CN108601819B - 用死亡受体激动剂改善系统性硬化症 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于治疗和/或预防自身免疫纤维化，如系统性硬化症(SSc；硬皮病)的方法和组合物。该方法包括向有需要的受试者给予有效量的死亡受体激动剂。适合的死亡受体激动剂包括肿瘤坏死因子(TNF)相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)、激动死亡受体抗体以及其变异体、类似物或衍生物。该死亡受体激动剂的该给予阻断成纤维细胞或促纤维发生细胞活化和/或减少或耗尽肌成纤维细胞，进而减少或预防系统性硬化症。

Description

用死亡受体激动剂改善系统性硬化症
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2015年12月17日提交的美国临时申请第62/268,637号的优先权益，该美国临时申请以全文引用的方式并入本文中。
关于联邦政府资助的研究的陈述
本发明是在政府支持下在由国防部(DOD)授予的CA130460下进行的。政府拥有本发明的某些权利。
序列表的参考
以2016年12月14日创建的名称为“JHU_C_13722_ST25.txt”并且大小为2,872个字节的文本文件形式提交的序列表依据37C.F.R.§1.52(e)(5)在此以引用的方式并入。
技术领域
本发明大体上针对用于用死亡受体激动剂治疗自身免疫纤维化疾病的组合物和方法。
背景技术
纤维化是指归因于组织硬化由正常功能丢失所导致的病况，其中结缔组织块(包括组织组分，如胶原蛋白)增加并且正常组织由结缔组织替换。纤维化可能在肝、肺、肾、心脏、皮肤和其它组织中发生。
还被称为硬皮病的系统性硬化症(SSc)是罕见的自身免疫和风湿性病症(McMahanZH等人，《自然·风湿病学综述(Nat Rev Rhuematol)》；9(2)：90-100(20130和Varga J等人，《临床研究杂志(J.Clin Invest)》；117(3)：557-567(2007))。SSc通过纤维化来诱导结缔组织的硬化(Ho YY等人，《自然·风湿病学综述》；10(7)：390-402(20140和Bhattacharyya S等人，《自然·风湿病学综述》；8(1)：42-54(2012))，影响大多数可见身体部位(如面部和手部)的皮肤并且呈弥漫性形式的细胞外基质(ECM)蛋白质积累可能会导致几乎任何内脏(包括肺、心脏、肾和胃)的严重功能障碍和衰竭。因此，这种免疫疾病的症状包括皮肤和内脏(包括肝、肺、肾、胃肠道和心脏)的纤维化。这些症状常常可能会使患者衰弱。SSc发病率在全世界大不相同，估计有250万患者。在无标准治疗的任何风湿性病况中，SSc的死亡率最高(Nikpour M等人，《风湿病学新见(Curr Opin Rheumatol)》；26(2)：131-137(2014))。在本文的本公开之前，不存在改善和/或预防受SSc影响的皮肤纤维化和内脏纤维化的疗法。因此，对SSc疗法的需要显著未满足，因为未出现药物。
发明内容
本公开至少部分基于鉴别用于治疗或预防如系统性硬化症(SSc)的纤维化自身免疫疾病或病症的组合物和方法。在不希望受理论束缚的情况下，相信本公开的方法和组合物通过选择性地靶向肌成纤维细胞(例如，活化的成纤维细胞)来作用，所述肌成纤维细胞是参与如SSc的纤维化疾病和/或肝、肺、肾、心脏、胃肠道、皮肤的纤维化病况的确立和/或进展的关键细胞，此类纤维化病况任选地与如SSc的病况相关。本文阐述的治疗策略基于鉴别和使用为死亡受体(DR)激动剂、其变异体和/或衍生物以及天然存在的DR激动剂的合成化合物和任选地其它模拟物的药剂。
在一个方面，本公开提供一种治疗或预防哺乳动物受试者的纤维化自身免疫疾病或病症的方法，其通过向受试者给予可有效减轻或预防受试者中的纤维化的量的死亡受体激动剂，从而治疗受试者的纤维化自身免疫疾病或病症。
在一个实施例中，本公开提供一种治疗或预防哺乳动物受试者的纤维化自身免疫疾病或病症的方法。该方法包括向受试者给予死亡受体激动剂，以便抑制和阻断成纤维细胞活化(转变成肌成纤维细胞)，或通过靶向活化的成纤维细胞和/或促纤维发生细胞上的上调死亡受体来耗尽活化的肌成纤维细胞。死亡受体激动剂的实例包括TRAIL和激动死亡受体抗体以及其类似物、变异体、片段和衍生物。活化的成纤维细胞和/或促纤维发生细胞的实例包括疾病进展期间的周细胞和纤维细胞。
在一个实施例中，纤维化自身免疫疾病是系统性硬化症(SSc)。在另一实施例中，SSc是局限性硬皮病或弥漫性硬皮病。
在某些实施例中，DR激动剂是或包括肿瘤坏死因子(TNF)相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)、TRAIL类似物、DR激动抗体或其衍生物。在其它实施例中，DR激动剂是或包括人类重组TRAIL、人类TRAIL类似物或其衍生物，或DR激动剂是或包括天然TRAIL、天然TRAIL类似物或其衍生物。在另一实施例中，DR激动剂包括选自由以下组成的群组的DR4或DR5激动剂中的一种或多种：抗体、嵌合抗体、抗体片段、融合蛋白质和多价药剂。
本公开的另一实施例提供连接到聚合物的DR激动剂。在相关实施例中，聚合物是聚乙二醇(PEG)或其衍生物。PEG或其衍生物可以是甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯、甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯N-羟基琥珀酰亚胺、甲氧基聚乙二醇丙醛和甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺。PEG和其衍生物可以具有线性和/或多支化类型。支化聚合物包括二支化、三支化、多臂、二聚和三聚结构。
PEG或其衍生物的分子量在约1,000Da与100,000Da之间。在另一实施例中，PEG或其衍生物的分子量在约5,000与50,000之间。PEG或其衍生物的分子量可以在约5,000与70,000Da之间，或在约20,000与50,000Da之间，或是属于1,000Da与100,000Da之间的范围内的任何分子量。
可以全身、经肠、肠胃外、局部或通过经颊递送给予DR激动剂。可以局部(如表面或皮下)给予DR激动剂。
在一个实施例中，与适当对照相比，真皮厚度、皮肤胶原蛋白、TGF-β、PDGF、PDGF受体、CTGF的水平和/或α-SMA+成纤维细胞减小、维持在受试者中的正常水平下或恢复到所述正常水平。
在另一实施例中，与适当对照相比，治疗或预防受试者中的纤维化。
在另一实施例中，通过注射以0.01mg/kg与50mg/kg之间，例如0.1到50mg/kg，例如1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg的剂量向受试者给予死亡受体激动剂。在某些实施例中，在一个或多个剂量中给予死亡受体激动剂。任选地，经一天或多天，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、1个月、2个月、3个月、6个月、1年或更久的时间段向受试者给予死亡受体激动剂。在一些情况下，每天给予死亡受体激动剂。在其它情况下，每隔一天给予死亡受体激动剂。
在另一实施例中，受试者是人类。在一些情况下，受试者被鉴别为患有或有风险患上纤维化自身免疫疾病或病症。
本公开还提供一种用于治疗或预防哺乳动物受试者的系统性纤维化疾病或病症的可注射医药组合物，其包括0.1到50mg/kg或0.001％与50％之间的浓度的死亡受体激动剂和医药学上可接受的载剂。
附图说明
图1描绘博莱霉素诱导的系统性硬化症的体内小鼠模型研究的研究设计的示意图。
图2描绘展示真皮厚度的定量评估的条形图。与健康皮肤相比在博莱霉素诱导的皮肤纤维化中真皮的真皮厚度增加大于70％。TRATLPEG减弱真皮厚度的增加并且使其返回到正常水平。###P＜0.001对正常，*P＜0.05对媒剂，***P＜0.001对媒剂。
图3描绘展示病变皮肤中的通过实时PCR定量的CollA1mRNA表达的条形图。观察到与正常小鼠相比，用博莱霉素处理的小鼠中的CollA1和CollA2mRNA水平有3倍增加。TRAILPEG处理显著地减弱胶原蛋白mRNA的上调。###P＜0.001对正常，***P＜0.001对媒剂。
图4描绘展示病变皮肤中的通过实时PCR定量的转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA表达的条形图。TRAILPEG给予大体上预防TGF-β1mRNA上调；#p＜0.05对正常；*p＜0.05对媒剂。
图5描绘展示诱导的肺纤维化中的通过实时PCR定量的CollA1mRNA表达的条形图。结果显示与正常小鼠相比，用博莱霉素处理的小鼠中的CollA1mRNA水平有大于50％增加；#p＜0.05，###p＜0.001对正常；**p＜0.01，***p＜0.001对媒剂。
图6A描绘展示博莱霉素诱导的肺中的通过实时PCR定量的血小板衍生生长因子(PDGF)-αmRNA表达的条形图。结果显示与正常小鼠相比，用博莱霉素处理的小鼠中的PDGFαmRNA水平增加。TRAILPEG处理显著地减弱PDGF-αmRNA的上调；#p＜0.05，###p＜0.001对正常；*p＜0.05，***p＜0.001对媒剂。图6B描绘展示博莱霉素诱导的肺中的通过实时PCR定量的PDGF-βmRNA表达的条形图。结果显示与正常小鼠相比，用博莱霉素处理的小鼠中的PDGF-βmRNA水平增加。TRAILPEG处理显著地减弱PDGF-βmRNA的上调；#p＜0.05，###p＜0.001对正常；*p＜0.05，***p＜0.001对媒剂。
具体实施方式
I.定义
如本文所用，“纤维化自身免疫疾病或病症”是指特征为纤维化的任何自身免疫疾病或病症。系统性硬化症(SSc；硬皮病)是纤维化自身免疫疾病或病症的一种例示形式，肝、肺、肾、心脏、胃肠道、皮肤等的任何自身免疫介导的纤维化也是。
术语“抗体”可以指多克隆抗血清或单克隆抗体。本文所描述的抗体不仅涵盖完整单克隆抗体，而且涵盖免疫活性抗体片段，例如Fab或(Fab)2片段；工程改造的单链FV分子；或嵌合分子，例如含有例如鼠类来源的一种抗体的结合特异性和例如人类来源的另一抗体的剩余部分的抗体。本文所描述的抗体还包括人源化抗体，其中抗体来自非人类物种，其蛋白质序列经过修饰以增加其与人类中天然产生的抗体变异体的类似性。一般来说，人源化抗体在其中引入有一个或多个来自非人类来源的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基在本文中被称为“输入”残基，其典型地取自“输入”抗体结构域、尤其可变结构域。
如本文所用，“激动剂”是增强蛋白质的生物功能的分子。激动剂进而可以结合到靶蛋白质以引发其功能。然而，还预想并不结合蛋白质的激动剂。激动剂可以直接或间接增强或活化蛋白质的生物功能。预想增加某些基因的表达的激动剂在本公开的特定实施例的范围内。适合的激动剂对于本领域的技术人员将是显而易见的。在本公开中，激动剂直接增强靶蛋白质的功能不是必需的。实际上，还预想稳定或增强最终导致靶蛋白质活化的路径上游的一种或多种蛋白质的功能。或者，激动剂可以抑制靶蛋白质的负转录调控子的功能，其中转录调控子在最终抑制靶蛋白质转录的路径上游作用。
“死亡受体”形成肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的子类别，其涵盖八个成员：Fas、TNFR1、神经营养素受体(p75NTR)、外异蛋白-A受体(EDAR)、死亡受体(DR)3、DR4、DR5和DR6。大多数死亡受体已经鉴别了其相应天然配体：TNFR1可以由TNF活化，Fas由Fas配体(FasL)活化，p75NTR由神经生长因子(NGF，基因ID：4803)活化。EDAR的一种配体是外异蛋白-A(EDA，基因ID：1896)。DR3可以由Apo3L(TWEAK/TNFSF12，基因ID：8742)、TL1A/VEGI(血管内皮生长抑制剂/TNFSF15，基因ID：9966)活化，而DR4和DR5共有相同配体，TNF相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)。尚未鉴别DR6的配体。这些配体、其变异体或模拟天然配体的作用的任何分子被视为死亡受体激动剂。这些天然配体和其激动剂中的每一个被视为死亡受体激动剂。
“死亡受体激动剂”在本文定义为能够通过死亡受体中的一种或多种来诱导促细胞凋亡信号传导的任何分子。死亡受体激动剂可以选自由以下组成的群组：抗体、死亡配体、细胞因子、死亡受体激动剂表达载体、肽、小分子激动剂、表达死亡受体激动剂的细胞(例如干细胞)和诱导死亡配体表达的药物。
