KR20170027795A - 항-사이토카인 항체의 동정을 위한 인간-유래 항-인간 il-20 항체 및 검정 - Google Patents

항-사이토카인 항체의 동정을 위한 인간-유래 항-인간 il-20 항체 및 검정 Download PDF

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Abstract

인간 기원의 신규한 인터류킨-20(IL-20) 결합 분자, 특히 인간-유래 항-인간 IL-20 항체뿐만 아니라 IL-20 결합 단편, 이들의 유도체 및 생물공학적 유도체가 제공된다. 또한, 진단 및 치료법에서 이용하기 위한 약학 조성물, 키트 및 방법이 기재된다. 또한, 약학적 이용을 위한 항체 및 이들의 생물공학적 유도체, 특히 재조합 인간-유래 항-인간 사이토카인 항체의 단리를 위한 세포성 효소-연관 리간드 결합 검정이 기재된다.

Description

항-사이토카인 항체의 동정을 위한 인간-유래 항-인간 IL-20 항체 및 검정{HUMAN-DERIVED ANTI-HUMAN IL-20 ANTIBODIES AND ASSAY FOR THE IDENTIFICATION OF ANTI-CYTOKINE ANTIBODIES}
본 발명은 일반적으로 포유류, 바람직하게는 인간 기원의 인터류킨-20(IL-20)에 결합하는 신규한 분자, 특히 인간 모노클로날 항체뿐만 아니라 이들의 단편, 유도체 및 변이체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 IL-20을 인식하는 재조합 인간 환자-유래 항-IL-20 항체뿐만 아니라 이들의 단편, 유도체 및 합성 또는 생물공학적 변이체에 관한 것이다. 또한, 장애의 치료 및 진단에서 유용한 이러한 결합 분자, 항체 및 이들의 모사체를 포함하는 조성물이 기재된다. 또한, 본 발명은 자가면역 및 자가염증성 장애뿐만 아니라 종양, 예컨대 다양한 형태의 관절염, 혈관 염증, 죽상경화, 건선, 아토피성 피부염, 전신 홍반성 루푸스(SLE) 및 암의 면역치료법뿐만 아니라 치료적 개입에서 표적으로의 이용을 위한 항-IL-20 항체 및 이들의 언급된 균등물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 전형적으로 면역 조절에 관여되는 유전자에서의 돌연변이로 인한 손상된 중추 및/또는 말초 관용성 또는 자가-관용성의 손실을 겪는 대상체에서 유래되는 B 세포로부터 단리된 모노클로날 자가항체에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 리간드-결합 도메인에 대한 관심 리간드의 결합 평가 및 평가 샘플에 존재하는 화합물, 특히 상기 리간드 결합을 방해할 수 있는 항체의 확인 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 리간드에 대한 관련 수용체(들)를 발현하는 세포로의 관심 리간드의 결합을 평가하기 위한 신규한 세포 검정 및 후보 화합물, 예로 항체가 세포 상의 그 인지체 수용체(들)에 대한 리간드의 결합을 방지하는지 혹은 지지하는지, 이에 따라 길항 또는 작동 활성을 갖는지 여부의 평가를 위한 상기 검정의 용도에 관한 것이다. 아래에 추가 기재되고 실시예 및 도면에 예시되는 검정의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 검정은 본원에서 발광 세포 결합 검정(LCBA)으로도 불릴 수 있다.
인터류킨-20(IL-20, 인터류킨-10D 또는 ZCYTO10으로도 알려져 있음)은 세포 성장에 영향을 미치는, 염증 및 면역조절 기능을 갖는 다기능성 사이토카인이다(Blumberg et al. Cell 104(2001), 9-19). 인간 IL-20 유전자(NCBI 참조 서열: NM_018724)는 염색체 1q32.1 상에 위치하며, 176개 아미노산(aa)을 포함하는 단백질을 인코딩한다(UniProtKB/Swiss Prot 식별자: Q9NYY1). IL-20은 하기 9개 구성원으로 이루어지는 IL-10 패밀리에 속한다: IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26, 및 가장 멀리 관련되는 IL-28A, IL-28B, 및 IL-29(Ouyang et al. Annu. Rev. Immunol . 29(2011), 71-109). IL-10 패밀리의 사이토카인은 조직 상피층의 온전성 및 항상성을 유지하기 위해 필수적이다. 상기 패밀리의 구성원은 조직 상피로부터 선천성 면역 반응을 촉진하여 바이러스 및 박테리아 감염에 의해 유도되는 손상을 제한할 수 있다. 맥락에 따라, IL-20은 강력한 염증성(Hsieh et al. Genes Immun . 7(2006) 2434-242), 혈관생성(Chen et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26(2006), 2090-2095) 및 화학유인 특징(Hsu et al. Arthritis Rheum. 54(2006), 2722-2733)을 갖는다. 그러나, 메치실린-내성 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로의 감염 동안 IL-19 및 IL-24와 함께 IL-20의 면역억제 역할도 확인되었다(Myles et al. Nature Immunol . 14(2013), 804-811). IL-20은 우선적으로 하기 5가지 주요 세포 유형에서 발현된다: 상피 세포, 근상피 세포, 내피 세포, 단핵구 및 골격근 세포(Hsing et al. Cytokine 35(2006), 44-52).
이는 저산소증 및 염증성 자극, 예컨대 IL-1β 및 지질다당류(LPS)에 의해 조절된다(Otkjaer et al. J. Invest. Dermatol .127(2007), 1326-1336; Chen and Chang J. Immunol. 182(2009), 5003-12). IL-20은 IL-20 수용체(R) 복합체 IL-20RA/IL-20RB를 통해(I형) 또는 IL-20 수용체 복합체 IL-22RA/IL-20RB를 통해(II형) 신호 전달물질 및 전사 활성화제(STAT) 1 및 3의 활성화를 유도한다(Parish-Novak et al. J. Biol . Chem . 277(2002), 47517-47523; Logsdon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(2012), 12704-9). 두 수용체 복합체는 모두 피부에서 발현되며, 건선 피부 및 아토피성 피부염에서 극적으로 상향조절된다(Blumberg et al. Cell 104(2001), 9-19; Toyhama et al. Eur. J. Immunol. 39(2009), 2779-88). 트랜스제닉 마우스에서 IL-20의 과발현은 비정상적 표피 분화를 포함하는 피부 이상과 함께 신생체의 치사를 유도한다(Blumberg et al. Cell 104(2001), 9-19; Liu et al. Blood 102(2003), 3206-3209). IL-20은 각질세포, 내피 및 활액 세포를 표적으로 하며, 건선과 연관된다(Wei et al. Clin . Immunol. 117(2005), 65-72; Sa et al. J. Immunol. 178(2007), 2229-2240).
또한, IL-20 및 그 수용체는 류마티스성 관절염(RA) 활액 조직 생검 및 강직성 척추염(AS)에서 과발현되는 것이 관찰되었으며(Kragstrup et al. Cytokine 41(2008), 16-23), 여기서 IL-20 및 그 수용체의 발현 수준은 염증의 중증도와 양의 상관성을 가졌다(Hsu et al. Arthritis Rheum. 54(2006), 2722-2733). IL-20은 RA 활액 섬유아세포(RASF)가 단핵구 화학유인 단백질(MCP)-1, IL-6 및 IL-8을 분비하도록 유도하였고, 호중구 화학주성, RASF 이동 및 내피 세포 증식을 촉진하였다. 콜라겐-유도 관절염(CIA)의 래트 모델은 가용성 IL-20RA가 CIA를 갖는 래트에서 관절염을 유의미하게 감소시켰으므로, IL-20이 관절염의 병리에 관여됨을 나타내었다(Hsu et al. Arthritis Rheum. 54(2006), 2722-2733).
류마티스성 관절염(RA) 및 건선의 진행 동안의 그 촉진 역할에 더하여, IL-20은 몇몇 다른 장애, 예컨대 죽상경화(Chen et al. Arterioscler . Thromb . Vasc. Biol. 26(2006), 2090-2095), 급성 신부전(Li et al. Genes Immun. 9(2008), 395-404), 궤양성 장염(Fonseca-Camarillo et al. J. Clin. Immunol. 33(2013), 640-8), 허혈성 뇌졸중(Chen and Chang J. Immunol. 182(2009), 5003-12)뿐만 아니라 골감소증 및 골다공증(Hsu et al. J. Exp. Med. 208(2011), 1849-1861)과 기능적으로 연관된 것으로 나타났다. 또한, IL-20은 조혈 세포의 발달에서 역할을 담당한다(Liu et al. Blood 102(2003), 3206-3209).
IL-20 유전자의 이상조절된 발현이 비-소세포 폐암(NSCL)(Baird et al. Eur. J. Cancer 47(2011), 1908-18) 및 근육 침투성 방광암(Lee et al. PLoS One 7(2012), e40267)에서 관찰되었다. IL-20은 p21(WAF1) 단백질 발현의 상향조절을 유도하여 핵 인자(NF-κB) 활성화를 야기하는 세포외 신호-조절 키나아제(ERK)-매개 MMP-9 단백질 발현을 통해 방광암 세포의 이동을 촉진한다(Lee et al. J. Biol. Chem. 288(2013), 5539-52). IL-20 및 그 수용체 서브유닛의 발현은 비-종양 조직에서보다 임상적인 구강 종양 조직뿐만 아니라 유방암 조직에서 더 높았다(Hsu et al. Mol . Cancer Res. 10(2012) 1403-9, Hsu et al. J. Immunol. 188(2012) 1981-91). 시험관 내에서, IL-20은 종양 괴사 인자(TNF)-α, IL-1β, MCP-1, CCR4, 및 CXCR4를 촉진하였고 활성화된 STAT3 및 AKT/JNK/ERK 신호를 통해 구강 암 세포의 증식, 이동, 반응성 산소종(ROS), 생산 및 집락 형성을 증가시켰다. 생체 내에서, 마우스 항-인간 IL-20 모노클로날 항체 7E를 이용한 IL-20의 중화는 구강 암 세포에서 종양 성장 및 염증을 감소시켰다(Hsu et al. Mol. Cancer Res. 10(2012) 1403-9).
결론적으로, IL-20은 매우 상이한 질환 환경에서 비정상적 세포 성장, 이동을 촉진하고, 염증의 원위 부위에서 작용할 수 있다. 따라서, IL-20은 아직 완전히 이해되지는 않았지만 중요한 신규한 치료 표적을 나타내며, IL-20의 생물학적 활성 및 기능을 중화할 수 있고, 유해한 IL-20 활성과 연관되는 장애 또는 질병의 치료 및 진단에서 유용하며, 인간에서 관용되는 IL-20 특이적 결합 분자에 대한 요구가 존재한다.
상기 문제에 대한 해결책은 청구범위에서 규명되고 기재에 개시되며 실시예 및 도면에서 아래에 추가로 예시된 바와 같은 본 발명의 구현예에 의해 제공된다.
발명의 요약
본 발명은 IL-20 특이적 인간-유래 모노클로날 항체뿐만 아니라 IL-20을 인식하는 이들의 단편, 유도체 및 합성 또는 생물공학적 변이체에 관한 것이다. 특히, 첨부된 실시예 및 도면에 나타낸 바와 같이 IL-20에 대한 선택적 결합 프로필을 가지며 결합 및 중화 활성을 나타내는 인간 모노클로날 항-IL-20 항체가 제공된다. 이들의 중화 특성으로 인해, 본 발명의 항체는 치료적, 예후적 및 진단적 유용성을 가지며, 이는 이들을 원치 않는 면역 반응의 개시 및/또는 유지에서 IL-20 활성과 연관되는/활성이 관여되는 다양한 자가면역 및 염증성 장애 및 질병, 예컨대 다양한 형태의 관절염(예로, 류마티스성 관절염(RA) 또는 척추관절염), 염증성 장 질환(IBD), 크론병, 건선, 혈관 염증 및 죽상경화, 아토피성 피부염 및 암에 관한 적용에서 특히 귀중하게 만든다; 이들 및 추가로 가능한 항-IL-20 치료 및 진단 적응증에 대해서는 상기 배경 섹션을 또한 참고하라.
본 발명의 항체는 AIRE(자가면역 조절인자) 유전자에서의 돌연변이로 인해 자가면역 다중내분비병증 증후군 1형(APS1)을 겪는 인간으로부터 단리되었으며(Peterson et al., Nat. Rev. Immunol. 8(2008), 948-957) 리뷰를 위해서는 국제 출원 WO2013/098419를 참고하라.
상기 맥락에서, 본 발명에 따라 수행된 실험에서, 가장 강력한 중화 후보 항체를 확인, 단리 및 특성규명하려는, 특히 선택하려는 최초 시도는 까다로운 것으로 나타났다. 예를 들어, 지금까지뿐만 아니라 본 발명에 따라 수행된 최초 실험에서, 루시퍼라아제 면역침전 시스템(LIPS) 검정이 원하는 IL-20에 대한 IgG 항체를 검출하기 위해 이용되어 왔고, 이는 중화 활성을 평가하기 위해, ELISA에 의해서는 누락되는 가능한 입체형태 에피토프에 대한 항체 모니터링 가능성을 갖는 것으로 보고되었다; 문헌 [Burbelo et al., Expert Rev. Vaccines 9(2010), 567-578, 저자 기고문; PMC 2012, August 13에서 이용 가능]을 참고하라. 그러나 본 발명에 따라 수행된 실험에서는 LIPS 검정이 중화 및 비-중화 항체를 구별하지 않았으므로, 상기 방법에 따른 항체의 확인 및 선택은 그 중화 활성의 관점에서 실제로 가장 강력한 항체를 제공하지 않을 수 있다.
따라서, 도 7에 예시되고 실시예 5에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따라 리간드에 대해 유도된 후보 항체가 세포 상 각각의 수용체에 결합하는 그 능력을 방지하는지 여부를 결정하는데 이용하기 위해 관련 수용체(들)을 발현하도록 유도된 세포에 대한 관심 리간드의 결합을 평가하기 위한 신규한 검정이 개발되었다. 예로서, 관심 리간드가 리포터, 즉 루시퍼라아제 융합 단백질로서 이용되므로, 리간드의 세포성 결합은 세포-연관 리포터, 즉 루시퍼라아제 활성에 의해 측정된다. 상기 검정은 리포터 활성에서의 변화, 즉 루시퍼라아제에 의한 광 방출 감소를 관찰함으로써 리간드에 대해 유도된 항체가 세포 상 각각의 수용체에 결합하는 그 능력을 방지하는지 여부의 평가를 허용한다. 따라서 본 발명에 따라, 신규한 발광 세포 결합 검정(LCBA)이 구축되었다. 상기 신규한 검정 덕분에, 강력한 IL-20 중화 항체를 확인할 수 있었다.
따라서, 실시예에 예시된 대상 항체는 (ⅰ) 항-IL-20 항체의 다량 생산체인 환자(APS1-9로 명명됨) 및 (ⅱ) 신규한 세포성 리간드 결합 리포터 검정의 이용 덕분에 단리되고 확인될 수 있었다.
상세하게는, 본 발명은 하기에 대한 것이다:
[1] 인간-유래 모노클로날 항-인간 인터류킨-20(IL-20) 항체 또는 IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체로서, 그 가변 영역에
(a) 하기에 도시된 VH 및/또는 VL 가변 영역 아미노산 서열의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR):
(ⅰ) 도 1(VH)(서열번호 2, 10, 18 및 26); 및
(ⅱ) 도 1(VL)(서열번호 4, 12, 20 및 28);
(b) 도 1에 도시된 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열;
(c) (a)의 임의의 하나의 아미노산 서열의 부분적 변경으로 생성되는 아미노산 서열로 이루어지는 적어도 하나의 CDR; 또는
(d) (b)의 아미노산 서열의 부분적 변경으로 생성되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역
을 포함하며; 바람직하게는 항체가 IL-20의 생물학적 활성을 감소시키거나 중화할 수 있는 항체 또는 IL-20 결합 단편.
[2] [1]에 있어서,
(1) 아미노산 서열 101-PDHYTLRKISSLANSFLT-118(서열번호 69), 102-DHYTLRKISSLANSF-116(서열번호 70) 및/또는 101-PDHYTLRKISSLANSFL-117(서열번호 72)로 이루어지는 IL-20 유래 펩타이드를 인식하며, P101, I109, S110 및/또는 L117만 또 다른 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환될 수 있고, (2) 아미노산 서열 97-NYQTPDHYTLRKISSLAN-114(서열번호 71)로 이루어지는 펩타이드를 인식하지 않거나 실질적으로 인식하지 않는 항체 또는 IL-20 결합 단편.
[3] [1] 또는 [2]에 있어서,
쥐과 IL-20에 결합하고/하거나 이를 중화할 수 있는 항체 또는 IL-20 결합 단편.
[4] [2] 또는 [3]에 있어서,
생물학적 활성이 하기:
(a) 세포 기재 STAT(신호 전달물질 및 전사 활성화제) 활성화 검정에서의 인간 IL-20 신호전달;
(b) IL-20 사이토카인 세포-표면 수용체 결합의 저해;
(c) 인간 IL20R1/IL20R2 수용체 복합체의 인간 IL-20 매개 활성화; 및/또는
(d) 인간 IL-20의 전-염증성 활성
인 항체 또는 IL-20 결합 단편.
[5] [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서,
적어도 CDR이 도 1에 나타낸 대응하는 CDR과 적어도 70%, 바람직하게는 80% 및 보다 바람직하게는 적어도 90% 동일하며/하거나 VH 및/또는 VL 가변 영역의 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 도 1에 나타낸 대응하는 프레임워크 영역과 적어도 70%, 바람직하게는 80% 및 보다 바람직하게는 적어도 90% 동일한 항체 또는 IL-20 결합 단편.
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서,
Ig1 또는 IgG4인 항체 또는 IL-20 결합 단편.
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서,
표 1에 나타낸 CH 및 CL 아미노산 서열(서열번호 6, 14, 22 및 30)로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 60% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CH 및/또는 CL 불변 영역을 포함하는 항체 또는 이들의 IL-20 결합 단편.
[8] 예를 들어 실시예 2에 따라 결정될, 인간 IL-20으로의 결합에 대해 [1] 내지 [7] 중 어느 하나의 항체와 경쟁하는 인간 항체 또는 이들의 항원-결합 분자.
[9] [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서,
단일쇄 Fv 단편(scFv), F(ab') 단편, F(ab) 단편, 및 F(ab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체.
[10] [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 항체 또는 항원-결합 단편의 하나의 면역글로불린쇄의 적어도 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서, 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드가 가변 영역 및 적어도 일부 불변 도메인을 인코딩하는 cDNA인 폴리뉴클레오타이드.
[11] [10]의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
[12] [10]의 폴리뉴클레오타이드 또는 [11]의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
[13] 항-IL-20 항체 또는 이들의 면역글로불린쇄(들)의 제조 방법으로서,
상기 방법이
(a) [12]의 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 항체 또는 이들의 면역글로불린쇄(들)를 배양물로부터 단리하는 단계
를 포함하며, 바람직하게는 항-IL-20 항체가 각각 상기 정의되고 기재의 하기 구현예에 기재된 바와 같은 항-인간 IL-20 항체 또는 IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체인 방법.
[14] [11]의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되거나 [13]의 방법에 의해 수득 가능한 항체 또는 이들의 면역글로불린쇄(들).
[15] [1] 내지 [9] 또는 [14] 중 어느 하나의, 또는 [12]의 세포를 배양하여 수득되는 항-IL-20 항체 또는 IL-20 결합 단편을 포함하는 면역접합체로서, 바람직하게는 방사선핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩타이드 태그, 중금속, 자기 입자, 약물, 또는 독소를 포함하는 면역접합체.
[16] [1] 내지 [9] 또는 [14] 중 어느 하나의 항-IL-20 항체 또는 IL-20 결합 단편, [15]의 면역접합체, [10]의 폴리뉴클레오타이드, [11]의 벡터, [12]의 세포를 포함하는 조성물로서, 바람직하게는 조성물이
(a) 약학 조성물이고, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하며 선택적으로 염증성 질환의 치료를 위해 유용한 추가 제제를 추가로 포함하거나;
(b) 진단 조성물 또는 키트이고, 면역- 또는 핵산-기반 진단 방법에서 통상적으로 이용되는 시약을 추가로 포함하는
조성물.
[17] [1] 내지 [9] 또는 [14] 중 어느 하나의 항-IL-20 항체 또는 IL-20 결합 단편, [15]의 면역접합체, 또는 [16]의 조성물로서,
(a) 면역 매개 또는 자가면역 질환 또는 질병의 치료 또는 진행 예방 방법;
(b) 면역 매개 또는 자가면역 질환 또는 질병과 연관되는 증상의 완화 방법; 및/또는
(c) 환자에서 IL-20의 발현 및 활성과 연관되는 면역 매개 또는 자가면역 질환 또는 질병의 존재에 대한 대상체의 진단 또는 스크리닝 방법, 또는 그 발생에 대한 대상체의 위험 결정 방법
에서 이용하기 위한 것이며, 바람직하게는 상기 질환이 염증성 장 질환(IBD; 크론병, 궤양성 장염 및 셀리악 질환 포함), 강직성 척추염 및 다른 형태의 척추관절염, 건선, 건선 관절염, 류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 골다공증, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증(MS), 전신 홍반성 루푸스(SLE), 루푸스 신염, 또는 이들의 조합, 피부, 혀, 식도 또는 폐의 편평 상피 세포 암종을 포함하는 암, 및 혈관 염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 면역접합체 또는 조성물.
[18] 하기 단계를 포함하는, IL-20의 발현 및 활성과 연관되는 장애의 치료에서 이용하기 위한 약학 조성물의 제조 방법:
(a) [12]의 세포를 배양하는 단계;
(b) 배양물로부터의 항체, 생물공학적 유도체 또는 이들의 면역글로불린쇄(들)를 약학 등급으로 정제하는 단계; 및
(c) 항체 또는 이들의 생물공학적 유도체를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계.
[19] IL-20의 발현과 연관되는 대상체에서의 면역 매개 또는 자가면역 질환 또는 질병의 진단 방법으로서, 대상체 세포의 생물학적 샘플을 [1] 내지 [9], [14] 또는 [15] 중 어느 하나의 항-IL-20 항체 또는 IL-20 결합 단편과 접촉시키는 단계, 및 IL-20의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
[20] 단리된 생물학적 샘플 중 IL-20의 검출 또는 결정 방법으로서, 샘플을 [1] 내지 [9], [14] 또는 [15] 중 어느 하나에 따른 항체와 혼합하는 단계, 항체가 혼합물에 존재하는 IL-20과 복합체를 형성할 수 있도록 하는 단계, 및 혼합물에 존재하는 상기 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 방법.
본 발명은 또한 본원에 개시된 인간-유래 모노클로날 항-인간 IL-20 항체 또는 IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체를 이용하여 본 발명에 따라 채택되는, IL-20 길항제, 예로 선행 기술에 기재된 항-IL-20 항체의 구현예를 이용하며, 이에 관한 것이다. 예를 들어, 특히 항-IL-20 모노클로날 항체를 이용하는 IL-20 활성의 길항은 다양한 염증성 질병의 치료를 위한 유망한 전략으로 기재되어 왔다; 예로, 국제 출원 WO99/27103, WO01/46261, WO03/051384, WO2004/085475, 및 WO2006/086396을 참고하라. 인간 IL-20에 결합하는 래트 또는 쥐과 모노클로날 항체도 기재되어 있다; 예로, 국제 출원 WO2005/052000, WO2007/081465 및 WO2010/000721을 참고하라. 그러나, 지금까지 환자 치료를 위해 적합한 인간-유래 항체는 제공되지 않았다. 본 발명은 당분야의 이러한 및 다른 필요성을 해결한다.
또한 도면에 예시되고 실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명은 평가 물질, 예로 리간드에 대해 유도된 항체와 같은 후보 화합물이 각각의 수용체(들)에 결합하는 그 능력을 방지하는지 여부의 결정에서 이용하기 위해 뿐만 아니라 후보 항-리간드 항체의 경쟁 및 교차-경쟁 검정으로서 이용하기 위해 관심 리간드의 그 인지체 수용체(들)에 대한 결합을 평가하기 위한 신규한 검정을 또한 제공한다.
상기 신규한 검정에서, 관련 수용체(들) 또는 항체는 세포에서 발현되며, 여기서 바람직하게는 적어도 리간드-결합 도메인이 세포 표면 상에 노출되고, 리간드가 융합 분자로서 제공된다, 즉 리포터에 연결되거나 이로 표지된다. 명백하게, 상기 신규한 검정은 후보 화합물, 예로 항체가 세포 상 그 인지체 수용체(들)에 대한 리간드의 결합을 방지하며 이에 따라 길항 활성을 갖는지 여부뿐만 아니라 후보 화합물이, 예를 들어 리간드-수용체 결합을 안정화함으로써 리간드 결합, 이에 따라 리포터 활성을 증강시키는지 여부의 평가를 허용하며, 이에 의해 리간드 결합의 작동제가 확인된다. 상기 맥락에서, 당분야 숙련가는 본 발명의 신규한 검정이 항-리간드 결합 분자뿐만 아니라 인지체 결합 도메인, 즉 리간드의 수용체에 결합하고 리간드 결합을 방해하는 물질의 스크리닝을 위해 유용함을 이해할 것이다. 따라서, 항-리간드 항체를 평가하기 위해 본원에 기재된 구현예 및 실시예는 항-리간드-결합 도메인, 특히 수용체, 바람직하게는 세포외 리간드-결합 부분을 갖는 것들에 동일하게 적용될 수 있다.
예로서, 관심 리간드가 리포터, 즉 루시퍼라아제 융합 단백질로서 이용되므로, 리간드의 세포성 결합이 세포-연관 리포터, 즉 루시퍼라아제 활성에 의해 측정된다. 상기 검정은 리포터 활성에서의 변화, 즉 루시퍼라아제에 의한 광 방출의 감소 또는 증가를 관찰함으로써 리간드에 대해 유도된 항체가 세포 상 각각의 수용체에 결합하는 그 능력을 방지하는지 또는 증강시키는지 여부의 평가를 허용한다.
지금까지 Luker 등(Biotechniques 47(2009), 625-632)은 케모카인-케모카인 수용체 결합에 대한 발광-기반 검정을 기재하였고, 케모카인 수용체의 탐침화 및 케모카인-케모카인 수용체 결합의 소분자 조정물질의 확인을 위한 생체발광 리포터의 이용을 제안하였다. 상기 검정은 공동-배양된 살아있는 세포 및 동물에서 생체내 리간드 수용체 보완 검정으로 추가 개발되었다; 문헌 [Luker et al., Nature Medicine 18(2012), 172-177]을 참고하라.
그러나 첨부된 실시예에 예시된 강력한 생체발광 세포성 시험관내 검정 및 표적 단백질 중화 항체, 특히 인터페론 또는 인터류킨 길항제의 확인, 단리 및/또는 검증을 위한 그 이용은 기재되거나 제안되지 않았다. 따라서 상기 측면에서, 본 발명은 리간드에 대한 관련 수용체(들)를 발현하는 세포로의 관심 리간드의 결합 평가를 위한 신규한 세포성 검정에 관한 것이다. 가장 광의의 측면에서, 본 발명은 하기에 대한 것이다:
[21] 리간드-결합 도메인에 대한 관심 리간드의 결합 평가 방법으로서,
(a) 선택적으로 세포내 기능적 영역(2)을 포함하는 리간드-결합 도메인을 발현하는 표적 세포(1)를 바람직하게는 검출 가능한 효소인 리포터(4)로 표지된 관심 리간드(3)를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계; 및
(b) 리포터 활성(5), 바람직하게는 화학발광을 결정하는 단계
를 포함하며; 대조군 대비 리포터 활성의 증가가 리간드-결합 도메인에 대한 관심 리간드의 결합을 시사하며; 리간드-결합 도메인이 수용체 또는 항-리간드 항체에서 유래되고, 바람직하게는 리간드는 인터페론 또는 인터류킨인 방법.
본원에서 이용되는 용어 "리간드"는 문헌 [Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, 2000년 개정 및 2003년 재인쇄, ISBN 0 19 850673 2]에 제공된 바와 같은 정의로 제공된다. 리간드에는 임의의 관심 소분자, 핵산, 단백질 또는 항원, 예를 들어 비제한적으로 CD 마커 리간드, 예컨대 CD48, CD40L, CD40, CD122, 사이토카인 및 케모카인, 예컨대 IL-2, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-6, TNF-a, ILβ, IL-10, IP-10, 성장 인자, 예컨대 ITAC, MIG, EGF, VEGF, 공동-자극 리간드, 예컨대 ICOS-L, OX-40-25 L, CD137-L, 신호전달 경로 성분, 및 실제로 임의의 관심 항원이 포함된다. 리간드에는 또한 항체가 포함된다. 본 발명의 방법에서, 리간드는 가장 바람직하게는 가용성 리간드이다.
리포터는 검출 가능한 모이어티이며, 직접적으로 또는 간접적으로 추적될 수 있는 임의의 종류일 수 있다. 여러 이러한 모이어티가 당분야에 널리 공지되어 있으며, 표준 표지, 예컨대 생화학, 세포 생물학 및 의학 진단 적용에서 일상적으로 이용되는 방사활성, 형광, 화학발광, 콜로이드성 금속의 플라즈몬 공명, 또는 효소-비색측정 검출에 기반하는 것들이 포함된다.
"리간드-결합 도메인"은 임의의 분자일 수 있으며, 이는 본원에서 상기 정의된 바와 같은 리간드에 결합할 수 있다. 전형적으로, 리간드-결합 도메인은 단백질 또는 폴리펩타이드, 예컨대 수용체 분자에서 유래될 수 있다. 그러나 원칙 상, 또한 비-단백질성 결합 분자, 예를 들어 합성 결합 분자가 본 발명에 따라 리간드-결합 도메인을 제공할 수 있다; 예로, 친수성 펩타이드에 대한 항체-유사 친화도를 갖는 합성 중합체 나노입자를 기재하는 문헌 [Zeng et al., ACS Nano 4(2010), 199-204]를 참고하라. 그럼에도 불구하고, 바람직한 구현예에서, 리간드-결합 도메인은 수용체 또는 항체, 전형적으로 항-리간드 항체에서 유래될 것이다. 리간드-결합 도메인은, 예컨대 본원에서 상기 정의된 리간드에 결합할 수 있는 임의의 폴리펩타이드 또는 이들의 일부일 수 있다. 수용체는 유전자 발현을 포함하는 신호 전달 경로를 조절하는 리간드-활성화 결합 단백질이다. 이들 수용체에 대한 작용 기전에는 제1 단계로서 리간드의 결합을 통한 활성화 및 제2 단계로서 유전자 발현의 조절에서 정점에 달하는 하류 신호전달 케스케이드를 유발하거나 저해하는 수용체에 의해 전달되는 신호가 관여된다. 리간드 결합에 관여하는 도메인은 리간드-결합 도메인(LBD)이다. 상기 도메인은 리간드 결합 및 동종- 및/또는 이종-이량체화를 포함하는 몇몇 활성에 참여한다. 수용체의 리간드화된 및 리간드화되지 않은 형태 간 전이를 수반하는 입체형태 변화는 다른 단백질에 대한 이들의 친화도에 극적으로 영향을 미친다(Edwards, J. Mammary. Gland Biol. Neoplasia 5(2000) 307-24; Thomas-Chollier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110(2013) 17826-31).
그러나 선행 기술에서의 대부분의 생체 검정과는 대조적으로 본 발명의 방법 및 검정이 리포터 활성을 기록하기 위해 세포내 신호전달에 의존하지 않으므로, 본 발명의 방법 및 검정의 목적을 위해서는 세포막 상에 세포외 존재하는 리간드-결합 도메인의 존재로 충분하다. 그럼에도 불구하고, 리간드-결합 도메인은 하나 이상의 기능적 영역, 예를 들어 막통과 영역에 융합되거나 결합될 수 있다.
막통과 영역은 일반적으로 수용체를 세포막을 부착하는 작용을 하며(이에 따라 세포외 리간드-결합 도메인이 막-결합되며) 이렇게 할 수 있는 임의의 단백질(또는 이러한 단백질을 인코딩하는 핵산)이 포함된다. 이러한 영역은 광범위한 원천, 예컨대 전부 또는 일부의 T 세포 수용체(TCR)의 알파, 베타, 또는 제타쇄, CD28, CD4, CDS, CD8, CD3a, CD16, CD22, CD23, CD45, CD80, CD86, CD64, CD9, CD37, CD122, CD137 또는 CD154, 사이토카인 수용체, 예컨대 인터류킨 수용체, TNF-R, 티로신 키나아제 수용체 또는 인터페론 수용체, 또는 집락 자극 인자 수용체에서 유래될 수 있다. 대안적으로, 막통과 영역은 합성 영역일 수 있다. 적합한 합성 막통과 영역은 주로 소수성 아미노산, 예컨대 류신 및 발린을 포함할 것이다.
본 발명의 맥락에서 이용되는 용어 "표적 세포"에는 하나 이상의 관심 리간드-결합 도메인(들)을 발현할 수 있는 임의의 세포가 포함된다. 특히, 관심 리간드와 결합할 수 있는 하나 이상의 수용체를 내인성으로 발현하거나, 예컨대 하나 이상의 상기 수용체를 발현하도록 전달감염되거나 형질전환될 수 있는 포유류 세포 및 세포주가 이용될 수 있다. 그러나 동시에, 리간드 결합을 연구하기 위해 수용체가 삽입될 수 있는 인공 세포 및 세포막이 개발되었다; 예로 리뷰를 위해 문헌 [Hammer and Kamat, FEBS Letters 586(2012) 2882-2890 및 May et al., Angewandte Chemie, International Edition 52(2013), 749 DOI: 10.1002/anie.201204645]를 참고하라.
본 발명의 방법 및 검정은 선택적으로 세포내 기능적 영역(2)을 포함하는 리간드-결합 도메인을 발현하는 표적 세포(1)를 리포터(4)로 표지된 관심 리간드(3)를 포함하는 샘플과 접촉시켜 수행될 수 있다. 인지체 리간드가 존재하는 경우, 두 결합 시약 간 복합체가 형성되며, 리간드가 표적 세포에 결합된다. 결합되지 않은 관심 리간드는, 예를 들어 세척에 의해 반응 혼합물로부터 분리되며, 표적 세포에 결합된 리간드의 존재는 리포터 모이어티(6)를 통해, 예를 들어 기질(5)에 대한 그 효소적 활성으로 인해 검출된다. 표적 세포-리간드 복합체에서 리포터 활성의 존재(또는 크기)는 리간드의 존재(또는 농도)의 지표이다. 본 발명의 방법 및 검정은 임의의 적절한 용기, 바이알, 배양 디쉬, 다중 웰 플레이트, 액체 모세관 시스템 등에서 수행될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 방법 및 검정은 리간드-결합 도메인에 결합된 리간드-리포터를 갖는 세포가, 예를 들어 리포터로서 형광 모이어티를 이용하는 경우 형광-활성화 세포 정렬(FACS)에 의해 선택적으로 검출되도록 수행될 수 있다.
실시예에 예시된 바와 같이, 본 발명의 방법 및 검정은 수용체 리간드-결합, 구체적으로는 사이토카인, 가장 바람직하게는 인터페론 또는 인터류킨과 그 인지체 수용체(들)의 상호작용을 검정하기 위해 특히 적합하다.
사이토카인은 소형 당단백질 메신저이며, 발견의 수치적 차수, 주어진 기능적 활성, 염증성 반응에서의 역학적 또는 기능적 역할, 일차 기원 세포, 또는 관련 분자와 공유되는 구조적 동족체에 의해 단일화된 분류 체계가 없이 다양하게 확인된다; 예로, [McInnes in Kelley's Textbook of Rheumatology, Elsevier Health Sciences 9th Edition Vol. 1 by Firestein et al.(2012), 3rd part, chapter 23, 367-377]을 참고하라. 본 발명에 따라 이용되는 사이토카인 및 수용체는 비제한적으로 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는, 표 23-1 내지 23-8에 도시된 문헌 [McInnes(2012) 3rd part, chapter 23, 367-377)]에 기재된 사이토카인 및 수용체, 및 국제 출원 WO2013/098419 및 출원인의 공동 계류 중인 국제 출원 WO2015/001047에 개시되는 사이토카인 목록에 기재된다. 바람직하게는, 사이토카인은 인간 사이토카인이다. 바람직한 구현예에서, 사이토카인은 류코트리엔, 림포카인, 인터류킨, 인터페론, 케모카인 및 TNF 패밀리의 구성원으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 그러나 원칙 상, 리간드는 호르몬 및 성장인자 뿐만 아니라 소분자, 예컨대 인지체 결합 도메인, 예컨대 수용체 또는 항체와 상호작용할 수 있는 탄수화물을 포함하는 실질적으로 모든 가용성 분자일 수 있다.
여기서, 본 발명에 따라 수행된 실험은 놀랍게도 LBCA 검정이 후보 항-리간드 항체의 평가를 위해 특히 적합하며, 여기서 이들의 막통과 버전의 발현에 의해, 항-리간드 항체가 항-리간드 결합 도메인으로 작용함을 드러내었다; 293T MSR 세포에서 항-IFN-알파 및 IFN-ω 항체 26B9의 발현 및 루시퍼라아제가 태그화된 IFN-ω에 대한 그 효율적 결합을 기재하는 실시예 9 및 도 17을 참고하라. 따라서 본 발명의 방법 및 검정은 또한 항체-리간드 결합의 검정을 위해 특히 적합하다. 따라서 추가로 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[22] [21]에 있어서, 리간드-결합 도메인이 항체 또는 리간드/항원-결합 단편 또는 이들의 유도체인 방법.
또한 상기 구현예에서, 리간드/항원은 바람직하게는 사이토카인일 수 있지만, 명백하게 임의의 다른 리간드/항원 상호작용도 검정될 수 있다.
배경 섹션에서 논의되고 실시예에 예시된 바와 같이, 원하는 특이성을 갖는 항체의 초기 스크리닝은 보통, 예를 들어 리간드에 대한 항체의 특이적 결합을 결정하기에 충분한 생화학적 검정, 예컨대 ELISA 및 LIPS 검정을 이용한다. 그러나 이들 검정은 거의 항상 비-세포성으로, 즉 비-생리적 조건 하에 수행되므로, 이러한 생화학적 검정은 주어진 항체가 또한 생체내 리간드에 결합하고 그 생물학적 활성, 예를 들어 수용체에 대한 리간드의 결합을 저해하여 신호 전달 경로를 유발하는 것을 방해하는지 여부를 신뢰할 수 있게 예상할 수 없다.
대조적으로 실시예 5에 나타낸 바와 같이, 리간드 결합이 세포성 맥락에서 평가되는 본 발명의 세포-기반 검정은 실시예 5에 기재된 기능적 STAT3 검정에 의해 확인된 바와 같이 항-리간드 분자의 중화 활성 결정에서 신뢰할 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포-기반 리간드-결합 검정은 이러한 기능적 검정의 수행 필요성을 배제함으로써 실험실 장비, 시간 및 비용을 감소시킨다. 따라서 하나의 구현예에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[23] [21] 또는 [22]에 있어서, 리간드-결합 도메인 및/또는 리간드가 생물학적으로 활성인 방법.
원칙 상 임의의 세포, 리간드 및 리간드-결합 도메인이 연구될 수 있지만, 본 발명의 검정은 포유류 및 특히 인간 리간드 및 리간드-결합 도메인의 평가를 위해 특히 적합하며, 그 이유로 인해 포유류 및 특히 인간 표적 세포의 이용이 또한 바람직하다. 따라서 추가로 바람직한 구현예에서 본 발명은 하기에 관한 것이다:
24] [21] 내지 [23] 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포, 리간드 및/또는 리간드-결합 도메인이 포유류, 바람직하게는 인간 기원인 방법. 그러나, 표적 세포가 반드시 포유류 기원인 것은 아니며, 원핵생물을 포함하는 임의의 세포일 수 있다. 리간드-결합 도메인은 또한 비제한적으로 바이러스-유사 입자(VLP), 합성 세포 또는 다른 세포-유사 입자를 포함하는 살아있지 않는 세포-유사 입자의 일부일 수 있다.
세포외 리간드-결합 도메인은 단백질 리간드에 결합할 수 있는 임의의 단백질(또는 이러한 단백질을 인코딩하는 핵산)을 포함한다. 가장 바람직하게는, 리간드는 가용성 리간드이다. 막-결합 세포외 리간드-결합 도메인에는, 예로 표면 막 수용체, 예컨대 키나아제 수용체, G-단백질 커플링된 수용체(GPCRs), 성장 인자 수용체, 사이토카인 수용체, 예컨대 인터류킨 수용체, 예로 IL-IR(I형 및 II형), IL-2R(α, β 및 γ 서브유닛), IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R; gp130, IL-8R, IL-13Ral, IL-4Ra, IL-30R, IL-15R(α, β 및 γ 서브유닛), IL-17R; TNF 수용체(들)(TNF-RI 및 TNF-RII); IL-β, IL-2, IL-10, IL-15, G-CSF, CSF-1, M-CSF, GM-CSF, HGF, EGF, PDGF, IGF, FGF, TGF-β, IP-10, ITAC, MIG 및 VEGF에 대한 수용체; CD 마커, 예컨대 CD2, CD4, CDS, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CD16, CD19, CD20, CD22, CD24, CD28, CD33, CD40, CD48, CD69, CD70, CD122 및 CD244; 및 ICOS-L, OX-40-L, CD40L 및 CD137-L에 대한 수용체가 포함되거나 여기에서 유래된다. 본 발명의 방법 및 검정에서 이용하기 위한 막-결합 세포외 리간드-결합 도메인에는 또한 보통 세포막 상이나 내에서 확인되지 않는 결합 도메인으로서의 분자, 예를 들어 세포질 또는 가용성 단백질, 예를 들어 비제한적으로 보통 분비되는 단백질이 포함될 수 있다. 따라서, 세포외 리간드-결합 도메인에는 또한 막통과 영역으로 인해 세포외로 제시되는 SOST, 및 LDL-관련 단백질, 예컨대 LRPS 및 LRP6, 사이토카인, 및 성장 인자가 포함될 수 있으며, 아래를 참고하다. 당분야 숙련가는 바람직하게는 세포 표면에 대한 세포외 리간드-결합 도메인을 표적으로 하는 신호 서열이 각각 리간드-결합 도메인 및 수용체를 인코딩하는 벡터의 DNA 서열에 포함됨을 이해할 것이다. 이러한 신호 서열은 당분야에 공지되어 있고, 세포외 리간드-결합 도메인과 천연 연관되는 서열(신호 서열/리더 서열)이 포함된다. 신호 서열은 일반적으로 세포 표면으로의 세포외 리간드-결합 도메인의 이송 동안 가공되고 제거될 것이다.
하나의 구현예에서, 세포외 리간드-결합 도메인은 이것이 하나 이상의 다른 세포외 리간드-결합 도메인과 상호작용하여 리간드를 인식할(이에 결합할) 수 있는 다중 연관된 세포외 리간드-결합 도메인을 획득하도록 선택될 수 있다. 따라서 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법 및 검정에서 표적 세포는 하나를 초과하는 막-결합 세포외 리간드-결합 도메인을 포함한다. 보다 바람직하게는, 2개 이상의 상이한 리간드-결합 도메인이 표적 세포에서 발현되어 리간드를 인식할(이에 결합할) 수 있는 다중 연관된 세포외 리간드-결합 도메인을 획득할 수 있다.
도 7a에 대한 주석에서 설명된 바와 같이, 리포터는 임의의 검출 가능한 모이어티일 수 있다. 리포터 모이어티에는 측정 가능한(검출 가능한) 신호를 생성할 수 있는 화합물, 예컨대 비제한적으로 루시퍼라아제, 분비된 알칼리 포스파타아제(SEAP), 녹색 형광 단백질 또는 적색 형광 단백질이 포함된다. 따라서 리포터 신호 측정에는 광 방출, 형광 또는 알칼리 포스파타아제 생산의 측정이 포함된다. 적절한 리포터 분자의 리뷰에 대해서는, 예로 문헌 [Lesner Biochem . Anal. Biochem . 4(2012), 1-2; Kain and Ganguly Curr . Protoc . Mol . Biol.(2001) Chapter 9: Unit 9.6)]을 참고하라. 따라서 하나의 구현예에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[25] [21] 내지 [24] 중 어느 하나에 있어서, 리포터가 바람직하게는 루시퍼라아제, SEAP, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, 및 알칼리 포스파타아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출 가능한 효소이고, 바람직하게는 검출 가능한 리포터 활성이 광 방출(발광, 화학발광)인 방법.
레닐라(Renilla) 루시퍼라아제(본원에서 "Ruc"로 약칭함)가 특히 바람직하다. 가장 바람직하게는, 실시예에 예시된 바와 같이, 리포터는 고도로 민감하고, 천연 분비되며, 배양물뿐만 아니라 생체외 동물의 피에서 세포의 컨디셔닝된 배지 중에 검출될 수 있어서, 세포 변수의 실시간 모니터링을 허용하는 가우시아(Gaussia) 루시퍼라아제이다(Tannus et al. Mol . Ther . 11(2005), 435-43; Wurdinger et al. Nat. Methods. 5(2008); 171-3). 대안적으로, 리포터는 또한 NanoLuc® 루시퍼라아제일 수 있다; 예로 문헌 [Hall et al. ACS Chem. Biol. 7(2012), 1848-1857]을 참고하라. 또 다른 구현예에서, 검출 가능한 모이어티는 검출 가능한 효소의 여러 사본을 포함한다. 이는, 예를 들어 결합 도메인의 어느 한 쪽에 배치되거나 일렬로 연결될 수 있는 효소의 여러 사본을 코딩하는 클로닝 벡터의 이용에 의해 달성될 수 있다. 다른 검출 가능한 모이어티에는, 예를 들어, 형광 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질, 및 예로 Clontech에서 이들의 Living Colors™ 제품 라인에서 판매되는 다양한 다른 유색 단백질이 포함된다.
그러나 언급된 바와 같이, 루시퍼라아제 및 동등한 광 방출 효소가 특히 바람직하다. 예를 들어, 형광 표지된 리간드를 이용하는 검정은 세포, 플라스틱 용품 및 완충액의 배경 자가형광의 어려움을 겪는다. 대조적으로, 루시퍼라아제는 소수의 매우 특화된 동물에서만 확인되며 포유류에서는 확인되지 않으므로, 본 발명의 LCBA 검정에서는 배경 광 방출이 없다. 추가 장점으로서, 세포 수용체가 알려지지 않은 경우에도, 반응성 세포주가 존재하는 한 LCBA 검정이 또한 작용한다. 마지막으로, 본 발명의 세포-결합 검정의 하나의 주요 장점은 이것이 가장 상류인 신호 전달 캐스캐이드 내 지점에서, 예로 항체의 기능을 평가할 수 있도록 한다는 사실이다. 따라서, 검정은, 예로 하류 신호전달 이벤트의 방해를 유발할 수 있는, 반응 혼합물에 존재하는 다른 신호전달 분자에 의해 영향받지 않는다. 따라서, 매우 복잡한 혼합물, 예컨대 혈청이 중화 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다.
선행 기술에 기재된 일부 검정에서, 리포터-항원 융합 단백질은 분비되지 않고 세포내 발현되며, 이는 융합 단백질을 수확하기 위해 세포를 용해시키는 것을 필요로 한다. 이는 다소 시간-소모적이므로, 본 발명의 검정의 바람직한 구현예에서, 표지된 리간드는 바람직하게는 분비되는 재조합 융합물이다. 따라서 하나의 구현예에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[26] [21] 내지 [25] 중 어느 하나에 있어서, 표지된 리간드가 바람직하게는 숙주 세포에 의해 발현되고 분비되는, 재조합 융합 단백질인 방법.
본 발명의 방법에서 이용되는 표적 세포는 천연 또는 유전적으로 조작되어 하나 이상의 리간드-결합 도메인을 발현하는 임의의 세포일 수 있다. 예를 들어, 항상적으로 또는 유도 시 관심 리간드-결합 도메인을 발현하는 유전적으로 조작된 세포주, 특히 포유류 세포주가 구축될 수 있다. 적합한 유도 시스템, 예컨대 TET-억제인자 시스템은 당분야 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 대안적으로, 특히 몇몇 종의 리간드-결합 상호작용의 연구 관점에서, 표적 세포는, 예를 들어 본 발명의 방법을 수행하기 시작할 때, 리간드-결합 도메인을 인코딩하는 적절한 발현 벡터의 전달감염에 의해, 적시에 리간드-결합 도메인을 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 유사하게, 리간드-리포터 융합 분자는 또한, 예를 들어 융합 리간드-리포터의 경우, 숙주 세포에서 융합 단백질을 일시적으로 발현시킴으로써, 필요 시 제조될 수 있다; 첨부된 실시예 5를 또한 참고하라.
포유류 표적 및 숙주 세포는 임의의 편리한 기법, 예컨대 전기천공, 칼슘 포스페이트 전달감염, DEAE-덱스트란 매개 전달감염, 트랜스벡션, 마이크로주사, 양이온성 지질 매개 전달감염, 전기천공, 형질도입, 스크레이프 로딩, 발리스틱 도입 또는 감염을 이용해서 발현 벡터로 전달감염될 수 있다(예로, 문헌 [Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology, 1986 및 Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbour laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989]을 참고하라). 숙주 세포 내에서 벡터 발현을 유도하기에 적합한 조건은 당분야에 널리 공지되어 있다. 전달감염은 일시적일 수도 있고, 또는 대안적으로, 리간드-결합 도메인을 안정적으로 발현하는 세포주가 당분야에 공지된 바와 같이 제조될 수도 있다. 특히, 문헌 [Methods in Molecular Biology 7. Gene Transfer and Expression Protocols. Edited E.J. Murray 1991]을 참고하라. 반면, 관심 리간드-결합 도메인을 내인성으로 발현하는 표적 세포도 이용될 수 있다; 예로, 실시예 5에서 이용되는 HEK 293T MSR 세포 및 COLO 205 결장직장 암종 세포를 참고하라. 예를 들어, 성장 인자 또는 사이토카인 수용체를 발현하는 세포 및 세포주가 각각, 예컨대 인터류킨-의존적 세포주가 이용될 수 있다. 또한, 리간드-결합 도메인으로서 막 결합된 항체에 대해 실시예 9에 기재된 실험의 관점에서, 항원-결합 도메인을 발현하는 세포가 막 결합된 항체 및 T-세포 수용체를 각각 발현하는 B- 및 T-세포를 포함하는 표적 세포로서 이용될 수 있다.
따라서 바람직한 추가 구현예에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[27] [21] 내지 [26] 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포가 내인성으로, 일시적으로 또는 안정적으로 리간드-결합 도메인을 발현하고/하거나, [26]에 있어서, 숙주 세포가 일시적으로 융합 단백질을 발현하는 방법.
원칙 상, 리간드-리포터 융합물은 각각 별도로 그리고 생화학적 수단에 의해, 예를 들어 시험관내 번역 또는 리포터 모이어티를 이용한 관심 리간드의 화학적 연결에 의해 생산될 수 있다. 대안적으로, 리포터 모이어티를 물리적 상호작용, 예를 들어 고친화도 시스템, 예컨대 스트렙타비딘/바이오틴을 통해 간접적으로 또는 금속, 예컨대 바람직하게는 콜로이드성 금으로 직접 표지하여 관심 리간드에 연결할 수도 있다. 원칙 상, 이는 융합 단백질, 예컨대 단리되고 고체 형태로 제공될 수 있는 사이토카인 및 루시퍼라아제의 융합물에 대해서도 가능할 것이다.
그러나, 화학적으로 생산되고/되거나 단리된 융합 단백질을 이용하는 단점은 이들의 제조로 인해 및/또는 예를 들어 단리 공정 동안, 리간드 성분의 건조 및/또는 동결건조가 더 이상 리간드의 그 결합 도메인에 대한 생체내 결합을 반영하기 위해 필요한 원상태 입체형태를 가지지 않으며, 원상태 구조가 또한 액체 샘플에서 재구축되지 않기 때문일 수 있다. 이는 이들의 제조 동안 변성되는 경향이 있고 가혹 조건 하에서만 재폴딩될 수 있는 시스테인 잔기 및 디설파이드 가교를 각각 갖는 사이토카인 및 호르몬, 예컨대 G-CSF에 대해 특히 해당된다.
대조적으로, 실시예에 예시된 바와 같이 본 발명에 따르면 리간드-리포터 융합 단백질이 숙주 세포에서 일시적으로 발현되고 배양 배지로 분비될 수 있다. 그 원상태 형태로 관심 리간드를 포함할 것으로 추정되는 융합 단백질을 함유하는 배양 배지 및 배양 상청액이 각각 임의의 즉각적 정제 단계 없이 본 발명의 방법에서 직접 이용될 수 있다; 실시예 5를 참고하라. 상기 구현예에서, 대조군으로서, 융합 단백질을 발현하고 분비하지 않거나, 상이한 리간드와의 융합 단백질을 발현하고 분비하는 숙주 세포로부터 수득되는 배양 배지 및 상청액을 각각 이용하는 것이 가장 적절하다. 따라서 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[28] [26] 또는 [27]에 있어서, 샘플이 숙주 세포의 배양 상청액을 포함하며, 바람직하게는 대조군은 상청액이 없는 배양 배지 또는 융합 단백질을 발현하고 분비하지 않는 동일한 종류의 세포 배양 상청액인 방법.
원칙 상, 각각 리간드-결합 도메인을 발현하고 융합 단백질을 분비할 수 있는 임의의 종류의 세포가 본 발명의 방법에서 이용될 수 있고, 포유류 세포가 표적 및 숙주 세포로서 이용하기 위해 바람직하다. Jurkat 세포, HEK 293, CHO, NIH3T3, NSO, Cos-7, Hela, MCF-7, HL-60, EL4, A549, 및 K562 세포를 포함하는 포유류 숙주 세포뿐만 아니라 리간드-결합 도메인, 즉 리간드에 결합할 수 있는 세포외 리간드-결합 도메인 및 막통과 영역을 갖는 생체검정 수용체를 인코딩하는 DNA를 함유하고 발현하도록 구성된 적절한 발현 벡터는, 예로 국제 출원 WO2007/060406에 기재되며, 그 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다. 그러나 국제 출원 WO2007/06040에 개시된 생체검정과는 대조적으로, 본 발명의 방법에 따라 이용하기 위한 수용체는 리포터 영역 및 신호를 전송할 수 있는 하나 이상의 세포내 신호전달 영역을 함유할 필요가 없다. 오히려, 세포외 리간드-결합 도메인 및 선택적으로 그 중 어느 하나 또는 둘 다가 세포외 리간드-결합 도메인에 대해 동종성이거나 이종성일 수 있는 막통과 영역 또는 또 다른 막 부착 폴리펩타이드의 발현이 본 발명의 방법의 목적을 위해 충분하다.
바람직하게는, 숙주 및 표적 세포는 각각 첨부된 실시예에서 이용된 바와 같은 세포, 즉 인간 배아 신장(HEK) 293T MSR 세포 또는 COLO 205 결장직장 암종 세포이다. 따라서, 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[29] [21] 내지 [28] 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포 및/또는 숙주 세포가 HEK 293T MSR 세포 또는 COLO 205 결장직장 암종 세포인 방법. 바람직하게는, 표적 세포는 일시적으로 I형 및 II형 IL-20 수용체를 발현하는 HEK 293T MSR 세포이며, 샘플은 IL-20-루시퍼라아제 융합 단백질을 발현하는 HEK 293T 세포의 상청액을 포함하거나; 표적 세포는 막통과 항-인터페론 오메가(IFNW) 항체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포이며, 샘플은 IFNW-루시퍼라아제 융합 단백질을 발현하는 HEK 293T 세포의 상청액을 포함한다.
실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법은 표적 세포가 단계 (b) 전에 용해되건 용해되지 않건 무관하게 유사한 결과를 제공한다. 표적 세포를 리포터에 연결된 관심 리간드와 접촉시키기 위한 단계 (a)에서, 표적 세포가 생활성이고 세포 막이 변성되지 않은 상태이기만 하면 되므로, 유리하다. 상기 단계 후, 본 발명의 방법은 비교된 강성 조건 하에 생화학적 검정, 예컨대 ELISA 또는 LIPS 검정에서와 유사한 방식으로 수행될 수 있다. 따라서 대안적으로, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[30] [21] 내지 [29] 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포가 단계 (b) 전에 용해되거나 용해되지 않는 방법.
도 7에 예시되고 본원에서 앞서 논의된 바와 같이, 그 생체내 리간드-결합의 반영 및 그 민감성의 관점에서 본 발명의 방법은 평가 물질이 리간드 결합을 방해, 즉 긍정적으로 또는 부정적으로 방해할 수 있는지, 그리고 이에 따라 관심 리간드의 그 인지체 리간드-결합 도메인(들)에 대한 결합의 작동제 또는 길항제로서 작용하는지 여부의 결정을 위해서도 특히 적합하다. 따라서, 중요한 추가 측면에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[31] [21] 내지 [30] 중 어느 하나의 방법의 단계를 포함하는, 평가 샘플이 관심 리간드의 그 인지체 리간드-결합 도메인에 대한 결합의 작동제 또는 길항제를 포함하는지 여부를 결정하기 위한 검정으로서, 단계 (a) 전에 또는 동안에 리간드 및/또는 표적 세포가 평가 샘플(7)을 거치며, 단계 (b)에서는 평가 샘플의 부재 하 또는 대조군의 존재 하 리포터 활성에 비해
(ⅰ) 리포터 활성의 증가가 작동제를 시사하고; 및
(ⅱ) 리포터 활성의 감소가 길항제를 시사하는 검정.
본 발명의 검정은 도 7에 예시되고 실시예 5에 추가 기재된다. 간략하게, 본 발명의 상술된 방법에서, 평가 물질 또는 예를 들어 리간드에 의해 유도된 관심 항체가 각각의 리간드-결합 도메인(들), 예컨대 표적 세포 상 리간드의 인지체 수용체(들)에 결합하는 그 능력을 방지하는지 여부가 평가된다. 따라서 관심 리간드가 단계 (a) 전에 평가 샘플 및 평가 물질과 각각 접촉될 수 있으며, 여기서 평가 물질의 관심 리간드에 대한 결합 시 리간드-결합 도메인에 대한 그 결합이 차단된다. 따라서 보통 리간드-리포터 융합 분자 결합 시 관찰 가능할 리포터 활성이 감소되거나 모두 함께 부재함으로써 리간드 결합 길항제의 존재를 시사한다. 대안적으로, 표적 세포가 단계 (a) 전에 평가 샘플 및 평가 물질과 각각 접촉될 수 있으며, 여기서 평가 물질의 리간드-결합 도메인에 대한 결합 시 관심 리간드에 결합하는 그 능력이 차단될 것이고, 이는 다시 리포터 활성의 감소 또는 심지어 부재로 이어지며, 이에 따라 길항제의 존재를 시사한다. 또한, 특히 리간드 결합 작동제의 결정을 위해서는, 평가 샘플 및 평가 물질이 각각 단계 (a) 동안 평가 세포 및 관심 리간드와 접촉되며, 여기서 예를 들어 평가 물질의 관심 리간드와 그 인지체 리간드-결합 도메인(들)의 복합체에 대한 결합 시, 관심 리간드의 결합-도메인에 대한 결합이 안정화될 수 있고, 그 결과 정량적으로 더 높은 리간드 결합으로 이어져서 리포터 활성의 증가가 작동제의 존재를 시사한다. 요약하면, 당분야의 숙련가는 관심 리간드의 그 인지체 리간드-결합 도메인(들)에 대한 결합의 작동제 또는 길항제를 결정하기 위한 본 발명의 검정의 이용 가능성을 잘 인식할 것이다.
본 발명의 맥락에서 이용되는 용어 "작동제" 및 "길항제"는 각각, 항체 및 이들의 생물공학적 유도체로 예시되고 있지만, 또한 관심 리간드, 그 인지체 리간드-결합 도메인(들) 또는 둘 다의 복합체에 결합할 수 있고, 이에 따라 작동시키는, 예로 리간드-수용체 결합을 지지하는, 또는 길항하는, 예로 리간드와 그 결합 도메인(들)의 상호작용을 방해하는 다른 비-항체 분자도 포함된다. 따라서, 평가 샘플 중 화합물에는 항체, 소분자(예로 NCEs) 및 다른 약물, 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드, 펩타이드 모사체, 지질, 탄수화물 및 핵산, 안키린, 수용체, 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자, 샤페론, 예컨대 열 충격 단백질(HSPs)뿐만 아니라 세포-세포 접착 분자, 예컨대 카드헤린, 인테그린, C-형 렉틴 및 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리의 구성원이 포함된다. 그럼에도 불구하고, 단지 명확성을 위해 그리고 본 발명의 범위를 제한하지 않고, 대부분의 하기 구현예가 치료제 및 진단제의 개발을 위해 바람직한 "작동제" 및 "길항제"를 나타내는 항체 및 항체-유사 분자에 관해 논의된다. 가장 바람직하게는, 평가 샘플에 존재하는 관심 화합물은 항체이다.
또한, 실시예 9를 참조로 상기 설명된 바와 같이, 본 발명의 검정은 또한 각각 경쟁 및 교차-경쟁 검정으로서, 예를 들어 후보 항-리간드 항체가 주어진 리간드의 동일한 또는 별도 에피토프에 결합하는지 여부를 연구하기 위해 적용될 수 있다; 2개의 항-인터페론 항체 8H1 및 26B9가 인터페론-ω의 별도 에피토프에 결합하는 것이 나타난 본 발명에 따른 교차-경쟁 검정을 예시하는 실시예 9 및 도 18을 참고하라. 따라서 본 발명의 검정의 하나의 구현예에서, 표적 세포는 막 결합 항체 또는 이들의 리간드-결합 도메인을 발현하며, 관심 리간드에 결합하는 작동제 및 길항제는 각각 동일한 종류의 항-리간드 항체 또는 유사 후보 항-리간드 항체일 수 있다. 따라서 상기 구현예에서, 본 발명의 검정은 각각 경쟁 및 교차-경쟁 검정으로서 이용되며, 여기서 리간드-결합 도메인 및 작동제/길항제는 동일한 리간드-결합 분자에서 유래된다.
실시예 및 도면에서, 본 발명의 검정은 항-리간드 항체의 확인 및 단리에 관해 예시된다. 그러나 당분야 숙련가에 의해 이해될 바와 같이, 본 발명의 검정은 또한 리간드-결합 도메인, 예를 들어 리간드의 수용체와 상호작용하는 화합물을 확인하고 단리할 수 있다. 예를 들어, 수용체의 리간드-결합 도메인을 인식하는 항체는 수용체에 대한 리간드의 결합을 방지함으로써 분석될 샘플로부터 리포터가 태그화된 리간드의 손실로 인해 리포터 활성을 감소시키고, 이에 따라 길항 항체의 존재를 시사할 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 용어 "평가 샘플"은 본원에서 용어 "평가 물질" 또는 "평가 화합물"과 상호 교환적으로 이용될 수 있으며, 보통 평가 물질이 전형적으로 샘플로서 제공됨을, 예를 들어 용매 중에 제시되고/되거나 평가 물질의 배치로부터 취해짐을 시사한다. 유사하게, 본 발명의 검정이, 예를 들어 약물 개발의 임의의 단계에서 이용될 수 있으므로, 평가 샘플은, 예로 화학적 합성으로부터의 반응 혼합물, 천연 원천의 샘플, 예컨대 토양 샘플, 물 샘플, 미생물 제조물, 체액 등, 식품 및 약물 생산의 중간 단계로부터 취한 샘플뿐만 아니라 약학적 이용 전 약물의 전임상 배치로부터의 샘플일 수 있다. 따라서 "평가 샘플"은 단독으로 또는 다른 성분과의 맥락에서 추정 작동제 또는 길항제를 함유하는 임의의 종류의 물질일 수 있다. 실시예에 예시된 바와 같이, 평가 샘플은 바람직하게는 체액, 예컨대 관심 리간드, 리간드-결합 도메인 및/또는 그 복합체에 결합할 수 있는 항체 또는 동등한 분자를 함유하는 혈액 혈장일 수 있다.
따라서 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[32] [31]에 있어서, 평가 샘플이 (ⅰ) 항-리간드 항체, 리간드-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체 또는 (ⅱ) 항-리간드 수용체(LR) 항체, LR-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체를 포함하며, 바람직하게는 항체가 인간-유래 항체이고; 선택적으로 대조군이 비-리간드- 또는 비-LR 결합 항체인 검정.
아래에서 추가로 설명된 바와 같이, 본 발명의 검정은 항원, 예로 관심 리간드로 면역화되었거나 다르게는 예를 들어 내부 또는 외부 자극, 예컨대 장애 또는 병원체 감염, 스트레스, 중독 등에 의해 유발된 포유류에서의 면역 반응으로 인해 항-리간드 항체를 생산할 것으로 예상될 수 있는 대상체, 예로 포유류에서 유래되는 샘플 중 원하는 특이성을 갖는 항체 또는 동등한 결합 분자의 존재를 결정하기 위해 특히 적합하다. 반면, 특정한 수준의 운동이나 긍정적 스트레스가 면역계를 활성화하고 일반적 질환, 예컨대 감기, 독감, 암 등에 대해 보호할 수 있다는 것이 알려져 있으므로, 대상체는 샘플을 채취하기 훨씬 전에 해당하는 경험을 수행했을 수 있다. 따라서 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[33] [31] 또는 [32]에 있어서, 샘플이 항-리간드 또는 항-LR 항체를 함유하는 것으로 추정되는 대상체로부터 수득하는 체액, 바람직하게는 혈청에서 유래되며, 바람직하게는 대상체가 자가면역 또는 염증성 장애, 병원체 감염, 암을 겪으며, 이것이 질환 공격 항체의 존재를 시사할 수 있거나 대상체가 운동을 수행했거나 긍정적인 스트레스를 경험했으므로, 대상체는 현저한 질환 경과, 즉 안정한 질환을 갖거나, 완화 중이거나, 질환을 극복한 검정.
실시예 5에 예시되고 도 7, 8 및 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법 및 검정을 수행하기 위한 상이한 방식이 존재한다. 예를 들어, 각 리간드-결합 특이성을 결정하고 경쟁적 저해제를 확인하기 위해, 세포성 리간드-결합 리포터 검정은 경쟁인자, 예로 리간드 또는 저해제, 예를 들어 리포터가 없는 동일한 리간드 또는 상이하지만 관심 리간드와 밀접하게 관련되며 관심 리간드에 연결된 리포터와 상이한 리포터로 표지되거나 표지되지 않을 수 있는 리간드의 존재 하에 수행될 수 있다; 또한 아래에 추가 기재된 구현예, 특히 이중 루시퍼라아제 검정에 관해 참고하라. (추정)경쟁적 리간드는 평가 세포가, 예를 들어 관심 리간드의 친화도 또는 경쟁적 리간드의 생물학적 활성에 대한, 예를 들어 리간드 결합 후 관심 리간드를 변위할 수 있는지 여부에 대한 정보를 얻기 위해 리포터-태그화된 관심 리간드를 거치기 전에, 동시에 또는 후에 첨가될 수 있다. 마찬가지로, 대안적으로 또는 추가적으로, 평가 물질을 포함하는 평가 샘플은 표적 세포와 리간드의 접촉 전에, 동시에 또는 후에 첨가될 수 있다. 평가 물질이 관심 리간드에 또는 표적 세포 상에 존재하는 리간드-결합 도메인에 또는 둘 다에 결합할 것으로 추정되는지 여부에 따라, 관심 리간드 또는 표적 세포가 평가 물질과 사전-인큐베이션될 수 있다. 상기 맥락에서, 리간드 및 리간드-결합 도메인에 각각 결합하지 않는 분자가 관심 리간드 및 표적 세포와 평가 샘플의 인큐베이션 전에, 동안에 또는 후에, 바람직하게는 과량으로 첨가될 수 있다. 따라서 하나의 구현예에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[34] [31] 내지 [33] 중 어느 하나에 있어서, 리간드 또는 표적 세포가 평가 샘플과, 또는 대조군으로서 비-리간드- 또는 비-LR-결합 분자와 또는 과량 농도의 표지되지 않은 리간드 및/또는 상이하고 표지되지 않은 또는 상이한 리포터로 표지된 리간드와 사전-인큐베이션되는 검정. 바람직하게는, 대조군 리간드는 관심 리간드와 밀접하게 관련되고/되거나 대조군 비-리간드- 또는 비-LR-결합 분자는 평가 물질과 밀접하게 관련된다.
상기 맥락에서, 본 발명의 검정은 또한 각각의 평가 샘플 및 평가 물질이 유사하지만 상이한 사이토카인에 대한 결합 및/또는 리간드-결합 도메인의 상이한 부위, 예를 들어 하나 이상의 사이토카인 수용체(들) 내로의 이들의 결합 간을 구별하는 능력을 결정할 수 있도록 한다. 그렇게 함으로써, 바람직한 구현예에서 하나 이상의 상이한 관심 항원, 예를 들어 사이토카인이 이용되고, 예를 들어 상이한 루시퍼라아제 또는 형광 단백질이 리포터로서 이용되는 경우, 상이판 파장의 광 방출로 인해, 바람직하게는 순차적으로 또는 동시적으로 평가될 수 있는 상이한 신호를 일으키는 리포터 모이어티로 표지된다. 상기 구현예에서, 예를 들어 Promega Corporation(2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 53711 USA)에서 공급하는 루시퍼라아제 리포터 검정 시스템(Dual-Luciferase® Reporter(DLR™) 검정 시스템)이 본 발명에 따라 채택되고 이용될 수 있고, 여기서 하나의 사이토카인이 초파리 루시퍼라아제로 그리고 제2 사이토카인이 레닐라 루시퍼라아제로 태그화된다. 본 발명의 검정에 따르면, 제1 관심 리간드에 융합된 초파리(포티누스 파이랄리스(Photinus pyralis)) 루시퍼라아제 및 제2 관심 리간드에 융합된 레닐라(레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) 또는 바다 팬지(sea pansy)) 루시퍼라아제의 활성이 단일 샘플로부터 순차적으로 측정된다. 초파리 루시퍼라아제 리포터는 먼저, 적어도 1분 지속되는 발광 신호를 생성하기 위해 루시퍼라아제 기질(예로 루시퍼라아제 검정 시약 II(LAR II))을 첨가하여 측정된다. 초파리 발광의 정량 후, 상기 반응이 켄칭되며, 이에 대한 Stop & Glo® 시약의 첨가에 의해 레닐라 루시퍼라아제 반응이 동시에 개시된다.
따라서 상기 구현예에서, 주어진 평가 물질, 예를 들어 항-사이토카인 항체가 또 다른 사이토카인에 비해 하나의 사이토카인에 대해, 또는 존재하는 경우, 또 다른 리간드-결합 도메인 종류는 영향받지 않게 두고 하나의 사이토카인에 대한 수용체의 리간드-결합 부위에 대해 우선적 결합을 나타내는지 여부를 쉽게 결정할 수 있다.
원칙 상, 후보 항체 또는 동등한 인간 사이토카인-결합제는 전통적인 하이브리도마 접근뿐만 아니라 합성 항체 및 항체-유사 사이토카인 결합 분자를 생산하기 위한 조합 라이브러리를 포함하는 임의의 가능한 원천에 의해 제공될 수 있다. 따라서 항체 조작은 천연 및 비-천연 인간 항체 레퍼토리에 대한 발견 방법, 생산 전략, 및 개질 기법 그리고 비-조합 및 조합 전략을 이용한 이들의 마이닝을 포괄하는 잘 개발된 원칙이 되었다. 여기에는 또한 하이브리도마 기술, 말초 B 세포의 클론 증식, 단세포 PCR, 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 포유류 세포 디스플레이 및 컴퓨터내 설계에 기반한 방법을 이용하는 미처리, 면역, 트랜스제닉 및 합성 인간 항체 레퍼토리로부터 인간 항체(mAbs)의 생산 및 선택이 포함된다; 천연 및 비-천연 인간 항체 레퍼토리의 특징 그리고 비-조합 및 조합 전략을 이용한 이들의 마이닝의 리뷰에 대해서는, 예로 문헌 [Beerli and Rader in Mining human antibody repertoires, mAbs 2(2010); 365-378 및 Campbell et al., British Journal of Pharmacology 162(2011), 1470-1484]를 참고하라; 그 개시 내용은 본원에 참조로 포함된다.
