CN106536554A - 人源化抗人il20抗体及用于识别抗细胞因子抗体的测定法 - Google Patents

人源化抗人il20抗体及用于识别抗细胞因子抗体的测定法 Download PDF

Info

Publication number
CN106536554A
CN106536554A CN201580036506.0A CN201580036506A CN106536554A CN 106536554 A CN106536554 A CN 106536554A CN 201580036506 A CN201580036506 A CN 201580036506A CN 106536554 A CN106536554 A CN 106536554A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
cell
ligand
binding
present
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580036506.0A
Other languages
English (en)
Inventor
斯蒂芬·梅耶尔
菲利普·弗拉伊库
安娜丽莎·马卡纽
帕特·彼得森
卡伊·基桑德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Immunoqure AG
Original Assignee
Immunoqure AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunoqure AG filed Critical Immunoqure AG
Publication of CN106536554A publication Critical patent/CN106536554A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

提供了人源的新型白介素‑20(IL‑20)结合分子，特别是人源化抗人IL‑20抗体以及其IL‑20结合片段、衍生物以及生物技术衍生物。另外，描述了用于诊断和治疗的药物组合物、试剂盒以及方法。此外，描述了细胞酶联配体结合测定法，用于分离用于药物用途的抗体和其生物技术衍生物，特别是重组人源化抗人细胞因子抗体。

Description

人源化抗人IL20抗体及用于识别抗细胞因子抗体的测定法
技术领域
本发明大体上涉及结合哺乳动物(优选人)源的白介素-20(IL-20)的新型分子，特别是人单克隆抗体以及其片段、衍生物和变体。特别地，本发明涉及识别IL-20的重组人患者衍生的抗IL-20抗体以及其片段、衍生物和合成变体或生物技术变体。另外，描述了包括在疾病(失调/紊乱，disorder)的治疗和诊断中有用的这样的结合分子、抗体及其模拟物(mimic)的组合物。此外，本发明涉及抗IL-20抗体及其所提及的等价物，用于免疫疗法中以及自身免疫和自发炎症性失调和恶性肿瘤(诸如各种形式的关节炎、血管炎症、动脉硬化、牛皮癣、过敏性皮肤炎、全身性红斑狼疮(SLE)以及癌症)的治疗干预中的靶点。更具体地，本发明涉及已经与B细胞分离的单克隆自身抗体，该B细胞源自通常由于涉及免疫调节的基因突变而受已受损的中枢耐受和/或外周耐受或自身耐受的丧失影响的受试者。
在另一方面，本发明涉及一种用于评估感兴趣的配体与配体结合域的结合以及识别在测试样品中存在的化合物(特别是能够干扰所述配体结合的抗体)的方法。更具体地，本发明涉及一种新型细胞测定法，该新型细胞测定法用于评估感兴趣的配体与表达一种或多种用于配体的相关受体的细胞的结合；以及该测定法用于评估候选化合物(例如抗体)是阻止还是支持配体与细胞上的其一种或多种同源受体的结合，并且因此具有拮抗的或者激活的(agonistic)活性的用途。根据下文进一步描述的且在实施例和附图中示出的该测定法的最优选的实施方式，本发明的测定法在本文中还可以称为发光细胞结合测定(LCBA)。
背景技术
白介素-20(IL20，还称为白介素-10D或ZCYTO10)是具有细胞生长影响、炎症性和免疫调节功能的多效性细胞因子(Blumberg等人，Cell 104(2001)，9-19)。人IL-20基因(NCBI参照序列：NM_018724)位于染色体lq32.1上，并且编码包括176个氨基酸(aa)(UniProtKB/Swiss Prot标识符：Q9NYY1)的蛋白质。IL-20属于IL-10家族，该家族由九个成员组成：IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、IL-26以及较远相关的IL-28A、IL-28B和IL-29(Ouyang等人，Ann.Rev.Immunol.29(2011)，71-109)。IL-10家族细胞因子对于维持组织上皮层的完整性和自稳态来说是必不可少的。该家族的成员可以促进来自组织上皮细胞的先天性免疫应答，以限制由病毒和细菌感染引起的损伤。根据上下文，IL-20具有强有力的炎症性(Hsieh等人，Genes Immun.7(2006)2434-242)、血管生成(Chen等人，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.26(2006)，2090-2095)和趋化性特性(Hsu等人，Arthritis Rheum.54(2006)，2722–2733)。然而，在用耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌感染期间，还已经识别出了与IL-19和IL-24一起的IL-20的免疫抑制作用(Myles等人，NatureImmunol.14(2013)，804-811)。IL-20优选地在五种主要细胞类型中表达：上皮细胞、肌上皮细胞、内皮细胞、单核细胞和骨骼肌细胞(Hsing等人，Cytokine 35(2006)，44-52)。
这是由缺氧和炎症性刺激物诸如IL-1β和脂多糖(LPS)调节的(Otkjaer等人，J.Invest.Dermatol.127(2007)，1326-1336；Chen and Chang J.Immunol.182(2009)，5003-12)。通过IL-20受体(R)复合物IL-20RA/IL-20RB(I型)或者通过IL-20受体复合物IL-22RA/IL-20RB(II型)，IL-20诱导了信号转导子和转录激活子(STAT)1和3的激活(Parish-Novak等人，J.Biol.Chem.277(2002)，47517-47523；Logsdon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109(2012)，12704-9)。两种受体复合物都在皮肤中表达，并且在牛皮癣皮肤和过敏性皮肤炎中显著地上调(Blumberg等人，Cell 104(2001)，9-19；Toyhama等人，Eur.J.Immunol.39(2009)，2779-88)。IL-20在转基因小鼠中的过度表达引起了具有皮肤畸形(包括异常表皮分化)的新生儿的致命性(Blumberg等人，Cell 104(2001)，9-19；Liu等人，Blood 102(2003)，3206-3209)。IL-20靶向角质细胞、内皮细胞和滑膜细胞，并且与牛皮癣相关联(Wei等人，Clin.Immunol.117(2005)，65-72；Sa等人，J.Immunol.178(2007)，2229-2240)。
此外，已经观察到IL-20及其受体在类风湿关节炎(RA)滑膜组织活检和强直性脊柱炎(AS)中被过度表达(Kragstrup等人，Cytokine 41(2008)，16-23)，其中，IL-20及其受体的表达水平与炎症的严重性正相关(Hsu等人，Arthritis Rheum.54(2006)，2722-2733)。IL-20诱导了RA滑膜成纤维细胞(RASF)以分泌单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、IL-6和IL-8，并且IL-20促进了嗜中性粒细胞趋化性、RASF迁移以及内皮细胞增殖。胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠模型证明了IL-20参与关节炎的发病机理，这是因为可溶的IL-20RA显著地减少了具有CIA的大鼠的关节炎(Hsu等人，Arthritis Rheum.54(2006)，2722-2733)。
除了在类风湿关节炎(RA)和牛皮癣的进展期间IL-20的促进作用，发现IL-20与几种其他疾病(诸如动脉硬化(Chen等人，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.26(2006)，2090-2095)、急性肾功能衰竭(Li等人，Genes Immun.9(2008)，395-404)、溃疡性结肠炎(Fonseca-Camarillo等人，J.Clin.Immunol.33(2013)，640-8)、缺血性发作(Chen和ChangJ.Immunol.182(2009)，5003-12)以及骨质减少和骨质疏松症(Hsu等人，J.Exp.Med.208(2011)，1849-1861))在功能上相关。此外，IL-20在造血细胞的发育中起作用(Liu等人，Blood 102 (2003)，3206-3209)。
已经在非小细胞肺(NSCL)癌(Baird等人，Eur.J.Cancer 47(2011)，1908-18)和肌肉浸润性膀胱癌(Lee等人，PLoS One 7(2012)，e40267)中观察到IL-20基因的失调表达。通过细胞外信号调节激酶(ERK)介导的MMP-9蛋白表达，IL-20促进了膀胱癌细胞的迁移，从而通过诱导p21(WAF1)蛋白表达的上调导致了核因子(NF-κB)激活(Lee等人，J.Biol.Chem.288(2013)，5539-52)。在临床的口腔肿瘤组织和乳腺癌组织中，IL-20及其受体亚基的表达比在非肿瘤组织中更高(Hsu等人，Mol.Cancer Res.10(2012)1403-9，Hsu等人，J.Immunol.188(2012)1981-91)。在体外，IL-20经由激活的STAT3和AKT/JNK/ERK信号促进了肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β、MCP-1、CCR4和CXCR4，并且增强了口腔癌细胞的增殖、迁移、活性氧(ROS)产生以及集落形成。在体内，使用小鼠抗人IL-20单克隆抗体7E中和IL-20减少了口腔癌细胞中的肿瘤生长和炎症(Hsu等人，Mol.Cancer Res.10(2012)1403-9)。
总之，IL-20可以在非常不同的疾病环境中促进异常细胞生长、迁移，并且在炎症的局部位点起作用。因此，IL-20代表了尚未完全理解但重要的新治疗靶点，并且存在对能够中和IL-20的生物活性和功能的IL-20特异性结合分子的需要，这在与有害的IL-20活性相关的疾病或病症的治疗和诊断中是有用的，并且在人类中是可接受的。
通过如在权利要求书中表征的和在说明书中公开的以及在实施例和附图中所示出的本发明的实施方式，下面进一步提供了对于该问题的解决方案。
发明内容
本发明涉及IL-20特异性人源化单克隆抗体以及其识别IL-20的片段、衍生物和合成变体或生物技术变体。特别地，如在所附的实施例和附图中所示的，提供了人单克隆抗IL-20抗体，其具有对于IL-20的选择性结合属性(profile)且显示出结合和中和活性。由于它们的中和特性，本发明的抗体具有治疗、预后和诊断功效，这使得它们在与以下疾病相关的应用中是特别有价值的：在与不期望的免疫反应的起始和/或维持中的与IL-20活性相关联/有关的多种多样的自身免疫性和炎症性疾病以及病症，诸如各种形式的关节炎(例如，类风湿关节炎(RA)或脊柱关节炎)、炎症性肠病(IBD)、克罗恩病、牛皮癣、血管炎症和动脉粥样硬化、特应性皮炎和癌症；对于这些和其他可能的抗IL-20治疗的和诊断的适应症，还参见上文的背景技术部分。
由于在AIRE(自身免疫调节)基因中的突变，已经从感染自身免疫性多内分泌腺病综合征1型(APS1)的人类中分离出本发明的抗体(Peterson等人，Nat.Rev.Immunol.8(2008)，948-957)，并参照国际申请WO2013/098419。
在本文中，在根据本发明执行的实验中，首先尝试识别、分离和表征，特别是选择最有效的中和候选抗体似乎是麻烦的。例如，迄今以及在根据本发明执行的最初的实验中，荧光素酶免疫沉淀反应系统(LIPS)测定法已经用于检测针对所期望的抗原IL-20的IgG抗体，其已经被报告具有监测抗体的潜能以由ELISA所错失的可能的构象表位，用于评估中和活性；参见Burbelo等人，Expert Rev.Vaccines 9(2010)，567–578，作者手稿；在2012年8月13日的PMC中可获得。然而，由于在根据本发明执行的实验中，LIPS测定法没有区分中和和非中和抗体，因此根据这种方法识别和选择的抗体可能不会导致在其中和活性方面提供实际最有效的抗体。
因此，如图7中所示出的和实施例5中所描述的，根据本发明，已经开发了用于评估感兴趣的配体与诱导以表达一种或多种相关受体的细胞的结合的新测定法，用于测定针对该配体的候选抗体是否防止了其结合至细胞上相应受体的能力。例如，当感兴趣的配体用作报道基因(报道分子，报道物，reporter)(即荧光素酶融合蛋白)时，配体的细胞结合是由细胞关联的报道基因(即荧光素酶活性)来测量的。这种测定法允许通过观察报道基因活性的变化(即由荧光素酶所减少的光发射)来评估针对该配体的抗体是否防止其结合至细胞上相应受体的能力。因此，根据本发明，已经建立了新的发光细胞结合测定法(LCBA)。由于这种新的测定法，可以识别有效的IL-20中和抗体。
因此，由于(i)患者(称为APS1-9)是抗IL-20抗体的高度产生者以及(ii)新的细胞配体结合报道基因测定法的使用，所以在实施例中示出的受试者抗体可以被分离和识别。
详细地，本发明涉及：
[1]一种人源化单克隆抗人白介素-20(IL-20)抗体或其IL-20结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物，在其可变区中包括：
(a)在以下项中描述的VH和/或VL可变区氨基酸序列的至少一个互补决定区(CDR)：
(i)图1(VH)(SEQ ID No：2、10、18和26)；以及
(ii)图1(VL)(SEQ ID NO：4、12、20和28)；
(b)如图1中描述的VH和/或VL区的氨基酸序列；
(c)由从(a)的所述氨基酸序列中的任一种的部分改变所得到的氨基酸序列组成的至少一个CDR；或者
(d)包括从(b)的所述氨基酸序列的部分改变所得到的氨基酸序列的重链和/或轻可变区；优选地其中，抗体能够减少或者中和IL-20的生物活性。
[2]根据[1]的抗体或IL-20结合片段，(1)其识别由氨基酸序列101-PDHYTLRKISSLANSFLT-118(SEQ ID NO：69)、102-DHYTLRKISSLANSF-116(SEQ ID NO：70)和/或101-PDHYTLRKISSLANSFL-117(SEQ ID No：72)组成的IL-20衍生肽，其中，仅P101、I109、S110和/或L117可以由其他氨基酸(优选为丙氨酸)取代，以及(2)其不能或基本上不能识别由氨基酸序列97-NYQTPDHYTLRKISSLAN-114(SEQ ID NO：71)组成的肽。
