CN117242088A - Il10受体结合分子和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供IL10R结合分子,其结合IL10Ra和IL10Rb并包含IL10Rb sdAb和IL10Rb VHH抗体。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年8月5日提交的美国临时申请号63/061,562、2020年9月15日提交的美国临时申请号63/078,745、2021年1月11日提交的美国临时申请号63/135,884和2021年1月11日提交的美国临时申请序列号63/136,098的优先权权益,其公开通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
背景技术
细胞因子和生长因子配体通常通过细胞表面受体亚基的多聚化发出信号。在一些情况下,细胞因子充当多特异性(例如,双特异性或三特异性)配体,其促进此类受体亚基的缔合,使它们的胞内结构域接近,从而可以发生胞内信号转导。细胞因子的性质决定了哪些受体亚基缔合以形成细胞因子受体复合物。因此,细胞因子将单个受体亚基桥接为受体复合物,从而导致胞内信号转导。
细胞因子受体亚基的胞内结构域具有富含脯氨酸的JAK结合结构域,其通常位于细胞膜内表面附近的细胞因子受体亚基的胞内结构域的盒1/盒(box1/box)区域。胞内JAK激酶与JAK结合结构域关联。当胞内结构域受体亚基接近时,通常是通过受体的同源配体与受体亚基的胞外结构域的结合,JAK相互磷酸化。已在哺乳动物细胞中鉴定出四种Janus激酶:JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。Ihle等.(1995)Nature 377(6550):591-4,1995;O'Shea和Plenge(2012)Immunity 36(4):542-50。JAK的磷酸化诱导JAK的构象变化,提供进一步磷酸化其他胞内蛋白质的能力,其启动导致多种胞内因子激活的级联反应,所述胞内因子转导与受体相关的胞内信号,从而导致胞内反应(例如基因转录),通常称为下游信号转导。在许多情况下,被JAK磷酸化的蛋白质是信号转导和转录激活因子(STAT)蛋白家族的成员。迄今为止,已鉴定出哺乳动物STAT家族的七个成员:STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。Delgoffe等,(2011)Curr Opin Immunol.23(5):632-8;Levy和Darnell(2002)NatRev Mol Cell Biol.3(9):651-62以及Murray,(2007)J Immunol.178(5):2623-9。激活的JAK和STAT蛋白的选择性相互作用,统称为JAK/STAT途径,提供了响应细胞因子结合而观察到的多种胞内反应。
人基因组编码大约四十种不同的JAK/STAT细胞因子受体。原则上,可以产生大约1600种独特的同源二聚体和异二聚体细胞因子受体对,并有可能通过不同的JAK/TYK/STAT组合发出信号(Bazan,Proc Natl Acad Sci U S A.87(18):6934-8,1990;Huising等,JEndocrinol.189(1):1-25,2006)。然而,就目前所知,人基因组编码的不同细胞因子配体少于50种(Bazan,Proc Natl Acad Sci U S A.87(18):6934-8,1990;Huising等,JEndocrinol.189(1):1-25,2006),将细胞因子受体复合物的范围限制在那些可由天然配体组装的复合物。鉴于细胞因子配体与细胞因子受体亚基的胞外结构域的相互作用决定了受体复合物中受体亚基的组成,并且细胞内JAK/TYK和RTK酶是简并的,细胞因子和生长因子受体二聚体天然发生配对的数量仅代表系统理论上允许的信号转导-能力型受体配对总数的一小部分。
天然存在的细胞因子配体介导多种细胞反应。在一些情况下,异源多聚细胞因子受体由受体复合物特有的一个或多个受体亚基构成,称为“专有”亚基,其与多个细胞因子受体共享的其他受体亚基相互作用,通常称为“共有”受体亚基。例如,IL7受体是IL7Ra专有亚基和CD132亚基的异二聚体受体复合物,CD132亚基也称为“共有γ”亚基,因为它是多种细胞因子受体复合物(包括IL2、IL4、IL19、IL15和IL21)的共享受体亚基。细胞因子与受体亚基的ECD相互作用的相对亲和力和动力学以及响应于细胞因子结合而形成的复合物的稳定性介导胞内信号转导的性质和强度。在一些情况下,细胞因子与专有亚基的结合增强了完整受体的形成,其中细胞因子对共有亚基的亲和力在不与专有亚基缔合时可能会显著降低。
细胞因子配体和受体亚基之间相互作用的细微差别是一个重要的科学研究问题。例如,天然存在的细胞因子的许多特性表明,它们在人疾病的治疗中具有潜在用途,但此类天然存在的细胞因子也可能引发不利和不良影响。在许多情况下,疾病与表达潜在治疗性细胞因子受体的具体细胞类型有关。然而,细胞因子受体也表达在其他不希望成为治疗干预靶标的细胞类型上。天然配体的给予激活两种细胞类型,导致不期望的副作用。
为了尝试产生能够选择性激活所需细胞类型的细胞因子类似物,已经产生了各种工程改造的细胞因子配体(或其组分),以选择性地调节它们与受体亚基的胞外结构域的亲和力。这些努力已经产生了细胞因子变体,这些变体已显示可提供部分活性,其导致配体的有益特性与不期望影响的解偶联。参见,例如,Mendoza等,(2019)567:56–60。然而,此类选择性细胞因子配体的工程改造是基于对配体和受体界面处个体氨基酸残基的选择性调节。这种用于调节细胞因子受体亲和力的蛋白质工程方法需要受体与细胞因子相互作用的三维(通常是X射线晶体学)图谱,以鉴定与受体亚基相互作用的细胞因子残基。此外,这些界面残基处的氨基酸取代的影响可以是高度可变的,通常需要大量耗时的反复试错来确认产生所需活性概况所需的特定氨基酸取代。然而,即使实现了具有所需信号转导概况的工程改造的细胞因子,许多蛋白质对氨基酸取代高度敏感,导致重组表达出现显著问题,无论是在哺乳动物表达系统还是原核系统中,此类氨基酸取代表达于包涵体中时都可以影响蛋白质重折叠。当细胞因子本身是异二聚体时,上述问题尤为突出。例如,IL12是由p35和p40亚基组成的异二聚体。在与受体亚基的界面(例如p40/IL12Rb2界面)处对细胞因子亚基配体工程改造的一个亚基界面的一个残基进行工程改造可能会导致细胞因子配体亚基(例如p35和p40)的缔合问题。此外,IL12的p40亚基作为单体和同二聚体发挥作用,其活性也可能受到此类氨基酸取代的影响。因此,本领域需要提供具有细胞因子活性的分子,其可以很容易地生成和工程改造以获得受体亲和力,并且不具有独立的脱靶活性。
附图简要说明
附图的图1提供了本公开的结合分子的一个实施方式的示意图,其包含第一单域抗体(1)和第二单域抗体(3)以及接头(2),其描述为与细胞膜(10)相关的异二聚体受体相互作用,该异二聚体受体包含含有胞外结构域(4)、跨膜结构域(5)和与结合分子相互作用的胞内结构域(6)的第一受体亚基,以及包含含有胞外结构域(7)、跨膜结构域(8)和胞内结构域(9)的第二第一受体亚基,其中结合分子的第一受体(6)的胞内结构域和第二受体(9)的胞内结构域在接近距离(11)内。
附图的图2提供了本公开的结合分子的两种说明性构型的示意图。分图A提供了说明性单条多肽链结合分子的示意图,其包含从氨基到羧基的第一单域抗体(1)和第二单域抗体(3)和接头(2)。分图B提供了包含第一单域抗体(1)和第二单域抗体(3)和接头(2)和杵臼(knob-into-hole)Fc结构域的结合分子的示意图,其包含作为Fc杵(13)的第一亚基和作为Fc臼(14)的第二亚基,其中单域抗体通过IgG铰链序列(12)与Fc结构域稳定缔合。
附图的图2提供了本公开的结合分子的两种说明性构型的示意图。分图A提供了包含第一单域抗体(1)和第二单域抗体(3)和接头(2)的说明性结合分子的示意图。分图B提供了包含两条多肽链的结合分子的示意图,第一多肽链包含(从氨基到羧基)第一单域抗体(1)、接头序列、第二单域抗体(3)、IgG铰链序列(12)和Fc杵结构域(13),第二多肽包含Fc臼(14),其中第一和第二多肽通过杵臼Fc结构域的相互作用稳定缔合。
附图的图3提供了本公开的结合分子的两种说明性构型的示意图。分图A提供了一个示例性结合分子构建体的示意图,该结合分子构建体包含两个结合分子,每个结合分子都连接到杵臼Fc结构域的亚基上,该构建体包含两条多肽链,第一多肽链(从氨基到羧基)包含第一单域抗体(1)、接头(2)和第二单域抗体(3)、IgG铰链序列(12)和Fc杵亚基(13),第二多肽链(从氨基到羧基)包含第一单域抗体(1)、接头(2)和第二单域抗体(3)、IgG铰链序列(12)和Fc臼亚基(14),其中第一和第二多肽通过杵臼Fc结构域的相互作用稳定缔合。分图B提供了结合分子构建体的替代排列的示意图,该结合分子构建体包含两条多肽,第一多肽链(从氨基到羧基)包含第一单域抗体(1)、接头(2)和第二单域抗体(3)、IgG铰链序列(12)和Fc杵亚基(13),第二多肽链(从氨基到羧基)包含第一第二域抗体(3)、接头(2)和第一单域抗体(1)、IgG铰链序列(12)和Fc臼亚基(14),其中第一和第二多肽通过杵臼Fc结构域的相互作用稳定缔合。
图4,分图A提供了本公开的结合分子的构型的替代示意图,其中一个单域抗体连接至包含两个多肽的杵臼Fc结构域的每个亚基,第一多肽从氨基到羧基包含第一单域抗体(1)、IgG铰链序列(12)和Fc杵亚基(13),第二多肽从氨基到羧基包含第二单域抗体(3)、IgG铰链序列(12)和Fc臼亚基(13),其中第一和第二单域抗体通过杵臼Fc结构域的相互作用稳定缔合。
图4,分图B提供了结合分子的示意图,结合结构域是通过过渡金属配位共价复合物缔合的单域抗体。如图所示,结合分子包含两个多肽亚基:第一亚基包含第一单域抗体(1)的通过第一接头(15)连接至第一螯合肽(17),第二亚基包含第二单域抗体(3)的通过第二接头(16)连接至第二螯合肽(18),其中第一螯合肽(17)和第二螯合肽(18)与单个过渡金属离子(“M”)形成配位共价复合物。过渡金属离子可以处于动力学不稳定或动力学惰性氧化状态。
附图的图5提供了用于评估IL10R结合分子在分离自PBMC的单核细胞、CD4T细胞和CD8 T细胞中的活性受接头长度影响的方案示意图。
附图的图6提供了来自评估IL10R多肽结合分子和诱导IL10活性的能力的数据,如磷酸化STAT3(Y轴)和X轴上不同浓度的IL10R结合分子测试品所测,以评估IL10Ra和IL10RbsdAb之间距离的变化对IL10活性的影响。在所有实验中,多肽IL10R结合分子的n端IL10RasdAb是DR241。在分图A中,C端IL2Rb sdAb是DR244。在分图B中,C端IL2Rb sdAb是DR246。在分图C中,C端IL2Rb sdAb是DR247。各种线条代表IL10R结合分子,其中IL10Ra和IL10RbsdAb之间的距离随接头长度而变化。
发明概述
本公开提供了可用于细胞受体的配对以产生可用于治疗哺乳动物对象疾病的所需效果的组合物。
本公开提供了至少包含特异性结合第一受体亚基的第一结构域和特异性结合第二受体亚基的第二结构域的组合物,使得在与表达第一和第二受体的细胞接触时,该组合物引起第一和第二受体的功能性缔合,从而引发它们的相互作用并导致下游信号转导。在一些实施方式中,第一和第二受体响应同源配体结合而发生接近,并且在本文中被称为“天然”细胞因子受体对。
在一个实施方式中,本公开提供结合分子,其包含结合IL10受体的IL10Ra的第一结构域和结合IL10受体的IL10Rb的第二结构域,使得在与表达IL10Ra受体和IL10Rb受体的细胞接触后,IL10R结合分子引起IL10Ra和IL10Rb的功能性缔合,从而导致受体和下游信号转导的功能性二聚化。
本公开提供公开提供作为细胞因子受体的配体的细胞因子受体结合分子,所述细胞因子受体结合分子包含:
(a)特异性结合细胞因子受体的第一亚基胞外结构域的第一单域抗体(sdAb);和
(b)特异性结合细胞因子受体亚基的第二亚基的胞外结构域的第二单域抗体;
其中:
·第一sdAb和第二sdAb稳定缔合;
·响应于与细胞因子受体的同源配体接触,细胞因子受体的第一和第二亚基二聚化;和
·将表达细胞因子受体的第一和第二亚基的细胞与有效量的细胞因子受体结合分子接触,导致细胞因子受体的第一和第二亚基的胞内结构域接近并导致胞内信号转导。
本公开的IL10R结合分子包含两个或更多单域抗体,其选择性结合IL10Ra和IL10Rb受体亚基的胞外结构域。在一个实施方式中,本公开提供了一种IL10受体(IL10R)结合分子,其为IL10R受体的配体,该IL10R受体结合分子包含:
(c)特异性结合IL10受体的IL10Ra亚基胞外结构域的第一单域抗体(sdAb)("IL10Ra sdAb"),和
(d)特异性结合IL10受体的IL10Rb亚基胞外结构域的第二单域抗体(sdAb)("IL10Rb sdAb"),
其中:
·第一sdAb和第二sdAb稳定缔合;
·IL10受体的IL10Ra和IL10Rb亚基响应于与IL10R结合分子的接触而二聚化;和
·将表达IL10Ra和IL10Rb的细胞与有效量的IL10R结合分子接触导致IL10Ra和IL10Rb的胞内结构域接近和胞内信号转导。
在一个实施方式中,细胞因子受体结合分子是IL10受体的配体并且包含特异性结合IL10Ra受体亚基胞外结构域的第一sdAb和特异性结合IL10Rb受体亚基胞外结构域的第二sdAb。
在一些实施方式中,抗IL10RαsdAb是VHH抗体(抗IL10RαVHH抗体)和/或抗IL10RβsdAb是VHH抗体(抗IL10RβVHH抗体)。在一些实施方式中,抗-IL10RαsdAb和抗-IL10RβsdAb通过肽接头连接。在一些实施方式中,肽接头包含1至50个氨基酸。
在另一个方面,本公开提供了一种在有此需要的对象中治疗肿瘤疾病(例如癌症)的方法,包括向对象给予本文所述的IL10R结合蛋白,其中IL10R结合蛋白结合并激活CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞和/或Treg细胞。在一些实施方式中,IL10R结合蛋白提供比聚乙二醇化IL10更长的治疗功效。在一些实施方式中,癌症是实体瘤癌症。
在其他方面,本文所述的IL10R结合蛋白也可用于治疗炎性疾病(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎),以及自身免疫性疾病(例如银屑病、类风湿性关节炎和多发性硬化症)。
在一些实施方式中,结合分子的一个sdAb是scFv,另一个sdAb是VHH。
在一些实施方式中,第一和第二sdAb通过化学连接共价结合。
在一些实施方式中,第一和第二sdAb作为单条连续多肽提供。
本发明提供了IL10R结合分子,其为IL10受体的合成配体。
在一些实施方式中,本发明的IL10R结合分子是下式[#1]的多肽:
H2N-(IL10 VHH#1)–(L1)a–(IL10 VHH#2)–(L2)b-(CP)c-COOH [#1]
其中:“—”代表共价键;L1和L2是接头;CP是螯合肽;a、b和c独立地选自整数0或1;“H2N”表示氨基末端;并且“COOH表示多肽的羧基末端”
在一些实施方式中,本发明提供的IL10R结合分子是下式[#1]的多肽,其中IL10VHH#1是ILRa sdAb,IL10 VHH#2是IL10Rb sdAb,IL10 VHH#1是ILRb sdAb并且IL10 VHH#2是IL10Ra sdAb。
在一些实施方式中,本发明提供了包含IL10Ra sdAb的IL10R结合分子,其包含:
·相对于SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49和52中任一个的序列,CDR1具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;
·相对于SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50和53中任一个的序列,CDR2具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;和
·相对于SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51和54中任一个的序列,CDR3具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化。
在一些实施方式中,本发明提供了包含IL10Rb sdAb的IL10R结合分子,其包含:
·相对于SEQ ID NO:55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148和151中任一个的序列,CDR1具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;
·相对于SEQ ID NO:56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149和152中任一个的序列,CDR2具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;和
·相对于SEQ ID NO:57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150和153中任一个的序列,CDR3具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化。
在一些实施方式中,本发明提供IL10R结合分子,相对于SEQ ID NO:154-171中的任一个,其包含至少90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的IL10Ra sdAb,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化。
在一些实施方式中,本发明提供IL10R结合分子,相对于SEQ ID NO:172-198或SEQID NO:199-201中的任一个,其包含至少90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的IL10Rb sdAb,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化。
在一些实施方式中,本发明提供IL10R结合分子,相对于SEQ ID NO:256-353中的任一个,其包含至少90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化。
在一些实施方式中,本发明提供IL10R结合分子,相对于SEQ ID NO:172-198或SEQID NO:199-201中的任一个,其包含具有至少90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的IL10Rb sdAb,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化。
在一些实施方式中,本发明提供与表29的任何一种IL10R结合分子的序列(SEQ IDNO:[DR1511-DR1525])具有至少90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的IL10R结合分子。在一些实施方式中,本发明提供与表29的任何一种IL10R结合分子(SEQ ID NO:[DR1511-DR1525])基本同一的IL10R结合分子。在一些实施方式中,本发明提供与表29的任何一种IL10R结合分子(SEQ ID NO:[DR1511-DR1525])的序列同一的IL10R结合分子。
在一个实施方式中,本公开提供了一种IL10Ra结合分子,其相对于单核细胞优先激活T细胞,特别是CD8+T细胞。在一个实施方式中,本公开提供了式#1的IL10Ra结合分子,其中IL10Ra sdAb对IL10Ra胞外结构域的亲和力高于IL10Rb sdAb对IL10Rb胞外结构域的亲和力。
在一些实施方式中,本公开提供经修饰的IL10R结合分子以在哺乳动物对象体内提供延长的作用时间,及其药学上可接受的制剂。在一些实施方式中,本发明提供聚乙二醇化的式#1的IL10R结合分子,其中PEG偶联至IL10R结合分子,并且PEG是直链或支链PEG分子,其具有约2,000至约80,000道尔顿、或约2,000至约70,000道尔顿、或约5,000至约50,000道尔顿、或约10,000至约50,000道尔顿、或约20,000至约50,000道尔顿、或约30,000至约50,000道尔顿、或20,000至约40,000道尔顿或约30,000至约40,000道尔顿分子量。在本公开的一个实施方式中,PEG为包含两个20kD臂的40kD支链PEG。
本公开的IL10R结合分子可用于治疗或预防哺乳动物对象的疾病。在一些实施方式中,本公开通过给予本公开治疗有效量的IL10R结合分子来治疗或预防哺乳动物对象的自身免疫性疾病。在一些实施方式中,本公开通过给予本公开治疗有效量的IL10R结合分子来治疗或预防哺乳动物对象的传染性疾病(包括病毒和慢性病毒感染)。在一些实施方式中,本公开通过给予本公开治疗有效量的IL10R结合分子来治疗或预防哺乳动物对象的肿瘤性疾病。在一些实施方式中,本公开通过给予本公开治疗有效量的IL10R结合分子与一种或多种辅助治疗剂的组合来治疗或预防哺乳动物对象的肿瘤、传染性或自身免疫。
本公开还提供了用于向哺乳动物对象给予的IL10R结合分子的药学上可接受的制剂。本公开还提供了一种药学上可接受的组合物,用于向哺乳动物对象给药,该组合物包含编码多肽IL10R结合分子的核酸序列、编码多肽IL10R结合分子的重组病毒或非病毒载体、或包含编码多肽IL10R结合分子的核酸序列的重组修饰的哺乳动物细胞,在每种情况下该核酸序列操作性地连接至在哺乳动物细胞中有功能的一种或多种表达控制元件。
本公开提供了编码多肽IL10R结合分子的核酸序列。本公开还提供了包含编码多肽IL10R结合分子的核酸序列的重组载体。本公开还提供了一种重组修饰的哺乳动物细胞,其包含编码多肽IL10R结合分子的核酸。本公开还提供了重组载体的多肽IL10R结合分子的重组产生、分离、纯化和表征的方法,其包含并提供了编码多肽IL10R结合分子的核酸序列。
本公开还提供了一种表达载体,其包含编码操作性地连接至一个或多个表达控制序列的双特异性结合分子的核酸。本公开还提供了一种分离的宿主细胞,其包含表达载体,表达载体包含编码双特异性结合分子的核酸,其操作性地连接至在宿主细胞中有功能的一个或多个表达控制序列。
在另一个方面,本公开提供了一种药物组合物,其包含本文所述的IL10R结合分子和药学上可接受的运载体。
在另一个方面,本公开提供了一种在有需要的对象中治疗自身免疫或炎性疾病、病症或病况或病毒感染的方法,包括向对象给予治疗有效量的本文所述的IL10R结合分子或本文所述的药物组合物。
本文描述的结合分子有几个优点。IL10受体的天然配体IL10导致IL10Ra和IL10Rb接近(即通过它们对IL10的同时结合)。然而,当IL10在哺乳动物(特别是人)对象中被用作治疗剂时,它也可能通过多种机制引发许多不利和不良影响,包括IL10Ra和IL10Rb在其他细胞类型上的存在以及与其他细胞类型上的IL10Ra和IL10Rb的结合可能会对表达IL10Ra和IL10Rb的细胞产生不良影响和/或不期望的信号转导。本公开内容涉及调节IL10Ra和IL10Rb结合的多重效应的方法和组合物,以便发生所需的治疗信号转导,特别是在所需的细胞或组织亚型中,同时最小化不期望的活性和/或胞内信号转导。
在一些实施方式中,本文所述的IL10R结合分子是IL10受体的部分激动剂。在一些实施方式中,本文所述的结合分子被设计为使得结合分子是完全激动剂。在一些实施方式中,本文所述的结合分子被设计为使得结合分子是超级激动剂。
在一些实施方式中,结合分子通过与所需细胞类型上的IL10Ra和IL10Rb的结合提供最大所需的IL10胞内信号转导,同时对其他不期望的细胞类型提供显著更少的IL10信号转导。例如,这可以通过选择具有不同亲和力,或与IL10对IL10Ra和IL10Rb的亲和力相比,对IL10Ra和IL10Rb造成不同的E最大的结合分子来实现。因为不同的细胞类型以不同的灵敏度响应配体与其同源受体的结合,通过调节二聚体配体(或其单个结合部分)对IL10受体相对于野生型IL10结合的亲和力促进所需活性的刺激同时减少对非靶标细胞的不期望的活性。
具体实施方式
为了便于理解本公开,某些术语和短语定义于下文以及整个说明书。本文提供的定义是非限制性的,应根据本领域技术人员的知识阅读。
在描述本发明的方法和组合物之前,应理解,本发明不限于所述的方法或组合物,因为它们当然可能改变。还应理解,本文中使用的术语仅意在描述实施方式,并不旨在进行限制。
提供数值范围时,也应视作具体公开了该范围的上限和下限之间以下限单位十分之一为间隔的各中间数值,除非上下文另有明确说明。本发明还包括设定范围内任何设定数值或中间数值和该设定范围内任何其它设定数值或中间数值之间的较小范围。取决于设定范围内任何明确排除的限值,所述范围可独立地包含或排除这些较小范围的上下限,本发明也包括这些较小范围不包含限值、包含任一或两个限值的各范围。设定范围包含一个或两个限值时,本发明也包括排除所述限值之一个或两个的范围。
除非另有说明,本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。虽然也可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明,但在此描述一些潜在和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用纳入本文,以公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。
应注意,本文和所附权利要求书所用的单数形式"一个"、"一种"和"所述"包括复数含义,除非上下文另有明确说明。因此,例如,提到"细胞"包括多个这样的细胞,提到"所述肽"包括本领域技术人员已知的一或多个肽及其等同物,例如多肽,等等。
提供本文讨论的出版物仅针对其在本申请提交日之前的公开。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些出版物。此外,所提供的出版日期可能与实际公开日期不同,这可能需要单独确认。
除非另有说明,份数是重量份数,分子量是重均分子量,温度是摄氏度(℃),压力是大气压或接近大气压。使用标准缩写,包括下述:bp=碱基对;kb=千碱基;pl=皮升;s或sec=秒;min=分钟;h或hr=小时;AA或aa=氨基酸;kb=千碱基;nt=核苷酸;pg=皮克;ng=纳克;μg=微克;mg=毫克;g=克;kg=千克;dl或dL=分升;μl或μL=微升;ml或mL=毫升;l或L=升;μM=微摩尔;mM=毫摩尔;M=摩尔;kDa=千道尔顿;i.m.=肌肉内(经肌肉内);i.p.=腹膜内(经腹膜内);SC或SQ=皮下(经皮下);QD=每日一次;BID=每日两次;QW=每周一次;QM=每月一次;HPLC=高效液相色谱;BW=体重;U=单元;ns=无统计学显著性;PBS=磷酸盐缓冲盐水;PCR=聚合酶链式反应;HSA=人血清白蛋白;MSA=小鼠血清白蛋白;DMEM=达氏改良伊氏培养基;EDTA=乙二胺四乙酸。
应理解,在本公开内容中,根据单字母或三字母代码提及氨基酸。为了方便阅读者,单字母和三字母氨基酸代码在下表1中提供。
科学文献中描述了分子生物学的标准方法(参见,例如,Sambrook和Russell(2001)《分子克隆》(Molecular Cloning),第3版,冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press),纽约冷泉港;和Ausubel,等(2001)《新编分子生物学指南》(Current Protocols in Molecular Biology),卷1-4,约翰威利父子公司(John Wileyand Sons,Inc.)纽约州纽约,其描述了在细菌细胞中克隆和DNA定点诱变(卷1)、哺乳动物细胞中和酵母中的克隆(卷2)、糖偶联物和蛋白质表达(卷3),以及生物信息学(卷4))。科学文献描述了用于蛋白质纯化的方法,包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶,以及化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的生产和蛋白糖基化(参见,例如,Coligan,等(2000)《新编蛋白质科学方案》(Current Protocols in Protein Science),卷.1-2,约翰威利父子公司(John Wiley and Sons,Inc.),NY)。
定义:
除非另有说明,下述术语意在具有如下含义。在整个说明书中定义了其他术语。
激活:本文所用术语“激活”用于指受体或受体复合物以反映直接和/或通过参与多组分信号转导级联产生的生物学效应,该生物学效应是对配体的结合响应,由激动剂配体结合至受体引起的。
活性:如本文所用术语“活性”是针对分子而言,以描述分子相对于测试系统(例如,试验)的特性或生物学或化学特性(例如该分子结合至另一分子的程度)或材料或细胞的物理学特性(例如细胞膜电位的改变)。这种生物学功能的示例包括但不限于生物剂的催化活性、刺激胞内信号转导的能力、基因表达、细胞增殖、调节免疫学活性(如炎症反应)的能力。“活性”通常表示为每个单元的测试试剂的生物活性水平,例如[催化活性]/[mg蛋白质]、[免疫活性]/[mg蛋白质],活性的国际单位(IU),[STAT5磷酸化]/[mg蛋白质]、[T-细胞增殖]/[mg蛋白质]、噬斑形成单位(plaque forming units)(pfu)等。如本文所用,术语“增殖活性”是指促进细胞增殖和复制的活性。
给药/给予:术语“给予”、“给药”和“施用”在本文中可互换使用,指的是接触对象的行为,包括用试剂与对象体外、体内或离体的细胞、组织、器官或生物流体接触(例如,直向同源物、IL2直向同源物、表达正交受体的工程改造的细胞、表达正交IL2受体的工程改造的细胞、表达正交IL2受体的CAR-T细胞、化疗剂、抗体或包含上述一种或多种的药物制剂)。试剂的给予可以通过多种本领域公认的方法中的任何一种来实现,包括但不限于局部给予、血管内注射(包括静脉内或动脉内输注)、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、吸入等。术语“给予”包括试剂与细胞、组织或器官的接触,以及试剂与液体的接触,其中液体与细胞、组织或器官接触。
亲和力:如本文所用术语“亲和力”是指第一分子(例如配体)特异性结合至第二分子(例如受体)的程度,以平衡解离常数(KD)衡量,其为分子与其靶标之间的解离速率常数(Koff)和分子与其靶标之间的缔合速率常数(Kon)的比率。
激动剂:如本文所用,术语“激动剂”是指特异性结合至第二试剂(“靶标”)并与靶标相互作用以引起或促进靶标激活的增加的第一试剂。在一些情况下,激动剂是受体蛋白的激活剂,可以调节细胞激活、增强激活、使细胞对第二试剂的激活敏感、或上调一个或多个基因、蛋白质、配体、受体、生物学途径,其可能导致细胞增殖或导致细胞周期停止,或导致细胞死亡(如通过凋亡)的途径的表达。在一些实施方式中,激动剂是结合至受体并改变受体状态,导致生物学响应的试剂。该响应模拟受体的内源性激活剂的效果。术语“激动剂”包括部分激动剂、完全激动剂和超级激动剂。当激动剂导致所研究的受体诱发的基本完全的生物响应(即与天然存在的配体/受体结合相互作用有关的响应)时,可将这种激动剂描述为“完全激动剂”,或者,激动剂也可以被描述为部分激动剂。与激动剂相反,拮抗剂可以特异性地结合至受体,但不导致通常由受体启动的信号级联,并且可以改变激动剂在该受体上的作用。反向激动剂是指产生与激动剂方向相反的药理反应的药剂。"超级激动剂"是能够产生大于靶受体的内源性激动剂的最大响应的激动剂,因此具有超过天然配体的100%的活性。超级激动剂通常是合组分子,在比较试验中以类似的浓度评估时,在分子的天然存在形式的可评估的定量或定性参数中,其表现出大于110%、或者大于120%、或者大于130%、或者大于140%、或者大于150%、或者大于160%、或者大于170%的响应。
拮抗剂:如本文所用,术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指与激动剂一种或多种作用相对的分子。拮抗剂可以防止、减少、抑制或中和激动剂的活性,而且拮抗剂也可以防止、抑制或减少靶标(如靶受体)的组成型活性,即使没有鉴定的激动剂。抑制剂是减少、阻断、防止、延迟激活、失活、脱敏或下调的分子,例如,基因、蛋白质、配体、受体、生物学途径或细胞。