그러나 이전에 언급된 바와 같이, 본 발명의 방법의 바람직한 구현예에서, 후보 항 인간 사이토카인 항체 또는 이들의 사이토카인 결합 단편은 모노클로날 항체 또는 이들의 항원-결합 단편의 단리를 포함하는 방법에 의해 제공되는 인간 항체에서 유래되며, 여기서 모노클로날 항체를 발현하는 B 세포가 대상체 포유류에서 수득되는 샘플로부터 단리된다. 과거 수십 년 동안, 모노클로날 항체를 단리하기 위해 그리고 인간화된 또는 완전 인간 항체를 생산하기 위해 몇몇 기술이 개발되었다; 예로, 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는, 유럽 특허 EP 1 974 020 B1로도 등록된 국제 출원 WO 2007/068758, 특히 섹션 [0002] 내지 [0027]를 참고하라. 전형적으로, 항체, 예를 들어 B-세포로부터의 모노클로날 항체의 단리는 면역글로불린 유전자의 클로닝 및 발현에 의존한다. 이는 B 세포로부터의 뒤섞인 VH 및 VL 유전자의 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여, 또는 단세포 PCR을 이용해서 단일 B 세포로부터 또는 불멸화된 B 세포 클론으로부터 페어링된 VH 및 VL 유전자의 단리에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 자가면역 및/또는 염증성 질환을 겪는 환자의 B 세포에서 기원한 후보 항 인간 사이토카인 항체의 이용은 특히, 즉 인간 항체의 제공을 위해 특히 귀중한 것으로 나타났다. 따라서 하나의 구현예에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[35] 인간-유래 모노클로날 항-리간드 항체 또는 리간드-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체의 제조 방법으로서, 모노클로날 항체를 발현하는 B 세포가 포유류에서 수득되는 샘플로부터 단리되며, 바람직하게는 포유류가 중추 및/또는 말초 관용성의 손상 또는 자가-관용성의 손실, 예컨대 자가면역 다중내분비병증-칸디다증-외분비 디스트로피(APECED)를 겪으며, 상기 방법이
(a) 항-리간드 항체의 존재에 대해 샘플을 검정하는 단계;
(b) B 세포, 바람직하게는 기억 B 세포를 항-리간드 항체를 함유하는 것으로 확인된 샘플로부터 정제하는 단계;
(c) B 세포를 배양하고, 선택적으로 B 세포 샘플을 항체의 생물학적 활성에 대해 검정하는 단계, 및
(ⅰ) 모노클로날 항체를 단리하는 단계; 또는
(ⅱ) 상기 B 세포 또는 기억 B 세포로부터 상기 항체의 적어도 가변 영역에 대한 면역글로불린 유전자 레퍼토리를 수득하는 단계; 및
(d) 상기 레퍼토리를 이용하여 숙주 세포에서 상기 항체 또는 리간드-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체를 발현하고, 항체 또는 리간드-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체를 단리하는 단계;
(e) 항체 또는 리간드-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체 샘플의 생물학적 활성을 검정하는 단계
를 포함하며; 선택적으로 (f) 단리된 항체 또는 리간드-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계
를 추가로 포함하며; 리간드가 [21] 내지 [34] 중 어느 하나에서 정의된 리간드이고, 단계 (a), (c), 및/또는 (e)에서 샘플 및 항체 각각의 검정이 [31] 내지 [34] 중 어느 하나의 검정에 따라 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
항체 또는 리간드-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체의 재조합적 생산은 당분야에 널리 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 선택적으로, 면역글로불린 유전자 레퍼토리, 즉 상기 항-리간드 항체의 적어도 가변 영역을 인코딩하는 DNA는 제한 부위의 도입, 코돈 이용의 변화, 기능적 영역 또는 펩타이드 링커에 대한 코딩 서열의 도입; 및/또는 전사 및/또는 번역 조절 서열의 부가 또는 최적화를 위해 조작된다. 상기 항체의 면역글로불린 유전자 레퍼토리의 수득을 위해 단일 정렬 세포의 RT-PCR이 바람직하게 채용된다. 특히 단세포 RT-PCR을 이용하는 인간 항체의 수득 방법은, 예를 들어 국제 출원 WO2008/110372에 기재되며, 그 개시 내용이 본원에 참조로, 특히 보충 방법 섹션 및 실시예 2에 포함된다. 본원에서 이용되는 용어 "cDNA" 및 "mRNA"는 비제한적으로 게놈 DNA, cDNA, 및 mRNA를 포함하는 모든 형태의 핵산을 포괄한다. 항체 또는 항체 단편의 클로닝 및 이종성 발현은 분자 생물학 및 재조합 DNA의 통상적 기법을 이용하여 수행될 수 있고, 이는 당분야의 기술 내에 있다(Wrammert et al., Nature 453(2008), 667-671 및 Meijer et al., J. Mol. Bio. 358(2006), 764-772). 이러한 기법은 문헌, 예를 들어 [Sambrook, 1989 Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 제2 Edition]에서 자세히 설명된다. VH/VL 서열의 검색 및 발현을 위해, 문헌 [Tiller et al., in J. Immunol . Methods 329(2008), 112-124]의 방법이 이용될 수 있다. 재조합 인간 항체를 발현하기 위해 임의의 적절한 숙주 세포, 예로 효모, 식물 세포 또는 동물 세포가 이용될 수 있다. 바람직하게는 포유류 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포 및 HEK 세포가 이용된다; 또한, 예로 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 유럽 특허 EP 1 974 020 B1, 섹션 [0164] 내지 [0171]을 참고하라.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체의 불변 영역 또는 이들의 일부, 특히 CH2 및/또는 CH3 도메인, 그러나 또한 선택적으로 CH1 도메인은 본 발명의 방법에 따라 단리되는 원상태 인간 모노클로날 항체의 가변 영역과 이종성이다. 상기 맥락에서, 이종성 불변 영역(들)은 본 발명의 항체의 치료적 적용의 경우 바람직하게는 인간 기원이지만, 또한 동물 연구의 경우, 예를 들어 설치류 기원일 수 있다.
대상체 포유류, 특히 자가면역 및/또는 염증성 장애를 겪는 인간 환자의 이용에 관해, 후보 항체는 바람직하게는 단일유전자 자가면역 장애에 의해 유도되는 자가-관용성의 손상되거나 이상조절된 발생에 기인하거나 이와 연관될 수 있는 중추 및/또는 말초 관용성의 손상 또는 자가-관용성의 손실을 겪는 포유류, 특히 인간으로부터 단리된다. 본 발명에 따른 자가항체에 대해 특히 적합한 원천을 제공하는 동물의 예는 AIRE(자가면역 조절인자) 유전자에서의 돌연변이와 연관되는 장애, 예컨대 각각 자가면역 다중내분비병증 증후군 1형(APS1) 및 자가면역 다중내분비병증-칸디다증-외분비 디스트로피(APECED)(Peterson et al. Nat. Rev. Immunol. 8(2008), 948-957), 자가면역 다중내분비병증 증후군 2형(APS2)(Baker et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 95(2010), E263-E270) 및 면역조절이상 다중내분비병증 장병증 X-연관 증후군(IPEX)(Powell et al. J. Pediatr. 100(1982), 731-737; Ochs et al. Immunol . Rev. 203(2005), 156-164)을 갖는 포유류, 예로 인간이다. 바람직하게는, 그로부터 후보 항체가 단리되는 대상체 포유류는 소정 인간 사이토카인에 대해 혈청반응성을 나타내고 있다. APECED/APS1 환자 및 이들의 자가-이뮤노좀의 스크리닝에 관한 추가 상세사항에 대해서도, 그 개시 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는 본 출원인의 국제 출원 WO2013/098419의 기재, 및 여기에 기재된 실시예, 특히 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 112~117페이지의 물질 및 방법 섹션; 117~118페이지의 실시예 1 및 128페이지의 실시예 7, 그리고 다음 표 1 내지 14; 및 168~171페이지의 실시예 17을 참고하라.
상기 맥락에서, 언급된 바와 같이 원칙 상 인간 항체의 생성이 일부 항원 클래스, 예컨대 아밀로이드-베타 및 바이러스 항원에 대해 보고되었지만, 인체에서 성숙된 단리된 및 재조합 인간 항-사이토카인 항체의 제공은 아직 보고되지 않은 것으로 보임이 주지된다. 따라서 본 발명에 따라, 그 개시 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는 본 출원인의 국제 출원 WO2013/098420에 개시되는, 인간 항체를 단리하는 신규한 독점적 방법에 의해 인간 후보 항-인간 사이토카인 항체가 바람직하게 클로닝된다. 간략하게, 관심 항체를 단리하기 위한 샘플은 가능한 항체 반응성의 검출을 위해 말초혈 단핵구(PBMC) 및 혈청을 포함하거나 이로 구성된다. 대상체에서 유래되는 샘플은 직접, 예로 하나 이상의 원하는 항원(들)에 대한 혈청반응성의 평가를 위해 이용될 수도 있고, 또는 추가 가공될 수도 있다, 예를 들어 B 림프구에 대해 농축될 수 있다. 특히, 샘플이 관심 항체를 생산하는 B 세포, 가장 바람직하게는 기억 B-세포를 포함하거나 이로부터 유래되는 것이 바람직하다. 기억 B 세포는 원하는 항원에 대해 반응성인 B 세포 배양물로부터의 세포를 선별해낸 뒤 면역글로불린 유전자 레퍼토리를 수득하기 위한 단일 정렬 세포의 RT-PCR 전까지 B 세포의 유한 수명만을, 전형적으로 1 내지 2주 이하를 허용하는 조건 하에 배양된다; 상세한 기재에 대해서는 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 국제 출원 WO2013/098419의 118~120페이지의 실시예 1 및 2의 상세한 설명 및 특히 국제 출원 WO2013/098420의 27~31페이지의 실시예 1 내지 4뿐만 아니라 도 1 및 6을 참고하라.
실제로 자가면역 및/또는 염증성 장애, 예컨대 APECED를 겪는 환자의 이용에 관해, 본 출원인의 국제 출원 WO2013/098419 및 WO2013/098420에 개시된 방법이 항-인간 사이토카인 항체의 단리를 위해 특히 적합한 것으로 나타났다.
물론 단리된 본 발명의 항체는 그대로 환자에게 적용되지 않을 수 있고, 보통 예로 이들의 환자에서의 안정성, 허용 가능성 및 생체이용률을 보장하기 위해 약학적으로 제형화되어야 한다. 따라서 하나의 구현예에서, 본 발명의 방법은 단리되고 검증된 후보 항체 또는 이들의 사이토카인-결합 단편을 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계를 추가로 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 철저한 논의는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company, N.J. 1991) 및 Gennaro(2000) Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, ISBN: 0683306472]에서 이용 가능하다. 투여를 위해 바람직한 형태에는 비경구 투여, 예로 주사 또는 주입, 예를 들어 볼루스 주사 또는 연속 주입을 위해 적합한 형태가 포함된다. 제품이 주사 또는 주입용인 경우, 이는 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 약학 제형에서 일반적으로 이용되는 제제, 예컨대 현탁화제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자는 적절한 멸균 액체와의 이용 전에 재구성을 위한 건조 형태일 수 있다. 일단 제형화되면, 조성물은 대상체에 직접 투여될 수 있다. 조성물이 인간 대상체로의 투여를 위해 채택되는 것이 바람직하다. 약학 조성물은 비제한적으로 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 복강내, 경막내, 심실내, 경피, 경피부, 국소, 피하, 비강내, 장, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 임의의 수의 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이들의 단편은 치료제로서 직접 이용될 수 있다. 그러나 하나의 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 인간 항-인간 사이토카인 항체 또는 이들의 사이토카인 결합 단편은 검출 가능하게 표지되거나 약물에 부착되고, 예를 들어 검출 가능한 표지는 효소, 방사선 동위원소, 형광단 및 중금속으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 발명의 표지된 인간 항-인간 사이토카인 항체 또는 사이토카인 결합 단편은 시험관내 "면역화학/면역표지" 유사 검정을 포함하는 생체내 또는 시험관내 특이적 표적을 검출하기 위해 이용될 수 있다. 생체내에서 이들은 관심 항원을 발현하는 조직, 세포 또는 다른 물질을 검출하기 위해 핵 의약 조영 기법과 유사한 방식으로 이용될 수 있다. 본 발명의 표지, 진단에서의 이들의 이용 및 인간 사이토카인 결합 분자에 대한 이들의 커플링은 당분야 숙련가에게 공지되어 있다. 상기 맥락에서, 하나의 구현예에서 용어 약학적 이용에는 생체내 진단적 이용, 특히 인간에서의 생체내 조영이 포함된다.
따라서 본 발명은 또한 임의 하나의 상기 확인된 자가면역 및/또는 염증성 장애 및 질환의 치료에서 치료적 개입을 위한 표적으로서 또는 약학적 이용을 위한 인간 항-인간 사이토카인 항체 또는 이들의 사이토카인 결합 단편의 제조 방법으로서, 본 발명의 임의의 상술된 방법의 단계를 포함하며, 선택적으로 인간 항-인간 사이토카인 항체 또는 이들의 사이토카인 결합 단편이 검출 가능하게 표지되거나 기능적 영역 또는 약물에 부착되며, 바람직하게는 검출 가능한 표지는 효소, 방사선 동위원소, 형광단 및 중금속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 관한 것이다.
물론 당분야의 숙련가는 본원에서 앞서 및 실시예에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법 및 검정이 일반적으로, 예를 들어 본 발명의 검정에서 충분히 활성인 것으로, 즉 리간드-결합을 효과적으로 길항하거나 작동시키는 것으로 입증된, 약학적 이용을 위한 배치의 품질 확인 및 선별을 위한, 리간드-결합을 방해하는 약물 배치의 검증을 위해 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서 추가 구현예에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[36] 자가면역 장애, 염증성 장애, 암 또는 수용체에 대한 리간드-결합에 의해 매개되는 장애의 치료에서 이용하기 위한 항-리간드 항체 또는 리간드-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법으로서,
(a) 항-리간드 항체를 제공하는 단계;
(b) 항체로 [31] 내지 [34] 중 어느 하나의 검정을 거치는 단계; 및
(c) 항체가 길항제 또는 작동제인 것으로 결정되는 경우에만 항체 또는 이들의 유도체를 약학 조성물 중 제형화하는 단계
를 포함하는 방법.
본 발명은 또한 본원에 기재된 방법 및 검정에서 이용하기 위한 시약이 키트 형태에 함유되는 것을 고려한다. 이러한 키트에는 적합한 포장 물질 내에 함유된 별도의 또는 연관되는 제1 결합 시약 및 리포터, 및 제2 결합 시약이 모두 상술된 바와 같이 포함될 것이다. 키트는 선택적으로 다른 성분, 예컨대 키트의 이용을 위한 지침 자료, 제1 결합 시약의 리포터를 검출하기 위한 시약(예로, 완충액, 검출 가능한 효소와 접촉되는 경우 빛을 일으키는 화합물 등), 비교 또는 교정 목적을 위한 양성 대조군 등을 추가로 함유할 수 있다. 따라서 추가 구현예에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[37] [21] 내지 [30] 중 어느 하나에 따른 방법 또는 [31] 내지 [34] 중 어느 하나의 검정을 수행하기 위해 유용한 키트로서, 키트가
(a) 리포터(4)로 표지된 관심 리간드(3) 및/또는 리간드-리포터 융합 단백질을 발현하고 바람직하게는 분비할 수 있는 숙주(리포터) 세포를 함유하는 샘플 또는 이를 위한 제조 수단;
(b) 선택적으로 세포내 기능적 영역(2)을 포함하는 리간드-결합 도메인을 발현하는 표적 세포(1) 또는 이를 위한 제조 수단;
(c) 리포터 활성(5)을 결정하기 위한 수단(6)
을 포함하며; 키트는 바람직하게는 방법 및 검정을 각각 수행하기 위한 지침을 포함하는 키트.
적절한 표적 및 숙주 세포, 벡터, 리간드, 수용체 및 리포터는 본원에서 앞서 그리고 실시예에 기재되었다. 레닐라 루시퍼라아제 융합물에 대한 플라스미드는, 예로 문헌 [Burbello et al. BMC Biotechnol. 5(2005), 22] 및 국제 출원 WO2006/071970에 이전에 기재되었다; 또한 Promega Corporation(2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 53711 USA)에 의해 제공되는 pRL 레닐라 루시퍼라아제 리포터 벡터 및 이러한 리포터 벡터의 이용을 위한 해당 기술 팜플렛을 또한 참고하라.
또한, InvivoGen(5, rue Jean Rodier, F-31400 Toulouse, France)에 의해 제공되는 리포터 검출 키트, 즉 SEAP이 비색 검정, QUANTI-Blue™ 및 HEK-Blue™ 검출을 이용하여 배양된 세포(예컨대 InvivoGen의 리포터 세포)의 상청액에서 효소 활성을 측정함으로써 쉽게 정량되는 그 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP) 리포터 유전자 시스템; 루시아 루시퍼라아제가 즉시 사용 가능한 생체발광 검정 시약 QUANTI-Luc™ 및 β-갈락토시다아제(LacZ) 리포터 유전자 시스템을 이용해서 세포 배양 상청액에서 직접 측정될 수 있는 분비된 합성 코엘렌테라진 루시퍼라아제 루시아 리포터 유전자 시스템이 본 발명에 따라 채택되고 이용될 수 있다: 예를 들어, InvivoGen의 리포터 세포와는 대조적으로, 본 발명에 따른 리포터(상기 정의된 바와 같은 숙주 세포) 세포주는 리간드-리포터 융합 단백질, 예로 SEAP 또는 루시아 루시퍼라아제에 융합된 사이토카인을 발현하고 바람직하게는 분비한다. 제2, 즉 표적 세포주는 하나 이상의 리간드-결합 도메인, 예로 바람직하게는 막 부착 폴리펩타이드에 연결된 하나 이상의 사이토카인 수용체(들) 또는 적어도 이들의 리간드-결합 도메인을 발현한다. 부가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 키트는 적절한 세포 내로 전달감염된 경우 원하는 리포터 및 표적 세포를 각각 생성하는 리포터(숙주) 세포 및 표적 세포 대응 발현 벡터 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
따라서 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기에 관한 것이다:
[38] [21] 내지 [37] 중 어느 하나에 따른 방법 및 검정을 각각 수행하기 위해 유용한 키트로서, 키트가
(a) [6]의 재조합 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 리포터를 인코딩하는 DNA 서열 및 관심 리간드 또는 이들의 단편을 인코딩하는 DNA에 대한 삽입 부위를 포함하는 적어도 하나의 제1 발현 벡터; 및/또는
(b) 선택적으로 관심 리간드의 하나 이상의 리간드-결합 도메인(들)을 인코딩하는 DNA를 포함하는 적어도 하나의 제2 발현 벡터;
(c) 양성 대조군으로 이용되는 리포터만을 인코딩하는 DNA를 포함하는 적어도 하나의 제3 발현 벡터;
(d) 단계 (c)의 리포터를 중화하는 적어도 하나의 대조군 항체, 또는 대안적으로 리포터 결합의 경쟁적 저해제로서의 표지되지 않은 재조합 리간드;
(e) 적어도 하나의 희석 완충액;
(f) 적어도 하나의 검정 완충액;
(g) 리포터 기질을 포함하는 적어도 하나의 염색 용액;
(h) 선택적으로 생체발광 생성 시스템에 의해 생성되는 빛의 스펙트럼을 시프팅하는 스펙트럼 시프팅 인자인 화합물, 및 선택적으로 리포터의 존재 또는 활성을 검출하기 위한 수단
을 포함하며; 키트는 바람직하게는 방법 및 검정을 각각 수행하기 위한 지침을 포함하는 키트.
인간 투여를 위한 제조, 이용 또는 판매의 당국에 의한 승인을 반영하는 통지인 약학적 또는 생물학적 제품의 제조, 이용 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 처방된 형태의 통지가 본 발명의 키트와, 예로 키트를 이루는 용기 내에 연관될 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 키트는 적절한 진단 검정에서 이용하기 위한 시약 및/또는 지침을 포함한다. 본 발명의 조성물, 즉 키트는 당연히 본 발명에 따른 방법 및 검정의 수행을 위해 특히 적합하며, 특히 상기 언급된 바와 같은 리간드-결합 도메인에 대한 관심 리간드 결합의 평가를 위해 적용 가능하다.
진단 목적을 위해 유용한 분자 및 세포 생화학에서의 일반 방법은, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al. Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds. John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al. John Wiley & Sons 1996)]와 같은 표준 교과서에서 확인될 수 있다. 진단 목적을 위한 시약, 검출 수단 및 키트는 상업적 공급업체, 예컨대 Pharmacia Diagnostics, Amersham, BioRad, Stratagene, Invitrogen, 및 Sigma-Aldrich뿐만 아니라 본원에 인용된 참고문헌, 특히 특허 문헌 중 어느 하나에 주어진 출처로부터 이용 가능하다.
본 발명의 방법 및 검정뿐만 아니라 키트의 성분은 하기 도면 및 실시예에 예시된다.
도면, 도면 주석 및 실시예에 개시된 임의의 특징은 개별적으로 또는 조합되어 청구범위 및 상술된 구현예 [21] 내지 [38]의 특징을 예시함이 이해되어야 한다. 따라서 청구범위 및 상기 대응하는 구현예에서의 임의의 특징은 도면, 도면 주석 및 실시예에서 이용되는 대응하는 특징의 하나 이상의 특정한 구현예에 의해 대체될 수 있다. 이는 특히 리간드-결합 도메인, 예로 사이토카인 수용체 및 리간드-리포터, 예로, 사이토카인-루시퍼라아제 융합 단백질을 발현하기 위한 표적 및 숙주 세포 및 이들을 이용하기 위한 발현 벡터에 관해 적용된다. 또한, 본 발명은 또한 본 발명의 방법 및 검정의 임의의 하나의 구현예에서 이용하기 위한 도면, 도면 주석 및 실시예에 기재된 임의의 물질 및 방법에 관한 것임이 이해되어야 한다. 완전성을 위해, 당분야 숙련가는 기재, 실시예 및 도면이 본 출원에 개시된 것과 동일한 발명에 관한 것이며 본 출원이 그에 대한 우선권을 청구하는 유럽 특허 출원 EP 14 175 585.0 및 EP 14 175 673.4의 개시 내용, 특히 실시예 및 도면으로 보충될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 추가 구현예는 후술되는 기재 및 실시예로부터 자명할 것이다. 그렇게 하는 경우, 그리고 달리 나타내지 않는 한, 용어 "모노클로날 항체", "mAb", "MAB" 및 "MAb"는 본원에서 상호 교환적으로 이용된다. 또한, 본 발명이 본 발명에 따라 수행되고 실시예에 기재된 실험에서 원래 수득된 인간-유래 항체에 대해 예시되고 기재되지만, 본 발명의 항체 또는 항체 단편에 대상 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 특히 IL-20에 대한 그 중화 활성을 보유하는, 화학적 또는 재조합 기법에 의해 합성되는 임의의 조작된 항체 또는 항체-유사 IL-20 결합 분자를 의미하는 항체의 합성 및 생물공학적 유도체가 포함되는 것이 이해되어야 한다. 따라서 본 발명이 항체에 대해 간결성을 위해 기재되었지만, 달리 언급되지 않는 한 이들의 합성 및 생물공학적 유도체뿐만 아니라 동등한 IL-20 결합 분자도 의미하는 것이며, 용어 항체의 의미 내에 포함된다.
도 1: 본 발명의 IL-20 특이적 인간 항체의 가변 영역, 즉 중쇄 및 카파/람다 경쇄(VH, VL)의 아미노산 서열. A: 항체 20A10(IgG4, 카파); B: 항체 2A11(IgG1, 람다); C: 항체 7D1(IgG1, 람다); D: 항체 6E11(IgG1, 람다). 프레임워크(FR) 및 상보성 결정 영역(CDRs)을 나타내며, CDR은 밑줄쳐 나타낸다. 이탤릭체 아미노산은 서열분석되지 않았으나 데이터베이스로부터 수득된 서열을 나타낸다.
도 2: APS1 환자로부터 단리된 혈청 중 IL-20 LIPS 혈청반응성의 비교. 개별 환자를 X-축 상에, MAB 결합의 RLU 측정을 Y-축 상에 나타낸다. 환자 APS1-2 및 APS1-9의 혈청이 증강된 IL-20 반응성을 나타낸다.
도 3: 가우시아 루시퍼라아제에 대해 N-말단으로(g1 IL-20) 또는 C-말단으로(g2 IL-20) 융합된 IL-20 구축물에 대한 예시적인 항-IL-20 항체 결합의 EC50 ELISA 결정. A: 2A11; B: 6E11; C: 6H2; D: 7D1; E: 20A10; F: 비-특이적 결합에 대한 대조군으로서 비-IL20 특이적 모노클로날 항체가 이용된다. 나머지 항체 6H2 및 7D1이 g2 IL-20에 더 낮은 친화도로 결합하는 것과 대조적으로, 항체 2A11, 6E11 및 20A10은 두 IL-20 구축물에 모두 고친화도로 결합한다.
도 4: 인간-유래 항-IL-20 모노클로날 항체는 I형 및 II형 IL-20 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포에서 재조합 IL-20-매개 STAT3 활성화를 중화한다. 어느 한 세포를 미처리 상태로 놔두거나 항체의 부재 하에 또는 인간-유래 IL-20 모노클로날 항체 또는 나타낸 바와 같은 인간 대조군 IgG(huIgG)의 존재 하에 재조합 인간 또는 쥐과 IL-20으로 자극하였다. 세포 용해물로 SDS-PAGE를 거치고, 웨스턴 블롯으로 pSTAT3 수준을 가시화하였다. 전체 STAT3, 알파-튜불린 및 IL-20RB 수준은 로딩 대조군으로 작용한다. 항체 농도: 5 ㎍/ml. A: 대조군: rhIL-20 및 rmIL-20은 I형 또는 II형 IL-20 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포에서 STAT3의 용량-의존적 인산화를 유도한다. 전체 및 인산화된 STAT3 및 IL-20RB-Myc-DDK 수준의 검출. B: rhIL-20(10 ng/ml) 또는 rmIL-20(25 ng/ml)을 이용한 자극. 예시적인 항체 2A11, 20A10 및 7D1은 rhIL-20을 중화하는 반면, 20A10 단독은 rmIL-20을 강력 중화한다.
도 5: 인간-유래 항-IL-20 모노클로날 항체는 IL-20 수용체 및 KZ136-NLuc으로 일시적으로 전달감염된 HEK 293T MSR 세포에서 KZ136-NLuc 리포터 구축물의 rhIL-20-매개 유도를 중화한다. 세포를 인간-유래 IL-20 모노클로날 항체 또는 나타낸 바와 같은 대조군 인간 IgG(huIgG)의 존재 하에 120 ng/ml rhIL-20 또는 200 ng/ml rmIL-20으로 자극하였다. A: KZ136-NLuc 리포터 구축물의 도식적 표시. B: 대조군: rhIL-20 및 rmIL-20은 I형 IL-20 수용체 및 KZ136-NLuc으로 일시적으로 전달감염된 HEK 293T MSR 세포에서 KZ136-NLuc 리포터 구축물을 유도한다. C, D: 예시적 항체 항체 20A10, 7D1 및 2A11의 rhIL-20 IC50 분석. E: 예시적 항체 20A10 및 대조군 인간 IgG의 rmIL-20 IC50 분석. F: 예시적 항체 20A10, 7D1 및 2A11의 IC50값.
도 6: pSTAT3 웨스턴 블롯 검정에서 rmIL-20에 대한 인간-유래 항-IL-20 모노클로날 항체 20A10의 IC50 분석. A: I형 IL-20 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포를 처리하지 않고 두거나 나타낸 바와 같이 예시적 항체 20A10의 존재(+) 하에 또는 항체의 부재(-) 하에 25 ng/ml rmIL-20으로 자극하였다. 세포 용해물로 SDS-PAGE를 거치고 pSTAT3 수준을 웨스턴 블롯에서 가시화하였다. 전체 STAT3 수준이 로딩 대조군으로 작용한다. B: pSTAT3 웨스턴 블롯 검정에서 rmIL-20에 대한 예시적 항체 20A10의 IC50값.
도 7: 리간드에 대한 관련 수용체를 발현하는 세포에 대한 관심 리간드의 결합을 평가하기 위한 신규한 검정. 관심 리간드가 루시퍼라아제 융합 단백질로서 이용되므로, 리간드의 세포성 결합이 세포-연관 루시퍼라아제 활성에 의해 측정된다. 상기 검정은 또한 리간드에 의해 유도된 항체가 세포 상 각각의 수용체에 결합하는 그 능력을 방지하는지의 평가를 허용한다. 인간-유래 항-IL-20 모노클로날 항체는 I형 및 II형 IL-20 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포에 대한 IL-20-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질의 결합을 중화한다. 세포를 나타낸 바와 같은 인간-유래 IL-20 모노클로날 항체, 인간 대조군 IgG(huIgG) 또는 1 ㎍/ml rhIL-20의 존재 하에 또는 항체의 부재 하에(-) IL-20-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질을 발현하는 HEK 293T 세포의 상청액과 인큐베이션하였다. 항체 농도: 5 ㎍/ml. A: 리간드에 대한 관련 수용체를 발현하는 세포에 대한 관심 리간드의 결합을 평가하기 위한 신규한 검정을 기재하는 도식적 표시. 관심 리간드가 리포터, 즉 루시퍼라아제 융합 단백질로 이용되므로, 리간드의 세포성 결합은 세포-연관 리포터, 예로 루시퍼라아제 활성에 의해 측정된다. 결합되지 않은 융합 단백질의 제거 후, 루시퍼라아제 기질이 첨가되고 광 방출이 기록된다. 광 출력은 결합된 융합 단백질의 양과 비례한다. B: 상기 루시퍼라아제-기반 화학발광 세포성 결합 검정은 평가 물질, 예컨대 리간드에 대해 유도된 항체가 세포 상 각각의 수용체에 결합하는 그 능력을 방지하는지의 평가를 또한 허용한다.
참조 기호:
1: 리간드-결합 도메인을 발현하는 표적 세포
2: 리간드-결합 도메인, 예컨대 사이토카인 수용체, 예로 I형 또는 II형 IL-20 수용체
3: 리간드, 예컨대 사이토카인, 예로 IL-20
4: 리포터, 예컨대 효소, 예로 인간 IL-20-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질
5: 선택적으로 리포터에 대한, 예컨대 루시퍼라아제에 대한 기질
6: 검출 가능한 리포터 활성, 예컨대 광 방출
7: 평가 물질, 예컨대 항체, 예로 IL-20 항체
리포터에 대한 기질이 필수적인 것은 아니다, 예를 들어 리포터가 효소가 아니고 자체가 검출 가능한 분자, 예컨대 중금속, 예로 금, 방사선 동위원소, 또는 형광 단백질인 경우 리간드-결합 도메인에 대한 리간드의 결합 시 리포터 활성의 변화는 방출의 켄칭, 파장의 변화, 차폐 등일 수 있다. C: 대조군: IL-20-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질(g1 IL-20)은 기능적으로 활성이다. IL-20-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질을 함유하는 HEK 293T의 상청액은 I형 및 II형 IL-20 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포에서 STAT3을 활성화한다. 세포를 g1 IL-20 상청액의 연속 희석물과 또는 대조군 배지(NC)와 인큐베이션하였다. 웨스턴 블롯에서 전체 및 인산화된 STAT3, IL-20RB-Myc-DDK, IL-20RA-Myc-DDK 및 IL-22RA(RA 서브유닛)의 검출. D: 대조군: g1 IL-20 융합 단백질은 Il-20 수용체 I형의 두 서브유닛을 모두 발현하는 HEK 293T MSR 세포에 특이적으로 결합한다. 결합은 표지되지 않은 rhIL-20(3 ㎍/ml)에 의해 폐지된다. E: 대조군: I형 IL-20 수용체를 발현하는 HEK 293T MSR 세포에 대한 g1 IL-20의 결합은 rhIL-20, rmIL-20 및 예시적인 인간-유래 IL-20 모노클로날 항체 20A10에 의해 용량 의존적 방식으로 저해된다. 결합은 비관련 rhIL-32γ 및 대조군 인간 IgG(huIgG)에 의해 영향받지 않는다. F: 예시적인 항체 2A11, 20A10 및 7D1은 I형 및 II형 IL-20 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포에 대한 g1 IL-20의 결합을 중화한다. 표지되지 않은 rhIL-20(1 ㎍/ml)이 양성 대조군으로서 작용한다. 항체 농도: 5 ㎍/ml. G: IFNA5-가우시아 루시퍼라아제-융합 단백질(g1 IFNA5)의 HEK 293T MSR 세포에 대한 결합은 표지되지 않은 rhIFNA2(3 ㎍/ml)에 의해 그리고 예시적인 인간-유래 모노클로날 IFN 항체 19D11(1.7 ㎍/ml)에 의해 저해된다. 인간 대조군 항체(huIgG, 15 ㎍/ml)는 효과를 나타내지 않는다. H: g1 IFNA2, A4, A5, A6, A7, A8, A10, A14, A16, A17 및 A21 융합 단백질의 HEK 293T MSR 세포에 대한 결합은 예시적인 인간-유래 모노클로날 IFN 항체 19D11에 의해 저해된다. g1 IFNB 및 W의 결합은 19D11에 의해 영향받지 않는다. 모든 g1 IFN의 결합은 대조군 인간 항체(huIgG)에 의해 영향받지 않는다. 항체 농도: 5 ㎍/ml.
도 8: 화학발광 세포성 결합 검정에서 인간-유래 항-IL-20 모노클로날 항체의 IC50 분석. I형 또는 II형 IL-20 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포를 인간-유래 IL-20 모노클로날 항체, A:　20A10, B: 7D1 및 C: 2A11의 존재 하에 g1 IL-20 상청액과 인큐베이션하였다. D: 예시적인 항체 20A10, 7D1 및 2A11의 IC50값.
도 9: 교차-경쟁. A: 실험 설정: 96 웰 마이크로플레이트(Costar, USA)를 4℃에서 O/N으로 PBS 중에 1/250배 희석된 토끼-항-GLuc 특이적 항체(NEB, E8023S)로 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T로 세척하고, 2% BSA(Sigma, Buchs, Switzerland) 함유 PBS로 실온에서 1 h 동안 차단하였다. 30 ㎕의 GLuc-IL-20을 최종 농도 2x106 LU/웰로 첨가하고, 실온에서 2 h 동안 인큐베이션하였다. 키메라 항체를 30 ㎕ PBS 중 0.5 ㎍/ml 대 3 ㎍/ml의 최종 농도로 인간 경쟁인자 항체와 사전혼합하고 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 2 h 동안 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS-T로 세척하고, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 접합 염소 항-마우스 IgG Fc-감마 특이적 항체(Jackson Immuno Research, 0.5% BSA-PBS 중 1:500)를 이용한 뒤 TMB 기질 용액(Sigma, Buchs, Switzerland)을 이용한 HRP 활성의 측정에 의해 인간-마우스 키메라 항체의 결합을 결정하였다. 별도 결합 부위에 대한 인간-마우스(hm) 키메라 구축물과 본 발명의 예시적인 인간-유래 항-IL-20 모노클로날 항체의 차별적 결합을 B: 20A10 hm, C: 2A11 hm, D: 7D1 hm 및 E: 6E11 hm과의 교차-경쟁 실험에서 연구하였다. F: IL-20 비-결합 대조군으로서, 비관련 항원에 결합하는 인간 항체를 이용하였다. 인간-유래 항-IL-20 MAb 20A10, 2A11 및 6E11은 임의의 다른 인간-마우스 키메라 항-IL-20 MAb와 경쟁하지 않았으나, 인간 6H2는 인간-키메라 7D1의 결합과 경쟁하였다.
도 10: 교차-반응성 - GLuc-샌드위치 ELISA에 의해 마우스 및 인간 IL-20에 대한 본 발명의 예시적인 인간-유래 항-IL-20 모노클로날 항체 6E11, 2A11 및 20A10 결합의 결정 및 비교. A: 교차-반응성의 평가를 위한 실험 설정: 96 웰 마이크로플레이트(Costar, USA)를 4℃에서 O/N으로 PBS 중에 1/250배 희석된 토끼-항-GLuc 특이적 항체(NEB, E8023S)로 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T로 세척하고, 2% BSA(Sigma, Buchs, Switzerland) 함유 PBS로 실온에서 1 h 동안 차단하였다. 30 ㎕의 GLuc-IL-20을 최종 농도 2x106 LU/웰로 첨가하고, 실온에서 2 h 동안 인큐베이션하였다. 경쟁인자인 항원 재조합 hIL-20 및 재조합 마우스 IL-20을 10 ㎍/ml 내지 4.6 ng/ml 범위의 연속 희석으로 평가될 항체(1 ㎍/ml의 고정 농도)에 대해 적정하였다. 웰 당 30 ㎕의 혼합물을 실온에서 1.5 h 동안 웰에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T로 세척하고, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 접합 염소 항-인간 Fc-감마-특이적 항체(Jackson Immuno Research, Europe Ltd., Cambridgeshire, UK)를 이용한 뒤 TMB 기질 용액(Sigma, Buchs, Switzerland)을 이용한 HRP 활성의 측정에 의해 경쟁인자의 존재 하에 관심 항원에 대한 인간 IgG의 결합을 결정하였다. B, C, D: 인간 IL-20은 g2 IL-20에 대해 모든 평가된 항-IL-20 항체의 결합을 저해한다. 쥐과 IL-20은 6E11을 제외한 모든 평가된 항체의 g2 IL-20에 대한 결합을 저해할 수 있다.
도 11: 귀 염증 검정 CytoEar IL-20. hIL-20 유도 염증 후 본 발명의 상이한 IL-20 차단 항체의 효과 평가. 염증을 유도하기 위해, IL-20을 상이한 농도의 125 ng, 250 ng, 500 ng 및 1000 ng으로 적정 후 최적 실험 결과를 제공한 부피 20 ㎕ 중 농도 1000 ng으로 주사하였다. A: 예시적인 10-일 실험 타임라인. B: 실험 동물군 A 내지 M의 실험 처리의 개요. 각각의 코호트에 대해, 관련 PBS 대조군에 대해 정상화된 것에 비해 0일 측정 대비 배율 변화로 계산되는 CytoEar 귀 두께 측정. C: 모든 정상화된 측정의 효과의 개요. D: 모든 정상화된 측정의 효과의 개요. E: 명확성을 위해, IL-20 결과만 나타내는 모든 정상화된 측정의 효과의 개요. 본 발명의 항체 20A10 및 7D1을 이용한 처리(6 내지 10일, 2A11에 대해서는 8 내지 10일에 귀 두께의 유의미한 감소)는 IgG를 이용한 대조군 처리(IL-20 비-관련 결합 특이성) 대비 IL-20 주사로 생성된 귀 두께의 현저한 감소로 이어진다. 평균 +/- SEM, ID = 피내 사이토카인 주사, M = 측정 - 귀 두께, S = 동물 희생; ID - 사이토카인 주사; 평가된 항체 2A11, 20A10, 7D1, 및 대조군 IgG를 0 및 6일에 주사하였다(IP). IP = 복강내 항체 주사, ID = 피내 귀 주사.
도 12: SPR 분석. A: 본 발명의 예시적인 항체에 대한 인간 및 마우스 IL-20의 결합에 관한 센소그램의 상세 분석. 1:1 결합 역학이 관찰되었다. 항원을 1.5 nM, 3.125 nM, 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM 및 100 nM의 농도로 주사하였다. 계산된 친화도(KD 값[M])를 도표에 나타낸다. B: 그래프는 모든 평가된 항체의 연합(온-속도 ka) 및 해리(오프-속도 kd)에 대해 피팅한 곡선에서 유래된 역학 파라미터를 나타낸다. 대시 표시 사선은 친화도(KD)를 나타낸다. C: 바이오틴-스트렙타비딘 결합의 SPR 문헌 값 대비 본 발명의 예시적인 항체의 KD 값. 20A0 및 2A11의 인간 IL-20에 대한 친화도는 마우스 IL-20에 대해 각각 피코몰 미만 농도 범위 및 나노몰 미만 농도 범위이다.
도 13: 본 발명의 인간 항-IL-20 항체의 에피토프 맵핑. A: 마이크로어레이에 커플링된 전장 항원에 대한 본 발명의 항체의 결합. Y-축은 Cy5-접합 2차 항체를 이용한 검출 시 형광 강도(RFU)를 나타내었다. B: 본 발명의 모든 항체에 대한 인간 IL-20의 18머 펩타이드의 1차 펩타이드 어레이. C: 본 발명의 모든 항체에 대한 쥐과 IL-20의 18머 펩타이드의 1차 펩타이드 어레이. D: 20A10에 대한 인간 IL-20의 1차 펩타이드 어레이. 아래 패널에는 라이신 89부터 메티오닌 129까지의 서열을 커버하는 펩타이드를 도시한다. 예시적인 항체 20A10은 펩타이드 20에 특이적으로 결합한다. E: 잔기 P101 내지 L129를 포함하는 예시적인 항체 20A10의 에피토프의 알라닌-스캐닝. 위치 D102, H103, Y104, T105, L106, R107, K108, S111, N114, S115 및 F116에서의 알라닌 치환은 mAb 결합의 파괴로 이어졌다.
도 14: 인간 IL-22-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질은 COLO 205 세포에 특이적으로 결합한다. 세포를 나타낸 바와 같은 저해제의 부재 하에(-) 또는 경쟁적 저해제의 존재 하에 IL-22-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질(g2 IL-22)을 발현하는 HEK 293T 세포의 상청액과 인큐베이션하였다. A: COLO 205 세포에 대한 g2 IL-22의 결합은 비관련 rhIFNA2에 의해서가 아니라 표지되지 않은 rhIL-22에 의해 저해된다. COLO 205 세포를 나타낸 바와 같은 저해제의 부재 하에 또는 표지되지 않은 rhIL-22 또는 rhIFNA2(각각 1 ㎍/ml)의 존재 하에 HEK 293T 세포의 g2 IL-22-함유 상청액과 인큐베이션하였다. 광 출력을 기록하기 전에, 세포를 용해시키거나 용해시키지 않았다. B: COLO 205 세포에 대한 g2 IL-22의 결합은 예시적인 인간-유래 IL-22 모노클로날 항체 30G1에 의해 용량-의존적 방식으로 저해된다. 결합은 대조군 인간 항체(huIgG)에 의해 영향받지 않는다.
도 15: 항체 26B9 막통과(26B9-TM) 구축물 설계. 인간 혈소판-유래 성장 인자 수용체(PDGFR)-베타(데이터베이스 접근 번호 uniprot P09619, 아미노산 513-561)의 myc-에피토프 및 막통과 도메인을 포함하는 단편이 불변 중쇄 도메인의 C-말단 부분에 융합된다(A). 카파 경쇄의 불변 영역은 변경되지 않고 유지된다(B). HEK 293T MSR 세포의 공동 전달감염 시, 항-인간-IgG-HC-FITC 및 항-인간-Ig 카파-APC 표지된 검출 항체를 이용한 FACS 분석에 의해 적절히 조립된 IgG가 세포 표면 상에서 검출된다.
도 16: 26B9-TM 막통과 영역의 서열(서열 목록 67). DNA 염기 1 내지 30의 myc-에피토프 및 DNA 염기 34 내지 183의 PDGFR 막통과 도메인을 포함하는 26B9-TM 막통과 영역의 DNA 및 아미노산 서열.
도 17: 인간 IFNW-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질은 막통과 항-IFNW mAb를 발현하는 HEK 293T MSR 세포에 특이적으로 결합한다. HEK 293T MSR 세포를 항-IFNW mAb 26B9의 막-결합된 버전(26B9-TM) 또는 빈 벡터(모의처리)를 인코딩하는 나타낸 양의 cDNA로 역-전달감염시켰다. 전달감염 48시간 후, IFNW-가우시아 루시퍼라아제를 첨가하고(g1 IFNW) 화학발광 세포성 결합 검정에서 결합을 분석하였다. A: 대조군: 26B9-TM은 전달감염된 HEK 293T MSR 세포의 세포 표면에서 발현된다. 표면 항체 발현을 세포-기반 ELISA에서 전달감염 48시간 후 분석하였다. B: g1 IFNW는 발광 세포성 결합 검정에서 26B9-TM을 발현하는 세포에 특이적으로 결합한다.
도 18: 항-IFNW 항체의 교차-경쟁 검정. 26B9-TM에 대한 g1 IFNW의 결합은 가용성 26B9에 의해 그리고 클론적으로 관련된 31B4 항체에 의해 용량 의존적으로 경쟁된다. 대조적으로, 결합은 대조군 IgG에 의해 또는 예시적인 항-IFNW 항체 8H1에 의해서는 영향받지 않는다.
발명의 상세한 설명
제1 측면에서, 본 발명은 일반적으로 포유류, 바람직하게는 인간 기원의 IL-20에 결합하는 신규한 분자에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 재조합 인간-유래 모노클로날 항-인터류킨-20(IL-20) 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 및 생물공학적 변이체뿐만 아니라 첨부된 실시예 및 도면에 예시된 임의 하나의 항-IL-20 항체 20A10, 2A11, 7D1 또는 6E11의 면역학적, 예로 IL-20 결합 특징 및/또는 하나 이상의 생물학적 활성을 나타내는 동등한 IL-20-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 언급된 항-IL-20 결합 분자는 인간에서 실질적으로 비-면역원성이다.
실시예 2 및 6에 기재되었을 뿐만 아니라 도 3 및 10에 예시된 바와 같이, 본 발명은 인간 IL-20에 선택적으로 또는 우선적으로 결합하는 항-IL-20 항체, 예로 항체 20A11 및 7D1뿐만 아니라 인간 및 쥐과 IL-20에 동등하게 결합하는 항-IL-20 항체, 즉 항체 20A10을 제공한다. 따라서 하나의 구현예에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체는 재조합 쥐과 IL-20에 결합할 수 있는 반면, 또 다른 구현예에서는 쥐과 IL-20에 실질적으로 결합하지 않는다. 두 구현예는 모두 장점을 갖는다. 예를 들어, 치료 항체 개발을 위해, 선도 항체가 특정한 질환 상에서의 치료 활성에 대해 그리고 독성학 연구를 수행하기 위해 동물 모델에서 평가되어야 하는 것이 일반적으로 알려져 있다. 여기서 마우스는 질환 모델을 위해 가장 일반적으로 이용되는 동물이며 마우스는 또한 독성학 연구를 위해 및 장기 생식 독성 연구를 위해 예비 스크리닝용으로 가장 일반적으로 이용되는 동물이다. 따라서, IL-20 항체 및 항체 20A10에서 유래되는 유사한 IL-20 결합 분자는 쥐과 IL-20과 이들의 교차-반응성으로 인한 대리 쥐과 항체에 대한 필요성을 제거한다.
반면, 항-IL-20 항체 및 항체 20A11 또는 7D1에서 유래되는 유사한 IL-20 결합 분자는 인간 IL-20에 선택적으로 결합하는 장점을 가지며, 그 이유로 질병이 재조합 인간 IL-20에 의해 유도되는 동물 모델, 예컨대 본 출원인의 공동 계류 중인 국제 출원 WO2015/001047, 또한 여기에서 실시예 2 및 3에 기재된 HuCytoMab-검정에서, 결과가 동물의 내인성 IL-20에 의해 영향받지 않는다. 또한, 인간 IL-20 및 대응하는 동물 종 간을 구별하는 항-IL-20 항체 및 유사한 IL-20 결합 분자는 진단적 이용을 위해 유리하다. 따라서, 본 발명의 인간 모노클로날 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체의 두 구현예는 모두 이들의 장점을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 인간 모노클로날 항-IL-20 항체 또는 이들의 IL-20 결합 단편은 IL-20의 생물학적 활성을 중화할 수 있으며, 바람직하게는 생물학적 활성은
(a) 예를 들어 실시에 3에 따라 결정될, 세포 기반 STAT(신호 전달물질 및 전사 활성화제) 활성화 검정에서의 IL-20 신호전달;
(b) 예를 들어 실시에 4에 따라 결정될, IL-20 사이토카인 세포-표면 수용체 결합의 저해;
(c) 예를 들어 실시에 5에 따라 결정될, 인간 IL20R1/IL20R2 수용체 복합체의 인간 IL-20 매개 활성화; 및/또는
(d) 예를 들어 실시에 7에 따라 결정될, 인간 IL-20의 전-염증성 활성
이다.
바람직하게는, 본 발명의 항-인간 인터류킨-20(IL-20) 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체는 그 가변 영역에
(a) 하기에 도시된 VH 및/또는 VL 가변 영역 아미노산 서열의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR):
(ⅰ) 도 1(VH)(서열번호 2, 10, 18 및 26); 및
(ⅱ) 도 1(VL)(서열번호 4, 12, 20 및 28);
(b) 도 1에 도시된 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열;
(c) (a)의 임의의 하나의 아미노산 서열의 부분적 변경으로 생성되는 아미노산 서열로 이루어지는 적어도 하나의 CDR; 및
(d) (b)의 아미노산 서열의 부분적 변경으로 생성되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역
을 포함한다.
본원에서 아래에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명의 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체는 임의의 유형, 클래스 또는 서브클래스의 면역글로불린 분자이거나 이로부터 유래될 수 있다. 그러나 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 IgG 이소형이며, 가장 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 서브클래스이다.
상기 맥락에서, 본 발명의 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체는 바람직하게는 표 1에 나타낸 CH 및 CL 아미노산 서열(서열번호 6, 8, 14, 16, 22, 24, 30 및 32)로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 언급된 참조 서열과 적어도 60% 동일성, 바람직하게는 70% 동일성, 보다 바람직하게는 80% 동일성, 더욱 바람직하게는 90% 동일성, 특히 바람직하게는 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CH 및/또는 CL 불변 영역을 포함한다.
상술된 바와 같이, IL-20은 IL-20 수용체(R) 복합체 IL-20RA/IL-20RB(I형) 결합을 통해 또는 IL-20 수용체 복합체 IL-22RA/IL-20RB(II형) 결합을 통해 STAT3 활성화를 유도하는 것으로 나타났다(Parish-Novak et al. J. Biol . Chem . 277(2002), 47517-47523; Logsdon et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(2012), 12704-9). 또한, IL-20은 다양한 전-염증성 사이토카인, 예컨대 단핵구 화학주성 단백질(MCP)-1, IL-6 및 IL-8을 유도할 수 있다(문헌 [Hsieh et al. Genes Immun . 7(2006) 2434-242), Hsu et al. Arthritis Rheum. 54(2006), 2722-2733, 상기] 참고). 상기 활성화 기전은 본 발명 내에서 IL-20-활성을 결정하기 위한 시험관내 및 생체내 검정의 설계를 위해(실시예 3 및 4 참고) 뿐만 아니라 실시예 5에 기재된 신규한 세포성 리간드 수용체 결합 검정에서, 뿐만 아니라 실시예 7 및 도 4, 5, 6, 7e, 7f, 및 8에 기재된 바와 같은 귀 염증 검정의 모니터링으로 본 발명의 항체의 중화 특성을 모니터링하기 위해 이용되었다. 여기에 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체는 IL-20, IL-20-매개 STAT3 활성화 및 I형뿐만 아니라 II형 IL-20 수용체에 대해 강력한 중화 활성을 갖는 것으로 나타났다. 따라서 하나의 구현예에서, 본 발명의 IL-20 항체 또는 이들의 IL-20 결합 단편은 인간 IL-20의 생물학적 활성을 감소시킬 수 있다. 바람직한 구현예에서, 생물학적 활성은 인간 IL-20 유도 염증이다. 또한 본 발명의 하나의 구현예에서, 생물학적 활성은 STAT 리포터 검정 및/또는 귀 염증 검정에서 결정된다. 또한, 본 발명의 항체의 결합 친화도가 본원에, 예로 실시예 2에 기재되고 도 3 및 10에 나타낸 바와 같이 ELISA 및 인간 IL-20-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질에 의해 평가되었다. 이들 실험 결과에 따르면, 본 발명은 IL-20에 대해 차별적 결합 친화도를 나타내는 몇몇 예시적인 항-IL-20 항체 및 이들의 IL-20 결합 단편을 제공하며, 이는 본원에 제공된 IL-20 결합 분자의 결합 및 중화 특징을 예시한다. 또한, 실시예 10에 기재되고 도 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 예시적인 항체 20A10은 큰 에피토프 빈(bin)을 갖는다, 즉 18머 IL-20 펩타이드의 아미노산 서열에서 다수의 아미노산이 항체의 결합을 위해 필수적이고 요구됨을 의미한다.
따라서 본 발명의 하나의 구현예에서, 아미노산 서열 101-PDHYTLRKISSLANSFLT-118(서열번호 69), 102-DHYTLRKISSLANSF-116(서열번호 70) 및/또는 101-PDHYTLRKISSLANSFL-117(서열번호 72)로 이루어지는 IL-20 유래 펩타이드를 인식하는 본 발명의 항체 또는 IL-20 결합 단편, 합성 또는 생물공학적 유도체가 제공되며, 여기서 P101, I109, S110 및/또는 L117만 알라닌으로 치환될 수 있고, 항체는 아미노산 서열 97-NYQTPDHYTLRKISSLAN-114(서열번호 71)로 이루어지는 펩타이드를 인식하지 않거나 실질적으로 인식하지 않는다.
흥미롭게도 항체 20A10은 전장 마우스 Il-20에 결합하는 항체의 능력에도 불구하고, 인간 IL-20 101-118-펩타이드로부터의 그 아미노산 서열에서 위치 Y104H 및 T118I만(후자는 20A10 결합에 있어 없어도 되는 것임) 상이한 마우스 IL-20에서 유래되는 대응하는 펩타이드나 임의의 다른 마우스 IL-20 유래 18머 펩타이드에는 결합하지 않는다; 예로, 도 13을 참고하라. 따라서, 20A10 항체는 인간 및 마우스 IL-20의 입체형태 에피토프를 인식하며, 이는 또한 인간 IL-20 유래 펩타이드 101-PDHYTLRKISSLANSFLT-118(서열번호 69) 및 101-PDHYTLRKISSLANSFL-117(서열번호 72)에 의해 형성되거나 모사될 수 있다고 가정하고자 한다.
실시예에 기재되고 도면에 나타낸 바와 같이, 본 발명을 예시하는 항-IL-20 항체는 각각 μM 범위 내지 최대 10 ng 미만의 EC 및 IC를 특징으로 한다(항-IL-20 항체 2A11). 따라서 바람직하게는, 본 발명의 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체는 g1 IL-20 및/또는 g2 IL-20에 있어서 ELISA 검정에 의해 결정되는 약 100 ng/ml 미만, 바람직하게는 50 ng/ml 미만 및 가장 바람직하게는 10 ng/ml 미만의 EC50을 갖는다; 실시예 2 및 도 3을 참고하라. 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체는 rhIL-20에 있어서 KZ136-NLuc 리포터 검정에 의해 결정되는 약 1000 ng/ml 미만, 바람직하게는 500 ng/ml 미만의 IC50을 갖는다; 실시예 3 및 4 및 도 5f에 나타낸 바를 참고하라. 본 발명의 항체의 결합 친화도에 대한 보다 상세한 사항은, 예로 더 아래의 "결합 특징" 섹션을 참고하라.
특히 치료적 적용을 위해 이용 가능한 항체를 제공하기 위해, 즉 인간에서의 마우스 항체와 같이 외래 항체에 대해 관찰되는 바와 같은 본 발명의 항체에 대한 면역학적 반응(HAMA-반응)을 배제하기 위해, 본 발명을 예시하는 실시예에 기재된 예시적인 항-IL-20 항체가 인간 환자에서 유래되었으므로, 본 발명은 바람직하게는 완전 인간-유래 항체에 관한 것이다.
상기 맥락에서, 인간화된 항체 및 다르게는 인간-유사 항체와는 대조적으로(또한 아래의 논의를 참고하라), 본 발명의 인간-유래 항체는 인체에 의해 나타난 CDR을 포함하는 것을 특징으로 하며, 이에 따라 실질적으로 면역원성의 위험이 없다. 따라서, 항체의 하나 또는 두 가변 경쇄 및 중쇄의 적어도 하나, 바람직하게는 2개, 및 가장 바람직하게는 전체 3개 CDR이 본원에 예시된 인간 항체에서 유래되는 경우, 본 발명의 항체는 여전히 인간-유래로 표시될 수 있다.
이러한 인간-유래 항체는 이들 항체가 처음에 대상체에 의해 실제로 발현되었으며, 예를 들어 지금까지의 인간-유사 항체를 제공하기 위해 시도하는 가장 일반적인 방법을 나타내는 인간 면역글로불린 발현 파지 라이브러리 또는 인간 면역글로불린 레퍼토리의 일부를 발현하는 트랜스제닉 동물에서 생성된 이종발생성 항체에 의해 생성되는 시험관내 선택된 구축물이 아님을 강조하기 위해, "인간 자가-항체"로도 불릴 수 있다. 반면, 본 발명의 인간-유래 항체는 이를 단백질 A 또는 친화도 컬럼을 통해 정제될 수 있는 인간 혈청 항체 자체로부터 구별하기 위해 합성, 재조합, 및/또는 생물공학적으로도 표시될 수 있다.
그러나 본 발명은 동물 모델, 예로 인간 IL-20을 발현하는 트랜스제닉 마우스에서 본 발명의 항체의 추가 연구를 이용하고 포함한다. 하나의 측면에서, 인간에서의 HAMA-반응과 유사한 실험 동물에서의 면역원성 효과를 배제하기 위해, 키메라 항체, 바람직하게는 키메라 설치류-인간 또는 설치류화 항체, 가장 바람직하게는 키메라 쥐과-인간 또는 쥐과화 항체인 본 발명의 항체 또는 결합 단편이 제공된다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항-IL-20 항체 또는 IL-20 결합 분자는 도 1에 도시되거나 표 1에 나타낸 바와 같은 대응하는 핵산에 의해 인코딩되는 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 인간 IL-20에 대한 특이적 결합에 있어서 본원에서 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 항체와 경쟁하는 항-IL-20 항체 또는 IL-20 결합 분자에 관한 것이다; 실시예 6 및 7뿐만 아니라 도 9-10을 참고하라. 특히, 실시예 및 도면에 예시된 항체에 대해 개요된 바와 같은 면역학적 결합 특징 및/또는 생물학적 특성을 나타내는 항-IL-20 항체가 제공된다. 존재하는 경우, 용어 "면역학적 결합 특징" 또는 항체의 항원과의 다른 결합 특징은 그 모든 문법적 형태에서 항체의 특이성, 친화도, 교차-반응성, 및 다른 결합 특징을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항-IL-20 항체는 항체 단편이다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 단편은 단일쇄 Fv 단편(scFv), F(ab') 단편, F(ab) 단편, F(ab')2 단편 및 단일 도메인 항체 단편(sdAB)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 항체의 추가 장점은 체액성 면역 반응이 그 생리적 및 세포성 환경에서 원상태 항원에 대해 유발되었다는 사실에 기인하여, 전형적으로 맥락에서, 예를 들어 다른 세포성 성분과의 그 제시, 세포 표면 막 상의 제시 및/또는 수용체로의 결합에 기인하는 항원의 입체형태 에피토프를 인식하는 자가항체가 생산되고 단리될 수 있다는 것이다. 대조적으로, 모노클로날 항체, 예컨대 마우스 모노클로날, 이들의 인간화 버전 또는 파지 디스플레이로부터 수득되는 항체를 생성하는 통상적 방법은 전형적으로 비-인간 포유류의 면역화 및 검출 각각을 위해 표적 단백질의 항원성 단편을 채용하며, 이 때 보통 그 생리적 및 세포성 맥락에서 원상태 단백질의 존재보다는 면역원의 2차원 구조로 제한되는 입체형태 에피토프 또는 선형 에피토프를 인식하는 항체가 수득된다. 따라서, 본 발명의 자가항체는 이들의 에피토프 특이성의 관점에서 독특하다고 예상하는 것이 신중하다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따라 단리되는 자가항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 나타내는 항체 및 유사-결합 분자에 관한 것이다. 이러한 항체는, 예를 들어 경쟁적 ELISA에 의해 또는 보다 적절하게는 본 발명의 자가항체 및 이들의 모노클로날 유도체를 각각 참조 항체로서, 그리고 실시예에 기재되거나 당분야 숙련가에게 달리 공지된 면역학적 평가를 이용하는 세포 기반 중화 검정에서 쉽게 평가될 수 있다.
본 발명은 일반적으로 이들의 가변 영역, 즉 결합 도메인에 (VH)(서열번호 2, 10, 18 및 26) 및 (VL)(서열번호 4, 12, 20 및 28)의 도 1에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있는 IL-20 결합 분자, 즉 항체 및 이들의 결합 단편을 예시한다 - 도 1에 밑줄치고 표 1에서 확인되는 예시적인 CDR 서열을 참고하라. 그러나 아래에서 논의된 바와 같이, 당분야 숙련가는 추가적으로 또는 대안적으로, 특히 CDR2 및 CDR3의 경우, 도 1에 나타낸 것과 이들의 아미노산 서열이 1, 2, 3개 또는 그 초과의 아미노산 치환에 의해 상이한 CDR이 이용될 수 있다는 점을 잘 인식한다.
본 발명의 항체에 대해 추가로 나타낸 바와 같이, 이들은 이들의 표적 단백질의 생물학적 활성을 중화할 수 있다; 예로, 실시예 3 및 도 4, 5, 6, 7e, 7f 및 실시예 7 및 도 11에 기재된 STAT3 저해 검정 및 귀 염증 검정의 결과를 참고하라. 상기 맥락에서, 용어 "중화"는 본 발명의 항-IL-20 항체 또는 이들의 IL-20 결합 단편이 본 발명의 대상 항체의 존재 하에 각각의 검정을 수행함으로서 평가될 수 있는 바와 같이, 생화학적, 세포-기반 또는 생체내 검정에서 그 표적 단백질의 생물학적 활성에 개입할 수 있음을 의미하며, 여기서 표적 단백질의 생물학적 활성은 본 발명의 항체의 부재 하 및 화합물, 예를 들어 표적 단백질의 생물학적 활성이 영향받지 않도록 두는 것으로 알려진 종류의 대조군 항체의 존재 하 단백질의 생물학적 활성에 비해 검정을 거친 본 발명의 항체의 수준 증가와 동시에 감소된다. 이러한 생화학적, 시험관내 및 생체내 기반 검정은 또한 표적 단백질의 생물학적 활성을 중화할 수 있는, 예컨대 본 발명의 항-IL-20 항체에 대해 나타난 것으로 공지된 참조 항체를 이용해서 후보 항체를 평가 샘플에 처리하여 수행될 수 있고, 여기서 참조 및 후보 항체의 조합 활성으로부터 생성되는 추가적 중화 효과가 관찰될 수 있거나 어느 한 항체의 표지에 의해 결정될 수 있는 후보 항체 및 참조 항체의 경쟁이 관찰된다. 따라서 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체는 그 항원의 생물학적 활성을 중화할 수 있다. 중화 효과는, 예로 IL-20 활성이 감소되는 양 또는 이러한 감소가 본 발명의 IL-20 결합 분자의 도입 후 관찰될 수 있는 시간의 관점으로, 또는 당연히 둘 다의 조합된 관점으로 평가될 수 있다.
본 발명의 더 아래에 기재된 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체뿐만 아니라 면역접합체는, 아래에 상세히 나타낸 바와 같이, 예를 들어 숙주 세포에서 또는 시험관내 무세포 번역 시스템에서 발현에 의해 제공될 수 있다. 숙주 세포에서 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 발현하기 위해, 상기 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체뿐만 아니라 면역접합체를 인코딩하는 핵산 분자가 적절한 발현 벡터, 즉 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소를 함유하는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 당분야 숙련가에게 널리 공지된 방법이 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 요소를 함유하는 발현 벡터를 구축하기 위해 이용될 수 있다. 이들 방법에는 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법, 및 생체내 유전적 재조합이 포함된다. 이러한 기법은 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual(1989), 및 Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology(1989)]에 기재된다; 이에 관한 추가 상세내용에 대해서는 또한 더 아래의 "폴리뉴클레오타이드" 및 "발현" 섹션 그리고 실시예 섹션에 언급된 문헌을 참고하라.
산물의 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 임의의 원핵생물 또는 진핵생물 세포; 예로, 박테리아 세포, 예컨대 E. 콜라이 또는 B. 서브틸리스, 곤충 세포(배큘로바이러스), 효모 세포, 식물 세포 또는 동물 세포일 수 있다. 그러나 효율적인 가공을 위해, 포유류 세포가 바람직하다. 상기 목적을 위해 유용한 전형적인 포유류 세포주에는 CHO 세포, HEK 293 세포, COS 세포 및 NSO 세포가 포함된다.
본 발명의 단리된 항체는 당연히 그대로 환자에게 적용되지 않을 수 있고, 보통, 예로 환자에서 이들의 안정성, 허용 가능성 및 생체이용률을 보장하기 위해 약학적으로 제형화되어야 한다. 따라서 하나의 구현예에서, 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체뿐만 아니라 면역접합체를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계를 추가로 포함하는, 본 발명의 방법이 제공된다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 아래에 추가로 상세히 기재될 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 면역글로불린쇄의 적어도 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 가변 영역은 도 1에 나타낸 바와 같은 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
유래된 또는 동등한 서열의 경우, 상기 서열은 서열 목록에서 확인되고 상기 나타낸 서열로 이루어진 군의 서열과 적어도 60% 동일성, 보다 바람직하게는(다음 순서로) 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 95%, 적어도 96-99%, 또는 심지어 100% 동일성을 나타낸다. 두 서열 간의 동일성 백분율은 두 서열의 최적 정렬을 도입하기 위해 필요한 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열의 비교 및 두 서열 간 동일성 백분율의 결정은 당분야 숙련가에게 널리 공지된 수학적 알고리즘을 이용해서 수행될 수 있다. 본원에 나타낸 동일성은 아래에서 본원에 더 나타낸 바와 같은 BLAST 프로그램을 이용하여 결정되어야 한다.
상기 언급된 바와 같이, 바람직한 구현예에서 본 발명은 실질적으로 완전 인간 항체, 바람직하게는 적어도 불변 중쇄 I(CH1) 및 람다 또는 카파와의 조합으로 불변 영역의 대응하는 경쇄, 즉 γ-1, γ-2, γ-3 또는 γ-4를 포함하는 IgG에 관한 것이다. 특히 바람직한 구현예에서, 실시예에 예시된 대상 항체에 대해 단리되는 불변 영역의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 뉴클레오타이드 서열에 대해 아래 표 1에 및 서열번호 5, 7, 13, 15, 21, 23, 29 및 31 및/또는 아미노산 서열 또는 이전에 참조된 것들과 적어도 60% 동일성을 갖는 아미노산 서열들에 대해 서열번호 6, 8, 14, 16, 22, 24, 30 및 32에 도시된 바와 같이 이용된다.
상기에 따르면, 하나의 구현예에서 본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편의 하나의 면역글로불린쇄의 적어도 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 전형적으로, 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 상기 가변 영역은 상기 항체의 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 항체의 가변 및 불변 영역은 아래의 "IgG 구조" 섹션에 보다 상세히 기재된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 아래의 표 1에 도시된 바와 같이 본 발명의 항체의 VH 또는 VL 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 이에 관해, 당분야 숙련가는 경쇄 및/또는 중쇄의 적어도 가변 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 면역글로불린쇄들 또는 이들 중 단 하나의 가변 도메인을 인코딩할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 본원에서 상기 정의된 바와 같은 항-IL-20 항체 또는 이들의 IL-20 결합 단편을 인코딩한다.
본 발명의 IgG4, 람다, IL-20 특이적 20A10 항체 및 IgG1, 람다, IL-20 특이적 2A11, 7D1 및 6E11 항체의 가변 및 불변 영역(VH, VL, CH, CL) 영역의 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라 본 발명에 따라 이용된 IgG1, 카파, IFN-α/ω 특이적 26B9, 31B4, 8H1 및 19D11 항체의 가변 및 불변 영역(VH, VL, CH, CL) 영역의 뉴클레오타이드 서열.
항체 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL), 불변 중쇄(CH) 및 불변 경쇄(CL)의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열. 서열 목록
20A10 VH DNA
Figure pct00001