[3]根据[1]或[2]的抗体或IL-20结合片段，其能够结合和/或中和鼠IL-20。
[4]根据[2]或[3]的抗体或IL-20结合片段，其中，生物活性是：
(a)人IL-20在基于细胞的STAT(信号转导子和转录激活子)激活测定法中发信号；
(b)抑制IL-20细胞因子细胞表面受体结合；
(c)人IL20R1/IL20R2受体复合物的人IL-20介导的激活；和/或
(d)人IL-20的促炎活性。
[5]根据权利要求1至4中任一项的抗体或IL-20结合片段，其中，至少CDR与图1中所示的相应的CDR是至少70％、优选地80％并且更优选地至少90％相同的和/或VH和/或VL可变区的框架区的氨基酸序列与图1中所示的相应框架区是至少70％、优选地80％并且更优选地至少90％相同的。
[6]根据[1]至[5]中任一项的抗体或IL-20结合片段，其是Ig1或者IgG4。
[7]根据[1]至[6]中任一项的抗体或其IL-20结合片段，包括CH和/或CL恒定区，所述恒定区包括选自表1中列出的CH和CL氨基酸序列(SEQ ID NO.：6、14、22和30)的氨基酸序列或具有至少60％同一性的氨基酸序列。
[8]一种人抗体或其抗原结合分子，其与[1]至[7]中任一项的抗体竞争用于结合至人IL-20，例如根据实施例2待被测定的人IL-20。
[9]根据[1]至[8]中任一项的抗体，其选自由单链Fv片段(scFv)、F(ab’)片段、F(ab)片段以及F(ab’)2片段组成的组。
[10]一种编码至少[1]至[9]中任一项的抗体或抗原结合片段的一个免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸，优选地其中，该多核苷酸是编码可变区和至少部分恒定域的cDNA。
[11]一种包括[10]的多核苷酸的载体。
[12]一种包括[10]的多核苷酸或[11]的载体的宿主细胞。
[13]一种用于制备抗IL-20抗体或其一个或多个免疫球蛋白链的方法，所述方法包括：
(a)培养[12]的细胞；以及
(b)从培养物中分离所述抗体或其一个或多个免疫球蛋白链，优选地其中，抗IL-20抗体是分别如上文限定的和在下文说明书中的实施方式中描述的抗人IL-20抗体或IL-20结合片段、其合成衍生物或生物技术衍生物。
[14]一种由[11]的多核苷酸编码的或由[13]的方法获得的抗体或其一个或多个免疫球蛋白链。
[15]一种包括[1]至[9]或[14]中任一项的抗IL-20抗体或IL-20结合片段的或通过培养[12]的细胞获得的免疫结合物，其优选地包括放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、重金属、磁性颗粒、药物或毒素。
[16]一种包括[1]至[9]或[14]中任一项的抗IL-20抗体或IL-20结合片段、[15]的免疫结合物、[10]的多核苷酸、[11]的载体以及[12]的细胞的组合物，优选地其中该组合物是：
(a)药物组合物，并且还包括药学上可接受的载体，并且可选地还包括对治疗炎性疾病有用的额外的药剂；或
(b)诊断组合物或试剂盒，并且还包括常规用于基于免疫的诊断方法或基于核酸的诊断方法中的试剂。
[17][1]至[9]或[14]中任一项的抗IL-20抗体或IL-20结合片段、[15]的免疫结合物或者[16]的组合物，用于以下方法中：
(a)治疗或防止免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的进展；
(b)与免疫介导的或自身免疫性疾病或病症相关联的症状的改善；和/或
(c)诊断或筛选在受试者中免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的存在或者确定受试者发展免疫介导的或自身免疫的疾病或病症的风险，所述疾病或病症与患者中IL-20的表达和活性相关联，优选地其中，所述疾病选自由以下项组成的组：炎症性肠病(IBD；包括克罗恩病、溃疡性结肠炎和脂泻病)、强直性脊柱炎和其他形式的脊柱关节炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、类风湿性关节炎、幼年型类风湿关节炎、骨质疏松症、干燥综合征、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎或者它们的组合，包括皮肤、舌、食道或肺的鳞状细胞癌的癌症，以及血管炎症。
[18]一种制备用于治疗与IL-20的表达和活性相关联的疾病的药物组合物的方法，该方法包括：
(a)培养[12]的细胞；
(b)将来自培养物的抗体、其生物技术的衍生物或一个或多个免疫球蛋白链纯化至药物级；以及
(c)将抗体或其生物技术衍生物与药学上可接受的载体混合。
[19]一种用于诊断与IL-20的表达相关联的受试者中的免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的方法，包括使受试者细胞的生物样品与[1]至[9]、[14]或[15]中任一项的抗IL-20抗体或IL-20结合片段接触，并且检测IL-20的存在。
[20]一种检测或确定在已分离的生物样品中IL-20的方法，包括将样品与根据[1]至[9]、[14]或[15]中任一项的抗体混合，允许抗体与混合物中存在的IL-20形成复合物，以及检测混合物中存在的所述复合物。
本发明还利用和涉及IL-20拮抗剂的实施方式，例如现有技术中描述的抗IL-20抗体，通过使用本文公开的人源化单克隆抗人IL-20抗体或IL-20结合片段、其合成的或生物技术的变体，根据本发明将其进行调整。例如，使用特别是抗IL-20单克隆抗体拮抗IL-20活性已经被描述为用于治疗各种炎症性病症的有希望的方法；参见例如，国际申请WO99/27103、WO01/46261、WO03/051384、WO2004/085475和WO2006/086396。结合人IL-20的大鼠或小鼠单克隆抗体也已经被描述；参见例如国际申请WO2005/052000、WO2007/081465和WO2010/000721。然而，迄今还没有提供适合于患者治疗的人源化抗体体。本发明解决了本领域中的这些和其他需要。
此外，如附图中示出的和实施例中描述的，本发明还提供了一种用于评估感兴趣的配体与其一种或多种同源受体的结合的新的测定法，用于确定针对配体的例如候选化合物(诸如抗体)的测试物质是否防止其结合至一种或多种相应受体的能力，以及用作用于候选抗配体抗体的竞争和交叉竞争测定法。
在这种新的测定法中，在细胞中表达了一种或多种相关受体或抗体，其中优选地，至少配体结合域暴露在细胞表面上，并且该配体作为融合分子被提供，即连接至报道基因或标记有报道基因。显然，这种新的测定法不仅允许评估例如抗体的候选化合物是否防止配体与细胞上的其一种或多种同源受体的结合，并且因此具有拮抗活性，而且还允许评估候选化合物是否可以提高配体结合，并因此提高报道基因活性，例如通过稳定配体受体结合，从而识别配体结合的激动剂(agonist)。在本文中，本领域技术人员将理解的是，本发明的新的测定法不仅对于抗配体结合分子的筛选有用，而且对于结合同源结合域(即配体的受体)的和干扰配体结合的物质的筛选也是有用的。因此，本文描述的用于测试抗配体抗体的实施方式以及实施例可以等同地应用于抗配体结合域，特别是受体，优选地具有细胞外配体结合部分。
举例说明，当感兴趣的配体用作报道基因(即荧光素酶融合蛋白)时，该配体的细胞结合是由细胞相关联的报道基因(即荧光素酶活性)测量的。这种测定法允许评估针对配体的抗体是否通过观察报道基因活性的变化(即由荧光素酶所减少的或增加的光发射)来防止或增强其结合细胞上相应受体的能力。
Hitherto，Luker等人(Biotechniques 47(2009)，625-632)描述了用于趋化因子-趋化因子受体结合的基于发光的测定法，并且建议使用生物发光报道基因，该生物发光报道基因用于探测趋化因子受体和识别趋化因子-趋化因子受体结合的小分子调节剂。这种测定法还进一步发展成在共培养的活细胞和动物中的体内配体受体互补测定法；参见Luker等人，Nature Medicine 18(2012)，172-177。
然而，在所附的实施例中所示的在体外测定法中强健的生物发光细胞以及其用于识别、分离和/或验证靶蛋白中和抗体(特别是干扰素或白介素的拮抗剂)的用途还未被描述或建议。因此，在该方面，本发明涉及一种新的细胞测定法，用于评估感兴趣的配体与表达用于该配体的一种或多种相关受体的细胞的结合。在其最广泛的方面，本发明涉及：
[21]一种用于评估感兴趣的配体与配体结合域的结合的方法，包括：
(a)使表达可选地包括细胞内功能区(2)的配体结合域的靶细胞(1)与包括用报道基因(4)(其优选的是可检测的酶)标记的感兴趣的配体(3)的样品接触；以及
(b)测定报道基因活性(5)，优选为化学发光；
其中，与对照相比，报道基因活性的增加表明感兴趣的配体与配体结合域的结合；以及
其中，该配体结合域源自受体或抗配体抗体，优选地其中，配体是干扰素或白介素。
如本文中使用的术语“配体”的定义如在Oxford Dictionary of Biochemistryand Molecular Biology(牛津大学生物化学和分子生物学词典)，Oxford UniversityPress(牛津大学出版社)，1997，2000年修订并且2003年再版，ISBN 0 19 850673 2中提供。配体包括感兴趣的任何小分子、核酸、蛋白质或抗原，例如但不限于CD标记配体(诸如CD48、CD40L、CD40、CD 122)、细胞因子和趋化因子(诸如IL-2、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-6、TNF-a、ILβ、IL-10、IP-10)、生长因子(诸如ITAC、MIG、EGF、VEGF)、共刺激配体(诸如ICOS-L、OX-40-25L、CD137-L)、信号通路的组分以及实际上感兴趣的任何抗原。配体还包括抗体。在本发明的方法中，该配体最优选地是可溶性配体。
报道基因是可检测的部分，并且可以是能够被直接或间接追踪的任何种类。许多这样的部分是本领域已知的并且包括标准标记，诸如基于在生物化学、细胞生物学和医学诊断应用中常规使用的放射性、荧光、化学发光、胶体金属的等离子体共振或酶比色检测的那些标记。
“配体结合域”可以是能够结合如上文中限定的配体的任何分子。通常，配体结合域可以源自蛋白或多肽，诸如受体分子。然而，原则上非蛋白质结合分子可以提供根据本发明的配体结合域，例如合成的结合分子；参见例如，描述了对于亲水的肽具有抗体样亲和性的合成聚合物纳米颗粒的Zeng等人，ACS Nano 4(2010)，199-204。然而，在优选的实施方式中，配体结合域将源自受体或抗体，通常是抗配体抗体。配体结合域可以是能够结合诸如上文限定的配体的任何多肽或者其部分。受体是调节包括基因表达的信号转导通路的配体激活的结合蛋白。这些受体的作用机制包括作为第一步的通过配体的结合的激活和作为第二步的通过受体转导的信号触发或抑制在基因表达的调节中达到顶点的下游信号级联。负责配体结合的域是配体结合域(LBD)。这种域参与多种活动，包括配体结合和同源二聚化和/或异源二聚化。伴随配体和非配体形式的受体之间的转变的构象变化显著地影响它们对于其他蛋白的亲和性(Edwards,J.Mammary.Gland Biol.Neoplasia 5(2000)307-24；Thomas-Chollier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(2013)17826-31)。
然而，为了本发明的方法和测定法的目的，细胞膜上细胞外存在的配体结合域的存在是充足的，因为与现有技术中的大多数生物测定法相比，本发明的方法和测定法不取决于用于记录报道基因活性的细胞内的信号。然而，配体结合域可以被融合或结合至一个或多个功能区，例如跨膜区。
跨膜区通常用于将受体锚固至细胞膜(因此细胞外配体结合域是膜结合的)并且包括能够如此做的任何蛋白质(或编码这样的蛋白质的核酸)。这样的区可以源自多种源，诸如以下项中的全部或部分：T细胞受体(TCR)的α链、β链、或ζ链，CD28、CD4、CDS、CD8、CD3a、CD16、CD22、CD23、CD45、CD80、CD86、CD64、CD9、CD37、CD122、CD137或CD154、诸如白介素受体的细胞因子受体、TNF-R、酪氨酸蛋白激酶受体或干扰素受体或集落刺激因子受体。可替换地，跨膜区可以是合成的。合适的合成的跨膜区将主要包括诸如亮氨酸和缬氨酸的疏水氨基酸。
如在本发明的上下文中使用的术语“靶细胞”包括任何细胞，其能够表达感兴趣的一个或多个配体结合域。特别地，可以使用哺乳动物细胞和细胞系，其内源性地表达能够结合至感兴趣的配体的一种或多种受体，或者其可以被转染或者转化以表达一种或多种所述受体。然而，同时已经开发了人造细胞和细胞膜，其中可以插入受体用于研究配体结合；参见例如，为了查阅Hammer 和Kamat，FEBS Letters 586(2012)2882–2890和May等人，Angewandte Chemie，国际版52(2013)，749DOI：10.1002/anie.201204645。
本发明的方法和测定法可以通过用包括用报道基因(4)标记的感兴趣的配体(3)的样品接触表达可选地包括细胞内功能区(2)的配体结合域的靶细胞(1)来进行。如果存在同源配体，则在两种结合试剂之间形成复合物，并且将该配体结合至靶细胞。将未结合的感兴趣的配体从反应混合物中分离，例如通过洗涤，并且经由报道基因部分(6)检测了结合至靶细胞的配体的存在，例如由于其针对底物(5)的酶活性。在靶细胞配体复合物中报道基因活性的存在(或量级)表示配体的存在(或浓度)。本发明的方法和测定法可以在任何合适的容器、瓶子、培养皿、多孔板、液体毛细管系统等中进行。可替换地，可以进行本发明的方法和测定法，使得具有结合至配体结合域的配体报道基因的细胞被选择性地检测到，例如当使用荧光部分作为报道基因时，通过荧光激活细胞分选术(FACS)。
如实施例中示出的，本发明的方法和测定法特别适合于测定受体配体结合，并且特别地测定细胞因子(最优选地为干扰素或白介素)与其一种或多种同源受体的相互作用。
细胞因子是小的糖蛋白信使，其在不存在统一分类系统的情况下通过发现的数字顺序、给定的功能活性、在炎症反应中的动力学或功能作用、起源的原代细胞或与相关的分子所分享的结构同系物(homologue)被不同地识别；参见例如，McInnes in Kelley'sTextbook of Rheumatology,Elsevier Health Sciences，第9版Vol.1 by Firestein etal.(2012)，第3部分，23章，367-377。描述了根据本发明使用的细胞因子和受体，但其不限于在McInnes(2012)第3部分，第23章，367-377，表23-1至23-8中列出(其公开内容通过引用并入本文)中以及在国际申请WO2013/098419和申请人的待审国际申请WO2015/001047中公开的细胞因子列表中描述的细胞因子和受体。优选地，细胞因子是人细胞因子。在优选的实施方式中，细胞因子选自由以下项组成的组：白细胞三烯、淋巴因子、白介素、干扰素、趋化因子和TNF家族的成员。然而，原则上配体实际上可以是任何可溶性分子，包括激素和生长因子，但也可以是小分子，诸如能够与同源结合域(诸如受体或抗体)相互作用的糖类(碳水化合物，carbohydrate)。