抗体:如本文所用,术语“抗体”统称指:(a)糖基化的和非糖基化的免疫球蛋白(包括但不限于哺乳动物免疫球蛋白类别IgG1、IgG2、IgG3和IgG4),它们特异性结合至靶分子,和(b)免疫球蛋白衍生物,其包括但不限于IgG(1-4)ΔCH2、F(ab’)2、Fab、ScFv、VH、VL、四抗、三抗、双抗、dsFv、F(ab’)3、scFv-Fc和(scFv)2,它们与其来源的免疫球蛋白竞争结合至靶分子。术语抗体不限于来自任何特定哺乳动物物种(包括鼠、人、马、骆驼)的免疫球蛋白、人抗体。术语抗体包括所谓的“重链抗体”或“VHH”或通常获取自骆驼科(包括骆驼、美洲驼和羊驼)的免疫(参见,例如Hamers-Casterman,等(1993)Nature 363:446-448)。具有给定特异性的抗体也可以来源于非哺乳动物来源,例如从软骨鱼(包但不限于鲨鱼)的免疫中获得的VHH。术语“抗体”包括可从天然来源或用抗原免疫后从动物身上分离的抗体,以及工程改造抗体,包括单克隆抗体、双特异性抗体、三特异性、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR移植的、饰面(veneered)的或去免疫化的(例如,去除T细胞表位)抗体。术语“人抗体”包括从人获得的抗体,以及从包含人免疫球蛋白基因的转基因哺乳动物中获得的抗体,使得,在抗原刺激后,转基因动物产生包含人产生的抗体的氨基酸序列特征的抗体。该术语包括亲本抗体及其衍生物,如亲和成熟的、饰面的、CDR移植的(包括CDR移植的VHH)、人源化的、骆驼源化的(在非骆驼衍生的VHH的情况下),或非免疫球蛋白支架中包含的抗体的结合结构域(如CDR)的结合分子。术语"抗体"不限于任何特定的合成方式,包括可从天然来源分离的天然存在的抗体,以及通过"重组"手段制备的工程改造抗体分子,所述工程改造的抗体分子包括从转人免疫球蛋白基因的转基因动物或由其制备的杂交瘤分离的抗体,从转化了导致抗体表达的核酸构建体的宿主细胞中分离出的抗体,从组合抗体文库(包括噬菌体展示文库)中分离出的或化学合成(例如固相蛋白合成)的抗体。在一个实施方式中,“抗体”是哺乳动物的免疫球蛋白。在一些实施方式中,该抗体是“全长抗体”,其包括提供结合和效应功能的可变和恒定结构域。在大多数情况下,全长抗体包括两条轻链和两条重链,各轻链包括可变区和恒定区。在一些实施方式中,术语“全长抗体”用于指常规的IgG免疫球蛋白结构,包括两条轻链和两条重链,各轻链包括提供结合和效应功能的可变区和恒定区。术语抗体包括抗体偶联物,其包括为延长作用时间而进行的修饰,例如融合蛋白或与偶联至聚合物(如PEG化的),在下文更详细地描述。
结合分子如本文所用,术语“结合分子”是指可以结合两个细胞表面受体的胞外结构域的二价分子。在一些实施方式中,结合分子特异性结合两个不同的受体(或其结构域或其亚基),使得受体(或结构域或亚基)保持彼此接近,使得受体(或结构域或亚基),包括其结构域(例如,胞内结构域)相互作用并导致下游信号转导。
CDR:如本文所用,术语“CDR”或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽免疫球蛋白多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。CDR已由Kabat等,J.Biol.Chem.252:6609-6616(1977);Kabat等,(1991)美国卫生及公共服务部出版物题为“免疫学热门蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”(本文中也称为“Kabat 1991”或“Kabat”);Chothia等,(1987)J.Mol.Biol.196:901-917(本文中也称为“Chothia”);以及MacCallum等(1996)J.Mol.Biol.262:732-745描述,其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。不过,述及抗体或移植抗体或其变体的CDR定义意在落在本文定义或所用术语范围之内。如本文所用术语“Chothia编号”是本领域公认的术语,指基于结构环区的位置编号氨基酸残基的系统(Chothia等1986,Science 233:755-758;Chothia和Lesk 1987,JMB 196:901-917;Chothia等1992,JMB 227:799-817)。出于本公开的目的,除非另有特别说明,抗体可变区域中CDR2和3的定位遵循Kabat编号或简称为"Kabat"。抗体可变区域中CDR1的定位遵循Kabat和Chothia编号方案的混杂。
克隆型:如本文所用,克隆型是指源自同一B细胞祖细胞的结合分子的集合。术语“克隆型”用于指属于同一种系家族、具有相同CDR3长度且在CDR3序列中具有70%或更高同源性的抗原结合分子的集合。
相当的:如本文所用,术语“相当的”用于描述可评价的定量或定性参数的两个测量结果的差异程度。例如,当可评价的定量参数的第一测量结果和该可评价参数的第二测量结果没有偏离本领域技术人员将会认为两个结果之间不会产生统计学显著性差异的范围,那么这两个测量将被视为“相当的”。在一些情况下,如果一个测量结果偏离另一个测量结果少于30%、或者少于25%、或者少于20%、或者少于15%、或者少于10%、或者少于7%、或者少于5%、或者少于4%、或者少于3%、或者少于2%或者少于1%,则测量结果可被视为“相当的”。在特定的实施方式中,如果一个测量结果偏离参考标准少于15%、或者少于10%、或者少于5%,则该测量结果与参考标准是相当的。
保守氨基酸取代:如本文所用,术语“保守氨基酸取代”是指将给定氨基酸改变为具有类似生物化学特性(例如电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸的氨基酸替代。例如,以下各组中的氨基酸可以被认为是彼此的保守氨基酸:(1)疏水性氨基酸:丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸和甘氨酸;(2)极性氨基酸:谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸;(3)碱性氨基酸:赖氨酸和精氨酸;和(4)酸性氨基酸:天冬氨酸和谷氨酸。
来源于:如本文所用术语“来源于”,在氨基酸序列或多核苷酸序列的上下文中(例如氨基酸序列“来源于”)意为表示多肽或核酸具有基于参考多肽或核酸的序列(例如天然存在的多肽或编码的核酸),不意在被限制为制备蛋白质或核酸的来源或方法。举例而言,术语“来源于”包括参考氨基酸或DNA序列的同源物或变体。
有效浓度(EC):如本文所用,术语“有效浓度”或其缩写“EC”互换使用表示试剂(例如,hIL2突变蛋白)的浓度为足以使测试系统中给定参数改变的量。缩写“E”指的是当测试系统被暴露于测试试剂时,测试系统中观察到的给定生物学效应的量级。当反应的量级以测试试剂的浓度(“C”)的因数表示时,使用缩写“EC”。在生物系统的环境下,术语E最大指的是在响应于激活测试试剂的饱和浓度中观察到的给定生物学效应的最大量级。当提供带下标的缩写EC(例如,EC40、EC50等)时,下标是指在该浓度观察到生物学效应的E最大的百分比。例如,在测试系统中,响应于此测试试剂,测试试剂足以导致可测量的生物学参数减少这种可测量的生物学参数的最大水平的30%的浓度,针对此生物学参数,其被称为该测试试剂的“EC30”。类似地,术语“EC100”用于表示试剂的有效浓度,该浓度使得可测量参数对该试剂产生最大(100%)反应。类似地,术语EC50(其通常用于药代动力学领域)是指足以导致可测量参数半最大(50%)改变的试剂浓度。术语“饱和浓度”是指在标准温度和压力的条件下,测试试剂能够溶于标准体积的特定溶剂(例如水)的最大可能量。在药代动力学中,药物的饱和浓度通常用于表示足以使所有可用受体被药物占据的药物浓度,而EC50是给予半最大效应的药物浓度。测试试剂的特定有效浓度的EC可以相对于特定参数和测试系统的方面进行缩写。
富集的:如本文所用的术语“富集的”是指对样品进行非天然操作,使感兴趣的物质(例如分子或细胞)以以下特点存在:(a)比物质在起始样品(如生物样品,例如在该样品中分子天然存在或在给药后存在)中的浓度高(例如,至少高3倍、或者至少高5倍、或者至少高10倍、或者至少高50倍、或者至少高100倍、或者至少高1000倍);或(b)浓度高于制备该分子的环境(例如,如在重组修饰的细菌或哺乳动物细胞中)。
胞外结构域:如本文所用术语“胞外结构域”或其缩写“ECD”是指细胞质膜外侧的细胞表面蛋白质部分(例如细胞表面受体)。术语“ECD”可以包括跨膜蛋白的胞质外部分或细胞表面的胞质外部分(或膜关联蛋白)。
同一性:如本文所用,在核酸或多肽的上下文中使用的术语“百分比(%)序列同一性”或“基本同一”是指与参考序列具有至少50%序列同一性的序列。另外,百分比序列同一性可以是50%到100%之间的任何整数。在一些实施方式中,如使用如下所述的标准参数通过BLAST确定的,序列与参考序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。为了序列比较,一般将一个序列用作与测试序列比较的参比序列。当使用序列比较算法时,将测试和参比序列输入计算机,如果需要,指定子序列坐标,并指定序列算法程序参数。可使用默认的程序参数,或者可指定另外的参数。然后,序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参比序列的序列同一性百分比。比较窗口包括对多个连续位置中的任一个的区段的参考,例如至少10个残基的区段。在一些实施方式中,比较窗口具有10至600个残基,例如约10至约30个残基、约10至约20个残基、约50至约200个残基或约100至约150个残基,其中序列可以在两个序列最佳比对后,将其与相同数量的连续位置的参考序列进行比对。适合测定序列同一性百分数和序列相似性百分数的算法是BLAST和BLAST 2.0算法,分别描述于Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等(1977)Nucleic Acids Res.25:3389-3402。进行BLAST分析的软件可从国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)(NCBI)网站公开获得。此算法包括:首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP),与数据库序列中长度相同的字比对时它们能匹配或满足一些正值的阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(Altschul等,同上)。这些初始相邻字命中(word hit)用作启动搜索的种子,以便找到含有它们的较长HSP。然后,沿各序列在两个方向上延伸该字命中,直到提高累积的比对评分。就核苷酸序列而言,采用参数M(一对匹配残基的奖励评分;总是>0)和N(错配残基的罚分;总是<0)计算累积评分。就氨基酸序列而言,用评分矩阵计算累积评分。出现以下情况时中止字命中在各个方向上的延伸:累积比对评分比其最大获得值降低X;由于一个或多个负评分残基比对的累积,累积评分变为零或零以下;或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定该比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用的默认值如下:字长(W)28,期望值(E)10,M=1,N=-2,以及比较两条链。对氨基酸序列而言,BLASTP程序使用的默认值为:字长(W)为3,期望值(E)为10,BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。BLAST算法也对两条序列间的相似性进行统计学分析(参见例如,Karlin和Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小概率和(P(N)),它表明两条核苷酸或氨基酸序列之间偶尔发生匹配的概率。例如,如果测试氨基酸序列与参考氨基酸序列比较中的最小概率和小于约0.01,更优选小于约10-5,并且最优选小于约10-20,则认为氨基酸序列与参考序列相似。
胞内信号转导:如本文所用,术语“胞内信号转导”和“下游信号转导”可互换使用,指由两个或更多个彼此接近的细胞表面受体的胞内结构域(ICD)相互作用引起的细胞信号转导过程。在通过JAK/STAT途径的受体复合物中,受体亚基的ICDS的缔合使ICD的JAK结构域接近,从而启动磷酸化级联反应,其中STAT分子被磷酸化并移位至与特定核酸序列关联的细胞核,导致细胞中特定基因的激活和表达。当被其天然同源IL10激活时,本公开的结合分子提供IL10受体的胞内信号转导特征。要测量下游信号活性,可以使用多种方法。例如,在一些实施方式中,可以通过磷酸化受体和/或磷酸化STAT的存在来测量JAK/STAT信号转导。在其他实施方式中,还可以测量一种或多种下游基因的表达,其表达水平可受结合分子引起的下游信号转导水平的影响。
以足以产生反应/响应/缓解(response)的量:如本文所使用的短语“以足以产生反应/响应/缓解(response)的量”用于指在对于测试系统应用测试试剂之前(如基线水平)和之后足以提供所测指标水平的可检测的变化的测试试剂的量。在一些实施方式中,测试系统是细胞、组织或生物体。在一些实施方式中,测试系统是体外测试系统,例如荧光试验。在一些实施方式中,测试系统是体内系统,其涉及在将测试剂应用于细胞、组织或生物体之前和之后测量反映生物功能的细胞、组织或生物体的参数水平的变化。在一些实施方式中,该指标反映了在试验中评估的细胞的生物功能或发育状态,以响应于一定量的测试试剂的给予。在一些实施方式中,测试系统涉及在将一种或多种测试试剂应用于细胞、组织或生物体之前和之后测量反映生物功能的细胞、组织或生物体的指示剂水平的变化。术语“足以产生反应的量”可以是足以治疗有效的量,但也可能多于或少于治疗有效量。
需要治疗的:本文所用术语“需要治疗的”是指医生或其他护理人员对对象作出的判断,关于对象和对象需要或将有可能从治疗中受益。这种判断是基于医生或护理人员的专业知识领域中的多种因素作出的。
分离的:如本文所使用的术语“分离的”是指感兴趣的多肽,如果是天然存在的,其环境与它可能天然存在的环境不同。“分离的”意指包括在样品中的多肽,其基本上富集了感兴趣的多肽和/或感兴趣的多肽被部分或基本上纯化了。如果多肽不是天然存在的,“分离的”表示该多肽已经从其通过合成的环境中分离出来,例如从包含工程改造以表达该多肽的细胞的重组细胞培养物中分离出来,或通过来自固相合成方式产生的溶液。
Kabat编号:如本文所用的术语"Kabat编号"是本领域公认的术语,指的是对免疫球蛋白的重链和轻链区域中比其他氨基酸残基更可变的氨基酸残基(例如,高变的(hypervariable))进行编号的系统(Kabat,等,(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-93;Kabat,等,(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest),第五版,美国卫生与公共服务部,NIH出版号91-3242)。如本文所用术语“Chothia编号”是本领域公认的术语,指基于结构环区的位置编号氨基酸残基的系统(Chothia等1986,Science 233:755-758;Chothia和Lesk 1987,JMB 196:901-917;Chothia等1992,JMB 227:799-817)。出于本公开的目的,除非另有特别说明,抗体可变区域中CDR2和3的定位遵循Kabat编号或简称为"Kabat"。抗体可变区域中CDR1的定位遵循Kabat和Chothia编号方案的混杂。
配体:如本文所用,术语“配体”是指表现出特异性结合至受体并导致受体生物活性改变从而使其所结合的受体的活性发生改变的分子。在一个实施方式中,术语“配体”是指可以作为受体的激动剂或拮抗剂的分子或其复合物。如本文所用,术语“配体”包括天然和合成的配体。“配体”也包括小分子,例如细胞因子的肽模拟物和抗体的肽模拟物。配体和受体的复合物被称为“配体-受体复合物”。
如本文所用,术语“接头”是指两个元件(例如蛋白质结构域)之间的连接。接头可以是共价键或肽接头。术语“键”是指化学键,例如酰胺键或二硫键,或由化学反应产生的任何种类的键,例如化学偶联。术语“肽接头”是指可用于连接两个蛋白质结构域以在两个蛋白质结构域之间提供空间和/或柔性的氨基酸或多肽。
调节:如本文所用,术语“调节”、“调制”等是指测试试剂在系统(包括生物系统或生化途径)中引起反应/响应的能力,可以是积极或消极的,也可以是直接或间接的。术语调节剂包括激动剂(包括部分激动剂、完全激动剂和超级激动剂)和拮抗剂。
多聚化:如本文所用,术语“多聚化”是指两个或更多个细胞表面受体或其结构域或亚基彼此接近,使得受体或其结构域或亚基可以相互作用并引起胞内信号转导。
N-末端:如本文在多肽结构的上下文中使用,“N-末端”(或“氨基末端”)和“C-末端”(或“羧基末端”)分别指多肽的极氨基端和羧基端,而术语“N-末端的”和“C-末端的”分别指多肽的氨基酸序列中朝向N-末端和C-末端的相对位置,并可分别包括N-末端和C-末端残基。术语“近邻N-末端的”或“近邻C-末端的”用于指第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置,其中第一和第二氨基酸残基共价结合以提供连续的氨基酸序列。
肿瘤性疾病:如本文所用和如下文更详细地讨论,术语“肿瘤性疾病”指的是对象中由细胞过度增殖或失控(或失调)的细胞复制引起的病症或病况。术语肿瘤性疾病指对象中存在肿瘤引起的病症。肿瘤可以分类为:(1)良性(2)恶变前(或“癌前”);和(3)恶性(或“癌性”)。术语“肿瘤性疾病”包括肿瘤相关疾病、病症和病况,指的是与肿瘤性疾病直接或间接相关的病症,包括例如血管生成和癌前病症,例如发育异常(dysplasia)或缓慢进展型多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma)。由细胞复制失调引起良性紊乱的示例包括肥厚性疤痕,例如瘢瘤(keloid scar)。
核酸:术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”等在本文中可互换使用,并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式,即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸,或其类似物。多核苷酸的非限制性示例包括线性和环形核酸、信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)、重组多核苷酸、载体、探针、引物等。
操作性地连接:在本文中使用术语“操作性地连接”指的是分子之间的关系,通常是多肽或核酸,它们被安排在构建体中,使得各组分分子的功能得以保留,尽管操作性连接可能导致构建体中单独组成部分的活性被正向或负向地调控。例如,聚乙二醇(PEG)分子操作性连接至野生型蛋白,可能导致构建体中该蛋白的生物活性相对于野生型分子降低,但两者仍被视为操作性地连接。当术语“操作性地连接”用于指编码不同功能的多个核酸序列在组合成单个核酸分子的关系时,例如,当使用重组技术将其引入细胞时,提供能够在细胞中实现特定核酸序列的转录和/或翻译的核酸。例如,如果它导致前蛋白的表达,编码信号序列的核酸序列可以被认为操作性地连接至编码多肽的DNA,由此信号肽促进多肽分泌;如果它影响序列的转录,启动子或增强子被认为操作性地连接至编码序列;或如果它被定位以促进翻译,核糖体结合位点被认为操作性地连接至编码序列。通常,在核酸分子的上下文中,术语"操作性地连接"意为被连接的核酸序列是连续的,在分泌型前导或分子的相关联亚结构域的上下文中,其为连续的并且处于阅读段。然而,某些遗传元件,如增强子,可以在一定距离处发挥功能,不需要与它们产生作用的序列连续,不过可以被认为操作性地连接。
部分激动剂:如本文所用,术语“部分激动剂”是指特异性结合结合至并激活给定受体的分子,但相对于完全激动剂,它只具有部分激活受体。部分激动剂可以同时表现激动和拮抗作用。例如,当完全激动剂和部分激动剂同时存在时,部分激动剂作为竞争性拮抗剂,通过与完全激动剂竞争对受体的结合,相对于在不存在部分激动剂的情况下受体与完全激动剂的接触,导致受体激活净减少。临床上,当内源性配体存在的数量不足时,部分激动剂可用于激活受体,以提供所需的亚最大反应,或者当内源性配体数量过多时,它们可减少对受体的过度刺激。部分激动剂产生的最大反应(E最大)被称为其固有活性,当完全激动剂产生100%的反应时,可以用百分比表示其固有活性。在一些实施方式中,与由IL10引起的E最大相比,IL10R结合分子具有降低的E最大。E最大反映了可通过配体(例如,本文所述的结合分子或天然细胞因子(例如,IL10))获得的细胞类型中的最大反应水平。在一些实施方式中,本文所述的IL10R结合分子具有由IL10引起的E最大的至少1%(例如,1%和100%之间、10%和100%之间、20%和100%之间、30%和100%之间、40%和100%之间、50%和100%之间、60%和100%之间、70%和100%之间、80%和100%之间、90%和100%之间、1%和90%之间、1%和80%之间、1%和70%之间、1%和60%之间、1%和50%之间、1%和40%之间、1%和30%之间、1%和20%之间、或者1%和10%之间)。在其他实施方式中,本文所述的IL10R结合分子的E最大比天然配体IL10的E最大更大(例如,至少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%更大)。在一些实施方式中,通过改变IL10R结合分子的接头长度,可以改变IL10R结合分子的E最大。IL10R结合分子可在最需要的细胞类型中引起E最大,并在其他细胞类型中引起E最大降低。
多肽:如本文所用术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用,并且指任何长度的氨基酸的聚合形式,其可以包括遗传编码的或非遗传编码的氨基酸,化学或生物化学修饰的或衍生的氨基酸,和具有修饰的多肽主链的多肽。术语多肽包括融合蛋白,包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白;具有异源和同源前导序列的融合蛋白;具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基的融合蛋白;具有促进纯化的氨基酸序列(例如螯合肽)的融合蛋白;具有免疫学标签蛋白的融合蛋白;包含具有免疫学活性多肽片段(例如抗原性白喉或破伤风毒素或毒素片段)的肽的融合蛋白等等。
预防/防止:本文所用的术语“预防”、“防止”等是指在对象疾病、紊乱、病症或其症状发生之前启动的行动过程,使得暂时或永久地预防、减轻、抑制或减少对象患某种疾病、病症、病况或类似疾病的风险(例如通过没有临床症状来确定),或推迟其发作,一般是在对象由于遗传、经验或环境因素而易患某种特定疾病、病症或病况的情况下。在某些情况下,术语“预防”、“防止”也被用来指减缓疾病、紊乱或病症从目前的状态向更有害的状态发展。
邻近/接近:如本文所用,术语“邻近/接近”是指在本文描述的结合分子结合两个细胞表面受体或其结构域或亚基之后两个细胞表面受体或其结构域或亚基之间的空间接近度或物理距离。在一些实施方式中,在结合分子结合细胞表面受体或其结构域或亚基后,细胞表面受体或其结构域或亚基之间的空间接近度可以是,例如小于约500埃,例如距离约为5埃至约500埃。在一些实施方式中,空间接近度小于约5埃、小于约20埃、小于约50埃、小于约75埃、小于约100埃、小于约150埃、小于约250埃、小于约300埃、小于约350埃、小于约400埃、小于约450埃、或小于约500埃。在一些实施方式中,空间接近度小于约100埃。在一些实施方式中,空间接近度小于约50埃。在一些实施方式中,空间接近度小于约20埃。在一些实施方式中,空间接近度小于约10埃。在一些实施方式中,空间接近度的范围为约10至100埃、50至150埃、约100至200埃、约150至250埃、约200至300埃、约250至350埃,约300到400埃,约350到450埃,或约400到500埃。在一些实施方式中,空间接近度为小于约250埃、或小于约200埃、或小于约150埃、或小于约120埃、或小于约100埃、或小于约80埃、或小于约70埃、或小于约50埃。
受体:如本文所用,术语“受体”是指具有特异性结合配体的结构域的多肽,该配体的结合导致该多肽的至少一种生物学特性的改变。在一些实施分数中,受体是“可溶性”受体,不与细胞表面关联。在一些实施方式中,受体是细胞表面受体,其包括胞外结构域(ECD)和膜关联结构域,后者用于将ECD锚定至细胞表面。在细胞表面受体的一些实施方式中,受体是跨膜多肽,其包括由通常称为跨膜结构域(transmembrane domain)(TM)的跨膜的结构域(membrane spanning domain)连接的胞内结构域(ICD)和胞外结构域(ECD)。配体结合至受体导致受体的构象改变,从而产生可测量的生物学效应。在一些情况下,如果受体是包括ECD、TM和ICD的跨膜多肽,配体结合至ECD导致由ICD的一个或多个结构域介导的可测量的胞内生物学效应,以响应于配体结合至ECD。在一些实施方式中,受体是多组分复合物的组分,以促进胞内信号转导。例如,配体可以结合未单独与任何胞内信号转导相关联的细胞表面分子,但在配体结合后促进形成导致胞内信号转导的多聚体复合物。
重组:如本文所用,术语“重组的”用作形容词指使用重组DNA技术修饰多肽、核酸或细胞的方法。重组蛋白是使用重组DNA技术产生的蛋白,可以使用小写字母“r”(例如,rhIL2)的缩写标示,以表示产生蛋白的方法。类似地,如果细胞经修饰,通过使用重组DNA技术纳入(例如转染、转导、感染)外源核酸(例如ssDNA、dsDNA、ssRNA、dsRNA、mRNA、病毒或非病毒载体、质粒、黏粒等),则细胞被称为“重组细胞”。用于重组DNA技术的技术和方案是本领域众所周知的,例如,可以在Sambrook等(1989)《分子克隆:实验室手册》(MolecularCloning:A Laboratory Manual)(第2版,冷泉港实验室出版社,纽约州普莱恩维尤)中和其他标准分子生物学实验手册中找到。
反应/响应/缓解:术语“反应/响应/缓解”,例如,细胞、组织、器官或生物体的反应,包括可评估的生化或生理参数(例如,浓度、密度、粘附性、增殖、激活、磷酸化、迁移、酶活、基因表达水平、基因表达率、能量消耗率(rate of energy consumption)、分化水平或状态)的定量或定性变化,其中该变化与激活、刺激或处理相关,或与外源试剂接触或内部机制(如遗传编程)相关。在某些情况下,术语“激活”、“刺激”等是指由内部机制以及外部或环境因素调节的细胞激活;而术语“抑制”、“下调”等则是指相反的效果。“反应”可以在体外评估,例如通过使用试验系统、表面等离子体共振、酶活、质谱、氨基酸或蛋白质测序技术。“反应/响应/缓解”可以体内定量评估,通过评估客观生理参数,例如体温、体重、肿瘤体积、血压、X-射线或其他成像技术的结果,或通过报告的主观感受(幸福、抑郁、忧虑或疼痛)的改变定性评估。在一些实施方式中,CD3激活的原代人T细胞的增殖水平可以在生物发光试验中评估,该试验产生与存在的ATP的量成比例的发光信号,而ATP与存在于培养物中的活细胞的量成比例,如Crouch,等(1993)J.Immunol.Methods160:81–8所述,或使用市售可得的试验,例如2.0细胞活力实验或/>3D细胞活力试剂盒,其可商购自普洛麦格公司(Promega Corporation),麦迪逊WI 53711,货号G9241和G9681,基本上按照制造商提供的说明。在一些实施方式中,响应于测试试剂的给予的T细胞的激活水平可以通过所述流式细胞术方法测定,如通过STAT(例如STAT1、STAT3、STAT5)磷酸化水平测定,根据本领域众所周知的方法。
显著减少的结合:如本文所用,术语“表现出显著减少的结合”用于相较于第一分子的亲本形式,第一分子(例如配体)的变体对于第二分子(例如受体)表现出显著减少的亲和力。如果变体对受体的天然形式的结合为该变体所来源于的亲本抗体的小于20%、或小于约10%、或小于约8%、或小于约6%、或小于约4%、或小于约2%、或小于约1%、或小于约0.5%,则对于抗体变体,抗体变体“表现出显著减少结合”。类似地,如果变体配体结合至受体的亲和力为该变体配体所来源于的亲本配体的小于20%、或小于约10%、或小于约8%、或小于约6%、或小于约4%、或小于约2%、或小于约1%、或小于约0.5%,则对于变体配体,变体配体“表现出显著减少结合”。类似地,如果变体受体结合的亲和力为该变体受体所来源于的亲本受体的小于20%、或小于约10%、或小于约8%、或小于约6%、或小于约4%、或小于约2%、或小于约1%、或小于约0.5%,则对于变体受体,变体配体“表现出显著减少结合”。
单域抗体(sdAb):术语“单域抗体”或“sdAb”是指具有单个(仅一个)单体可变抗体结构域的抗体。sdAb能够选择性地结合特定抗原。VHH是sdAb的一个示例。
特异性结合:如本文所用的术语“特异性结合”是指对于第二分子,第一分子表现出亲和性/亲和力的程度。在结合对(如配体/受体、抗体/抗原)的上下文中,当结合对的第一分子不以显著量结合至样品中存在的其他组分时,就称作结合对的第一分子特异性结合至结合对的第二分子。当结合对的第一分子对第二分子的亲和力比第一分子对样品中存在的其他组分的亲和力至少大2倍、或至少大5倍、或至少大10倍、或至少大20倍、或至少大100倍时,结合对的第一分子被称为特异性结合至结合对的第二分子。在结合对中的第一分子是抗体的特定实施方式中,如果抗体和抗原之间的平衡解离常数(KD)小于约10-6M、或者小于约10-8M、或者小于约10-10M、或者小于约10-11M、小于约10-12M,例如通过Scatchard分析确定,则该抗体特异性结合至抗原(或蛋白质、抗原、配体或受体的抗原决定簇(表位))(Munsen,等(1980)Analyt.Biochem.107:220-239)。在一个实施方式中,如果解离大于约105M,或者大于约106M,或者大于约107M,或者大于约108M,或者大于约109M,或者大于约1010M,或者大于约1011M,则配体特异性结合受体。特异性结合可使用本领域已知的技术进行评估,包括但不限于竞争ELISA、放射性配体结合试验(例如,饱和结合、斯卡查德图(Scatchard plot)、非线性曲线拟合程序和竞争结合试验);非放射性配体结合试验(例如,荧光偏振(fluorescence polarization)(FP)、荧光共振能量转移(FRET);液相配体结合试验(例如,实时聚合酶链式反应(RT-qPCR)和免疫沉淀);和固相配体结合试验(例如,多孔板试验、珠上配体结合试验、柱上配体结合试验和过滤试验)和表面等离子体共振试验(参见,例如,Drescher等(2009),Methods Mol Biol 493:323-343,使用市售可得的仪器例如Biacore 8+、Biacore S200、Biacore T200(GE医疗生命科学公司,地址:100Results Way,Marlborough MA 01752))。在一些实施方式中,本发明提供特异性结合至hIL12RB1同种型的分子(例如结合hIL12RB1的sdAb)。如本文所用,IL12RB1结合分子对IL12RB1的结合亲和力,可通过表面等离子体共振(“SPR”)测定和/或定量结合亲和力。在评估IL12RB1结合分子对IL12RB1的结合亲和力时,可以固定结合对的任一成员,并在流动相中提供结合对的另一元件。在一些实施方式中,其上要固定感兴趣蛋白的传感器芯片与促进感兴趣蛋白结合的物质偶联,例如氮三乙酸(NTA)衍生的表面等离子体共振传感器芯片(例如,可从Cytiva全球生命科学解决方案美国有限责任公司(Cytiva Global Life Science Solutions USALLC),马萨诸塞州马尔伯勒,获得的传感器芯片NTA,目录号BR100407),作为抗His标签抗体(例如可从Cytiva,马萨诸塞州马尔伯勒,商购的抗组氨酸CM5芯片)、蛋白A或生物素。因此,为了评估结合,经常需要修饰蛋白质以提供与偶联至芯片表面的物质的结合。例如,通过纳入包含多组氨酸序列的螯合肽(例如6xHis或8xHis)以保留在与NTA偶联的芯片上来评估结合对的一个成员。在一些实施方式中,结合分子可以固定在芯片上,可以在流动相中提供受体亚基(或其ECD片段)。或者,受体亚基(或其ECD片段)可以固定在芯片上,可以在流动相中提供结合分子。在任一情况下,应注意,一些固定在涂覆的SPR芯片上的蛋白质的修饰可能会干扰待用SPR评估的结合对的一个或两个组分的结合特性。在这种情况下,可能需要切换结合对的可移动和结合元件,或者使用具有结合剂的芯片,所述结合剂促进待评估蛋白质的非干扰偶联。或者当使用SPR评估结合分子对受体亚基的结合亲和力时,结合分子可以通过C末端加入多聚-His序列(例如6xHis或8xHis)衍生并固定在NTA衍生的传感器芯片上,在流动相中提供了正在评估其结合亲和力的受体亚基。将多聚-His序列纳入到通过重组DNA技术产生的结合分子的C末端的方法是生物技术相关领域的技术人员熟知的。