Figure pct00002
 1
20A10 VH 아미노산
Figure pct00003
 2
20A10 VL κ DNA
Figure pct00004
 3
20A10 VL κ 아미노산
Figure pct00005
 4
20A10 CH DNA
Figure pct00006
 5
20A10 CH 아미노산
Figure pct00007
 6
20A10 CL κ DNA
Figure pct00008
 7
20A10 CL κ 아미노산
Figure pct00009
 8
2A11 VH DNA
Figure pct00010
 9
2A11 VH 아미노산
Figure pct00011
 10
2A11 VL λ DNA
Figure pct00012

Figure pct00013
 11
2A11 VL λ 아미노산
Figure pct00014
 12
2A11 CH DNA
Figure pct00015
 13
2A11 CH 아미노산
Figure pct00016
 14
2A11 CL λ DNA
Figure pct00017
 15
2A11 CL λ 아미노산
Figure pct00018
 16
7D1 VH DNA
Figure pct00019
 17
7D1 VH 아미노산
Figure pct00020
 18
7D1 VL λ DNA
Figure pct00021
 19
7D1 VL λ 아미노산
Figure pct00022
 20
7D1 CH DNA
Figure pct00023

Figure pct00024
 21
7D1 CH 아미노산
Figure pct00025
 22
7D1 CL λ DNA
Figure pct00026
 23
7D1 CL λ 아미노산
Figure pct00027
 24
6E11 VH DNA
Figure pct00028
 25
6E11 VH 아미노산
Figure pct00029
 26
6E11 VL κ DNA
Figure pct00030
 27
6E11 VL κ 아미노산
Figure pct00031
 28
6E11 CH DNA
Figure pct00032
 29
6E11 CH 아미노산
Figure pct00033
 30
6E11 CL κ DNA
Figure pct00034
 31
6E11 CL κ 아미노산
Figure pct00035
 32
26B9 VH DNA
Figure pct00036
 35
26B9 VH 아미노산
Figure pct00037
 36
26B9 VL κ DNA
Figure pct00038
 37
26B9 VL κ 아미노산
Figure pct00039
 38
26B9 CH DNA
Figure pct00040
 39
26B9 CH 아미노산
Figure pct00041

Figure pct00042
 40
26B9 CL κ DNA
Figure pct00043
 41
26B9 CL κ 아미노산
Figure pct00044
 42
31B4 VH DNA
Figure pct00045
 43
31B4 VH 아미노산
Figure pct00046
 44
31B4 VL κ DNA
Figure pct00047
 45
31B4 VL κ 아미노산
Figure pct00048
 46
31B4 CH DNA
Figure pct00049
 47
31B4 CH 아미노산
Figure pct00050

Figure pct00051
 48
31B4 CL κ DNA
Figure pct00052
 49
31B4 CL κ 아미노산
Figure pct00053
 50
8H1 VH DNA
Figure pct00054
 51
8H1 VH 아미노산
Figure pct00055
 52
8H1 VL κ DNA
Figure pct00056
 53
8H1 VL κ 아미노산
Figure pct00057
 54
8H1 CH DNA
Figure pct00058
 55
8H1 CH 아미노산
Figure pct00059

