JP2023537005A - Il10受容体結合性分子および使用方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書において提供されるのは、IL10RaおよびIL10Rbに結合し、かつIL10Rb sdAbおよびIL10Rb VHH抗体を含む、IL10R結合性分子である。TIFF2023537005000197.tif184170
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2020年8月5日に出願された米国仮出願第63/061,562号、2020年9月15日に出願された米国仮出願第63/078,745号、2021年1月11日に出願された米国仮出願第63/135,884号、および2021年1月11日に出願された米国仮出願第63/136,098号に対する優先権を主張し、これらの開示は、参照により全体がすべての目的のために本明細書に組み入れられる。
本出願は、2020年8月5日に出願された米国仮出願第63/061,562号、2020年9月15日に出願された米国仮出願第63/078,745号、2021年1月11日に出願された米国仮出願第63/135,884号、および2021年1月11日に出願された米国仮出願第63/136,098号に対する優先権を主張し、これらの開示は、参照により全体がすべての目的のために本明細書に組み入れられる。
開示の背景
サイトカインおよび増殖因子リガンドは典型的には細胞表面受容体サブユニットの多量体化を通じてシグナル伝達を行う。一部の事例において、サイトカインは、そのような受容体サブユニットの会合を促す多特異性(例えば、二特異性または三特異性)リガンドとして作用して、それらの細胞内ドメインを、細胞内シグナル伝達が起こり得るような近接状態にする。サイトカインの性質は、どの受容体サブユニットが会合してサイトカイン受容体複合体を形成するのかを決定する。サイトカインはそのため、個々の受容体サブユニットを、細胞内シグナル伝達をもたらす受容体複合体へと架橋するように作用する。
サイトカインおよび増殖因子リガンドは典型的には細胞表面受容体サブユニットの多量体化を通じてシグナル伝達を行う。一部の事例において、サイトカインは、そのような受容体サブユニットの会合を促す多特異性(例えば、二特異性または三特異性)リガンドとして作用して、それらの細胞内ドメインを、細胞内シグナル伝達が起こり得るような近接状態にする。サイトカインの性質は、どの受容体サブユニットが会合してサイトカイン受容体複合体を形成するのかを決定する。サイトカインはそのため、個々の受容体サブユニットを、細胞内シグナル伝達をもたらす受容体複合体へと架橋するように作用する。
サイトカイン受容体サブユニットの細胞内ドメインはプロリンリッチJAK結合ドメインを有し、該ドメインは、細胞膜の内部表面近くのサイトカイン受容体サブユニットの細胞内ドメインのbox1/box領域に典型的には位置する。細胞内JAKキナーゼはJAK結合ドメインと会合する。細胞内ドメイン受容体サブユニットが、典型的には受容体サブユニットの細胞外ドメインに対する受容体のコグネイトリガンドの結合により近接状態にされた場合に、JAKは互いをリン酸化する。4つのヤヌスキナーゼが哺乳動物細胞において同定されている:JAK1、JAK2、JAK3およびTYK2。Ihle,et al.(1995)Nature 377(6550):591-4,1995; O'Shea and Plenge(2012)Immunity 36(4):542-50。JAKのリン酸化は、JAKにおけるコンホメーション変化を誘導して、他の細胞内タンパク質をさらにリン酸化する能力を提供し、それは受容体と関連付けられる細胞内シグナルを伝達する複数の細胞内因子の活性化を結果としてもたらすカスケードを開始させて、細胞内応答、例えば遺伝子転写を結果としてもたらし、これは頻繁に下流シグナル伝達として言及される。多くの事例において、JAKによりリン酸化されるタンパク質は、シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子(STAT)タンパク質ファミリーのメンバーである。哺乳動物STATファミリーの7つのメンバーが現在までに同定されている:STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a STAT5b、およびSTAT6。Delgoffe,et al.,(2011)Curr Opin Immunol.23(5):632-8; Levy and Darnell(2002)Nat Rev Mol Cell Biol.3(9):651-62およびMurray,(2007)J Immunol.178(5):2623-9。JAK/STAT経路と総称的に称される、活性化されたJAKおよびSTATタンパク質の選択的な相互作用は、サイトカイン結合に応答して観察される多様な細胞内応答を提供する。
ヒトゲノムは、約40の異なるJAK/STATサイトカイン受容体をコードする。原理的に、約1600の独特のホモ二量体およびヘテロ二量体サイトカイン受容体ペアが、異なるJAK/TYK/STATの組合せを通じてシグナル伝達を行う潜在能力と共に生成され得る(Bazan,Proc Natl Acad Sci U S A.87(18):6934-8,1990; Huising et al.,J Endocrinol.189(1):1-25,2006)。しかしながら、現在の知識では、ヒトゲノムは50未満の異なるサイトカインリガンドをコードし(Bazan,Proc Natl Acad Sci U S A.87(18):6934-8,1990; Huising et al.,J Endocrinol.189(1):1-25,2006)、サイトカイン受容体複合体の範囲を、天然リガンドによりアセンブルされ得るものに限定している。サイトカイン受容体サブユニットの細胞外ドメインとのサイトカインリガンドの相互作用が受容体複合体中の受容体サブユニットの組成を決定し、細胞内JAK/TYKおよびRTK酵素は縮退していることを考慮すると、天然において起こるサイトカインおよび増殖因子受容体二量体ペア形成の数は、系により理論的に許容されるシグナル伝達コンピテント受容体の総数の部分に過ぎないものとなる。
天然に存在するサイトカインリガンドは多様な細胞応答を媒介する。一部の事例において、ヘテロ多量体サイトカイン受容体は、「専有」(proprietary)サブユニットとして言及される、その受容体複合体に独特の1つまたは複数の受容体サブユニットから構成され、これは、「共通」受容体サブユニットとして頻繁に言及される、複数のサイトカイン受容体により共有される他の受容体サブユニットと相互作用する。例えば、IL7受容体は、IL7Ra専有サブユニットと、IL2、IL4、IL19、IL15およびIL21を含む複数のサイトカイン受容体複合体の共有される受容体サブユニットであるため「共通ガンマ」サブユニットとしても言及されるCD132サブユニットとのヘテロ二量体受容体複合体である。受容体サブユニットのECDに対するサイトカインの相互作用の相対的な親和性および動態ならびにサイトカイン結合に応答して形成される複合体の安定性は、細胞内シグナル伝達の性質および強度を媒介する。一部の事例において、専有サブユニットへのサイトカインの結合は完全な受容体の形成を増強し、共通サブユニットに対するサイトカインの親和性は、専有サブユニットと会合していない場合に有意により低いものとなり得る。
サイトカインリガンドと受容体サブユニットとの間の相互作用の微妙な差違は、重大な科学的研究事項である。例えば、天然に存在するサイトカインの多くの特性はヒト疾患の処置におけるそれらの潜在的な有用性を示唆するが、そのような天然に存在するサイトカインはまた、有害なおよび望ましくない効果のトリガーとなり得る。多くの事例において、疾患は、潜在的に治療的なサイトカインの受容体を発現する特定の細胞型と関連付けられる。しかしながら、サイトカイン受容体はまた、治療的介入のために標的とされることが望ましくない他の細胞型上にも発現される。ネイティブなリガンドの投与は両方の細胞型を活性化させて、望ましくない副作用を結果としてもたらす。
所望の細胞型の選択的な活性化を提供するサイトカインアナログを生成することを試みるために、受容体サブユニットの細胞外ドメインに対するそれらの親和性を選択的にモジュレートするように様々な操作されたサイトカインリガンド(またはその構成要素)が生成されている。これらの努力は、望ましくない効果からのリガンドの有益な特性の非連関を結果としてもたらす部分的な活性を提供することが示されたサイトカインバリアントを生成している。例えば、Mendoza,et al.(2019)567:56-60を参照。しかしながら、そのような選択的なサイトカインリガンドの操作は、リガンドおよび受容体のインターフェースにおける個々のアミノ酸残基の選択的なモジュレーションに基づく。サイトカイン受容体親和性のモジュレーションへのこのタンパク質操作アプローチは、受容体サブユニットとのインターフェースにあるサイトカインの残基を同定するために受容体およびサイトカインの相互作用の3次元の、通常はx線結晶学的な、マップを要求する。追加的に、これらのインターフェース残基におけるアミノ酸置換の効果は、高度に可変的であり得、多くの場合に、所望される活性プロファイルを生成するために要求される特定のアミノ酸置換を同定するために、著しい量の時間を消費する試行錯誤を要求する。しかしながら、所望されるシグナル伝達プロファイルを有する操作されたサイトカインが達成されたとしても、多くのタンパク質はアミノ酸置換に対して高度に感受性であり、哺乳動物発現系および原核系の両方において、組換え発現についての重大な問題を結果としてもたらし、そのようなアミノ酸置換は、封入体中で発現される場合にタンパク質リフォールディングに影響し得る。以上の問題は、サイトカインそれ自体がヘテロ二量体である場合に特に深刻である。例えば、IL12はp35およびp40サブユニットのヘテロ二量体として存在する。受容体サブユニットとのインターフェース(例えばp40/IL12Rb2インターフェース)におけるサイトカインサブユニットのリガンド操作の1つのサブユニットのインターフェースの1つの残基の操作は、サイトカインリガンドサブユニット(例えばp35およびp40)の会合に伴う問題を引き起こし得る。追加的に、IL12のp40サブユニットは、その活性がまたそのようなアミノ酸置換により影響され得る単量体およびホモ二量体としての機能を有する。結果的に、サイトカインの活性を提供し、受容体親和性のために容易に生成および操作可能であり、独立したオフターゲット活性を有しない分子に対する必要性が当技術分野において存在する。
開示の概要
本開示は、哺乳動物対象における疾患の処置において有用な望ましい効果を生成するための細胞受容体のペア形成において有用な組成物を提供する。
本開示は、哺乳動物対象における疾患の処置において有用な望ましい効果を生成するための細胞受容体のペア形成において有用な組成物を提供する。
本開示は、第1の受容体サブユニットに特異的に結合する、第1のドメインと、第2の受容体サブユニットに特異的に結合する、第2のドメインとを少なくとも含む組成物であって、第1および第2の受容体を発現している細胞と接触すると、該組成物が第1および第2の受容体の機能的な会合を引き起こし、それにより、それらの相互作用のトリガーとなり、下流のシグナル伝達をもたらすような、組成物を提供する。一部の態様において、第1および第2の受容体は、コグネイトリガンドの結合に応答して近接状態となり、かつ、これらは本明細書において「天然」サイトカイン受容体ペアとして言及される。
1つの態様において、本開示は、IL10受容体のIL10Raに結合する第1のドメインと、IL10受容体のIL10Rbに結合する第2のドメインとを含む結合性分子であって、IL10Ra受容体およびIL10Rb受容体を発現している細胞と接触すると、IL10R結合性分子は、IL10RaおよびIL10Rbの機能的な会合を引き起こし、それにより、受容体の機能的な二量体化および下流のシグナル伝達をもたらすような、結合性分子を提供する。
本開示は、
(a)サイトカイン受容体の第1のサブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第1の単一ドメイン抗体(sdAb)と、
(b)サイトカイン受容体サブユニットの第2のサブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第2の単一ドメイン抗体と
を含む、サイトカイン受容体のリガンドであるサイトカイン受容体結合性分子であって、
・第1のsdAbおよび第2のsdAbが安定な会合状態にあり;
・サイトカイン受容体の第1および第2のサブユニットが、サイトカイン受容体のコグネイトリガンドとの接触に応答して二量体化し; かつ
・サイトカイン受容体の第1および第2のサブユニットを発現している細胞を有効量のサイトカイン受容体結合性分子と接触させることが、結果としてサイトカイン受容体の第1および第2のサブユニットの細胞内ドメインを近接状態にして、細胞内シグナル伝達をもたらす、
該サイトカイン受容体結合性分子を提供する。
(a)サイトカイン受容体の第1のサブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第1の単一ドメイン抗体(sdAb)と、
(b)サイトカイン受容体サブユニットの第2のサブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第2の単一ドメイン抗体と
を含む、サイトカイン受容体のリガンドであるサイトカイン受容体結合性分子であって、
・第1のsdAbおよび第2のsdAbが安定な会合状態にあり;
・サイトカイン受容体の第1および第2のサブユニットが、サイトカイン受容体のコグネイトリガンドとの接触に応答して二量体化し; かつ
・サイトカイン受容体の第1および第2のサブユニットを発現している細胞を有効量のサイトカイン受容体結合性分子と接触させることが、結果としてサイトカイン受容体の第1および第2のサブユニットの細胞内ドメインを近接状態にして、細胞内シグナル伝達をもたらす、
該サイトカイン受容体結合性分子を提供する。
本開示のIL10R結合性分子は、IL10RaおよびIL10Rb受容体サブユニットの細胞外ドメインに選択的に結合する2つまたはより多くの単一ドメイン抗体を含む。1つの態様において、本開示は、
(c)IL10受容体のIL10Raサブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第1の単一ドメイン抗体(sdAb)(「IL10Ra sdAb」)と、
(d)IL10受容体のIL10Rbサブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第2の単一ドメイン抗体(「IL10Rb sdAb」)と
を含む、IL10R受容体のリガンドであるIL10受容体(IL10R)結合性分子であって、
・第1のsdAbおよび第2のsdAbが安定な会合状態にあり;
・IL10受容体のIL10RaおよびIL10Rbサブユニットが、IL10R結合性分子との接触に応答して二量体化し; かつ
・IL10RaおよびIL10Rbを発現している細胞を有効量のIL10R結合性分子と接触させることが、結果としてIL10RaおよびIL10Rbの細胞内ドメインを近接状態にして、細胞内シグナル伝達をもたらす、
該IL10R受容体結合性分子を提供する。
(c)IL10受容体のIL10Raサブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第1の単一ドメイン抗体(sdAb)(「IL10Ra sdAb」)と、
(d)IL10受容体のIL10Rbサブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第2の単一ドメイン抗体(「IL10Rb sdAb」)と
を含む、IL10R受容体のリガンドであるIL10受容体(IL10R)結合性分子であって、
・第1のsdAbおよび第2のsdAbが安定な会合状態にあり;
・IL10受容体のIL10RaおよびIL10Rbサブユニットが、IL10R結合性分子との接触に応答して二量体化し; かつ
・IL10RaおよびIL10Rbを発現している細胞を有効量のIL10R結合性分子と接触させることが、結果としてIL10RaおよびIL10Rbの細胞内ドメインを近接状態にして、細胞内シグナル伝達をもたらす、
該IL10R受容体結合性分子を提供する。
1つの態様において、サイトカイン受容体結合性分子は、IL10受容体のリガンドであり、かつIL10Ra受容体サブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第1のsdAbと、IL10Rb受容体サブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第2のsdAbとを含む。
一部の態様において、抗IL10Rα sdAbはVHH抗体(抗IL10Rα VHH抗体)であり、かつ/または抗IL10Rβ sdAbはVHH抗体(抗IL10Rβ VHH抗体)である。一部の態様において、抗IL10Rα sdAbおよび抗IL10Rβ sdAbはペプチドリンカーによりつながれている。一部の態様において、ペプチドリンカーは1~50個のアミノ酸を含む。
別の局面において、本開示は、その必要のある対象において新生物性疾患、例えばがんを処置する方法であって、対象に本明細書に記載されるIL10R結合性タンパク質を投与することを含み、IL10R結合性タンパク質が、CD8+T細胞、CD4+T細胞、マクロファージ、および/またはTreg細胞に結合してそれを活性化させる、方法を提供する。一部の態様において、IL10R結合性タンパク質は、ペグ化されたIL10よりも長い治療有効性を提供する。一部の態様において、がんは固形腫瘍がんである。
他の局面において、本明細書に記載されるIL10R結合性タンパク質はまた、炎症性疾患、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、ならびに自己免疫疾患、例えば乾癬、関節リウマチ、および多発性硬化症を処置するために使用され得る。
一部の態様において、結合性分子の1つのsdAbはscFvであり、および他のsdAbはVHHである。
一部の態様において、第1および第2のsdAbは、化学的連結を介して共有結合している。
一部の態様において、第1および第2のsdAbは単一の連続的なポリペプチドとして提供される。
本発明は、IL10受容体の合成リガンドであるIL10R結合性分子を提供する。
一部の態様において、本発明のIL10R結合性分子は、以下の式[#1]のポリペプチドである:
H2N-(IL10 VHH#1)-(L1)a-(IL10 VHH#2)-(L2)b-(CP)c-COOH[#1]
式中:「-」は共有結合を表し; L1およびL2はリンカーであり; CPはキレート化ペプチドであり; a、b、およびcは、整数0または1から独立して選択され; 「H2N」はアミノ末端を表し; ならびに「COOH」はポリペプチドのカルボキシ末端を表す。
H2N-(IL10 VHH#1)-(L1)a-(IL10 VHH#2)-(L2)b-(CP)c-COOH[#1]
式中:「-」は共有結合を表し; L1およびL2はリンカーであり; CPはキレート化ペプチドであり; a、b、およびcは、整数0または1から独立して選択され; 「H2N」はアミノ末端を表し; ならびに「COOH」はポリペプチドのカルボキシ末端を表す。
一部の態様において、本発明は、IL10 VHH#1がILRa sdAbであり、かつIL10 VHH#2がIL10Rb sdAbである、IL10 VHH#1がILRb sdAbであり、かつIL10 VHH#2がIL10Ra sdAbである、式[#1]のポリペプチドである本発明のIL10R結合性分子を提供する。
一部の態様において、本発明は、
・SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、および52のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50および53のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51および54のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3
を含むIL10Ra sdAbを含む、IL10R結合性分子を提供する。
・SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、および52のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50および53のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51および54のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3
を含むIL10Ra sdAbを含む、IL10R結合性分子を提供する。
一部の態様において、本発明は、
・SEQ ID NO:55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148および151のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149および152のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150および153のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3
を含むIL10Rb sdAbを含む、IL10R結合性分子を提供する。
・SEQ ID NO:55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148および151のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149および152のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150および153のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3
を含むIL10Rb sdAbを含む、IL10R結合性分子を提供する。
一部の態様において、本発明は、SEQ ID NO:154~171のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するIL10Ra sdAbを含む、IL10R結合性分子を提供する。
一部の態様において、本発明は、SEQ ID NO:172~198またはSEQ ID No:199~201のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するIL10Rb sdAbを含む、IL10R結合性分子を提供する。
一部の態様において、本発明は、SEQ ID NO:256~353のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するIL10R結合性分子を提供する。
一部の態様において、本発明は、SEQ ID NO:172~198またはSEQ ID No:199~201のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するIL10Rb sdAbを含む、IL10R結合性分子を提供する。
一部の態様において、本発明は、表29のSEQ ID NO:[DR1511~DR1525]のIL10R結合性分子のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有するIL10R結合性分子を提供する。一部の態様において、本発明は、表29のSEQ ID NO:[DR1511~DR1525]のIL10R結合性分子のいずれか1つと実質的に同一のIL10R結合性分子を提供する。一部の態様において、本発明は、表29のSEQ ID NO:[DR1511~DR1525]のIL10R結合性分子のいずれか1つの配列と同一のIL10R結合性分子を提供する。
1つの態様において、本開示は、単球と比べてT細胞、特にCD8+T細胞を優先的に活性化させるIL10Ra結合性分子を提供する。1つの態様において、本開示は、IL10Rbの細胞外ドメインに対するIL10Rb sdAbの親和性よりも高い、IL10Raの細胞外ドメインに対する親和性を、IL10Ra sdAbの親和性が有する、式#1のIL10Ra結合性分子を提供する。
一部の態様において、本開示は、哺乳動物対象においてインビボで長期化された作用の持続期間を提供するように修飾されたIL10R結合性分子およびその薬学的に許容される製剤を提供する。一部の態様において、本発明は、PEG化された式#1のIL10R結合性分子であって、PEGがIL10R結合性分子にコンジュゲートされており、およびPEGが、約2,000~約80,000ダルトン、代替的に約2,000~約70,000ダルトン、代替的に約5,000~約50,000ダルトン、代替的に約10,000~約50,000ダルトン、代替的に約20,000~約50,000ダルトン、代替的に約30,000~約50,000ダルトン、代替的に約20,000~約40,000ダルトン、または代替的に約30,000~約40,000ダルトンの分子量を有する直鎖状または分岐鎖状PEG分子である、該IL10R結合性分子を提供する。本開示の1つの態様において、PEGは、2つの20kDのアームを含む40kDの分岐鎖状PEGである。
本開示のIL10R結合性分子は、哺乳動物対象における疾患の処置または予防において有用である。一部の態様において、本開示は、治療有効量の本開示のIL10R結合性分子の投与による、哺乳動物対象における自己免疫疾患の処置または予防を提供する。一部の態様において、本開示は、治療有効量の本開示のIL10R結合性分子の投与による、哺乳動物対象における、ウイルスおよび慢性ウイルス感染症を含む感染性疾患の処置または予防を提供する。一部の態様において、本開示は、治療有効量の本開示のIL10R結合性分子の投与による、哺乳動物対象における新生物性疾患の処置または予防を提供する。一部の態様において、本開示は、1つまたは複数の補充的な治療剤と組み合わせた治療有効量の本開示のIL10R結合性分子の投与による、哺乳動物対象における新生物性、感染性または自己免疫の処置または予防を提供する。
本開示は、哺乳動物対象への投与のためのIL10R結合性分子の薬学的に許容される製剤をさらに提供する。本開示は、哺乳動物対象への投与のための薬学的に許容される組成物であって、該組成物が、ポリペプチドIL10R結合性分子をコードする核酸配列、ポリペプチドIL10R結合性分子をコードする組換えウイルスもしくは非ウイルスベクター、またはポリペプチドIL10R結合性分子をコードする核酸配列を含む、組換えにより改変された哺乳動物細胞を含み、各々の場合において核酸配列が哺乳動物細胞において機能的な1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されている、組成物をさらに提供する。
本開示は、ポリペプチドIL10R結合性分子をコードする核酸配列を提供する。本開示は、ポリペプチドIL10R結合性分子をコードする核酸配列を含む組換えベクターをさらに提供する。本開示は、ポリペプチドIL10R結合性分子をコードする核酸を含む組換えにより改変された哺乳動物細胞をさらに提供する。本開示は、ポリペプチドIL10R結合性分子の組換え製造、単離、精製および特徴付けの方法をさらに提供する。ポリペプチドIL10R結合性分子をコードする核酸配列を含む組換えベクターを提供する。
本開示はまた、1つまたは複数の発現制御配列に機能的に連結された二特異性結合性分子をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。本開示はまた、宿主細胞において機能的な1つまたは複数の発現制御配列に機能的に連結された二特異性結合性分子をコードする核酸を含む発現ベクター発現ベクターを含む、単離された宿主細胞を提供する。
別の局面において、本開示は、本明細書に記載されるIL10R結合性分子および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。
別の局面において、本開示は、その必要のある対象において自己免疫もしくは炎症性疾患、障害、もしくは状態またはウイルス感染症を処置する方法であって、対象に治療有効量の本明細書に記載されるIL10R結合性分子または本明細書に記載される薬学的組成物を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの利点が、本明細書に記載される結合性分子から得られる。IL10受容体の天然リガンド、IL10は、IL10RaおよびIL10Rbが近接状態となることを引き起こす(すなわち、IL10へのそれらの同時の結合による)。しかしながら、IL10が哺乳動物、特にはヒト対象において治療剤として使用される場合、それはまた、他の細胞型上のIL10RaおよびIL10Rbの存在を含む様々な機序により多数の有害なおよび望ましくない効果のトリガーとなり得、他の細胞型上のIL10RaおよびIL10Rbへの結合は、IL10RaおよびIL10Rbを発現している細胞における望ましくない効果および/または望ましくないシグナル伝達をもたらし得る。本開示は、望ましくない活性および/または細胞内シグナル伝達を最小化しながら、所望される治療的なシグナル伝達が、特には所望される細胞または組織サブタイプにおいて起こるように、IL10RaおよびIL10Rb結合の複数の効果をモジュレートする方法および組成物に方向付けられている。
一部の態様において、本明細書に記載されるIL10R結合性分子はIL10受容体の部分アゴニストである。一部の態様において、本明細書に記載される結合性分子は、結合性分子が完全アゴニストであるように設計される。一部の態様において、本明細書に記載される結合性分子は、結合性分子がスーパーアゴニストであるように設計される。
一部の態様において、結合性分子は、他の望ましくない細胞型において有意により低いIL10シグナル伝達を提供する一方で、所望の細胞型上のIL10RaおよびIL10Rbに対する結合から、最大の所望のIL10細胞内シグナル伝達を提供する。これは、例えば、IL10RaおよびIL10Rbに対するIL10の親和性と比較して異なる親和性を有するか、またはIL10RaおよびIL10Rbに対する異なるEmaxを引き起こす結合性分子の選択により、達成され得る。異なる細胞型は、異なる感度と共にコグネイト受容体へのリガンドの結合に応答するので、野生型IL10結合と比べてIL10受容体に対する二量体リガンド(またはその個々の結合性部分)の親和性をモジュレートすることにより、非標的細胞における望ましくない活性を低減させながら、所望される活性の刺激が促される。
発明の詳細な説明
本開示の理解を容易にするために、ある特定の用語および語句を下記のみならず本明細書全体にわたり定義する。本明細書に提供される定義は非限定的であり、当業者が知っているであろう知識を考慮して読むべきである。
本開示の理解を容易にするために、ある特定の用語および語句を下記のみならず本明細書全体にわたり定義する。本明細書に提供される定義は非限定的であり、当業者が知っているであろう知識を考慮して読むべきである。
本方法および組成物を説明する前に、本発明が記述される特定の方法または組成物に限定されず、このようにもちろん変動しうることを理解されたい。本明細書において用いられる専門用語は、態様だけを説明することを目的とし、限定することを意図しないことも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、この範囲の上限と下限との間の、下限の単位の10分の1までの各介在値も具体的に開示されることが理解されている。任意の表示値または表示範囲内の介在値と、他の任意の表示値または表示範囲内の介在値との間のより小さい範囲が各々本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、より小さい範囲に含まれるまたはより小さい範囲から除外される場合があり、表示範囲において具体的に除外される任意の限界値があれば、これらの限界値のうちのいずれか一方もしくは両方がより小さい範囲に含まれる各範囲またはどちらも含まれない各範囲も、本発明に包含される。表示範囲がこれらの限界値のうちのいずれか一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値のうちのいずれか一方または両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
別途定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解する意味と同一の意味を有する。本明細書において記述される方法および物質と同様もしくは同等の任意の方法および物質を本発明の実践または試験に使用することもできるが、いくつかの潜在的かつ好ましい方法および物質が、これから説明される。本明細書において言及される全ての刊行物は、それとの関連で刊行物が引用される方法および/または物質を開示および記述するために、参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数指示対象を含むことに留意すべきである。したがって例えば、「細胞」への言及は、複数のこのような細胞を含み、「ペプチド」への言及は、1つまたは複数のペプチドおよびその等価物、例えば、当業者に公知のポリペプチドなどへの言及を含む。
本明細書において論じられる刊行物は、それらの開示が本出願の出願日に先行するものについてのみ提供される。本明細書に含まれるいかなる記述も、本発明が先行発明によってそのような刊行物に先行する権利を与えられないことを認めるものとして解釈すべきではない。さらに、提示する刊行の日付は、別個に確認する必要がありうる実際の刊行の日付と異なる場合がある。
特に示されていない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度(℃)であり、圧力は大気圧または大気圧近くである。以下を含めて、標準的な略語が用いられる:bp = 塩基対; kb = キロ塩基; pl = ピコリットル; sまたはsec = 秒; min = 分; hまたはhr = 時間; AAまたはaa = アミノ酸; kb = キロ塩基; nt = ヌクレオチド; pg = ピコグラム; ng = ナノグラム; μg = マイクログラム; mg = ミリグラム; g = グラム; kg = キログラム; dlまたはdL = デシリットル; μlまたはμL = マイクロリットル; mlまたはmL = ミリリットル; lまたはL = リットル; μM = マイクロモル; mM = ミリモル; M = モル; kDa = キロダルトン; i.m. = 筋肉内(に); i.p. = 腹腔内(に); SCまたはSQ = 皮下(に); QD = 1日1回; BID = 1日2回; QW = 週1回; QM = 月1回; HPLC = 高速液体クロマトグラフィー; BW = 体重; U = 単位; ns = 統計的に有意でない; PBS = リン酸緩衝食塩水; PCR = ポリメラーゼ連鎖反応; HSA = ヒト血清アルブミン; MSA = マウス血清アルブミン; DMEM = ダルベッコ改変イーグル培地; EDTA = エチレンジアミン四酢酸。
本開示にわたり、アミノ酸が1文字コードまたは3文字コードにしたがって参照されることが認識されるであろう。読者の便宜上、1文字アミノ酸コードおよび3文字アミノ酸コードを表1に提供する。
分子生物学における標準方法は、科学文献に記述されている(例えば、Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; ならびに細菌細胞におけるクローニングおよびDNA変異誘発(Vol. 1)、哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング(Vol. 2)、複合糖質およびタンパク質の発現(Vol. 3)、ならびにバイオインフォマティクス(Vol. 4)を記述しているAusubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y.を参照されたい)。この科学文献は、免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含むタンパク質精製のための方法のみならず、化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の産生、およびタンパク質のグリコシル化を記述している(例えば、Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vols. 1-2, John Wiley and Sons, Inc., NYを参照されたい)。
定義:
別途示されない限り、以下の用語は、下記に示される意味を有することが意図される。他の用語は、明細書中の他の箇所で定義される。
別途示されない限り、以下の用語は、下記に示される意味を有することが意図される。他の用語は、明細書中の他の箇所で定義される。
活性化する:本明細書において用いられる場合、「活性化する」という用語は、受容体または受容体複合体に関し用いられて、リガンドの結合に応答する受容体へのアゴニストリガンドの結合から生じる、直接的な、および/または多成分シグナル伝達カスケードへの関与によった、生物学的効果を反映する。
活性:本明細書において用いられる場合、「活性」という用語は、ある分子に関して、試験系(例えばアッセイ)に関する当該分子の特性または生物学的もしくは化学的特性(例えば、当該分子の別の分子への結合の程度)または物質もしくは細胞の物理的性質(例えば、細胞膜電位の改変)を記述するために用いられる。そのような生物学的機能の例としては、生物学的作用物質の触媒活性、細胞内シグナル伝達を刺激する能力、遺伝子発現、細胞増殖、炎症応答などの免疫活性を調節する能力が挙げられるが、これらに限定されることはない。「活性」は、典型的には、[触媒活性]/[mgタンパク質]、[免疫活性]/[mgタンパク質]、活性の国際単位(IU)、[STAT5リン酸化]/[mgタンパク質]、[T細胞増殖]/[mgタンパク質]、プラーク形成単位(pfu)などのような、試験される作用物質の単位あたりの生体活性のレベルとして表現される。本明細書において用いられる場合、「増殖活性」という用語は、細胞の増殖および複製を促進する活性をいう。
投与する/投与:「投与」および「投与する」という用語は、インビトロ、インビボまたはエクスビボで対象の細胞、組織、臓器または生体液を作用物質(例えばオルソログ、IL2オルソログ、オルソログ受容体を発現する操作された細胞、オルソログIL2受容体を発現する操作された細胞、オルソログIL2受容体を発現するCAR-T細胞、化学療法剤、抗体、または前記の1つもしくは複数を含む薬学的製剤)と接触させることを含む、対象を接触させる行為をいうように本明細書において互換的に用いられる。作用物質の投与は、外用投与、血管内注射(静脈内または動脈内注入を含む)、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、吸入などを含むが、これらに限定されない、当技術分野において承認されている種々の方法のいずれかによって達成されうる。「投与」という用語は、作用物質と、細胞、組織または臓器との接触のみならず、作用物質と、細胞、組織または臓器と接触している液体との接触を含む。
親和性:本明細書において用いられる場合、「親和性」という用語は、第1の分子(例えばリガンド)の第2の分子(例えば受容体)への特異的結合の程度をいい、分子とその標的との間の解離速度定数(Koff)と、分子とその標的との間の会合速度定数(Kon)との比である平衡解離定数(KD)によって測定される。
アゴニスト:本明細書において用いられる場合、「アゴニスト」という用語は、第2の作用物質(「標的」)と特異的に結合し、標的と相互作用して標的の活性化の増強を引き起こすまたは促進する、第1の作用物質をいう。場合によっては、アゴニストは、細胞活性化を調節する、活性化を増強する、細胞を第2の作用物質による活性化へと感作する、または1つもしくは複数の遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体の発現、細胞増殖をもたらしうる生物学的経路または細胞周期の停止もしくはアポトーシスなどによる細胞死を結果としてもたらす経路を上方制御する、受容体タンパク質の活性化物質である。いくつかの態様において、アゴニストは、受容体に結合し、受容体の状態を改変し、生物学的応答を結果としてもたらす作用物質である。この応答は、受容体の内因性活性化因子の効果を模倣する。「アゴニスト」という用語は、部分アゴニスト、完全アゴニストおよびスーパーアゴニストを含む。アゴニストは、このようなアゴニストが研究中の受容体によって誘導される実質的に完全な生物学的応答(すなわち、天然のリガンド/受容体結合相互作用と関連する応答)をもたらす場合の「完全アゴニスト」、または部分アゴニストとして記述される場合がある。アゴニストと対照的に、アンタゴニストは、受容体に特異的に結合しうるが、典型的には受容体によって開始されるシグナルカスケードを結果としてもたらさず、その受容体でのアゴニストの作用を改変しうる。逆アゴニストは、アゴニストの薬理応答と逆方向の薬理応答を産生する作用物質である。「スーパーアゴニスト」は、標的受容体に対して内因性アゴニストよりも大きな最大応答を産生することが可能なタイプのアゴニストであり、したがって、天然リガンドの100%よりも大きな活性を有する。スーパーアゴニストは、典型的には、同等のアッセイにおいて同様の濃度で評価された場合、天然形態の分子の評価可能な量的または質的パラメータにおいて110%よりも大きい、代替的に120%よりも大きい、代替的に130%よりも大きい、代替的に140%よりも大きい、代替的に150%よりも大きい、代替的に160%よりも大きい、または代替的に170%よりも大きい応答を示す合成分子である。
アンタゴニスト:本明細書において用いられる場合、「アンタゴニスト」または「阻害剤」という用語は、アゴニストの作用と対抗する分子をいう。アンタゴニストは、アゴニストの活性を防止、低減、阻害、または中和し、アンタゴニストはまた、特定されたアゴニストがない場合であっても、標的、例えば標的受容体の構成的活性を防止、阻害、または低減することができる。阻害剤は、例えば、遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、生物学的経路、または細胞を減少させる、遮断する、防止する、活性化を遅延させる、不活性化する、脱感作する、または下方制御する分子である。
抗体:本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、(a)標的分子に特異的に結合するグリコシル化されたおよびグリコシル化されていない免疫グロブリン(哺乳動物免疫グロブリンクラスIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含むが、これらに限定されない)ならびに(b)標的分子への結合についてそれが由来した免疫グロブリンと競合するIgG(1-4)デルタCH2、F(ab')2、Fab、ScFv、VH、VL、テトラボディ、トリアボディ、ダイアボディ、dsFv、F(ab')3、scFv-Fcおよび(scFv)2を含むが、これらに限定されない免疫グロブリン誘導体を総称的に指す。抗体という用語は、任意の特定の哺乳動物種に由来する免疫グロブリンに制限されず、マウス、ヒト、ウマ科動物、ラクダ科動物、ヒト抗体を含む。抗体という用語は、ラクダ科動物(ラクダ、ラマおよびアルパカを含む)の免疫化から典型的には得られるようないわゆる「重鎖抗体」または「VHH」または「ナノボディ(登録商標)」を含む(例えば、Hamers-Casterman,et al.(1993)Nature 363:446-448を参照)。所与の特異性を有する抗体はまた、非哺乳動物供給源に由来してもよく、例えばVHHは、サメを含むが、これに限定されない軟骨魚の免疫化から得られ得る。「抗体」という用語は、天然の供給源からまたは抗原での免疫化後の動物から単離可能な抗体の他に、モノクローナル抗体、二特異性抗体、三特異性、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、CDRグラフト化、ベニア化(veneered)、または脱免疫化(例えば、T細胞エピトープを除去するため)された抗体を含む操作された抗体を包含する。「ヒト抗体」という用語は、ヒトから得られる抗体の他に、抗原での刺激でトランスジェニック動物がヒトにより産生される抗体に特徴的なアミノ酸配列を含む抗体を産生するようなヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物から得られる抗体を含む。抗体という用語は、親抗体およびその誘導体、例えば親和性成熟、ベニア化、CDRグラフト化(CDRグラフト化VHHを含む)、ヒト化、ラクダ化(非ラクダ由来VHHの場合)、または非免疫グロブリンスキャフォールド中の抗体の結合ドメイン(例えば、CDR)を含む結合性分子の両方を含む。「抗体」という用語は、任意の特定の合成手段に限定されず、天然の供給源から単離可能な天然に存在する抗体の他に、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであるトランスジェニック動物またはそれから調製されるハイブリドーマから単離された抗体を含む「組換え」手段により調製される操作された抗体分子、抗体の発現を結果としてもたらす核酸構築物で形質転換された宿主細胞から単離された抗体、ファージディスプレイライブラリーを含むコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離されたかまたは化学的に合成(例えば、固相タンパク質合成)された抗体を含む。1つの態様において、「抗体」は哺乳動物免疫グロブリンである。一部の態様において、抗体は、結合およびエフェクター機能を提供する可変および定常ドメインを含む「全長抗体」である。ほとんどの事例において、全長抗体は2つの軽鎖および2つの重鎖を含み、各々の軽鎖は可変領域および定常領域を含む。一部の態様において、「全長抗体」という用語は、2つの軽鎖および2つの重鎖を含む従来のIgG免疫グロブリン構造であって、各々の軽鎖が、結合およびエフェクター機能を提供する可変領域および定常領域を含むものを指すために使用される。抗体という用語は、作用の持続期間を長期化させるための修飾、例えば以下により詳細に記載されている融合タンパク質またはポリマーへのコンジュゲーション(例えば、PEG化)を含む抗体コンジュゲートを含む。
結合性分子:本明細書において用いられる場合、「結合性分子」という用語は、2つの細胞表面受容体の細胞外ドメインに結合できる二価分子をいう。いくつかの態様において、結合性分子は2つの異なる受容体(またはそのドメインもしくはサブユニット)に特異的に結合し、その結果、これらの受容体(またはドメインもしくはサブユニット)は、そのドメイン(例えば、細胞内ドメイン)を含むこれらの受容体(またはドメインもしくはサブユニット)が互いに相互作用して下流のシグナル伝達をもたらすような、互いに近接した距離に維持される。
CDR:本明細書において用いられる場合、「CDR」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖免疫グロブリンポリペプチドおよび軽鎖免疫グロブリンポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非連続抗原結合部位(combining site)を意味することが意図される。CDRは、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat, et al., U.S. Dept. of Health and Human Services publication entitled "Sequences of proteins of immunological interest" (1991) (本明細書において「Kabat 1991」または「Kabat」ともいわれる); Chothia, et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917 (本明細書において「Chothia」ともいわれる); およびMacCallum, et al. (1996) J. Mol. Biol. 262:732-745によって記述されており、ここで、これらの定義は相互に比較した場合にアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体もしくは移植抗体またはそれらのバリアントのCDRをいうためのいずれかの定義の適用は、本明細書において定義および使用される場合にこの用語の範囲内であると意図される。本明細書において用いられる「Chothia付番」という用語は、当技術分野において認識されており、構造ループ領域の位置に基づいてアミノ酸残基に付番するシステムをいう(Chothiaet al.1986, Science 233:755-758; Chothia & Lesk 1987, JMB 196:901-917; Chothia et al.1992, JMB 227:799-817)。本開示の目的のために、特に指定されない限り、抗体の可変領域におけるCDR2およびCDR3の位置決めは、Kabat付番または単に「Kabat」に従う。抗体の可変領域におけるCDR1の位置決めは、KabatおよびChothia付番スキームの混成に従う。
クローン形質:本明細書において用いられる場合、クローン形質は、同じB細胞前駆細胞に由来する結合性分子の集合体をいう。「クローン形質」という用語は、同じ生殖細胞系列に属し、同じCDR3長を有し、CDR3配列において70%またはそれ以上の相同性を有する抗原結合性分子の集合体をいうように用いられる。
同等:本明細書において用いられる場合、「同等」という用語は、評価可能な定量または定性パラメータの2つの測定値における差の程度を記述するために用いられる。例えば、評価可能な定量パラメータの第1の測定値と、評価可能なパラメータの第2の測定値との差が、当業者がその状況における2つの結果の間に実際に統計的有意差を生じないと認識するであろう範囲を超えない場合、これら2つの測定値は「同等」と見なされるであろう。場合によっては、ある測定値の別の測定値からの差が30%未満、代替的に25%未満、代替的に20%未満、代替的に15%未満、代替的に10%未満、代替的に7%未満、代替的に5%未満、代替的に4%未満、代替的に3%未満、代替的に2%未満、または1%未満である場合、これらの測定値は「同等」と見なされうる。特定の態様において、ある測定値の参照標準からの差が15%未満、代替的に10%未満、または代替的に5%未満である場合、この測定値は参照標準と同等である。
保存的アミノ酸置換:本明細書において使用される場合、「保存的アミノ酸置換」という用語は、所与のアミノ酸を、類似した生化学的特性(例えば、電荷、疎水性、およびサイズ)を有する異なるアミノ酸に変化させるアミノ酸の置換えを指す。例えば、以下の群の各々におけるアミノ酸は互いの保存的アミノ酸として考えられ得る:(1)疎水性アミノ酸:アラニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、およびグリシン; (2)極性アミノ酸:グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、メチオニン、およびシステイン; (3)塩基性アミノ酸:リジンおよびアルギニン; ならびに(4)酸性アミノ酸:アスパラギン酸およびグルタミン酸。
~に由来する:本明細書において使用される場合、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列(例えば、「~に由来する」アミノ酸配列)の文脈における「~に由来する」という用語は、ポリペプチドまたは核酸が、参照ポリペプチドまたは核酸(例えば、天然に存在するポリペプチドまたはコードする核酸)の配列に基づく配列を有することを指し示すことが意味され、供給源またはタンパク質もしくは核酸が作られた方法に関して限定的であることは意味されない。例として、「~に由来する」という用語は、参照アミノ酸またはDNA配列のホモログまたはバリアントを含む。
有効濃度(EC):本明細書において用いられる場合、「有効濃度」という用語またはその略語「EC」は、試験系において所与のパラメータの変化をもたらすのに十分な量の作用物質(例えば、hIL2ムテイン)の濃度をいうために互換的に用いられる。略語「E」は、試験系が被検物質に曝された場合に、該試験系において観察される所与の生物学的効果の大きさをいう。応答の大きさが、被検物質の濃度(「C」)の因数として表現される場合、略語「EC」が用いられる。生物学的システムの文脈で、Emaxという用語は、活性化被検物質の飽和濃度に応答して観察される所与の生物学的効果の最大の大きさをいう。略語ECに下付き文字が付く場合(例えば、EC40、EC50など)、下付き文字は、その濃度で観察される生物学的効果のEmaxに対するパーセントをいう。例えば、被検物質に応答した、測定可能な生物学的パラメータの最大レベルの30%である、試験系におけるこのような測定可能な生物学的パラメータの誘導を結果としてもたらすのに十分なこのような被検物質の濃度は、このような生物学的パラメータに関する被検物質の「EC30」といわれる。同様に、「EC100」という用語は、作用物質に応答する測定可能なパラメータの最大(100%)応答を結果としてもたらす、このような作用物質の有効濃度を意味するために用いられる。同様に、EC50という用語(薬力学の分野で一般に用いられる)は、測定可能なパラメータに最大半量(50%)の変化を結果としてもたらすのに十分な作用物質の濃度をいう。「飽和濃度」という用語は、温度および圧力の標準条件下で標準体積の特定の溶媒(例えば水)中に溶解できる被検物質の最大可能量をいう。薬力学において、薬物の飽和濃度は、典型的には、全ての利用可能な受容体が薬物によって占有されるのに十分な薬物濃度を意味するために用いられ、EC50は、最大半量効果を与えるための薬物濃度である。被検物質の特定の有効濃度のECは、特定のパラメータおよび試験系に関して略されうる。
富化された:本明細書において使用される場合、「富化された」という用語は、非天然にマニピュレートされており、その結果、関心対象の種(例えば分子または細胞)が、(a)出発試料、例えば生物学的試料(例えば、分子が天然に存在するか、もしくはそれが投与後に存在する試料)中の種の濃度よりも高い濃度(例えば、少なくとも3倍高い、代替的に少なくとも5倍高い、代替的に少なくとも10倍高い、代替的に少なくとも50倍高い、代替的に少なくとも100倍高い、もしくは代替的に少なくとも1000倍高い); または(b)分子が作られた環境(例えば、組換えにより改変された細菌もしくは哺乳動物細胞)よりも高い濃度で存在する試料を指す。
細胞外ドメイン:本明細書において用いられる場合、「細胞外ドメイン」という用語またはその略語「ECD」は、細胞の原形質膜の外側にある細胞表面タンパク質(例えば細胞表面受容体)の部分をいう。「ECD」という用語は、膜貫通タンパク質の細胞質外部分または細胞表面(もしくは膜結合性タンパク質)の細胞質外部分を含みうる。
