JP7200138B2 - アルブミン結合ドメイン融合タンパク質 - Google Patents

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Description

生物製剤は、癌を含む多くの疾患の治療に有用であるが、そのような分子の短い循環半減期は大きな障害となっている。
生物製剤は、様々な方法で癌の治療に有用である。サイトカイン系治療は、癌細胞の増殖および繁殖を妨げることによって、癌細胞に直接作用し得る。サイトカインは、キラーＴ細胞、および癌細胞を攻撃する他の細胞の増殖を促進することによって、免疫系を刺激することもあり得る。さらに、サイトカインは癌細胞を促進して、免疫系細胞を引き付ける化学物質を送り出し得る。例えば、Ｄｒａｎｏｆｆ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ４：１１－２２（２００４）、およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６（１８）：７５１３－７５１８（２００９）を参照されたい。抗体は、特異性と高親和性の両方で標的を認識する能力があるため、治療薬として望ましい。Ｔ細胞の活性化を制限する腫瘍表面抗原および阻害信号を標的とするものを含むモノクローナル抗体系治療は、２０年以上にわたり癌治療法の標準的な構成要素であった。例えば、Ｗｅｉｎｅｒ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １５（６）：３６１－３７０（２０１５）を参照されたい。
循環半減期が短いことは、多くの生物製剤にとって大きな障害となっている。例えば、Ｐｅｒｄｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ ２１：２９７－３０７（２０１０）を参照されたい。そのような短時間作用型治療薬には、特に慢性疾患の場合、クリニックへの適用性を低減させ得る頻繁な投与プロファイルが必要である。治療上適切な血清濃度を達成するための分子の繰り返しの注射の必要性を低減させるため、長い血清半減期が望ましい。治療用タンパク質の半減期の延長方法には、ＰＥＧ化、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）への融合、ヒト免疫グロブリンＩｇＧの定常断片（Ｆｃ）への融合、ＸＴＥＮなどの非構造化ポリペプチドへの融合が含まれる。例えば、Ｓｔｏｈｌ、ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２９（４）：２１５－２３９（２０１５）を参照されたい。半減期延長技術によって、頻繁な投薬の費用および負担を軽減する新規な改善された生物学的治療が可能になる。したがって、タンパク質およびペプチド系治療薬の半減期を延長するのに有用な新規試薬および方法が引き続き必要とされている。
アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物が本明細書で提供される。本明細書に記載されるように、主題のアルブミン結合ドメイン（すなわち、アルブミン結合ドメイン融合タンパク質）を含む生物製剤は、有利なことに、ＡＢＤなしの生物製剤と比較して、延長された半減期およびより良好なインビボ薬物動態を示す。
一態様では、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む組成物が、本明細書で提供される。ＡＢＤには、ａ）図２に示される可変重鎖のうちのいずれか１つのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖と、ｂ）図２に示される可変軽鎖のうちのいずれか１つのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖と、が含まれる。
いくつかの実施形態では、図２に示されるｖｈＣＤＲ１配列、ｖｈＣＤＲ２配列、およびｖｈＣＤＲ３配列のうちのいずれかに従って、ｖｈＣＤＲ１にはｖｈＣＤＲ１配列が含まれ、ｖｈＣＤＲ２にはｖｈＣＤＲ２配列が含まれ、ｖｈＣＤＲ３にはｖｈＣＤＲ３配列が含まれる。一実施形態では、可変重鎖には、図２に示される可変重鎖のうちのいずれか１つの配列が含まれる。いくつかの実施形態では、図２に示されるｖｌＣＤＲ１配列、ｖｌＣＤＲ２配列、およびｖｈＣＤＲ３配列のうちのいずれかに従って、ｖｌＣＤＲ１にはｖｌＣＤＲ１配列が含まれ、ｖｌＣＤＲ２にはｖｌＣＤＲ２配列が含まれ、ｖｌＣＤＲ３にはｖｌＣＤＲ３配列が含まれる。一実施形態では、可変軽鎖には、図２に示される可変軽鎖のうちのいずれか１つの配列が含まれる。例示的な実施形態では、アルブミン結合ドメインは、Ａ１０ｍ３の前記可変重鎖および可変軽鎖（図２Ｄ）を含む。
別の態様では、多様体ＩＬ－１５を含む組成物が、本明細書で提供される。多様体ＩＬ－１５には、親ＩＬ－１５と比較して、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｒ、Ｎ１１２Ａ、Ｎ１１２Ｓ、Ｎ１１２Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ｓ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ｓ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｄ、およびＫ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換が含まれる。
いくつかの実施形態では、多様体ＩＬ－１５には、図３に示される多様体ＩＬ－１５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列が含まれる。特定の実施形態では、多様体ＩＬ－１５には、前記ＩＬ－１５に結合したＩＬ－１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）がさらに含まれる。
一態様では、融合パートナーに結合したＡＢＤを含むアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）融合タンパク質が、本明細書で提供される。ＡＢＤには、図２に示される可変重鎖のうちのいずれか１つのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖と、図２に示される可変軽鎖のうちのいずれか１つのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖と、が含まれる。
いくつかの実施形態では、図２に示されるｖｈＣＤＲ１配列、ｖｈＣＤＲ２配列、およびｖｈＣＤＲ３配列のうちのいずれかに従って、ｖｈＣＤＲ１にはｖｈＣＤＲ１配列が含まれ、ｖｈＣＤＲ２にはｖｈＣＤＲ２配列が含まれ、ｖｈＣＤＲ３にはｖｈＣＤＲ３配列が含まれる。いくつかの実施形態では、可変重鎖には、図２に示される可変重鎖配列のうちのいずれか１つの配列が含まれる。
特定の実施形態では、図２に示されるｖｌＣＤＲ１配列、ｖｌＣＤＲ２配列、およびｖｈＣＤＲ３配列のうちのいずれかに従って、ｖｌＣＤＲ１にはｖｌＣＤＲ１配列が含まれ、ｖｌＣＤＲ２にはｖｌＣＤＲ２配列が含まれ、ｖｌＣＤＲ３にはｖｌＣＤＲ３配列が含まれる。特定の実施形態では、可変軽鎖には、図２に示される可変軽鎖配列のうちのいずれか１つの配列が含まれる。
例示的な実施形態では、可変重鎖および可変軽鎖には、それぞれＡ１０ｍ３の可変重鎖および可変軽鎖（図２Ｄ）が含まれる。
いくつかの実施形態では、融合パートナーはサイトカインである。特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮ－αから選択される。
特定の実施形態では、融合パートナーは結合部分である。いくつかの実施形態では、結合部分は、ｓｃＦｖ可変重鎖およびｓｃＦｖ可変軽鎖を含むｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖ、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ、および抗ＴＮＦ ｓｃＦｖから選択される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは抗インターロイキンｓｃＦｖである。例示的な実施形態では、ｓｃＦｖは、抗ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１７（Ａ－Ｆ）、またはＩＬ－２３ ｓｃＦｖである。
いくつかの実施形態では、ＡＢＤは、リンカーによって前記融合パートナーに結合している。例示的な実施形態では、リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｘであり、式中、ｘは１～１０の整数である。
別の態様では、式（ＩＬ－１５）－Ｌ－（ＡＢＤ）によるＩＬ１５－アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）融合タンパク質が、本明細書で提供される。ＡＢＤには、図２に示される可変重鎖のうちのいずれか１つのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖と、図２に示される可変軽鎖のうちのいずれか１つのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖と、が含まれ、Ｌはリンカーである。
いくつかの実施形態では、図２に示されるｖｈＣＤＲ１配列、ｖｈＣＤＲ２配列、およびｖｈＣＤＲ３配列のうちのいずれかに従って、ｖｈＣＤＲ１にはｖｈＣＤＲ１配列が含まれ、ｖｈＣＤＲ２にはｖｈＣＤＲ２配列が含まれ、ｖｈＣＤＲ３にはｖｈＣＤＲ３配列が含まれる。いくつかの実施形態では、可変重鎖には、図２に示される可変重鎖配列のうちのいずれか１つの配列が含まれる。
特定の実施形態では、図２に示されるｖｌＣＤＲ１配列、ｖｌＣＤＲ２配列、およびｖｈＣＤＲ３配列のうちのいずれかに従って、ｖｌＣＤＲ１にはｖｌＣＤＲ１配列が含まれ、ｖｌＣＤＲ２にはｖｌＣＤＲ２配列が含まれ、ｖｌＣＤＲ３にはｖｌＣＤＲ３配列が含まれる。特定の実施形態では、可変軽鎖には、図２に示される可変軽鎖配列のうちのいずれか１つの配列が含まれる。
例示的な実施形態では、可変重鎖および可変軽鎖には、それぞれＡ１０ｍ３の可変重鎖および可変軽鎖（図２Ｄ）が含まれる。
２８．前記ＩＬ－１５が、親ＩＬ－１５と比較して、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｒ、Ｎ１１２Ａ、Ｎ１１２Ｓ、Ｎ１１２Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ｓ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ｓ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｄ、およびＫ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む多様体ＩＬ－１５である、請求項２２～２７のいずれか一項に記載のＩＬ１５－ＡＢＤ融合タンパク質。いくつかの実施形態では、多様体ＩＬ－１５には、図３に示される多様体ＩＬ－１５のうちのいずれか１つのアミノ酸配列が含まれる。例示的な実施形態では、多様体ＩＬ－１５には、ＩＬ１５ Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａのアミノ酸配列が含まれる。
特定の実施形態では、ＩＬ－１５は野生型ＩＬ－１５である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）に結合した野生型ＩＬ－１５を含む。
特定の実施形態では、リンカーは、図４８に示されるリンカーのうちのいずれかから選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｘであり、式中、ｘは１～１０の整数である。
一実施形態では、ＩＬ１５－ＡＢＤ融合タンパク質は、図４に示されるアミノ酸配列のうちのいずれか１つによるアミノ酸配列を有する。
別の態様では、式（ＩＬ－１２）－Ｌ－（ＡＢＤ）によるＩＬ１２－アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）融合タンパク質が、本明細書で提供される。ＡＢＤには、図２に示される可変重鎖のうちのいずれか１つのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖と、図２に示される可変軽鎖のうちのいずれか１つのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖と、が含まれ、Ｌはリンカーである。
いくつかの実施形態では、図２に示されるｖｈＣＤＲ１配列、ｖｈＣＤＲ２配列、およびｖｈＣＤＲ３配列のうちのいずれかに従って、ｖｈＣＤＲ１にはｖｈＣＤＲ１配列が含まれ、ｖｈＣＤＲ２にはｖｈＣＤＲ２配列が含まれ、ｖｈＣＤＲ３にはｖｈＣＤＲ３配列が含まれる。いくつかの実施形態では、可変重鎖には、図２に示される可変重鎖配列のうちのいずれか１つの配列が含まれる。
特定の実施形態では、図２に示されるｖｌＣＤＲ１配列、ｖｌＣＤＲ２配列、およびｖｈＣＤＲ３配列のうちのいずれかに従って、ｖｌＣＤＲ１にはｖｌＣＤＲ１配列が含まれ、ｖｌＣＤＲ２にはｖｌＣＤＲ２配列が含まれ、ｖｌＣＤＲ３にはｖｌＣＤＲ３配列が含まれる。特定の実施形態では、可変軽鎖には、図２に示される可変軽鎖配列のうちのいずれか１つの配列が含まれる。
例示的な実施形態では、可変重鎖および可変軽鎖には、それぞれＡ１０ｍ３の可変重鎖および可変軽鎖（図２Ｄ）が含まれる。
一実施形態では、ＩＬ－１２は、ｐ３５サブユニット、ｐ４０サブユニット、およびＩＬ－１２リンカーを含む単鎖ＩＬ－１２であり、ＩＬ－１２リンカーは、ｐ３５サブユニットをｐ４０サブユニットに共有結合させる。特定の実施形態では、リンカーは、図４８に示されるリンカーのうちのいずれかから選択される。例示的な実施形態では、リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｘであり、ｘは１～１０の整数である。
例示的な実施形態では、ＩＬ１２－ＡＢＤ融合タンパク質には、図２０のアミノ酸配列のうちのいずれか１つによるアミノ酸配列が含まれる。
別の態様では、Ｎ末端からＣ末端へ、ａ）（ＩＬ－１２）－Ｌ１－（ＡＢＤ）－Ｌ２－（ＩＬ－１５）、およびｂ）（ＩＬ－１５）－Ｌ１－（ＡＢＤ）－Ｌ２－（ＩＬ－１２）から選択される式を有するｎアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）融合タンパク質が、本明細書で提供される。ＡＢＤには、図２に示される可変重鎖のうちのいずれか１つのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖と、図２に示される可変軽鎖のうちのいずれか１つのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖と、が含まれ、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ第１および第２のリンカーである。
いくつかの実施形態では、図２に示されるｖｈＣＤＲ１配列、ｖｈＣＤＲ２配列、およびｖｈＣＤＲ３配列のうちのいずれかに従って、ｖｈＣＤＲ１にはｖｈＣＤＲ１配列が含まれ、ｖｈＣＤＲ２にはｖｈＣＤＲ２配列が含まれ、ｖｈＣＤＲ３にはｖｈＣＤＲ３配列が含まれる。いくつかの実施形態では、可変重鎖には、図２に示される可変重鎖配列のうちのいずれか１つの配列が含まれる。
特定の実施形態では、図２に示されるｖｌＣＤＲ１配列、ｖｌＣＤＲ２配列、およびｖｈＣＤＲ３配列のうちのいずれかに従って、ｖｌＣＤＲ１にはｖｌＣＤＲ１配列が含まれ、ｖｌＣＤＲ２にはｖｌＣＤＲ２配列が含まれ、ｖｌＣＤＲ３にはｖｌＣＤＲ３配列が含まれる。特定の実施形態では、可変軽鎖には、図２に示される可変軽鎖配列のうちのいずれか１つの配列が含まれる。
例示的な実施形態では、可変重鎖および可変軽鎖には、それぞれＡ１０ｍ３の可変重鎖および可変軽鎖（図２Ｄ）が含まれる。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５には、野生型ＩＬ－１５ポリペプチドが含まれる。特定の実施形態では、野生型ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）に結合している。
一実施形態では、ＩＬ－１５は、親ＩＬ－１５と比較して、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｒ、Ｎ１１２Ａ、Ｎ１１２Ｓ、Ｎ１１２Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ｓ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ｓ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｄ、およびＫ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑから選択される１つ以上のアミノ酸置換が含まれる多様体ＩＬ－１５である。一実施形態では、ＩＬ－１５には、図３に示されるアミノ酸配列のうちのいずれかによるアミノ酸配列が含まれる。
特定の実施形態では、ＩＬ－１２は、ｐ３５サブユニット、ｐ４０サブユニット、およびＩＬ－１２リンカーを含む単鎖ＩＬ－１２であり、ＩＬ－１２リンカーは、ｐ３５サブユニットをｐ４０サブユニットに結合させる。
いくつかの実施形態では、第１のリンカーおよび第２のリンカーは、それぞれ独立して、図４８に示されるリンカーのうちのいずれかから選択される。例示的な実施形態では、リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｘであり、ｘは１～１０の整数である。
別の態様では、式（サイトカイン）－Ｌ－（ＡＢＤ）による、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、サイトカイン、およびリンカー（Ｌ）を含むＡＢＤ融合タンパク質が、本明細書で提供される。ＡＢＤには、図２に示される可変重鎖のうちのいずれか１つのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖と、図２に示される可変軽鎖のうちのいずれか１つのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖と、が含まれ、Ｌはリンカーである。サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮ－αから選択される。
いくつかの実施形態では、図２に示されるｖｈＣＤＲ１配列、ｖｈＣＤＲ２配列、およびｖｈＣＤＲ３配列のうちのいずれかに従って、ｖｈＣＤＲ１にはｖｈＣＤＲ１配列が含まれ、ｖｈＣＤＲ２にはｖｈＣＤＲ２配列が含まれ、ｖｈＣＤＲ３にはｖｈＣＤＲ３配列が含まれる。いくつかの実施形態では、可変重鎖には、図２に示される可変重鎖配列のうちのいずれか１つの配列が含まれる。
特定の実施形態では、図２に示されるｖｌＣＤＲ１配列、ｖｌＣＤＲ２配列、およびｖｈＣＤＲ３配列のうちのいずれかに従って、ｖｌＣＤＲ１にはｖｌＣＤＲ１配列が含まれ、ｖｌＣＤＲ２にはｖｌＣＤＲ２配列が含まれ、ｖｌＣＤＲ３にはｖｌＣＤＲ３配列が含まれる。特定の実施形態では、可変軽鎖には、図２に示される可変軽鎖配列のうちのいずれか１つの配列が含まれる。
例示的な実施形態では、可変重鎖および可変軽鎖には、それぞれＡ１０ｍ３の可変重鎖および可変軽鎖（図２Ｄ）が含まれる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、図４８に示されるリンカーのうちのいずれかから選択される。例示的な実施形態では、リンカーは（ＧＧＧＧＳ）ｘであり、ｘは１～１０の整数である。
別の態様では、式（ＦＰ１）－Ｌ１－（ＡＢＤ）－Ｌ２－（ＦＰ２）によるＡＢＤ融合タンパク質が、本明細書で提供され、式中、ＡＢＤは、可変重鎖および可変軽鎖を含むアルブミン結合ドメインであり、ＦＰ１およびＦＰ２は、それぞれ第１の融合タンパク質および第２の融合タンパク質であり、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ第１および第２のリンカーである。ＡＢＤには、図２に示される可変重鎖のうちのいずれか１つのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖と、図２に示される可変軽鎖のうちのいずれか１つのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖と、が含まれる。
いくつかの実施形態では、図２に示されるｖｈＣＤＲ１配列、ｖｈＣＤＲ２配列、およびｖｈＣＤＲ３配列のうちのいずれかに従って、ｖｈＣＤＲ１にはｖｈＣＤＲ１配列が含まれ、ｖｈＣＤＲ２にはｖｈＣＤＲ２配列が含まれ、ｖｈＣＤＲ３にはｖｈＣＤＲ３配列が含まれる。いくつかの実施形態では、可変重鎖には、図２に示される可変重鎖配列のうちのいずれか１つの配列が含まれる。
特定の実施形態では、図２に示されるｖｌＣＤＲ１配列、ｖｌＣＤＲ２配列、およびｖｈＣＤＲ３配列のうちのいずれかに従って、ｖｌＣＤＲ１にはｖｌＣＤＲ１配列が含まれ、ｖｌＣＤＲ２にはｖｌＣＤＲ２配列が含まれ、ｖｌＣＤＲ３にはｖｌＣＤＲ３配列が含まれる。特定の実施形態では、可変軽鎖には、図２に示される可変軽鎖配列のうちのいずれか１つの配列が含まれる。
例示的な実施形態では、可変重鎖および可変軽鎖には、それぞれＡ１０ｍ３の可変重鎖および可変軽鎖（図２Ｄ）が含まれる。
いくつかの実施形態では、ＦＰ１およびＦＰ２は、それぞれ第１のサイトカインおよび第２のサイトカインである。例示的な実施形態では、第１のサイトカインおよび前記第２のサイトカインは、ＩＬ－２およびＩＬ－１２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５、ＩＬ－１５およびＩＬ－１２、ＩＬ－１８およびＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２１およびＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－２１、ならびにＩＦＮ－αおよびＩＬ－１５から選択される。
いくつかの実施形態では、第１および第２の融合パートナーは、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖおよびＩＬ－１２、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖおよびＩＬ－１５、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖおよび抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖ、第１の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖおよび第２のＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ、抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖおよびＩＬ－１２、抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖおよびＩＬ－１５、抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖおよびＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ、ならびに、第１の抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖおよび第２の抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖから選択される。
ＦＰ１およびＦＰ２が、それぞれ第１の結合部分および第２の結合部分である、請求項６８に記載のＡＢＤ融合タンパク質。特定の実施形態では、第１の結合部分および前記第２の結合部分は、それぞれｓｃＦｖである。例示的な実施形態では、第１の結合部分および第２の結合部分は、ＴＮＦ ｓｃＦｖおよびＩＬ－１ ｓｃＦｖ、ＴＮＦ ｓｃＦｖおよびＩＬ－６ ｓｃＦｖ、ＴＮＦ ｓｃＦｖおよびＩＬ－８ ｓｃＦｖ、ＴＮＦ ｓｃＦｖおよびＩＬ－１７（アイソフォームＡ～Ｆ）ｓｃＦｖ、ＴＮＦ ｓｃＦｖおよびＩＬ－２３ ｓｃＦｖ、ならびに第１のＴＮＦ ｓｃＦｖおよび第２のＴＮＦ ｓｃＦｖから選択される。
いくつかの実施形態では、第１のリンカーおよび第２のリンカーは、それぞれ独立して、図４８に示されるリンカーのうちのいずれかから選択される。一実施形態では、第１のリンカーおよび第２のリンカーは、それぞれ独立して、（ＧＧＧＧＳ）ｘであり、ｘは１～１０の整数である。