Figure pct00060
 56
8H1 CL κ DNA
Figure pct00061
 57
8H1 CL κ 아미노산
Figure pct00062
 58
19D11 VH DNA
Figure pct00063
 59
19D11 VH 아미노산
Figure pct00064
 60
19D11 VL κ DNA
Figure pct00065
 61
19D11 VL κ 아미노산
Figure pct00066
 62
19D11 CH DNA
Figure pct00067
 63
19D11 CH 아미노산
Figure pct00068
 64
19D11 CL κ DNA
Figure pct00069
 65
19D11 CL κ 아미노산
Figure pct00070
 66
밑줄 친, 진한 뉴클레오타이드 또는 아미노산은 가변쇄 서열에서 CDR 코딩 영역을 나타낸다. 밑줄 친, 이탤릭체 뉴클레오타이드 또는 아미노산은 서열분석되지 않았지만 데이터베이스로부터 수득된 서열을 나타낸다. 불변쇄에서, 이러한 15개 영역은 데이터베이스에서의 관련 인간 생식계열 가변 영역 서열에 따라 정렬되고 조정된다; 예로 MRC Centre for Protein Engineering(Cambridge, UK)에 의해 호스팅되는 Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)를 참고하라.
당분야 숙련가는 상술된 가변 도메인을 갖는 항체의 가변 도메인이 원하는 특이성 및 생물학적 기능을 갖는 다른 폴리펩타이드 또는 항체의 구축을 위해 이용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 따라서 본 발명은 또한 상술된 가변 도메인의 적어도 하나의 CDR을 포함하며 유리하게는 첨부된 실시예에 기재된 임의 하나의 항-IL-20 항체와 실질적으로 동일하거나 유사한 결합 특성을 갖는 폴리펩타이드 및 항체를 포괄한다. 당분야 숙련가는 본원에 기재된 가변 도메인 또는 CDR을 이용하여 항체가 당분야에 공지된, 예로 유럽 특허 출원 EP 0 451 216 A1 및 EP 0 549 581 A1에 기재된 방법에 따라 구축될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.
또한 당분야 숙련가는 Kabat에 의해 정의된 바와 같은 CDR과 부분적으로 중복되는 CDR 내에서 또는 고가변 루프(Chothia and Lesk, J. Mol . Biol . 196(1987), 901-917) 내에서 아미노산 치환을 수행함으로써 결합 친화도가 증강될 수 있음을 안다. 따라서 본 발명은 또한 하나 이상의 언급된 CDR이 하나 이상, 바람직하게는 2개 이하의 아미노산 치환을 포함하는 항체에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 그 면역글로불린쇄의 하나 또는 둘 다에 서열번호 2, 10, 18 및 26에서 VH 영역에 대해 및 서열번호 4, 12, 20 및 28에서 VL 영역에 대해 나타낸 바와 같은 또는 도 1에 나타낸 바와 같은 가변 영역의 2개 또는 전체 3개의 CDR을 포함한다. 바람직하게는, 하나 이상의 아미노산 변경, 예로 치환을 갖는 임의 하나의 언급된 CDR을 포함하는 항체 또는 IL-20 결합 단편 또는 이들의 생물공학적 유도체는 실시예에 예시된 임의 하나의 항체의 결합 특징을 나타낸다. 특히 바람직한 구현예에서, 이러한 항체 또는 IL-20 결합 단편 또는 이들의 생물공학적 유도체는 아미노산 서열 101-PDHYTLRKISSLANSFLT-118(서열번호 69) 또는 102-DHYTLRKISSLANSF-116(서열번호 70) 및/또는 101-PDHYTLRKISSLANSFL-117(서열번호 72)로 이루어지는 IL-20 유래 펩타이드를 인식하며, 여기서 P101, I109, S110 및/또는 L117만 또 다른 아미노산, 바람직하게는 알라닌으로 치환될 수 있는 반면, T118 이외의 다른 아미노산 위치는 불변이다; 또한 실시예 10 및 도 13d 및 e를 참고하라. 따라서 상기 구현예에서, 항체는 누락되는 S115 및 F116의 관점에서 아미노산 서열 97-NYQTPDHYTLRKISSLAN-114(서열번호 71)로 이루어지는 펩타이드를 인식하지 않거나 실질적으로 인식하지 않는다. 또한, 실시예 10 및 도 13c에 예시된 바와 같이, 이러한 항체 또는 IL-20 결합 단편 또는 이들의 생물공학적 유도체는 바람직하게는 마우스 IL-20에서 유래되는 대응하는 18머 펩타이드에 결합하지 않는 반면, 바람직하게는 전장 인간 및 마우스 IL-20에는 결합할 수 있다. 상기 맥락에서, 본 발명의 항체 또는 IL-20 결합 단편 또는 이들의 생물공학적 유도체의 언급된 결합 특징의 결정은 바람직하게는 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이, 예로 실시예 10에 기재되고 도 10에 나타낸 바와 같이 마이크로어레이 상에서 수행된다.
상술된 항체를 인코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는, 예로 DNA, cDNA, RNA 또는 합성적으로 생성된 DNA 또는 RNA 또는 단독으로 또는 조합으로 임의의 이들 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합적으로 생산된 키메라 핵산 분자일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 선택적으로 상기 항체의 다른 면역글로불린쇄의 가변 영역을 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오타이드와의 조합으로 제공된다. 이러한 벡터는 추가 유전자, 예컨대 적합한 숙주 세포에서 적합한 조건 하에 상기 벡터의 선택을 허용하는 마커 유전자를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서의 발현을 허용하는 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현은 폴리뉴클레오타이드의 번역 가능한 mRNA로의 전사를 포함한다. 진핵생물 세포, 바람직하게는 포유류 세포에서의 발현을 보장하는 조절 요소는 당분야 숙련가에게 널리 공지되어 있다. 이들은 보통 전사의 개시를 보장하는 조절 서열 및 선택적으로 전사의 종결 및 전사체의 안정화를 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다. 추가적인 조절 요소에는 전사뿐만 아니라 번역 인핸서, 및/또는 천연 연관 또는 이종성 프로모터 영역이 포함될 수 있다.
이에 관해, 당분야 숙련가는 경쇄 및/또는 중쇄의 적어도 가변 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 두 면역글로불린쇄 모두 또는 하나의 쇄만의 가변 도메인을 인코딩할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.
마찬가지로, 상기 폴리뉴클레오타이드는 동일한 프로모터의 제어 하에 있을 수도 있고 또는 발현을 위해 별도로 제어될 수도 있다. 원핵생물 숙주 세포에서 발현을 허용하는 가능한 조절 요소는, 예로 E. 콜라이에서의 PL, lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함하며, 진핵생물 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 조절 요소에 대한 예는 효모에서의 AOX1 또는 GAL1 프로모터 또는 포유류 및 다른 동물 세포에서의 CMV-, SV40- , RSV-프로모터, CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론이다.
전사의 개시에 관여되는 요소 이외에, 이러한 조절 요소는 또한 폴리뉴클레오타이드의 하류에 전사 종결 신호, 예컨대 SV40-폴리-A 부위 또는 tk-폴리-A 부위를 포함할 수 있다. 또한, 이용되는 발현 시스템에 따라, 폴리펩타이드를 세포 구획으로 보내거나 이를 배지 내로 분비할 수 있는 리더 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 코딩 서열에 부가될 수 있고, 당분야에 널리 공지되어 있다. 리더 서열(들)은 번역, 개시 및 종결 서열, 및 바람직하게는 번역된 단백질 또는 이들의 일부의 원형질막 주위 공간 또는 세포외 배지 내로의 분비를 지시할 수 있는 리더 서열과 함께 적절한 상으로 조립된다. 선택적으로, 이종성 서열이 원하는 특징, 예로 발현되는 재조합 산물의 안정화 또는 정제 단순화를 부여하는 C- 또는 N-말단 확인 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 인코딩할 수 있다. 상기 맥락에서, 적합한 발현 벡터, 예컨대 Okayama-Berg cDNA 발현 벡터 pcDV1(Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(Invitro-gen), 또는 pSPORT1(GIBCO BRL)이 당분야에 공지되어 있다.
바람직하게는, 발현 제어 서열은 진핵생물 숙주 세포의 형질전환 또는 전달감염이 가능한 벡터 내의 진핵생물 프로모터 시스템일 것이지만, 원핵생물 숙주에 대한 제어 서열이 또한 이용될 수 있다. 일단 벡터가 적절한 숙주 내로 도입되면, 숙주는 뉴클레오타이드 서열의 고수준 발현을 위해 적합한 조건 하에 유지되며, 원하는 경우 면역글로불린 경쇄, 중쇄, 경쇄/중쇄 이량체 또는 온전한 항체, 결합 단편 또는 다른 면역글로불린 형태의 수집 및 정제가 뒤따를 수 있다; 문헌 [Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979)]을 참고하라.
또한, 본 발명은 본 발명의 항원 또는 바람직하게는 항체의 면역글로불린쇄의 가변 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를; 선택적으로 본 발명의 항체의 다른 면역글로불린쇄의 가변 도메인을 인코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와의 조합으로 포함하는 유전적 조작에서 통상적으로 이용되는 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 벡터는 발현 벡터 및/또는 유전자 전달 또는 표적화 벡터이다.
바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 소 유두종 바이러스에서 유래되는 발현 벡터가 표적화된 세포 집단 내로의 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 전달을 위해 이용될 수 있다. 당분야 숙련가에게 널리 공지된 방법이 재조합 바이러스 벡터를 구축하기 위해 이용될 수 있다; 예를 들어, 문헌 [Sambrook Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1989) N.Y. 및 Ausubel Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)]에 기재된 기법을 참고하라. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 벡터는 표적 세포로의 전달을 위해 리포좀 내로 재구성될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(예로, 면역글로불린쇄 인코딩 서열의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인(들) 및 발현 제어 서열)를 함유하는 벡터는 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있고, 이는 세포 숙주의 유형에 따라 변한다. 예를 들어, 원핵생물 세포에 대해서는 칼슘 클로라이드 전달감염이 일반적으로 이용되는 반면, 다른 세포성 숙주의 형질전환을 위해서는 칼슘 포스페이트 처리 또는 전기천공이 이용될 수 있다; 문헌 [Sambrook, 상기]를 참고하라.
상기에 관해, 본 발명은 추가로 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 숙주 세포에 존재하는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수도 있고 또는 염색체 외로 유지될 수도 있다. 숙주 세포는 임의의 원핵생물 또는 진핵생물 세포, 예컨대 박테리아, 곤충, 진균, 식물, 동물 또는 인간 세포일 수 있다; 본 발명의 항체의 생산을 위해 적합한 숙주 세포 및 방법은 아래의 "숙주 세포" 섹션에 보다 상세히 기재된다.
상기 언급된 숙주 세포를 이용해서, 예로 약학적 이용을 위해 또는 치료적 개입을 위한 표적으로서 본 발명의 항체를 생산하고 제조할 수 있다. 따라서 하나의 구현예에서, 본 발명의 목적은 항-IL-20 항체 또는 이들의 IL-20 결합 단편의 제조 방법으로서, 상기 방법이
(a) 본원에서 상기 정의된 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 배양물로부터 상기 항체 또는 이들의 IL-20 결합 단편을 단리하는 단계
를 포함하는 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되거나 항-IL-20 항체 또는 이들의 면역글로불린쇄(들)의 상기 언급된 제조 방법에 의해 수득 가능한 재조합, 바람직하게는 인간-유래 항-IL-20 항체 및 이들의 IL-20 결합 단편, 이들의 면역글로불린쇄(들)에 관한 것이다.
항체 및 이들의 모사체의 재조합 생산 수단 및 방법뿐만 아니라 항체일 수도 항체가 아닐 수도 있는 경쟁하는 결합 분자에 대한 스크리닝 방법은 당분야에 공지되어 있다. 그러나 본원에 기재된 바와 같이, 특히 인간에서의 치료적 적용에 대해, 본 발명의 항체는 상기 항체의 적용에서 다른 경우 키메라 및 심지어 인간화 항체에 대해 관찰되는 이러한 항체에 대해 유도되는 면역 반응이 실질적으로 없다는 점에서 인간 항체이다.
항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체는 치료제로서 직접 이용될 수 있다. 그러나 하나의 구현예에서, 본 발명에 의해 제공되는 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체는 검출 가능하게 표지되거나 약물에 부착되며, 바람직하게는 검출 가능한 표지는, 예를 들어 효소, 방사선동위원소, 형광단, 펩타이드 및 중금속으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 각각 치료제 또는 검출 가능한 표지를 포함하고 이에 접합되는 항체 또는 다르게는 면역글로불린 성분은 "면역접합체"로도 불린다.
따라서 추가 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 인간-유래 모노클로날 항-인간 IL-20 항체 또는 이들의 언급된 유도체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이며, 이는 바람직하게는 기능적 모이어티, 예컨대 방사선핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩타이드 태그, 중금속, 자기 입자, 약물, 또는 독소를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 발명의 면역접합체는, 예를 들어 인체에서 항체의 반감기 및 생체이용률을 개선하기 위해 peg화된다. 면역접합체 및 적절한 검출 가능한 표지, 약물 및 독소의 제조는 당분야에 공지되어 있고, 예로 국제 출원 WO2005/052000에 기재된다.
본 발명의 표지된 항체 또는 항원-결합 단편 및 면역접합체는 시험관내 "면역화학/면역표지" 유사 검정을 포함하여 생체내 또는 시험관내 특이적 표적을 검출하기 위해 이용될 수 있다. 생체 내에서 이들은 관심 항원을 발현하는 조직, 세포 또는 다른 물질을 검출하기 위해 핵 의약 조영 기법과 유사한 방식으로 이용될 수 있다. 표지, 진단에서의 이들의 이용 및 본 발명의 결합 분자에 대한 이들의 커플링은 더 아래에서 "표지 및 진단" 섹션에 보다 상세히 기재된다.
본 발명에서 확인되는 IL-20 특이적 항체는, 예로 APECED 환자에서 관찰된 증상과 연관되는, 이환 개체의 면역계의 중증 손상에 관여될 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가 측면은 이환 인간 환자 또는 동물에서 자가항체의 수 및/또는 이들의 효과를 최소화하기 위한 수단 및 조치를 제공함으로써 자가면역 장애를 겪는 대상체의 병리적 반응을 소멸시키거나 적어도 경감시키는 것이다. 따라서 하나의 구현예에서, 본 발명은 또한 본 발명의 자가항체에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 펩타이드-기반 화합물에 관한 것이다. 경쟁적 항원의 적용에서와 유사한 효과인 격리 및 이에 의해 자가항체의 이들 각각의 표적에 대한 결합의 방지는 아래에서 더욱 상세히 기재된 바와 같이 항-개별특이형 항체에 의해 수득될 수 있다. 따라서 하나의 구현예에서, 본 발명은 또한 본 발명의 자가항체의 항-개별특이형 항체를 제공한다. 이미 상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 장애, 즉 자가-관용성의 손상 또는 조절장애의 생성과 연관되는 장애의 치료에서 이용하기 위한 본 발명의 항-개별특이형 항체 또는 펩타이드 또는 펩타이드-기반 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 단리된 항체 또는 이들의 단편은 모노클로날 항-개별특이형 패널을 생성하기 위한 면역원으로서 이용될 수 있다. 항-개별특이형 항체에 대해서는 문헌 [Raychadhuri et al. J. Immunol . 137(1986), 1743] 및 T 세포의 생성을 위해 적합한 방법에 대해서는 문헌 [Ertl et al. J. Exp . Med . 159(1985), 1776]을 참고하라. 항-개별특이형 항체는 문헌 [Raychaudhuri et al. J. Immunol. 137(1986), 1743]에 상세히 기재된 바와 같이 당분야에서 일상적으로 실시되는 표준 검정을 이용해서 내부 영상 및 비-내부 영상의 표현에 대해 특성규명될 것이다. 항-개별특이형 항체가 항체의 항원을 구조적으로 모사하는 경우, 이는 결합하거나 결합되며, 항원의 "내부 영상"으로 불린다.
자가면역 질환-연관 자가-항체(자가항체)의 개별특이형을 모사하는 분자의 제공 방법은 당분야에 기재되어 있다; 예로, 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 국제 출원 WO03/099868을 참고하라. 예를 들어, 이러한 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: (a) 본 발명의 방법에 따라 자가항체를 제공하는 단계; (b) 자가항체를 고상에 결합시켜 친화도 매트릭스를 형성하는 단계; (c) 면역글로불린을 포함하는 풀링된 혈장 또는 B 세포를 친화도 매트릭스와 접촉시킨 뒤 미결합 혈장 성분을 제거하는 단계; (d) 매트릭스로부터, 자가항체에 대한 항-개별특이형 항체(항-Id)인 결합된 면역글로불린을 용출시키는 단계; (e) 복수의 분자 구성원을 포함하는 분자 라이브러리를 제공하는 단계; 및 (e) 항-Id와 분자 라이브러리를 접촉시키고, 항-Id에 의해 결합된 결합 분자를 단리하는 단계로서, 결합 분자는 자가항체의 개별특이형을 모사하는 분자인 단계. 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 국제 출원 WO2010/136196에 개시된 개별특이형 자가항체의 단리 방법은 자가면역 질환 및 면역계 장애의 치료를 위해 정상 인간 혈청(NHS)으로부터 단리된 천연 폴리클로날 IgG-반응성 항체(Ab)를 함유하는 면역글로불린 제조물을 기재한다. IgG-반응성 Ab는 항원 조합 부위 내에 또는 근처에 위치하는(예로, 이와 중복되는) 이들의 항원성 결정기에 결합함으로써, 자가면역 질환을 겪는 환자의 혈청 중에 존재하는 질환-연관 또는 병원성 자가항체를 강력히 중화한다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의 하나의 상기 언급된 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포, 펩타이드 또는 펩타이드-기반 화합물 및/또는 조합되어 본 발명의 항-IL-20 항체 또는 이들의 IL-20 결합 단편의 특징을 나타내는 항-IL-20 항체의 또는 이들의 IL-20 결합 단편의 칵테일을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 부가적으로 또는 대안적으로 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물 또는 키트는 본 발명의 항-개별특이형 항체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 조성물은 약학 조성물이며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체, 투여 경로 및 투여량 요법은 당분야 숙련가에게 공지된 대응하는 문헌으로부터 취할 수 있고, 더 아래의 "약학적 담체" 및 "투여량 요법" 섹션에 또한 더 상세히 기재된다.
또한, 본 발명은 항-IL-20 모노클로날 항체 또는 IL-20 결합 단편 또는 이들의 생물공학적 유도체를 포함하는 조성물의 제조 방법에 관한 것이며, 제조는 항체, IL-20 결합 단편 또는 이들의 생물공학적 유도체를 인코딩하는 형질전환 DNA의 재조합 숙주 유기체에서의 발현에 의한 항체, IL-20 결합 단편 또는 이들의 생물공학적 유도체의 제조 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 조성물은 약학 조성물이며, 약학 조성물의 제조에서 항체, IL-20 결합 단편 또는 이들의 생물공학적 유도체와 약학적으로 허용 가능한 담체의 혼합에 이어 선택적으로 하나 이상의 단계 후 항체, IL-20 결합 단편 또는 이들의 생물공학적 유도체의 제조 단계가 뒤따른다. 예를 들어, 약학 조성물에서의 제형화 전에, 항체 또는 이들의 IL-20 결합 단편은 세포 배양물로부터 약학적 등급으로 정제되고/되거나 유도체화, 예를 들어 peg화 또는 진단 표지 또는 약물에 접합되어 약학 조성물을 수득할 수 있다.
생화학적 및 세포 기반 시험관내 검정 이외에, 본 발명의 항체의 치료적 유용성은 더 아래의 실시예 섹션에 상세히 기재된 바와 같이 적절한 동물 모델에서 검증될 수 있다.
하나의 구현예에서, 약학 조성물은 염증 또는 자가면역 장애의 치료를 위해 유용한 추가 제제를 추가로 포함하며, 바람직하게는 상기 제제는 비-스테로이드성 소염 약물(NSAIDs), 코르티코스테로이드, 항-히스타민 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 추가 구현예에서 약학 조성물은 면역억제 및 소염 또는 "항-류마티스성" 약물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 염증 관련 질환의 치료를 위해 유용한 추가 제제를 추가로 포함한다.
또 다른 구현예에서, 조성물은 진단 조성물 또는 키트이며, 면역- 또는 핵산-기반 진단 방법에서 통상적으로 이용되는 시약을 추가로 포함한다.
또한, 본 발명은
(a) 면역 매개 또는 자가면역 질환 또는 질병의 치료 또는 진행 예방 방법;
(b) 면역 매개 또는 자가면역 질환 또는 질병과 연관되는 증상의 완화 방법; 및/또는
(c) 대상체의 면역 매개 또는 자가면역 질환 또는 질병의 존재에 대한 또는 발생 위험의 결정에 대한 대상체의 진단 또는 스크리닝 방법
에서 이용하기 위한 본원에서 상기 정의된 바와 같은 상기 언급된 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체, 또는 조성물을 제공하며;
질환 또는 질병은 환자에서 IL-20의 발현, 상승된/상승되거나 유해한 IL-20 활성과 연관된다.
상기 나타낸 바와 같이, 이들의 결합 특이성으로 인해, 본 발명의 IL-20 결합 분자, 예컨대 항체 및 이들의 단편은 바람직하게는 면역 매개 또는 자가면역 장애의 또는 IL-20의 발현, IL-20의 상승되고/되거나 유해한 활성과 연관되고/되거나 이에 의해 유도되는 질병의 상기 정의된 치료, 완화, 진단 및/또는 스크리닝 방법에서 이용될 수 있다.
예를 들어, IL-20의 발현, 상승되고/되거나 유해한 활성은 류마티스성 관절염(RA) 활액 조직 생검, 건선 피부 병변 및 강직성 척추염(AS)에서 관찰되었으며, 여기서 IL-20의 발현 수준은 염증의 중증도와 양의 연관성을 가졌다(Kragstrup et al. Cytokine 41(2008), 16-23, Blumberg et al. Cell 104(2001), 9-19, Toyhama et al. Eur . J. Immunol . 39(2009), 2779-88, 상기 문헌). 류마티스성 관절염(RA), 건선 및 강직성 척추염(AS)에 더하여, IL-20은 몇몇 다른 장애, 예로 죽상경화(Chen et al. Arterioscler . Thromb . Vasc . Biol. 26(2006), 2090-2095, 상기 문헌), 급성 신부전(Li et al. Genes Immun . 9(2008), 395-404, 상기 문헌), 궤양성 장염(Fonseca-Camarillo et al. J. Clin. Immunol . 33(2013), 640-8, 상기 문헌), 허혈성 뇌졸중(Chen and Chang J. Immunol . 182(2009), 5003-12, 상기 문헌)뿐만 아니라 골감소증 및 골다공증(Hsu et al. J. Exp . Med . 208(2011), 1849-1861, 상기 문헌)과 기능적으로 연관된 것으로 나타났다.
또한 IL-20의 전사 증가는 비-소세포 폐(NSCL) 암(Baird et al. Eur . J. Cancer 47(2011), 1908-18, 상기 문헌) 및 근육 침습성 방광암(Lee et al. PLoS One 7(2012), e40267, 상기 문헌)에서 관찰되었다. 비암성 조직에 비해 임상적 구강암 조직뿐만 아니라 유방암 조직에서 IL-20 및 그 수용체 서브유닛의 발현이 더 높았다(Hsu et al. Mol . Cancer Res. 10(2012) 1403-9, Hsu et al. J. Immunol. 188(2012) 1981-91, 모두 상기 문헌).
따라서 하나의 구현예에서, 상기 언급된 방법에서 이용하기 위한 본원에서 상기 정의된 바와 같은 항-IL-20 항체 또는 IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체 또는 조성물이 제공되며, 여기서 상기 질환은 바람직하게는 류마티스성 관절염(RA), 강직성 척추염 및 비제한적으로 건선 관절염을 포함하는 다른 형태의 척추관절염, 건선, 혈관 염증 및 죽상경화, 아토피성 피부염 및 비소세포 폐(NSCL) 암, 근육 침습성 방광암, 구강암 및 유방암을 포함하는 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가면역 질환이다.
예로, 본원에 제시된 염증과 연관되는 장애의 치료에 적합한 분자의 다양성으로 인해, 본 발명은 또한 이러한 장애의 가능한 경과 및 결과의 치료, 진단 및/또는 예진 방법 및 본 발명의 분자의 이용에 관한 것이며, 바람직하게는 면역 매개 또는 자가면역 질환 또는 질병은 IL-20의 발현, 상승되고/되거나 유해한 활성과 연관된다. 하나의 구현예에서, 이러한 장애의 치료 방법이 제공되며, 방법은 이를 필요로 하는 대상체에 상기 언급된 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체, 조합되어 본 발명의 항체, 항-개별특이형 항체 또는 펩타이드 또는 펩타이드-기반 화합물의 특징을 나타내는 항체의 칵테일의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
또한 하나의 구현예에서, 본 발명은 대상체에
(a) 본 발명의 항-IL-20 항체 또는 이들의 IL-20 결합 단편의 적어도 하나의 CDR; 또는
(b) 본원에서 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 항-개별특이형 항체 및/또는 펩타이드 또는 펩타이드-기반 화합물
을 포함하는 리간드 결합 분자의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, IL-20의 발현, 상승되고/되거나 유해한 활성과 연관되는 면역 매개 또는 자가면역 질환 또는 질병의 치료 방법에 관한 것이다.
질환에 관련되거나 이를 유도하는 특정한 항원의 에피토프에 특이적인 단 하나의 모노클로날 항체의 이용에 기반한 치료 방법은 몇몇 단점을 겪을 수 있다. 예를 들어, 치료의 어려움 및 가능한 비효율은 몇몇 항원의 동시 표적화를 필요로 하는 특정한 장애를 유도하는 여러 병원성 기전에서 기인할 수 있다. 또한, 환자 집단의 내재적 다양성은, 예로 적어도 이용되는 모노클로날 항체의 감소된 결합 효율로 이어질 수 있는, 상이한 또는 하나의 환자에서의 주어진 항원의 다형성, 당화의 이종성 또는 약간의 변성을 고려해야 한다. 일부 이러한 단점은, 예로 항원이 치료될 환자와 면역학적으로 관련되는지 여부 및 특정한 환자에 임의의 에피토프 변화가 있는지 여부를 결정하기 위한 치료-전 스크리닝에 의해 회피될 수 있다. 그러나 이러한 스크리닝은 종종 치료의 긴급성 또는 비용 제약으로 인해 생략된다. 따라서 본 발명은 추가로 환자에 대해 한 번에 하나를 초과하는 유형의 결합 분자의 적용, 즉 결합 분자 칵테일의 적용에 기반하는 방법에 관한 것이다. 이들 결합 분자는 상이한 에피토프에서 IL-20에 특이적으로 결합할 수 있고, 적용되는 각각의 결합 분자가 IL-20에 특이적으로 결합할 수 있거나 몇몇 결합 분자가 IL-20의 몇몇 에피토프에 대한 결합에 이용된다. 본 발명의 결합 분자가 항원으로서 IL-20에 대한(이에 특이적으로 결합하는) 경우, 이들의 결합 특이성은 상기 항원의 별도 에피토프에 대한 것이다. 이러한 칵테일의 이용은, 약 3000여 내인성 항원에 대한 자가항체의 존재의 관점에서 하나의 특정한 항체를 이용한 단일치료법을 위해 적합하지 않은 자가면역 장애, 예컨대 APS1을 겪는 환자의 치료에 대해 특히 고려된다. 이러한 경우, 동일하거나 상이한 항원 특이성을 갖는 본 발명의 2개 이상의 모노클로날 항체 및/또는 펩타이드 및 펩타이드-기반 화합물을 이용한 조합 치료법은 적어도 증상의 일부 경감을 달성할 것으로 예상된다.
따라서 하나의 구현예에서, 대상체에
(a) 본원에서 상기 정의된 바와 같은 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체; 및/또는
(b) 본 발명의 항-개별특이형 항체, 및/또는 본 발명의 펩타이드 또는 펩타이드-기반 화합물
로서, 본 발명의 항체 또는 이들의 항원-결합 단편에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프를 포함하는 펩타이드 또는 펩타이드-기반 화합물로 본질적으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2, 3, 4, 5개 및 그 초과의 성분으로 이루어지는 칵테일의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 장애의 추가 치료 방법이 제공된다.
본 발명은 자연히 IL-20의 발현, 상승되고/되거나 유해한 활성과 연관되는 면역 매개 또는 자가면역 질병 및 장애의 진단 및/또는 질환의 발생의 예후, 즉 그 진행, 치료에 대한 반응 또는 회복에 대한 진단 및 예진 방법으로도 연장된다. 따라서 하나의 구현예에서, 본 발명은 대상체의 생물학적 샘플을 본 발명의 항-IL-20 항체 또는 이들의 IL-20 결합 단편과 접촉시키는 단계, 및 IL-20의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, IL-20의 발현, 상승되고/되거나 유해한 활성과 연관되는 대상체에서의 면역 매개 또는 자가면역 질환 또는 질병의 진단 방법에 관한 것이다. 또한 하나의 구현예에서, 본 발명은 샘플을 본 발명의 항-IL-20 항체와 혼합하는 단계, 항체가 혼합물에 존재하는 IL-20과 복합체를 형성하도록 하는 단계, 및 혼합물에 존재하는 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 단리된 생물학적 샘플 중 IL-20의 검출 또는 결정 방법에 관한 것이다.
이미 상기에 언급된 바와 같이, 하나의 구현예에서 본 발명은 IL-20의 발현과 연관되는 면역 매개 또는 자가면역 질환 또는 질병의 진단을 위한 키트에 관한 것이며, 상기 키트는 상기 언급된 항-IL-20 항체, IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체, 항-개별특이형 항체 또는 펩타이드 또는 펩타이드-기반 화합물, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포를 선택적으로 시약 및/또는 사용 지침과 함께 포함한다.
본 발명의 키트와 연관되어, 예로 키트를 이루는 용기 내에는 약학적 또는 생물학적 제품의 제조, 이용 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 처방된 형태의 통지가 연관될 수 있고, 이 통지는 인간 투여를 위한 제조, 이용 또는 판매 당국에 의한 승인을 반영한다. 부가적으로 또는 대안적으로, 키트는 적절한 진단 검정에서 이용하기 위한 시약 및/또는 지침을 포함한다. 본 발명의 조성물, 즉 키트는 당연히, IL-20의 발현에 수반되는 장애 또는 질병의 진단, 예방 및 치료를 위해 특히 적합하며, 특히 상기 언급된 바와 같은 질환의 치료를 위해 적용 가능하다. 특히 바람직한 구현예에서, 장애는 IL-20의 발현과 연관된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 하나의 상술된 IL-20-결합 분자, 항체, 항원-결합 단편, 펩타이드 또는 펩타이드-기반 화합물, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포 및 선택적으로 검출을 위해 적합한 수단, 예컨대 면역- 또는 핵산-기반 진단 방법에서 통상적으로 이용되는 시약을 포함하는 진단 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 액상으로 이용되거나 고상 담체에 결합될 수 있는 면역검정에서 이용하기 위해 적합하다. 본 발명의 항체를 이용할 수 있는 면역검정의 예는 직접적 또는 간접적 포맷의 경쟁적 및 비-경쟁적 면역검정이다. 이러한 면역검정의 예는 방사선면역검정(RIA), 샌드위치(면역계측 검정), 유세포측정 및 웨스턴 블롯 검정이다. 본 발명의 항원 및 항체는 여러 상이한 담체에 결합되고 이에 특이적으로 결합된 세포를 단리하기 위해 이용될 수 있다. 널리 공지된 담체의 예에는 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 덱스트란, 나일론, 아밀로오스, 천연 및 개질 셀룰로오스, 폴리아크릴아마이드, 아가로오스, 및 마그네타이트가 포함된다. 담체의 성질은 본 발명의 목적을 위해 가용성 또는 불용성일 수 있다. 당업자에게 공지된 여러 상이한 표지 및 표지 방법이 존재한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 표지의 유형의 예에는 효소, 방사선 동위원소, 콜로이드성 금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 및 생체발광 화합물이 포함된다; 또한 본원에서 상기 논의된 구현예를 참고하라.
상기 맥락에서, 본 발명은 또한 상기 목적을 위해 특이적으로 설계된 수단에 관한 것이다. 예를 들어, 자가면역 질환을 겪는 환자에 존재할 수 있는 자가항체를 검출하기 위해 IL-20 유래 항원이 로딩되고 질환-연관 항원을 함유하는 단백질- 또는 항체-기반 어레이가 이용될 수 있다. 마이크로어레이 면역검정의 설계는 문헌 [Kusnezow et al. Mol . Cell Proteomics 5(2006), 1681-1696]에 요약된다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따라 확인되는 결합 분자 또는 항원이 로딩된 마이크로어레이에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 인간-유래 모노클로날 항-인간 IL-20 항체 또는 IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 변이체에 적용 가능하고 유용한, 선행 기술에 기재된 IL-20 길항제, 예로 항-IL-20 항체의 구현예를 이용하고 이에 관한 것이다. 예를 들어, 국제 출원 WO2005/052000은 특히 시험관내 및 생체내 이들의 특성규명을 위한 수단 및 방법뿐만 아니라 이들의 용도를 포함하는 래트 항-인간 IL-20뿐만 아니라 항-IL-20RA 및 항-IL-20RB 모노클로날 항체를 기재하며, 이는 또한 본 발명의 인간-유래 모노클로날 항-인간 IL-20 항체 및 이들의 언급된 유도체에 따라 적용될 수 있다.
따라서 추가 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 인간-유래 모노클로날 항-인간 IL-20 항체 및 이들의 언급된 유도체, 면역접합체 또는 약학 조성물을 포함하는 조성물을 이용해서 조혈 세포 및 조혈 세포 전구체를 포함하는 배양 골수 또는 말초 혈액 세포의 IL-20 유도 증식 또는 분화를 감소시키거나 저해하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이며, 여기서 상기 감소 또는 저해는 가용성 사이토카인의 부재 하에 배양되는 골수 또는 말초 혈액 세포에 비해 골수 또는 말초 혈액 세포에서의 조혈 세포의 증식 또는 분화로서 측정된다. 조혈 세포 및 조혈 전구체 세포는 림프구 세포일 수 있고, 바람직하게는 림프구 세포는 대식구 또는 T 세포이다.
따라서 원칙 상, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 인간-유래 모노클로날 항-인간 IL-20 항체 및 이들의 언급된 유도체, 면역접합체 및 약학 조성물은 특히 국제 출원 WO2005/052000에 기재된 바와 같은 IL-20 길항제 및 항-IL-20 항체의 임의의 치료 용도에 따라 적용될 수 있다.
정의 및 구현예
달리 언급되지 않는 한, 본원에서 이용되는 용어 및 구현예에는 국제 출원 WO2013/098419 및 WO2013/098420 보충자료에 제공되고 이용된 바와 같은 정의가 주어지며, 본원에서 이용되는 일반 용어에는 문헌 [Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, 2000년 개정 및 2003년 재인쇄, ISBN 0 19 850673 2]에 제공된 바와 같은 정의가 주어진다.
단수 용어는 하나 이상의 물체를 나타냄이 주지되어야 한다; 예를 들어, "항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 이상의" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호 교환적으로 이용된다.
용어 "중화" 및 "중화 항체"는 각각 당분야에서 일반적인 바와 같이 이용되어 항체가 항원 또는 살아있는 미생물의 적어도 일부 생물학적 활성을 감소시키거나 폐지함을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 항-IL-20 항체는 중화 항체이며, 적당한 양인 경우, 예를 들어 실시예에 기재된 바와 같은 검정에서 IL-20의 활성을 폐지하거나 감소시킨다. 중화는 일반적으로 50% 저해 농도(IC50)에 의해 정의되며, 중화 적정 곡선(AUC) 하 면적에 기반하여 통계적으로 평가될 수 있다. 본 발명의 예시적인 항-IL-20 항체의 IC50값이 본원에 기재되고 나타난다, 예로 예시적인 항체 20A10은 KZ136-NLuc 리포터 검정에서 329.7 ng/ml의 인간 IL-20의 IC50값을, 및 화학발광 세포-결합 검정에서 4.03 ng/ml의 IC50값을 갖는다(각각 도 5f, 왼쪽 열 및 도 8d).
펩타이드 및 폴리펩타이드 :
용어 "펩타이드"는 그 의미 내에 용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"(때때로 본원에서 상호 교환적으로 이용될 수 있음) 및 임의의 아미노산 서열, 예컨대 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변 영역뿐만 아니라 불변 영역의 서열을 포함하는 것으로 이해된다. 유사하게, 단백질 및 폴리펩타이드의 단편도 고려되며, 본원에서 "펩타이드"로 불릴 수 있다. 그럼에도 불구하고, 용어 "펩타이드"는 바람직하게는 적어도 5개 인접 아미노산, 바람직하게는 적어도 10개 인접 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 15개 인접 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 20개 인접 아미노산, 및 특히 바람직하게는 적어도 25개 인접 아미노산을 포함하는 아미노산 중합체를 표시한다. 또한, 본 발명에 따른 펩타이드는 전형적으로 100개 미만의 인접 아미노산, 바람직하게는 80개 미만의 인접 아미노산 및 보다 바람직하게는 50개 미만의 인접 아미노산을 갖는다.
본원에서 이용되는 용어 "폴리펩타이드"는 단수의 "폴리펩타이드"뿐만 아니라 복수의 "폴리펩타이드", 예컨대 본 발명의 항체를 포괄하려는 것이며, 아마이드 결합(펩타이드 결합으로도 알려져 있음)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 이루어진 분자를 나타낸다. 용어 "폴리펩타이드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 나타내며, 특정한 길이의 산물을 나타내는 것은 아니다. 따라서 "펩타이드", "디펩타이드", "트리펩타이드", 올리고펩타이드", "단백질", "아미노산쇄" 또는 2개 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 나타내기 위해 이용되는 임의의 다른 용어가 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되며, 용어 "폴리펩타이드"는 임의의 이러한 용어 대신에 또는 상호 교환적으로 이용될 수 있다.
용어 "폴리펩타이드"는 또한 비제한적으로 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아마이드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백분해 절단, 또는 비천연 생성 아미노산에 의한 개질을 포함하는 폴리펩타이드의 발현 후 개질 산물을 나타내려는 것이다. 폴리펩타이드는 천연 생물학적 원천에서 유래되거나 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 화학적 합성을 포함하는 임의의 방식으로 생성될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상, 또는 2,000개 이상의 아미노산 크기일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 용어 "폴리펩타이드"는 바람직하게는 적어도 100개 아미노산을 포함하는 아미노산 중합체를 표시한다. 폴리펩타이드는 정의된 3차원 구조를 가질 수 있지만, 이들이 반드시 이러한 구조를 갖지는 않는다. 정의된 3차원 구조를 갖는 폴리펩타이드는 폴딩된 것으로 불리며, 정의된 3차원 구조를 보유하지 않고 다수의 상이한 입체형태를 채택할 수 있는 폴리펩타이드는 폴딩되지 않은 것으로 불린다. 본원에서 이용되는 용어 당단백질은 아미노산 잔기, 예로 세린 잔기 또는 아스파라긴 잔기의 산소 함유 또는 질소 함유 측쇄를 통해 단백질에 부착되는 적어도 하나의 탄수화물 모이어티에 커플링된 단백질을 나타낸다.
"단리된" 폴리펩타이드 또는 이들의 단편, 변이체, 또는 유도체는 그 천연 환경에 있지 않는 폴리펩타이드에 대한 것이다. 특정한 수준의 정제가 필요한 것은 아니다. 예를 들어, 단리된 폴리펩타이드는 그 원상태 또는 천연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 발현되는 재조합적으로 생산된 폴리펩타이드 및 단백질은 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분획화되거나, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 원상태 또는 재조합 폴리펩타이드와 마찬가지로 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
"재조합 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질"은 재조합 DNA 기법에 의해 생산되는, 즉 원하는 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 외인성 재조합 DNA 발현 구축물에 의해 형질전환된 세포, 미생물 또는 포유류로부터 생산되는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 나타낸다. 대부분의 박테리아 배양물에서 발현되는 단백질 또는 펩타이드에는 전형적으로 글리칸이 없을 것이다. 효모에서 발현되는 단백질 또는 폴리펩타이드는 포유류 세포에서 발현되는 것과 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드의 단편, 유도체, 유사체 및 변이체 그리고 이들의 임의의 조합이 또한 포함된다. 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"에는 천연 펩타이드의 아미노산 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 폴리펩타이드가 포함된다. 용어 "충분히 유사한"은 제1 및 제2 아미노산 서열이 공통적인 구조 도메인 및/또는 공통적인 기능적 활성을 갖도록 제2 아미노산 서열에 비해 충분한 또는 최소 수의 동일하거나 동등한 아미노산 잔기를 함유하는 제1 아미노산 서열을 의미한다. 예를 들어, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100% 동일한, 공통적인 구조 도메인을 포함하는 아미노산 서열은 본원에서 충분히 유사한 것으로 정의된다. 바람직하게는, 변이체는 본 발명의 바람직한 펩타이드의 아미노산 서열, 특히 본 발명의 항체 또는 단편, 이들 중 어느 하나의 변이체, 유도체 또는 유사체에 의해 인식되는 에피토프를 포함하는 항체 또는 항체 단편, 또는 합성 펩타이드 또는 펩타이드-기반 화합물과 충분히 유사할 것이다. 이러한 변이체는 일반적으로 본 발명의 펩타이드의 기능적 활성을 보유한다, 즉 본 발명의 항체에 의해 결합된다. 변이체에는 하나 이상의 아미노산의 결실(들), 부가(들) 및/또는 치환(들)에 의해 각각 원상태 및 wt 펩타이드로부터 아미노산 서열과 상이한 펩타이드가 포함된다. 이들은 천연 생성 변이체뿐만 아니라 인공적으로 설계된 것일 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 폴리펩타이드를 언급할 때 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"에는 대응하는 원상태 결합 분자, 항체, 또는 폴리펩타이드의 항원-결합 특성의 적어도 일부를 보유하는 임의의 폴리펩타이드가 포함된다. 본 발명의 폴리펩타이드의 단편에는 본원에서 다른 곳에서 논의되는 특정한 항체 단편에 부가하여, 단백분해 단편뿐만 아니라 결실 단편이 포함된다. 본 발명의 항체 및 항체 폴리펩타이드의 변이체에는 상술된 단편, 및 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입으로 인해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드가 또한 포함된다. 변이체는 천연 또는 비천연 생성될 수 있다. 비천연 생성 변이체는 당분야에 공지된 돌연변이화 기법을 이용해서 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩타이드는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 본 발명의 결합 분자의 유도체, 예로 본 발명의 항체 및 항체 폴리펩타이드는 원상태 폴리펩타이드에서 발견되지 않는 추가적인 특징을 나타내기 위해 변경된 폴리펩타이드이다. 예에는 융합 단백질이 포함된다. 변이체 폴리펩타이드는 또한 본원에서 "폴리펩타이드 유사체"로 불릴 수 있다. 본원에서 이용되는 결합 분자 또는 이들의 단편, 항체, 또는 항체 폴리펩타이드의 "유도체"는 기능적 측쇄기의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖는 대상 폴리펩타이드를 나타낸다. 또한 20개 표준 아미노산의 하나 이상의 천연 생성 아미노산 유도체를 함유하는 펩타이드가 "유도체"로서 포함된다. 예를 들어, 4-하이드록시프롤린이 프롤린에 대해 치환될 수 있고; 5-하이드록시라이신이 라이신에 대해 치환될 수 있고; 3-메틸히스티딘이 히스티딘에 대해 치환될 수 있고; 호모세린이 세린에 대해 치환될 수 있고; 오르니틴이 라이신에 대해 치환될 수 있다.
항- 개별특이형 항체:
항체 또는 다른 결합 분자를 언급할 때 용어 "항-개별특이형 항체"에는 항원 결합 부위에서 또는 근처에서 항체의 가변 영역 상에 위치하는 독특한 항원성 펩타이드 서열에 결합함으로써 다른 경우 주어진 자가항체에 의해 유도되는 특정한 면역 반응을 저해하는 분자가 포함된다. 유사한 방식으로, 본 발명의 항체에 의해 특이적으로 인식되는 에피토프를 포함하는 합성 펩타이드 또는 펩타이드-기반 화합물이 이용될 수 있다.
항-개별특이형 항체는 다른 항체와 유사한 방식으로 수득될 수 있다. 특정한 항-개별특이형 항체는 응집(탁도계측 또는 혼탁계측 검정), 침전(방사상 면역확산) 또는 샌드위치 면역검정, 예컨대 ELISA에 의해 임의의 종류의 가교에 의해 검출된다. U.S. 특허 출원 번호 20020142356은 고농도, 고분자량 표적 항원에 대해 특이적인 항체에 대해 유도되는 항-개별특이형 모노클로날 항체 집단의 수득 방법을 제공하며, 여기서 상기 항-개별특이형 항체 집단은 상기 표적 항원에 대해 특이적인 선택된 항체에 대해 광범위한 결합 친화도를 가지며, 특정한 적용을 위해 요구되는 친화도를 갖는 상기 항-개별특이형 항체 집단의 하위세트가 선택될 수 있다.
U.S. 특허 출원 번호 20020142356은 코팅으로서 항체를 및 검출로서 항-개별특이형 항체를 또는 반대로 이용하는 항원의 경쟁적 면역검정을 기재한다. 대리 항원으로서 항-개별특이형 항체의 이용을 개시하는 다른 참고문헌에는 문헌 [Losman et al. Cancer Research 55(1995)(23 suppl. S):S5978-S5982; Becker et al. J. Immunol . Methods 192(1996), 73-85; Baral et al. Int . J. Cancer 92(2001), 88-95; 및 Kohen et al. Food and Agriculture Immunology 12(2000), 193-201]이 포함된다. 질환의 치료에서 또는 기생충에 대한 항-개별특이형 항체의 이용은 당분야에 공지되어 있다; 예로, 문헌 [Sacks et al. J. Exp.. Medicine 155(1982), 1108-1119]를 참고하라.
분자의 유사성 및/또는 동일성 결정:
두 펩타이드 간 "유사성"은 하나의 펩타이드의 아미노산 서열을 제2 펩타이드의 서열과 비교하여 결정된다. 하나의 펩타이드의 아미노산은 이것이 동일한 또는 보존적 아미노산 치환인 경우, 제2 펩타이드의 대응하는 아미노산과 유사하다. 보존적 치환에는 문헌 [Dayhoff, M.O., ed., The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. (1978), 및 Argos EMBO J. 8(1989), 779-785]에 기재된 것들이 포함된다. 예를 들어, 하기 군 중 하나에 속하는 아미노산은 보존적 변화 또는 치환을 나타낸다: -Ala, Pro, Gly, Gln, Asn, Ser, Thr; -Cys, Ser, Tyr, Thr; -Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; -Lys, Arg, His; -Phe, Tyr, Trp, His; 및 -Asp, Glu.
두 서열 간 동일성 또는 유사성 백분율의 결정은 바람직하게는 문헌 [Karlin and Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877]의 수학적 알고리즘을 이용해서 달성된다. 이러한 알고리즘은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge)에서 이용 가능한 문헌 [Altschul et al.(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]의 BLASTn 및 BLASTp 프로그램 내에 포함된다.
동일성 또는 유사성 백분율의 결정은 BLASTn 및 BLASTp 프로그램의 표준 파라미터를 이용해서 수행된다.