例示性死亡受体激动剂能够通过一种或多种细胞内路径结合到死亡受体并且诱导细胞凋亡或程序性细胞死亡。例示性充分研究的死亡受体激动剂包括TNF配体家族的成员，除了对组织的保护性和致病性作用之外，其可以在对免疫耐受性的调节和有害作用方面起关键作用(Rieux-Laucat等人，2003，《免疫学新见(Current Opinion inImmunology)》15：325；Mackay和Ambrose，2003，《细胞因子和生长因子综述(Cytokine andgrowth factor reviews)》，14：311；Mackay和Railed，2002，《免疫学新见》，14：783-790)。此类蛋白质的实例包括肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)、Fas配体(FasL)和肿瘤坏死因子(TNF)。例示性死亡受体激动剂在结合到含有跨膜死亡结构域的受体后诱导细胞凋亡。举例来说，TRAIL结合到死亡受体4(DR4；TRAIL受体1)和5(DR5；TRAIL受体2)。存在三种其它TRAIL结合受体，但其被视为“诱饵受体”，因为其呈现为不能传输细胞凋亡信号。诱饵受体1(DcR1)呈现为缺乏跨膜和细胞内结构域并且通过糖基化磷脂酰肌醇尾锚定于质膜。诱饵受体2(DcR2)具有截短并且显然非功能性的死亡结构域，而第三诱饵受体骨保护素是分泌的可溶受体。Fas配体通过结合到Fas(也被称为CD95或Apo-1)诱导细胞凋亡，而DcR3螯合来自Fas的FasL。另一死亡受体激动剂TNF可以通过结合到TNF-受体I(也被称为TNFRI或TNFR55)诱导细胞凋亡。
如本文所用，术语“变异体”是指与参考多肽或多核苷酸不同但保持必需特性的多肽或多核苷酸。多肽的典型变异体的氨基酸序列与另一个参考多肽不同。一般来说，差异是有限的，以使得参考多肽与变异体的序列总体上密切类似并且在许多区中一致。变异体与参考多肽的氨基酸序列的不同可以在于一个或多个修饰(例如，取代、添加和/或缺失)。取代或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基。多肽的变异体可以是天然存在的，如等位基因变异体，或其可以是已知非天然存在的变异体。
“肿瘤坏死因子家族成员”或“肿瘤坏死因子配体家族成员”是能够活化肿瘤坏死因子受体的任何细胞因子。如本文所用，“TRAIL蛋白质”涵盖野生型TRAIL蛋白质和TRAIL变异体。
可以对本公开的多肽的结构进行修饰和改变并且仍获得具有类似于多肽的特征(例如，保守氨基酸取代)的分子。举例来说，某些氨基酸可以取代序列中的其它氨基酸，而无明显活性损失。因为定义多肽的生物功能活性的是多肽的相互作用能力和性质，所以可以对多肽序列进行某些氨基酸序列取代并且仍然获得具有类似特性的多肽。
举例来说，“变异”死亡受体激动剂意味着，该死亡受体激动剂的至少一个氨基酸位置与死亡受体激动剂的野生型序列不同。“变异”TRAIL蛋白质意味着，该TRAIL蛋白质的至少一个氨基酸位置与野生型TRAIL蛋白质(也被称为TNFSFIO，TL2；APO2L；CD253；Apo-2L)，Entrez GenelD：8743；寄存编号NM_003810.2；UniProtKB/Swiss-Prot：P50591；UniProtKB/TrEMBL：Q6IBA9不同。
“药剂”意味着任何小化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”意味着足以治疗、抑制或缓解待治疗疾病状态的一种或多种症状或以其它方式提供所需药理和/或生理作用的剂量。精确剂量将根据多种因素变化，所述因素如受试者依赖性变量(例如，年龄、免疫系统健康等)、疾病或病症和待给予的治疗。有效量的作用可以是相对于对照。此类对照是本领域中已知并且本文论述的，并且可以是例如在给予药物或药物组合之前或在无给予药物或药物组合存在下的受试者病况，或在药物组合的情况下，组合的作用可以与给予仅一种药物的作用相比较。对照还可以是需要药物/治疗但未接受药物/治疗的受试者。
“改善”意味着降低、抑制、减弱、削弱、遏制或稳定疾病的罹患或进展。
在本公开中，“包含(comprises/comprising)”、“含有”和“具有”等可以具有美国专利法中归于其的含义并且可以意味着“包括(includes/including)”等；“基本上由……组成(consisting essentially of/consists essentially)”同样具有美国专利法中归于其的含义并且该术语是开放的，允许存在超过所列举内容，只要所列举内容的基本或新颖特征不因存在超过所列举内容而改变，但排除现有技术实施例。
“检测”是指鉴别待检测的分析物的存在、不存在或量。
“标记物”意味着具有与疾病或病症相关的表达水平或活性变化的任何蛋白质或多核苷酸。
术语“减少”、“抑制”、“缓解”或“降低”相对于对照使用。本领域的技术人员将容易鉴别用于每个实验的适当对照。举例来说，用化合物处理的受试者或细胞的反应与不用化合物处理的受试者或细胞的反应相比降低。
“调节”意味着改变(增加或降低)。此类改变通过标准领域已知的方法(如本文所描述的方法)检测。
本文所提供的范围理解为范围内的所有值的简写。举例来说，1与50之间的范围理解为包括包含以下的任何数值、数值组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包括外源多核苷酸的细胞，无关于用于插入的方法，例如直接吸收、转导或本领域中已知的形成重组宿主细胞的其它方法。外源多核苷酸可以维持为未整合的载体，例如质粒，或者可以整合到宿主基因组中。如本文所用，术语“培养基(medium/media)”包括可以负载或含有任何宿主细胞(包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核宿主细胞、大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属(Pseudomonas)宿主细胞)和细胞内含物的任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性载体。因此，该术语可以涵盖宿主细胞已经生长的培养基，例如，TRAIL已经分泌到其中的培养基，包括增殖步骤之前或之后的培养基。该术语还可以涵盖含有宿主细胞溶解物的缓冲剂或试剂，如在TRAIL在细胞内产生并且宿主细胞溶解或破碎以释放TRAIL的情况下。
“减少”意味着至少10％、25％、50％、75％或100％的负变化。
如本文所用，如“获得药剂”中的“获得”包括合成、购买或以其它方式获取药剂。
“受试者”意味着哺乳动物，包括但不限于人类或非人类哺乳动物，如牛科动物、马科动物、犬科动物、羊科动物或猫科动物。
术语“TRAIL”还包括通过化学手段连接的或表达为融合蛋白质的任一种或多种TRAIL或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、连接子、配体或任何类型的其它生物活性分子的TRAIL异二聚体、同二聚体、异多聚体或同多聚体，以及含有例如特异性缺失或其它修饰但维持生物活性的多肽类似物。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”等是指减轻或改善病症和/或与其相关联的症状(例如，纤维化)。应了解，尽管不排除，但治疗病症或病况不需要病症、病况或与其相关联的症状被完全消除。
如本文所用，术语“预防(prevent/preventing/prevention)”、“预防性治疗”等是指减轻未患有但处于患上病症或病况风险下或易患病症或病况的受试者患上病症或病况的概率。
“参考”意味着标准或对照状况。
除非具体陈述或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“或”理解为包括性的。除非具体陈述或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“一(a/an)”和“该”理解为单数或复数。
除非具体陈述或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“约”理解为在本领域中的一般公差范围内，例如在平均值的2倍标准差内。“约”可以理解为在陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非另外从上下文清楚可见，否则本文所提供的所有数值都通过术语约来修饰。
本文中的变量的任何定义下的化学基团的列表的引述包括任何单一基团或所列基团组合形式的该变量的定义。本文中的变量或方面的实施例的引述包括任何单一实施例或与任何其它实施例或其部分组合形式的该实施例。
本文所提供的任何组合物或方法可以与本文所提供的任何其它组合物和方法中的一种或多种组合。
本领域的技术人员从以下详细描述和权利要求书将显而易知本发明的其它特征和优点。
从其优选实施例的以下描述和权利要求书将显而易知本发明的其它特征和优点。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管可以在本发明的实践或测试中使用类似于或等效于本文所描述的方法和材料的方法和材料，但适合的方法和材料描述如下。本文所引用的所有公开的外国专利和专利申请都以引用的方式并入本文中。由本文所引用的寄存编号指示的Genbank和NCBI提交以引用的方式并入本文中。本文所引用的所有其它公开的参考文献、文档、文稿和科学文献都以引用的方式并入本文中。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅仅是说明性的并且不打算是限制性的。
II.组合物
TRAIL(肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体，基因名称TNFSF10)是可以诱导表达其同源死亡受体(DR)，DR4(基因名称TNFRSF10A)和DR5(基因名称TNFRSF10B)的细胞的细胞凋亡的死亡配体(Johnstone RW等人，《自然·癌症综述(Nat Rev Cancer)》；8(10)：782-798(2008))。归因于其选择性地诱导DR+癌细胞中的DR介导的细胞凋亡同时对正常细胞不展示明显毒性的独特能力，已经针对癌症疗法主动地研究重组TRAIL和DR激动抗体。TRAIL的临床研究在人类中展现广泛耐受性但未能在肿瘤学中展现稳定治疗益处(Lemke J等人，《细胞死亡与分化(Cell Death Differ)》；21(9)：1350-1364(2014))。造成癌症患者中使用的TRAIL的令人失望的结果的主要因素是1)其短半衰期(在人类中少于30分钟)和2)异质原发性癌症通常是TRATL抗性的。活化的原代人类肝和胰星形细胞而非休眠星形细胞归因于上调的DR4和DR5变得对TRAIL诱导的细胞凋亡高度灵敏(美国专利申请公开第US 2016/0022776号)。活化的HSC和PSC被视为肝和胰纤维化的祖细胞。
SSc中的纤维化背后的致病机制是复杂的并且很大程度上未知的。然而，肌成纤维细胞(MFB)显然是这种病症的显著起因之一(Ho YY等人，《自然·风湿病学综述》；10(7)：390-402(2014)和Bhattacharyya S等人，《自然·风湿病学综述》；8(1)：42-54(2012))。在慢性皮肤损伤或疾病期间，滞留成纤维细胞经历活化并且转化为增殖性、纤维发生和收缩性α-SMA+MFB，其积累在活性纤维化的前缘。MFB合成胶原蛋白和其它ECM组分以及多种纤维发生组分以协调和保持皮肤纤维发生的能力增加。本性上，MFB是皮肤纤维化/SSc疗法的主要上游标靶。因此，设计可以消除SSc的祖细胞MFB同时留下正常细胞的高度选择性药剂可以产生显著的抗纤维化作用。然而，缺乏选择性地靶向体内的MFB的稳定方式妨碍了这种策略。需要在SSc进展期间耗尽α-SMA+MFB同时保留正常细胞未受伤害的新策略。
需要改善和/或预防受系统性硬化症影响的皮肤纤维化和内脏纤维化的疗法。
因此，本发明的目标是提供用于治疗或预防系统性硬化症而无脱靶毒性的组合物和方法。
本发明的另一目标是提供用于减少或阻断系统性硬化症中的成纤维细胞或促纤维发生细胞活化同时保留正常细胞未受伤害的组合物和方法。
本发明的另一目标是提供用于减少或耗尽系统性硬化症中的肌成纤维细胞同时保留正常细胞未受伤害的组合物和方法。
本公开至少部分基于死亡受体(DR)激动剂(例如，TRAIL和DR激动抗体)作为治疗和/或预防模式以天然激动剂药剂或其变异体或衍生物形式用于治疗和/或预防哺乳动物受试者的纤维化自身免疫疾病或病症(例如，SSc)的发现。本文所阐述的研究的主要目标涉及鉴别TNF相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)受体激动剂(TRA)(例如，重组TRAIL变异体和抗体)作为抗纤维化和/或抗炎剂以便靶向局部和弥漫性SSc。在某些实施例中，本公开因此描述一种靶向和阻断关键纤维发生细胞活化为肌成纤维细胞(MFB)、或根除关键纤维发生细胞以在SSc中逆转纤维化和消释发炎的独特作用机制。
本文所公开的研究显示，死亡受体激动剂可以诱导SSc中的活化的成纤维细胞和肌成纤维细胞的TRAIL介导的细胞凋亡。重要地，包括TRAIL类似物和DR抗体的DR激动剂通过选择性地阻断成纤维细胞活化和耗尽α-SMA+MFB并且同时下调多种纤维发生组分而无显著毒性来强有力地改善互补SSc模型中的纤维化和发炎。