同一性:本明細書において用いられる場合、核酸またはポリペプチドの文脈において用いられる「パーセント(%)配列同一性」または「実質的に同一」という用語は、参照配列と少なくとも50%の配列同一性を有する配列をいう。あるいは、パーセント配列同一性は、50%から100%までの任意の整数であることができる。いくつかの態様において、配列は、下記のように、標準的なパラメータを用いてBLASTで決定された場合に参照配列と少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有する。配列比較の場合、通常、1つの配列が参照配列としての役割を果たし、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムのプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータが用いられてもよく、または別のパラメータが指定されてもよい。配列比較アルゴリズムは次に、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。比較ウィンドウは、連続する位置の数のいずれか1つのセグメント、例えば、少なくとも10残基のセグメントへの参照を含む。いくつかの態様において、比較ウィンドウは10~600残基、例えば、約10~約30残基、約10~約20残基、約50~約200残基、または約100~約150残基を有し、そのなかで2つの配列が最適に整列された後に、配列が同じ数の連続する位置の参照配列と比較されうる。配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するために適したアルゴリズムは、それぞれAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410およびAltschul, et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記述されているBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のウェブサイトを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントした場合にマッチするまたはある正の値の閾値スコアTを満たす、クエリ配列中の長さWの短いワードを同定することによって、最初に高スコア配列ペア(HSP)を同定することを伴う。Tは、隣接ワードスコアの閾値といわれる(Altschulら、前記)。これらの最初の隣接ワードのヒットは、それらを含有するより長いHSPを見出す検索を開始するためのシードとして働く。次いで、アライメントスコアの合計が増加できる限り、配列ごとにワードのヒットを両方向に伸ばす。ヌクレオチド配列について、パラメータM (マッチする残基のペアについての報酬スコア(reward score); 常に>0)およびN (ミスマッチする残基についてのペナルティースコア(penalty score); 常に<0)を使用してスコアの合計が計算される。アミノ酸配列について、スコアの合計を計算するためにスコアリング行列が用いられる。各方向におけるワードヒットの伸展は、アライメントスコアの合計がその最大達成値から量Xだけ低下する; 1つもしくは複数の負スコアの残基のアライメントの累積によりスコアの合計がゼロ以下になる; またはいずれかの配列の末端に達する場合に停止される。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXは、アライメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列について)は、同様に機能するが、デフォルトとしてワードサイズ(W) 28、期待値(E) 10、M=1、N=-2、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムは、デフォルトとしてワードサイズ(W) 3、期待値(E) 10、およびBLOSUM62スコアリング行列を使用する(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい)。BLASTアルゴリズムは2つの配列間の類似性の統計分析も実施する(例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照されたい)。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は、最小和確率(P(N))であり、これは2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、アミノ酸配列は、試験アミノ酸配列と参照アミノ酸配列との比較における最小和確率が約0.01未満、より好ましくは約10-5未満、最も好ましくは約10-20未満である場合、参照配列に類似していると見なされる。
細胞内シグナル伝達:本明細書において用いられる場合、「細胞内シグナル伝達」および「下流シグナル伝達」という用語は、互いに近接している2つまたはそれ以上の細胞表面受容体の細胞内ドメイン(ICD)の相互作用によって引き起こされる細胞シグナル伝達過程をいうように互換的に用いられる。JAK/STAT経路を介した受容体複合体において、受容体サブユニットのICDSの会合は、ICDのJAKドメインを近接させ、STAT分子がリン酸化され核に移行して特定の核酸配列と会合し、細胞内の特定の遺伝子の活性化および発現をもたらすリン酸化カスケードを開始させる。本開示の結合性分子は、その天然の同族体IL10によって活性化されると、IL10受容体に特徴的な細胞内シグナル伝達を提供する。下流シグナル伝達活性を測定するために、いくつかの方法が利用可能である。例えば、いくつかの態様において、リン酸化受容体および/またはリン酸化STATの存在によりJAK/STATシグナル伝達を測定することができる。他の態様において、発現レベルが結合性分子によって引き起こされる下流シグナル伝達のレベルにより影響されうる1つまたは複数の下流遺伝子の発現も測定することができる。
応答をもたらすために十分な量で:本明細書において使用される場合、「応答を引き起こすために十分な量で」という語句は、試験系への被検物質の適用の前(例えば、ベースラインレベル)および後に測定された指標のレベルにおける検出可能な変化を提供するために十分な被検物質の量に関して使用される。一部の態様において、試験系は、細胞、組織または生物である。一部の態様において、試験系は、インビトロ試験系、例えば蛍光アッセイである。一部の態様において、試験系は、細胞、組織、または生物への被検物質の適用の前および後の生物学的機能を反映した細胞、組織、または生物のパラメーターのレベルにおける変化の測定を伴うインビボシステムである。一部の態様において、指標は、ある量の被検物質の投与に応答してアッセイにおいて評価される細胞の生物学的機能または発生の状態を反映したものである。一部の態様において、試験系は、細胞、組織、または生物への1つまたは複数の被検物質の適用の前および後の生物学的状態を反映した細胞、組織、または生物の指標のレベルにおける変化の測定を伴う。「応答をもたらすために十分な量で」という用語は、治療有効量であるために十分であり得るが、治療有効量よりも多いまたは少ないものであってもよい。
処置を必要とする:「処置を必要とする」という用語は、本明細書において使用される場合、対象は、処置を要求するか、または処置から潜在的に利益を受けるという、対象に関して医師または他の介護者により為される判断を指す。この判断は、医師または介護者の専門知識の範囲内の様々な要因に基づいて為される。
単離された:本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、天然に存在する場合に、それが天然に存在し得る環境とは異なる環境にある関心対象のポリペプチドに関して使用される。「単離された」は、関心対象のポリペプチドが実質的に富化された、および/または関心対象のポリペプチドが部分的にもしくは実質的に精製された試料内にあるポリペプチドを含むことが意味される。ポリペプチドが天然に存在しない場合、「単離された」は、ポリペプチドが、それが合成された環境から分離されている、例えばポリペプチドを発現するように操作された細胞を含む組換え細胞培養物から単離されていることまたは固相合成手段の結果としてもたらされる溶液によることを指し示す。
Kabatの番号付け:本明細書において使用されている「Kabatの番号付け」という用語は、当技術分野において認識されており、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖領域中の他のアミノ酸残基よりも高い可変性(例えば、超可変性)のアミノ酸残基を番号付けするシステムを指す(Kabat,et al.,(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-93; Kabat,et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No. 91-3242)。本明細書において使用されている「Chothia番号付け」という用語は、当技術分野において認識されており、構造ループ領域の位置に基づいてアミノ酸残基を番号付けするシステムを指す(Chothia et al.1986,Science 233:755-758; Chothia&Lesk 1987,JMB 196:901-917; Chothia et al.1992,JMB 227:799-817)。本開示の目的のために、他に特に同定されなければ、抗体の可変領域中のCDR2および3の位置は、Kabatの番号付けまたは単純に「Kabat」に従う。抗体の可変領域中のCDR1の位置は、KabatおよびChothia番号付けスキームのハイブリッドに従う。
リガンド:本明細書において用いられる場合、「リガンド」という用語は、受容体への特異的結合を示し、それが結合する受容体の活性の変化をもたらすように受容体の生物学的活性の変化を引き起こす分子をいう。1つの態様において、「リガンド」という用語は、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる分子、またはその複合体をいう。本明細書において用いられる場合、「リガンド」という用語は、天然および合成リガンドを包含する。「リガンド」はまた、小分子、例えば、サイトカインのペプチド模倣体および抗体のペプチド模倣体を包含する。リガンドおよび受容体の複合体は、「リガンド-受容体複合体」と称される。
本明細書において用いられる場合、「リンカー」という用語は、2つの要素、例えば、タンパク質ドメイン間の連結をいう。リンカーは共有結合またはペプチドリンカーであることができる。「結合」という用語は、化学結合、例えば、アミド結合もしくはジスルフィド結合、または化学反応から生じる任意の種類の結合、例えば、化学的コンジュゲーションをいう。「ペプチドリンカー」という用語は、2つのタンパク質ドメイン間に空間および/または可動性を提供するように2つのタンパク質ドメインを連結するために利用されうるアミノ酸またはポリペプチドをいう。
調節する:本明細書において用いられる場合、「調節する」、「調節」などの用語は、生物学的システムまたは生化学経路を含むシステムにおいて被検物質がプラスもしくはマイナスに、または直接的もしくは間接的に応答を引き起こす能力をいう。モジュレーターという用語は、アゴニスト(部分アゴニスト、完全アゴニスト、およびスーパーアゴニストを含む)およびアンタゴニストの両方を含む。
多量体化:本明細書において用いられる場合、「多量体化」という用語は、受容体、またはそのドメインもしくはサブユニットが互いに作用して細胞内シグナル伝達を引き起こすことができるように、2つまたはそれ以上の細胞表面受容体、またはそのドメインもしくはサブユニットが互いに近接されることをいう。
N末端:ポリペプチドの構造の文脈で本明細書において用いられる場合、「N末端」(または「アミノ末端」)および「C末端」(または「カルボキシル末端」)は、それぞれポリペプチドのアミノ最末端およびカルボキシル最末端をいうのに対し、「N末端側」および「C末端側」は、それぞれポリペプチドのアミノ酸配列におけるN末端およびC末端方向の相対位置をいい、それぞれN末端およびC末端の残基を含むことができる。「直接N末端側」または「直接C末端側」という用語は、第1のアミノ酸残基および第2のアミノ酸残基が共有結合して、連続するアミノ酸配列を提供する場合の、第2のアミノ酸残基と比べた第1のアミノ酸残基の位置をいうように用いられる。
新生物性疾患:本明細書において使用される場合、以下により詳細に議論されるように、「新生物性疾患」という用語は、細胞の過剰増殖または調節されない(もしくは脱調節された)細胞複製から生じる対象における障害または状態を指す。新生物性疾患という用語は、対象における新生物の存在から生じる障害を指す。新生物は、(1)良性、(2)前悪性(または「前がん性」); および(3)悪性(または「がん性」)として分類され得る。「新生物性疾患」という用語は、新生物性疾患と直接的または間接的に関連付けられる状態を指す新生物関連疾患、障害および状態を含み、例えば、血管新生および前がん性状態、例えば異形成症またはくすぶり型多発性骨髄腫を含む。脱調節された細胞複製から生じる良性障害の例は、肥厚性瘢痕、例えばケロイド瘢痕を含む。
核酸:「核酸」、「核酸分子」、および「ポリヌクレオチド」などの用語は、本明細書において交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそのアナログの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例は、直鎖状および環状の核酸、メッセンジャーRNA(mRNA)、相補的DNA(cDNA)、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、プライマーおよびを含む。
機能的に連結された:「機能的に連結された」という用語は、構築物中に並べられた分子、典型的にはポリペプチドまたは核酸の間の関係性であって、構成要素分子の機能の各々が保持されているが、機能的な連結が、構築物の個々の構成要素の、正または負のいずれかの、活性のモジュレーションを結果としてもたらし得るようなものを指すために本明細書において使用される。例えば、野生型タンパク質へのポリエチレングリコール(PEG)分子の機能的な連結は、タンパク質の生物学的活性が野生型分子と比べて減少している構築物を結果としてもたらし得るが、2つはそれにもかかわらず機能的に連結されていると考えられる。「機能的に連結された」という用語が異なる機能をコードする複数の核酸配列の関係性に適用される場合、単一の核酸分子に組み合わせられた場合の複数の核酸配列は、例えば、組換え技術を使用して細胞に導入された場合に、細胞中での特定の核酸配列の転写および/または翻訳をもたらす能力を有する核酸を提供する。例えば、シグナル配列をコードする核酸配列は、プレタンパク質の発現を結果としてもたらし、それにより、シグナル配列がポリペプチドの分泌を促す場合に、ポリペプチドをコードするDNAに機能的に連結されていると考えることができ; プロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響する場合に、コーディング配列に機能的に連結されていると考えられ; またはリボソーム結合部位は、翻訳を促すように配置されている場合に、コーディング配列に機能的に連結されていると考えられる。一般に核酸分子の文脈において、「機能的に連結された」という用語は、連結されている核酸配列が連続していること、および、分子の分泌リーダーまたは関連付けられるサブドメインの場合、連続し、読み枠(reading phase)にあることを意味する。しかしながら、ある特定の遺伝子エレメント、例えばエンハンサーは、距離をおいて機能し、それらが効果を提供する配列に関して連続している必要はないことがあるが、それにもかかわらず機能的に連結されていると考えられ得る。
部分アゴニスト:本明細書において用いられる場合、「部分アゴニスト」という用語は、所与の受容体に特異的に結合し、それを活性化するが、完全アゴニストと比べて受容体の部分活性化だけを有する分子をいう。部分アゴニストは、アゴニスト効果およびアンタゴニスト効果の両方を示す場合がある。例えば、完全アゴニストおよび部分アゴニストの両方が存在する場合、部分アゴニストは、受容体との結合を完全アゴニストと競合することによって競合アンタゴニストとして作用し、部分アゴニストの非存在下での受容体と完全アゴニストとの接触と比べて受容体活性化に純減をもたらす。臨床的には、部分アゴニストは、不十分な量の内因性リガンドが存在する場合に受容体を活性化して、所望の最大下の応答を与えるように用いることができる、または過剰量の内因性リガンドが存在する場合に、それらは受容体の過刺激を低減することができる。部分アゴニストによって生じる最大応答(Emax)は、その内在活性と呼ばれ、完全アゴニストが100%応答を生じる場合のパーセンテージスケールで表現されうる。いくつかの態様において、IL10R結合性分子は、IL10によって引き起こされるEmaxと比較して低減されたEmaxを有する。Emaxは、リガンド(例えば、本明細書において記述される結合性分子または天然のサイトカイン(例えば、IL10))によって得ることができる細胞型における最大応答レベルを反映する。いくつかの態様において、本明細書において記述されるIL10R結合性分子は、IL10によって引き起こされるEmaxの少なくとも1% (例えば、1%~100%、10%~100%、20%~100%、30%~100%、40%~100%、50%~100%、60%~100%、70%~100%、80%~100%、90%~100%、1%~90%、1%~80%、1%~70%、1%~60%、1%~50%、1%~40%、1%~30%、1%~20%または1%~10%)を有する。他の態様において、本明細書において記述されるIL10R結合性分子のEmaxは、天然リガンドIL10のEmaxよりも大きい(例えば、少なくとも1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%または50%大きい)。いくつかの態様において、IL10R結合性分子のリンカー長を変化させることによって、IL10R結合性分子のEmaxを変化させることができる。IL10R結合性分子は、最も望まれる細胞型においてEmaxをもたらし、他の細胞型において低減されたEmaxをもたらしうる。
ポリペプチド:本明細書において用いられる場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、遺伝的にコードされるアミノ酸および遺伝的にコードされないアミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸、ならびに改変ポリペプチド主鎖を有するポリペプチドを含むことができる任意の長さのアミノ酸の重合体形態をいうように本明細書において互換的に用いられる。用語ポリペプチドは、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質; 異種および相同リーダー配列を有する融合タンパク質; N末端メチオニン残基を有するまたは有しない融合タンパク質; キレートペプチドとして精製を促進するアミノ酸配列との融合タンパク質; 免疫学的にタグ付けされたタンパク質との融合タンパク質; 免疫学的に活性なポリペプチド断片(例えば、抗原性ジフテリアまたは破傷風毒素またはトキソイド断片)等との、ペプチドを含む融合タンパク質などを含むが、これらに限定されない融合タンパク質を含む。
予防する:本明細書において用いられる場合、「予防する」、「予防すること」、「予防」など用語は、一般的に遺伝要因、経験的要因、または環境要因により、特定の疾患、障害、または状態を有する素因のある対象に関連して、対象が疾患、障害、状態、もしくはその他(例えば、臨床症状の非存在によって決定されるもの)を発生するリスクを一時的もしくは永続的に予防する、抑制する、阻害する、もしくは低減する、またはそれらの発生を遅延させるように、疾患、障害、状態、またはそれらの症状の発生前に対象に関して開始される行動をいう。ある特定の例では、「予防する」、「予防すること」、「予防」という用語は、疾患、障害、または状態の現在の状態からより有害な状態への進行を遅らせることをいうためにも用いられる。
近接:本明細書において用いられる場合、「近接」という用語は、本明細書において記述される結合性分子が2つの細胞表面受容体、またはそのドメインもしくはサブユニットに結合した後の、2つの細胞表面受容体、またはそのドメインもしくはサブユニット間の空間的近接または物理的距離をいう。いくつかの態様において、結合性分子が細胞表面受容体、またはそのドメインもしくはサブユニットに結合した後、細胞表面受容体、またはそのドメインもしくはサブユニット間の空間的近接は、例えば、約500オングストローム未満、例えば、約5オングストローム~約500オングストロームの距離などであることができる。いくつかの態様において、空間的近接は、約5オングストローム未満、約20オングストローム未満、約50オングストローム未満、約75オングストローム未満、約100オングストローム未満、約150オングストローム未満、約250オングストローム未満、約300オングストローム未満、約350オングストローム未満、約400オングストローム未満の、約450オングストローム未満の、または約500オングストローム未満になる。いくつかの態様において、空間的近接は約100オングストローム未満になる。いくつかの態様において、空間的近接は約50オングストローム未満になる。いくつかの態様において、空間的近接は約20オングストローム未満になる。いくつかの態様において、空間的近接は約10オングストローム未満になる。いくつかの態様において、空間的近接は、約10~100オングストローム、約50~150オングストローム、約100~200オングストローム、約150~250オングストローム、約200~300オングストローム、約250~350オングストローム、約300~400オングストローム、約350~450オングストローム、または約400~500オングストロームに及ぶ。いくつかの態様において、空間的近接は、約250オングストローム未満、代替的に約200オングストローム未満、代替的に約150オングストローム未満、代替的に約120オングストローム未満、代替的に約100オングストローム未満、代替的に約80オングストローム未満、代替的に約70オングストローム未満、または代替的に約50オングストローム未満になる。
受容体:本明細書において用いられる場合、「受容体」という用語は、リガンドの結合がポリペプチドの少なくとも1つの生物学的性質に変化をもたらす、リガンドと特異的に結合するドメインを有するポリペプチドをいう。いくつかの態様において、受容体は、細胞表面と関連しない「可溶性」受容体である。いくつかの態様において、受容体は、細胞外ドメイン(ECD)と、ECDを細胞表面に固定するように作用する膜関連ドメインとを含む細胞表面受容体である。細胞表面受容体のいくつかの態様において、受容体は、典型的には膜貫通ドメイン(TM)といわれる膜貫通ドメインによって連結された細胞内ドメイン(ICD)および細胞外ドメイン(ECD)を含む膜貫通ポリペプチドである。リガンドの受容体への結合は、受容体に立体構造変化をもたらし、測定可能な生物学的効果をもたらす。受容体がECD、TMおよびICDを含む膜貫通ポリペプチドであるいくつかの場合では、リガンドのECDへの結合は、リガンドのECDへの結合に応答してICDの1つまたは複数のドメインによって媒介される測定可能な細胞内生物学的効果をもたらす。いくつかの態様において、受容体は細胞内シグナル伝達を促進するための多成分複合体の一成分である。例えば、リガンドは、いかなる細胞内シグナル伝達単独とも関連していない細胞表面分子と結合しうるが、リガンドが結合すると、細胞内シグナル伝達をもたらす多量体複合体の形成を促進する。
組み換え:本明細書において用いられる場合、「組み換え」という用語は、ポリペプチド、核酸、または細胞が組み換えDNA技術を用いて改変された方法をいうように形容詞として用いられる。組み換えタンパク質は、組み換えDNA技術を用いて産生されたタンパク質であり、タンパク質が産生された方法を示すために小文字「r」の略語を用いてそのように(例えば、rhIL2)表記されうる。同様に、組み換えDNA技術を用いて外因性核酸(例えば、ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、mRNA、ウイルスまたは非ウイルスベクター、プラスミド、コスミドなど)の組み入れ(例えば、トランスフェクション、形質導入、感染)によって細胞が改変されているならば、細胞は「組み換え細胞」といわれる。Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)および他の標準的な分子生物学実験マニュアルにおいて見出すことができるものなどの、組み換えDNA技術のための技法およびプロトコルは、当技術分野において周知である。
応答:例えば、細胞、組織、臓器、または生物の、「応答」という用語は、評価可能な生化学的または生理学的パラメーター(例えば、濃度、密度、接着、増殖、活性化、リン酸化、遊走、酵素活性、遺伝子発現のレベル、遺伝子発現の速度、エネルギー消費の速度、分化のレベルまたは状態)における定量的または定性的な変化を包含し、変化は、活性化、刺激、または処置(処理)、外因性の作用因子との接触または内的な機序、例えば遺伝子プログラミングと相関している。ある特定の文脈において、「活性化」および「刺激」などの用語は、内的な機序による他に、外的なまたは環境上の要因により調節されるような細胞活性化を指す一方; 「阻害」および「下方調節」などの用語は反対の効果を指す。「応答」は、インビトロで、例えばアッセイシステム、表面プラズモン共鳴、酵素活性、質量分析、アミノ酸またはタンパク質シークエンシング技術の使用を通じて評価されてもよい。「応答」は、客観的な生理学的パラメーター、例えば体温、体重、腫瘍体積、血圧、X線もしくは他のイメージング技術の結果の評価により定量的に、または幸福、うつ、激越、もしくは疼痛の報告される主観的な感覚における変化を通じて定性的にインビボで評価されてもよい。一部の態様において、CD3活性化初代ヒトT細胞の増殖のレベルは、Crouch,et al.(1993)J.Immunol.Methods 160:81-8に記載されるように培養物中に存在する生存細胞の数に直接的に比例する存在するATPの量に比例する発光シグナルを生成する生物発光アッセイにおいて、または商業的に入手可能なアッセイ、例えばPromega Corporation、Madison WI 53711からカタログ番号G9241およびG9681として商業的に入手可能なCellTiter-Glo(登録商標)2.0 Cell Viability Assay or CellTiter-Glo(登録商標)3D Cell Viability kitsを生産者により提供される指示書に実質的にしたがって使用して評価されてもよい。一部の態様において、被検物質の投与に応答したT細胞の活性化のレベルは、当技術分野において周知の方法にしたがってSTAT(例えば、STAT1、STAT3、STAT5)リン酸化のレベルにより決定されるような記載されているフローサイトメトリー方法により決定されてもよい。
有意に低減された結合:本明細書において使用される場合、「有意に低減された結合を呈する」という用語は、第1の分子(例えばリガンド)の親形態と比べて第2の分子(例えば受容体)に対する親和性における有意な低減を呈する第1の分子のバリアントに関して使用される。抗体バリアントに関して、抗体バリアントは、バリアントが、バリアントが由来した親抗体の20%未満、代替的に約10%未満、代替的に約8%未満、代替的に約6%未満、代替的に約4%未満、代替的に約2%未満、代替的に約1%未満、または代替的に約0.5%未満の親和性で受容体のネイティブな形態に結合する場合に、「有意に低減された結合を呈する」。同様に、バリアントリガンドに関して、バリアントリガンドは、バリアントリガンドが、バリアントリガンドが由来した親リガンドの20%未満、代替的に約10%未満、代替的に約8%未満、代替的に約6%未満、代替的に約4%未満、代替的に約2%未満、代替的に約1%未満、または代替的に約0.5%未満の親和性で受容体に結合する場合に、「有意に低減された結合を呈する」。同様に、バリアント受容体に関して、バリアントリガンドは、バリアント受容体の親和性が、バリアント受容体が由来した親受容体の20%未満、代替的に約10%未満、代替的に約8%未満、代替的に約6%未満、代替的に約4%未満、代替的に約2%未満、代替的に約1%未満、または代替的に約0.5%未満の親和性で結合する場合に、「有意に低減された結合を呈する」。
単一ドメイン抗体(sdAb):「単一ドメイン抗体」または「sdAb」という用語は、単一(1つのみ)の単量体可変抗体ドメインを有する抗体を指す。sdAbは、特異的な抗原に選択的に結合することができる。VHHはsdAbの例である。
特異的に結合する:本明細書において使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、第1の分子が第2の分子に関して呈する親和性の程度を指す。結合ペア(例えば、リガンド/受容体、抗体/抗原)の文脈において、結合ペアの第1の分子が試料中に存在する他の成分に有意な量で結合しない場合に、結合ペアの第1の分子は結合ペアの第2の分子に特異的に結合するといわれる。結合ペアの第1の分子が、第2の分子に対する第1の分子の親和性が、試料中に存在する他の成分に対する第1の分子の親和性よりも少なくとも2倍高い、代替的に少なくとも5倍高い、代替的に少なくとも10倍高い、代替的に少なくとも20倍高い、または代替的に少なくとも100倍高い場合に、結合ペアの第1の分子は結合ペアの第2の分子に特異的に結合するといわれる。特定の態様において、結合ペアの第1の分子が抗体である場合、例えば、スキャッチャード分析(Munsen,et al.(1980)Analyt.Biochem.107:220-239)により決定された場合に抗体と抗原(またはタンパク質、抗原、リガンド、もしくは受容体の抗原決定因子(エピトープ))との間の平衡解離定数(KD)が約10-6M未満、代替的に約10-8M未満、代替的に約10-10M未満、代替的に約10-11M未満、約10-12M未満である場合に、抗体は抗原に特異的に結合する。1つの態様において、解離が約105Mより高い、代替的に約106Mより高い、代替的に約107Mより高い、代替的に約108Mより高い、代替的に約109Mより高い、代替的に約1010Mより高い、または代替的に約1011Mより高い場合に、リガンドは受容体に特異的に結合する。特異的結合は、競合ELISAアッセイ、放射性リガンド結合アッセイ(例えば、飽和結合、スキャッチャードプロット、非線形曲線フィッティングプログラムおよび競合結合アッセイ); 非放射性リガンド結合アッセイ(例えば、蛍光偏光法(FP)、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET); 液相リガンド結合アッセイ(例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)、および免疫沈降); ならびに固相リガンド結合アッセイ(例えば、マルチウェルプレートアッセイ、オンビーズリガンド結合アッセイ、オンカラムリガンド結合アッセイ、およびフィルターアッセイ))ならびに商業的に入手可能な器具、例えばBiacore 8+、Biacore S200、Biacore T200(GE Healthcare Bio-Sciences、100 Results Way、Marlborough MA 01752)を用いる表面プラズモン共鳴アッセイ(例えば、Drescher et al.,(2009)Methods Mol Biol 493:323-343を参照)を含むが、これらに限定されない当技術分野において公知の技術を使用して評価されてもよい。一部の態様において、本開示は、hIL12RB1アイソフォームに特異的に結合する分子(例えば、IL12RB1結合性sdAb)を提供する。本明細書において使用される場合、IL12RB1に対するIL12RB1結合性分子の結合親和性、結合親和性は、表面プラズモン共鳴(「SPR」)により決定および/または定量化されてもよい。IL12RB1に対するIL12RB1結合性分子の結合親和性の評価において、結合ペアのいずれかのメンバーが固定化されてもよく、結合ペアの他の要素が移動相中に提供されてもよい。一部の態様において、関心対象のタンパク質が固定化されるセンサーチップは、関心対象のタンパク質の結合を促すための物質をコンジュゲートされ、これは例えば、ニトリロ三酢酸(NTA)誘導体化表面プラズモン共鳴センサーチップ(例えば、Cytiva Global Life Science Solutions USA LLC、Marlborough MAからカタログ番号BR100407として入手可能なSensor Chip NTA)、抗Hisタグ抗体(例えばCytiva、Marlborough MAから商業的に入手可能な抗ヒスチジンCM5チップ)、プロテインAまたはビオチンである。結果的に、結合を評価するために、チップの表面にコンジュゲートされた物質への結合を提供するためにタンパク質を修飾することが頻繁に必要とされる。例えば、結合ペアの1つのメンバーは、NTAをコンジュゲートされたチップ上の保持のためにポリヒスチジン配列(例えば、6xHisまたは8xHis)を含むキレート化ペプチドの組込みにより評価される。一部の態様において、結合性分子はチップ上に固定化されてもよく、受容体サブユニット(またはそのECD断片)は移動相中に提供されてもよい。代替的に、受容体サブユニット(またはそのECD断片)はチップ上に固定化されてもよく、結合性分子は移動相中に提供されてもよい。いずれの状況においても、被覆されたSPRチップ上の固定化のための一部のタンパク質の修飾は、SPRにより評価されるべき結合ペアの1つまたは両方の成分の結合特性に干渉し得ることが留意されるべきである。そのような場合において、結合ペアの移動要素および結合要素を切り替えるか、または評価されるべきタンパク質のコンジュゲーションへの非干渉を促す結合剤を有するチップを使用することが必要なことがある。代替的に、SPRを使用して受容体サブユニットに対する結合性分子の結合親和性を評価する場合に、結合性分子は、ポリHis配列(例えば、6xHisまたは8xHis)のC末端付加により誘導体化され、NTA誘導体化センサーチップ上に固定化されてもよく、結合親和性が評価されている受容体サブユニットは移動相中に提供される。組換えDNA技術により製造される結合性分子のC末端へのポリHis配列の組込みのための手段は、バイオテクノロジーの関連技術分野の当業者に周知である。
対象:「レシピエント」、「個体」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、診断、処置、または療法が所望される任意の哺乳動物対象、特にはヒトを指す。処置の目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物を指し、ヒト、家畜および農用動物、ならびに動物園、競技、または愛玩動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどを含む。
実質的に純粋な:本明細書において使用される場合、「実質的に純粋な」という用語は、組成物の成分が、組成物の全含有量の約50%より多く、代替的に約60%より多く、代替的に約70%より多く、代替的に約80%より多く、代替的に約90%より多く、代替的に約95%より多くを構成することを指し示す。「実質的に純粋な」タンパク質は、組成物の全含有量の約50%より多く、代替的に約60%より多く、代替的に約70%より多く、代替的に約80%より多く、代替的に約90%より多く、代替的に約95%より多くを構成する。
~を患う:本明細書において使用される場合、「~を患う」という用語は、対象は処置を要求するか、または処置から利益を受けるという、X線、CTスキャン、従来の実験室診断検査(例えば、血球算定)、ゲノムデータ、タンパク質発現データ、免疫組織化学を含むが、これらに限定されない疾患、障害または状態の同定の分野において許容される利用可能な情報に基づいて対象に関して医師により為される決定を指す。~を患うという用語は、典型的には、特定の疾患状態との関連において使用され、例えば「新生物性疾患を患う」は、新生物の存在を伴うと診断された対象を指す。
T細胞:本明細書において使用される場合、「T細胞」(T-cell)または「T細胞」(T cell)という用語は、その従来の意味において使用され、胸腺において分化し、特有の細胞表面抗原受容体を有するリンパ球を指し、細胞媒介性および液性免疫の開始または抑制を制御するものならびに抗原保有細胞を溶解するその他のものを含む。一部の態様において、T細胞は、ナイーブCD8+T細胞、細胞傷害性CD8+T細胞、ナイーブCD4+T細胞、ヘルパーT細胞、例えばTH1、TH2、TH9、TH11、TH22、TFH; 制御性T細胞、例えばTR1、Treg、誘導性Treg; メモリーT細胞、例えばセントラルメモリーT細胞、エフェクターメモリーT細胞、NKT細胞、腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)、ならびに、CAR-T細胞、組換え改変されたTILおよびTCR操作された細胞を含むがこれらに限定されないそのようなT細胞の操作されたバリアントを限定なく含む。
末端/末端の:ポリペプチドの構造の文脈において本明細書において使用される場合、「N末端」(または「アミノ末端」)および「C末端」(または「カルボキシル末端」)は、ポリペプチドのそれぞれ最もアミノおよびカルボキシル側の末端を指すが、「N末端の」および「C末端の」という用語は、それぞれN末端およびC末端へ向けたポリペプチドのアミノ酸配列中の相対的な位置を指し、それぞれN末端およびC末端における残基を含むことができる。「直ちにN末端の」は、連続するポリペプチド配列中の第2のアミノ酸残基と比べた第1のアミノ酸残基の位置であって、第1のアミノ酸がポリペプチドのN末端により近いものを指す。「直ちにC末端の」は、連続するポリペプチド配列中の第2のアミノ酸残基と比べた第1のアミノ酸残基の位置であって、第1のアミノ酸がポリペプチドのC末端により近いものを指す。
治療有効量:本明細書において用いられる場合、「治療有効量」という用語は、対象に投与した場合に疾患、障害、または状態の任意の症状、局面、または特徴に任意の検出可能なプラス効果を有することができる量の単一用量で、一連の用量の一部として、単独で、または薬学的組成物もしくは治療レジメンの一部として作用物質を対象に投与することを参照して用いられる。治療有効量は、関連する生理学的効果を測定することによって確認することができ、これは、投薬レジメンに関して、ならびに対象の状態などの診断分析に応じて調整されうる。作用物質の治療有効量を決定するための評価のためのパラメータは、年齢、体重、性別、全身の健康状態、ECOGスコア、観察可能な生理学的パラメータ、血中レベル、血圧、心電図、コンピュータ断層撮影、X線、およびその他などの徴候を含むが、これらに限定されない、当技術分野において承認されている診断基準を用いて医師により決定される。代替的にまたは追加的に、臨床背景で通常評価される他のパラメータ、例えば、体温、心拍、血液化学の正常化、血圧の正常化、コレステロールレベルの正常化、または疾患、障害、もしくは状態の任意の症状、局面、もしくは特徴、バイオマーカーレベルの改変、生存期間の増加、無増悪生存期間の延長、進行までの時間の延長、処置失敗までの時間の増加、無イベント生存期間の延長、次処置までの期間の延長、奏効率の改善、奏効期間の改善などは、作用物質の治療有効量が対象に投与されていたかを決定するためにモニタリングされる場合があり、これらのパラメータは、作用物質の投与に応答した対象の状態の改善を評価するために当技術分野の臨床家によって頼られている。
Treg細胞または制御性T細胞:「制御性T細胞」または「Treg細胞」という用語は、本明細書において使用される場合、エフェクターT細胞(Teff)を含むが、これに限定されない他のT細胞の応答を抑制することができるCD4+T細胞の種類を指す。Treg細胞は、CD4、IL2受容体のa-サブユニット(CD25)、および転写因子フォークヘッドボックスP3(FOXP3)の発現により特徴付けられる(Sakaguchi,Annu Rev Immunol 22,531-62(2004))。「従来のCD4+T細胞」により、制御性T細胞以外のCD4+T細胞が意味される。
膜貫通ドメイン:「膜貫通ドメイン」または「TM」という用語は、膜貫通ポリペプチドが細胞膜と会合している場合に、細胞膜中に包埋されており、膜貫通ポリペプチドの細胞外ドメイン(ECD)および細胞内ドメイン(ICD)とペプチジル連結している、膜貫通ポリペプチドのドメインを指す。膜貫通ドメインは、細胞外および/または細胞内ドメインのいずれかまたは両方と同種(天然に関連付けられる)または異種(天然に関連付けられない)であってもよい。膜貫通ドメインは、細胞外および/または細胞内ドメインのいずれかまたは両方と同種(天然に関連付けられる)または異種(天然に関連付けられない)であってもよい。一部の態様において、受容体が第1の親受容体に由来する細胞内ドメインを含むキメラ受容体であり、第2の細胞外ドメインが第2の異なる親受容体に由来する場合、キメラ受容体の膜貫通ドメインは、キメラ受容体が由来する親受容体のICDまたはECDのいずれかと通常は関連付けられる膜貫通ドメインである。代替的に、受容体の膜貫通ドメインは、形質膜を貫通する人工アミノ酸配列であってもよい。一部の態様において、受容体が第1の親受容体に由来する細胞内ドメインを含むキメラ受容体であり、第2の細胞外ドメインが第2の異なる親受容体に由来する場合、キメラ受容体の膜貫通ドメインは、キメラ受容体が由来する親受容体のICDまたはECDのいずれかと通常は関連付けられる膜貫通ドメインである。
処置する:「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、疾患、障害、もしくは状態、またはそれらの症状が対象において診断された、観察された、またはその他の後に、対象を苦しめているこのような疾患、障害、もしくは状態の根本原因の少なくとも1つ、またはこのような疾患、障害、もしくは状態に関連する症状の少なくとも1つを一時的または永続的に除去する、低減する、抑制する、緩和する、または回復させるように対象に関して開始される行動(例えば、本明細書において記述される結合性分子、またはそれを含む薬学的組成物を投与すること)をいう。処置は、疾患を患っている対象に関して採られる行動を含み、当該行動は、対象における疾患の阻害をもたらす(例えば、疾患、障害、もしくは状態の進展を停止させる、またはそれに関連する1つもしくは複数の症状を回復させる)。
VHH:本明細書において用いられる場合、「VHH」という用語は、単一の単量体重鎖可変抗体ドメインを有するsdAbの一種である。そのような抗体は、もともと軽鎖がないラクダ科の哺乳動物(例えば、ラクダ、ラマ)に見出され、またはそれらから産生されうる。VHHは、ラクダ科動物(ラクダ、ラマおよびアルパカを含む)の免疫から(例えば、Hamers-Casterman, et al. (1993) Nature 363:446-448を参照のこと)、またはVHHフレームワークで構築されたライブラリ(例えば、ファージライブラリ)をスクリーニングすることにより得ることができる。所与の特異性を有する抗体は、サメを含むがこれに限定されない軟骨魚類の免疫から得られたVHHなどの非哺乳動物源から導出されてもよい。特定の態様において、本明細書において記述される二重特異性VHH2結合性分子中のVHHは、VHHと受容体との間の平衡解離定数が、例えば、Scatchard分析(Munsen, et al. 1980 Analyt. Biochem. 107:220-239)によって決定された場合、約10-6 Mより大きい、代替的に約10-8 Mより小さい、代替的に約10-10 Mより小さい、代替的に約10-11 Mより小さい、代替的に約10-10 Mより小さい、約10-12 Mより小さい場合、受容体(例えば、天然または非天然受容体ペアの第1の受容体または第2の受容体)に結合する。ラクダ科動物からの単一ドメイン抗体の作製のための標準化されたプロトコルは、科学文献において周知である。例えば、Vincke, et al (2012) Chapter 8 in Methods in Molecular Biology, Walker, J. editor (Humana Press, Totowa NJ)を参照されたい。特異的結合は、競合ELISA、BIACORE(登録商標)アッセイおよび/またはKINEXA(登録商標)アッセイを含むがこれらに限定されない当技術分野において公知の技法を用いて評価されうる。いくつかの態様において、本明細書において記述されるVHHは、ヒトフレームワーク領域を含むようにヒト化することができる。ヒト化VHHを作るために用いることができるヒト生殖細胞系の例としては、VH3-23 (例えば、UniProt ID:P01764)、VH3-74 (例えば、UniProt ID:A0A0B4J1X5)、VH3-66 (例えば、UniProt ID:A0A0C4DH42)、VH3-30 (例えば、UniProt ID:P01768)、VH3-11 (例えば、UniProt ID:P01762)およびVH3-9 (例えば、UniProt ID:P01782)が挙げられるが、これらに限定されることはない。
V H H 2 :本明細書において用いられる場合、「VHH2」および「二重特異性VHH2」および「VHH二量体」という用語は、第1および第2のsdAbがともにVHHであり、かつ第1の受容体、またはそのドメインもしくはサブユニットに結合する第1のVHH、および第2の受容体、またはそのドメインもしくはサブユニットに結合する第2のVHHである、本開示の結合性分子のサブタイプをいうように、互換的に用いられる。
野生型:本明細書において用いられる場合、「野生型」または「WT」または「天然」という用語は、天然に見出され、ヒトの手によって改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列をいうように用いられる。
インターロイキン10受容体結合性分子
本発明は、IL10受容体の合成リガンドであるIL10R結合性分子を提供する。
本発明は、IL10受容体の合成リガンドであるIL10R結合性分子を提供する。
本開示のIL10R結合性分子は、IL10RaおよびIL10Rb受容体サブユニットの細胞外ドメインに選択的に結合する2つまたはより多くの単一ドメイン抗体を含む。1つの態様において、本開示は、
(e)IL10受容体のIL10Raサブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第1の単一ドメイン抗体(sdAb)(「IL10Ra sdAb」)と、
(f)IL10受容体のIL10Rbサブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第2の単一ドメイン抗体(「IL10Rb sdAb」)と
を含む、IL10R受容体のリガンドであるIL10受容体(IL10R)結合性分子であって、
・第1のsdAbおよび第2のsdAbが安定な会合状態にあり;
・IL10受容体のIL10RaおよびIL10Rbサブユニットが、IL10R結合性分子との接触に応答して二量体化し; かつ
・IL10RaおよびIL10Rbを発現している細胞を有効量のIL10R結合性分子と接触させることが、結果としてIL10RaおよびIL10Rbの細胞内ドメインを近接状態にして、細胞内シグナル伝達をもたらす、
該IL10R受容体結合性分子を提供する。
(e)IL10受容体のIL10Raサブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第1の単一ドメイン抗体(sdAb)(「IL10Ra sdAb」)と、
(f)IL10受容体のIL10Rbサブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第2の単一ドメイン抗体(「IL10Rb sdAb」)と
を含む、IL10R受容体のリガンドであるIL10受容体(IL10R)結合性分子であって、
・第1のsdAbおよび第2のsdAbが安定な会合状態にあり;
・IL10受容体のIL10RaおよびIL10Rbサブユニットが、IL10R結合性分子との接触に応答して二量体化し; かつ
・IL10RaおよびIL10Rbを発現している細胞を有効量のIL10R結合性分子と接触させることが、結果としてIL10RaおよびIL10Rbの細胞内ドメインを近接状態にして、細胞内シグナル伝達をもたらす、
該IL10R受容体結合性分子を提供する。
本開示のIL10R結合性分子は、哺乳動物対象における疾患の処置または予防において有用である。一部の態様において、本開示は、治療有効量の本開示のIL10R結合性分子の投与による哺乳動物対象における自己免疫疾患の処置または予防を提供する。一部の態様において、本開示は、治療有効量の本開示のIL10R結合性分子の投与による哺乳動物対象における、ウイルスおよび慢性ウイルス感染症を含む、感染性疾患の処置または予防を提供する。一部の態様において、本開示は、治療有効量の本開示のIL10R結合性分子の投与による哺乳動物対象における新生物性疾患の処置または予防を提供する。一部の態様において、本開示は、1つまたは複数の補充的な治療剤と組み合わせた治療有効量の本開示のIL10R結合性分子の投与による哺乳動物対象における新生物性、感染性または自己免疫の処置または予防を提供する。
一部の態様において、本開示は、哺乳動物対象においてインビボで長期化された作用の持続期間を提供するように修飾されたIL10R結合性分子およびその薬学的に許容される製剤を提供する。
本開示は、哺乳動物対象への投与のためのIL10R結合性分子の薬学的に許容される製剤をさらに提供する。本開示は、哺乳動物対象への投与のための薬学的に許容される組成物であって、組成物が、ポリペプチドIL10R結合性分子をコードする核酸配列、ポリペプチドIL10R結合性分子をコードする組換えウイルスもしくは非ウイルスベクター、またはポリペプチドIL10R結合性分子をコードする核酸配列を含む組換えにより改変された哺乳動物細胞を含み、各々の場合において核酸配列が哺乳動物細胞において機能的な1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結されている、組成物をさらに提供する。
一部の態様において、本開示のIL10R結合性分子はポリペプチドである。本開示は、ポリペプチドIL10R結合性分子をコードする核酸配列を提供する。本開示は、ポリペプチドIL10R結合性分子をコードする核酸配列を含む組換えベクターをさらに提供する。本開示は、ポリペプチドIL10R結合性分子をコードする核酸を含む組換えにより改変された哺乳動物細胞をさらに提供する。本開示は、ポリペプチドIL10R結合性分子の組換え製造、単離、精製および特徴付けの方法をさらに提供する。ポリペプチドIL10R結合性分子をコードする核酸配列を含む組換えベクターを提供する。
IL10:
IL10受容体(IL10R)のコグネイトリガンドはサイトカインIL10である。IL10という用語はヒトおよびマウス(murineまたはmouse)IL10を含む。ヒトIL10(hIL10)は、2つの同一のサブユニットを含む非共有結合的に連結されたホモ二量体タンパク質である。各々のヒトIL10単量体は、18アミノ酸のシグナル配列を含む178アミノ酸のプレタンパク質として発現され、シグナル配列は翻訳後に除去されて160アミノ酸の成熟タンパク質となる。シグナル配列(プレタンパク質のアミノ酸19~178に対応する)を有しない成熟IL-10タンパク質のカノニカルなアミノ酸配列(UniProt Reference No. P22301)は、
である。
IL10受容体(IL10R)のコグネイトリガンドはサイトカインIL10である。IL10という用語はヒトおよびマウス(murineまたはmouse)IL10を含む。ヒトIL10(hIL10)は、2つの同一のサブユニットを含む非共有結合的に連結されたホモ二量体タンパク質である。各々のヒトIL10単量体は、18アミノ酸のシグナル配列を含む178アミノ酸のプレタンパク質として発現され、シグナル配列は翻訳後に除去されて160アミノ酸の成熟タンパク質となる。シグナル配列(プレタンパク質のアミノ酸19~178に対応する)を有しない成熟IL-10タンパク質のカノニカルなアミノ酸配列(UniProt Reference No. P22301)は、
である。
マウス(mouseまたはmurine)IL10(mIL10)は、2つの同一のサブユニットを含む非共有結合的に連結されたホモ二量体タンパク質である。各々のマウスIL10単量体は、18アミノ酸のシグナル配列を含む178アミノ酸のプレタンパク質として発現され、シグナル配列は翻訳後に除去されて160アミノ酸の成熟タンパク質となる。シグナル配列(プレタンパク質のアミノ酸19~178に対応する)を有しない成熟IL-10タンパク質のカノニカルなアミノ酸配列(UniProt Reference No. P18893)は、
である。
である。
IL10R結合性分子は、IL10受容体を発現している細胞においてIL10シグナル伝達を活性化させる。本開示は、IL10受容体を発現している細胞において選択的なレベルの細胞内シグナル伝達を提供するように操作されたIL10R結合性分子を提供する。本発明は、特定の細胞型において細胞内シグナル伝達を生成するように操作されたIL10R結合性分子を提供する。
IL10受容体
IL10受容体は、IL10RaおよびIL10Rbサブユニットを含むヘテロ二量体タンパク質複合体である。IL10RaおよびIL10Rbサブユニットを発現する哺乳動物細胞の表面上のIL10の相互作用は、IL10RaおよびIL10Rbの二量体化ならびに細胞内シグナル伝達をもたらす。IL10RaおよびIL10RbのIL10媒介性二量体化に特徴的な細胞内シグナル伝達は、JAK/STAT経路の活性化、特に、シグナル伝達経路の他の構成要素と組み合わせて遺伝子発現のモジュレーションを結果としてもたらす細胞内シグナル伝達経路の構成要素であるSTAT3分子のリン酸化である。一部の態様において、IL10受容体はヒトIL10受容体であり、IL10はヒトIL10である。一部の態様において、IL10受容体はマウスIL10受容体であり、IL10はマウスIL10である。本明細書において使用される場合、「IL10受容体受容体」および「IL10受容体」および「IL10R」という用語は交換可能に使用され、IL10RaおよびIL10Rbを含むヘテロ二量体複合体を指す。IL10Rという用語は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、サル、ウシ、およびブタを含むが、これらに限定されない任意の哺乳動物のIL10受容体を含む。
IL10受容体は、IL10RaおよびIL10Rbサブユニットを含むヘテロ二量体タンパク質複合体である。IL10RaおよびIL10Rbサブユニットを発現する哺乳動物細胞の表面上のIL10の相互作用は、IL10RaおよびIL10Rbの二量体化ならびに細胞内シグナル伝達をもたらす。IL10RaおよびIL10RbのIL10媒介性二量体化に特徴的な細胞内シグナル伝達は、JAK/STAT経路の活性化、特に、シグナル伝達経路の他の構成要素と組み合わせて遺伝子発現のモジュレーションを結果としてもたらす細胞内シグナル伝達経路の構成要素であるSTAT3分子のリン酸化である。一部の態様において、IL10受容体はヒトIL10受容体であり、IL10はヒトIL10である。一部の態様において、IL10受容体はマウスIL10受容体であり、IL10はマウスIL10である。本明細書において使用される場合、「IL10受容体受容体」および「IL10受容体」および「IL10R」という用語は交換可能に使用され、IL10RaおよびIL10Rbを含むヘテロ二量体複合体を指す。IL10Rという用語は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、サル、ウシ、およびブタを含むが、これらに限定されない任意の哺乳動物のIL10受容体を含む。
本開示の目的のために、本明細書に記載されているhIL10Raポリペプチドのアミノ酸残基の番号付けは、このカノニカルな配列UniProg Database Reference No. Q13651の番号付けにしたがって為される。SEQ ID NO:452のアミノ酸1~21はIL10Raのシグナルペプチドとして同定され、SEQ ID NO:452のアミノ酸22~235は細胞外ドメインとして同定され、SEQ ID NO:452のアミノ酸236~256は膜貫通ドメインとして同定され、SEQ ID NO:452のアミノ酸257~578は細胞内ドメインとして同定される。
マウスIL10受容体のIL10Ra成分はマウスIL10Ra(mIL10Ra)タンパク質である。mIL10Raは、16アミノ酸のシグナル配列を含有する575アミノ酸のプレタンパク質として発現され、シグナル配列は翻訳後に切断されて569アミノ酸の成熟タンパク質となる。カノニカルな全長mIL10Raは、アミノ酸配列:
を有するポリペプチドである。
を有するポリペプチドである。
