CD22に対して向けられた、リンパ腫に結合するCH3−AD2−IgG−e−mab(エピラツズマブ)を有し、734−2bは、そのAD2モジュールとして、ハプテン、In−DTPAに対して向けられた、動物タンパク質又は組織には一切結合しないCH3−AD2−IgG−h734を有し、R12bは、ヒトインスリン様増殖因子1受容体(IGF−1R)に結合するCH3−AD2−IgG−hR1を使用する。
in vitroでの20−2bのIFNα生物活性を、細胞に基づくリポーター、ウイルス防御、及びリンパ腫増殖アッセイを使用して、市販のペグ化IFNα2作用剤、PEGASYS、及びPEG−イントロンのIFNα生物活性と比較した。比活性は、インターフェロン刺激応答エレメントに融合されたレポーター遺伝子を保持するトランスジェニックヒト前単球細胞系を使用する、細胞に基づくキットを使用して決定した(図1A〜1D)。20−2bの比活性(5300IU/pmol)は、PEGASYS(170IU/pmol)及びPEG−イントロン(3400IU/pmol)の両方より大きかった(図1A)。20−2bと同様に産生した734−2b、1R−2b、及び5つの更なるMAb−IFNα構築体(データ非表示)は、各々が同様の比活性(4000〜8000IU/pmol)を示し、そのような構造を生成するためのDNL法の一貫性を実証した(図1A)。4つのIFNα2b群を有することは、MAb−IFNαの効力増強に寄与した。IFNα当量に正規化すると、比活性/IFNαは、PEGASYSよりも約10倍大きく、PEG−イントロンより約2倍低いに過ぎなかった。
IFNαは、NK細胞及びマクロファージを活性化することにより、抗CD20免疫療法の基本的作用機構(MOA)であるADCC活性を強化することができる。本発明者らは、末梢血単核細胞(PBMC)をエフェクター細胞として使用して、20−2b及びv−mabのADCCを2つのNHL細胞系で比較した。複数の供与者に由来するPBMCを使用した重複アッセイは、Daudi及びRaji細胞の両方について示されたように、v−mabと比較して、20−2bがADCCを増強したことを一貫して実証した(図3A)。この効果は、わずかなADCCを示す(Carnahan et al., 2007, Mol Immunol 44:1331−41)、抗CD22 MAb、エピラツズマブを含むMAb−IFNαである22−2bでも示された。
CDCは、I型の抗CD20 MAb(v−mab及びリツキシマブを含む)の重要なMOAであると考えられている。しかしながら、この機能は、トシツモマブにより代表されるII型のMAbには欠如しており(Cardarelli et al., 2002, Cancer Immunol Immunother 51:15−24)、にもかかわらず、それは抗リンパ腫活性を有する。v−mabとは異なり、20−2bは、in vitroでCDC活性を示さない(図3B)。これらの結果は、補体結合が恐らくは立体障害により明らかに損なわれるCH3−AD2−IgG−v−mabモジュールに基づく他のDNL構造の結果と一致している。
20−2bの薬物動態学的(PK)特性を、雄Swiss−Websterマウスで評価し、PEGASYS、PEG−イントロン、及びα2b−413(DNLにより製作されたペグ化IFN、米国特許出願第11/925,408号を参照)の薬物動態学的特性と比較した。種々の時点における血清試料中のIFN−αの濃度を、ELISAで決定した。IFNα2b比活性を、製造業者(PBL Interferon Source社)の示唆するプロトコールに従って、iLiteヒトインターフェロンアルファ細胞ベースアッセイキットを使用して決定した。図2は、他の作用剤と比較して、20−2bの著しくより遅い除去及びより長い血清残留を示したPK分析の結果を示す。210pmolの注射用量では、時間で計算された薬物動態学的血清半減期は、8.0時間(20−2b)、5.7時間(α2b−413)、4.7時間(PEGASYS)、及び2.6時間(PEG−イントロン)だった。除去速度(1/時間)は、0.087(20−2b)、0.121(α2b−413)、0.149(PEGASYS)、及び0.265(PEG−イントロン)だった。計算されたMRT0.08→∞(時間)は、22.2(20−2b)、12.5(α2b−413)、10.7(PEGASYS)、及び6.0(PEG−イントロン)だった。薬物動態パラメーターは、個々の抗体又はサイトカインよりも複合体の性質により決定されるため、サイトカイン−DNL複合体のPK特徴は、他のサイトカイン部分及び抗体部分に一般化され、上記で考察された特定の20−2b構築体に限定されないことが予想される。
血清安定性
20−2bは、37℃のヒト血清(10日以上)又は全血(6日以上)中で安定していた(非表示)。20−2b複合体の濃度は、二重特異性ELISAアッセイを使用して決定した。アッセイ期間にわたって、全血又は血清のいずれかにおいても血清20−2bレベルに検出可能な変化は本質的に存在しなかった。