因此，根据本发明进行的实验出人意外地揭示了LBCA测定法特别适合于测试候选抗配体抗体，其中，通过其跨膜形式的表达，抗配体抗体用作抗配体结合域；参见实施例9和附图17，它们描述了293T MSR细胞中抗IFN-α和IFN-ω抗体26B9的表达及其与荧光素酶标记的IFN-ω的有效结合。因此，本发明的方法和测定法还特别适合于测定抗体配体结合。因此，在另一优选的实施方式中，本发明涉及：
[22]根据[21]的方法，其中，配体结合域是抗体或配体/抗原结合片段或它们的衍生物。
同样在该实施方式中，配体/抗原可以优选地是细胞因子，然而显然地也可以测定任何其他配体/抗原相互作用。
如背景技术部分讨论的和实施例中示出的，具有所需的特异性的抗体的初步筛选利用了生物化学测定法(诸如ELISA和LIPS测定法)，其通常足够用于确定例如抗体与配体的特异性结合。然而，由于这些测定法几乎总是在非细胞(即非生理)情况下进行的，所以这种生物化学测定法不可能可靠地预测给定的抗体是否也能够在体内结合至配体并且干扰其生物活性，例如抑制配体与受体的结合，从而触发信号转导通路。
相比之下，如实施例5中所证明的，本发明的基于细胞的测定法(其中在细胞环境中评估配体结合)对于测定抗配体分子的中和活性方面是可靠的，如由实施例5中描述的功能性STAT3测定法所证实的。因此，本发明的基于细胞的配体结合测定法排除了对进行这种功能性测定法的需要，从而减少了实验室设备、时间和成本。因此，在一个实施方式中，本发明涉及：
[23]根据[21]或[22]的方法，其中，配体结合域和/或配体是生物活性的。
尽管原则上可以研究任何细胞、配体和配体结合域，但是本发明的测定法特别适合于评估哺乳动物的(特别是人的)配体和配体结合域，还由于该原因，使用哺乳动物的并且特别是人的靶细胞是优选的。因此，在另一优选的实施方式中，本发明涉及：
[24]根据[21]至[23]中任一项的方法，其中，靶细胞、配体和/或配体结合域是哺乳动物的，优选地是人源的。然而，靶细胞不一定是哺乳动物源的，而可以是任何细胞，包括原核生物。配体结合域还可以是非生物细胞样颗粒的部分，包括但不限于病毒样颗粒(VLP)、合成的细胞或其他细胞样颗粒。
细胞外配体结合域包括能够结合蛋白配体的任何蛋白(或编码这种蛋白的核酸)。最优选地，配体是可溶性配体。膜结合的细胞外配体结合域包括或源自例如表面细胞膜受体、诸如激酶受体、G蛋白偶联受体(GPCR)、生长因子受体、细胞因子受体(诸如白介素受体)，例如IL-IR(I型和II型)、IL-2R(α、β和γ亚基)、IL-3R、IL-4R、IL-5R、IL-6R；gp130、IL-8R、IL-13Ral、IL-4Ra、IL-30R、IL-15R(α、β和γ亚基)、IL-17R；一种或多种TNF受体(TNF-RI和TNF-RII)；用于IL-β、IL-2、IL-10、IL-15、G-CSF、CSF-1、M-CSF、GM-CSF、HGF、EGF、PDGF、IGF、FGF、TGF-β、IP-10、ITAC、MIG和VEGF的受体；CD标记物，诸如CD2、CD4、CDS、CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD19、CD20、CD22、CD24、CD28、CD33、CD40、CD48、CD69、CD70、CD122和CD244；以及用于ICOS-L、OX-40-L、CD40L和CD137-L的受体。用于本发明的方法和测定法中的膜结合的细胞外配体结合域还可以包括作为结合域的分子，其通常在细胞膜上或细胞膜内不能被发现，例如，细胞因子或可溶性蛋白，例如但不限于通常分泌的蛋白。因此，细胞外配体结合域还可以包括SOST、诸如LRPS和LRP6的LDL相关蛋白、细胞因子和生长因子，参见下文其凭借跨膜区存在于细胞外。本领域技术人员将会理解的是，优选地在载体的DNA序列中包括将细胞外配体结合域靶向细胞表面的信号序列，该载体分别编码配体结合域和受体。这种信号序列在本领域中是已知的并且包括与细胞外配体结合域天然相关联的序列(信号序列/前导序列)。在细胞外配体结合域到细胞表面的运输期间，通常将处理和移除信号序列。
在一个实施方式中，可以选择细胞外配体结合域，使得其与一个或多个其他细胞外配体结合域相互作用以实现能够识别(结合至)配体的多重相关的细胞外配体结合域。因此，在一个实施方式中，本发明的方法和测定法中的靶细胞包括多于一个的膜结合的细胞外配体结合域。更优选地，可以在靶细胞中表达两个或更多个不同的配体结合域以实现能够识别(结合至)配体的多重相关的细胞外配体结合域。
如说明书中对图7A所解释的，报道基因可以是任何可检测的部分。报道基因部分包括能够生成可测量的(可检测的)信号的化合物，诸如但不限于荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。因此，报道基因信号测量包括光发射、荧光或碱性磷酸酶产物的测量。为了合适的报道基因分子的观点；参见例如LesnerBiochem.Anal.Biochem.4(2012)，1-2；Kain和Ganguly Curr.Protoc.Mol.Biol.(2001)Chapter 9：Unit 9.6)。因此，在一个实施方式中，本发明涉及：
[25]根据[21]至[24]中任一项的方法，其中，报道基因是可检测的酶，优选地选自由以下项组成的组：荧光素酶、SEAP、辣根过氧化物酶以及碱性磷酸酶，优选地其中，可检测的报道基因活性是光发射(发光、化学发光)。
海肾荧光素酶(本文缩写为“Ruc”)是特别优选的。最优选地，如实施例中示出的，报道基因是高斯荧光素酶(Gaussia luciferase)，其是高度敏感的、天然分泌的并且可以在培养物中的和离体的动物血液中的细胞的条件培养基中被检测到，从而允许细胞变化的实时监测(Tannus等人，Mol.Ther.11(2005)，435-43；Wurdinger等人，Nat.Methods.5(2008)；171-3)。可替换地，报道基因还可以是荧光素酶；参见例如Hall等人，ACS Chem.Biol.7(2012)，1848-1857。在另一实施方式中，可检测的部分包括可检测的酶的多个复制物。这可以通过例如使用编码酶的多个复制物的克隆载体来完成，该克隆载体可以串联连接或者位于结合域的任一侧。其他可检测的部分包括例如荧光蛋白(诸如绿荧光蛋白)和由例如Clontech在其Living ColorsTM产品系列中出售的各种其他有色的蛋白。
然而，如提及的荧光素酶和等效的光发射酶是特别优选的。例如，用荧光素酶标记配体的测定法经受细胞、塑料制品和缓冲液的背景自发荧光。相比之下，在本发明的LCBA测定法中没有背景光发射，因为荧光素酶仅在少数非常特定的动物中发现，而不在哺乳动物中发现。作为另外的优点，当细胞受体未知时，只要存在响应细胞系，LCBA测定法就还工作。最终，本发明的细胞结合测定法的一个主要优点是其允许评估例如在最大地上游的信号转导级联中的点处的抗体的功能。因此，该测定法不受例如存在于反应混合物中的其他信号分子的影响，其可能触发干扰下游信号事件。因此，由于中和抗体的存在可以测定非常复杂的混合物(诸如血清)。
在现有技术中描述的一些测定法中，报道基因抗原融合蛋白未分泌，但是在细胞内被表达，其需要裂解细胞以收获融合蛋白。由于这是相当消耗时间的，所以在本发明的测定法的优选实施方式中，所标记的配体是优选分泌的重组融合物。因此，在一个实施方式中，本发明涉及：
[26]根据[21]至[25]中任一项的方法，其中，所标记的配体是重组融合蛋白，其优选地通过宿主细胞表达和分泌。
在本发明的方法中使用的靶细胞可以是任何细胞，其天然地或基因工程地表达一个或多个配体结合域。例如，可以建立基因工程细胞系(特别是哺乳动物细胞系)，其构成地(必要地/组成地，constitutively)或根据诱导表达感兴趣的配体结合域。合适的诱导系统(诸如TET抑制剂系统)是本领域技术人员已知的。可替换地，特别是为了研究几种配体结合互相作用，可以按时将靶细胞进行基因工程以表达配体结合域，例如通过在开始进行本发明的方法时编码配体结合域的合适的表达载体的转染。类似地，还可以根据需要制备配体报道基因融合分子，例如在通过在宿主细胞中瞬时表达融合蛋白的融合配体报道基因蛋白的情况下；还参见所附的实施例5。
可以使用任何合适的技术(诸如电穿孔、磷酸钙转染、DEAE右旋糖酐介导的转染、转位(transvection)、显微镜注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、刮痕实验、弹道引入或感染)用表达载体来转染哺乳动物靶细胞和宿主细胞(参见例如Davis等人，BasicMethods in Molecular Biology，1986和Sambrook等人，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第2次编辑，Cold Spring Harbour laboratory Press，Cold SpringHarbour，NY，1989)。用于诱导宿主细胞内的载体表达的合适的条件是本领域中已知的。转染可以是瞬时的，或者可替换地，稳定表达配体结合域的细胞系可以如本领域中已知的那样被生产。特别地，参见Methods in Molecular Biology 7.Gene Transfer andExpression Protocols.Edited E.J.Murray 1991。在另一方面，还可以使用内源性地表达感兴趣的配体结合域的靶细胞；参见例如，实施例5中使用的HEK 293T MSR细胞和COLO 205结肠直肠癌细胞。例如，可以使用分别表达生长因子或细胞因子受体的细胞和细胞系，诸如白介素依赖性细胞系。此外，鉴于实施例9中关于膜结合抗体作为配体结合域所描述的实验，表达抗原结合域的细胞可以用作包括分别表达膜结合抗体和T细胞受体的B细胞和T细胞的靶细胞。
因此，在另一优选的实施方式中，本发明涉及：
[27]根据[21]至[26]中任一项的方法，其中，靶细胞内源地、瞬时地或稳定地表达配体结合域和/或根据[26]的方法，其中，宿主细胞瞬时地表达融合蛋白。
原则上，配体报道基因融合可以单独地和经由生化手段分别地被生产，例如通过体外翻译或感兴趣的配体与报道基因部分的化学连接(chemical linking)。可替换地，还可以经由例如高亲和性系统(诸如链霉亲和素/生物素)或用金属(诸如优选为胶体金)直接标记的物理相互作用间接地将报道基因部分连接至感兴趣的配体。原则上，这对于融合蛋白(诸如细胞因子和可以以分离的和固体形式被提供的荧光素酶的融合物)也是可能的。
然而，使用化学生产的和/或分离的融合蛋白的缺点可能是，因为它们的制备和/或在例如分离过程、干燥和/或冻干的过程中，配体组分已经不再具有对于反映配体在体内与其结合域的结合而言必要的天然构象，并且天然结构也不在液体样品中重建。这对于分别具有半胱氨酸残基和二硫键的细胞因子和激素(诸如G-CSF)是特别真实的，G-CSF在其制备过程中趋向于变性并且仅可以在苛刻的条件下被复性(refold)。
相反，如实施例中示出的，根据本发明，配体报道基因融合蛋白可以在宿主细胞中瞬时地表达，并且在培养基中分泌。分别含有融合蛋白的培养物的培养基和上清液可以直接用于本发明的方法中而不需要进任何立即的纯化步骤，该融合蛋白应该包括以其天然形式的感兴趣的配体；参见实施例5。在该实施方式中，最合适的是分别使用从宿主细胞获得的培养基和上清液作为对照，该宿主细胞不表达和分泌融合蛋白或者表达和分泌具有不同配体的融合蛋白。因此，在特别优选的实施方式中，本发明涉及：
[28]根据[26]或[27]的方法，其中，样品包括宿主细胞的培养物的上清液，优选地其中，对照物是没有上清液的培养基或者是没有表达和分泌融合蛋白的同种细胞的培养物的上清液。
原则上，能够分别表达配体结合域和分泌融合蛋白的任何种类的细胞可以用于本发明的方法中，其中哺乳动物细胞优选地用作靶细胞和宿主细胞。哺乳动物宿主细胞包括白血病细胞(Jurkat cell)、HEK 293、CHO、NIH3T3、NSO、Cos-7、Hela、MCF-7、HL-60、EL4、A549和K562细胞以及被配置成含有和表达编码配体结合域的DNA的合适的表达载体，即具有能够结合至配体的细胞外配体结合域的生物测定受体，以及在例如国际申请WO2007/060406(其公开内容通过引用并入到本文)中描述的跨膜区。然而，与国际申请WO2007/06040中公开的生物测定相反，根据本发明的方法使用的受体不需要含有报道基因区和能够传送信号的一个或多个细胞内信号区。当然，对于本发明的方法的目的，细胞外配体结合域和可选的跨膜区或另一膜锚定多肽(这二者之一或者二者可以与细胞外配体结合域同源或异源)的表达是足够的。
优选地，宿主细胞和靶细胞分别是在所附实施例中使用的细胞，即人胚肾(HEK)293T MSR细胞或者COLO 205结肠直肠癌细胞。因此，在另一优选的实施方式中，本发明涉及：
[29]根据[21]至[28]中任一项的方法，其中，靶细胞和/或宿主细胞是HEK 293TMSR细胞或COLO 205结肠直肠癌细胞。优选地，靶细胞是瞬时表达I型和II型的IL-20受体的HEK 293T MSR细胞，并且样品包括表达IL-20荧光素酶融合蛋白的HEK 293T细胞的上清液；或者靶细胞是瞬时表达跨膜抗干扰素ω(IFNW)抗体的HEK 293T MSR细胞，并且样品包括表达IFNW荧光素酶融合蛋白的HEK 293T细胞的上清液。
如实施例中示出的，不考虑在步骤(b)之前靶细胞是裂解了还是没有裂解，本发明的方法给出了类似的结果。这是有利的，因为靶细胞在用于使靶细胞与连接有报道基因的感兴趣的配体接触的步骤(a)中分别仅必须是有活力的并且细胞膜处于非变性状态。在该步骤之后，本发明的方法可以在相对健全的条件下以类似的方式进行作为生物化学测定法(诸如ELISA或LIPS测定法)。因此，可替换地，本发明涉及：
[30]根据[21]至[29]中任一项的方法，其中，在步骤(b)之前靶细胞被裂解或者未被裂解。
如图7中示出的和本文之前讨论的，本发明的方法鉴于其在体内配体结合的反映和其敏感性也是特别适合于确定测试物质是否能够干扰配体结合，即是积极地还是消极地，并且因此充当感兴趣的配体与其同源配体结合域的结合的激动剂或拮抗剂。因此，在另一重要的方面，本发明涉及：
[31]一种用于确定测试样品是否包括感兴趣的配体与其同源配体结合域的结合的激动剂或拮抗剂的测定法，其包括[21]至[30]中任一项的方法的步骤，其中在步骤(a)之前或者在步骤(a)期间，配体和/或靶细胞经受测试样品(7)，并且在步骤(b)中，与在没有测试样品或者存在对照物的情况下的报道基因活性相比：
(i)报道基因活性的增加指示激动剂；以及
(ii)报道基因活性的降低指示拮抗剂。