本公开证明，通过上调的DR阻断MFB活化和耗尽MFB(主要促纤维发生细胞群体)诱导SSc中的晚期纤维化的消释或预防其进展。TGFβ活化的α-SMA+原代原代人类成纤维细胞通过DR介导的细胞凋亡自发地变得易受TRAIL和DR激动抗体影响。不同于某些类型的原代癌细胞，活化的MFB对TRAIL不具有抗性。在互补两个SSc小鼠模型中，研究证实，DR4和DR5在纤维化皮肤组织中的α-SMA+MFB上与正常皮肤组织中的相比高度上调。当用TRAIL类似物和DR抗体处理SSc动物模型时，发现DR激动剂靶向体内MFB并且明显改善晚期纤维化而无脱靶毒性。此外，分析来自健康受试者和患有SSc的患者的皮肤活检体中的组织纤维化。在正常皮肤组织中，未观察到强α-SMA和DR表达。相比之下，在来自SSc患者的纤维化皮肤组织中检测到DR4和DR5以及α-SMA的较高水平。本公开提供新颖SSc治疗的新理解和临床基本原理。
使用来自SSc患者的原代人类组织和SSc动物模型，TRAIL受体类似物(TRA)逆转纤维化和与SSc相关的广泛发炎反应。基于临床前数据，全身给予的TRAILPEG(PEG化重组人类同源三聚TRAIL)和抗DR抗体靶向体内α平滑肌肌动蛋白阳性(α-SMA+)肌成纤维细胞以同时抑制SSc中的多种纤维发生分子。在啮齿动物SSc模型中，TRAILPEG和抗DR抗体使皮肤硬化和过量胶原蛋白产生减轻回到健康水平。类似地，TRAILPEG和抗DR抗体减轻特发性肺纤维化中的广泛纤维化，其为SSc的一种可能症状。
在组织损伤期间，发炎和自身抗体使成纤维细胞活化为肌成纤维细胞，所述肌成纤维细胞诱导纤维化。募集的细胞(如纤维细胞、骨髓间质干细胞和周细胞)也在纤维化进展期间转分化为肌成纤维细胞。TRAILPEG和抗DR抗体呈现为靶向和阻断仅肌成纤维细胞中而非正常细胞中的此类活化和诱导的TRAIL介导的细胞死亡，以及改善可活化肌成纤维细胞的发炎反应。因此，纤维发生路径停止并且健康成纤维细胞再填充脏器。在不希望受理论束缚的情况下，因此相信包括TRAILPEG和抗DR抗体的DR激动剂可通过针对所有成纤维细胞活化机制(包括自身免疫、发炎和转分化机制)来靶向肌成纤维细胞细胞群体并且展现其逆转SSc的能力。
在下文和本文别处阐述所公开的方法的其它特征。
A.死亡受体激动剂
本文所描述的死亡受体激动剂包括TRAIL和激动死亡受体抗体以及其类似物、变异体、片段和衍生物。
1.TRAIL
肿瘤坏死因子(TNF)相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)是TNF家族的成员，并且是参与细胞凋亡的跨膜蛋白质。TRAIL是影响细胞凋亡的由281个氨基酸组成的蛋白质，其中细胞外结构域包括从位置115处的精氨酸到位置281处的甘氨酸或位置95处的苏氨酸到位置281处的甘氨酸的氨基酸。
人类TRAIL蛋白质序列可以REFSEQ寄存号NP_003801获得并且提供于下文(SEQ IDNO：1)：
Figure BDA0001753430790000121
三个TRAIL单体分子形成结构上经过修饰的三聚体。TRAIL三聚体与参与细胞死亡的受体组装以诱导细胞凋亡。TRAIL与TNF超家族的其它成员之间的主要差异是其不诱导正常组织处的细胞死亡的能力。因为TNF影响正常细胞并且还诱导癌细胞和过度活化的免疫细胞的死亡，所以其适用性有限。相比之下，TRAIL诱导广泛范围的癌细胞和过度活化的免疫细胞的细胞凋亡，对正常细胞作用极小。这归因于细胞类型之间的差异性TRAIL受体表达。
TRAIL通过与其受体相互作用诱导细胞凋亡。当前，已经鉴别了TRAIL的4种人类受体，包括死亡受体4(DR4)、死亡受体5(DR5)、诱饵受体1(DcRl)、诱饵受体2(DcR2)和骨保护素(OPG)。TRAIL在结合到DR4和DR5(其都含有保守死亡结构域(DD)基序)后通过卡斯蛋白酶(caspase)依赖性细胞凋亡诱导死亡。DcRl和DcR2因为其过度表达时抑制TRAIL诱导的细胞凋亡的能力而充当诱饵。DcR1和DcR2与DR4和DR5的细胞外结构域具有紧密同源性。DcR2具有截短的非功能性细胞质DD，而DcR1不具有胞溶质区并且通过糖磷脂部分锚定于质膜。DcR2的细胞质结构域是功能性的并且活化NF-KB，其导致已知可拮抗死亡信号传导路径和/或促进发炎的基因的转录。配体结合到DR4触发受体三聚和其细胞内死亡结构域的簇聚，导致形成死亡诱导复合物(DISC)。DISC募集衔接分子并且引发卡斯蛋白酶的结合和活化以诱导细胞凋亡。通过TRAIL受体诱导或恢复信号传导是一种抗癌策略；TRAIL还显示为可抑制自身抗原特异性T细胞，表明其可以抑制自身免疫反应。
除了对一些正常细胞的毒性之外，TRAIL具有短体内半衰期，并且根据测试中使用的动物物种而具有不同半衰期。举例来说，TRAIL据报道在啮齿动物中的半衰期是几分钟并且在猿中是约30分钟(H.Xiang等人《药物代谢与处置(Drug Metabolism andDisposition)》2004，32，1230-1238)。具体来说，大部分TRAIL通过肾快速排出。
a.TRAIL类似物
TRAIL可以以三聚体形式与其受体相互作用。因此，在一些实施例中，本文所公开的方法中使用的配体或激动剂是或可以形成多聚体、优选三聚体。三聚体可以是同三聚体或异三聚体。
本文所描述的所有TRAIL蛋白质都可以使用分离天然或重组蛋白质的标准技术制备，并且如本文所描述进行化学修饰。
TRAIL共轭物可以包括TRAIL类似物或激动TRAIL受体结合片段或其变异体。TRAIL类似物是本领域中已知的。在优选实施例中，与野生型或内源TRAIL相比，类似物对于一种或多种激动TRAIL受体(例如，TRAILR1(DR4)和/或TRAIL-R2(DR5))的亲和力或特异性增加，对于一种或多种拮抗或诱饵TRAIL受体(例如，受体DcR1和DcR2)的亲和力或特异性降低，或是这两种情况的组合。
在一些实施例中，类似物是野生型TRAIL的DR4选择性突变体。DR-4选择性突变体是本领域中已知的并且公开于例如Tur，《生物化学杂志(J.Biological Chemistry)》，283(29)：20560-8(2008)中。在一特定实施例中，类似物是SEQ ID NO：1的具有D218H或D218Y取代的变异体或其功能片段(例如，细胞外结构域)。
在一些实施例中，类似物是野生型TRAIL的DR5选择性突变体。特定DR-5选择性突变体包括SEQ ID NO：1的具有D269H、D269H/E195R或D269H/T214R的变异体和其功能片段(例如，细胞外结构域)。此类变异体描述于van der Sloot，《美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)》103(23)：8634-9(2006)中。
b.TRAIL融合蛋白质
TRAIL共轭物可以是TRAIL融合蛋白质。TRAIL融合多肽具有包括TRAIL蛋白质细胞外结构域的全部或一部分的第一融合搭配物，其(i)直接与第二多肽融合，或(ii)任选地与连接肽序列融合，该连接肽序列与第二多肽融合。融合蛋白质任选地含有起作用以使两个或更多个融合蛋白二聚或多聚的结构域。肽/多肽连接子结构域可以是单独结构域，或者可以含于融合蛋白质的其它结构域之一(TRAIL多肽或第二多肽)内。类似地，起作用以使融合蛋白质二聚或多聚的结构域可以是单独结构域，或者可以含于融合蛋白质的其它结构域之一(TRAIL多肽、第二多肽或肽/多肽连接子结构域)内。在一个实施例中，二聚/多聚结构域和肽/多肽连接子结构域相同。
本文所公开的融合蛋白质可以具有式I：
N-R1-R2-R3-C
其中“N”表示融合蛋白质的N末端，“C”表示融合蛋白质的C末端，“R1”是TRAIL多肽，“R2”是任选的肽/多肽连接子结构域，并且“R3”是第二多肽。或者，R3可以是TRAIL多肽并且R1可以是第二多肽。
融合蛋白质可以是二聚或多聚的。二聚或多聚可以通过二聚或多聚结构域在两个或更多个融合蛋白质之间或之中进行。或者，融合蛋白质的二聚或多聚可以通过化学交联进行。形成的二聚体或多聚体可以是同二聚/同多聚或异二聚/异多聚的。
第二多肽的存在可以改变TRAIL融合多肽的溶解度、稳定性、亲和力和/或价数。如本文所用，“价数”是指每分子可用的结合位点的数目。在一些实施例中，第二多肽含有免疫球蛋白重链恒定区的一个或多个结构域，优选具有对应于人类免疫球蛋白Cγ1链的铰链、CH2和CH3区或对应于鼠类免疫球蛋白Cγ2a链的铰链、CH2和CH3区的氨基酸序列。在一特定二聚融合蛋白质中，二聚体由Ig重链的为二硫键键联于二聚的正常Ig重链中的相同Cys残基的两者的铰链区中的Cys残基的共价键结产生。
在一特定实施例中，TRAIL融合蛋白质是TRAIL模拟物，包括三个TRAIL原聚体子序列组合于一个多肽链中，被称为单链TRAIL-受体结合结构域(scTRAIL-RBD)，如Gieffers，《分子癌症治疗学(Molecular Cancer Therapeutics)》，12(12)：273547(2013)中所描述。可以使各自具有三个受体结合位点的所谓scTRAIL-RBD中的两个紧密近接，产生具有六价结合模式的多聚融合蛋白质。在一些实施例中，多聚通过以下方式来实现：使人类免疫球蛋白G1(IgG1)-突变蛋白质的Fc部分与scTRAIL-RBD多肽C末端融合，进而每药物分子产生六个受体结合位点。
基于scFv连接子修饰迫使scFv-scTRAIL二聚以获得主要由二聚体构成的靶向scTRAIL(DbscTRAIL)对于一些靶细胞类型超过非靶向scTRAIL的活性约100倍。DbscTRAIL的活性增加还展现于标靶阴性细胞上，表明除了靶向之外，等效于标准TRAIL的至少二聚组装的寡聚本身增强细胞凋亡信号传导。因此，在优选实施例中，TRAIL融合蛋白质具有可以产生例如二聚、三聚或六聚分子的多聚结构域，如二聚或三聚结构域或其组合。
促进三聚体形成的另一融合蛋白质包括与三聚亮氨酸或异亮氨酸拉链结构域氨基末端融合的TRAIL受体结合片段。
TRAIL融合蛋白质和在功能分析中使用所述融合蛋白质的结果还描述于Wahl，《肝脏病学(Hepatology)》，57(2)：625-36(2013)中。
2.TRAILPEG：PEG化TRAIL
a.聚乙二醇
聚乙二醇(PEG)是当呈线性形式时具有HO-(-CH2CH2O-)n-H结构的聚合物。归因于其高亲水性，PEG当连接到药物蛋白质时使其溶解度增加。另外，当适合地连接到蛋白质时，PEG增加经修饰蛋白质的分子量同时维持主要生物功能，如酶活性和受体结合；进而减少尿排泄，保护蛋白质免于识别外源抗原的细胞和抗体，并且减少蛋白质被蛋白酶降解。能够连接到蛋白质的PEG的分子量在约1,000与100,000之间的范围内。已知分子量高于1,000的PEG具有极低毒性。分子量在1,000与6,000之间的PEG广泛分布遍及整个身体并且通过肾代谢。具体来说，分子量为40,000的PEG分布在血液和包括肝的脏器中，并且在肝中代谢。例示性PEG或PEG衍生物包括但不限于：甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯、甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯N-羟基琥珀酰亚胺、甲氧基聚乙二醇丙醛、甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺和多支化聚乙二醇。
在这点上，PEG选择性地连接TRAIL的N末端，如以引用的方式并入本文中的国际公开第WO 2007/145457号中所描述。另外，PEG化显著地增加TRAIL的溶解度和稳定性(例如，PEG化TRAIL的稳定性、半衰期和体内活性显著大于天然型TRAIL)。此外，发现PEG化可改进连接药物在各种配制物中长期储存下的药物动力学特征曲线，从而降低药物给予频率并且使得药物作用的持续时间持续。
还可以使用PEG或其衍生物的非线性形式。实例包括支化聚合物，如二支化、三支化、多臂、二聚和三聚结构。
i.聚环氧烷和TRAIL
使用亲水性聚合物如聚环氧烷或其共聚物如巴斯夫(BASF)销售的
Figure BDA0001753430790000151
可以共价键结到分子以改进TRAIL的药物动力学和药效动力学特征曲线(Kim等人，《生物共轭化学(Bioconjugate Chem.)》，22(8)，第1631-1637页(2011))。研究显示，用PEG衍生的TRAIL类似物维持抗癌活性，同时还展现较高的血浆中代谢稳定性、延伸的药物动力学特征曲线和较大的循环半衰期(Chae等人，《分子癌症治疗学》9(6)：1719-29(2010)；Kim等人，《生物共轭化学》，22(8)：1631-7(2011)；Kim等人，《医药科学杂志(Journal ofpharmaceutical sciences)》100(2)：482-91(2011)；Kim等人，《控制释放杂志(Journal ofcontrolled release)》：控制释放协会(Controlled Release Society)的官方杂志150(1)：639(2011))。