BLAST 폴리뉴클레오타이드 검색은 BLASTn 프로그램을 이용해서 수행된다. 일반적 파라미터에 있어서, "최대 표적 서열" 박스는 100으로 설정될 수 있고, "짧은 쿼리" 박스가 선택될 수 있고, "예상 역치" 박스는 10으로 설정될 수 있고, "단어 크기" 박스는 28로 설정될 수 있다. 스코어링 파라미터에 있어서, "최대/미스매치 스코어"는 1, -2로 설정될 수 있고, "갭 코스트" 박스는 선형으로 설정될 수 있다. 필터 및 차단 파라미터에 있어서, "저복합성 영역" 박스는 선택해제될 수 있고, "종-특이적 반복" 박스는 선택해제될 수 있고, "룩업 표만 차단" 박스는 선택될 수 있고, "소문자 글자 차단" 박스는 선택해제될 수 있다.
BLAST 단백질 검색은 BLASTp 프로그램을 이용해서 수행된다. 일반적 파라미터에 있어서, "최대 표적 서열" 박스는 100으로 설정될 수 있고, "짧은 쿼리" 박스가 선택될 수 있고, "예상 역치" 박스는 10으로 설정될 수 있고, "단어 크기" 박스는 "3"으로 설정될 수 있다. 스코어링 파라미터에 있어서, "매트릭스" 박스는 "BLOSUM62"로 설정될 수 있고, "갭 코스트" 박스는 "존재: 11 연장: 1"로 설정될 수 있고, "조성 조정" 박스는 "조건적 조성 스코어 매트릭스 조정"으로 설정될 수 있다. 필터 및 차단 파라미터에 있어서, "저복합성 영역" 박스는 선택해제될 수 있고, "룩업 표만 차단" 박스는 선택해제될 수 있고, "소문자 글자 차단" 박스는 선택해제될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 :
용어 "폴리뉴클레오타이드"는 단수 핵산뿐만 아니라 복수 핵산을 포괄하려는 것이며, 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예로 메신저 RNA(mRNA) 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 통상적 포스포디에스테르 결합 또는 비-통상적 결합(예로, 아마이드 결합, 예컨대 펩타이드 핵산(PNA)에서 확인되는 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산"은 임의의 하나 이상의 핵산 절편, 예로 폴리뉴클레오타이드에 존재하는 DNA 또는 RNA 단편을 나타낸다. "단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드는 그 원상태 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA에 대한 것이다. 예를 들어, 벡터에 함유되는 항체를 인코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오타이드의 추가 예에는 이종성 숙주 세포에서 유지되는 재조합 폴리뉴클레오타이드 또는 용액 중 정제되는(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오타이드가 포함된다. 단리된 RNA 분자에는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체가 포함된다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산에는 합성적으로 생산된 이러한 분자가 추가로 포함된다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결인자일 수도 있고 또는 이를 포함할 수도 있다.
본원에서 이용되는 "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어지는 핵산 부분이다. "정지 코돈"(TAG, TGA, 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만, 이는 코딩 영역의 일부로 간주될 수 있는 반면, 임의의 측면 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결인자, 인트론 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 본 발명의 2개 이상 코딩 영역은 단일 폴리뉴클레오타이드 구축물에, 예로 단일 벡터 상에, 또는 별도의 폴리뉴클레오타이드 구축물에, 예로 별도의(상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 함유할 수도 있고, 또는 2개 이상의 코딩 영역을 포함할 수도 있다, 예로 단일 벡터가 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 별도로 인코딩할 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오타이드, 또는 핵산은 결합 분자, 항체, 또는 이들의 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 핵산에 융합되거나 융합되지 않은 이종성 코딩 영역을 인코딩할 수 있다. 이종성 코딩 영역에는 비제한적으로 특화된 요소 또는 모티프, 예컨대 분비 신호 펩타이드 또는 이종성 기능적 도메인이 포함된다.
특정한 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에는 보통 하나 이상의 코딩 영역과 작동 가능하게 연관되는 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 제어 요소가 포함될 수 있다. 작동 가능한 연관은 유전자 산물, 예로 폴리펩타이드에 대한 코딩 영역이 조절 서열(들)의 영향 또는 제어 하에 유전자 산물의 발현을 배치하도록 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 연관되는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예컨대 폴리펩타이드 코딩 영역 및 이와 연관되는 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 일으키는 경우 그리고 두 DNA 단편 간 연결의 성질이 유전자 산물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 DNA 주형이 전사되는 능력을 방해하지 않는 경우 "작동 가능하게 연관"되거나 "작동 가능하게 연결"된다. 따라서, 프로모터 영역은 프로모터가 그 핵산의 전사를 실시할 수 있는 경우 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산과 작동 가능하게 연관될 것이다. 프로모터는 소정 세포에서만 DNA의 실질적 전사를 유도하는 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 제어 요소, 예를 들어 인핸서, 작동인자, 억제인자 및 전사 종결 신호가 세포-특이적 전사를 유도하기 위해 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연관될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 제어 영역이 본원에 개시된다.
다양한 전사 제어 영역이 당분야 숙련가에게 공지되어 있다. 이들에는 비제한적으로 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대 비제한적으로 사이토메갈로바이러스(인트론-A와 함께, 최조기 프로모터), 시미안 바이러스 40(조기 프로모터), 및 레트로바이러스(예컨대 라우스 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 절편이 포함된다. 다른 전사 제어 영역에는 척추동물 유전자에서 유래되는 것들, 예컨대 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈뿐만 아니라 진핵생물 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열이 포함된다. 적합한 추가적인 전사 제어 영역에는 조직-특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 림포카인-유도성 프로모터(예로, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도 가능한 프로모터)가 포함된다.
유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 당업자에게 공지되어 있다. 이들에는 비제한적으로 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 피코나바이러스에서 유래되는 요소(특히 CITE 서열로도 불리는 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES)가 포함된다
다른 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 RNA, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA), 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 소형 간섭 RNA(siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 산물의 형태이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 코딩 영역은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드의 분비를 지시하는, 분비 또는 신호 펩타이드를 인코딩하는 추가적인 코딩 영역과 연관될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유류 세포에 의해 분비되는 단백질은 일단 조면 소포체를 통해 성장하는 단백질쇄의 외수송이 개시되면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩타이드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비되는 폴리펩타이드가 일반적으로 폴리펩타이드의 N-말단에 융합되는 신호 펩타이드를 가지며, 이것이 완전 또는 "전장" 폴리펩타이드로부터 절단되어 분비된 또는 "성숙" 형태의 폴리펩타이드를 생산한다는 것을 인지한다. 특정한 구현예에서, 원상태 신호 펩타이드, 예로 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩타이드, 또는 이와 작동 가능하게 연관되는 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 그 서열의 기능적 유도체가 이용된다. 대안적으로, 이종성 포유류 신호 펩타이드, 또는 이들의 기능적 유도체가 이용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 리더 서열이 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다아제의 리더 서열로 치환될 수 있다. 그러나, 폴리펩타이드, 특히 본 발명의 면역글로불린 및 이들의 단편의 세포내 생산도 가능하다.
발현:
본원에서 이용되는 용어 "발현"은 유전자가 생화학 물질, 예를 들어 RNA 또는 폴리펩타이드를 생산하는 공정을 나타낸다. 공정에는 비제한적으로 유전자 녹다운뿐만 아니라 일시적 발현 및 안정한 발현 둘 다를 포함하는, 세포 내 유전자의 기능적 존재의 임의의 발현이 포함된다. 여기에는 비제한적으로 유전자의 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 소형 간섭 RNA(siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 산물로의 전사, 및 이러한 mRNA의 폴리펩타이드(들)로의 번역이 포함된다. 원하는 최종 산물이 생화학 물질인 경우, 발현에는 그 생화학 물질 및 임의의 전구체의 생성이 포함된다. 유전자의 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본원에서 이용되는 유전자 산물은 핵산, 예로 소형 간섭 RNA(siRNA), 유전자의 전사에 의해 생산되는 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역되는 폴리펩타이드일 수 있다. 본원에 기재된 유전자 산물에는 전사 후 개질, 예로 폴리아데닐화를 갖는 핵산, 또는 번역 후 개질, 예로 메틸화, 글리코실화, 지질의 부가, 다른 단백질 서브유닛과의 연관, 단백분해 절단 등을 갖는 폴리펩타이드가 포함된다.
다양한 발현 벡터/숙주 시스템이 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하고 발현하기 위해 이용될 수 있다. 이들에는 비제한적으로 미생물, 예컨대 재조합 박테리오파지, 플라스미드, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예로, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(예로, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 박테리아 발현 벡터(예로, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템이 포함된다.
숙주 세포에서 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 융합 단백질(본원에서 이후 "산물"로 불림)을 발현하기 위해, 하기와 같은 절차가 이용될 수 있다. 상기 산물을 인코딩하는 DNA 서열을 함유하는 제한 단편이 숙주 세포에서 기능하는 복제 기점 및 적절한 선택 마커를 함유하는 적절한 재조합 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다. 플라스미드에는 산물의 유도성 발현을 위한 프로모터(예로, pTrc(Amann et al Gene 69(1988), 301 315) 및 pETl Id(Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990), 60 89)가 포함될 수 있다. 재조합 플라스미드는, 예를 들어 전기천공에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있고, 재조합 플라스미드를 함유하는 세포는 플라스미드 상의 마커에 대한 선택에 의해 확인될 수 있다. 산물의 발현은 산물에 대해 특이적인 검정을 이용해서 숙주 세포에서 유도되고 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 산물/펩타이드를 인코딩하는 DNA는 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 예를 들어, DNA에는 동일한 아미노산에 대해 다른 코돈보다 숙주 세포에서 우선하는 하나 이상의 아미노산에 대한 코돈이 포함될 수 있다.
대안적으로, 산물의 발현은 또한 기능적 연구를 위해 개질된 또는 비천연 아미노산의 포함을 위해 특히 적합한 무세포 추출물 중 단백질의 시험관내 합성에 의해 수행될 수 있다; 또한 아래 내용을 참고하라. 시험관내 번역 시스템의 이용은 과발현된 산물이 숙주 세포에 대해 독성인 경우, 산물이 불용성이거나 봉입체를 형성하는 경우, 또는 단백질이 세포내 프로테아제에 의해 신속한 단백 분해를 거치는 경우 생체내 유전자 발현에 비해 장점을 가질 수 있다. 가장 빈번하게 이용되는 무세포 번역 시스템은 토끼 망상적혈구, 밀 배아 및 대장균으로부터의 추출물로 구성된다. 모두가 외인성 RNA의 번역을 위해 요구되는 모든 거대분자 성분(70S 또는 80S 리보솜, tRNA, 아미노아실-tRNA 합성효소, 개시, 연장 및 종결 인자 등)을 함유하는 조정제 추출물로서 제조된다. 효율적인 번역을 보장하기 위해, 각각의 추출물은 아미노산, 에너지원(ATP, GTP), 에너지 재생 시스템(진핵생물 시스템을 위한 크레아틴 포스페이트 및 크레아틴 포스포키나아제, 및 E. 콜라이 용해물을 위한 포스포에놀 피루베이트 및 피루베이트 키나아제), 및 당분야에 공지된 다른 보조-인자(Mg2+, K+ 등)으로 보강되어야 한다. 적절한 전사/번역 시스템은, 예를 들어 Promega Corporation, Roche Diagnostics, 및 Ambion, 즉 Applied Biosystems(Anderson et al. Meth . Enzymol. 101(1983), 635-644; Arduengo et al. The Role of Cell-Free Rabbit Reticulocyte Expression Systems in Functional Proteomics in Kudlicki, Katzen and Bennett eds., Cell-Free Expression Vol. 2007. Austin, Tx: Landes Bioscience, pp. 1-18; Chen and Zubay Meth . Enzymol . 101(1983), 674-90; Ezure et al. Biotechnol. Prog. 22(2006), 1570-1577)으로부터 상업적으로 이용 가능하다.
숙주 세포:
본 발명에 관해, 숙주 세포는 임의의 원핵생물 또는 진핵생물 세포, 예컨대 박테리아, 곤충, 진균, 식물, 동물 또는 인간 세포일 수 있다. 바람직한 진균 세포는, 예를 들어 사마로마이세스 속의 세포, 특히 S. 세레비시애 종의 세포이다. 용어 "원핵생물"은 본 발명의 항체 또는 대응하는 면역글로불린쇄의 발현을 위해 DNA 또는 RNA 분자로 형질전환되거나 전달감염될 수 있는 모든 박테리아를 포함하려는 것이다. 원핵생물 숙주에는 그램 음성뿐만 아니라 그램 양성 박테리아, 예컨대 E. 콜라이 , S. 타이피무리움 , 세라티아 마르세센스 및 바실러 스 서브틸리스가 포함될 수 있다. 용어 "진핵생물"은 효모, 고등 식물, 곤충 및 바람직하게는 포유류 세포, 가장 바람직하게는 HEK 293, NSO, CSO 및 CHO 세포를 포함하려는 것이다. 재조합 생산 절차에서 채용되는 숙주에 따라, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 항체 또는 면역글로불린쇄는 글리코실화될 수도 있고 또는 글리코실화되지 않을 수도 있다. 본 발명의 항체 또는 대응하는 면역글로불린쇄에는 또한 최초 메티오닌 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 당업자에게 일반적으로 공지된 임의의 기법을 이용하여 숙주를 형질전환시키거나 전달감염시키기 위해 이용될 수 있다. 또한, 융합된, 작동 가능하게 연결된 유전자의 제조 방법 및, 예로 포유류 세포 및 박테리아에서의 이들의 발현 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다(Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 유전적 구축물 및 여기에 기재된 방법은 진핵생물 또는 원핵생물 숙주에서 본 발명의 항체 또는 대응하는 면역글로불린쇄의 발현을 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 삽입된 폴리뉴클레오타이드의 효율적인 전사를 촉진하는 프로모터 서열을 함유하는 발현 벡터가 숙주와 함께 이용된다. 발현 벡터는 전형적으로 복제 기원, 프로모터, 및 종결인자뿐만 아니라 형질전환된 세포의 표현형 선택을 제공할 수 있는 특정한 유전자를 함유한다. 면역글로불린 발현 및 분비를 위한 DNA 서열 및 숙주 세포의 적합한 원천 세포는, 여러 공급원, 예컨대 American Type Culture Collection("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas," Fifth edi-tion(1985) Rockville, Maryland, U.S.A., 본원에 참조로 포함됨)에서 수득될 수 있다. 또한, 본 발명의 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물, 바람직하게는 포유류가 본 발명의 항체의 대규모 생산을 위해 이용될 수 있다.
형질전환된 숙주는 발효장치에서 성장되고 당분야에 공지된 기법에 따라 배양되어 최적 세포 성장을 달성할 수 있다. 일단 발현되면, 본 발명의 전체 항체, 이들의 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄, 또는 다른 면역글로불린 형태는 암모늄 설페이트 침전, 친화도 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다; 문헌 [Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982)]를 참고하라. 이어서 본 발명의 항체 또는 그 대응하는 면역글로불린쇄(들)는 성장 배지, 세포 용해물, 또는 세포막 분획으로부터 단리될 수 있다. 예로, 본 발명의 재조합적으로 발현된 항체 또는 면역글로불린쇄의 단리 및 정제는 임의의 통상적 수단, 예컨대 분취용 크로마토그래피 분리 및 예로 본 발명의 항체의 불변 영역에 대해 유도된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 이용이 관여되는 것과 같은 면역학적 분리에 의할 수 있다. 당분야 숙련가에게는 본 발명의 항체가, 예로 약물 표적화 및 조영 적용을 위해 다른 모이어티에 추가로 커플링될 수 있음이 자명할 것이다. 이러한 커플링은 항체 또는 항원의 발현 후 부착 부위에 대해 화학적으로 수행될 수도 있고, 또는 커플링 산물이 DNA 수준에서 본 발명의 항체 또는 항원 내로 조작될 수도 있다. 이어서 DNA는 적합한 숙주 시스템에서 발현되고, 발현된 단백질이 수집되고, 필요한 경우 재생된다.
약학적 이용을 위해 적어도 약 90 내지 95% 균질성의 실질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하며, 98 내지 99% 이상 균질성이 가장 바람직하다. 일단 정제되면, 원하는 바에 따라 부분적으로 또는 균질성까지의 항체가 치료적으로(체외 포함) 또는 검정 절차의 개발 및 수행에서 이용될 수 있다.
본 발명에는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터를 이용한 세포의 유전적 조작 단계를 포함하는 본 발명의 항체 또는 그 대응하는 면역글로불린쇄(들)를 발현할 수 있는 세포의 생산 방법이 관여된다. 본 발명의 방법에 의해 수득 가능한 세포는, 예를 들어 본 발명의 항체와 그 항원의 상호작용을 평가하기 위해 이용될 수 있다.
ELISA-검정:
다양한 항원에 대한 효소-연관 면역흡착 검정(ELISAs)에는 비색계측, 화학발광 및 형광계측에 기반한 것들이 포함된다. ELISA는 혈장 및 소변 샘플 중 소량의 약물 및 다른 항원성 성분의 결정에서 성공적으로 적용되어 왔으며, 추출 단계가 관여되지 않고, 수행이 간편하다. 단백질 항원에 대한 항체의 검출을 위한 ELISA는 종종 마이크로타이터 플레이트의 플라스틱 표면에 대한 짧은 합성 펩타이드의 직접적 결합을 이용한다. 펩타이드는, 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하는 효율적인 정제 방법 및 이들의 합성 성질로 인해 일반적으로 매우 순수하다. 짧은 펩타이드의 단점은 이들이 보통 입체형태 또는 불연속적 에피토프가 아닌 선형 에피토프를 나타낸다는 것이다. 입체형태 에피토프를 제시하기 위해서는 긴 펩타이드 또는 완전한 원상태 단백질이 이용된다. 플레이트의 소수성 폴리스티렌 지지체에 대한 단백질 항원의 직접적 결합은 결합된 단백질의 부분적 또는 전체적 변성 및 입체형태 에피토프의 손실을 일으킬 수 있다. 항원의 고정화를 매개하는 항체를 이용한 플레이트의 코팅(포획 ELISA)은 이러한 효과를 배제할 수 있다.
그러나 빈번하게는, 과발현된 재조합 단백질이 불용성이며, 입체형태 에피토프에 대한 항체가 분석되어야 하는 경우, 변성 조건 하의 정제 및 재생을 필요로 한다. 코팅 단백질로서 재조합 융합 단백질을 이용하는 일반적 ELISA에 대해서는 예를 들어, U.S. 특허 출원 번호 20030044870을 참고하라.
결합 분자:
본 발명의 맥락에서 이용되는 "결합 분자"는 일차적으로 항체 및 이들의 단편에 관한 것이지만, 또한 본 발명의 "관심 분자"에 결합하는 다른 비-항체 분자를 나타낼 수 있으며, 여기서 관심 분자는 사이토카인, 특히 IL-20으로 공지된 당단백질 클래스의 단백질이다. 본 발명의 관심 분자는 상기 및 하기 본 발명의 특정한 구현예의 기재 내에 더욱 상세히 정의된다. 본 발명의 결합 분자에는 비제한적으로 호르몬, 수용체, 리간드, 주조직 적합 복합체(MHC) 분자, 샤페론, 예컨대 열 충격 단백질(HSPs)뿐만 아니라 세포-세포 접착 분자, 예컨대 카드헤린, 인테그린, C-형 렉틴 및 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리의 구성원이 포함된다. 따라서 오직 명확성을 위해 그리고 본 발명의 범위를 제한하지 않고, 대부분의 하기 구현예는 치료제 및 진단제의 개발을 위한 바람직한 결합 분자를 나타내는 항체 및 항체-유사 분자에 대해 논의된다.
항체:
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 상호 교환적으로 이용된다. 항체 또는 면역글로불린은 본원에서 상기 및 하기 정의된 바와 같은 본 발명의 관심 분자에 결합하는 분자이며, 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함하고, 보통 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 포함한다. 척추동물 시스템에서의 기본적 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해되어 있다; 예로, 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]을 참고하라. 본 발명의 결합 분자, 예로 항체의 결합 친화도에 대한 용어 "결합한다" 및 "인식한다"는 상호 교환적으로 이용된다.
본원에서 상기 및 하기 정의된 바와 같은 관심 분자에 특이적으로 결합하기에 충분한 구조를 함유하는 임의의 항체 또는 면역글로불린 단편은 본원에서 "결합 분자", "결합 단편" 또는 "면역특이적 단편"으로서 상호 교환적으로 표시된다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 면역특이적 단편, 이들의 변이체, 또는 유도체에는 비제한적으로 폴리클로날, 모노클로날, 다중특이적, 인간, 인간화, 영장류화, 쥐과화 또는 키메라 항체, 단일쇄 항체, 에피토프-결합 단편, 예로 Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fv, 단일쇄 Fv(scFv), 단일쇄 항체, 디설파이드-결합 Fv(sdFv), VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산되는 단편, 및 항-개별특이형(항-Id) 항체(예로, 본원에 개시된 항체에 대한 항-Id 항체 포함)가 포함된다. ScFv 분자는 당분야에 공지되어 있으며, 예로 US 특허 5,892,019에 기재되어 있다. 이에 관해, 항체의 항원-결합 단편은 단일 도메인 항체(sdAB) 또는 nanobodies™(Ablynx, Gent, Belgium)로도 알려져 있는 도메인 항체(dAb)일 수 있다, 예로 문헌 [De Haard et al. J. Bacteriol . 187(2005), 4531-4541; Holt et al. Trends Biotechnol . 21(2003), 484-490]을 참고하라. 아래에서 더 상세히 논의될 바와 같이, 용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 광범위한 클래스의 폴리펩타이드를 포함한다. 당분야 숙련가는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)으로 분류되며, 이들 중에는 일부 서브클래스가 포함됨을 이해할 것이다(예로, γ1-γ4). 항체의 "클래스"를 각각 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY로 결정하는 것이 상기 사슬의 성질이다. 면역글로불린 서브클래스(이소형), 예로 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 등은 잘 특성규명되어 있으며, 기능적 특화를 부여하는 것으로 공지되어 있다. 본 발명의 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예로, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예로, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등) 또는 서브클래스일 수 있다. 이들 클래스 및 이소형 각각의 개질된 버전은 본 개시의 관점에서, 따라서 본 발명의 범위 내에서, 당분야 숙련가에게 쉽게 식별 가능하다. 모든 면역글로불린 클래스가 명확히 본 발명의 범위 내에 있지만, 하기 논의는 일반적으로 면역글로불린 분자의 IgG 클래스에 대한 것일 것이다. IgG에 관해, 표준 면역글로불린 분자는 분자량이 대략 23,000 달톤인 2개의 동일한 경쇄 폴리펩타이드, 및 분자량이 53,000-70,000인 2개의 동일한 중쇄 폴리펩타이드를 포함한다. 4개의 쇄는 전형적으로 "Y" 구조로 디설파이드 결합에 의해 연결되며, 여기서 경쇄는 "Y"의 입 부분에서 시작하여 가변 영역을 통해 계속되어 중쇄를 감싼다.
상기 표 1에 기재된 본 발명의 예시적인 항-IL-20 항체의 분류로부터 자명하듯이, 본 발명의 예시적인 항체는 IgG4 또는 IgG1 클래스이며, 가능하게는 이러한 AIRE-결핍 상태에서의 이들의 개시에서 조절 T-세포 반응 및/또는 상피를 시사한다. 이러한 발견은 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Kaerner et al. in Clin . Exp . Immunol .(2012); doi: 10.1111/cei.12024]에 기재된 AIRE-결핍 마우스에서 확인되는 대응하는 자가항체의 분류에 의해 확인된다. 따라서 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 IgG 유형이며, 더욱 바람직하게는 IgG4 또는 IgG1이다.
IgG 구조:
경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ)로 분류된다. 각각의 중쇄 클래스에는 카파 또는 람다 경쇄가 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되며, 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성되는 경우 2개 중쇄의 "꼬리" 부분은 비-공유 결합 또는 공유 디설파이드 결합에 의해 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 구조의 포크형 말단에서의 N-말단으로부터 각 쇄의 바닥에서의 C-말단으로 진행된다. 경쇄 및 중쇄는 모두 구조적 및 기능적 상동성 영역으로 구분된다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 이용된다. 이에 관해, 두 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 부분 모두의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정함이 이해될 것이다. 반대로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 중요한 중요한 생물학적 특성, 예컨대 분비, 태반통과 이동, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등을 부여한다. 관례 상, 항체의 항원-결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더 원위가 됨에 따라 불변 영역 도메인의 넘버링이 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고 C-말단 부분은 불변 영역이다; CH3 및 CL 도메인은 실제로 중쇄 및 경쇄 각각의 카복시-말단을 포함한다.
위에 나타낸 바와 같이, 가변 영역은 항체가 항원 상의 에피토프를 선택적으로 인식하고 특이적으로 결합할 수 있도록 한다. 즉, 항체의 VL 도메인 및 VH 도메인, 또는 상보성 결정 영역(CDRs)의 하위세트가 조합되어 3차원 항원-결합 부위를 정의하는 가변 영역을 형성한다. 상기 사차 항체 구조는 Y의 각 팔의 말단에 존재하는 항원-결합 부위를 형성한다. 보다 구체적으로, 항원-결합 부위는 각각의 VH 및 VL 쇄 상에서 3개 CDR에 의해 정의된다. 본 발명의 관심 분자에 특이적으로 결합하기 충분한 구조를 함유하는 임의의 항체 또는 면역글로불린 단편은 본원에서 "결합 단편" 또는 "면역특이적 단편"으로서 상호 교환적으로 표시된다.
천연 생성 항체에서, 항체는 때때로 각각의 항원-결합 도메인에 존재하며, 항체가 수성 환경에서 그 3차원 구조를 이룸에 따라 항원-결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 배치되는 아미노산의 짧은 비-인접 서열인 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로 불리는 6개의 고가변 영역을 포함한다. "CDR"에는 더 적은 분자간 가변성을 나타내는 4개의 상대적으로 보존된 "프레임워크" 영역 또는 "FR"이 인접한다. 프레임워크 영역은 대개 β-시트 입체형태를 채택하며, CDR은 β-시트 구조를 연결하고 일부 경우 그 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 프레임워크 영역은 쇄-간, 비-공유 상호작용에 의해 정확한 배향으로 CDR 배치를 제공하는 골격을 형성하는 작용을 한다. 배치된 CDR에 의해 형성되는 항원-결합 도메인은 면역반응성 항원 상 에피토프에 상보적인 표면을 정의한다. 상기 상보적 표면은 그 인지체 에피토프에 대한 항체의 비-공유 결합을 촉진한다. 각각 CDR 및 프레임워크 영역을 포함하는 아미노산은 이들이 정확히 정의되었으므로, 당업자에 의해 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대해 쉽게 확인될 수 있다; 본원에 이들의 전문이 참조로 포함되는 문헌 ["Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat et al. U.S. Department of Health and Human Services, (1983); 및 Chothia and Lesk J. Mol . Biol . 196(1987), 901-917]을 참고하라.
당분야에서 이용되고/되거나 허용되는 용어의 2개 이상의 정의가 존재하는 경우, 명시적으로 다르게 언급되지 않는 한, 본원에서 이용된 용어의 정의는 이러한 모든 의미를 포함하려는 것이다. 구체예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 모두의 가변 영역 내에서 확인되는 비-인접 항원 조합 부위를 설명하는 용어 "상보성 결정 영역"("CDR")의 이용이다. 상기 특정한 영역은 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Kabat et al. U.S . Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 및 [Chothia and Lesk J. Mol . Biol . 196(1987), 901-917]에 의해 설명되었으며, 그 정의에는 서로에 대해 비교되는 경우 중복되는 또는 하위 세트의 아미노산 잔기가 포함된다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이들의 변이체의 CDR을 나타내기 위한 어느 한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 이용되는 용어의 범위 내인 것이다. 상기 인용된 각각의 참고문헌에서 정의된 바와 같은 CDR을 포괄하는 적절한 아미노산 잔기를 비교를 위해 아래의 표 2에 나타난다. 특정한 CDR을 포괄하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라 변할 것이다. 당분야 숙련가는 어느 잔기가 항체의 주어진 가변 영역 아미노산 서열에 따라 항체의 인간 IgG 서브타입의 특정한 고가변 영역 또는 CDR을 이루는지 일상적으로 결정할 수 있다.
CDR 정의1
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1표 2에서 모든 CDR 정의의 넘버링은 문헌 [Kabat et al.]에 나타낸 넘버링 관례를 따른다(아래 참고).
문헌 [Kabat et al.]에서는 또한 임의의 항체에 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 자체를 넘어서는 임의의 실험 데이터에 대한 의존이 없이도, 임의의 가변 도메인 서열에 대한 "Kabat 넘버링"의 상기 시스템을 모호하지 않게 지정할 수 있다. 본원에서 이용되는 "Kabat 넘버링"은 문헌 [Kabat et al. U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 나타낸 넘버링 시스템을 나타낸다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 이들의 변이체, 또는 유도체에서 특정한 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 언급은 Kabat 넘버링 시스템을 따르지만, 이는 이론적인 것이며 본 발명의 모든 항체에 동일하게 적용되지 않을 수 있다. 예를 들어, 제1 CDR의 위치에 따라, 다음 CDR이 어느 방향으로든 이동될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 항체는 5가 구조를 갖는 IgM 또는 이들의 유도체가 아니다. 특히 본 발명의 특정한 적용, 특히 치료적 이용에서, IgM은 이들의 5가 구조 및 친화도 성숙의 부재로 인해 종종 비특이적인 교차-반응성 및 매우 낮은 친화도를 나타내므로, IgM이 IgG 및 다른 2가 항체 또는 대응하는 결합 분자에 비해 덜 유용하다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체가 아니다, 즉 혈장 면역글로불린 샘플로부터 수득되는 혼합물에 비해 실질적으로 하나의 특정한 항체 종으로 구성된다.
항체 단편, 동물화:
단일쇄 항체를 포함하는 항체 단편은 단독으로, 또는 하기: 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 전부 또는 일부와의 조합으로 가변 영역(들)을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 관심 분자에 결합하는 단편이 본 발명에 포함되며, 상기 단편은 가변 영역(들)과 힌지 영역, CH1, CH2, 및 CH3 도메인의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명의 방법에 따라 단리되는 모노클로날 항체와 동등한 본 발명의 항체 또는 이들의 면역특이적 단편, 특히 인간 모노클로날 항체는 조류 및 포유류를 포함하는 임의의 동물 기원에서 유래될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간, 쥐과, 당나귀, 토끼, 염소, 기니아픽, 낙타, 라마, 말, 또는 닭 항체이다. 또 다른 구현예에서, 가변 영역은 연골어류 기원일 수 있다(예로, 상어 유래).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 항체는 상기 및 하기에서, 예로 표 1 및 도면, 특히 도 3 내지 10 및 실시예, 예로 실시예 2 및 5에 상세히 정의된 바와 같이, 본 발명의 IL-20에 특이적으로 결합하는, 인간 대상체로부터 클로닝된 천연 생성 인간 모노클로날 항체 또는 결합 단편, 유도체 및 이들의 변이체이다.
선택적으로, 인간 항체의 프레임워크 영역은 데이터베이스에서 관련 인간 생식계열 가변 영역 서열에 따라 정렬되고 채택된다; 예로, MRC Centre for Protein Engineering(Cambridge, UK)에서 호스팅되는 Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)를 참고하라. 예를 들어, 실제 생식계열 서열로부터 일탈할 수 있는 것으로 간주되는 아미노산은 클로닝 공정 동안 포함되는 PCR 프라이머 서열에 기인할 수 있다. 인공 생성 인간-유사 항체, 예컨대 파지 디스플레이 항체 라이브러리 또는 이종발생성 마우스로부터의 단일쇄 항체 단편(scFvs)에 비해, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 (ⅰ) 동물 대리물에 비해 인간 면역 반응을 이용하여 수득되며, 즉 항체가 인체에서 그 관련 입체형태로 천연 IL-20에 대해 반응하여 생성되었으며, (ⅱ) 질환, 예로 SLE 증상의 존재로부터 개체를 보호했거나 적어도 유의미하게 최소화했으며, 및 (ⅲ) 항체가 인간 기원이므로, 자가-항원에 대한 교차-반응성 위험이 최소화되는 것을 특징으로 할 수 있다. 따라서 본 발명에 따르면, 용어 "인간 모노클로날 항체", "인간 모노클로날 자가항체", "인간 항체" 등은 인간 기원인, 즉 B 세포 또는 이들의 하이브리도마와 같은 인간 세포로부터 단리되었거나 그 cDNA가 인간 세포, 예를 들어 인간 기억 B 세포의 mRNA로부터 직접 클로닝된 IL-20 결합 분자를 표시하기 위해 이용된다. 인간 항체는 아미노산 치환이 항체에서, 예로 그 결합 특징을 개선하기 위해 수행되는 경우에도 "인간"으로 간주된다.
아래에, 그리고 예를 들어 US 특허 번호 5,939,598(Kucherlapati et al.)에 기재된 바와 같이 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 트랜스제닉이고 내인성 면역글로불린을 발현하지 않는 동물에서 유래되는 항체는 이들을 실제로 본 발명의 인간 항체와 구별하기 위해 인간-유사 항체로 표시된다.
예를 들어, 인간-유사 항체, 예컨대 전형적으로 파지 디스플레이로부터 단리된 합성 및 반-합성 항체의 중쇄 및 경쇄의 페어링은 이것이 반드시 원래 인간 B 세포에서 일어나는 원래 페어링을 반영하지는 않는다. 따라서 선행 기술에서 일반적으로 이용되는 재조합 발현 라이브러리로부터 수득되는 Fab 및 scFv 단편은 면역원성 및 안정성에 대한 모든 가능한 연관 효과를 갖는 인공적인 것으로 간주될 수 있다.
대조적으로, 본 발명은 이들의 치료적 유용성을 특징으로 하는, 선택된 인간 대상체로부터 단리된 친화도-성숙 항체를 제공한다.
그라프팅된 항체( 동등물 )
본 발명은 또한 본 발명의 항체, 예컨대 IL-20 항체에서 각각 유래되는 CDR을 함유하는 그라프팅된 항체(동등물로서 상호 교환적으로 불림)에 관한 것이다. 이러한 그라프팅된 CDR에는 동물화 항체가 포함되며, 여기서 본 발명의 항체로부터의 CDR이 그라프팅되었거나 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 CDR이 그라프팅된다. CDR은 인간 프레임워크 또는 상기 나타낸 바와 같은 동물 기원으로부터의 항체 프레임워크 내로 직접 그라프팅될 수 있다. 원하는 경우, 프레임워크 변화는 또한 프레임워크 라이브러리를 생성함으로써 포함될 수 있다. CDR 및/또는 프레임워크 서열의 최적화는 아래에 보다 상세히 기재된 바와 같이 독립적으로 수행되고 순차적으로 조합될 수도 있고, 또는 동시에 수행될 수도 있다.
그라프팅된 항체를 생성하기 위해, 본 발명의 항체의 공여체 CDR는 항체 수신체 가변 영역 프레임워크 상으로 그라프팅된다. 활성을 최적화하기 위한 항체의 그라프팅 방법 및 CDR 변이체의 생성 방법은 이전에 기재되었다(예로, 국제 특허 출원 WO98/33919; WO00/78815; WO01/27160 참고). 동시 공정에서 공여체 CDR의 그라프팅 및 친화도 재획득을 달성하기 위한 절차가 수행될 수 있다. 방법은 유사하게 가변 영역의 결합 친화도를 개질하거나 최적화하기 위해 단독으로 또는 CDR 그라프팅과의 조합으로 이용될 수 있다. 수신체 가변 영역 상에 공여체 CDR 결합 친화도를 부여하는 방법은 중쇄 및 경쇄 가변 영역 모두에 적용 가능하며, 그대로 그라프팅하는 동시에 항체 가변 영역의 결합 친화도를 최적화하기 위해 이용될 수 있다.
공여체 CDR은 공여체 CDR 내의 모든 또는 선택되는 위치에서 복수의 상이한 아미노산 잔기 변화를 함유하도록 변경될 수 있다. 예를 들어, 20개 천연 생성 아미노산 잔기 또는 사전 선택된 하위세트의 무작위 또는 편향된 도입은 다양한 CDR 종 집단을 생산하기 위해 공여체 CDR 내로 도입될 수 있다. 다양한 가변 영역 집단 내로의 CDR 변이체 종의 혼입은 소정 항원에 대해 최적화된 결합 친화도를 나타내는 변이체 종의 생성을 허용한다. 다양한 가능한 변화가 공여체 CDR 위치에서 수행될 수 있다. 선택될 수 있는 가능한 변화의 일부 또는 전부가 그라프팅된 공여체 CDR 집단 내로 도입될 수 있다. CDR 내 단일 위치가 변화를 도입하기 위해 선택될 수도 있고, 또는 변경된 아미노산을 갖는 다양한 위치가 조합되고 활성에 대해 스크리닝될 수 있다.
하나의 접근은, 예를 들어 모든 20개 천연 생성 아미노산을 이용한 각 위치에서의 대체에 의해 CDR을 따라 모든 아미노산 위치를 변화시키는 것이다. 각 위치에서의 대체는 CDR의 상당부가 진정한 공여체 CDR 서열을, 이에 따라 공여체 CDR의 결합 친화도를 유지하도록 다른 공여체 CDR 아미노산 위치의 맥락에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 수신체 가변 영역 프레임워크의 원상태이건 변경된 프레임워크이건, CDR 내의 각 위치에서 단일 위치 대체를 함유하는 CDR 집단이 그라프팅될 수 있다. 유사하게, 수신체 가변 영역 프레임워크는 모든 20개 아미노산 잔기 또는 아미노산 하위세트를 혼입하도록 변화된 하나를 초과하는 위치를 함유하는 CDR 집단의 그라프팅을 위해 표적화될 수 있다. CDR 내 또는 그라프팅될 CDR 그룹 내 하나 이상의 아미노산 위치가 수신체 가변 영역 프레임워크 내로 변경되고 그라프팅되어 그라프팅된 항체 집단을 생성할 수 있다. 원하는 경우, 하나 이상의 변경된 위치를 갖는 CDR이 하나 이상의 변경된 위치를 갖는 하나 이상의 다른 CDR과 조합될 수 있음이 이해된다.
하나 이상의 변경된 위치를 갖는 CDR 변이체 종의 집단은 가변 영역의 결합 포켓을 이루는 임의의 또는 모든 CDR과 조합될 수 있다. 따라서, 수신체 가변 영역 프레임워크는 중쇄 또는 경쇄에서 1, 2 또는 모든 3개 수신체 위치에서 공여체 CDR 변이체 집단의 동시 혼입을 위해 표적화될 수 있다. 아미노산 위치 변화를 갖고 표적화할 CDR 또는 CDR의 수의 선택은, 예를 들어 수신체 내로의 전체 CDR 그라프팅을 원하는지 또는 방법이 결합 친화도의 최적화를 위해 수행되고 있는지 여부에 의존할 것이다.
항체 수신체 가변 영역 프레임워크 상으로 공여체 CDR 결합 친화도를 부여하기 위해 변화시키는 공여체 CDR 아미노산의 선택을 위한 또 다른 접근은 고도로 가변적인 공지된 또는 쉽게 확인 가능한 CDR 위치를 선택하는 것이다. 예를 들어, 가변 영역 CDR3은 일반적으로 고도로 가변적이다. 따라서 상기 영역은 단독으로 또는 관련 수신체 가변 프레임워크 변화와 함께, 결합 친화도 재획득 또는 증대를 보장하기 위해 그라프팅 절차 동안 아미노산 위치 변화를 위해 선택적으로 표적화될 수 있다.
쥐과화 항체:
상술된 바와 같이, 그라프팅에 의해 생성되는 항체의 예가 쥐과화 항체이다. 본원에서 이용되는 용어 "쥐과화 항체" 또는 "쥐과화 면역글로불린"은 본 발명의 인간 항체로부터의 하나 이상의 CDR; 및 마우스 항체 서열에 기반하는 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입을 함유하는 인간 프레임워크 영역을 포함하는 항체를 나타낸다. CDR을 제공하는 인간 면역글로불린은 "모체" 또는 "수신체"로 불리며 프레임워크 변화를 제공하는 마우스 항체는 "공여체"로 불린다. 불변 영역이 존재할 필요는 없지만, 존재하는 경우 보통 마우스 항체 불변 영역과 실질적으로 동일하다, 즉 적어도 약 85-90%, 바람직하게는 약 95% 이상 동일하다. 따라서 일부 구현예에서, 전장 쥐과화 인간 중쇄 또는 경쇄 면역글로불린은 마우스 불변 영역, 인간 CDR, 및 여러 "쥐과화" 아미노산 치환을 갖는 실질적으로 인간 프레임워크를 함유한다. 전형적으로, "쥐과화 항체"는 쥐과화 가변 경쇄 및/또는 쥐과화 가변 중쇄를 포함하는 항체이다. 예로 키메라 항체의 전체 가변 영역이 비-마우스이므로, 예를 들어, 쥐과화 항체는 전형적인 키메라 항체를 포괄하지 않을 것이다. "쥐과화" 공정에 의해 "쥐과화"된 개질 항체는 CDR을 제공하는 모체 항체와 동일한 항원에 결합하고, 보통 모체 항체에 비해 마우스에서 면역원성이 더 적다.
항체 단편:
본원에서 이용되는 용어 "중쇄 부분"에는 면역글로불린 중쇄에서 유래되는 아미노산 서열이 포함된다. 중쇄 부분을 포함하는 폴리펩타이드는 CH1 도메인, 힌지(예로, 상부, 중앙, 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 이들의 변이체 또는 단편 중 적어도 하나를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 이용하기 위한 결합 폴리펩타이드는 CH1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드쇄; CH1 도메인, 적어도 일부 힌지 도메인, 및 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩타이드쇄; CH1 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드쇄; CH1 도메인, 적어도 일부 힌지 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드쇄, 또는 CH1 도메인, 적어도 일부 힌지 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드쇄를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩타이드쇄를 포함한다. 또한, 본 발명에서 이용하기 위한 결합 폴리펩타이드에는 적어도 일부 CH2 도메인(예로, 전부 또는 일부 CH2 도메인)이 없을 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 당업자는 이들 도메인(예로, 중쇄 부분)이 천연 생성 면역글로불린 분자로부터의 아미노산 서열이 다르도록 개질될 수 있음이 이해될 것이다.
본원에 개시된 특정한 항체, 또는 항원-결합 단편, 이들의 변이체, 또는 유도체에서, 다량체의 하나의 폴리펩타이드쇄의 중쇄 부분은 다량체의 제2 폴리펩타이드쇄의 중쇄 부분과 동일하다. 대안적으로, 본 발명의 중쇄 부분 함유 단량체는 동일하지 않다. 예를 들어, 각각의 단량체는, 예를 들어 이중특이적 항체 또는 디아바디를 형성하는 상이한 표적 결합 부위를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 항체, 또는 항원-결합 단편, 이들의 변이체, 또는 유도체는 단일 폴리펩타이드쇄, 예컨대 scFv로 이루어지며, 가능한 생체내 치료 및 진단 적용을 위해 세포내 발현된다(인트라바디).
본원에 개시된 진단 및 치료 방법에서 이용하기 위한 결합 폴리펩타이드의 중쇄 부분은 상이한 면역글로불린 분자에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 중쇄 부분은 IgG1 분자에서 유래되는 CH1 도메인 및 IgG3 분자에서 유래되는 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자에서, 및 부분적으로 IgG3 분자에서 유래되는 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 중쇄 부분은 부분적으로 IgG1 분자에서, 및 부분적으로 IgG4 분자에서 유래되는 키메라 힌지를 포함할 수 있다.
따라서 실시예에 또한 예시된 바와 같이, 하나의 구현예에서 본 발명의 항체 또는 이들의 일부, 특히 CH2 및/또는 CH3 도메인, 그러나 선택적으로 또한 CH1 도메인의 불변 영역은 본 발명의 방법에 따라 단리되는 원상태 인간 모노클로날 항체의 가변 영역과 이종성이다. 상기 맥락에서, 이종성 불변 영역(들)은 본 발명의 항체의 치료적 적용의 경우 바람직하게는 인간 기원이지만, 또한, 예를 들어 동물 연구의 경우 설치류 기원일 수 있다; 실시예를 또한 참고하라.
본원에서 이용되는 용어 "경쇄 부분"에는 면역글로불린 경쇄에서 유래되는 아미노산 서열이 포함된다. 바람직하게는, 경쇄 부분은 적어도 하나의 VL 또는 CL 도메인을 포함한다.
이미 나타낸 바와 같이, 다양한 면역글로불린 클래스의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 구성은 널리 공지되어 있다. 본원에서 이용되는 용어 "VH 도메인"에는 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인이 포함되며, 용어 "CH1 도메인"에는 면역글로불린 중쇄의 제1(가장 아미노 말단) 불변 영역 도메인이 포함된다. CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하며, 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대해 아미노 말단이다.
본원에서 이용되는 용어 "CH2 도메인"에는, 예로 통상적 넘버링 방식을 이용해서 항체의 잔기 약 244 내지 잔기 360으로 연장되는 중쇄 분자의 부분이 포함된다(잔기 244 내지 360, Kabat 넘버링 시스템; 및 잔기 231-340, EU 넘버링 시스템; 문헌 [Kabat et al, 상기] 참고). CH2 도메인은 이것이 또 다른 도메인과 밀접하게 페어링되지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물쇄는 온전한 원상태 IgG 분자의 2개 CH2 도메인 사이에 배치된다. CH3 도메인은 IgG 분자의 CH2 도메인으로부터 C-말단 영역으로 연장되며, 대략 108개 잔기를 포함하는 것이 잘 보고되어 있다.