本発明者らは、全血由来のリンパ腫又は正常B細胞を除去する、20−2b、v−mab、734−2b、又はv−mab+734−2bの能力をex vivoの設定で比較した(図4)。ネイクド抗CD20 MAbの治療効能は、3つの作用機序(MOA):シグナル伝達誘導性アポトーシス又は増殖停止、ADCC、及びCDCにより達成されると考えられている(Glennie et al., 2007, Mol Immunol 44:3823−37)。このアッセイでは、v−mabは、3つのMOAを全て使用することができるが、in vitroの知見に基づくと、20−2bは、シグナル伝達及びADCC増強を活用できる可能性はあるが、CDCを活用できない。この短期のモデルでは、20−2b及び734−2bのIFNα2b群は、腫瘍細胞に直接的に作用し、v−mabのADCC活性を増大させ、恐らくは幾つかの免疫賦活性効果を示すことができる。しかしながら、in vivoで生じる可能性がある、先天性免疫系及び適応免疫系のIFNα−媒介性活性化の完全な範囲は、この2日間のex vivoアッセイでは理解されない。
マウスモデルの制限は、ヒトIFNα2bに対するマウス細胞の感受性が非常に低いことである。ヒトで達成される可能性がある20−2bの全体的な治療上の利点は、先天性免疫及び適応免疫の両方の増強を伴う場合がある。これらの制限を念頭において、本発明者らは、SCIDマウスにおける播種性バーキットリンパ腫モデルに対する20−2bの抗リンパ腫in vivo効能を研究した。本発明者らは、最初に、高度に感受性の初期Daudiモデルを試験した(図5A)。接種の1日後に、単回低用量の20−2b、v−mab、又は734−2bを群に投与した。0.7pmol(170ng)のv−mab又は734−2bの単回投与は、v−mabの代わりの生理食塩水と比較して、生存の有意な向上をもたらしたが(P<0.0001)、無関係のMAb−IFNα対照、734−2bの代わりの生理食塩水との比較では向上をもたらさなかった(図5A)。この向上は、わずかであり、生存期間中央値(MST)は、生理食塩水の場合の27日からv−mabの場合の34日に増加した。しかしながら、0.7pmol(170ng)の20−2bの単回投与は、生理食塩水及びv−mab群の両方よりも100日を超えてMSTを向上させた(P<0.0001)(図5A)。この研究は19週後に終了し、その時点で、0.7pmolの20−2b治療群の7匹の長期生存動物(LTS)を剖検して、目に見える疾患の痕跡が無い(治癒した)ことを見出した(図5A)。驚くべきことに、0.07pmol(17ng)という低用量の20−2bでさえ、MSTは2倍を超えた(図5A)。
これらの結果は、抗CD20 MAbでIFNαを標的化することにより、免疫サイトカインが、いずれか一方の作用剤単独又は組み合わせよりも強力で効果的になることを疑いの余地無く実証する。腫瘍に対するIFNαのMAb標的化は、単一作用剤の投与スケジュールをより低頻度にし、IFN治療に伴う副作用を低減又は排除し、効能の顕著な増強をもたらすことができる可能性がある。加えて、標的とされたIFNαは、急性腫瘍に向けられる免疫応答を誘導し、恐らくは先天性免疫及び適応免疫の多面的刺激により免疫記憶を誘起することができる(Belardelli et al, 2002, Cytokine Growth Factor Rev 12:119−34)。他のグループは、そのような構築体の潜在的な臨床利益の幾つかを明らかにした化学的結合により製作されたMAb−IFNαを生成している(Pelham et al., 1983, Cancer Immunol Immunother 15:210−16;Ozzello et al., 1998, Breast Cancer Res Treat 48:135−47)。マウスIFNα及び抗HER2/neu MAbを含む組換えMAb−IFNαは、免疫応答性マウスにおいて、トランスジェニック(HER2/neu)マウスB細胞リンパ腫の強力な阻害を示し、免疫記憶による防御的適応免疫応答を誘導することもできた(Huang et al., 2007, J Immunol 179:6881−88)。
哺乳動物細胞での発現用EPO−DDD2−pdHL2の構築
EPOのcDNA配列をPCRで増幅し、そのC末端で、以下のもので構成されるポリペプチドに融合されたEPOがもたらされた:
KSHHHHHHGSGGGGSGGGCGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(配列番号88)
EPO Xba I left
TCTAGACACAGGACCTCATCATGGGGGTGCACGAATGTCC(配列番号91)
EPO BamHI Right
GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTTCTGTCCCCTGTCCTGCAG(配列番号92)
EPO−pdHL2を、SalI酵素で消化することにより線形化し、エレクトロポレーションによりSp/ESFミエローマ細胞に安定的に形質移入した。クローンを、0.15μM MTXを含有する培地で選択した。クローン番号41、49、及び37は各々、Nunc Immobilizerニッケルキレートプレートを使用してHisタグ融合タンパク質を捕捉し、抗EPO抗体で検出するELISAにより、約0.5mg/LのEPOを産生することが示された。およそ2.5mgのEPO−DDD2を、9.6リットルの無血清回転ボトル培養からIMACで精製した。
734−EPOを、20−2bについて上述したように産生した。プロテインAで精製した734−EPOのSE−HPLC分析は、主要ピーク及びより高い分子サイズのショルダー部分を示した(非表示)。主要ピークの滞留時間は、IgG及び4つのEPO群で構成される共有結合性複合体と一致した。ショルダー部分は、IgG−EPO結合体の非共有結合性二量体による可能性が高い。クマシーブルー染色によるSDS−PAGE分析及び抗EPO免疫ブロット分析は、非還元条件下では、産物が260kDaを超えるMrを有し(非表示)、約310kDaの推定MWと一致したことを示した。還元条件下では、734−EPOの3つの成分ポリペプチド(EPO−DDD2、重鎖−AD2、及び軽鎖)に対応するバンドが明白であり、量的に同様であると考えられた(非表示)。非産物夾雑物は検出されなかった。
哺乳動物細胞での発現用G−CSF−DDD2−pdHL2の構築
G−CSFのcDNA配列をPCRで増幅し、そのC末端で、配列番号88で構成されるポリペプチドに融合されたG−CSFがもたらされた。PCR増幅は、全長ヒトG−CSF cDNAクローン(Invitrogen IMAGE ヒト カタログ番号97002RG クローンID5759022)をテンプレートとして使用し、以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して達成された:
G−CSF XbaI Left
TCTAGACACAGGACCTCATCATGGCTGGACCTGCCACCCAG(配列番号93)
G−CSF BamHI−Right
GGATCCATGATGGTGATGATGGTGTGACTTGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG(配列番号94)。
G−CSF−pdHL2を、SalI酵素で消化することにより線形化し、エレクトロポレーションによりSp/ESFミエローマ細胞に安定的に形質移入した。クローンを、0.15μM MTXを含有する培地で選択した。クローン番号4は、サンドイッチELISAにより、0.15mg/LのG−CSF−DDD2を産生することが示された。
クローン番号4を、0.4μM MTXを有する合計20LのハイブリドーマSFMを含有する34個の回転ボトルで増殖して、最終培養に到達させた。上清液を遠心分離で清澄化し、ろ過し(0.2μM)、1×結合緩衝液(10mMイミダゾール、0.5M NaCl、50mM NaH2PO4、pH7.5)にダイアフィルトレーションし、濃縮した。濃縮物をIMACで精製した。
また、G−CSF−DDD2を、微生物発酵により大腸菌中の可溶性タンパク質として発現させた。G−CSF−DDD2−pdHL2 DNAをテンプレートとして使用して、コード配列をPCRで増幅した。アンプライマーを、NdeI及びXhoI制限部位を使用して、pET26b大腸菌発現ベクターにクローニングした。LB振とうフラスコを18℃にて12時間100μMのIPTGで誘導することにより、タンパク質をBL21pLysS宿主細胞で細胞内発現させた。可溶性G−CSF−DDD2を、細胞溶解産物からIMACで精製した。
代替的G−CSF−DDD2モジュールを、17位の非対形成システイン残基がセリンに置換されていることにより野生型と異なるG−CSF(C17S)のN末端にDDD2配列及びペプチドスペーサーを融合させることにより製作した。N−DDD2−G−CSF(C17S)を、大腸菌で発現させ、IMACで精製した。
酸化還元条件下でCH3−AD2−IgG−hR1を過剰N−DDD2−G−CSF(C17S)と混合し、その後プロテインAアフィニティークロマトグラフィーで精製することにより、hR1−17Sを産生した。プロテインAで精製したhR1−17SのSE−HPLC分析は、主要ピーク及びより高い分子サイズのショルダー部分を示した(非表示)。主要ピークの滞留時間は、IgG及び4つのG−CSF群で構成される共有結合性複合体と一致した。ショルダー部分は、IgG−G−CSF結合体の非共有結合性二量体による可能性が高い。クマシーブルー染色によるSDS−PAGE分析及び抗G−CSF免疫ブロット分析は、非還元条件下では、産物が約260kDaの還元MWと一致したMrを有することを示した。還元条件下では、hR1−17Sの3つの成分ポリペプチド(N−DDD2−G−CSF(C17S)、重鎖−AD2、及び軽鎖)を表すバンドが検出された(非表示)。