对象:术语“受体”、“个体”、“对象”和“患者”在本文中可互换使用,并指任何需要诊断、处理或治疗的哺乳动物对象,特别是人。用于治疗目的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物,包括人、家养和农场动物、非人灵长类动物,以及动物园、运动或宠物动物,例如狗、马、猫、奶牛、绵羊、山羊、猪等。在一些实施方式中,哺乳动物为人。
基本上纯的:如本文所用,术语“基本上纯的”表示组合物的组分占组合物总含量的大于约50%、或大于约60%、或大于约70%、或大于约80%、或大于约90%、或大于约95%。“基本上纯的”蛋白质占组合物总含量的大于约50%、或大于约60%、或大于约70%、或大于约80%、或大于约90%、或大于约95%。
患有:如本文所用,术语“患有”是指医生根据本领域公认的鉴定疾病、紊乱或病症的现有信息(包括但不限于X-射线、CT-扫描、常规实验室诊断测试(例如血细胞计数)、基因组数据、蛋白质表达数据、免疫组织化学)对对象做出的其需要或将受益于治疗的判断。术语患有通常与特定疾病状态结合使用,例如“患有肿瘤疾病”指患者被诊断为携带肿瘤。
T-细胞:如本文所用术语“T-细胞”或“T细胞”以其常规意义使用,是指在胸腺中分化的淋巴细胞,拥有特定细胞表面抗原受体,包括一些控制细胞介导的免疫和体液免疫和其他裂解携带抗原的细胞的起始或抑制的。在一些实施方式中,T细胞包括但不限于初始CD8+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、初始CD4+T细胞、辅助T细胞,例如TH1、TH2、TH9、TH11、TH22、TFH;调节性T细胞,例如TR1、Treg、诱导型Treg;记忆性T细胞,例如中心记忆T细胞、效应记忆T细胞、NKT细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和此类T细胞的工程改造变体,包括但不限于CAR-T细胞、重组修饰TIL和TCR工程改造细胞。
末端/末端的:如本文在多肽结构的上下文中使用,“N-末端”(或“氨基末端”)和“C-末端”(或“羧基末端”)分别指多肽的极氨基端和羧基端,而术语“N-末端的”和“C-末端的”分别指多肽的氨基酸序列中朝向N-末端和C-末端的相对位置,并可分别包括N-末端和C-末端残基。“近邻N-末端的”是指连续多肽序列中第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置,第一氨基酸距多肽的N-末端更近。“近邻C-末端的”是指连续多肽序列中第一氨基酸残基相对于第二氨基酸残基的位置,第一氨基酸距多肽的C-末端更近。
治疗有效量:如本文所用,术语“治疗有效量”是指向对象给予试剂,单独地或作为药物组合物或治疗方案的一部分,以单剂量或作为系列剂量的一部分,以能够对疾病、病症或病况的任何症状、方面或特征产生任何可检测的、积极影响的量。治疗有效量可以通过测量相关的生理效应来确定,并且可以结合给药方案和对对象病情的诊断分析等来调整。用于确定试剂的治疗有效量的评估参数由医生使用公认的诊断标准确定,包括但不限于指标例如年龄、体重、性别、总体健康状况、ECOG评分、可观察到的生理参数、血液浓度、血压、心电图、计算机断层扫描、X-射线等。或者或此外,还可以监测临床情境中通常评估的其他参数,以确定是否对对象给予了治疗有效量的试剂,如体温,心率,血液化学的正常化,血压的正常化,胆固醇水平的正常化,或疾病、病症或病况的任何症状、方面或特征,生物标志物水平的改变、生存期的延长、无进展生存期的延长、出现进展的时间的延长、出现治疗失败时间的延长、无事件生存期的延长、到下次治疗时间的延长、客观缓解率的改善、反应持续时间的改善等,本领域的临床医生基于这些评估对象对给予试剂的反应的状况改善。
Treg细胞或调节性T细胞。本文所用的术语“调节性T细胞”或“Treg细胞”是指CD4+T细胞的类型,其能够抑制其他T细胞的反应,包括但不限于效应T细胞(Teff)。Treg细胞特征在于表达CD4、IL2受体的a亚基(CD25)和转录因子叉头盒P3(FOXP3)(Sakaguchi,AnnuRev Immunol 22,531-62(2004)。“常规CD4+T细胞”意指除调节性T细胞以外的CD4+T细胞。
跨膜结构域:术语"跨膜结构域"或"TM"是指跨膜多肽的结构域,当该跨膜多肽与细胞膜相关联时,该结构域嵌入细胞膜中,并与跨膜多肽的胞外结构域(ECD)和胞内结构域(ICD)以肽基键连接(peptidyl linkage)。跨膜结构域可以与胞外和/或胞内结构域中的一个或两个同源(天然相关联)或异源(不天然相关联)。跨膜结构域可以与胞外和/或胞内结构域中的一个或两个同源(天然相关联)或异源(不天然相关联)。在一些实施方式中,在受体是包括源自第一亲本受体的胞内结构域和源自第二不同亲本受体的第二胞外结构域的嵌合受体的情况下,嵌合受体的跨膜结构域是通常与衍生嵌合受体的亲本受体的ICD或ECD相关联的跨膜结构域。或者,受体的跨膜结构域可以是跨越质膜的人工氨基酸序列。在一些实施方式中,在受体是包括源自第一亲本受体的胞内结构域和源自第二不同亲本受体的第二胞外结构域的嵌合受体的情况下,嵌合受体的跨膜结构域是通常与衍生嵌合受体的亲本受体的ICD或ECD相关联的跨膜结构域。
治疗/处理:术语“治疗”、“疗法”、“处理”等是指在诊断、观察到对象的疾病、紊乱或病症或其症状后,起始的行动过程(例如给予本文所述的结合分子或包含其的药物组合物)或类似情况,以便暂时或永久地消除、减少、抑制、减轻或改善困扰对象的这种疾病、紊乱或病症的至少一个根本原因,或与这种疾病、紊乱或病症相关的至少一个症状。治疗包括对患有疾病的对象采取的行动过程,其中该行动过程导致对象的疾病被抑制(例如,阻止疾病、紊乱或病症的发展或改善与此相关的一个或多个症状)。
VHH:如本文所用,术语“VHH”是一种具有单个单体重链可变抗体结构域的sdAb。此类抗体可在天然缺乏轻链VHH的骆驼科哺乳动物(例如骆驼、美洲驼)中发现或从中产生,可通过骆驼(包括骆驼、美洲驼和羊驼)的免疫(参见例如Hamers-Casterman,等(1993)Nature363:446-448)或通过在VHH框架中构建的筛选文库(例如噬菌体文库)获得。具有给定特异性的抗体也可以来源于非哺乳动物来源,例如从软骨鱼(包但不限于鲨鱼)的免疫中获得的VHH。在特定实施方式中,如果VHH和抗原之间的平衡解离常数大于约10-6M、或者小于约10- 8M、或者小于约10-10M、或者小于约10-11M、或小于约10-10M、小于约10-12M,例如通过Scatchard分析确定的,则如本文所述的双特异性VHH2结合分子中VHH结合至受体(例如天然或非天然受体对的第一受体或第二受体)(Munsen,等1980Analyt.Biochem.107:220-239)。从骆驼科动物中产生单域抗体的标准化方案在科学文献中是众所周知的。参见,例如,Vincke等人(2012)《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》第8章,Walker,J.编辑(胡马纳出版社,新泽西州托托瓦)。特异性结合可使用本领域已知的技术进行评估,包括但不限于竞争ELISA、试验和/或/>试验。在一些实施方式中,本文所述的VHH可以是人源化的,以包含人框架区。可用于产生人源化VHH的人种系的实例包括但不限于VH3-23(例如UniProt ID:P01764)、VH3-74(例如UniProt ID:A0A0B4J1X5)、VH3-66(例如UniProt ID:A0A0C4DH42)、VH3-30(例如UniProt ID:P01768)、VH3-11(例如UniProt ID:P01762)和VH3-9(例如UniProt ID:P01782)。
VHH2 :如本文所用,术语“VHH2”和“双特异性VHH2”和“VHH二聚体”是可互换使用以指代本公开的结合分子的亚型,其中第一和第二sdAb都是VHH,并且第一VHH结合到第一受体或其结构域或亚基,以及第二VHH结合到第二受体或其结构域或亚基。
野生型:如本文所用,术语“野生型”或“WT”或“天然”用于指在自然界中发现且未被人为改变的氨基酸序列或核苷酸序列。
白细胞介素10受体结合分子
本发明提供了IL10R结合分子,其为IL10受体的合成配体。
本公开的IL10R结合分子包含两个或更多单域抗体,其选择性结合IL10Ra和IL10Rb受体亚基的胞外结构域。在一个实施方式中,本公开提供了一种IL10受体(IL10R)结合分子,其为IL10R受体的配体,该IL10R受体结合分子包含:
(g)特异性结合IL10受体的IL10Ra亚基胞外结构域的第一单域抗体(sdAb)(一个"IL10Ra sdAb"),和
(h)特异性结合IL10受体的IL10Rb亚基胞外结构域的第二单域抗体(sdAb)(一个"IL10Rb sdAb"),
其中:
·第一sdAb和第二sdAb稳定缔合;
·IL10受体的IL10Ra和IL10Rb亚基响应于与IL10R结合分子的接触而二聚化;和
·将表达IL10Ra和IL10Rb的细胞与有效量的IL10R结合分子接触导致IL10Ra和IL10Rb的胞内结构域接近和胞内信号转导。
本公开的IL10R结合分子可用于治疗或预防哺乳动物对象的疾病,在一些实施方式中,本公开通过给予治疗有效量的本公开的IL10R结合分子来治疗或预防哺乳动物对象的自身免疫性疾病。在一些实施方式中,本公开通过给予本公开治疗有效量的IL10R结合分子来治疗或预防哺乳动物对象的传染性疾病(包括病毒和慢性病毒感染)。在一些实施方式中,本公开通过给予本公开治疗有效量的IL10R结合分子来治疗或预防哺乳动物对象的肿瘤疾病。在一些实施方式中,本公开通过联合给予本公开治疗有效量的IL10R结合分子和一种或多种辅助治疗剂来治疗或预防哺乳动物对象的肿瘤、传染性或自身免疫。
在一些实施方式中,本公开提供经修饰的IL10R结合分子以在哺乳动物对象体内提供延长的作用时间,及其药学上可接受的制剂。
本公开还提供了用于向哺乳动物对象给予的IL10R结合分子的药学上可接受的制剂。本公开还提供了一种药学上可接受的组合物,用于向哺乳动物对象给药,该组合物包含编码多肽IL10R结合分子的核酸序列、编码多肽IL10R结合分子的重组病毒或非病毒载体、或包含编码多肽IL10R结合分子的核酸序列的重组修饰的哺乳动物细胞,在每种情况下该核酸序列可操作地连接至在哺乳动物细胞中有功能的一种或多种表达控制元件
在一些实施方式中,本发明的IL10R结合分子是多肽。本公开提供了编码多肽IL10R结合分子的核酸序列。本公开还提供了包含编码多肽IL10R结合分子的核酸序列的重组载体。本公开还提供了一种重组修饰的哺乳动物细胞,其包含编码多肽IL10R结合分子的核酸。本公开还提供了重组载体的多肽IL10R结合分子的重组产生、分离、纯化和表征的方法,其包含并提供了编码多肽IL10R结合分子的核酸序列。
IL10:
IL10受体(IL10R)的同源配体是细胞因子IL10。术语IL10包括人和鼠(或小鼠)IL10。人IL10(hIL10)是一种非共价连接的同源二聚体蛋白,其包含两个相同的亚基。每个人IL10单体表达为178个氨基酸的前蛋白,其包含18个氨基酸的信号序列,信号序列在翻译后被去除,以产生160个氨基酸的成熟蛋白质。不含信号序列的成熟IL-10蛋白(UniProt参考号P22301)的经典氨基酸序列(对应前蛋白的氨基酸19-178)为:
SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN SEQ ID NO:460
小鼠(或鼠)IL10(hIL10)是一种非共价连接的同源二聚体蛋白,其包含两个相同的亚基。每个鼠IL10单体表达为178个氨基酸的前蛋白,其包含18个氨基酸的信号序列,信号序列在翻译后被去除,以产生160个氨基酸的成熟蛋白质。不含信号序列的成熟IL-10蛋白(UniProt参考号P18893)的经典氨基酸序列(对应前蛋白的氨基酸19-178)为:
SRGQYSREDNNCTHFPVGQSHMLLELRTAFSQVKTFFQTKDQLDNILLTDSLMQDFKGYLGCQALSEMIQFYLVEVMPQAEKHGPEIKEHLNSLGEKLKTLRMRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKSDFNKLQDQGVYKAMNEFDIFINCIEAYMMIKMKS(SEQ ID NO:461).
IL10R结合分子在表达IL10受体的细胞中激活IL10信号。本公开提供经工程改造以在表达IL10受体的细胞中提供胞内信号转导的选择性水平的IL10R结合分子。本发明提供经工程改造以在特定细胞类型中产生胞内信号转导的IL10R结合分子。
IL10受体
IL10受体是包含IL10Ra和IL10Rb亚基的异二聚体蛋白复合物。IL10在表达IL10Ra和IL10Rb亚基的哺乳动物细胞表面的相互作用导致IL10Ra和IL10Rb的二聚化和胞内信号转导。IL10介导的IL10Ra和IL10Rb二聚化的胞内信号转导特征是JAK/STAT途径的激活,特别是STAT3分子的磷酸化,它是胞内信号转导途径的一个组成部分,与信号转导途径的其他组成部分结合导致基因表达的调节。在一些实施方式中,IL10受体是人IL10受体并且IL10是人IL10。在一些实施方式中,IL10受体是鼠IL10受体并且IL10是鼠IL10。如本文所用,术语“IL10受体”和“IL10受体”和“IL10R”可互换使用,指包含IL10Ra和IL10Rb的异二聚体复合物。术语IL10R包括任何哺乳动物的IL10受体,包括但不限于人类、狗、猫、小鼠、猴、牛和猪。
人IL10受体的IL10Ra组分是人IL10Ra(hIL10Ra)蛋白。经典全长hIL10Ra蛋白是具有以下氨基酸序列的多肽:
MLPCLVVLLAALLSLRLGSDAHGTELPSPPSVWFEAEFFHHILHWTPIPNQSESTCYEVALLRYGIESWNSISNCSQTLSYDLTAVTLDLYHSNGYRARVRAVDGSRHSNWTVTNTRFSVDEVTLTVGSVNLEIHNGFILGKIQLPRPKMAPANDTYESIFSHFREYEIAIRKVPGNFTFTHKKVKHENFSLLTSGEVGEFCVQVKPSVASRSNKGMWSKEECISLTRQYFTVTNVIIFFAFVLLLSGALAYCLALQLYVRRRKKLPSVLLFKKPSPFIFISQRPSPETQDTIHPLDEEAFLKVSPELKNLDLHGSTDSGFGSTKPSLQTEEPQFLLPDPHPQADRTLGNREPPVLGDSCSSGSSNSTDSGICLQEPSLSPSTGPTWEQQVGSNSRGQDDSGIDLVQNSEGRAGDTQGGSALGHHSPPEPEVPGEEDPAAVAFQGYLRQTRCAEEKATKTGCLEEESPLTDGLGPKFGRCLVDEAGLHPPALAKGYLKQDPLEMTLASSGAPTGQWNQPTEEWSLLALSSCSDLGISDWSFAHDLAPLGCVAAPGGLLGSFNSDLVTLPLISSLQSSE(SEQ ID NO:452)
为了本公开的目的,本文所述的hIL10Ra多肽的氨基酸残基的编号是根据该经典序列(UniProt数据库参考号:Q13651)的编号进行的。SEQ ID NO:452的氨基酸1-21被鉴定为IL10Ra的信号肽,SEQ ID NO:452的氨基酸22-235被鉴定为胞外结构域,SEQ ID NO:452的氨基酸236-256被鉴定为跨膜结构域,并且SEQ ID NO:452的氨基酸257-578被鉴定为胞内结构域。
小鼠IL10受体的IL10Ra组分是小鼠IL10Ra(mIL10Ra)蛋白。mIL10Ra为575个氨基酸的前蛋白,其包含16个氨基酸的信号序列,信号序列在翻译后被切割,以产生569个氨基酸的成熟蛋白质。经典全长mIL10Ra是具有以下氨基酸序列的多肽:
MLSRLLPFLVTISSLSLEFIAYGTELPSPSYVWFEARFFQHILHWKPIPNQSESTYYEVALKQYGNSTWNDIHICRKAQALSCDLTTFTLDLYHRSYGYRARVRAVDNSQYSNWTTTETRFTVDEVILTVDSVTLKAMDGIIYGTIHPPRPTITPAGDEYEQVFKDLRVYKISIRKFSELKNATKRVKQETFTLTVPIGVRKFCVKVLPRLESRINKAEWSEEQCLLITTEQYFTVTNLSILVISMLLFCGILVCLVLQWYIRHPGKLPTVLVFKKPHDFFPANPLCPETPDAIHIVDLEVFPKVSLELRDSVLHGSTDSGFGSGKPSLQTEESQFLLPGSHPQIQGTLGKEESPGLQATCGDNTDSGICLQEPGLHSSMGPAWKQQLGYTHQDQDDSDVNLVQNSPGQPKYTQDASALGHVCLLEPKAPEEKDQVMVTFQGYQKQTRWKAEAAGPAECLDEEIPLTDAFDPELGVHLQDDLAWPPPALAAGYLKQESQGMASAPPGTPSRQWNQLTEEWSLLGVVSCEDLSIESWRFAHKLDPLDCGAAPGGLLDSLGSNLVTLPLISSLQVEE(SEQ ID NO:454)
为了本公开的目的,本文所述的小鼠IL10Ra多肽的氨基酸残基的编号是根据该经典序列(UniProt数据库参考号:Q61727)的编号进行的。SEQ ID NO:454的氨基酸1-16被鉴定为mIL10Ra的信号肽,SEQ ID NO:454的氨基酸17-241被鉴定为胞外结构域,SEQ ID NO:454的氨基酸242-262被鉴定为跨膜结构域,并且SEQ ID NO:454的氨基酸263-575被鉴定为胞内结构域。
hIL10Rb表达为325个氨基酸的前蛋白质,前19个氨基酸包括信号序列,其在成熟的306个氨基酸的蛋白质中翻译后被切割。氨基酸20-220(成熟蛋白的氨基酸1-201)对应于胞外结构域,氨基酸221-242(成熟蛋白的氨基酸202-223)对应于22个氨基酸的跨膜结构域,氨基酸243-325(成熟蛋白的氨基酸224-306)对应于胞内结构域。经典全长hIL10Rb前体是具有以下氨基酸序列的多肽:
MAWSLGSWLGGCLLVSALGMVPPPENVRMNSVNFKNILQWESPAFAKGNLTFTAQYLSYRIFQDKCMNTTLTECDFSSLSKYGDHTLRVRAEFADEHSDWVNITFCPVDDTIIGPPGMQVEVLADSLHMRFLAPKIENEYETWTMKNVYNSWTYNVQYWKNGTDEKFQITPQYDFEVLRNLEPWTTYCVQVRGFLPDRNKAGEWSEPVCEQTTHDETVPSWMVAVILMASVFMVCLALLGCFALLWCVYKKTKYAFSPRNSLPQHLKEFLGHPHHNTLLFFSFPLSDENDVFDKLSVIAEDSESGKQNPGDSCSLGTPPGQGPQS
(SEQ ID NO:456)
为了本公开的目的,本文所述的人IL10Rb多肽的氨基酸残基的编号是根据该经典序列(UniProt ID:Q08334,SEQ ID NO:456)的编号进行的。
鼠IL10Rb(mIL10Rb)表达为349个氨基酸的前蛋白,包括19个氨基酸的N-末端信号序列。氨基酸20-220(成熟蛋白的氨基酸1-201)对应于胞外结构域,氨基酸221-241(成熟蛋白的氨基酸202-222)对应于21个氨基酸的跨膜结构域,氨基酸242-349(成熟蛋白的氨基酸223-330)对应于胞内结构域。包含信号序列的经典全长mIL10Rb前体蛋白是一种多肽,在UniProtKB数据库中引用为条目Q61190。包含信号序列的经典全长mIL10Rb前体蛋白质是具有以下氨基酸序列的多肽:
MAPCVAGWLGGFLLVPALGIPPPEKVRMNSVNFKNILQWEVPAFPKTNLTFTAQYESYRSFQDHCKRTASTQCDFSHLSKYGDYTVRVRAELADEHSEWVNVTFCPVEDTIIGPPEMQIESLAESLHLRFSAPQIENEPETWTLKNIYDSWAYRVQYWKNGTNEKFQVVSPYDSEVLRNLEPWTTYCIQVQGFLLDQNRTGEWSEPICERTGNDEITPSWIVAIILIVSVLVVFLFLLGCFVVLWLIYKKTKHTFRSGTSLPQHLKEFLGHPHHSTFLLFSFPPPEEAEVFDKLSIISEESEGSKQSPEDNCASEPPSDPGPRELESKDEAPSPPHDDPKLLTSTSEV(SEQ ID NO:458)
为了本公开的目的,本文所述的鼠IL10Rb多肽的氨基酸残基的编号是根据该经典序列(UniProt ID:Q61190,SEQ ID NO 458)的编号进行的。
单域抗体
本发明的IL10R结合分子包含两个或更多个单域抗体。如本文所用术语“单域抗体”(sdAb)是指由单体可变抗体结构域组成的抗体片段,其能够特异性地结合至抗原并与其所衍生的亲本抗体竞争结合。术语“单域抗体”包括scFv和VHH分子。在一些实施方式中,细胞因子受体结合分子的一种或两种sdAb是scFv。在一些实施方式中,一种或两种sdAb是VHH。在一些实施方式中,一种或两种sdAb是scFv。
术语单域抗体包括工程改造的sdAb,包括但不限于嵌合sdAb、CDR移植的sdAb和人源化的sdAb。在一些实施方式中,用于纳入本公开的IL10R结合分子中的一种或多种sdAb是CDR嫁接的。如Saerens等(2005)J.Mol Biol 352:597-607中所述,可将从抗体、重链抗体和衍生自其的sdAb获得的CDR移植到替代框架上,以产生CDR移植的sdAb。任何框架区均可与本文所述的CDR一起使用。
在一些实施方式中,用于纳入IL10R结合分子的一个或多个sdAb是嵌合sdAb,其中CDR来源于一种物种(例如,骆驼),而框架和/或恒定区来源于另一物种(例如人或小鼠)。在特定实施方式中,框架区是人或人源化序列。因此,包含一种或多种人源化sdAb的IL10R结合分子被认为在本公开的范围内。
在一些实施方式中,本公开细胞因子受体结合分子的一种或两种sdAb是VHH。如本文所用,术语“VHH”是指衍生自骆驼科动物抗体的单域抗体,通常获取自骆驼科(包括骆驼、美洲驼和羊驼)的免疫(参见,例如Hamers-Casterman,等(1993)Nature 363:446-448)。VHH也可以称为重链抗体或作为单域抗体也可以来源于非哺乳动物来源,例如从软骨鱼(包但不限于鲨鱼)的IgNAR抗体免疫中获得的VHH。VHH是单域抗体(sdAb)的一种类型,其包含单个单体可变抗体结构域。像全长抗体一样,它能够选择性地结合特定抗原。
VHH的互补决定区(CDR)位于单域多肽内。VHH可以从骆驼科动物中发现的重链抗体进行工程改造。示例性VHH具有约12-15kDa的分子量,其比由两条重链和两条轻链构成的传统哺乳动物抗体(150-160kDa)小得多。VHH可以在骆驼科哺乳动物(如骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼和骆马)中发现或产生,其天然地缺乏轻链。sdAb和VHH的描述可以见于例如DeGreve等,Curr Opin Biotechnol.61:96-101,2019;Ciccarese,等,Front Genet.10:997,2019:Chanier和Chames,Antibodies(Basel)8(1),2019;和De Vlieger,等,《抗体》(Antibodies)(Basel)8(1),2018。源于骆驼科动物VHH的CDR可用于制备CDR移植的VHH,其可被纳入IL10R结合分子中。
在一些实施方式中,用于纳入本公开IL10R结合分子的VHH是含有人框架区的人源化VHH。骆驼科单域抗体的人源化技术在本领域中是众所周知的。参见,例如Vincke,等(2009)《骆驼类单域抗体人源化的一般策略和通用人源化纳米体支架的鉴定》(GeneralStrategy to Humanize a Camelid Single-domain Antibody and Identification of aUniversal Humanized Nanobody Scaffold)J.Biol.Chem.284(5)3273-3284.可用于制备人源化VHH的人框架区包括但不限于VH3-23(例如UniProt ID:P01764)、VH3-74(例如UniProt ID:A0A0B4J1X5)、VH3-66(例如UniProt ID:A0A0C4DH42)、VH3-30(例如UniProtID:P01768)、VH3-11(例如UniProt ID:P01762)和VH3-9(例如UniProt ID:P01782)。
稳定缔合:
本公开的IL10R结合分子包含选择性结合IL10Ra胞外结构域的单域抗体(“IL10RasdAb”)与选择性结合IL10Rb胞外结构域的单域抗体(“IL10Rb”)稳定缔合。如本文所用,术语“稳定缔合”或“稳定缔合于”用于指代一个分子(例如,多肽)可以与另一个分子热力学和/或动力学缔合的各种方式。一个分子与另一个分子的稳定缔合可以通过多种方式实现,包括共价结合和非共价相互作用。
在一些实施方式中,IL10Ra sdAb和IL10Rb sdAb的稳定缔合可以通过共价键(例如肽键)实现。在一些实施方式中,第一和第二结合结构域之间的共价连接是第一结合结构域的C-末端和第二结合结构域的N-末端之间的共价键。
在一些实施方式中,IL10R结合蛋白的IL10Ra sdAb和IL10Rb sdAb的共价连接受配位共价连接的影响。本公开提供了包含螯合肽的单域抗体的示例。螯合肽导致与过渡金属离子的配位共价连接。在一些实施方式中,过渡金属离子能够与两个或多个螯合肽形成配位共价键。因此,第一和第二结合结构域可以各自包含螯合肽,并通过每个亚基与过渡金属离子形成配位共价复合物,使结合结构域稳定缔合。在一些实施方式中,过渡金属离子选自钒、锰、铁、铱、锇、铼铂、钯、钴、铬或钌。附图的图4,分图B中提供了此构造的示意图。应注意的是,在图4的分图A和B中所示的每个构型中,单域抗体的N-末端域呈现在环境中,能够帮助sdAb的CDRs对目标细胞因子受体ECD的暴露增强。当过渡金属离子处于动力学不稳定的氧化态时(例如Co(II)、Cr(II)或Ru(III)),有利于两者之间配位共价键的形成。络合后,过渡金属的氧化态可能会改变(氧化或还原)为动力学惰性氧化态(例如Co(III)、Cr(III)或Ru(II)),提供动力学惰性配位共价络合物.Anderson等,1995年8月8日授权的美国专利号5,439,928中更详细地描述了通过过渡金属在包含螯合肽的蛋白质之间形成动力学惰性和动力学不稳定的配位共价复合物。
在一些实施方式中,IL10R结合分子的IL10Ra sdAb和IL10Rb sdAb的共价键还可以包含接头。接头是选自以下组的分子:包括但不限于肽接头和化学接头。在一些实施方式中,接头a将IL10Ra sdAb的C-末端连接到IL10Rb sdAb的N-末端。在一些实施方式中,接头将IL10Rb sdAb的C-末端连接到IL10Ra sdAb的N-末端。
在一些实施方式中,接头是肽接头。肽接头可包含1至50个氨基酸(例如,2至50之间、5至50之间、10至50之间、15至50之间、20至50之间、25至50之间、30至50之间、30至50之间、35至50之间、40至50之间、45至50之间、2至45之间、2至40之间、2至35之间、2至30之间、2至25之间、2至20之间、2至15之间、2至10之间、2至5个氨基酸之间)。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的,因此可以用作组分之间的中性系连(tether)。甘氨酸聚合物的示例包括(G)n、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物(例如,(GmSo)n、(GSGGS)n)、(GmSoGm)n、(GmSoGmSoGm)n、(GSGGSm)n、(GSGSmG)n和(GGGSm)n及其组合,其中m、n和o各自独立地选自至少1至20的整数,例如1-18、216、3-14、4-12、5-10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)和其他柔性接头。可用于制备本公开的IL10R结合分子的示例性柔性肽接头,包括但不限于表16中提供的接头。
在一些实施方式中,第一和第二结构域的共价连接可以通过化学接头实现。化学接头的实例包括芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。
在一些实施方式中,IL10R结合蛋白的IL10Ra sdAb和IL10Rb sdAb的稳定缔合受到非共价相互作用的影响。在两个分子之间提供稳定缔合的非共价相互作用的示例包括静电相互作用(例如,氢键、离子键、卤素结合、偶极-偶极相互作用、范德华力和p-效应(包括阳离子-p相互作用、阴离子-p相互作用和p-p相互作用))和疏水/亲水相互作用。在一些实施方式中,本公开的结合分子的sdAb的稳定缔合可受非共价相互作用的影响。
在一个实施方式中,IL10R结合分子的IL10Ra sdAb和IL10Rb sdAb的非共价稳定缔合可通过偶联sdAb"杵臼"工程改造的Fc二聚体的每个单体来实现。杵臼修饰是指在CH3结构域中两个免疫球蛋白重链之间界面的修饰,其中:i)在第一条重链的CH3结构域中,氨基酸残基被具有较大侧链的氨基酸残基(例如,酪氨酸或色氨酸)替代,从表面产生突起(“杵”)和ii)在第二条重链的CH3结构域中,氨基酸残基被具有较小侧链的氨基酸残基(如丙氨酸或苏氨酸)替代,从而在第二CH3结构域的界面内产生空腔(“臼”),其中第一CH3结构域的突出侧链(“杵”)被第二CH3结构域中的空腔接收。杵臼修饰更全面地描述于Ridgway,等(1996)《蛋白质工程改造》(Protein Engineering)9(7):617-621和1998年3月24日授权的美国专利号5,731,168、2010年1月5日授权的美国专利号7,642,228、2010年4月13日授权的美国专利号7,695,936以及2012年7月10日授权的美国专利号8,216,805。在一个实施方式中,“杵臼修饰”包括抗体重链之一中的氨基酸取代T366W和任选地氨基酸取代S354C,和另一个抗体重链中的氨基酸取代T366S、L368A、Y407V和任选地Y349C。此外,Fc结构域可以通过在S354和Y349位置引入半胱氨酸残基进行修饰,从而在Fe区的两个抗体重链之间产生稳定的二硫键(Carter,等(2001)Immunol Methods 248,7-15)。杵臼形式用于促进在具有“杵”修饰的第一Fc单体上第一多肽(例如结合IL10Rb的sdAb)的表达和在具有“臼”修饰的第二Fc单体上的第二多肽的表达,以促进异二聚体多肽偶联物的表达。杵臼形式用于促进在具有“杵”修饰的第一Fc单体上第一多肽的表达和在具有“臼”修饰的第二Fc单体上的第二多肽的表达,以促进异二聚体多肽偶联物的表达。IL10R结合分子的一个实施方式,其中IL10Ra sdAb和IL10Rb sdAb处于稳定的、非共价的缔合中,其中IL10R结合分子的每个sdAb共价结合至杵臼Fc二聚体的每个亚基,可选地包括一个接头,如附图中的图4,分图A所示。
IL10Ra sdAb的产生和评估
为了产生针对hIL2Ra的sdAb,可以使用hIL2Ra蛋白的胞外结构域作为免疫原。成熟(缺少信号序列)hIL2Ra的胞外结构域具有氨基酸序列(SEQ ID NO:452的氨基酸22-235),其具有氨基酸序列
HGTELPSPPSVWFEAEFFHHILHWTPIPNQSESTCYEVALLRYGIESWNSISNCSQTLSYDLTAVTLDLYHSNGYRARVRAVDGSRHSNWTVTNTRFSVDEVTLTVGSVNLEIHNGFILGKIQLPRPKMAPANDTYESIFSHFREYEIAIRKVPGNFTFTHKKVKHENFSLLTSGEVGEFCVQVKPSVASRSNKGMWSKEECISLTRQYFTVTN(SEQ IDNO:453)
在一些实施方式中,当用作免疫原或免疫原性组合物时,hIL2Ra ECD可以作为具有免疫调节蛋白的融合蛋白的结构域提供。
为了产生针对mIL10Ra的sdAb,可以使用mIL10Ra蛋白的胞外结构域作为免疫原。mIL10Ra胞外结构域的胞外结构域具有氨基酸序列(SEQ ID NO:454的氨基酸17-241),其具有氨基酸序列