本開示の目的のために、本明細書に記載されているマウスIL10Raポリペプチドのアミノ酸残基の番号付けは、このカノニカルな配列UniProt Database Reference No. Q61727の番号付けにしたがって為される。SEQ ID NO:454のアミノ酸1~16はmIL10Raのシグナルペプチドとして同定され、SEQ ID NO:454のアミノ酸17~241は細胞外ドメインとして同定され、SEQ ID NO:454のアミノ酸242~262は膜貫通ドメインとして同定され、SEQ ID NO:454のアミノ酸263~575は細胞内ドメインとして同定される。
hIL10Rbは、325アミノ酸のプレタンパク質として発現され、最初の19アミノ酸は、成熟した306アミノ酸のタンパク質において翻訳後に切断されるシグナル配列を含む。アミノ酸20~220(成熟タンパク質のアミノ酸1~201)は細胞外ドメインに対応し、アミノ酸221~242(成熟タンパク質のアミノ酸202~223)は22アミノ酸の膜貫通ドメインに対応し、アミノ酸243~325(成熟タンパク質のアミノ酸224~306)は細胞内ドメインに対応する。カノニカルな全長hIL10Rb前駆体は、アミノ酸配列:
を有するポリペプチドである。
を有するポリペプチドである。
本開示の目的のために、本明細書に記載されているヒトIL10Rbポリペプチドのアミノ酸残基の番号付けは、カノニカルな配列(UniProt ID:Q08334、SEQ ID NO:456)の番号付けにしたがって為される。
マウスIL10Rb(mIL10Rb)は、19アミノ酸のN末端シグナル配列を含む349アミノ酸のプレタンパク質として発現される。アミノ酸20~220(成熟タンパク質のアミノ酸1~201)は細胞外ドメインに対応し、アミノ酸221~241(成熟タンパク質のアミノ酸202~222)は21アミノ酸の膜貫通ドメインに対応し、アミノ酸242~349(成熟タンパク質のアミノ酸223~330)は細胞内ドメインに対応する。シグナル配列を含むカノニカルな全長mIL10Rb前駆体タンパク質は、UniProtKBデータベースにおいてエントリーQ61190として参照されるポリペプチドである。シグナル配列を含むカノニカルな全長mIL10Rb前駆体タンパク質は、アミノ酸配列:
のポリペプチドである。
のポリペプチドである。
本開示の目的のために、本明細書に記載されているマウスIL10Rbポリペプチドのアミノ酸残基の番号付けは、このカノニカルな配列(UniProt ID:Q61190、SEQ ID NO 458)の番号付けにしたがって為される。
単一ドメイン抗体
本発明のIL10R結合性分子は、2つまたはより多くの単一ドメイン抗体を含む。「単一ドメイン抗体」(sdAb)という用語は、本明細書において使用される場合、抗原に特異的に結合することができ、それが由来する親抗体と結合について競合する単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を指す。「単一ドメイン抗体」という用語はscFvおよびVHH分子を含む。一部の態様において、サイトカイン受容体結合性分子のsdAbの1つまたは両方はscFvである。一部の態様において、sdAbの1つまたは両方はVHHである。一部の態様において、sdAbの1つまたは両方はscFvである。
本発明のIL10R結合性分子は、2つまたはより多くの単一ドメイン抗体を含む。「単一ドメイン抗体」(sdAb)という用語は、本明細書において使用される場合、抗原に特異的に結合することができ、それが由来する親抗体と結合について競合する単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を指す。「単一ドメイン抗体」という用語はscFvおよびVHH分子を含む。一部の態様において、サイトカイン受容体結合性分子のsdAbの1つまたは両方はscFvである。一部の態様において、sdAbの1つまたは両方はVHHである。一部の態様において、sdAbの1つまたは両方はscFvである。
単一ドメイン抗体という用語は、キメラsdAb、CDRグラフト化sdAbおよびヒト化sdAbを含むが、これらに限定されない操作されたsdAbを含む。一部の態様において、本開示のIL10R結合性分子への組込みのためのsdAbの1つまたは複数はCDRグラフト化されている。抗体、重鎖抗体、およびそれらに由来するsdAbから得られるCDRは、CDRグラフト化sdAbを生成するためにSaerens,et al.(2005)J.Mol Biol 352:597-607に記載されるように代替的なフレームワークにグラフトされてもよい。任意のフレームワーク領域が、本明細書に記載されているCDRと共に使用され得る。
一部の態様において、IL10R結合性分子への組込みのためのsdAbの1つまたは複数は、CDRが1つの種(例えば、ラクダ)に由来し、ならびにフレームワークおよび/または定常領域が別の種(例えば、ヒトまたはマウス)に由来するキメラsdAbである。特有の態様において、フレームワーク領域はヒトまたはヒト化配列である。そのため、1つまたは複数のヒト化されたsdAbを含むIL10R結合性分子は、本開示の範囲内にあると考えられる。
一部の態様において、本開示のサイトカイン受容体結合性分子のsdAbの1つまたは複数はVHHである。本明細書において使用される場合、「VHH」という用語は、ラクダ科動物(ラクダ、ラマおよびアルパカを含む)の免疫化から典型的には得られるラクダ科動物抗体に由来する単一ドメイン抗体を指す(例えば、Hamers-Casterman,et al.(1993)Nature 363:446-448を参照)。VHHはまた、重鎖抗体またはNanobodies(登録商標)として参照され、単一ドメイン抗体はまた、非哺乳動物供給源、例えばサメを含むが、これに限定されない軟骨魚のIgNAR抗体免疫化から得られるVHHに由来してもよい。VHHは、単一の単量体可変抗体ドメインを含有する単一ドメイン抗体(sdAb)の種類である。全長抗体のように、それは特異的な抗原に選択的に結合することができる。
VHHの相補性決定領域(CDR)は単一ドメインポリペプチド内にある。VHHは、ラクダ科動物中に見出される重鎖抗体から操作され得る。例示的なVHHは、2つの重鎖および2つの軽鎖から構成される伝統的な哺乳動物抗体(150~160kDa)よりもはるかに小さい約12~15kDaの分子量を有する。VHHは、軽鎖を天然に欠いているラクダ科哺乳動物(例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびグアナコ)において見出され得るか、または該動物から製造され得る。sdAbおよびVHHSの説明は、例えば、De Greve et al.,Curr Opin Biotechnol.61:96-101,2019; Ciccarese,et al.,Front Genet.10:997,2019; Chanier and Chames,Antibodies(Basel)8(1),2019; およびDe Vlieger et al.,Antibodies(Basel)8(1),2018において見出され得る。ラクダ科動物VHHに由来するCDRを使用して、IL10R結合性分子に組み込まれ得るCDRグラフト化VHHを調製してもよい。
一部の態様において、本開示のIL10R結合性分子への組込みのためのVHHは、ヒトフレームワーク領域を含有するヒト化されたVHHである。ラクダ科動物単一ドメイン抗体のヒト化の技術は当技術分野において周知である。例えば、Vincke,et al.(2009)General Strategy to Humanize a Camelid Single-domain Antibody and Identification of a Universal Humanized Nanobody Scaffold J.Biol.Chem.284(5)3273-3284を参照。ヒト化されたVHHの調製において有用なヒトフレームワーク領域は、VH3-23(例えば、UniProt ID:P01764)、VH3-74(例えば、UniProt ID:A0A0B4J1X5)、VH3-66(例えば、UniProt ID:A0A0C4DH42)、VH3-30(例えば、UniProt ID:P01768)、VH3-11(例えば、UniProt ID:P01762)、およびVH3-9(例えば、UniProt ID:P01782)を含むが、これらに限定されない。
安定的に会合した:
本開示のIL10R結合性分子は、IL10Rbの細胞外ドメインに選択的に結合する単一ドメイン抗体(「IL10Rb sdAb」)との安定な会合状態にあるIL10Raの細胞外ドメインに選択的に結合する単一ドメイン抗体(「IL10Ra sdAb」)を含む。本明細書において使用される場合、「安定的に会合した」または「~との安定な会合状態にある」という用語は、1つの分子(例えば、ポリペプチド)が別の分子と熱力学的および/または動態的に会合され得る様々な手段を指すために使用される。別の分子への1つの分子の安定な会合は、共有結合性および非共有結合性相互作用を含む、様々な手段により達成されてもよい。
本開示のIL10R結合性分子は、IL10Rbの細胞外ドメインに選択的に結合する単一ドメイン抗体(「IL10Rb sdAb」)との安定な会合状態にあるIL10Raの細胞外ドメインに選択的に結合する単一ドメイン抗体(「IL10Ra sdAb」)を含む。本明細書において使用される場合、「安定的に会合した」または「~との安定な会合状態にある」という用語は、1つの分子(例えば、ポリペプチド)が別の分子と熱力学的および/または動態的に会合され得る様々な手段を指すために使用される。別の分子への1つの分子の安定な会合は、共有結合性および非共有結合性相互作用を含む、様々な手段により達成されてもよい。
一部の態様において、IL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbの安定な会合は、共有結合、例えばペプチド結合により達成されてもよい。一部の態様において、第1および第2の結合ドメインの間の共有結合性連結は、第1の結合ドメインのC末端と第2の結合ドメインのN末端との間の共有結合である。
一部の態様において、IL10R結合性タンパク質のIL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbの共有結合性連結は、配位共有結合性連結によりもたらされる。本開示は、キレート化ペプチドを含む単一ドメイン抗体の例を提供する。キレート化ペプチドは、遷移金属イオンへの配位共有結合性連結を結果としてもたらす。一部の態様において、遷移金属イオンは、2つまたはより多くのキレート化ペプチドと配位共有結合性連結を形成する能力を有する。結果的に、第1および第2の結合ドメインの各々は、キレート化ペプチドおよび各々のサブユニットによる結合ドメインの安定な会合を含んで、遷移金属イオンとの配位共有結合性複合体を形成してもよい。一部の態様において、遷移金属イオンは、バナジウム、マンガン、鉄、イリジウム、オスミウム、レニウム、白金、パラジウム、コバルト、クロムまたはルテニウムから選択される。この構成の模式的な実例は、添付の図面の図4、パネルBにおいて提供される。図4、パネルAおよびBに示される構成の各々において、単一ドメイン抗体のN末端ドメインは環境に提示されて、標的サイトカイン受容体ECDへのsdAbのCDRの増強された曝露を促すことが留意されるべきである。配位共有結合性連結の形成は、遷移金属イオンが動態的に不安定な酸化状態、例えばCo(II)、Cr(II)、またはRu(III)にある場合に、助長される。錯化後に、遷移金属の酸化状態は、動態的に不活性の酸化状態、例えばCo(III)、Cr(III)、またはRu(II)に変化(酸化または還元)されて、動態的に不活性の配位共有結合性複合体を提供してもよい。遷移金属を介するキレート化ペプチドを含むタンパク質の間の動態的に不活性のおよび動態的に不安定な配位共有結合性複合体の形成は、1995年8月8日に発行されたAnderson,et al.、米国特許第5,439,928号明細書においてより詳細に記載されている。
一部の態様において、IL10R結合性分子のIL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbの共有結合性連結はリンカーをさらに含んでもよい。リンカーは、ペプチドリンカーおよび化学的リンカーを含むが、これらに限定されない群から選択される分子である。一部の態様において、リンカーは、IL10Ra sdAbのC末端をIL10Rb sdAbのN末端につなぐ。一部の態様において、リンカーは、IL10Rb sdAbのC末端をIL10Ra sdAbのN末端につなぐ。
一部の態様において、リンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは、1~50個のアミノ酸(例えば、2~50、5~50、10~50、15~50、20~50、25~50、30~50、35~50、40~50、45~50、2~45、2~40、2~35、2~30、2~25、2~20、2~15、2~10、2~5個のアミノ酸)を含むことができる。グリシンおよびグリシン-セリンポリマーは相対的に構造化されておらず、したがって構成要素の間の中立なテザーとして役立ち得る。グリシンポリマーの例は、(G)n、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、グリシン-セリンポリマー(例えば、(GmSo)n、(GSGGS)n、(GmSoGm)n、(GmSoGmSoGm)n、(GSGGSm)n、(GSGSmG)nおよび(GGGSm)n、ならびにこれらの組合せ(ここで、m、n、およびoの各々は、少なくとも1~20、例えば、1~18、216、3~14、4~12、5~10、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10の整数から独立して選択される))、ならびに他の柔軟性リンカーを含む。本開示のIL10R結合性分子の調製において有用な例示的な柔軟なペプチドリンカーは、表16において提供されるリンカーを含むが、これらに限定されない。
一部の態様において、第1および第2のドメインの共有結合性連結は、化学的リンカーにより達成されてもよい。化学的リンカーの例は、アリールアセチレン、2~10個の単量体単位を含有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、またはこれらの組合せを含む。
一部の態様において、IL10R結合性タンパク質のIL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbの安定な会合は、非共有結合性相互作用によりもたらされる。2つの分子の間の安定な会合を提供する非共有結合性相互作用の例は、静電相互作用(例えば、水素結合、イオン結合、ハロゲン結合、双極子-双極子相互作用、ファンデルワールス力、ならびに陽イオン-p相互作用、陰イオン-p相互作用およびp-p相互作用を含むp-効果)ならびに疎水性/親水性相互作用を含む。一部の態様において、本開示の結合性分子のsdAbの安定な会合は、非共有結合性相互作用によりもたらされてもよい。
1つの態様において、IL10R結合性分子のIL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbの非共有結合性の安定な会合は、「ノブ-イントゥー-ホール」操作型Fc二量体の各々の単量体のsdAbのコンジュゲーションにより達成されてもよい。ノブ-イントゥー-ホール改変は、CH3ドメイン中の2つの免疫グロブリン重鎖の間のインターフェースにおける改変であって、i)第1の重鎖のCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基が、表面からの突出(「ノブ」)を作り出すより大きい側鎖を有するアミノ酸残基(例えば、チロシンまたはトリプトファン)で置き換えられており、ii)第2の重鎖のCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基が、より小さい側鎖を有するアミノ酸残基(例えば、アラニンまたはスレオニン)で置き換えられており、それにより、第2のCH3ドメイン中のインターフェースにおいてキャビティ(「ホール」)を生成し、該インターフェース内で、第1のCH3ドメインの突出する側鎖(「ノブ」)が第2のCH3ドメイン中のキャビティにより受け入れられるものを指す。ノブ-イントゥー-ホール改変は、Ridgway,et al.(1996)Protein Engineering 9(7):617-621ならびに1998年3月24日に発行された米国特許第5,731,168号明細書、2010年1月5日に発行された米国特許第7,642,228号明細書、2010年4月13日に発行された米国特許第7,695,936号明細書、および2012年7月10日に発行された米国特許第8,216,805号明細書においてより十分に記載されている。1つの態様において、「ノブ-イントゥー-ホール改変」は、抗体重鎖の1つにおけるアミノ酸置換T366Wおよび任意でアミノ酸置換S354C、ならびに抗体重鎖の他の1つにおけるアミノ酸置換T366S、L368A、Y407Vおよび任意でY349Cを含む。さらには、Fcドメインは、位置S354およびY349におけるシステイン残基の導入により改変されてもよく、これは、Fe領域中の2つの抗体重鎖の間の安定化ジスルフィドブリッジを結果としてもたらす(Carter,et al.(2001)Immunol Methods 248,7-15)。ノブ-イントゥー-ホールフォーマットは、「ノブ」改変を有する第1のFc単量体上の第1のポリペプチド(例えば、IL10Rb結合性sdAb)および「ホール」改変を有する第2のFc単量体上の第2のポリペプチドの発現を促して、ヘテロ二量体ポリペプチドコンジュゲートの発現を促すために使用される。ノブ-イントゥー-ホールフォーマットは、「ノブ」改変を有する第1のFc単量体上の第1のポリペプチドおよび「ホール」改変を有する第2のFc単量体上の第2のポリペプチドの発現を促して、ヘテロ二量体ポリペプチドコンジュゲートの発現を促すために使用される。IL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbが安定な非共有結合性の会合状態にあるIL10R結合性分子の1つの態様は、添付の図面の図4、パネルAに示されるように、IL10R結合性分子の各々のsdAbが、任意でリンカーを含んで、ノブ-イントゥー-ホールFc二量体の各々のサブユニットに共有結合しているものである。
IL10Ra sdAbの生成および評価
hIL2Raに対するsdAbを生成するために、hIL2Raタンパク質の細胞外ドメインが免疫原として使用されてもよい。成熟(シグナル配列を欠いている)hIL2Raの細胞外ドメインは、アミノ酸配列
を有するアミノ酸配列(SEQ ID NO:452のアミノ酸22~235)を有する。
hIL2Raに対するsdAbを生成するために、hIL2Raタンパク質の細胞外ドメインが免疫原として使用されてもよい。成熟(シグナル配列を欠いている)hIL2Raの細胞外ドメインは、アミノ酸配列
を有するアミノ酸配列(SEQ ID NO:452のアミノ酸22~235)を有する。
一部の態様において、免疫原または免疫原性組成物として用いられる場合、hIL2Ra ECDは、免疫調節タンパク質との融合タンパク質のドメインとして提供されてもよい。
mIL10Raに対するsdAbを生成するために、mIL10Raタンパク質の細胞外ドメインが免疫原として使用されてもよい。mIL10Raの細胞外ドメインの細胞外ドメインは、アミノ酸配列
を有するアミノ酸配列(SEQ ID NO:454のアミノ酸17~241)を有する。
を有するアミノ酸配列(SEQ ID NO:454のアミノ酸17~241)を有する。
一部の態様において、免疫原または免疫原性組成物として用いられる場合、mIL2Ra ECDは、免疫調節タンパク質との融合タンパク質のドメインとして提供されてもよい。
hIL10Ra sdAbのシリーズは、本明細書の実施例1~4の教示に実質的にしたがって生成された。簡潔に述べれば、IL10Raの細胞外ドメイン、ヒトIgG1ヒンジドメインおよびヒトIgG1重鎖Fcを含む組換えにより製造された融合タンパク質を含有する皮下用のアジュバント添加された組成物により数週の期間にかけてヒトIL10RaのECDでラクダを逐次的に免疫化した。免疫化後に、適切なサイズのVHH-ヒンジ-CH2-CH3種の血液試料から抽出されたRNAを転写してDNA配列を生成し、消化し、VHHドメインをコードする核酸配列を含む約400bpの断片を同定し、単離した。単離された配列を制限エンドヌクレアーゼで消化し、hisタグをコードする配列とインフレームでのファージミドベクターへの挿入を促し、大腸菌(E.coli)への形質転換を行い、ファージライブラリーを生成した。ファージライブラリーの複数ラウンドのバイオパニングを実行して、IL10Ra(適宜ヒトまたはマウス)のECDに結合するVHHを同定した。個々のファージクローンを96ウェルプレートフォーマットにおけるペリプラズム抽出物ELISA(PE-ELISA)のために単離し、選択的な結合を比色決定により確認した。IL10Ra抗原への特異的結合を実証したIL10Ra結合性分子を単離し、シークエンシングし、配列を分析してVHH配列、CDRを同定し、独特のVHHクロノタイプを同定した。本明細書において使用される場合、「クロノタイプ」という用語は、同じB細胞前駆細胞を起源とする結合性分子のコレクション、特に同じ生殖系列ファミリーに属し、同じCDR3長さを有し、およびCDR3配列において70%またはより高い相同性を有する抗原結合性分子のコレクションを指す。
hIL10Ra ECD抗原への特異的結合を実証したVHH分子(hIL10Ra VHH)のアミノ酸配列は表5に提供され、そのようなVHHから単離されたCDRは表2に提供される。表5のVHHをコードする核酸配列は表8に提供される。
IL10Ra sdAbの結合の結合親和性を確認および評価するために、生成された各々のクロノタイプからの代表的な例を、SPRを介する結合の評価のために選択した。SEQ ID NO 159、161、162、163、165、167および170に対応するECDに対するhIL10Ra VHHの結合親和性の評価を、実施例5の教示に実質的にしたがって表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して実行した。緩衝液をサブストラクトしたセンサーグラムをBiacore T200 Evaluation Softwareで処理し、1:1ラングミュア結合モデルと大域的にフィッティングして(バルクシフトを0に設定)、動態および親和性定数(ka、kd、KD)を抽出した。RMAX<100RUは、動態分析と適合性の表面密度を指し示す。Rmaxの計算値を、式:Rmax=ロード(RU)×リガンドの価数×(分析物の分子量/リガンドの分子量)を使用して生成した。表面活性は、Rmaxの実験値/計算値の比として定義した。これらの結合親和性実験の結果は以下の表22に提供される。表22に提供されるデータは、生成されたIL10Ra単一ドメイン抗体はhIL10RaのECDへの特異的結合を有したことを実証する。
表2は、本開示の結合性分子への組込みのためのIL10Ra sdAbの調製において有用なCDRを提供する。一部の態様において、IL10Ra sdAbは、hIL10RaのECDでの免疫化に応答して生成され、それに特異的に結合する。一部の態様において、IL10Ra sdAbは、SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49および52のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1; SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26 29、32、35、38、41、44、47、50および53のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびにSEQ ID NO:3、6、9、12、15、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51および54のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3を含む、単一ドメイン抗体である。
一部の態様において、IL10Ra sdAbは、表5に提供されるhIL10Ra sdAbのアミノ酸配列(SEQ ID NO:154~171)のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の態様において、IL10Ra sdAbは、表5に提供されるhIL10Ra sdAbのアミノ酸配列(SEQ ID NO:154~171)のいずれか1つの配列と実質的に同一の配列を含む。ある特定の態様において、IL10Ra sdAbは、表5に提供されるhIL10Ra sdAbのアミノ酸配列(SEQ ID NO:154~171)のいずれか1つの配列と同一の配列を含む。
別の局面において、本開示は、本明細書に記載されるIL10Ra sdAbをコードする単離された核酸を提供する。表8は、表5のIL10Ra sdAb(SEQ ID NO:154~171)をコードするDNA配列(SEQ ID NO:205~222)を提供する。ある特定の態様において、本開示は、表8のDNA配列(SEQ ID NO:205~222)に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有する配列を含む単離された核酸を提供する。ある特定の態様において、本開示は、表8のDNA配列(SEQ ID NO:205~222)と実質的に同一のDNA配列を含む単離された核酸を提供する。ある特定の態様において、本開示は、表8のDNA配列(SEQ ID NO:205~222)と同一のDNA配列を含む単離された核酸を提供する。
IL10Rb VHHの生成および評価
本開示は、マウスおよびヒトIL10Rb(hIL10Rb)ならびにマウスIL10Rb(mIL10Rb)の細胞外ドメインに特異的に結合するIL10Rb sdAbをさらに提供する。IL10Rb VHHの生成のために用いられた手順は、上記に提供されるものと実質的に同じであり、以下により詳細に議論されるように免疫化のために使用された抗原の例外と共に実施例5の教示に実質的にしたがって為された。
本開示は、マウスおよびヒトIL10Rb(hIL10Rb)ならびにマウスIL10Rb(mIL10Rb)の細胞外ドメインに特異的に結合するIL10Rb sdAbをさらに提供する。IL10Rb VHHの生成のために用いられた手順は、上記に提供されるものと実質的に同じであり、以下により詳細に議論されるように免疫化のために使用された抗原の例外と共に実施例5の教示に実質的にしたがって為された。
hIL10Rbに対するsdAbを生成するために、hIL10Rbタンパク質の細胞外ドメインが免疫原として使用される。成熟(シグナル配列を欠いている)hIL10Rbの細胞外ドメインは、アミノ酸配列:
を有する。
を有する。
mIL10Rbに対するsdAbを生成するために、mIL10Rbタンパク質の細胞外ドメインが免疫原として使用される。成熟(シグナル配列を欠いている)mIL10Rbの細胞外ドメインは、hIL10Rbタンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を有し、免疫原として使用された。成熟(シグナル配列を欠いている)mIL10Rbの細胞外ドメインは、アミノ酸配列:
を有する。
を有する。
以上にしたがって生成されhIL10Rb ECD抗原への特異的結合を実証したVHH分子(hIL10Rb VHH)のアミノ酸配列は表6(SEQ ID NO:172~198)に提供され、そのようなVHHから単離されたCDRは表3(SEQ ID NO:55~135)に提供される。表6のVHHをコードする核酸配列は表9(SEQ ID NO:223~249)に提供される。
以上にしたがって生成されmIL10Rb ECD抗原への特異的結合を実証したVHH分子(mIL10Rb VHH)のアミノ酸配列は表7(SEQ ID NO:199~204)に提供され、そのようなVHHから単離されたCDRは表4(SEQ ID NO:136~153)に提供される。表7のVHHをコードする核酸配列は表10(SEQ ID NO:250~255)に提供される。
hIL10Rb sdAbの結合の結合親和性を確認および評価するために、生成された各々のクロノタイプからの代表的な例を、SPRを介する結合の評価のために選択した。SEQ ID NO:172、174、183、186 187、197および198に対応するhIL10Rbに対するhIL10Rb結合性分子の結合親和性の評価を、実施例5の教示に実質的にしたがって表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して実行した。緩衝液をサブストラクトしたセンサーグラムをBiacore T200 Evaluation Softwareで処理し、1:1ラングミュア結合モデルと大域的にフィッティングして(バルクシフトを0に設定)、動態および親和性定数(ka、kd、KD)を抽出した。RMAX<100RUは、動態分析と適合性の表面密度を指し示す。Rmaxの計算値を、式:Rmax=ロード(RU)×リガンドの価数×(分析物の分子量/リガンドの分子量)を使用して生成した。表面活性は、Rmaxの実験値/計算値の比として定義した。これらの結合親和性実験の結果は以下の表23に提供される。
提供されるデータは、生成されたhIL10Rb単一ドメイン抗体は、hIL10RbのECDに対する特異的結合を有し、以下に議論されるようにIL10R結合性分子の活性のモジュレーションにおいて有用な範囲の結合親和性を有したことを実証する。
表3および表4は、本開示の結合性分子への組込みのためのIL10Ra sdAbの調製において有用なCDRを提供する。一部の態様において、IL10Ra sdAbは、hIL10RaのECDでの免疫化に応答して生成され、それに特異的に結合する。一部の態様において、IL10Ra sdAbは、表3のCDR1配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1; 表3のCDR1配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに表3のCDR1配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3を含む、単一ドメイン抗体である。一部の態様において、IL10Ra sdAbは、mIL10RaのECDでの免疫化に応答して生成され、それに特異的に結合する。一部の態様において、IL10Ra sdAbは、表4のCDR1配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1; 表4のCDR1配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに表4のCDR1配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3を含む、単一ドメイン抗体である。
一部の態様において、IL10Rb sdAbは、表6のhIL10Rb sdAbのアミノ酸配列(SEQ ID NO:172~198)のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の態様において、IL10Rb sdAbは、表6のhIL10ba sdAbのアミノ酸配列(SEQ ID NO:172~198)のいずれか1つの配列と実質的に同一の配列を含む。ある特定の態様において、IL10Rb sdAbは、表6のhIL10ba sdAbのアミノ酸配列(SEQ ID NO:172~198)のいずれか1つの配列と同一の配列を含む。
一部の態様において、IL10Rb sdAbは、表7のmIL10Rb sdAbのアミノ酸配列(SEQ ID NO:199~204)のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の態様において、IL10Rb sdAbは、表7のmIL10Rb sdAbのアミノ酸配列(SEQ ID NO:199~204)のいずれか1つの配列と実質的に同一の配列を含む。ある特定の態様において、IL10Rb sdAbは、表7のmIL10Rb sdAbのアミノ酸配列(SEQ ID NO:199~204)のいずれか1つの配列と同一の配列を含む。
別の局面において、本開示は、本明細書に記載されるIL10Rb sdAbをコードする単離された核酸を提供する。ある特定の態様において、本開示は、表9のDNA配列(SEQ ID NO:223~249)に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有する配列を含む単離された核酸を提供する。ある特定の態様において、本開示は、表9のDNA配列(SEQ ID NO:223~249)と実質的に同一のDNA配列を含む単離された核酸を提供する。ある特定の態様において、本開示は、表9のDNA配列(SEQ ID NO:223~249)と同一のDNA配列を含む単離された核酸を提供する。
別の局面において、本開示は、本明細書に記載されるIL10Rb sdAbをコードする単離された核酸を提供する。ある特定の態様において、本開示は、表10のDNA配列(SEQ ID NO:250~255)に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有する配列を含む単離された核酸を提供する。ある特定の態様において、本開示は、表10のDNA配列(SEQ ID NO:250~255)と実質的に同一のDNA配列を含む単離された核酸を提供する。ある特定の態様において、本開示は、表10のDNA配列(SEQ ID NO:250~255)と同一のDNA配列を含む単離された核酸を提供する。
IL10Rポリペプチド結合性分子の生成
一部の態様において、本発明のIL10R結合性分子は、以下の式[#1]のポリペプチドである:
H2N-(IL10 VHH#1)-(L1)a-(IL10 VHH#2)-(L2)b-(CP)c-COOH[#1]
式中:「-」は共有結合を表し; L1およびL2はリンカーであり; CPはキレート化ペプチドであり; a、b、およびcは、整数0または1から独立して選択され; 「H2N」はアミノ末端を表し; ならびに「COOH」はポリペプチドのカルボキシ末端を表す。
一部の態様において、本発明のIL10R結合性分子は、以下の式[#1]のポリペプチドである:
H2N-(IL10 VHH#1)-(L1)a-(IL10 VHH#2)-(L2)b-(CP)c-COOH[#1]
式中:「-」は共有結合を表し; L1およびL2はリンカーであり; CPはキレート化ペプチドであり; a、b、およびcは、整数0または1から独立して選択され; 「H2N」はアミノ末端を表し; ならびに「COOH」はポリペプチドのカルボキシ末端を表す。
上記の調製されたhIL10Ra VHHおよびhIL10Rb VHHを使用して、式[#1]の98個のポリペプチドIL10R結合性分子のシリーズをSEQ ID NO:256~353として調製し、SEQ ID NO 256~353の各々に関して、a=1およびL1=G3S; b=1およびL2=Ala-Ser; c=1およびCP=ヘキサ-ヒスチジンであった。SEQ ID NO 256~353のこれらの98個のIL-10受容体結合性タンパク質のIL10Ra VHH、リンカーおよびIL10Ra VHH、キレート化ペプチド要素は、表11に提供される。SEQ ID NO:256~353のアミノ酸配列は表12に提供され、IL10R結合性分子の発現のために使用される以上の各々をコードするDNA配列は表14(SEQ ID NO:353~402)に提供される。
表11および表12のIL10R結合性タンパク質を調製し、IL10活性について評価した。これらの98個のIL10R結合性タンパク質の発現および精製に関する詳細は実施例において提供される。簡潔に述べれば、実施例4に実質的にしたがってSEQ ID No:256~353をコードする核酸配列をそれぞれSEQ ID No:354~451として合成し、組換え発現ベクターに挿入し、24ウェルプレートフォーマットにおいてHEK293細胞中で発現させ、精製した。本明細書の実施例5および6に実質的にしたがってSEQ ID NO:192~298のIL-10受容体結合性タンパク質を含有する上清を、非刺激および野生型ヒトIL-10を対照として用いて活性について評価した。これらの実験の結果は表13に提供される。
表13に提供されるデータから見られ得るように、式[#1]のIL-10受容体結合性タンパク質はIL-10活性アッセイにおいてIL-10活性を実証した。IL-10活性のレベルを、吸光度読取り値に基づいて低(非刺激より高く、かつA630<1)、中(A630 1~1.5)、および高(A630>1.5)としてカテゴライズした。上記のデータから、11個のIL10受容体結合性タンパク質は高い活性を実証し(SEQ ID NO:258、273、274、275、276、282、290、297、298、308および314)、4個は中程度の活性(SEQ ID NO:267、269、271、および333)、8個のVHHは低い活性(SEQ ID NO:276、281、283、288、291、301、303、および313)を有した。
上記の調製されたIL10R結合性分子の結合をさらに調べ、特徴付けるために、以上の分子の選択をhIL10RaおよびhIL10Rb受容体サブユニットへの結合について実施例の教示に実質的にしたがってSPRにより評価し、データを以下の表24および表25に提示した。第1の列は、IL10R結合性分子において使用されたVHH(上記の表5および表6に提供される)ならびにアミノからカルボキシへのそれらの配向性を表し、各々の分子は、ビオチンにコンジュゲートされたVHHの間の4アミノ酸G3Sリンカーと共に発現された。以下の表24および表25に提供されるデータにより示されるように、式[#1]のIL10Rポリペプチド結合性分子は、SPRにより決定された場合にhIL10RaおよびhIL10Rb VHHサブユニットの各々に対する1桁のナノモル濃度の結合親和性を実証する。このデータは、hIL10RaおよびhIL10Rb VHHサブユニットの各々は、それらのそれぞれのIL10受容体サブユニットに対するそれらのそれぞれの結合親和性を保持すること、ならびに、以下により詳細に議論されるように、「フォワード」または「リバース」のいずれの構成において提供されていても、活性を保持したことを実証する。
受容体結合性分子の活性のモジュレーション
一部の態様において、例えば部分的なアゴニズムまたは特定の細胞型の選択的な活性化を達成するために、本開示のIL10R結合性分子の設計は、受容体結合性分子の設計における構造的バリエーションによりモジュレートされてもよい。活性におけるこのバリエーションは、IL10R受容体結合性分子の結合および活性をモジュレートするため、IL10R結合性分子の活性を最適化して部分的なアゴニズム、選択的な細胞型の活性化を達成するため、またはIL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbの各々についてコグネイトリガンドと比べてそれらのそれぞれの受容体サブユニットに対する増加もしくは減少した結合を有する分子を提供するために用いられてもよい。
一部の態様において、例えば部分的なアゴニズムまたは特定の細胞型の選択的な活性化を達成するために、本開示のIL10R結合性分子の設計は、受容体結合性分子の設計における構造的バリエーションによりモジュレートされてもよい。活性におけるこのバリエーションは、IL10R受容体結合性分子の結合および活性をモジュレートするため、IL10R結合性分子の活性を最適化して部分的なアゴニズム、選択的な細胞型の活性化を達成するため、またはIL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbの各々についてコグネイトリガンドと比べてそれらのそれぞれの受容体サブユニットに対する増加もしくは減少した結合を有する分子を提供するために用いられてもよい。
本開示のIL10R結合性分子の活性をモジュレートする能力は、複数の治療的応用において実質的な利益を提供する。IL10は、T細胞、B細胞、マクロファージ、および抗原提示細胞(APC)に対する作用ならびにその臨床開発を制限してきた一見矛盾する活性を通じて複数の免疫応答を調節する多面的サイトカインである。IL10は、免疫応答を抑制することが報告されており、活性化された単球およびマクロファージにおいてIL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、GM-CSFおよびG-CSFの発現を阻害する。IL10は、NK細胞によるIFN-γ産生の抑制と関連付けられる。対照的に、IL10は、IL-2およびIL-4で処理された胸腺細胞の刺激の増強、B細胞の生存能の増強、ならびにMHCクラスII抗原の提示の刺激を含む、免疫刺激特性を呈する。結果として、IL-10の使用は、炎症状態、免疫関連障害、線維性障害、代謝障害およびがんを含む、広範囲の疾患、障害および状態の処置において有用であるとして同定されている。
本開示のIL10R分子は、活性のモジュレーションを可能にし、ヒト疾患の処置において有意な利益を提供する。本明細書に記載されるIL10R結合性タンパク質は、その必要のある対象における、新生物性疾患、例えばがん(例えば、固形腫瘍がん; 例えば、非小細胞肺癌(NSCLC)、腎細胞癌(RCC)、または黒色腫)の処置において有用である。一部の態様において、本明細書に記載されるIL10R結合性タンパク質は、IL10よりも長い治療有効性(例えば、より低い有効用量、低減された毒性)を提供することができる。本開示のIL10R結合性分子は、異なる細胞型において異なるレベルの下流のシグナル伝達のトリガーとなることができる。例えば、IL10R結合性分子中のIL10Ra sdAb抗体とIL10Rb sdAb抗体との間のリンカーの長さを変更することにより、IL10R結合性分子は、望ましくない細胞型と比較して、所望される細胞型においてより高いレベルの下流のシグナル伝達を提供する。一部の態様において、IL10R結合性分子は、マクロファージよりもT細胞(例えば、CD8+T細胞)を選択的に活性化させる部分的なIL10アゴニストである。一部の態様において、活性化されたT細胞はIFNガンマの上方調節を有する。一部の態様において、部分アゴニストであるIL10R結合性タンパク質は、自己免疫性炎症性疾患、例えば潰瘍性大腸炎およびクローン病を抑制することができる。
1つの態様において、本開示は、単球と比べてT細胞、特にCD8+T細胞を優先的に活性化させるIL10Ra結合性分子を提供する。1つの態様において、本開示は、IL10Rbの細胞外ドメインに対するIL10Rb sdAbの親和性よりも高い、IL10Raの細胞外ドメインに対する親和性を、IL10Ra sdAbの親和性が有する、式#1のIL10Ra結合性分子を提供する。一部の態様において、本開示は、IL10Ra sdAbの親和性が、約10-8~約10-10M、代替的に約10-9~約10-10M、または代替的に約10-10MのIL10Raの細胞外ドメインに対する親和性を有し、およびIL10Rb sdAbが、約10-6~約10-9M、代替的に約10-7~約10-9M、代替的に約10-7~約10-8M、代替的に約10-9M、代替的に約10-8MのIL10Rbの細胞外ドメインに対する親和性を有する、式#1のIL10Ra分子を提供する。一部の態様において、本開示は、IL10Ra sdAbの親和性が、約10-8~約10-10M、代替的に約10-9~約10-10M、または代替的に約10-10MのIL10Raの細胞外ドメインに対する親和性を有し、およびIL10Rb sdAbが、約10-6~約10-9M、代替的に約10-7~約10-9M、代替的に約10-7~約10-8M、代替的に約10-9M、代替的に約10-8MのIL10Rbの細胞外ドメインに対する親和性を有し、およびIL10RaのECDに対するIL10Ra sdAbの親和性が、IL10RbのECDに対するIL10Rb sdAbの親和性よりも2倍より大きく高い、代替的に5倍より大きく高い、代替的に10倍より大きく高い、代替的に20倍より大きく高い、代替的に40倍より大きく高い、代替的に50倍より大きく高い、代替的に60倍より大きく高い、代替的に70倍より大きく高い、代替的に80倍より大きく高い、代替的に90倍より大きく高い、代替的に100倍より大きく高い、代替的に150倍より大きく高い、代替的に200倍より大きく高いまたは代替的に500倍より大きく高い、式#1のIL10Ra分子を提供する。
一部の態様において、例えばリンカー長さを変更することにより、IL10R結合性分子は、IL10RaおよびIL10Rbの両方の受容体を発現するがあまりに強力に活性化された場合に貧血を引き起こし得る細胞型であるマクロファージにおける下流のシグナル伝達のレベルと比較して、T細胞(例えば、CD8+T細胞)においてより高いレベルの下流のシグナル伝達を引き起こすことができる。マクロファージにおける下流のシグナル伝達が高いレベルまで活性化された場合、これらの活性化されたマクロファージは次に、加齢赤血球細胞を排除して、貧血を引き起こし得る。IL10R結合性分子の活性をモジュレートする能力は、マクロファージにおける下流のシグナル伝達のレベルと比較して、T細胞(例えば、CD8+T細胞)における、より高いレベルの下流のシグナル伝達を伴う分子を提供し、その結果、貧血が回避される。一部の態様において、本開示のIL10R結合性分子は、マクロファージにおける下流のシグナル伝達のレベルの少なくとも1.1、1.5、2、3、5、または10倍の、T細胞(例えば、CD8+T細胞)における下流のシグナル伝達のレベルをもたらす。他の態様において、異なる結合親和性を有する異なるIL10Ra sdAb抗体および異なる結合親和性を有する異なるIL10Rb sdAb抗体を使用して、IL10R結合性分子の活性をチューニングすることができる。さらに、IL10R結合性分子が単一のポリペプチドとして提供される場合、ポリペプチド中の2つの抗体の配向性はまた、分子の特性を変更するために変更され得る。一部の態様において、IL10、IL10受容体のコグネイトリガンド(すなわちIL10部分アゴニストであるIL10R結合性分子)により引き起こされるEmaxと比較して低減されたEmaxを有するIL10R結合性タンパク質を提供することが所望される。Emaxは、リガンド(例えば、本明細書に記載される結合性タンパク質またはコグネイトリガンド(例えば、IL10))により得られ得る細胞型における最大応答レベルを反映する。一部の態様において、本明細書に記載されるIL10R結合性タンパク質は、hIL10により引き起こされるEmaxの少なくとも1%(例えば、1%~100%、10%~100%、20%~100%、30%~100%、40%~100%、50%~100%、60%~100%、70%~100%、80%~100%、90%~100%、1%~90%、1%~80%、1%~70%、1%~60%、1%~50%、1%~40%、1%~30%、1%~20%、または1%~10%)を有する。
以前に議論したように、IL10R結合性分子のsdAbの配向性は、分子の所望される特徴を最適化するために使用され得る。添付の図面の図2、図3および図4において示されている様々な異なる構造において提供されるIL10RのsdAbの配向性は、以下の式で表される:
(a)H2N-[IL10Ra sdAb]-[L1]x-[IL10Rb sdAb]-[L2]y-[CP]z-COOH;
(b)H2N-[IL10Rb sdAb]-[L1]x-[IL10Ra sdAb]-[L2]y-[CP]z-COOH;
(c)H2N-[IL10Ra sdAb]-[L1]x-[IL10Rb sdAb]-[L2]y-[Fc]z-COOH;
(d)H2N-[IL10Rb sdAb]-[L1]x-[IL10Ra sdAb]]-[L2]y-[Fc]z-COOH;
(式中、L1およびL2は1~50個のアミノ酸の独立して選択されるポリペプチドリンカーであり、x=0または1、y=0または1であり; CPはキレート化ペプチドであり; 「Fc」は単量体Fcドメインであり、y=0または1である); 前記構造の非共有結合性複合体:
(e)[H2N-[IL10Ra sdAb]-[L1]x-Fc1-COOH:H2N-[IL10Rb sdAb]-[L2]y-Fc2-COOH];
(式中、L1およびL2は1~50個のアミノ酸の独立して選択されるポリペプチドリンカーであり、x=0または1、y=0または1であり; CPはキレート化ペプチドであり; 「Fc1」は単量体Fcドメインであり、「Fc2」は単量体Fcドメインであり、Fc1およびFc2は安定な非共有結合性会合を形成し、y=0または1である); ならびに、前記構造の配位共有結合性複合体
(f)H2N-[IL10Ra sdAb]-[L1]x-(CP1)-M-(CP2)-(L2)-[IL10Rb sdAb]-NH2
(式中、L1およびL2は1~50個のアミノ酸の独立して選択されるポリペプチドリンカーであり、xおよびyは0または1から独立して選択され; CP1は第1のキレート化ペプチドであり; CP2は第2のキレート化ペプチドであり; Mは遷移金属イオンである)。
(a)H2N-[IL10Ra sdAb]-[L1]x-[IL10Rb sdAb]-[L2]y-[CP]z-COOH;
(b)H2N-[IL10Rb sdAb]-[L1]x-[IL10Ra sdAb]-[L2]y-[CP]z-COOH;
(c)H2N-[IL10Ra sdAb]-[L1]x-[IL10Rb sdAb]-[L2]y-[Fc]z-COOH;
(d)H2N-[IL10Rb sdAb]-[L1]x-[IL10Ra sdAb]]-[L2]y-[Fc]z-COOH;
(式中、L1およびL2は1~50個のアミノ酸の独立して選択されるポリペプチドリンカーであり、x=0または1、y=0または1であり; CPはキレート化ペプチドであり; 「Fc」は単量体Fcドメインであり、y=0または1である); 前記構造の非共有結合性複合体:
(e)[H2N-[IL10Ra sdAb]-[L1]x-Fc1-COOH:H2N-[IL10Rb sdAb]-[L2]y-Fc2-COOH];
(式中、L1およびL2は1~50個のアミノ酸の独立して選択されるポリペプチドリンカーであり、x=0または1、y=0または1であり; CPはキレート化ペプチドであり; 「Fc1」は単量体Fcドメインであり、「Fc2」は単量体Fcドメインであり、Fc1およびFc2は安定な非共有結合性会合を形成し、y=0または1である); ならびに、前記構造の配位共有結合性複合体
(f)H2N-[IL10Ra sdAb]-[L1]x-(CP1)-M-(CP2)-(L2)-[IL10Rb sdAb]-NH2
(式中、L1およびL2は1~50個のアミノ酸の独立して選択されるポリペプチドリンカーであり、xおよびyは0または1から独立して選択され; CP1は第1のキレート化ペプチドであり; CP2は第2のキレート化ペプチドであり; Mは遷移金属イオンである)。
本開示の受容体結合性分子の活性および/または特異性のモジュレーションの手段の例は、ポリペプチドIL10R結合性分子中のIL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbの逐次的な配向性を変更すること、各々のIL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbの、それらのそれぞれのIL10Raおよび/または各々の標的に対する結合親和性を独立して変更すること、ならびに、例えばリンカーを用いることもしくは長さを変更することにより、IL10Ra sdAbとIL10Rb sdAbとの間の距離をモジュレートすること(これは、IL10受容体サブユニットの細胞内シグナル伝達ドメインの近接状態に影響し、それにより、受容体へのコグネイトリガンドの結合に特徴的な細胞内シグナル伝達、例えば細胞において誘導されるホスホSTAT3のレベルのモジュレーションを達成する)を含むが、これらに限定されない。以下に提供されるデータにより示されるように、これらのバリエーションの各々は、IL10R結合性分子の特性をチューニングするために使用され得る。
単一ポリペプチドIL10R結合性分子中のIL10RaおよびIL10Rb sdAbの逐次的な配向性
IL10R結合性分子が単一のポリペプチド中にIL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAb配列を含む場合、IL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAb配列は、IL10Ra sdAbがIL10Rb sdAbに対してN末端にある(本明細書において「フォワード構成」と称される)か、またはIL10Rb sdAbがIL10Ra sdAbに対してN末端にある(本明細書において「リバース構成」と称される)ように並べられてもよい。2つの配向性は、以下の式により表される[#1]の化合物の例として示され得る;
(a)H2N-[IL10Ra sdAb]-[L1]x-[IL10Rb sdAb]-[L2]y-[CP]z-COOH;
(b)H2N-[IL10Rb sdAb]-[L1]x-[IL10Ra sdAb]-[L2]y-[CP]z-COOH;
式中:「-」は共有結合を表し; L1およびL2はリンカーであり; CPはキレート化ペプチドであり; a、b、およびcは、整数0または1から独立して選択され; 「H2N」はアミノ末端を表し; ならびに「COOH」はポリペプチドのカルボキシ末端を表す。
IL10R結合性分子が単一のポリペプチド中にIL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAb配列を含む場合、IL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAb配列は、IL10Ra sdAbがIL10Rb sdAbに対してN末端にある(本明細書において「フォワード構成」と称される)か、またはIL10Rb sdAbがIL10Ra sdAbに対してN末端にある(本明細書において「リバース構成」と称される)ように並べられてもよい。2つの配向性は、以下の式により表される[#1]の化合物の例として示され得る;
(a)H2N-[IL10Ra sdAb]-[L1]x-[IL10Rb sdAb]-[L2]y-[CP]z-COOH;
(b)H2N-[IL10Rb sdAb]-[L1]x-[IL10Ra sdAb]-[L2]y-[CP]z-COOH;
式中:「-」は共有結合を表し; L1およびL2はリンカーであり; CPはキレート化ペプチドであり; a、b、およびcは、整数0または1から独立して選択され; 「H2N」はアミノ末端を表し; ならびに「COOH」はポリペプチドのカルボキシ末端を表す。
「フォワード」構成:
一部の態様において、IL10R結合性分子は、式[#1]の構造のポリペプチドを含み、式[#1]のN末端VHH(すなわち、IL10 VHH#1)はIL10Ra VHHであり、C末端VHH(すなわち、IL10 VHH#2)はIL10Rb VHHであり、「-」は共有結合を表し; L1およびL2は、表16、リンカーの独立して選択されるポリペプチドリンカーであり; CPはキレート化ペプチドであり; a、b、およびcは、整数0または1から独立して選択され; 「H2N」はアミノ末端を表し; ならびに「COOH」はポリペプチドのカルボキシ末端を表す。
一部の態様において、IL10R結合性分子は、式[#1]の構造のポリペプチドを含み、式[#1]のN末端VHH(すなわち、IL10 VHH#1)はIL10Ra VHHであり、C末端VHH(すなわち、IL10 VHH#2)はIL10Rb VHHであり、「-」は共有結合を表し; L1およびL2は、表16、リンカーの独立して選択されるポリペプチドリンカーであり; CPはキレート化ペプチドであり; a、b、およびcは、整数0または1から独立して選択され; 「H2N」はアミノ末端を表し; ならびに「COOH」はポリペプチドのカルボキシ末端を表す。
「リバース」構成:
一部の態様において、IL10R結合性分子は、式[#1]の構造のポリペプチドを含み、上記の式[#1]のN末端VHH(すなわち、IL10 VHH#1)は抗IL10Rb VHHであり、C末端VHH(すなわち、IL10 VHH#2)は抗IL10Ra VHHであり(「フォワード配向性」)、「-」は共有結合を表し; L1およびL2は、表16、リンカーの独立して選択されるポリペプチドリンカーであり; CPはキレート化ペプチドであり; a、b、およびcは、整数0または1から独立して選択され; 「H2N」はアミノ末端を表し; ならびに「COOH」はポリペプチドのカルボキシ末端を表す。
一部の態様において、IL10R結合性分子は、式[#1]の構造のポリペプチドを含み、上記の式[#1]のN末端VHH(すなわち、IL10 VHH#1)は抗IL10Rb VHHであり、C末端VHH(すなわち、IL10 VHH#2)は抗IL10Ra VHHであり(「フォワード配向性」)、「-」は共有結合を表し; L1およびL2は、表16、リンカーの独立して選択されるポリペプチドリンカーであり; CPはキレート化ペプチドであり; a、b、およびcは、整数0または1から独立して選択され; 「H2N」はアミノ末端を表し; ならびに「COOH」はポリペプチドのカルボキシ末端を表す。
フォワードおよびリバース配向性の例示的なIL10R分子の活性の評価
IL10RaおよびIL10Rb sdAbのフォワードおよびリバース配向性のIL10R結合性分子を、実施例の教示に実質的にしたがって生成した。配列ID NOS:256~304に対応するIL10R結合性分子は「フォワード構成」または「フォワード配向性」の例である。配列ID NOS:305~353に対応するIL10R結合性分子は、「リバース配向性」または「リバース構成」の化合物の例である。これらの「フォワード配向性」および「リバース配向性」分子を、実施例にしたがって活性について評価し、データを表13に提供した。表13に提示される結合データを参照すると、IL10RaおよびIL10Rb sdAb結合ドメインの配向性は、IL10R結合性分子のIL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbの逐次的な(フォワード対リバース)配向性に応答してIL10活性の実質的なモジュレーションを提供することが見られ得る。
IL10RaおよびIL10Rb sdAbのフォワードおよびリバース配向性のIL10R結合性分子を、実施例の教示に実質的にしたがって生成した。配列ID NOS:256~304に対応するIL10R結合性分子は「フォワード構成」または「フォワード配向性」の例である。配列ID NOS:305~353に対応するIL10R結合性分子は、「リバース配向性」または「リバース構成」の化合物の例である。これらの「フォワード配向性」および「リバース配向性」分子を、実施例にしたがって活性について評価し、データを表13に提供した。表13に提示される結合データを参照すると、IL10RaおよびIL10Rb sdAb結合ドメインの配向性は、IL10R結合性分子のIL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbの逐次的な(フォワード対リバース)配向性に応答してIL10活性の実質的なモジュレーションを提供することが見られ得る。
上記の配列の調製されたVHH分子から単離されるCDRは、フォワードおよびリバースの両方の構成のIL10R結合性分子を調製するために使用され得る。一部の態様において、本開示は、「フォワード」構成のIL10R結合性分子であって、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に以下のポリペプチドを含む、該IL10R結合性分子を提供する:
(a)以下を含むIL10Ra sdAb:
・SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、および52のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50および53のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51および54のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3;
(b)1~50個のアミノ酸、代替的に1~40個のアミノ酸、代替的に1~30個のアミノ酸、代替的に1~20個のアミノ酸、代替的に1~15個のアミノ酸、代替的に1~10個のアミノ酸、代替的に1~8個のアミノ酸、代替的に1~6個のアミノ酸、代替的に1~4個のアミノ酸のポリペプチドリンカー; ならびに
(c)以下を含むIL10Rb sdAb:
・SEQ ID NO:55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148および151のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149および152のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150および153のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3。
(a)以下を含むIL10Ra sdAb:
・SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、および52のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50および53のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51および54のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3;
(b)1~50個のアミノ酸、代替的に1~40個のアミノ酸、代替的に1~30個のアミノ酸、代替的に1~20個のアミノ酸、代替的に1~15個のアミノ酸、代替的に1~10個のアミノ酸、代替的に1~8個のアミノ酸、代替的に1~6個のアミノ酸、代替的に1~4個のアミノ酸のポリペプチドリンカー; ならびに
(c)以下を含むIL10Rb sdAb:
・SEQ ID NO:55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148および151のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149および152のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150および153のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3。
一部の態様において、「フォワード」構成のIL10R結合性分子において、IL10R結合性分子は、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に以下のポリペプチドを含む:
(a)SEQ ID NO:154~171のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むIL10Ra sdAb;
(b)1~50個のアミノ酸、代替的に1~40個のアミノ酸、代替的に1~30個のアミノ酸、代替的に1~20個のアミノ酸、代替的に1~15個のアミノ酸、代替的に1~10個のアミノ酸、代替的に1~8個のアミノ酸、代替的に1~6個のアミノ酸、代替的に1~4個のアミノ酸のポリペプチドリンカー; および
(c)SEQ ID NO:172~204のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有する配列を含むIL10Rb sdAb。
(a)SEQ ID NO:154~171のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むIL10Ra sdAb;
(b)1~50個のアミノ酸、代替的に1~40個のアミノ酸、代替的に1~30個のアミノ酸、代替的に1~20個のアミノ酸、代替的に1~15個のアミノ酸、代替的に1~10個のアミノ酸、代替的に1~8個のアミノ酸、代替的に1~6個のアミノ酸、代替的に1~4個のアミノ酸のポリペプチドリンカー; および
(c)SEQ ID NO:172~204のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有する配列を含むIL10Rb sdAb。
一部の態様において、「フォワード」構成のIL10R分子においてIL10R結合性分子は、SEQ ID NO:256~304のいずれか1つの配列に対して90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
一部の態様において、本開示は、「リバース」構成のIL10R結合性分子であって、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に以下のポリペプチドを含む、該IL10R結合性分子を提供する:
(a)以下を含むIL10Rb sdAb:
・SEQ ID NO:55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148および151のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149および152のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150および153のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3;
(b)1~50個のアミノ酸、代替的に1~40個のアミノ酸、代替的に1~30個のアミノ酸、代替的に1~20個のアミノ酸、代替的に1~15個のアミノ酸、代替的に1~10個のアミノ酸、代替的に1~8個のアミノ酸、代替的に1~6個のアミノ酸、代替的に1~4個のアミノ酸のポリペプチドリンカー; および
(c)以下を含むIL10Ra sdAb:
(d)SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、および52のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
(e)SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50および53のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
(f)SEQ ID NO:、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51および54のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3。
(a)以下を含むIL10Rb sdAb:
・SEQ ID NO:55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148および151のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149および152のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150および153のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3;
(b)1~50個のアミノ酸、代替的に1~40個のアミノ酸、代替的に1~30個のアミノ酸、代替的に1~20個のアミノ酸、代替的に1~15個のアミノ酸、代替的に1~10個のアミノ酸、代替的に1~8個のアミノ酸、代替的に1~6個のアミノ酸、代替的に1~4個のアミノ酸のポリペプチドリンカー; および
(c)以下を含むIL10Ra sdAb:
(d)SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、および52のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
(e)SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50および53のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
(f)SEQ ID NO:、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51および54のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3。
一部の態様において、本開示は、「リバース」構成のIL10R結合性分子であって、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に以下のポリペプチドを含む、該IL10R結合性分子を提供する:
(a)SEQ ID NO:172~204のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有する配列を含むIL10Rb sdAb;
(b)1~50個のアミノ酸、代替的に1~40個のアミノ酸、代替的に1~30個のアミノ酸、代替的に1~20個のアミノ酸、代替的に1~15個のアミノ酸、代替的に1~10個のアミノ酸、代替的に1~8個のアミノ酸、代替的に1~6個のアミノ酸、代替的に1~4個のアミノ酸のポリペプチドリンカー; および
(c)SEQ ID NO:154~171のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むIL10Ra sdAb。
(a)SEQ ID NO:172~204のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有する配列を含むIL10Rb sdAb;
(b)1~50個のアミノ酸、代替的に1~40個のアミノ酸、代替的に1~30個のアミノ酸、代替的に1~20個のアミノ酸、代替的に1~15個のアミノ酸、代替的に1~10個のアミノ酸、代替的に1~8個のアミノ酸、代替的に1~6個のアミノ酸、代替的に1~4個のアミノ酸のポリペプチドリンカー; および
(c)SEQ ID NO:154~171のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むIL10Ra sdAb。
一部の態様において、IL10R結合性分子は、式#1のIL10R結合性分子に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有するポリペプチドであり、IL10VHH#1およびIL10VHH#2は、以下の表の行のSEQ IDに対応する(例えばIL10VHH#1はSEQ ID NO:165であり、IL10VHH#2はSEQ ID NO:198である、などである):
IL10R結合性分子の活性に対するリンカー長さの効果の評価
本開示において議論されるように、本開示のIL10R二量体VHH IL10R結合性分子の活性は、第1のIL10 VHH単量体と第2のIL10 VHH単量体との間のリンカーの長さを変更することによりモジュレートされてもよい。リンカー長さにおけるバリエーションのバリエーション効果の実例を示すために、各々の場合においてb=1およびL2=Ala-Ser; c=1; ならびにCP=hisx6の式[#1]のIL10R結合性ポリペプチドのシリーズを、以下の表26にしたがってIL10VHH#1配列をDR241(SEQ ID NO 170)と一定に保持しながらIL10VHH#2におけるバリエーションを含有させて調製した。
本開示において議論されるように、本開示のIL10R二量体VHH IL10R結合性分子の活性は、第1のIL10 VHH単量体と第2のIL10 VHH単量体との間のリンカーの長さを変更することによりモジュレートされてもよい。リンカー長さにおけるバリエーションのバリエーション効果の実例を示すために、各々の場合においてb=1およびL2=Ala-Ser; c=1; ならびにCP=hisx6の式[#1]のIL10R結合性ポリペプチドのシリーズを、以下の表26にしたがってIL10VHH#1配列をDR241(SEQ ID NO 170)と一定に保持しながらIL10VHH#2におけるバリエーションを含有させて調製した。
SEQ ID NO:489、490、300、491、492、493、494、302、494、303、495、496および497に対応するIL10R結合性分子に応答して誘導されたpSTAT3のレベルを、野生型ヒトIL10、C末端His6キレート化ペプチドを含み非刺激の野生型IL10を対照として使用してCD4+T細胞、CD8+T細胞および単球における活性について評価した。関与するアッセイのプロトコールおよび方法論は添付の図面の図5に提示される。これらの試験の結果は、添付の図面の図6に提供される。単独でのリンカー長さの効果を明らかにするために、図6のパネルの各々(パネルA、B、およびC)は、IL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbを一定に保持し、リンカーの長さのみを変更している条件を表す。2X、4Xなどの用語はリンカー中のアミノ酸の数を指し、リンカーの配列は表16に提供される。図6に提示されるデータにより示されるように、単独でのリンカー長さのバリエーション(図6の各々のパネルにおいて反映されるようにsdAbおよび他の構成要素を一定に維持する)は、所与の細胞型(例えばCD4+、CD8+、または単球)に関するIL10R結合性分子の活性のレベルをモジュレートするために使用され得るだけでなく、リンカー長さにおけるバリエーションは、別の細胞型に対する、1つの細胞型の活性のモジュレートを反映するために使用され得る。提供されるデータにより示されるように、IL10Ra sdAbとIL10Rb sdAbとの間の距離のバリエーション、一部の事例においてリンカー分子の異なる長さは、pSTAT3活性のレベルにより測定された場合の細胞におけるIL10活性のレベルのモジュレーションを提供することができる。
Fcコンジュゲート
本開示において議論されるように、一部の態様において、IL10R結合性分子は、図2、パネルBに示され、式#2:
H2N-(IL10 VHH#1)-(L1)a-(IL10 VHH#1)-(L2)b-(Fc単量体)c-COOH[#2]
により表されるようにFcドメインのサブユニットにコンジュゲートされてもよい。
本開示において議論されるように、一部の態様において、IL10R結合性分子は、図2、パネルBに示され、式#2:
H2N-(IL10 VHH#1)-(L1)a-(IL10 VHH#1)-(L2)b-(Fc単量体)c-COOH[#2]
により表されるようにFcドメインのサブユニットにコンジュゲートされてもよい。
各々の場合においてa=1、L1=G3S、b=1およびL2=Ala-Ser; c=1; ならびにFc単量体がSEQ ID NO:502のポリペプチドである式[#1]のIL10R結合性ポリペプチドの代表的なシリーズを、以下の表27にしたがってIL10VHH#1配列をDR241(SEQ ID NO 170)と一定に保持しながらIL10VHH#2におけるバリエーションを含有させて調製した:それらの構築において使用されるIL10RaおよびIL10Rb sdAbのこれらの特色および詳細は以下の表27に要約される。
CD4+、CD8+および単球における異なる濃度のこれらの分子の各々の活性に関するデータもまた図6に提供される。これらのFc融合物の各々は、同じ配向性で同じIL10RaおよびIL10Rb sdAbを有する非Fc融合分子と比較して含められたことが留意されるべきである。そのため、図6に提供されるデータはまた、Fcドメインの追加によるIL10R結合性分子のIL10活性に対する効果を評価するために使用されてもよい。提供されるデータから、Fc融合分子は、同じ配向性(フォワードまたはリバース)で同じIL10RaおよびIl10Rb sdAbを含有し、かつ同じリンカー(G3Sとして参照される4X als、表16を参照)リンカーを有する分子と比較され、Fc融合物は、非Fcバリアントと比べて同等の、一部の事例においては増強された活性を実証した。このデータは、本開示のIL10R結合性分子が、非Fc融合分子と同等の様々な細胞型におけるIL10活性レベルなしで、および該IL10活性レベルを提供して、インビボで延長された寿命を提供するためにFcドメインにコンジュゲートされてもよいことを実証する。
さらなる評価のためのIL10R結合性分子の構築
以上の実験に基づいて、DR521(SEQ ID NO:304)に基づくIL10R結合性分子バリアントの選択されたサブセットをさらなる評価のために選択した。これらの実験において使用された分子は、式[#1]により表すことができ、式中、各々の場合においてa=1、L1=G3S(SEQ ID NOr、b=1およびL2=Ala-Ser; CP=Hisx6、IL10 VHH#1はIL10Ra VHH DR241(SEQ ID NO 170)であり、IL10 VHH#2はIL10Rb VHH DR 246(SEQ ID NO:187)である。SEQ ID NO:170のポリペプチドは本明細書においてDR241とも称され、SEQ ID NO:187のポリペプチドは本明細書においてDR246とも称される。
以上の実験に基づいて、DR521(SEQ ID NO:304)に基づくIL10R結合性分子バリアントの選択されたサブセットをさらなる評価のために選択した。これらの実験において使用された分子は、式[#1]により表すことができ、式中、各々の場合においてa=1、L1=G3S(SEQ ID NOr、b=1およびL2=Ala-Ser; CP=Hisx6、IL10 VHH#1はIL10Ra VHH DR241(SEQ ID NO 170)であり、IL10 VHH#2はIL10Rb VHH DR 246(SEQ ID NO:187)である。SEQ ID NO:170のポリペプチドは本明細書においてDR241とも称され、SEQ ID NO:187のポリペプチドは本明細書においてDR246とも称される。
DR521(DR241-G3S-DR246-ASH6):
1つの態様において、評価のために調製された例示的なポリペプチドは、式[#1]のポリペプチドであって、各々の場合においてa=1、L1=G3S-Ser、b=1およびL2=Ala-Ser; CP=Hisx6、IL10 VHH#1はIL10Ra VHH DR241(SEQ ID NO 170)であり、IL10 VHH#2はIL10Rb VHH DR 246(SEQ ID NO:187)であり:a=1およびL1はG3Sリンカーであり; b=1およびL2は配列Ala-Serを有し; c=1であり、CPはヒスチジンポリペプチド六量体であるものであり、該ポリペプチドはアミノ酸配列:
を有する。
1つの態様において、評価のために調製された例示的なポリペプチドは、式[#1]のポリペプチドであって、各々の場合においてa=1、L1=G3S-Ser、b=1およびL2=Ala-Ser; CP=Hisx6、IL10 VHH#1はIL10Ra VHH DR241(SEQ ID NO 170)であり、IL10 VHH#2はIL10Rb VHH DR 246(SEQ ID NO:187)であり:a=1およびL1はG3Sリンカーであり; b=1およびL2は配列Ala-Serを有し; c=1であり、CPはヒスチジンポリペプチド六量体であるものであり、該ポリペプチドはアミノ酸配列:
を有する。
SEQ ID NO:302のポリペプチドは本明細書においてDR521とも称される。
DR838(Q1E N29Q DR521):
アミノ酸置換1QEおよびN29Qを組み込んだDR521(SEQ ID NO:302)SEQ ID NO:302のポリペプチドバリアントが調製され、これはアミノ酸配列:
を有する。
アミノ酸置換1QEおよびN29Qを組み込んだDR521(SEQ ID NO:302)SEQ ID NO:302のポリペプチドバリアントが調製され、これはアミノ酸配列:
を有する。
SEQ ID NO:486のポリペプチドは本明細書においてDR838とも称される。
他の箇所に議論されるように、アルデヒド化学によるPEG化を複雑にするN末端におけるピログルタメート形成を回避するために、DR838(SEQ ID NO:486)の調製においてQ1Eアミノ酸置換を組み込んでN末端PEG化を促した。追加的に、DR521(SEQ ID NO:302)のCDRの配列の検査は、Asn29-Cys30-Ser30における配列中のN結合型グリコシル化モチーフN-X-Sの存在を指し示す。N結合型グリコシル化モチーフの配列を改変してグリコシル化を予防することによりそのようなN結合型グリコシル化モチーフを排除する。DR521(SEQ ID NO:302)のDR838(SEQ ID NO:486)誘導体の調製において、このN結合型グリコシル化モチーフを、N29Q置換として参照されるDR521の29位におけるアスパラギンのグルタミン残基での置換により排除した。
DR839 Q1E N29D DR521-Ala-Ser-HIS6
Q1EおよびN29Dアミノ酸置換を有するSEQ ID NO:302の追加のポリペプチドバリアントを調製したが、これはアミノ酸配列:
を有する。
Q1EおよびN29Dアミノ酸置換を有するSEQ ID NO:302の追加のポリペプチドバリアントを調製したが、これはアミノ酸配列:
を有する。
SEQ ID NO:487のポリペプチドは本明細書においてDR839とも称される。
DR841(Q1E S31A DR521)
Q1EおよびS31Aアミノ酸置換(DR521のAsn29-Cys30-Ser30 N結合型グリコシル化モチーフを排除するため)を有するSEQ ID NO:302の追加のポリペプチドバリアントを調製したが、これはアミノ酸配列:
を有する。
Q1EおよびS31Aアミノ酸置換(DR521のAsn29-Cys30-Ser30 N結合型グリコシル化モチーフを排除するため)を有するSEQ ID NO:302の追加のポリペプチドバリアントを調製したが、これはアミノ酸配列:
を有する。
SEQ ID NO:488のポリペプチドは本明細書においてDR841とも称される。
sdAbのヒト化
以前に議論したように、本開示のIL10R結合性分子の調製において有用であるIL10RaおよびIL10Rb VHH sdAbはヒト化されてもよい。IL10R結合性分子のVHH構成要素のヒト化バージョンの有用性を実証するために、DR241およびDR246のヒト化バージョンを調製し、それぞれIL10RaおよびIL10RbのECDへの結合について表面プラズモン共鳴分光法(Biacore(登録商標))により評価した。
以前に議論したように、本開示のIL10R結合性分子の調製において有用であるIL10RaおよびIL10Rb VHH sdAbはヒト化されてもよい。IL10R結合性分子のVHH構成要素のヒト化バージョンの有用性を実証するために、DR241およびDR246のヒト化バージョンを調製し、それぞれIL10RaおよびIL10RbのECDへの結合について表面プラズモン共鳴分光法(Biacore(登録商標))により評価した。
標的に関してVHHをヒト化する場合、ヒト化されたVHHの設計のための考慮は、その改変がタンパク質の二次および三次構造における実質的な改変を導入し得るアミノ酸残基を示唆する非ヒトフレームワークの各々の位置におけるアミノ酸の分布である。カノニカルなラマVHH配列VH3-66(INSERT REF/SEQ)のある特定のフレームワーク残基は、位置V37、G44、L45およびW47を含み、ならびにベルニエ(vernier)ゾーン残基R94およびW103もまた、容易に改変し難い残基であり得ることを文献は示唆する。高度に保存されたラクダVHHフレームワーク領域のアミノ酸を同定するために、約1023個のVHH sdAb配列を得、「R Script」で各々の位置におけるアミノ酸の分布を評価した。アミノ酸分布チャートを使用して各々の位置における希少な残基を同定した。ラクダVHHフレームワーク領域のある特定の残基は高度に保存されていることが決定された。
この情報に基づいて、最良適合ヒト生殖系列配列VH3-を同定した。DR241の配列アライメントは、最良適合ヒト生殖系列配列VH3-23に対する72%の同一性を示唆する。IL10Ra VHH DR241のヒト化バージョン(表19を参照)。ヒト化されたDR241構築物はヒトに対して88%の同一性を示す。IL10Rb VHH DR246のヒト化バージョン(表19)もまた調製した。DR241の配列アライメントは、DR246は最良適合ヒト生殖系列VH3-23に対して73%の同一性を有することを示唆する。ヒト化されたDR246(DR1228)構築物はヒトに対して89%の同一性を示す。
以下の表19は、本開示のヒト化されたIL10R結合性分子の例を提供する。
以上のヒト化されたsdAbをコードする核酸配列は表30に提供される。
一部の態様において、本発明は、表19のIL10RaおよびIL10Rb sdAbのいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有するsdAbを提供する。一部の態様において、本発明は、表19のsdAbのいずれか1つと実質的に同一性を有するsdAbを提供する。一部の態様において、本発明は、表19のsdAbのいずれか1つと同一性を有するsdAbを提供する。
以下の実験のシリーズにおいて、上記の参照されるポリペプチドを、アミノ酸配列のIgHシグナルペプチドをコードする5'核酸配列を組み込んだDR521およびDR838をコードする合成核酸配列を含むベクターでの宿主細胞のトランスフェクションにより組換えにより発現させた。
DR1223、DR1224; DR1225、DR1226; DR1227; DR1228; DR1229およびDR1230をコードする合成核酸配列は表31に提供され、これはさらにN末端シグナルペプチドおよびカルボキシ末端IgG4ヒンジ(SEQ ID NO:485)を含み、単量体Fcドメイン(SEQ ID NO:504)を調製し、pExSynにおいてクローニングし、expi293細胞にトランスフェクトした。実施例においてより詳細に提供されるように、分子をそれらのそれぞれの標的(IL10RaまたはIL10Rb)への結合についてSPR(Biacore)により評価した。細胞培養物からの上清をそれぞれIL10RaおよびIL10RbのECDへの結合について評価した。簡潔に述べれば、Fcをコンジュゲートされたヒト化VHHをプロテインAチップに固定化し、それぞれのIL10受容体サブユニットのECDを移動相中で流した。この研究の結果は、ヒト化されたVHH配列はそれらのそれぞれの標的への結合を有効に保持することを指し示した。以上のヒト化されたIL10RaおよびIL10Rb VHHは、本開示のヒト化された二量体IL10R結合性分子の構築において使用され得る。
ヒト化されたIL10R結合性分子:
本開示は、ヒト化されたIL10Raおよび/またはIL10Rb sdAbを含むIL10R結合性分子をさらに提供する。「ヒト化されたIL10R結合性分子」という用語は、ヒト化されたIL10Raおよび/またはIL10Rb sdAbを含むIL10R結合性分子を指す。
本開示は、ヒト化されたIL10Raおよび/またはIL10Rb sdAbを含むIL10R結合性分子をさらに提供する。「ヒト化されたIL10R結合性分子」という用語は、ヒト化されたIL10Raおよび/またはIL10Rb sdAbを含むIL10R結合性分子を指す。
以下の表29は、IL10RaおよびIL10Rb sdAbを含むヒト化されたIL10R結合性分子のアミノ酸配列を提供し、CDRを下線で指し示している。
一部の態様において、本発明は、表29のIL10R結合性分子のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有するIL10R結合性分子を提供する。一部の態様において、本発明は、表29のIL10R結合性分子のいずれか1つと実質的に同一のIL10R結合性分子を提供する。一部の態様において、本発明は、表29のIL10R結合性分子のいずれか1つの配列と同一のIL10R結合性分子を提供する。
結合性分子およびsdAb構成要素への修飾
キレート化ペプチド
1つの態様において、本開示は、キレート化ペプチドとして公知の1つまたは複数の遷移金属キレート化ポリペプチド配列を含むIL10Rb1結合性分子を提供する。キレート化ペプチドは、式:
(His)a-(AA)b-(His)c
(式中、「His」はアミノ酸ヒスチジンであり; 「AA」はプロリン以外のアミノ酸であり; はヒスチジン残基であり; a=0~10の整数; b=0~4の整数; c=0~10の整数)のポリペプチド、ならびにそのランダム、ブロックおよび交互コポリマーである。一部の態様において、キレート化ペプチドは、SEQ ID NO:507~521からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。そのような遷移金属キレート化ドメインの組込みは、1986年2月11日に発行されたSmith,et al.、米国特許第4,569,794号明細書に記載されている固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(immobilized metal affinity chromatography; IMAC)での精製を促す。本開示のIL12RB1結合性分子の実施において有用な遷移金属キレート化ポリペプチドの例は、上掲のSmith,et al.および1995年5月10日に発行されたDobeli,et al.、米国特許第5,320,663号明細書(これらの教示全体は参照により本明細書に組み入れられる)に記載されている。本開示のIL12RB1結合性分子の実施において有用な特定の遷移金属キレート化ポリペプチドは、3~6個の連続するヒスチジン残基を含むポリペプチド、例えば6-ヒスチジン(His)6ペプチドであり、当技術分野において「Hisタグ」として頻繁に参照される。組換えタンパク質のための精製「ハンドル」を提供することに加えて、またはSPRセンサーチップ上の固定化を促すために、キレート化ペプチドへのhIL12RB1結合性分子のそのようなコンジュゲーションは、Anderson,et al.(1995年8月8日に発行された米国特許第5,439,829号明細書)およびHale,J.E(1996)Analytical Biochemistry 231(1):46-49の教示に実質的にしたがって動態的に不活性のまたは動態的に不安定な複合体としての遷移金属イオンのIL12RB1発現細胞へのターゲティングされた送達を促す。「動態的に不活性の複合体」に関して、「不活性の」という用語は、その配位圏中の1つまたは複数の配位子の他のものによる置換を結果としてもたらす反応に関与する特定の錯体化イオンの能力に繋がる不安定性の程度を指す。水性環境中で、遷移金属の占有されていない配位位置は水分子により占有される。これらの水分子は、[遷移金属:キレート化ペプチド]複合体を形成するためにキレート化ペプチドまたは有機キレート剤により置換されなければならない。そのような反応が急速に起こる場合、反応は「不安定」(labile)と称される。しかしながら、そのような反応が非常に緩徐に起こる場合、複合体は動態的に「不活性」といわれる。動態的な不安定性または不活発性は、反応速度に関連し、熱力学的な安定性または不安定性と混同されるべきではない。CottonおよびWilkinsonはこの区別を説明している。
キレート化ペプチド
1つの態様において、本開示は、キレート化ペプチドとして公知の1つまたは複数の遷移金属キレート化ポリペプチド配列を含むIL10Rb1結合性分子を提供する。キレート化ペプチドは、式:
(His)a-(AA)b-(His)c
(式中、「His」はアミノ酸ヒスチジンであり; 「AA」はプロリン以外のアミノ酸であり; はヒスチジン残基であり; a=0~10の整数; b=0~4の整数; c=0~10の整数)のポリペプチド、ならびにそのランダム、ブロックおよび交互コポリマーである。一部の態様において、キレート化ペプチドは、SEQ ID NO:507~521からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。そのような遷移金属キレート化ドメインの組込みは、1986年2月11日に発行されたSmith,et al.、米国特許第4,569,794号明細書に記載されている固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(immobilized metal affinity chromatography; IMAC)での精製を促す。本開示のIL12RB1結合性分子の実施において有用な遷移金属キレート化ポリペプチドの例は、上掲のSmith,et al.および1995年5月10日に発行されたDobeli,et al.、米国特許第5,320,663号明細書(これらの教示全体は参照により本明細書に組み入れられる)に記載されている。本開示のIL12RB1結合性分子の実施において有用な特定の遷移金属キレート化ポリペプチドは、3~6個の連続するヒスチジン残基を含むポリペプチド、例えば6-ヒスチジン(His)6ペプチドであり、当技術分野において「Hisタグ」として頻繁に参照される。組換えタンパク質のための精製「ハンドル」を提供することに加えて、またはSPRセンサーチップ上の固定化を促すために、キレート化ペプチドへのhIL12RB1結合性分子のそのようなコンジュゲーションは、Anderson,et al.(1995年8月8日に発行された米国特許第5,439,829号明細書)およびHale,J.E(1996)Analytical Biochemistry 231(1):46-49の教示に実質的にしたがって動態的に不活性のまたは動態的に不安定な複合体としての遷移金属イオンのIL12RB1発現細胞へのターゲティングされた送達を促す。「動態的に不活性の複合体」に関して、「不活性の」という用語は、その配位圏中の1つまたは複数の配位子の他のものによる置換を結果としてもたらす反応に関与する特定の錯体化イオンの能力に繋がる不安定性の程度を指す。水性環境中で、遷移金属の占有されていない配位位置は水分子により占有される。これらの水分子は、[遷移金属:キレート化ペプチド]複合体を形成するためにキレート化ペプチドまたは有機キレート剤により置換されなければならない。そのような反応が急速に起こる場合、反応は「不安定」(labile)と称される。しかしながら、そのような反応が非常に緩徐に起こる場合、複合体は動態的に「不活性」といわれる。動態的な不安定性または不活発性は、反応速度に関連し、熱力学的な安定性または不安定性と混同されるべきではない。CottonおよびWilkinsonはこの区別を説明している。
この[不安定対安定]の区別の単純な例は[Co(NH3)6]3+イオンにより提供され、該イオンは酸性培地中で数日持続し、これは、それが熱力学的に不安定であるという事実にもかかわらず動的な不活発性または不安定性の欠如のためであり、これは以下の平衡定数:
[Co(NH3)6]3++6H3O+=[Co(H2O)6]3++6NH4 + K=1025
に示される。
対照的に、[Ni(CN)4]2-の安定性は極めて高く:
[Ni(CN)4]2-=Ni2++4CN- K=10-22
しかし、溶液に加えられた同位体標識されたシアン化物イオンでのCN-イオンの交換の速度は、普通の技術によっては測定不可能なほどに迅速である。
Advanced Inorganic Chemistry,Cotton,F.A.and Wilkinson,G.(1972)3rd ed.Interscience Publishers,p.652。一部の態様において、遷移金属イオンは、レポーター分子、例えば蛍光化合物または放射活性剤、例えば放射線学的イメージングまたは治療剤である。
[Co(NH3)6]3++6H3O+=[Co(H2O)6]3++6NH4 + K=1025
に示される。
対照的に、[Ni(CN)4]2-の安定性は極めて高く:
[Ni(CN)4]2-=Ni2++4CN- K=10-22
しかし、溶液に加えられた同位体標識されたシアン化物イオンでのCN-イオンの交換の速度は、普通の技術によっては測定不可能なほどに迅速である。
Advanced Inorganic Chemistry,Cotton,F.A.and Wilkinson,G.(1972)3rd ed.Interscience Publishers,p.652。一部の態様において、遷移金属イオンは、レポーター分子、例えば蛍光化合物または放射活性剤、例えば放射線学的イメージングまたは治療剤である。
一部の態様において、キレート化ペプチドは、表21に提供されるキレート化ペプチドである。
N結合型グリコシル化部位の排除
一部の態様において、IL10RaまたはIL10Rb sdAbのアミノ酸配列(特にはCDR配列)は、グリコシル化モチーフ、特には配列Asn-X-Ser(N-X-S)またはAsn-X-Thr(N-X-T)(ここで、Xはプロリンを除く任意のアミノ酸である)のN結合型グリコシル化モチーフを含有し得ることが可能である。そのような事例において、N結合型グリコシル化モチーフの配列を改変してグリコシル化を予防することによりそのようなN結合型グリコシル化モチーフを排除することが望ましい。一部の態様において、Asn-X-Ser(N-X-S)N結合型グリコシル化モチーフの排除は、Asn-X-Ser(N-X-S)N結合型グリコシル化モチーフのAsn(N)残基および/またはSer(S)残基の保存的アミノ酸置換の組込みにより達成されてもよい。一部の態様において、Asn-X-Thr(N-X-T)N結合型グリコシル化モチーフの排除は、Asn-X-Thr(N-X-T)N結合型グリコシル化モチーフのAsn(N)残基および/またはThr(T)残基の保存的アミノ酸置換の組込みにより達成されてもよい。一部の態様において、グリコシル化部位の排除は、IL10RaまたはIL10Rb sdAbを含むIL10R結合性分子が原核宿主細胞において発現される場合に要求されない。原核細胞は組換えタンパク質のグリコシル化のための機構を提供しないので、IL10Ra or IL10Rb sdAbを含む組換えIL10R結合性分子を製造するために原核発現系を用いる場合、N結合型グリコシル化部位を排除するための配列の改変は不必要となり得る。
一部の態様において、IL10RaまたはIL10Rb sdAbのアミノ酸配列(特にはCDR配列)は、グリコシル化モチーフ、特には配列Asn-X-Ser(N-X-S)またはAsn-X-Thr(N-X-T)(ここで、Xはプロリンを除く任意のアミノ酸である)のN結合型グリコシル化モチーフを含有し得ることが可能である。そのような事例において、N結合型グリコシル化モチーフの配列を改変してグリコシル化を予防することによりそのようなN結合型グリコシル化モチーフを排除することが望ましい。一部の態様において、Asn-X-Ser(N-X-S)N結合型グリコシル化モチーフの排除は、Asn-X-Ser(N-X-S)N結合型グリコシル化モチーフのAsn(N)残基および/またはSer(S)残基の保存的アミノ酸置換の組込みにより達成されてもよい。一部の態様において、Asn-X-Thr(N-X-T)N結合型グリコシル化モチーフの排除は、Asn-X-Thr(N-X-T)N結合型グリコシル化モチーフのAsn(N)残基および/またはThr(T)残基の保存的アミノ酸置換の組込みにより達成されてもよい。一部の態様において、グリコシル化部位の排除は、IL10RaまたはIL10Rb sdAbを含むIL10R結合性分子が原核宿主細胞において発現される場合に要求されない。原核細胞は組換えタンパク質のグリコシル化のための機構を提供しないので、IL10Ra or IL10Rb sdAbを含む組換えIL10R結合性分子を製造するために原核発現系を用いる場合、N結合型グリコシル化部位を排除するための配列の改変は不必要となり得る。
作用の持続期間を増加させるためのキャリア分子との会合
本明細書に記載されるIL10R結合性分子は、インビボでの延長された寿命および/または対象における作用の延長された持続期間を提供するために修飾され得る。一部の態様において、結合性分子は、所望される薬理学的特性、例えば延長された半減期を提供するためにキャリア分子にコンジュゲートされ得る。一部の態様において、結合性分子は、当技術分野において公知のように、例えば、ペグ化、およびグリコシル化などにより、その半減期を延長させるためにIgGのFcドメイン、アルブミン、または他の分子に共有結合的に連結され得る。一部の態様において、哺乳動物対象において作用の延長された持続期間を提供するために修飾されたIL10R結合性分子は、4時間より長い、代替的に5時間より長い、代替的に6時間より長い、代替的に7時間より長い、代替的に8時間より長い、代替的に9時間より長い、代替的に10時間より長い、代替的に12時間より長い、代替的に18時間より長い、代替的に24時間より長い、代替的に2日より長い、代替的に3日より長い、代替的に4日より長い、代替的に5日より長い、代替的に6日より長い、代替的に7日より長い、代替的に10日より長い、代替的に14日より長い、代替的に21日より長い、または代替的に30日より長い哺乳動物における半減期を有する。
本明細書に記載されるIL10R結合性分子は、インビボでの延長された寿命および/または対象における作用の延長された持続期間を提供するために修飾され得る。一部の態様において、結合性分子は、所望される薬理学的特性、例えば延長された半減期を提供するためにキャリア分子にコンジュゲートされ得る。一部の態様において、結合性分子は、当技術分野において公知のように、例えば、ペグ化、およびグリコシル化などにより、その半減期を延長させるためにIgGのFcドメイン、アルブミン、または他の分子に共有結合的に連結され得る。一部の態様において、哺乳動物対象において作用の延長された持続期間を提供するために修飾されたIL10R結合性分子は、4時間より長い、代替的に5時間より長い、代替的に6時間より長い、代替的に7時間より長い、代替的に8時間より長い、代替的に9時間より長い、代替的に10時間より長い、代替的に12時間より長い、代替的に18時間より長い、代替的に24時間より長い、代替的に2日より長い、代替的に3日より長い、代替的に4日より長い、代替的に5日より長い、代替的に6日より長い、代替的に7日より長い、代替的に10日より長い、代替的に14日より長い、代替的に21日より長い、または代替的に30日より長い哺乳動物における半減期を有する。
哺乳動物対象において作用の延長された持続期間を提供するためのIL10R結合性分子の修飾は、
・1つまたは複数のキャリア分子へのIL10R結合性分子のコンジュゲーション、
・任意で追加のポリペプチド配列との融合タンパク質の形態(例えば、IL10R結合性分子-Fc融合物)の、タンパク質キャリア分子へのIL10R結合性分子のコンジュゲーション、および
・ポリマー(例えばPEG化されたIL10R結合性分子を提供するための水溶性ポリマー)へのコンジュゲーション
を含む(但しこれらに限定されない)。
・1つまたは複数のキャリア分子へのIL10R結合性分子のコンジュゲーション、
・任意で追加のポリペプチド配列との融合タンパク質の形態(例えば、IL10R結合性分子-Fc融合物)の、タンパク質キャリア分子へのIL10R結合性分子のコンジュゲーション、および
・ポリマー(例えばPEG化されたIL10R結合性分子を提供するための水溶性ポリマー)へのコンジュゲーション
を含む(但しこれらに限定されない)。
哺乳動物対象において作用の延長された持続期間を提供する1つより多くの種類の修飾が所与のIL10R結合性分子に関して用いられてもよいことが留意されるべきである。例えば、本開示のIL10R結合性分子は、作用の延長された持続期間を提供するアミノ酸置換の他に、キャリア分子、例えばポリエチレングリコール(PEG)分子へのコンジュゲーションの両方を含んでもよい。
タンパク質キャリア分子:
インビボでの作用の延長された持続期間を提供するためにIL10R結合性分子に共有結合的に取り付けられ得るタンパク質キャリア分子の例は、アルブミン、抗体および抗体断片、例えばIgG分子のFcドメインを含むが、これらに限定されない。
インビボでの作用の延長された持続期間を提供するためにIL10R結合性分子に共有結合的に取り付けられ得るタンパク質キャリア分子の例は、アルブミン、抗体および抗体断片、例えばIgG分子のFcドメインを含むが、これらに限定されない。
Fc融合物:
一部の態様において、IL10R結合性分子は、Fc融合キメラポリペプチド分子の機能的ドメインにコンジュゲートされる。Fc融合コンジュゲートは、バイオ医薬品の全身半減期を増加させることが示されており、そのためバイオ医薬品製造物はより低い頻度の投与を要求し得る。Fcは、血管を裏打ちする内皮細胞における新生児Fc受容体(FcRn)に結合し、結合すると、Fc融合分子は分解から保護され、循環中に再放出され、分子を循環中により長く保つ。このFc結合は、内因性IgGがその長い血漿中半減期を保持する機序であると考えられている。より最近のFc融合技術は、バイオ医薬品の単一のコピーを抗体のFc領域に連結して、伝統的なFc融合コンジュゲートと比較してバイオ医薬品の薬物動態的および薬力学的特性を最適化する。Fc融合物の調製において有用な「Fc領域」は、天然に存在するポリペプチドまたはパパインでのIgGの消化により製造されるIgG C末端ドメインに相同的な合成ポリペプチドであることができる。IgG Fcは約50kDaの分子量を有する。本明細書に記載される結合性分子は、Fc領域全体、または元となるキメラポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持するより小さい部分にコンジュゲートされ得る。追加的に、全長または断片化されたFc領域は野生型分子のバリアントであることができる。典型的な状況において、二量体Fcの各々の単量体は異種ポリペプチドを有することができ、異種ポリペプチドは同じまたは異なるものであり得る。
一部の態様において、IL10R結合性分子は、Fc融合キメラポリペプチド分子の機能的ドメインにコンジュゲートされる。Fc融合コンジュゲートは、バイオ医薬品の全身半減期を増加させることが示されており、そのためバイオ医薬品製造物はより低い頻度の投与を要求し得る。Fcは、血管を裏打ちする内皮細胞における新生児Fc受容体(FcRn)に結合し、結合すると、Fc融合分子は分解から保護され、循環中に再放出され、分子を循環中により長く保つ。このFc結合は、内因性IgGがその長い血漿中半減期を保持する機序であると考えられている。より最近のFc融合技術は、バイオ医薬品の単一のコピーを抗体のFc領域に連結して、伝統的なFc融合コンジュゲートと比較してバイオ医薬品の薬物動態的および薬力学的特性を最適化する。Fc融合物の調製において有用な「Fc領域」は、天然に存在するポリペプチドまたはパパインでのIgGの消化により製造されるIgG C末端ドメインに相同的な合成ポリペプチドであることができる。IgG Fcは約50kDaの分子量を有する。本明細書に記載される結合性分子は、Fc領域全体、または元となるキメラポリペプチドの循環半減期を延長する能力を保持するより小さい部分にコンジュゲートされ得る。追加的に、全長または断片化されたFc領域は野生型分子のバリアントであることができる。典型的な状況において、二量体Fcの各々の単量体は異種ポリペプチドを有することができ、異種ポリペプチドは同じまたは異なるものであり得る。
本開示のIL10R結合性分子のために有用なFcフォーマットの実例的な例は、添付の図面の図1~4に模式的に提供される。
Fc単量体への結合性分子の連結
指し示されるように、FcサブユニットへのIL10R結合性分子の連結は、IL10R結合性分子とFcサブユニットとの間に以下に記載されているリンカー分子を組み込んでもよい。一部の態様において、IL10R結合性分子は、IgG抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列を組み込んだFcドメインとの融合タンパク質として発現される。以上にしたがって操作されたFcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4哺乳動物IgG種に由来してもよい。一部の態様において、Fcドメインは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4 IgG種に由来してもよい。一部の態様において、ヒンジ領域はIgG1のヒンジ領域である。1つの特定の態様において、IL10R結合性分子は、ヒトIgG1ヒンジドメインを使用してFcドメインに連結される。
指し示されるように、FcサブユニットへのIL10R結合性分子の連結は、IL10R結合性分子とFcサブユニットとの間に以下に記載されているリンカー分子を組み込んでもよい。一部の態様において、IL10R結合性分子は、IgG抗体のヒンジ領域のアミノ酸配列を組み込んだFcドメインとの融合タンパク質として発現される。以上にしたがって操作されたFcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4哺乳動物IgG種に由来してもよい。一部の態様において、Fcドメインは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4 IgG種に由来してもよい。一部の態様において、ヒンジ領域はIgG1のヒンジ領域である。1つの特定の態様において、IL10R結合性分子は、ヒトIgG1ヒンジドメインを使用してFcドメインに連結される。
ノブ-イントゥー-ホールFcフォーマット
一部の態様において、二量体Fc分子は、「ノブ-イントゥー-ホール改変」を有するように操作されてもよい。
一部の態様において、二量体Fc分子は、「ノブ-イントゥー-ホール改変」を有するように操作されてもよい。
アルブミンキャリア分子
一部の態様において、コンジュゲートされるIL10R結合性分子は、インビボで延長された曝露を促すことが当技術分野において公知のアルブミン分子(例えば、ヒト血清アルブミン)である。本発明の1つの態様において、IL10R結合性分子は、化学的連結を介してアルブミンにコンジュゲートされるか、またはIL10R結合性分子アルブミン融合物として本明細書において参照されるアルブミン分子との融合タンパク質として発現される。「アルブミン」という用語は、αβhIL2ムテインアルブミン融合物の文脈において使用される場合、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン(HSA)、カニクイザル血清アルブミン、およびウシ血清アルブミン(BSA)を含む。一部の態様において、HSA HSAは、野生型HSA配列と比べてC34SまたはK573Pアミノ酸置換を含む。本開示によれば、アルブミンは、カルボキシル末端、アミノ末端、カルボキシル末端およびアミノ末端の両方、ならびに内部においてIL10R結合性分子にコンジュゲートされ得る(例えば、US 5,876,969およびUS 7,056,701を参照)。本開示により想定されるHAS IL10R結合性分子において、様々な形態のアルブミン、例えばアルブミン分泌プレ配列およびそのバリアント、断片およびそのバリアント、ならびにHSAバリアントが使用され得る。そのような形態は、1つまたは複数の所望されるアルブミン活性を一般に有する。追加の態様において、本開示は、アルブミン、アルブミン断片、およびアルブミンバリアントなどに直接的または間接的に融合されたIL10R結合性分子を含む融合タンパク質を伴い、融合タンパク質は融合されていない薬物分子よりも高い血漿安定性を有し、および/または融合タンパク質は融合されていない薬物分子の治療活性を保持する。IL10R結合性分子とアルブミン分子との間の化学的連結の代替として、IL10R結合性分子-アルブミン複合体は、任意でアルブミンとIL10R結合性分子との間にリンカー分子を含む、宿主細胞中で単一のポリペプチド鎖として組換えにより発現されるアルブミンポリペプチド配列およびIL10R結合性分子を含む融合タンパク質として提供されてもよい。そのような融合タンパク質は、組換え技術を通じて当業者にとって容易に調製され得る。そのような融合タンパク質をコードする核酸配列は、様々な商用の供給元のいずれかに注文されてもよい。融合タンパク質をコードする核酸配列は、1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結された発現ベクターに組み込まれ、ベクターは好適な宿主細胞に導入され、融合タンパク質は、当技術分野において周知の技術により宿主細胞培養物から単離される。