因此，在一些实施例中，TRAIL结构域用一个或多个乙二醇(EG)单元、更优选2个或更多个EG单元(即，聚乙二醇(PEG))或其衍生物衍生。PEG的衍生物包括但不限于甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯、甲氧基聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺、甲氧基聚乙二醇醛、甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺和多支化聚乙二醇。
EG或衍生单元的精确数目取决于所需活性、血浆稳定性和药物动力学特征曲线。举例来说，Kim等人(同前文献)报道，2、5、10、20和30K-PEG-TRAIL在小鼠中分别产生3.9、5.3、6.2、12.3和17.7小时的较大循环半衰期，对TRAIL的1.1小时。在一些实施例中，PEG的分子量在约1与100kDa之间，优选在约1与50kDa之间。举例来说，PEG的分子量可以是“N”kDa，其中N是1与100之间的任何整数。PEG的分子量可以是“N”Da，其中N是1,000与1,000,000之间的任何整数。在一特定实施例中，PEG的分子量是“N”Da，其中“N”在1,000与50,000之间，或更优选在5,000与50,000之间。
促细胞凋亡剂可以与线性或支化PEG共轭。一些研究已经显示，用支化PEG衍生的蛋白质与线性PEG-蛋白质相比体内循环半衰期延长，认为这部分归因于支化PEG-蛋白质的较大流体动力学体积，Fee等人，《生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng.)》，98(4)：725-3(2007)。
肽配体可以使用本领域中已知的方法在C末端处或优选在N末端处衍生。
TRAIL-PEG共轭物可以由下式描绘：
X-L-(PEG)n，
其中
X表示TRAIL蛋白质，
L表示连接子，
PEG表示支化聚(乙二醇)链，并且
n是选自2、3、4、5、6、7或8的整数。
在某些实施例中，n是2。
聚环氧烷通过连接子偶合到蛋白质。连接子可以是聚环氧烷，并且优选使两个聚环氧烷聚合物连接到蛋白质。
在一特定实施例中，TRAIL-共轭物是包括以下的PEG-共轭物：TRAIL结构域，包括人类TRAIL的截短形式，例如人类TRAIL的全长形式(1-281)的精氨酸-114到甘氨酸-281；和分子量在1,000与100,000道尔顿之间、并且优选在5,000与50,000道尔顿之间的PEG。
N末端修饰的PEG-TRAIL共轭物可以通过使TRAIL结构域的N末端胺与PEG的醛基在还原剂存在下反应来获得。PEG和TRAIL可以在2到10或优选5到7.5的摩尔比(PEG/TRAIL)下反应。
在优选实施例中，TRAIL-共轭物包括使得可在三个TRAIL-共轭物单体之间形成三聚体的拉链氨基酸基序，例如异亮氨酸拉链基序。
PEG链优选但不必具有相等分子量。每个PEG链的例示性分子量范围在约10kDa与60kDa、并且优选约20kDa与40kDa之间。PEG40是合成的支化PEG部分，并且分子量是40kDa：20+20kDa(每个PEG链)。
三聚PEG部分可以由支化PEG链连接到连接臂组成。三聚体PEG部分的可视描述紧接在下方提供。
Figure BDA0001753430790000171
支化PEG PEG连接臂
总Mw.10-60kDa总Mw.1-30kDa
优选20-40kDa优选2-20kDa
合成以下三聚PEG：YPEG42、YPEG43.5、YPEG45、YPEG50和YPEG60。
●YPEG42是分子量为42kDa：(20+20kDa)(支化PEG)+2kDa(连接臂)的三聚PEG部分。
●YPEG43.5是分子量为43.5kDa：(20+20kDa)(支化PEG)+3.5kDa(连接臂)的三聚PEG部分。
●YPEG45是分子量为45kDa：(20+20kDa)(支化PEG)+5kDa(连接臂)的三聚PEG部分。
●YPEG50是分子量为50kDa：(20+20kDa)(支化PEG)+10kDa(连接臂)的三聚PEG部分。
●YPEG60是分子量为60kDa：(20+20kDa)(支化PEG)+20kDa(连接臂)的三聚PEG部分。
ii.连接子部分
蛋白质或肽通过连接子共价接合到支化PEG部分。连接子是聚合物，并且通常原子长度是至少800埃。典型地，连接子的原子长度是约800到约2,000埃、约800到约1,500埃、约800到约1,000埃、或约900到约1,000埃。应了解，以上列出的原子距离是指充分延伸的聚合物，并且当呈固态或在溶液中时，连接子可以按以下方式折叠或卷曲，使得支化PEG与蛋白质或肽之间的实际距离小于以上列出的原子长度。
在某些实施例中，连接子是分子量在约1kDa到30kDa、优选约2kDa到20kDa之间的聚(乙二醇)衍生物。连接子还可以是长度为至少80个单元的天然或非天然氨基酸。
连接子的PEG替代物包括合成或天然水溶性生物相容性聚合物，如聚环氧乙烷、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺；蛋白质，如玻尿酸和硫酸软骨素；纤维素，如羟甲基纤维素；聚乙烯醇；和聚羟烷基(甲基)丙烯酸酯。
蛋白质和肽可以使用常规化学反应共价键结到连接子。如见于N末端处或赖氨酸残基中的伯胺基将在还原条件下与醛和其等效物反应得到胺。(Molineux，《当今药物设计(Current pharmaceutical design)》，10(11)：1235-1244(2004))。如见于半胱氨酸残基中的巯基(-SH)可以经历与多种迈克尔受体(Michael acceptor)，包括丙烯酸和甲基丙烯酸衍生物以及马来酰亚胺的共轭加成(Gong等人，《英国药理学杂志(British Journal ofPharmacology)》，163(2)：399-412(2011))。肽和蛋白质中所见的其它适合亲核基团包括二硫键(Brocchini等人，《自然实验手册(Natureprotocols)》，1：2241-2252(2006))和组氨酸残基(Cong等人，《生物共轭化学(Bioconjugate Chemistry)》，23(2)：248-263(2012))。
连接子可以使用常规化学反应共价接合到蛋白质或肽。举例来说，连接子聚合物可以在一个末端用亲电基团如醛、环氧化物、卤素(氯、溴、碘)、磺酸酯(甲苯磺酸酯、甲磺酸酯)、迈克尔受体或活化羧酸酯衍生，并且接着与蛋白质或肽中的亲核胺或硫醇基反应。适合的迈克尔受体包括丙烯酸和甲基丙烯酸衍生物，如丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，以及马来酰亚胺。适合的活化羧酸酯包括硝基苯基碳酸酯和N-羟基琥珀酸酯(N-hydroxy succinate，NHS)。在其它实施例中，含有精氨酸残基的肽和蛋白质可以与含有反应性1，3二酮官能团的连接子共价接合。
共轭物可以通过以下方式制备：首先使连接子与肽或蛋白质接合，随后使连接子与支化聚(乙二醇)接合，或通过首先使连接子与支化聚(乙二醇)接合，随后使连接子与肽或蛋白质接合。键结形成的最优顺序由所涉及的具体化学转化决定。
c.大分子
在其它实施例中，TRAIL可以通过报道的方法使用生物聚合物或多肽衍生为半衰期延长的长效TRAIL；例如但不限于使用化学共轭的玻尿酸(Yang等人，《生物材料(Biomaterials)》32(33)；8722-8729(2011)、储存物形成多肽(Amiram等人，《美国国家科学院院刊》，110(8)；27922792(2013)，美国公开申请第US 2013-0178416 A1号)和连接到延伸的重组多肽的TRAIL(美国公开申请第US 2010-0239554 A1号)。
d.复合物
TRAIL结构域可以与带负电的部分复合。在一些实施例中，带负电的部分可以促进配体或激动剂负载到纳米粒子中以实现延长、持续或延时释放的递送。在一些实施例中，带负电的部分本身介导配体或激动剂的延长、持续或延时释放的递送。优选地，带负电的部分不会显著地削弱配体或激动剂诱导或增强细胞凋亡的能力。
开发带正电的TRAIL与带负电的硫酸软骨素(CS)之间的复合物(CS/TRAIL)形成，并且其显示为促进TRAIL负载在聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)微球(MS)中而不损害TRAIL的活性(Kim等人，《药学与药理学杂志(Journal ofPharmacy and Pharmacology)》，65(1)：11-21(2013))。在pH 5.0下以2 TRAIL比CS(TC2)的重量比形成约200nm的纳米复合物。复合物在通过多乳液方法制备的PLGA MS中的负载效率比天然TRAIL的负载效率高＞95％。因此，在一些实施例中，配体或激动剂、尤其TRAIL肽和其变异体、功能片段和融合蛋白质、或其共轭物如PEG-共轭物与硫酸软骨素复合并且任选地负载到微粒子或纳米粒子(例如基于PLGA的粒子)中。
在其它实施例中，配体或激动剂、尤其TRAIL肽和其变异体、功能片段和融合蛋白质、或其共轭物如PEG-共轭物与玻尿酸(HA)复合。PEG-TRAIL与HA的通过混合带正电的PEG-TRAIL和带负电的HA而制备的纳米复合物显示为具有持续体内递送，与PEGTRAIL相比生物活性丢失可忽略(Kim等人，《生物材料》，31(34)：9057-64(2010))。递送进一步通过在含1％HA的溶液中给予纳米粒子来增强。
B.抗体组合物和制造方法
可以使用纯化的TRAIL受体多肽、其片段、融合物或抗原或表位制备特异性结合到TRAIL受体的抗体。可以使用本领域中已知的任何适合方法制备抗体。随后，可以使用本领域中已知的方法筛选抗体的功能活性(例如，激动或拮抗活性)。例示性激动抗体包括死亡受体DR4和DR5的抗体。
1.死亡受体激动抗体
本公开的某些方面包括针对死亡受体的激动抗体(包括，或者，抗体片段或其变异体)(例如，TRAIL抗体)。可以使用本领域的技术人员已知的方法制备和纯化抗体。举例来说，可以从动物(例如，小鼠、大鼠、兔、山羊、驴、马、鸭或鸡)的血清亲和力纯化抗体。还可以使用多种可用的DR抗体，DR4和DR5抗体治疗纤维化自身免疫疾病(例如，系统性硬化症)。例示性DR激动剂包括来沙木单抗(Lexatumumab)、替加珠单抗(Tigatuzumab)、康纳木单抗(Conatumumab)、德罗兹妥单抗(Drozitumab)、马帕木单抗(Mapatumumab)、HGSTR2J/KMTRS和LBY-135。在一些实施例中，DR抗体是多价药剂，例如TAS266。
本公开的抗体可以指一种多肽，其包括足以赋予与特定靶抗原的特异性结合的典型免疫球蛋白序列元件。如本领域中已知，如在自然界中产生的完整抗体是约150kD四聚试剂，其具有两个一致重链多肽(各自是约50kD)和两个一致轻链多肽(各自是约25kD)，所述多肽彼此结合成通常被称为“Y形”结构的物质。每个重链包括至少四个结构域(各自约110个氨基酸长)：氨基端可变(VH)结构域(位于Y结构的顶端)，随后是三个恒定结构域：CH1、CH2和羧基端CH3(位于Y的茎干的基部)。被称为“转换区(switch)”的短区连接重链可变区与恒定区。“铰链”将CH2和CH3结构域连接到抗体的其余部分。这一铰链区中的两个二硫键使完整抗体中的两个重链多肽彼此连接。每个轻链包括两个结构域：氨基端可变(VL)结构域，随后是羧基端恒定(CL)结构域，由另一“转换区”彼此隔开。完整抗体四聚体由两个重链-轻链二聚体构成，其中重链和轻链通过单个二硫键彼此连接；两个其它二硫键使重链铰链区彼此连接，使得二聚体彼此连接并且形成四聚体。天然产生的抗体也被糖基化，典型地在CH2结构域上。天然抗体中的每个结构域都具有这样一种结构，其特征在于由两个β片层(例如，3、4或5链片层)按压缩反向平行β桶形式针对彼此填充形成的“免疫球蛋白折叠”。每个可变结构域含有三个被称为“互补决定区”的高变环(CDR1、CDR2和CDR3)和四个在某种程度上不变的“构架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成为结构域提供结构构架的β片层，并且来自重链和轻链的CDR环区在三维空间中聚在一起，使得它们产生位于Y结构的顶端的单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的Fc区结合到补体系统的元件，并且还结合到效应细胞上的受体，包括例如介导细胞毒性的效应细胞。如本领域中已知，可以通过糖基化或其它修饰来调节Fc区对Fc受体的亲和力和/或其它结合属性。
在一些实施例中，抗体是多克隆抗体；在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，抗体具有为小鼠、兔、灵长类动物或人类抗体的特征的恒定区序列。在一些实施例中，抗体序列元件是充分人类的，或人源化、灵长类化、嵌合等，如本领域中已知。此外，如本文所用，术语“抗体”在适当实施例中可以指(除非另外陈述或从上下文显而易见，否则)本领域已知或开发的在替代性呈现中利用抗体结构和功能特征的构建体或形式中的任一种。