上記で考察したように、ヒト化抗CD20 mAbであるベルツズマブに共有結合で結合された四量体IFN−α2bを含むようにドック−アンド−ロック(DNL)法により生成された単一特異性免疫サイトカインである20−2bは、in vitro及びヒトリンパ腫異種移植片において非常に強力な抗腫瘍活性を示した。しかしながら、CD20をほとんど又は全く発現しないリンパ腫及び白血病は、20−2bによる治療に耐性であることが予想される。HLA−DRは、多くの造血器腫瘍及び幾つかの固形癌で発現される。CD20及びHLA−DRの両方に対してIFN−αを標的化することができる二重特異性免疫サイトカインは、CD20、HLA−DR、又はその両方を発現するものを含む幅広く多様な造血器悪性疾患に対するより有効な治療薬であり得る。多機能性複合体の各成分(ベルツズマブ、抗HLA−DR F(ab)2、及びIFN−α2b)は、独立して抗腫瘍活性を有するため、本発明者らは、二重特異性免疫サイトカインが、潜在的に、単一特異性免疫サイトカイン、20−2bよりも更により強力であり得るか否かを評価した。
抗体及び細胞培養。以下の考察で使用される略語は以下の通りである:20(CH3−AD2−IgG−v−mab、抗CD20 IgG DNLモジュール);C2(CH1−DDD2−Fab−hL243、抗HLA−DR Fab2 DNLモジュール);2b(二量体IFNα2B−DDD2 DNLモジュール);734(非標的化対照として使用される抗in−DTPA IgG DNLモジュール)。以下のMAbは、Immunomedics,Inc.社から提供された:ベルツズマブ又はv−mab(抗CD20 IgG1)、hL243γ4p(Immu−114、抗HLA−DR IgG4)、マウス抗IFNα MAb、及びv−mab(WR2)及びhL243(WT)に対するラット抗イディオタイプMAb。加熱不活性化FBSは、Hyclone社(ローガン、ユタ州)から得た。他の細胞培養培地及び補完剤は全て、Invitrogen Life Technologies社(カールズバッド、カリフォルニア州)から購入した。
20−C2−2bの精製及び特徴付け。二重特異性MAb−IFNαは、IgG−AD2モジュール、CH3−AD2−IgG−v−mabを、2つの異なる二量体DDDモジュール、CH1−DDD2−Fab−hL243、及びIFNα2b−DDD2と混合することにより生成した。いずれかのDDDモジュールと2つのAD2群が無作為に結合するため、20−C2−2bに加えて、2つの副産物、20−C2−C2及び20−2b−2bが形成されることが予想される。
本発明者ら及び他者は、CD20を標的とするMAb及びIFNαを含む融合タンパク質が、異種移植片及び同系マウスモデルにおいて、MAb及びIFNαの組み合わせと比較して、NHLに対してより有効であり、MAb−IFNαが、IFNαに伴う毒性及びPk制限を克服することができることを示したことを報告している(Rossi et al., Blood 2009;114:3864−71;Xuan et al., Blood 2010;115:2864−71)。CD20は、B細胞リンパ腫の標的化MAb−IFNα治療の魅力的な候補であるが、その発現は、大部分がこの系統の悪性疾患に制限されており、幾つかの個体は低抗原密度を示す。本明細書において、本発明者らは、IFNα2bをCD20及びHLA−DRの両方に特異的に標的化し、従ってこの免疫サイトカイン治療に応答する造血器腫瘍タイプを拡張する可能性がある最初の二重特異性免疫サイトカイン、20−C2−2bを報告する。
Claims (25)
- 3つの異なるエフェクター部分を含むDNL(ドックアンドロック)構築体であって、前記エフェクター部分が、タンパク質キナーゼA(PKA)に由来する2つのDDD(二量体化及びドッキングドメイン)部分、及びAKAPタンパク質に由来する1つのAD(アンカードメイン)部分に結合されており、前記2つのDDD部分が、二量体を形成し、前記AD部分に結合して、前記DNL構築体を形成するDNL構築体。
- 前記DDD部分が、ヒトRIα、RIβ、RIIα、又はRIIβ PKAに由来するアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のDNL構築体。
- 前記エフェクター部分が、第1の抗体又は抗体断片、第2の抗体又は抗体断片、及び1つ又は複数コピーのサイトカインを含む、請求項1に記載のDNL構築体。
- 前記第1の抗体又は抗体断片及び前記第2の抗体又は抗体断片が、2つの異なる抗原に結合する、請求項3に記載のDNL構築体。