一部の態様において、コンジュゲートされるIL10R結合性分子は、インビボで延長された曝露を促すことが当技術分野において公知のアルブミン分子(例えば、ヒト血清アルブミン)である。本発明の1つの態様において、IL10R結合性分子は、化学的連結を介してアルブミンにコンジュゲートされるか、またはIL10R結合性分子アルブミン融合物として本明細書において参照されるアルブミン分子との融合タンパク質として発現される。「アルブミン」という用語は、αβhIL2ムテインアルブミン融合物の文脈において使用される場合、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン(HSA)、カニクイザル血清アルブミン、およびウシ血清アルブミン(BSA)を含む。一部の態様において、HSA HSAは、野生型HSA配列と比べてC34SまたはK573Pアミノ酸置換を含む。本開示によれば、アルブミンは、カルボキシル末端、アミノ末端、カルボキシル末端およびアミノ末端の両方、ならびに内部においてIL10R結合性分子にコンジュゲートされ得る(例えば、US 5,876,969およびUS 7,056,701を参照)。本開示により想定されるHAS IL10R結合性分子において、様々な形態のアルブミン、例えばアルブミン分泌プレ配列およびそのバリアント、断片およびそのバリアント、ならびにHSAバリアントが使用され得る。そのような形態は、1つまたは複数の所望されるアルブミン活性を一般に有する。追加の態様において、本開示は、アルブミン、アルブミン断片、およびアルブミンバリアントなどに直接的または間接的に融合されたIL10R結合性分子を含む融合タンパク質を伴い、融合タンパク質は融合されていない薬物分子よりも高い血漿安定性を有し、および/または融合タンパク質は融合されていない薬物分子の治療活性を保持する。IL10R結合性分子とアルブミン分子との間の化学的連結の代替として、IL10R結合性分子-アルブミン複合体は、任意でアルブミンとIL10R結合性分子との間にリンカー分子を含む、宿主細胞中で単一のポリペプチド鎖として組換えにより発現されるアルブミンポリペプチド配列およびIL10R結合性分子を含む融合タンパク質として提供されてもよい。そのような融合タンパク質は、組換え技術を通じて当業者にとって容易に調製され得る。そのような融合タンパク質をコードする核酸配列は、様々な商用の供給元のいずれかに注文されてもよい。融合タンパク質をコードする核酸配列は、1つまたは複数の発現制御エレメントに機能的に連結された発現ベクターに組み込まれ、ベクターは好適な宿主細胞に導入され、融合タンパク質は、当技術分野において周知の技術により宿主細胞培養物から単離される。
ポリマーキャリア
一部の態様において、IL10R結合性分子の作用の延長されたインビボ持続期間は、1つまたは複数のポリマーキャリア分子、例えばXTENポリマーまたは水溶性ポリマーへのコンジュゲーションにより達成されてもよい。
一部の態様において、IL10R結合性分子の作用の延長されたインビボ持続期間は、1つまたは複数のポリマーキャリア分子、例えばXTENポリマーまたは水溶性ポリマーへのコンジュゲーションにより達成されてもよい。
XTENコンジュゲート
IL10R結合性分子はXTENポリマーをさらに含んでもよい。XTENポリマーは、αβhIL2ムテインに(化学的にまたは融合タンパク質として)コンジュゲートされてPEG化と類似の延長された持続期間を提供してもよく、また大腸菌(E.coli)中で組換え融合タンパク質として製造されてもよい。本開示のIL10R結合性分子と組み合わせた使用のために好適なXTENポリマーは、Podust,et al.(2016)“Extension of in vivo half-life of biologically active molecules by XTEN protein polymers”,J Controlled Release 240:52-66およびHaeckel et al.(2016)“XTEN as Biological Alternative to PEGylation Allows Complete Expression of a Protease-Activatable Killin-Based Cytostatic”PLOS ONE|DOI:10.1371/journal.pone.0157193 June 13,2016において提供されている。XTENポリマーは、XTENポリペプチドとhIL2ムテインとの間にプロテアーゼ感受性切断部位、例えばMMP-2切断部位を組み込んでいてもよい融合タンパク質であってもよい。
IL10R結合性分子はXTENポリマーをさらに含んでもよい。XTENポリマーは、αβhIL2ムテインに(化学的にまたは融合タンパク質として)コンジュゲートされてPEG化と類似の延長された持続期間を提供してもよく、また大腸菌(E.coli)中で組換え融合タンパク質として製造されてもよい。本開示のIL10R結合性分子と組み合わせた使用のために好適なXTENポリマーは、Podust,et al.(2016)“Extension of in vivo half-life of biologically active molecules by XTEN protein polymers”,J Controlled Release 240:52-66およびHaeckel et al.(2016)“XTEN as Biological Alternative to PEGylation Allows Complete Expression of a Protease-Activatable Killin-Based Cytostatic”PLOS ONE|DOI:10.1371/journal.pone.0157193 June 13,2016において提供されている。XTENポリマーは、XTENポリペプチドとhIL2ムテインとの間にプロテアーゼ感受性切断部位、例えばMMP-2切断部位を組み込んでいてもよい融合タンパク質であってもよい。
水溶性ポリマー
一部の態様において、IL10R結合性分子は、1つまたは複数の水溶性ポリマーにコンジュゲートされ得る。本開示の実施において有用な水溶性ポリマーの例は、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ-プロピレングリコール(PPG)、多糖(ポリビニルピロリドン、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリオレフィン系アルコール)、多糖)、ポリ-アルファ-ヒドロキシ酸)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン(POZ)、ポリ(N-アクリロイルモルホリン)、またはこれらの組合せを含む。
一部の態様において、IL10R結合性分子は、1つまたは複数の水溶性ポリマーにコンジュゲートされ得る。本開示の実施において有用な水溶性ポリマーの例は、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ-プロピレングリコール(PPG)、多糖(ポリビニルピロリドン、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、ポリオレフィン系アルコール)、多糖)、ポリ-アルファ-ヒドロキシ酸)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン(POZ)、ポリ(N-アクリロイルモルホリン)、またはこれらの組合せを含む。
一部の態様において、IL10R結合性分子は、1つまたは複数のポリエチレングリコール分子にコンジュゲートされ得るか、または「PEG化」され得る。結合性分子へのPEG取付けの方法または部位は様々であり得るが、ある特定の態様においてPEG化は、結合性分子の活性を変更しないか、または最小にのみ変更する。
ポリペプチド配列へのコンジュゲーションのために好適なPEGは、一般に、室温で水に可溶性であり、一般式
R(O-CH2-CH2)nO-R
を有し、式中、Rは、水素または保護基、例えばアルキルもしくはアルカノール基であり、nは1~1000の整数である。Rが保護基である場合、それは一般に1~8個の炭素を有する。PEGは直鎖状または分岐鎖状であることができる。分岐鎖状PEG誘導体、「star-PEG」およびマルチアームPEGは本開示により想定される。
R(O-CH2-CH2)nO-R
を有し、式中、Rは、水素または保護基、例えばアルキルもしくはアルカノール基であり、nは1~1000の整数である。Rが保護基である場合、それは一般に1~8個の炭素を有する。PEGは直鎖状または分岐鎖状であることができる。分岐鎖状PEG誘導体、「star-PEG」およびマルチアームPEGは本開示により想定される。
いくつかの例では、表9および10に提供される本開示のIL10R結合性分子の配列は、N末端グルタミン(「1Q」)残基を保有する。N末端グルタミン残基は、生理学的条件でまたはその近傍で、自発的に環化してピログルタミン酸(pE)を形成することが観察されている。(例えば、Liu, et al (2011) J. Biol. Chem. 286(13):11211-11217を参照のこと)。いくつかの態様において、ピログルタミン酸の形成は、特にアルデヒド化学がN末端PEG化のために用いられる場合、N末端PEGコンジュゲーションを複雑化させる。その結果、本開示のIL10R結合性分子をPEG化する場合、特にアルデヒド化学が利用される場合、1位にアミノ酸(例えば、1Q)を保有するIL10R結合性分子は、1位で別のアミノ酸により置換されるか、または1位で欠失される(例えば、des-1Q)。いくつかの態様において、本開示のIL10R結合性分子は、群Q1EおよびQ1Dから選択されるアミノ酸置換を含む。
いくつかの態様において、例えば、選択的PEGコンジュゲーションを容易にする側鎖を有する非天然アミノ酸の組み込みによる、IL10R結合性分子の選択的PEG化が利用されうる。特異的なPEG化部位は、結合性分子のPEG化が標的受容体へのその結合に影響を与えないように選択することができる。
ある特定の態様において、半減期の増大は、いかなる生物学的活性の低下よりも大きい。ポリペプチド配列へのコンジュゲーションに適したPEGは、一般的に、室温で水溶性であり、Rが水素またはアルキル基もしくはアルカノール基などの保護基であり、nが1~1000の整数である一般式R(O-CH2-CH2)nO-Rを有する。Rが保護基である場合、これは一般的に1~8つの炭素を有する。ポリペプチド配列とコンジュゲーションされるPEGは、直鎖または分岐であることができる。分岐PEG誘導体、「スターPEG」およびマルチアーム型PEGが本開示によって考えられている。
本開示において用いられるPEGの分子量は、任意の特定の範囲に制限されない。結合性分子のPEG成分は、約5 kDaよりも大きい、約10 kDaよりも大きい、約15 kDaよりも大きい、約20 kDaよりも大きい、約30 kDaよりも大きい、約40 kDaよりも大きい、または約50 kDaよりも大きい分子質量を有することができる。いくつかの態様において、分子質量は、約5 kDa~約10 kDa、約5 kDa~約15 kDa、約5 kDa~約20 kDa、約10 kDa~約15 kDa、約10 kDa~約20 kDa、約10 kDa~約25 kDaまたは約10 kDa~約30 kDaである。直鎖または分岐PEG分子は、約2,000~約80,000ダルトン、代替的に約2,000~約70,000ダルトン、代替的に約5,000~約50,000ダルトン、代替的に約10,000~約50,000ダルトン、代替的に約20,000~約50,000ダルトン、代替的に約30,000~約50,000ダルトン、代替的に約20,000~約40,000ダルトン、または代替的に約30,000~約40,000ダルトンの分子量を有する。本開示の1つの態様において、PEGは2つの20 kDアームを含む40 kDの分岐PEGである。
本開示はまた、PEGが異なるn値を有し、したがって、さまざまな異なるPEGが特定の比で存在する、コンジュゲートの組成物を考えている。例えば、いくつかの組成物は、n = 1、2、3および4であるコンジュゲートの混合物を含む。いくつかの組成物では、n = 1であるコンジュゲートの率は18~25%であり、n = 2であるコンジュゲートの率は50~66%であり、n = 3であるコンジュゲートの率は12~16%であり、n = 4であるコンジュゲートの率は最大5%である。このような組成物は、当技術分野において公知の反応条件および精製方法によって産生することができる。クロマトグラフィーは、コンジュゲートの画分を分離するために用いられる場合があり、次いで、例えば、所望の数のPEGが結び付いているコンジュゲートを含有する画分が特定され、未改変タンパク質配列および他の数のPEGが結び付いたコンジュゲートがないように精製される。
ポリペプチド配列へのコンジュゲーションに適したPEGは、一般的に室温で水溶性であり、Rが水素またはアルキル基もしくはアルカノール基などの保護基であり、nが1~1000の整数である一般式R(O-CH2-CH2)nO-Rを有する。Rが保護基である場合、これは一般的に1~8つの炭素を有する。
2つの広く使用されている第1世代活性化モノメトキシPEG (mPEG)はスクシンイミジルカルボネートPEG (SC-PEG; 例えば、Zalipsky, et al. (1992) Biotehnol. Appl. Biochem 15:100-114を参照されたい)およびベンゾトリアゾールカルボネートPEG (BTC-PEG; 例えば、Dolenceら、米国特許第5,650,234号を参照されたい)であり、それらは、リシン残基と優先的に反応してカルバメート結合を形成するが、ヒスチジン残基およびチロシン残基と反応することも知られている。PEG-アルデヒドリンカーの使用は、還元的アミノ化を通してポリペプチドのN末端の単一部位を標的とする。
PEG化は、ポリペプチドのN末端でのα-アミノ基、リシン残基の側鎖でのイプシロンアミノ基、およびヒスチジン残基の側鎖でのイミダゾール基で起こることが最も多い。大部分の組み換えポリペプチドは、単一のαアミノ基ならびにいくつかのεアミノ基およびイミダゾール基を有するので、リンカーの化学的性質に依存して多数の位置異性体を生成することができる。当技術分野において公知の一般的なPEG化戦略を本明細書において適用することができる。
PEGは、1つまたは複数のポリペプチド配列の遊離アミノ基またはカルボキシル基とポリエチレングリコールとの間の結合を媒介する末端反応基(「スペーサー」)によって本開示の結合性分子に結合させることができる。遊離アミノ基に結合させることができるスペーサーを有するPEGは、ポリエチレングリコールのコハク酸エステルをN-ヒドロキシスクシニルイミドで活性化することによって調製することができるN-ヒドロキシスクシニルイミドポリエチレングリコールを含む。
いくつかの態様において、独特な側鎖を担持する非天然アミノ酸を組み入れて部位特異的PEG化を促進することによって、結合性分子のPEG化が促進される。このようなポリペプチドの部位特異的PEG化を達成するための機能的部分を提供するためにポリペプチドに非天然アミノ酸を組み入れることは、当技術分野において公知である。例えば、Ptacinら、2018年8月3日に出願され、2019年2月7日に国際公開公報番号WO 2019/028419Alとして公開されたPCT国際出願番号PCT/US2018/045257を参照されたい。
ポリペプチド配列とコンジュゲートされたPEGは、直鎖または分岐であることができる。分岐PEG誘導体、「スターPEG」およびマルチアーム型PEGが、本開示によって考えられている。特定の態様において、本開示の実践において有用なPEGは、10 kDa直鎖PEG-アルデヒド(例えば、Sunbright (登録商標) ME-100AL, NOF America Corporation, One North Broadway, White Plains, NY 10601 USA))、10 kDa直鎖PEG-NHSエステル(例えば、Sunbright (登録商標) ME-100CS、Sunbright (登録商標) ME-100AS、Sunbright (登録商標) ME-100GS、Sunbright (登録商標) ME-100HS、NOF)、20 kDa直鎖PEG-アルデヒド(例えば、Sunbright (登録商標) ME-200AL、NOF)、20 kDa直鎖PEG-NHSエステル(例えば、Sunbright (登録商標) ME-200CS、Sunbright (登録商標) ME-200AS、Sunbright (登録商標) ME-200GS、Sunbright (登録商標) ME-200HS、NOF)、20 kDa 2アーム型分岐PEG-アルデヒドであって、2つの10 kDa直鎖PEG分子を含む20 kDA PEG-アルデヒド(例えば、Sunbright (登録商標) GL2-200AL3、NOF)、20 kDa 2アーム型分岐PEG-NHSエステルであって、2つの10 kDA 直鎖PEG分子を含む20 kDA PEG-NHSエステル(例えば、Sunbright (登録商標) GL2-200TS、Sunbright (登録商標) GL200GS2、NOF)、40 kDa 2アーム型分岐PEG-アルデヒドであって、2つの20 kDA 直鎖PEG分子を含む40 kDA PEG-アルデヒド(例えば、Sunbright (登録商標) GL2-400AL3)、40 kDa 2アーム型分岐PEG-NHSエステルであって、2つの20 kDA 直鎖PEG分子を含む40 kDA PEG-NHSエステル(例えば、Sunbright (登録商標) GL2-400AL3、Sunbright (登録商標) GL2-400GS2、NOF)、直鎖30 kDa PEG-アルデヒド(例えば、Sunbright (登録商標) ME-300AL)および直鎖30 kDa PEG-NHSエステルを含む。
いくつかの態様において、リンカーは、IL10R結合性分子およびPEG分子をつなぎ合わせるために用いることができる。適当なリンカーは、一般的に改変ポリペプチド配列と、連結された構成要素および分子との間に幾分の運動を許すのに十分な長さの「可動性リンカー」を含む。リンカー分子は、一般的に約6~50原子長である。リンカー分子は、例えば、アリールアセチレン、2つ~10の単量体ユニットを含有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであってもよい。適当なリンカーは、容易に選択することができ、任意の適当な長さ、例えば1アミノ酸長(例えば、Gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10~20、20~30、30~50または50超のアミノ酸長であることができる。可動性リンカーの例は、セクションIVに記述されている。さらに、これらのリンカー配列の多量体(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10~20、20~30または30~50)を一緒に連結して、2分子をコンジュゲートするために用いられうる可動性リンカーを提供してもよい。ポリペプチドリンカーに代えて、リンカーは化学リンカー、例えばPEG-アルデヒドリンカーであることができる。いくつかの態様において、結合性分子は、N-末端アセチルトランスフェラーゼおよび例えばアセチルCoAとの酵素反応によりN-末端でアセチル化される。代替的に、またはN末端アセチル化に加えて、結合性分子は、例えば、リジンアセチルトランスフェラーゼとの酵素反応により、1つまたは複数のリジン残基でアセチル化されてもよい。例えば、Choudhary et al. (2009) Science 325 (5942):834-840を参照されたい。
一部の態様において、本発明は、PEG化された式#1のIL10R結合性分子であって、PEGがIL10R結合性分子にコンジュゲートされており、およびPEGが、約2,000~約80,000ダルトン、代替的に約2,000~約70,000ダルトン、代替的に約5,000~約50,000ダルトン、代替的に約10,000~約50,000ダルトン、代替的に約20,000~約50,000ダルトン、代替的に約30,000~約50,000ダルトン、代替的に約20,000~約40,000ダルトン、または代替的に約30,000~約40,000ダルトンの分子量を有する直鎖状または分岐鎖状PEG分子である、該IL10R結合性分子を提供する。本開示の1つの態様において、PEGは、2つの20kDのアームを含む40kDの分岐鎖状PEGである。
脂肪酸キャリア
一部の態様において、Resh(2016)Progress in Lipid Research 63:120-131に記載されるように、哺乳動物対象における作用の延長された持続期間を有し、および本開示の実施において有用なIL10R結合性分子は、脂肪酸分子へのIL10R結合性分子の共有結合性取付けにより達成される。コンジュゲートされ得る脂肪酸の例は、ミリスチン酸、パルミチン酸およびパルミトレイン酸を含む。ミリストイル化は、典型的にはN末端グリシンに連結されるが、リジンもまたミリストイル化され得る。パルミトイル化は、遊離システイン-SH基の酵素修飾により典型的には達成され、例えばDHHCタンパク質はS-パルミトイル化を触媒する。セリンおよびスレオニン残基のパルミトイル化は、典型的にはPORCN酵素を使用して酵素的に達成される。一部の態様において、IL10R結合性分子は、N末端アセチルトランスフェラーゼおよび、例えば、アセチルCoAとの酵素反応によりN末端においてアセチル化される。代替的に、またはN末端アセチル化に加えて、IL10R結合性分子は、1つまたは複数のリジン残基において、例えば、リジンアセチルトランスフェラーゼとの酵素反応により、アセチル化される。例えば、Choudhary et al.(2009)Science 325(5942):834L2 ortho840を参照。
一部の態様において、Resh(2016)Progress in Lipid Research 63:120-131に記載されるように、哺乳動物対象における作用の延長された持続期間を有し、および本開示の実施において有用なIL10R結合性分子は、脂肪酸分子へのIL10R結合性分子の共有結合性取付けにより達成される。コンジュゲートされ得る脂肪酸の例は、ミリスチン酸、パルミチン酸およびパルミトレイン酸を含む。ミリストイル化は、典型的にはN末端グリシンに連結されるが、リジンもまたミリストイル化され得る。パルミトイル化は、遊離システイン-SH基の酵素修飾により典型的には達成され、例えばDHHCタンパク質はS-パルミトイル化を触媒する。セリンおよびスレオニン残基のパルミトイル化は、典型的にはPORCN酵素を使用して酵素的に達成される。一部の態様において、IL10R結合性分子は、N末端アセチルトランスフェラーゼおよび、例えば、アセチルCoAとの酵素反応によりN末端においてアセチル化される。代替的に、またはN末端アセチル化に加えて、IL10R結合性分子は、1つまたは複数のリジン残基において、例えば、リジンアセチルトランスフェラーゼとの酵素反応により、アセチル化される。例えば、Choudhary et al.(2009)Science 325(5942):834L2 ortho840を参照。
追加の機能を提供するための改変
一部の態様において、態様、IL10R結合性分子はキメラポリペプチドの機能的ドメインを含んでもよい。本開示のIL10R結合性分子融合タンパク質は、当技術分野において公知の技術による組換えDNA方法論により、IL10R結合性分子のN末端またはC末端のいずれかにおける融合パートナーをコードする核酸配列とインフレームのIL10R結合性分子をコードする核酸配列を含む核酸配列を含む組換えベクターを構築することにより容易に製造可能であり、配列は任意で、リンカーまたはスペーサーポリペプチドをインフレームでコードする核酸配列をさらに含む。
一部の態様において、態様、IL10R結合性分子はキメラポリペプチドの機能的ドメインを含んでもよい。本開示のIL10R結合性分子融合タンパク質は、当技術分野において公知の技術による組換えDNA方法論により、IL10R結合性分子のN末端またはC末端のいずれかにおける融合パートナーをコードする核酸配列とインフレームのIL10R結合性分子をコードする核酸配列を含む核酸配列を含む組換えベクターを構築することにより容易に製造可能であり、配列は任意で、リンカーまたはスペーサーポリペプチドをインフレームでコードする核酸配列をさらに含む。
FLAGタグ
他の態様において、IL10R結合性分子は、抗原性タグとして機能する追加のポリペプチド配列、例えばFLAG配列を含むように改変され得る。FLAG配列は、本明細書に記載されるように、ビオチン化された、高度に特異的な、抗FLAG抗体により認識される(例えば、Blanar et al.(1992)Science 256:1014 and LeClair,et al.(1992)PNAS-USA 89:8145を参照)。一部の態様において、結合性分子はC末端c-mycエピトープタグをさらに含む。
他の態様において、IL10R結合性分子は、抗原性タグとして機能する追加のポリペプチド配列、例えばFLAG配列を含むように改変され得る。FLAG配列は、本明細書に記載されるように、ビオチン化された、高度に特異的な、抗FLAG抗体により認識される(例えば、Blanar et al.(1992)Science 256:1014 and LeClair,et al.(1992)PNAS-USA 89:8145を参照)。一部の態様において、結合性分子はC末端c-mycエピトープタグをさらに含む。
ターゲティング部分:
一部の態様において、IL10R結合性分子は、ターゲティングドメインに特異的に結合する細胞表面分子を発現する特定の細胞型または組織への選択的な結合を促進するために、(「ターゲティングドメイン」)を提供する分子にコンジュゲートされ、任意でIL10R結合性分子の配列と融合タンパク質のターゲティングドメインの配列との間に1~40(代替的に2~20、代替的に5~20、代替的に10~20)個のアミノ酸のリンカー分子を組み込んでいる。
一部の態様において、IL10R結合性分子は、ターゲティングドメインに特異的に結合する細胞表面分子を発現する特定の細胞型または組織への選択的な結合を促進するために、(「ターゲティングドメイン」)を提供する分子にコンジュゲートされ、任意でIL10R結合性分子の配列と融合タンパク質のターゲティングドメインの配列との間に1~40(代替的に2~20、代替的に5~20、代替的に10~20)個のアミノ酸のリンカー分子を組み込んでいる。
他の態様において、IL10R結合性分子および抗体またはその抗原結合部分を含むキメラポリペプチドが生成され得る。キメラタンパク質の抗体または抗原結合成分はターゲティング部分として役立つことができる。例えば、それは、キメラタンパク質を細胞または標的分子の特定のサブセットに局在化させるために使用され得る。サイトカイン-抗体キメラポリペプチドを生成する方法は、例えば、米国特許第6,617,135号明細書に記載されている。
一部の態様において、ターゲティング部分は、腫瘍細胞と関連付けられる少なくとも1つの細胞表面分子(すなわち少なくとも1つの腫瘍抗原)に特異的に結合する抗体であり、腫瘍細胞と関連付けられる細胞表面分子は、GD2、BCMA、CD19、CD33、CD38、CD70、GD2、IL3R□2、CD19、メソテリン、Her2、EpCam、Muc1、ROR1、CD133、CEA、EGRFRVIII、PSCA、GPC3、Pan-ErbBおよびFAPからなる群より選択される。
組換え製造
代替的に、本開示のIL10R結合性分子は組換えDNA技術により製造される。ポリペプチドの組換え製造の典型的な実施において、所望されるポリペプチドをコードする核酸配列は、発現が達成される宿主細胞のために好適な発現ベクターに組み込まれ、核酸配列は、ベクターによりコードし、および標的宿主細胞において機能的な1つまたは複数の発現制御配列に機能的に連結されている。組換えタンパク質は、宿主細胞の破砕を通じて、または分泌リーダー配列(シグナルペプチド)がポリペプチドに組み込まれている場合に細胞培地から回収されてもよい。
代替的に、本開示のIL10R結合性分子は組換えDNA技術により製造される。ポリペプチドの組換え製造の典型的な実施において、所望されるポリペプチドをコードする核酸配列は、発現が達成される宿主細胞のために好適な発現ベクターに組み込まれ、核酸配列は、ベクターによりコードし、および標的宿主細胞において機能的な1つまたは複数の発現制御配列に機能的に連結されている。組換えタンパク質は、宿主細胞の破砕を通じて、または分泌リーダー配列(シグナルペプチド)がポリペプチドに組み込まれている場合に細胞培地から回収されてもよい。
IL10R結合性分子をコードする核酸配列
一部の態様において、IL10R結合性分子は、IL10R結合性分子(またはIL10R結合性分子を含む融合タンパク質)をコードする核酸配列を使用して組換え法により製造される。所望されるαβhIL10R結合性分子をコードする核酸配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用して化学的手段により合成され得る。
一部の態様において、IL10R結合性分子は、IL10R結合性分子(またはIL10R結合性分子を含む融合タンパク質)をコードする核酸配列を使用して組換え法により製造される。所望されるαβhIL10R結合性分子をコードする核酸配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用して化学的手段により合成され得る。
核酸分子は、ポリペプチドをコードする配列に限定されず; コーディング配列(例えば、IL-2のコーディング配列)の上流または下流にある非コーディング配列の一部またはすべてもまた含まれ得る。分子生物学の技術分野における当業者は、核酸分子を単離するための常用の手順に精通している。それらは、例えば、制限エンドヌクレアーゼでのゲノムDNAの処理により、またはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の実行により生成され得る。核酸分子がリボ核酸(RNA)である場合、分子は、例えば、インビトロ転写により製造され得る。
IL10R結合性分子(およびその融合物)をコードする核酸分子は、天然に存在する配列、または天然に存在する配列とは異なるが、遺伝コードの縮重に起因して、同じポリペプチドをコードする配列を含有してもよい。これらの核酸分子は、RNAもしくはDNA(例えば、ゲノムDNA、cDNA、もしくは合成DNA、例えばホスホロアミダイトベースの合成により製造されるもの)、またはこれらの種類の核酸内のヌクレオチドの組合せもしくは修飾からなることができる。追加的に、核酸分子は、二本鎖または一本鎖(すなわち、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれか)であることができる。
IL10R結合性分子をコードする核酸配列は、特製の核酸配列を提供する様々な商用の供給元から得られてもよい。本開示のIL10R結合性分子のアミノ酸配列バリアントは、当技術分野において周知の遺伝コードに基づいてコーディング配列に適切なヌクレオチド変化を導入することにより調製される。そのようなバリアントは、注記されている残基の挿入、置換、および/または指定される欠失を表す。最終構築物が、本明細書において定義されている所望される生物学的活性を有する限り、最終構築物に到達するために挿入、置換、および/または指定される欠失の任意の組合せが為される。
IL10R結合性分子をコードするDNA配列を構築し、好適に形質転換された宿主においてそれらの配列を発現させるための方法は、PCRに補助される突然変異誘発技術の使用を含むが、これに限定されない。IL10R結合性分子に対するアミノ酸残基の欠失または付加からなる突然変異はまた、標準的な組換え技術を用いて為され得る。欠失または付加の場合、IL10R結合性分子をコードする核酸分子は、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて任意で消化される。結果としてもたらされる断片は、直接的に発現され得るか、または、例えば、それを第2の断片にライゲートすることにより、さらにマニピュレートされ得る。ライゲーションは、核酸分子の2つの末端が互いにオーバーラップする相補的なヌクレオチドを含有する場合に促され得るが、平滑末端断片もまたライゲートされ得る。PCRで生成される核酸もまた、様々な突然変異体配列を生成するために使用され得る。
本開示のIL10R結合性分子は、直接的にだけでなく、異種ポリペプチド、例えばシグナル配列または成熟したIL10R結合性分子のN末端もしくはC末端において特異的な切断部位を有する他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換えにより製造されてもよい。一般に、シグナル配列はベクターの構成要素であってもよく、またはそれは、ベクターに挿入されるコーディング配列の部分であってもよい。選択される異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識およびプロセシング(すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断)されるものである。シグナル配列を含めることは、IL10R結合性分子が作られる組換え細胞からIL10R結合性分子を分泌させるためにそれが所望されるかどうかに依存する。選択される細胞が原核性である場合、DNA配列はシグナル配列をコードしないことが一般に好ましい。組換え宿主細胞が酵母細胞、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である場合、2007年4月3日に発行されたSingh、米国特許第7,198,919 B1号明細書に記載されるように、アルファ接合因子分泌シグナル配列を用いて、培養培地へのIL10R結合性分子の細胞外分泌を達成してもよい。
発現されるべきIL10R結合性分子がキメラ(例えば、IL10R結合性分子および異種ポリペプチド配列を含む融合タンパク質)として発現されるべき場合、キメラタンパク質は、IL10R結合性分子の全体または部分をコードする第1の配列および異種ポリペプチドの全体または部分をコードする第2の配列を含むハイブリッド核酸分子によりコードされ得る。例えば、本明細書に記載される主題IL10R結合性分子は、細菌により発現されるタンパク質の精製を促すためにヘキサ-/オクタ-ヒスチジンタグに、または真核細胞中で発現されるタンパク質の精製を促すためにヘマグルチニンタグに融合されてもよい。第1および第2により、それは融合タンパク質のエレメントの配向性に対する限定として理解されるべきではなく、異種ポリペプチドは、IL10R結合性分子のN末端および/またはC末端のいずれかにおいて連結され得る。例えば、N末端はターゲティングドメインに連結されてもよく、およびC末端はヘキサ-ヒスチジンタグ精製ハンドルに連結されてもよい。
発現されるべきポリペプチド(または融合物/キメラ)の完全なアミノ酸配列を使用して、逆翻訳される遺伝子を構築することができる。IL10R結合性分子をコードするヌクレオチド配列を含有するDNAオリゴマーが合成され得る。例えば、所望されるポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さいオリゴヌクレオチドが合成され、次にライゲートされ得る。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的なアセンブリーのために5'または3'オーバーハングを含有する。
コドン最適化:
一部の態様において、IL10R結合性分子をコードする核酸配列は、特定の宿主細胞タイプにおける発現を促すために「コドン最適化」されてもよい。哺乳動物、酵母および細菌宿主細胞を含む、多様な発現系におけるコドン最適化のための技術は当技術分野において周知であり、様々な宿主細胞タイプにおける発現のためにコドン最適化された配列を提供するためのオンラインツールがある。例えば、Hawash,et al.,(2017)9:46-53 and Mauro and Chappell、Recombinant Protein Expression in Mammalian Cells:Methods and Protocols、David Hacker編(Human Press New York)を参照。追加的に、コドン最適化された核酸配列の調製を補助するために自由に利用可能な様々なウェブベースのオンラインソフトウェアパッケージがある。
一部の態様において、IL10R結合性分子をコードする核酸配列は、特定の宿主細胞タイプにおける発現を促すために「コドン最適化」されてもよい。哺乳動物、酵母および細菌宿主細胞を含む、多様な発現系におけるコドン最適化のための技術は当技術分野において周知であり、様々な宿主細胞タイプにおける発現のためにコドン最適化された配列を提供するためのオンラインツールがある。例えば、Hawash,et al.,(2017)9:46-53 and Mauro and Chappell、Recombinant Protein Expression in Mammalian Cells:Methods and Protocols、David Hacker編(Human Press New York)を参照。追加的に、コドン最適化された核酸配列の調製を補助するために自由に利用可能な様々なウェブベースのオンラインソフトウェアパッケージがある。
発現ベクター:
(合成、部位特異的突然変異誘発または別の方法により)アセンブルされたら、IL10R結合性分子をコードする核酸配列は発現ベクターに挿入される。様々な宿主細胞における使用のための様々な発現ベクターが利用可能であり、典型的には発現用の宿主細胞に基づいて選択される。発現ベクターは、典型的には、以下:複製起点、1つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列の1つまたは複数を含むが、これらに限定されない。ベクターは、ウイルスベクター、プラスミドベクター、および組込みベクターなどを含む。プラスミドは非ウイルスベクターの例である。
(合成、部位特異的突然変異誘発または別の方法により)アセンブルされたら、IL10R結合性分子をコードする核酸配列は発現ベクターに挿入される。様々な宿主細胞における使用のための様々な発現ベクターが利用可能であり、典型的には発現用の宿主細胞に基づいて選択される。発現ベクターは、典型的には、以下:複製起点、1つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列の1つまたは複数を含むが、これらに限定されない。ベクターは、ウイルスベクター、プラスミドベクター、および組込みベクターなどを含む。プラスミドは非ウイルスベクターの例である。
組換えポリペプチドの効率的な発現を促すために、発現されるべきポリペプチド配列をコードする核酸配列は、選択された発現宿主において機能的な転写および翻訳調節用制御配列に機能的に連結される。
選択マーカー:
発現ベクターは、通常は、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含有する。この遺伝子は、選択的な培養培地中で生育される形質転換された宿主細胞の生存または増殖のために必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地中で生存しない。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、(b)栄養要求性欠損を補完するか、または(c)複合培地から利用可能でない不可欠な栄養分を供給するタンパク質をコードする。
発現ベクターは、通常は、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含有する。この遺伝子は、選択的な培養培地中で生育される形質転換された宿主細胞の生存または増殖のために必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培養培地中で生存しない。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、(b)栄養要求性欠損を補完するか、または(c)複合培地から利用可能でない不可欠な栄養分を供給するタンパク質をコードする。
調節用制御配列:
本開示のIL10R結合性分子のための発現ベクターは、宿主生物により認識され、IL10R結合性分子をコードする核酸配列に機能的に連結された調節配列を含有する。「調節用制御配列」、「調節配列」または「発現制御配列」という用語は本明細書において交換可能に使用され、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を指す。例えば、Goeddel(1990)、Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185(Academic Press,San Diego CA USA)を参照。調節配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的な発現を指令するものおよびある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの(例えば、組織特異的な調節配列)を含む。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、および所望されるタンパク質の発現のレベルなどのような要因に依存し得ることが当業者により理解される。発現制御配列の選択において、当業者により理解される様々な要因が考慮されるべきである。これらは、例えば、配列の相対的な強度、その制御可能性、および主題IL10R結合性分子をコードする実際のDNA配列とのその適合性、特には潜在的な二次構造に関するものを含む。
本開示のIL10R結合性分子のための発現ベクターは、宿主生物により認識され、IL10R結合性分子をコードする核酸配列に機能的に連結された調節配列を含有する。「調節用制御配列」、「調節配列」または「発現制御配列」という用語は本明細書において交換可能に使用され、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)を指す。例えば、Goeddel(1990)、Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185(Academic Press,San Diego CA USA)を参照。調節配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的な発現を指令するものおよびある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの(例えば、組織特異的な調節配列)を含む。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、および所望されるタンパク質の発現のレベルなどのような要因に依存し得ることが当業者により理解される。発現制御配列の選択において、当業者により理解される様々な要因が考慮されるべきである。これらは、例えば、配列の相対的な強度、その制御可能性、および主題IL10R結合性分子をコードする実際のDNA配列とのその適合性、特には潜在的な二次構造に関するものを含む。
プロモーター:
一部の態様において、調節配列はプロモーターであり、これは、例えば、発現が求められる細胞型に基づいて選択される。プロモーターは、それらが機能的に連結された特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する構造遺伝子の開始コドンの上流(5')(一般に約100~1000bp以内)に位置する翻訳されない配列である。そのようなプロモーターは、典型的には、2つのクラス、誘導性および構成的に入る。誘導性プロモーターは、培養条件における何らかの変化、例えば、栄養分の存在もしくは非存在または温度における変化に応答してそれらの制御下のDNAからの増加されたレベルの転写を開始させるプロモーターである。様々な潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。
一部の態様において、調節配列はプロモーターであり、これは、例えば、発現が求められる細胞型に基づいて選択される。プロモーターは、それらが機能的に連結された特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する構造遺伝子の開始コドンの上流(5')(一般に約100~1000bp以内)に位置する翻訳されない配列である。そのようなプロモーターは、典型的には、2つのクラス、誘導性および構成的に入る。誘導性プロモーターは、培養条件における何らかの変化、例えば、栄養分の存在もしくは非存在または温度における変化に応答してそれらの制御下のDNAからの増加されたレベルの転写を開始させるプロモーターである。様々な潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。
T7プロモーターは細菌において使用可能であり、ポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞において使用可能であり、サイトメガロウイルスまたはメタロチオネインプロモーターは哺乳動物細胞において使用可能である。また、高等真核生物の場合、組織特異的および細胞種特異的なプロモーターが広く利用可能である。これらのプロモーターは、身体内の所与の組織または細胞型において核酸分子の発現を指令するそれらの能力のためにそのように命名されている。当業者は、核酸の発現を指令するために使用され得る多数のプロモーターおよび他の調節エレメントをよく認識している。
哺乳動物宿主細胞中でのベクターからの転写は、そのようなプロモーターが宿主細胞系と適合性である限り、例えば、ウイルス、例えばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス(例えばヒトアデノウイルス血清型5)、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス(例えばマウス幹細胞ウイルス)、B型肝炎ウイルス、最も好ましくはシミアンウイルス40(SV40)のゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター、PGK(ホスホグリセリン酸キナーゼ)、または免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターにより制御されてもよい。SV40ウイルスの早期および後期プロモーターは、好都合には、SV40ウイルス複製起点も含有するSV40制限断片として得られる。
エンハンサー:
高等真核生物による転写は、多くの場合に、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加される。エンハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常は約10~300bpの、DNAのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、相対的に配向性および位置に非依存性であり、転写単位の5'および3'、イントロン内の他に、コーディング配列それ自体の中に見出されている。哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ-フェトプロテイン、およびインスリン)からの多くのエンハンサー配列が今や公知である。典型的には、しかしながら、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用される。例は、複製起点の後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。エンハンサーは、コーディング配列の5'または3'の位置において発現ベクターにスプライシングされてもよいが、好ましくはプロモーターの5'の部位に位置する。真核宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、転写の終結のためおよびmRNAを安定化させるために必要な配列を含有する。そのような配列は、真核またはウイルスDNAまたはcDNAの非翻訳領域の5'および、時折3'から一般的に入手可能である。上記に列記される構成要素の1つまたは複数を含有する好適なベクターの構築は標準的な技術を用いる。
高等真核生物による転写は、多くの場合に、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増加される。エンハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常は約10~300bpの、DNAのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、相対的に配向性および位置に非依存性であり、転写単位の5'および3'、イントロン内の他に、コーディング配列それ自体の中に見出されている。哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ-フェトプロテイン、およびインスリン)からの多くのエンハンサー配列が今や公知である。典型的には、しかしながら、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用される。例は、複製起点の後期側のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。エンハンサーは、コーディング配列の5'または3'の位置において発現ベクターにスプライシングされてもよいが、好ましくはプロモーターの5'の部位に位置する。真核宿主細胞において使用される発現ベクターはまた、転写の終結のためおよびmRNAを安定化させるために必要な配列を含有する。そのような配列は、真核またはウイルスDNAまたはcDNAの非翻訳領域の5'および、時折3'から一般的に入手可能である。上記に列記される構成要素の1つまたは複数を含有する好適なベクターの構築は標準的な技術を用いる。
挿入される核酸分子の転写を促す配列に加えて、ベクターは、複製起点、および選択マーカーをコードする他の遺伝子を含有することができる。例えば、ネオマイシン耐性(neoR)遺伝子は、それが発現される細胞にG418耐性を付与するため、トランスフェクトされた細胞の表現型選択を可能にする。マーカーまたはレポーター遺伝子の追加の例は、ベータ-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、ハイグロマイシン-B-ホスホトランスフェラーゼ(HPH)、チミジンキナーゼ(TK)、lacZ(ベータ-ガラクトシダーゼをコードする)、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT)を含む。当業者は、所与の調節エレメントまたは選択マーカーが特定の実験的文脈における使用のために好適であるかどうかを容易に決定することができる。
発現ベクターの適正なアセンブリーは、ヌクレオチドシークエンシング、制限マッピング、および好適な宿主中での生物学的に活性のポリペプチドの発現により確認され得る。
宿主細胞:
本開示は、IL10R結合性分子をコードする核酸分子を含有および発現する原核または真核細胞をさらに提供する。本開示の細胞は、トランスフェクトされた細胞、すなわち、核酸分子、例えば突然変異体IL-2ポリペプチドをコードする核酸分子が、組換えDNA技術の手段により導入された細胞である。そのような細胞の子孫もまた本開示の範囲内にあると考えられる。
本開示は、IL10R結合性分子をコードする核酸分子を含有および発現する原核または真核細胞をさらに提供する。本開示の細胞は、トランスフェクトされた細胞、すなわち、核酸分子、例えば突然変異体IL-2ポリペプチドをコードする核酸分子が、組換えDNA技術の手段により導入された細胞である。そのような細胞の子孫もまた本開示の範囲内にあると考えられる。
宿主細胞は、典型的には、選択された発現ベクターとのそれらの適合性、本発明のDNA配列によりコードされる生成物の毒性、それらの分泌特徴、ポリペプチドを正確にフォールディングさせるそれらの能力、それらの発酵または培養の要求、およびDNA配列によりコードされる生成物の精製の容易さにしたがって選択される。本明細書におけるベクターにおけるDNAのクローニングまたは発現のための好適な宿主細胞は、原核生物、酵母、または高等真核生物細胞である。
一部の態様において、組換えIL10R結合性分子はまた、真核生物、例えば酵母またはヒト細胞において製造され得る。好適な真核宿主細胞は、昆虫細胞(培養された昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)中でのタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターの例はpAcシリーズ(Smith et al.(1983)Mol.Cell Biol.3:2156-2165)およびpVLシリーズ(Lucklow and Summers(1989)Virology 170:31-39)を含む); 酵母細胞(酵母S.セレビシエ(S.cerenvisiae)中での発現のためのベクターの例は、pYepSecl(Baldari et al.(1987)EMBO J.6:229-234)、pMFa(Kurjan and Herskowitz(1982)Cell 30:933-943)、pJRY88(Schultz et al.(1987)Gene 54:113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation、San Diego、Calif.)、およびpPicZ(Invitrogen Corporation、San Diego、Calif.)を含む); または哺乳動物細胞(哺乳動物発現ベクターはpCDM8(Seed(1987)Nature 329:840)およびpMT2PC(Kaufman et al.(1987)EMBO J.6:187:195)を含む)を含む。
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、マウスL細胞(L-M[TK-]、ATCC#CRL-2648)、SV40により形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7、ATCC CRL 1651); ヒト胚性腎臓株(HEK293または懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされたHEK293細胞); ベビーハムスター腎臓細胞(BHK、ATCC CCL 10); チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO); マウスセルトリ細胞(TM4); サル腎臓細胞(CV1 ATCC CCL 70); アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76、ATCC CRL-1 587); ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2); イヌ腎臓細胞(MDCK、ATCC CCL 34); バッファローラット肝細胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442); ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75); ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065); マウス乳腺腫瘍(MMT 060562、ATCC CCL51); TRI細胞; MRC 5細胞; FS4細胞; およびヒトヘパトーマ株(Hep G2)である。哺乳動物細胞において、発現ベクターの制御機能は、多くの場合に、ウイルス調節エレメントにより提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス40に由来する。