抗体可以在细胞培养物、噬菌体或各种动物中产生。在一个实施例中，抗体是哺乳动物抗体。噬菌体技术可以用以分离初始抗体或生成具有改变的特异性或亲合力特征的变异体。此类技术是常规的并且本领域中熟知的。在一个实施例中，抗体通过本领域中已知的重组手段产生。举例来说，重组抗体可以通过用包含编码抗体的DNA序列的载体转染宿主细胞来产生。一种或多种载体可以用以转染宿主细胞中的表达至少一个VL和一个VH区的DNA序列。抗体生成和产生的重组手段的例示性描述包括Delves，《抗体产生：必需技术(Antibody Production：Essential Techniques)》(威利(Wiley)，1997)；Shephard等人，《单克隆抗体(Monoclonal Antibodies)》(牛津大学出版社(Oxford University Press)，2000)；Goding，《单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies：Principles And Practice)》(学术出版社(Academic Press)，1993)；和《免疫学最新方案(Current Protocols In Immunology)》(约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)，最新版)。
所公开的抗体可以通过重组手段修饰以增加抗体在介导所需功能方面的较大功效。抗体可以使用重组手段通过取代而修饰。典型地，取代将是保守取代。举例来说，抗体的恒定区中的至少一个氨基酸可以被不同残基置换。参看例如，美国专利第5,624,821号、美国专利第6,194,551号、WO 9958572；和Angal等人《分子免疫学(Mol.Immunol.)》30：105-08(1993)。氨基酸的修饰包括氨基酸的缺失、添加和取代。在一些情况下，作出此类改变以减少非所需活性，例如补体依赖性细胞毒性。抗体常常通过共价或非共价接合提供可检测信号的物质来标记。多种多样的标记和共轭技术是已知的并且广泛报道于科学和专利文献中。这些抗体可以针对结合到TRAIL受体进行筛选。参看例如，《抗体工程改造：实用方法(Antibody Engineering：A Practical Approach)》(牛津大学出版社，1996)。
适合的具有所需生物活性的抗体可以通过包括但不限于以下的体外分析：增殖、迁移、粘附、软琼脂生长、血管生成、细胞间通讯、细胞凋亡、输送、信号转导；和以下体内分析，如肿瘤生长抑制，来鉴别。
可以用于所公开的组合物和方法中的抗体包括任何类别的全免疫球蛋白(即，完整抗体)、其片段和至少含有抗体的抗原结合可变结构域的合成蛋白质。可变结构域在抗体之间的序列不同并且用于对于其特定抗原的每种特定抗体的结合和特异性。然而，可变性通常并非均匀分布于抗体可变结构域中。其典型地集中在三个称为互补决定区(CDR)或高变区的区段，所述区段位于轻链和重链可变结构域中。可变结构域的更高度保守部分被称为构架(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个大部分采用β片层构型的FR区，所述FR区通过三个CDR连接，从而形成环，所述环连接β片层结构并且在一些情况下形成β片层结构的一部分。每个链中的CDR通过FR区极为接近地保持在一起，并与来自其它链的CDR一起促进抗体的抗原结合位点的形成。
还公开具有抗体的生物活性的片段。片段(无论是否附接到其它序列)包括特定区或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其它选择的修改，其限制条件是片段的活性与未修饰的抗体或抗体片段相比不显著改变或减弱。
技术还可以适合于产生对本公开的抗原蛋白质具有特异性的单链抗体。产生单链抗体的方法是本领域的技术人员熟知的。单链抗体可以通过以下方式产生：使用短肽连接子使重链和轻链的可变结构域融合在一起，由此重构在单个分子上的抗原结合位点。已经开发如下单链抗体可变片段(scFv)：其中一个可变结构域的C末端通过15到25个氨基酸肽或连接子系栓到其它可变结构域的N末端而不显著破坏抗原结合或结合的特异性。连接子经选择以准许重链和轻链在其恰当构形取向上结合在一起。
二价单链可变片段(二-scFv)可以通过连接两个scFv工程改造。这可以通过产生具有两个VH和两个VL区的单个肽链产生串联scFv完成。ScFv还可以被设计具有太短而使两个可变区不能折叠在一起(约五个氨基酸)，迫使scFv二聚的连接肽。这种类型被称为双链抗体。双链抗体已经示出具有低于相对应的scFv高达40倍的解离常数，意味着其对于其标靶具有高得多的亲和力。还要更短的连接子(一个或两个氨基酸)导致形成三聚体(三链抗体或三倍体)。还已经产生四链抗体。其对于其标靶呈现比双链抗体甚至更高的亲和力。
单克隆抗体由大体均质抗体群体获得，即，群体内的个别抗体除了可以抗体分子的小子集存在的可能天然存在的突变之外是一致的。单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与在衍生自特定物种或属于特定抗体类别或子类别的抗体中相对应的序列一致或同源，而(一个或多个)链的剩余部分与在衍生自另一物种或属于另一抗体类别或子类别的抗体以及这类抗体的片段中的相对应的序列一致或同源，只要它们呈现所需拮抗活性。
单克隆抗体可以使用产生单克隆抗体的任何程序制备。在杂交瘤方法中，典型地用免疫剂使小鼠或其它适当宿主动物免疫以使淋巴细胞产生或能够产生特异性结合到免疫剂的抗体。或者，淋巴细胞可以体外免疫。
抗体还可以通过重组DNA方法制备。编码所公开的抗体的DNA可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合到编码鼠类抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。抗体或活性抗体片段库还可以使用噬菌体呈现技术生成和筛选。
2.人类和人源化抗体
许多非人类抗体(例如，衍生自小鼠、大鼠或兔的抗体)在人类中具天然抗原性，并且因此当向人类给予时可能会引起不期望的免疫反应。因此，在方法中使用人类或人源化抗体用以减小向人类给予的抗体引起不期望的免疫反应的机率。
可以采用在免疫后能够在无内源免疫球蛋白产生存在下产生完全人类抗体库的转基因动物(例如，小鼠)。举例来说，已经描述，嵌合和生殖系突变小鼠中抗体重链接合区(J(H))基因的纯合缺失导致完全抑制内源抗体产生。将人类生殖系免疫球蛋白基因阵列转移到此类生殖系突变小鼠中将会在抗原攻击时产生人类抗体。任选地，抗体在其它物种中产生并且“人源化”以便在人类中给予。非人类(例如，鼠类)抗体的人源化形式是含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。人源化抗体包括人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体抗体的互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人类物种(供体抗体)(如小鼠、大鼠或兔)的CDR的残基置换。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv构架残基被相应非人类残基置换。人源化抗体还可以含有在受体抗体中和在所输入的CDR或构架序列中都不存在的残基。一般来说，人源化抗体将含有大体上所有的至少一个并且典型地两个可变结构域，其中所有或大体上所有的CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区并且所有或大体上所有的FR区是人类免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最优还含有免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人类免疫球蛋白的至少一部分。
使非人类抗体人源化的方法在本领域中是熟知的。一般来说，人源化抗体具有一个或多个从非人类来源引入到其中的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常常被称为“输入”残基，其典型地从“输入”可变结构域获取。抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术操控编码抗体分子的一个或多个多肽链的DNA序列。人源化基本上可以通过用啮齿动物CDR或CDR序列取代相应的人类抗体序列来进行。因此，非人类抗体(或其片段)的人源化形式是嵌合抗体或片断，其中显著小于完整人类可变结构域被来自非人类物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体典型地是一些CDR残基和可能一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代的人类抗体。
为了降低抗原性，选择待用于制备人源化抗体的人类可变结构域(轻和重)极为重要。根据“最佳拟合”方法，针对已知人类可变结构域序列的整个库来筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。接着接受最接近于啮齿动物的序列的人类序列作为人源化抗体的人类构架(FR)。另一方法使用衍生自轻链或重链的特定子组的所有人类抗体的共有序列的特定构架。相同构架可以用于几种不同人源化抗体。
此外重要的是，抗体被人源化而保持对于抗原的高亲和力和其它有利生物特性。为了实现这个目标，人源化抗体优选通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和多种概念人源化产品的方法制备。三维免疫球蛋白模型通常是可用的并且是本领域的技术人员熟悉的。说明和展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构形结构的计算机程序是可用的。查看这些显示器允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的潜在作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从共有和输入序列选择和组合FR残基以便实现所需抗体特征，如增加的对于靶抗原的亲和力。一般来说，CDR残基直接并且大部分显著地参与影响抗原结合。
3.单链抗体
产生单链抗体的方法是本领域的技术人员熟知的。单链抗体通过以下方式产生：使用短肽连接子使重链和轻链的可变结构域融合在一起，由此重构在单个分子上的抗原结合位点。已经开发如下单链抗体可变片段(scFv)：其中一个可变结构域的C末端通过15到25个氨基酸肽或连接子系栓到其它可变结构域的N末端而不显著破坏抗原结合或结合的特异性。连接子经选择以准许重链和轻链在其恰当构形取向上结合在一起。这些Fv缺乏天然抗体的重链和轻链中存在的恒定区(Fc)。
4.单价抗体
体外方法也适于制备单价抗体。消化抗体以产生其片段、尤其Fab片段可以使用本领域中已知的常规技术来实现。举例来说，消化可以使用木瓜蛋白酶进行。木瓜蛋白酶消化抗体典型地产生两个被称为Fab片段的一致抗原结合片段，其各自具有单一抗原结合位点和残余Fc片段。胃蛋白酶处理产生被称为F(ab')2片段的片段，其具有两个抗原组合位点并且仍能够交联抗原。
抗体消化中产生的Fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于，重链结构域的羧基端增加了几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。F(ab')2片段是包含在铰链区通过二硫桥键连接的两个Fab'片段的二价片段。Fab'-SH在本文中是用于恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab'的名称。抗体片段最初产生为在其之间具有铰链半胱氨酸的Fab'片段对。抗体片段的其它化学偶合也是已知的。
5.杂交抗体
抗体可以是杂交抗体。在杂交抗体中，一个重链和轻链对与针对一个表位培养的抗体中所见的对同源，而其它重链和轻链对与针对另一表位培养的抗体中所见的对同源。这导致多官能价数的特性，即，二价抗体能够同时结合至少两个不同表位。此类杂交体可以通过融合产生对应的组分抗体的杂交瘤或通过重组技术形成。此类杂交体当然还可以使用嵌合链形成。
6.使用蛋白质化学制备抗体的方法
一种制备包含抗体的蛋白质的方法是通过蛋白质化学技术将两个或更多个肽或多肽连接在一起。举例来说，肽或多肽可以使用当前可用的实验室设备使用Fmoc(芴基甲氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)化学而化学合成。(应用生物系统公司(Applied Biosystems，Inc.)，福斯特市(Foster City)，加利福尼亚州(CA))。本领域技术人员可以容易了解，对应于抗体的肽或多肽例如可以通过标准化学反应合成。举例来说，肽或多肽可以被合成并且不由其合成树脂裂解，而抗体的其它片段可以被合成并且随后由树脂裂解，进而使其它片段上功能性阻断的端基暴露。通过肽缩合反应，这两个片段可以通过肽键分别在其羧基端和氨基端共价接合以形成抗体或其片段。或者，如上文所描述，肽或多肽独立地在体内合成。在分离后，这些独立肽或多肽可以通过类似肽缩合反应连接以形成抗体或其抗原结合片段。