- 前記第1及び第2の抗体又は抗体断片が、炭酸脱水酵素IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF−1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a〜e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM−6、B7、フィブロネクチンのED−B、H因子、FHL−1、Flt−3、葉酸受容体、GROB、HMGB−1、低酸素誘導因子(HIF)、HM1.24、インスリン様増殖因子−1(ILGF−1)、IFN−γ、IFN−α、IFN−β、IL−2、IL−4R、IL−6R、IL−13R、IL−15R、IL−17R、IL−18R、IL−6、IL−8、IL−12、IL−15、IL−17、IL−18、IL−25、IP−10、MAGE、mCRP、MCP−1、MIP−1A、MIP−1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA−95、NCA−90、Ia、HM1.24、EGP−1、EGP−2、HLA−DR、テネイシン、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson−Friedenreich抗原、腫瘍壊死抗原、TNF−α、TRAIL受容体(R1及びR2)、VEGFR、EGFR、PlGF、補体成分C3、C3a、C3b、C5a、C5、及び癌遺伝子産物からなる群から選択される抗原に結合する、請求項4に記載のDNL構築体。
- 前記第1及び第2の抗体又は抗体断片が、hR1(抗IGF−1R)、hPAM4(抗ムチン)、hA20(抗CD20)、hA19(抗CD19)、hIMMU31(抗AFP)、hLL1(抗CD74)、hLL2(抗CD22)、hMu−9(抗CSAp)、hL243(抗HLA−DR)、hMN−14(抗CEACAM5)、hMN−15(抗CEACAM6)、hRS7(抗EGP−1)、及びhMN−3(抗CEACAM6)からなる群から選択される、請求項5に記載のDNL構築体。
- 前記サイトカインが、ヒトMIF(マクロファージ遊走阻止因子)、HMGB−1(高移動度群ボックスタンパク質1)、TNF−α、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−23、IL−24、CCL19、CCL21、IL−8、MCP−1、RANTES、MIP−1A、MIP−1B、ENA−78、MCP−1、IP−10、Gro−β、エオタキシン、インターフェロン−α、−β、−λ、G−CSF、GM−CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt−3リガンド、エリトロポイエチン、トロンボポイエチン、CNTF、レプチン、オンコスタチンM、VEGF、EGF、FGF、PlGF、インスリン、hGH、カルシトニン、第VIII因子、IGF、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲン活性化因子、及びLIFからなる群から選択される、請求項4に記載のDNL構築体。
- 前記第1の抗体又は抗体断片がベルツズマブであり、前記第2の抗体又は抗体断片がhL243であり、前記サイトカインがヒトインターフェロン−α2bである、請求項4に記載のDNL構築体。
- 前記hL243抗体又は抗体断片が、重鎖CDR配列CDR1(NYGMN、配列番号1)、CDR2(WINTYTREPTYADDFKG、配列番号2)、及びCDR3(DITAVVPTGFDY、配列番号3)、並びに軽鎖CDR配列CDR1(RASENIYSNLA、配列番号4)、CDR2(AASNLAD、配列番号5)、及びCDR3(QHFWTTPWA、配列番号6)を含む、請求項8に記載のDNL構築体。
- 前記3つのエフェクター部分が、融合タンパク質であり、各融合タンパク質がAD及びDDD部分を含む、請求項1に記載のDNL構築体。
- 前記エフェクター部分が、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原結合性抗体、免疫調節物質、サイトカイン、ホルモン、酵素、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、毒素、リボヌクレアーゼ、異種抗原、ポリエチレングリコール(PEG)、抗血管新生作用剤、細胞毒性剤、及びアポトーシス促進剤からなる群から選択される、請求項1に記載のDNL構築体。
- 前記DDD部分が、配列番号13、配列番号14、配列番号17、配列番号18、配列番号20の最初の44個アミノ酸、配列番号21の最初の44個アミノ酸、配列番号22、又は配列番号59のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のDNL構築体。