LEFIAYGTELPSPSYVWFEARFFQHILHWKPIPNQSESTYYEVALKQYGNSTWNDIHICRKAQALSCDLTTFTLDLYHRSYGYRARVRAVDNSQYSNWTTTETRFTVDEVILTVDSVTLKAMDGIIYGTIHPPRPTITPAGDEYEQVFKDLRVYKISIRKFSELKNATKRVKQETFTLTVPIGVRKFCVKVLPRLESRINKAEWSEEQCLLITTEQYFTVTNLSI
(SEQ ID NO:455)
在一些实施方式中,当用作免疫原或免疫原性组合物时,mIL2Ra ECD可以作为具有免疫调节蛋白的融合蛋白的结构域提供。
基本上根据本文实施例1-4的教导,产生了一系列hIL10Ra sdAb。简言之,在数周的时间内,通过皮下注射含有重组产生的融合蛋白的佐剂组合物,用人IL10Ra的ECD依次免疫骆驼,所述融合蛋白包含IL10Ra的胞外结构域、人IgG1铰链域和人IgG1重链Fc。免疫后,从适当大小的VHH-铰链-CH2-CH3物种的血液样品中提取的RNA被转录以产生DNA序列,其经消化以鉴定被分离的包含编码VHH结构域的核酸序列的约400bp片段。分离的序列用限制性内切酶消化,以便于插入噬菌体载体中,与编码his-标签的序列在框内,并转化到大肠杆菌中以生成噬菌体文库。对噬菌体文库进行多轮生物淘选(bio-panning),以进行鉴定结合至IL10Ra的ECD的VHH(人或小鼠,视情况而定)。以96孔板形式分离单个噬菌体克隆用于周质提取物ELISA(PE-ELISA),并通过比色测定确认选择性结合。分离并测序显示出与IL10Ra抗原特异性结合的IL10Ra结合分子,并分析序列以鉴定VHH序列、CDR和鉴定独特的VHH克隆型。如本文所用,术语“克隆型”是指来源于同一B细胞祖细胞的结合分子的集合,特别是属于同一种系家族、具有相同CDR3长度且在CDR3序列中具有70%或更高同源性的抗原结合分子集合。
表5提供了显示与hIL10Ra ECD抗原特异性结合的VHH分子(hIL10Ra VHH)的氨基酸序列,表2提供了从此类VHH中分离出来的CDR。表8提供了编码表5的VHH的核酸序列。
为了确认和评估IL10Ra sdAb结合的结合亲和力,从产生的每个克隆型中选择一个代表性示例用于评估通过SPR的结合。使用表面等离子体共振(SPR)基本上按照实施例5的教导,评估hIL10Ra VHH对对应于SEQ ID NO 159、161、162、163、165、167和170的ECD的结合亲和力。用Biacore T200评估软件处理减去缓冲液的感测图,并用1:1Langmuir结合模型(整体偏移设置为零)进行全局拟合,以提取动力学和亲和常数(ka,kd,kD)。R最大<100RU表示表面密度与动力学分析兼容。使用以下公式生成计算的R最大:R最大=载荷(RU)x配体的价态x(分析物的分子量/配体的分子量)。表面活性定义为实验/计算的R最大之比。下表22中提供了这些结合亲和力实验的结果。表22中提供的数据表明生成的IL10Ra单域抗体具有与hIL10Ra的ECD的特异性结合。
表2提供了可用于制备IL10Ra sdAb以纳入本公开的结合分子中的CDR。在一些实施方式中,IL10Ra sdAb是在其响应免疫时产生的,并与hIL10Ra的ECD特异性结合。在一些实施方式中,IL10Ra sdAb是单域抗体,其包含:相对于SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49和52中任一个的序列,具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化的CDR1;和相对于SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50和53中任一个的序列,具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化的CDR2;和相对于SEQ ID NO:3、6、9、12、15、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51和54中任一个的序列,具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化的CDR3。
在一些实施方式中,IL10Ra sdAb包含相对于表5中提供的hIL10Ra sdAb的任一个氨基酸序列(SEQ ID NO:154-171)具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的序列。在某些实施方式中,IL10Ra sdAb包含与表5中提供的hIL10Ra sdAb的任一个氨基酸序列(SEQ ID NO:154-171)的序列基本同一的序列。在某些实施方式中,IL10Ra sdAb包含与表5中提供的hIL10Ra sdAb的任一个氨基酸序列(SEQ ID NO:154-171)的序列同一的序列。
另一方面,本公开提供了一种分离的编码本文所述的IL10Ra sdAb的核酸。表8提供了DNA序列(SEQ ID NO:205-222,编码表5的IL10Ra sdAb(SEQ ID NO:154-171))。在某些实施方式中,本公开提供了分离的核酸,其包含相对于表8的DNA序列(SEQ ID NO:205-222)具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%)序列同一性的序列。在某些实施方式中,本公开提供了分离的核酸,其包含与表8的DNA序列(SEQID NO:205-222)基本同一的DNA序列。在某些实施方式中,本公开提供了分离的核酸,其包含与表8的DNA序列(SEQ ID NO:205-222)同一的DNA序列。
IL10Rb VHH的产生和评估
本公开还提供了特异性结合小鼠和人IL10Rb(hIL10Rb)和小鼠IL10Rb(mIL10Rb)的胞外结构域的IL10Rb sdAb。用于产生IL10Rb VHH的程序基本上与上文提供的程序相同,并且基本根据实施例5的教导,除了用于免疫的抗原之外,下文将详细讨论。
为了产生针对hIL10Rb的sdAb,将hIL10Rb蛋白的胞外结构域用作免疫原。成熟(缺乏信号序列)hIL10Rb的胞外结构域具有氨基酸序列:
MVPPPENVRMNSVNFKNILQWESPAFAKGNLTFTAQYLSYRIFQDKCMNTTLTECDFSSLSKYGDHTLRVRAEFADEHSDWVNITFCPVDDTIIGPPGMQVEVLADSLHMRFLAPKIENEYETWTMKNVYNSWTYNVQYWKNGTDEKFQITPQYDFEVLRNLEPWTTYCVQVRGFLPDRNKAGEWSEPVCEQTTHDETVPS(SEQ ID NO:457)
为了产生针对mIL10Rb的sdAb,将mIL10Rb蛋白的胞外结构域用作免疫原。成熟(缺少信号序列)mIL10Rb的胞外结构域具有hIL10Rb蛋白的胞外结构域用作免疫原的氨基酸序列。成熟(缺乏信号序列)mIL10Rb的胞外结构域具有氨基酸序列:
MIPPPEKVRMNSVNFKNILQWEVPAFPKTNLTFTAQYESYRSFQDHCKRTASTQCDFSHLSKYGDYTVRVRAELADEHSEWVNVTFCPVEDTIIGPPEMQIESLAESLHLRFSAPQIENEPETWTLKNIYDSWAYRVQYWKNGTNEKFQVVSPYDSEVLRNLEPWTTYCIQVQGFLLDQNRTGEWSEPICERTGNDEITPS(SEQ ID NO:459)
表6提供了按照上述方法产生并证明与hIL10Rb ECD抗原特异性结合的VHH分子(hIL10Rb VHH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:172-198),表3提供了从此类VHH分离的CDR(SEQID NO:55-135)。表9提供了编码表6的VHH的核酸序列(SEQ ID NOS:223-249)。
表7提供了按照上述方法产生并证明与mIL10Rb ECD抗原特异性结合的VHH分子(mIL10Rb VHH)的氨基酸序列(SEQ ID NO:199-204),表4提供了从此类VHH分离的CDR(SEQID NO:136-153)。表10提供了编码表7的VHH的核酸序列(SEQ ID NOS:250-255)。
为了确认和评估hIL10Rb sdAb结合的结合亲和力,从产生的每个克隆型中选择一个代表性示例用于评估通过SPR的结合。使用表面等离子体共振(SPR)基本上根据实施例5的教导评估hIL10Rb结合分子对hIL10Rb的结合亲和力,其对应于SEQ ID NO:172、174、183、186、187、197和198。用Biacore T200评估软件处理减去缓冲液的感测图,并用1:1Langmuir结合模型(整体偏移设置为零)进行全局拟合,以提取动力学和亲和常数(ka,kd,kD)。R最大<100RU表示表面密度与动力学分析兼容。使用以下公式生成计算的R最大:R最大=载荷(RU)x配体的价态x(分析物的分子量/配体的分子量)。表面活性定义为实验/计算的R最大之比。下表23中提供了这些结合亲和力实验的结果。
*不准确拟合
提供的数据表明,产生的hIL10Rb单域抗体具有与hIL10Rb的ECD的特异性结合和一系列结合亲和力,可用于调节IL10R结合分子的活性,如下文所讨论。
表3和4提供了可用于制备IL10Ra sdAb以纳入本公开的结合分子中的CDR。在一些实施方式中,IL10Ra sdAb是在响应免疫时产生的,并与hIL10Ra的ECD特异性结合。在一些实施方式中,IL10Ra sdAb是单域抗体,其包含:相对于表3的CDR1序列,CDR1具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%),或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;相对于表3的CDR1序列,CDR2具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;相对于表3的CDR1序列,CDR3具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化。在一些实施方式中,IL10Ra sdAb是在响应免疫时产生的,并与mIL10Ra的ECD特异性结合。在一些实施方式中,IL10Ra sdAb是单域抗体,其包含:相对于表4的CDR1序列,CDR1具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;相对于表4的CDR1序列,CDR2具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸改变;相对于表4的CDR1序列,CDR3具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化。
在一些实施方式中,IL10Rb sdAb包含相对于表6中的hIL10Rb sdAb的任一个氨基酸序列(SEQ ID NO:172-198)具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的序列。在某些实施方式中,IL10Rb sdAb包含与表6中的hIL10ba sdAb的任一个氨基酸序列(SEQ ID NO:172-198)的序列基本同一的序列。在某些实施方式中,IL10Rb sdAb包含与表6中的hIL10ba sdAb的任一个氨基酸序列(SEQ IDNO:172-198)的序列同一的序列。
在一些实施方式中,IL10Rb sdAb包含相对于表7中的mIL10Rb sdAb的任一个氨基酸序列(SEQ ID NO:199-204)具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的序列。在某些实施方式中,IL10Rb sdAb包含与表7中的mIL10Rb sdAb的任一个氨基酸序列(SEQ ID NO:199-204)的序列基本同一的序列。在某些实施方式中,IL10Rb sdAb包含与表7中的mIL10Rb sdAb的任一个氨基酸序列(SEQ IDNO:199-204)的序列同一的序列。
另一方面,本公开提供了一种分离的编码本文所述IL10Rb sdAb的核酸。在某些实施方式中,本公开提供了分离的核酸,其包含相对于表9的DNA序列(SEQ ID NO:223-249)具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%)序列同一性的序列。在某些实施方式中,本公开提供了分离的核酸,其包含与表9的DNA序列(SEQ IDNO:223-249)基本同一的DNA序列。在某些实施方式中,本公开提供了分离的核酸,其包含与表9的DNA序列(SEQ ID NO:223-249)同一的DNA序列。
另一方面,本公开提供了一种分离的编码本文所述IL10Rb sdAb的核酸。在某些实施方式中,本公开提供了分离的核酸,其包含相对于表10的DNA序列(SEQ ID NO:250-255)具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%)序列同一性的序列。在某些实施方式中,本公开提供了分离的核酸,其包含与表10的DNA序列(SEQID NO:250-255)基本同一的DNA序列。在某些实施方式中,本公开提供了分离的核酸,其包含与表10的DNA序列(SEQ ID NO:250-255)同一的DNA序列。
IL10R多肽结合分子的产生
在一些实施方式中,本发明的IL10R结合分子是下式[#1]的多肽:
H2N-(IL10 VHH#1)–(L1)a–(IL10 VHH#2)–(L2)b-(CP)c-COOH [#1]
其中:“—代表共价键;”L1和L2是接头;CP是螯合肽;a、b和c独立地选自整数0或1;“H2N”表示氨基末端;并且“COOH表示多肽的羧基末端”
使用上文制备的hIL10Ra VHH和hIL10Rb VHH,制备了一系列如SEQ ID NO:256-353的98种式[#1]的多肽IL10R结合分子,并且关于SEQ ID NO 256-353中的每一个:a=1且L1=G3S;b=1且L2=Ala-Ser;c=1且CP=六组氨酸。表11中提供了SEQ ID NOS256-353的98种IL-10受体结合蛋白的IL10Ra VHH、接头和IL10Ra VHH、螯合肽元件。表12提供了SEQID NO:256-353的氨基酸序列,表14提供了编码前述每一个用于表达IL10R结合分子的DNA序列(SEQ ID NO:353-402)。
制备表11和12的IL10R结合蛋白并评估IL10活性。实施例中提供了关于这98种IL10R结合蛋白的表达和纯化的详细信息。简言之,基本上按照实施例4,编码SEQ ID No:256-353的核酸序列分别合成为SEQ ID No:354-451,插入重组表达载体并在24孔板形式的HEK293细胞中表达。基本上根据本文的实施例5和6,用未刺激和野生型人IL-10作为对照,评估含有SEQ ID NO:192-298的IL-10受体结合蛋白的上清液的活性。实验结果提供于表13中。
从表13中提供的数据可以看出,式[#1]的IL-10受体结合蛋白在IL-10活性试验中证明了IL-10活性。基于吸光度读数,IL-10活性水平被分类为低(高于未刺激和A630<1)、中等(A630 1-1.5)和高(A630>1.5)。从上述数据中,11种IL10受体结合蛋白表现出高活性(SEQID NO:258、273、274、275、276、282、290、297、298、308和314),4种具有中等活性(SEQ IDNO:267、269、271和333)以及8种VHH(SEQ ID NO:276、281、283、288、291、301、303和313)具有低活性。
为了进一步研究和表征以上制备的IL10R结合分子的结合,基本上按照实施例的教导以及下表2和25中提供的数据,通过SPR评估了上述分子与hIL10Ra和hIL10Rb受体亚基的结合情况。第一列代表IL10R结合分子中使用的VHH(如上表5和6中提供的),其方向从氨基到羧基,并且每个分子在与生物素偶联的VHH之间用4个氨基酸的G3S接头表达。如下表24和25中提供的数据所示,通过SPR测定,式[#1]的IL10R多肽结合分子显示出对每个hIL10Ra和hIL10Rb VHH亚基的个位数纳摩尔结合亲和力。该数据表明,hIL10Ra和hIL10Rb VHH亚基的每一个都保留了它们各自对其各自的IL10受体亚基的结合亲和力,并且如下文更详细讨论的,无论以“正向”还是“反向”构型提供,都保留了活性。
受体结合分子活性的调节
在一些实施方式中,例如为了实现特定细胞类型的部分激动或选择性激活,本公开的IL10R结合分子的设计可以通过受体结合分子设计中的结构变化来调节。这种活性变化可用于调节IL10R受体结合分子的结合和活性,以优化IL10R结合分子的活性以实现部分激动、选择性细胞类型激活或提供相对于IL10Ra sdAb和IL10Rb sdAb各自受体亚基的同源配体。
调节本公开IL10R结合分子的活性的能力在多种治疗应用中提供了实质性益处。IL10是一种多效性细胞因子,通过作用于T细胞、B细胞、巨噬细胞和抗原呈递细胞(APC)以及看似矛盾的活性来调节多种免疫反应,其限制了临床开发。据报道,IL10可抑制免疫反应并抑制激活的单核细胞和巨噬细胞中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、GM-CSF和G-CSF的表达。IL10与抑制NK细胞产生IFN-γ有关。相反,IL10表现出免疫刺激特性,包括增强对IL-2和IL-4处理的胸腺细胞的刺激,增强B细胞的活力,以及刺激MHC II类抗原的呈递。因此,IL-10的用途已确定可用于治疗范围广泛的疾病、病症和病况,包括炎性病症、免疫相关病症、纤维化病症、代谢病症和癌症。
本公开的IL10R分子能够调节活性以在人类疾病的治疗中提供显著益处。本文所述的IL10R结合蛋白可用于在有需要的对象中治疗肿瘤疾病,例如癌症(例如,实体瘤癌症(例如,非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)或黑色素瘤))。在一些实施方式中,本文所述的IL10R结合蛋白可以提供比IL10更长的治疗功效(例如,更低的有效剂量、更低的毒性)。本公开的IL10R结合分子可以在不同细胞类型中触发不同水平的下游信号转导。例如,通过改变IL10R结合分子中IL10Ra sdAb抗体和IL10Rb sdAb抗体之间的接头长度,与不期望的细胞类型相比,IL10R结合分子在期望的细胞类型中提供更高水平的下游信号转导。在一些实施方式中,IL10R结合分子是部分IL10激动剂,其选择性激活T细胞(例如,CD8+T细胞)而不是巨噬细胞。在一些实施方式中,激活的T细胞具有上调的IFNγ。在一些实施方式中,作为部分激动剂IL10R结合蛋白可以抑制自身免疫性炎性疾病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)。
在一个实施方式中,本公开提供了一种IL10Ra结合分子,其相对于单核细胞优先激活T细胞,具体是CD8+T细胞。在一个实施方式中,本公开提供了式#1的IL10Ra结合分子,其中IL10Ra sdAb对IL10Ra胞外结构域的亲和力高于IL10Rb sdAb对IL10Rb胞外结构域的亲和力。在一些实施方式中,本公开提供了式#1的IL10Ra分子,其中IL10Ra sdAb对IL10Ra胞外结构域的亲和力为约10-8至约10-10M、或约10-9至约10-10M、或10-10M,并且IL10Rb sdAb对IL10Rb胞外结构域的亲和力为约10-6至约10-9M、或约10-7至约10-9M、或约10-7至约10-8M、或约10-9M、或约10-8M。在一些实施方式中,本公开提供了式#1的IL10Ra分子,其中IL10RasdAb对IL10Ra胞外结构域的亲和力为约10-8至约10-10M、或约10-9至10-10M、或约10-10M,并且IL10Rb sdAb对IL10Rb胞外结构域的亲和力为约10-6至约10-9M、或者约10-7至约10-9M、或者约10-7至约10-8M、或者约10-9M、或者约10-8M,并且相对于IL10Rb sdAb对IL10Rb的ECD的亲和力,IL10Ra sdAb对IL10Ra的ECD的亲和力高于2倍、或高于5倍、或高于10倍、或高于20倍、或高于40倍、或高于50倍、或高于60倍、或高于70倍、或高于80倍、或高于90倍、或高于100倍、或高于150倍、或高于200倍、或高于500倍。
在一些实施方式中,例如通过改变接头长度,与巨噬细胞中的下游信号转导水平相比,IL10R结合分子可以在T细胞(例如,CD8+T细胞)中引起更高水平的下游信号转导,巨噬细胞是一种表达IL10Ra和IL10Rb受体两者的细胞类型,但当激活得太强时会导致贫血。当巨噬细胞中的下游信号转导被激活到高水平时,这些激活的巨噬细胞便可以消除老化的红细胞,从而导致贫血。调节IL10R结合分子活性的能力使分子在T细胞(例如,CD8+T细胞)中具有比巨噬细胞下游信号转导水平更高的下游信号转导水平,从而避免贫血。在一些实施方式中,本公开的IL10R结合分子导致T细胞(例如,CD8+T细胞)中的下游信号转导水平至少巨噬细胞中的下游信号转导水平的1.1、1.5、2、3、5或10倍。在其他实施方式中,具有不同结合亲和力的不同IL10Ra sdAb抗体和具有不同结合亲和力的不同IL10Rb sdAb抗体可用于调节IL10R结合分子的活性。此外,IL10R结合分子作为单条多肽提供时,也可改变多肽中两种抗体的取向以改变分子的性质。在一些实施方式中,期望提供IL10R结合蛋白,对比IL10引起的E最大,其具有降低的E最大,所述IL10是IL10受体的同源配体(即,IL10R结合分子是IL10部分激动剂)。E最大反映了可通过配体(例如,本文所述的结合蛋白或同源配体(例如,IL10))获得的细胞类型中的最大反应水平。在一些实施方式中,本文所述的IL10R结合蛋白具有由IL10R引起的E最大的至少1%(例如,1%至100%之间、10%至100%之间、20%至100%之间、30%至100%之间、40%至100%之间、50%至100%之间、60%至100%之间、70%至100%之间、80%至100%之间、90%至100%之间、1%至90%之间、1%至80%之间,1%至70%之间、1%至60%之间、1%至50%之间、1%至40%之间、1%至30%之间、1%至20%之间、或者1%至10%之间)。
如前所述,IL10R结合分子的sdAb的取向可用于优化分子所期望的特性。IL10R的sdAb的取向可以在多种不同的结构中被提供,如附图的图2、3和4所示,如下式表达:
(a)H2N-[IL10Ra sdAb]-[L1]x-[IL10Rb sdAb]-[L2]y-[CP]z-COOH;
(b)H2N-[IL10Rb sdAb]-[L1]x-[IL10Ra sdAb]-[L2]y-[CP]z-COOH;
(c)H2N-[IL10Ra sdAb]-[L1]x-[IL10Rb sdAb]-[L2]y-[Fc]z-COOH;
(d)H2N-[IL10Rb sdAb]-[L1]x-[IL10Ra sdAb]]-[L2]y-[Fc]z-COOH;
其中L1和L2是独立选择的1-50个氨基酸的多肽接头,x=0或1,y=0或1;CP是螯合肽;“Fc”是单体Fc结构域且y=0或1;该结构的非共价复合物:
(e)[H2N-[IL10Ra sdAb]-[L1]x-Fc1-COOH:H2N-[IL10Rb sdAb]-[L2]y-Fc2-COOH];
其中L1和L2是独立选择的1-50个氨基酸的多肽接头,x=0或1,y=0或1;CP是螯合肽;“Fc1”为单体Fc结构域“Fc2”为单体Fc结构域,其中Fc1和Fc2形成稳定的非共价缔合,y=0或1;和该结构的配体共价复合物:
(f)H2N-[IL10Ra sdAb]-[L1]x-(CP1)-M-(CP2)-(L2)-[IL10Rb sdAb]-NH2
其中L1和L2是独立选择的1-50个氨基酸的多肽接头,x和y独立地选自0或1;CP1是第一螯合肽;CP2是第二螯合肽;M是过渡金属离子。
调节本公开的受体结合分子的活性和/或特异性的方式的示例包括但不限于,改变多肽IL10Ra sdAb和IL10Rb sdAb在多肽IL10R结合分子中的顺序取向,独立地改变每个IL10Ra sdAb和IL10Rb sdAb相对于它们各自的IL10Ra和/或每个目标的结合亲和力,调节IL10Ra sdAb和IL10Rb sdAb之间的距离,例如通过采用接头或不同的长度,这将影响IL10受体亚基的胞内信号结构域的接近程度,从而实现对同源配体与受体结合的胞内信号转导特征的调节,例如在细胞内诱导的磷酸STAT3的水平。如以下提供的数据所示,这些变体中的每一个都可用于调节IL10R结合分子的特性。
单条多肽IL10R结合分子中IL10Ra和IL10Rb sdAb的顺序取向
当IL10R结合分子在单条多肽中包含IL10Ra sdAb和IL10Rb sdAb序列时,可以排列IL10Ra sdAb和IL10Rb sdAb序列,其中IL10Ra sdAb相对于IL10Rb sdAb是N-末端(本文称为“正向构型”)或IL10Rb sdAb相对于IL10Ra sdAb是N-末端(本文称为“反向构型”)。这两个取向可以作为由下式表示的式[#1]化合物的示例来说明;
(a)H2N-[IL10Ra sdAb]-[L1]x-[IL10Rb sdAb]-[L2]y-[CP]z-COOH;
(b)H2N-[IL10Rb sdAb]-[L1]x-[IL10Ra sdAb]-[L2]y-[CP]z-COOH;
其中:“—”代表共价键;L1和L2是接头;CP是螯合肽;a、b和c独立地选自整数0或1;“H2N”表示氨基末端;并且“COOH”表示多肽的羧基末端
“正向”构型
在一些实施方式中,IL10R结合分子包含式[#1]结构的多肽,其中式[#1]的N-末端VHH(即,IL10 VHH#1)是IL10Ra VHH,C-末端VHH(即,IL10 VHH#2)是IL10Rb VHH,并且其中:“–”代表共价键;L1和L2是独立选择的表16接头的多肽接头;CP是螯合肽;a、b和c独立地选自整数0或1;“H2N”表示氨基末端;并且“COOH”表示多肽的羧基末端。
“反向”构型
在一些实施方式中,IL10R结合分子包含式[#1]结构的多肽,其中上式[#1]的N-末端VHH(即,IL10 VHH#1)是抗-IL10Rb VHH,并且C-末端VHH(即,IL10VHH#2)是抗-IL10RaVHH(“正向”)并且其中:“–”代表共价键;L1和L2是独立选择的表16接头的多肽接头;CP是螯合肽;a、b和c独立地选自整数0或1;“H2N”表示氨基末端;并且“COOH”表示多肽的羧基末端。
正向和反向的示例性IL10R分子的活性评估
IL10Ra和IL10Rb sdAb的正向和反向的IL10R结合分子基本上根据实施例的教导产生。对应于序列ID NO:256-304的IL10R结合分子是“正向构型”或“正向”的示例。对应于序列ID NO:305-353的IL10R结合分子是“反向”或“反向构型”化合物的示例。按照实施例和表13中提供的数据评估这些“正向”和“反向”分子的活性。参考表13中呈现的结合数据,可以看出响应于IL10R结合分子的IL10Ra sdAb和IL10Rb sdAb的顺序取向(正向比反向),IL10Ra和IL10Rb sdAb结合结构域的取向提供了IL10活性的实质性调控。
从上述序列制备的VHH分子分离的CDR可用于制备正向和反向构型的IL10R结合分子。在一些实施方式中,本公开提供了“正向”构型的IL10R结合分子,其中IL10R结合分子包含从氨基到羧基末端的多肽:
IL10Ra sdAb,其包含:
相对于SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49和52中任一个的序列,CDR1具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;
相对于SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50和53中任一个的序列,CDR2具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;和
相对于SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51和54中任一个的序列,CDR3具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;
(b)1-50个氨基酸、或1-40个氨基酸、或1-30个氨基酸、或1-20个氨基酸、或1-15个氨基酸、或1-10个氨基酸、或1-8个氨基酸、或1-6个氨基酸、或1-4个氨基酸的多肽接头;和
(c)IL10Rb sdAb,其包含:
相对于SEQ ID NO:55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148和151中任一个的序列,CDR1具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;
相对于SEQ ID NO:56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149和152中任一个的序列,CDR2具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;和
相对于SEQ ID NO:57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150和153中任一个的序列,CDR3具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;
在一些实施方式中,“正向”构型的IL10R结合分子,其中IL10R结合分子包含从氨基到羧基末端的多肽:
(a)IL10Ra sdAb,其包含相对于SEQ ID NO:154-171的任一个序列具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的氨基酸序列。
(b)1-50个氨基酸、或1-40个氨基酸、或1-30个氨基酸、或1-20个氨基酸、或1-15个氨基酸、或1-10个氨基酸、或1-8个氨基酸、或1-6个氨基酸、或1-4个氨基酸的多肽接头;和
(c)以及IL10Rb sdAb,其包含相对于SEQ ID NO:172-204的任一个序列具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的序列。
在一些实施方式中,IL10R分子具有“正向”构型,其中IL10R结合分子包含相对于SEQ ID NO:256-304中任一个序列具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的多肽。
在一些实施方式中,本公开提供了“反向”构型的IL10R结合分子,其中IL10R结合分子包含从氨基到羧基末端的多肽:
IL10Ra sdAb,其包含:
相对于SEQ ID NO:55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148和151中任一个的序列,CDR1具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;
相对于SEQ ID NO:56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149和152中任一个的序列,CDR2具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;和
相对于SEQ ID NO:57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150和153中任一个的序列,CDR3具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;
(b)1-50个氨基酸、或1-40个氨基酸、或1-30个氨基酸、或1-20个氨基酸、或1-15个氨基酸、或1-10个氨基酸、或1-8个氨基酸、或1-6个氨基酸、或1-4个氨基酸的多肽接头;和
(c)IL10Ra sdAb,其包含:
(d)相对于SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49和52中任一个的序列,CDR1具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;
(e)相对于SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50和53中任一个的序列,CDR2具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;和