本发明的测定法在图7中示出并且在实施例5中进一步进行了描述。简言之，在本发明的上述方法中，评估了直接针对感兴趣的配体的测试样品或例如抗体是否防止其结合至一个或多个相应的配体结合域(诸如靶细胞上配体的一种或多种同源受体)的能力。因此，在步骤(a)之前感兴趣的配体可以分别与测试样品和测试物质接触，其中，当测试物质与感兴趣的配体结合时，阻挡了其结合到配体结合域。因此，通常在结合配体报道基因融合分子时将是可观察到的报道基因活性降低或所有的一起缺失了，从而指示了配体结合的拮抗剂的存在。可替换地，在步骤(a)之前，靶细胞可以分别与测试样品和测试物质接触，其中当测试物质与配体结合域结合时，其结合感兴趣的配体的能力将会被阻挡，这继而再次导致报道基因活性的降低或者甚至缺失，并因此指示了拮抗剂的存在。此外，特别是为了确定配体结合的激动剂，在步骤(a)期间测试样品和测试物质分别与测试细胞和感兴趣的配体接触，其中当例如测试物质与具有其一个或多个同源配体结合域的感兴趣的配体的复合物结合时，感兴趣的配体与结合域的结合可以是稳定的，并且结果导致配体的定量较高的结合，并因此报道基因活性的增加指示了激动剂的存在。总之，本领域技术人员将会很好地认识到使用本发明的测定法来测定感兴趣的配体与其一个或多个同源配体结合域的结合的激动剂或拮抗剂的可能性。
分别如在本发明的上下文中使用的术语“激动剂”和“拮抗剂”，尽管用抗体及其生物技术衍生物来说明，但还包括其他非抗体分子，该其他非抗体分子能够将感兴趣的配体结合到其同源配体结合域或者结合到两者的复合物，从而激励例如支持配体受体结合或者拮抗例如干扰配体与其一个或多个结合域的相互作用。因此，测试样品中的化合物包括抗体、小分子(例如NCE)以及其他药物、蛋白质、多肽和肽、模拟肽、脂类(脂质，lipid)、糖类和核酸、锚蛋白、受体、主要组织相容性复合物(MHC)分子、伴侣蛋白(chaperones)(诸如热激蛋白(HSP))以及细胞-细胞粘附分子(诸如钙粘蛋白、整合素、C型凝集素和免疫球蛋白(Ig)总科的成员)。然而，仅为了清楚而不限制本发明的范围，关于抗体和抗体样分子讨论了大多数的下文的实施方式，该抗体和抗体样分子代表了用于开发治疗和诊断剂的优选的“激动剂”和“拮抗剂”。最优选地，在测试样品中存在的感兴趣的化合物是抗体。
另外，如上文参照实施例9所解释的，本发明的测定法还可以分别用作竞争和交叉竞争测定法，例如用于研究候选抗配体抗体是否结合至给定配体的相同或不同的表位；参见实施例9和图18，其示出了根据本发明的交叉竞争测定法，其中示出了两种抗干扰素抗体8H1和26B9结合至干扰素ω的不同表位。因此，在本发明的测定法的一个实施方式中，靶细胞表达了膜结合抗体或其配体结合域，并且感兴趣的配体的结合的激动剂和拮抗剂分别可以是相同种类的抗配体抗体或者类似的候选抗配体抗体。因此，在该实施方式中，本发明的测定法分别用作竞争和交叉竞争测定法，其中，配体结合域和激动剂/拮抗剂源自相同的配体结合分子。
在实施例和附图中，关于抗配体抗体的识别和分离说明了本发明的测定法。然而，如本领域技术人员将理解的是，本发明的测定法也能够识别和分离与配体结合域相互作用的化合物，例如配体的受体。例如，识别受体的配体结合域的抗体可以防止配体与受体的结合，从而降低了报道基因活性，因为报道基因标记的配体从待分析的样品中丢失，并因此指示了拮抗剂抗体的存在。
除非另有说明，否则术语“测试样品”在本文中与术语“测试物质”或“测试化合物”可互换使用，并且通常指示了测试物质通常作为样品被提供，例如存在于溶液中和/或取自一批测试物质。同样地，由于本发明的测定法可以在例如药物发展的任何阶段使用，因此测试样品可以是例如来自化学合成的反应混合物、天然来源的样品诸如土壤样品、水样品、微生物的制备物、体液等，取自食物和药物生产的中间步骤的样品，以及来自药物使用之前的临床前批次的药物的样品。因此“测试样品”可以是含有假定的激动剂或拮抗剂的任何种类的物质，要么是单独的要么是在上下文中与其他成分一起的。如实施例中示出的，测试样品可以优选地是含有能够结合感兴趣的配体、配体结合域和/或其复合物的抗体或等效分子的体液，诸如血浆。
因此，在特别优选的实施方式中，本发明涉及：
[32]根据[31]的测定法，其中，测试样品包括(i)抗配体抗体、配体结合片段、其合成衍生物或生物技术衍生物或者(ii)抗配体受体(LR)抗体、LR结合片段、其合成衍生物或生物技术衍生物，优选地其中，抗体是人源化抗体体；并且可选地其中，对照物是非配体或非LR结合抗体。
如下文中进一步解释的，本发明的测定法特别适合于确定在源自受试者(例如已经用抗原免疫的哺乳动物)的样品中具有所需的特异性的抗体或等效的结合分子的存在，例如感兴趣或其他的配体可能被期待产生抗配体抗体，例如因为由内部的或外部的刺激(诸如疾病或病源感染、压力(应激，stress)、中毒等)所引起的哺乳动物中的免疫应答。在另一方面，由于某一水平的锻炼或正压力激活了免疫系统并且可以保护免遭普通的疾病(诸如感冒、流感、癌症等)，在获取样品之前受试者可能已经进行相应的经历。因此，在优选的实施方式中，本发明涉及：
[33]根据[31]或[32]的测定法，其中，样品源自体液，所数据体液优选地是从疑似含有抗配体或抗LR抗体的受试者获得的血清，优选地其中，该受试者遭受自身免疫或炎症性疾病、病源感染、癌症，具有显著病程(即，稳定的疾病，在缓解期或已经克服疾病)的受试者，由于这可以指示对抗抗体的疾病的存在，或者受试者已经进行了锻炼或经历的正压力。
如实施例5中说明的和图7、图8和图14中示出的，存在进行本发明的方法和测定法的不同方式。例如，为了分别确定配体结合的特异性和识别竞争性抑制剂，细胞配体结合报道基因测定法可以在存在竞争物(例如配体或抑制剂)的情况下进行，例如相同的配体而不是不同的但是与感兴趣的配体密切相关的并且可以不标记或用不同于连接到感兴趣的配体的报道基因的报道基因标记的报道基因或配体；还可参见下文进一步描述的实施方式，特别是关于双荧光素酶测定法。(假定的)竞争性配体可以在测试细胞已经经受报道基因标记的感兴趣的配体之前、同时或之后被添加，例如，以便得到关于感兴趣的配体的亲和性或竞争性配体的生物活性的信息，例如，其是否能够在配体结合之后置换感兴趣的配体。同样地，可替换地或者另外地，具有测试物质的测试样品可以在使靶细胞与配体接触之前、同时或之后被添加。根据怀疑测试物质是否结合至感兴趣的配体或结合至靶细胞上存在的配体结合域或者结合至两者，感兴趣的配体或靶细胞可以用测试物质预孵育。在这种情况下，分别没有结合配体和配体结合域的分子可以优选地在用测试样品培养感兴趣的配体和靶细胞之前、期间或之后过量被添加。因此，在一个实施方式中，本发明涉及：
[34]根据[31]至[33]中任一项的测定法，其中，配体或靶细胞利用测试样品预孵育，或者作为对照利用非配体结合分子或非LR结合分子或过量浓度的未标记配体和/或不同的并且未标记的配体或用不同报道基因标记的配体预孵育。优选地，该对照配体与感兴趣的配体密切相关和/或该对照非配体结合分子或者非LR结合分子与测试物质密切相关。
在本文中，本发明的测定法还允许分别确定测试样品和测试物质的能力，以在例如结合至类似但是不同的细胞因子和/或它们结合至配体结合域(例如在一种或多种细胞因子受体内)的不同位点之间来区分。为此，在优选的实施方式中，使用了一种或多种不同的感兴趣的抗原(例如细胞因子)并且标记有产生不同信号的报道基因部分，优选地可以连续地或者同时地评估该不同信号，例如因为在使用不同荧光素酶或荧光蛋白作为报道基因的情况下不同波长的光的发射。在该实施方式中，例如由Promega Corporation，2800WoodsHollow Road，Madison，WI 53711 USA提供的荧光素酶报道基因测定系统( 报道基因(DLRTM)测定系统)可以根据本发明被改变和使用，其中，一种细胞因子针对萤火虫荧光素酶被标记，而第二种细胞因子针对海肾荧光素酶被标记。根据本发明的测定法，从单个样品顺序地测量融合至第一感兴趣的配体的萤火虫(光素酶)荧光素酶和融合至第二感兴趣的配体的海肾(动物海肾或者海堇)荧光素酶的活性。首先通过添加荧光素酶底物(例如荧光素酶测定试剂II(LAR II))来测量萤火虫荧光素酶报道基因以产生持续至少一分钟的发光信号。在定量萤火虫发光之后，终止这种反应，并且通过向其中添加Stop&(停止&)试剂同时开始海肾荧光素酶反应。
因此，在该实施方式中，可以容易地确定给定的测试物质(例如抗细胞因子抗体)是否示出了与一种细胞因子比与另一种细胞因子或者与一种细胞因子的受体的配体结合位点的优先的结合，同时如果存在，留下另一种配体结合域性质上不受影响。
原则上，候选抗体或等同的人细胞因子结合剂可以通过任何可能的来源提供，包括经典的杂种瘤方法以及用于产生合成抗体和抗体样细胞因子结合分子的组合的库。因此，抗体工程已经成为一门成熟的科学，包括用于天然和非天然人抗体谱系的发现方法、生产策略和修饰技术以及用非组合和组合策略的它们的开发。这还包括使用基于杂种瘤技术、外围B细胞的克隆扩增、单细胞PCR、噬菌体展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示以及计算机生物学(in silico)设计的方法从天然的、免疫的、转基因的和合成的人抗体谱系生产和选择人抗体(mAb)；对于天然和非天然抗体谱系的特性以及用非组合和组合策略的它们的开发的观点，参见例如，Beerli和Rader的Mining human antibody repertoires，mAbs 2(2010)；365-378以及Campbell等人，British Journal of Pharmacology 162(2011)，1470–1484；这些文献的公开内容通过引用合并到本文中。
然而，如上文提及的，在本发明的优选实施方式中，候选抗人细胞因子抗体或其细胞因子结合片段源自由包括分离单克隆抗体或其抗原结合片段的方法提供的人抗体，其中从获自受试哺乳动物的样品中分离表达单克隆抗体的B细胞。在过去的数十年中，已经开发了几种技术来分离单克隆抗体，并且产生人源化的或完全人抗体；参见例如，也被授予为欧洲专利EP 1 974 020 B1的国际申请WO 2007/068758中引用的参考文献，特别是在[0002]至[0027]部分中，其公开内容通过引用合并到本文中。通常，抗体(例如来自B细胞的单克隆抗体)的分离依赖于免疫球蛋白基因的克隆和表达。这可以通过使用来自B细胞的杂交VH和VL基因的噬菌体展示库，或通过使用单细胞PCR从单个B细胞或从永生化B细胞克隆分离配对的VH和VL基因来完成。
根据本发明，来源于患有自身免疫和/或炎性疾病的患者的B细胞的候选抗人细胞因子抗体的用途被证明是特别有价值的，即特别用于提供人抗体。因此，在一个实施方式中，本发明涉及：
[35]一种用于制备人源化单克隆抗配体抗体或其配体结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物的方法，其中，从获自哺乳动物的样品中分离表达单克隆抗体的B细胞，优选地其中，哺乳动物感染有受损的中枢和/或外周耐受性或丧失自身耐受性，诸如自身免疫多内分泌腺病念珠菌病外胚层营养不良(APECED)，该方法包括：
(a)针对抗配体抗体的存在来测定样品；
(b)纯化B细胞，优选地为来自已经被识别含有抗配体抗体的样品的记忆B细胞；
(c)培养该B细胞，针对抗体的生物活性可选地测定B细胞的样品，以及
(i)分离单克隆抗体；或者
(ii)从所述B细胞或记忆B细胞获得用于所述抗体的至少可变区的免疫球蛋白基因谱(谱系)；以及
(d)使用所述谱(谱系)以在宿主细胞中表达所述抗体或其配体结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物，并且分离抗体或其配体结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物；
(e)测定抗体或其配体结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物的样品的生物活性；可选地还包括步骤
(f)将已分离的抗体或其配体结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物与药学上可接受的载体混合；
其特征在于，配体是如前述项[21]至[34]中的任一项限定的配体，并且根据[31]至[34]中任一项的测定法分别进行在步骤(a)、(c)和/或(e)中测定样品和抗体。
可以通过本领域公知的方法来进行该抗体或其配体结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物的重组生产。可选地，为了引入限制位点，操纵免疫球蛋白基因谱，即编码所述抗配体抗体的至少可变区的DNA，以改变密码子的使用，引入用于功能区或肽连接的编码序列；和/或以添加或优化转录和/或翻译调节序列。单个已分类的细胞的RT-PCR优选地被用于获得所述抗体的免疫球蛋白基因谱。例如在国际申请WO2008/110372(其公开内容通过引用合并到本文中，特别是补充方法部分和实施例2)中描述了使用特别是单细胞RT-PCR获得人抗体的方法。如本文中使用的，术语“cDNA”和“mRNA”包括所有形式的核酸，包括但不限于基因组DNA、cDNA和mRNA。使用在本领域技术的范围内的分子生物学和重组DNA的常规技术可以进行抗体或抗体片段的克隆和异源表达(Wrammert等人，Nature 453(2008)，667-671和Meijer等人，J.Mol.Bio.358(2006)，764-772)。这些技术在文献中有全面的解释，例如在Sambrook，1989Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版中。为了检索VH/VL序列和表达，可以使用Tiller等人，在J.Immunol.Methods 329(2008)，112–124中的方法。可以使用用于表达重组人抗体的任何合适的宿主细胞，例如酵母、植物细胞或动物细胞。优选地，使用诸如CHO细胞和HEK细胞的哺乳动物宿主细胞；还参见例如，欧洲专利EP 1 974 020B1的[0164]到[0171]部分，其公开内容通过引用合并到本文中。
在一个实施方式中，本发明的抗体的恒定区或其部分(特别是CH2和/或CH3域但可选地还有CH1域)与根据本发明的方法所分离的天然人单克隆抗体的可变区是异源的。在本文中，在本发明的抗体的治疗应用的情况下该异源的恒定区优选是人源的，但在动物研究情况下也可以是例如啮齿动物源的。
关于受试哺乳动物(特别是患有自身免疫和/或炎性病症的人类患者)的使用，候选抗体优选地从哺乳动物(特别是人类)分离，其感染有受损的中枢和/或外周耐受性或丧失自身耐受性，可能由于自身耐受的破坏或失调的发生或与自身耐受的破坏或失调的发生相关，优选地由单基因自身免疫病症引起。提供用于根据本发明的自身抗体的特别合适的来源的动物的实例是哺乳动物，例如具有与AIRE(自身免疫调节剂)基因中的突变相关联的病症的人，分别诸如自身免疫多内分泌腺病综合征1型(APS1)和自身免疫多内分泌腺病念珠菌病外胚层营养不良(APECED)(Peterson等人，Nat.Rev.Immunol.8(2008)，948-957)，以及自身免疫多内分泌腺病综合症2型(APS2)(Baker等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.95(2010)，E263–E270)和自身免疫调节多内分泌腺病肠道病X连锁的综合征(IPEX)(Powell等人，J.Pediatr.100(1982)，731–737；Ochs等人，Immunol.Rev.203(2005)，156-164)。优选地，分离候选抗体的受试哺乳动物展示了针对预定的人细胞因子的血清反应性。关于APECED/APS1患者以及他们自身免疫体的筛选的更多细节；参见申请人的国际申请WO2013/098419的说明书，其公开内容通过引用合并到本文中，以及其中描述的实施例，特别是第112-117页的材料和方法的部分；第117-118页的实施例1和第128页的实施例7以及下面的表1至表14；以及第168-171页的实施例17，其公开内容均通过引用合并到本文中。