举例来说，克隆或合成的肽区段的酶连接使得相对短的肽片段可接合以产生较大肽片段、多肽或全蛋白结构域。或者，可以利用合成肽的天然化学连接以从较短肽片段合成构建大肽或多肽。这种方法由两步化学反应组成。第一步骤是未受保护的合成肽-α-硫酯与含有氨基端Cys残基的另一未受保护的肽片段化学选择性反应，得到硫酯连接的中间物为初始共价产物。在反应条件不改变的情况下，这种中间物经历自发快速分子内反应以在连接位点形成天然肽键。
III.使用方法
本文所公开的死亡受体激动剂可以单独或以于医药组合物或配制物中的活性剂形式用于治疗患有自身免疫纤维化(如系统性硬化症)的受试者。
A.硬皮病(系统性硬化症，SSc)
硬皮病是通过使结缔组织硬化而影响身体的自身免疫、风湿性并且慢性的疾病。结缔组织由许多种蛋白质(例如，胶原蛋白)组成并且分布广泛。SSc致使皮肤和内脏纤维化，并且是SSc的致死组分。纤维化是特征为结缔组织组分在脏器或组织中的过度积累的病理过程。纤维化响应于慢性组织损伤或慢性发炎因失调的伤口愈合(例如，过量胶原蛋白产生)而产生。过量胶原蛋白阻止脏器正常作用(JHU硬皮病中心(JHU Scleroderma Center)：www.hopkinsscleroderrna.org)。使组织架构变形并且导致脏器功能进行性丢失的进行性纤维化被视为患有SSc(致死性最大的风湿性疾病之一)的个体中的发病和死亡的主要原因之一。活化的α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)肌成纤维细胞是在纤维化中产生细胞外基质疤痕的细胞(Ho等人，《自然·风湿病学综述》10,390-402(2014))。α-SMA+细胞常常用作肌成纤维细胞形成的生物标记物，并且是硬皮病的显著起因。
SSc是一种罕见疾病，并且当前在美国有少于500,000人被诊断出。约80％的患者是女性，并且平均诊断年龄是40多岁(35与50岁之间)。死亡最常起因于肺、心脏和肾累及，但用对于肾衰竭有效的治疗，存活极大地改进。肺纤维化是最常见的死亡原因，在诊断10年内死亡率是50％。
SSc的早期症状包括手指的变化，其中手指变得对冷非常灵敏并且可能会因冷或情绪应激而变色(例如，雷诺现象(Raynaud's phenomenon))，并且可能会变得僵硬和肿胀。手指变色由血管的痉挛和变窄造成。这归因于使血管变窄的过量胶原蛋白以及皮肤血管对冷的温度和情绪应激的过度反应而发生。对冷灵敏和变色被称为雷诺现象。雷诺现象是一种常见病况。大多数具有雷诺现象的人不会患上硬皮病。存在两种类型的雷诺现象：原发性(被诊断具有雷诺现象并且不患有硬皮病的受试者)和继发性(被诊断具有雷诺现象并且患有硬皮病的受试者)。
纤维化还可能影响内脏并且可能会导致受影响的脏器损伤或衰竭。最常受影响的脏器是食道、心脏、肺和肾。内脏累及的信号可以是烧心、吞咽困难(difficultyswallowing/dysphagia)、高血压(high blood pressure/hypertension)、肾脏问题、呼吸急促、腹泻或使食物移动通过消化道的肌肉收缩削弱。
约15％到25％的具有系统性硬皮病特征的人还具有影响结缔组织的另一病况的征兆和症状，该另一病况如多发性肌炎、皮肌炎、类风湿性关节炎、肖格伦综合征(Sjogrensyndrome)或系统性红斑狼疮。系统性硬皮病与其它结缔组织异常的组合被称为硬皮病重叠综合征。
1.硬皮病的类型
a.局限性硬皮病(CREST综合征)
局限性硬皮病被表征为SSc的较轻微形式。局限性硬皮病大多影响面部颈部和末梢肘部和膝部的皮肤，并且疾病后期造成孤立性肺高血压。一般来说，局限性硬皮病与较严重形式相比造成更少的身体脏器累及。一些患者可能会患上肺病和心脏病。
局限性硬皮病与CREST(钙质沉着、雷诺现象、食道功能障碍、肢端皮肤硬化、毛细管扩张)综合征相关。皮肤和组织中的钙可能是疼痛性的并且可能会刺激或破坏皮肤表面。如上文所描述，雷诺综合征与冷不耐受相关。来自食道蠕动异常的胃酸倒流可能是疼痛性的，在食道内层造成刺激。毛细管扩张是特征为毛细管的扩张的病况，并且导致毛细管显现为红色或紫色簇。其典型地不造成症状，并且可以通过激光疗法去除。
b.弥漫性硬皮病
弥漫性硬皮病常常影响较多区域，包括皮肤、心脏、肺、胃肠道和肾(例如，区域因胶原蛋白的过度产生而变得增厚)。变紧的皮肤使得弯曲手指、手部和其它关节更困难，并且常常观察到关节、肌腱和肌肉的发炎。
c.系统性硬化症无皮肤硬化的硬皮病
在系统性硬化症无皮肤硬化的硬皮病中，纤维化影响一个或多个内脏但不影响皮肤。受影响的内脏包括食道、肺、心脏和肾。
B.待治疗的受试者
待用所公开的方法治疗的受试者包括罹患系统性硬化症的患者。患者可能罹患局限性硬皮病或弥漫性硬皮病。患者可能罹患SSc的早期症状并且可能具有雷诺原发性或继发性现象。患者可能罹患钙质沉着、雷诺现象、食道功能障碍、肢端皮肤硬化、毛细管扩张和/或弥漫性硬皮病。患者可能在疾病的早期、中期或晚期阶段。
待治疗的受试者可能罹患系统性硬化症的一种或多种形式、不存在其它纤维化疾病，如内脏的纤维化或发炎。实例包括罹患系统性硬化症、存在或不存在肝纤维化的患者群体；罹患系统性硬化症、存在或不存在肝硬化的受试者；罹患系统性硬皮病、存在或不存在胰纤维化的受试者；和罹患系统性硬化症、存在或不存在胰腺炎的受试者。
待治疗的受试者的其它实例包括罹患系统性硬化症、存在或不存在2型糖尿病、关节炎或其它自身免疫疾病(如1型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮或多发性硬化症)的患者。
待治疗的受试者的其它实例包括罹患系统性硬化症、存在或不存在增殖性疾病(如癌症)的患者。
C.当前用于SSc的疗法和治疗
当前，SSc不可治愈；然而，治疗可用于一些症状。例示性此类治疗包括软化皮肤和减少发炎的药物，另外，患者暴露于热据展现具有有益作用。尽管不存在有效并且安全的长期疗法或FDA批准的药物，但不改变疾病进展但可以改善症状(例如，疼痛和溃疡)的表面治疗是可用的。可以使用免疫抑制药物，但糖皮质激素的应用有限。还可以使用多种非类固醇抗发炎药物(NSAID)(例如，萘普生(naproxen))，以及类固醇(例如，泼尼松(prednisone))。有助于缓解症状的其它药剂包括钙通道阻断剂(例如，硝苯地平(nifedipine))、前列环素、内皮素受体激动剂(例如，波生坦(bosentan))、甲氨蝶呤、环孢菌素、青霉胺、ACE抑制剂、环磷酰胺、依前列醇(epoprostenol)、波生坦和雾化伊洛前列素(aerolized iloprost)。
制药业内的研究常常针对特发性肺纤维化(IPF)结合硬皮病。几家医药公司的研究管线与自身免疫疾病(例如，类风湿性关节炎和幼年特发性关节炎)相关，所述医药公司包括豪夫迈·罗氏有限公司(Hoffmann-La Roche，Ltd)、拜耳股份公司(Bayer AG)、塞尔基因公司(Celgene Corporation)、InterMune公司和Corbus制药控股公司。然而，当前治疗策略中没有一个关于SSc集中于逆转纤维化和消释发炎。
D.组合疗法
组合疗法包括向受试者给予有效量的死亡受体激动剂以及一种或多种其它药剂。其它药剂可以包括当前用于改善系统性硬化症的症状的治疗剂。
其它药剂包括免疫抑制药物，如甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、更生霉素、蒽环霉素、丝裂霉素C、博莱霉素、光神霉素、糖皮质激素、巴利昔单抗(basiliximab)、达利珠单抗(daclizumab)、莫罗单抗(muromonab)-CD3、环孢菌素、他克莫司(tacrolimus)、西罗莫司(sirolimus)、依维莫司(everolimus)、干扰素和霉酚酸酯；抗微生物剂，如新霉素、链霉素、氯霉素、头孢菌素、氨苄青霉素、青霉素、四环素和环丙沙星(ciprofloxacin)；类固醇和类固醇药物，如磷酸克林霉素、甲硝哒唑、盐酸甲硝哒唑、硫酸庆大霉素、盐酸林可霉素、硫酸托普霉素、盐酸万古霉素、硫酸多粘菌素B、多粘菌素E甲磺酸钠和硫酸粘杆菌素；非类固醇抗炎药物，如吲哚美辛(indomethacin)、酮基布洛芬(ketoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、萘普生、布洛芬(ibuprofen)、雷米那酮(ramifenazone)和吡罗昔康(piroxicam)；止痛剂，如阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬、萘普生钠、丁基原啡因(buprenorphine)、盐酸右丙氧芬(propoxyphene hydrochloride)、萘磺酸右丙氧芬、盐酸哌替啶(meperidine hydrochloride)、盐酸氢吗啡酮(hydromorphone hydrochloride)、吗啡(morphine)、羟考酮(oxycodone)、可待因(codeine)、重酒石酸二氢可待因(dihydrocodeine bitartrate)、戊唑星(pentazocine)、重酒石酸氢可酮(hydrocodonebitartrate)、左啡诺(levorphanol)、二氟尼柳(diflunisal)、水杨酸三乙醇胺(trolaminesalicylate)、盐酸纳布啡(nalbuphine hydrochloride)、甲芬那酸(mefenamic acid)、布托啡诺(butorphanol)、水杨酸胆碱、布他比妥(butalbital)、柠檬酸苯托沙敏、柠檬酸苯海拉明、左美丙嗪(methotrimeprazine)、盐酸桂麻磺碱和甲丙氨酯；维生素；钙通道阻断剂如氨氯地平(amlodipinen)、地尔硫卓(diltiazem)、非洛地平(felodipine)、伊拉地平(isradipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平、尼索地平(nisoldipine)和维拉帕米(verapamil)；内皮素受体激动剂；甲氨蝶呤，环孢菌素，青霉胺，ACE抑制剂，如贝那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)、莫西普利(moexipril)、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)、雷米普利(ramipril)和群多普利(trandolapril)；环磷酰胺，依前列醇，波生坦和雾化伊洛前列素。
其它药剂可以与死亡受体激动剂同时给予。
或者，其它药剂可以在给予有效量的死亡受体激动剂之前或之后给予。在之前或之后，给予其它药剂可以与给予有效量的死亡受体激动剂时间间隔至少3小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少2周、至少3周或至少一个月。
E.医药组合物和给药方案
1.医药组合物
本公开的另一方面涉及化合物的医药组合物。本公开的医药组合物典型地包括药剂，如死亡受体激动剂；和医药学上可接受的载剂。如本文所用，“医药学上可接受的载剂”包括生理学上相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。载剂的类型可以基于预期给药途径选择。在各种实施例中，载剂适用于静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、表面、经皮或经口给药。医药学上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散液以及即用制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和药剂于医药学上活性物质的使用是本领域中众所周知的。除非任何常规介质或药剂与活性剂不相容，否则考虑将其用于医药组合物中。也可以将补充性活性剂并入到组合物中。
治疗组合物典型地必须在制造和储存条件下无菌并且稳定。组合物可以配制为溶液、微乳液、脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。载剂可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其适合混合物的溶剂或分散介质。恰当的流动性可以例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散液情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，优选在组合物中包括等张剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)实现。此外，药剂可以在延时释放配制物中，例如在包括缓慢释放聚合物的组合物中给予。活性剂可以与防止药剂快速释放的载剂一起制备，如控制释放配制物，包括植入物和微囊封递送系统。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制备此类配制物的许多方法通常是本领域的技术人员已知的。