別の態様では、ＴＧＦβ結合ドメインおよびアルブミン結合ドメインを含むアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）融合タンパク質が、本明細書で提供される。アルブミン結合ドメインには、図２の可変重鎖および可変軽鎖のうちのいずれかのアミノ酸配列を有するＡＢＤ可変重鎖およびＡＢＤ可変軽鎖が含まれる。
例示的な実施形態では、ＡＢＤ可変重鎖および前記ＡＢＤ可変軽鎖は、Ａ１０ｍ３の可変重鎖および可変軽鎖のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＴＧＦβ結合ドメインは、４Ｄ９の可変重鎖および可変軽鎖を含むｓｃＦｖ（図４０Ｂ）である。いくつかの実施形態では、ＡＢＤには、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、または第２のＴＧＦβ結合ドメインがさらに含まれる。
別の態様では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインおよびアルブミン結合ドメインを含むアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）融合タンパク質が、本明細書で提供される。アルブミン結合ドメインには、図２の可変重鎖および可変軽鎖のうちのいずれかのアミノ酸配列を有するＡＢＤ可変重鎖およびＡＢＤ可変軽鎖が含まれる。
いくつかの実施形態では、ＡＢＤ可変重鎖および前記ＡＢＤ可変軽鎖は、Ａ１０ｍ３の可変重鎖および可変軽鎖のアミノ酸配列（図２Ｄ）を含む。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合ドメインは、１０Ｄ１２の可変重鎖および可変軽鎖を含むｓｃＦｖ（図５０）である。
いくつかの実施形態では、ＡＢＤには、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ結合ドメイン、または第２のＰＤ－Ｌ１結合ドメインがさらに含まれる。
別の態様では、本明細書に記載される、アルブミン結合ドメイン、多様体ＩＬ－１５、またはＡＢＤ融合タンパク質のいずれかをコードする核酸、任意のそのような核酸を含む宿主細胞、およびそのようなＡＢＤ、多様体ＩＬ－１５、またはＡＢＤ融合タンパク質の作製方法が、本明細書で提供される。
さらに別の態様では、それを必要とする対象の腫瘍の抑制または軽減方法が、本明細書で提供され、この方法には、ＡＢＤ融合タンパク質を対象に投与することが含まれる。
本明細書に開示されるいくつかの例示的なアルブミン結合ドメイン融合タンパク質を示す図であり、それらは、アルブミン結合ドメインが、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１２またはＩＬ－１５）に結合している融合タンパク質、ならびにアルブミン結合ドメインが、１）２つのサイトカイン、２）２つの結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）、３）結合部分およびサイトカインに結合している融合タンパク質を含む。 本明細書に記載される主題のアルブミン結合ドメイン融合タンパク質の特定の実施形態に含まれる、例示的なアルブミン結合ドメインの配列を示す図である。可変重ドメイン配列、および可変軽ドメイン配列、ならびに特定のｖｈＣＤＲ１～３およびｖｌＣＤＲ１～３配列が、これらの図に含まれる。 本明細書に記載される例示的なＩＬ－１５多様体の配列を示す図である。 本明細書に記載されるＩＬ－１５－ＡＢＤ融合タンパク質の例示的な実施形態を示す図である。図４に示されるＩＬ－１５－ＡＢＤ融合タンパク質には、Ａ１０ｍ３ ＡＢＤが含まれる。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における転写が、ＩＬ－１５－Ａ１０ｍ３の低発現を説明していないことを示す研究結果を示す図である。トランスフェクト細胞におけるＩＬ１５－Ａ１０ｍ３ ｍＲＮＡの検証。Ａ）ＨＥＫ２９３におけるＩＬ１５－Ａ１０ｍ３の発現は、いずれかの抗Ｈｉｓタグ抗体を使用したウェスタンブロッティング（左）、またはＭＳＡに結合している機能的ＥＬＩＳＡ（右）では検出できない。Ｍ：マーカー、ＣＫ：対照としての非トランスフェクト培地、１～３：３つの独立したトランスフェクト細胞培養からの培養培地（１００、２００、および２５０はそれぞれ、１００、２００、２５０ｕｇ／ｍｌゼオシンである）。ＩＬ１５－Ａ１０ｍ３を産生する１０ｕｇ／ｍｌの大腸菌は、陽性対照として機能した。Ｂ）ｍＲＮＡが、４つの独立したＩＬ１５－Ａ１０ｍ３トランスフェクト細胞から調製され、ＲＴ－ＰＣＲが行われて、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルと比較して、ＩＬ１５－Ａ１０ｍ３ ｍＲＮＡのｍＲＮＡレベルを定量化した。レーン１）非トランスフェクト細胞対照、２－５）ＩＬ１５－Ａ１０ｍ３ ｍＲＮＡの転写は、全てのトランスフェクト細胞において正常に見える、６）ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの陽性対照。 ＩＬ－１５に結合しているＩＬ－１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）によって推定的に保護される潜在的なＩＬ－１５ユビキチン化部位の同定を示す図である。（Ａ）赤のＫ８６は、推定ユビキチン化部位であり、ＩＬ－１５Ｒα結合部位（星印）の隣にあり、（Ｂ）Ｋ８６は、オンラインユビキチン化部位データベース（ｗｗｗ．ｕｂｐｒｅｄ．ｏｒｇ）であるＵｂＰｒｅｄからのユビキチン化のヒットである。 本明細書に記載される安定性が改善された様々なＩＬ－１５－ＡＢＤ融合タンパク質の概略図を提供する図であり、それには、ＩＬ－１５Ｒａ／ＩＬ１５「スシドメイン」融合パートナーを有するＩＬ－１５－ＡＢＤ（Ａ）、および推定ユビキチン化部位Ｋ８６にアミノ酸置換を有するＩＬ－１５多様体融合パートナーを含むＩＬ－１５－ＡＢＤ融合タンパク質（Ｂ）が含まれる。 ＨＥＫ２９３細胞産生ＩＬ－１５－ＡＢＤ Ｋ８６Ｒ、およびＫ８６Ａ多様体、およびＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５－ＡＢＤの、発現レベル（図８Ａ）およびマウス血清アルブミン（図８Ａ）およびＩＬ－１５Ｒα（図８Ｂ）への結合能力を評価する研究を示すグラフである。Ａ）１２個のＷＴ ＩＬ１５－Ａ１０ｍ３クローン（ＷＴ）、１２個のＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５－Ａ１０ｍ３クローン（ＩＬ１５Ｒａ）、６個のＩＬ－１５ Ｋ８６Ａ－Ａ１０ｍ３変異体クローン（Ｋ８６Ａ）、および６個のＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３変異体クローン（Ｋ８６Ｒ）のマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に結合しているＩＬ１５－ＡＢＤのＥＬＩＳＡ読み出し。２４個のウェルプレートの各試料ウェルの培養培地が、ＭＳＡでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに加えられた。Ｂ）プレートにコーティングされたＩＬ－１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）へのＩＬ－１５の結合に関するＥＬＩＳＡが使用され、Ｋ８６Ａ（クローンＡ３、黄色の星）およびＫ８６Ｒ（クローンＲ６、緑色の星）変異体は、ＩＬ－１５のＩＬ－１５Ｒαへの結合活性への影響はなかったことを確認した。ＩＬ－１５Ｒα－ＩＬ－１５－Ａ１０ｍ３における内部ＩＬ－１５Ｒα（クローンα１、赤色の星）は、内部ＩＬ１５に結合し、したがってプレートにコーティングされたＩＬ－１５Ｒαへの結合を遮断し得る。１０ｕｇ／ｍｌの大腸菌産生ＷＴ ＩＬ－１５－Ａ１０ｍ３は、陽性対照として使用された。 ＩＬ１５Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３クローン＃６のスケールアップ産生を示す図である。Ａ）サイズ排除カラムによるＩＬ１５Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３のクロマトグラフ、Ｂ）１４～４２までのＳＥＣ分画のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、Ｃ）最終産物（１：ＩＬ１５Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３、２：ＩＬ１５Ｒａ－ＩＬ１５－Ａ１０ｍ３）は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左）および抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロッティング（右）によって最終確認された。 インビトロ結合アッセイの結果を示す図であり、ＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３のマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）への結合能力を確認する。 ＣＴＬＬ２増殖アッセイの結果を示すグラフであり、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生されるＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３ポリペプチドは、大腸菌から産生される野生型ＩＬ－１５およびＩＬ－１５－Ａ１０ｍ３と比較して、生物活性が低減していることを示す。 ＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３を産生するＨＥＫ細胞の生物活性の低減は、少なくとも部分的にはそのグリコシル化に起因することを示す研究結果を示す図である。 ＩＬ１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３に導入されるＮ１１２Ａ変異体が、ＣＴＬＬ２増殖アッセイにおいて脱グリコシル化されたＩＬ－１５Ｒ－Ａ１０ｍ３に匹敵するＩＬ－１５生物活性を回復させ得ることを示す研究結果を提供するグラフである（Ａ）。（Ｂ）ＩＬ－１５アミノ酸置換Ｎ１１２Ａ、Ｎ１１２Ｑ、およびＮ１１２Ｓを有するＩＬ－１５Ｒ－Ａ１０ｍ３融合タンパク質が、置換側鎖のサイズに反比例的に生物活性の増加を示したことをさらに示す。 Ｂ１６－Ｆ１０マウス黒色腫モデルにおける腫瘍増殖に対するＩＬ－１５およびＩＬ－１５－ＡＢＤのインビボ効果を評価するための研究の実験セットアップを示す図である。 ＩＬ－１５－ＡＢＤ融合タンパク質で治療したＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、治療後１１日目のＢ１６－Ｆ１０腫瘍増殖阻害量を示すグラフである。 腫瘍浸潤リンパ球集団に対するＩＬ－１５－ＡＢＤ治療の効果を示すＦＡＣＳ分析を提供する図である。 脾臓および腫瘍におけるリンパ球集団に対するＩＬ－１５－ＡＢＤ治療の効果の概要を提供する図である。 対照のＩＬ－１５ ＷＴと比較して、マウスモデル（Ａ）およびヒト血清（Ｂ）における主題のＩＬ－１５－ＡＢＤの安定性を示す研究結果を提供するグラフである。 本明細書に記載される例示的なＩＬ－１２－ＡＢＤの配列である、ｍＩＬ－１２ｓｃ－Ａ１０ｍ３およびヒトＩＬ－１２ｓｃ－Ａ１０ｍ３を示す図である。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生される主題のＩＬ－１２－ＡＢＤが、インビトロアッセイおよび細胞系アッセイにおいて生物学的に活性であることを示す研究の図である。 Ｂ１６－Ｆ１０マウス黒色腫モデルにおける腫瘍増殖に対するＩＬ－１２およびＩＬ－１２－ＡＢＤのインビボ効果を評価するための研究の実験セットアップを示す図である。同様のモル濃度のＩＬ－１２およびＩＬ－１２が、３つの異なる濃度で使用された。例えば、ＩＬ－１２の３μｇは、ＩＬ－１２－ＡＢＤの４．５μｇと同じモル濃度であり、ＩＬ－１２の１０μｇは、ＩＬ－１２－ＡＢＤの１５μｇと同じモル濃度であり、ＩＬ－１２の２０μｇは、ＩＬ－１２－ＡＢＤの３０μｇと同じモル濃度である。ＩＬ－１２の分子量は７０ｋＤであり、ＩＬ－１２－ＡＢＤの分子量は１０７ｋＤである。 ＩＬ－１２－ＡＢＤ／ＩＬ－１２のインビボ研究における様々な群の腫瘍増殖速度論を示すグラフである。図２４Ａは、ＩＬ－１２およびＩＬ－１２－ＡＢＤ群における腫瘍サイズ評価の結果を示し、図２４Ｂは、ＩＬ－１２治療群を個別に示し、図２４Ｃは、ＩＬ－１２－ＡＢＤ治療群を個別に示す。 ＩＬ－１２－ＡＢＤ／ＩＬ－１２のインビボ研究の様々な群のそれぞれにおける個々の動物の腫瘍増殖速度論を示すグラフである。 ＩＬ－１２－ＡＢＤ／ＩＬ－１２のインビボ研究における様々な群の、治療後１０日目の腫瘍体積を示すグラフである。 ＩＬ－１２またはＩＬ－１２－ＡＢＤを用いた治療後の様々な時点での、Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍保有マウスにおける縦体重（左）および体重％（右）の測定値を示すグラフである。 ＩＬ－１２－ＡＢＤ／ＩＬ－１２のインビボ研究における様々な群のカルパン－マイヤー疑似生存曲線を提供するグラフである。 Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍保有マウスに対するＩＬ－１２－ＡＢＤ対ＩＬ－１２の単回投与の、５日目の薬力学的効果を比較した研究の概要を示すグラフである。腫瘍重量、脾臓重量、血清ＩＦＮ－γ、および体重の比較が示される。 ＩＬ－１２－ＡＢＤ（１．３μｇ）、ＩＬ－１２（３０μｇ）、またはプラセボのいずれかを注射した１０日目のＢ１６－Ｆ１０腫瘍保有マウスの腫瘍体積を比較した研究結果を示すグラフである。この研究において、ＩＬ－１２－ＡＢＤは、ＩＬ－１２よりも約３０倍低いモル用量で投与される。 ３日目と７日目の図３２に示される研究からのマウスにおけるＩＬ－１２－ＡＢＤおよびＩＬ－１２の造血作用をさらに示すグラフである。 Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍保有マウスにおける腫瘍増殖に対するＩＬ－１２－ＡＢＤまたはＩＬ－１２と抗ＰＤ－１抗体を使用した、単回投与併用治療の効果を示す研究を示すグラフである。 ＩＬ－１２ ＷＴに対するＩＬ１２－ＡＢＤについてのＰＫの増加を示す、血清分析の結果を示すグラフである。 本明細書に記載される例示的な主題のＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２の配列、１）ｈＩＬ－１５（Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ）－Ａ１０ｍ３－ｍＩＬ－１２ｓｃ、２）ｍＩＬ－１２ｓｃ－Ａ１０ｍ３－ｈＩＬ－１５（Ｋ８６Ｒ）、および３）ｍＩＬ－１２ｓｃ－Ａ１０ｍ３－ｈＩＬ－１５（Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ）を示す図である。 ｈＩＬ－１５（Ｋ８６Ｒ）－Ａ１０ｍ３－ｍＩＬ－１２ｓｃおよびｍＩＬ－１２ｓｃ－Ａ１０ｍ３－ｈＩＬ－１５（Ｋ８６Ｒ）両方の、ＭＳＡ（Ａ）、ＩＬ－１５受容体αおよびＩＬ－１２受容体β２（Ｂ）への、ＥＬＩＳＡによって確認された結合活性を示すグラフである。 本明細書に記載される追加の例示的な主題のＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２の配列、１）ｈＩＬ－１５（Ｋ８６Ｒ）－Ａ１０ｍ３－ｈＩＬ－１２ｓｃ、２）ｈＩＬ－１２ｓｃ－Ａ１０ｍ３－ｈＩＬ－１５（Ｋ８６Ｒ）、および３）ｈＩＬ－１２ｓｃ－Ａ１０ｍ３－ｈＩＬ－１５（Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ）を示す図である。 本明細書に記載されるＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２が、ＩＬ－１２（図３９）およびＩＬ－１５（図４０）活性の両方を示すことを示す実験結果を示す図である。 本明細書に記載されるＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２が、ＩＬ－１２－ＡＢＤ単独と比較して、優れた活性を示したことを示す研究結果を示すグラフである。 可変重鎖配列、可変軽鎖配列、およびｓｃＦｖフォーマット配列を含む、本明細書に記載される２つの例示的なＴＧＦβ結合ドメインの配列である４Ｈ７および４Ｄ９を示す図である。 本明細書に記載されるＴＧＦβ ｓｃＦｖが、ＴＧＦβ１誘導Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋）の増殖を遮断し得ることを示す研究結果を示す図である。 ＴＧＦ－β遮断が、ＴＧＦ－β１誘導の上皮から間葉への移行（図４４）および移動（図４５）を逆転させることを示す図である。（図４２Ａ）ＥＭＴ中のＥ－カドヘリンの損失およびビメンチンの誘導発現の図式表現である。（図４４Ｂ）マウス４Ｔ１細胞は、ＴＧＦ－β１単独、または１Ｄ１１（パネル３）、または抗ＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖ（パネル４）が補充された増殖培地中で培養され、次いで固定され、Ｅ－カドヘリン抗体（緑色）およびビメンチン抗体（紫）で染色された。核はＤＡＰＩ（青）で対比染色された。ＴＧＦ－β１を用いる治療によって、細胞間接合部からのＥ－カドヘリンの損失が誘導され、ビメンチンの発現が増加した。この効果は、本明細書に記載される１Ｄ１１または主題の抗ＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖの添加によって逆転する。図４３はさらに、本明細書に記載される主題の抗ＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖが、ＴＧＦ－β１媒介癌細胞移動を遮断することを示す。 本明細書に記載される主題の抗ＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖが、ヒト細胞（Ａ）およびマウス細胞（Ｂ）中のＴＧＦ－β媒介Ｓｍａｄ２リン酸化を阻害し得ることを示す研究の概要を提供する図である。Ａ中では、主題の抗ＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖは、用量依存的にヒト細胞におけるヒトＴＧＦ－β１媒介Ｓｍａｄ２リン酸化を阻害し得た。Ｂ中では、主題の抗ＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖは、マウス細胞におけるマウスＴＧＦ－β１、－β２、および－β３媒介Ｓｍａｄ２リン酸化を阻害し得た。 例示的なＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖ－ＡＢＤ構築物（４Ｄ９Ｍ－Ａ６ｍおよび４Ｈ７－Ａ６ｍ）の配列を示す図である。 抗ＴＧＦβ－１－ＡＢＤが、抗ＴＧＦβ－１ ｓｃＦｖを延長することを示す研究の概要を提供するグラフである。 大腸菌または哺乳動物（ＨＥＫ）細胞において産生される様々な抗ＴＧＦ－β１ｓｃＦｖ－ＡＢＤ（ＴＧＦ－β１の二価）が、マウス血清アルブミンに結合し得ることを示す研究の概要を提供するグラフである。 Ｔ細胞増殖のＴＧＦβ－１媒介阻害が、例示的なＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖ－ＡＢＤ構築物（４Ｄ９Ｍ－Ａ６ｍおよび４Ｈ７－Ａ６ｍ）によって逆転した（すなわち、Ｔ細胞増殖の増加）ことを示す研究の概要を提供する図である。 主題の融合タンパク質で使用され得る例示的なリンカーを示す図である。そのようなリンカーは、ＡＢＤ可変重鎖および可変軽鎖のｓｃＦｖリンカーとして使用され得る。そのようなリンカーはまた使用されて、本明細書に記載されるアルブミン結合ドメインを、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５融合パートナーに結合させ得る、またはＩＬ－１２融合パートナー（ｐ３５およびｐ４０）もしくはＩＬ－１５融合パートナー（ＩＬ－１５およびＩＬ－１５Ｒα）の構成要素を互いに接続し得る。 本明細書に記載されるＡＢＤ融合タンパク質に含まれ得る例示的なサイトカインのアミノ酸配列を提供する図である。ＡＢＤがＡ１０ｍ３である例示的なサイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質もまた、図４９Ａ～Ｇに示される。そのようなサイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質は、Ａ１０ｍ３ ＡＢＤで示されるが、本明細書に記載されるＡＢＤを含む任意のＡＢＤは、サイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質に含まれ得る。 本明細書に記載されるＡＢＤ融合タンパク質と共に使用され得る例示的な抗ＰＤ－Ｌ１結合ドメイン、１０Ｄ１２のアミノ配列を提供する図である。１０Ｄ１２は低ｐＨでｈＰＤ－Ｌ１に結合し、ｍＰＤ－Ｌ１と交差反応する。１０Ｄ１２はｈＰＤ－Ｌ２またはｍＰＤ－Ｌ２に結合しない。さらに、１０Ｄ１２はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用、およびＢ７１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断する。 いくつかの有用なサイトカイン－ＡＢＤ－サイトカイン（Ａ）および結合部分－ＡＢＤ－サイトカイン／結合部分（Ｂ）の組み合わせを示す図である。各組み合わせの「Ａ」と「Ｂ」は、反対の方向に切り替えることができる。サイトカイン－ＡＢＤ－サイトカインおよび結合部分－ＡＢＤ－サイトカイン／結合部分の組み合わせに含まれ得るリンカー－Ａ１０ｍ３－リンカー骨格もまた、これらの図に示される。Ａ１０ｍ３ ＡＢＤが示されているが、本明細書に示されるもののいずれか（例えば、図２）を含む任意のＡＢＤは、そのような構築物において使用され得る。
Ａ．概要
サイトカインおよび抗体系治療薬を含む生物製剤は、癌の治療に有用である。
現在および潜在的なサイトカイン系治療薬には、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１ ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮ－αを利用する治療薬が含まれる。
ＩＬ－１２は、炎症誘発性の内因性抗腫瘍免疫応答の強化に適合する様式で、免疫エフェクター機能を媒介することができる。（例えば、Ｂｏｇｇｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８８：５８９－９６（１９９８）、Ｃａｖａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９：４１４－２１（１９９９）、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：８５５－６５（１９９６）、Ｎａｓｔａｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３：１６９７：７０６（１９９４）、Ｂｒｕｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７８：１２２３－３０（１９９３）を参照されたい。）ＩＬ－１２は、炎症性Ｔｈ１ ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性を強化することが知られている。研究はまた、ＩＬ－１２により媒介されるＩＦＮγのＴ細胞分泌が、Ｔ細胞アネルギーを逆転させ得、エフェクターＴ細胞耐性を免疫抑制性調節性Ｔ細胞に付与し得ることも示している。ＩＬ－１２は、適応免疫系および自然免疫系を活性化する能力だけでなく、免疫に敵対する腫瘍微小環境をさらに調節する能力により、ＩＬ－１２は腫瘍免疫療法の理想的な候補になる。
ＩＬ－１５は、腫瘍内部のＴ細胞増殖を刺激することができ（例えば、Ｍｉｅｃｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ６（２２８）：２２８ｒａ３７（２０１４）を参照されたい）、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の生存性を延長し、ＮＫ細胞の発生にとって重要である。したがって、ＩＬ－１５は、チェックポイント阻害剤およびＴ細胞を利用して癌細胞を攻撃する他の免疫療法の効力を高め得ると考えられている。しかし、ＩＬ－１５モノマーのインビボにおける半減期は短く、４０分未満である。ＩＬ－１５モノマーの修飾は、癌の治療におけるインビボの薬物動態を改善し得る。これらの修飾は、一般的に、ＩＬ－１５受容体のαサブユニットであるＩＬ－１５Ｒαを用いるＩＬ－１５のトランス提示の改善に集中している。そのような修飾には、１）ＩＬ－１５：ＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃ複合体を形成するための、ＩＬ－１５とその可溶性受容体ａ－サブユニット－Ｆｃ融合体との事前会合（例えば、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０３：９１６６－７１（２００６）を参照されたい。）、２）ハイパーアゴニストＩＬ－１５－ｓＩＬ－１５Ｒα－スシタンパク質の発現（例えば、Ｂｅｓｓａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：２７３６－４５（２００９）を参照されたい）、および３）ヒトＩＬ－１５変異体ＩＬ－１５Ｎ７２ＤとＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃスシ－Ｆｃ融合複合体との事前会合（例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８３：３５９８－６００７（２００９）を参照されたい）が含まれる。