본원에서 이용되는 용어 "힌지 영역"에는 CH1 도메인을 CH2 도메인에 연결하는 중쇄 분자의 부분이 포함된다. 상기 힌지 영역은 대략 25개 잔기를 포함하며 가요성이어서, 2개의 N-말단 항원-결합 영역이 독립적으로 이동할 수 있도록 한다. 힌지 영역은 하기 3개의 별도 도메인으로 세분될 수 있다: 상부, 중앙, 및 하부 힌지 도메인; 문헌 [Roux et al. J. Immunol. 161(1998), 4083]을 참고하라.
본원에서 이용되는 용어 "디설파이드 결합"에는 2개의 황 원자 간에 형성되는 공유 결합이 포함된다. 아미노산 시스테인은 제2 티올기와 디설파이드 결합 또는 가교를 형성할 수 있는 티올기를 포함한다. 대부분의 천연 생성 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 디설파이드 결합에 의해 연결되며, 2개의 중쇄는 Kabat 넘버링 시스템을 이용해서 239 및 242에 대응하는 위치(위치 226 또는 229, EU 넘버링 시스템)에서 2개의 디설파이드 결합에 의해 연결된다.
본원에서 이용되는 용어 "연결된", "융합된" 또는 "융합"은 상호 교환적으로 이용된다. 이들 용어는 화학적 접합 또는 재조합 수단을 포함하는 모든 수단에 의해, 2개 이상의 요소 또는 성분을 함께 연결하는 것을 나타낸다 "프레임-내 융합"은 원래 ORF의 정확한 번역 해독틀을 유지하는 방식으로, 연속적인 더 긴 ORF를 형성하기 위해 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 개방 해독틀(ORF)을 연결하는 것을 나타낸다. 따라서, 재조합 융합 단백질은 원래 ORF에 의해 인코딩되는 폴리뉴클레오타이드에 대응하는 2개 이상의 절편(이 절편은 자연에서 보통 이렇게 연결되지는 않음)을 함유하는 단일 단백질이다. 따라서 해독틀이 융합된 절편을 통해 연속적으로 만들어지지만, 절편은, 예를 들어 프레임-내 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 가변 영역의 CDR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프레임-내 융합될 수 있지만, "융합된" CDR이 연속적 폴리펩타이드의 일부로서 공동 번역되는 한, 적어도 하나의 면역글로불린 프레임워크 영역 또는 추가적인 CDR 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 분리될 수 있다.
에피토프 :
항체의 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프의 최소 크기는 약 4 내지 5개 아미노산인 것으로 여겨진다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는 바람직하게는 적어도 7개, 보다 바람직하게는 적어도 9개, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 15 내지 30개 아미노산을 함유한다. CDR은 그 삼차 형태로 항원성 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 인식할 수 있지만, 에피토프를 이루는 아미노산이 인접할 필요는 없고, 일부 경우에는 동일한 펩타이드쇄 상에 있지 않을 수도 있다. 본 발명에서, 본 발명의 항체에 의해 인식되는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 에피토프는 본 발명의 관심 분자, 즉 IL-20의 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 보다 바람직하게는 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 약 15 내지 약 30 또는 약 30 내지 약 50 인접 또는 비-인접 아미노산 서열을 함유한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체에 의해 인식되는 펩타이드는 15 내지 18개 아미노산을 함유한다. 바람직한 구현예에서, 펩타이드는 서열번호 69의 서열 PDHYTLRKISSLANSFLT를 갖는 인간 IL-20으로부터의 인접 서열로 이루어지는 18개 아미노산을 함유한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 15개 아미노산을 함유하는 펩타이드 에피토프는 서열번호 70의 서열 DHYTLRKISSLANSF로 구성된다.
결합 특징:
본원에서 상호 교환적으로 이용되는 "결합" 또는 "인식하는"은 일반적으로 결합 분자, 예로 항체가 그 항원-결합 도메인을 통해 소정 에피토프에 결합하며, 결합이 항원-결합 도메인 및 에피토프 간 일부 상보성을 수반함을 의미한다. 상기 정의에 따르면, 항체는 이것이 무작위, 비관련 에피토프에 결합하는 것보다 쉽게 그 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합하는 경우, 그 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 불린다. 용어 "특이성"은 본원에서 특정한 항체가 특정한 에피토프에 결합하는 상대적 친화도를 정량하기 위해 이용된다. 예를 들어, 항체 "A"가 항체 "B"에 비해 주어진 에피토프에 대해 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주될 수 있거나, 항체 "A"가 관련된 에피토프 "D"에 대한 것보다 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합하는 것으로 불릴 수 있다. 비관련 에피토프는 보통 비특이적 항원(예로, BSA, 카제인, 또는 임의의 다른 명시된 폴리펩타이드)의 일부이며, 이는 주어진 결합 분자의 결합 특이성의 추정을 위해 이용될 수 있다. 상기 측면에서, 용어 "특이적 결합"은 비특이적 항원으로의 결합에 대한 그 KD보다 적어도 2배 적은 KD를 갖는 소정 항원으로의 항체 결합을 나타낸다. 본원에서 이용되는 용어 "고도로 특이적인" 결합은 특정한 표적 에피토프에 대한 항체의 상대적 KD가 다른 리간드로의 항체 결합에 대한 KD보다 적어도 10-배 적음을 의미한다.
존재하는 경우, 용어 "면역학적 결합 특징" 또는 항원과 항체의 다른 결합 특징은 그 모든 문법적 형태에서 항체의 특이성, 친화도, 교차-반응성, 및 다른 결합 특징을 나타낸다.
"우선적으로 결합"이란, 결합 분자, 예로 항체가 관련된, 유사한, 동종성 또는 유사한 에피토프에 결합할 것보다 쉽게 에피토프에 특이적으로 결합함을 의미한다. 따라서, 주어진 에피토프에 "우선적으로 결합하는" 항체는 이러한 항체가 관련 에피토프와 교차-반응할 수 있음에도 불구하고, 관련 에피토프에 비해 해당 에피토프에 결합할 가능성이 더 높음을 의미한다.
비제한적 예로서, 결합 분자, 예로 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 KD보다 적은 해리 상수(KD)로 상기 제1 에피토프에 결합하는 경우, 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비-제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 KD보다 적어도 한 차수 적은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우, 제1 항원에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비-제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 KD보다 적어도 2 차수 적은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우, 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
또 다른 비-제한적 예에서, 결합 분자, 예로 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 적은 오프 속도(k(off))로 제1 에피토프에 결합하는 경우, 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비-제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 적어도 한 차수 적은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우, 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 비-제한적 예에서, 항체는 이것이 제2 에피토프에 대한 항체의 k(off)보다 적어도 2 차수 적은 친화도로 제1 에피토프에 결합하는 경우, 제1 에피토프에 우선적으로 결합하는 것으로 간주될 수 있다.
본원에 개시된 결합 분자, 예로 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 본 발명의 관심 분자, 이들의 단편 또는 변이체에 5 x 10-2초-1, 10-2초-1, 5 x l0-3초-1 또는 l0-3초-1 이하의 오프 속도(k(off))로 결합하는 것으로 불릴 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 본 발명의 관심 분자 또는 이들의 단편 또는 변이체에 5 x 10-4초-1, 10-4초-1, 5 x 10-5초-1, 또는 10-5초-1 5 x 10-6초-1, 10-6초-1, 5 x 10-7초-1 또는 10-7초-1 이하의 오프 속도(k(off))로 결합하는 것으로 불릴 수 있다.
본원에 개시된 결합 분자, 예로 항체 또는 항원-결합 단편, 변이체, 또는 유도체는 본 발명의 관심 분자 또는 이들의 단편 또는 변이체에 103 M-1초-1, 5 x 103 M-1초-1, 104 M-1초-1 또는 5 x 104 M-1초-1 이상의 온 속도(k(on))로 결합하는 것으로 불릴 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 본 발명의 관심 분자 또는 이들의 단편 또는 변이체에 105 M-1초-1, 5 x 105 M-1초-1, 106 M-1초-1, 또는 5 x 106 M-1초-1 또는 107 M-1초-1 이상의 온 속도(k(on))로 결합하는 것으로 불릴 수 있다.
결합 분자, 예로 항체는 이것이 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 어느 정도 차단하는 정도로 해당 에피토프에 우선적으로 결합하는 경우, 주어진 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 경쟁적으로 저해하는 것으로 불린다. 경쟁적 저해는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 경쟁 ELISA 검정에 의해 결정될 수 있다. 항체는 주어진 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%까지 경쟁적으로 저해하는 것으로 불릴 수 있다.
본원에서 이용되는 용어 "친화도"는 개별 에피토프와 결합 분자, 예로 면역글로불린 분자의 CDR의 결합 강도의 척도를 나타낸다; 예로, 문헌 [Harlow et al. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.(1988) at pages 27-28]을 참고하라. 본원에서 이용되는 용어 "결합력"은 면역글로불린 집단 및 항원 간 복합체의 전반적 안정성, 즉 면역글로불린 혼합물과 항원의 기능적 조합 강도를 나타낸다; 예로, 문헌 [Harlow at pages 29-34]를 참고하라. 결합력은 집단 중 개별 면역글로불린 분자와 특정한 에피토프의 친화도 및 또한 면역글로불린 및 항원의 결합가에 모두 관련된다. 예를 들어, 2가 모노클로날 항체 및 고도 반복 에피토프 구조를 갖는 항원, 예컨대 중합체 간 상호작용은 높은 결합력을 갖는 것일 것이다. 항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합력은 임의의 적합한 방법을 이용해서 실험적으로 결정될 수 있다; 예를 들어, 문헌 [Berzofsky et al. "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y(1984), Kuby Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y(1992)], 및 여기에 기재된 방법을 참고하라. 항원에 대한 항체의 친화도를 측정하기 위한 일반적 기법에는 ELISA, RIA, 및 표면 플라즈몬 공명이 포함된다. 특정한 항체-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건, 예로 염 농도, pH 하에 측정되는 경우 변할 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 항원-결합 파라미터, 예로 KD, IC50의 측정은 바람직하게는 항체 및 항원의 표준화된 용액 및 표준화된 완충액으로 수행된다.
본 발명의 결합 분자, 예로, 항체 또는 항원-결합 단편, 이들의 변이체 또는 유도체는 또한 이들의 교차-반응성의 측면에서 기재되거나 명시될 수 있다. 본원에서 이용되는 용어 "교차-반응성"은 하나의 항원에 대해 특이적인 항체가 제2 항원과 반응하는 능력; 두 상이한 항원성 물질 간 관련성의 척도를 나타낸다. 따라서, 항체는 이것아 그 형성을 유도하는 것과 다른 에피토프에 결합하는 경우, 교차 반응성이다. 교차 반응성 에피토프는 일반적으로 유도 에피토프와 동일한 여러 상보적 구조 특징을 함유하며, 일부 경우 원래보다 실제로 더 잘 피팅될 수 있다.
예를 들어, 특정한 항체는 관련되었지만 동일하지 않은 에피토프, 예로 참조 에피토프에 대해 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 및 적어도 50% 동일성(당분야에 공지되고 본원에 기재된 방법을 이용해서 계산됨)을 갖는 에피토프에 결합한다는 점에서 어느 정도의 교차-반응성을 갖는다. 항체는 이것이 참조 에피토프에 대해 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 및 50% 미만의 동일성(당분야에 공지되고 본원에 기재된 방법을 이용해서 계산됨)을 갖는 에피토프에 결합하지 않는 경우, 교차-반응성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 불릴 수 있다. 항체는 이것이 해당 에피토프의 임의의 다른 유사체, 오르소로그 또는 동족체에 결합하지 않는 경우, 특정한 에피토프에 대해 "고도로 특이적"인 것으로 간주될 수 있다.
본 발명의 결합 분자, 예로 항체 또는 항원-결합 단편, 이들의 변이체 또는 유도체는 또한 본 발명의 관심 분자에 대한 이들의 결합 친화도의 관점에서 기재되거나 명시될 수 있다. 바람직한 결합 친화도에는 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13　M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, 또는 10-15 M 미만의 해리 상수 또는 KD를 갖는 것들이 포함된다. 전형적으로, 항체는 그 소정 항원에 대해 10-7 M 이하의 해리 상수(KD)로 결합한다. 바람직하게는, 항체는 10-9 M 이하의 해리 상수(KD), 더욱 바람직하게는 10-11 M 이하의 해리 상수(KD)로 그 인지체 항원에 결합한다.
항체의 개질:
면역글로불린 또는 그 인코딩 cDNA는 추가로 개질될 수 있다. 따라서 추가 구현예에서, 본 발명의 방법은 키메라 항체, 인간화 항체, 단일쇄 항체, Fab-단편, 이중-특이적 항체, 융합 항체, 표지된 항체 또는 이들 중 임의 하나의 유사체를 생산하는 임의의 하나의 단계(들)를 포함한다. 해당 방법은 당분야 숙련가에게 공지되어 있고, 예로 문헌 [Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988]에 기재된다. 상기 항체의 유도체가 파지 디스플레이 기법에 의해 수득되는 경우, BIAcore 시스템에서 채용되는 바와 같은 표면 플라즈몬 공명이 본 발명에 의해 제공되는 임의의 하나의 항체에서와 동일한 에피토프에 결합하는 파지 항체의 효율을 증가시키기 위해 이용될 수 있다(Schier Human Antibodies Hybri - domas 7(1996), 97-105; Malmborg J. Immunol . Methods 183(1995), 7-13). 키메라 항체의 생산은, 예를 들어 국제 출원 WO89/09622에 기재된다. 인간화 항체의 생산 방법은, 예로 유럽 출원 EP 239 400 A1 및 국제 출원 WO90/07861에 기재된다. 본 발명에 따라 이용될 항체의 추가 원천은 소위 이종발생성 항체이다. 이종발생성 항체, 예컨대 마우스에서의 인간 항체의 생산을 위한 일반 원리는, 예로 국제 출원 WO91/10741, WO94/02602, WO96/34096 및 WO 96/33735에 기재되어 있다. 위에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체는 완전 항체에 더하여, 예를 들어 Fv, Fab 및 F(ab)2뿐만 아니라 단일쇄를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다; 예로, 국제 출원 WO88/09344를 참고하라.
본 발명의 항체 또는 이들의 대응하는 면역글로불린쇄(들)는 당분야에 공지된 통상적 기법을 이용하여, 예를 들어 아미노산 결실(들), 삽입(들), 치환(들), 부가(들) 및/또는 재조합(들) 및/또는 당분야에 공지된 임의의 다른 개질(들)을 단독으로 또는 조합으로 이용하여 추가 개질될 수 있다. 면역글로불린쇄의 아미노산 서열에 내재되는 DNA 서열 내 이러한 개질의 도입 방법은 당분야 숙련가에게 널리 공지되어 있다; 예로, 문헌 [Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1989) N.Y. 및 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biol - ogy , Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)]를 참고하라. 본 발명의 항체의 개질에는 아세틸화, 하이드록실화, 메틸화, 아마이드화 및 탄수화물 또는 지질 모이어티, 보조 인자 등의 부착을 포함하는 측쇄 개질, 골격 개질, 및 N- 및 C-말단 개질을 포함하는 하나 이상의 구성 아미노산에서의 화학적 및/또는 효소적 유도체화가 포함된다. 마찬가지로, 본 발명은 이종성 분자, 예컨대 표지 또는 약물에 융합되어 아미노 말단에서의 기재되는 항체 또는 이들의 일부 단편을 포함하는 키메라 단백질의 생산을 포괄한다. 상기 방식으로 생성된 항원 결합 분자는 각각 이환 세포 및 조직의 적절한 표면 구조를 발현하는 세포에 대한 약물 편재화를 위해 이용될 수 있다. 상기 표적화 및 세포에 대한 결합은 치료적 또는 진단적 활성제의 전달 및 유전자 치료법/유전자 전달을 위해 유용할 수 있다. 본 발명의 항체를 포함하는 분자/입자는 특정한 관심 항원을 발현하는 세포/조직에 특이적으로 결합할 것이며, 이에 따라 진단적 및 치료적 용도를 가질 수 있다.
샘플:
본원에서 이용되는 용어 "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 대상체 또는 환자로부터 수득되는 임의의 생물학적 물질을 나타낸다. 하나의 측면에서, 샘플은 혈액, 뇌척수액("CSF"), 또는 소변을 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 샘플은 전혈, 혈장, 말초혈로부터 농축된 단핵 세포(PBMC), 예컨대 림프구(즉, T-세포, NK-세포 또는 B-세포), 단핵구, 대식구, 수지상 세포 및 호염기구; 및 배양된 세포(예로, 대상체로부터의 B-세포)를 포함할 수 있다. 샘플에는 또한 종양 조직을 포함하는 생검 또는 조직 샘플이 포함될 수 있다. 일부 다른 측면에서, 샘플은 전체 세포 및/또는 세포 용해물을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 샘플은 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 포함한다. 샘플은 당분야에 공지된 방법에 의해 수집될 수 있다.
질환 및 장애:
달리 언급되지 않는 한, 용어 "장애" 및 "질환"은 본원에서 상호 교환적으로 이용된다. 본원에서 이용되는 용어 "자가면역 장애"는 개체 자신의 조직 또는 기관에서 발생되고 이에 대해 유도되는 질환 또는 장애 또는 이들의 공동-응집 또는 발현 또는 이로부터 생성되는 질병이다. 자가면역 질환은 일차적으로 적응 면역 반응의 조절이상에 의해 유도되며 자가-구조에 대한 자가항체 또는 자가반응성 T 세포가 형성된다. 거의 모든 자가면역 질환은 염증성 성분을 또한 갖는다. 자가염증성 질환은 일차적으로는 염증성이며, 일부 전통적인 자가염증성 질환은 선천성 염증 경로에서의 유전적 결함에 의해 유도된다. 자가염증성 질환에서는, 자가반응성 T 세포 또는 자가항체가 확인되지 않는다. 여러 이러한 자가면역 및 자가염증성 장애에서, 비제한적으로 고감마글로불린혈증, 고수준의 자가항체, 조직 내 항원-항체 복합체 침적, 코르티코스테로이드 또는 면역저하 치료로부터의 유익, 및 이환 조직에서의 림프구 세포 응집을 포함하는 여러 임상적 및 실험실 마커가 존재할 수 있다. B 세포 매개 자가면역 장애에 관한 이론에 구애받지 않고, B 세포는 자가항체 생산, 면역 복합체 형성, 수지상 및 T 세포 활성화, 사이토카인 합성, 직접적 케모카인 방출, 및 역외 신-림프형성을 위한 핵 제공을 포함하는 여러 기계적 경로를 통해 인간 자가 면역 질환에서 병리 효과를 나타내는 것으로 여겨진다. 각각의 이러한 경로는 자가면역 질환의 병리에서 상이한 정도로 참여할 수 있다.
본원에서 이용되는 "자가면역 장애"는 기관-특이적 질환(즉, 면역 반응이 기관계, 예컨대 내분비계, 조혈계, 피부, 심폐계, 위장관 및 간 시스템, 신장계, 갑상샘, 귀, 신경근육계, 중추 신경계 등에 대해 특이적으로 유도됨) 또는 비제한적으로 전신 홍반성 루푸스(SLE), 류마티스성 관절염(RA), 다중근염, 자가면역 다중내분비병증 증후군 1형(APS1)/자가면역 다중내분비병증-칸디다증-외분비 디스트로피(APECED) 등을 포함하는 다중 기관계에 영향을 미칠 수 있는 전신 질환일 수 있다. 바람직한 상기 질환에는 비제한적으로 다발성 경화증(MS), 염증성 장 질환(IBD), 비제한적으로 류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 척추관절염, 건선 관절염, 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 비제한적으로 SLE 및 루푸스 신염을 포함하는 루푸스, 다중근육염/피부근육염, 및 건선 관절염을 포함하는 다양한 형태의 자가면역 류마티스성 장애), 자가면역 피부 장애(비제한적으로 건선, 물집증 그룹 질환, 물집 유사 물집증 질환, 및 피부 홍반성 루푸스 포함), 및 자가면역 내분비 장애(비제한적으로 당뇨병-관련 자가면역 질환, 예컨대 1형 또는 인슐린 의존성 당뇨병(T1DM 또는 IDDM), 자가면역 갑상샘 질환(비제한적으로 그래이브스 질환 및 갑상샘염 포함) 포함) 및 비제한적으로 자가면역 다중내분비병증 증후군 1형(APS1)/자가면역 다중내분비병증-칸디다증-외분비 디스트로피(APECED) 및 중증 근무력증(MG/가슴샘종)을 포함하는 자가면역의 생성에 영향을 미치는 질환이 포함된다. 바람직한 질환에는, 예를 들어 SLE, RA, 척추관절염, 건선 관절염, 건선, 쇼그렌 증후군, 그레이브스 질환, 갑상샘염, 사구체신염 및 APS1이 포함된다. 더 바람직한 것은 RA 및 SLE이며, 가장 바람직한 것은 SLE이다.
IL-20 길항제, 예컨대 항-IL-20 항체의 추가적인 의학적 용도가, 예를 들어 류마티스성 관절염 및 골다공증의 예방 또는 치료를 위해 국제 출원 WO2010/042634에; 간 섬유증의 감소를 위해 국제 출원 WO2014/025767에; 알러지성 기도 장애(예로, 천식 또는 기관지 기도 폐색)의 치료를 위해 국제 출원 WO2014/025775에 및 뼈 골절을 갖는 대상체에서 뼈 골절 치유를 촉진하기 위해 국제 출원 WO2014/036384에 최근 기재되었다.
표지 및 진단:
표지제는 본 발명의 항체 또는 항원에 대해, 예를 들어 면역접합체를 제조하기 위해 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 간접적 커플링의 하나의 예는 스페이서 모이어티의 이용에 의한 것이다. 또한, 본 발명의 항체는 추가 도메인을 포함할 수 있으며, 상기 도메인은 공유 또는 비-공유 결합에 의해 연결된다. 연결은 당분야에 공지되고 상술된 방법에 따른 유전적 융합에 기반할 수 있거나, 예로 국제 출원 WO94/04686에 기재된 바와 같은 화학적 가교에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 항체를 포함하는 융합 단백질에 존재하는 추가 도메인은 바람직하게는 가요성 링커, 유리하게는 폴리펩타이드 링커에 의해 연결될 수 있고, 여기서 상기 폴리펩타이드 링커는 상기 추가 도메인의 C-말단 끝 및 본 발명의 항체의 N-말단 끝 사이 또는 반대 경우의 거리에 걸쳐 충분한 길이의 복수의, 친수성, 펩타이드-결합 아미노산을 포함한다. 치료적 또는 진단적 활성제는 다양한 수단에 의해 본 발명의 항체 또는 이들의 항원-결합 단편에 커플링될 수 있다. 여기에는, 예를 들어 공유 방법, 예컨대 펩타이드 결합에 의해 치료적 또는 진단적 활성제에 커플링된 본 발명의 항체의 가변 영역을 포함하는 단일쇄 융합 단백질이 포함된다. 추가 예에는 하기 비제한적 예시 목록의 것들을 포함하는 공유적으로 또는 비공유적으로 추가 분자에 커플링된 적어도 항원-결합 단편을 포함하는 분자가 포함된다. 문헌 [Traunecker, Int. J. Cancer Surp. SuDP 7(1992), 51-52]는 CD3에 대한 Fv 영역이 가용성 CD4 또는 다른 리간드, 예컨대 OVCA 및 IL-7에 커플링되는 이중특이적 시약 야누신을 기재한다. 유사하게, 본 발명의 항체의 가변 영역은 Fv 분자 내로 구축되고 대안적 리간드, 예컨대 인용된 문헌에서 예시된 것들에 커플링될 수 있다. 문헌 [Higgins J. Infect. Disease 166(1992), 198-202]은 GP120의 V3 영역에서 특정한 서열에 대해 유도된 항체에 대해 가교된 OKT3으로 이루어지는 헤테로-접합체 항체를 기재하였다. 이러한 헤테로-접합체 항체는 또한 본 발명의 항체에 함유되는 적어도 가변 영역을 이용하여 구축될 수 있다. 특정한 항체의 추가 예에는 문헌 [Fanger, Cancer Treat. Res. 68(1993), 181-194 및 Fanger, Crit . Rev. Immunol. 12(1992), 101-124]에 기재된 것들이 포함된다. 통상적 항체를 포함하는 면역독소인 접합체는 당분야에 널리 기재되어 있다. 독소는 통상적 커플링 기법에 의해 항체에 커플링될 수도 있고, 또는 단백질 독소 부분을 함유하는 면역독소가 융합 단백질로서 생산될 수도 있다. 본 발명의 항체는 이러한 면역독소를 수득하기 위해 해당하는 방식으로 이용될 수 있다. 이러한 면역독소의 예는 문헌 [Byers Seminars Cell. Biol . 2(1991), 59-70 및 Fanger, Immunol . Today 12(1991), 51-54]에 기재된다.
상술된 융합 단백질은 절단 가능한 링커 또는 프로니타아제에 대한 절단 부위를 추가로 포함할 수 있다. 이들 스페이서 모이어티는 다시 불용성 또는 가용성일 수 있고(Diener et al. Science 231(1986), 148) 표적 부위에서 항원으로부터의 약물 방출을 가능케 하도록 선택될 수 있다. 면역치료법을 위해 본 발명의 항체 및 항원에 커플링될 수 있는 치료제의 예는 케모카인, 귀소 분자, 약물, 방사선 동위원소, 렉틴 및 독소이다. 본 발명의 항체 및 항원에 접합될 수 있는 약물은 접합된 분자를 이용하려는 질환 맥락에 의존한다. 예를 들어, 종양 질환의 치료에서 유용한 표적에 대해 특이적인 항체는 전통적으로 항-종양 약물, 예컨대 미토마이신 C, 다우노루비신, 및 빈블라스틴으로 불리는 화합물에 접합될 수 있다. 예로 종양 면역치료법을 위한, 방사선 동위원소적으로 접합된 본 발명의 항체 또는 항원의 이용에서, 특정한 동위원소가 백혈구 분포뿐만 아니라 안정성 및 방출과 같은 요인에 따라 다른 것보다 더 바람직할 수 있다. 자가면역 반응에 따라, 일부 방출체가 다른 것보다 바람직할 수 있다. 일반적으로, α 및 β 입자 방출 방사선 동위원소가 면역치료법에서 바람직하다. 단범위, 고에너지 α 방출체, 예컨대 212Bi가 바람직하다. 치료적 목적을 위해 본 발명의 항체 또는 항원에 결합될 수 있는 방사선 동위원소의 예는 125I, 131I, 90Y, 67Cu, 212Bi, 212At, 211Pb, 47Sc, 109Pd 및 188Re이다. 본 발명의 항체 또는 항원에 커플링될 수 있는 다른 치료제뿐만 아니라 생체외 및 생체내 치료 프로토콜은 공지되어 있거나 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 표지화를 위해 적합한 방사선핵종의 비제한적 예는 198Au, 212Bi, 11C, 14C, 57Co, 67Cu, 18F, 67Ga, 68Ga, 3H, 197Hg, 166Ho, 111In, 113mIn, 123I, 125I, 127I, 131I, 111In, 177Lu, 15O, 13N, 32P, 33P, 203Pb, 186Re, 188Re, 105Rh, 97Ru, 35S, 153Sm 및 99m Tc이다. 표지화를 위해 적합한 다른 분자는 형광 또는 발광 염료, 자기 입자, 금속, 및 제2 효소 또는 결합 단계를 통해 검출될 수 있는 분자, 예컨대 효소 또는 펩타이드 태그이다. 본 발명에서 표지로서 이용하기 위해 적합한 상업적 형광 탐침은 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, 8th Edition]에 기재된다. 자기 입자-기반 검정(MPAs)에서 이용하기 위해 적합한 자기 입자는 상자성, 반자성, 강자성 및 초상자성 물질로부터 선택될 수 있다.
진단 목적을 위해 유용한 분자 및 세포 생화학에서의 일반적 방법은 표준 교과서, 예컨대 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al. Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al. John Wiley & Sons 1996)]에서 확인될 수 있다. 진단 목적을 위한 시약, 검출 시약 및 키트는 상업적 공급업체, 예컨대 Pharmacia Diagnostics, Amersham, BioRad, Stratagene, Invitrogen, 및 Sigma-Aldrich뿐만 아니라 본원에서 인용되는 임의의 하나의 참고문헌, 특히 특허 문헌에 주어진 원천으로부터 이용 가능하다.
치료 및 약물:
본원에서 이용되는 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 나타내며, 여기서 목적은 바람직하지 않은 생리적 변화 또는 장애, 예컨대 자가면역 및/또는 자가염증성 질환의 발생을 예방하거나 지연시키는(줄이는) 것이다. 유익하거나 바람직한 임상적 결과에는 비제한적으로 검출 가능하건 검출 불가능하건, 증상의 경감, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않은) 상태, 질환 진행의 느려짐 또는 지연, 질환 상태의 완화 또는 개선, 및 관해(부분적이건 전체적이건)이 포함된다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존에 비해 연장되는 생존을 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 자들에는 질병 또는 장애를 이미 갖는 자들뿐만 아니라 질병 또는 장애를 갖기 쉬운 자들 또는 질병 또는 장애의 발현이 예방되어야 하는 자들이 포함된다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "약물", "의약" 또는 "약제"는 본원에서 상호 교환적으로 이용되며, 비제한적으로 (A) 내용 또는 외용 물품, 의약 및 제조물, 및 인간 또는 다른 동물의 질환의 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방을 위해 이용되려는 임의의 물질 또는 물질의 혼합물; 및 (B) 인간 또는 다른 동물의 신체의 구조 또는 임의의 기능에 영향을 미치려는 물품, 의약 및 제조물(식품 이외의 것); 및 (C) (A) 및 (B)항에서 명시된 임의의 물품의 성분으로서 이용하려는 물품이 모두 포함된다. 용어 "약물", "의약" 또는 "약제"에는 하나 이상의 "제제", "화합물", "물질" 또는 "(화학적) 조성물"을 함유하는 인간 또는 다른 동물에서 이용하려는 제조물의 전체 제형물 및 일부 다른 맥락에서 또한 다른 약학적 불활성 부형제, 예컨대 충전제, 붕해제, 윤활제, 활택제, 결합제 또는 인간 또는 다른 동물의 신체 내의 의도되는 표적 위치, 예로 피부, 위 또는 장에서 "약물", "의약" 또는 "약제"의 용이한 수송, 붕해, 분리, 용해 및 생물학적 이용 가능성을 보장하기 위한 부형제가 포함된다. 용어 "제제", "화합물" 또는 "물질"은 본원에서 상호 교환적으로 이용되며, 보다 특정한 맥락에서 비제한적으로 모든 약리적 활성제, 즉 원하는 생물학적 또는 약리적 효과를 유도하거나 본 발명의 방법에 의해 이러한 가능한 약리적 효과를 유도하는 능력에 대해 연구되거나 평가되는 제제가 포함된다.
"항-류마티스 약물" 및 면역억제 약물의 예에는 클로로퀸, 하이드록시클로로퀸, 미오크리신, 아루라노핀, 설파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 에타네르셉트, 인플릭시맵(+경구 및 피하 메토트렉세이트), 아달리무맵 등, 아자티오프린, D-페니실아민, 금 염(경구), 금 염(근육내), 미노사이클린, 사이클로스포린 A 및 국소 사이클로스포린을 포함하는 사이클로스포린, 타크롤리무스, 미코페놀레이트 모페틸, 사이클로포스파마이드, 스타필로코커스 단백질 A(Goodyear and Silverman J. Exp . Med., 197(2003), 125-39)가 이들의 염 및 유도체 등을 포함하여 포함된다.
"비-스테로이드성 소염 약물" 또는 "NSAID"의 예에는 아스피린, 아세틸살리실산, 이부프로펜 및 이부프로펜 리타드, 페노프로펜, 피록시캄, 플루르바이프로펜, 나프록센, 케토프로펜, 나프록센, 테녹시캄, 베노릴레이트, 디클로페낙, 나프록센, 나부메톤, 인도메타신, 케토프로펜, 메페남산, 디클로페낙, 펜부펜, 아자프로파존, 아세메타신, 티아프로펜산, 인도메타신, 설린닥, 톨메틴, 페닐부타존, 디클로페낙 및 디클로페낙 리타드, 사이클로옥시게나아제(COX)-2 저해제, 예컨대 GR 253035, MK966, 셀레콕시브(CELEBREX®; 4-(5-(4-메틸페닐)-3-(트리플루오로메틸)-lH-피라졸-1-일), 벤젠설폰-아마이드 및 발데콕시브(BEXTRA®), 및 멜록시캄(MOBIC®)이 이들의 염 및 유도체 등을 포함하여 포함된다. 바람직하게는, 이들은 아스피린, 나프록센, 이부프로펜, 인도메타신, 또는 톨메틴이다. 이러한 NSAID는 선택적으로 진통제, 예컨대 코데닌, 트라마돌, 및/또는 디하이드로코디닌 또는 마취약, 예컨대 모르핀과 함께 이용된다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유류"는 그에 대한 진단, 예진, 예방, 또는 치료법이 바람직한 임의의 대상체, 특히 포유류 대상체, 예로 인간 환자를 의미한다.
약학 담체 :
약학적으로 허용 가능한 담체 및 투여 경로는 당분야 숙련가에게 공지된 해당 문헌에서 취할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 당분야에 널리 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다; 예를 들어 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472, Vaccine Protocols. 2nd Edition by Robinson et al., Humana Press, Totowa, New Jersey, USA, 2003; Banga Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems. 2nd Edition by Taylor and Francis. (2006), ISBN: 0-8493-1630-8]을 참고하라. 적합한 약학 담체의 예는 당분야에 널리 공지되어 있고, 인산염 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 수화제, 멸균 용액 등이 포함된다. 이러한 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 통상적 방법에 의해 제형화될 수 있다. 이들 약학 조성물은 적합한 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 적합한 조성물의 투여는 상이한 방식에 의해 실시될 수 있다. 예에는 경구, 비강내, 직장, 국소, 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 피부하, 경피, 경막내, 및 두개내 방법을 통한 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 조성물의 투여가 포함된다. 에어로졸 제형물, 예컨대 비강 분무 제형물에는 보존제 및 등장화제를 함유하는 활성제의 정제된 수성 또는 다른 용액이 포함된다. 이러한 제형은 바람직하게는 비강 점막과 상용성인 pH 및 등장성 상태로 조정된다. 경구 투여를 위한 약학 조성물, 예컨대 단일 도메인 항체 분자(예로, "nanobodies™") 등도 본 발명에서 고려된다. 이러한 경구 제형물은 정제, 캡슐, 분말, 액체 또는 반고체 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체, 예컨대 젤라틴 또는 아쥬반트를 포함할 수 있다. 직장 또는 질 투여를 위한 제형물은 적합한 담체와의 좌약으로 제공될 수 있다; 또한 문헌 [O'Hagan et al. Nature Reviews, Drug Discovery 2(2003), 727-735]를 참고하라. 다양한 유형의 투여를 위해 적합한 제형물에 관한 추가 지침은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)] 및 대응하는 업데이트에서 확인될 수 있다. 약물 전달을 위한 방법의 간략한 리뷰에 대해서는 문헌 [Langer Science 249(1990), 1527-1533]을 참고하라.
투여량 요법:
투여량 요법은 주치의 및 임상적 요인에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 널리 공지된 바와 같이, 임의의 하나의 환자에 대한 투여량은 환자의 체격, 체표면적, 연령, 투여될 특정한 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반 건강 및 동시 투여되는 다른 약물을 포함하는 여러 요인에 의존한다. 전형적인 용량은, 예를 들어 0.001 내지 1000 ㎍(또는 상기 범위의 발현을 위한 또는 그 저해를 위한 핵산)의 범위일 수 있다; 그러나 상기 예시적인 범위 미만 또는 초과 용량이, 특히 상기 언급된 요인을 고려하여 포함된다. 일반적으로, 약학 조성물의 정규적 투여로서의 요법은 1 ㎍ 내지 10 mg 단위/일의 범위여야 한다. 요법이 연속 주입인 경우, 이는 또한 각각 1 ㎍ 내지 10 mg 단위/체중 kg/분의 범위여야 한다. 진행은 주기적 평가에 의해 모니터링될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제조물에는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼이 포함된다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예컨대 올리브 오일, 및 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체에는 식염수 및 완충 매질을 포함하는, 물, 알코올/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 비경구 비히클에는 나트륨 클로라이드 용액, 링거 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 나트륨 클로라이드, 락테이트화 링거, 또는 신전유가 포함된다. 정맥내 비히클에는 유체 및 영양 보충물, 전해질 보충물(예컨대 링거 덱스트로오스에 기반하는 것들) 등이 포함된다. 보존제 및 다른 첨가제, 예를 들어 항균제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 불활성 기체 등이 또한 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 의도되는 용도에 따라, 추가 제제, 예컨대 항종양제 및 세포독성 약물을 포함할 수 있다.
또한, 다른 제제의 공동-투여 또는 순차적 투여가 바람직할 수 있다. 치료적 유효 용량 또는 양은 증상 또는 질병을 완화시키기 충분한 활성 성분의 양을 나타낸다. 이러한 화합물의 치료 유효성 및 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약학 절차, 예로 ED50(집단의 50%에서의 치료 유효 용량) 및 LD50(집단의 50%에 대한 치사 용량)에 의해 결정될 수 있다. 치료 및 독성 효과 간 용량 비가 치료 지수이고, 비, LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 바람직하게는, 조성물 중 치료제는 염증의 예방 또는 면역 반응의 억제를 위해 충분한 양으로 존재한다.
이들 및 다른 구현예가 개시되며, 본 발명의 기재 및 실시예에 의해 포괄된다. 본 발명에 따라 채용될 물질, 방법, 용도 및 화합물의 임의 하나에 대한 추가 문헌은, 예를 들어 전자 장치를 이용해서 공개 라이브러리 및 데이터베이스로부터 검색될 수 있다. 예를 들어 공개 데이터베이스 "PubMed"가 이용될 수 있고, 이는 National Center for Biotechnology Information 및/또는 National Library of Medicine at the National Institutes of Health에 의해 호스팅된다. 추가 데이터베이스 및 웹 주소, 예컨대 European Molecular Biology Laboratory(EMBL)의 일부인 European Bioinformatics Institute(EBI)의 주소는 당분야 숙련가에게 공지되어 있고, 또한 인터넷 검색 엔진을 이용해서 수득될 수 있다. 생물공학에서 특허 정보의 개요 및 후행 검색을 위해 그리고 현재의 인식을 위해 유용한 특허 정보의 관련 원천에 대한 조사는 문헌 [Berks TIBTECH 12(1994), 352-364]에 제공된다.
상기 개시는 본 발명을 일반적으로 설명한다. 몇몇 문헌이 본 명세서의 텍스트를 통해 인용된다. 전체 서지 인용은 청구범위 바로 앞의 명세서 말단에서 확인될 수 있다. 모든 인용된 참고문헌(배경 섹션에서의 개시를 포함하는 본 출원을 통해 인용되는 문헌 참조, 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 및 제조업체의 사양, 지침 등을 포함)의 내용은 본원에 명시적으로 참조로 포함된다; 그러나 인용되는 임의의 문헌이 본 발명에 대해 실제로 선행 문헌이라는 인정은 아니다.
보다 완전한 이해는 예시 목적만을 위해 본원에 제공되는 하기 구체적 실시예에 대한 참조에 의해 수득될 수 있다.
실시예
하기 실시예 1 내지 10 및 대응하는 도 1 내지 18은 본 발명을 추가로 예시하지만, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 통상적 방법, 에컨대 본원에서 채용된 것들의 상세한 설명은 인용되는 문헌에서 확인될 수 있다; 또한 문헌 ["The Merck Manual of Diagnosis and Therapy" Seventeenth Ed. ed. by Beers and Berkow (Merck & Co., Inc., 2003)]을 참고하라. 본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 통상적 기법을 채용할 것이며, 이는 당분야의 기술 수준 내이다.
분자 유전학 및 유전적 조작에서의 방법은 일반적으로 하기 문헌에 기재된다[the current editions of Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al., eds.); 및 Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press). Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al., eds.); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal , A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986)]. 본 개시에서 언급되는 유전적 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터, 및 키트는 상업적 공급업체, 예컨대 BioRad, Stratagene, Invitrogen, Promega 및 Clontech에서 이용 가능하다. 세포 배양 및 배지 수집에서의 일반적 기법은 대규모 포유류 세포 배양(Hu et al. Curr . Opin . Biotechnol. 8(1997), 148); 무혈청 배지(Kitano, Biotechnology 17(1991), 73); 대규모 포유류 세포 배양(Curr. Opin . Biotechnol . 2(1991), 375); 및 포유류 세포의 현탁 배양(Birch et al. Bioprocess Technol . 19(1990), 251)에 개요되어 있다.
실시예 1: 후보 항-IL-20 항체의 LIPS 검정, 클로닝 및 재조합 발현에 의한 환자의 혈청 중 인간 사이토카인 특이적 항체의 검출
유전적 질병 APECED(자가면역 다중내분비병증 1형(APS1)으로도 불리는 자가면역 다중내분비병증 칸디다증 표피 형성이상)를 겪는 환자의 혈청 중 IL-20 항체의 차별적 분석을 위해 LIPS 검정을 이용하였다. IL-20을 N-말단에서 가우시아 루시퍼라아제와 융합시키고, 아래 표 3에 나타낸 프라이머를 이용해서, 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 본 출원인의 국제 출원 WO2013/098419에서 158페이지의 실시예 10 및 165-167페이지의 실시예 15에 기재된 바와 같이 HEK293 세포의 일시적 전달감염에 의해 발현시켰다.
본 프로토콜은 루시퍼라아제 면역침전 시스템(LIPS) 기법에 의한 항체의 검출을 위한 실험 절차를 기재한다.
물질:
* MultiScreen HTS 필터 플레이트, Millipore #MSBVN1B50
* 재조합 단백질 G 아가로오스 비드, Exalpha #X1197
* 완충액 A(50 mM Tris, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1% Triton X-100)
* 루시퍼라아제 검정 시스템, Promega #E1501
* 가우시아 루시퍼라아제 검정 시약, 표적화 시스템 GAR-2B
* Luc-항원(-80℃에서 보관, 농도(LU/ml))
* PBS
하드웨어:
* 회전 진탕기
* MultiScreenHTS 진공 매니폴드, Millipore #MSVMHTS00
* 1450 MicroBeta TriLux 액체 신틸레이션 카운터 & 발광측정계, Perkin Elmer
* Victor X5 Multilabel 플레이트 판독기, Perkin Elmer
* Multichannel 피펫: Biohit 30-300 ㎕
* Eppendorf 원심분리기 5415D
방법:
* 단백질 G 아가로오스를 조심스럽게 재현탁하고, 필요량(1개 플레이트 당 100 ㎕의 배액 배지를 제조하는 대략 200 ㎕ 현탁액)을 취한다. 5분 동안 300 g에서 원심분리하고, 배액된 부피를 확인하고, 완충액 A로 5분 동안 300 g에서 1회 세척한다(3x부피). 25 ㎕의 현탁액이 1 ㎕의 배액된 단백질 G 아가로오스를 함유하도록, 완충액 A 중에 재현탁한다(단백질 G 아가로오스를 보통 필요한 양으로 튜브에 분취하는 것이 유용할 것이다).
* 25 ㎕/웰의 1:100 희석도의 환자 혈청(완충액 A 중 희석됨)을 첨가한다.
* 25 ㎕/웰의 단백질 G 아가로오스 현탁액을 첨가한다.
* 실온에서 1시간 동안 회전 진탕기 상에서 플레이트를 인큐베이션한다.
* 106(5*105) 광량 단위(LU)가 50 ㎕의 완충액 A 중에 첨가되도록 Luc-항원을 희석한다. 50 ㎕/웰의 Luc-항원 희석액을 첨가한다.
* 실온에서 1시간 동안 회전 진탕기 상에서 플레이트를 인큐베이션한다.
* 진공 매니폴드 상에서 플레이트를 세척한다. 각각의 웰을 200 ㎕의 완충액 A로 5회, 이어서 200 ㎕의 PBS로 2회 세척한다. 종이 타월 또는 여과지 적층물을 이용해서 플레이트가 건조되도록 블로팅하여 플레이트 상부 및 하부 상 수분을 확실히 제거한다.
* 가우시아-구축물을 이용해서, 가우시아 기질 10 ㎕/웰을 첨가하고, 2초 동안 진탕한다. 기기 매뉴얼의 지침에 따라 5초 동안 발광을 즉시 판독한다. 초파리-구축물을 이용해서, 루시퍼라아제 기질 20 ㎕/웰을 첨가하고, 2초 동안 진탕한다. 기기 매뉴얼의 지침에 따라 5초 동안 발광을 즉시 판독한다.
그 N-말단에 가우시아 루시퍼라아제를 갖는 IL-20.
유전자 AA 프라이 머 이름 서열 및 서열번호
IL-20 25-176 IL20-F TTTGGATCCTA*CTGAAGACACTCAATTTGGGAAGCTG
(IL20 특이적 26 bp, EcoRI 부위가 인접함), 서열번호 33
IL20-R TTTGCGGCCGC*CTATTCTGTCTCCTCCATCCATTGCA
(IL20 특이적 26 bp, NotI 부위가 인접함), 서열번호 34
신호 서열이 없는 전장 IL-20(25-176 aa)을 pGaussia1(Molecular Pathology, University of Tartu, Estonia) 포유류 발현 벡터(EcoRI 및 NotI 부위 내로)를 이용해서 IL-20 N-말단에서 가우시아 루시퍼라아제 유전자와의 융합물로 클로닝하였다. HEK 293 세포로의 전달감염 후, 세포 배양 상청액을 루시퍼라아제-기반 면역침전 검정에서 항원으로서 이용하였다.
APS1-1 내지 APS1-30의 코드로 나타내는 30명 환자로부터의 혈청을 모두 함께 검정에서 이용하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 환자 APS1-9로부터의 혈청이 가장 높은 항-IL-20 항체 역가를 드러내었다. 따라서, 환자 APS1-9를 후보 항-IL-20 항체의 클로닝을 위한 기억 B 세포의 원천으로서 이용하였다. 언급되는 국제 출원에서 구체적으로 이용된 IL-17 및 IL-22 대신, 단리되고 분석된 항체의 특이성이 본원에서 상기 및 하기 정의된 바와 같이 IL-20에 대해 유도되었다는 차이를 가지고, 국제 출원 WO 2013/098419 및 WO 2013/098420에 기재된 바와 같이 기억 B 세포 단리, 배양 및 항체 단리를 수행하였다; 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 WO 2013/098419의 실시예 섹션, 특히 117 내지 120페이지의 실시예 1 및 2 및 168-171페이지의 실시예 17 및 WO 2013/098420의 27 내지 31페이지의 실시예 1 내지 4를 참고하라.
실시예 2: 후보 항-IL-20 항체의 EC50 ELISA 결정
본 발명의 인간 항체의 분자 클로닝 및 후속 항체 생산 및 정제를 국제 출원 WO 2013/098419에 기재된 바와 같이 수행하였으며, 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 출원의 실시예 섹션, 특히 여기에서의 117-120페이지의 실시예 1 내지 3을 참고하라. 가우시아 루시퍼라아제를 갖는 인간 IL-20의 융합 단백질(g1 IL-20 및 g2 IL-20)에 대한 예시적인 본 발명의 항-IL-20 항체의 EC50 결합을 GLuc-샌드위치 ELISA에 의해 결정하였다. 플레이트를 항-Gluc Ab(1 ㎍/ml)로 코팅하고, Gluc 항원을 결합시키고, MAB의 연속 희석물을 2 h 동안 결합시켰다. 이후 플레이트를 세척하고, MAB의 결합을 항-인간 HRP-접합 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, Europe Ltd., Cambridgeshire, UK)로 검출하였다. 각각의 항원에 대해 절반 최대 결합을 생성하는 MAB의 농도(EC50, ng/ml)를 log 농도 대 OD 450 nm 측정의 도시에 의해 수득되는 시그마형 용량-반응 곡선(가변 경사, 4개 파라미터) 상에서 Prism 4 GraphPad 소프트웨어를 이용해서 계산하였으며, 그 결과는 하기의 도 3 및 표 4를 참고하라.
g1 IL-20 및 g2 IL-20에 대한 MAB 결합의 EC50 값의 요약.