- 前記AD部分が、配列番号15、配列番号16、配列番号19、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、M配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、又は配列番号58のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のDNL構築体。
- サイトカインを対象体に投与する方法であって、請求項4に記載のDNL複合体を対象体に投与することを含む方法。
- 前記第1及び第2の抗体又は抗体断片が、炭酸脱水酵素IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF−1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a〜e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM−6、B7、フィブロネクチンのED−B、H因子、FHL−1、Flt−3、葉酸受容体、GROB、HMGB−1、低酸素誘導因子(HIF)、HM1.24、インスリン様増殖因子−1(ILGF−1)、IFN−γ、IFN−α、IFN−β、IL−2、IL−4R、IL−6R、IL−13R、IL−15R、IL−17R、IL−18R、IL−6、IL−8、IL−12、IL−15、IL−17、IL−18、IL−25、IP−10、MAGE、mCRP、MCP−1、MIP−1A、MIP−1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA−95、NCA−90、Ia、HM1.24、EGP−1、EGP−2、HLA−DR、テネイシン、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson−Friedenreich抗原、腫瘍壊死抗原、TNF−α、TRAIL受容体(R1及びR2)、VEGFR、EGFR、PlGF、補体成分C3、C3a、C3b、C5a、C5、及び癌遺伝子産物からなる群から選択される抗原に結合する、請求項14に記載の方法。
- 前記第1及び第2の抗体又は抗体断片が、hR1(抗IGF−1R)、hPAM4(抗ムチン)、hA20(抗CD20)、hA19(抗CD19)、hIMMU31(抗AFP)、hLL1(抗CD74)、hLL2(抗CD22)、hMu−9(抗CSAp)、hL243(抗HLA−DR)、hMN−14(抗CEA)、hMN−15(抗CEA)、hRS7(抗EGP−1)、及びhMN−3(抗CEA)からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記サイトカインが、ヒトMIF(マクロファージ遊走阻止因子)、HMGB−1(高移動度群ボックスタンパク質1)、TNF−α、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−23、IL−24、CCL19、CCL21、IL−8、MCP−1、RANTES、MIP−1A、MIP−1B、ENA−78、MCP−1、IP−10、Gro−β、エオタキシン、インターフェロン−α、−β、−λ、G−CSF、GM−CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt−3リガンド、エリトロポイエチン、トロンボポイエチン、CNTF、レプチン、オンコスタチンM、VEGF、EGF、FGF、PlGF、インスリン、hGH、カルシトニン、第VIII因子、IGF、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲン活性化因子、及びLIFからなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記第1の抗体又は抗体断片がベルツズマブであり、前記第2の抗体又は抗体断片がhL243であり、前記サイトカインがヒトインターフェロン−α2bである、請求項14に記載の方法。
- 癌、免疫機能不全、及び自己免疫疾患からなる群から選択される疾患を治療する方法であって、請求項1に記載のDNL構築体を、前記疾患を有する対象体に投与することを含む方法。