IL10R結合性分子は、原核性宿主、例えば細菌大腸菌、または真核宿主、例えば昆虫細胞(例えば、Sf21細胞)、もしくは哺乳動物細胞(例えば、COS細胞、NIH 3T3細胞、もしくはHeLa細胞)において製造されてもよい。これらの細胞は、American Type Culture Collection(Manassas、Va.)を含む、多くの供給元から入手可能である。発現系の選択において、構成要素が互いと適合性であることのみが問題となる。当業者はそのような決定を行うことができる。さらには、発現系の選択においてガイダンスが要求される場合、当業者は、Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,New York,N.Y.,1993)およびPouwels et al.(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,1985 Suppl.1987)を参照することができる。
一部の態様において、得られるIL10R結合性分子は、ムテインを製造するために使用される宿主生物に依存してグリコシル化または非グリコシル化される。細菌が宿主として選択される場合、製造されるIL10R結合性分子は非グリコシル化される。真核細胞は、他方で、典型的には、IL10R結合性分子のグリコシル化を結果としてもたらす。
一部の態様において、IL10R結合性分子に組み込まれるべきsdAbのアミノ酸配列(特にはCDR配列)は、グリコシル化モチーフ、特には配列Asn-X-Ser(N-X-S)またはAsn-X-Thr(N-X-T)(ここで、Xはプロリンを除く任意のアミノ酸である)のN結合型グリコシル化モチーフを含有し得ることが可能である。そのような事例において、N結合型グリコシル化モチーフの配列を改変してグリコシル化を予防することによりそのようなN結合型グリコシル化モチーフを排除することが望ましい。一部の態様において、N結合型グリコシル化モチーフは、N結合型グリコシル化モチーフのAsn(N)残基の保存的アミノ酸置換の組込みにより破壊される。
原核細胞および真核細胞の両方のための他の追加の発現系について、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,N.Y.)のChapter 16および17を参照。Goeddel(1990)、Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185(Academic Press,San Diego,Calif.)を参照。
トランスフェクション:
発現構築物を宿主細胞に導入し、それにより本明細書に開示されるIL10R結合性分子を製造することができる。IL10R結合性分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核または真核宿主細胞に導入される。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションの好適な方法は、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,N.Y.)および他の標準的な分子生物学実験室マニュアルに見出され得る。標的細胞のトランスフェクションを促すために、標的細胞は、非ウイルスベクターの取込みを促す条件下で非ウイルスベクターに直接的に曝露されてもよい。哺乳動物細胞による外来核酸の取込みを促す条件の例は当技術分野において周知であり、化学的手段(例えばLipofectamine(登録商標)、Thermo-Fisher Scientific)、高レベルの塩、および磁場(エレクトロポレーション)を含むがこれらに限定されない。
発現構築物を宿主細胞に導入し、それにより本明細書に開示されるIL10R結合性分子を製造することができる。IL10R結合性分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核または真核宿主細胞に導入される。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションの好適な方法は、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,N.Y.)および他の標準的な分子生物学実験室マニュアルに見出され得る。標的細胞のトランスフェクションを促すために、標的細胞は、非ウイルスベクターの取込みを促す条件下で非ウイルスベクターに直接的に曝露されてもよい。哺乳動物細胞による外来核酸の取込みを促す条件の例は当技術分野において周知であり、化学的手段(例えばLipofectamine(登録商標)、Thermo-Fisher Scientific)、高レベルの塩、および磁場(エレクトロポレーション)を含むがこれらに限定されない。
細胞培養:
細胞は、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または所望される配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改変された従来の栄養培地中で培養されてもよい。哺乳動物宿主細胞は様々な培地中で培養されてもよい。商業的に入手可能な培地、例えばHam F10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、Sigma)、RPMI 1640(Sigma)、およびダルベッコ改変イーグル培地((DMEM)、Sigma)は、宿主細胞を培養するために好適である。これらの培地のいずれも、ホルモンおよび/または他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子)、塩(例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩)、緩衝剤(例えばHEPES)、ヌクレオシド(例えばアデノシンおよびチミジン)、抗生物質、微量元素、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー供給源を必要に応じて補充され得る。任意の他の必要な補充物もまた、当業者に公知の適切な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば温度およびpHなどは、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されるものであり、当業者に明らかである。
細胞は、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または所望される配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改変された従来の栄養培地中で培養されてもよい。哺乳動物宿主細胞は様々な培地中で培養されてもよい。商業的に入手可能な培地、例えばHam F10(Sigma)、最小必須培地((MEM)、Sigma)、RPMI 1640(Sigma)、およびダルベッコ改変イーグル培地((DMEM)、Sigma)は、宿主細胞を培養するために好適である。これらの培地のいずれも、ホルモンおよび/または他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子)、塩(例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩)、緩衝剤(例えばHEPES)、ヌクレオシド(例えばアデノシンおよびチミジン)、抗生物質、微量元素、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー供給源を必要に応じて補充され得る。任意の他の必要な補充物もまた、当業者に公知の適切な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば温度およびpHなどは、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されるものであり、当業者に明らかである。
組換えタンパク質の回収:
組換えにより製造されたIL10R結合性分子ポリペプチドは、分泌リーダー配列が用いられる場合に分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収され得る。代替的に、IL10R結合性分子ポリペプチドはまた、宿主細胞溶解液から回収され得る。プロテアーゼ阻害剤、例えばフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)が、精製の間のタンパク質分解を阻害するために細胞溶解液からの回収フェーズの間に用いられてもよく、抗生物質が、外来性夾雑物の増殖を予防するために含められてもよい。
組換えにより製造されたIL10R結合性分子ポリペプチドは、分泌リーダー配列が用いられる場合に分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収され得る。代替的に、IL10R結合性分子ポリペプチドはまた、宿主細胞溶解液から回収され得る。プロテアーゼ阻害剤、例えばフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)が、精製の間のタンパク質分解を阻害するために細胞溶解液からの回収フェーズの間に用いられてもよく、抗生物質が、外来性夾雑物の増殖を予防するために含められてもよい。
様々な精製工程、例えばアフィニティークロマトグラフィーが当技術分野において公知であり、用途を有する。アフィニティークロマトグラフィーは、生物学的高分子中に通常存在する高度に特異的な結合部位を使用して、特定のリガンドに結合するそれらの能力において分子を分離する。共有結合は、リガンドをタンパク質試料に明白に提示する方式でリガンドを不溶性の、多孔性の支持媒体に取り付け、それにより、1つの分子種の天然の特異的な結合を使用して混合物から第2の種を分離および精製する。抗体は、アフィニティークロマトグラフィーにおいて一般的に使用される。サイズ選択工程もまた使用可能であり、例えばゲル濾過クロマトグラフィー(サイズ排除クロマトグラフィーまたはモレキュラーシーブクロマトグラフィーとしても公知)は、サイズにしたがってタンパク質を分離するために使用される。ゲル濾過において、タンパク質溶液は、半透性多孔性樹脂を充填されたカラムを通過させられる。半透性樹脂は、カラムで分離され得るタンパク質のサイズを決定する細孔径の範囲を有する。
形質転換された宿主による組換えによるIL10R結合性分子は、任意の好適な方法にしたがって精製され得る。組換えIL10R結合性分子は、大腸菌中に生成された封入体から、または所与のムテインを産生する哺乳動物もしくは酵母培養物からの条件培地から陽イオン交換、ゲル濾過、およびまたは逆相液体クロマトグラフィーを使用して単離され得る。実質的に精製された形態の組換えIL10R結合性分子は、常用の生化学的手順を使用して発現系から精製可能であり、例えば、本明細書に記載されるように、治療剤として使用され得る。
一部の態様において、IL10R結合性分子が上記で議論されている精製タグと共に発現される場合、この精製ハンドルは、細胞溶解液または細胞培地からのIL10R結合性分子の単離のために使用され得る。精製タグがキレート化ペプチドである場合、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを使用するそのような分子の単離の方法は当技術分野において周知である。例えば、Smith,et al.、米国特許第4,569,794号明細書を参照。
回収されたIL10R結合性分子の生物学的活性は、当技術分野において公知の任意の好適な方法により活性化についてアッセイ可能であり、実質的に精製された形態として、または分泌リーダー配列が発現のために用いられる場合に細胞溶解液もしくは細胞培地の部分として評価されてもよい。
薬学的製剤
一部の態様において、主題IL10R結合性分子(および/またはIL10R結合性分子をコードする核酸、もしくは核酸配列を組み込んでおり、IL10R結合性分子を発現するように改変されている組換え細胞)は、薬学的組成物を含む、組成物に組み込まれ得る。そのような組成物は、典型的には、ポリペプチドまたは核酸分子および薬学的に許容される担体を含む。薬学的組成物は、その意図される投与の経路と適合性であるように製剤化され、処置または予防を必要とする対象にIL10R結合性分子が投与される治療的使用と適合性である。
一部の態様において、主題IL10R結合性分子(および/またはIL10R結合性分子をコードする核酸、もしくは核酸配列を組み込んでおり、IL10R結合性分子を発現するように改変されている組換え細胞)は、薬学的組成物を含む、組成物に組み込まれ得る。そのような組成物は、典型的には、ポリペプチドまたは核酸分子および薬学的に許容される担体を含む。薬学的組成物は、その意図される投与の経路と適合性であるように製剤化され、処置または予防を必要とする対象にIL10R結合性分子が投与される治療的使用と適合性である。
担体:
担体は、無菌の希釈剤、例えば注射用の水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、ならびにこれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散体の場合には要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムの使用により維持することができる。静脈内投与のために、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Cremophor ELTM(BASF、Parsippany、N.J.)またはリン酸緩衝食塩水(PBS)を含む。
担体は、無菌の希釈剤、例えば注射用の水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、ならびにこれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散体の場合には要求される粒子サイズの維持により、および界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムの使用により維持することができる。静脈内投与のために、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、Cremophor ELTM(BASF、Parsippany、N.J.)またはリン酸緩衝食塩水(PBS)を含む。
緩衝剤:
緩衝剤という用語は、緩衝剤、例えば酢酸(塩)、クエン酸(塩)またはリン酸(塩)および張度の調整のための剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含む。pHは、酸または塩基、例えば一および/もしくは二塩基性リン酸ナトリウム、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて(例えば、約7.2~7.8、例えば、7.5のpHに)調整され得る。
緩衝剤という用語は、緩衝剤、例えば酢酸(塩)、クエン酸(塩)またはリン酸(塩)および張度の調整のための剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースを含む。pHは、酸または塩基、例えば一および/もしくは二塩基性リン酸ナトリウム、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて(例えば、約7.2~7.8、例えば、7.5のpHに)調整され得る。
分散体:
一般に、分散体は、基本的な分散媒体および上記に列記されるものからの要求される他の成分を含有する無菌媒体中に活性化合物を組み込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液の調製用の無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥およびフリーズドライであり、これは、活性成分と、以前に滅菌濾過されたその溶液からの任意の追加の所望の成分との粉末をもたらす。
一般に、分散体は、基本的な分散媒体および上記に列記されるものからの要求される他の成分を含有する無菌媒体中に活性化合物を組み込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液の調製用の無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥およびフリーズドライであり、これは、活性成分と、以前に滅菌濾過されたその溶液からの任意の追加の所望の成分との粉末をもたらす。
防腐剤:
対象への非経口投与用の薬学的製剤は無菌であるべきであり、容易な注射針通過性を促すために流体であるべきである。それは、生産および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、夾雑物から保護される。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン; 抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム; キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなどにより達成され得る。無菌の溶液は、要求に応じて、上記に列記される成分の1つまたは組合せと共に適切な溶媒中に要求される量の活性化合物を組み込み、続いて滅菌濾過することにより調製され得る。
対象への非経口投与用の薬学的製剤は無菌であるべきであり、容易な注射針通過性を促すために流体であるべきである。それは、生産および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、夾雑物から保護される。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン; 抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム; キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなどにより達成され得る。無菌の溶液は、要求に応じて、上記に列記される成分の1つまたは組合せと共に適切な溶媒中に要求される量の活性化合物を組み込み、続いて滅菌濾過することにより調製され得る。
張度剤:
多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。
多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。
投与の経路
本開示の治療方法の一部の態様は、IL10R結合性分子(および/またはIL10R結合性分子をコードする核酸またはIL10R結合性分子を発現する組換えにより改変された宿主細胞)を含む薬学的製剤の、処置を必要とする対象への投与を伴う。本開示のIL10R結合性分子を含む薬学的製剤は、処置または予防を必要とする対象に、非経口投与、経口、外用、または吸入経路を含む、様々な投与の経路により投与されてもよい。
本開示の治療方法の一部の態様は、IL10R結合性分子(および/またはIL10R結合性分子をコードする核酸またはIL10R結合性分子を発現する組換えにより改変された宿主細胞)を含む薬学的製剤の、処置を必要とする対象への投与を伴う。本開示のIL10R結合性分子を含む薬学的製剤は、処置または予防を必要とする対象に、非経口投与、経口、外用、または吸入経路を含む、様々な投与の経路により投与されてもよい。
非経口投与:
一部の態様において、本開示の方法は、IL10R結合性分子(および/またはIL10R結合性分子をコードする核酸またはIL10R結合性分子を発現する組換えにより改変された宿主細胞)を含む薬学的製剤の、処置を必要とする対象への非経口投与を伴う。非経口の投与の経路の例は、例えば、静脈内、皮内、皮下、経皮(外用)、経粘膜、および直腸投与を含む。非経口製剤は、非経口の適用のために使用される溶液または懸濁液を含み、媒体、担体および緩衝剤を含むことができる。非経口投与用の薬学的製剤は、無菌水性溶液(水溶性の場合)または分散体および無菌注射溶液または分散体の即席調製のための無菌粉末を含む。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作られたアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアル中に封入され得る。1つの態様において、製剤は、事前充填されたシリンジ中に提供される。
一部の態様において、本開示の方法は、IL10R結合性分子(および/またはIL10R結合性分子をコードする核酸またはIL10R結合性分子を発現する組換えにより改変された宿主細胞)を含む薬学的製剤の、処置を必要とする対象への非経口投与を伴う。非経口の投与の経路の例は、例えば、静脈内、皮内、皮下、経皮(外用)、経粘膜、および直腸投与を含む。非経口製剤は、非経口の適用のために使用される溶液または懸濁液を含み、媒体、担体および緩衝剤を含むことができる。非経口投与用の薬学的製剤は、無菌水性溶液(水溶性の場合)または分散体および無菌注射溶液または分散体の即席調製のための無菌粉末を含む。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックで作られたアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアル中に封入され得る。1つの態様において、製剤は、事前充填されたシリンジ中に提供される。
経口投与:
一部の態様において、本開示の方法は、IL10R結合性分子(および/またはIL10R結合性分子をコードする核酸またはIL10R結合性分子を発現する組換えにより改変された宿主細胞)を含む薬学的製剤の、処置を必要とする対象への経口投与を伴う。経口組成物が使用される場合、それは一般に不活性希釈剤または食用担体を含む。経口的な治療的投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に組込み可能であり、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての使用のために流体担体を使用して調製され得る。薬学的に適合性の結合剤、および/またはアジュバント材料が組成物の部分として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、およびトローチなどは、以下の成分、または類似した性質の化合物のいずれかを含有することができる:結合剤、例えば微結晶セルロース、ガムトラガカントもしくはゼラチン; 賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、Primogel(商標)、もしくはコーンスターチ; 滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはSterotes(商標); 滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素; 甘味剤、例えばスクロースもしくはサッカリン; または香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香味剤。
一部の態様において、本開示の方法は、IL10R結合性分子(および/またはIL10R結合性分子をコードする核酸またはIL10R結合性分子を発現する組換えにより改変された宿主細胞)を含む薬学的製剤の、処置を必要とする対象への経口投与を伴う。経口組成物が使用される場合、それは一般に不活性希釈剤または食用担体を含む。経口的な治療的投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤と共に組込み可能であり、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォッシュとしての使用のために流体担体を使用して調製され得る。薬学的に適合性の結合剤、および/またはアジュバント材料が組成物の部分として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、およびトローチなどは、以下の成分、または類似した性質の化合物のいずれかを含有することができる:結合剤、例えば微結晶セルロース、ガムトラガカントもしくはゼラチン; 賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、Primogel(商標)、もしくはコーンスターチ; 滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはSterotes(商標); 滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素; 甘味剤、例えばスクロースもしくはサッカリン; または香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香味剤。
吸入製剤:
一部の態様において、本開示の方法は、IL10R結合性分子(および/またはIL10R結合性分子をコードする核酸またはIL10R結合性分子を発現する組換えにより改変された宿主細胞)を含む薬学的製剤の、処置を必要とする対象への吸入投与を伴う。吸入による投与の場合、主題IL10R結合性分子、またはそれらをコードする核酸は、好適な噴射剤、例えば、ガス、例えば二酸化炭素を含有する加圧された容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。そのような方法は、米国特許第6,468,798号明細書に記載されるものを含む。
一部の態様において、本開示の方法は、IL10R結合性分子(および/またはIL10R結合性分子をコードする核酸またはIL10R結合性分子を発現する組換えにより改変された宿主細胞)を含む薬学的製剤の、処置を必要とする対象への吸入投与を伴う。吸入による投与の場合、主題IL10R結合性分子、またはそれらをコードする核酸は、好適な噴射剤、例えば、ガス、例えば二酸化炭素を含有する加圧された容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。そのような方法は、米国特許第6,468,798号明細書に記載されるものを含む。
粘膜および経皮製剤:
一部の態様において、本開示の方法は、IL10R結合性分子(および/またはIL10R結合性分子をコードする核酸またはIL10R結合性分子を発現する組換えにより改変された宿主細胞)を含む薬学的製剤の、処置を必要とする対象への粘膜または経皮投与を伴う。経粘膜または経皮投与のために、透過されるべき障壁にとって適切な浸透剤が製剤中で使用される。そのような浸透剤は当技術分野において一般に公知であり、例えば、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐剤坐剤(例えば、従来の坐剤基剤、例えばココアバターおよび他のグリセリドを用いたもの)または直腸送達用の保持浣腸の使用を通じて達成され得る。経皮投与のために、活性化合物は、当技術分野において一般に公知のように軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化され、また透過増強剤、例えばエタノールまたはラノリンを組み込んでもよい。
一部の態様において、本開示の方法は、IL10R結合性分子(および/またはIL10R結合性分子をコードする核酸またはIL10R結合性分子を発現する組換えにより改変された宿主細胞)を含む薬学的製剤の、処置を必要とする対象への粘膜または経皮投与を伴う。経粘膜または経皮投与のために、透過されるべき障壁にとって適切な浸透剤が製剤中で使用される。そのような浸透剤は当技術分野において一般に公知であり、例えば、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐剤坐剤(例えば、従来の坐剤基剤、例えばココアバターおよび他のグリセリドを用いたもの)または直腸送達用の保持浣腸の使用を通じて達成され得る。経皮投与のために、活性化合物は、当技術分野において一般に公知のように軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化され、また透過増強剤、例えばエタノールまたはラノリンを組み込んでもよい。
持続放出およびデポー製剤:
本開示の方法の一部の態様において、IL10R結合性分子は、処置を必要とする対象に、IL10R結合性分子剤の持続放出を提供するための製剤中で投与される。注射可能な組成物の持続放出製剤の例は、組成物中に吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによりもたらされ得る。1つの態様において、主題IL10R結合性分子または核酸は、身体からの急速な排除からIL10R結合性分子を保護する担体と共に調製され、これは例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤である。生分解性、生体適合性ポリマーが使用可能であり、これは例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸である。そのような製剤は、標準的な技術を使用して調製され得る。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals,Inc.から商業的に得られ得る。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞にターゲティングされたリポソームを含む)もまた、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号明細書に記載されるように、当業者に公知の方法にしたがって調製され得る。
本開示の方法の一部の態様において、IL10R結合性分子は、処置を必要とする対象に、IL10R結合性分子剤の持続放出を提供するための製剤中で投与される。注射可能な組成物の持続放出製剤の例は、組成物中に吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによりもたらされ得る。1つの態様において、主題IL10R結合性分子または核酸は、身体からの急速な排除からIL10R結合性分子を保護する担体と共に調製され、これは例えば、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤である。生分解性、生体適合性ポリマーが使用可能であり、これは例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸である。そのような製剤は、標準的な技術を使用して調製され得る。材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals,Inc.から商業的に得られ得る。リポソーム懸濁液(ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞にターゲティングされたリポソームを含む)もまた、薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号明細書に記載されるように、当業者に公知の方法にしたがって調製され得る。
IL10R結合性分子をコードする核酸の投与:
本開示の方法の一部の態様において、処置を必要とする対象へのIL10R結合性分子の送達は、IL10R結合性分子をコードする核酸の投与により達成される。対象へのIL10R結合性分子をコードする核酸の投与方法は、McCaffrey et al.(Nature(2002)418:6893)、Xia et al.(Nature Biotechnol.(2002)20:1006-1010)、またはPutnam(Am.J.Health Syst.Pharm.(1996)53:151-160、エラータムはAm.J.Health Syst.Pharm.(1996)53:325)に記載される方法を含むが、これらに限定されない当技術分野において公知の方法を使用してトランスフェクションまたは感染により達成される。一部の態様において、IL10R結合性分子は、哺乳動物対象において機能的な1つまたは複数の発現制御配列に機能的に連結されたIL10R結合性分子をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターの薬学的に許容される製剤の投与により対象に投与される。一部の態様において、特定の標的細胞型におけるIL10R結合性分子の選択的な発現を促すために限られた範囲の細胞型(または単一の細胞型)において機能的な発現制御配列が選択されてもよい。1つの態様において、組換え発現ベクターはウイルスベクターである。一部の態様において、組換えベクターは組換えウイルスベクターである。一部の態様において、組換えウイルスベクターは、組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)または組換えアデノウイルス(rAd)、特にヒトアデノウイルス血清型3および/または5に由来する複製欠損型アデノウイルスである。一部の態様において、複製欠損型アデノウイルスは、ヒト細胞において細胞周期および/またはアポトーシス経路を開始するウイルスの能力に干渉するE1領域に対する1つまたは複数の改変を有する。複製欠損型アデノウイルスベクターはE3ドメインにおける欠失を任意で含んでもよい。一部の態様において、アデノウイルスは複製コンピテントアデノウイルスである。一部の態様において、アデノウイルスは、標的細胞型において選択的に複製するように操作された複製コンピテント組換えウイルスである。
本開示の方法の一部の態様において、処置を必要とする対象へのIL10R結合性分子の送達は、IL10R結合性分子をコードする核酸の投与により達成される。対象へのIL10R結合性分子をコードする核酸の投与方法は、McCaffrey et al.(Nature(2002)418:6893)、Xia et al.(Nature Biotechnol.(2002)20:1006-1010)、またはPutnam(Am.J.Health Syst.Pharm.(1996)53:151-160、エラータムはAm.J.Health Syst.Pharm.(1996)53:325)に記載される方法を含むが、これらに限定されない当技術分野において公知の方法を使用してトランスフェクションまたは感染により達成される。一部の態様において、IL10R結合性分子は、哺乳動物対象において機能的な1つまたは複数の発現制御配列に機能的に連結されたIL10R結合性分子をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターの薬学的に許容される製剤の投与により対象に投与される。一部の態様において、特定の標的細胞型におけるIL10R結合性分子の選択的な発現を促すために限られた範囲の細胞型(または単一の細胞型)において機能的な発現制御配列が選択されてもよい。1つの態様において、組換え発現ベクターはウイルスベクターである。一部の態様において、組換えベクターは組換えウイルスベクターである。一部の態様において、組換えウイルスベクターは、組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)または組換えアデノウイルス(rAd)、特にヒトアデノウイルス血清型3および/または5に由来する複製欠損型アデノウイルスである。一部の態様において、複製欠損型アデノウイルスは、ヒト細胞において細胞周期および/またはアポトーシス経路を開始するウイルスの能力に干渉するE1領域に対する1つまたは複数の改変を有する。複製欠損型アデノウイルスベクターはE3ドメインにおける欠失を任意で含んでもよい。一部の態様において、アデノウイルスは複製コンピテントアデノウイルスである。一部の態様において、アデノウイルスは、標的細胞型において選択的に複製するように操作された複製コンピテント組換えウイルスである。
一部の態様において、特には対象へのIL10R結合性分子の投与のために、特には対象における腸管の疾患または細菌感染症の処置のために、IL10R結合性分子をコードする核酸は、IL10R結合性分子をコードする組換えにより改変されたバクテリオファージベクターの投与により対象に送達されてもよい。本明細書において使用される場合、「原核ウイルス」、「バクテリオファージ」および「ファージ」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、細菌に感染し、その中で複製する様々な細菌ウイルスのいずれかを記載する。バクテリオファージは原核細胞に選択的に感染し、哺乳動物細胞における発現を回避しながら対象において原核細胞にIL10R結合性分子の発現を制限する。広範囲の細菌細胞の選択が可能な多様なバクテリオファージが科学文献において大規模に同定および特徴付けされている。一部の態様において、ファージは、隣接モチーフ(PAM)を除去するために改変される。ファージゲノムからのCas9配列の排除は、IL10R結合性分子をコードする侵入性ファージを中和する標的原核細胞のCas9エンドヌクレアーゼの能力を低減させる。
IL10R結合性分子を発現する組換えにより改変された細胞の投与
本開示の方法の一部の態様において、処置を必要とする対象へのIL10R結合性分子の送達は、本明細書に記載される治療的および予防的応用において投与され得るIL10R結合性分子を発現するように改変された組換え宿主細胞の投与により達成される。一部の態様において、組換え宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。
本開示の方法の一部の態様において、処置を必要とする対象へのIL10R結合性分子の送達は、本明細書に記載される治療的および予防的応用において投与され得るIL10R結合性分子を発現するように改変された組換え宿主細胞の投与により達成される。一部の態様において、組換え宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。
一部の態様において、IL10R結合性分子をコードする核酸配列(またはそれを含むベクター)は、投与のための組換えにより改変された宿主細胞中で染色体外に維持されてもよい。他の態様において、IL10R結合性分子をコードする核酸配列は、細胞のゲノム配列への核酸配列の組込み挿入を促すために少なくとも1つのエンドヌクレアーゼを使用して、投与されるべき宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。本明細書において使用される場合、「エンドヌクレアーゼ」という用語は、DNAまたはRNA分子、好ましくはDNA分子内の核酸の間の結合の切断を触媒する能力を有する野生型またはバリアント酵素を指すために使用される。エンドヌクレアーゼは、そのようなエンドヌクレアーゼが約12塩基対(bp)の長さより長い、より好ましくは14~55bpのポリヌクレオチド認識部位を有する場合に、「希少切断性」エンドヌクレアーゼとして参照される。希少切断性エンドヌクレアーゼは、座位において遺伝子を不活性化するため、または相同組換え(HR)により、すなわち座位においてDNA二本鎖切断(DSB)を誘導し、遺伝子修復機構によりこの座位に外因性DNAを挿入することにより導入遺伝子を組み込むために使用され得る。希少切断性エンドヌクレアーゼの例は、ホーミングエンドヌクレアーゼ(Grizot,et al(2009)Nucleic Acids Research 37(16):5405-5419)、操作されたジンクフィンガードメインの融合の結果としてもたらされるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)(Porteus M and Carroll D.,Gene targeting using zinc finger nucleases(2005)Nature Biotechnology 23(3):967-973)、TALEN-ヌクレアーゼ、CRISPRシステムからのそのままのCas9エンドヌクレアーゼまたは拡張された配列特異性のための改変された制限エンドヌクレアーゼ(Eisenschmidt,et al.2005; 33(22):7039-7047)を含む。
一部の態様において、特には腸管へのIL10R結合性分子の投与のために、IL10R結合性分子は、組換えにより改変された原核細胞(例えば、ラクトバシラス・ラクチ(Lactobacillus lacti))により対象に送達されてもよい。腸管への組換えタンパク質の送達のための操作された原核細胞の使用は当技術分野において公知である。例えば、Lin,et al.(2017)Microb Cell Fact 16:148を参照。一部の態様において、IL10R結合性分子を発現する操作された細菌細胞は、典型的には水性懸濁液中で、経口的に、または直腸内(例えば浣腸)に投与されてもよい。
使用の方法
本開示はさらに、本開示のIL10R結合性分子(またはIL10R結合性分子をコードする組み換えウイルスを含むIL10R結合性分子をコードする核酸)の治療有効量の投与により疾患 障害または状態に罹患している対象を処置する方法を提供する。
本開示はさらに、本開示のIL10R結合性分子(またはIL10R結合性分子をコードする組み換えウイルスを含むIL10R結合性分子をコードする核酸)の治療有効量の投与により疾患 障害または状態に罹患している対象を処置する方法を提供する。
炎症性および自己免疫性障害
本開示のIL10R結合性分子(そのようなIL10R結合性分子をコードする組み換えウイルスを含む、IL10R結合性分子および/またはそれらをコードする核酸分子を含む薬学的に許容される製剤を含む)による処置に適した障害は、臓器拒絶反応、移植片対宿主病、自己免疫性甲状腺疾患、多発性硬化症、アレルギー、喘息、アルツハイマー病を含む神経変性疾患、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己炎症性疾患、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、1型または2型糖尿病を含む糖尿病、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、SEA症候群(血清陰性腱付着部症関節症症候群(Seronegativity Enthesopathy Arthropathy Syndrome)、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、SEA症候群(血清陰性腱付着部症関節症症候群(Seronegativity, Enthesopathy, Arthropathy Syndrome))を含むがこれらに限定されない、炎症性疾患または自己免疫疾患を含む。
本開示のIL10R結合性分子(そのようなIL10R結合性分子をコードする組み換えウイルスを含む、IL10R結合性分子および/またはそれらをコードする核酸分子を含む薬学的に許容される製剤を含む)による処置に適した障害は、臓器拒絶反応、移植片対宿主病、自己免疫性甲状腺疾患、多発性硬化症、アレルギー、喘息、アルツハイマー病を含む神経変性疾患、全身性エリテマトーデス(SLE)、自己炎症性疾患、炎症性腸疾患(IBD)、クローン病、1型または2型糖尿病を含む糖尿病、炎症、自己免疫疾患、アトピー性疾患、腫瘍随伴性自己免疫疾患、軟骨炎症、関節炎、関節リウマチ、若年性関節炎、若年性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、多関節型若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、若年性強直性脊椎炎、若年性腸炎性関節炎、若年性反応性関節炎、若年性ライター症候群、SEA症候群(血清陰性腱付着部症関節症症候群(Seronegativity Enthesopathy Arthropathy Syndrome)、若年性皮膚筋炎、若年性乾癬性関節炎、若年性強皮症、若年性全身性エリテマトーデス、若年性血管炎、小関節型関節リウマチ、多関節型関節リウマチ、全身型関節リウマチ、強直性脊椎炎、腸炎性関節炎、反応性関節炎、ライター症候群、SEA症候群(血清陰性腱付着部症関節症症候群(Seronegativity, Enthesopathy, Arthropathy Syndrome))を含むがこれらに限定されない、炎症性疾患または自己免疫疾患を含む。
本開示のIL10R結合性分子(そのようなIL10R結合性分子をコードする組み換えウイルスを含む、IL10R結合性分子および/またはそれらをコードする核酸分子を含む薬学的に許容される製剤を含む)による処置に適した増殖性および/または分化性障害の他の例としては、皮膚障害が挙げられるが、これに限定されることはない。皮膚障害は、真皮層、表皮層もしくは下皮層における細胞もしくは細胞群の異常な活性、または真皮-表皮接合部における異常を伴いうる。例えば、皮膚障害は、ケラチノサイト(例えば、過増殖性基底ケラチノサイトおよび直上基底(immediately suprabasal)ケラチノサイト)、メラノサイト、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、免疫細胞、ならびに表皮層、例えば、基底層(胚芽層(stratum germinativum))、有棘層、顆粒層、透明層または角質層の1つまたは複数において見られる他の細胞の異常な活性を伴いうる。他の態様において、障害は、真皮層、例えば、乳頭層または網状層に見られる真皮細胞、例えば、真皮内皮、線維芽細胞、免疫細胞(例えば、肥満細胞またはマクロファージ)の異常な活性を伴いうる。
炎症性または自己免疫性の皮膚障害の例としては、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎(湿疹)、例えば、剥離性皮膚炎またはアトピー性皮膚炎、毛孔性紅色粃糠疹、ばら色粃糠疹、類乾癬、苔癬状粃糠疹、扁平苔癬、光沢苔癬、魚鱗癬様皮膚炎、角皮症、皮膚疾患、円形脱毛症、壊疽性膿皮症、白斑、類天疱瘡(例えば、眼部瘢痕性類天疱瘡または水疱性類天疱瘡)、蕁麻疹、汗孔角化症、関節包を裏打ちする上皮関連細胞の過剰増殖および炎症を伴う関節リウマチ、脂漏性皮膚炎および日光皮膚炎などの皮膚炎、脂漏性角化症、老人性角化症、光線性角化症、光線誘発性角化症および毛包性角化症などの角化症、尋常性ざ瘡、ケロイドおよびケロイド形成に対する予防、母斑、いぼ、コンジローマまたは尖圭コンジローマを含む疣贅、および性器疣贅などのヒト乳頭腫ウイルス(HPV)感染、白板症、扁平苔癬、ならびに角膜炎が挙げられる。皮膚障害は皮膚炎、例えば、アトピー性皮膚炎もしくはアレルギー性皮膚炎、または乾癬であることができる。
本開示の組成物(そのようなIL10R結合性分子をコードする組み換えウイルスを含む、IL10R結合性分子および/またはそれらをコードする核酸分子を含む薬学的に許容される製剤を含む)は、乾癬または乾癬性障害に罹患している(または罹患しうる)患者に投与することもできる。「乾癬」という用語は、その医学的な意味、すなわち、主に皮膚を侵し、隆起し、肥厚し、鱗屑のある、傷のない病変を生じさせる疾患を有することを意図する。この病変は、通常、重なり合った光沢のある鱗屑で覆われた、境界が鮮明な紅斑性丘疹である。鱗屑は、通常、銀色またはわずかに不透明である。爪の関与が頻繁に起こり、その結果、孔食、爪の剥離、肥厚および変色が起こる。乾癬は関節炎を伴うこともあり、身体を不自由にさせることもある。ケラチノサイトの過剰増殖は、表皮の炎症およびケラチノサイトの分化の低下とともに、乾癬性表皮過形成の主要な特徴である。乾癬を特徴付けるケラチノサイト過剰増殖を説明するために、複数の機構が引き合いに出されてきた。また、細胞性免疫の異常も乾癬の病態に関与していると考えられている。乾癬性障害の例としては、慢性定常性乾癬、尋常性乾癬、中度から重度の尋常性乾癬、尋常性乾癬、発疹性乾癬、乾癬性紅皮症、汎発性膿疱性乾癬、環状膿疱性乾癬、または限局性膿疱性乾癬が挙げられる。
新生物性疾患の処置
本開示は、本明細書において記述されるIL10R結合性分子(またはIL10R結合性分子をコードする組み換えベクターを含むIL10R結合性分子をコードする核酸)の治療有効量の投与による新生物性疾患障害または状態に罹患している対象の処置におけるIL10R結合性分子の使用の方法を提供する。
本開示は、本明細書において記述されるIL10R結合性分子(またはIL10R結合性分子をコードする組み換えベクターを含むIL10R結合性分子をコードする核酸)の治療有効量の投与による新生物性疾患障害または状態に罹患している対象の処置におけるIL10R結合性分子の使用の方法を提供する。
本開示の組成物および方法は、良性および悪性の新生物および新生物性疾患を含む、新生物の存在によって特徴付けられる新生物性疾患を患っている対象の処置において有用である。
本開示の組成物および方法を使用する処置に適している良性新生物の例としては、腺腫、線維腫、血管腫、および脂肪腫が挙げられるが、これらに限定されることはない。本開示の組成物および方法を使用する処置に適している前悪性新生物の例としては、過形成、異型、化生、および異形成が挙げられるが、これらに限定されることはない。本開示の組成物および方法を使用する処置に適している悪性新生物の例としては、癌(皮膚などの上皮組織または内臓を覆う組織から発生するがん)、白血病、リンパ腫、および典型的には骨脂、筋肉、血管、または結合組織に由来する肉腫が挙げられるが、これらに限定されることはない。新生物という用語には、疣贅などのウイルス誘導新生物およびEBV誘導疾患(すなわち、伝染性単核症)、瘢痕形成、内膜平滑筋細胞過形成、再狭窄、血管閉塞などを含む過剰増殖性血管疾患も含まれる。
「新生物性疾患」という用語は、乳がん、肉腫(骨肉腫および血管肉腫および線維肉腫を含むが、これらに限定されることはない)、白血病、リンパ腫、尿生殖器がん(卵巣、尿道、膀胱、および前立腺がんを含むが、これらに限定されることはない)、胃腸がん(結腸、食道および胃がんを含むが、これらに限定されることはない)、肺がん、骨髄腫、膵臓がん、肝臓がん、腎臓がん、内分泌がん、皮膚がん、ならびに神経膠腫および神経芽腫、星細胞腫、骨髄異形成障害を含む脳または中枢神経系(CNS)および末梢神経系腫瘍、悪性または良性、子宮頸部上皮内癌、腸ポリポーシス、口腔白板症、組織球症、ケロイド瘢痕を含む過剰増殖性瘢痕、血管腫、過剰増殖性動脈狭窄、乾癬、炎症性関節炎、関節炎を含む過角化症および丘疹落屑型発疹を含むが、これらに限定されない固形腫瘍および非固形腫瘍によって特徴付けられるがんを含む。
新生物性疾患という用語は、癌を含む。「癌」という用語は、呼吸器系癌、消化器系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、および黒色腫を含む、上皮または内分泌組織の悪性疾患をいう。新生物性疾患という用語は、腺癌を含む。「腺癌」は、腺組織に由来する、または腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成する癌をいう。
本明細書において用いられる場合、「造血新生物障害」という用語は、造血起源の、例えば、骨髄、リンパもしくは赤血球系列、またはその前駆細胞から生じる、過形成/新生細胞を伴う新生物性疾患をいう。
骨髄系新生物は、骨髄増殖性新生物、好酸球増加を伴う骨髄性およびリンパ性障害、骨髄増殖性/骨髄異形成新生物、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病および関連する前駆細胞性新生物、ならびに分化系統不明瞭な急性白血病を含むが、これらに限定されることはない。本開示による処置に適している例示的な骨髄系障害は、急性前骨髄球性白血病(APML)、急性骨髄性白血病(AML)および慢性骨髄性白血病(CML)を含むが、これらに限定されることはない。
リンパ系新生物は、前駆リンパ系腫瘍、成熟B細胞新生物、成熟T細胞新生物、ホジキンリンパ腫、および免疫不全関連リンパ増殖性障害を含むが、これらに限定されることはない。本開示による処置に適している例示的なリンパ障害は、B細胞性急性リンパ芽球性白血病(ALL)およびT細胞性ALLを含む急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、前リンパ性白血病(PLL)、有毛細胞白血病(HLL)ならびにワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症(WM)を含むが、これらに限定されることはない。
場合によっては、造血新生物障害は、低分化急性白血病(例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病)に起因する。本明細書において用いられる場合、「造血新生物障害」という用語は、非ホジキンリンパ腫およびそのバリアント、末梢T細胞性リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、大型顆粒リンパ球性白血病(LGF)、ホジキン病およびリード-ステルンベルグ病を含むが、これらに限定されない悪性リンパ腫をいう。
対象が「新生物性疾患を患っている」かどうかの判定は、X線、CTスキャン、従来の臨床診断検査(例えば血球算定など)、ゲノムデータ、タンパク質発現データ、免疫組織化学を含むが、これらに限定されない、疾患、障害、または状態を特定するための分野で受け入れられている入手可能な情報に基づき、医師が対象に関して行う、対象が処置を必要とするまたは処置から恩恵を受けるであろうという判定をいう。
適応免疫系は、腫瘍突然変異に応答してある特定の細胞表面タンパク質の提示を認識して新生物性細胞の認識および排除を促す。より高い腫瘍突然変異負荷(TMB)を有する腫瘍は、そのような「腫瘍抗原」を呈する可能性がより高い。実際に、高い腫瘍突然変異負荷を呈する新生物性細胞を含む腫瘍は、免疫チェックポイント遮断を含む、免疫療法に応答する可能性がより高いことを臨床的な経験は示している(Rizvi,et al.(2015)Science 348(6230):124-128; Marabelle,et al.(2020)Lancet Oncol 21(10):1353-1365)。腫瘍突然変異負荷は、免疫療法、例えば本開示において提供されるものに対する増加した感受性を有する腫瘍を同定するためのバイオマーカーとして有用である。
一部の態様において、本開示の組成物および方法は、中等度のまたは高い腫瘍突然変異負荷(TMB)を呈する固形腫瘍の形成と関連付けられる新生物性疾患の処置において有用である。一部の態様において、本開示の組成物および組成物および方法は、中等度のまたは高い腫瘍突然変異負荷(TMB)を呈する免疫感受性固形腫瘍の処置において有用である。本開示の組成物および方法での処置に適する中等度のまたは高い腫瘍突然変異負荷を有する固形腫瘍の形成と関連付けられる新生物性疾患の例は、非小細胞肺がんおよび腎臓細胞がんを含むが、これらに限定されない。1つの態様において、組成物および方法は、中等度のまたは高いTMBを呈する非小細胞肺がん(NSCLC)の処置において有用である。NSCLC細胞は典型的には有意な数の突然変異を宿し、したがって免疫療法に対してより感受性である。NSCLCに対する現行の標準治療は、がんを開始させる機序により層化されており、一般にNCCNまたはASCOの推奨に従う。NSCLCの高い割合は増加したTMBを有し、したがって最初に免疫療法に対してより感受性である。しかしながら、ほとんどの腫瘍は免疫チェックポイント阻害において最終的に再発する。再発した腫瘍を有する患者は、典型的には、免疫チェックポイント阻害の前の病変と比較して腫瘍におけるT細胞浸潤の低減、全身性のT細胞疲弊および免疫応答の抑制を示す。したがって、疲弊した、希少な腫瘍浸潤性T細胞を再活性化および拡大増殖する改善された免疫療法が要求される。
補充的な治療剤とのIL10R結合性分子の組合せ:
本開示は、1つまたは複数の追加の活性剤(「補充的な剤」)と組み合わせた本開示のIL10R結合性分子の使用を提供する。そのようなさらなる組合せは、交換可能に「補充的な組合せ」または「補充的な併用療法」として参照され、本開示のIL10R結合性分子と組み合わせて使用される治療剤は「補充的な剤」として参照される。本明細書において使用される場合、「補充的な剤」という用語は、別々に投与または導入され得る、例えば、別々の投与(例えば、キットにおいて提供され得る)および/またはhIL10R結合性分子と組み合わせて投与もしくは導入され得る療法のために別々に製剤化され得る剤を含む。
本開示は、1つまたは複数の追加の活性剤(「補充的な剤」)と組み合わせた本開示のIL10R結合性分子の使用を提供する。そのようなさらなる組合せは、交換可能に「補充的な組合せ」または「補充的な併用療法」として参照され、本開示のIL10R結合性分子と組み合わせて使用される治療剤は「補充的な剤」として参照される。本明細書において使用される場合、「補充的な剤」という用語は、別々に投与または導入され得る、例えば、別々の投与(例えば、キットにおいて提供され得る)および/またはhIL10R結合性分子と組み合わせて投与もしくは導入され得る療法のために別々に製剤化され得る剤を含む。