在本文中，注意的是，尽管如原则上提到的，人抗体的生成已经被报道用于一些抗原种类(诸如淀粉样蛋白-β和病毒抗原)，但在人体中成熟的分离的和重组的人抗细胞因子抗体的提供似乎还没有被报道。因此，根据本发明，人的候选抗人细胞因子抗体优选地通过分离人抗体的新的并专有的方法来克隆，这公开在申请人的国际申请WO2013/098420中，该公开内容整体通过引用合并到本文中。简言之，用于分离感兴趣的抗体的样品包括或由外周血单核细胞(PBMC)和血清组成，用于检测可能的抗体反应性。源自受试者的样品可直接用于例如测试针对一种或多种所需的抗原的血清反应性，或可以进一步被处理，例如富集B淋巴细胞。特别地，优选的是该样品包括或源自于产生感兴趣抗体的B细胞，最优选地为记忆B细胞。在仅允许B细胞的确定寿命的条件下培养该记忆B细胞，通常不多于1至2周直到从B细胞培养物中挑选出针对理想抗原反应的细胞，随后进行单个挑选的细胞的RT-PCR以用于获得免疫球蛋白基因谱；对于更详细的描述，参见国际申请WO2013/098419的第118至120页的实施例1和实施例2，以及特别是国际申请WO2013/098420的第27页至31页的实施例1至实施例4以及图1和图6，其公开内容通过引用合并到本文中。
实际上，关于患有自身免疫和/或炎性病症(诸如APECED)的患者的使用，其证明了申请人的国际申请WO2013/098419和WO2013/098420中公开的方法特别适合于分离抗人细胞因子抗体。
本发明的分离的抗体当然可以不用这样应用于患者，但通常必须药学配制，以确保例如它们在患者体内的稳定性、可接受性以及生物利用度。因此，在一个实施方式中，本发明的方法还包括将分离的和验证的候选抗体或其细胞因子结合片段与药学上可接受的载体混合的步骤。在Remington’s pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，N.J.1991)中和在Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，ISBN：0683306472中可获得药学上可接受的载体的详尽讨论。用于给药的优选形式包括适合于肠胃外给药的形式，例如通过注射或灌输(输注，infusion)，例如通过药丸注射或者连续灌输。当产品用于注射或者灌输时，其可以采取在油性或者水性载体中的悬浮液、溶液或乳剂的形式，并且其可以含有通常用于药物制剂中的试剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可替换地，抗体分子可以以干燥的形式，在与合适的无菌液体一起使用之前用于重构。一旦配制，组合物可以直接给予受试者。优选的是组合物适于给予人类受试者。药物组合物可以通过任何数量的途径给药，包括但不限于口服的、静脉内的、肌内的、动脉内的、髓内的、腹膜内的、鞘内的、心室内的、经皮肤的、经皮的、局部的、皮下的、鼻内的、肠内的、舌下腺的、阴道内的或者直肠的途径给予。
本发明的抗体或其片段可以直接用作治疗剂。然而，在一个实施方式中，由本发明提供的人抗人细胞因子抗体或其细胞因子结合片段被可检测地标记或者附着至药物，例如其中，可检测的标记物选自由以下项组成的组：酶、放射性同位素、荧光团和重金属。本发明的标记的人抗人细胞因子抗体或者细胞因子结合片段可以用于检测体内或体外的特异性靶，包括体外“免疫化学/免疫标记”样测定。在体内，它们可以以类似于核医学成像技术的方式用于检测表达感兴趣抗原的组织、细胞或其他材料。标记物、它们在诊断中的用途以及它们偶联至本发明的人细胞因子结合分子是本领域技术人员已知的。在本文中，在一个实施方式中，术语药物用途包括体内诊断用途，特别是在人体内的体内成像。
因此，本发明还涉及一种制备用于在上述自身免疫和/或炎性病症和疾病中的任一种的治疗中的药物用途或作为治疗干预的靶标的人抗人细胞因子抗体或其细胞因子结合片段的方法，包括本发明的上述方法中任一种的步骤，可选地其中，人抗人细胞因子抗体或其细胞因子结合片段被可检测地标记或者附着至功能区或药物，优选地其中，该可检测的标记物选自由酶、放射性同位素、荧光团和重金属组成的组。
当然，本领域技术人员将理解是，如上文和实施例中描述的本发明的方法和测定法通常可应用于验证干扰配体结合的一批药物，例如用于质量检查和选择用于药物用途的那些批次，这证明在本发明的测定法中是足够活性的，即有效地拮抗或对抗(agonizing)配体结合。因此，在另一实施方式中，本发明涉及：
[36]一种用于制备包括抗配体抗体或其配体结合片段、合成的或生物技术的变体的药物组合物的方法，其用于治疗自身免疫病症、炎性病症、癌症或由配体结合至受体介导的病症，该方法包括：
(a)提供抗配体抗体；
(b)使抗体经受[31]至[34]中任一项的测定法；以及
(c)仅当抗体被确定为拮抗剂或激活剂时，在药物组合物中配制抗体或其衍生物。
本发明还考虑了用于本文描述的方法和测定法中的试剂以试剂盒的形式被包含。这种试剂盒将包括容纳在合适的包装材料内的第一结合试剂和报道基因(分开的或连接的)以及第二结合试剂，二者都如上文中描述的。试剂盒还可以可选地含有其他组分，诸如用于试剂盒使用的说明材料、用于检测第一结合试剂的报道基因的试剂(例如，缓冲液、当与可检测的酶接触时产生光的化合物等)、用于比较或校准目的的阳性对照等。
因此，在另一实施方式中，本发明涉及：
[37]一种用于进行根据[21]至[30]中任一项的方法或根据[31]至[34]中任一项的测定法的试剂盒，该试剂盒包括：
(a)含有用报道基因(4)标记的感兴趣配体(3)和/或能够表达并优选地分泌配体报道基因融合蛋白的宿主(报道基因)细胞的样品或者用于制备它们的装置(方法，means)；
(b)表达可选地包括细胞内功能区(2)的配体结合域的靶细胞(1)或用于制备它们的装置(方法，means)；
(c)用于确定报道基因活性(5)的装置(6)；
该试剂盒优选地包括用于分别进行所述方法和测定法的说明书。
合适的靶细胞和宿主细胞、载体、配体、受体和报道基因已经在上文和实施例中进行了描述。用于海肾荧光素酶融合的质粒已经在之前描述了，例如在Burbello等人，BMCBiotechnol.5(2005)，22和国际申请WO2006/071970中；还参见由Promega Corporation，2800Woods Hollow Road，Madison，WI 53711 USA提供的pRL海肾荧光素酶报道基因载体和用于这种报道基因载体的相应的技术公报。
此外，由InvivoGen，5，rue Jean Rodier，F-31400Toulouse，France提供报道基因检测试剂盒，即其分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报道基因系统，其中，通过使用比色测定、QUANTI-BlueTM和HEK-BlueTM检测测量所培养的细胞(如InvivoGen报道基因细胞)的上清液中的酶活性来容易地量化SEAP；分泌的合成腔肠素荧光素酶Lucia报道基因系统，其中使用即用型生物发光测定试剂QUANTI-LucTM可以直接测量细胞培养上清液中的Lucia荧光素酶，并且根据本发明可以修改和使用β-半乳糖苷酶(LacZ)报道基因系统：例如，与InvivoGen报道基因细胞相反，根据本发明的报道基因(如上文限定的宿主细胞)细胞系表达并且优选地分泌配体报道基因融合蛋白，例如融合至SEAP或Lucia荧光素酶的细胞因子。第二种，即靶细胞系表达一个或多个配体结合域，例如一种或多种细胞因子受体或至少它们的配体结合域优选地连接至膜锚定多肽。此外，或可替换地，本发明的试剂盒包括用于报道基因(宿主)细胞和靶细胞(这二者与表达载体相对应)中的一种或两种，当转染到合适的细胞中时，分别产生所需的报道基因和靶细胞。
因此，在优选的实施方式中，本发明涉及：
[38]一种用于分别进行根据[21]至[37]中任一项的方法和测定法的试剂盒，该试剂盒包括：
(a)至少一种第一表达载体，包括编码[6]的重组融合蛋白的DNA或编码报道基因的DNA序列以及用于编码感兴趣配体或其片段的DNA的插入位点；和/或
(b)可选地至少一种第二表达载体，包括编码感兴趣配体的一个或多个配体结合域的DNA；
(c)至少一种第三表达载体，包括编码单独用作阳性对照的报道基因的DNA；
(d)至少一种对照抗体，中和步骤(c)的报道基因，或可替换地未标记的重组配体作为报道基因结合的竞争性抑制剂；
(e)至少一种稀释缓冲液；
(f)至少一种测定缓冲液；
(g)包括报道基因底物的至少一种染色溶液；
(h)可选地化合物，其是光谱移动器，该光谱移动器移动了由生物发光生成系统生成的光的光谱，以及可选地用于检测报道基因的存在或活性的装置；
该试剂盒优选地包括用于分别进行所述方法和测定法的说明书。
与本发明的试剂盒相关联的，(例如，在包括试剂盒的容器内)可以是以由调控药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机关规定的形式的通知，该通知反映了通过用于人给药的制造、使用或销售的机构的许可。此外地或可替换地，试剂盒包括用于在合适的诊断测定中使用的试剂和/或说明书。组合物(即本发明的试剂盒)当然特别适合于进行根据本发明的方法和测定法，特别适合于评估如上文所述的感兴趣配体与配体结合域的结合。
在分子的和细胞的生物化学中用于诊断目的的一般方法可以在这种标准的教科书中找到，如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3次编辑(Sambrook等人，Harbor Laboratory Press 2001)；Short Protocols in Molecular Biology，第4次编辑，(Ausubel等人，eds.John Wiley&Sons 1999)；Protein Methods(Bollag等人，John Wiley&Sons 1996)。用于诊断目的的试剂、检测装置和试剂盒可从商业供应商(诸如PharmaciaDiagnostics、Amersham、BioRad、Stratagene、Invitrogen和Sigma-Aldrich)以及本文所引用的参考文献(特别是专利文献)中的任一者给出的来源获得。
本发明的方法和测定法以及试剂盒的组成在下文中的附图和实施例中说明。
可以理解的是，附图、附图说明和实施例中公开的特征中的任一者单独地或组合地示出了权利要求书中和上文描述的实施方式[21]至[38]中的特征。因此，权利要求书中和上文相对应实施方式中的任何特征可以由在附图、附图说明和实施例中使用的相对应的特征的一个或多个特定实施方式代替。这特别适用于用于表达配体结合域的靶细胞和宿主细胞，例如细胞因子受体和配体-报道基因，例如细胞因子-荧光素酶融合蛋白和用于其的表达载体。此外，可以理解的是，本发明还涉及在附图、附图说明和实施例中描述的任何材料和方法，用于本发明的方法和测定法的任何一个实施方式中。为了完整性，本领域技术人员将会理解的是，说明书、实施例和附图可以补充有公开的内容，特别是欧洲专利申请EP14 175 585.0和EP 14 175 673.4的实施例和附图，其涉及与本申请中公开相同的发明，并且本申请要求了它们的优先权。
从下文中的说明书和实施例，本发明的其他实施方式将显而易见。当如此做时，如果没有其他特别的指示，术语“单克隆抗体”、“mAb”、“MAB”和“MAb”在本文中可互换使用。此外，虽然本发明是通过参照人源化抗体体来示出和说明的，该人源化抗体体是最初从根据本发明进行的和在实施例中描述的实验中获得的，但是可以理解的是，本发明的抗体或抗体片段包括抗体的合成的和生物技术的衍生物，其意味着通过化学或重组技术合成的任何工程化抗体或抗体样IL-20结合分子，其保留受试者抗体的一种或多种功能特性，特别是其针对IL-20的中和活性。因此，虽然为了简明起见可通过参照抗体来描述本发明，但是除非另有说明，否则抗体的合成的和生物技术的衍生物以及等同的IL-20结合分子也意指术语抗体并且包括在术语抗体的含义中。
附图说明
图1：本发明的IL-20特异性人抗体的可变区(即重链和κ/λ轻链(VH、VL))的氨基酸序列。A：抗体20A10(IgG4，κ)；B：抗体2A11(IgG1，λ)；C：抗体7D1(IgG1，λ)；D：抗体6E11(IgG1，λ)。用加有下划线的CDR指示了框架(FR)和互补决定区(CDR)。斜体氨基酸指示尚未序列化但已从数据库获得的序列。
图2：从APS1患者分离出的血清中IL-20LIPS血清活性的比较。在X轴线上指示了个体患者，而在Y轴线上指示了MAB结合的RLU测量值。患者APS1-2和APS1-9的血清示出了增强的IL-20反应性。
图3：示例性的抗IL-20抗体与IL-20构建体结合的EC50ELISA测定，该IL-20构建体将N-端(g1IL-20)或C端(g2IL-20)融合到高斯荧光素酶。A：2A11；B：6E11；C：6H2；D：7D1；E：20A10；F：非IL-20特异性单克隆抗体用作非特异性结合的对照。抗体2A11、6E11和20A10以高亲和性与两种IL-20构建体结合，相比之下剩余的抗体6H2和7D1以较低的亲和性与g2IL-20结合。
图4：在瞬时表达I型和II型IL-20受体的HEK 293T MSR细胞中，人源化抗体IL-20单克隆抗体中和重组IL-20介导的STAT3激活。在不存在抗体或存在人源IL-20单克隆抗体或如指示的人对照IgG(huIgG)的情况下，使细胞保持未处理或用重组人或鼠IL-20刺激。将细胞裂解产物经受SDS-PAGE并且在蛋白质印迹中pSTAT3水平是可视的。总的STAT3、α-微管蛋白以及IL-20RB水平用作负载对照。抗体浓度：5μg/ml。A：对照：rhIL-20和rmIL-20在瞬时表达I型或II型的IL-20受体的HEK 293T MSR细胞中诱导STAT3的剂量依赖性磷酸化作用。B：用rhIL-20(10ng/ml)或rmIL-20(25ng/ml)刺激。示例性的抗体2A11、20A10和7D1均中和了rhIL-20，而仅20A10还有效地中和了rmIL-20。
图5：人源化抗体IL-20单克隆抗体中和了用IL-20受体和KZ136-NLuc瞬时转染的HEK 293T MSR细胞中的KZ136-NLuc报道基因构建体的rhIL-20介导的诱导。如指示的在人源IL-20单克隆抗体的或在对照人IgG(huIgG)存在的情况下，用120ng/ml的rhIL-20或200ng/ml的rmIL-20刺激细胞。A：KZ136-NLuc报道基因构建体的示意图。B：对照：rhIL-20和rmIL-20在用I型IL-20受体和KZ136-NLuc瞬时转染的HEK 293T MSR细胞中诱导KZ136-NLuc报道基因构建体。C、D：示例性抗体20A10、7D1和2A11的rhIL-20IC50分析。E：示例性抗体20A10和对照人IgG的rmIL-20IC 50分析。F：示例性抗体20A10、7D1和2A11的IC 50值。