Ｔ細胞の活性化を制限する腫瘍表面抗原と阻害信号を標的とするものを含むモノクローナル抗体系治療は、２０年以上にわたり癌治療法の標準的な構成要素であった。例えば、Ｗｅｉｎｅｒ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １５（６）：３６１－３７０（２０１５）を参照されたい。
短い循環半減期は、サイトカインおよび抗体系治療薬を含む多くの生物製剤にとって大きな障害となる。例えば、Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ－Ｓｙｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：６８９－６９８（２０１３）、およびＰｅｒｄｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ ２１：２９７－３０７（２０１０）を参照されたい。そのような短時間作用型治療薬には、特に慢性疾患の場合、クリニックへの適用性を低減させ得る頻繁な投与プロファイルが必要である。治療上適切な血清濃度を達成するための分子の繰り返しの注射の必要性を低減させるため、長い血清半減期が望ましい。治療用タンパク質の半減期の延長方法には、ＰＥＧ化、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）への融合、ヒト免疫グロブリンＩｇＧの定常断片（Ｆｃ）への融合、ＸＴＥＮなどの非構造化融合タンパク質への融合が含まれる。例えば、Ｓｔｏｈｌ、ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２９（４）：２１５－２３９（２０１５）を参照されたい。半減期延長技術によって、頻繁な投薬の費用および負担を軽減する改善されたまたは新規な生物学的治療が可能になる。したがって、タンパク質およびペプチド系治療薬の半減期を延長し得る新規試薬および方法が引き続き必要とされている。
生物製剤（例えば、インターロイキンおよび抗体）の半減期を延長するのに有用な新規アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）融合タンパク質が、本明細書で提供される。血清アルブミンは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した再利用によって、２～４週間の範囲の長い半減期を有する。アルブミンは、マクロピノサイトーシスを介して内皮細胞によって取り込まれ、初期エンドソームの酸性環境内でｐＨ依存的にＦｃＲｎに結合する。アルブミン－ＦｃＲｎ結合は、リソソーム区画内で分解からアルブミン分子をそらし、アルブミン分子を形質膜に向け直し、そこで中性ｐＨによって血漿に戻される。
本明細書に記載されるアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）は、アルブミン結合に関してＦｃＲＮと競合せず、アルブミンに結合したときに、ＡＢＤがＦｃＲｎ駆動エンドソームアルブミン再利用を受けることも可能にするｐＨ範囲でアルブミンに結合する。したがって、主題のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む生物製剤は、アルブミン－ＦｃＲｎ経路を使用してリソソーム分解を回避することができ、その結果、ＡＢＤを欠く対応物よりも長い血清半減期を示す。
さらに、そのようなＡＢＤ含有治療薬は、有利なことに、高レベルの血清アルブミンを含有することが知られている腫瘍に局在化する。したがって、そのようなＡＢＤ含有治療薬は、癌の治療に特に有用である。
Ｂ．アルブミン結合ドメイン
一態様では、アルブミン結合ドメインを含む組成物が、本明細書で提供される。本明細書で使用される「血清アルブミン」とは、血液中のステロイド、脂肪酸、および甲状腺ホルモンの担体タンパク質として主に機能する、肝臓によって産生される球状タンパク質のファミリーのメンバーを指す。血清アルブミンはまた、血漿の膠質浸透圧に寄与することにより細胞外液量の安定化にも主要な役割を果たし、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００４７７およびＮＰ＿０００４６８）、およびマウス血清アルブミン（ＭＳＡ、Ｇｅｎｂａｎｋ 受託番号：ＮＭ＿００９６５４およびＮＰ＿００３３７８４）が含まれるが、これらに限定されない。アルブミンの構造は、いくつかの長いαヘリックスによって特徴付けられ、疎水性化合物の１１個の異なる結合ドメインを含有している。ヒトにおいては、血清アルブミンはＡＬＢ遺伝子によってコードされている。
主題のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含む融合タンパク質は、血清アルブミン（ＳＡ）に結合することができ、これによりマクロピノサイトーシスによって細胞に融合タンパク質を取り込むことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＤは、約ｐＨ５．５～約ｐＨ７．２のｐＨ範囲で結合する。初期エンドソームにおいて、そのようなＳＡ結合ＡＢＤ融合タンパク質は、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．５）でＳＡを介してＦｃＲｎに結合し、次に、これにより、細胞のリソソーム区画からＳＡ結合ＡＢＤ融合タンパク質をそらし、形質膜に戻る。形質膜で、ＳＡは、中性ｐＨ（例えば、ｐＨ７．１～７．５）によりＦｃＲｎから解離し、ＳＡおよびＡＢＤ融合タンパク質が放出されて血流に戻る。主題のＡＢＤを含む治療薬は、約ｐＨ５．５～約ｐＨ７．２のｐＨ範囲でアルブミンに結合することができるので、そのような治療薬は、有利なことに、ＦｃＲｎ駆動エンドソームアルブミン再利用も受け、したがって、リソソーム分解を回避する。したがって、そのようなＡＢＤを含む治療薬は、有利なことに、ＡＢＤを欠く対応物よりも長い血清半減期を示す。そのような治療薬は、高レベルの血清アルブミンを含有することが知られている癌の治療に特に有用である。
いくつかの実施形態では、アルブミン結合ドメインは、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）へのＳＡの結合を妨げない部位でアルブミンに結合する。本明細書で使用される「ＦｃＲｎ」または「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に連結し、少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。当該技術分野において既知のように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば重鎖および軽鎖と呼ばれる２つの融合タンパク質を含む。軽鎖はβ－２－ミクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされている。本明細書において別段の記載がない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とβ－２－ミクログロブリンとの複合体を指す。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載または例示されるアルブミン結合ドメインは、好ましくは、血清アルブミン分子とＦｃＲｎとの相互作用に関与しない血清アルブミン分子上のエピトープで血清アルブミン（例えば、ＨＳＡ）に特異的に結合する。したがって、血清アルブミン分子へのＳＡ結合部分の結合は、好ましくは、血清アルブミン分子（例えば、ＨＳＡ）とＦｃＲｎとの結合を実質的に妨害、阻害、防止、さもなければ低減させない。好ましくは、アルブミン結合ドメインは、血清アルブミン分子への結合についてＦｃＲｎと競合しない。好ましくは、アルブミン結合ドメインは、血清アルブミンのＦｃＲｎへの結合を立体的に阻害しない。好ましくは、ＳＡ結合部分は、アルブミンがＦｃＲｎと相互作用できないように血清アルブミン分子の立体配座を変化させない。
いくつかの実施形態では、アルブミン結合ドメインは、５．０±０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０のｐＨでＳＡ（例えばＨＳＡ）に結合する。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ドメインは、約ｐＨ５．５～約ｐＨ７．２のｐＨ範囲でＳＡに結合する。いくつかの実施形態では、ＳＡ結合部分は、５．５のｐＨでＳＡに結合する。
特定の実施形態では、アルブミン結合ドメインは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメインである。ＨＳＡ結合ドメインには、ＨＳＡ分子全体またはＨＳＡの断片などのＨＳＡ分子に結合できるアルブミン結合ドメインが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、ＨＳＡ結合ドメインはまた、マウス血清アルブミンにも結合する。いくつかの態様では、ＨＳＡ結合ドメインはまた、カニクイザルアルブミンにも結合する。特定の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合しない。
本明細書で提供されるアルブミン結合ドメインには、可変重鎖単独、または可変軽鎖と共同した可変重鎖が含まれ得る。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ドメインには、可変重鎖が含まれる。特定の実施形態では、可変重鎖には、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３（可変重鎖相補性決定領域１～３）が含まれる。特定の実施形態では、抗原結合ドメインには、可変軽鎖も含まれる。特定の実施形態では、可変軽鎖には、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３（可変軽鎖相補性決定領域１～３）が含まれる。
いくつかの実施形態では、アルブミン結合ドメインには、図２に示される可変重鎖のいずれかのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ドメインには、図２Ｄに示されるようなＡ１０ｍ３可変重鎖のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３が含まれる。特定の実施形態において、アルブミン結合ドメインには、図２Ｄに示されるようなＡ１０ｍ３のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３が含まれる。
特定の実施形態では、アルブミン結合ドメインには、可変軽鎖も含まれる。例示的な実施形態では、アルブミン結合ドメインには、図２に示される可変軽鎖のいずれかのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖が含まれる。いくつかの実施形態において、アルブミン結合ドメインには、図２Ｄに示されるようなＡ１０ｍ３可変軽鎖のｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３が含まれる。特定の実施形態において、アルブミン結合ドメインには、図２Ｄに示されるようなＡ１０ｍ３のｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３が含まれる。
特定の実施形態では、アルブミン結合ドメイン（例えば、ＨＳＡ結合ドメイン）は、抗体または抗体断片である。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ドメイン（例えば、ＨＳＡ結合ドメイン）は、ｓｃＦｖである。
ＡＢＤが、可変重鎖および可変軽鎖の両方を含むいくつかの実施形態では、可変重鎖および可変軽鎖は、リンカー（例えば、ｓｃＦｖリンカー）によって互いに結合している。特定の実施形態では、リンカーは、そのＣ末端で可変重鎖に結合し、そのＮ末端で可変軽鎖に結合している。好適なリンカーは、本明細書および図４８に記載される。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘリンカーであり、ｘは１、２、３、４、５、６、７、または８である。特定の実施形態では、リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーである。
特定の実施形態では、アルブミン結合ドメインには、Ａ１０ｍ３のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、ならびにＡ１０ｍ３のｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖も含まれる（図２Ｄ）。一実施形態では、アルブミン結合ドメインには、図２Ｄに示されるＡ１０ｍ３ ＡＢＤの可変重配列および可変軽配列が含まれる。
Ｃ．インターロイキン－１５多様体
別の態様では、野生型ＩＬ－１５と比較して、改善されたインビボ安定性および／または生物活性を有する多様体ＩＬ－１５を含む組成物が、本明細書で提供される。
本明細書で使用される「インターロイキン１５」、「ＩＬ－１５」、および「ＩＬ１５」は全て、ＩＬ－１５特異的受容体α鎖、ＩＬ－２／ＩＬ－１５受容体β鎖（ＣＤ１２２）、および一般的なγ鎖（γＣ、ＣＤ１３２）からなる複合体に結合し、それを介して信号を出すインターロイキンを指す（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００００５８５およびＮＰ＿０００５７６（ヒト）、ならびにＮＭ＿００１２５４７４７およびＮＰ＿００１２４１６７６（マウス））。
ＩＬ－１５は、腫瘍内部のＴ細胞増殖を刺激することが示されている（例えば、Ｍｉｅｃｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ６（２２８）：２２８ｒａ３７（２０１４）を参照されたい）。ＩＬ－１５はまた、エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の生存性を延長することもでき、ＮＫ細胞の発生にとって重要である。ＩＬ－１５は、チェックポイント阻害剤およびＴ細胞を利用して癌細胞を攻撃する他の免疫療法の効力を高め得ると考えられている。したがって、特定の動作理論に拘束されることなく、本明細書に記載されるＩＬ－１５は、癌の治療に有用であると考えられている。
しかし、ＩＬ－１５モノマーのインビボにおける半減期は短く、４０分未満である。ＩＬ－１５モノマーの修飾は、癌の治療におけるインビボの薬物動態を改善し得る。これらの修飾は、一般的に、ＩＬ－１５受容体のαサブユニットであるＩＬ－１５Ｒαを用いるＩＬ－１５のトランス提示の改善に集中している。そのような修飾には、１）ＩＬ－１５：ＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃ複合体を形成するための、ＩＬ－１５とその可溶性受容体ａ－サブユニット－Ｆｃ融合体との事前会合（例えば、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０３：９１６６－７１（２００６）を参照されたい。）、２）ハイパーアゴニストＩＬ－１５－ｓＩＬ－１５Ｒα－スシタンパク質の発現（例えば、Ｂｅｓｓａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：２７３６－４５（２００９）を参照されたい）、および３）ヒトＩＬ－１５変異体ＩＬ－１５Ｎ７２ＤとＩＬ－１５Ｒα－Ｆｃスシ－Ｆｃ融合複合体との事前会合（例えば、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８３：３５９８－６００７（２００９）を参照されたい）が含まれる。
いくつかの態様では、ＩＬ－１５は、野生型ＩＬ－１５と比較して、安定性が向上した親ＩＬ－１５の多様体である。特定の実施形態では、多様体ＩＬ－１５は、野生型ヒトＩＬ－１５の多様体である。例示的な実施形態では、多様体ＩＬ－１５には、図３に示される親ＩＬ－１５の位置Ｋ８６にアミノ酸置換が含まれる。本明細書に記載されるように、Ｋ８６は、特定の細胞型（例えば、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞）を使用して作製される場合、ユビキチン依存性分解の推定部位である（実施例２を参照されたい）。したがって、特定の動作理論に拘束されることなく、アミノ酸置換によるＫ８６ユビキチン化部位の除去によって、ＩＬ－１５の安定性が改善されると考えられている（実施例２および３を参照されたい）。
特定の実施形態では、ＩＬ－１５は、位置Ｎ１１２にアミノ酸置換を有する多様体ＩＬ－１５である。特にＩＬ－１５がＡＢＤに結合している場合、適切なＩＬ－１５／ＩＬ－１５受容体γ相互作用にとって重要であるため、アミノ酸位置Ｎ１１２はＩＬ－１５生物活性の重要な部位である。したがって、特定の動作理論に拘束されることなく、位置Ｎ１１２の変異体は、腫瘍環境におけるＴ細胞増殖の促進、ＣＤ８＋Ｔ細胞の生存性の強化、およびＮＫ細胞の発生の促進を含むが、これらに限定されないＩＬ－１５の１つ以上の機能を強化できると考えられている。
ＩＬ－１５のインビボ安定性および／または生物活性を改善することができる特定のアミノ酸置換には、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｒ、Ｎ１１２Ａ、Ｎ１１２Ｓ、Ｎ１１２Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ｓ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ｓ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｄ、およびＫ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑが含まれるが、これらに限定されない。そのようなアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む例示的な多様体ＩＬ－１５が図３に示される。例示的な実施形態では、多様体ＩＬ－１５には、アミノ酸置換Ｋ８６ＡおよびＮ１１２Ａが含まれる。
一実施形態では、本明細書に記載されるＩＬ－１５（野生型および多様体ＩＬ－１５）は、ＩＬ－１５Ｒαに結合している。その受容体とトランスで提示されるそのようなＩＬ－１５は、ネイティブＩＬ－１５単独と比較して、延長された半減期およびより高い効力を有することが示されている。例えば、Ｗｕ、Ｊ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ ７、８５（２０１３）を参照されたい。
Ｄ．ＩＬ－１２
別の態様では、ＩＬ－１２を含む組成物が、本明細書で提供される。本明細書で使用される「インターロイキン１２」、「ＩＬ－１２」、および「ＩＬ１２」は全て、ＩＬ－１２ＡおよびＩＬ－１２Ｂ遺伝子によってコードされるヘテロダイマーサイトカインであるインターロイキンを指す（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００８８２（ＩＬ－１２Ａ）およびＮＭ＿００２１８７（ＩＬ－１２Ｂ））。ＩＬ－１２は、４つのαヘリックスのバンドルから構成され、ネイティブＴ細胞のＴＨ１細胞への分化に関与している。ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２受容体に結合し、ＩＬ－１２受容体は、ＩＬ－１２Ｒ－β１およびＩＬ－１２Ｒ－β２によって形成されるヘテロ二量体受容体である。ＩＬ－１２は、Ｔ細胞の増殖と機能を刺激できるＴ細胞刺激因子として知られている。具体的には、ＩＬ－１２は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からのインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）の産生を刺激することができ、ＩＬ－４媒介によるＩＦＮ－γの抑制を低減させる。ＩＬ－１２は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞傷害活性の強化をさらに媒介し得る。さらに、ＩＬ－１２は、インターフェロンγの産生を増加させることにより抗血管新生活性を有することもでき、次に、これにより、ケモカイン誘導性タンパク質－１０（ＩＰ－１０またはＣＸＣＬ１０）の産生を増加させる。次いで、ＩＰ－１０は、この抗血管新生効果を媒介する。特定の動作理論に拘束されることなく、免疫応答を誘導する能力および抗血管新生活性を介したＩＬ－１２が使用されて、癌を治療することができると考えられている。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２はマウスＩＬ－１２である。他の実施形態では、ＩＬ－１２はヒトＩＬ－１２である。
特定の実施形態では、ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットに結合したＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットを含む単鎖ＩＬ－１２ポリペプチドである。そのようなＩＬ－１２単鎖ポリペプチドは、有利なことに、野生型ＩＬ－１２の生物活性の１つ以上を保持する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される単鎖ＩＬ－１２ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、式（ｐ４０）－（Ｌ）－（ｐ３５）によるものであり、式中、「ｐ４０」はＩＬ－１２ ｐ４０サブユニットであり、「ｐ３５」はＩＬ－１２ ｐ３５サブユニットであり、Ｌはリンカーである。他の実施形態では、単鎖ＩＬ－１２は、Ｎ末端からＣ末端へ、式（ｐ３５）－（Ｌ）－（ｐ４０）によるものである。任意の好適なリンカーは、本明細書に記載され、図４９Ｃに開示されるものを含む単鎖ＩＬ－１２ポリペプチド内で使用され得る。好適なリンカーには、例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｘを有し、式中、ｘが１～１０の整数であるリンカーが含まれ得る。他の好適なリンカーには、例えば、アミノ酸配列ＧＧＧＧＧＧＳが含まれる。主題の単鎖ＩＬ－１２ポリペプチドと共に使用され得る例示的な単鎖ＩＬ－１２リンカーは、Ｌｉｅｓｃｈｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：３５－４０（１９９７）にも記載されており、それは、特に、ＩＬ－１２ポリペプチドリンカーの教示について、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
例示的な実施形態では、単鎖ＩＬ－１２ポリペプチドは、単鎖ヒトＩＬ－１２ポリペプチド（すなわち、ヒトｐ３５およびｐ４０ ＩＬ－１２サブユニットを含む）である。特定の実施形態では、単鎖ＩＬ－１２ポリペプチドは、単鎖マウスＩＬ－１２ポリペプチドである。例示的な単鎖ヒトおよびマウスＩＬ－１２は、図２０（ＡＢＤとの融合ペプチドとして示される）および４９Ｃに示される。
Ｅ．ＡＢＤ融合タンパク質
一態様では、リンカーを介して１つ以上の融合パートナー（例えば、第１の融合パートナー、第２の融合パートナーなど）に結合したアルブミン結合ドメインを含むＡＢＤ組成物が、本明細書で提供される。本明細書で議論されるように、主題のＡＢＤ融合タンパク質は、ＦｃＲｎ媒介エンドソーム再利用の下で、したがって有利なことに、そのようなＡＢＤを含まない対応物と比較して、延長された半減期を示し得る。
そのようなＡＢＤ融合タンパク質に有用なＡＢＤには、本明細書に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない。ｖｈＣＤＲ１～３、ｖｌＣＤＲ１～３、可変重鎖、および可変軽鎖配列を含む、そのようなＡＢＤのアミノ酸配列は、例えば図２に開示される。いくつかの実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質には、図２のＡＢＤ可変重鎖のいずれかのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、ならびに図２のＡＢＤ可変軽鎖のいずれかのｖｌＣＤＲ１、ｖ１ＣＤＲ２、およびｖＣＤＲ３を含む可変軽鎖が含まれる。特定の実施形態では、ＡＢＤには、図２に開示されるＡＢＤのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を有する可変重鎖、ならびに図２に開示されるＡＢＤのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を有する可変軽鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質には、図２に開示されるＡＢＤの可変重鎖および可変軽鎖が含まれる。