本明細書において使用される場合、対象への複数の剤の投与への言及において使用される場合の「と組み合わせて」という用語は、対象への少なくとも1つの追加(すなわち第2、第3、第4、第5など)の剤との第1の剤の投与を指す。本発明の目的のために、1つの剤(例えば、hIL10R結合性分子)は、第1の剤および第2の剤の治療効果がオーバーラップするように第1の剤の投与の結果としてもたらされる生物学的効果が第2の剤の投与の時点に対象において持続する場合に、第2の剤(例えば、免疫チェックポイント経路のモジュレーター)と組み合わせて投与されると考えられる。例えば、本開示のhIL10R結合性分子が典型的にはより頻繁に、例えば、1日毎に、BIDで、または週毎に投与されながら、PD1免疫チェックポイント阻害剤(例えば、ニボルマブまたはペムブロリズマブ)は典型的にはIV注入により2週毎または3週毎に投与される。しかしながら、第1の剤(例えば、ペムブロリズマブ)の投与は、延長された時間にかけて治療効果を提供し、および第2の剤(例えば、hIL10R結合性分子)の投与は、第1の剤の治療効果が依然として進行中である間にその治療効果を提供し、その結果、第1の剤は第2の剤の投与の時点から有意に遠く離れた(例えば、日または週)時点において投与されていたとしても、第2の剤は第1の剤と組み合わせて投与されると考えられる。1つの態様において、第1および第2の剤が同時に(互いの30分以内に)、同期間にまたは逐次的に投与される場合に、1つの剤は第2の剤と組み合わせて投与されると考えられる。一部の態様において、第1および第2の剤が互いの約24時間以内に、好ましくは互いの約12時間以内に、好ましくは互いの約6時間以内に、好ましくは互いの約2時間以内に、または好ましくは互いの約30分以内に投与される場合に、第1の剤は第2の剤と「同期間」に投与されるとみなされる。「と組み合わせて」という用語はまた、第1の剤および第2の剤が単一の薬学的に許容される製剤中に共製剤化され、共製剤が対象に投与される状況に適用されることが理解される。ある特定の態様において、hIL10R結合性分子および補充的な剤は逐次的に投与または適用され、例えば、1つの剤は1つまたは複数の他の剤の前に投与される。他の態様において、hIL10R結合性分子および補充的な剤は同時に投与され、例えば、2つまたはより多くの剤は同じまたはおおよそ同じ時点において投与され; 2つまたはより多くの剤は2つもしくはより多くの別々の製剤中に存在し得るか、または単一の製剤(すなわち、共製剤)に組み合わせられ得る。剤が逐次的に投与されるのか、または同時に投与されるのかにかかわらず、それらは本開示の目的のために組合せで投与されると考えられる。
最適なコンビナトリアル療法の確立:
さらなる態様は、組合せでの剤の最適な量を決定するための方法またはモデルを含む。最適な量は、例えば、対象もしくは対象集団において最適な効果を達成する量、または剤の1つもしくは複数と関連付けられる有害効果を最小化もしくは排除しながら治療効果を達成する量であることができる。一部の態様において、方法は、hIL10R結合性分子と、対象(例えば、ヒト)または対象集団における本明細書に記載される疾患、障害または状態(例えば、がん性状態)の処置または予防において有効であることが既知であるか、またはそのように決定されている補助的な剤との組合せを伴い、1つの剤の量は、他の剤の量が一定に保持されながら滴定される。この方式において剤の量をマニピュレートすることにより、臨床医は、例えば、特定の疾患、障害もしくは状態を処置するため、または有害効果を排除するか、もしくは状況下で許容されるように有害効果を低減させるために最も有効な剤の比を決定することができる。
さらなる態様は、組合せでの剤の最適な量を決定するための方法またはモデルを含む。最適な量は、例えば、対象もしくは対象集団において最適な効果を達成する量、または剤の1つもしくは複数と関連付けられる有害効果を最小化もしくは排除しながら治療効果を達成する量であることができる。一部の態様において、方法は、hIL10R結合性分子と、対象(例えば、ヒト)または対象集団における本明細書に記載される疾患、障害または状態(例えば、がん性状態)の処置または予防において有効であることが既知であるか、またはそのように決定されている補助的な剤との組合せを伴い、1つの剤の量は、他の剤の量が一定に保持されながら滴定される。この方式において剤の量をマニピュレートすることにより、臨床医は、例えば、特定の疾患、障害もしくは状態を処置するため、または有害効果を排除するか、もしくは状況下で許容されるように有害効果を低減させるために最も有効な剤の比を決定することができる。
炎症性または自己免疫障害の処置において有用な補助的な剤
一部の態様において、方法は、コルチコステロイド、ヤヌスキナーゼ阻害剤、カルシニューリン阻害剤、mTor阻害剤、IMDH阻害剤、生物製剤、ワクチン、および治療抗体からなる群より選択される1つまたは複数の補充的な剤と組み合わせて本開示のIL10R結合性分子を投与することをさらに含む。ある特定の態様において、治療抗体は、BLyS、CD11a、CD20、CD25、CD3、CD52、IgEIL12/IL23、IL17a、IL1β、IL4Rα、IL5、IL6R、インテグリン-α4β7、RANKL、TNFα、VEGF-A、およびVLA-4からなる群より選択されるタンパク質に結合する抗体である。
一部の態様において、方法は、コルチコステロイド、ヤヌスキナーゼ阻害剤、カルシニューリン阻害剤、mTor阻害剤、IMDH阻害剤、生物製剤、ワクチン、および治療抗体からなる群より選択される1つまたは複数の補充的な剤と組み合わせて本開示のIL10R結合性分子を投与することをさらに含む。ある特定の態様において、治療抗体は、BLyS、CD11a、CD20、CD25、CD3、CD52、IgEIL12/IL23、IL17a、IL1β、IL4Rα、IL5、IL6R、インテグリン-α4β7、RANKL、TNFα、VEGF-A、およびVLA-4からなる群より選択されるタンパク質に結合する抗体である。
一部の態様において、補充的な剤は、コルチコステロイド(プレドニゾン、ブデソニド、プレドニゾンを含むが、これらに限定されない)、ヤヌスキナーゼ阻害剤(トファシチニブ(Xeljanz(登録商標))を含むが、これに限定されない)、カルシニューリン阻害剤(シクロスポリンおよびタクロリムスを含むが、これらに限定されない)、mTor阻害剤(シロリムスおよびエベロリムスを含むが、これらに限定されない)、IMDH阻害剤(アザチオプリン、レフルノミドおよびミコフェノレートを含むが、これらに限定されない)、生物製剤、例えばアバタセプト(Orencia(登録商標))またはエタネルセプト(Enbrel(登録商標))、ならびに治療抗体からなる群より選択される1つまたは複数の剤である。
自己免疫疾患の処置において本開示のIL10R結合性分子と組み合わせて補充的な剤として投与され得る治療抗体の例は、抗CD25抗体(例えばダクリズマブおよびバシリキシマブ)、抗VLA-4抗体(例えばナタリズマブ)、抗CD52抗体(例えばアレムツズマブ)、抗CD20抗体(例えばリツキシマブ、オクレリズマブ)、抗TNF抗体(例えばインフリキシマブ、およびアダリムマブ)、抗IL6R抗体(例えばトシリズマブ)、抗TNFα抗体(例えばアダリムマブ(Humira(登録商標))、ゴリムマブ、およびインフリキシマブ)、抗インテグリン-α4β7抗体(例えばベドリズマブ)、抗IL17a抗体(例えばブロダルマブまたはセクキヌマブ)、抗IL4Rα抗体(例えばデュピルマブ)、抗RANKL抗体、IL6R抗体、抗IL1β抗体(例えばカナキヌマブ)、抗CD11a抗体(例えばエファリズマブ)、抗CD3抗体(例えばムロモナブ)、抗IL5抗体(例えばメポリズマブ、レスリズマブ)、抗BLyS抗体(例えばベリムマブ); ならびに抗IL12/IL23抗体(例えばウステキヌマブ)を含むがこれらに限定されない。多くの治療抗体が自己免疫疾患に対する臨床使用のために承認されている。指し示される自己免疫疾患の処置のために本開示のIL10R結合性分子と組み合わせた補充的な剤(および任意で追加の補充的な剤)として投与され得る自己免疫疾患を患う対象におけるその処置における使用のためにthe United States Food and Drug Administration(FDA)により承認されている抗体の例は、アテゾリズマブ、オララツマブ、イキセキズマブ、トラスツズマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、エドレコロマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、ネシツムマブ、ジヌツキシマブ、ニボルマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブベドチン、イピリムマブ、オファツムマブ、セルトリズマブ-ペゴル、カツマキソマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、ラムシルマブ、シルツキシマブ、エンホルツマブ・ベドチン、ポラツズマブ・ベドチン、[fam]-トラスツズマブ・デルクステカン、セミプリマブ、モキセツモマブ・パスドトクス、モガムリズマブ、チルドラキズマブ、イバリズマブ、デュルバルマブ、イノツズマブ、オゾガマイシン、アベルマブ、オビヌツズマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、セツキシマブ、トシツモマブ-I131、イブリツモマブチウキセタン、ゲムツズマブ、およびオゾガマイシンを含むがこれらに限定されない。
本開示の方法の実施において補充的な剤として有用な以上の抗体は、単独でまたは抗体、リンカー、および1つもしくは複数の薬物(例えば1、2、3、4、5、6、7、もしくは8個の薬物)を含む任意の抗体薬物コンジュゲート(ADC)の形態でまたは改変された形態(例えばPEG化されたもの)で投与されてもよい。
新生物性疾患の処置に有用な補助作用物質:
いくつかの態様において、補助作用物質は化学療法剤である。いくつかの態様において、補助作用物質は複数の化学療法剤の「カクテル」である。いくつかの態様において、化学療法剤またはカクテルは、1つまたは複数の物理的方法(例えば放射線療法)と組み合わせて投与される。「化学療法剤」という用語は、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド; アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン; アジリジン、例えばベンゾデパ、カルボコン、メツレデパおよびウレデパ; アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン(methylamelamine); ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード; ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン; 抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシンA2などのブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン、カミノマイシン(caminomycin)、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンおよびデメトキシ-ダウノマイシン、11-デオキシダウノルビシン、13-デオキシダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシンなどの誘導体、マルセロマイシン、マイトマイシンC、N-メチルマイトマイシンCなどのマイトマイシン; ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン; 代謝拮抗物質、例えばメトトレキサートおよび5-フルオロウラシル(5-FU); 葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキセート、ジデアザテトラヒドロ葉酸、およびフォリン酸; プリン類似体、例えばフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン; ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジン、5-FU; アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン; 抗副腎薬(anti-adrenal)、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン; 葉酸補充物、例えばフロリン酸; アセグラトン; アルドホスファミドグリコシド; アミノレブリン酸; アムサクリン; ベストラブシル; ビサントレン; エダトレキセート; デフォファミン(defofamine); デメコルシン; ジアジクオン; エフロルニチン; 酢酸エリプチニウム; エトグルシド; 硝酸ガリウム; ヒドロキシ尿素; レンチナン; ロニダミン; ミトグアゾン; ミトキサントロン; モピダモール; ニトラクリン; ペントスタチン; フェナメット; ピラルビシン; ポドフィリン酸; 2-エチルヒドラジド; プロカルバジン; ラゾキサン; シゾフィラン; スピロゲルマニウム; テヌアゾン酸; トリアジコン; 2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン; ウレタン; ビンデシン; ダカルバジン; マンノムスチン; ミトブロニトール; ミトラクトール; ピポブロマン; ガシトシン; アラビノシド(Ara-C); シクロホスファミド; チオテパ; タキソイド、例えばパクリタキセル、nab-パクリタキセルおよびドキセタキセル; クロラムブシル; ゲムシタビン; 6-チオグアニン; メルカプトプリン; メトトレキサート; 白金および白金配位化合物、例えばシスプラチン、オキサプラチン(oxaplatin)およびカルボプラチン; ビンブラスチン; エトポシド(VP-16); イホスファミド; マイトマイシンC; ミトキサントロン; ビンクリスチン; ビノレルビン; ナベルビン; ノバントロン; テニポシド; ダウノマイシン; アミノプテリン; ゼローダ; イバンドロネート; CPT11; トポイソメラーゼ阻害剤; ジフルオロメチルオルニチン(DMFO); レチノイン酸; エスペラミシン; カペシタビン; タキサン、例えばパクリタキセル、ドセタキセル、カルバジタキセル; カルミノマイシン、アドリアマイシン、例えば4'-エピアドリアマイシン、4-アドリアマイシン-14-ベンゾエート、アドリアマイシン-14-オクタノエート、アドリアマイシン-14-ナフタレンアセテート; コルヒチンならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含むが、これらに限定されることはない。
いくつかの態様において、補助作用物質は化学療法剤である。いくつかの態様において、補助作用物質は複数の化学療法剤の「カクテル」である。いくつかの態様において、化学療法剤またはカクテルは、1つまたは複数の物理的方法(例えば放射線療法)と組み合わせて投与される。「化学療法剤」という用語は、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド; アルキルスルホネート、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン; アジリジン、例えばベンゾデパ、カルボコン、メツレデパおよびウレデパ; アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン(methylamelamine); ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード; ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン; 抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシンA2などのブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン、カミノマイシン(caminomycin)、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンおよびデメトキシ-ダウノマイシン、11-デオキシダウノルビシン、13-デオキシダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシンなどの誘導体、マルセロマイシン、マイトマイシンC、N-メチルマイトマイシンCなどのマイトマイシン; ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン; 代謝拮抗物質、例えばメトトレキサートおよび5-フルオロウラシル(5-FU); 葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキセート、ジデアザテトラヒドロ葉酸、およびフォリン酸; プリン類似体、例えばフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン; ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジン、5-FU; アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン; 抗副腎薬(anti-adrenal)、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン; 葉酸補充物、例えばフロリン酸; アセグラトン; アルドホスファミドグリコシド; アミノレブリン酸; アムサクリン; ベストラブシル; ビサントレン; エダトレキセート; デフォファミン(defofamine); デメコルシン; ジアジクオン; エフロルニチン; 酢酸エリプチニウム; エトグルシド; 硝酸ガリウム; ヒドロキシ尿素; レンチナン; ロニダミン; ミトグアゾン; ミトキサントロン; モピダモール; ニトラクリン; ペントスタチン; フェナメット; ピラルビシン; ポドフィリン酸; 2-エチルヒドラジド; プロカルバジン; ラゾキサン; シゾフィラン; スピロゲルマニウム; テヌアゾン酸; トリアジコン; 2,2',2"-トリクロロトリエチルアミン; ウレタン; ビンデシン; ダカルバジン; マンノムスチン; ミトブロニトール; ミトラクトール; ピポブロマン; ガシトシン; アラビノシド(Ara-C); シクロホスファミド; チオテパ; タキソイド、例えばパクリタキセル、nab-パクリタキセルおよびドキセタキセル; クロラムブシル; ゲムシタビン; 6-チオグアニン; メルカプトプリン; メトトレキサート; 白金および白金配位化合物、例えばシスプラチン、オキサプラチン(oxaplatin)およびカルボプラチン; ビンブラスチン; エトポシド(VP-16); イホスファミド; マイトマイシンC; ミトキサントロン; ビンクリスチン; ビノレルビン; ナベルビン; ノバントロン; テニポシド; ダウノマイシン; アミノプテリン; ゼローダ; イバンドロネート; CPT11; トポイソメラーゼ阻害剤; ジフルオロメチルオルニチン(DMFO); レチノイン酸; エスペラミシン; カペシタビン; タキサン、例えばパクリタキセル、ドセタキセル、カルバジタキセル; カルミノマイシン、アドリアマイシン、例えば4'-エピアドリアマイシン、4-アドリアマイシン-14-ベンゾエート、アドリアマイシン-14-オクタノエート、アドリアマイシン-14-ナフタレンアセテート; コルヒチンならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含むが、これらに限定されることはない。
「化学療法剤」という用語はまた、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、オナプリストンおよびトレミフェンを含む抗エストロゲン薬; ならびに抗アンドロゲン薬、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリン; ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体などの、腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤を含む。
いくつかの態様において、補助作用物質は、TAC、FOLFOX、TPC、FEC、ADE、FOLFOX-6、EPOCH、CHOP、CMF、CVP、BEP、OFF、FLOX、CVD、TC、FOLFIRI、PCV、FOLFOXIRI、ICE-V、XELOX、および当技術分野における熟練の臨床家によって容易に認識されるその他を含むが、これらに限定されない公知の化学療法治療レジメンに実践されるような、サイトカインまたはサイトカインアンタゴニスト、例えばIL-12、INFα、または抗上皮増殖因子受容体、イリノテカン; テトラヒドロ葉酸代謝拮抗薬、例えばペメトレキセド; 腫瘍抗原に対する抗体、モノクローナル抗体と毒素との複合体、T細胞アジュバント、骨髄移植片、または抗原提示細胞(例えば樹状細胞療法)、抗腫瘍ワクチン、複製可能なウイルス、シグナル伝達阻害剤(例えば、グリベック(Gleevec) (登録商標)もしくはハーセプチン(Herceptin) (登録商標))または腫瘍成長の相加的もしくは相乗的抑制を達成するための免疫調節因子、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、シクロオキシゲナーゼ-2 (COX-2)阻害剤、ステロイド、TNFアンタゴニスト(例えば、レミケード(Remicade) (登録商標)およびエンブレル(Enbrel) (登録商標))、インターフェロン-β1a (アボネックス(Avonex) (登録商標))、およびインターフェロン-β1b (ベタセロン(Betaseron) (登録商標))のみならず、前記の1つまたは複数の組み合わせを含むが、これらに限定されない、新生物性疾患の治療に有用であると当技術分野において同定された1つまたは複数の化学作用物質または生物学的作用物質である。
いくつかの態様において、IL10R結合性分子は、BRAF/MEK阻害剤、キナーゼ阻害剤、例えばスニチニブ、PARP阻害剤、例えばオラパリブ、EGFR阻害剤、例えばオシメルチニブ(Ahn, et al. (2016) J Thorac Oncol 11:S115)、IDO阻害剤、例えばエパカドスタット、および腫瘍溶解性ウイルス、例えばタリモジーン-ラハーパレプベック(T-VEC)と組み合わせて投与される。
いくつかの態様において、「補助作用物質」は治療用抗体である(二重特異性T細胞誘導抗体(BITE)、二重親和性リターゲティング(DART)構築体、および三重特異性キラーエンゲージャ(TriKE)構築体を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数の腫瘍関連抗原に結合する二重特異性および三重特異性抗体を含む)。
いくつかの態様において、治療用抗体は、HER2 (例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ado-トラスツズマブ エムタンシン)、ネクチン-4 (例えばエンホルツマブ)、CD79 (例えばポラツズマブ ベドチン)、CTLA4 (例えばイピリムマブ)、CD22 (例えばモキセツモマブ パスドトクス)、CCR4 (例えばモガムリズマブ)、IL23p19 (例えばチルドラキズマブ)、PDL1 (例えばデュルバルマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ)、IL17a (例えばイキセキズマブ)、CD38 (例えばダラツムマブ)、SLAMF7 (例えばエロツズマブ)、CD20 (例えば、リツキシマブ、トシツモマブ、イビリツモマブおよびオファツムマブ)、CD30 (例えばブレンツキシマブ ベドチン)、CD33 (例えばゲムツズマブオゾガマイシン)、CD52 (例えばアレムツズマブ)、EpCam、CEA、fpA33、TAG-72、CAIX、PSMA、PSA、葉酸結合性タンパク質、GD2 (例えばジヌツキシマブ)、GD3、IL6 (例えばシルツキシマブ)、GM2、Ley、VEGF (例えばベバシズマブ)、VEGFR、VEGFR2 (例えばラムシルマブ)、PDGFR□(例えばオファツムマブ(olartumumab))、EGFR (例えば、セツキシマブ、パニツムマブおよびネシツムマブ)、ERBB2 (例えばトラスツズマブ)、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAIL R1、TRAIL R2、RANKL RAP、テネイシン、インテグリンαVβ3、およびインテグリンα4β1からなる群より選択される少なくとも1つの腫瘍抗原に結合する抗体である。
一部の態様において、抗体は、第1および第2の腫瘍抗原、例えばHER2およびHER3(HER2×HER3と略記される)を標的とする二特異性抗体、FAP×DR-5二特異性抗体、CEA×CD3二特異性抗体、CD20×CD3二特異性抗体、EGFR-EDV-miR16三特異性抗体、gp100×CD3二特異性抗体、Ny-eso×CD3二特異性抗体、EGFR×cMet二特異性抗体、BCMA×CD3二特異性抗体、EGFR-EDV二特異性抗体、CLEC12A×CD3二特異性抗体、HER2×HER3二特異性抗体、Lgr5×EGFR二特異性抗体、PD1×CTLA-4二特異性抗体、CD123×CD3二特異性抗体、gpA33×CD3二特異性抗体、B7-H3×CD3二特異性抗体、LAG-3×PD1二特異性抗体、DLL4×VEGF二特異性抗体、カドヘリン-P×CD3二特異性抗体、BCMA×CD3二特異性抗体、DLL4×VEGF二特異性抗体、CD20×CD3二特異性抗体、Ang-2×VEGF-A二特異性抗体、CD20×CD3二特異性抗体、CD123×CD3二特異性抗体、SSTR2×CD3二特異性抗体、PD1×CTLA-4二特異性抗体、HER2×HER2二特異性抗体、GPC3×CD3二特異性抗体、PSMA×CD3二特異性抗体、LAG-3×PD-L1二特異性抗体、CD38×CD3二特異性抗体、HER2×CD3二特異性抗体、GD2×CD3二特異性抗体、およびCD33×CD3二特異性抗体である。そのような治療抗体は、直接的にまたはリンカー、特に酸、塩基もしくは酵素的に不安定なリンカーを通じて1つまたは複数の化学療法剤(例えば抗体薬物コンジュゲートまたはADC)にさらにコンジュゲートされてもよい。
いくつかの態様において、補助作用物質は、1つまたは複数の非薬理学的様式(例えば、局所放射線療法もしくは全身放射線療法または外科手術)である。例として、本開示は、放射線照射相に、IL10R結合性分子および1つまたは複数の補助作用物質を含む処置レジメンを用いた処置が先行または後続する処置レジメンを考えている。いくつかの態様において、本開示は、外科手術(例えば腫瘍切除)と組み合わせたIL10R結合性分子の使用をさらに考えている。いくつかの態様において、本開示は、骨髄移植、末梢血幹細胞移植または他の種類の移植療法と組み合わせたIL10R結合性分子の使用をさらに考えている。
いくつかの態様において、「補助作用物質」は、対象における新生物性疾患のみならず、新生物性疾患に関連する疾患、障害または状態を治療および/または予防するための免疫チェックポイント調節因子である。「免疫チェックポイント経路」という用語は、免疫応答の刺激(例えば、T細胞活性の上方制御)または阻害(例えば、T細胞活性の下方制御)のいずれかを介して免疫応答を調節する、抗原提示細胞(APC)上に発現する第1の分子(例えば、PD1などのタンパク質)の、免疫細胞(例えばT細胞)上に発現する第2の分子(例えば、PDL1などのタンパク質)への結合によって誘発される生物学的応答をいう。免疫応答を調節する結合ペアの形成に関与する分子は、一般に「免疫チェックポイント」といわれる。このような免疫チェックポイント経路によって調節される生物学的応答は、細胞の活性化、サイトカイン産生、細胞遊走、細胞傷害性因子の分泌、および抗体産生などの下流の免疫エフェクタ経路に至る細胞内シグナル伝達経路によって媒介される。免疫チェックポイント経路は、一般に、第1の細胞表面発現分子の、免疫チェックポイント経路に関連する第2の細胞表面分子への結合(例えば、PD1のPDL1への結合、CTLA4のCD28への結合など)によって誘発される。免疫チェックポイント経路の活性化は、免疫応答の刺激または阻害をもたらすことができる。
1つの態様において、免疫チェックポイント経路モジュレーターは、PDL1および/またはPDL2へのPD1の結合を阻害する負の免疫チェックポイント経路のアンタゴニスト(「PD1経路阻害剤」)である。PD1経路阻害剤は、広範囲の好都合な免疫応答の刺激、例えばT細胞疲弊の逆転、サイトカイン産生の回復、および抗原依存性T細胞の拡大増殖を結果としてもたらす。PD1経路阻害剤は、黒色腫、肺がん、腎臓がん、ホジキンリンパ腫、頭頸部がん、膀胱がんおよび尿路上皮がんを含む多様ながんの処置のためにUSFDAからの承認を受けた有効な多様ながんとして認識されている。
PD1経路阻害剤という用語は、PD1のPDL1および/またはPDL2への結合を妨害するモノクローナル抗体を含む。抗体PD1経路阻害剤は、当技術分野において周知である。市販のPD1経路阻害剤の例としては、ニボルマブ(オプジーボ(Opdivo) (登録商標)、BMS-936558、MDX1106、BristolMyers Squibb、Princeton NJから市販されている)、ペムブロリズマブ(キイトルーダ(Keytruda) (登録商標)MK-3475、ランブロリズマブ、Merck and Company、Kenilworth NJから市販されている)、およびアテゾリズマブ(テセントリク(Tecentriq) (登録商標)、Genentech/Roche、South San Francisco CA)を含む、PD1のPDL1および/またはPDL2への結合を妨害するモノクローナル抗体が挙げられる。デュルバルマブ(MEDI4736, Medimmune/AstraZeneca)、ピディリズマブ(CT-011, CureTech)、PDR001 (Novartis)、BMS-936559 (MDX1105, BristolMyers Squibb)、およびアベルマブ(MSB0010718C, Merck Serono/Pfizer); およびSHR-1210 (Incyte)を含むが、これらに限定されないさらなるPD1経路阻害抗体は、臨床開発中である。さらなる抗体PD1経路阻害剤は、2012年7月10日付で発行された米国特許第8,217,149号(Genentech, Inc); 2012年5月1日付で発行された米国特許第8,168,757号(Merck SharpおよびDohme Corp.)、2011年8月30日付で発行された米国特許第8,008,449号(Medarex)、2011年5月17日付で発行された米国特許第7,943,743号(Medarex, Inc)に記述されている。
いくつかの態様において、本開示の方法は、新生物性疾患、自己免疫疾患、または炎症性疾患を処置するための細胞療法の形態の、IL10R結合性分子と補助作用物質との投与の組み合わせを含む場合がある。本開示の方法と組み合わせて使用することが適用できる細胞療法の例としては、1つまたは複数の活性化CAR-T細胞、操作されたTCR細胞、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、操作されたTreg細胞を含む操作されたT細胞産物が挙げられるが、これらに限定されることはない。操作されたT細胞産物は、通常、対象へのそれらの投与前にエクスビボで活性化され、したがって、上方制御されたレベルのCD25を提供するので、そのような活性化された操作T細胞型を含む細胞産物は、本明細書において記述されるCD25バイアス型IL10R結合性分子の投与をさらに支援するために適用できる。本発明のオルソゴナル受容体を組み入れるために改変されうる市販のCAR-T細胞産物の例は、アキシカブタゲン シロルユーセル(Gilead PharmaceuticalsからYescarta (登録商標)として販売)およびチサゲンレクルユーセル(NovartisからKymriah (登録商標)として販売)を含む。
予防的用途
いくつかの態様において、IL10R結合性分子が疾患の予防に使用される場合、補助作用物質はワクチンでありうる。本発明のIL10R結合性分子は、Doyleら、1998年9月1日付で発行された米国特許第5,800,819号の教示にしたがってワクチンに対する免疫応答を増強するためのアジュバントとしてワクチンと組み合わせて対象に投与されうる。本発明のIL10R結合性分子と組み合わされうるワクチンの例としては、HSVワクチン、百日咳菌(Bordetella pertussis)ワクチン、大腸菌(Escherichia coli)ワクチン、プレベナー(Prevnar) (登録商標) 13などの多価肺炎球菌ワクチンを含む肺炎球菌ワクチン、ジフテリア、破傷風および百日咳ワクチン(ペディアトリックス(Pediatrix) (登録商標))およびペンタセル(Pentacel) (登録商標)などの混合ワクチンを含む)、水痘ワクチン、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae) B型ワクチン、ガラシル(Garasil) (登録商標)などのヒト乳頭腫ウイルスワクチン、ポリオワクチン、レプトスピラ症ワクチン、呼吸器混合ワクチン、モラクセラ(Moraxella)ワクチン、ウシ呼吸器病ワクチン(RSV)などの弱毒生または死滅ウイルスワクチン製品、フルゾン(Fluzone) (登録商標)およびクアドラフレントフルゾン(Quadravlent Fluzone) (登録商標)などの多価ヒトインフルエンザワクチン)、ネコ白血病ワクチン、伝染性胃腸炎ワクチン、COVID-19ワクチン、ならびに狂犬病ワクチンが挙げられる。
いくつかの態様において、IL10R結合性分子が疾患の予防に使用される場合、補助作用物質はワクチンでありうる。本発明のIL10R結合性分子は、Doyleら、1998年9月1日付で発行された米国特許第5,800,819号の教示にしたがってワクチンに対する免疫応答を増強するためのアジュバントとしてワクチンと組み合わせて対象に投与されうる。本発明のIL10R結合性分子と組み合わされうるワクチンの例としては、HSVワクチン、百日咳菌(Bordetella pertussis)ワクチン、大腸菌(Escherichia coli)ワクチン、プレベナー(Prevnar) (登録商標) 13などの多価肺炎球菌ワクチンを含む肺炎球菌ワクチン、ジフテリア、破傷風および百日咳ワクチン(ペディアトリックス(Pediatrix) (登録商標))およびペンタセル(Pentacel) (登録商標)などの混合ワクチンを含む)、水痘ワクチン、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae) B型ワクチン、ガラシル(Garasil) (登録商標)などのヒト乳頭腫ウイルスワクチン、ポリオワクチン、レプトスピラ症ワクチン、呼吸器混合ワクチン、モラクセラ(Moraxella)ワクチン、ウシ呼吸器病ワクチン(RSV)などの弱毒生または死滅ウイルスワクチン製品、フルゾン(Fluzone) (登録商標)およびクアドラフレントフルゾン(Quadravlent Fluzone) (登録商標)などの多価ヒトインフルエンザワクチン)、ネコ白血病ワクチン、伝染性胃腸炎ワクチン、COVID-19ワクチン、ならびに狂犬病ワクチンが挙げられる。
実施例1. V h Hの生成:
ラクダを免疫化の前に少なくとも7日間、研究施設において順化させた。抗原を1×PBSで希釈した(抗原は全部で約1mg)。抗原の品質をSDS-PAGEにより評価して純度(例えば、>80%)を確実にした。最初に、10mLのCFA(続いてIFAを使用して6回)を乳鉢に加え、次に1×PBS中の10mLの抗原を乳鉢に緩徐に加え、乳棒で摩砕した。成分が乳白色を示し、硬質となって分散して見えるまで、抗原およびCFA/IFAを粉砕した。ラクダにCFA中で乳化させた抗原を、身体上の少なくとも6つの部位において皮下に注射し、注射は各々の部位に約2mLで行った(ラクダ当たり全部で10mL)。より多くの部位により大きい体積で注射することにより、より強い免疫応答が生成された。免疫化は、7回にわたり週(7日)毎に実行した。針を各々の注射後に10~15秒間、皮下空間に挿入して、エマルションの漏出を回避した。代替的に、シリンジプランジャーにおける軽い引きもまた漏出を予防した。血液試料を7回目の免疫化の3日後に収集した。
ラクダを免疫化の前に少なくとも7日間、研究施設において順化させた。抗原を1×PBSで希釈した(抗原は全部で約1mg)。抗原の品質をSDS-PAGEにより評価して純度(例えば、>80%)を確実にした。最初に、10mLのCFA(続いてIFAを使用して6回)を乳鉢に加え、次に1×PBS中の10mLの抗原を乳鉢に緩徐に加え、乳棒で摩砕した。成分が乳白色を示し、硬質となって分散して見えるまで、抗原およびCFA/IFAを粉砕した。ラクダにCFA中で乳化させた抗原を、身体上の少なくとも6つの部位において皮下に注射し、注射は各々の部位に約2mLで行った(ラクダ当たり全部で10mL)。より多くの部位により大きい体積で注射することにより、より強い免疫応答が生成された。免疫化は、7回にわたり週(7日)毎に実行した。針を各々の注射後に10~15秒間、皮下空間に挿入して、エマルションの漏出を回避した。代替的に、シリンジプランジャーにおける軽い引きもまた漏出を予防した。血液試料を7回目の免疫化の3日後に収集した。
hIL10Raに対するVHHを生成するために、用いた免疫原はhIL10Ra(UNIPROT Ref:Q13651)の細胞外ドメイン(アミノ酸22~235)であった。hIL10Rbに対するVHHを生成するために、用いた免疫原は、hIL10Rbの201アミノ酸の細胞外ドメイン、前駆体のアミノ酸20~220および成熟タンパク質(UNIPROT Reference No. Q08334)のアミノ酸1~201であった。mIL10Rbに対するVHHを生成するために、用いた免疫原は、mIL10Rbの201アミノ酸の細胞外ドメイン、前駆体のアミノ酸20~220および成熟タンパク質(UNIPROT Reference No. Q61190)のアミノ酸1~201であった。各々の抗原に関して、以下の方法論を使用してVHHを同定および単離した。
免疫化後に、ライブラリーを構築した。簡潔に述べれば、RNAを血液から抽出し、cDNAに転写した。VHH領域を2工程PCRを介して得、これは約400bpの断片であった。PCRの成果物およびpMECSファージミドのベクターをPst IおよびNot Iで消化し、その後に、pMECS/Nb組換えにライゲートした。ライゲーション後に、生成物で大腸菌(Escherichia coli; E.coli)TG1細胞をエレクトロポレーションにより形質転換した。次に、形質転換体を増殖培地中で富化し、プレート上に接種した。最後に、コロニーの数をカウントすることによりライブラリーサイズを概算した。ライブラリーバイオパニングを実行して、ライブラリー構築後に抗原に対して候補をスクリーニングした。ファージディスプレイ技術をこの手順において応用した。陽性コロニーをPE-ELISAにより同定した。
実施例2. 抗hIL10R VHHの生成
ラクダをヒトIL10R□(アミノ酸22~235、UniProtKB Q13651、hIL-10Rαecd)およびIL10Rβ(アミノ酸20~220、UniProtKB Q08334、hIL-10Rαecd)の細胞外ドメインで7週にわたり週毎に免疫化し、PBMCを52日目に採取した。ファージディスプレイライブラリーを構築し、上記の実施例1に記載されるようにバイオパニングを実行した。50個のVHH配列をhIL10-R1における選択後に得、47個のVHH配列をhIL10-R2における選択後に得た。生殖系列割当ておよびCDR3配列類似性を使用して配列をクロノタイプ判定した。
ラクダをヒトIL10R□(アミノ酸22~235、UniProtKB Q13651、hIL-10Rαecd)およびIL10Rβ(アミノ酸20~220、UniProtKB Q08334、hIL-10Rαecd)の細胞外ドメインで7週にわたり週毎に免疫化し、PBMCを52日目に採取した。ファージディスプレイライブラリーを構築し、上記の実施例1に記載されるようにバイオパニングを実行した。50個のVHH配列をhIL10-R1における選択後に得、47個のVHH配列をhIL10-R2における選択後に得た。生殖系列割当ておよびCDR3配列類似性を使用して配列をクロノタイプ判定した。
実施例3. シンセカインをコードするDNAの合成
7つの独特の抗hIL-10Rαecd配列(SEQ ID No:44~50)および7つの独特の抗hIL-10Rβecd配列(SEQ ID No:51~57)を各々のコホートから選択し、GGGS(SEQ ID NO:23)をコードするDNAによるリンカー配列により分離された1つのIL-10R□VHHをコードするDNAおよび1つのIL-10RαVHHをコードするDNAからなるDNAを合成した。DNAは、各々の可能なVHH組合せ、および両方の配向性におけるものであり、全部で98個、7×7×2=98個のVHH二量体であった。Ala-Ser(「AS」)リンカー、続いてHis-6 DNA(ASH6、SEQ ID NO 430)を各々のDNA構築物の3'末端に加えた。これらの構築物をコードするコドン最適化されたDNA配列はSEQ ID No:290~237として提供され、その構成要素の配向性は本明細書の上記の表2に記載される。
7つの独特の抗hIL-10Rαecd配列(SEQ ID No:44~50)および7つの独特の抗hIL-10Rβecd配列(SEQ ID No:51~57)を各々のコホートから選択し、GGGS(SEQ ID NO:23)をコードするDNAによるリンカー配列により分離された1つのIL-10R□VHHをコードするDNAおよび1つのIL-10RαVHHをコードするDNAからなるDNAを合成した。DNAは、各々の可能なVHH組合せ、および両方の配向性におけるものであり、全部で98個、7×7×2=98個のVHH二量体であった。Ala-Ser(「AS」)リンカー、続いてHis-6 DNA(ASH6、SEQ ID NO 430)を各々のDNA構築物の3'末端に加えた。これらの構築物をコードするコドン最適化されたDNA配列はSEQ ID No:290~237として提供され、その構成要素の配向性は本明細書の上記の表2に記載される。
実施例4. 組換え製造および精製
コドン最適化されたDNA挿入物(SEQ ID No:290~237)および24ウェルプレート中のHEK293細胞における小スケール発現のための改変されたpcDNA3.4(Genscript)へのクローニング。上清 細胞 IL2R結合性タンパク質を以下の手順に実質的にしたがって精製した。Hamilton Star自動化システムを使用して、4×24ウェルブロック中の96×4mlの上清を4×96ウェル、1mLのブロックに再アレイ化した。80uLのNi-Excel IMAC樹脂(Cytiva)を保持するPhyNexusマイクロピペットチップ(Biotage、San Jose CA)を洗浄緩衝液:PBS pH 7.4、30mMのイミダゾールで平衡化する。すべての4×96ウェルブロックにわたりPhyNexusチップを浸漬し、14サイクルの1mLのピペッティングのサイクルを行った。PhyNexusチップを、洗浄緩衝液を保持する2×1mLブロック中で洗浄した。PhyNexusチップを、溶出緩衝液:PBS pH 7.4、400mMのイミダゾールを保持する3×0.36mLブロック中で溶出させた。PhyNexusチップを0.5M水酸化ナトリウムの3×1mLブロック中で再生させた。
コドン最適化されたDNA挿入物(SEQ ID No:290~237)および24ウェルプレート中のHEK293細胞における小スケール発現のための改変されたpcDNA3.4(Genscript)へのクローニング。上清 細胞 IL2R結合性タンパク質を以下の手順に実質的にしたがって精製した。Hamilton Star自動化システムを使用して、4×24ウェルブロック中の96×4mlの上清を4×96ウェル、1mLのブロックに再アレイ化した。80uLのNi-Excel IMAC樹脂(Cytiva)を保持するPhyNexusマイクロピペットチップ(Biotage、San Jose CA)を洗浄緩衝液:PBS pH 7.4、30mMのイミダゾールで平衡化する。すべての4×96ウェルブロックにわたりPhyNexusチップを浸漬し、14サイクルの1mLのピペッティングのサイクルを行った。PhyNexusチップを、洗浄緩衝液を保持する2×1mLブロック中で洗浄した。PhyNexusチップを、溶出緩衝液:PBS pH 7.4、400mMのイミダゾールを保持する3×0.36mLブロック中で溶出させた。PhyNexusチップを0.5M水酸化ナトリウムの3×1mLブロック中で再生させた。
精製されたタンパク質溶出液を、以下の手順に実質的にしたがってBiacore(登録商標)T200を使用して定量化した。10uLの第1の96×0.36mL溶出液をBiacore(登録商標)96ウェルマイクロプレートに移し、HBS-EP+緩衝液(10mM Hepes pH 7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、0.05% Tween 20)中に60uLまで希釈した。96個の試料の各々を、抗ヒスチジン捕捉抗体(Cytiva)で以前に機能化されたCM5シリーズSチップに注入した。注入は5uL/分で18秒間行う。捕捉レベルを緩衝液洗浄の60秒後に記録した。既知のVHH濃度(270、90、30、10、3.3、1.1μg/mL)の標準曲線を4つのBiacoreチップフローセルの各々において獲得して、セル表面間のばらつきを排除した。96個の捕捉を、特異的および非特異的な1部位結合を含む非線形モデルを使用して標準曲線に対して補間した。第1の溶出ブロックにおける濃度は、4~149μgに対応する12~452μg/mLで変動した。5つの無作為に選んだ試料のSDS-PAGE分析を行って、予想される値(約30KDa)に対応する溶出液の分子量を確実にした。
タンパク質の濃度を、以下の手順に実質的にしたがってHamilton Star自動化システムを使用して正規化した。濃度値をExcelスプレッドシートにインポートし、0.22mL中50μg/mLへの希釈を行うためのピペッティング体積を算出した。第1の溶出ブロックおよび希釈剤としての溶出緩衝液を使用する希釈ピペッティングを行うために特化したHamilton Star方法においてスプレッドシートをインポートした。最終の、正規化されたプレートを、0.22μmフィルタープレート(Corning)を使用して無菌濾過し、材料を以下のインビトロアッセイのために使用した。
実施例5. 表面プラズモン共鳴を介する結合親和性の評価
実施例1~3にしたがって生成されたIL10aの各々のクロノタイプからの1つの代表的な例を、以下のようなSPRを介する結合の評価のために選択した。SEQ ID NO 159、161、162、163、165、167および170に対応するhIL10RaのECDに対するIL10Ra結合性分子の結合親和性の評価を、以下の手順に実質的にしたがって表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して実行した。すべての実験は、プロテインA誘導体化センサーチップ(Cytiva)を備えたBiacore T200機器上で10mM Hepes、150mM NaCl、0.05%(v/v)ポリソルベート20(PS20)および3mM EDTA(HBS-EP+緩衝液)中で実行した。モノ-Fc VHHリガンドを、以下の表に列記される捕捉ロードに達する18~300秒の範囲に及ぶ可変の時間にわたり5μl/分で流した。リガンド捕捉後に、典型的には1μM~1nMの間の少なくとも5つの濃度を含む、C末端ポリHis配列を組み込むように改変されたIL2Rb受容体の細胞外ドメインの2倍希釈系列の注入を高性能または単一サイクル速度論モードで行った。表面再生は、10mMグリシン-HCl、pH 1.5を流すことにより達成した(60秒、50μL/分)。緩衝液をサブストラクトしたセンサーグラムをBiacore T200 Evaluation Softwareで処理し、1:1ラングミュア結合モデルと大域的にフィッティングして(バルクシフトを0に設定)、動態および親和性定数(ka、kd、KD)を抽出した。RMAX<100RUは、動態分析と適合性の表面密度を指し示す。Rmaxの計算値を、式:Rmax=ロード(RU)×リガンドの価数×(分析物の分子量/リガンドの分子量)を使用して生成した。表面活性は、Rmaxの実験値/計算値の比として定義した。これらの結合親和性実験の結果は以下の表23、表24および表25に提供される。
実施例1~3にしたがって生成されたIL10aの各々のクロノタイプからの1つの代表的な例を、以下のようなSPRを介する結合の評価のために選択した。SEQ ID NO 159、161、162、163、165、167および170に対応するhIL10RaのECDに対するIL10Ra結合性分子の結合親和性の評価を、以下の手順に実質的にしたがって表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して実行した。すべての実験は、プロテインA誘導体化センサーチップ(Cytiva)を備えたBiacore T200機器上で10mM Hepes、150mM NaCl、0.05%(v/v)ポリソルベート20(PS20)および3mM EDTA(HBS-EP+緩衝液)中で実行した。モノ-Fc VHHリガンドを、以下の表に列記される捕捉ロードに達する18~300秒の範囲に及ぶ可変の時間にわたり5μl/分で流した。リガンド捕捉後に、典型的には1μM~1nMの間の少なくとも5つの濃度を含む、C末端ポリHis配列を組み込むように改変されたIL2Rb受容体の細胞外ドメインの2倍希釈系列の注入を高性能または単一サイクル速度論モードで行った。表面再生は、10mMグリシン-HCl、pH 1.5を流すことにより達成した(60秒、50μL/分)。緩衝液をサブストラクトしたセンサーグラムをBiacore T200 Evaluation Softwareで処理し、1:1ラングミュア結合モデルと大域的にフィッティングして(バルクシフトを0に設定)、動態および親和性定数(ka、kd、KD)を抽出した。RMAX<100RUは、動態分析と適合性の表面密度を指し示す。Rmaxの計算値を、式:Rmax=ロード(RU)×リガンドの価数×(分析物の分子量/リガンドの分子量)を使用して生成した。表面活性は、Rmaxの実験値/計算値の比として定義した。これらの結合親和性実験の結果は以下の表23、表24および表25に提供される。
実施例6. IL10活性のアッセイ:
HEK-Blue(商標)IL-10レポーター細胞株(Invivogen、San Diego CA)をIL10R1/R2 VHHのスクリーニングのために使用した。HEK-Blue(商標)IL-10細胞は、hIL-10R αおよびβ鎖、ヒトSTAT3、ならびにSTAT3誘導性SEAP(分泌型胚性アルカリホスファターゼ)レポーターをコードする遺伝子を用いたヒト胚性腎臓HEK293細胞株への安定なトランスフェクションにより生成した。HEK-Blue(商標)IL-10細胞の表面上のその受容体へのIL-10の結合は、JAK1/STAT3シグナル伝達およびその後のSEAPの産生のトリガーとなる。シグナルを次に、QUANTI-Blue(商標)顕色溶液(Invivogen、San Diego CA)を使用して細胞培養上清中のSEAP活性を定量化することにより検出し、吸光度値を分光光度的に630nmで測定した。STAT3はまた、サイトカイン、例えばIFN-α/βおよびIL-6のシグナル伝達に結び付けられるので、HEK-Blue(商標)IL-10細胞はhIFNAR2およびhIL-6Rの発現についてノックアウトされる。
HEK-Blue(商標)IL-10レポーター細胞株(Invivogen、San Diego CA)をIL10R1/R2 VHHのスクリーニングのために使用した。HEK-Blue(商標)IL-10細胞は、hIL-10R αおよびβ鎖、ヒトSTAT3、ならびにSTAT3誘導性SEAP(分泌型胚性アルカリホスファターゼ)レポーターをコードする遺伝子を用いたヒト胚性腎臓HEK293細胞株への安定なトランスフェクションにより生成した。HEK-Blue(商標)IL-10細胞の表面上のその受容体へのIL-10の結合は、JAK1/STAT3シグナル伝達およびその後のSEAPの産生のトリガーとなる。シグナルを次に、QUANTI-Blue(商標)顕色溶液(Invivogen、San Diego CA)を使用して細胞培養上清中のSEAP活性を定量化することにより検出し、吸光度値を分光光度的に630nmで測定した。STAT3はまた、サイトカイン、例えばIFN-α/βおよびIL-6のシグナル伝達に結び付けられるので、HEK-Blue(商標)IL-10細胞はhIFNAR2およびhIL-6Rの発現についてノックアウトされる。
実施例7. SEQ ID NO:192~289のスクリーニング:
IL10R1/R2 VHHをスクリーニングするために、HEK-Blue(商標)IL-10細胞を96ウェルプレートに50,000細胞/ウェルで播種し、25nMまたは100nMのタンパク質(3連)で24時間処理した。Recombinant Animal-Free Human IL-10(Shenandoah Biotechnology,Inc.Warwick、PA Catalog No. 100-83AF)を陽性対照として使用し、非刺激の細胞を陰性対照として使用した。処理の24時間後に、20μlの細胞上清を平底96ウェルプレートに移し、180μlのQUANTI-Blue(商標)(Invivogen)を2時間加えることによりアッセイを顕色させた。吸光度値をEnvision(登録商標)(PerkinElmer、Waltham MA)マルチラベルプレートリーダー上で630nmで測定した。このスクリーニングの結果は、本明細書の表3に提示される。
IL10R1/R2 VHHをスクリーニングするために、HEK-Blue(商標)IL-10細胞を96ウェルプレートに50,000細胞/ウェルで播種し、25nMまたは100nMのタンパク質(3連)で24時間処理した。Recombinant Animal-Free Human IL-10(Shenandoah Biotechnology,Inc.Warwick、PA Catalog No. 100-83AF)を陽性対照として使用し、非刺激の細胞を陰性対照として使用した。処理の24時間後に、20μlの細胞上清を平底96ウェルプレートに移し、180μlのQUANTI-Blue(商標)(Invivogen)を2時間加えることによりアッセイを顕色させた。吸光度値をEnvision(登録商標)(PerkinElmer、Waltham MA)マルチラベルプレートリーダー上で630nmで測定した。このスクリーニングの結果は、本明細書の表3に提示される。
実施例8. 表面プラズモン共鳴を介するIL10RaおよびIL10Rb単一ドメイン抗体の結合親和性の評価