图6：在pSTAT3蛋白质印迹测定中人源化抗体IL-20单克隆抗体20A10针对rmIL-20的IC50分析。A：如指示的在不存在抗体的(-)或在存在示例性抗体20A10的(+)情况下，使瞬时表达I型IL-20受体的HEK 293T MSR细胞保持未处理或用25ng/ml的rmIL-20刺激。将细胞裂解产物经受SDS-PAGE，并且在蛋白质印迹中pSTAT3水平是可视的。总STAT3水平作为负载对照。B：在pSTAT3蛋白质印迹测定中示例性抗体20A10针对rmIL-20的IC50值。
图7：用于评估感兴趣的配体对表达用于该配体的相关受体的细胞的结合的新测定法。通过细胞相关的荧光素酶活性来测量该配体的细胞结合，因为感兴趣的配体被用作荧光素酶融合蛋白。这种测定法还允许评估直接针对该配体的抗体是否防止了其结合至细胞上相应受体的能力。人源化抗体IL-20单克隆抗体中和了IL-20高斯荧光素酶融合蛋白到瞬时表达I型和II型IL-20受体的HEK 293T MSR细胞的结合。如指示的在不存在抗体的(-)或者在存在人源IL-20单克隆抗体、人对照IgG(huIgG)或1μg/ml的rhIL-20的情况下，用表达IL-20高斯荧光素酶融合蛋白的HEK 293T细胞的上清液孵育细胞。抗体浓度：5μg/ml。A：描述了用于评估感兴趣配体与表达用于该配体的相关受体的细胞的结合的新测定法的示意图。由于感兴趣的配体用作报道基因(即荧光素酶融合蛋白)，所以配体的细胞结合通过细胞相关联的报道基因(例如荧光素酶活性)来测量。在移除未结合的融合蛋白之后，添加荧光素酶底物并且记录光发射。光输出与结合融合蛋白的量是成比例的。B：这种基于荧光素酶的化学发光细胞结合测定还允许评估测试物质(诸如直接针对该配体的抗体)是否防止了其结合至细胞上相应受体的能力。
附图标记：
1：表达配体结合域的靶细胞
2：诸如细胞因子受体的配体结合域，例如I型或II型IL-20受体
3：诸如细胞因子的配体，例如IL-20
4：诸如酶的报道基因，例如人IL-20高斯荧光素酶融合蛋白
5：可选地用于报道基因(诸如用于荧光素酶)的底物
6：可检测的报道基因活性，诸如光发射
7：诸如抗体(例如IL-20抗体)的测试物质
用于报道基因的底物可不是强制性的，例如在报道基因不是酶而是本身可检测的分子(诸如重金属(例如黄金)、放射性同位素或荧光蛋白)的情况下，其中，当配体结合至配体结合域时报道基因活性的变化可以是例如发射的淬灭、波长的变化、掩蔽等。C：对照：IL-20高斯荧光素酶融合蛋白(gl IL-20)是功能活性的。含有IL-20高斯荧光素酶融合蛋白的HEK 293T的上清液激活了瞬时表达I型和II型IL-20受体的HEK 293T MSR细胞中的STAT3。用连续稀释的g1IL-20上清液或用对照培养基(NC)孵育细胞。在蛋白质印迹中检测总的和磷酸化的STAT3、IL-20RB-Myc-DDK、IL-20RA-Myc-DDK以及IL-22RA(RA亚基)。D：对照：g1IL-20融合蛋白特异性地结合至表达IL-20受体I型的两种亚基的HEK 293T MSR细胞。通过未标记的rhIL-20(3μg/ml)消除结合。E：对照：由rhIL-20、rmIL-20和示例性的人源IL-20单克隆抗体20A10以剂量依赖性方式抑制了g1IL-20与表达I型的IL-20受体的HEK293T MSR细胞的结合。结合不受不相关的rhIL-32γ和对照人IgG(huIgG)的影响。F：示例性抗体2A11、20A10和7D1中和了g1IL-20与瞬时表达I型和II型IL-20受体的HEK 293T MSR细胞的结合。未标记的rhIL-20(1μg/ml)用作阳性对照。抗体浓度：5μg/ml。G：通过未标记的rhIFNA2(3μg/ml)和示例性的人源单克隆IFN抗体19D11(1.7μg/ml)抑制了IFNA5高斯荧光素酶融合蛋白(g1 IFNA5)与HEK 293T MSR细胞的结合。人对照抗体(huIgG,15μg/ml)显示没有效果。H：通过示例性的人源单克隆IFN抗体19D11抑制了g1IFNA2、A4、A5、A6、A7、A8、A10、A14、A16、A17和A21融合蛋白与HEK 293T MSR细胞的结合。g1IFNB和W的结合不受19D11影响。所有g1IFN的结合都不受对照人抗体(huIgG)的影响。抗体浓度：5μg/ml。
图8：化学发光细胞结合测定中人源化抗体IL-20单克隆抗体的IC50分析。在人源IL-20单克隆抗体(A：20A10，B：7D1以及C：2A11)存在下，用g1IL-20上清液孵育瞬时表达I型或II型IL-20 受体的HEK 293T MSR细胞。D：示例性抗体20A10、7D1和2A11的IC50值。
图9：交叉竞争。A：实验设计：在4℃下用在PBS O/N中稀释1/250的兔抗GLuc特异性抗体(NEB，E8023S)包被96孔微板(Costar，USA)。用PBS-T洗涤板并在室温下用含有2％的BSA(Sigma，Buchs，Switzerland)的PBS封闭板1小时。以2x106LU/加样孔的最终浓度添加30μl的GLuc-IL-20，并且在室温下孵育2小时。以在30μl的PBS中0.5μg/ml对3μg/ml的最终浓度将嵌合抗体与人竞争抗体预先混合，并且添加到板中。在室温下孵育2h后用PBS-T洗涤板，并且使用辣根过氧化物酶轭合的羊抗小鼠IgG Fcγ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch，在0.5％的BSA-PBS中1:500)测定人-小鼠嵌合抗体的结合，随后使用TMB底物溶液(Sigma，Buchs，Switzerland)测量HRP活性。在具有B：20A10hm，C：2A11hm，D：7D1hm和E：6E11hm的交叉竞争的实验中研究了本发明的示例性的人源化抗IL-20单克隆抗体与人-小鼠(hm)嵌合构建体到不同结合位点的差异性结合。F：作为IL-20非结合对照，使用了与不相关的抗原结合的人抗体。人源化抗IL-20MAb 20A10、2A11和6E11不与任何其他人-小鼠嵌合抗IL-20MAb竞争，但是人6H2与人嵌合7D1的结合有竞争。
图10：交叉反应性-通过GLuc-夹心ELISA测定和比较本发明示例性的人源化抗IL-20单克隆抗体6E11、2A11和20A10与小鼠和人IL-20的结合。A：用于测试交叉反应性的实验计划：在4℃下用在PBS O/N中稀释1/250的兔抗GLuc抗体(NEB，E8023S)包被96孔微板(Costar，USA)。用PBS-T洗涤板，并且用含有2％的BSA(Sigma，Buchs，Switzerland)的PBS在室温下封闭1小时。以2x 106LU/加样孔的最终浓度添加30μl的GLuc-IL-20，并且在室温下孵育2小时。以10μg/ml到4.6ng/ml的连续稀释将竞争抗原重组hIL-20和重组小鼠IL-20滴定到待测试的抗体(固定浓度为1μg/ml)。将每加样孔30μl的混合物在孔中在室温下孵育1.5小时。用PBS-T洗涤板，并且使用辣根过氧化物酶轭合的羊抗人Fc-γ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch，Europe Ltd.，Cambridgeshire，UK)测定人IgG与感兴趣的抗原在竞争物存在下的结合，随后使用TMB底物溶液(TMB，Sigma，Buchs，Switzerland)测量HRP活性。B、C、D：人IL-20抑制了所有测试的抗IL-20抗体到g2IL-20的结合。鼠IL-20可以抑制除了6E11之外的所有测试的抗体与g2IL-20的结合。
图11：耳朵炎症测定细胞色素氧化酶耳朵(CytoEar)IL-20。测试在hIL-20诱导的炎症之后本发明的不同的IL-20阻断抗体的效果。为了诱导炎症，以20μl体积中1000ng的浓度注射IL-20，该浓度是在滴定125ng、250ng、500ng和1000ng的不同浓度之后给出了最佳的实验结果。A：示例性的10天的实验时间轴。B：实验动物组A至M的实验治疗的概述。对于每一同期组群(cohort)，相对于第0天测量所计算的细胞色素氧化酶耳朵耳朵厚度测量与归一化为相关PBS对照相比为倍数变化。C：所有归一化的测量效果的概述。D：所有归一化测量效果的概述。E：仅为了清楚示出了IL-20结果的所有归一化测量的效果概述。与用(IL-20非相关的结合特异性的)IgG进行的对照治疗相比较，用本发明的抗体20A10和7D1进行的治疗(在第6天到第10天耳朵厚度显著减少，对于2A11分别是在第8天到第10天)导致由IL-20注射造成的耳朵厚度显著减少。平均值+/-SEM(标准差)，ID＝皮内细胞因子注射，M＝测量值-耳朵厚度，S＝动物的牺牲；ID-细胞因子注射；在第0天和第6天(IP)注射已测试的抗体2A11、20A10、7D1和控制IgG。IP＝腹膜内的抗体注射，ID＝皮内的耳朵注射。
图12：SPR分析。A：关于人和小鼠IL-20与本发明的示例性抗体的结合的感应图(传感图，sensogram)的详细分析。观察到了1:1结合动力。以1.5nM、3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM和100nM的浓度注射抗原。在图中指示了计算出的亲和性(KD值[M])。B：图示出了由用于所有已测试的抗体的缔合(结合，association)(结合率(on-rate)ka)和离解(离解率(off-rate)kd)的拟合曲线推导出的动力学参数。虚的斜线指示亲和性(KD)。C：与生物素-链霉亲和素结合的SPR文献值相比，本发明的示例性抗体的KD值。对于小鼠IL-20，针对20A0和2A11的人IL-20的亲和性分别在亚皮摩尔范围内和在亚纳摩尔范围内。
图13：本发明的人抗IL-20抗体的表位的图谱。A：本发明的抗体与偶联至微阵列的全长抗原的结合。Y轴指示在用Cy5轭合的二抗检测时的荧光强度(RFU)。B：针对本发明的所有抗体的人IL-20的18聚体肽类的初级肽阵列。C：针对本发明的所有抗体的鼠IL-20的18聚体肽类的初级肽阵列。D：针对20A10的人IL-20的初级肽阵列。在较低的图面中，描述了覆盖从赖氨酸89到蛋氨酸129的序列的肽类。示例性抗体20A10特异性地结合至肽20。E：包括残基P101到L129的示例性抗体20A10的表位的丙氨酸扫描。在位置D102、H103、Y104、T105、L106、R107、K108、S111、N114、S115和F116的丙氨酸取代导致了mAB结合的分解。
图14：人IL-22高斯荧光素酶融合蛋白特异性地结合至COLO205细胞。如所指示的在不存在抑制剂(-)或在存在竞争性抑制剂的情况下，用表达IL-22高斯荧光素酶融合蛋白(g2IL-22)的HEK 293T细胞的上清液孵育细胞。A：通过未标记的rhIL-22而非由不相关的rhIFNA2抑制g2IL-22与COLO 205细胞的结合。如所指示的，在不存在抑制剂或在存在未标记的rhIL-22或rhIFNA2(各1μg/ml)的情况下，用含有HEK 293T细胞的上清液的g2IL-22孵育COLO 205细胞。在记录灯光输出之前，将细胞裂解或不裂解。B：通过示例性的人源IL-22单克隆抗体30G1以剂量依赖性的方式抑制g2IL-22与COLO 205细胞的结合。该结合不受对照人抗体(huIgG)的影响。
图15：抗体26B9跨膜(26B9-TM)构建体设计。将包括人血小板衍生生长因子受体(PDGFR)-β(数据库登记号no.uniprot P09619，氨基酸513-561)的myc-表位和跨膜域的片段融合至恒定重域的C-端部分(A)。κ轻链的恒定区保持不变(B)。在HEK 293T MSR细胞的共转染后，通过使用抗人IgG-HC-FITC和抗人Igκ-APC标记的检测抗体的FACS分析来检测在细胞表面上正确装配的IgG。
图16：26B9-TM跨膜区的序列(SEQ ID：67)。包括来自DNA碱基1至30的myc-表位和来自DNA碱基34至183的PDGFR跨膜域的26B9-TM跨膜区的DNA和氨基酸序列。
图17：人IFNW-高斯荧光素酶融合蛋白特异性地结合至表达跨膜抗IFNW mAb的HEK293T MSR细胞。用指定量的编码抗IFNW mAb 26B9(26B9-TM)的膜结合形式的cDNA或空载体(Mock)反转染HEK 293T MSR细胞。在转染后48小时，添加IFNW-高斯荧光素酶(G1IFNW)并且在化学发光细胞结合测定中分析结合。A：对照：在已转染的HEK 293T MSR细胞的细胞表面上表达26B9-TM。在基于细胞的ELISA中转染后48小时分析表面抗体表达。B：g1IFNW在发光细胞结合测定中特异性地结合至表达26B9-TM的细胞。
图18：抗IFNW抗体的交叉竞争测定。g1IFNW与26B9-TM的结合通过可溶性26B9和克隆性相关的31B4抗体剂量依赖性地竞争。相比之下，结合不受对照IgG或示例性抗IFNW抗体8H1的影响。
具体实施方式
第一方面，本发明大体上涉及结合哺乳动物(优选为人源)的IL-20的新分子。因此，本发明涉及重组人源化单克隆抗白介素-20(IL-20)抗体、IL-20结合片段及其合成的和生物技术的变体，还涉及显示免疫性的等同的IL-20结合分子，例如IL-20结合特性和/或所附实施例和图中示出的抗IL-20抗体20A10、2A11、7D1或6E11中的任何一种的一种或多种生物活性。在本发明的特别优选的实施方式中，所提及的抗IL-20结合分子在人体中基本上是非免疫原性的。
如实施例2和实施例6中描述的，以及如图3和图10中示出的，本发明提供了选择性地或优选地结合人IL-20的抗IL-20抗体(例如抗体20A11和7D1)，以及同样地结合人和鼠IL-20的抗IL-20抗体(即抗体20A10)。因此，在一个实施方式中，本发明的人单克隆抗IL-20抗体、IL-20结合片段及其合成的或生物技术的变体能够结合重组鼠IL-20，而在另一实施方式中，其基本上不结合鼠IL-20。两个实施方式都有优点。例如，众所周知的是，对于治疗性抗体的发展，应该在动物模型中测试前导抗体，用于对特定疾病的治疗活性以及用于进行毒理学研究。在此小鼠是疾病模型最常用的动物，并且小鼠还是用于毒理学研究的初步筛选以及用于长期再生毒理学研究的最常用的动物。因此，源自抗体20A10的IL-20抗体和类IL-20结合分子由于其与鼠IL-20的交叉反应性而消除了对代替鼠抗体的需求。
另一方面，源自抗体20A11或7D1的抗IL-20抗体和类IL-20结合分子具有选择性地结合人IL-20的优点，由于该原因在动物模型中，其中由重组人IL-20诱导条件，诸如在申请人的共同未决的国际申请WO2015/001047中描述的用HuCyt oMab测定中，还参见其中的实施例2和3，该结果不受动物的内源性IL-20的影响。此外，区分人IL-20和相应的动物物种的抗IL-20抗体和类IL-20结合分子对于诊断用途是有利的。因此，本发明的人单克隆抗IL-20抗体、IL-20结合片段及其合成的或生物技术的变体的两个实施方式都具有其优点。
在优选的实施方式中，人单克隆抗IL-20抗体或其IL-20结合片段能够中和IL-20的生物活性，优选地，其中生物活性是
(a)在基于细胞的STAT(信号转导子和转录激活子)激活测定法中IL-20发信号，例如待根据实施例3确定的；
(b)IL-20细胞因子细胞表面受体结合的抑制，例如待根据实施例4确定的；
(c)人IL20R1/IL20R2受体复合物的人IL-20介导的激活，例如待根据实施例5确定的；和/或
(d)人IL-20的促炎活性，例如待根据实施例7确定的。