- 前記癌が、非ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、B細胞白血病、T細胞リンパ腫、T細胞白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ヘアリーセル白血病、急性骨髄白血病、慢性骨髄白血病、多発性骨髄腫、神経膠腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、癌腫、メラノーマ、肉腫、神経膠腫、皮膚癌、口腔癌、消化器癌、肺管癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膀胱癌、膵臓癌、骨癌、肝臓癌、胆嚢癌、腎臓癌、及び精巣癌からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シドナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、狼瘡性腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IgA腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓性血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎/多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、又は線維化性肺胞炎からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記第1及び第2の抗体又は抗体断片が、炭酸脱水酵素IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD11A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF−1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a〜e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM−6、B7、フィブロネクチンのED−B、H因子、FHL−1、Flt−3、葉酸受容体、GROB、HMGB−1、低酸素誘導因子(HIF)、HM1.24、インスリン様増殖因子−1(ILGF−1)、IFN−γ、IFN−α、IFN−β、IL−2、IL−4R、IL−6R、IL−13R、IL−15R、IL−17R、IL−18R、IL−6、IL−8、IL−12、IL−15、IL−17、IL−18、IL−25、IP−10、MAGE、mCRP、MCP−1、MIP−1A、MIP−1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4抗原、NCA−95、NCA−90、Ia、HM1.24、EGP−1、EGP−2、HLA−DR、テネイシン、Le(y)、RANTES、T101、TAC、Tn抗原、Thomson−Friedenreich抗原、腫瘍壊死抗原、TNF−α、TRAIL受容体(R1及びR2)、VEGFR、EGFR、PlGF、補体成分C3、C3a、C3b、C5a、C5、及び癌遺伝子産物からなる群から選択される抗原に結合する、請求項19に記載の方法。
- 前記第1及び第2の抗体又は抗体断片が、hR1(抗IGF−1R)、hPAM4(抗ムチン)、hA20(抗CD20)、hA19(抗CD19)、hIMMU31(抗AFP)、hLL1(抗CD74)、hLL2(抗CD22)、hMu−9(抗CSAp)、hL243(抗HLA−DR)、hMN−14(抗CEA)、hMN−15(抗CEA)、hRS7(抗EGP−1)、及びhMN−3(抗CEA)からなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記サイトカインが、ヒトMIF(マクロファージ遊走阻止因子)、HMGB−1(高移動度群ボックスタンパク質1)、TNF−α、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12、IL−13、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−23、IL−24、CCL19、CCL21、IL−8、MCP−1、RANTES、MIP−1A、MIP−1B、ENA−78、MCP−1、IP−10、Gro−β、エオタキシン、インターフェロン−α、−β、−λ、G−CSF、GM−CSF、SCF、PDGF、MSF、Flt−3リガンド、エリトロポイエチン、トロンボポイエチン、CNTF、レプチン、オンコスタチンM、VEGF、EGF、FGF、PlGF、インスリン、hGH、カルシトニン、第VIII因子、IGF、ソマトスタチン、組織プラスミノーゲン活性化因子、及びLIFからなる群から選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記第1の抗体又は抗体断片がベルツズマブであり、前記第2の抗体又は抗体断片がhL243であり、前記サイトカインがヒトインターフェロン−α2bである、請求項19に記載の方法。
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