无菌可注射溶液可以通过如下方法来制备：视需要将所需量的活性剂与上文所列举的成分中的一者或组合并入适当溶剂中，接着过滤灭菌。一般来说，分散液通过将药剂并入含有碱性分散介质和来自上文所列举的成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其得到活性成分加上来自其先前经无菌过滤的溶液的任何其它所需成分的粉末。
取决于给药途径，药剂可以包覆于材料中以保护其免于遭受可能会使药剂失活的酶、酸和其它天然条件作用。举例来说，药剂可以在与酶抑制剂共同给予的适当载剂或稀释剂中或在适当载剂如脂质体中向受试者给予。医药学上可接受的稀释剂包括生理盐水和缓冲水溶液。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、氟磷酸二异丙酯(DEP)和抑肽酶。脂质体包括水包油包水乳液以及常规脂质体(Strejan等人，(1984)《神经免疫学杂志(J.Neuroimmunol)》7：27)。分散液还可以在甘油、液体聚乙二醇和其混合物中以及在油中制备。在一般储存和使用条件下，这些制剂可以含有防腐剂以防止微生物生长。
2.有效量和单位剂型
组合物中的活性剂(例如，TRAILPEG、DR抗体)优选以治疗有效量配制于组合物中。活性剂的治疗有效量可以根据以下因素变化，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及药剂在个体中引发所需反应的能力。给药方案可以调整以提供有益治疗反应。治疗有效量还是治疗有益作用超过药剂的任何毒性或有害作用的量。在另一实施例中，活性剂以预防有效量配制于组合物中。“预防有效量”是指在必需剂量下及在必需时间段内有效实现所需预防结果的量。典型地，因为预防剂量在疾病之前或在疾病的较早期用于受试者，所以预防有效量将小于治疗有效量。
组合物中活性化合物的量可以根据以下因素变化，如个体的疾病状态、年龄、性别和体重。给药方案可以调整以提供最优治疗反应。举例来说，如由治疗情况的紧急状态所指示的，可以给予单次推注，可以随着时间给予若干分次剂量，或可以按比例地减少或增加剂量。将肠胃外组合物配制成容易投药和剂量均一的单位剂型特别有利。如本文所用，单位剂型是指适合作为单一剂量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理离散单元；每个单元含有经计算以与所需医药载剂结合产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。单位剂型的规格由以下因素规定并且直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果，和(b)混合这类活性化合物用于治疗个体的灵敏度的领域中固有的局限性。
3.剂量和给药途径
药剂(例如TRAILPEG，DR抗体)的例示性剂量包括例如约0.0001％与5％、约0.0001％与1％、约0.0001％与0.1％、约0.001％与0.1％、约0.005％与0.1％、约0.01％与0.1％、约0.01％与0.05％和约0.05％与0.1％之间。任选地，剂量包括约0.001％与约50％、约0.01％与约5％、约0.1％与约2.5％、约0.2％与约2％、约0.3％与约1.5％、约0.4％与约1.25％、约0.5％与约1％、约0.6％与约0.9％和约0.7％与约0.8％之间的医药组合物或配制物。例示性剂量还可以与所治疗受试者的体重成比例表示，例如以mg/kg为单位，如约0.0001mg/kg与约1g/kg、0.001mg/kg与约1g/kg、约0.01mg/kg与约1g/kg、约0.1mg/kg与约1g/kg、约0.2mg/kg与约500mg/kg、0.3mg/kg与约200mg/kg、约0.4mg/kg与约100mg/kg、约0.5mg/kg与约50mg/kg、约0.6mg/kg与约30mg/kg、约7mg/kg与约20mg/kg、约0.8mg/kg与约15mg/kg、约1mg/kg与约10mg/kg、约2mg/kg与约8mg/kg和约4mg/kg与约6mg/kg之间。
可以全身、经肠、肠胃外、局部或通过经颊递送给予死亡受体激动剂。任选地，局部给予死亡受体激动剂。局部给药包括表面和/或皮下给药。可以在单次给药中或在一次或多次给药中给予有效量的激动剂。
可以在一次或多次给药中以有效剂量给予药剂(死亡受体激动剂)。有效剂量的药剂的每次给予可以时间间隔至少3小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少2周、至少3周或至少一个月。
药剂可以按以下方式给予：相对于在无本文所提供的组合物存在下的药剂，延长化合物的生物可用性的持续时间、增加药剂的作用的持续时间和药剂的释放时间范围选自由以下组成的群组的量：至少3小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少2周、至少3周和至少一个月，但至少一定量。任选地，延长前述作用中的任一个或全部的持续时间至少30分钟、至少一小时、至少2小时、至少3小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少2周、至少3周或至少一个月。
药剂可以配制成药剂是其中的唯一活性剂的医药组合物。或者，医药组合物可以含有其它活性剂。举例来说，可以组合使用两种或更多种化合物。此外，化合物可以与一种或多种对自身免疫疾病(例如系统性硬化症)具有调节作用的其它药剂组合。
IV.试剂盒
本公开还包括试剂盒，其包括有效量的药剂，如死亡受体激动剂(例如TRA1LPEG和DR抗体)；和使用说明书。
试剂盒可以在一个或多个准备好给药的灭菌的、预包装的注射器、胶囊、片剂、散剂、凝胶或贴片中包括有效剂量的药剂。
试剂盒可以包括其它药剂以及有效剂量的用于组合疗法的药剂。
本发明将通过参考以下非限制性实例得到进一步理解。
本发明通过以下实例进一步说明，所述实例不应理解为限制性的。遍及本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及图以引用的方式并入本文中。
实例
实例1：活化的成纤维细胞上调死亡受体(DR)并且DR激动剂选择性地诱导活化的肌成纤维细胞中的但不诱导正常成纤维细胞中的细胞凋亡.
活化的α-SMA+成纤维细胞(肌成纤维细胞)是硬皮病的起因之一。本文中证实，体内选择性根除肌成纤维细胞逆转SSc并且消释发炎。迄今为止，不存在靶向和影响人类中的肌成纤维细胞的临床测试的稳健方法。TRAILPEG据先前鉴别可通过靶向α-SMA+活化的肝和胰星形细胞来逆转肝和胰中的严重纤维化(国际申请公开第WO/2015/164217号)。在本公开中，TRAIL、TRAILPEG和DR5抗体据鉴别可靶向由成纤维细胞转化的α-SMA+肌成纤维细胞并且同时抑制SSc中的多个关键因素。当原代健康真皮成纤维细胞通过TGF-β1活化54小时时，活化的成纤维细胞上调α-SMA、DR4、DR5和包括胶原蛋白的纤维化标记物的mRNA和蛋白质水平(表1和2)。重要地，当活化的成纤维细胞用重组TRAIL(R&D SystemsTM，1ug/mL)、TRAILPEG(1ug/mL)和DR5抗体(1ug/mL，康纳木单抗与蛋白G和HGSTR2J/KMTRS)体外处理3小时时，仅活化的肌成纤维细胞归因于TRAIL诱导的细胞凋亡而展示细胞凋亡标记物活性卡斯蛋白酶-8和卡斯蛋白酶-3/7的水平增加并且展现形态变化(表3)。原代人肺成纤维细胞(
Figure BDA0001753430790000321
CCL-151)也通过TGF-β1(10ng/mL)活化54小时并且接着用TRAILPEG处理，并且仅活化的肺成纤维细胞归因于TRAIL诱导的细胞凋亡而展现形态变化。本文所提供的以下实例支持硬皮病模型(例如皮肤和肺纤维化)中的TRAILPEG和DR抗体功效。
表1.正常和TGF-β1活化的人类原代真皮成纤维细胞中的死亡受体、α-SMA(ACTA2)和胶原蛋白的mRNA水平(相对倍数).***P＜0.001对正常成纤维细胞.
Figure BDA0001753430790000331
表2.正常和TGF-β1活化的人类原代真皮成纤维细胞中的死亡受体和α-SMA的蛋白质水平(相对倍数).**P＜0.01，***p＜0.001对正常成纤维细胞.
Figure BDA0001753430790000332
表3.用TRAIL、TRAILPEG和DR5抗体(康纳木单抗与蛋白G和HGSTR2J/KMTRS)处理的正常成纤维细胞(正常)和TGF-β1活化的人类原代真皮成纤维细胞(MFB)中的卡斯蛋白酶-3/7(细胞凋亡标记物)活性(相对倍数).***P＜0.001对正常成纤维细胞.
Figure BDA0001753430790000333
实例2：TRAILPEG逆转皮肤增厚和胶原蛋白沉积
研究设计I(博莱霉素诱导的SSc小鼠模型中的轻微纤维化)
在体内研究中，使用利用博莱霉素诱导的硬皮病的小鼠模型。将小鼠(DBA2/J)用皮下(s.c.)博莱霉素处理(第0-28天)。从第15天持续两周每隔一天用TRAILPEG(10、20mg/kg)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)腹膜内(i.p.)处理；n＝5/组。实验设计的示意图描绘于图1中。在第28天收集模型的来自皮肤和肺的组织样品并且通过福尔马林处理制备用于组织学。将石蜡包埋的组织切片用苏木精-伊红(H&E)染色。此外，使用免疫组织化学分析组织切片的多种纤维发生标记物(胶原蛋白、α-SMA)。还通过蛋白质印迹(western blot)和RT-PCT分析组织匀浆的纤维发生标记物。
在小鼠皮肤硬皮病模型中在2周处理之后TRAILPEG处理逆转皮肤增厚以接近正常 级别
为了评估TRAILPEG在小鼠硬皮病模型中的作用，使用博莱霉素诱导的真皮纤维化模型。为了评估确立的纤维化的处理，在开始博莱霉素注射之后2周开始TRAILPEG处理的注射。在TRAILPEG处理2周之后，TRAILPEG处理小鼠中的发炎细胞浸润减少。定量评估显示，真皮的厚度在博莱霉素诱导的皮肤纤维化模型小鼠中与健康皮肤相比增加了大于70％；然而，向此类小鼠给予TRAILPEG减弱了真皮厚度的增加并且使其返回到正常水平(图2)。
在小鼠皮肤硬皮病模型中在2周处理之后TRAILPEG处理减少胶原蛋白沉积以接近 正常级别
博莱霉素诱导的纤维化中的皮肤病变展示厚胶原蛋白束在真皮中的致密积累，反映了胶原蛋白沉积的增加。然而，被给予TRAILPEG、博莱霉素伤害持续的小鼠展示显著减少的胶原蛋白沉积。使切片经历三色染色，其允许检测成熟胶原蛋白沉积的区域。博莱霉素诱导的小鼠中的皮肤病变展示厚胶原蛋白束在真皮中的致密积累，反映了胶原蛋白沉积的增加。然而，被给予TRAILPEG以及博莱霉素的小鼠展示显著逆转的胶原蛋白沉积。
为了检查TRAILPEG对体内胶原蛋白基因表达的作用，通过实时PCR定量病变皮肤中的mRNA。结果显示与正常小鼠相比，用博莱霉素处理的小鼠中的CollA1和CollA2mRNA水平有3倍增加。TRAILPEG处理显著地下调胶原蛋白mRNA(图3)。
实例3：TRAILPEG靶向SSc的起因
TRAILPEG处理显著地下调α-SMA+细胞群体(例如活化的成纤维细胞，肌成纤维细 胞，SSc的起因)
通过免疫组织化学测定α-SMA，用于鉴别在病理性纤维发生中起关键作用的肌成纤维细胞的标记物的表达。在博莱霉素处理的小鼠中，注意到病变真皮和皮下层中的α-SMA增加。TRAILPEG处理显著地减少α-SMA+成纤维细胞的数目。在博莱霉素处理的小鼠中，注意到病变真皮和皮下层中的α-SMA增加。TRAILPEG处理显著地减少α-SMA+成纤维细胞的数目。分别使用蛋白质印迹和实时PCR分析确定α-SMA蛋白质和基因水平。
实例4：TRAILPEG对转化生长因子β1(TGF-β1)和死亡受体5(DR5)表达的作用
TRAILPEG处理证实在体内模型中皮肤硬皮病可以逆转
转化生长因子是多种纤维化病症中的以及博莱霉素诱导的纤维化的动物模型中的纤维化的关键介体。为了评估TGF-β1在体内对TRAILPEG的调节，检查病变皮肤中的TGF-β1mRNA。TRAILPEG给予显著地预防TGF-β1mRNA的上调(图4)。
实例5：TRAILPEG逆转肺纤维化
TRAILPEG处理消除肺纤维化中的胶原蛋白和肌成纤维细胞刺激
为了检查TRAILPEG对博莱霉素诱导的肺纤维化中的胶原蛋白和α-SMA表达的作用，通过实时PCR定量肺中的mRNA。结果显示与正常小鼠相比，用博莱霉素处理的小鼠中的CollA1(图5)mRNA水平有大于50％增加。TRAILPEG处理显著地减弱胶原蛋白mRNA的上调。
TRAILPEG减弱博莱霉素诱导的肺纤维化中的血小板衍生生长因子(PDGF)
PDGF通过刺激其增殖、迁移和存活而在肌成纤维细胞的扩增中起关键作用。在肺的纤维化病变中一贯地展现升高的PDGF水平。为了检查TRAILPEG处理对博莱霉素诱导的肺中的PDGF表达的作用，通过实时PCR定量肺中的mRNA。结果显示与正常小鼠相比，被给予博莱霉素的小鼠中的PDGFα(图6A)和PDGFβ(图6B)mRNA水平增加。TRAILPEG处理显著地减弱PDGF mRNA的上调。
实例6：TRAILPEG逆转博莱霉素诱导的SSc小鼠模型中的晚期纤维化.