例示的な実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質には、Ａ１０ｍ３可変重鎖のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、ならびにＡ１０ｍ３可変軽鎖のｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖＣＤＲ３を含む可変軽鎖（図２Ｄ）が含まれる。特定の実施形態では、ＡＢＤには、Ａ１０ｍ３のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を有する可変重鎖、ならびにＡ１０ｍ３のｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を有する可変軽鎖（図２Ｄ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質には、Ａ１０ｍ３の可変重鎖および可変軽鎖（図２Ｄ）が含まれる。
本明細書に記載されるＡＢＤ融合タンパク質には、融合パートナーが含まれる。いくつかの実施形態では、融合パートナーには、２つの融合パートナー（第１の融合パートナー（ＦＰ１）および第２の融合パートナー（ＦＰ２））が含まれる。２つの融合パートナーを含む実施形態では、融合パートナーは、いくつかの方向でＡＢＤに結合することができる。いくつかの実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、式ＦＰ１－ＡＢＤ－ＦＰ２、ＦＰ１－ＰＦ２－ＡＢＤまたはＡＢＤ－ＦＰ１－ＦＰ２によるものであり、式中、ＦＰ１は第１の融合パートナーであり、ＦＰ２は第２の融合パートナーである。
融合パートナーの半減期の延長が望まれる任意の好適な融合パートナーは、主題のＡＢＤ融合タンパク質に含まれ得る。融合パートナーには、例えば、サイトカイン（例えば、インターフェロンおよびインターロイキン）、増殖因子、ポリペプチド、タンパク質、およびホルモン（例えば、増殖ホルモン、副甲状腺ホルモン）を含まれ得る。
特定の実施形態では、融合パートナーは、可変重鎖および可変軽鎖を含む抗体系結合部分である。そのような結合部分は、例えば、腫瘍特異的標的またはサイトカインを含む関心のある任意の標的に結合し得る。例示的な実施形態では、融合パートナーは単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。抗体系融合パートナーには、ｄｓ－ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ダイアボディ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、および全長抗体も含まれるが、これらに限定されない。抗体系融合パートナーには、多重特異性（例えば、二重特異性）抗体および断片も含まれる。
本明細書に記載される主題のＡＢＤ融合タンパク質は、構成要素間（ＡＢＤおよび融合パートナー）および構成要素内のリンカーを利用する。例えば、ｓｃＦｖ融合パートナーは、一般にグリシンとセリンに基づく標準的なペプチドリンカーを利用して、変異型重鎖と軽鎖を結合させて、ｓｃＦｖを形成する。さらに、標準的なペプチドリンカーが利用されて、ＡＢＤを融合パートナー（例えば、サイトカイン融合パートナー）に結合させる。さらに、リンカーが使用されて、特定の部分の構成要素、例えばＩＬ－１２およびＩＬ－１５のｐ３５およびｐ４０サブユニットをＩＬ－１５Ｒαに結合させる。いくつかの実施形態では、リンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘリンカーであり、ｘは１、２、３、４、６、７、または８である。特定の実施形態では、ＡＢＤは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５リンカーによって融合パートナーに接続される。
本明細書に示されるように、組換え技術によって生成される従来のペプチド結合を含めて、使用され得る好適なリンカーは、ある数存在する。リンカーペプチドは、主に、以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒを含み得る。リンカーペプチドは、それらが所望の活性を保持するように互いに対して正しい立体配座をとるような方法で２つの分子を結合させるのに十分な長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは、約１～５０アミノ酸長、好ましくは約１～３０アミノ酸長である。一実施形態では、１～２０アミノ酸長のリンカーが使用されてもよく、いくつかの実施形態では、約５～約１０アミノ酸が有用である。有用なリンカーには、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎ（ｎは少なくとも１（および一般に３～４）の整数である）を含むグリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、ならびに他の可動性リンカーが含まれる。代替的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーが、リンカーとして有用であり得、すなわちリンカーとして有用であり得る。
他のリンカー配列は、任意の長さのＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の配列を含むが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの全ての残基を含まない場合があり、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５～１２アミノ酸残基である。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えば、ＣκまたはＣλに由来し得る。リンカーは、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、およびＣμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来配列、および他のタンパク質由来の他の天然配列などの他のタンパク質に由来してもよい。
多くの場合、リンカーは、細胞外環境に対して実質的に敏感ではない。本明細書で使用される、リンカーの文脈における「細胞外環境に実質的に敏感ではない」とは、約２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、または約１％以下の抗体薬物コンジュゲート化合物の試料中のリンカーは、抗体－薬物コンジュゲート化合物が細胞外環境（例えば、血漿中）に存在すると切断されることを意味する。
リンカーが細胞外環境に対して実質的に敏感ではないかどうかは、例えば、所定の時間（例えば、２、４、８、１６、または２４時間）抗体－薬物コンジュゲート化合物を血漿と共にインキュベートして、次いで、血漿中に存在する遊離薬物の量を定量することにより決定することができる。
他の、相互に排他的でない実施形態では、リンカーは細胞内在化を促進する。特定の実施形態では、リンカーは、治療薬にコンジュゲートした場合（すなわち、本明細書に記載されるような抗体－薬物コンジュゲート化合物のリンカー治療薬部分の環境において）、細胞内在化を促進する。さらに他の実施形態では、リンカーは、オーリスタチン化合物と本発明のＡＢＤ融合タンパク質の両方にコンジュゲートした場合、細胞内在化を促進する。
本組成物および方法で使用され得る様々な例示的なリンカーは、国際特許出願第２００４／０１０９５７号、米国特許公開第２００６／００７４００８号、米国特許公開第２００５／０２３８６４９号、および米国特許公開第２００６／００２４３１７号（これらのそれぞれは、全ての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ドメインリンカー、ｓｃＦｖリンカー、ならびに特定の融合パートナーの結合構成要素として、主題のＡＢＤと共に利用され得る例示的なリンカーが、さらに図４８に示される。
いくつかの実施形態では、リンカーとは、本明細書に概説されるような任意の２つのドメイン（例えば、サイトカイン融合パートナー（例えば、インターロイキン）およびＡＢＤ）を共に結合するために使用される「ドメインリンカー」である。任意の適切なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１（および一般に３～４～５）である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン－セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さおよび柔軟性を有する２つのドメインの組換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。
いくつかの実施形態では、融合パートナーは、可変重鎖および可変軽鎖を含むｓｃＦｖである。そのような実施形態では、ＡＢＤ可変重鎖は、ｓｃＦｖリンカーを用いて可変軽鎖に結合している。
例示的なＡＢＤ融合タンパク質は、以下でさらに議論される。
１．サイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質
いくつかの実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質には、サイトカイン融合パートナー、すなわち、サイトカイン－アルブミン結合ドメイン（サイトカイン－ＡＢＤ）融合タンパク質（図１）が含まれる。いくつかの実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質には、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２７、ＧＭ－ＣＳＦまたはＩＦＮ－αが含まれる。主題のサイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質は、そのような免疫調節効果が必要な対象における免疫調節効果に有用である（例えば、癌または自己免疫疾患の治療）。さらに、主題のサイトカイン－ＡＢＤは、インターロイキン治療薬単独と比較して、より長い半減期と改善された薬物動態特性を示す。
本明細書に記載される主題のサイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質と共に、任意のＡＢＤが使用され得る。いくつかの実施形態では、ＡＢＤには、ＡＢＤ可変重鎖が含まれる。特定の実施形態では、ＡＢＤには、ＡＢＤ可変軽鎖が含まれる。例示的な実施形態では、ＡＢＤは、リンカー（例えば、本明細書および図４８に開示されるリンカーのうちのいずれか）によって可変軽鎖に結合した可変重鎖を含むｓｃＦｖである。
特定の実施形態では、可変重鎖には、図２に示されるこれらのＡＢＤ可変重鎖を含む、本明細書に記載されるＡＢＤ可変重鎖のうちのいずれかのｖｈＣＤＲ１～３が含まれる。特定の実施形態では、ＡＢＤ可変重鎖には、Ａ１０ｍ３可変重鎖のｖｈＣＤＲ１～３（図２Ｄ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＢＤ可変重鎖には、図２Ｄに示されるようなＡ１０ｍ３ ｖｈＣＤＲ１～３が含まれる。例示的な実施形態では、ＡＢＤ可変重鎖は、Ａ１０ｍ３可変重鎖のアミノ酸配列を有する。
特定の実施形態では、ＡＢＤには、ＡＢＤ可変軽鎖が含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＢＤ可変軽鎖には、図２に示されるこれらのＡＢＤ可変軽鎖を含む、本明細書に記載されるＡＢＤ可変軽鎖のうちのいずれかのｖｌＣＤＲ１～３が含まれる。特定の実施形態では、ＡＢＤ可変軽鎖には、Ａ１０ｍ３可変軽鎖のｖｌＣＤＲ１～３（図２Ｄ）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＢＤ可変軽鎖には、図２Ｄに示されるようなＡ１０ｍ３ ｖｌＣＤＲ１～３が含まれる。例示的な実施形態では、ＡＢＤ可変軽鎖は、Ａ１０ｍ３可変軽鎖の配列を有する。
主題のサイトカイン－ＡＢＤ融合体中で使用され得る例示的なサイトカインのアミノ酸配列、ならびにＡＢＤがＡ１０ｍ３である例示的なサイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質は、図４９Ａ～Ｇに示される。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－ＡＢＤは、Ｎ末端からＣ末端へ、式サイトカイン－Ｌ－ＡＢＤまたはＡＢＤ－Ｌ－サイトカインによるものであり、式中、ＬはサイトカインをＡＢＤに結合させるリンカー（例えば、ペプチドリンカー）である。特定の実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤは、可変重鎖を含み、サイトカインは、ＡＢＤ可変重鎖のＮ末端に結合している。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＡＢＤ可変重鎖のＣ末端に結合している。例示的な実施形態では、インターロイキン－ＡＢＤには、可変軽鎖（例えば、ＡＢＤ ｓｃＦｖ）も含むＡＢＤが含まれる。いくつかの実施形態では、サイトカインは、可変軽鎖のＣ末端に結合している。特定の実施形態では、サイトカインのＮ末端は、ＡＢＤに結合している。他の実施形態では、サイトカインのＣ末端は、ＡＢＤに結合している。
特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２７、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＦＮ－αから選択されるサイトカインである。サイトカイン分子には、例えば、全長サイトカイン、およびサイトカイン断片、例えば、特定のサイトカインの機能に重要な部分（例えば、その受容体に結合するインターロイキンの部分）が含まれる。
いくつかの実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤには、ＩＬ－２分子またはその断片が含まれる。本明細書で使用される「インターロイキン２」、「ＩＬ－２」、および「ＩＬ２」とは、４個のαヘリックスバンドルを有するサイトカインのメンバーを指し、ＩＬ－２受容体を介して信号を出す（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００５８６およびＮＰ＿０００５７７（ヒト）、ならびにＮＭ＿００８３６６およびＮＰ＿０３２３９２（マウス））。ＩＬ－２は、主にＴ細胞への直接的な影響を介して、免疫系の機能、耐性、免疫に重要な役割を果たす。胸腺において、ＩＬ－２は、特定の未熟なＴ細胞の調節性Ｔ細胞への分化を促進することによって、自己免疫疾患を防止し、それは、体内で通常の健康な細胞を攻撃するために準備されている他のＴ細胞を殺す。ＩＬ－２は、癌（悪性黒色腫、腎細胞癌）の治療に大量の断続的投与で使用されており、連続投与で広く使用されている。例示的なＩＬ－２－ＡＢＤが、図４９Ａに示される。
いくつかの態様では、サイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質には、ＩＬ－７分子またはその断片が含まれる。本明細書で使用される「インターロイキン７」、「ＩＬ－７」、および「ＩＬ７」（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００８８０およびＮＰ＿０００８７１（ヒト）、ならびにＮＭ＿００８３７１およびＮＰ＿０３２３９７（マウス））は全て、骨髄および胸腺の間質細胞によって分泌され、ＩＬ－７受容体に結合する造血増殖因子であるサイトカインのメンバーを指す。インターロイキン－７（ＩＬ－７）は、適応免疫系において中心的な役割を果たす非造血細胞由来のサイトカインである。それは、末梢におけるナイーブおよびメモリーＴ細胞の恒常性の生存を維持する胸腺において、リンパ球の発生を促進する。さらに、リンパ節（ＬＮ）の器官形成、および二次リンパ器官（ＳＬＯ）に補充される活性化Ｔ細胞の維持にとって重要である。ＩＬ－７は、末梢Ｔ細胞の増殖を促進することによって、免疫抑制された癌患者の免疫再構成に理想的な解決策である。動物モデルにおいて、ＩＬ－７は、腫瘍保有宿主の生存を延長することが証明されている。例示的なＩＬ－７－ＡＢＤが、図４９Ｂに示される。
特定の実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤには、ＩＬ－１２分子またはその断片が含まれる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２は、本明細書に記載されるような、図２０（ＡＢＤとの融合ペプチドとして示される）および４９Ｃに示されるような単鎖ＩＬ－１２である。
特定の実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤには、ＩＬ－１５分子またはその断片が含まれる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５－ＡＢＤには、本明細書ならびに図３および４に記載されるような多様体ＩＬ－１５が含まれる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５は、図３に示されるような野生型ＩＬ－１５（例えば、「親ＩＬ－１５」）である。特定の実施形態では、野生型ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）に結合している。
特定の実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤには、ＩＬ－２１分子またはその断片が含まれる。本明細書で使用される「インターロイキン２１」、「ＩＬ－２１」、および「ＩＬ２１」（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１２０７００６およびＮＰ＿００１１９３９３５（ヒト）、ならびにＮＭ＿０００１２９１０４１およびＮＰ＿００１２７７９７０（マウス））は全て、ＩＬ－２１受容体に結合し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞傷害性細胞を含む免疫系の細胞に強力な調節性効果を有し、ウイルス感染細胞または癌細胞を破壊し得るＩＬ－２１受容体に結合するサイトカインのメンバーを指す。したがって、特定の動作理論に拘束されることなく、ＩＬ－２１を有する主題のサイトカイン－ＡＢＤは、様々な癌の治療に有用であると考えられている。例示的なＩＬ－２１－ＡＢＤが、図４９Ｅに示される。
主題のサイトカイン－ＡＢＤに含まれ得る他の有用なサイトカインには、ＩＬ－２７、ＩＦＮ－α、およびＧＭ－ＣＳＦが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、インターロイキン－ＡＢＤポリペプチドには、インターフェロン－α、インターフェロン－β、またはＧＭ－ＣＳＦ分子も含まれる。そのような分子は、腫瘍への送達および毒性の低減に有用である。
いくつかの実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤには、以下、ＩＬ－２およびＩＬ－１２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５、ＩＬ－１５およびＩＬ－１２、ＩＬ－１８およびＧＭＣ ＳＦ、ＩＬ－２１およびＩＬ－１５、ＧＭＣ－ＳＦおよびＩＬ－１２、ＧＭＣ－ＳＦおよびＩＬ－２１、ならびにＩＦＮ－αおよびＩＬ－１５から選択されるＡＢＤに結合した２つのサイトカインが含まれる。図１は、２つのサイトカインがＡＢＤに結合し得るいくつかの例示的な方向を示す。任意のＡＢＤは、そのような融合タンパク質に使用でき、それには、図２に示されるＡＢＤ可変重ドメインおよび可変軽ドメインのうちのいずれかを含むものが含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＢＤはＡ１０ｍ３である。
任意のリンカーが使用されて、各サイトカインをＡＢＤに結合することができ、それは、図４８に示される任意のリンカーを含む。そのような融合タンパク質において使用するための例示的な骨格リンカー－Ａ１０ｍ３－リンカー配列が、図５０に示される。使用され得る例示的なリンカーには、（ＧＧＧＧＳ）ｘリンカーが含まれ、式中、Ｘは１～１０である。特定の実施形態では、（ＧＧＧＧＳ）５が使用されて、サイトカインをＡＢＤに結合させる。
いくつかの実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤは、以下から選択される式、（Ｎ末端からＣ末端へ）サイトカイン１－Ｌ１－ＡＢＤ－Ｌ２－サイトカイン２、サイトカイン１－Ｌ１－サイトカイン２－Ｌ２－ＡＢＤ、およびＡＢＤ－Ｌ１－サイトカイン１－Ｌ２－サイトカイン２によるものであり、式中、Ｌ１およびＬ２は、サイトカインとＡＢＤ構成要素を接続するリンカーであり、サイトカイン１およびサイトカイン２は、以下のサイトカインペア、ＩＬ－２およびＩＬ－１２、ＩＬ－７およびＩＬ－１５、ＩＬ－１５およびＩＬ－１２、ＩＬ－１８およびＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－２１およびＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１２、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－２１、ならびにＩＦＮ－αおよびＩＬ－１５から選択される。いくつかの実施形態では、ＡＢＤは、Ａ１０ｍ３（図２Ｄ）である。
そのようなサイトカイン－ＡＢＤにおいて、いずれかのサイトカインが「サイトカイン１」であり、他方のサイトカインが「サイトカイン２」であり得る。例えば、ＩＬ－２およびＩＬ－１２サイトカインペアの一実施形態では、ＩＬ－２は「サイトカイン１」であり、ＩＬ－１２は「サイトカイン２」である。ＩＬ－２およびＩＬ－１２サイトカインペアの別の実施形態では、ＩＬ－１２は「サイトカイン１」であり、ＩＬ－２は「サイトカイン２」である。
いくつかの実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤには、２つの同じインターロイキンが含まれる。他の実施形態では、インターロイキン－ＡＢＤポリペプチドには、上記に記載されているように、２つの異なるインターロイキン（例えば、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５）が含まれる。特定のサイトカインの組み合わせを含むＡＢＤ融合タンパク質は、図５１に開示される。異なるサイトカインの組み合わせを含む例示的なサイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質は、以下でさらに詳細に議論される。
ａ．ＩＬ－１２およびＩＬ－１５
特定の実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質には、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５が含まれる。そのような実施形態に含まれ得る例示的なＩＬ－１２およびＩＬ－１５配列が、図３および４９Ｃに示される。ＩＬ－１２およびＩＬ－１５融合パートナーの両方を含むサイトカイン－ＡＢＤは、両方のインターロイキンの抗腫瘍効果を示すと考えられている。ＩＬ－１２とＩＬ－１５の組み合わせが示されて、サイトカイン単独と比較して、強化された抗腫瘍活性を誘導した。そのような強化された抗腫瘍活性は、ＩＦＮ－γの相乗的誘導を介した各サイトカインの受容体の相互アップレギュレーションと相関していた。ＩＬ－１２とＩＬ－１５の組み合わせは、一酸化窒素の合成を介して腹膜マクロファージにおける抗腫瘍活性を促進することがさらに示された。特定の動作理論に拘束されることなく、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５融合パートナーの両方を有するポリペプチドは、自然応答を迅速に活性化し（ＩＬ－１２）、Ｔ細胞の増殖を強力に刺激し、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を維持する（ＩＬ－１５）ことができると考えられている。動物研究は、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５発現細胞の連続送達により、確立された腫瘍の治療環境でマウスも治癒したことを示す。ＣＤ８＋細胞の枯渇により、この治療の保護が排除され、腫瘍ＣＴＬのクローンの増殖を示唆する。例えば、Ｃｒｏｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１（２ Ｐｔ １）：７３５－７４２（２００５）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤは、Ｎ末端からＣ末端へ、以下の式によるものである。