优选地，本发明的抗人白介素-20(IL-20)抗体、IL-20结合片段、其合成的或生物技术的变体在它们的可变区中包括：
(a)在以下项中描述的VH和/或VL可变区氨基酸序列的至少一个互补决定区(CDR)
(i)图1(VH)(SEQ ID NOs：2、10、18和26)；以及
(ii)图1(VL)(SEQ ID NOs：4、12、20和28)；
(b)如图1中描述的VH和/或VL区的氨基酸序列；
(c)由从(a)的氨基酸序列中的任一种的部分改变所得到的氨基酸序列组成的至少一个CDR；以及
(d)包括从(b)的氨基酸序列的部分改变所得到的氨基酸的重链和/或轻链可变区。
如下文更详细描述的，本发明的抗IL-20抗体、IL-20结合片段、其合成的或生物技术的变体可以是或源自任何类型、种类或亚类的免疫球蛋白分子。然而，在优选的实施方式中，本发明的抗体是IgG同型，最优选地是IgG1或IgG4亚类。
在本文中，本发明的抗IL-20抗体、IL-20结合片、及其合成的或生物技术的变体优选地包括CH和/或CL恒定区，该恒定区包括选自表1中列出的CH和CL氨基酸序列(SEQ IDNOs：6、8、14、16、22、24、30和32)的氨基酸序列或与提及的参考序列具有至少60％同一性、优选地70％同一性，更优选地80％同一性，还更优选地90％同一性，以及特别优选地至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
如上文所述，已经发现IL-20通过IL-20受体(R)复合物IL-20RA/IL-20RB(I型)或通过IL-20受体复合物IL-22RA/IL-20RB(II型)结合诱导STAT3激活(Parish-Novak等人，J.Biol.Chem.277(2002)，47517-47523；Logsdon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA109(2012)，12704-9)。此外，IL-20可以诱导各种促炎细胞因子，诸如单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、IL-6和IL-8(参见Hsieh等人，Genes Immun.7(2006)2434-242)，Hsu等人，ArthritisRheum.54(2006)，2722-2733，同上)。这种激活机制已经在本发明中用于设计用于确定IL-20活性的在体内和在体外的测定，参见实施例3和实施例4，以及用于实施例5中描述的新的细胞配体受体结合测定中，还用于监测如实施例7和附图4、5、6、7E、7F和8中描述的耳朵炎症测定中，以监测本发明的抗体的中和性能。如其中详细描述的，已经发现本发明的抗体对于IL-20、IL-20介导的STAT3激活以及I型和II型的IL-20受体具有有效的中和活性。因此，在一个实施方式中，本发明的IL-20抗体或其IL-20结合片段能够减少人IL-20的生物活性。在优选的实施方式中，生物活性是人IL-20诱导的炎症。此外，在本发明的一个实施方式中，在STAT报道基因测定和/或耳朵炎症测定中确定了生物活性。此外，如本文中例如实施例2中描述的和图3和图10中示出的通过ELISA和人IL-20高斯荧光素酶融合蛋白已经测试了本发明的抗体的结合亲和性。根据这些实验的结果，本发明提供了示出对IL-20的差异性结合亲和性的几种示例性的抗IL-20抗体及其IL-20结合片段，这示例了本文提供的IL-20结合分子的结合和中和特性。此外，如实施例10中描述的以及图13中示出的，本发明的示例性抗体20A10具有大的表位条(表位仓，epitope bin)，这意指18聚体IL-20肽的氨基酸序列中的大量氨基酸是必需的并且是抗体的结合所必需的。
因此，在本发明的实施方式中，提供了本发明的抗体或IL-20结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物，它们识别由氨基酸序列101-PDHYTLRKISSLANSFLT-118(SEQ ID NO：69)、102-DHYTLRKISSLANSF-116(SEQ ID NO：70)和/或101-PDHYTLRKISSLANSFL-117(SEQID No：72)组成的IL-20衍生肽，其中仅P101、I109、S110和/或L117可以用丙氨酸取代，并且抗体不识别或者基本上不识别由氨基酸序列97-NYQTPDHYTLRKISSLAN-114(SEQ ID NO:71)组成的肽。
有趣的是，抗体20A10不结合至源自小鼠IL-20的相应的肽，该相应的肽在其氨基酸序列中仅在Y104H和T118I的位置处不同于人IL-20 101-118肽，后者对于20A10结合是非必要的，也不结合至任何其他的小鼠IL-20衍生的18聚体肽，尽管抗体的结合全长小鼠Il-20的能力；参见例如，图13。因此，诱人的假设是，20A10抗体识别人和小鼠IL-20的构象表位，该构象表位还可以由人IL-20衍生肽101-PDHYTLRKISSLANSFLT-118(SEQ ID NO：69)和101-PDHYTLRKISSLANSFL-117(SEQ ID No：72)形成或模拟。
如实施例中证明的以及附图中示出的，说明本发明的抗IL-20抗体分别由在μM范围可达低于10ng(抗IL-20抗体2A11)中的EC和IC表征。因此，优选地，本发明的抗IL-20抗体、IL-20结合片段、其合成的或生物技术的变体具有如通过低于约100ng/ml、优选地低于50ng/ml和最优选地低于10ng/ml的g1IL-20和/或g2IL-20的ELISA测定而确定的EC50；参见实施例2和图3。此外，或可替换地，本发明的抗IL-20抗体、其IL-20结合片段、合成的或生物技术的变体具有如通过低于约1000ng/ml、优选地低于500ng/ml的rhIL-20的KZ136-NLuc报道基因测定而确定的IC50；参见实施例3和实施例4以及图5F中示出的。关于本发明的抗体的结合亲和性的更多细节，进一步参见例如下文的“结合特性”部分。
为了提供特别可用于治疗应用的抗体，即为了避免对本发明的抗体的免疫应答，如针对外来抗体诸如人体中的小鼠抗体(HAMA应答)所观察到的，本发明优选地涉及全人源的抗体，这是因为在示出了本发明的实施例中描述的示例性的抗IL-20抗体已经从患者中得到。
在本文中，与人源化抗体以及其他的人样抗体相反，也参见下文讨论，本发明的人源化抗体的特征在于包括CDR，该CDR已经通过人体观察到，并且因此基本上没有产生免疫原性的风险。因此，本发明的抗体仍可以表明是人源化的，如果抗体的可变轻链和重链中的一种或两者中的至少一个、优选地两个和最优选地所有三个CDR源自本文说明的人抗体。
这样的人源化抗体还可以称为“人自身抗体”，以便强调那些抗体实际上最初由人受试者表达，而不是例如通过人免疫球蛋白表达噬菌体库生成的体外选择的构建体，或在人免疫球蛋白库的转基因动物表达部分中生成的异种抗体，这是迄今代表用于试图提供人样抗体的最常用的方法。另一方面，本发明的人源化抗体体可以被表示为合成的、重组的和/或生物技术的，以便将其与自身可以通过蛋白A或亲和柱纯化的人血清抗体区分开。
然而，本发明使用并设想了本发明的抗体在动物模型中(例如在表达人IL-20的转基因小鼠中)的进一步研究。为了避免在实验动物中类似于人体中HAMA应答的免疫原性效果，在一个方面，提供了本发明的抗体或结合片段，它们是嵌合抗体，优选地是嵌合型啮齿动物-人或啮齿动物源化的(rodentized)抗体，最优选地是嵌合型小鼠-人或鼠源化的(murinized)抗体。
在一个实施方式中，本发明的抗IL-20抗体或IL-20结合分子包括如图1中描绘的或如由表1所示出的相对应的核酸编码的VH和/或VL区的氨基酸序列。另外，在另一实施方式中，本发明涉及抗IL-20抗体或IL-20结合分子，它们与如上文限定的用于特异性结合至人IL-20的本发明的抗体竞争；参见实施例6和实施例7以及图9至图10。特别地，提供了抗IL-20抗体，其证明了如对于实施例中和附图中示出的抗体所概述的免疫结合特性和/或生物性能。当存在时，术语抗体与抗原的“免疫学结合特性”或其他结合特性(在其所有语法形式中)是指抗体的特异性、亲和性、交叉反应性以及其他结合特性。
在一个实施方式中，本发明的抗IL-20抗体是抗体片段。例如，本发明的抗体或抗体片段选自由单链Fv片段(scFv)、F(ab’)片段、F(ab)片段、F(ab’)2片段以及单域抗体片段(sdAB)组成的组。
本发明的抗体的另一优点是，由于已经在天然抗体的生理和细胞环境中引发对天然抗体的体液免疫应答的事实，通常产生自身抗体并且可以分离自身抗体，该自身抗体可以识别抗原的构象表位，由于其在例如具有其他细胞组分的环境中呈递、在细胞表面膜上呈递和/或结合至受体。相反，生成单克隆抗体(诸如小鼠单克隆抗体)、其人源化版本或从噬菌体展示获得的抗体的传统方法通常采用靶蛋白的抗原片段，以用于分别使非人的哺乳动物免疫和检测，据此通常获得识别限制于免疫原的二维结构的线性表位或构象表位而非识别其生理和细胞环境中天然蛋白的存在的抗体。因此，谨慎地预期本发明的自身抗体在其表位特异性方面是独特的。因此，本发明还涉及表现出与根据本发明的方法所分离的自身抗体基本上相同的结合特异性的抗体和类结合分子。通过例如竞争性ELISA或更合适地分别使用自身抗体和单克隆衍生物作为参考抗体以及实施例中描述的或本领域技术人员已知的免疫测试法可以在基于细胞的中和测定中容易地测试这样的抗体。
本发明示例了IL-20结合分子即抗体及其结合片段，其特征通常可以在于在它们的可变区(即结合域)中包括可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)，该可变区包括图1的(VH)(SEQ ID Nos：2、10、18和26)和(VL)(SEQ ID NOs：4、12、20和28)中描述的氨基酸序列-参见图1中带有下划线的和表1中标记的示例性CDR序列。然而，如下文所讨论的，本领域技术人员清楚地意识到以下事实：可以另外或可替换地使用与图1中指示的那些的CDR在其氨基酸序列方面相差一个、两个、三个或甚至更多个的氨基酸取代的CDR，特别是在CDR2和CDR3的情况下。
如已经针对本发明的抗体进一步证实的，它们能够中和其靶蛋白的生物活性；参见例如，实施例3和图4、图5、图6、图7E、图7F以及实施例7和图11中描述的STAT3抑制测定和耳朵炎症测定的结果。在本文中，术语“中和”意指本发明的抗IL-20抗体或其IL-20结合片段在生化的基于细胞的或体内测定中能够干预其靶蛋白的生物活性，如通过在本发明的受试者抗体存在的情况下进行相应的测定可以评估的，其中，与在不存在本发明的抗体并且存在化合物例如已知在性质上使靶蛋白的生物活性不受影响的对照抗体的情况下蛋白的生物活性比较，靶蛋白的生物活性随着经受该测定的本发明的抗体的水平增加而降低。还可以使用已知能够中和靶蛋白的生物活性(诸如针对本发明的抗IL-20抗体所示出的)的参考抗体和使候选抗体经受测试样品来进行这种生物化学的基于体外和体内的测定，其中，可以观察到由于参考抗体和候选抗体的组合活性造成的附加中和效果，或者可以观察到候选抗体和参考抗体的竞争，这是可以通过对任一种抗体进行标记来确定的。因此，在本发明的优选实施方式中，本发明的抗IL-20抗体、IL-20结合片段、其合成的或生物技术的变体能够中和它们的抗原的生物活性。可以依据例如降低IL-20活性的量或就引入本发明的IL-20结合分子之后可以观察到这种降低的时间或者当然就该量和时间组合来评估中和效果。
如下文详细描述的，通过例如在宿主细胞中或在体外无细胞翻译系统中的表达，可以提供本发明下文进一步描述的抗IL-20抗体、其IL-20结合片段、及合成的或生物技术的变体以及免疫结合物。为了在宿主细胞中表达肽、多肽或融合蛋白，编码所述抗IL-20抗体、其IL-20结合片段、合成的或生物技术的变体以及免疫结合物的氨基酸分子可以被插入到合适的表达载体中，即含有用于所插入的编码序列的转录和翻译的必要的元素(元件)的载体。可以使用本领域技术人员已知的方法来构建含有编码感兴趣的多肽和适当的转录和翻译控制元件的序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组。在Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)，和Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1989)中描述了这样的技术；对于这方面的进一步细节，还参见下文“多核苷酸”和“表达”的部分以及实施例部分中引用的文献。
用于表达产物的合适的宿主细胞可以是任何的原核或真核细胞；例如，诸如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的细菌细胞、昆虫细胞(杆状病毒)、酵母细胞、植物细胞或动物细胞。然而，为了有效的处理，哺乳动物细胞是优选的。可用于该目的的典型的哺乳动物细胞包括CHO细胞、HEK 293细胞、COS细胞和NSO细胞。
本发明的分离的抗体当然可以不必像这样应用于患者，但通常不得不按药学配制以确保例如它们在患者中的稳定性、可接受性以及生物利用度。因此，在一个实施方式中，提供了本发明的方法，其还包括将抗IL-20抗体、其IL-20结合片段、合成的或生物技术的变体、免疫结合物与药学上可接受的载体混合的步骤。在下文中将进一步描述药学上可接受的载体。
本发明还涉及多核苷酸，该多核苷酸编码本发明的抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白链的至少一个可变区。优选地，所述可变区包括如图1中列出的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
在衍生或等同的序列的情况下，所述序列示出了与由上文涉及的和由序列表中识别的那些序列组成的组中的序列至少60％的同一性，更优选地(按照下面的顺序)至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，以及最优选地95％、至少96％-99％或甚至100％的同一性。两种序列之间的百分比同一性是由序列共享的相同位置的数目的函数，考虑到需要引入以用于两种序列的最佳针对的空位的数量以及每个空位的长度。序列的比较和两种序列之间的百分比同一性的确定可以使用本领域技术人员已知的数学算法来完成。本文中提及的同一性通过使用下文中进一步提及的BLAST程序来确定。
如上文提及的，在优选的实施方式中，本发明涉及基本上全人抗体(优选地为IgG)，其包括至少恒定区的恒定重链I(CH1)和对应的轻链，即与λ或κ组合的γ-1、γ-2、γ-3或γ-4。在特别优选的实施方式中，实施例中举例说明的为受试者抗体所分离的那些恒定区的核苷酸和氨基酸序列如下文表1中所描述的使用，并且关于核苷酸序列以SEQ ID NO：5、7、13、15、21、23、29和31中的使用，和/或关于氨基酸序列或与之前参考的这些具有至少60％同一性的的氨基酸序列在SEQ ID NO：6、8、14、16、22、24、30和32中使用。