EC50(ng/ml)
2A11 6E11 6H2 7D1 20A10
g1 IL-20 9.8 128 8548 5868 18.6
g2 IL-20 6.5 347 42.2 27.1 21.0
MAB 2A11, 6E11, 6H2, 7D1 및 20A10은 g1 IL-20 및 g2 IL-20에 결합하지 않았다. MAB 7D1은 매우 고농도에서만 g1 IL-20에 결합하여 EC50 결합이 5 ㎍/ml을 초과함을 시사하였다.
실시예 3: 인간-유래 항-IL-20 모노클로날 항체가 재조합 IL-20 및 IL-20 수용체 매개 STAT3 활성화를 중화함
연구되는 사이토카인에 반응하는 세포주로 중화 검정을 수행한다. 일반적으로 수용체에 대한 리간드 결합은 대응하는 신호전달 경로, 전사 인자의 핵으로의 전위를 활성화하고, 반응인자 유전자 전사, 번역 및 가능한 경우 산물 분비를 상향 조절한다. 이용되는 사이토카인 농도는 검정의 감수성을 최대화하기 위해 용량-반응 곡선의 선형 부분 시작부로부터 선택한다. 항체의 중화능을 평가하기 위해, 최적 농도의 표적 사이토카인을 혈청, 상청액 또는 정제된 항체 샘플의 연속 희석물과 사전 인큐베이션한다. 결과를 양성 및 음성 대조군 사이의 절반 값을 나타내는 항체의 농도 또는 역가로 표현한다.
제1 실험 세트에서, 인간-유래 항-IL-20 모노클로날 항체로 I형 및 II형 IL-20 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포에서 재조합 IL-20-매개 STAT3 활성화에 대한 이들의 중화 활성을 평가히기 위한 인산-STAT3 검정을 거쳤다(도 4).
인산- STAT3 검정
20,000개 HEK 293T MSR 세포(Cat. No. R79507, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 96-웰 조직 배양 플레이트(Corning Inc., Corning, NY, USA) 내로 씨드접종하였다. 다음 날, 세포에 IL20RA-Myc-DDK 및 IL20RB-Myc-DDK(I형 IL-20 수용체; Cat. No. RC212546 및 RC213197, OriGene, Rockville, MD, USA) 또는 IL22RA(Cat. No. SC322566, OriGene) 및 IL20RB-Myc-DDK 발현 플라스미드(II형 IL-20 수용체)를 공동-전달감염시켰다. 전달감염 다음 날, 재조합 IL-20을 항-IL-20 mAb 또는 대조군 IgG와 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 사전-인큐베이션하였다. 사전-인큐베이션 후, 혼합물을 이용해서 37℃에서 40분 동안 IL-20 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포를 자극하였다. 자극 후, 세포를 프로테아제 및 포스파타아제 저해제(Cat. No. C2978, P5726, P0044, P8340, SIGMA-ALDRICH, St. Louis, MO, USA)가 보강된 CelLytic™ M 용해 완충액으로 용해시키고 수집된 용해물을 테이블탑 원심분리기에서 13,000 RPM, 4℃에서 청정화하였다. 용해물로 환원성 SDS-PAGE를 거치고 니트로셀룰로오스 막 상으로 블로팅하였다. 실온에서 1시간 동안 0.25% 소 젤라틴, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl pH 7.5, 0.05% Triton X-100을 함유하는 완충액으로 막을 차단한 뒤, 하룻밤 동안 4℃에서 인산화된 STAT3(Tyr705, 차단 완충액 중 1:2000 희석됨, Cat. No. 9145, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 또는 알파-튜불린(1:2500 희석됨, Cat. No. 2125, Cell Signaling Technology)에 대한 토끼 모노클로날 항체와 인큐베이션하였다. 다음 날, 블롯을 차단 완충액으로 3회 세척한 뒤 토끼 IgG에 대한 홀스래디쉬 퍼옥시다아제-결합 2차 항체(차단 완충액 중 1:20,000 희석됨, Cat. No. 111-035-144, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)와 인큐베이션하였다. 3회의 추가 세척 단계 후, ECL 기질을 첨가하고(Cat. No. 34087, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) 반응성 밴드를 방사선 촬영을 통해 가시화하였다. 결합된 항체를 Restore 웨스턴 블롯 박리 완충액(Cat. No. 21059, Thermo Fisher Scientific) 중 인큐베이션에 의해 제거하고, 토끼 모노클로날 항-STAT3 혈청을 이용해서 전체 STAT3 수준을 가시화하였다(1:1000 희석됨, Cat. No. 12640, Cell Signaling Technology). IL-20 수용체 서브유닛의 발현을 마우스 모노클로날 항-DDK 혈청(1:1000 희석됨, Cat. No. TA50011, OriGene) 및 IL-20RA 및 IL-22RA에 대한 토끼 폴리클로날 혈청(각각 1:500 및 1:1000 희석됨, Cat. No. 06-1073 및 06-1077, Millipore, Billerica, MA, USA)을 이용해서 가시화하였다.
중화 검정에서 이용되는 재조합 단백질(인터류킨)의 목록.
단백질 제공업체 Cat. No.
rhIL-20 R&D Sysmtems 1102-IL/CF
rmIL-20 R&D Sysmtems 1204-ML/CF
g2 IL-22 인간 IL-22와 가우시아 루시퍼라아제의 융합 단백질
g1 IL-20 인간 IL-20과 가우시아 루시퍼라아제의 융합 단백질
대조군으로서, rhIL-20 및 rmIL-20은 I형 또는 II형 IL-20 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포에서 STAT3의 용량-의존적 인산화를 유도한다. 전체 및 인산화된 STAT3 및 IL-20RB-Myc-DDK 수준의 검출(도 4a).
도 4b에 나타낸 바와 같이, 항체 20A10 및 7D1뿐만 아니라 2A11은 가장 강력한 중화 항체이다. 그러나, 이는 부분적으로, 예를 들어 6E11이 항체 7D1에 비해 더 높은 결합 친화도를 나타내고 항체 2A11이 항체 7D1에 비해 실질적으로 더 우수하게 수행하는 실시예 2에서 수득되고 도 3에 나타낸 결과로부터 예상될 수 있는 것과는 대조적이다.
다음으로, pSTAT3 웨스턴 블롯 검정에서 rmIL-20에 대한 20A10의 적정을 수행하였다. I형 IL-20 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포를 미처리 상태로 놔두거나 항체의 부재(-) 또는 나타낸 바와 같은 예시적인 항체 20A10의 존재(+) 하에 25 ng/ml rmIL-20으로 자극하였다(도 6a). 세포 용해물로 SDS-PAGE를 거치고 pSTAT3 수준을 웨스턴 블롯에서 가시화하였다. 전체 STAT3 수준이 로딩 대조군으로 작용한다. 용량-반응 곡선을 도시하고 IL-20 활성의 역전에 대한 IL-20 항체 20A10의 적정을 조사함으로써, I형 IL-20 수용체에 결합하는 rmIL-20에 대한 MAb 20A10의 높은 중화 활성을 뒷받침하는 1,867 ng/ml의 IC50이 계산되었다(도 6b).
실시예 4: 인간-유래 항-IL-20 모노클로날 항체가 KZ136- NLuc 리포터 유전자의 rhIL -20 및 IL-20 수용체 매개 유도를 중화함
상기 실시예 2에서 수득되고 도 3에 나타낸 후보 항-IL-20 항체의 EC50 ELISA 결정 결과, 및 실시예 3에서 수득되고 도 4b에 나타낸 인산-STAT3 검정 결과의 불일치의 관점에서, IL-20 수용체의 IL-20-매개 유도의 중화에서 후보 항-IL-20 항체 7D1, 20A10 및 2A11의 유효성을 검증하기 위해, KZ136-NLuc 리포터 중화 검정을 구축하였다.
KZ136- NLuc 리포터 검정
KZ136- NLuc 리포터 구축물의 생성
Poulsen 및 동료들에 의해 최초 기재된 바와 같은 KZ136 리포터 구축물(Poulsen et al., Signal Transduction via the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway Induced by Binding of Coagulation Factor VIIa to Tissue Factor, JBC, 1998)은 c-fos 프로모터 단편(뉴클레오타이드 649-747, GenBankTM 접근 번호 K00650)이 선행하는 유도성 초파리 루시퍼라아제를 인코딩한다. 바로 상류에서, 구축물은 혈청 반응 요소와 함께, c-fos, p21WAF1, β-카제인, 및 Fcg RI 유전자의 4개 STAT 결합 요소를 특징으로 한다. 원래 KZ136 구축물을 일차적으로 안정한 세포주의 생성을 위해 이용하였다. 본원에 기재되는 KZ136-NLuc 리포터는 상당히 더 밝은 Nano 루시퍼라아제를 인코딩하며 일시적인 공동-전달감염 실험을 위해 적합하다. NheI 및 XhoI 제한 부위가 인접하는 KZ136 프로모터 서열을 함유하는 구축물을 유전자 합성을 통해 생성하였다. KZ136 프로모터 서열을 NheI 및 XhoI 이중 제한에 의해 절제한 뒤, 동일한 제한 효소로 소화시킨 Nano 루시퍼라아제-인코딩 pNL2.1 표적 벡터(Cat. No. N1061, Promega) 내로 결찰하였다(도 5a의 구축 방식 참고).
KZ136- NLuc 리포터 중화 검정
10,000개 HEK 293T MSR 세포를 백색 절반 면적 96-웰 조직 배양 플레이트(Cat. No. 3688, Corning Inc.)에 씨드접종하였다. 다음 날, 세포를 Fugene HD(Cat. No. E2311, Promega, Madison, WI, USA)를 이용해서 20 ng의 KZ136-Nano 루시퍼라아제 리포터 및 80 ng IL-20 수용체 구축물로 공동-전달감염시켰다. 전달감염 다음 날, 세포를 37℃에서 1시간 동안 사전-인큐베이션한 항-IL-20 mAb 또는 대조군 인간 IgG(huIgG)를 포함하거나 포함하지 않고 120 ng/ml 재조합 인간(rh) IL-20(도 5c, d) 또는 200 ng/ml 재조합 마우스(rm) IL-20(도 5e)의 혼합물을 함유하는 배지로 24시간 동안 자극하였다. 24시간 자극 후, 루시퍼라아제 검정을 제조업체의 지침에 따라 발색시켰다(Cat. No. N1130, Promega).
대조군으로서 rhIL-20 및 rmIL-20은 I형 IL-20 수용체 및 KZ136-NLuc으로 일시적으로 전달감염된 HEK 293T MSR 세포에서 KZ136-NLuc 리포터 구축물을 유도한다(도 5b). rhIL-20(도 5c, d) 또는 rmIL-20(도 5e)을 이용한 KZ136-NLuc 리포터 검정에 의한 예시적인 인간-유래 IL-20 mAb 20A10, 7D1 및 2A11의 IC50 분석. 결과를 도 5f에 요약하여 20A10의 IL-20 중화능을 나타낸다. 인산-STAT3-검정(도 4b)에서 이미 나타난 바와 같이, 항체 20A10은 I형 IL-20 수용체에 결합하는 rhIL-20에 대해 더 높은 유효성을 갖는 항체 7D1 및 2A11에 비해 가장 높은 중화능을 나타내었다(도 5f, 왼쪽 열).
실시예 5: 인간-유래 항-IL-20 모노클로날 항체가 화학발광 세포성 결합 검정에서 IL-20 수용체에 대한 IL-20의 결합을 중화함.
LIPS 검정이 길항, 즉 후보 항체의 중화 활성을 예상하지 않았으므로, 리간드에 대해 유도된 후보 항체가 세포 상에서 각각의 수용체(들)에 결합하는 그 능력을 방지하는지 여부의 결정에서 이용하기 위해 관련 수용체(들)를 발현하는 세포에 대한 관심 리간드의 결합을 평가하기 위한 새로운 검정을 본 발명에 따라 개발하였다.
도 7a에 예시된 바와 같이, 본 발명의 신규한 방법에 따라 관심 리간드를 표지하고, 리포터를 포함하는 융합 단백질, 즉 루시퍼라아제 융합 단백질, 예컨대 가우시아 루시퍼라아제로서 제공한다. 리간드의 세포성 결합을 세포-연관 리포터, 즉 루시퍼라아제 활성에 의해 측정한다. 상기 검정은 리간드에 대해 유도된 항체가 세포 상에서 각각의 수용체에 결합하는 그 능력을 방지하는지 여부의 평가를 허용한다(도 7g 및 7h).
중화 검정에서 이용되는 재조합 단백질의 목록(전체 단백질).
단백질 제공업체 Cat. No.
rhIL-20 R&D Systems 1102-IL/CF
rmIL-20 R&D Systems 1204-ML/CF
rhIL-22 ImmunoTools 11340227
rhIFNA2b ImmunoTools 11343516
rhIL-32γ R&D Systems 4690-IL/CF
g1 IFNA2, A4, A5, A6, A7, A8, A10, A14, A16, A17, A21, B, W 인간 IFN와 가우시아 루시퍼라아제의 융합 단백질
g2 IL-22 인간 IL-22와 가우시아 루시퍼라아제의 융합 단백질
g1 IL-20 인간 IL-20과 가우시아 루시퍼라아제의 융합 단백질
g1 IFNW 인간 IFNW와 가우시아 루시퍼라아제의 융합 단백질
먼저, 인간-유래 항-IFN-알파 모노클로날 항체를 단리하고, 발광 세포 결합 검정(LCBA)에서 수용체 결합 및 인간 IFN과 가우시아 루시퍼라아제의 융합 단백질의 중화를 위해 적합함을 증명하였다. 예시적인 항-IFN-알파 항체 및 IFNA 서브타입 및 분자의 상세한 설명에 대해서는 그 개시 내용, 특히 IgG1, 카파, IFNA, 예로 IFNA2, -4 및 -14를 인식하는 항체 5D1, 13B11, 19D11, 25C3, 및 31B4뿐만 아니라 IFNA 서브타입에 더하여 IFNW(인터페론 오메가)를 효과적으로 인식하는 항체 26B9 및 8H1의 가변 및 불변 영역(VH, VL, CH, CL) 영역의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열뿐만 아니라 IFNA 서브타입 분자의 원천을 포함하는 이들의 기능적 특성규명을 개시하는 실시예 1 내지 9, 표 1 및 도 1이 본원에 참조로 포함되는 본 출원인의 공동 계류 중인 국제 출원 WO2015/001013을 참고하라. 가우시아-루시퍼라아제-IFN-융합물 및 가우시아-루시퍼라아제-IL-22-융합 구축물의 클로닝을 위해 이용되는 프라이머 서열에 대해서는 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는, 2013년 7월 04일에 공개된 본 출원인의 국제 출원 WO 2013/098419를 참고하라.
인터페론(들)- 가우시아 루시퍼라아제
30,000개 HEK 293T MSR 세포를 백색 절반 면적 96-웰 조직 배양 플레이트(Cat. No. 3688, Corning Inc.)에 씨드접종하였다. 다음 날, 인간 IFN-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질을 일시적으로 발현하는 HEK 293T 세포의 상청액을 항-IFN mAb, 대조군 IgG 또는 과량 농도의 표지되지 않은 재조합 IFNA2와 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 사전 인큐베이션 후, 혼합물을 이용해서 HEK 293T MSR 세포를 37℃에서 40분 동안 자극하였다. 결합 시, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 제조업체의 지침(Cat. No. 16159, Thermo Fisher Scientific)에 따라 가우시아 Flash 검정 키트를 이용해서 발색시켰다.
도 7g에 나타낸 상기 실험의 결과는 HEK 293T MSR 세포에 대한 IFNA5-가우시아 루시퍼라아제-융합 단백질(g1 IFNA5)의 결합이 표지되지 않은 재조합 인간(rh) IFNA2(3 ㎍/ml)에 의해 및 예시적인 인간-유래 모노클로날 IFN 항체 19D11(1.7 ㎍/ml)에 의해 저해됨을 나타낸다. 또한, HEK 293T MSR 세포에 대한 g1 IFNA2, A4, A5, A6, A7, A8, A10, A14, A16, A17 및 A21 융합 단백질의 결합은 예시적인 인간-유래 모노클로날 IFN 항체 19D11에 의해 저해된다. 대조적으로, g1 IFNB 및 W의 결합은 19D11에 의해 영향받지 않으며 모든 g1 IFN의 결합은 대조군 인간 항체(huIgG)에 의해 영향받지 않는다(도 7h). 항체 농도: 5 ㎍/ml.
다음으로, 인간-유래 IL-22 모노클로날 항체를 단리하고, 발광 세포 결합 검정(LCBA)에서 수용체 결합 및 인간 IL-22와 가우시아 루시퍼라아제의 융합 단백질의 중화를 위해 적합함을 증명하였다. 예시적인 항-IL-22 항체 및 분자의 상세한 설명에 대해서는 그 개시 내용이 본원에 참조로 포함되는 본 출원인의 국제 출원 WO 2013/098419를 참고하라.
IL-22- 가우시아 루시퍼라아제
COLO 205 결장직장 암종 세포를 제조업체의 지침(Cat. No. 15040-066, Invitrogen)에 따라 Versene으로 탈착시키고 PBS로 2회 세척하였다. 8x105개 세포를 웰 당 200 ㎕의 COLO 205 완전 배양 배지(RPMI 1640 GlutaMAX, 10% 소 태아 혈청, 각각 Cat. No. 61870-044 및 10109155, Invitrogen)로 1시간 동안 차단한 V-형 바닥 96-웰 플레이트(Cat. No. 24957, Thermo Fisher Scientific) 내로 옮겼다. 인간 IL-22-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질을 일시적으로 발현하는 HEK 293T 세포의 상청액을 항-IL-22 mAb, 대조군 IgG 또는 과량 농도의 표지되지 않은 재조합 IL-22과 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 사전-인큐베이션하였다. 사전-인큐베이션 후, 혼합물을 이용하여 V-형 바닥 96-웰 플레이트에서 37℃에서 1시간 동안 COLO 205 세포를 자극하였다. 결합 시, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 가우시아 루시퍼라아제 검정을 제조업체의 지침(Cat. No. 16159, Thermo Fisher Scientific)에 따라 가우시아 Flash 검정 키트를 이용하여 발색시켰다. 루시퍼라아제 기질의 첨가 전에 세포를 용해시키거나 용해시키지 않았다.
인간 IL-22-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질은 COLO 205 세포에 특이적으로 결합한다. 세포를 저해제의 부재(-) 또는 나타낸 바와 같은 경쟁적 저해제의 존재 하에 IL-22-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질(g2 IL-22)을 발현하는 HEK 293T 세포의 상청액과 인큐베이션하였다. 도 14a에 나타낸 상기 실험의 결과는 COLO 205 세포에 대한 g2 IL-22의 결합이 표지되지 않은 rhIL-22에 의해 저해되고 비관련 rhIFNA2에 의해서는 저해되지 않음을 나타낸다. COLO 205 세포를 저해제의 부재 또는 나타낸 바와 같은 표지되지 않은 rhIL-22 또는 rhIFNA2(각각 1 ㎍/ml)의 존재 하에 HEK 293T 세포의 g2 IL-22-함유 상청액과 인큐베이션하였다. 광 출력을 기록하기 전에 세포를 용해시키거나 용해시키지 않았다. 도 14b는 COLO 205 세포에 대한 g2 IL-22의 결합이 예시적인 인간-유래 IL-22 모노클로날 항체 30G1에 의해 용량-의존적 방식으로 저해됨을 나타낸다. 결합은 대조군 인간 항체(huIgG)에 의해서는 영향받지 않는다.
세 번째로, LIPS 검정이 후보 항체의 길항, 즉 중화 활성을 예상하지 않았으므로, 리간드에 대해 유도된 후보 항체가 세포 상에서 각각의 수용체(들)에 결합하는 그 능력을 방지하는지 여부의 결정에서 이용하기 위해 관련 수용체(들)를 발현하는 세포에 대한 관심 리간드의 결합을 평가하기 위한 새로운 검정을 본 발명에 따라 개발하였다.
상기 이유로, 먼저 두 수용체(들), 즉 I형 및 II형 IL-20 수용체뿐만 아니라 리포터로 표지된 리간드, 즉 IL-20-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질이 검정에서 생물학적으로 활성인지 여부를 연구하기 위해 실시예 3에 기재된 인산-STAT3 검정을 적용하였다. 도 7c 및 7d에 나타낸 바와 같이, IL-20-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질(g1 IL-20)은 기능적으로 활성이다. 세포를 g1 IL-20 상청액의 연속 희석물 또는 대조군 배지(NC)와 인큐베이션하였다. 웨스턴 블롯에서 전체 및 인산화된 STAT3, IL-20RB-Myc-DDK, IL-20RA-Myc-DDK 및 IL-22RA(RA 서브유닛)의 검출(도 7a). 대조군으로서, IL-20 융합 단백질이 Il-20 수용체 I형의 두 서브유닛을 모두 발현하는 HEK 293T MSR 세포에 특이적으로 결합하는 것으로 나타난다(도 7d). 결합은 표지되지 않은 rhIL-20(3 ㎍/ml)에 의해 폐지된다. 따라서, IL-20-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질을 함유하는 HEK 293T의 상청액은 I형 및 II형 IL-20 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포에서 STAT3을 특이적으로 활성화한다.
따라서, 리간드 및 리간드-결합 도메인의 결합 특징은 생체내의 특징을 실질적으로 모방할 것으며, 그 이유로 본 발명의 검정으로 확인되고 수득되는 활성화제 및 길항제는 생체내에서도 생물학적으로 활성일 것으로 예상하는 것이 신중하다.
다음 단계로서, 후보 항체로 이들의 중화 활성을 평가하기 위한 화학발광 세포성 결합 검정을 거쳤다.
화학발광 세포성 결합 검정
IL-20 화학발광 세포성 결합 검정을 위해, 10,000개의 HEK 293T MSR 세포를 백색 절반 면적 96-웰 조직 배양 플레이트(Cat. No. 3688, Corning Inc.)에 씨드접종하였다. 다음 날, 세포에 IL20RA-Myc-DDK 및 IL20RB-Myc-DDK(I형 IL-20 수용체; Cat. No. RC212546 및 RC213197, OriGene, Rockville, MD, USA) 또는 IL22RA(Cat. No. SC322566, OriGene) 및 IL20RB-Myc-DDK 발현 플라스미드(II형 IL-20 수용체)를 공동-전달감염시켰다. 전달감염 다음 날, 인간 IL-20-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질을 일시적으로 발현하는 HEK 293T 세포의 상청액을 항-IL-20 mAb, 대조군 IgG 또는 과량 농도의 표지되지 않은 재조합 IL-20과 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 사전-인큐베이션하였다. 사전-인큐베이션 후, 혼합물을 이용하여 IL-20 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포를 37℃에서 30분 동안 자극하였다. 결합 시, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 가우시아 루시퍼라아제 검정을 제조업체의 지침(Cat. No. 16159, Thermo Fisher Scientific)에 따라 가우시아 Flash 검정 키트를 이용하여 발색시켰다.
도 7e 및 7f에 나타낸 바와 같이, 세포성 결합 검정에서 관찰된 효과는 실시예 3 및 4뿐만 아니라 도 4 내지 6에서 후보 항체에 대해 관찰되는 중화 활성의 수준을 밀접하게 반영한다. 대조군으로서, I형 IL-20 수용체를 발현하는 HEK 293T MSR 세포에 대한 g1 IL-20의 결합은 rhIL-20, rmIL-20 및 예시적인 인간-유래 IL-20 모노클로날 항체 20A10에 의해 용량-의존적 방식으로 저해된다(도 7e). 결합은 비관련 rhIL-32γ 및 대조군 인간 IgG(huIgG)에 의해서는 영향받지 않는다. 예시적인 항-IL-20 항체 2A11, 20A10 및 7D1은 I형 및 II형 IL-20 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포에 대한 g1 IL-20의 결합을 중화한다. 표지되지 않은 rhIL-20(1 ㎍/ml)이 양성 대조군으로 작용한다. 항체 농도: 5 ㎍/ml(도 7f). 인산-STAT3 검정(실시예 3) 및 KZ136-NLuc 리포터 중화 검정(실시예 4)에서의 결과와 일관되게, 항-IL-20 항체 20A10이 가장 높은 저해, 즉 중화 활성을 나타낸 반면, MAb 2A11 및 7D1은 I형 및 II형 IL-20 수용체 둘 다에 결합하는 g1 IL-20의 약간 더 약한 중화능만을 나타내었다. 대조적으로, 항-IL-20 항체 6E11은 I형에 결합하는 g1 IL-20의 온건한 중화능을, 그러나 II형 IL-20 수용체에 대한 중화능의 부재를 드러내었다. MAb 6H2에 대해서는 중화능의 부재 또는 큰 감소를 관찰할 수 있었다.
따라서 본 발명의 신규한 세포성 리간드 수용체 결합 검정은 다른 경우 추가로 추구되거나 최초 확인되지 않았을 수 있는 치료적으로 유용한 항체의 확인 및 수득을 크게 단순화하는, 후보 화합물, 특히 항-리간드 항체의 생물학적, 즉 중화 활성을 예상하기 위한 신뢰할 수 있는 수단을 제공한다.
실제로, 화학발광 세포성 결합 검정에서 인간-유래 항-IL-20 모노클로날 항체의 추가 IC50(최소 절반(50%) 저해 농도) 분석은 예시적인 IL-20 항체 20A10, 7D1 및 2A11(도 8)에 의한 IL-20의 효과적인 중화능을 나타내었다. 이를 위해, I형 또는 II형 IL-20 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포를 나타낸 바와 같은, 인간-유래 IL-20 모노클로날 항체 도 8a: 20A10, b: 7D1 및 c: 2A11의 존재 하에 g1 IL-20 상청액과 인큐베이션하였다. 도 8d는 예시적인 항체 20A10, 7D1 및 2A11의 IC50값을 요약하여, 항-IL-20 항체 20A10이 가장 높은 중화 활성을 나타낸 인산-STAT3 검정(실시예 3) 및 KZ136-NLuc 리포터 중화 검정(실시예 4)에 의해 수득되는 데이터를 뒷받침한다. MAb 2A11은 20A10보다 약간 더 약한 중화능만을 나타내었다. 대조적으로, MAb 7D1은 I형 또는 II형 IL-20 수용체에 대한 g1 IL-20 결합을 저해하기 위해 가장 높은 IC50을 필요로 하는 것으로 보인다.
실시예 6: 인간-마우스 키메라 구축물과의 교차-경쟁 및 항-IL-20 항체 20A10, 2A11, 7D1 및 6E11의 교차-반응성
상이한 결합 부위의 수를 결정하기 위해, 별도 항원 결합 부위에 대한 항-IL-20 MAB의 차별적 결합을 조사하였다. 상기 목적을 위해, MAB를 인간(hMAB) 또는 마우스(hmMAB) Fc와 함께 발현시키고 GLuc 샌드위치 ELISA에 의해 교차-경쟁 실험을 수행한다. GLuc-Il20을 사전-코팅된 토끼 항-GLuc 항체에 의해 포획한다. 큰 과량의 인간 MAB의 존재 하 hmMAB의 결합을 1차 항체의 Fc 부분에 대해 유도된 HRP-접합 2차 항체에 의해 검출한다(도 9a의 실험 설정 방식을 참고하라).
방법:
96 웰 마이크로플레이트(Costar, USA)를 PBS 중 1/250 희석된 토끼 항-GLuc 항체(NEB, E8023S), 30 ㎕/웰로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T로 세척하고, 2% BSA(Sigma, Buchs, Switzerland) 함유 PBS로 실온에서 1 h 차단하였다. 30 ㎕ GLuc-IL-20을 최종 농도 2x106 LU/웰로 첨가하고 실온에서 2 h 동안 인큐베이션하였다. 키메라 항체를 인간 경쟁인자 항체와 30 ㎕ PBS 중에 최종 농도 0.5 ㎍/ml 대 3 ㎍/ml로 사전 혼합하고, 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 2 h 동안 인큐베이션 시, 플레이트를 PBS-T로 세척하고 인간-마우스 키메라 항체의 결합을 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 접합 염소 항-마우스 IgG Fc-감마 특이적 항체(Jackson Immuno Research, 1:500, 0.5% BSA-PBS 중)를 이용하여 결정한 후 TMB 기질 용액(Sigma, Buchs, Switzerland)을 이용하여 HRP 활성을 측정하였다.
아래의 도 9b-f 및 표 7에서 알 수 있듯이, 키메라 항-IL-20 항체 20A10(hm), 2A11(hm) 및 6E11(hm)은 이들의 인지체 인간 대응물과만 경쟁하여, 각각의 인간-유래 항-IL-20 항체 20A10, 2A11 및 6E11이 IL-20의 상이한 결합 부위(들)를 인식함을 시사한다. 대조적으로, 키메라 항-IL-20 항체 7D1(hm)은 그 인간 대응물뿐만 아니라 인간-유래 IL-20 항체 6H2와도 경쟁하여, 이들 항체의 에피토프가 부분적으로 중복될 수 있음을 시사한다.
그러나 실시예 3-5에서의 기능적 검정의 관점에서 그리고 도 4b, 7f 및 8d에 나타낸 바와 같이, 항체 7D1은 IL-20 활성을 효과적으로 중화하는 것으로 보인다. 따라서, 항체 7D1 및 6H2의 에피토프가 동일하지는 않지만 중복되거나, 항체가 입체 장애로 인해 IL-20에 대한 결합을 방해하는 것으로 추정된다.
특히 결합 친화도/특이성 및 중화 활성 간 상관성의 부재를 나타내는 본 발명에 따라 수행된 실험의 관점에서, 본 발명의 신규한 세포성 리간드-결합 검정이 치료적 이용을 위한 항-IL-20 항체의 선택 및 제공에서 유용하고 필수적임은 명확하다. 그럼에도 불구하고, IL-20 활성을 효과적으로 중화하지 않는 것으로 보이는 본 발명의 IL-20 항체도, 예를 들어 진단적 적용에서 유용하다.
본 발명의 예시적인 항체의 교차-경쟁 실험 결과.
g2 IL-20
 인간 MAB 경쟁인자
2A11 6E11 6H2 7D1 20A10