ａ）（ＩＬ－１２）－Ｌ１－（ＡＢＤ）－Ｌ２－（ＩＬ－１５）、または
ｂ）（ＩＬ－１５）－Ｌ１－（ＡＢＤ）－Ｌ２－（ＩＬ－１２）。
例えば、図２にリスト化されるＡＢＤ可変重鎖のうちのいずれかのｖｈＣＤＲ１～３を含むＡＢＤ可変重鎖を有するＡＢＤを含む、任意の好適なＡＢＤが使用され得る。例示的な実施形態では、可変重鎖には、Ａ１０ｍ３可変重鎖のｖｈＣＤＲ１～３（図２Ｄ）が含まれる。特定の実施形態では、ＡＢＤには、Ａ１０ｍ３可変軽鎖のｖｌＣＤＲ１～３を含むＡＢＤ可変軽鎖が含まれる。例示的な実施形態では、ＡＢＤは、Ａ１０ｍ３ ｓｃＦｖである。
任意の好適なＩＬ－１２およびＩＬ－１５が使用され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５は、本明細書に記載されるような多様体ＩＬ－１５である（例えば、図３を参照されたい）。ＩＬ－１５はまた、野生型ＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒαに結合している野生型ＩＬ－１５であり得る。一実施形態では、ＩＬ－１５は、図３に示されるものから選択される多様体ＩＬ－１５である。例示的な実施形態では、Ｉｌ－１５は、アミノ酸置換Ｋ８６ＲおよびＮ１１２Ａを有する多様体ＩＬ－１５である。
使用され得るＩＬ－１２には、ｐ３５およびｐ４０ドメインを有するこれらのＩＬ－１２が含まれる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２は、本明細書に記載されるような単鎖ＩＬ－１２である（例えば、ＩＬ－１２－ＡＢＤ融合ポリペプチドの一部として示される図２０、および図４９Ｃを参照されたい）。
そのような実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ第１および第２のリンカーであり、Ｌ１およびＬ２は、ＩＬ－１５およびＩＬ－１２ドメインをＡＢＤドメインに結合させるのに好適な任意のリンカーであり得る（例えば、図４８にリスト化されるリンカー）。使用され得る例示的なリンカーには、（ＧＧＧＧＳ）ｘリンカーが含まれ、式中、Ｘは１～１０である。特定の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ（ＧＧＧＧＳ）５である。
ＩＬ－１２およびＩＬ－１５を含む例示的なＡＢＤポリペプチドの配列が、図３４および３６に示される。
ｂ．ＩＬ－２およびＩＬ－１２
特定の実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤには、ＩＬ－２およびＩＬ－１２が含まれる。
ＩＬ－２およびＩＬ－１２は、相互の受容体を相互にアップレギュレートし、別個に信号伝達経路を使用して、異なるが相補性生物学的効果を誘導する。ＩＬ－２とＩＬ－１２は両方とも、マイトジェンまたはＣＤ３活性化Ｔ細胞を刺激して、ＩＦＮ－γを増殖および産生し得る。さらに、研究は、ＩＬ－２およびＩＬ－１２遺伝子の両方の、Ｂ１６黒色腫を有するマウスへの送達が、腫瘍組織量の有意な低減および全生存の強化を誘発したことを示す（例えば、Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｓｕｒｇ ３８７（３４）：１７７－１８２（２００２）を参照されたい）。したがって、ＩＬ－２およびＩＬ－の両方を有するサイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質は、腫瘍の低減および癌の治療に有用であると考えられている。
ｃ．ＩＬ－２およびＩＬ－１５
特定の実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質には、ＩＬ－２およびＩＬ－１５が含まれる。ＩＬ－２とＩＬ－１５の両方は、ＮＫ細胞および活性化Ｔ細胞の増殖を刺激することができ、エフェクターＴ細胞の増殖をサポートする。ＩＬ－２およびＩＬ－１５の両方を含むサイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質は、腫瘍の縮小および癌の治療に有用であると考えられている。
ｄ．ＩＬ－７およびＩＬ－１２
特定の実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質には、ＩＬ－７およびＩＬ－１２融合パートナーが含まれる。
インターロイキン－７（ＩＬ－７）は、適応免疫系において中心的な役割を果たす非造血細胞由来のサイトカインである。それは、末梢におけるナイーブおよびメモリーＴ細胞の恒常性の生存を維持する胸腺において、リンパ球の発生を促進する。さらに、リンパ節（ＬＮ）の器官形成、および二次リンパ器官（ＳＬＯ）に補充される活性化Ｔ細胞の維持にとって重要である。癌患者の免疫力は抑制され、Ｔ細胞数の減少、エフェクター免疫細胞の浸潤の減少、消耗したエフェクター細胞のレベルの増加、および形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）などの免疫抑制性サイトカインのレベルの増加が特徴である。ＩＬ－７は、末梢Ｔ細胞の増殖を促進することによって、免疫抑制された癌患者の免疫再構成に理想的な解決策である。動物モデルにおいて、ＩＬ－７は、腫瘍保有宿主の生存を延長することが証明されている。Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．１６：１０２６７－１０２８０（２０１５）を参照されたい。
ＩＬ－１２は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に直接作用して、ＩＬ－７媒介増殖を強化する。ＩＬ－７およびＩＬ－１２結合ドメインを含むサイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質は、有利なことに、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進し、腫瘍に対する細胞溶解活性を強化すると考えられている。
ｅ．ＩＬ－７およびＩＬ－１５
特定の実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質には、ＩＬ－７およびＩＬ－１５が含まれる。上記のように、インターロイキン７および１５は、腫瘍形成を低減する能力を有する強力な炎症誘発性サイトカインと考えられる。ＩＬ－７およびＩＬ－１５の両方を含むサイトカインＡＢＤ融合タンパク質は、腫瘍の縮小および癌の治療に有用であると考えられている。
ｆ．ＩＬ－１２およびＩＬ－２１
特定の実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤには、ＩＬ－１２およびＩＬ－２１が含まれる。
上記のように、ＩＬ－１２は、ＮＫ細胞および活性化Ｔ細胞の増殖を刺激することができ、エフェクターＴ細胞の増殖をサポートする。ＩＬ－２１は、自然免疫系と適応免疫系を橋渡しするＮＫおよびＴ細胞機能の制御因子である。ＩＬ－２１は、骨髄前駆細胞からのＮＫ細胞の成熟を促進し、ヒト末梢ＮＫ細胞を活性化し、ＮＫの増殖と成熟を促進し、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介エフェクター機能を強化する。
ＩＬ－１２およびＩＬ－２１の両方を含むサイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質は、腫瘍の縮小および癌の治療に有用であると考えられている。
ｇ．ＩＬ－１２およびＩＬ－１８
特定の実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤには、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８が含まれる。
ＩＬ－１８は、ＩＦＮ－γ産生を誘導し、Ｔｈ１細胞の発生およびＮＫ活性化を促進することが知られている。ＩＬ－１２は、ＩＦＮ－γ依存的にＩＬ－１８受容体のアップレギュレーションを誘導することが知られている。ＩＬ－１８とＩＬ－１２を共発現するＳＣＫマウス乳癌細胞をマウスに投与すると、腫瘍組織量が低減し、血管新生が阻害された（例えば、Ｃｏｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０１（６）：１４４１－１４５２（１９９８）を参照されたい）。ＩＬ－１８を腫瘍保有マウスにＩＬ－１２と組み合わせて使用すると、ＩＦＮ－γの延長した血清レベルが相乗的に誘導され、一方では、ＩＬ－１８またはＩＬ－１２単独で治療した腫瘍保有マウスは、急速に減衰する最小限の血清ＩＦＮ－γを誘導した（例えば、Ｓｕｂｌｅｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６（２２）：１１００５－１１０１２（２００６）参照されたい）。例示的なＩＬ－１８－ＡＢＤが、図３７に示される。
ＩＬ－１２およびＩＬ－１８融合パートナーの両方を含むサイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質は、腫瘍の縮小および癌の治療に有用であると考えられている。
ｈ．ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１２
特定の実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤには、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１８が含まれる。ＧＭ－ＣＳＦは、造血前駆細胞の分化と増殖を調節する。ＧＭ－ＣＳＦはまた、ＡＰＣが抗原を処理および提示する能力を強化し、次に、これにより、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化、ＩＦＮ－γ産生の増加、および最終的には腫瘍退縮をもたらす。ＧＭ－ＣＳＦとＩＬ－１２の両方は、肝臓腫瘍モデルおよび肺腫瘍モデルを含むいくつかの異なる前臨床腫瘍モデルにおいて有意な抗腫瘍応答を誘発することができる。（例えば、Ｋｉｌｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７７（１０）：６９６２－６９７３（２００６）を参照されたい）。
ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１２融合パートナーの両方を含むサイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質は、腫瘍の縮小および癌の治療に有用であると考えられている。
ｉ．ＩＦＮαおよびＩＬ－１２
これら２つのサイトカインの協同の性質は、単なる類似の生物学的効果を超えて広がる。例えば、ＩＦＮ－γ産生を誘導することがよく知られているＩＬ－１２は、ＩＦＮ－α信号伝達を強化する追加の可溶性因子の産生をもたらし得る。インターフェロンαを含むインターフェロンは、悪性細胞内でアポトーシスを誘導することが知られている。例えば、Ｔｈｙｒｅｌｌ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１，１２５１－１２６２（２００２）を参照されたい。
ＩＦＮαおよびＩＬ－１２の両方を含むサイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質は、腫瘍の縮小および癌の治療に有用であると考えられている。
主題のサイトカイン－ＡＢＤ融合タンパク質に含まれ得る追加のサイトカイン－サイトカインの組み合わせが、図５１Ａに示される。
２．結合部分－ＡＢＤ融合タンパク質
いくつかの実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質には、結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）融合パートナー、すなわちＢＭ－ＡＢＤ融合タンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、ＢＭ－ＡＢＤには、１つの結合部分が含まれる。特定の実施形態では、ＢＭ－ＡＢＤには、２つの結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）が含まれる。他の実施形態では、ＢＭ－ＡＢＤには、サイトカインおよび結合部分が含まれる（図１Ｂ）。図１は、結合部分または結合部分－サイトカイン／結合部分－結合部分の組み合わせがＡＢＤに結合し得るいくつかの例示的な方向を示す。
抗体可変重ドメインおよび可変軽ドメインに基づく主要なＢＭ－ＡＢＤ結合部分を用いた実行に有用な結合部分。いくつかの実施形態では、結合部分には、可変重ドメインおよび可変軽ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、結合部分は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
任意のＡＢＤは、そのような融合タンパク質に使用することができ、それには、図２に示されるＡＢＤ可変重ドメインおよび可変軽ドメインのうちのいずれかを含むものが含まれる。特定の実施形態では、ＡＢＤには、Ａ１０ｍ３の可変重ドメインおよび軽ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＢＤは、Ａ１０ｍ３ ｓｃＦｖである。
任意のリンカーが使用されて、サイトカインおよび／または結合部分をＡＢＤに結合することができ、それは、図４８に示される任意のリンカーを含む。例示的な実施形態では、リンカーは（ＧＧＧＧＳ）５である。そのような融合タンパク質において使用するための例示的な骨格リンカー－Ａ１０ｍ３－リンカー配列が、図４８に示される。
２つの結合部分（例えば、ｓｃＦｖ）、またはサイトカインと結合部分の例示的な組み合わせ（そのようなＡＢＤ融合タンパク質であり得る）が、図５１Ｂに示される。
いくつかの実施形態では、ＢＭ－ＡＢＤには、抗ＴＧＦβ結合ドメイン（例えば、抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖ）が含まれる。例示的な抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖ配列が、図４５に示される。いくつかの実施形態では、抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖには、４Ｄ９抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖの可変重ドメインおよび可変軽ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質には、抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖおよびサイトカインまたは追加の結合部分が含まれ、サイトカインまたは追加の結合部分は、第２の抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、または抗ＰＤ－Ｌ１結合ドメイン（１０Ｄ１２）である。図５１Ｂを参照されたい。
いくつかの実施形態では、ＢＭ－ＡＢＤには、抗ＰＤ－Ｌ１結合ドメイン（例えば、抗Ｔ ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ）が含まれる。いくつかの態様において、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖには、４Ｄ９抗ＰＤ－Ｌ１ １０Ｄ１２ ｓｃＦｖの可変重ドメインおよび可変軽ドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質には、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖおよびサイトカインまたは追加の結合部分が含まれ、サイトカインまたは追加の結合部分は、第２の抗抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、または抗ＴＧＦβ結合ドメイン（４Ｄ９）である。図５１Ｂを参照されたい。
ａ．ＴＧＦ－β結合部分
特定の実施形態では、本明細書で提供されるＢＭ－ＡＢＤには、ＴＧＦ－β結合部分が含まれる。本明細書で使用される「ＴＧＦ－β」、「ＴＧＦβ」、「ＴＧＦｂ」、および「形質転換増殖因子β」は全て、ほとんどの細胞の増殖、細胞分化、および他の機能を制御することに関与し、少なくとも３つのアイソフォーム、ＴＧＦβ１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００６６０およびＮＰ＿０００６５１（ヒト）、ならびにＮＭ＿０１１５７７およびＮＰ＿０３５７０７（マウス））、ＴＧＦβ２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１３５５９９およびＮＰ＿００１１２９０７１（ヒト）、ならびにＮＭ＿００９３６７およびＮＰ＿３３３９３（マウス））、およびＴＧＦβ３（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００３２３９）、中に存在するサイトカインのファミリーのメンバーを指す。ＴＧＦβファミリーのメンバーは、細胞からの分泌に必要な２０～３０のアミノ酸のＮ末端信号ペプチド、プロ領域、およびその放出型に従う成熟ＴＧＦβ分子になる１１２～１１３のアミノ酸のＣ末端領域、タンパク質分解によるプロ領域を有する。特定の実施形態では、成熟ＴＧＦβタンパク質は二量体化して、多くの保存された構造モチーフを有する２５ｋＤａの活性分子を産生し、９つのシステイン残基を含み、そのうち８つがＴＧＦβ分子内でジスルフィド結合を形成して、システインノット構造を作成することができる。９番目に保存されたシステインは、別のＴＧＦβの９番目のシステインと結合を形成して、二量体を産生する。
特定の動作理論に拘束されることなく、ＴＧＦβに結合する主題のＢＭ－ＡＢＤは、癌（例えば、末期癌）を有する対象の治療に使用され得ると考えられている。特定の実施形態では、ＢＭ－ＡＢＤには、ＴＧＦβ１結合部分が含まれる。特定の実施形態では、ＢＭ－ＡＢＤには、ＴＧＦβ２結合部分が含まれる。特定の実施形態では、ＢＭ－ＡＢＤには、ＴＧＦβ３結合部分が含まれる。いくつかの実施形態では、多価結合ポリペプチドには、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、および／またはＴＧＦβ３、またはそれらの任意の組み合わせに結合できる結合部分が含まれる（例えば、ＴＧＦβ１とＴＧＦβ２との結合、ＴＧＦβ２とＴＧＦβ３との結合、ＴＧＦβ１とＴＧＦβ３との結合、またはＴＧＦβ１と、ＴＧＦβ２と、ＴＧＦβ３との結合）。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ結合部分は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３に結合する。いくつかの実施形態では、図４０のＴＧＦβ結合部分の可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含むＴＧＦβ結合部分。一実施形態では、ＴＧＦβ結合部分には、ＴＧＦβ結合部分４Ｄ９の可変重ドメインおよび可変軽ドメイン（図４０Ｂ）が含まれる。特定の実施形態では、ＴＧＦβ結合部分は、４Ｄ９ ｓｃＦｖである。４Ｄ９は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞の増殖を防止し、Ｓｍａｄの活性化（例えば、Ｓｍａｄ２のリン酸化）を防止し、細胞の上皮から間葉への移行および／または癌細胞の移動を防止することが示されている。
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ結合部分－ＡＢＤ融合タンパク質は、別の結合部分またはサイトカインにさらに結合している。特定の実施形態では、他の結合部分は、ＰＤ－Ｌ１結合部分または別のＴＧＦβ結合部分である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１５またはＩＬ－１２である（図５１Ｂを参照されたい）。
ｂ．ＰＤ－Ｌ１結合部分
特定の実施形態では、本明細書で提供されるＢＭ－ＡＢＤには、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）結合部分が含まれる。本明細書で使用される「プログラム細胞死１リガンド１」、「プログラム死リガンド１」、「ＰＤＬ１」、および「ＰＤ－Ｌ１」（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２６７７０６およびＮＰ＿００１２５４６３５（ヒト）、ならびにＮＭ＿０２１８９３およびＮＰ＿０６８６９３（マウス））は全て、活性化または阻害を調節するために、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄細胞に見られるＰｄ１受容体に結合している４０ｋＤａ １型膜貫通タンパク質のメンバーを指す。ＰＤ－Ｌ１のアップレギュレーションにより、癌は免疫系を回避できる。例えば、Ｈａｍａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４（９）：３３６０－５（２００７）を参照されたい。したがって、ＰＤ－Ｌ１結合部分を含む主題のＢＭ－ＡＢＤは、癌の治療おいて有用であり得ると考えられている。
一実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合部分には、ＰＤ－Ｌ１結合部分１０Ｄ１２の可変重ドメインおよび可変軽ドメイン（図５０）が含まれる。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合部分は、１０Ｄ１２ ｓｃＦｖ（図５０）である。１０Ｄ１２は低ｐＨでｈＰＤ－Ｌ１に結合し、ｍＰＤ－Ｌ１と交差反応する。１０Ｄ１２はｈＰＤ－Ｌ２またはｍＰＤ－Ｌ２に結合しない。さらに、１０Ｄ１２はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用、ならびにＢ７１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を遮断する。
いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１結合部分－ＡＢＤ融合タンパク質は、別の結合部分またはサイトカインにさらに結合している。特定の実施形態では、他の結合部分は、ＴＧＦβ結合部分または別のＰＤ－Ｌ１結合部分である。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＬ－１５またはＩＬ－１２である（図５１Ｂを参照されたい）。
ｃ．ＴＮＦおよびその他の結合部分
一実施形態では、本明細書で提供されるＡＢＤ融合タンパク質には、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）結合部分が含まれる。特定の動作理論に縛られることなく、そのようなＡＢＤ融合タンパク質は、抗炎症および／または癌治療薬として有用であると考えられている。いくつかの実施形態では、ＴＮＦ結合部分はｓｃＦｖである。特定の実施形態では、ＴＮＦ結合部分－ＡＢＤ融合タンパク質は、結合部分または阻害剤ペプチドである別の融合パートナーにさらに結合している。特定の実施形態では、第２の結合部分は、第２のＴＮＦ結合部分、ＩＬ－１結合部分、ＩＬ－６結合部分、ＩＬ－８結合部分、ＩＬ－１７（アイソフォームＡ～Ｆ）結合部分、またはＩＬ－２３結合部分である。
別の実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質には、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１７（Ａ～Ｆ）、およびＩＬ－２３結合部分から選択される結合部分が含まれる。
いくつかの実施形態では、そのようなＴＮＦおよびインターロイキン結合部分－ＡＢＤは、関節リウマチ、クローン病、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、慢性プラーク乾癬、およびＴＮＦ系疾患などの疾患の治療に有用である。
Ｆ．診断的使用
別の態様では、腫瘍を画像化および／または検出する方法が、本明細書で提供される。いくつかの態様において、方法は、腫瘍細胞、腫瘍細胞培養物、腫瘍血管細胞、腫瘍血管細胞培養物、腫瘍組織、ならびに他の組織および細胞を、標識された本発明の主題のＡＢＤ融合タンパク質と接触させることを含む。
ＡＢＤ融合タンパク質はまた、本明細書のＡＢＤ融合タンパク質の抗原結合パートナーに関連する腫瘍または自己免疫疾患状態のインビボまたはインビトロ画像化にも有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質は、診断と治療との両方、または診断のみに使用される。いくつかの実施形態では、主題のＡＢＤ融合タンパク質は標識されている。