(f)相对于SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51和54中任一个的序列,CDR3具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;
在一些实施方式中,本公开提供了“反向”构型的IL10R结合分子,其中IL10R结合分子包含从氨基到羧基末端的多肽:
(c)以及IL10Rb sdAb,其包含相对于SEQ ID NO:172-204的任何一个序列具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的序列。
(b)1-50个氨基酸、或1-40个氨基酸、或1-30个氨基酸、或1-20个氨基酸、或1-15个氨基酸、或1-10个氨基酸、或1-8个氨基酸、或1-6个氨基酸、或1-4个氨基酸的多肽接头;和
(c)IL10Ra sdAb,其包含相对于SEQ ID NO:154-171的任何一个序列具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中,IL10R结合分子是相对于式#1的IL10R结合分子的序列具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的多肽,其中IL10VHH#1和IL10VHH#2对应于下表的每行的SEQ ID(例如IL10VHH#1是SEQ IDNO:165,IL10VHH#2是SEQ ID NO:198,等):
IL10VHH#1 SEQ ID | IL10VHH#1 SEQ ID |
165 | 198 |
167 | 197 |
170 | 187 |
183 | 161 |
162 | 172 |
172 | 162 |
161 | 187 |
161 | 197 |
162 | 197 |
161 | 186 |
163 | 174 |
187 | 163 |
161 | 183 |
159 | 198 |
159 | 187 |
162 | 187 |
170 | 186 |
165 | 187 |
161 | 198 |
162 | 198 |
170 | 197 |
167 | 172 |
183 | 159 |
174 | 163 |
186 | 162 |
接头长度对IL10R结合分子活性影响的评估
如本公开中所讨论的,本公开的IL10R二聚体VHH IL10R结合分子的活性可以通过改变第一和第二IL10 VHH单体之间的接头长度来调节。为了说明接头长度变化的影响,一系列具有式[#1]的IL10R结合多肽,在每种情况下b=1且L2=Ala-Ser;c=1;以及CP=hisx6,其制备成包含IL10VHH#2中的变化,同时保持IL10VHH#1序列恒定如DR241(SEQ IDNO 170),其按照下表26:
使用野生型人IL10、包含C末端His6螯合肽且未酰亚胺化的野生型IL10作为对照,评估响应于对应SEQ ID NO:489、490、300、491、492、493、494、302、494、303、495、496和497的IL10R结合分子诱导的pSTAT3在CD4+T细胞、CD8+T细胞和单核细胞的活性。所涉及的试验和方法的方案在附图的图5中呈现。这些测试的结果提供于附图图6中。为了单独阐明接头长度的影响,在图6的每个分图(分图A、B和C)中表示了条件,其中IL10Ra sdAb和IL10RbsdAb保持不变并且只有接头长度发生变化,术语2X、4X等是指接头中氨基酸的数目,接头的序列在表16中提供。如图6中的数据所示,仅接头长度的变化(保持sdAb和其他组分恒定,如图6的每个分图所示)不仅可用于调节IL10R结合分子对于给定细胞类型(例如CD4+、CD8+或单核细胞)的活性水平,接头长度的变化可用于反映一种细胞类型对另一种细胞类型的活性的调节。如提供的数据所示,改变IL10Ra和IL10Rb sdAb之间的距离,在某些情况下改变接头分子的长度可以提供细胞中IL10活性水平的调节,如通过pSTAT3活性水平所测量的。
Fc偶联物
如本公开中所讨论的,在一些实施方式中,IL10R结合分子可以偶联至Fc结构域的亚基,如图2的分图B所示并由式#2表示:
H2N-(IL10 VHH#1)–(L1)a–(IL10 VHH#1)–(L2)b-(Fc单体)c-COOH [#2]
一系列代表性的式[#1]的IL10R结合多肽,在每种情况下a=1,L1=G3S,b=1和L2=Ala-Ser;c=1;和Fc单体是SEQ ID NO:502的多肽,其制备成包含IL10VHH#2中的变化,同时保持IL10VHH#1序列恒定如DR241(SEQ ID NO 170),其按照下表27。在其构建中使用的IL10Ra和IL10Rb sdAb的这些特征和细节,总结在下表27中:
图6还提供了与各分子在不同浓度下在CD4+、CD8+和单核细胞中的活性有关的数据。应注意的是,相对于在相同取向具有相同IL10Ra和IL10Rb sdAb的非Fc融合分子,这些Fc融合体中的每一个都包括在内。因此,图6中提供的数据也可用于评估添加Fc结构域对IL10R结合分子的IL10活性的影响。从提供的数据来看,Fc融合体融合分子包含在相同取向(正向或反向)的相同IL10Ra和Il10Rb sdAb,并与具有相同接头的分子(4X也称为G3S)进行比较,参见表16)接头,Fc融合体显示出相当的,在一些情况下相对于非Fc变体增强的活性。该数据表明,本公开的IL10R结合分子可以与Fc结构域偶联以提供延长的体内寿命,而不会在各种细胞类型中提供与非Fc融合分子相当的IL10活性水平。
用于进一步评估的IL10R结合分子的构建
基于前述实验,选择了基于DR521(SEQ ID NO:304)的IL10R结合分子变体的选定子集用于进一步评估。在这些实验中使用的分子可以由式[#1]表示,其中在每种情况a=1,L1=G3S(SEQ ID NOr,b=1和L2=Ala-Ser;CP=Hisx6,IL10 VHH#1是IL10Ra VHH DR241(SEQ ID NO:170),IL10 VHH#2是IL10Rb VHH DR 246(SEQ ID NO:187)。SEQ ID NO:170的多肽在本文中也称为DR241,而SEQ ID NO:187的多肽在本文中也称为DR246。
DR521(DR241-G3S-DR246-ASH6):
在一个实施方式中,为评估而制备的示例性多肽是式[#1]的多肽,其中在每种情况下a=1,L1=G3S-Ser,b=1且L2=Ala-Ser;CP=Hisx6,IL10 VHH#1是IL10Ra VHH DR241(SEQ ID NO:170),IL10 VHH#2是IL10Rb VHH DR 246(SEQ ID NO:187):a=1且L1是G3S接头;b=1且L2具有序列Ala-Ser;c=1其中CP是组氨酸多肽六聚体,该多肽具有以下氨基酸序列:
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYSNCSYDMTWYRQAPGKEREFVSAIHSDGSTRYADSVKGRFFISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCKTDPLHCRAHGGSWYSVRANYWGQGTQVTVSSGGGSQVQLQESGGGSVEAGGSLRLSCAASGYTHSSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDVDGSTTYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTGMYYCAAEFADCSSNYFLPPGAVRYWGQGTQVTVSSASHHHHHH(SEQ ID NO:302)
SEQ ID NO:302的多肽在本文中也称为DR521。
DR838(Q1E N29Q DR521):
制备了DR521(SEQ ID NO:302)SEQ ID NO:302的多肽变体,其纳入氨基酸取代1QE和N29Q,其具有以下氨基酸序列:
EVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYSQCSYDMTWYRQAPGKEREFVSAIHSDGSTRYADSVKGRFFISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCKTDPLHCRAHGGSWYSVRANYWGQGTQVTVSGGGSQVQLQESGGGSVEAGGSLRLSCAASGYTHSSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDVDGSTTYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTGMYYCAAEFADCSSNYFLPPGAVRYWGQGTQVTVSSASHHHHHH(SEQ ID NO:486).
SEQ ID NO:486的多肽在本文中也称为DR838。
如别处所讨论的,为了避免在N-末端形成焦谷氨酸而使通过醛化学进行的PEG化复杂化,在DR838(SEQ ID NO:486)的制备中纳入了Q1E氨基酸取代以促进N-末端聚乙二醇化。此外,对DR521(SEQ ID NO:302)的CDR序列的检查表明在Asn29-Cys30-Ser30的序列中存在N-连接的糖基化基序N-X-S。通过修饰N-连接糖基化基序的序列以防止糖基化来消除此类N-连接的糖化基序。在DR521(SEQ ID NO:302)的DR838(SEQ ID NO:486)衍生物的制备中,通过用谷氨酰胺残基取代DR521位置29的天冬酰胺,消除了该N-连接糖基化基序,称为N29Q取代。
DR839 Q1E N29D DR521-Ala-Ser-HIS6
制备SEQ ID NO:302的附加的多肽变体,其具有Q1E和N29D氨基酸取代并具有氨基酸序列:
EVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYSDCSYDMTWYRQAPGKEREFVSAIHSDGSTRYADSVKGRFFISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCKTDPLHCRAHGGSWYSVRANYWGQGTQVTVSSGGGSQVQLQESGGGSVEAGGSLRLSCAASGYTHSSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDVDGSTTYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTGMYYCAAEFADCSSNYFLPPGAVRYWGQGTQVTVSSASHHHHHH(SEQ ID NO:487).
SEQ ID NO:487的多肽在本文中也称为DR839。
DR841(Q1E S31A DR521)
制备SEQ ID NO:302的附加的多肽变体,其具有Q1E和S31A氨基酸取代(以消除DR521的Asn29-Cys30-Ser30 N-连接的糖基化基序)并具有氨基酸序列:
EVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYSNCAYDMTWYRQAPGKEREFVSAIHSDGSTRYADSVKGRFFISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCKTDPLHCRAHGGSWYSVRANYWGQGTQVTVSSGGGSQVQLQESGGGSVEAGGSLRLSCAASGYTHSSYCMGWFRQAPGKEREGVAAIDVDGSTTYADSVKGRFTISKDNAKNTLYLQMNSLKPEDTGMYYCAAEFADCSSNYFLPPGAVRYWGQGTQVTVSSASHHHHHH(SEQ ID NO:488).
SEQ ID NO:488的多肽在本文中也称为DR841。
sdAb的人源化
如前所述,可用于制备本公开的IL10R结合分子的IL10Ra和IL10Rb VHH sdAb可被人源化。为了证明IL10R结合分子的VHH组分的人源化版本的实用性,制备了DR241和DR246的人源化版本,并分别通过表面等离子共振光谱评估了与IL10Ra和IL10Rb的ECD的结合。
当针对目标人源化VHH时,设计人源化VHH的考虑因素是非人框架每个位置的氨基酸分布,这表明氨基酸残基的修饰可能会在蛋白的二级和三级结构中引入实质性修饰。文献表明,经典美洲驼VHH序列VH3-66(INSERT REF/SEQ)的某些构架残基包括位置V37、G44、L45和W47,游标区残基R94和W103也可能是不易修饰的残基。为了鉴定高度保守的骆驼VHH框架区的氨基酸,获得了大约1023个VHH sdAb序列和一个“R脚本”来评估每个位置的氨基酸分布。氨基酸分布图用于识别每个位置的稀有残基。已确定骆驼VHH框架区的某些残基是高度保守的。
基于此信息,确定了最适合的人类种系序列VH3。DR241的序列比对表明与最适合的人类种系序列VH3-23有72%的同一性。IL10Ra VHH DR241的人源化版本(见表19)。人源化DR241构建体显示出相对人88%的同一性。还制备了IL10Rb VHH DR246的人源化版本(表19)。DR241的序列比对表明DR246与最适合的人类种系VH3-23具有73%的同一性。人源化DR246(DR1228)构建体显示出与人类89%的同一性。
下表19提供了本公开的人源化IL10R结合分子的示例。
/>
表30中提供了编码前述人源化sdAb的核酸序列。
在一些实施方式中,本发明提供与表19的任一种IL10Ra和IL10Rb sdAb的序列具有至少90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的sdAb。在一些实施方式中,本发明提供与表19中的任一个sdAb基本同一的sdAb。在一些实施方式中,本发明提供与表19中的任一个sdAb同一的sdAb。
在以下系列实验中,通过用包含编码DR521和DR838的合成核酸序列的载体转染宿主细胞重组表达上述多肽,该合成核酸序列纳入了编码IgH信号肽的5'核酸序列的氨基酸序列。
编码DR1223、DR1224;DR1225、DR1226;DR1227;DR1228;DR1229和DR1230的合成核酸序列在表31中提供,还包含N-末端信号肽和羧基端IgG4铰链(SEQ ID NO:485)和单体Fc结构域(SEQ ID NO:504),制备并克隆到pExSyn中并转染到expi293细胞中。如实施例中更详细提供的,通过SPR(Biacore)评估分子与其各自靶标(IL10Ra或IL10Rb)的结合。评估来自细胞培养的上清液分别与IL10Ra和IL10Rb的ECD的结合。简而言之,将Fc偶联的人源化VHH固定在蛋白A芯片上,相应IL10受体亚基的ECD流动在流动相中。这项研究的结果表明,人源化VHH序列有效地保留了与其各自靶标的结合。前述人源化IL10Ra和IL10Rb VHH可用于构建本公开的人源化二聚IL10R结合分子。
人源化IL10R结合分子:
本公开还提供了包含人源化IL10Ra和/或IL10Rb sdAb的IL10R结合分子。术语“人源化IL10R结合分子”是指包含人源化IL10Ra和/或IL10Rb sdAb的IL10R结合分子。
下表29提供了包含IL10Ra和IL10Rb sdAb的人源化IL10R结合分子的氨基酸序列,并用下划线表示CDR。
/>
/>
/>
/>
/>
在一些实施方式中,本发明提供与表29的任一种IL10R结合分子的序列具有至少90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性的IL10R结合分子。在一些实施方式中,本发明提供与表29的任一种IL10R结合分子基本同一的IL10R结合分子。在一些实施方式中,本发明提供与表29的任一种IL10R结合分子序列同一的IL10R结合分子。
对结合分子和sdAb组分的修饰
螯合肽
在一个实施方式中,本公开提供了一种IL10Rb1结合分子,其包含一种或多种称为螯合肽的过渡金属螯合多肽序列。螯合肽是下式的多肽:
(His)a-(AA)b-(His)c
其中“His”是氨基酸组氨酸;“AA”是脯氨酸以外的氨基酸;是组氨酸残基=0至10的整数;b=0到4之间的整数;c=0–10之间的整数;及其无规、嵌段和交替共聚物。在一些实施方式中,螯合肽具有选自以下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:507-521。纳入这种过渡金属螯合结构域促进纯化固定化金属亲和层析(IMAC),如Smith等1986年2月11日授权的美国专利第4,569,794号所述。在本IL12RB1结合分子的实践中有用的过渡金属螯合多肽的示例描述于Smith等(同上)以及Dobeli等的1995年5月10日授权的美国专利第5,320,663号,其中的全部教导通过引用纳入此处。在本IL12RB1结合分子的实践中有用的具体过渡金属螯合多肽是包含3-6个连续的组氨酸残基的多肽,例如6-组氨酸肽(His)6肽,在本领域经常被称为“His-标签”。除了为重组蛋白提供纯化“柄”或促进SPR传感器芯片上的固定化,这种hIL12RB1结合分子与螯合肽的偶联还有助于将过渡金属离子作为动力学惰性或动力学不稳定复合物靶向递送至表达IL12RB1的细胞,基本上根据Anderson等的教导(1995年8月8日授权的美国专利号5,439,829和Hale,J.E(1996)Analytical Biochemistry 231(1):46-49。关于“动力学惰性复合物”,术语“惰性”是指特定复合离子参与导致其配位球中的一个或多个配体被其他配体取代的反应的能力的不稳定性程度。在水性环境中,过渡金属未占据的配位位置被水分子占据。这些水分子必须被螯合肽或有机螯合剂置换以形成[过渡金属:螯合肽]复合物。当此类反应迅速发生时,该反应被称为“不稳定”。然而,在这种反应发生得非常缓慢的地方,复合物被认为是动力学“惰性”的。动力学不稳定性或惰性与反应速率有关,不应与热力学稳定性或不稳定性相混淆。Cotton和Wilkinson说明了这种区别:
[惰性相比稳定]的区别的一个简单示例由[Co(NH3)6]3+离子提供,尽管它在热力学上不稳定,但由于其动力学惰性或缺乏不稳定性,它会在酸性介质中持续数天,如以下平衡常数所示:
[Co(NH3)6]3++6H3O+=[Co(H2O)6]3++6NH4 + K=1025
相比之下,[Ni(CN)4]2-的稳定性极高:
[Ni(CN)4]2-=Ni2++4CN- K=10-22
但是CN-离子与添加到溶液中的同位素标记的氰化物离子的交换速率用普通技术无法测量。
《高等无机化学》(Advanced Inorganic Chemistry),Cotton,F.A.和Wilkinson,G.(1972)第3版,跨科学出版社(Interscience Publishers),第652页。在一些实施方式中,过渡金属离子是报告分子,例如荧光化合物或放射性试剂,包括放射成像剂或治疗剂。
在一些实施方式中,螯合肽是表21中提供的螯合肽。
N-连接的糖基化位点的消除
在一些实施方式中,IL10Ra或IL10Rb sdAb的氨基酸序列(特别是CDR序列)可能包含糖基化基序,特别是序列Asn-X-Ser(N-X-S)或Asn-X-Thr(N-X-T)的N-连接糖基化基序,其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。在这种情况下,期望通过修改N-连接的糖基化基序的序列以防止糖基化来消除这种N-连接的糖化基序。在一些实施方式中,Asn-X-Ser(N-X-S)N-连接的糖基化基序的消除可以通过在Asn-X-Ser(N-X-S)N-连接的糖基化基序的Asn(N)残基和/或Ser(S)残基掺入保守氨基酸取代来实现。在一些实施方式中,Asn-X-Thr(N-X-T)N-连接的糖基化基序的消除可以通过在Asn-X-Thr(N-X-T)N-连接的糖基化基序的Asn(N)残基和/或Thr(T)残基掺入保守氨基酸取代来实现。在一些实施方式中,当包含IL10Ra或IL10Rb sdAb的IL10R结合分子在原核宿主细胞中表达时,不需要消除糖基化位点。由于原核细胞不提供重组蛋白糖基化的机制,当使用原核表达系统产生包含IL10Ra或IL10RbsdAb的重组IL10R结合分子时,可以避免对序列进行修饰以消除N-连接的糖基化位点。
与运载体分子结合以增加作用持续时间
本文所述的IL10R结合分子可以被修饰以提供延长体内寿命和/或在对象中提供延长的作用持续时间。在一些实施方式中,结合分子可偶联至运载体分子以提供所需的药理学特性,例如延长的半衰期。在一些实施方式中,结合分子可以共价地连接至IgG的Fc结构域、白蛋白或其他分子以延长其半衰期,例如,通过本领域已知的聚乙二醇化、糖基化等。在一些实施方式中,经修饰以在哺乳动物对象中提供延长的作用持续时间的IL10R结合分子在哺乳动物中具有大于4小时、或大于5小时、或大于6小时、或大于7小时、或大于8小时、或大于9小时、或大于10小时、或大于12小时、或大于18小时、或大于24小时、或大于2天、或大于3天、或大于4天、或大于5天、或大于6天、或大于7天、或大于10天、或大于14天、或大于21天、或大于30天的半衰期。
修饰IL10R结合分子以在哺乳动物对象中提供延长的作用持续时间包括(但不限于);
·将IL10R结合分子与一种或多种运载体分子偶联,
·将IL10R结合分子与蛋白质运载体分子偶联,任选地以具有附加多肽序列的融合蛋白的形式(例如,IL10R结合分子-Fc融合体)和
·与聚合物偶联(例如水溶性聚合物以提供PEG化的IL10R结合分子)。
应当注意,对于给定的IL10R结合分子,可以采用多于一种类型的修饰以在哺乳动物对象中提供延长的作用持续时间。例如,本公开的IL10R结合分子可包含提供延长作用持续时间的氨基酸取代以及与运载体分子(例如聚乙二醇(PEG)分子)的偶联。
蛋白质运载体分子:
可以共价连接到IL10R结合分子以提供延长的体内作用持续时间的蛋白质运载体分子的示例包括但不限于白蛋白、抗体和抗体片段,例如IgG分子的Fc结构域。
Fc融合体:
在一些实施方式中,IL10R结合分子偶联至Fc融合体嵌合多肽分子的功能域。Fc融合体偶联物已被证明可以增加生物药物的全身半衰期,因此,生物药物产品可以不需要频繁给药。Fc结合至衬垫在血管的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn),结合后,Fc融合分子被保护,不被降解并重新释放到循环中,使分子在循环中保持更长的时间。这种Fc结合被认为是内源性IgG保持其长血浆半衰期的机制。最近的Fc融合体技术将一份生物药物的单拷贝连接至抗体的Fc区,与传统的Fc融合体偶联物相比,优化了生物药物的药代动力学和药效动力学特性。用于制备Fc融合体的"Fc区"可以是天然存在或合成的多肽,其与用木瓜蛋白酶消化IgG产生的IgG C-末端结构域同源。IgG Fc的分子量约为50kDa。本文所述的结合分子可以偶联至整个Fc区,或保留延长其作为嵌合多肽的部分的循环半衰期能力的较小部分。此外,全长或片段的Fc区可以是野生型分子的变体。在一个典型的呈现中,二聚体Fc的每个单体可携带异源多肽,异源多肽是相同或不同的。
附图的图1-4示意性地提供了可用于本公开的IL10R结合分子的Fc形式的说明性示例。
结合分子与Fc单体的连接
如上所述,IL10R结合分子与Fc亚基的连接可以在IL10R结合分子与Fc亚基之间纳入如下所述的接头分子。在一些实施方式中,IL10R结合分子表达为融合蛋白,其Fc结构域掺入了IgG抗体铰链区的氨基酸序列。根据前述工程改造的Fc结构域可以源于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4哺乳动物IgG种类。在一些实施方式中,Fc结构域可源自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4 IgG种类。在一些实施方式中,铰链区是IgGl的铰链区。在一个特定的实施方式中,IL10R结合分子使用人IgG1铰链结构域与Fc结构域连接。
杵臼Fc形式
在一些实施方式中,二聚体Fc分子可以被工程改造为具有“杵臼(knob-into-hole)修饰”。
白蛋白运载体分子
在一些实施方式中,IL10R结合分子偶联至白蛋白分子(例如,人血清白蛋白),其在本领域是已知的,以促进体内延长暴露。在本发明的一个实施方式中,IL10R结合分子通过化学连接与白蛋白偶联或表达为与白蛋白分子的融合蛋白,在本文中称为“IL10R结合分子白蛋白融合体”。αβhIL2突变蛋白白蛋白融合体的上下文中使用术语“白蛋白”时,包含白蛋白,例如人血清白蛋白(HSA)、食蟹猴血清白蛋白(cyno serum albumin)和牛血清白蛋白(BSA)。在一些实施方式中,相对于野生型HSA序列,该HSA包含C34S或K573P氨基酸取代。根据本发明,白蛋白可以被偶联至IL10R结合分子,在羧基末端、氨基末端、羧基及氨基末端和内部(参见,例如,US 5,876,969和US 7,056,701)。在本发明所预期的HAS IL10R结合分子中,可以使用多种形式的白蛋白,例如白蛋白分泌前序列(albumin secretion pre-sequence)及其变体、其片段和变体和HSA变体。这种形式通常具有一种或多种所需的白蛋白活性。在其他实施方式中,本发明涉及包含IL10R结合分子直接或间接融合至白蛋白、白蛋白片段和白蛋白变体等的融合蛋白,其中融合蛋白比未融合的药物分子具有更高的血浆稳定性和/或融合蛋白保留了未融合药物分子的治疗活性。作为IL10R结合分子和白蛋白分子之间化学连接的替代方案,IL10R结合分子-白蛋白复合物可以作为融合蛋白提供,其包含白蛋白多肽序列和IL10R结合分子,在宿主细胞中重组表达为单条多肽链,任选地包含白蛋白和IL10R结合分子之间的接头分子。对于本领域的普通技术人员而言,此类融合蛋白可以通过重组技术容易地制备。编码此类融合蛋白的核酸序列可从多种商业来源中的任一种订购。将编码融合蛋白的核酸序列纳入与一个或多个表达控制元件可操作连接的表达载体中,将载体引入合适的宿主细胞中,并通过本领域熟知的技术从宿主细胞培养中分离融合蛋白。
聚合物载体
在一些实施方式中,IL10R结合分子延长的体内作用持续时间可通过偶联至一种或多种聚合物运载体分子(例如XTEN聚合物或水溶性聚合物)来实现。
XTEN偶联物
IL10R结合分子还可包含XTEN聚合物。XTEN聚合物与αβhIL2突变蛋白偶联(通过化学方式或以融合蛋白形式)提供了延伸的类似于PEG化的延长的持续时间,可在大肠杆菌中以重组融合蛋白形式生产。适合与本发明的IL10R结合分子偶联的XTEN聚合物提供于Podust,等(2016)“通过XTEN蛋白聚合物延长生物活性分子的体内半衰期(Extension ofin vivo half-life of biologically active molecules by XTEN proteinpolymers)”,J Controlled Release 240:52-66和Haeckel等(2016)“XTEN作为PEG化的生物学替代方案,允许完全表达基于蛋白酶可激活的杀伤性细胞抑制剂(XTEN asBiological Alternative to PEGylation Allows Complete Expression of aProtease-Activatable Killin-Based Cytostatic)”PLOS ONE|DOI:10.1371/journal.pone.0157193,2016年6月13日。XTEN聚合物融合蛋白可以在XTEN多肽和hIL2突变蛋白之间纳入蛋白酶敏感裂解位点,例如MMP-2裂解位点。
水溶性聚合物
在一些实施方式中,IL10R结合分子偶联至一个或多个水溶性聚合物。在本公开实践中有用的水溶性聚合物的示例包括聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、多糖(聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(氧乙基化多元醇)、聚烯烃醇(polyolefinic alcohol))、多糖)、聚-α-羟基酸、聚乙烯醇(PVA)、聚磷腈、聚噁唑啉(polyoxazoline)(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉),或其组合。
在一些实施方式中,IL10R结合分子可以偶联至一个或多个聚乙二醇分子或“聚乙二醇化/PEG化”。尽管PEG附接至结合分子的方法或位点可能不同,在某些实施方式中聚乙二醇化不改变或仅在最小程度上改变结合分子的活性。
适合偶联至多肽序列的PEG通常在室温溶于水,并且具有通式
R(O-CH2-CH2)nO-R,
其中R是氢或保护基团,例如烷基或烷醇基,其中n是1-1000的整数。当R是保护基团时,其通常具有1-8个碳。PEG可以是直链或支链的。本发明考虑了支化PEG衍生物,“星形-PEG(star-PEG)”和多臂PEG。
在一些情况下,表9和10中提供的本公开的IL10R结合分子的序列具有N-末端谷氨酰胺(“1Q”)残基。已观察到N-末端谷氨酰胺残基在生理条件下或接近生理条件下自发环化形成焦谷氨酸(pE)。(参见例如,Liu,等(2011)J.Biol.Chem.286(13):11211–11217)。在一些实施方式中,焦谷氨酸的形成使N-末端PEG偶联复杂化,特别是当醛化学用于N-末端PEG化时。因此,当PEG化本发明的IL10R结合分子时,特别是当使用醛化学时,在1位(例如,1Q)具有氨基酸的IL10R结合分子在1位被替代性氨基酸取代或在1位缺失(例如,des-1Q)。在一些实施方式中,本公开的IL10R结合分子包含选自Q1E和Q1D组的氨基酸取代。
在一些实施方式中,可以采用IL10R结合分子的选择性PEG化,例如,通过纳入带有侧链的非天然氨基酸以促进选择性的PEG偶联。可以选择特定的PEG化位点,使得结合分子的PEG化不影响其与靶受体的结合。
在某些实施方式中,半衰期的增加大于生物学活性的任何减少。适合偶联至多肽序列的PEG通常在室温溶于水,并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R,其中R是氢或保护基团,例如烷基或烷醇基,其中n是1-1000的整数。当R是保护基团时,其通常具有1-8个碳。偶联至多肽序列的PEG可以是直链的或支链的。本发明考虑了支化PEG衍生物,“星形-PEG(star-PEG)”和多臂PEG。
本发明中使用的PEG的分子量不限于任何特定范围。结合分子的PEG组分可以具有大于约5kDa、大于约10kDa、大于约15kDa、大于约20kDa、大于约30kDa、大于约40kDa、或大于约50kDa的分子量。在一些实施方式中,分子量为约5kDa至约10kDa,约5kDa至约15kDa,约5kDa至约20kDa,约10kDa至约15kDa,约10kDa至约20kDa,约10kDa至约25kDa或约10kDa至约30kDa。直链或支链PEG分子的分子量从约2,000至约80,000道尔顿,或者约2,000至约70,000道尔顿,或者约5,000至约50,000道尔顿,或者约10,000至约50,000道尔顿,或者约20,000至约50,000道尔顿,或者约30,000至约50,000道尔顿,或者约20,000至约40,000道尔顿,或者约30,000至约40,000道尔顿。在本公开的一个实施方式中,PEG为包含两个20kD臂的40kD支链PEG。
本发明还考虑了偶联物的组合物,其中PEG具有不同的n值,因此在特定的比率下存在多种不同的PEG。例如,一些组合物包含偶联物的混合物,其中n=1、2、3和4。在一些组合物中,n=1的偶联物的百分比为18-25%,n=2的偶联物的百分比为50-66%,n=3的偶联物的百分比为12-16%,n=4的偶联物的百分比多达5%。这种组合物可以通过本领域已知的反应条件和纯化方法生产。层析可用于分辨偶联物的馏分,然后鉴定包含具有例如附接所需数量的PEG的偶联物的馏分,从未修饰的蛋白质序列和具有附接其他数量PEG的偶联物中纯化出来。
适合偶联至多肽序列的PEG通常在室温溶于水,并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R,其中R是氢或保护基团,例如烷基或烷醇基,其中n是1-1000的整数。当R是保护基团时,其通常具有1-8个碳。
两种广泛使用的第一代激活的单甲氧基PEG(mPEG)是琥珀酰亚胺基碳酸酯PEG(SC-PEG;参见,例如,Zalipsky,等(1992)Biotehnol.Appl.Biochem 15:100-114)和苯并三唑甲酯PEG(BTC-PEG;参见,例如Dolence,等美国专利号5,650,234),其优选与赖氨酸残基反应以形成氨基甲酸酯连接,但也已知与组氨酸和酪氨酸残基反应。使用PEG-醛接头通过还原性胺化靶向多肽的N-末端单个位点。