hm-MAB

 2A11 +++++ - - - -
6E11 - +++++ - - -
6H2 - - +++++ +++++ -
7D1 - - +++++ +++++ -
20A10 - - - - +++++
인간 MAB(hMAB)를 마우스 Fc를 갖는 MAB(hmMAB)의 첨가 전에 각각의 항원으로 코팅된 플레이트에 크게 과량으로 첨가하였다.
또한, 마우스 및 인간 IL-20에 대한 본 발명의 예시적인 인간-유래 항-IL-20 모노클로날 항체 6E11, 2A11 및 20A10의 결합을 연구하여 GLuc-샌드위치 ELISA에 의한 마우스 및 인간 IL-20 에피토프에 대한 교차-반응성을 결정하고 비교하였다(도 10a의 실험 설정 방식을 참고하라).
방법:
96 웰 마이크로플레이트(Costar, USA)을 PBS 중 1/250 희석된 토끼 항-GLuc 항체(NEB, E8023S), 30 ㎕/웰로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 플레이트를 PBS-T로 세척하고, 2% BSA(Sigma, Buchs, Switzerland)를 함유하는 PBS로 실온에서 1 h 동안 차단하였다. 30 ㎕ GLuc-IL-20을 최종 농도 2x106 LU/웰로 첨가하고 실온에서 2 h 동안 인큐베이션하였다. 경쟁인자 항원인 재조합 인간 IL-20 및 재조합 마우스 IL-20을 10 ㎍/ml 내지 4.6 ng/ml 범위의 연속 희석물로 평가될 항체(고정 농도 1 ㎍/ml)에 대해 적정하였다. 30 ㎕/웰의 혼합물을 실온에서 1.5 h 동안 웰에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T로 세척하고, 경쟁인자의 존재 하에 관심 항원에 대한 인간 IgG의 결합을 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 접합 염소 항-인간 IgG Fc-감마-특이적 항체(Jackson ImmunoResearch, Europe Ltd., Cambridgeshire, UK)를 이용해서 결정한 뒤 TMB 기질 용액(TMB, Sigma, Buchs, Switzerland)을 이용해서 HRP 활성을 측정하였다.
도 10b-d에 나타낸 바와 같이, 인간 IL-20은 g2 IL-20에 대한 모든 평가된 항-IL-20 항체의 결합을 저해할 수 있다. 쥐과 IL-20은 6E11을 제외하고, g2 IL-20에 대한 모든 평가된 항-IL-20 항체의 결합을 저해할 수 있다. 따라서 예시적인 항-IL-20 항체 2A11 및 20A10은 종 교차-반응성을 나타내는 반면, MAb 6E11은 hIL-20만 인식한다. 그러나 실시예 3-5에서의 기능적 검정의 관점에서 그리고 도 4b에 나타낸 바와 같이, 항체 2A11은 mIL-20의 중화에서 MAb 20A10만큼 효과적이지 않다. 2A11은 강력한 결합물질이지만, IL-20 및 그 수용체 간 상호작용에 관여되지 않는 IL-20 영역을 명백히 인식한다. 2A11 및 7D1은 rhIL-20을 약하게 중화하지만, GLuc IL-20의 더 우수한 중화를 나타낸다. 상기 결과는 특히 결합 친화도/특이성 및 중화 활성 간 상관성의 부재를 추가로 나타낸다. 본 발명의 신규한 세포성 리간드-결합 검정이 치료적 이용을 위한 항-IL-20 항체의 선택 및 제공에서 유용하고 필수적임은 명확하다. 그럼에도 불구하고, IL-20 활성을 효과적으로 중화하지 않는 것으로 보이는 본 발명의 IL-20 항체도, 예를 들어 진단적 적용에서 유용하다.
실시예 7: 대상 항체의 검증
본 발명에 의해 제공되는 항체를 동물 질환 모델에서 인간 IL-20에 대한 이들의 중화 활성에 관해 평가한다. 이러한 실험을 수행하는 경우, 인간 IL-20이 마우스에서 이환 표현형을 유도하고 평가되는 본 발명의 IL-20 항체 및 쥐과 IL-20 동족체 간 교차-반응이 일어나지 않음을 확인해야 한다. 선행 기술에서 이용 불가능한 IL-20에 대한 적절한 모델 시스템은 존재하지 않으므로, 본 실시예는 마우스 IL-20과 교차 반응하지 않는 IL-20 중화 항체를 평가하기 위한 시스템을 기재하고 제공한다.
귀 염증 검정
30-게이지 바늘을 이용해서 1일, 3일, 6일 및 8일의 교대하는 날짜에 제공되는 각 귀 내로의 인간 사이토카인 IL-20 또는 PBS 대조군의 피내 주사(20 ㎕/귀, 1000 ng/귀, 2000 ng/마우스/일)에 의해 8주령 C57BL/6J(WT; from Charles River) 마우스에서 귀 염증 표현형을 유도하였다. 본 발명의 예시적인 항-IL-20 2A11, 7D1 및 20A10 항체 치료를 유도된 귀 염증 표현형을 감소시키는 이들의 중화능에 대해 이들 동물에서 평가하였다. 2A11, 7D1 및 20A10 또는 대조군 인간 IgG[200 ㎍,]의 2회 IP 주사를 0일 및 6일째에 동물에 투여하였다. 마우스를 10일째에 희생시켰다.
본 발명의 항체의 잠재적 치료 효과를 평가하기 위해, 동물의 귀 두께 측정을 IL-20 주사 전에 매일 측정에 의해 IL-20 투여 동안 Mitutoyo 디지털 마이크로미터로 수행하였다. 또한, 치료 동안 체중을 모니터링하였지만, 적용되는 치료로 인해 어떠한 동물군에서도 유의미한 체중 변화가 관찰되지 않았다. 또한, 동물 희생 후, 귀의 H&E(헤마톡실린 및 에오신; 문헌 [Harris, H.F., J. Appl. Microscopy III(1900), 777-781 및 Mallory, F.B.: Pathological technique. Philadelphia, Saunders,(1938)] 참고) 조직 염색을 수행한다. 이들 실험은 인간 IL-20의 피내 주사를 이용한 귀 부종의 유도가 2A11, 7D1 및 20A10 중화 항체의 존재 하에 감소함을 나타낸다; 도 11을 참고하라. 이는 6일 이후 다양한 정도의 통계적 유의성으로 유의미하다. 예시적인 항-IL-20 항체 2A11, 7D1 및 20A10은 마우스 모델에서 주사된 IL-20을 중화할 수 있다. 따라서, 본원에 나타낸 데이터는 본 발명의 항-IL-20 항체가 사이토카인 유도된 귀 염증 실험에서 IL-20에 대해 효과적임을 시사하여, 본 발명의 IL-20 특이적 결합 분자의 치료적 가치를 나타낸다.
실시예 8: 표면 플라즈몬 공명( SPR ) 기술을 이용한 항체 친화도 측정
본 발명의 항체의 친화도 결정을 위해, 표면 플라즈몬 공명 SPR 측정을 제조업체의 지침에 따라 Biacore T200 SPR 기기(GE Healthcare)를 이용해서 수행하였다. CM5 칩을 항-huIgG Fc 마우스 IgG1 mAb(GE Healthcare)로 커플링하고 항-IL20 항체를 포화 시까지 포획하였다. 분석물질로서 인간 및 마우스 IL20을 1.5 내지 100 nM 농도로 반복 수행에 적용하였다. 온- 및 오프-속도 및 생성 KD를 1:1 결합 피팅을 이용해서 기기 분석 소프트웨어에 의해 결정하였다(도 12).
실시예 9: 리간드가 도메인에 결합함에 따라 대상 항체의 막통과 버전을 이용하는 LCBA 검정
대상 항체 26B9의 혈소판-유래 성장 인자 수용체(PDGFR)-막통과(TM) 매개 표면 발현에 대한 구축물, 서열 정보 및 참고문헌을 도 15 및 16에 표시한다; 또한 추가 상세내용에 대해서는 이에 대한 도면 주석, 상기 내용을 참고하라.
막통과 항체에 대한 리간드-결합
30,000 HEK 293T MSR 세포를 백색 절반 면적 96-웰 조직 배양 플레이트(Cat. No. 3688, Corning Inc.)에 씨드접종하였다. 씨드접종 동안, 세포를 Fugene HD(Cat. No. E2311, Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 항-IFN mAb 26B9의 막통과 버전(26B9-TM)을 인코딩하는 100 ng cDNA로 전달감염시켰다(서열 목록 67, Ho et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 103(2006), 9637-9642; Zhou et al., Mabs 2(2010), 508-518)(도 17, 18). 표면 항체(26B9-TM) 발현을 세포-기반 ELISA(도 17a)에서 전달감염 48시간 후 분석하였다. 전달감염 48시간 후, 인간 IFNW-가우시아 루시퍼라아제 융합 단백질(g1 IFNW)을 일시적으로 발현하는 HEK 293T 세포의 상청액을 이용하여 37℃에서 40분 동안 앞서 전달감염시킨 HEK 293T MSR 세포를 자극하였다. 대안적으로, g1 IFNW 상청액을 항-IFN mAb 또는 대조군 IgG와 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 사전 인큐베이션 후, 혼합물을 이용하여 37℃에서 40분 동안 26B9-TM을 일시적으로 발현하는 HEK 293T MSR 세포를 자극하였다. 결합 시, 세포를 PBS로 3회 세척하고, 가우시아 루시퍼라아제 검정을 제조업체의 지침(Cat. No. 16159, Thermo Fisher Scientific)에 따라 가우시아 Flash 검정 키트를 이용하여 발색시켜 g1 IFNW가 26B9-TM을 발현하는 세포에 특이적으로 결합함을 나타내었다(도 17b). 단량체성 Fv의 PDGFR-매개 표면 발현 및 PDGFR-도메인에 대한 추가 참조는 문헌 [Ho et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 103(2006), 9637-9642]에 기재된다. 완전 IgG의 PDGFR-매개 표면 발현은 문헌 [Zhou et al. Mabs 2(2010), 508-518]에 기재된다.
항- IFNW 항체의 교차-경쟁 검정.
상기 실험 설정을 또한 이용하여 본 발명의 예시적인 항체 26B9, 31B4 및 8H1 간 교차-경쟁을 평가하였다(도 18을 참고하라). HEK 293T MSR 세포를 26B9-TM을 인코딩하는 cDNA로 역-전달감염시켰다. 전달감염 48시간 후, g1 IFNW를 가용성 항-IFNW 항체 26B9, 31B4, 8H1 또는 대조군 IgG(huIgG)와 혼합하고, 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 혼합물을 전달감염시킨 세포에 첨가하고 결합을 화학발광 세포성 결합 검정에서 분석하였다. 도 18에 나타낸 바와 같이, g1 IFNW의 26B9-TM에 대한 결합은 가용성 26B9 및 클론적으로 관련된 31B4 항체에 의해 용량-의존적으로 경쟁된다. 대조적으로, 결합은 대조군 IgG에 의해 또는 예시적인 항-IFNW 항체 8H1에 의해 영향받지 않는다. 이들 결과는 예시적인 항체 26B9 및 31B4가 유사한 에피토프를 공유하는 반면, 8H1은 별도 에피토프에 결합하는 것으로 나타남을 시사한다.
실시예 10: 항-IL-20 모노클로날 항체의 항원 맵핑
이들 각각의 항원에 대한 MAB의 결합 영역은, 예로 PepStar™ 분석에 의해 맵핑될 수 있다. 따라서, 중복되는 18머 펩타이드(14개 아미노산 중복)를 모든 공지된 변이체를 포함하여 인간 및 쥐과 IL-20을 각각 커버하도록 설계하였다. 펩타이드(도 13b-인간 IL-21 및 도 13c-쥐과 Il-20) 및 전장 항원(양성 대조군으로서; 도 13a)을 마이크로어레이 상에 스폿팅하고, 펩타이드 마이크로어레이를 1차 항체, 이어서 1차 항체의 Fc 부분에 대해 유도된 형광 표지된 2차 항체와 인큐베이션한다. 입체 장애에 의해 유도되는 위음성을 배제하기 위해, 최적화된 친수성 링커 모이어티를 유리 표면 및 항원 유래 펩타이드 서열 간에 삽입한다.
또한, 인간 IL-20의 서열 101-PDHYTLRKISSLANSFL-117(서열번호 72)을 포함하는 17개 펩타이드 세트를 알라닌-스캐닝에 의한 에피토프 특성규명을 위해 합성하였다. 여기서, 각각의 개별 아미노산을 알라닌에 의해 별도로 치환하여 항체 결합에 대한 그 기여를 평가한다.
샘플을 1 ㎍/ml 농도로 마이크로어레이 슬라이드 상에 인쇄하였다. 이후 마이크로어레이를 30℃에서 60분 동안 차단 완충액 중 본 발명의 항체와 인큐베이션하였다. 검출을 위해, Cy5-항-인간 IgG(JIR 209-175-082) 2차 항체를 차단 완충액 중 희석된 1 ㎍/ml의 농도로 이용하고 30℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 또한, 형광 표지된 2차 항체 단독과의 인큐베이션을 대조군 실험으로서 수행하여 잠재적인 위양성 신호를 검출하였다. 각 단계 전에, 마이크로어레이를 세척 완충액으로 세척하였다. 분석을 위해, 신호 강도를 단백질 서열 상에 맵핑하여 선형 에피토프의 확인을 허용하였다.
완충액 및 용액
0.1% Tween 20(JPT), pH 7.2을 포함하는 50 mM TBS-완충액
3 mM SSC-완충액(JPT), pH 7.0
차단 완충액(Pierce International, Superblock TBS T20, order# 37536)
하드웨어 및 소프트웨어
펩타이드 마이크로어레이(JPT Peptide Technologies GmbH, Berlin, Germany; batch # 2611)
Axon Genepix 스캐너 4200AL
스팟-인식 소프트웨어 GenePix
각각 인간 및 쥐과 IL-20의 18머 펩타이드의 펩타이드 어레이 상에서 본 발명의 예시적인 항체 20A10, 2A11, 6E11 및 7D1에 대해 이러한 펩타이드 맵핑을 수행하였다. 검정 결과를 도 13에 나타낸다. 예시적인 항체 20A10은 IL-20의 펩타이드 20(PDHYTLRKISSLANSFLT 서열번호 69)에 특이적으로 결합하지만(도 13d) 아미노산 서열 NYQTPDHYTLRKISSLAN(서열번호 71)으로 이루어지는 펩타이드 19에는 결합하지 않는다. 따라서 항체 20A10의 결합 특이성은 IL-20의 펩타이드 19 및 20에 모두 결합하는, 국제 출원 WO2010/000721에 기재된 항-IL20 항체 15D2 및 5B7에서와는 상이하다(상기 출원에서 항체 5B7에 대해 펩타이드 25 및 26 그리고 항체 15D2에 대해 펩타이드 86 및 87로 명명됨; WO 2010/000721, 도 6a, 6b, 7a 및 7b 참고).
예시적인 항체 2A11은 마이크로어레이 상에서가 아니라(도 13a) 교차 경쟁 검정에서(도 10c) 쥐과 IL-20에 결합하는 반면, 본 발명의 예시적인 항-IL-20 항체 20A10은 두 경우에서 모두 쥐과 및 인간 IL-20에 결합한다(도 10d 및 도 13a). 알라닌-스캐닝에 의해 나타난 바와 같이(도 13g), 펩타이드 20의 서열 내 몇몇 잔기는 예시적인 항체 20A10과의 상호작용을 위해 중추적이며, 이들 중추적 아미노산이 치환되는 경우 그 결합이 폐지되거나 적어도 심하게 감소된다.
예시적인 항체 20A10의 결합에 대한 특정한 아미노산의 중요성은 15 aa 에피토프 빈: 101-P DHYTLRK IS S LA N SFLT-118의 하기 텍스트 전사에 요약되며, 여기서 예시적인 항체 20A10에 의한 결합을 위해 중추적인 아미노산은 진한 이탤릭체로 밑줄쳐 나타내고, 상호작용하고 덜 중추적인 아미노산은 밑줄쳐서 나타낸다. 대조적으로, WO 2010/000721에 기재된 항체 5B7 및 15D2에 대한 말단 결실 및 알라닌 스캐닝 에피토프 맵핑에서는 12개 아미노산 형태 H103-N114의 더 작은 선형 에피토프를 제시하지만, 여기서 3개 아미노산 위치(H103, S111 및 N114)만 항체 5B7 및 15D2에 의한 결합을 위해 불변이고 중추적인 것으로 나타났다; WO 2010/000721, 실시예 7 및 8뿐만 아니라 도 7 및 8에서의 알라닌-스캐닝 데이터를 참고하라.
추가의 흥미로운 관찰은 항체 20A10이 전장 인간 및 쥐과 IL-20에 결합하는 반면(도 10d, 12c, 및 도 13a의 마이크로어레이의 맥락에서), 위치 Y104H 및 T118I만 인간 IL-20 101-118-펩타이드로부터의 그 아미노산 서열과 상이한 마우스 IL-20에서 유래되는 대응하는 펩타이드에 대한 어레이 항원 맵핑 검정에서는 결합하지 않는다는 것이며, 여기서 후자는 20A10 결합 및 임의의 다른 마우스 IL-20 유래 18머 펩타이드를 위해 불필요한 것으로 보인다(도 13c). 따라서, 항체 20A10은 인간 및 마우스 IL-20의 입체형태 에피토프를 인식할 수 있고, 이는 또한 인간 IL-20 유래 펩타이드 101-PDHYTLRKISSLANSFLT-118(서열번호 69)에 의해 형성되거나 모사될 수 있고, 또는 상기 펩타이드의 아미노산 서열이 상기 입체형태 에피토프의 주요 구성성분을 나타낸다. 따라서, 항체 20A10의 큰 에피토프 빈 및 마우스 IL-20에서 유래되는 펩타이드에 대한 그 결합의 부재는 상기 항체를 IL-20에 대해 고도로 특이적으로 만들며, 그 이유로 다른 사이토카인, 예로, IL-10 및 IL-10-유사 사이토카인과의 교차-반응은 일어나지 않을 것이다.
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tgg gtg cga cag gcc cct gga cag ggt ctt gag tgg ctg 144 Thr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 gga gga atg atc cct atc ctt agt aga aca acg tac gcg cag aag ttt 192 Gly Gly Met Ile Pro Ile Leu Ser Arg Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 cag ggc aga ctc acg att acc gcg gac gaa ccc acg agc acg tcc tac 240 Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Pro Thr Ser Thr Ser Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctg agc agc ctg aaa tct gag gac acg gcc gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg acc gag ggg gaa gtt tct gcc gcg cac aac tac tac tac gga atg 336 Ala Thr Glu Gly Glu Val Ser Ala Ala His Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110 gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 375 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(336) <223> 20A10-VL variable light chain (VL) sequence; kappa type <220> <221> V_region <222> (70)..(117) 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tac tgc atg caa act 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Thr 85 90 95 cta cat act gta ttc act ttc ggc cct ggg acc aga gtg gat atc aaa 336 Leu His Thr Val Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Val Asp Ile Lys 100 105 110 <210> 5 <211> 981 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(981) <223> 20A10-CH constant heavy chain (CH) sequence <400> 5 gct tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 agc acc tcc gag agc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acg aag acc 240 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 tac acc tgc aac gta gat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 aga gtt gag tcc aaa tat ggt ccc cca tgc cca tca tgc cca gca cct 336 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 gag ttc ctg ggg gga cca tca gtc ttc ctg ttc ccc cca aaa ccc aag 384 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 gac act ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg 432 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 gac gtg agc cag gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gat 480 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag ttc 528 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 576 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc 624 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 ccg tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga 672 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cag gag gag atg acc aag 720 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac 768 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag 816 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 864 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 agg cta acc gtg gac aag agc agg tgg cag gag ggg aat gtc ttc tca 912 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag agc 960 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 ctc tcc ctg tct ctg ggt aaa 981 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 7 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <223> 20A10-CL constant light chain (CL) sequence <400> 7 cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt 321 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 9 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <223> 2A11-VH variable heavy chain (VH) sequence; 2A11: IgG1, lambda <220> <221> V_region <222> (88)..(102) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(192) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(327) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 9 cag gtg cat ctg gtt cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48 Gln Val His Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc aac aat ttt 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Asn Phe 20 25 30 ccc atg agt tgg gtg cga cag gcc cct gga cga ggg ctt gag tgg atg 144 Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gca ggg atc atc cct gta ttt ggt tcg gca aac tat gca cag cag ttt 192 Ala Gly Ile Ile Pro Val Phe Gly Ser Ala Asn Tyr Ala Gln Gln Phe 50 55 60 cac ggc aga gtc acc att agc gcg gac ata tcc acg agc acg gtg tcc 240 His Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ser Thr Ser Thr Val Ser 65 70 75 80 atg gaa ctg aat gac ttg aaa tct gag gac acg ggc gtt tat tat tgt 288 Met Glu Leu Asn Asp Leu Lys Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg att agt gga gat gag gac aac tgg atc atg aac ttt tgg ggc cag 336 Ala Ile Ser Gly Asp Glu Asp Asn Trp Ile Met Asn Phe Trp Gly Gln 100 105 110 gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 360 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) 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150 155 160 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 528 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 576 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 624 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 672 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag 720 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 816 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 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Tyr Phe Asp Phe Trp Gly 100 105 110 cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <223> 7D1-VL variable light chain (VL) sequence; lambda type <220> <221> V_region <222> (67)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (151)..(171) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (268)..(297) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <400> 19 cag tct gtt ctg act caa cca ccc tca gcg tct ggg acc ccc ggg cag 48 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 aca gtc atc atc tct tgt tct gga acc acc tcc aac atc ggc agt aat 96 Thr Val Ile Ile Ser Cys Ser Gly Thr Thr Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 act gta agc tgg tac cgg caa ctc cca ggg gcg gcc ccc aaa ctc ctc 144 Thr Val Ser Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 atc ttt act tat aat cag cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc tct 192 Ile Phe Thr Tyr Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc tcc aag tct ggc acc tct gcc tcc ctg gcc atc agt ggc ctc cag 240 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 tct gac gat gag gct gat tat tac tgt gcc gtg tgg gat gac gcc ctg 288 Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Asp Ala Leu 85 90 95 ggt ggt tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 330 Gly Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 21 <211> 990 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(990) <223> 7D1-CH constant heavy chain (CH) sequence <400> 21 gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc 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agc aat ggg cag ccg gag aac 816 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 912 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 cag aag agc ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa 990 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 23 <211> 318 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(318) <223> 7D1-CL constant light chain (CL) sequence <220> <221> misc_feature <222> (270)..(318) <223> not sequenced but obtained from database <400> 23 ggt cag ccc aag gct gcc ccc tcg gtc act ctg ttc ccg ccc tcc tct 48 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 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gat att agc aaa tat 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gtc cct aaa ctc ctg atc 144 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tac gaa aca tcc aat ttg gaa gta ggg gtc cca tca agg ttc agt gga 192 Tyr Glu Thr Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca cat ttt act ctc acc atc agc agc ctg cag gct 240 Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 gaa gat ttt gca aca tat tac tgt caa cag tat gag aat ttc ccg ttc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Asn Phe Pro Phe 85 90 95 act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 321 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 55 <211> 990 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(990) <223> 8H1-CH constant heavy chain (CH) sequence <400> 55 gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 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Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 432 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 528 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 576 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 624 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 672 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag 720 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 816 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 912 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 cag aag agc ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa 990 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 57 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <223> 8H1-CL constant kappa chain (CL) sequence <400> 57 cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 324 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 59 <211> 378 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(378) <223> 19D11-VH variable heavy chain (VH) sequence; 19D11: IgG1, kappa <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> not sequenced but obtained from database <220> <221> V_region <222> (91)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR1 <220> <221> V_region <222> (148)..(198) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR2 <220> <221> V_region <222> (295)..(345) <223> complementarity determining region (CDR) VH-CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (361)..(378) <223> not sequenced but obtained from database <400> 59 gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gct gag gtg aag agg cct ggg tcg 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 tcg gtg agg gtc tcc tgc agg gct tct gga gac acc ttc agc agt tac 96 Ser Val Arg Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Asp Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 cct atc agt tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctt gag tgg atg 144 Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga agg atc ctc cct gcc ctt ggt gtc aca aac tac gct cag aac ttc 192 Gly Arg Ile Leu Pro Ala Leu Gly Val Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Phe 50 55 60 cgg ggc aga atc acg att acc gcg gac aag tcg ccc ctc aca gcc tac 240 Arg Gly Arg Ile Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Pro Leu Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ttg gaa ctg agt agc ctc aga ttt gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 288 Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcg agt ccc agt gcg gac ata att cct tcg att ttg ggg acg acc ctc 336 Ala Ser Pro Ser Ala Asp Ile Ile Pro Ser Ile Leu Gly Thr Thr Leu 100 105 110 ttt gcc ttc tgg ggc cag gga agc ctg gtc acc gtc tcc tca 378 Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 61 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(330) <223> 19D11-VL variable light chain (VL) sequence, kappa type <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> not sequenced but obtained from database <220> <221> V_region <222> (70)..(105) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR1 <220> <221> V_region <222> (151)..(171) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR2 <220> <221> V_region <222> (268)..(300) <223> complementarity determining region (CDR) VL-CDR3 <220> <221> misc_feature <222> (312)..(330) <223> not sequenced but obtained from database <400> 61 gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ctg tct ccg ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa ggg gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag aat gtt agc aga cac 96 Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Ser Arg His 20 25 30 tac tta acc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag tct ccc cgg ctc ctc 144 Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu 35 40 45 atc tat ggt ggc tcc agc agg gcc act ggc gtc cca gac agg ttc agt 192 Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc ggt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agg ctg gag 240 Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 cct gaa gac ttt gca gtg ttt tac tgc cag agc tat cat agc cca cct 288 Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Ser Tyr His Ser Pro Pro 85 90 95 cct gtg tac act ttc ggc cag ggg acc aag gtg gag atc aaa 330 Pro Val Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 63 <211> 993 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(990) <223> 19D11-CL constant kappa chain (CL) sequence <220> <221> misc_feature <222> (966) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (968) <223> n is a, c, g, or t <400> 63 gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 240 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 aga gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 336 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 384 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 432 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 528 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 576 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 624 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 672 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag 720 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 816 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 912 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 cag aan anc ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa tga 993 Gln Xaa Xaa Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 65 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(321) <223> 19D11-CL constant kappa chain (CL) sequence <400> 65 cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 324 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 67 <211> 183 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of transmembrane region region <220> <221> misc_structure <222> (1)..(30) <223> myc-epitope <220> <221> CDS <222> (1)..(180) <220> <221> misc_structure <222> (34)..(183) <223> PDGFR transmembrane domain <400> 67 gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg aat gct gtg ggc cag gac 48 Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ala Val Gly Gln Asp 1 5 10 15 acg cag gag gtc atc gtg gtg cca cac tcc ttg ccc ttt aag gtg gtg 96 Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu Pro Phe Lys Val Val 20 25 30 gtg atc tca gcc atc ctg gcc ctg gtg gtg ctc acc atc atc tcc ctt 144 Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Ile Ile Ser Leu 35 40 45 atc atc ctc atc atg ctt tgg cag aag aag cca cgt tag 183 Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro Arg 50 55 60 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment of human IL-20 <220> <221> BINDING <222> (1)..(15) <223> 15 aa fragment of the IL-20-peptide 20 bound specifically by mAB 20A10 <400> 69 Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe 1 5 10 15 <210> 70 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide fragment of human IL-20 <220> <221> BINDING <222> (1)..(18) <223> IL-20-peptide 19 not bound by mAB 20A10, however specifically bound by antibodies 5B7 and 15D2 described in WO 2010/000721 <400> 70 Asn Tyr Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu 1 5 10 15 Ala Asn <210> 71 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide used for epitope characterization by alanine scan <220> <221> BINDING <222> (1)..(17) <223> Peptide used for epitope characterization by alanine-scan <400> 71 Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe 1 5 10 15 Leu

Claims (32)

  1. 인간-유래 모노클로날 항-인간 인터류킨-20(IL-20) 항체 또는 IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체로서, 바람직하게는 그 가변 영역에
    (a) 하기에 도시된 VH 및/또는 VL 가변 영역 아미노산 서열의 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR):
    (ⅰ) 도 1(VH)(서열번호 2, 10, 18 및 26); 및
    (ⅱ) 도 1(VL)(서열번호 4, 12, 20 및 28);
    (b) 도 1에 도시된 VH 및/또는 VL 영역의 아미노산 서열;
    (c) (a)의 임의의 하나의 아미노산 서열의 부분적 변경으로 생성되는 아미노산 서열로 이루어지는 적어도 하나의 CDR; 또는
    (d) (b)의 아미노산 서열의 부분적 변경으로 생성되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항체 또는 IL-20 결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    IL-20의 생물학적 활성을 감소시키거나 중화할 수 있는 항체 또는 IL-20 결합 단편.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    아미노산 서열 101-PDHYTLRKISSLANSFLT-118(서열번호 69), 102-DHYTLRKISSLANSF-116(서열번호 70) 또는 101-PDHYTLRKISSLANSFL-117(서열번호 72)로 이루어지는 IL-20 유래 펩타이드를 인식하며, P101, I109, S110 및/또는 L117는 또 다른 아미노산, 바람직하게는 알라닌에 의해 치환될 수 있고, 아미노산 서열 97-NYQTPDHYTLRKISSLAN-114(서열번호 71)로 이루어지는 펩타이드를 인식하지 않거나 실질적으로 인식하지 않는 항체 또는 IL-20 결합 단편, 합성 또는 생물공학적 유도체.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    쥐과 IL-20에 실질적으로 결합하고/하거나 이를 중화시키지 않는 항체 또는 IL-20 결합 단편.
  5. 청구항 2 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    생물학적 활성이
    (a) 세포 기반 STAT(신호 전달물질 및 전사 활성화제) 활성화 검정에서의 인간 IL-20 신호전달;
    (b) IL-20 사이토카인 세포-표면 수용체 결합의 저해;
    (c) 인간 IL20 I형/II형 수용체 복합체의 인간 IL-20 매개 활성화; 및/또는
    (d) 인간 IL-20의 전-염증성 활성
    인 항체 또는 IL-20 결합 단편.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 CDR이 도 1에 나타낸 대응하는 CDR과 적어도 70%, 바람직하게는 80% 및 보다 바람직하게는 적어도 90% 동일하고/하거나 VH 및/또는 VL 가변 영역의 프레임워크 영역의 아미노산 서열이 도 1에 나타낸 대응하는 프레임워크 영역과 적어도 70%, 바람직하게는 80% 및 보다 바람직하게는 적어도 90% 동일한 항체 또는 IL-20 결합 단편.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    Ig1 또는 IgG4인 항체 또는 IL-20 결합 단편.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    표 1에 나타낸 CH 및 CL 아미노산 서열(서열번호 6, 14, 22 및 30)로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 적어도 60% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CH 및/또는 CL 불변 영역을 포함하는 항체 또는 이들의 IL-20 결합 단편.
  9. 인간 IL-20과의 결합에 대해 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항의 항체와 경쟁하는 항체 또는 항원-결합 분자.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    단일쇄 Fv 단편(scFv), F(ab') 단편, F(ab) 단편, 및 F(ab')2 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편의 하나의 면역글로불린쇄의 적어도 가변 영역을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  12. 청구항 11의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  13. 청구항 11의 폴리뉴클레오타이드 또는 청구항 12의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  14. 청구항 12의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 항체 또는 이들의 면역글로불린쇄(들).
  15. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항의, 또는 청구항 13의 세포를 배양하여 수득되는 항-IL-20 항체 또는 IL-20 결합 단편을 포함하는 면역접합체로서, 바람직하게는 방사선핵종, 효소, 기질, 보조인자, 형광 마커, 화학발광 마커, 펩타이드 태그, 중금속, 자기 입자, 약물, 또는 독소를 포함하는 면역접합체.
  16. 청구항 1 내지 청구항 10 또는 청구항 14 중 어느 한 항의 항-IL-20 항체 또는 IL-20 결합 단편, 청구항 15의 면역접합체, 청구항 11의 폴리뉴클레오타이드, 청구항 12의 벡터, 청구항 13의 세포를 포함하는 조성물로서, 바람직하게는 조성물이
    (a) 약학 조성물이고, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하며 선택적으로 염증성 질환의 치료를 위해 유용한 추가 제제를 추가로 포함하거나;
    (b) 진단 조성물 또는 키트이고, 면역- 또는 핵산-기반 진단 방법에서 통상적으로 이용되는 시약을 추가로 포함하는 조성물.
  17. (a) 선택적으로 세포내 기능적 영역(2)을 포함하는 리간드-결합 도메인을 발현하는 표적 세포(1)를 리포터(4)로 표지된 관심 리간드(3)를 포함하는 샘플과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 리포터 활성(6)을 결정하는 단계
    를 포함하는 리간드-결합 도메인에 대한 관심 리간드의 결합 평가 방법으로서,
    대조군 대비 리포터 활성의 증가는 리간드-결합 도메인에 대한 관심 리간드의 결합을 시사하는 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    리간드-결합 도메인이 수용체 또는 항-리간드 항체에서 유래되고/되거나 리간드가 사이토카인, 바람직하게는 인터페론 또는 인터류킨인 방법.
  19. 청구항 17 또는 청구항 18에 있어서,
    리간드-결합 도메인 및/또는 리간드가 생물학적으로 활성인 방법.
  20. 청구항 17 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
    세포, 리간드 및/또는 리간드-결합 도메인이 포유류, 바람직하게는 인간 기원인 방법.
  21. 청구항 17 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
    리포터가 바람직하게는 루시퍼라아제, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, 및 알칼리성 포스파타아제, 가장 바람직하게는 가우시아 또는 NanoLuc 루시퍼라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출 가능한 효소인 방법.
  22. 청구항 17 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
    표지된 리간드가 바람직하게는 숙주 세포에 의해 발현되고 분비되는, 재조합 융합 단백질인 방법.
  23. 청구항 17 내지 청구항 22 및/또는 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포가 내인성으로, 일시적으로 또는 안정적으로 리간드-결합 도메인을 발현하고/하거나 숙주 세포가 일시적으로 융합 단백질을 발현하는 방법.
  24. 청구항 22 또는 청구항 23에 있어서,
    샘플이 숙주 세포의 배양 상청액을 포함하며, 바람직하게는 대조군은 상청액이 없는 배양 배지 또는 융합 단백질을 발현 및 분비하지 않는 동일한 종류의 세포의 배양 상청액인 방법.
  25. 청구항 17 내지 청구항 24 중 어느 한 항에 있어서,
    표적 세포 및/또는 숙주 세포가 HEK 293T MSR 세포 또는 COLO 205 결장직장 암종 세포이며, 바람직하게는 (ⅰ) 표적 세포는 일시적으로 I형 및 II형 IL-20 수용체를 발현하는 HEK 293T MSR 세포이고, 샘플은 IL-20-루시퍼라아제 융합 단백질을 발현하는 HEK 293T 세포의 상청액을 포함하거나; 또는 (ⅱ) 표적 세포는 일시적으로 막통과 항-인터페론 오메가(IFNW) 항체를 발현하는 HEK 293T 세포이며, 샘플은 IFNW-루시퍼라아제 융합 단백질을 발현하는 HEK 293T 세포의 상청액을 포함하는 방법.
  26. 청구항 17 내지 청구항 25 중 어느 한 항의 방법 단계를 포함하는, 평가 샘플이 관심 리간드의 그 인지체 리간드-결합 도메인에 대한 결합의 작동제 또는 길항제를 포함하는지 여부를 결정하기 위한 검정으로서, 단계 (a) 전에 또는 동안에 리간드 및/또는 표적 세포가 평가 샘플(7)을 거치며, 단계 (b)에서 평가 샘플의 부재 하 또는 대조군의 존재 하 리포터 활성에 비해
    (ⅰ) 리포터 활성의 증가가 작동제를 시사하고; 및
    (ⅱ) 리포터 활성의 감소가 길항제를 시사하는 검정.
  27. 청구항 26에 있어서,
    평가 샘플이 (ⅰ) 항-리간드 항체, 리간드-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체 또는 (ⅱ) 항-리간드 수용체(LR) 항체, LR-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체를 포함하며, 바람직하게는 항체는 인간-유래 항체이고; 선택적으로 대조군은 비-리간드- 또는 비-LR 결합 항체인 검정.
  28. 청구항 26 또는 청구항 27에 있어서,
    샘플이 항-리간드 또는 항-LR 항체를 함유하는 것으로 추정되는 대상체로부터 수득되는 체액, 바람직하게는 혈청에서 유래되며, 바람직하게는 대상체는 자가면역 또는 염증성 장애, 병원체 감염, 암을 겪는 검정.
  29. 청구항 26 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    리간드가 평가 샘플과, 또는 대조군으로서 비-리간드- 또는 비-LR-결합 분자 또는 과량 농도의 표지되지 않은 리간드와 사전-인큐베이션되는 검정.
  30. 인간-유래 모노클로날 항-리간드 항체 또는 리간드-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체의 제조 방법으로서, 모노클로날 항체를 발현하는 B 세포가 포유류로부터 수득되는 샘플로부터 단리되며, 바람직하게는 포유류가 중추 및/또는 말초 관용성의 손상 또는 자가-관용성의 손실, 예컨대 자가면역 다중내분비병증-칸디다증-외분비 디스트로피(APECED)를 겪으며, 상기 방법이
    (a) 항-리간드 항체의 존재에 대한 샘플의 검정 단계;
    (b) 항-리간드 항체를 함유하는 것으로 확인된 샘플로부터 B 세포, 바람직하게는 기억 B 세포를 정제하는 단계;
    (c) B 세포를 배양하고, 선택적으로 항체의 생물학적 활성에 대해 B 세포의 샘플을 검정하는 단계, 및
    (ⅰ) 모노클로날 항체를 단리하는 단계; 또는
    (ⅱ) 상기 B 세포 또는 기억 B 세포로부터 상기 항체의 적어도 가변 영역에 대한 면역글로불린 유전자 레퍼토리를 수득하는 단계; 및
    (d) 상기 레퍼토리를 이용하여 숙주 세포에서 상기 항체 또는 리간드-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체를 발현하고, 항체 또는 리간드-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체를 단리하는 단계;
    (e) 항체 또는 리간드-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체의 샘플의 생물학적 활성을 검정하는 단계
    를 포함하며; 선택적으로 (f) 단리된 항체 또는 리간드-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계
    를 추가로 포함하고; 리간드가 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에서 정의된 리간드이고, 단계 (a), (c), 및/또는 (e)에서의 샘플 검정 단계가 청구항 26 내지 청구항 29 중 어느 한 항의 검정에 따라 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. (a) 항-리간드 항체를 제공하는 단계;
    (b) 항체로 청구항 26 내지 청구항 29 중 어느 한 항의 검정을 거치는 단계; 및
    (c) 항체가 길항제 또는 작동제인 것으로 결정되는 경우에만 항체 또는 이들의 유도체를 약학 조성물에 제형화하는 단계
    를 포함하는 자가면역 장애, 염증성 장애, 암 또는 수용체에 대한 리간드-결합에 의해 매개되는 장애의 치료에서 이용하기 위한 항-리간드 항체 또는 리간드-결합 단편, 이들의 합성 또는 생물공학적 유도체를 포함하는 약학 조성물의 제조 방법.
  32. 청구항 17 내지 청구항 25, 청구항 30 또는 청구항 31 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 청구항 26 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 따른 검정을 수행하기 위해 유용한 키트로서, 키트가
    (a) 리포터(4)로 표지된 관심 리간드(3)를 함유하는 샘플 또는 이를 위한 제조 수단;
    (b) 선택적으로 세포내 기능적 영역(2)을 포함하는 리간드-결합 도메인을 발현하는 표적 세포(1) 또는 이를 위한 제조 수단;
    (c) 선택적으로 리포터 활성(6)을 결정하기 위한 수단(5)
    을 포함하며; 키트는 바람직하게는 청구항 17 내지 청구항 25, 청구항 30 또는 청구항 31 중 어느 한 항에 따른 방법 또는 청구항 26 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 따른 검정을 수행하기 위한 지침을 추가로 포함하는 키트.
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