診断は、以下に記載のように全身画像診断を可能にする診断用タンパク質の投与によってインビボで、あるいは患者から取り出した試料においてインビトロで行うことができる。本文脈における「試料」は、体液（血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門および膣分泌物、汗、ならびに精液を含むがこれらに限定されない）、ならびに関連組織の生検から得られるもの等の組織試料を含むがこれらに限定されない、任意の数のものを含む。
本明細書における「標識される」とは、本明細書に開示のＡＢＤ融合タンパク質に、スクリーンまたは診断手順における検出を可能にするために１つ以上の元素、同位体、または化学的化合物を結合させることを意味する。一般に、標識は、いくつかのクラスに分けられる：ａ）抗体によって認識される融合パートナーとして組み込まれるエピトープであり得る、免疫標識、ｂ）放射性または重同位体であり得る、同位体標識、ｃ）蛍光および比色色素、または他の標識方法を可能にするビオチン等の分子を含み得る、小分子標識、ならびにｄ）粒子（超音波標識用のバブルを含む）または身体撮像を可能にする常磁性標識等の標識。標識は、当該技術分野において既知のように、いずれの位置で（例えば、本明細書に記載されるリンカーのうちの１つ以上を介して）タンパク質に組み込まれてもよく、タンパク質発現中にインビトロまたはインビボで組み込まれてもよい。特定の標識には、発色団、蛍光体、および蛍光色素分子が含まれるが、これらに限定されない光学色素を含み、後者は多くの場合に特異的である。蛍光色素分子は、「小分子」蛍光体またはタンパク質性蛍光体のいずれかであり得る。
「蛍光標識」とは、その固有の蛍光特性を介して検出され得る分子を意味する。好適な蛍光標識には、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルーＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣレッド６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣレッド７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３ 、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０）、カスケードブルー、カスケードイエロー、およびＲ－フィコエリスリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン）、ＦＩＴＣ、ローダミン、およびテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ピッツバーグ、Ｐａ）が含まれるが、これらに限定されない。蛍光色素分子を含む好適な光学色素は、参照により完全に組み込まれるＲｉｃｈａｒｄ Ｐ．ＨａｕｇｌａｎｄによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されている。
好適なタンパク質性蛍光標識には、ＧＦＰのウミシイタケ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、またはＡｅｑｕｏｒｅａ種（Ｃｈａｌｆｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２－８０５（１９９４））を含む緑色蛍光タンパク質、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．１８０１ ｄｅ Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ Ｈ３Ｈ １Ｊ９；Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４：４６２－４７１、Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８－１８２）、強化された黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８－５４１７（１９９３））、βガラクトシダーゼ（ＮｏｌａｎＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２６０３－２６０７（１９９８））およびウミシイタケ（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５，２９２，６５８号、米国特許第５，４１８，１５５号、米国特許第５，６８３，８８８号、米国特許第５，７４１，６６８号、米国特許第５，７７７，０７９号、米国特許第５，８０４，３８７号、米国特許第５８７４３０４号、米国特許第５８７６９９５号、米国特許第５９２５５５８号）が含まれる。本項において、上記引用文献の全ては、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
Ｇ．アルブミン結合ドメインおよび融合タンパク質の産生
当業者には理解されるように、標準プロトコルが使用されて、主題のＡＢＤを作製する。抗体分子生物学、発現、精製、およびスクリーニングの一般的な方法については、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ＆Ｄｕｂｅｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、２００１；およびＨａｙｈｕｒｓｔ＆Ｇｅｏｒｇｉｏｕ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ５：６８３－６８９（２００１）、Ｍａｙｎａｒｄ＆Ｇｅｏｒｇｉｏｕ、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｍｅｄ Ｅｎｇ ２：３３９－７６（２０００）に記載されている。
本明細書に開示される一実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質をコードする核酸が作成され、次いで、核酸は、必要に応じて宿主細胞にクローニングされ、発現およびアッセイされ得る。したがって、各タンパク質配列をコードする核酸、特にＤＮＡが、作製され得る。これらの実行は、よく知られた手順を使用して行われる。例えば、抗体の産生と同様に、ＡＢＤ融合タンパク質の生成に有用であり得る様々な方法が、本明細書に開示され、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版。（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００１）、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）に記載されており、両方とも参照により完全に組み込まれる。本明細書に開示されるＡＢＤをコードするＤＮＡを効率的に生成するために使用され得る様々な技術が存在する。そのような方法には、遺伝子アセンブリ方法、ＰＣＲ系の方法およびＰＣＲの変形を使用する方法、リガーゼ連鎖反応系の方法、合成シャッフリングで使用されるものなどのプールオリゴ方法、エラーを起こしやすい増幅方法、ランダム変異体を伴うオリゴを使用する方法、古典的な部位指向変異誘発方法、カセット変異誘発、および他の増幅および遺伝子合成方法が含まれるが、これらに限定されない。当該技術分野において既知のように、遺伝子アセンブリ、変異誘発、ベクターサブクローニングなどのための様々な市販のキットおよび方法が存在し、そのような市販品は、ＡＢＤ融合タンパク質をコードする核酸を生成するのに有用である。
本明細書に開示されるＡＢＤは、タンパク質の発現を誘導または引き起こす適切な条件下で、ＡＢＤ融合タンパク質をコードする核酸を含有する核酸、例えば発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を培養することにより産生され得る。発現に適した条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって異なり、日常的な実験を介して当業者によって容易に確認される。哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、酵母、および植物細胞を含むが、これらに限定されない、多種多様な適切な宿主細胞が使用され得る。例えば、本明細書に開示されるＡＢＤ融合タンパク質の生成に有用であり得る様々な細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なＡＴＣＣ（登録商標）細胞株カタログに記載されている。
一実施形態では、ＡＢＤは、発現構築物が、レトロウイルスまたはアデノウイルスなどのウイルスを使用して哺乳動物細胞に導入される系を含む哺乳動物細胞発現系において発現される。任意の哺乳動物細胞、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、霊長類の細胞が使用され得る。好適な細胞には、ジャーカットＴ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＰＥＲ Ｃ．６、ＨｅＬａ、Ｓｐ２／０、ＮＳ０細胞、およびそれらの多様体が含まれるが、これらに限定されない既知の研究細胞も含まれる。代替の実施形態では、ライブラリータンパク質は、細菌細胞において発現される。細菌発現系は、当該技術分野において周知であり、大腸菌（大腸菌）、枯草菌、クレモリス連鎖球菌、およびリビダン連鎖球菌が含まれる。別の実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ２１／Ｓｆ９、イラクサギンウワバＢｔｉ－Ｔｎ５ｂ１－４）または酵母細胞（例えば、出芽酵母、ピキアなど）内で産生される。代替の実施形態において、ＡＢＤポリペプチドは、無細胞翻訳系を使用してインビトロで発現される。原核細胞（大腸菌など）および真核細胞（小麦胚芽、ウサギ網状赤血球）の両方から誘導されるインビトロ翻訳系が利用可能であり、目的のタンパク質の発現レベルと機能特性に基づいて選択され得る。例えば、当業者には理解されるように、いくつかのディスプレイ技術、例えばリボソームディスプレイにはインビトロ翻訳が必要である。加えて、ＡＢＤ融合タンパク質は、化学合成法によって産生され得る。また、動物（例えば、牛乳、羊乳、または山羊乳、ふ化鶏卵、昆虫全体の幼虫など）および植物（例えば、トウモロコシ、タバコ、ウキクサなど）の両方の遺伝子導入発現系。
本明細書に開示されるＡＢＤ融合タンパク質をコードする核酸は、タンパク質を発現させるために発現ベクターに組み込まれ得る。タンパク質発現には、様々な発現ベクターが利用され得る。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに統合されるベクターを含み得る。発現ベクターは、宿主細胞タイプと互換性があるように構築される。したがって、本明細書に開示される抗体の生成に有用である発現ベクターには、哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、酵母、およびインビトロ系においてタンパク質発現を可能にするものが含まれるが、これらに限定されない。当該技術分野において既知のように、本明細書中に開示される抗体を発現するために有用であり得る種々の発現ベクターが、商業的にまたは他の方法で入手可能である。
開示されたＡＢＤ融合タンパク質は、複数の核酸分子によってコードされ得る。例えば、可変重鎖および可変軽鎖は、独立して宿主細胞に導入され得る。別個の核酸に存在するが、それらの発現は、単一のポリペプチドを産生する。
発現ベクターは、典型的には、制御配列または調節性配列、選択可能なマーカー、任意の融合パートナー、および／または追加の要素と操作可能に結合したタンパク質を含む。本明細書において「操作可能に結合した」とは、核酸が別の核酸配列と機能的な関係にあることを意味する。一般に、これらの発現ベクターには、多価ＡＢＤ融合タンパク質をコードする核酸に操作可能に結合した転写および翻訳調節性核酸が含まれ、典型的にはタンパク質の発現に使用される宿主細胞に適している。一般に、転写および翻訳調節性配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、およびエンハンサーまたはアクティベーター配列が含まれ得る。当該技術分野において既知のように、発現ベクターは、典型的には、発現ベクターを含有する形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択遺伝子またはマーカーを含有する。選択遺伝子は当技術分野で周知であり、使用される宿主細胞によって異なる。
一実施形態では、ＡＢＤは、発現後に精製または単離される。ＡＢＤおよびＡＢＤ融合タンパク質は、当業者に既知の様々な方法で単離または精製され得る。本明細書に記載されるように、ホモ二量体重鎖種からヘテロ二量体重鎖種を分離するのに、精製が特に有用であり得る。標準的な精製方法には、ＦＰＬＣやＨＰＬＣなどの系を使用して大気圧または高圧で行われる、イオン交換、疎水性相互作用、アフィニティ、サイジングまたはゲルろ過、および逆相を含むクロマトグラフィー技術が含まれる。精製方法には、電気泳動、等電点電気泳動、免疫学、沈殿、透析、およびクロマトフォーカシング技術も含まれる。限外ろ過およびダイアフィルトレーション技術も、タンパク質濃度と組み合わせて、有用である。融合が使用され、Ｈｉｓタグが使用される場合はＮｉ＋２アフィニティクロマトグラフィーが、フラグタグが使用される場合は固定化された抗フラグ抗体が使用される。好適な精製技術の一般的なガイダンスについては、例えば、参照により完全に組み込まれる、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第３版、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ、１９９４、参照により完全に組み込まれる、を参照されたい。必要な精製の程度は、抗体のスクリーニングまたは用途によって異なる。場合によっては精製は不要である。
Ｈ．アルブミン結合ドメインおよびＡＢＤ融合タンパク質の治療用途
主題のＡＢＤおよびＡＢＤ融合タンパク質は、本明細書に記載されるように、様々な治療用途において有用である。
一態様では、本明細書に記載される主題のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）融合タンパク質に投与することによって、それを必要とする対象の腫瘍増殖を阻害する方法が、本明細書で提供される。有用なＡＢＤ融合タンパク質には、図４、２０、３４、３６、４０、４５、５０～５１に開示されるものが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質には、ＩＬ－１２またはＩＬ－１５（例えば、ＩＬ－１２－ＡＢＤまたはＩＬ－１５－ＡＢＤ融合タンパク質）が含まれる。本明細書に記載されるように、ＩＬ－１５ ＡＢＤ融合タンパク質は、用量依存的に腫瘍増殖を阻害することができる。そのようなＩＬ－１５媒介腫瘍増殖阻害は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む腫瘍浸潤リンパ球の増加を伴う。特定の実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質には、ＩＬ－１２分子が含まれる。いくつかの態様では、ＡＢＤ融合タンパク質には、ＩＬ－１５が含まれる。さらに他の特定の実施形態では、サイトカイン－ＡＢＤには、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５が含まれる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５－ＡＢＤには、本明細書に記載されるような多様体ＩＬ－１５が含まれる（例えば、図３を参照されたい）。
主題のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）融合タンパク質を投与することによって、癌を有する対象を治療する方法もまた、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質には、ＩＬ－１２またはＩＬ－１５（例えば、ＩＬ－１２－ＡＢＤまたはＩＬ－１５－ＡＢＤ融合タンパク質）が含まれる。ＩＬ－１２およびＩＬ－１５は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の生存性を増殖および延長する能力によって、腫瘍微小環境の免疫調節のためのサイトカインである。他の有用なＡＢＤ融合タンパク質には、図４、２０、３４、３６、４０、４５、５０～５１に開示されるものが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で治療される癌の例としては、癌腫、芽細胞腫、肉腫、特定の白血病またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌（例えば、上皮扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌を含む肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、皮膚癌／黒色腫、ならびに原発腫瘍のいずれかに関連する頭頸部癌および転移が挙げられる。
本明細書で提供される別の態様では、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および／または生存性を高める方法である。特定の実施形態では、この方法は、細胞を、ＩＬ－１２および／またはＩＬ－１５を含むアルブミン結合ドメイン融合タンパク質（例えば、ＩＬ－１２－ＡＢＤまたはＩＬ－１５－ＡＢＤ融合タンパク質）と接触させることを含む。特定の実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質には、ＩＬ－１２分子が含まれる。いくつかの実施形態では、ＡＢＤ融合タンパク質には、ＩＬ－１５分子が含まれる。さらに他の実施形態では、融合タンパク質ＡＢＤ融合タンパク質には、ＩＬ－１２およびＩＬ－１５が含まれる。
Ｉ．医薬製剤、投与および投薬
別の態様では、任意の主題のアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）ポリペプチドおよび担体を含む治療用組成物が、本明細書で提供される。前述の方法の実行に使用される主題の治療用組成物は、所望の送達方法に好適な担体を含む薬学的組成物に製剤化され得る。好適な担体には、治療用組成物と組み合わせたときに、その治療用組成物の抗腫瘍機能を保持し、かつ一般に患者の免疫系と反応性ではない任意の物質が含まれる。例としては、いくつかの標準的な薬学的担体、例えば、無菌リン酸緩衝生理食塩水、静菌水等のうちの任意のものが挙げられるが、これらに限定されない（一般には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａ．Ｏｓａｌ．， Ｅｄ．， １９８０）。
１．インビボ投与のための組成物
本発明によって使用されるアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）融合タンパク質の製剤は、所望の純度を有するＡＢＤ融合タンパク質を、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で保存用に調製される。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度において、レシピエントに対して非毒性でありリン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）融合タンパク質；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡまたはＤＰＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；および／または様々な分子量のＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
本明細書の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な２つ以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものも含有し得る。例えば、ＡＢＤ融合タンパク質に他の特異性を与えることが望ましい場合がある。あるいは、またはさらに、組成物は、細胞傷害剤、サイトカイン、増殖阻害剤、および／または小分子アンタゴニストを含み得る。かかる分子は、意図する目的に有効な量で組み合わせて存在するのが好適である。
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製されるマイクロカプセル中、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセルそれぞれの中、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に捕捉されてもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第１６版、Ｏｓｏｌ、Ａ．Ｅｄ（１９８０）に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は、無菌またはほぼ無菌でなければならない。これは、滅菌ろ過膜を介するろ過によって容易に達成される。
徐放性調合剤が調製され得る。徐放性調剤の好適な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成形品、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン－酢酸ビニルコポリマー、分解性乳酸－グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドからなる注射可能なミクロスフェア）、およびポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン－酢酸ビニル、および乳酸－グリコール酸などのポリマーは１００日間以上分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い期間タンパク質を放出する。
カプセル化されたアルブミン結合ドメイン融合タンパク質が長時間体内に残る場合、３７℃で湿気にさらされた結果、変性または凝集する可能性があり、生物活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。関与するメカニズムに応じて、安定化のための合理的な戦略が考案され得る。例えば、凝集メカニズムがチオジスルフィド交換を介する分子間Ｓ－Ｓ結合形成であることが判明した場合、スルフヒドリル残基の変性、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の使用、および特定のポリマーマトリックス組成物の開発によって、安定化が達成され得る。
２．行政モダリティ
主題のアルブミン結合ドメイン融合タンパク質および治療薬は、既知の方法に従って、例えば、ボーラスとしての静脈内投与または一定期間にわたる連続注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、くも膜下腔内、経口、局所、または吸入経路によって、対象に投与される。抗体の静脈内または皮下投与が好ましい。
３．治療法
本明細書で提供される方法において、治療は、疾患または病状に関して肯定的な治療応答を提供するために使用される。「肯定的な治療応答」は、疾患もしくは病状の改善、および／または疾患または病状に関連する症状の改善を意図する。例えば、肯定的な治療応答は、疾患における以下の改善のうちの１つ以上を指し得る：（１）新生物細胞の数の減少、（２）新生物細胞死の増加、（３）新生物細胞の生存の阻害、（５）腫瘍増殖の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、（６）患者生存率の増加、および（７）疾患または病状に関連する１つ以上の症状からのいくらかの解放。
任意の所与の疾患または病状における肯定的な治療応答は、その疾患または病状に特有の標準化された応答基準によって決定され得る。腫瘍応答は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線撮影、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン撮影、内視鏡検査、ならびに骨髄穿刺（ＢＭＡ）および循環中の腫瘍細胞の計数を含む腫瘍生検サンプリングなどのスクリーニング技法を使用して、腫瘍形態（すなわち、全身腫瘍組織量、腫瘍サイズなど）の変化について評価され得る。
これらの肯定的な治療応答に加えて、治療を受けている対象は、疾患に関連する症状の改善の有益な効果を経験し得る。