聚乙二醇化化经常发生在多肽N-末端的α-氨基基团,赖氨酸残基侧链上的ε氨基基团和组氨酸残基侧链上的咪唑基团。由于大多数重组多肽具有单个α基团和若干ε基团和咪唑基团,根据接头的化学性质,可以产生许多位置异构体。本领域中已知的一般PEG化策略可本文中应用。
PEG可以通过末端反应性基团(“间隔子")结合至本发明的结合分子,该基团在一个或多个多肽序列的游离氨基或羧基与聚乙二醇之间介导结合。具有可结合至游离氨基基团的间隔子的PEG包括N-羟基琥珀酰亚胺聚乙二醇,它可以通过用N-羟基琥珀酰亚胺激活聚乙二醇的琥珀酸酯来制备。
在一些实施方式中,通过纳入带有独特侧链的非天然氨基酸以促进特定位点的PEG化来促进结合分子的PEG化。将非天然氨基酸纳入多肽以提供功能部分以实现此类多肽的位点特异性PEG化是本领域中已知的。参见,例如Ptacin,等,(PCT国际申请号PCT/US2018/045257,2018年8月3日提交并公开于2019年2月7日,国际公开号WO 2019/028419Al。
偶联至多肽序列的PEG可以是直链的或支链的。本发明考虑了支化PEG衍生物,“星形-PEG(star-PEG)”和多臂PEG。本公开的实践中有用的具体实施方式PEG包括10kDa直链PEG-醛(例如,ME-100AL、NOF美国公司(NOF America Corporation),北百老汇(One North Broadway),纽约州白原市(White Plains,NY)10601USA)、10kDa直链PEG-NHS酯(例如,/>ME-100CS,/>ME-100AS,/>ME-100GS,/>ME-100HS,NOF)、20kDa直链PEG-醛(例如/>ME-200AL,NOF、20kDa直链PEG-NHS酯(例如,/>ME-200CS,/>ME-200AS,/>ME-200GS,/>ME-200HS,NOF)、20kDa 2-臂支链PEG-醛,该20kDA PEG-醛,其包含两个10kDA直链PEG分子(例如,/>GL2-200AL3,NOF)、20kDa 2-臂支链PEG-NHS酯,该20kDA PEG-NHS酯,其包含两个10kDA直链PEG分子(例如,/>GL2-200TS,/>GL200GS2,NOF)、40kDa 2-臂支链PEG-醛,该40kDA PEG-醛,其包含两个20kDA直链PEG分子(例如,/>GL2-400AL3)、40kDa 2-臂支链PEG-NHS酯,该40kDA PEG-NHS酯,其包含两个20kDA直链PEG分子(例如,/>GL2-400AL3,/>GL2-400GS2,NOF)、直链30kDa PEG-醛(例如,/>ME-300AL)和直链30kDa PEG-NHS酯。
在一些实施方式中,接头可用于接合IL10R结合分子和PEG分子。合适的接头包括“柔性接头”,其长度通常足以允许修饰的多肽序列与连接的组分和分子之间有一些移动。接头分子通常约6-50个原子长。接头分子也可以是,例如,芳基乙炔、含有2-10个单体单元的乙二醇寡聚物、二胺、二酸、氨基酸或其组合。合适的接头可以容易地选择,可以是任何合适的长度,例如1个氨基酸(如Gly)、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30、30-50或超过50个氨基酸。柔性接头的实例在第IV节中说明。此外,这些接头序列的多聚体(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30或30-50)可以连接在一起,以提供柔性接头,其可用于偶联两个分子。另选多肽接头,所述接头可以是化学接头,例如,PEG-醛接头。在一些实施方式中,结合分子在N-末端通过与N-末端乙酰转移酶和,例如,乙酰CoA的酶促反应被乙酰化。替代或除了N-末端乙酰化之外,结合分子可以在一个或多个赖氨酸残基处乙酰化,例如通过与赖氨酸乙酰转移酶的酶促反应。参见,例如,Choudhary等(2009)Science 325(5942):834-840。
在一些实施方式中,本发明提供PEG化的式#1的IL10R结合分子,其中PEG偶联至IL10R结合分子,并且PEG是直链或支链PEG分子,其具有约2,000至约80,000道尔顿、或约2,000至约70,000道尔顿、或约5,000至约50,000道尔顿、或约10,000至约50,000道尔顿、或约20,000至约50,000道尔顿、或约30,000至约50,000道尔顿、或20,000至约40,000道尔顿或约30,000至约40,000道尔顿分子量。在本公开的一个实施方式中,PEG为包含两个20kD臂的40kD支链PEG。
脂肪酸运载体
在一些实施方式中,如Resh(2016)Progress in Lipid Research 63:120–131中所述,通过将IL10R结合分子共价连接至脂肪酸分子,实现IL10R结合分子在哺乳动物对象中具有延长的作用持续时间并可用于本公开的实践。可被偶联的脂肪酸的示例包括肉豆蔻酸、棕榈酸和棕榈油酸。肉豆蔻酸通常被连接至N-末端甘氨酸,但赖氨酸也可以被肉豆蔻酰化。棕榈酰化通常通过对游离的半胱氨酸-SH基团的酶促修饰来实现,例如DHHC蛋白催化S-棕榈酰化。丝氨酸和苏氨酸残基的棕榈酰化通常通过使用PORCN酶酶促实现。在一些实施方式中,IL10R结合分子在N-末端通过与N-末端乙酰转移酶和,例如,乙酰CoA的酶促反应被乙酰化。替代或除了N-末端乙酰化之外,IL10R结合分子在一个或多个赖氨酸残基处乙酰化,例如通过与赖氨酸乙酰转移酶的酶促反应。参见,例如,Choudhary等(2009)Science 325(5942):834L2 ortho840。
提供附加功能的修饰
在一些实施方式中,IL10R结合分子可以包含嵌合多肽的功能域。本发明的IL10R结合分子融合蛋白可以通过本领域已知的技术通过重组DNA方法容易地生产,通过构建重组载体,该载体包含核酸序列,该核酸序列包括在框内的编码IL10R结合分子的核酸序列与编码IL10R结合分子的N-末端或C-末端融合伴侣的核酸序列,该序列可任选地进一步包括在框内的编码接头或间隔子多肽的核酸序列。
FLAG标签
在其他的实施方式中,IL10R结合分子可以被修饰为包括功能为抗原标签的其他多肽序列,例如FLAG序列。如本文所述,FLAG序列可被生物素化、高特异性的抗-FLAG抗体识别(参见例如,Blanar等(1992)Science 256:1014和LeClair,等(1992)PNAS-USA 89:8145)。在一些实施方式中,结合分子进一步包括C-末端的c-myc表位标签。
靶向部分:
在一些实施方式中,IL10R结合分子与分子偶联,该分子提供(“靶向结构域”)以促进对特定细胞类型或组织的选择性结合,所述特定细胞类型或组织表达特异性结合此类靶向结构域的细胞表面分子的组织,任选地在IL10R结合分子序列和融合蛋白的靶向结构域序列之间纳入1-40(或2-20、或5-20、或10-20)个氨基酸的接头分子。
在其他实施方式中,可以产生包含IL10R结合分子和其抗体或其抗原结合部分的嵌合多肽。嵌合蛋白的抗体或抗原结合组分可以作为靶向部分。例如,它可以用来将嵌合蛋白定位到特定的细胞亚群或靶分子。产生细胞因子-抗体嵌合多肽的方法描述于,例如,美国专利号6,617,135。
在一些实施方式中,靶向部分是一种抗体,其特异性结合至与肿瘤细胞相关的至少一种细胞表面分子(即至少一种肿瘤抗原),其中与肿瘤细胞相关的细胞表面分子选自下组:GD2、BCMA、CD19、CD33、CD38、CD70、GD2、IL3R2、CD19、间皮素、Her2、EpCam、Muc1、ROR1、CD133、CEA、EGRFRVIII、PSCA、GPC3、泛-ErbB和FAP。
重组生产
或者,通过重组DNA技术生产本发明的IL10R结合分子。在多肽的重组生产的典型实践中,编码所需多肽的核酸序列被纳入适合用于将要完成表达的宿主细胞的表达载体中,核酸序列被操作性地连接至该载体编码的一个或多个表达控制序列,并在目标宿主细胞中发挥功能。如果在多肽中纳入分泌前导序列(信号肽),重组蛋白可以通过破坏宿主细胞或从细胞介质中回收。
编码IL10R结合分子的核酸序列
在一些实施方式中,通过重组方法使用编码IL10R结合分子(或包含IL10R结合分子的融合蛋白)的核酸序列生产IL10R结合分子。编码所需αβhIL10R结合分子的核酸序列可以使用寡核苷酸合成仪通过化学方式合成。
核酸序列不限于编码多肽的序列;也可以包括位于编码序列(例如,IL-2的编码序列)的上游或下游的部分或全部非编码序列。分子生物学的本领域技术人员熟知用于分离核酸分子的常规操作。例如,他们可以用限制性核酸内切酶处理基因组DNA或通过进行聚合酶链式反应(PCR)产生。如果核酸分子是核糖核酸(RNA),分子可以,例如,通过体外转录产生。
编码IL10R结合分子的核酸分子(及其融合体)可以包含天然存在的序列或不同于天然存在序列的序列,但由于遗传密码的简并性,其编码相同的多肽。这些核酸分子可以由以下组成:RNA或DNA(例如基因组DNA、cDNA或合成DNA,例如通过基于亚磷酰胺的合成(phosphoramidite-based synthesis)产生的)或这些类型核酸内核苷酸的组合或修饰。此外,核酸分子可以是双链的或单链的(即正义链或反义链)。
编码IL10R结合分子的核酸序列可以获取自提供定制核酸序列的多种商业来源。本发明的IL10R结合分子的氨基酸序列变体是基于本领域众所周知的遗传密码将合适的核苷酸变化纳入编码序列来制备的。这种变体表示所指出的残基的插入、取代和/或特异性缺失。插入、取代和/或特异性缺失的任何组合都可以得到最终的构建体,只要最终的构建体拥有本文定义的所需生物活性。
构建编码IL10R结合分子的DNA序列和在合适的转化的宿主中表达这些序列的方法包括但不限于使用PCR-辅助诱变技术。也可以用标准重组技术向IL10Rb结合分子制造由氨基酸残基缺失或添加组成的突变。如果缺失或添加,编码IL10R结合分子的核酸分子任选地用合适的限制性核酸内切酶消化。所得片段可以直接表达,或通过,例如,连接至第二片段来进一步操作。如果核酸分子的两个末端包含相互重叠的互补核苷酸,则可以促进连接,但也可以连接平末端片段。PCR产生的核酸也可以用于产生多种突变序列。
本发明的IL10Rb结合分子不仅可以直接重组生产,而且可以与异源多肽(例如信号序列或其他N-末端或C-末端具有在成熟IL10Rb结合分子的特定裂解位点的多肽)的融合多肽形式生产。通常,信号序列可以是载体的组分,也可以是插入到载体中的编码序列的部分。所选择的异源信号序列优选是被宿主细胞识别和处理(即被信号肽酶切割)的序列。信号序列的包含取决于其是否需要从制备的重组细胞分泌IL10R结合分子。如果所选细胞是原核细胞,通常优选DNA序列不编码信号序列。当重组宿主细胞是酵母细胞,例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)时,可以使用α交配因子分泌信号序列(alpha matingfactor secretion signal sequence)以实现IL10R结合分子的胞外分泌,进入培养基,如描述于Singh,授权于2007年4月3日的美国专利号7,198,919B1。
如果要表达的IL10R结合分子待以嵌合体(chimera)形式表达(例如包含IL10R结合分子和异源多肽序列的融合蛋白),则嵌合蛋白可以由杂交核酸分子编码,其包含编码所有或部分IL10R结合分子的第一序列和编码所有或部分异源多肽的第二序列。例如,本文所述的主体IL10R结合分子可融合至六-组氨酸/八-组氨酸标签以促进细菌表达的蛋白的纯化,或融合至血凝素标签,以促进真核细胞中表达的蛋白的纯化。述及第一和第二,不应理解为限制融合蛋白的元件取向,异源多肽可以被连接至IL10R结合分子的N-末端和/或C-末端。例如,N-末端可以被连接至靶向部分,C-末端连接至六-组氨酸标签纯化柄。
要表达的多肽(或融合体/嵌合体)的完整氨基酸序列可以被用于构建回译基因(back-translated gene)。可以合成含有编码IL10R结合分子的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如,可以合成编码部分所需多肽的一些小寡核苷酸,然后连接。单个的寡核苷酸通常包含5’或3’突出端用于互补组装。
密码子优化:
在一些实施方式中,编码IL10R结合分子的核酸序列可以是“密码子优化”的以促进在特定宿主细胞类型中的表达。在多种表达系统,包括哺乳动物、酵母和细菌宿主细胞中密码子优化的技术是本领域众所周知的,且有在线工具以提供用于在多种宿主细胞类型中表达的密码子优化的序列。参见例如,Hawash,等(2017)9:46-53和Mauro和Chappell在《哺 乳动物细胞中重组蛋白表达:方法和方案》(Recombinant Protein Expression in Mammalian Cells:Methods and Protocols),David Hacker编(胡马纳出版社(HumanPress)纽约)。此外,有多种基于网络的在线软件可以免费使用,以协助制备密码子优化的核酸序列。
表达载体:
组装(通过合成、定点诱变或另一方式)后,编码IL10Rb结合分子的核酸序列将被插入表达载体。可以使用用于多种宿主细胞中的多种表达载体,通常是基于用于表达的宿主细胞选择。表达载体通常包含但不限于以下一个或多个:复制起点,一个或多个标志物基因,增强子元件、启动子和转录终止序列。载体包括病毒载体、质粒载体、整合载体等。质粒是非病毒载体的示例。
为了促进重组多肽的高效表达,要表达的编码多肽序列的核酸序列被操作性地连接至在所选的表达宿主中发挥功能的转录和翻译调控序列。
选择性标志物:
表达载体通常包含选择基因,也被称为选择性标志物。该基因编码转化的宿主细胞在选择性培养基中生长的存活或生长所必需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞无法在培养基中存活。典型的选择基因编码蛋白质,其将(a)赋予对抗生素或其他毒素例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素的抗性;(b)弥补营养缺陷型缺陷;或(c)提供无法从复合培养基中获得的关键营养素。
调控序列:
用于本发明的IL10R结合分子的表达载体包含调节序列,其被宿主生物体识别且操作性地连接至编码IL10R结合分子的核酸序列。术语“调控序列”、“调节序列”或“表达控制序列”在本文中可互换使用,指启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。参见,例如Goeddel(1990)于《基因表达技术:酶学方法》(Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology)185(学术出版社(Academic Press),美国加利福尼亚州圣地亚哥。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中引导组成型表达的核苷酸序列,和仅在某些宿主细胞中引导表达的核苷酸序列(例如,组织特异性调节序列)。本领域技术人员将理解,表达载体的设计可能取决于例如要转化的宿主细胞的选择,所需蛋白质的表达水平等因素。在表达控制序列的选择中,本领域技术人员理解将要考虑多种因素。这些包括,例如,序列的相对强度、它的可控性,以及它与编码主体IL10R结合分子的实际DNA序列的相容性,特别是关于潜在的二级结构。
启动子:
在一些实施方式中,调节序列是启动子,其选择基于,例如,寻求在其中表达的细胞类型。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5')的非翻译序列(通常在约100到1000bp内),其控制与其操作性地连接的特定核酸序列的转录和翻译。这种启动子通常分为两类,诱导型的和组成型的。诱导型启动子是对培养条件的某些变化(如营养物的存在或不存在或温度的变化)反应,从其控制下的DNA启动增加转录水平的启动子。多种潜在的宿主细胞所识别的大量启动子是众所周知的。
在细菌中可以使用T7启动子,在昆虫细胞中可以使用多角体蛋白启动子,在哺乳动物细胞中可以使用巨细胞病毒或金属硫蛋白(metallothionein)启动子。另外,在高等的真核细胞的情况下广泛使用组织特异性和细胞特异性启动子。这些启动子以其在给定的体内组织或细胞类型中核酸分子的指导表达的能力而命名。技术人员知晓许多可用于核酸的指导表达的启动子和其他调节元件。
哺乳动物宿主细胞中载体的转录可以被控制,由,例如,从病毒基因组中获得的启动子,例如多瘤病毒、牛痘病毒、腺病毒(如人腺病毒血清型5)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒(如鼠干细胞病毒)、乙肝病毒和最理想的猿猴病毒40(SV40),来自异源哺乳动物的启动子,例如,肌动蛋白启动子、PGK(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白启动子,来自热休克启动子,只要这些启动子与宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地以SV40限制性片段形式获得,该片段也含有SV40病毒的复制起点。
增强子:
高等真核生物的转录通常通过在载体中插入增强子序列来增加。增强子是DNA的顺式作用元件,通常约为10至300bp,它作用于启动子以增加其转录。增强子的取向和位置相对独立,在转录单元的5'和3'处、内含子内以及编码序列本身内都有发现。现在已经从哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)中得知了许多增强子序列。然而,通常人们会使用来自真核细胞病毒的增强子。示例包括复制起点后侧的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以被剪接到表达载体中编码序列的5'或3'的位置,但优选是位于离启动子5'的位置。用于真核宿主细胞的表达载体还将包含用于终止转录和用于稳定化mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核生物或病毒DNA或cDNA的5',偶尔3'非翻译区获得。含有一个或多个上述组分的合适载体的构建采用了标准技术。
除了促进插入核酸分子的转录的序列之外,载体可以包含复制起点和其他编码选择性标志物的基因。例如,新霉素-抗性(neoR)基因赋予其表达细胞G418抗性,因而允许对转染的细胞进行表型选择。标志物或报告基因的其他例子包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、lacZ(编码β-半乳糖苷酶)和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。本领域技术人员可以容易地确定给定的调节元件或选择性标志物适合或不适合用于特定表达环境。
表达载体的正确组装可以通过核酸测序、限制性图谱和在合适宿主中生物活性多肽的表达来确认。
宿主细胞:
本发明进一步提供原核或真核细胞,其包含和表达编码IL10R结合分子的核酸分子。本发明的细胞是转染的细胞,即核酸分子进入的细胞,例如已经通过重组DNA技术引入编码突变IL-2多肽的核酸分子的。这种细胞的子代也被认为在本发明的范围内。
通常根据它们与所选表达载体的相容性、本发明DNA序列编码的产物的毒性、它们的分泌特性、它们正确折叠多肽的能力、它们的发酵或培养要求、以及DNA序列编码的产物的纯化难易程度来选择宿主细胞。用于克隆或表达本文载体中DNA的合适宿主细胞是上述的原核细胞、酵母或高等真核细胞。
在一些实施方式中,重组IL10R结合分子也可以在真核生物(例如酵母或人细胞)中制备。合适的真核宿主细胞包括昆虫细胞(例如在培养的昆虫细胞中可用于蛋白表达的杆状病毒载体(例如Sf9细胞)包括pAc系列(Smith等(1983)Mol.Cell Biol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170:31-39));酵母细胞(例如用于在酵母啤酒酵母(S.cerenvisiae)(包括pYepSecl)中表达的载体(Baldari等(1987)EMBO J.6:229-234),pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell30:933-943),pJRY88(Schultz等(1987)Gene 54:113-123),pYES2(英杰公司(Invitrogen Corporation),加利福尼亚州圣地亚哥)和pPicZ(英杰公司,加利福尼亚州圣地亚哥));或哺乳动物细胞(哺乳动物表达载体包括pCDM8(Seed(1987)Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBO J.6:187:195))。
有用的哺乳动物宿主细胞系的例子为,小鼠L细胞(L-M[TK-],ATCC号CRL-2648)、由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7,ATCC CRL 1651);人胚胎肾细胞系(HEK293或HEK293细胞亚克隆,在悬浮培养中生长;幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO);小鼠塞尔托利氏细胞(TM4);猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1 587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL 2);犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL34);水牛鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);人肺细胞(W138,ATCC CCL 75);人肝细胞(Hep G2,HB 8065);小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCC CCL51);TRI细胞;MRC 5细胞;FS4细胞;和人肝癌细胞系(Hep G2)。在哺乳动物细胞中,表达载体的控制功能通常通过病毒调控元件提供。例如,常用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2型、巨细胞病毒和猿猴病毒40。
IL10R结合分子可以在原核宿主中,例如细菌大肠杆菌,或在真核宿主中,例如昆虫细胞(例如Sf21细胞)或哺乳动物细胞(例如COS细胞、NIH 3T3细胞或HeLa细胞)中生产。这些细胞可以从许多来源获得,包括美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马萨纳斯)。在选择表达系统时,最重要的是各组分之间相容。本领域技术人员能够做这种决定。此外,如果在选择表达系统时需要指导,本领域技术人员可以查阅Ausubel等(《新编分子生物学方案》(Current Protocols in Molecular Biology),John Wiley和Sons,纽约州纽约,1993)和Pouwels等(《克隆载体:实验室手册》(Cloning Vectors:A Laboratory Manual),1985增刊1987)。
在一些实施方式中,获得的IL10R结合分子将是糖基化的或未糖基化的,取决于用于生产突变蛋白的宿主生物体。如果选择细菌作为宿主,那么生产的IL10R结合分子将是未糖基化的。另一方面,真核细胞通常会导致IL10R结合分子的糖基化。
在一些实施方式中,可能将被纳入IL10R结合分子中的sdAb的氨基酸序列(特别是CDR序列)可含有糖基化基序,特别是序列Asn-X-Ser的N-连接糖基化基序(N-X-S)或Asn-X-Thr的N-连接糖基化基序(N-X-T),其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸。在这种情况下,期望通过修改N-连接的糖基化基序的序列以防止糖基化来消除这种N-连接的糖化基序。在一些实施方式中,N-连接的糖基化基序通过N-连接的糖基化基序的Asn(N)残基的保守氨基酸取代的纳入而被破坏。
关于用于原核和真核细胞的其他表达系统,参见Sambrook等(1989)《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版,冷泉港实验室出版社,纽约州普莱恩维尤)的第16和17章。参见,Goeddel(1990)于《基因表达技术:酶学方法》(GeneExpression Technology:Methods in Enzymology)185(学术出版社,加利福尼亚州圣地亚哥)。
转染:
可以将表达构建体引入宿主细胞,从而产生本文公开的IL10R结合分子。通过常规转化或转染技术将包含编码IL10R结合分子的核酸序列的表达载体引入原核或真核宿主细胞。关于用于转化或转染宿主细胞的合适的方法可以在Sambrook等(1989)《分子克隆:实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第2版,冷泉港实验室出版社,纽约州普莱恩维尤)中和其他标准分子生物学实验手册中找到。为促进目标细胞的转染,可以在有利于摄取非病毒载体的条件下使目标细胞直接暴露于非病毒载体。促进哺乳动物细胞摄取外源核酸的条件的例子在本领域是众所周知的,包括但不限于化学手段(例如赛默飞世尔科技(Thermo-Fisher Scientific)),高盐和磁场(电穿孔)。
细胞培养:
细胞可以在被改良为适合用于诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养。哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售可得的培养基如汉姆氏F10(Ham's F10)(西格玛(Sigma))、最小必需培养基((MEM),西格玛)、RPMI1640(西格玛)和达氏改良的伊氏培养基((DMEM),西格玛)都适合培养宿主细胞。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素和葡萄糖或等同的能量来源。任何其他必需的补充剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包含在内。培养条件,如温度、pH值等,是以前用于选择表达的宿主细胞的条件,对普通技术人员来说是显而易见的。
重组蛋白回收:
如果使用分泌前导序列,重组生产的IL10R结合分子多肽可以以分泌多肽形式从培养基中回收。或者,IL10R结合分子多肽也可以从宿主细胞裂解物中回收。蛋白酶抑制剂,例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)可以在从细胞裂解物中在回收阶段中使用,以抑制纯化过程中的蛋白酶降解,并可包括抗生素以防止外源污染物的生长。
各种纯化步骤是本领域已知的,并且可以寻用,例如亲和层析。亲和层析利用了通常存在于生物大分子中的高度特异性结合位点,根据分子与特定配体结合的能力将其分离。共价键将配体附接至不溶性的多孔支持介质上,使配体明显地呈现在蛋白质样品上,从而利用一种分子种类的天然特异性结合,从混合物中分离和纯化第二种类。抗体通常用于亲和层析。也可以使用尺寸选择步骤,例如,凝胶过滤层析(也被称为尺寸排阻或分子筛层析)用于根据蛋白质的尺寸进行分离。在凝胶过滤中,蛋白质溶液通过由半透性多孔树脂填充的柱。半透性树脂具有孔径范围,决定了可以用该柱分离的蛋白质的大小。
由转化的宿主重组的IL10R结合分子可以根据任何合适的方法纯化。重组的IL10R结合分子可以从大肠杆菌中产生的包涵体中分离出来,或从生产给定突变蛋白的哺乳动物或酵母培养物的条件培养基中,使用阳离子交换、凝胶过滤和或反相液相色谱分离出来。重组IL10R结合分子的基本纯化形式可以用常规的生化程序从表达系统中纯化出来,并可以如本文所述,例如,作为治疗剂使用。
在一些实施方式中,当IL10R结合分子与如上所述的纯化标签一起表达时,该纯化柄可用于从细胞裂解物或细胞培养基中分离IL10R结合分子。在纯化标签是螯合肽的情况下,使用固定化金属亲和层析分离此类分子的方法是本领域众所周知的。参见,例如,Smith等,美国专利4,569,794。
回收的IL10R结合分子的生物学活性可以通过任何合适的本领域已知方法进行激活试验,并且可以作为基本纯化形式评估,或者当使用分泌前导序列表达时作为细胞裂解物或细胞培养基的部分评估。
药物制剂
在一些实施方式中,可以将主体IL10R结合分子(和/或编码IL10R结合分子的核酸或纳入该核酸序列并修饰以表达IL10R结合分子的重组细胞)纳入组合物中,包括药物组合物。此类组合物通常包括多肽或核酸分子和药学上可接受的运载体。制备相容于其意在给予的途径,且相容于治疗用途的药物组合物,用于向需要治疗或预防的对象给予IL10R结合分子。
运载体:
运载体包括无菌稀释剂,例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂。运载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可以维持合适的流动性,例如通过使用诸如卵磷脂的涂覆材料、分散液情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂,例如十二烷基硫酸钠。对于静脉内给药,合适的运载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(巴斯夫(BASF),新泽西州帕西潘尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
缓冲液:
术语缓冲剂包括缓冲剂,例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐,以及用于调节张性的试剂,例如氯化钠或右旋糖。pH可以用酸或碱调整,例如单-和/或双-碱基磷酸钠、盐酸或氢氧化钠(例如至pH约为7.2-7.8,例如7.5)。
分散体:
通常,将活性化合物纳入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载剂中制备分散液。在制备无菌注射液的无菌粉剂时,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥,由之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。
防腐剂:
用于肠胃外给予对象的药物制剂应当是无菌的并且应当是流动的以促进易注射性。它应当在制造和储存条件下稳定,并且被保存时抵抗污染。防止微生物的作用可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现,例如,例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂,例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂,例如乙二胺四乙酸、对羟基苯甲酸酯类(parabens)、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。可将所需量的活性化合物和一种上述组分或其组合根据需要掺入合适溶剂后过滤灭菌,从而制备无菌溶液。
张力剂:
在许多情况下,组合物中可优选地包含张力剂,例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。
给予途径
在本公开的治疗方法的一些实施方式中,涉及给予有需要的对象包含IL10R结合分子(和/或编码IL10R结合分子的核酸或表达IL10R结合分子的重组修饰的宿主细胞)的药物制剂。包含本发明的IL10R结合分子的药物制剂可以通过多种给药途径给予需要治疗或预防的对象,包括肠胃外给药、口服、局部或吸入途径。
肠胃外给予:
在一些实施方式中,本公开的方法涉及向需要治疗的对象肠胃外给予包含IL10R结合分子(和/或编码IL10R结合分子的核酸或表达IL10R结合分子的重组修饰的宿主细胞)的药物制剂。肠胃外途径的示例包括,例如静脉内、皮内、皮下、透皮(局部)、经粘膜和直肠给药。肠胃外制剂包括用于肠胃外应用的溶液或悬浮液,可以包括载剂和缓冲剂。适于肠胃外给药的药物制剂包括无菌水性溶液(水溶性时)或分散液,以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。肠胃外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。在一个实施方式中,制剂于预先填充的注射器中提供用于
口服给予:
在一些实施方式中,本公开的方法涉及向需要治疗的对象口服给予包含IL10R结合分子(和/或编码IL10R结合分子的核酸或表达IL10R结合分子的重组修饰的宿主细胞)的药物制剂。如果使用口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用运载体。对于口服治疗给药目的,可用赋形剂将活性化合物掺入并以片剂、含片或胶囊的形式使用,例如明胶胶囊。口服组合物也可以使用液体运载体制备以用作漱口水。可以包含药学上相容的结合剂和/或佐剂材料作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊、含片等可含有任何以下成分或具有相似特性的化合物:粘合剂例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶;赋形剂例如淀粉或乳糖,崩解剂例如海藻酸、羧甲基淀粉(PrimogelTM)或玉米淀粉;润滑剂例如硬脂酸镁或完全氢化植物油(SterotesTM);助流剂例如二氧化硅胶体;甜味剂例如蔗糖或糖精;或调味剂例如薄荷、水杨酸甲酯、或橙调味剂。
吸入制剂:
在一些实施方式中,本发明的方法涉及向需要治疗的对象吸入给予包含IL10R结合分子(和/或编码IL10R结合分子的核酸或表达IL10R结合分子的重组修饰的宿主细胞)的药物制剂。在通过吸入给予的情况下,主体IL10R结合分子或编码它的核酸以来自含合适推进剂(例如,如二氧化碳气体)或喷雾剂的受压容器或分配器的气雾剂喷雾形式递送。此类方法包括描述于美国专利号6,468,798中的那些。
粘膜和透皮制剂:
在一些实施方式中,本公开的方法涉及向需要治疗的对象粘膜或透皮给予包含IL10R结合分子(和/或编码IL10R结合分子的核酸或表达IL10R结合分子的重组修饰的宿主细胞\)的药物制剂。对于经粘膜或透皮给药,在制剂中采用适合渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂通常为本领域已知,并包括例如用于经粘膜给药的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药可以通过使用鼻腔喷雾剂或栓剂栓剂(例如使用常规的栓剂基料,如可可油或其它甘油酯)或滞留灌肠剂的形式制备化合物用于直肠递送。对于透皮给药,将活性化合物配制成药膏、软膏、凝胶或霜剂,如本领域通常已知的那样,并可纳入渗透促进剂,如乙醇或羊毛脂。
延长释放和储库制剂:
在本发明的方法的一些实施方式中,IL10R结合分子在提供IL10R结合分子试剂的延长释放的制剂中被给予需要治疗的对象。可注射组合物的延长释放制剂的例子可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现。在一个实施方式中,用运载体制备主体IL10R结合分子或核酸,其将保护该IL10R结合分子不被身体快速清除,如控释制剂,包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物,例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。可以使用标准技术制备这种制剂。所述材料还可购自阿尔扎公司(Alza Corporation)和诺华制药股份有限公司(Nova Pharmaceuticals,Inc.)。脂质体悬浮液(包含用单克隆抗体对病毒抗原靶向感染的细胞的脂质体)还可以用作药学上可接受的运载体。这些可按本领域技术人员已知的方法制备,例如,如美国专利号4,522,811中所述。
编码IL10R结合分子的核酸的给予:
在本公开方法的一些实施方式中,通过给予编码IL10R结合分子的核酸实现向需要治疗的对象的递送IL10R结合分子。将编码IL10R结合分子的核酸给予于对象的方法是使用本领域已知的方法通过转染或感染实现的,包括但不限于描述于McCaffrey等(Nature(2002)418:6893),Xia等(Nature Biotechnol.(2002)20:1006-1010),或Putnam(Am.J.Health Syst.Pharm.(1996)53:151-160erratum于Am.J.Health Syst.Pharm.(1996)53:325)中的方法。在一些实施方式中,通过给予重组表达载体的药学上可接受的制剂向对象给予IL10R结合分子,所述重组表达载体包含编码IL10R结合分子的核酸序列,该核酸序列操作性地连接至一个或多个在哺乳动物对象中操作性的表达控制序列。在一些实施方式中,可以选择在有限范围的细胞类型(或单一细胞类型)中的操作性表达控制序列,以促进IL10R结合分子在特定靶细胞类型中的选择性表达。在一些实施方式中,重组表达载体是病毒载体。在一些实施方式中,重组载体是重组病毒载体。在一些实施方式中重组病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)或重组腺病毒(rAd),特别是源自人腺病毒血清型3和/或5的复制缺陷型腺病毒。在一些实施方式中,复制缺陷型腺病毒具有一个或多个对E1区的修饰,这干扰病毒在人细胞中启动细胞循环和/或凋亡途径的能力。复制缺陷型腺病毒载体可以任选地在E3结构域中包含缺失。在一些实施方式中,腺病毒是复制能力型腺病毒。在一些实施方式中腺病毒是复制能力型重组病毒,其经工程改造为选择性地在靶细胞类型中复制。
在一些实施方式中,特别是为了向对象给予IL10R结合分子,特别是为了治疗对象的肠道疾病或细菌感染,编码IL10R结合分子的核酸可以通过给予编码IL10R结合分子的重组修饰噬菌体载体\递送至对象。如本文所用,术语“原核病毒”、“噬菌体”和“噬菌体”在本文中可互换使用,以描述在细菌内感染并复制的多种细菌病毒中的任一种。噬菌体选择性地感染原核细胞,限制IL10R结合分子在对象体内的原核细胞中表达,同时避免在哺乳动物细胞中表达。科学文献中已经鉴定和表征了多种能够选择多种细菌细胞的噬菌体。在一些实施方式中,噬菌体被修饰以去除相邻基序(PAM)。从噬菌体基因组中去除Cas9序列会降低靶标原核细胞的Cas9核酸内切酶中和编码IL10R结合分子的侵入性噬菌体的能力。
表达IL10R结合分子的重组修饰细胞的给予
在本发明的方法的一些实施方式中,通过给予经修饰以表达IL10R结合分子的重组宿主细胞来实现向需要治疗的对象递送IL10R结合分子,可在本文所述的治疗和预防应用中给予。在一些实施方式中,重组宿主细胞是哺乳动物细胞,例如,人细胞。
在一些实施方式中,编码IL10R结合分子(或包含其的载体)的核酸序列可以在重组修饰的宿主细胞中在染色体外维持以用于给药。在其他实施方式中,可以使用至少一种核酸内切酶将编码IL10R结合分子的核酸序列纳入待给予的宿主细胞的基因组中以促进将核酸序列插入细胞的基因组序列中。如本文所用,术语“核酸内切酶”是用于指能够催化裂解DNA或RNA分子(优选DNA分子)内核酸之间的键的野生型或变体酶。当这种核酸内切酶具有长度大于约12个碱基对(bp)(更优选14-55bp)的多核苷酸识别位点时,被称为“稀有切割(rare-cutting)”核酸内切酶。稀有切割核酸内切酶可用于灭活基因座处的基因或通过同源重组(HR)整合转基因,即通过诱导基因座处的DNA双链断裂(DSB)和通过基因修复机制在该基因座处插入外源DNA。稀有切割核酸内切酶的例子包括归巢核酸内切酶(Grizot,等(2009)Nucleic Acids Research 37(16):5405-5419)、由工程改造的锌指结构域融合体产生的嵌合锌指核酸酶(ZFN)(Porteus M和Carroll D.,使用锌指核酸酶的基因靶向(Genetargeting using zinc finger nucleases)(2005)Nature Biotechnology23(3):967-973、TALEN-核酸内切酶,来自CRISPR系统的Cas9核酸内切酶作为或修饰的限制性核酸内切酶以扩展序列特异性(Eisenschmidt,等2005;33(22):7039–7047)。
在一些实施方式中,特别是对于将IL10R结合分子给予肠道,可以通过重组修饰的原核细胞(例如,乳酸乳杆菌())将IL10R结合分子递送至对象。使用工程改造的原核细胞将重组蛋白递送至肠道是本领域已知的。参见,例如,Lin等(2017)Microb Cell Fact 16:148。在一些实施方式中,表达IL10R结合分子的工程改造的细菌细胞可以口服给予,通常以水性悬浮液形式给药,或直肠给药(例如灌肠)。
使用方法
本发明还提供了治疗患有疾病病症或病况的对象的方法,通过给予治疗有效量的本发明的IL10R结合分子(或编码IL10R结合分子的核酸,包括编码IL10R结合分子的重组病毒)。
炎症和自身免疫性病症
适用本发明的IL10R结合分子(包括包含IL10R结合分子和/或编码其的核酸分子的药学上可接受的制剂,包括编码这种IL10R结合分子的重组病毒)治疗的病症包括炎症或自身免疫疾病,包括但不限于器官排斥、移植物抗宿主病、自身免疫性甲状腺疾病、多发性硬化、过敏、哮喘、神经退行性疾病,其包括阿尔兹海默病、系统性红斑狼疮(SLE)、自体炎症疾病、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、糖尿病,包括1型或2型糖尿病、炎症、自身免疫疾病、特应性疾病、癌旁自身免疫疾病、软骨炎、关节炎、类风湿性关节炎、幼年关节炎、幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、多关节型幼年类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎全身发作、幼年强直性脊柱炎、幼年肠病性关节炎、幼年反应性关节炎、幼年瑞特氏综合征、SEA综合征(血清阴性接骨点病变关节病综合征(Seronegativity Enthesopathy ArthropathySyndrome))、幼年皮肌炎、幼年银屑病性关节炎、幼年硬皮病、幼年系统性红斑狼疮、幼年血管炎、少关节型类风湿性关节炎、多关节型类风湿关节炎、类风湿性关节炎全身发作、强直性脊柱炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、瑞特氏综合征、SEA综合征(血清阴性、接骨点病变、关节病综合征)。
适用本发明的IL10R结合分子(包括包含IL10R结合分子和/或编码其的核酸分子的药学上可接受的制剂,包括编码这种IL10R结合分子的重组病毒)治疗的增殖性和/或分化性紊乱的其他例子包括但不限于皮肤病。皮肤病可能涉及真皮、表皮或下皮层(hypodermal layer)的一个或一组细胞或层的异常活动,或真皮-表皮连接处的异常。例如,皮肤病可能涉及角质形成细胞(如过度增殖的基底和紧靠上基底的角质形成细胞)、黑素细胞、朗格汉斯细胞、默克尔细胞、免疫细胞和发现于一个或多个表皮层(如基底层(生发层)、棘层、颗粒层、透明层或角质层)的其他细胞的异常活动。在其他实施方式中,该紊乱可能涉及真皮细胞的异常活性,例如真皮内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞(例如肥大细胞或巨噬细胞),其发现于真皮层,例如乳头层或网状层。
炎症性或自身免疫性皮肤病的例子包括银屑病、银屑病关节炎、皮炎(湿疹)、例如剥脱性皮炎或特应性皮炎、毛发红糠疹、酒渣鼻糠疹、类银屑病、苔癣样糠疹、扁平苔藓、光泽苔藓、鱼鳞病样皮肤病、皮肤角化病、皮肤病、斑秃、坏疽性脓皮病、白癜风、类天疱疮(例如眼部瘢痕性类天疱疮或大疱性类天疱疮)、荨麻疹、角化病、类风湿性关节炎,其涉及关节囊内衬上皮相关细胞的过度增殖和炎症;皮炎例如脂溢性皮炎和日光性皮炎;角化病例如脂溢性角化病、老年性角化病、光化性角化病、光诱导性角化病和毛囊角化病;寻常痤疮;瘢痕瘤和瘢痕瘤形成的预防;痣;肉赘,包括疣、湿疣或尖锐湿疣,以及人乳头状瘤病毒(HPV)感染,例如性病湿疣;黏膜白斑病;扁平苔藓和角膜炎。皮肤病可以是皮炎,例如特应性皮炎或过敏性皮炎,如银屑病。
本发明的组合物(包括包含IL10R结合分子和/或编码其的核酸分子的药学上可接受的制剂,包括编码这种IL10R结合分子的重组病毒)也可以给予患有(或可能患有)银屑病或银屑病疾病的患者。术语"银屑病"旨在具有其医学含义,即主要累及皮肤并产生隆起、增厚、脱屑、非疤痕性病灶的疾病。病灶通常是界限分明的红斑性丘疹,覆盖着重叠的发亮鳞屑。鳞屑通常呈银色或略带乳白色。指甲经常受累,导致点蚀、指甲分离、增厚和变色。银屑病有时与关节炎相关联,可能会造成严重后果。角质形成细胞过度增殖是银屑病表皮增生的一个关键特征,同时还有表皮炎症和角质形成细胞分化减少。人们引用多种机制来解释银屑病特有的角质形成细胞过度增殖。紊乱的细胞免疫也被认为与银屑病的发病机制有关。银屑病疾病的例子包括慢性静止型银屑病、斑块型银屑病、中度至重度斑块型银屑病、寻常型银屑病、发疹型银屑病、银屑病红皮病、泛发性脓疱型银屑病、环状脓疱型银屑病或局部脓疱型银屑病。
肿瘤性疾病治疗
本发明提供了通过给予本文所述治疗有效量的IL10R结合分子(或编码IL10R结合分子的核酸,包括编码IL10R结合分子的重组载体)来使用IL10R结合分子治疗患有肿瘤疾病病症或病况的对象的方法。
本发明的组合物和方法用于治疗患有肿瘤性疾病的对象,其特征为存在肿瘤,包括良性和恶性肿瘤,以及肿瘤性疾病。
适合用本发明的组合物和方法治疗的良性肿瘤的例子包括但不限于腺瘤、纤维瘤、血管瘤和脂肪瘤。适合用本发明的组合物和方法进行治疗的恶变前(pre-malignant)肿瘤的例子包括但不限于增生、异型(atypia)、化生和发育异常(dysplasia)。适合使用本发明的组合物和方法治疗的恶性肿瘤的例子包括但不限于癌(起源于上皮组织的癌,例如皮肤或衬里(line)内脏器官的组织)、白血病、淋巴瘤和肉瘤(通常起源于骨脂肪、肌肉、血管或结缔组织)。术语肿瘤还包括病毒诱发的肿瘤,例如疣和EB病毒诱发的疾病(即传染性单核细胞增多症)、瘢痕形成、增殖性血管疾病,包括内膜平滑肌细胞增生、再狭窄(restenosis)和血管阻塞(vascular occlusion)等。
术语“肿瘤性疾病”包括以实体瘤和非实体瘤为特征的癌症,包括但不限于乳腺癌;肉瘤(包括但不限于骨肉瘤和血管肉瘤及纤维肉瘤),白血病,淋巴瘤,泌尿生殖系统癌症(包括但不限于卵巢癌、尿道癌、膀胱癌和前列腺癌);胃肠道癌症(包括但不限于结肠食道癌和胃癌);肺癌;骨髓瘤;胰腺癌;肝癌;肾癌;内分泌癌;皮肤癌;以及脑或中枢和外周神经(CNS)系统肿瘤,恶性的或良性的,包括胶质瘤和成神经细胞瘤、星形细胞瘤、骨髓增生异常症;宫颈原位癌;肠息肉;口腔白斑病;组织细胞增多症(histiocytose),增生性瘢痕,包括瘢痕疙瘩,血管瘤;增生性动脉狭窄,银屑病,炎症性关节炎;角化过度和丘疹鳞屑性皮疹(papulosquamous eruption),包括关节炎。
术语肿瘤性疾病包括癌。术语"癌"是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤,包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑色素瘤。术语肿瘤性疾病包括腺癌。"腺癌"是指起源于腺组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌症。
如本文所用,术语"造血肿瘤性疾病(hematopoietic neoplastic disorder)"是指涉及造血来源的增生/肿瘤细胞的肿瘤性疾病,例如,起源于骨髓、淋巴或红细胞谱系,或其前体细胞。
髓系肿瘤包括但不限于骨髓增生性肿瘤、带有嗜酸性粒细胞增多症的骨髓和淋巴紊乱、骨髓增生性/骨髓增生异常性肿瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓性白血病和相关的前体肿瘤,以及不明谱系急性白血病(acute leukemia of ambiguous lineage)。适合根据本发明内容治疗的示例性髓系紊乱包括但不限于急性早幼粒细胞白血病(APML)、急性髓细胞白血病(acute myelogenous leukemia)(AML)和慢性髓细胞白血病(chronicmyelogenous leukemia)(CML)。
淋巴肿瘤包括但不限于前体淋巴肿瘤、成熟B细胞肿瘤、成熟T细胞肿瘤、霍奇金淋巴瘤和免疫缺陷相关的淋巴增生性紊乱。适合根据本发明内容治疗的示例性淋巴疾病包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL),其包括B谱系ALL和T谱系ALL、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、原淋巴细胞白血病(PLL)、毛细胞白血病(HLL)和华氏巨球蛋白血症(WM)。
在一些情况下,造血肿瘤性疾病产生于分化不良的急性白血病(如红细胞白血病和急性巨核细胞白血病)。如本文所用,术语"造血肿瘤性疾病"是指恶性淋巴瘤,包括但不限于非霍奇金淋巴瘤及其变体、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、霍奇金病和里-斯氏病。
确定对象是否“患有肿瘤疾病”指的是由医生根据本领域公认的鉴定疾病、紊乱或病症的现有信息(包括但不限于X-射线、CT-扫描、常规实验室诊断测试(例如血细胞计数等)、基因组数据、蛋白质表达数据、免疫组织化学)对对象做出的其需要或将受益于治疗的判断。
适应性免疫系统会识别某些细胞表面蛋白的展示,以应对肿瘤突变,促进识别和消除肿瘤细胞。拥有较高肿瘤突变负荷(TMB)的肿瘤更有可能表现出此类"肿瘤抗原"。事实上,临床经验表明,由表现出高肿瘤突变负荷的肿瘤细胞构成的肿瘤更有可能对免疫疗法产生反应,所述免疫疗法包括免疫检查点阻断(Rizvi,等(2015)Science 348(6230):124-128;Marabelle,等(2020)Lancet Oncol 21(10):1353-1365)。肿瘤突变负荷用作生物标志物,以鉴定对免疫疗法(如本发明中提供的疗法)敏感性增加的肿瘤。
在一些实施方式中,本发明的组合物和方法用于治疗与形成表现为中等或高肿瘤突变负荷(TMB)的实体瘤有关的肿瘤性疾病。在一些实施方式中,本发明的组合物和组合物和方法用于治疗表现出中等或高肿瘤突变负荷(TMB)的免疫敏感实体瘤。适合用本发明的组合物和方法治疗的与具有中等或高肿瘤突变负荷的实体瘤的形成相关联的肿瘤性疾病的例子,包括但不限于非小细胞肺癌和肾细胞癌。在一个实施方式中,本发明的组合物和方法用于治疗表现出中等或高TMB的非小细胞肺癌(NSCLC)。NSCLC细胞通常富含大量突变,因此对免疫疗法更加敏感。目前NSCLC的治疗标准是根据癌症起始机制分层的,一般遵循NCCN或ASCO的建议。很大一部分NSCLC具有增加的TMB,因此最初对免疫疗法更敏感。然而,大多数肿瘤最终在免疫检查点抑制下复发。与免疫检查点抑制前的病灶相比,复发的肿瘤患者通常表现为肿瘤中T细胞浸润减少,全身T细胞耗竭,免疫反应受到抑制。因此,需要改进免疫疗法,重新激活和扩增耗竭的、稀有肿瘤浸润T细胞。
IL10R结合分子与补充治疗剂的组合:
本发明提供了本发明的IL10R结合分子与一种或多种其他活性剂(“补充剂”)组合的用途。这种进一步的组合可互换地称为“补充组合”或“补充组合疗法”,而那些与本发明的IL10R结合分子组合使用的治疗剂被称为“补充剂”。如本文所用,术语“补充剂”包括可分别给予或引入的试剂,例如,为单独给予而单独配制的试剂(例如,可在试剂盒中提供)和/或可与IL10R结合分子组合给予或引入的治疗。
如本文所用,术语"与……组合"在指给予对象多种试剂时是指给予对象第一试剂至少一种其它(即第二、第三、第四、第五,等)试剂。出于本发明的目的,如果在给予第二试剂时,因给予第一试剂而产生的生物学效应在对象体内持续,使第一试剂和第二试剂的治疗作用叠加,则认为一种试剂(如hIL10R结合分子)与第二试剂(例如免疫检查点途径的调节剂)组合给予。例如,PD1免疫检查点抑制剂(例如纳武单抗或帕博利珠单抗)通常通过IV输注每两周或每三周给予一次,而本发明的hIL10R结合分子通常可以更频繁地给予,如每天、BID或每周。然而,第一试剂(如帕博利珠单抗(pembrolizumab))的给药在较长的时间内提供治疗作用,第二试剂(如hIL10R结合分子)的给予在第一试剂的治疗作用仍在进行时提供其治疗作用,因此第二试剂被认为是与第一试剂组合给予,即使第一试剂可能是在离第二试剂给予时间很远的时间点(如几天或几周)进行的。在一个实施方式中,如果第一和第二试剂同时(在彼此的30分钟内)、同期或依次给予,则认为一种试剂与第二试剂组合给予。在一些实施方式中,如果第一试剂和第二试剂在彼此约24小时内,优选在彼此约12小时内,优选在彼此约6小时内,优选在彼此约2小时内,或优选在彼此约30分钟内给予,则第一试剂被视为与第二试剂“同期”给予。术语“与……组合”也应理解为适用于第一试剂和第二试剂共同配制在单一药学上可接受的制剂中并将该共同制剂给予对象的情况。在某些实施方式中,hIL10R结合分子和一种或多种补充剂是依次给予或应用的,例如,在给予一种试剂后给予一个或多个其他试剂。在其他实施方式中,hIL10R结合分子和一种或多种补充剂同时给予,例如,在同一时间或大约同一时间给予两种或多种试剂;这两种或多种试剂可以存在于两种或多种分别的制剂中,或组合成单一制剂(即共同制剂)。无论这些试剂是依次或同时给予,出于本发明的目的,它们都被认为是组合给予的。
确立最佳组合疗法:
进一步的实施方式包括一种方法或模型,用于确定组合中试剂的最佳量。最佳量可以是,例如,在对象或对象群体中实现最佳效果的量,或达到治疗效果同时最小化或消除与一种或多种试剂相关的不良反应的量。在一些实施方式中,涉及hIL10R结合分子和补充剂的组合的方法,其为已知或已被确定对治疗或预防本文所述的对象(例如人)或对象群体中所述的疾病、紊乱或病症(如癌症病症)有效,滴定试剂的量而一种或多种其他药剂的量保持恒定。通过以这种方式操纵一种或多种试剂的量,临床医生能够确定用于,例如,治疗特定的疾病、紊乱或病症,或消除不良反应或减少不良反应的最有效的试剂的比率,使得其在这种情况下是可接受的。
用于炎症或自身免疫病症的补充剂
在一些实施方式中,该方法进一步包括给予本发明的IL10R结合分子与一种或多种选自下组的补充试剂的组合:类固醇、Janus激酶抑制剂、钙调磷酸酶抑制剂、mTor抑制剂、IMDH抑制剂、生物制剂、疫苗和治疗抗体。在某些实施方式中,治疗抗体是结合选自下组的蛋白质的抗体:BLyS、CD11a、CD20、CD25、CD3、CD52,IgEIL12/IL23、IL17a、IL1β、IL4Rα、IL5、IL6R、整合素-α4β7、RANKL、TNFα、VEGF-A和VLA-4。
在一些实施方式中,补充剂是一种或多种选自下组的皮质类固醇的试剂(包括但不限于强的松、布地奈德、泼尼松龙(prednilisone))、Janus激酶抑制剂(包括但不限于托法替尼钙调磷酸酶抑制剂(包括但不限于环孢菌素和他克莫司)、mTor抑制剂(包括但不限于西罗莫司和依维莫司)、IMDH抑制剂(包括但不限于硫唑嘌呤、来氟米特和霉酚酸酯(mycophenolate)),生物制剂例如阿巴西普(abatcept)/>或依那西普(etanercept)/>和治疗性抗体。
可以作为补充剂与本发明的IL10R结合分子组合给予以治疗自身免疫疾病的治疗性抗体的例子包括但不限于抗-CD25抗体(例如达克珠单抗和巴利昔单抗)、抗-VLA-4抗体(例如那他珠单抗),抗-CD52抗体(例如阿仑单抗),抗-CD20抗体(例如利妥昔单抗、奥瑞珠单抗),抗-TNF抗体(例如,英夫利昔单抗和阿达木单抗),抗-IL6R抗体(例如托珠单抗),抗-TNFα抗体(例如阿达木单抗戈利木单抗和英夫利昔单抗),抗-整合素-α4β7抗体(例如维多珠单抗),抗-IL17a抗体(例如布达鲁单抗(brodalumab)或苏金单抗),抗-IL4Rα抗体(例如达必妥(dupilumab)),抗-RANKL抗体,IL6R抗体,抗-IL1β抗体(例如卡那基单抗),抗-CD11a抗体(例如依法利珠单抗),抗-CD3抗体(例如莫罗单抗(muramonab)),抗-IL5抗体(例如美泊珠单抗(mepolizumab)、瑞利珠单抗),抗-BLyS抗体(例如贝利单抗);和抗-IL-12/IL-23抗体(例如乌司奴单抗)。许多治疗性抗体已被批准用于对抗自身免疫疾病的临床使用。美国食品和药品管理局(FDA)批准的用于治疗对象所患自身免疫病的抗体的,其作为补充剂与本发明的IL10R结合分子组合给予(和任选的其他补充剂),用于治疗指示的自身免疫病,所述抗体的实例包括但不限于:阿特珠单抗(atezolizumab),奥拉单抗(olaratumab),伊克珠单抗(ixekizumab),曲妥珠单抗(trastuzumab),英夫利昔单抗(infliximab),利妥昔单抗(rituximab),依决洛单抗(edrecolomab),达雷木单抗(daratumumab),依洛珠单抗(elotuzumab),奈昔妥珠单抗(necitumumab),地努妥昔单抗(dinutuximab),纳武单抗(nivolumab),博纳吐单抗(blinatumomab),帕博利珠单抗(pembrolizumab),帕妥珠单抗(pertuzumab),本妥昔单抗维多汀(brentuximab vedotin),伊匹单抗(ipilimumab),奥法木单抗(ofatumumab),聚乙二醇化赛妥珠单抗(certolizumabpegol),卡妥索单抗(catumaxomab),帕尼单抗(panitumumab),贝伐单抗(bevacizumab),雷莫芦单抗(ramucirumab),司妥昔单抗(siltuximab),恩诺单抗维多汀(enfortumabvedotin),泊洛妥珠单抗维多汀(polatuzumab vedotin),[fam]-德喜曲妥珠单抗(trastuzumab deruxtecan),西妥昔单抗(cetuximab),莫妥昔单抗假单抗(moxetumomabpasudotox),莫格利珠单抗(mogamuizumab),替拉珠单抗(tildrakizumab),伊巴珠单抗(ibalizumab),度伐鲁单抗(durvalumab),伊妥珠单抗(inotuzumab),奥佐米星(ozogamicin),阿维鲁单抗(avelumab),奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab),阿多曲妥珠单抗美坦(ado-trastuzumab emtansine),西妥昔单抗,托西莫单抗(tositumomab)-I131,替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan),吉妥珠单抗(gemtuzumab)和奥佐米星(ozogamicin)。
在本发明的方法的实践中作为补充剂有用的前述抗体可以单独给予或以任何抗体药物偶联物(ADC)的形式给予,其包括抗体、接头和一种或多种药物(如1、2、3、4、5、6、7或8种药物)或以修饰形式(如PEG化)。
可用于治疗肿瘤疾病的补充剂:
在一些实施方式中,补充剂是化学治疗剂/化疗剂。在一些实施方式中,补充剂是多种化疗剂的“混合物(cocktail)”。在一些实施方式中,化疗剂或混合物与一种或多种物理方法(如放射疗法)组合给予。术语“化疗剂”包括但不限于:烷化剂,例如噻替哌和环磷酰胺;烷基磺酸盐,如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮杂环丙烷,例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米得哌(memredopa)和乌瑞替哌(uredopa);乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(methylamelamine),包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)、三吖啶基氧化磷(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine);氮芥类,例如苯丁酸氮芥(chiorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯乙酸氮芥胆甾醇酯(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfmaide)、尿嘧啶芥(uracil mustard);亚硝基脲类(nitrosureas),例如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine);抗生素,例如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放射菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)(例如博来霉素A2)、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)及其衍生物,例如去甲氧道诺霉素(demethoxy-daunomycin)、11-脱氧柔红霉素(11-deoxydaunorubicin)、13-脱氧柔红霉素(13-deoxydaunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、衣索比星(esorubicin)、伊达比星(idambicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin),例如mitomycin C,N-methyl mitomycin C;霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(poffiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代谢药,例如氨甲蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物,例如二甲叶酸(denopterin)、氨甲蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate);二去氮杂四氢叶酸(dideazatetrahydrofolic acid),和叶酸;嘌呤类似物,例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine);嘧啶类似物,例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU;雄激素类,例如卡普睾酮(calusterone)、丙酸甲雄烧酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone);抗肾上腺类,例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂,例如亚叶酸(frolinic acid);醋葡内酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基-γ-酮戊酸(aminolevulinic acid);安吖啶(amsacrine);苯塔布希(bestrabucil);比生群(bisantrene);依达曲沙(edatraxate);地弗法明(defofamine);秋水仙胺(demecolcine);地吖醌(diaziquone);依氟鸟氨酸(elfornithine);依利醋铵(elliptinium acetate);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓;羟基脲;香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);米托胍腙(mitoguazone);米托葸醌(mitoxantrone);莫哌达醇(mopidamol);硝氨丙吖啶(nitracrine);喷司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);吡柔比星(pirarubicin);鬼臼酸(podophyllinic acid);2-乙基酰肼(2.2-ethylhydrazide);丙卡巴胼(procarbazine);雷佐生(razoxane);西佐喃(sizofiran);锗螺胺(spirogermanium);包菌丽酸(tenuazonic acid);三亚胺醌酸(triaziquone acid);2,2′,2″-三氯三乙胺;乌拉坦(urethan);长春地辛(vindesine);达卡巴嗪(dacarbazine);甘露莫司汀(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇(mitolactol);哌泊溴烷(pipobroman);甘托欣(gacytosine);阿糖胞苷(Ara-C);环磷酰胺;噻替哌;紫杉烷类,例如紫杉醇、nab-paclitaxel和多西紫杉醇;氯胺丁;吉西他滨;6-硫鸟嘌呤;巯基嘌呤;甲氨蝶呤;铂和铂配位络合物,例如顺铂、奥沙利铂(oxaplatin)和卡铂;长春花碱;多西它赛;铂;依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺;丝裂霉素C;米托蒽醌;长春新碱;长春瑞滨;诺维本(navelbine);诺肖林(novantrone);替尼泊苷;道诺霉素(daunomycin);氨蝶呤(aminopterin);希罗达(xeloda);伊班膦酸钠(ibandronate);CPT11;拓扑异构酶抑制剂;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);维甲酸;埃斯培拉霉素(esperamicins);卡培他滨;紫杉烷,例如紫杉醇,多西他赛,卡巴他赛;洋红霉素(carminomycin),阿霉素,例如4′-表阿霉素(4′-epiadriamycin),4-阿霉素-14-苯甲酸酯(4-adriamycin-14-benzoate),阿霉素-14-辛酸酯(adriamycin-14-octanoate),阿霉素-14-萘乙酸酯(adriamycin-14-naphthaleneacetate);秋水仙素(cholchicine)和任何上述药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