研究设计II(博莱霉素诱导的SSc小鼠模型中的晚期纤维化)
为了进一步证实DR激动剂在晚期纤维化的SSc小鼠模型中的抗纤维化功效，将小鼠(DBA2/J)用博莱霉素皮下(s.c.)处理三周(第0-21天)以建立皮肤纤维化，并且进一步用DR激动剂或PBS处理另外三周。持续三周(第22-42天；n＝7-10/组)每隔一天腹膜内(i.p.)给予TRAILPEG(5mg/kg)或PBS。在第43天收集组织样品并且如上文所描述进行分析。通过分析试剂盒(西格玛(Sigma))测量羟基脯氨酸(胶原蛋白标记物)含量。此外，使用免疫组织化学分析皮肤组织切片的多种纤维发生标记物(胶原蛋白、α-SMA)。通过蛋白质印迹和RT-PCT分析组织匀浆的DR5、α-SMA、TGF-β1、胶原蛋白、PDGFR和PDGF。为了证实TRAIL诱导的细胞凋亡，通过分析试剂盒测量皮肤组织中的卡斯蛋白酶-8和卡斯蛋白酶-3/7活性。
结果：
注射博莱霉素诱导显著皮肤纤维化与真皮增厚、胶原蛋白沉积、真皮内脂肪组织损失、致密发炎性浸润和肌成纤维细胞分化。与注射3周随后注射NaCl另外3周相比，注射博莱霉素延长的6周使皮肤纤维化的严重程度接近。与被注射博莱霉素3周的PBS处理小鼠相比，在3周博莱霉素攻击之后开始的TRAILPEG处理改善纤维化进展，发炎性浸润、真皮厚度、羟基脯氨酸含量和肌成纤维细胞计数显著减小(表4)。此外，TRAILPEG降低预先确立的真皮纤维化样品中的纤维化标记物(ACTA2、TGF-β1、CollA1、CollA2、PDGFR-β和PDGFα)mRNA水平的表达(表5)。还发现，与PBS处理小鼠相比，博莱霉素处理小鼠中的DR5mRNA水平显著更高。证实了TRAILPEG处理的博莱霉素诱导的SSc小鼠的皮肤中的TRAIL诱导的细胞凋亡的增加，但在健康小鼠的皮肤中不增加(表6)。
表4：TRAILPEG在博莱霉素诱导的皮肤纤维化中的作用(相对倍数).***P＜0.001对正常+PBS，##P＜0.01，###P＜0.001对博莱霉素+PBS.
Figure BDA0001753430790000361
表5：皮肤中的DR5、ACTA2、TGF-β1、CollA1、CollA2、PDGFR-β和PDGFα的mRNA水平的实时PCR分析(相对倍数).*P＜0.05，***P＜0.001对正常+PBS，#P＜0.05，###P＜0.001对博莱霉素+PBS.
Figure BDA0001753430790000362
表6：用TRAILPEG处理的对照组和博莱霉素诱导的皮肤纤维化小鼠的皮肤中的卡斯蛋白酶-8和卡斯蛋白酶-3/7活性.*P＜0.05，**P＜0.01对正常+PBS.
Figure BDA0001753430790000363
实例7：DR激动剂(TRAILPEG)改善紧皮-1(Tight skin-1，TSK-1)转基因SSc小鼠模型中的纤维化.
研究DR激动剂(TRAILPEG)在TSK-1小鼠中的作用。TSK-1表型由肌原纤维蛋白-1基因中的显性突变产生，其引起SSc类疾病，皮肤有微小浸润、自身抗体产生和纤维化。这种模型模拟皮肤纤维化的具有较少发炎的后期。TSK-1小鼠购自
Figure BDA0001753430790000372
实验室。在5周大时开始处理并且在10周大时研究结果。在野生型(WT)小鼠或TSK-1小鼠中持续五周(第5-10周；n＝7-10/组)每隔一天腹膜内(i.p.)给予TRAILPEG(5mg/kg)或PBS。如表7中概述，与对照(野生型，WT)相比，TSK-1小鼠展现增加的真皮厚度、羟基脯氨酸含量(胶原蛋白标记物)和α-SMA+肌成纤维细胞细胞群体。与PBS处理的TSK-1小鼠相比，用TRAILPEG(1mg/kg)处理TSK-1小鼠5周减少皮肤的真皮增厚、羟基脯氨酸含量和肌成纤维细胞计数。
表7：TRAILPEG在TSK-1小鼠中的作用(相对倍数).*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001对WT+PBS，#P＜0.05，###P＜0.001对TSK-1+PBS.
Figure BDA0001753430790000371
实例8：DR抗体(MD5-1，小鼠抗DR5抗体)逆转博莱霉素诱导的SSc小鼠模型中的晚期纤维化.
为了进一步证实激动DR抗体在晚期纤维化的SSc小鼠模型中的抗纤维化功效，如研究设计II中所描述，将小鼠(DBA2/J)用博莱霉素皮下(s.c.)处理三周(第0-21天)以建立皮肤纤维化，并且进一步每隔一天用DR5抗体(100μg/小鼠)、IgG(对照)或PBS处理另外三周(第22-42天；n＝7-10/组)。
在第43天收集组织样品并且如上文所描述进行分析。如上文所描述测量真皮厚度和羟基脯氨酸(胶原蛋白标记物)含量以及α-SMA+肌成纤维细胞细胞群体。通过RT-PCT分析组织匀浆的α-SMA、TGF-β1、胶原蛋白、PDGFR和PDGF。为了证实TRAIL诱导的细胞凋亡，通过分析试剂盒测量皮肤组织中的卡斯蛋白酶-8和卡斯蛋白酶-3/7活性。
结果：
在具有预先确立的纤维化的SSc小鼠中用抗DR5抗体(MD5-1)处理3周改善皮肤纤维化，真皮厚度、羟基脯氨酸含量和肌成纤维细胞计数显著降低(表8)。另外，给予MD5-1显著降低预先确立的纤维化中的ACTA2(α-SMA)、CollA1、CollA2、TGF-β1、PDGFR-β和PDGFα的mRNA水平(表9)。通过卡斯蛋白酶-8和卡斯蛋白酶-3/7活性分析证实因MD5-1所致的DR-介导的细胞凋亡(表10)。
表8：DR激动抗体(MD5-1)在博莱霉素诱导的SSc小鼠中的作用(相对倍数).***P＜0.001对正常+IgG，###P＜0.001对博莱霉素+IgG.
Figure BDA0001753430790000381
表9：皮肤中的ACTA2、TGF-β1、CollA1、CollA2、PDGFR-β和PDGFα的mRNA水平的实时PCR分析(相对倍数).*P＜0.05，***P＜0.001对正常+IgG，###P＜0.001对博莱霉素+IgG.
Figure BDA0001753430790000382
表10：用DR抗体处理的对照组和博莱霉素诱导的皮肤纤维化小鼠的皮肤中的卡斯蛋白酶-8和卡斯蛋白酶-3/7活性.**P＜0.01，***P＜0.001对正常+IgG.
Figure BDA0001753430790000383
其它实施例
虽然本发明已经结合其详细描述描述，但前述描述意图说明并且不限制由所附权利要求书的范围定义的本发明的范围。其它方面、优势和修改在所附权利要求书的范围内。
本文提及的专利和科学文献确定了本领域的技术人员可获得的知识。本文引用的所有美国专利和公开或未公开的美国专利申请都以引用的方式并入。本文所引用的所有公开的外国专利和专利申请都以引用的方式并入本文中。由本文所引用的寄存编号指示的Genbank和NCBI提交以引用的方式并入本文中。本文所引用的所有其它公开的参考文献、文档、文稿和科学文献都以引用的方式并入本文中。
虽然已经参考本发明的优选实施例来具体地显示并且描述本发明，但本领域的技术人员应理解，在不脱离如由随附权利要求书所涵盖的本发明范围的情况下，可以在其中作出形式和细节的各种变化。
等效物
本领域的技术人员顶多使用常规实验即可识别出或能够确定本文所描述的特定实施例的许多等效物。此类等效物意图由所附权利要求书涵盖。
序列表
<110> 约翰霍普金斯大学(The Johns Hopkins University)
<120> 用死亡受体激动剂改善系统性硬化症
<130> JHU C 13772
<141> 2016-12-16
<150> 62/268,637
<151> 2015-12-17
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 281
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys
1 5 10 15
Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
20 25 30
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
35 40 45
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr
50 55 60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val
65 70 75 80
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser
85 90 95
Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro
100 105 110
Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
115 120 125
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
130 135 140
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
145 150 155 160
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
165 170 175
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
180 185 190
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
195 200 205
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
210 215 220
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
245 250 255
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
260 265 270
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
275 280

Claims (24)

1.DR4或DR5激动剂在制备治疗哺乳动物受试者的系统性硬化症(SSc)的药物中的应用；
其中所述DR4或DR5激动剂以可阻断成纤维细胞的活化或耗尽经转化生长因子(TGF)-β诱导的活化的肌成纤维细胞，以及减少胶原蛋白沉积到正常水平的有效量给予所述受试者。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述SSc是局限性硬皮病或弥漫性硬皮病。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述DR4或DR5激动剂包含肿瘤坏死因子(TNF)相关细胞凋亡诱导配体(TRAIL)、TRAIL细胞外结构域或死亡受体激动抗体。
4.根据权利要求1所述的应用，其中所述DR4或DR5激动剂包含SEQ ID NO:1的人类重组TRAIL、TRAIL细胞外结构域，所述TRAIL细胞外结构域包括从位置115处的精氨酸到位置281处的甘氨酸或位置95处的苏氨酸到位置281处的甘氨酸的氨基酸；或具有D218H取代、D218Y取代、D269H取代、D269H和E195R取代、D269H和T214R取代的SEQ ID NO:1。
5.根据权利要求1所述的应用，其中所述DR4或DR5激动剂包含天然TRAIL。
6.根据权利要求1所述的应用，其中所述DR4或DR5激动剂选自由以下组成的群组：来沙木单抗(Lexatumumab)、替加珠单抗(Tigatuzumab)、康纳木单抗(Conatumumab)、德罗兹妥单抗(Drozitumab)、HGSTR2J/KMTRS和LBY-135。
7.根据权利要求1所述的应用，其中所述DR4或DR5激动剂包含选自由以下组成的群组：TAS266和scTRAIL-RBD。
8.根据权利要求1所述的应用，其中所述DR4或DR5激动剂包括选择性地连接到聚合物的SEQ ID NO:1的人类重组TRAIL、TRAIL细胞外结构域，所述TRAIL细胞外结构域包括从位置115处的精氨酸到位置281处的甘氨酸或位置95处的苏氨酸到位置281处的甘氨酸的氨基酸；或具有D218H取代、D218Y取代、D269H取代、D269H和E195R取代、D269H和T214R取代的SEQID NO:1。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述聚合物包含聚乙二醇(PEG)或其衍生物。
10.根据权利要求9所述的应用，其中所述PEG或PEG衍生物选自由以下组成的群组：甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯、甲氧基聚乙二醇琥珀酸酯N-羟基琥珀酰亚胺、甲氧基聚乙二醇丙醛、甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺和多支化聚乙二醇。
11.根据权利要求9所述的应用，其中所述PEG或其衍生物的分子量在1,000Da与100,000Da之间。
12.根据权利要求9所述的应用，其中所述PEG或其衍生物的分子量在5,000Da与50,000Da之间。
13.根据权利要求1所述的应用，其中所述DR4或DR5激动剂经全身性给予。
14.根据权利要求1所述的应用，其中所述DR4或DR5激动剂经局部给予。
15.根据权利要求1所述的应用，其中所述DR4或DR5激动剂经皮下给予。
16.根据权利要求1所述的应用，其中与适当对照相比治疗或预防所述受试者中的纤维化。
17.根据权利要求1所述的应用，其中所述DR4或DR5激动剂以通过注射以0.001mg/kg与50mg/kg之间的剂量给予所述受试者。
18.根据权利要求1所述的应用，其中所述DR4或DR5激动剂以通过注射以0.5mg/kg与50mg/kg之间的剂量给予所述受试者。
19.根据权利要求1所述的应用，其中经一天或多天的时间段向所述受试者给予所述有效量的所述DR4或DR5激动剂。
20.根据权利要求1所述的应用，其中所述受试者是人类。
21.根据权利要求1所述的应用，其中所述有效量的DR4或DR5激动剂的所述给予，与适当对照相比，减小真皮厚度、皮肤胶原蛋白水平、TGF-β、PDGFR、PDGF、IL-6水平和/或减少α-SMA+成纤维细胞。
22.根据权利要求21所述的应用，其中在一个或多个剂量中给予所述有效量的所述DR4或DR5激动剂。
23.根据权利要求1所述的应用，其中所述DR4或DR5激动剂以有效与适当对照相比减小真皮厚度的量存在。
24.根据权利要求1所述的应用，其中所述有效量的DR4或DR5激动剂的所述给予恢复皮肤的正常伤口愈合。
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