したがって、例えば、Ｂ細胞腫瘍の場合、対象はいわゆるＢ症状、すなわち寝汗、発熱、体重減少、および／または蕁麻疹の軽減を経験する可能性がある。前悪性状態の場合、多価治療薬を用いる治療は、関連する悪性状態の発症、例えば、意義不明のモノクローナル免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）に罹患している対象における多発性骨髄腫の発症までの時間を遮断および／または延長する可能性がある。
病気の改善は完全奏効として特徴付けられる可能性がある。「完全奏効」とは、骨髄腫の場合、任意の以前の異常な放射線検査、骨髄、および脳脊髄液（ＣＳＦ）または異常なモノクローナルタンパク質の正常化を伴う臨床的に検出可能な疾患がないこと意味する。
そのような奏効は、主題の方法による以下の治療後、少なくとも４～８週間、または時には６～８週間持続する場合がある。あるいは、疾患の改善は、部分奏効として分類される場合がある。「部分奏功」とは、新規な病変がない場合、測定可能な全ての腫瘍組織量（すなわち、対象に存在する悪性細胞の数、または腫瘍塊の測定されたバルク、または異常なモノクローナルタンパク質の量）の少なくとも約５０％の減少を意味し、４～８週間、または６～８週間持続する可能性する場合がある。
治療には、使用される薬剤の「治療有効量」が含まれる。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために、必要な投薬量および期間で有効な量をいう。
治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子によって異なり得る。治療有効量はまた、抗体または抗体部分のいずれの毒性または有害な効果よりも治療上有益な効果が勝る量である。
腫瘍療法のための「治療有効量」は、疾患の進行を安定化する能力によっても測定することができる。癌を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価してもよい。
あるいは、組成物のこの特性は、当業者に知られているインビトロアッセイによって、化合物が細胞増殖を阻害するか、またはアポトーシスを誘導する能力を検査することによって評価してもよい。治療有効量の治療用化合物は、腫瘍サイズを減少させるか、さもなければ対象の症状を軽減し得る。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択される特定の組成物または投与経路などの因子に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。
実施例１：ヒト血清アルブミン結合ドメインのスクリーニングおよび同定
ファージのｓｃＦｖアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を同定するために、固相パニングおよび溶液パニングの方法を行った。続いて、ヒト血清アルブミン結合ドメインの一次スクリーニングから選択されたアルブミン結合ドメインを、標準ＥＬＩＳＡ技術を使用してマウス血清アルブミンに対する交差反応性についてスクリーニングした。スクリーニング法を使用して得られた一次アルブミン結合ドメイン候補を配列決定し、続いて、標的濃度依存的結合、ｐＨ安定性、ＦｃＲｎ結合干渉、および動力学的結合についてアッセイした。特に、低ｐＨ（ｐＨ５．５）および中性ｐＨ（ｐＨ７．７）で、ヒト血清アルブミン（ｋＤ約２０～６０ｎＭ）、マウス血清アルブミン（ｋＤ約１０～３０ｎＭ）、およびカニクイザル血清アルブミン（ｋＤ２０～６０ｎＭ）を結合する能力のために、候補ＡＢＤを選択した。候補ＡＢＤをアッセイして、血清アルブミンへのＦｃＲｎ結合と競合しないことを確認した。本明細書で説明されるように、そのようなｐＨで結合し、ＦｃＲｎ結合と競合しなかったＡＢＤは、ＦｃＲｎ媒介エンドソーム再利用が可能である。したがって、そのようなＡＢＤを含む生物製剤（例えば、サイトカインおよび抗体系生物製剤）はまた、そのようなＦｃＲｎ媒介再利用も可能であり、したがって、そのようなＡＢＤを含まない対応物と比較してより長い半減期を示す。
これらの基準に基づいて、５つのアルブミン結合クローン、Ａ９、Ａ１０、Ａ６、２Ｂ４、２Ｈ１０が選択された。これらの５つのクローンのうち、Ａ１０が高発現レベルと最高の活性プロファイルに基づいて選択された。次いで、Ａ１０を変異させて、免疫原性を推定的に引き起こす可能性のある領域を排除した。これらのＡ１０多様体から、血清アルブミンに対する高い親和性に基づいて、Ａ１０ｍ３がリードとして選択された。
例示的なヒト血清アルブミン結合ドメインの配列を、Ａ１０ｍ３（図２Ｄ）を含む図２に示す。
実施例２：多様体ＩＬ－１５およびＩＬ－１５－ＡＢＤ
ＩＬ１５－Ａ１０ｍ３タンパク質の発現は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞によって非常に乏しく、転写では説明できない。
ＩＬ－１５－ＡＢＤ（ＩＬ－１５－Ａ１０ｍ３）構築物を、独立してトランスフェクトされた３つの細胞培養物内のＨＥＫ２９３細胞内で産生し、抗Ｈｉｓタグ抗体（図５Ａ、左）またはマウス血清への機能的ＥＬＩＳＡ結合（図５Ａ、右）のいずれかを使用したウェスタンブロッティングによって評価した。図５Ａに示されるように、ＩＬ－１５－Ａ１０ｍ３の発現を、これらの方法のいずれでも評価できなかった。ＨＥＫ２９３細胞内のＩＬ－１５－Ａ１０ｍ３発現の欠如が、低転写レベルによるものかどうかを評価するために、４つの独立したＩＬ－１５－Ａ１０ｍ３トランスフェクト細胞からｍＲＮＡを調製し、ＲＴ－ＰＣＲを行って、ハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨ（図５Ｂ、レーン６）と比較して、ＩＬ１５－Ａ１０ｍ３ ｍＲＮＡ（図５Ｂ、レーン２～５）のｍＲＮＡレベルを定量した。図５Ｂに示されるように、ＩＬ１５－Ａ１０ｍ３ ｍＲＮＡを、その対照ＧＡＰＤＨに対して、トランスフェクト細胞からかなりの量で検出した、このことは、ＨＥＫ２９３細胞内で産生されるＩＬ－１５－Ａ１０ｍ３の低発現レベルは、転写によるものではなく、おそらく翻訳プロセスまたは翻訳後プロセスに関連付けられる。
ＩＬ１５受容体α結合部位に隣接しているＩＬ１５内の推定ユビキチン化部位の同定
研究は、ＩＬ１５タンパク質が細胞内で発現したが、非常に不安定で半減期が短いことを示した。同じ細胞内でＩＬ１５ＲαとＩＬ１５を共発現させると、細胞表面のＩＬ１５ＲαとＩＬ１５の量が大幅に増加した。さらなる研究により、ＩＬ１５Ｒαは、ＩＬ１５のシャペロンとして作用し、ＩＬ１５を細胞内で結合して、分泌前にＩＬ１５を保護および安定化することが確認された。これらの発見は、翻訳が、ＩＬ１５の低い産生性を説明し得ないことを示唆している。むしろ、翻訳後修飾（ＰＴＭ）は、ＩＬ１５細胞内不安定性に関与する可能性があり、ＩＬ１５の細胞内不安定性は、ＩＬ１５Ｒαが特定のまだ知られていない翻訳後修飾を遮断することによって克服され得る。ユビキチン化は、細胞が分解のために細胞内タンパク質をマークできるようにする、十分に実証されたメカニズムである。
ＩＬ１５は非常に強力な炎症誘発性サイトカインであり、その発現は細胞によって厳密に制御されていると仮定すると、細胞がユビキチン化を利用して、ＩＬ１５タンパク質レベルを活発に制御することが可能である。ＩＬ－１５Ｒαへの結合により推定的に保護されるＩＬ－１５上の潜在的なユビキチン化部位が特定された（図６）。特に、アミノ酸Ｋ８６は、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒα結合部位の隣にある推定ユビキチン化部位であり（図６Ａ）、ＩＬ１５ＲαのＩＬ１５への結合が、ユビキチンリガーゼ（例えば、Ｅ３）のＩＬ１５タンパク質上のＫ８６へのアクセシビリティを遮断する可能性を示唆している。Ｋ８６は、オンラインユビキチン化部位データベース（ｗｗｗ．ｕｂｐｒｅｄ．ｏｒｇ）であるＵｂＰｒｅｄ（図６Ｂ）を使用して、ユビキチン化部位としてさらに確認された。
ＩＬ１５上のＫ８６の変異は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞によるＩＬ１５－Ａ１０ｍ３タンパク質の発現を回復させる。
Ｋ８６でのユビキチン化が、ＩＬ－１５の細胞内安定性に影響するかどうかを評価するために、Ｋ８６ＡおよびＫ８６Ｒを含むＫ８６でのアミノ酸置換を含有するＩＬ－１５多様体を作製した。これらのＩＬ－１５多様体のいくつかの配列を図３に示す。特定の動作理論に拘束されることなく、これらの特定のユビキチン化部位でのアミノ酸置換は、野生型ＩＬ－１５よりも高い安定性を示すユビキチン化耐性ＩＬ－１５をもたらすと考えられている。このようなＩＬ－１５多様体は、半減期をさらに延長するためにＡＢＤ（Ａ１０ｍ３）に結合された（図４）。図７は、そのようなＩＬ－１５－ＡＢＤ融合タンパク質の概略図を提供し、それは、ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ１５「スシドメイン」を有するＩＬ－１５－ＡＢＤ（Ａ）、およびユビキチン化部位Ｋ８６にアミノ酸置換を有するＩＬ－１５多様体を含むＩＬ－１５－ＡＢＤ融合タンパク質（Ｂ）を含む。
ＨＥＫ２９３細胞産生ＩＬ－１５－ＡＢＤ Ｋ８６Ｒ、およびＫ８６Ａ多様体、ならびにＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ１５－ＡＢＤを、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）およびＩＬ－１５Ｒαに結合する能力について評価した。図８Ａに示されるように、ＨＥＫ２９３で産生されるＩＬ－１５－ＡＢＤ Ｋ８６ＲおよびＫ８６Ａ多様体（１２クローン）、ならびにＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ１５－ＡＢＤ（１２クローン）は、ＨＥＫ－２９３で産生された野生型ＩＬ－１５－ＡＢＤ（１２クローン）と比較して、より高い発現を示した。そのような構築物は、ＭＳＡに結合することもできた。さらに、図８Ｂに示されるように、Ｋ８６Ｒ（クローンＲ６、緑色の星）およびＫ８６Ａ（クローンＡ３、黄色の星）の置換は、ＩＬ－１５Ｒαに結合する多様体の能力を妨げなかった。興味深いことに、ＩＬ１５Ｒα融合ＩＬ１５－Ａ１０ｍ３は、ＩＬ１５Ｒαへの結合を示さず、内部ＩＬ１５Ｒαスシドメインが分子内でＩＬ１５に結合し、したがってプレート上にコーティングされた外部ＩＬ１５Ｒαへの結合を遮断したことを示唆した。これは、ＩＬ１５のＩＬ１５Ｒαスシドメインへの結合が、ＩＬ１５発現を増加させるという我々および他者の発見と一致している（図７Ｂ）。
アミノ酸置換Ｋ８６Ｒ（ＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３）を含有する１つの特定の多様体ＨＥＫ２９３細胞産生ＩＬ－１５－ＡＢＤのスケールアップ産生を行い、ＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３構築物をインビトロ血清アルブミン結合について評価した。図９に示されるように、Ｋ８６変異を有するＩＬ－１５－ＡＢＤ（ＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３）およびＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ１５－ＡＢＤ（ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ１５－Ａ１０ｍ３）は、ＨＥＫ ２９３細胞内でスケールアップした数量で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図９Ｃ、左）および抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロッティング（右）で確認されるように、産生することができた。さらに、図１０に示されるように、Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３は、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）への結合を示した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生されるＩＬ１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３の生物活性は損なわれるが、それは、脱グリコシル化により救われ得る。
ＣＴＬＬ２増殖アッセイを使用して、様々なＩＬ－１５－ＡＢＤの生物活性を試験した。試験したＩＬ－１５－ＡＢＤには、野生型ＩＬ－１５－Ａ１０ｍ３、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で産生される３つの異なるＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３が含まれる。両方とも大腸菌を使用して作製される市販のＩＬ－１５および社内産生されるＩＬ－１５－ＡＢＤを対照として使用した。図１１に示されるように、ＨＥＫ２９３Ｔから産生されるＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３は、市販の野生型ＩＬ－１５（Ｒ＆Ｄ）および社内産生されるＩＬ－１５－Ａ１０ｍ３を含む、大腸菌内で産生される対照と比較して、ＣＴＬＬ２増殖を促進する能力が著しく低減したことを示した。ＨＥＫ２９３ＴからのＩＬ１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３と大腸菌からのＩＬ１５－Ａ１０ｍ３の間のＣＴＬＬ２増殖アッセイの違いを考えると、大腸菌から産生されるＩＬ１５－Ａ１０ｍ３は、哺乳動物細胞のように基本的なＮ－グリコシル化を受けないという仮説が立てられ、ＨＥＫ２９３ Ｔ細胞内でのＩＬ１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３のグリコシル化は、ＩＬ１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３とその受容体の相互作用を妨害する可能性がある。
ＨＥＫ細胞産生ＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３の生物活性の低減がグリコシル化によるものかどうかを評価するために、ＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３をＰＮＧａｓｅを使用して脱グリコシル化し、ＣＴＬＬ２増殖アッセイを行って、脱グリコシル化されたＩＬ１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３の生物活性を評価した。ＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３をネイティブ条件下でＰＮＧａｓｅ混合処理した後、グリカンを完全に除去し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで、続いてグリカン染色（図１２Ａ、左）とクマシーブルー染色（図１２Ａ、右）で視覚化した。１）ＩＬ－１５Ｒ－Ａ１０ｍ３＋５ｕｌ ＰＮＧａｓｅ混合、２）タンパク質＋１０ｕｌ ＰＮＧａｓｅ混合、３）酵素制御なし。図１２Ｂに示されるように、ＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３（青）の脱グリコシル化は、未処理の試料（紫、黄色）と比較して、ＣＴＬＬ２増殖アッセイにおいてほぼ完全に活性を救った。Ｒ＆ＤシステムズからのＷＴ ＩＬ－１５（赤）、および社内での大腸菌産生ＩＬ１５－Ａ１０ｍ３（黒）を陽性対照として使用した。
ＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３のＮ１１２は、ＣＴＬＬ２増殖を促進するためのその生物活性にとって重要である。
ＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３のアミノ酸位置Ｎ１１２は、ＩＬ－１５とＩＬ１５受容体γ間の相互作用を適切に確立するために重要であるため、特にＩＬ－１５－ＡＢＤとの関連でＩＬ－１５生物活性にとって重要な部位である。多様体ＩＬ－１５ Ｋ８６ＲをＮ１１２Ａでさらに変異させ、この部位の変異が脱グリコシル化されたＩＬ－１５と同様に、ＩＬ－１５の生物活性を回復させ得るかどうかを判定した。特に、ＩＬ１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３を変異させて、Ｎ１１２Ｑ、Ｎ１１２Ａ、またはＮ１１２Ｓ ＩＬ－１５アミノ酸置換をさらに含め、生物活性を試験するためにＣＴＴＬＬ２増殖アッセイを行った。図１３Ａに示されるように、アミノ酸置換Ｎ１１２ＡをＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３（青色）に導入すると、ＣＴＬＬ２増殖アッセイにおいて、脱グリコシル化されたＩＬ－１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３（緑色）に匹敵する生物活性が回復したが、Ｎ１１２Ｑ変異（赤色）は、脱グリコシル化なしの親ＩＬ－１５Ｒ－Ａ１０ｍ３（黄色）と比較して、生物活性に影響はない。Ｒ＆ＤシステムズからのＷＴ ＩＬ－１５（黒）が陽性対照として機能した。
Ｎ１１２で異なる側鎖を有する変異を試験して、生物活性に対するサイズ影響をさらに実証した。図１３Ｂに示されるように、Ｎ１１２Ｑ（大きい、赤）、Ｎ１１２Ｓ（中くらい、緑）、およびＮ１１２Ａ（小さい、青）は、側鎖のサイズに反比例して増加した生物活性を示した。さらに、ＩＬ－１５のＮ１１２およびＩＬ１５受容体γのＹ１０３によって確立された推奨される水素結合は、Ｎ１１２Ａがそのような結合を形成できないため、この活性にとって重要ではないようだ。Ｒ＆ＤシステムズからのＷＴ ＩＬ－１５（黒）、および社内での大腸菌産生ＩＬ１５－Ａ１０ｍ３（紫）を陽性対照として使用し、脱グリコシル化なしの親ＩＬ１５ Ｋ８６Ｒ－Ａ１０ｍ３（黄色）を陰性対照として使用した。
実施例３：多様体ＩＬ－１５およびＩＬ－１５－ＡＢＤのインビボ活性
ＩＬ－１５およびＩＬ－１５－ＡＢＤの腫瘍増殖を阻害する能力を、Ｂ１６－Ｆ１０マウス黒色腫モデルを使用して評価した。図１４に要約されているように、マウスを、４８時間間隔で４つの異なる時点でＩＶ注射によりＩＬ－１５、ＰＢＳプラセボまたは様々な用量のＩＬ－１５－ＡＢＤで治療した。図１６に示されるように、ＩＬ－１５－ＡＢＤは、用量依存的に腫瘍の増殖を阻害する。
これらの研究からのＩＬ－１５－ＡＢＤ治療マウスにおける腫瘍浸潤リンパ球集団のプロファイルをさらに評価するために、ＦＡＣＳ分析を行った。図１６に示されるように、ＩＬ－１５－ＡＢＤ処理マウスにおいて腫瘍は、ＮＫ細胞集団の増加を示した。このデータは、上記に記載されているように、ＩＬ－１５－ＡＢＤ治療マウスにおける腫瘍蓄積および保持の増加の観察と相まって、ＡＢＤが腫瘍内のＩＬ－１５の炎症誘発効果を強化することを示唆している。脾臓および腫瘍のリンパ球集団に対するＩＬ－１５－ＡＢＤ治療の効果を図１７および１８にまとめている。図１７および１８に示されるように、リンパ球集団のＦＡＣＳ分析は、ＩＬ－１５ ＡＢＤ治療マウスの腫瘍における腫瘍浸潤ＣＴＬおよびＮＫ細胞集団の３～６倍の増加を示している。脾臓に有意差は認められなかった。全体として、これらの研究の結果は、インビボでのＩＬ－１５－ＡＢＤの腫瘍免疫調節能力を示している。
ＡＢＤ融合タンパク質のＩＬ－１５の半減期を延長する能力を評価するために、Ｃ５７Ｂマウスに５μｇのＩＬ－１５－ＡＢＤまたはＩＬ－１５単独を静脈内注射し、続いてＩＬ－１５－ＡＢＤおよびＩＬ－１５の血清濃度を評価した。図２０Ａに示されるように、ＩＬ－１５－ＡＢＤは、ＩＬ－１５ ＷＴと比較して、より高いＰＫを示した。ＩＬ－１５ Ｔ １／２β＝０．６時間、公共の領域で報告されたもの（約０．５時間）と同様である。研究結果は、ＡＢＤが、ＩＬ－１５ Ｔ １／２βを約７．０時間まで延長することを示しており、これは約１０倍の増加である。ＩＬ－１５－ＡＢＤを、細胞系アッセイを使用して、ヒト血清の安定性についてもアッセイした。図１９Ｂに示されるように、ＩＬ－１５－ＡＢＤは、ＡＢＤなしの市販のＩＬ－１５対照と比較して、ヒト血清中でより安定であった。
例４：ＩＬ－１２－ＡＢＤ
マウスＩＬ－１２単鎖－ＡＢＤ構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で作製し、サイズ排除クロマトグラフによって精製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から産生されるＩＬ－１２－Ａ１０ｍ３は、インビトロアッセイおよび細胞系アッセイの両方において完全に活性である。図２１Ａに示されるように、ＩＬ１２－Ａ１０ｍ３は、マウス血清アルブミンに結合することができ、平衡解離定数（ＫＤ）は２．１ｎＭである。ＨＥＫ２９３Ｔから産生されるＩＬ１２－Ａ１０ｍ３は、社内で産生されるマウスＩＬ１２および市販のマウスＩＬ－１２（Ｒ＆Ｄ）に匹敵する、ヒトＰＢＭＣ増殖を刺激することもできた（図２１Ｂ）。さらに、ＨＥＫ２９３Ｔから産生されるＩＬ１２－Ａ１０ｍ３は、社内で産生されるマウスＩＬ－１２および市販のマウスＩＬ－１２（Ｒ＆Ｄ）の分泌に匹敵する、ヒトＰＢＭＣからのインターフェロンγの分泌を刺激した（図２２）。
ＩＬ－１２－ＡＢＤを用いる治療は、インビボでの腫瘍体積を低減させる。
ＩＬ－１２およびＩＬ－１２－ＡＢＤの腫瘍増殖を阻害する能力を、Ｂ１６－Ｆ１０マウス黒色腫モデルを使用して評価した。図２３に要約されるように、腫瘍接種（０日目）後７日目に腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したときに、ＩＶ注射により３つの同様の用量でＩＬ－１２－ＡＢＤまたはＩＬ－１２のいずれかを用いてマウスを治療した。腫瘍の増殖を、治療後１０日間、２日ごとに監視した。ＰＢＳプラセボは、対照として機能した。図２４～２６および２８に示されるように、ＩＬ－１２およびＩＬ－１２－ＡＢＤの両方は、用量依存的に腫瘍増殖を低減させることができた。さらに、ＩＬ－１２－ＡＢＤは、同様の濃度でＩＬ－１２単独と比較して、腫瘍体積をより効果的に低減させることができた（例えば、図２６の１０日目、および図２８の５０％の腫瘍が２０００ｍｍ３に達するまでの中央値日数を参照されたい）。これらの研究で得られたマウスの縦方向の体重測定では、全てのＩＬ－１２－ＡＢＤ治療群で体重のわずかな変化が示されている（図２７）。観察された体重の有意な変化の欠如は、治療後１２日間にわたる治療群におけるＩＬ－１２－ＡＢＤ毒性の欠如を示唆している。
５日後のＢ１６－Ｆ１０腫瘍保有マウスにおけるＩＬ－１２－ＡＢＤの単回投与（４．５μｇＩＬ－１２－ＡＢＤ、３μｇＩＬ－１２対照と同じモル用量）の薬力学的効果のさらなる特性評価により、ＩＬ－１２－ＡＢＤが、ＩＬ－１２対照の同様のモル用量と比較して、腫瘍増殖の同様の大きな抑制を示したことが実証された。ＩＬ－１２－ＡＢＤ治療マウスは、脾臓重量およびＩＦＮ－γの増加によって示されるように、対照と比較して、マウスの体重に影響を与えることなく、免疫活性化の対応する増加も示した（図２９）。
図３０は、ＩＬ－１２－ＡＢＤ（１．３μｇ）、ＩＬ－１２（３０μｇ）、またはプラセボのいずれかを注射した１０日目のＢ１６－Ｆ１０腫瘍保有マウスの腫瘍体積を比較した研究結果をさらに示す。ＩＬ－１２（１μｇ）およびＩＬ－１２－ＡＢＤ（１．３μｇ）はモル当量であり、インビトロで同じ生物活性を有しているが、ＩＬ－１２－ＡＢＤは、インビボでＩＬ－１２よりも約３０倍強力である（図３０の１０日目の結果を比較する、１．３μｇのＩＬ－１２－ＡＢＤ≧３０μｇのＩＬ－１２）。図３１は、３日目と７日目の図３０に示される研究からのマウスにおけるＩＬ－１２－ＡＢＤおよびＩＬ－１２の造血作用をさらに示す。図３１に示されるように、ＩＬ－１２－ＡＢＤで治療したマウスは、ＩＬ－１２治療マウスおよびプラセボ対照と比較して、３日目にＷＢＣ、好中球、およびリンパ球の一時的な低下を示した。しかし、そのような細胞集団は７日目までに正常に戻った。さらに、ＩＬ－１２－ＡＢＤで治療したマウスのＩＦＮ－γレベルは、ＩＬ－１２および対照で治療したマウスと比較して、３日目および７日目で高かった。
インビボでの抗ＰＤ－１抗体と組み合わせたＩＬ－１２－ＡＢＤまたはＩＬ－１２の抗腫瘍効果の評価。
ＩＬ－１２－ＡＢＤまたはＩＬ－１２、および抗ＰＤ－１抗体を使用した単回併用治療の効果を、８日目にＢ１６－Ｆ１０腫瘍保有マウスで評価した（図３２）。
Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍細胞接種（２ｘ１０４細胞／マウス）の１０日後に、動物（７～１０週齢）を８群（１群あたり８動物）に割り当てた。動物を腫瘍体積に基づいて割り当てた。割り当ての時点で、群当たりの平均腫瘍体積は、１００ｍｍ３であった。０日目（腫瘍が１００ｍｍ３に達したとき）に、各群にＰＢＳ（プラセボ）、ＩＬ１２－ＡＢＤ（１．５ｕｇ、５ｕｇ、１５ｕｇ）、またはＩＬ１５－ＡＢＤ－ＩＬ１２（１．７ｕｇ、６ｕｇ、１７ｕｇ）のいずれかのＩ．Ｖ．単回投与を行った。
群を、体重、腫瘍体積、および擬似生存性について検査した。腫瘍接種前および腫瘍測定時に体重を測定した。腫瘍サイズを、ノギスを使用して２日ごとに２次元で測定し、体積を、式Ｖ＝０．５×ａ×ｂ２を使用して、ｍｍ３表した、式中、ａおよびｂは、腫瘍の長径と短径である。この研究を疑似生存として実施した。腫瘍が２０００ｍｍ３に達したとき、または瀕死であると判断したときに、各マウスを安楽死させた。