术语"化疗剂"还包括调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素剂,如抗雌激素,包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制芳香化酶的4(5)-咪唑类、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、克沃昔芬(keoxifene)、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬;和抗雄激素,例如氟他胺、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林;以及上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在一些实施方式中,补充剂是一种或多种本领域中鉴定的对治疗肿瘤性疾病有用的化学或生物试剂,包括但不限于:细胞因子或细胞因子拮抗剂,例如IL-12、INFα或抗表皮生长因子受体、伊立替康;四氢叶酸抗代谢剂,例如培美曲塞;针对肿瘤抗原的抗体、单克隆抗体和毒素的复合物、T细胞助剂、骨髓移植、或抗原呈递细胞(例如树突状细胞治疗)、抗肿瘤疫苗、复制能力型病毒、信号传导抑制剂(如或/>)或免疫调节剂,以实现对肿瘤生长的补充或协同抑制、非甾体抗炎药(NSAID)、环氧合酶-2(COX-2)抑制剂、类固醇、TNF拮抗剂(如。/>和/>)、干扰素-β1a/>和干扰素-β1b以及本领域熟练的临床医生容易理解的已知化疗治疗方案中的上述一种或多种的组合,包括但不限于TAC、FOLFOX、TPC、FEC、ADE、FOLFOX-6、EPOCH、CHOP、CMF、CVP、BEP、OFF、FLOX、CVD、TC、FOLFIRI、PCV、FOLFOXIRI、ICE-V、XELOX和其他。
在一些实施方式中,hIL10R结合分子与BRAF/MEK抑制剂、激酶抑制剂(如舒尼替尼)、PARP抑制剂(如奥拉帕尼)、EGFR抑制剂(如奥西替尼(osimertinib))(Ahn,等(2016)JThorac Oncol 11:S115)、IDO抑制剂(如依帕司他(epacadostat)),和溶瘤病毒(如塔利兰帕(talimogene laherparepvec))(T-VEC)组合给予。
在一些实施方式中,“补充剂”是治疗性抗体(包括结合至一个或多个肿瘤相关抗原的双特异性和三特异性抗体,包括但不限于双特异性T细胞接合(BITE)、双亲和靶向(DART)构建体和三特异性杀伤性接合(TriKE)构建体)。
在一些实施方式中,治疗性抗体是结合至至少一种肿瘤抗原的抗体,其选自下组:HER2(例如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、阿多-曲妥珠单抗-美坦),柄蛋白-4(如恩诺单抗),CD79(如泊洛妥珠单抗维多汀),CTLA4(如伊匹单抗),CD22(如莫妥昔单抗假单抗),CCR4(如莫格利珠单抗(magamuizumab)),IL23p19(如替拉珠单抗(tildrakizumab)),PDL1(如度伐鲁单抗,阿维鲁单抗,阿特珠单抗),IL17a(如伊克珠单抗),CD38(如达雷木单抗),SLAMF7(如埃洛妥单抗(elotuzumab)),CD20(如利妥昔单抗,托西莫单抗,替伊莫单抗和奥法木单抗),CD30(如本妥昔单抗维多汀),CD33(如吉妥珠单抗奥佐米星),CD52(如阿仑单抗),EpCam,CEA,fpA33,TAG-72,CAIX,PSMA,PSA,叶酸结合蛋白,GD2(如地努妥昔单抗(dinuntuximab)),GD3,IL6(如司妥昔单抗(silutxumab))GM2,Ley,VEGF(如贝伐单抗),VEGFR,VEGFR2(如雷莫芦单抗(ramucirumab))、PDGFR(如奥拉木单抗(olartumumab))、EGFR(如西妥昔单抗、帕尼单抗和奈西妥单抗(necitumumab)),ERBB2(如曲妥珠单抗),ERBB3,MET,IGF1R,EPHA3,TRAIL R1,TRAIL R2,RANKL RAP,生腱蛋白(tenascin),整合素αVβ3和整合素α4β1。
经FDA批准并可作为补充剂用于治疗肿瘤性疾病的抗体治疗剂的例子包括下表中提供的那些。
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在一些实施方式中,其中抗体是靶向第一和第二肿瘤抗原的双特异性抗体,例如HER2和HER3(缩写为HER2 x HER3),FAP x DR-5双特异性抗体,CEA x CD3双特异性抗体,CD20 x CD3双特异性抗体,EGFR-EDV-miR16三特异性抗体,gp100x CD3双特异性抗体,Ny-eso x CD3双特异性抗体,EGFR x cMet双特异性抗体,BCMA x CD3双特异性抗体,EGFR-EDV双特异性抗体,CLEC12A x CD3双特异性抗体,HER2 x HER3双特异性抗体,Lgr5 x EGFR双特异性抗体,PD1 x CTLA-4双特异性抗体,CD123 x CD3双特异性抗体,gpA33 x CD3双特异性抗体,B7-H3x CD3双特异性抗体,LAG-3 x PD1双特异性抗体,DLL4 x VEGF双特异性抗体,钙粘蛋白-P x CD3双特异性抗体,BCMA x CD3双特异性抗体,DLL4 x VEGF双特异性抗体,CD20 x CD3双特异性抗体,Ang-2x VEGF-A双特异性抗体,
CD20 x CD3双特异性抗体,CD123 x CD3双特异性抗体,SSTR2 X CD3双特异性抗体,PD1 x CTLA-4双特异性抗体,HER2 x HER2双特异性抗体,GPC3 x CD3双特异性抗体,PSMA x CD3双特异性抗体,LAG-3 x PD-L1双特异性抗体,CD38 x CD3双特异性抗体,HER2x CD3双特异性抗体,GD2 x CD3双特异性抗体和CD33 x CD3双特异性抗体。此类治疗性抗体可以直接或通过接头,特别是酸、碱或酶促不稳定接头,进一步偶联至一种或多种化疗剂(如抗体药物偶联物或ADC)。
在一些实施方式中,补充剂是一种或多种非药物治疗方式(例如,局部放疗或全身放疗或手术)。举例而言,本发明内容考虑了治疗方案,其中在放射阶段之前或之后,用包含IL10R结合分子和一种或多种补充剂的治疗方案进行治疗。在一些实施方式中,本发明进一步考虑将IL10R结合分子与手术(如肿瘤切除术)组合使用。在一些实施方式中,本发明进一步考虑将IL10R结合分子与骨髓移植、外周血干细胞移植或其他类型的移植疗法组合使用。
在一些实施方式中,“补充剂”是免疫检查点调节剂,用于治疗和/或预防对象的肿瘤性疾病以及与肿瘤性疾病相关的疾病、紊乱或病症。术语“免疫检查点途径”是指由表达在抗原呈递细胞(APC)上的第一分子(例如PD1等蛋白)结合至第二分子(例如PDL1等蛋白)所引发的生物学反应,后者在免疫细胞(例如T细胞)上表达,其或通过刺激免疫反应(例如T细胞活性的上调)或抑制(例如T细胞活性的下调)调节免疫反应。参与形成调节免疫反应的结合对的分子通常被称为“免疫检查点”。由这种免疫检查点途径调节的生物学反应是由胞内信号转导途径介导的,其导致下游的免疫效应途径,例如细胞激活、细胞因子产生、细胞迁移、细胞毒性因子分泌和抗体产生。免疫检查点途径通常由第一细胞表面表达的分子结合至与免疫检查点途径相关的第二细胞表面分子而引发(例如PD1结合至PDL1,CTLA4结合至CD28等)。免疫检查点途径的激活可以导致免疫反应的刺激或抑制。
在一个实施方式中,免疫检查点途径调节剂是抑制PD1结合至PDL1和/或PDL2的负向免疫检查点途径的拮抗剂("PD1途径抑制剂")。PD1途径抑制剂导致刺激一些有利的免疫反应,如逆转T细胞耗竭,恢复细胞因子的产生,以及扩增抗原依赖性T细胞。PD1途径抑制剂已被确定为多种癌症有效的,并获得USFDA批准用于治疗各种癌症,包括黑色素瘤、肺癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤、头颈癌、膀胱癌和尿道癌。
术语PD1途径抑制剂包括干扰PD1至PDL1和/或PDL2的结合的单克隆抗体。抗体PD1途径抑制剂在本领域中是众所周知的。干扰PD1结合至PDL1和/或PDL2的市售可得的单克隆抗体的PD1途径抑制剂的例子包括纳武单抗(BMS-936558,MDX1106,商购自BristolMyers Squibb公司,新泽西州普林斯顿),帕博利珠单抗(/>MK-3475,兰姆单抗,商购自默克公司(Merck and Company),新泽西州肯尼尔沃斯)和阿特珠单抗(基因泰克/罗氏(Genentech/Roche),加利福尼亚州南旧金山)。其他PD1途径抑制剂抗体在临床开发中,包括但不限于杜瓦鲁单抗(MEDI4736,阿斯利康/米迪缪尼(Medimmune/AstraZeneca))、匹利珠单抗(CT-011,CureTech)、PDR001(诺华(Novartis))、BMS-936559(MDX1105,BristolMyers Squibb),以及阿维鲁单抗(MSB0010718C,默克/辉瑞(Merck Serono/Pfizer))和SHR-1210(因赛特医疗(Incyte))。2012年7月10日授权的美国专利号8,217,149(基因泰克公司)、2012年5月1日授权的美国专利号8,168,757(默沙东(Merck Sharp and Dohme Corp))、2011年8月30日授权的美国专利号8,008,449(美达莱(Medarex))、2011年5月17日授权的美国专利号7,943,743(美达莱公司)中描述了其他抗体PD1途径抑制剂。
在一些实施方式中,本发明的方法可以包括IL10R结合分子的给予与细胞疗法形式的补充剂的组合,以治疗肿瘤性、自身免疫性或炎症性疾病。适合与本发明的方法组合使用的细胞疗法的例子包括但不限于工程改造的T细胞产品,其包括一种或多种激活的CAR-T细胞、工程改造的TCR细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、工程改造的Treg细胞。由于工程改造的T细胞产品在给予对象之前通常离体激活,因此提供了上调的CD25水平,包括这种激活的工程改造T细胞类型的细胞产品适合通过给予本文所述的CD25偏向化IL10R结合分子以进一步支持。可以被修饰以纳入本发明的正交受体的市售可得CAR-T细胞产品的例子包括阿基伦赛(axicabtagene ciloleucel)(从吉利德制药公司(Gilead Pharmaceuticals)以名称市售可得)和替沙伦赛(tisagenlecleucel)(从诺华(Novartis)以名称市售可得)。
预防应用
在IL10R结合分子用于疾病预防的一些实施方式中,补充剂可以是疫苗。根据Doyle,等的美国专利第5,800,819号(1998年9月1日授权)的教导,本发明的IL10R结合分子可与疫苗组合给予对象作为佐剂以增强对疫苗的免疫反应。可以与本发明的IL10R结合分子组合的疫苗的例子包括HSV疫苗,百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis),大肠杆菌疫苗,肺炎球菌疫苗(pneumococcal vaccine),其包括多价肺炎球菌疫苗例如13,白喉,破伤风和百日咳疫苗(包括组合疫苗例如/>)和/>),水痘疫苗,B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type B)疫苗,人乳头瘤病毒疫苗例如小儿麻痹症,钩端螺旋体病疫苗(Leptospirosis vaccines),组合呼吸道疫苗,莫拉氏菌(Moraxella)疫苗,以及减毒或灭活病毒产品,例如牛呼吸道疾病疫苗(RSV),多价人流感疫苗例如/>和Quadravlent/>),猫白血病病毒疫苗(felineleukemia vaccine),传染性肠胃炎疫苗、COVID-19疫苗和狂犬病疫苗。
表格
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实施例
实施例-VhH产生:
在免疫前,骆驼在研究机构中至少适应了7天。用1×PBS(抗原总量约1mg)稀释抗原。通过SDS-PAGE评估抗原的质量以确保纯度(例如>80%)。对于首次,将10mL CFA(随后使用IFA进行6次)加入研钵中,然后将10mL抗原在1×PBS中缓慢加入研钵,用研杵研磨。将抗原和CFA/IFA研磨,直到该组分显示乳白色并且看起来难以分散。在骆驼身上的至少六个部位皮下注射在CFA中乳化的抗原,在每个部位注射约2mL(每只骆驼总共10mL)。通过注射更多的部位和更大的体积,可以产生更强的免疫反应。每周(7天)进行免疫,进行7次。每次注射后将针插入皮下空间10至15秒,以避免乳液泄漏。或者,轻轻牵拉注射器柱塞也可以防止泄漏。第7次免疫后3天采集血样。
为了产生针对hIL10Ra的VHH,所使用的免疫原是hIL10Ra的胞外结构域(氨基酸22-235)(UNIPROT Ref:Q13651)。为了产生针对hIL10Rb的VHH,所使用的免疫原是hIL10Rb的201个氨基酸胞外结构域、前体的氨基酸20-220和成熟蛋白的氨基酸1-201(UNIPROT参考号Q08334)。为了产生针对mIL10Rb的VHH,所使用的免疫原是mIL10Rb的201个氨基酸胞外结构域、前体的氨基酸20-220和成熟蛋白的氨基酸1-201(UNIPROT参考号Q61190)。对于每种抗原,使用以下方法鉴定和分离VHH。
免疫之后,构建文库。简言之,从血液中提取RNA并转录成cDNA。通过两步PCR获得VHH区,其片段约400bp。PCR结果和pMECS噬菌粒的载体用Pst I和Not I消化,随后连接到pMECS/Nb重组体。连接后,通过电穿孔将产物转化到大肠杆菌(E.coli)TG1细胞中。然后,在生长培养基中富集转化体并接种在平板上。最后,通过计数集落数估计文库大小。在文库构建后进行文库生物淘选以筛选针对抗原的候选物。在此过程中应用噬菌体展示技术。通过PE-ELISA鉴定阳性集落。
实施例2.抗-hIL10R VHH的产生
每周用人IL10R(氨基酸22-235、UniProtKB Q13651、hIL-10Rαecd)和IL10Rβ(氨基酸20-220、UniProtKB Q08334、hIL-10Rαecd)的胞外结构域对骆驼进行免疫,持续七周,并于第52天收集PBMC。如上文实施例1所述构建噬菌体展示文库并进行生物淘选。在hIL10-R1上选择后获得50个VHH序列,在hIL10-R2上选择后获得47个VHH序列。使用种系分配和CDR3序列相似性对序列进行克隆分型。
实施例3.DNA编码合成因子的合成
从每个群组中选择七个独特的抗hIL-10Rαecd序列(SEQ ID NO:44-50)和七个独特的抗hIL-10Rβecd序列(SEQ ID NO:51-57),并合成由一种编码IL-10R VHH的DNA和一种编码IL-10RαVHH的DNA组成的DNA,其由编码GGGS(SEQ ID NO:23)的DNA的接头序列隔开。DNA用于每种可能的VHH组合,并且在两个取向上总共有98 7x7x2=98种VHH二聚体。在每个DNA构建体的3'端加入Ala-Ser("AS")连接体,后接His-6 DNA(ASH6,SEQ ID NO:430)。编码这些构建体的密码子优化的DNA序列作为SEQ ID No:290-237提供,其组分的取向描述于上文说明书的表2中。
实施例4.重组产生和纯化
将密码子优化的DNA插入物(SEQ ID No:290-237)克隆到修饰的pcDNA3.4(Genscript)中,用于在24孔板中的HEK293细胞中的小规模表达。上清液细胞IL2R结合蛋白基本上按照以下程序进行纯化。使用Hamilton Star自动化系统,将4x24孔块中的96x4ml上清液重新排列成4x96孔1mL块。PhyNexus微量移液吸头(Biotage,San Jose CA)吸取80μLNi-Excel IMAC树脂(Cytiva)平衡洗涤缓冲液:PBS pH 7.4,30mM咪唑。在所有4x96孔块上浸渍PhyNexus吸头并循环进行14次1mL移液循环。PhyNexus吸头在2x1mL块中洗涤,块中装有洗涤缓冲液。PhyNexus吸头在3x0.36mL块中洗脱,块中装有洗脱缓冲液:PBS pH 7.4,400mM咪唑。PhyNexus吸头在3x1mL 0.5M氢氧化钠的块中再生。
根据以下程序,使用T200对纯化的蛋白质洗脱液进行定量。将10μL的第一次96x0.36mL洗脱液转移到/>96孔微孔板中,并在HBS-EP+缓冲液(10mM HepespH 7.4,150mM NaCl,1mM EDTA,0.05% Tween 20)中稀释至60μL。96个样品中的每一个都注射在先前用抗组氨酸捕获抗体(Cytiva)功能化的CM5系列S芯片上:以5μL/分钟的速度注射18秒。缓冲液洗涤60秒后记录捕获水平。在4个Biacore芯片流细胞中的每个中获得已知VHH浓度(270、90、30、10、3.3、1.1μg/mL)的标准曲线,以消除细胞间表面的可变性。使用包括特异性和非特异性的单位点结合的非线性模型,对照标准曲线对96次捕获进行内插。第一洗脱块中的浓度在12至452μg/mL之间变化,对应于4-149μg。对5个随机选取的样品进行SDS-PAGE分析,以确保洗脱液的分子量符合预期值(约30kDa)。
基本上按照以下程序,使用Hamilton Star自动化系统对蛋白质的浓度进行标准化。在Excel电子表格中输入浓度值,其中计算移液体积以在0.22mL中稀释至50μg/mL。该电子表格以Hamilton Star方法输入,该方法致力于使用第一洗脱块和洗脱缓冲液作为稀释剂进行稀释移液。使用0.22μm滤板(康宁公司(Corning))和用于以下体外测定的材料对最终的标准化板进行无菌过滤。
实施例5.通过表面等离子体共振评估结合亲和力
从根据实施例1-3产生的IL10a的每个克隆型中选择一个代表性实施例,用于进行如下通过SPR的结合评估。使用表面等离子体共振(SPR)基本上按照以下程序评估IL10Ra结合分子对对应于SEQ ID NO:159、161、162、163、165、167和170的hIL10Ra的ECD的结合亲和力。所有实验均在配备蛋白A衍生传感器芯片(Cytiva)的Biacore T200仪器上在10mMHepes、150mM NaCl、0.05%(v/v)聚山梨醇酯20(PS20)和3mM EDTA(HBS-EP+缓冲液)中进行。单-Fc VHH配体以5μl/分钟的速度流动18至300秒的可变时间,达到下表所列的捕获载荷。配体捕获后,在高性能或单循环动力学模式下注射IL2Rb受体胞外结构域的2倍稀释系列,该序列经修饰以包含C末端多聚-His序列,通常包括在1μM和1nM之间的至少5个浓度。通过流动pH 1.5的10mM甘氨酸-HCl(60秒,50μL/分钟)实现表面再生。用Biacore T200评估软件处理减去缓冲液的感测图,并用1:1Langmuir结合模型(整体偏移设置为零)进行全局拟合,以提取动力学和亲和常数(ka,kd,kD)。R最大<100RU表示表面密度与动力学分析兼容。使用以下公式生成计算的R最大:R最大=载荷(RU)x配体的价态x(分析物的分子量/配体的分子量)。表面活性定义为实验/计算的R最大之比。下表23、24和25中提供了这些结合亲和力实验的结果。
实施例6.IL10活性试验:
HEK-BlueTMIL-10报告细胞系(英杰公司(Invivogen),加利福尼亚州圣地亚哥)被用于筛选IL10R1/R2 VHH。HEK-BlueTMIL-10细胞是通过使用编码hIL-10Rα和β链、人STAT3和STAT3诱导型SEAP(分泌型胚胎碱性磷酸酶)报告基因的基因稳定转染人胚肾HEK293细胞系而产生的。IL-10与其在HEK-BlueTMIL-10细胞表面的受体结合会引发JAK1/STAT3信号转导和随后的SEAP产生。然后通过使用QUANTI-BlueTM开发溶液(英杰公司(Invivogen),圣地亚哥CA)量化细胞培养上清液中的SEAP活性来检测信号,并在630nm处通过分光光度法测量吸光度值。由于STAT3还涉及细胞因子(例如IFN-α/β和IL-6)的信号转导,因此HEK-BlueTMIL-10细胞进行敲除以表达hIFNAR2和hIL-6R。
实施例7.SEQ ID NO:192-289的筛选:
为筛选IL10R1/R2 VHH,将HEK-BlueTMIL-10细胞以每孔50,000个细胞接种在96孔板中,并用25nM或100nM蛋白质(一式三份)处理24小时。重组无动物的人IL-10(雪兰多生物技术公司(Shenandoah Biotechnology,Inc.)Warwick,PA目录号100-83AF)用作阳性对照,未刺激的细胞用作阴性对照。处理后24小时,将20μl细胞上清液转移到平底96孔板中,并通过添加180μl QUANTI-BlueTM(Invivogen,英杰公司)2小时展开测定。在(帕金埃尔默有限公司(PerkinElmer,Inc.),马萨诸塞州华尔顿)多标签酶标仪上测量630nm处的吸光度值。筛选的结果列于说明书的表3中。
实施例8.通过表面等离子共振评估IL10Ra和IL10Rb单域抗体的结合亲和力
从根据实施例1-3产生的每个克隆型中选择一个代表性例子,用于进行如下通过SPR的结合评估。使用表面等离子体共振(SPR)基本上按照以下程序评估IL10Rb结合分子对对应于SEQ ID NO:21、29、33、37、45、53和65的CD122的结合亲和力。所有实验均在配备蛋白A衍生传感器芯片(Cytiva)的Biacore T200仪器上在10mM Hepes、150mM NaCl、0.05%(v/v)聚山梨醇酯20(PS20)和3mM EDTA(HBS-EP+缓冲液)中进行。单-Fc VHH配体以5μl/分钟的速度流动18至300秒的可变时间,达到下表所列的捕获载荷。配体捕获后,在高性能或单循环动力学模式下注射IL2Rb受体胞外结构域的2倍稀释系列,该序列经修饰以包含C末端多聚-His序列,通常包括在1μM和1nM之间的至少5个浓度。通过流动pH 1.5的10mM甘氨酸-HCl(60秒,50μL/分钟)实现表面再生。用Biacore T200评估软件处理减去缓冲液的感测图,并用1:1Langmuir结合模型(整体偏移设置为零)进行全局拟合,以提取动力学和亲和常数(ka,kd,kD)。R最大<100RU表示表面密度与动力学分析兼容。使用以下公式生成计算的R最大:R最大=载荷(RU)x配体的价态x(分析物的分子量/配体的分子量)。表面活性定义为实验/计算的R最大之比。下表4中提供了这些结合亲和力实验的结果。
实施例9.通过表面等离子体共振评估IL10R结合分子的结合亲和力
所有实验均在配备蛋白A或CAP生物素芯片(Cytiva)的Biacore T200仪器上在10mM Hepes、150mM NaCl、0.05%(v/v)聚山梨醇酯20(PS20)和3mM EDTA(HBS-EP+缓冲液)中进行。对于蛋白A芯片上的实验,Fc融合的配体以5μl/分钟的速度流动18至300秒的可变时间,达到下表所列的捕获载荷。
配体捕获后,在高性能或单循环动力学模式下注射2倍稀释系列的分析物,其通常包含1μM和1nM之间的至少5种浓度。通过流动pH 1.5的10mM甘氨酸-HCl(60秒,50μL/分钟)实现表面再生。用Biacore T200评估软件处理减去缓冲液的感测图,并用1:1Langmuir结合模型(整体偏移设置为零)进行全局拟合,以提取动力学和亲和常数(ka,kd,kD)。R最大<100RU表示表面密度与动力学分析兼容。
如上所述在CAP芯片上进行实验,在捕获生物素化配体之前进行附加的生物素捕获试剂捕获步骤(10秒,40uL/分钟)。
使用以下公式生成计算的R最大:R最大=载荷(RU)x配体的价态x(分析物的分子量/配体的分子量)。表面活性定义为实验/计算的R最大之比。表22和23中提供了评估样品构型和这些实验的结果
实施例10:通过表面等离子体共振评估人源化IL10RA结合分子的结合亲和力
所有实验均在配备抗组氨酸捕获芯片(Cytiva)的Biacore T200仪器上在10mMHepes、150mM NaCl、0.05%(v/v)聚山梨醇酯20(PS20)和3mM EDTA(HBS-EP+缓冲液)中进行。~0.5μg/mL hIL10Rb-his(义翘神州(Sino Biological)目录号10945)以5μl/分钟流动120秒,达到下表中列出的捕获负载。配体捕获后,在单循环动力学模式下注射人源化单FcVHH(参见表中的分析物)的2倍稀释系列(50、25、12.5、6.25、3.13nM)。通过流动pH 1.5的10mM甘氨酸-HCl(60秒,50μL/分钟)实现表面再生。用Biacore T200评估软件处理减去缓冲液的感测图,并用1:1Langmuir结合模型(整体偏移设置为零)进行全局拟合,以提取动力学和亲和常数(ka,kd,kD)。R最大<100RU表示表面密度与动力学分析兼容。使用以下公式生成计算的R最大:R最大=载荷(RU)x配体的价态x(分析物的分子量/配体的分子量)。表面活性定义为实验/计算的R最大之比。样品信息和实验结果见下表。
Claims (19)
1.一种IL10受体(IL10R)结合分子,其包含:
(a)特异性结合IL10Ra的第一亚基胞外结构域的第一单域抗体(sdAb)(IL10Ra sdAb);和
(b)特异性结合IL10Rb胞外结构域的第二单域抗体(IL10Rb sdAb);
其中:
·IL10Ra sdAb和IL10Rb sdAb稳定缔合;
·IL10Ra和IL10Rb响应于与细胞因子受体的同源配体接触发生二聚化;和
·使表达IL10Ra和IL10Rb的细胞与有效量的IL10R结合分子接触导致IL10Ra和IL10Rb的胞内结构域接近,导致胞内信号转导。
2.如权利要求1所述的IL10R结合分子,其中所述IL10Ra sdAb和IL10Rb共价连接。
3.如权利要求1所述的IL10R结合分子,其中所述IL10Ra sdAb和IL10Rb使用接头共价连接。
4.如权利要求1所述的IL10R结合分子,其中所述IL10受体是多肽。
5.一种IL10R结合分子,IL10R是下式[#1]的多肽:
H2N-(IL10 VHH#1)–(L1)a–(IL10 VHH#2)–(L2)b-(CP)c-COOH [#1]
其中:“—”代表共价键;L1和L2是接头;CP是螯合肽;a、b和c独立地选自整数0或1;“H2N”表示氨基末端;并且“COOH”表示多肽的羧基末端。
6.如权利要求5所述的IL10R结合分子,其中所述IL10 VHH#1是IL10Ra sdAb且IL10VHH#2是IL10Rb sdAb,IL10 VHH#1是IL10Rb sdAb且IL10 VHH#2是IL10Ra sdAb。
7.如权利要求6所述的IL10R结合分子,其中所述IL10Ra sdAb是一种sdAb,其包含:
·CDR1,其相对于SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49和52中任一个的序列具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;
·CDR2,其相对于SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50和53中任一个的序列具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;和
·CDR3,其相对于SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51和54中任一个的序列具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;
并且所述IL10Rb sdAb是一种sdAb,其包含:
·CDR1,其相对于SEQ ID NO:55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、109、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148和151中任一个的序列具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;
·CDR2,其相对于SEQ ID NO:56、59、62、65、68、71、74、77、80、83、86、89、92、95、98、101、104、107、110、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149和152中任一个的序列具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化;
·CDR3,其相对于SEQ ID NO:57、60、63、66、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150和153中任一个的序列具有至少90%(例如,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化。
8.如权利要求6所述的IL10R结合分子,其中,L10Ra sdAb是一种sdAb,其相对于SEQ IDNO:154-171中的任一个具有至少90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化。
9.如权利要求6所述的IL10R结合分子,其中IL10Rb sdAb是一种sdAb,其相对于SEQ IDNO:172-198或SEQ ID NO:199-201中的任一个具有至少90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化。
10.如权利要求6所述的IL10R结合分子,其中相对于SEQ ID NO:256-353中的任一个,具有至少90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化。
11.如权利要求6所述的IL10R结合分子,其中相对于SEQ ID NO:172-198或SEQ ID NO:199-201中的任一个,具有至少90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性,或具有0、1、2或3个氨基酸变化,任选保守氨基酸变化。
12.如权利要求6所述的IL10R结合分子,其中与表29的任何一种IL10R结合分子的序列(SEQ ID NO:[DR1511-DR1525])具有至少90%(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)序列同一性。
13.如权利要求6所述的IL10R结合分子,其中所述IL10Ra sdAb对IL10Ra胞外结构域的亲和力高于IL10Rb sdAb对IL10Rb胞外结构域的亲和力。
14.如权利要求1-13中任一项所述的IL10R结合分子,其中所述IL10R结合蛋白是PEG化的。
15.如权利要求1-14中任一项所述的IL10R结合分子的药学上可接受的制剂。
16.一种核酸序列,其编码权利要求6-12中任一项所述的IL10R结合分子。
17.一种重组载体,其包含权利要求16所述的多肽IL10R结合分子的核酸。
18.一种通过给予权利要求1-14中任一项所述的治疗有效量的IL10R结合分子来治疗患有自身免疫性疾病、传染病或炎性疾病的哺乳动物对象的方法。
19.一种通过给予权利要求1-14中任一项所述的治疗有效量的IL10R结合分子来治疗患有肿瘤性疾病的哺乳动物对象的方法。
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