実施例1~3にしたがって生成された各々のクロノタイプからの1つの代表的な例を、以下のようなSPRを介する結合の評価のために選択した。SEQ ID NO 21、29、33、37、45、53および65に対応するCD122に対するIL2Rb結合性分子の結合親和性の評価を、以下の手順に実質的にしたがって表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して実行した。すべての実験は、プロテインA誘導体化センサーチップ(Cytiva)を備えたBiacore T200機器上で10mM Hepes、150mM NaCl、0.05%(v/v)ポリソルベート20(PS20)および3mM EDTA(HBS-EP+緩衝液)中で実行した。モノ-Fc VHHリガンドを、以下の表に列記される捕捉ロードに達する18~300秒の範囲に及ぶ可変の時間にわたり5μl/分で流した。リガンド捕捉後に、典型的には1μM~1nMの間の少なくとも5つの濃度を含む、C末端ポリHis配列を組み込むように改変されたIL2Rb受容体の細胞外ドメインの2倍希釈系列の注入を高性能または単一サイクル速度論モードで行った。表面再生は、10mMグリシン-HCl、pH 1.5を流すことにより達成した(60秒、50μL/分)。緩衝液をサブストラクトしたセンサーグラムをBiacore T200 Evaluation Softwareで処理し、1:1ラングミュア結合モデルと大域的にフィッティングして(バルクシフトを0に設定)、動態および親和性定数(ka、kd、KD)を抽出した。RMAX<100RUは、動態分析と適合性の表面密度を指し示す。Rmaxの計算値を、式:Rmax=ロード(RU)×リガンドの価数×(分析物の分子量/リガンドの分子量)を使用して生成した。表面活性は、Rmaxの実験値/計算値の比として定義した。これらの結合親和性実験の結果は以下の表4に提供される。
実施例1~3にしたがって生成された各々のクロノタイプからの1つの代表的な例を、以下のようなSPRを介する結合の評価のために選択した。SEQ ID NO 21、29、33、37、45、53および65に対応するCD122に対するIL2Rb結合性分子の結合親和性の評価を、以下の手順に実質的にしたがって表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して実行した。すべての実験は、プロテインA誘導体化センサーチップ(Cytiva)を備えたBiacore T200機器上で10mM Hepes、150mM NaCl、0.05%(v/v)ポリソルベート20(PS20)および3mM EDTA(HBS-EP+緩衝液)中で実行した。モノ-Fc VHHリガンドを、以下の表に列記される捕捉ロードに達する18~300秒の範囲に及ぶ可変の時間にわたり5μl/分で流した。リガンド捕捉後に、典型的には1μM~1nMの間の少なくとも5つの濃度を含む、C末端ポリHis配列を組み込むように改変されたIL2Rb受容体の細胞外ドメインの2倍希釈系列の注入を高性能または単一サイクル速度論モードで行った。表面再生は、10mMグリシン-HCl、pH 1.5を流すことにより達成した(60秒、50μL/分)。緩衝液をサブストラクトしたセンサーグラムをBiacore T200 Evaluation Softwareで処理し、1:1ラングミュア結合モデルと大域的にフィッティングして(バルクシフトを0に設定)、動態および親和性定数(ka、kd、KD)を抽出した。RMAX<100RUは、動態分析と適合性の表面密度を指し示す。Rmaxの計算値を、式:Rmax=ロード(RU)×リガンドの価数×(分析物の分子量/リガンドの分子量)を使用して生成した。表面活性は、Rmaxの実験値/計算値の比として定義した。これらの結合親和性実験の結果は以下の表4に提供される。
実施例9. 表面プラズモン共鳴を介するIL10R結合性分子の結合親和性の評価
すべての実験は、プロテインAまたはCAPビオチンチップ(Cytiva)を備えたBiacore T200機器上で10mM Hepes、150mM NaCl、0.05%(v/v)ポリソルベート20(PS20)および3mM EDTA(HBS-EP+緩衝液)中で実行した。プロテインAチップでの実験のために、Fc融合リガンドを、以下の表に列記される捕捉ロードに達する18~300秒の範囲に及ぶ可変の時間にわたり5μl/分で流した。
すべての実験は、プロテインAまたはCAPビオチンチップ(Cytiva)を備えたBiacore T200機器上で10mM Hepes、150mM NaCl、0.05%(v/v)ポリソルベート20(PS20)および3mM EDTA(HBS-EP+緩衝液)中で実行した。プロテインAチップでの実験のために、Fc融合リガンドを、以下の表に列記される捕捉ロードに達する18~300秒の範囲に及ぶ可変の時間にわたり5μl/分で流した。
リガンド捕捉後に、典型的には1μM~1nMの間の少なくとも5つの濃度を含む分析物の2倍希釈系列の注入を高性能または単一サイクル速度論モードで行った。表面再生は、10mMグリシン-HCl、pH 1.5を流すことにより達成した(60秒、50μL/分)。緩衝液をサブストラクトしたセンサーグラムをBiacore T200 Evaluation Softwareで処理し、1:1ラングミュア結合モデルと大域的にフィッティングして(バルクシフトを0に設定)、動態および親和性定数(ka、kd、KD)を抽出した。RMAX<100RUは、動態分析と適合性の表面密度を指し示す。
CAPチップでの実験は、ビオチン化リガンドの捕捉の前に行われたビオチン捕捉試薬の追加の捕捉工程(10秒、40uL/分)と共に上記されるように行った。
計算されたRmaxを、式:Rmax=ロード(RU)×リガンドの価数×(分析物の分子量/リガンドの分子量)を使用して生成した。表面活性は、Rmaxの実験値/計算値の比として定義した。評価された試料の構成およびこれらの実験の結果は表22および表23に提供される。
実施例10:表面プラズモン共鳴を介するヒト化IL10RA結合性分子の結合親和性の評価
すべての実験は、抗ヒスチジン捕捉チップ(Cytiva)を備えたBiacore T200機器上で10mM Hepes、150mM NaCl、0.05%(v/v)ポリソルベート20(PS20)および3mM EDTA(HBS-EP+緩衝液)中で実行した。約0.5μg/mL hIL10Rb-his(Sino Biological cat#10945)を5μl/分で120秒間流して、以下の表に列記される捕捉ロードに達しさせた。リガンド捕捉後に、ヒト化されたモノ-Fc VHH(表中の分析物を参照)の2倍希釈系列(50、25、12.5、6.25、3.13nM)の注入を単一サイクル速度論モードで行った。表面再生は、10mMグリシン-HCl、pH 1.5を流すことにより達成した(60秒、50μL/分)。緩衝液をサブストラクトしたセンサーグラムをBiacore T200 Evaluation Softwareで処理し、1:1ラングミュア結合モデルと大域的にフィッティングして(バルクシフトを0に設定)、動態および親和性定数(ka、kd、KD)を抽出した。RMAX<100RUは、動態分析と適合性の表面密度を指し示す。計算されたRmaxを、式:Rmax=ロード(RU)×リガンドの価数×(分析物の分子量/リガンドの分子量)を使用して生成した。表面活性は、Rmaxの実験値/計算値の比として定義した。試料の情報および実験結果について以下の表を参照のこと。
すべての実験は、抗ヒスチジン捕捉チップ(Cytiva)を備えたBiacore T200機器上で10mM Hepes、150mM NaCl、0.05%(v/v)ポリソルベート20(PS20)および3mM EDTA(HBS-EP+緩衝液)中で実行した。約0.5μg/mL hIL10Rb-his(Sino Biological cat#10945)を5μl/分で120秒間流して、以下の表に列記される捕捉ロードに達しさせた。リガンド捕捉後に、ヒト化されたモノ-Fc VHH(表中の分析物を参照)の2倍希釈系列(50、25、12.5、6.25、3.13nM)の注入を単一サイクル速度論モードで行った。表面再生は、10mMグリシン-HCl、pH 1.5を流すことにより達成した(60秒、50μL/分)。緩衝液をサブストラクトしたセンサーグラムをBiacore T200 Evaluation Softwareで処理し、1:1ラングミュア結合モデルと大域的にフィッティングして(バルクシフトを0に設定)、動態および親和性定数(ka、kd、KD)を抽出した。RMAX<100RUは、動態分析と適合性の表面密度を指し示す。計算されたRmaxを、式:Rmax=ロード(RU)×リガンドの価数×(分析物の分子量/リガンドの分子量)を使用して生成した。表面活性は、Rmaxの実験値/計算値の比として定義した。試料の情報および実験結果について以下の表を参照のこと。
一部の態様において、結合性分子は、他の望ましくない細胞型において有意により低いIL10シグナル伝達を提供する一方で、所望の細胞型上のIL10RaおよびIL10Rbに対する結合から、最大の所望のIL10細胞内シグナル伝達を提供する。これは、例えば、IL10RaおよびIL10Rbに対するIL10の親和性と比較して異なる親和性を有するか、またはIL10RaおよびIL10Rbに対する異なるEmaxを引き起こす結合性分子の選択により、達成され得る。異なる細胞型は、異なる感度と共にコグネイト受容体へのリガンドの結合に応答するので、野生型IL10結合と比べてIL10受容体に対する二量体リガンド(またはその個々の結合性部分)の親和性をモジュレートすることにより、非標的細胞における望ましくない活性を低減させながら、所望される活性の刺激が促される。
[本発明1001]
(g)IL10Raの第1のサブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第1の単一ドメイン抗体(sdAb)(IL10Ra sdAb)と、
(h)IL10Rbの細胞外ドメインに特異的に結合する第2の単一ドメイン抗体(IL10Rb sdAb)と
を含む、IL10受容体(IL10R)結合性分子であって、
・IL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbが安定な会合状態にあり;
・IL10RaおよびIL10Rbが、サイトカイン受容体のコグネイトリガンドとの接触に応答して二量体化し; かつ
・IL10RaおよびIL10Rbを発現している細胞を有効量のIL10R結合性分子と接触させることが、結果としてIL10RaおよびIL10Rbの細胞内ドメインを近接状態にして、細胞内シグナル伝達をもたらす、
該IL10R結合性分子。
[本発明1002]
IL10Ra sdAbおよびIL10Rbが共有結合的に連結されている、本発明1001のIL10R結合性分子。
[本発明1003]
IL10Ra sdAbおよびIL10Rbが、リンカーを使用して共有結合的に連結されている、本発明1001のIL10R結合性分子。
[本発明1004]
IL10受容体がポリペプチドである、本発明1001のIL10R結合性分子。
[本発明1005]
IL10R結合性分子IL10Rが、以下の式[#1]のポリペプチドである:
H2N-(IL10 VHH#1)-(L1) a -(IL10 VHH#2)-(L2) b -(CP) c -COOH[#1]
式中:「-」は共有結合を表し; L1およびL2はリンカーであり; CPはキレート化ペプチドであり; a、b、およびcは、整数0または1から独立して選択され; 「H2N」はアミノ末端を表し; ならびに「COOH」はポリペプチドのカルボキシ末端を表す。
[本発明1006]
IL10 VHH#1がIL10Ra sdAbでありかつIL10 VHH#2がIL10Rb sdAbであり、IL10 VHH#1がIL10Rb sdAbでありかつIL10 VHH#2がIL10Ra sdAbである、本発明1005のIL10R結合性分子。
[本発明1007]
IL10Ra sdAbが、
・SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、および52のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50および53のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51および54のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3
を含むsdAbであり、
かつIL10Rb sdAbが、
・SEQ ID NO:55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148および151のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149および152のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150および153のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3
を含むsdAbである、
本発明1006のIL10R結合性分子。
[本発明1008]
L10Ra sdAbが、SEQ ID NO:154~171のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するsdAbである、本発明1006のIL10R結合性分子。
[本発明1009]
IL10Rb sdAbが、SEQ ID NO:172~198またはSEQ ID No:199~201のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するsdAbである、本発明1006のIL10R結合性分子。
[本発明1010]
SEQ ID NO:256~353のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有する、本発明1006のIL10R結合性分子。
[本発明1011]
SEQ ID NO:172~198またはSEQ ID No:199~201のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有する、本発明1006のIL10R結合性分子。
[本発明1012]
表29(SEQ ID NO:[DR1511~DR1525])のIL10R結合性分子のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有する、本発明1006のIL10R結合性分子。
[本発明1013]
IL10Rbの細胞外ドメインに対するIL10Rb sdAbの親和性よりも高い、IL10Raの細胞外ドメインに対する親和性を、IL10Ra sdAbの親和性が有する、本発明1006のIL10R結合性分子。
[本発明1014]
IL10R結合性タンパク質がPEG化されている、本発明1001~1013のいずれかのIL10R結合性分子。
[本発明1015]
本発明1001~1014のいずれかのIL10R結合性分子の、薬学的に許容される製剤。
[本発明1016]
本発明1006~1012のいずれかのIL10R結合性分子をコードする、核酸配列。
[本発明1017]
本発明1016の核酸を含む組換えベクター。ポリペプチドIL10R結合性分子。
[本発明1018]
治療有効量の本発明1001~1014のいずれかのIL10R結合性分子の投与により、自己免疫疾患、感染性疾患、または炎症性疾患を患う哺乳動物対象を処置する方法。
[本発明1019]
治療有効量の本発明1001~1014のいずれかのIL10R結合性分子の投与により、新生物性疾患を患う哺乳動物対象を処置する方法。
[本発明1001]
(g)IL10Raの第1のサブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第1の単一ドメイン抗体(sdAb)(IL10Ra sdAb)と、
(h)IL10Rbの細胞外ドメインに特異的に結合する第2の単一ドメイン抗体(IL10Rb sdAb)と
を含む、IL10受容体(IL10R)結合性分子であって、
・IL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbが安定な会合状態にあり;
・IL10RaおよびIL10Rbが、サイトカイン受容体のコグネイトリガンドとの接触に応答して二量体化し; かつ
・IL10RaおよびIL10Rbを発現している細胞を有効量のIL10R結合性分子と接触させることが、結果としてIL10RaおよびIL10Rbの細胞内ドメインを近接状態にして、細胞内シグナル伝達をもたらす、
該IL10R結合性分子。
[本発明1002]
IL10Ra sdAbおよびIL10Rbが共有結合的に連結されている、本発明1001のIL10R結合性分子。
[本発明1003]
IL10Ra sdAbおよびIL10Rbが、リンカーを使用して共有結合的に連結されている、本発明1001のIL10R結合性分子。
[本発明1004]
IL10受容体がポリペプチドである、本発明1001のIL10R結合性分子。
[本発明1005]
IL10R結合性分子IL10Rが、以下の式[#1]のポリペプチドである:
H2N-(IL10 VHH#1)-(L1) a -(IL10 VHH#2)-(L2) b -(CP) c -COOH[#1]
式中:「-」は共有結合を表し; L1およびL2はリンカーであり; CPはキレート化ペプチドであり; a、b、およびcは、整数0または1から独立して選択され; 「H2N」はアミノ末端を表し; ならびに「COOH」はポリペプチドのカルボキシ末端を表す。
[本発明1006]
IL10 VHH#1がIL10Ra sdAbでありかつIL10 VHH#2がIL10Rb sdAbであり、IL10 VHH#1がIL10Rb sdAbでありかつIL10 VHH#2がIL10Ra sdAbである、本発明1005のIL10R結合性分子。
[本発明1007]
IL10Ra sdAbが、
・SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、および52のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50および53のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51および54のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3
を含むsdAbであり、
かつIL10Rb sdAbが、
・SEQ ID NO:55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148および151のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149および152のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150および153のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3
を含むsdAbである、
本発明1006のIL10R結合性分子。
[本発明1008]
L10Ra sdAbが、SEQ ID NO:154~171のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するsdAbである、本発明1006のIL10R結合性分子。
[本発明1009]
IL10Rb sdAbが、SEQ ID NO:172~198またはSEQ ID No:199~201のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するsdAbである、本発明1006のIL10R結合性分子。
[本発明1010]
SEQ ID NO:256~353のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有する、本発明1006のIL10R結合性分子。
[本発明1011]
SEQ ID NO:172~198またはSEQ ID No:199~201のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有する、本発明1006のIL10R結合性分子。
[本発明1012]
表29(SEQ ID NO:[DR1511~DR1525])のIL10R結合性分子のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有する、本発明1006のIL10R結合性分子。
[本発明1013]
IL10Rbの細胞外ドメインに対するIL10Rb sdAbの親和性よりも高い、IL10Raの細胞外ドメインに対する親和性を、IL10Ra sdAbの親和性が有する、本発明1006のIL10R結合性分子。
[本発明1014]
IL10R結合性タンパク質がPEG化されている、本発明1001~1013のいずれかのIL10R結合性分子。
[本発明1015]
本発明1001~1014のいずれかのIL10R結合性分子の、薬学的に許容される製剤。
[本発明1016]
本発明1006~1012のいずれかのIL10R結合性分子をコードする、核酸配列。
[本発明1017]
本発明1016の核酸を含む組換えベクター。ポリペプチドIL10R結合性分子。
[本発明1018]
治療有効量の本発明1001~1014のいずれかのIL10R結合性分子の投与により、自己免疫疾患、感染性疾患、または炎症性疾患を患う哺乳動物対象を処置する方法。
[本発明1019]
治療有効量の本発明1001~1014のいずれかのIL10R結合性分子の投与により、新生物性疾患を患う哺乳動物対象を処置する方法。
特異的に結合する:本明細書において使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、第1の分子が第2の分子に関して呈する親和性の程度を指す。結合ペア(例えば、リガンド/受容体、抗体/抗原)の文脈において、結合ペアの第1の分子が試料中に存在する他の成分に有意な量で結合しない場合に、結合ペアの第1の分子は結合ペアの第2の分子に特異的に結合するといわれる。結合ペアの第1の分子が、第2の分子に対する第1の分子の親和性が、試料中に存在する他の成分に対する第1の分子の親和性よりも少なくとも2倍高い、代替的に少なくとも5倍高い、代替的に少なくとも10倍高い、代替的に少なくとも20倍高い、または代替的に少なくとも100倍高い場合に、結合ペアの第1の分子は結合ペアの第2の分子に特異的に結合するといわれる。特定の態様において、結合ペアの第1の分子が抗体である場合、例えば、スキャッチャード分析(Munsen,et al.(1980)Analyt.Biochem.107:220-239)により決定された場合に抗体と抗原(またはタンパク質、抗原、リガンド、もしくは受容体の抗原決定因子(エピトープ))との間の平衡解離定数(KD)が約10-6M未満、代替的に約10-8M未満、代替的に約10-10M未満、代替的に約10-11M未満、約10-12M未満である場合に、抗体は抗原に特異的に結合する。1つの態様において、解離が約105Mより高い、代替的に約106Mより高い、代替的に約107Mより高い、代替的に約108Mより高い、代替的に約109Mより高い、代替的に約1010Mより高い、または代替的に約1011Mより高い場合に、リガンドは受容体に特異的に結合する。特異的結合は、競合ELISAアッセイ、放射性リガンド結合アッセイ(例えば、飽和結合、スキャッチャードプロット、非線形曲線フィッティングプログラムおよび競合結合アッセイ); 非放射性リガンド結合アッセイ(例えば、蛍光偏光法(FP)、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET); 液相リガンド結合アッセイ(例えば、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)、および免疫沈降); ならびに固相リガンド結合アッセイ(例えば、マルチウェルプレートアッセイ、オンビーズリガンド結合アッセイ、オンカラムリガンド結合アッセイ、およびフィルターアッセイ))ならびに商業的に入手可能な器具、例えばBiacore 8+、Biacore S200、Biacore T200(GE Healthcare Bio-Sciences、100 Results Way、Marlborough MA 01752)を用いる表面プラズモン共鳴アッセイ(例えば、Drescher et al.,(2009)Methods Mol Biol 493:323-343を参照)を含むが、これらに限定されない当技術分野において公知の技術を使用して評価されてもよい。一部の態様において、本開示は、hIL12RB1アイソフォームに特異的に結合する分子(例えば、IL12RB1結合性sdAb)を提供する。本明細書において使用される場合、IL12RB1に対するIL12RB1結合性分子の結合親和性、結合親和性は、表面プラズモン共鳴(「SPR」)により決定および/または定量化されてもよい。IL12RB1に対するIL12RB1結合性分子の結合親和性の評価において、結合ペアのいずれかのメンバーが固定化されてもよく、結合ペアの他の要素が移動相中に提供されてもよい。一部の態様において、関心対象のタンパク質が固定化されるセンサーチップは、関心対象のタンパク質の結合を促すための物質をコンジュゲートされ、これは例えば、ニトリロ三酢酸(NTA)誘導体化表面プラズモン共鳴センサーチップ(例えば、Cytiva Global Life Science Solutions USA LLC、Marlborough MAからカタログ番号BR100407として入手可能なSensor Chip NTA)、抗Hisタグ抗体(例えばCytiva、Marlborough MAから商業的に入手可能な抗ヒスチジンCM5チップ)、プロテインAまたはビオチンである。結果的に、結合を評価するために、チップの表面にコンジュゲートされた物質への結合を提供するためにタンパク質を修飾することが頻繁に必要とされる。例えば、結合ペアの1つのメンバーは、NTAをコンジュゲートされたチップ上の保持のためにポリヒスチジン配列(例えば、6xHis(SEQ ID NO:532)または8xHis(SEQ ID NO:534))を含むキレート化ペプチドの組込みにより評価される。一部の態様において、結合性分子はチップ上に固定化されてもよく、受容体サブユニット(またはそのECD断片)は移動相中に提供されてもよい。代替的に、受容体サブユニット(またはそのECD断片)はチップ上に固定化されてもよく、結合性分子は移動相中に提供されてもよい。いずれの状況においても、被覆されたSPRチップ上の固定化のための一部のタンパク質の修飾は、SPRにより評価されるべき結合ペアの1つまたは両方の成分の結合特性に干渉し得ることが留意されるべきである。そのような場合において、結合ペアの移動要素および結合要素を切り替えるか、または評価されるべきタンパク質のコンジュゲーションへの非干渉を促す結合剤を有するチップを使用することが必要なことがある。代替的に、SPRを使用して受容体サブユニットに対する結合性分子の結合親和性を評価する場合に、結合性分子は、ポリHis配列(例えば、6xHis(SEQ ID NO:532)または8xHis(SEQ ID NO:534))のC末端付加により誘導体化され、NTA誘導体化センサーチップ上に固定化されてもよく、結合親和性が評価されている受容体サブユニットは移動相中に提供される。組換えDNA技術により製造される結合性分子のC末端へのポリHis配列の組込みのための手段は、バイオテクノロジーの関連技術分野の当業者に周知である。
IL10:
IL10受容体(IL10R)のコグネイトリガンドはサイトカインIL10である。IL10という用語はヒトおよびマウス(murineまたはmouse)IL10を含む。ヒトIL10(hIL10)は、2つの同一のサブユニットを含む非共有結合的に連結されたホモ二量体タンパク質である。各々のヒトIL10単量体は、18アミノ酸のシグナル配列を含む178アミノ酸のプレタンパク質として発現され、シグナル配列は翻訳後に除去されて160アミノ酸の成熟タンパク質となる。シグナル配列(プレタンパク質のアミノ酸19~178に対応する)を有しない成熟IL-10タンパク質のカノニカルなアミノ酸配列(UniProt Reference No. P22301)は、
である。
IL10受容体(IL10R)のコグネイトリガンドはサイトカインIL10である。IL10という用語はヒトおよびマウス(murineまたはmouse)IL10を含む。ヒトIL10(hIL10)は、2つの同一のサブユニットを含む非共有結合的に連結されたホモ二量体タンパク質である。各々のヒトIL10単量体は、18アミノ酸のシグナル配列を含む178アミノ酸のプレタンパク質として発現され、シグナル配列は翻訳後に除去されて160アミノ酸の成熟タンパク質となる。シグナル配列(プレタンパク質のアミノ酸19~178に対応する)を有しない成熟IL-10タンパク質のカノニカルなアミノ酸配列(UniProt Reference No. P22301)は、
である。
一部の態様において、リンカーはペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは、1~50個のアミノ酸(例えば、2~50、5~50、10~50、15~50、20~50、25~50、30~50、35~50、40~50、45~50、2~45、2~40、2~35、2~30、2~25、2~20、2~15、2~10、2~5個のアミノ酸)を含むことができる。グリシンおよびグリシン-セリンポリマーは相対的に構造化されておらず、したがって構成要素の間の中立なテザーとして役立ち得る。グリシンポリマーの例は、(G)n、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、グリシン-セリンポリマー(例えば、(GmSo)n(SEQ ID NO:562)、(GSGGS)n(SEQ ID NO:563)、(GmSoGm)n(SEQ ID NO:564)、(GmSoGmSoGm)n(SEQ ID NO:565)、(GSGGSm)n(SEQ ID NO:566)、(GSGSmG)n(SEQ ID NO:567)および(GGGSm)n(SEQ ID NO:568)、ならびにこれらの組合せ(ここで、m、n、およびoの各々は、少なくとも1~20、例えば、1~18、216、3~14、4~12、5~10、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10の整数から独立して選択される))、ならびに他の柔軟性リンカーを含む。本開示のIL10R結合性分子の調製において有用な例示的な柔軟なペプチドリンカーは、表16において提供されるリンカーを含むが、これらに限定されない。
上記の調製されたhIL10Ra VHHおよびhIL10Rb VHHを使用して、式[#1]の98個のポリペプチドIL10R結合性分子のシリーズをSEQ ID NO:256~353として調製し、SEQ ID NO 256~353の各々に関して、a=1およびL1=G3S(SEQ ID NO:484); b=1およびL2=Ala-Ser; c=1およびCP=ヘキサ-ヒスチジン(SEQ ID NO:532)であった。SEQ ID NO 256~353のこれらの98個のIL-10受容体結合性タンパク質のIL10Ra VHH、リンカーおよびIL10Ra VHH、キレート化ペプチド要素は、表11に提供される。SEQ ID NO:256~353のアミノ酸配列は表12に提供され、IL10R結合性分子の発現のために使用される以上の各々をコードするDNA配列は表14(SEQ ID NO:353~402)に提供される。
上記の調製されたIL10R結合性分子の結合をさらに調べ、特徴付けるために、以上の分子の選択をhIL10RaおよびhIL10Rb受容体サブユニットへの結合について実施例の教示に実質的にしたがってSPRにより評価し、データを以下の表24および表25に提示した。第1の列は、IL10R結合性分子において使用されたVHH(上記の表5および表6に提供される)ならびにアミノからカルボキシへのそれらの配向性を表し、各々の分子は、ビオチンにコンジュゲートされたVHHの間の4アミノ酸G3Sリンカー(SEQ ID NO:484)と共に発現された。以下の表24および表25に提供されるデータにより示されるように、式[#1]のIL10Rポリペプチド結合性分子は、SPRにより決定された場合にhIL10RaおよびhIL10Rb VHHサブユニットの各々に対する1桁のナノモル濃度の結合親和性を実証する。このデータは、hIL10RaおよびhIL10Rb VHHサブユニットの各々は、それらのそれぞれのIL10受容体サブユニットに対するそれらのそれぞれの結合親和性を保持すること、ならびに、以下により詳細に議論されるように、「フォワード」または「リバース」のいずれの構成において提供されていても、活性を保持したことを実証する。
IL10R結合性分子の活性に対するリンカー長さの効果の評価
本開示において議論されるように、本開示のIL10R二量体VHH IL10R結合性分子の活性は、第1のIL10 VHH単量体と第2のIL10 VHH単量体との間のリンカーの長さを変更することによりモジュレートされてもよい。リンカー長さにおけるバリエーションのバリエーション効果の実例を示すために、各々の場合においてb=1およびL2=Ala-Ser; c=1; ならびにCP=hisx6(SEQ ID NO:532)の式[#1]のIL10R結合性ポリペプチドのシリーズを、以下の表26にしたがってIL10VHH#1配列をDR241(SEQ ID NO 170)と一定に保持しながらIL10VHH#2におけるバリエーションを含有させて調製した。
本開示において議論されるように、本開示のIL10R二量体VHH IL10R結合性分子の活性は、第1のIL10 VHH単量体と第2のIL10 VHH単量体との間のリンカーの長さを変更することによりモジュレートされてもよい。リンカー長さにおけるバリエーションのバリエーション効果の実例を示すために、各々の場合においてb=1およびL2=Ala-Ser; c=1; ならびにCP=hisx6(SEQ ID NO:532)の式[#1]のIL10R結合性ポリペプチドのシリーズを、以下の表26にしたがってIL10VHH#1配列をDR241(SEQ ID NO 170)と一定に保持しながらIL10VHH#2におけるバリエーションを含有させて調製した。
SEQ ID NO:489、490、300、491、492、493、494、302、494、303、495、496および497に対応するIL10R結合性分子に応答して誘導されたpSTAT3のレベルを、野生型ヒトIL10、C末端His6(SEQ ID NO:532)キレート化ペプチドを含み非刺激の野生型IL10を対照として使用してCD4+T細胞、CD8+T細胞および単球における活性について評価した。関与するアッセイのプロトコールおよび方法論は添付の図面の図5に提示される。これらの試験の結果は、添付の図面の図6に提供される。単独でのリンカー長さの効果を明らかにするために、図6のパネルの各々(パネルA、B、およびC)は、IL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbを一定に保持し、リンカーの長さのみを変更している条件を表す。2X、4Xなどの用語はリンカー中のアミノ酸の数を指し、リンカーの配列は表16に提供される。図6に提示されるデータにより示されるように、単独でのリンカー長さのバリエーション(図6の各々のパネルにおいて反映されるようにsdAbおよび他の構成要素を一定に維持する)は、所与の細胞型(例えばCD4+、CD8+、または単球)に関するIL10R結合性分子の活性のレベルをモジュレートするために使用され得るだけでなく、リンカー長さにおけるバリエーションは、別の細胞型に対する、1つの細胞型の活性のモジュレートを反映するために使用され得る。提供されるデータにより示されるように、IL10Ra sdAbとIL10Rb sdAbとの間の距離のバリエーション、一部の事例においてリンカー分子の異なる長さは、pSTAT3活性のレベルにより測定された場合の細胞におけるIL10活性のレベルのモジュレーションを提供することができる。
各々の場合においてa=1、L1=G3S(SEQ ID NO:484)、b=1およびL2=Ala-Ser; c=1; ならびにFc単量体がSEQ ID NO:502のポリペプチドである式[#1]のIL10R結合性ポリペプチドの代表的なシリーズを、以下の表27にしたがってIL10VHH#1配列をDR241(SEQ ID NO 170)と一定に保持しながらIL10VHH#2におけるバリエーションを含有させて調製した:それらの構築において使用されるIL10RaおよびIL10Rb sdAbのこれらの特色および詳細は以下の表27に要約される。
CD4+、CD8+および単球における異なる濃度のこれらの分子の各々の活性に関するデータもまた図6に提供される。これらのFc融合物の各々は、同じ配向性で同じIL10RaおよびIL10Rb sdAbを有する非Fc融合分子と比較して含められたことが留意されるべきである。そのため、図6に提供されるデータはまた、Fcドメインの追加によるIL10R結合性分子のIL10活性に対する効果を評価するために使用されてもよい。提供されるデータから、Fc融合分子は、同じ配向性(フォワードまたはリバース)で同じIL10RaおよびIl10Rb sdAbを含有し、かつ同じリンカー(G3S(SEQ ID NO:484)として参照される4X als、表16を参照)リンカーを有する分子と比較され、Fc融合物は、非Fcバリアントと比べて同等の、一部の事例においては増強された活性を実証した。このデータは、本開示のIL10R結合性分子が、非Fc融合分子と同等の様々な細胞型におけるIL10活性レベルなしで、および該IL10活性レベルを提供して、インビボで延長された寿命を提供するためにFcドメインにコンジュゲートされてもよいことを実証する。
さらなる評価のためのIL10R結合性分子の構築
以上の実験に基づいて、DR521(SEQ ID NO:304)に基づくIL10R結合性分子バリアントの選択されたサブセットをさらなる評価のために選択した。これらの実験において使用された分子は、式[#1]により表すことができ、式中、各々の場合においてa=1、L1=G3S(SEQ ID NO:484)(SEQ ID NOr、b=1およびL2=Ala-Ser; CP=Hisx6(SEQ ID NO:532)、IL10 VHH#1はIL10Ra VHH DR241(SEQ ID NO 170)であり、IL10 VHH#2はIL10Rb VHH DR 246(SEQ ID NO:187)である。SEQ ID NO:170のポリペプチドは本明細書においてDR241とも称され、SEQ ID NO:187のポリペプチドは本明細書においてDR246とも称される。
以上の実験に基づいて、DR521(SEQ ID NO:304)に基づくIL10R結合性分子バリアントの選択されたサブセットをさらなる評価のために選択した。これらの実験において使用された分子は、式[#1]により表すことができ、式中、各々の場合においてa=1、L1=G3S(SEQ ID NO:484)(SEQ ID NOr、b=1およびL2=Ala-Ser; CP=Hisx6(SEQ ID NO:532)、IL10 VHH#1はIL10Ra VHH DR241(SEQ ID NO 170)であり、IL10 VHH#2はIL10Rb VHH DR 246(SEQ ID NO:187)である。SEQ ID NO:170のポリペプチドは本明細書においてDR241とも称され、SEQ ID NO:187のポリペプチドは本明細書においてDR246とも称される。
DR521(DR241-G3S-DR246-ASH6):
1つの態様において、評価のために調製された例示的なポリペプチドは、式[#1]のポリペプチドであって、各々の場合においてa=1、L1=G3S(SEQ ID NO:484)-Ser、b=1およびL2=Ala-Ser; CP=Hisx6(SEQ ID NO:532)、IL10 VHH#1はIL10Ra VHH DR241(SEQ ID NO 170)であり、IL10 VHH#2はIL10Rb VHH DR 246(SEQ ID NO:187)であり:a=1およびL1はG3Sリンカー(SEQ ID NO:484)であり; b=1およびL2は配列Ala-Serを有し; c=1であり、CPはヒスチジンポリペプチド六量体(SEQ ID NO:532)であるものであり、該ポリペプチドはアミノ酸配列:
を有する。
1つの態様において、評価のために調製された例示的なポリペプチドは、式[#1]のポリペプチドであって、各々の場合においてa=1、L1=G3S(SEQ ID NO:484)-Ser、b=1およびL2=Ala-Ser; CP=Hisx6(SEQ ID NO:532)、IL10 VHH#1はIL10Ra VHH DR241(SEQ ID NO 170)であり、IL10 VHH#2はIL10Rb VHH DR 246(SEQ ID NO:187)であり:a=1およびL1はG3Sリンカー(SEQ ID NO:484)であり; b=1およびL2は配列Ala-Serを有し; c=1であり、CPはヒスチジンポリペプチド六量体(SEQ ID NO:532)であるものであり、該ポリペプチドはアミノ酸配列:
を有する。
結合性分子およびsdAb構成要素への修飾
キレート化ペプチド
1つの態様において、本開示は、キレート化ペプチドとして公知の1つまたは複数の遷移金属キレート化ポリペプチド配列を含むIL10Rb1結合性分子を提供する。キレート化ペプチドは、式:
(His)a-(AA)b-(His)c
(式中、「His」はアミノ酸ヒスチジンであり; 「AA」はプロリン以外のアミノ酸であり; はヒスチジン残基であり; a=0~10の整数; b=0~4の整数; c=0~10の整数)のポリペプチド、ならびにそのランダム、ブロックおよび交互コポリマーである。一部の態様において、キレート化ペプチドは、SEQ ID NO:507~521からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。そのような遷移金属キレート化ドメインの組込みは、1986年2月11日に発行されたSmith,et al.、米国特許第4,569,794号明細書に記載されている固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(immobilized metal affinity chromatography; IMAC)での精製を促す。本開示のIL12RB1結合性分子の実施において有用な遷移金属キレート化ポリペプチドの例は、上掲のSmith,et al.および1995年5月10日に発行されたDobeli,et al.、米国特許第5,320,663号明細書(これらの教示全体は参照により本明細書に組み入れられる)に記載されている。本開示のIL12RB1結合性分子の実施において有用な特定の遷移金属キレート化ポリペプチドは、3~6個の連続するヒスチジン残基(SEQ ID NO:569)を含むポリペプチド、例えば6-ヒスチジン(His)6ペプチド(SEQ ID NO:532)であり、当技術分野において「Hisタグ」として頻繁に参照される。組換えタンパク質のための精製「ハンドル」を提供することに加えて、またはSPRセンサーチップ上の固定化を促すために、キレート化ペプチドへのhIL12RB1結合性分子のそのようなコンジュゲーションは、Anderson,et al.(1995年8月8日に発行された米国特許第5,439,829号明細書)およびHale,J.E(1996)Analytical Biochemistry 231(1):46-49の教示に実質的にしたがって動態的に不活性のまたは動態的に不安定な複合体としての遷移金属イオンのIL12RB1発現細胞へのターゲティングされた送達を促す。「動態的に不活性の複合体」に関して、「不活性の」という用語は、その配位圏中の1つまたは複数の配位子の他のものによる置換を結果としてもたらす反応に関与する特定の錯体化イオンの能力に繋がる不安定性の程度を指す。水性環境中で、遷移金属の占有されていない配位位置は水分子により占有される。これらの水分子は、[遷移金属:キレート化ペプチド]複合体を形成するためにキレート化ペプチドまたは有機キレート剤により置換されなければならない。そのような反応が急速に起こる場合、反応は「不安定」(labile)と称される。しかしながら、そのような反応が非常に緩徐に起こる場合、複合体は動態的に「不活性」といわれる。動態的な不安定性または不活発性は、反応速度に関連し、熱力学的な安定性または不安定性と混同されるべきではない。CottonおよびWilkinsonはこの区別を説明している。
キレート化ペプチド
1つの態様において、本開示は、キレート化ペプチドとして公知の1つまたは複数の遷移金属キレート化ポリペプチド配列を含むIL10Rb1結合性分子を提供する。キレート化ペプチドは、式:
(His)a-(AA)b-(His)c
(式中、「His」はアミノ酸ヒスチジンであり; 「AA」はプロリン以外のアミノ酸であり; はヒスチジン残基であり; a=0~10の整数; b=0~4の整数; c=0~10の整数)のポリペプチド、ならびにそのランダム、ブロックおよび交互コポリマーである。一部の態様において、キレート化ペプチドは、SEQ ID NO:507~521からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。そのような遷移金属キレート化ドメインの組込みは、1986年2月11日に発行されたSmith,et al.、米国特許第4,569,794号明細書に記載されている固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(immobilized metal affinity chromatography; IMAC)での精製を促す。本開示のIL12RB1結合性分子の実施において有用な遷移金属キレート化ポリペプチドの例は、上掲のSmith,et al.および1995年5月10日に発行されたDobeli,et al.、米国特許第5,320,663号明細書(これらの教示全体は参照により本明細書に組み入れられる)に記載されている。本開示のIL12RB1結合性分子の実施において有用な特定の遷移金属キレート化ポリペプチドは、3~6個の連続するヒスチジン残基(SEQ ID NO:569)を含むポリペプチド、例えば6-ヒスチジン(His)6ペプチド(SEQ ID NO:532)であり、当技術分野において「Hisタグ」として頻繁に参照される。組換えタンパク質のための精製「ハンドル」を提供することに加えて、またはSPRセンサーチップ上の固定化を促すために、キレート化ペプチドへのhIL12RB1結合性分子のそのようなコンジュゲーションは、Anderson,et al.(1995年8月8日に発行された米国特許第5,439,829号明細書)およびHale,J.E(1996)Analytical Biochemistry 231(1):46-49の教示に実質的にしたがって動態的に不活性のまたは動態的に不安定な複合体としての遷移金属イオンのIL12RB1発現細胞へのターゲティングされた送達を促す。「動態的に不活性の複合体」に関して、「不活性の」という用語は、その配位圏中の1つまたは複数の配位子の他のものによる置換を結果としてもたらす反応に関与する特定の錯体化イオンの能力に繋がる不安定性の程度を指す。水性環境中で、遷移金属の占有されていない配位位置は水分子により占有される。これらの水分子は、[遷移金属:キレート化ペプチド]複合体を形成するためにキレート化ペプチドまたは有機キレート剤により置換されなければならない。そのような反応が急速に起こる場合、反応は「不安定」(labile)と称される。しかしながら、そのような反応が非常に緩徐に起こる場合、複合体は動態的に「不活性」といわれる。動態的な不安定性または不活発性は、反応速度に関連し、熱力学的な安定性または不安定性と混同されるべきではない。CottonおよびWilkinsonはこの区別を説明している。
発現されるべきIL10R結合性分子がキメラ(例えば、IL10R結合性分子および異種ポリペプチド配列を含む融合タンパク質)として発現されるべき場合、キメラタンパク質は、IL10R結合性分子の全体または部分をコードする第1の配列および異種ポリペプチドの全体または部分をコードする第2の配列を含むハイブリッド核酸分子によりコードされ得る。例えば、本明細書に記載される主題IL10R結合性分子は、細菌により発現されるタンパク質の精製を促すためにヘキサ-/オクタ-ヒスチジンタグ(それぞれ、SEQ ID NO:532および534)に、または真核細胞中で発現されるタンパク質の精製を促すためにヘマグルチニンタグに融合されてもよい。第1および第2により、それは融合タンパク質のエレメントの配向性に対する限定として理解されるべきではなく、異種ポリペプチドは、IL10R結合性分子のN末端および/またはC末端のいずれかにおいて連結され得る。例えば、N末端はターゲティングドメインに連結されてもよく、およびC末端はヘキサ-ヒスチジンタグ(SEQ ID NO:532)精製ハンドルに連結されてもよい。
実施例3. シンセカインをコードするDNAの合成
7つの独特の抗hIL-10Rαecd配列(SEQ ID No:44~50)および7つの独特の抗hIL-10Rβecd配列(SEQ ID No:51~57)を各々のコホートから選択し、GGGS(SEQ ID NO:484)をコードするDNAによるリンカー配列により分離された1つのIL-10R□VHHをコードするDNAおよび1つのIL-10RαVHHをコードするDNAからなるDNAを合成した。DNAは、各々の可能なVHH組合せ、および両方の配向性におけるものであり、全部で98個、7×7×2=98個のVHH二量体であった。Ala-Ser(「AS」)リンカー、続いてHis-6(SEQ ID NO:532) DNA(ASH6、SEQ ID NO 560)を各々のDNA構築物の3'末端に加えた。これらの構築物をコードするコドン最適化されたDNA配列はSEQ ID No:290~237として提供され、その構成要素の配向性は本明細書の上記の表2に記載される。
7つの独特の抗hIL-10Rαecd配列(SEQ ID No:44~50)および7つの独特の抗hIL-10Rβecd配列(SEQ ID No:51~57)を各々のコホートから選択し、GGGS(SEQ ID NO:484)をコードするDNAによるリンカー配列により分離された1つのIL-10R□VHHをコードするDNAおよび1つのIL-10RαVHHをコードするDNAからなるDNAを合成した。DNAは、各々の可能なVHH組合せ、および両方の配向性におけるものであり、全部で98個、7×7×2=98個のVHH二量体であった。Ala-Ser(「AS」)リンカー、続いてHis-6(SEQ ID NO:532) DNA(ASH6、SEQ ID NO 560)を各々のDNA構築物の3'末端に加えた。これらの構築物をコードするコドン最適化されたDNA配列はSEQ ID No:290~237として提供され、その構成要素の配向性は本明細書の上記の表2に記載される。
Claims (19)
- (g)IL10Raの第1のサブユニットの細胞外ドメインに特異的に結合する第1の単一ドメイン抗体(sdAb)(IL10Ra sdAb)と、
(h)IL10Rbの細胞外ドメインに特異的に結合する第2の単一ドメイン抗体(IL10Rb sdAb)と
を含む、IL10受容体(IL10R)結合性分子であって、
・IL10Ra sdAbおよびIL10Rb sdAbが安定な会合状態にあり;
・IL10RaおよびIL10Rbが、サイトカイン受容体のコグネイトリガンドとの接触に応答して二量体化し; かつ
・IL10RaおよびIL10Rbを発現している細胞を有効量のIL10R結合性分子と接触させることが、結果としてIL10RaおよびIL10Rbの細胞内ドメインを近接状態にして、細胞内シグナル伝達をもたらす、
該IL10R結合性分子。 - IL10Ra sdAbおよびIL10Rbが共有結合的に連結されている、請求項1記載のIL10R結合性分子。
- IL10Ra sdAbおよびIL10Rbが、リンカーを使用して共有結合的に連結されている、請求項1記載のIL10R結合性分子。
- IL10受容体がポリペプチドである、請求項1記載のIL10R結合性分子。
- IL10R結合性分子IL10Rが、以下の式[#1]のポリペプチドである:
H2N-(IL10 VHH#1)-(L1)a-(IL10 VHH#2)-(L2)b-(CP)c-COOH[#1]
式中:「-」は共有結合を表し; L1およびL2はリンカーであり; CPはキレート化ペプチドであり; a、b、およびcは、整数0または1から独立して選択され; 「H2N」はアミノ末端を表し; ならびに「COOH」はポリペプチドのカルボキシ末端を表す。 - IL10 VHH#1がIL10Ra sdAbでありかつIL10 VHH#2がIL10Rb sdAbであり、IL10 VHH#1がIL10Rb sdAbでありかつIL10 VHH#2がIL10Ra sdAbである、請求項5記載のIL10R結合性分子。
- IL10Ra sdAbが、
・SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、および52のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50および53のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51および54のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3
を含むsdAbであり、
かつIL10Rb sdAbが、
・SEQ ID NO:55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148および151のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR1;
・SEQ ID NO:56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149および152のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR2; ならびに
・SEQ ID NO:57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150および153のいずれか1つの配列と比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するCDR3
を含むsdAbである、
請求項6記載のIL10R結合性分子。 - L10Ra sdAbが、SEQ ID NO:154~171のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するsdAbである、請求項6記載のIL10R結合性分子。
- IL10Rb sdAbが、SEQ ID NO:172~198またはSEQ ID No:199~201のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有するsdAbである、請求項6記載のIL10R結合性分子。
- SEQ ID NO:256~353のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有する、請求項6記載のIL10R結合性分子。
- SEQ ID NO:172~198またはSEQ ID No:199~201のいずれか1つと比べて、少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%)の配列同一性を有するか、または0、1、2、もしくは3個のアミノ酸変化、任意で保存的アミノ酸変化を有する、請求項6記載のIL10R結合性分子。
- 表29(SEQ ID NO:[DR1511~DR1525])のIL10R結合性分子のいずれか1つの配列に対して少なくとも90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%)の配列同一性を有する、請求項6記載のIL10R結合性分子。
- IL10Rbの細胞外ドメインに対するIL10Rb sdAbの親和性よりも高い、IL10Raの細胞外ドメインに対する親和性を、IL10Ra sdAbの親和性が有する、請求項6記載のIL10R結合性分子。
- IL10R結合性タンパク質がPEG化されている、請求項1~13のいずれか一項記載のIL10R結合性分子。
- 請求項1~14のいずれか一項記載のIL10R結合性分子の、薬学的に許容される製剤。
- 請求項6~12のいずれか一項記載のIL10R結合性分子をコードする、核酸配列。
- 請求項16の核酸を含む組換えベクター。ポリペプチドIL10R結合性分子。
- 治療有効量の請求項1~14のいずれか一項記載のIL10R結合性分子の投与により、自己免疫疾患、感染性疾患、または炎症性疾患を患う哺乳動物対象を処置する方法。
- 治療有効量の請求項1~14のいずれか一項記載のIL10R結合性分子の投与により、新生物性疾患を患う哺乳動物対象を処置する方法。
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