図３３に示されるように、ＩＬ－１２－ＡＢＤは、抗ＰＤ－１またはモル当量の組換えＩＬ－１２のいずれかによる治療よりも効果的であった。さらに、ＩＬ－１２－ＡＢＤは、組換えＩＬ－１２と抗ＰＤ－１治療の組み合わせと同じくらい効果的であった。興味深いことに、組換えＩＬ－１２に抗ＰＤ－１ Ａｂを添加すると、いずれかの治療単独の有効性が改善されたが、抗ＰＤ－１治療はＩＬ－１２－ＡＢＤにそれ以上の利益をもたらさなかった。
ＡＢＤ融合タンパク質のＩＬ－１２の半減期を延長する能力を評価するために、Ｃ５７Ｂマウスに５μｇのＩＬ－１２－ＡＢＤまたはＩＬ－１２単独を静脈注射し、ＩＬ－１２－ＡＢＤおよびＩＬ－１２の血清濃度を評価した。図３３に示されるように、ＩＬ－１２－ＡＢＤは、ＩＬ－１２ ＷＴよりも高いＰＫを示した。ＩＬ－１２ Ｔ １／２β＝２．５時間、公共の領域で報告されたもの（約３．５時間）と同様である。研究結果は、ＡＢＤが、ＩＬ－１２ Ｔ １／２βを約９．５時間まで延長することを示しており、これは約４倍の増加である。
例５：二重特異性ＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２
ＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２、ｈＩＬ１５（Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ）－Ａ１０ｍ３－ｍＩＬ－１２ｓｃおよびｍＩＬ－１２ｓｃ－Ａ１０ｍ３－ｈＩＬ１５（Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ）構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で作成し、サイズ排除クロマトグラフで精製した。これらの構築物の配列を図３４に示す。ｈＩＬ１５（Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ）－Ａ１０ｍ３－ｍＩＬ－１２ｓｃおよびｍＩＬ－１２ｓｃ－Ａ１０ｍ３－ｈＩＬ１５（Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ）構築物が、ＭＳＡ、ＩＬ１２受容体β２、およびＩＬ－１５受容体αに結合する能力をＥＬＩＳＡで評価した。図３５に示されるように、両方のＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２構築物を、細胞培養培地中で用量依存的にＭＳＡに結合させることができた。さらに、両方の二重特異性構築物を、細胞培養培地中で用量依存的にＩＬ１２受容体β２およびＩＬ１５受容体αに結合させることができた。図３５に示されるように、Ｎ末端からＣ末端へ、ＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２の方向を有するＩＬ－１２／ＩＬ－１５－ＡＢＤは、ＩＬ－１２－ＡＢＤ－ＩＬ－１５と比較して、より良好な抗原結合を示した。ＩＬ－１５およびＩＬ－１２を含む追加の二重特異性を図３６に開示する。
ＩＬ－１２およびＩＬ－１５活性に関するＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２の評価
ＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２のＩＬ－１２およびＩＬ－１５活性をさらに評価した（図３７および３８）。
ＩＬ－１２活性を評価するために、ＰＢＭＣからのリンパ球は、４日間ＰＨＡ－Ｐで治療し、３日目にｒｈＩＬ－２で治療することによって芽球形成を引き起こされた。次いで、リンパ芽球が、ＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２またはＩＬ－１２対照のいずれかを用いて２日間処理され、リンパ芽球増殖およびＩＦＮ－γ分泌に基づいて、ＩＬ－１２活性を評価した（図３７Ａ）。ＩＬ－１５活性を、ＣＴＬＬ－２細胞傷害性Ｔリンパ球増殖アッセイを使用して評価した（図３８Ａ）。
図３７に示されるように、ＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２は、リンパ芽球の増殖（図３７Ｂ）およびＩＦＮ－γの分泌（図３７Ｃ）によって評価されるＩＬ－１２活性を示した。さらに、ＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２は、ＣＴＬＬ－２増殖アッセイにおいてＩＬ－１５を示した（図３８Ｂ）。したがって、主題のＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２とＩＬ－１５の両方の生物活性を示した。
Ｂ１６－Ｆ１０マウス黒色腫モデルにおけるＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２の抗腫瘍効果
特定の動作理論に縛られることなく、ＩＬ－１５／ＩＬ－１２ ＡＢＤは、相乗的な生物活性を提供すると考えられている。特に、ＩＬ－１２はＩＬ－１５α受容体、ＩＦＮ－γを増加させる。ＮＫ／Ｔ細胞、およびＴＨ１免疫、一方Ｔｒｅｇ細胞のダウンレギュレーション。ＩＬ－１５は、ＩＬ－１２β１受容体およびＮＫ細胞を増加させ、一方でＣＤ８細胞の記憶喪失を低減させる。
ＩＬ１２－ＡＢＤのＩＬ１５－ＡＢＤ－ＩＬ１２への抗腫瘍効果と疑似生存性を、Ｂ１６－Ｆ１０マウス黒色腫モデルを使用して評価した（図３９）。
Ｂ１６－Ｆ１０腫瘍細胞接種（２ｘ１０４細胞／マウス）後の１０日目に、動物（７～１０週齢）を８群（１群あたり８動物）に割り当てた。動物を腫瘍体積に基づいて割り当てた。割り当ての時点で、群当たりの平均腫瘍体積は、１００ｍｍ３であった。０日目（腫瘍が１００ｍｍ３に達したとき）に、各群にＰＢＳ（プラセボ）のＩ．Ｖ．単回投与、またはＩＬ１２－ＡＢＤ（１．５ｕｇ、５ｕｇ、１５ｕｇ）、またはＩＬ１５－ＡＢＤ－ＩＬ１２（１．７ｕｇ、６ｕｇ、１７ｕｇ）のモル当量投与を行った。
図３９に示されるように、ＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２は、等モル濃度でＢ１６－Ｆ１０マウスモデル内のＩＬ－１２－ＡＢＤと比較して、抗腫瘍活性が優れていた。他の同様のインビボ研究では、Ｉ－１５（１ｕｇ）と組み合わせた遊離ＩＬ－１２（５ｕｇ）は、ＩＬ－１５－ＡＢＤ－ＩＬ－１２（６ｕｇ）の５０％未満の効力があることが示されている（データは示していない）。
例６：抗ＴＧＦβ－ＡＢＤ
表面プラズモン共鳴技術を使用してバイオパニングおよびスクリーニングを行った後、抗ｈＴＧＦβ１結合ドメインを同定した：１Ａ１０、１Ｆ１１、２Ｈ６、４Ｂ９、４Ｃ１０、４Ｄ９、４Ｇ３、４Ｇ６、４Ｈ４、４Ｈ７、および６Ｈ１１。これらのクローンは、ｈＴＧＦβ２、３、およびｍＴＧＦβ１に対して交差反応性を示し、ｈＴＧＦβ１のその受容体ＩＩへの結合を潜在的に阻害した。続いて、クローンをｓｃＦｖとしての精製およびさらなる特性評価のために選択した。
標準的なＥＬＩＳＡ技術を使用して、ｓｃＦｖをマウスおよびヒトＴＧＦβ－１に対する交差反応性についてスクリーニングした。結合ＥＬＩＳＡは、２Ｈ６、４Ｇ３、４Ｈ７、４Ｂ９、４Ｄ９、および６Ｈ１１が、ｍＴＧＦβ－１およびｈＴＧＦβ－１の両方に対して良好な交差反応性を有することを示している。
抗ＴＧＦβ－１ｓｃＦｖがＴＧＦβ－１に結合し、ＴＧＦβＲ－ＩＩとの相互作用を遮断できるかどうかを判定するために、結合および遮断ＥＬＩＳＡを行った。２Ｈ６、４Ｇ３、４Ｈ７、４Ｂ９、および４Ｄ９は全て、ｍＴＧＦβおよびｍＴＧＦβＲ－ＩＩ相互作用の良好な遮断効果と阻害を示す。
これらの抗ＴＧＦβ－１ ｓｃＦｖのいくつかを、ＴＧＦβ－１の生物活性に干渉する能力について試験した。抗ＴＧＦβ－１ ｓｃＦｖ ４Ｈ７および４Ｄ９の配列を、図４０ＡおよびＢに示す。
ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞のＴＧＦβ１誘導増殖の遮断
調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫系の恒常性に影響を与えることができる。欠陥が重度の自己免疫疾患をもたらす可能性があるため、そのようなＴｒｅｇは自己寛容を維持するために不可欠である。癌において、腫瘍細胞は、免疫系の恒常性に影響を及ぼすサイトカインを分泌できる。特に、腫瘍細胞は、ＴＧＦβを分泌する可能性があり、これが循環するＴｒｅｇの数に影響を与える可能性がある。ＴＧＦβ１への暴露は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－ＴからのＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇサブセットの増殖をもたらすことが以前に実証されている。これらの誘導されたＴｒｅｇは、腫瘍抗原特異的細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を阻害することにより、Ｔ細胞のアネルギー応答の誘導に寄与することができる。
図４１に示されるように、組換えＴＧＦβ１は、健康なヒトドナーＰＢＭＣから単離された混合Ｔ細胞集団からのＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓの増殖を刺激することができる。しかし、抗ＴＧＦβ１Ｄ１１抗体またはＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖ ２Ｈ６、４Ｈ７、および４Ｄ９を用いるＴＧＦβの遮断は、いずれも用量依存的にＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋ＴｒｅｇｓのＴＧＦβ誘導増殖を有意に阻害する。したがって、そのようなＴＧＦβ１ ｓｃＦｖは、癌におけるＴＲｅｇ増殖を低減させるのに有用である。
ＴＧＦβ１誘導上皮から間葉への移行（ＥＭＴ）の遮断
ＴＧＦβへの曝露は、上皮から間葉への移行を誘導することが既知である。このプロセス中に、上皮細胞は、丸石形態を有する組織化され、極性化され、密接に接続された細胞の上皮シートから、形態が間葉性に見える非組織化および運動性細胞に分化転換する。ＥＭＴ中に、細胞の侵襲能力が活性化され、それにより細胞の腫瘍形成能力が強化される。Ｅ－カドヘリンは、上皮細胞の一般的に使用されるマーカーであり、上皮細胞間の接着接合に局在している。Ｅ－カドヘリンの損失は、分化転換プロセスを示すＥＭＴの強力なマーカーである。（図４２Ａ）さらに、ビメンチンは運動性の高い細胞に関連している。したがって、細胞におけるビメンチン発現の誘導はまた、運動性の増加およびインビボでの局所的浸潤の増加を示す。
図４２および４３に示されるように、抗ＴＧＦβ１Ｄ１１抗体またはＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖによるＴＧＦ－βの遮断は、ＴＧＦ－β１誘導上皮から間葉への移行（図４２）および移動（図４３）を逆転させる。マウス４Ｔ１細胞を、ＴＧＦ－β１（パネル２）、ＴＧＦ－β１および１Ｄ１１（パネル３）、またはＴＧＦ－β１および抗ＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖ（パネル４）が補充された増殖培地中で培養し、次いで固定し、Ｅ－カドヘリン抗体（緑色）およびビメンチン抗体（紫）で染色した。核をＤＡＰＩ（青）で対比染色した。ＴＧＦ－β１による治療によって、細胞間接合部からのＥ－カドヘリンの損失が誘導され、ビメンチンの発現が増加した。この効果は、本明細書に記載される１Ｄ１１または主題の抗ＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖの添加によって逆転する（図４２パネル３および４）。さらに、本明細書に記載される抗ＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖは、ＴＧＦ－β１媒介癌細胞移動を遮断することができる（図４３）。
ＴＧＦβ１誘導Ｓｍａｄ活性化の中和
ＴＧＦβスーパーファミリーは、細胞増殖、分化、移動、細胞生存、血管新生、創傷治癒、および免疫監視を含む様々な生物学的プロセスを調節する多面性サイトカインからなる。ヒトにおいては、主要なアイソフォームはＴＧＦβ１であり、それは、様々な組織型で発現している。ＴＧＦβは、ほとんどの正常な上皮細胞の増殖を阻害する。さらに、上皮起源の癌の初期段階では、ＴＧＦβは、細胞増殖阻害剤として機能する。したがって、癌の開始時に、ＴＧＦβは、腫瘍抑制因子として機能する。しかし、癌の進行の後期には、腫瘍細胞は、ＴＧＦβの増殖阻害効果に抵抗性になり、ＴＧＦβは、腫瘍プロモーターの役割を果たす。実際、ＴＧＦβ１は、様々な腫瘍において過剰発現することが示されている。ＴＧＦβ経路の活性化は、ＴＧＦβリガンドのＩＩ型ＴＧＦβ受容体（ＴβＲＩＩ）への結合を介して起こり、次いで、それは、ＴβＲＩＩとＴβＲＩとの間の結合とオリゴマー化を誘導する。このオリゴマーが形成されると、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３は、ＴβＲＩによって補充され、リン酸化される。次いで、リン酸化されたＳｍａｄ２またはＳｍａｄ３は、細胞質内のＳｍａｄ４に結合し、この複合体は核に移動し、そこでプロモーター領域と相互作用して標的遺伝子の転写を活性化する。したがって、ＴＧＦβの血清不足の細胞への添加後のＳｍａｄ２の急速なリン酸化によって、ＴＧＦβ経路の活性化が測定可能となる。しかし、ＴＧＦβの効果的な遮断は、Ｓｍａｄ２のリン酸化を阻害する。ここで、Ｓｍａｄ２リン酸化の不在は、主題の抗ＴＧＦβｓｃＦｖ構築物によるＴＧＦβの効果的な遮断の尺度として使用され得る。
血清不足状態のヒト細胞（図４４Ａ）またはマウス細胞（図４４Ｂ）を使用して、ヒト組換えＴＧＦβ１（図４４Ａ）またはマウスＴＧＦ－β１、－β２、および－β３（図４４Ｂ）の添加がＳｍａｄ２のリン酸化を誘導することが判断された。そのようなリン酸化は、ＴＧＦβが、対照の抗ＴＧＦβ１Ｄ１１抗体またはＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖ構築物２Ｈ６、４Ｈ７、および４Ｄ９とプレインキュベートされると、用量依存的に低減する。これらのデータは、２Ｈ６、４Ｈ７、および４Ｄ９ ｓｃＦｖ構築物がＴＧＦβ１を隔離し、ＴβＲＩＩ／ＴβＲＩとの相互作用を阻害し得ることにより、末期期癌の間のＴＧＦβ活性化カスケードを阻害し得ることを示唆している。
４Ｄ９抗ＴＧＦβ－１－ＡＢＤ
例示的なＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖ－ＡＢＤ構築物の配列（４Ｄ９Ｍ－Ａ６ｍおよび４Ｈ７－Ａ６ｍ）を図４５Ａに示す。図４５Ｂに示されるように、抗ＴＧＦβ－１－ＡＢＤは、抗ＴＧＦβ－１ ｓｃＦｖ Ｔ １／２βを１０６分から１０．６時間に延長した。
大腸菌およびＨＥＫ細胞内で産生される抗ＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖ－ＡＢＤ（ＴＧＦ－β１の二価）を、マウス血清アルブミンへの結合について評価した（図４７）。構築物の３つの異なる方向を評価した。ＡＢＤのＮ末端に結合した２つの抗ＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖ（「Ｂｉ Ｎ末端」）、ＡＢＤのＣ末端に結合した２つの抗ＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖ（「Ｂｉ Ｃ末端」）、または、ＡＢＤのＮ末端およびＣ末端のそれぞれに結合した１つの抗ＴＧＦ－β１ ｓｃＦｖ（「Ｂｉ Ｍｉｄ」）。図４６に示されるように、全ての構築物は，マウス血清アルブミンへの結合を示した。大腸菌内で産生される構築物に関して、Ｂｉ ＭｉｄはＮ末端方向よりもＭＳＡへの良好な結合を示した。ＨＥＫ細胞内で産生される構築物に関して、Ｂｉ Ｎ末端方向は、Ｂｉ ＭｉｄまたはＢｉ Ｃ末端方向よりもＭＳＡへの良好な結合を示した。
図４７に示されるように、Ｔ細胞増殖のＴＧＦβ－１媒介阻害は、そのような構築物によって逆転した（すなわち、Ｔ細胞増殖が増加する）（図４６Ｂ）。さらに、４Ｄ９Ｍ－ＡＢＤは、ヒトＴＧＦβ－１および同族受容体と結合するヒトＴＧＦβ－３を遮断することが示されている（データは示していない）。
全ての引用文献は、本明細書にそれらの全体が参照により明示的に組み込まれる。
本発明の特定の実施形態を例示の目的で上述のように説明してきたが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく詳細の多数の変形をなし得ることが当業者には理解されよう。

Claims (24)

  1. １又は複数の融合パートナーに結合したアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）を含むＡＢＤ融合タンパク質であって、
    前記ＡＢＤが、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む、配列番号２５を有する可変重鎖と、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む、配列番号２９を有する可変軽鎖と、を含む、
    ＡＢＤ融合タンパク質。
  2. 前記可変重鎖及び前記可変軽鎖が、それぞれ、配列番号２５及び２９の可変重鎖及び可変軽鎖を含む、請求項１に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  3. 前記１又は複数の融合パートナーのそれぞれが、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＩＦＮ－αからなる群から選択される、請求項１又は２に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  4. 前記１又は複数の融合パートナーのそれぞれが、抗ＴＧＦβ ｓｃＦｖ、抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｃＦｖ、及び抗ＴＮＦ ｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１又は２に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  5. 前記１又は複数の融合パートナーのそれぞれが、抗ＩＬ－１ ｓｃＦｖ、抗ＩＬ－６ ｓｃＦｖ、抗ＩＬ－８ ｓｃＦｖ、抗ＩＬ－１７（Ａ－Ｆ）ｓｃＦｖ、及び抗ＩＬ－２３ ｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１又は２に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  6. 前記１又は複数の融合パートナーが、ＩＬ－１２及びＩＬ－１５、ＩＬ－１８及びＩＬ－１２、ＩＬ－１８及びＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－１２、ＩＬ－１２及びＩＬ－１２、並びにＩＬ－７及びＩＬ－１５からなる群から選択される２つの融合パートナーである、請求項１から５のいずれか１項に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  7. 前記１又は複数の融合パートナーが、リンカーによって、前記ＡＢＤに共有結合している、請求項１から６のいずれか１項に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  8. 前記１又は複数の融合パートナーが、ＩＬ－１８及びＩＬ－１２を含む、請求項６に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  9. Ｎ末端からＣ末端へ、（ＩＬ－１８）－Ｌ１－（ＡＢＤ）－Ｌ２－（ＩＬ－１２）の式を有し、
    Ｌ１が第１のリンカーであり、Ｌ２が第２のリンカーである、
    請求項８に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  10. 前記１又は複数の融合パートナーが、ＩＬ－１８及びＧＭ－ＣＳＦを含む、請求項６に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  11. Ｎ末端からＣ末端へ、（ＩＬ－１８）－Ｌ１－（ＡＢＤ）－Ｌ２－（ＧＭ－ＣＳＦ）の式を有し、
    Ｌ１が第１のリンカーであり、Ｌ２が第２のリンカーである、
    請求項１０に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  12. 前記１又は複数の融合パートナーが、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－１２を含む、請求項６に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  13. Ｎ末端からＣ末端へ、（ＧＭ－ＣＳＦ）－Ｌ１－（ＡＢＤ）－Ｌ２－（ＩＬ－１２）の式を有し、
    Ｌ１が第１のリンカーであり、Ｌ２が第２のリンカーである、
    請求項１２に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  14. 前記１又は複数の融合パートナーが、ＩＬ－１２及びＩＬ－１５を含む、請求項６に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  15. Ｎ末端からＣ末端へ、（ＩＬ－１２）－Ｌ１－（ＡＢＤ）－Ｌ２－（ＩＬ－１５）の式を有し、
    Ｌ１が第１のリンカーであり、Ｌ２が第２のリンカーである、
    請求項１４に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  16. 前記１又は複数の融合パートナーが、ＩＬ－１２を含む、請求項６に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  17. Ｎ末端からＣ末端へ、（ＩＬ－１２）－Ｌ１－（ＡＢＤ）－Ｌ２－（ＩＬ－１２）の式を有し、
    Ｌ１が第１のリンカーであり、Ｌ２が第２のリンカーである、
    請求項１６に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  18. 前記１又は複数の融合パートナーが、ＩＬ７及びＩＬ１５を含む、請求項６に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  19. Ｎ末端からＣ末端へ、（ＩＬ－７）－Ｌ１－（ＡＢＤ）－Ｌ２－（ＩＬ－１５）の式を有し、
    Ｌ１が第１のリンカーであり、Ｌ２が第２のリンカーである、
    請求項１８に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  20. 前記ＩＬ－１５が、親ＩＬ－１５と比較して、Ｋ８６Ａ、Ｋ８６Ｒ、Ｎ１１２Ａ、Ｎ１１２Ｓ、Ｎ１１２Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ｓ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ｓ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７９Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ａ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ｄ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｄ／Ｎ７９Ｑ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ａ、Ｋ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｄ、及びＫ８６Ｒ／Ｎ１１２Ａ／Ｎ７１Ｑ／Ｎ７９Ｑからなる群から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む変異ＩＬ－１５である、請求項３又は６に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  21. 前記ＩＬ－１５が、ＩＬ－１５受容体α（ＩＬ－１５Ｒα）に結合した野生型ＩＬ－１５を含む、請求項３又は６に記載のＡＢＤ融合タンパク質。
  22. 請求項１から２１のいずれか１項に記載のＡＢＤ融合タンパク質をコードする核酸。
  23. 請求項２２に記載の前記核酸を含む宿主細胞。
  24. 請求項１から２１のいずれか１項に記載のＡＢＤ融合タンパク質の作製方法であって、前記ＡＢＤ融合タンパク質が産生される条件下で請求項２３に記載の前記宿主細胞を培養することと、前記ＡＢＤ融合タンパク質を回収することと、を含む、ＡＢＤ融合タンパク質の作製方法。
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