根据上文，在一个实施方式中，本发明还提供了多核苷酸，该多核苷酸至少编码本发明的抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白链的可变区。通常，通过多核苷酸编码的所述可变区包括所述抗体的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。在下文“IgG结构”部分中更加详细地描述了抗体的可变区和恒定区。在本发明的优选实施方式中，多核苷酸包括具有下述多核苷酸序列的核酸、基本上由所述核酸组成或者由所述核酸组成，该多核苷酸序列编码如下文表1中所描述的本发明的抗体的VH或VL区。在该方面，本领域技术人员将容易理解的是，至少编码轻链和/或重链的可变域的多核苷酸可以编码任一免疫球蛋白链或它们中的仅一个的可变域。在优选的实施方式中，多核苷酸编码如上文所限定的抗IL-20抗体或其IL-20结合片段。
表1：本发明的IgG4、λ、IL-20特异性20A10抗体和IgG1、λ、IL-20特异性2A11、7D1和6E11抗体的可变区和恒定区((VH、VL、CH、CL)区)的核苷酸序列，以及根据本发明使用的IgG1、κ、IFN-α/ω特异性26B9、31B4、8H1和19D11抗体的可变区和恒定区((VH、VL、CH、CL)区)的核苷酸序列。加下划线的、加粗体的核苷酸或氨基酸指示了可变链序列中的CDR编码区。加下划线的、斜体的核苷酸或氨基酸指示了还没有排序的但已经从数据库获得的序列。在恒定链中，这样的15个区与数据库中的相关的人的种系可变区序列针对并根据数据库中的相关的人的种系可变区序列进行调谐；参见例如由蛋白工程MRC中心(剑桥大学(Cambridge)，英国(UK))主办的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)。
本领域技术人员将容易理解的是，具有上述可变域的抗体的可变域可以用于构建具有理想的特异性和生物功能的其他多肽或抗体。因此，本发明还包括多肽和抗体，该多肽和抗体包括上述可变域中的至少一个CDR并且有利地具有与在所附实施例中描述的抗IL-20抗体中的任何一个基本上相同或类似的结合特性。本领域技术人员将容易理解的是，根据本领域已知的方法，例如如欧洲专利申请EP 0 451 216 A1和EP 0 549 581 A1中描述的方法，可以通过使用本文描述的可变域或CDR来构建抗体。
此外，本领域技术人员已知，可以通过在CDR内或在与如由Kabat定义的CDR部分重叠的超变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196(1987)，901-917)内进行氨基酸替换来提高结合亲和性(亲和力，affinity)。因此，本发明还涉及其中所提及的CDR中的一种或多种包括一个或多个(优选地不多于两个)的氨基酸替换的抗体。优选地，本发明的抗体在其免疫球蛋白链的一种或两者中包括如针对SEQ ID NOs：2、10、18和26中VH区和针对SEQ ID NOs：4、12、20和28中VL区或如图1中所指示的可变区的两个或所有三个CDR。优选地，包括具有一个或多个氨基酸改变(例如取代)的所提及的CDR中的任一个的抗体或IL-20结合片段或其生物技术衍生物展示了实施例中示出的任一种抗体的结合特性。在特别优选的实施方式中，这样的抗体或其IL-20结合片段或生物技术衍生物识别IL-20衍生肽，该衍生肽包括氨基酸序列101-PDHYTLRKISSLANSFLT-118(SEQ ID NO：69)或102-DHYTLRKISSLANSF-116(SEQID NO：70)和/或101-PDHYTLRKISSLANSFL-117(SEQ ID No：72)，其中，仅P101、I109、S110和/或L117可以由其他的氨基酸(优选地为丙氨酸)取代，而除了T118的其他氨基酸的位置是不变的；还参见实施例10和图13D以及图13E。因此，在该实施方式中，由于缺失S115和F116抗体不识别或者基本上不识别由氨基酸序列97-NYQTPDHYTLRKISSLAN-114(SEQ IDNO：71)组成的肽。此外，如实施例10和图13C中示出的，这种抗体或其IL-20结合片段或生物技术衍生物优选地不结合源自小鼠IL-20的相应的18聚体肽，而优选地其能够结合全长人IL-20和小鼠IL-20。在本文中，应当理解的是，本发明的抗体或其IL-20结合片段或生物技术衍生物的所提及的结合特性的测定优选地如所附实施例中描述的(例如在如实施例10中所描述的和在图10中所示的微阵列上)进行。
编码上述抗体的本发明的多核苷酸可以是例如DNA、cDNA、RNA或合成产生的DNA或RAN，或以单独或组合的方式包括这些多核苷酸中的任一种的重组产生的嵌合型核酸分子。在优选的实施方式中，提供了包括上述多核苷酸的载体，可选地组合有对所述抗体的其他免疫球蛋白链的可变区编码的所述多核苷酸。这些载体可以包括其他基因，诸如允许在合适的宿主细胞中且在合适的条件下选择所述载体的标记基因。
优选地，本发明的多核苷酸可操作性地连接至允许在原核或真核细胞中表达的表达控制序列。所述多核苷酸的表达包括将多核苷酸转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞(优选地为哺乳动物细胞)中表达的调控元件对于本领域技术人员而言是公知的。调控元件通常包括确保转录的起始的调节序列和确保转录的终止和转录物稳定的可选聚A信号。另外的调控元件可以包括转录以及翻译增强子和/或自然关联的或异源的启动子区。
在该方面，本领域技术人员将容易理解的是，至少编码轻链和/或重链的可变域的多核苷酸可以编码两种免疫球蛋白链或仅一种免疫球蛋白链的可变域。
同样地，所述多核苷酸可以受相同启动子的控制或者可以被单独控制以用于表达。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括例如大肠杆菌中的PL、lac、trp或tac启动子，并且例如允许在真核宿主细胞中表达的调控元件是酵母中的AOX1或GAL1启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV启动子、SV40启动子、RSV启动子、CMV增强子、SV40增强子或球蛋白内含子。
除了负责转录的起始的元件之外，这样的调控元件还可以包括多核苷酸下游的转录终止信号，诸如SV40聚A位点或者tk聚A位点。此外，取决于所使用的表达系统，能够将多肽引导至细胞区室或能够将多肽分泌到介质中的前导序列可以被添加到本发明的多核苷酸的编码序列中，并且在本领域中是公知的。一种或多种前导序列在适当的阶段与翻译、起始和终止序列组装在一起，并且优选地是一种能够将翻译蛋白或其一部分的分泌物引导入周质空间或胞外介质中的前导序列。可选地，异源序列可以编码包括C端或N端识别肽的融合蛋白，该C端或N端识别肽赋予所表达的重组产物的期望特性(例如稳定性或简化的纯化)。在这种情况下，合适的表达载体在本领域是已知的，诸如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia公司)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen公司)或pSPORT1(GIBCO BRL公司)。
优选地，表达控制序列将会是载体中能够转化或转染真核宿主细胞的真核启动子系统，但也可以使用用于原核宿主的控制序列。一旦载体已经被并入到合适的宿主中，将该宿主保持在适合于核苷酸序列的高水平表达的条件下，并且如果期望的话，可以伴随免疫球蛋白轻链、重链、轻/重链二聚体或完整抗体、结合片段或其他免疫球蛋白形式的收集和纯化；参见Beychok，Cells of Immunoglobulin Synthesis，Academic Press，N.Y.，(1979)。
此外，本发明涉及载体，特别是通常在基因工程中使用的质粒、粘粒、病毒和噬菌体，其包括对抗原进行编码或优选地对本发明抗体的免疫球蛋白链的可变域进行编码的多核苷酸；可选地，其与本发明的多核苷酸组合，该多核苷酸编码本发明的抗体的其他免疫球蛋白链的可变域。优选地，所述载体是表达载体和/或基因转移或靶向载体。
源自病毒(诸如逆转录酶病毒、牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒)的表达载体可以用于将本发明的多核苷酸或载体递送到靶细胞群体中。本领域技术人员熟知的方法可以用于构建重组病毒载体；参见例如，在Sambrook Molecular Cloning ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel CurrentProtocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and WileyInterscience，N.Y.(1994)中描述的技术。可替换地，本发明的多核苷酸和载体可以被重组到脂质体中以用于递送至靶细胞。包括本发明的多核苷酸(例如，编码序列和表达控制序列的免疫球蛋白链的一个或多个重链和/或轻链可变域)的载体可以通过公知的方法被转移到宿主细胞中，这些方法根据宿主细胞的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可以用于其他宿主细胞的转化；参见Sambrook，上文。
关于上文所述的，本发明还涉及包括所述多核苷酸或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核或真核细胞。存在于宿主细胞中的本发明的多核苷酸或载体可以被整合到宿主细胞的基因组(染色体组)中或者其可以维持在染色体外。宿主细胞可以是任何的原核或真核细胞，诸如细菌、昆虫、真菌、植物、动物或人细胞；在下文的“宿主细胞”部分将更加详细地描述用于产生本发明的抗体的合适的宿主细胞和方法。
使用上述宿主细胞，可以生产和制备用于例如药物用途或者作为治疗干预的靶标的本发明的抗体。因此，在一个实施方式中，本发明的目的还在于提供一种用于制备抗IL-20抗体或其IL-20结合片段的方法，所述方法包括：
(a)培养如上文限定的细胞；以及
(b)从培养物中分离所述抗体或其IL-20结合片段。
因此，本发明涉及由本发明的多核苷酸编码的或通过用于制备抗IL-20抗体或其一种或多种免疫球蛋白链的上述方法获得的重组抗体，优选地人源化抗体IL-20抗体及其IL-20结合片段、其一种或多种免疫球蛋白链。
用于重组生产抗体及其模拟物的装置(方式)和方法以及筛选竞争结合分子(其可以是抗体或可以不是抗体)的方法在本领域中是已知的。然而，如本文中描述的，特别关于在人体中的治疗应用，本发明的抗体在以下意义上是人抗体：所述抗体的应用基本上没有针对这种抗体的免疫应答(反应)，而针对嵌合抗体或甚至人源化的抗体会观察到这种免疫应答。
抗IL-20抗体、其IL-20结合片段、合成的或生物技术的变体可以直接用作治疗剂。然而，在一个实施方式中，由本发明提供的抗IL-20抗体、其IL-20结合片段、合成变体或生物技术变体被可检测地标记或附着于药物，优选地，其中可检测的标记选自例如由以下项组成的组：酶、放射性同位素、荧光团、肽和重金属。分别包括并轭合于治疗剂或可检测标记的抗体或其他免疫球蛋白组分也称为“免疫结合物”。
因此，在另一实施方式中，本发明涉及一种包括本发明的人源化单克隆抗人IL-20抗体或所提及的其衍生物的免疫结合物，其优选地包括功能部分，诸如放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、重金属、磁性颗粒、药物或毒素。在一个实施方式中，本发明的免疫结合物是聚乙二醇化的，例如以便提高抗体在人体中的半衰期和生物利用度。免疫结合物和合适的可检测标记、药物和毒素的制备在本领域中是已知的，并且描述在例如国际申请WO2005/052000中。
本发明的标记的抗体或抗原结合片段以及免疫结合物可以用于在体内或在体外检测特定靶标，包括体外“免疫化学/免疫标记”类测定。在体内，可以以类似于核医学成像技术的方式使用它们来检测表达感兴趣的抗原的组织、细胞或其他材料。在下文“标记和诊断”部分进一步更详细地描述了在诊断中使用的以及偶联至本发明的结合分子的标记物。
在本发明中识别的IL-20特异性抗体可以涉及严重损害受感染个体的免疫系统，这与例如在APECED患者中观察到的症状相关联。因此，本发明的另一方面在于通过提供手段和措施以最小化患病的人患者或动物中自身抗体的数量和/或他们的作用来消除或至少减轻患有自身免疫性疾病的受试者的病理性反应。因此，在一个实施方式中，本发明还涉及包括由本发明的自身抗体特异性识别的表位的肽或基于肽的化合物。如下文进一步详细描述的，可以通过抗独特型抗体来获得与通过应用竞争抗原、隔绝并因而阻止自身抗体与其相应靶标结合的相似作用。因此，在一个实施方式中，本发明还提供了本发明的自身抗体的抗独特型抗体。如上文已经示出的，本发明还涉及在治疗如上文中限定的疾病(即与自身耐受性的破坏或不受控发生相关联的疾病)中使用的本发明的抗独特型抗体或者肽或基于肽的化合物。本发明的这些分离的抗体或其片段可以用作免疫基因以生成单克隆抗独特型的组(panel)。对于适合于生成抗独特型抗体的方法，参见Raychadhuri等人，J.Immunol.137(1986),1743，以及适合于生成T细胞的方法，参见Ertl等人，J.Exp.Med.159(1985),1776。如在Raychaudhuri等人J.Immunol.137(1986), 1743中详细描述的，将使用本领域中通常进行的标准测定，抗独特型抗体将被表征涉及内部影像和非内部影像独特型的表达。如果抗独特型抗体在结构上模拟其结合至或者被其结合的抗体的抗原，则其被称作抗原的“内部影像”。
在本领域中描述了提供模拟自身免疫性疾病相关联的自身抗体(自体抗体)的独特型的分子的方法；参见，例如，国际申请WO03/099868，将该申请的公开内容通过引用并入到本文中。例如，这样的方法可以包括以下步骤：(a)根据本发明的方法提供自身抗体；(b)将自身抗体结合至固相以形成亲和性基质；(c)使包括免疫球蛋白的混合血浆或B细胞与亲和性基质接触，随后移除未结合的血浆组分；(d)从基质中洗脱作为针对自身抗体的抗独特型抗体(抗Id)的结合免疫球蛋白；(e)提供包括多种分子成员的分子库；以及(e)使抗Id与分子库接触并且分离那些被抗Id结合的结合分子，该结合分子是模仿自身抗体的独特型的分子。在国际申请WO2010/136196中公开了一种分离独特型自身抗体的方法，该国际申请的公开内容通过引用合并到本文中，该申请描述了包括从正常人血清(NHS)分离的天然多克隆IgG反应性抗体(Ab)的免疫球蛋白的制备，用于自身免疫性疾病和免疫系统失调的治疗。IgG反应性Ab通过结合至它们的位于抗原结合位点内或附近(例如与抗原结合位点重叠)的抗原决定簇而强有力地中和在患有自身免疫性疾病的患者血清中存在的疾病相关联的或病原自身抗体。
本发明还涉及包括本发明的上述抗IL-20抗体、其IL-20结合片段、合成的或生物技术变体、多核苷酸、载体、细胞、肽或基于肽的化合物和/或涉及组合时表现出本发明的抗IL-20抗体或其IL-20结合片段的特征的抗IL-20抗体或其IL-20结合片段的混合物中的任一种的组合物。另外地或可替换地，在一个实施方式中，本发明的组合物或试剂盒包括本发明的抗独特型抗体。在一个实施方式中，该组合物是药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体、给药途径以及剂量方案(给药方案)可以从本领域技术人员已知的相对应的文献中获取，并且还在下文“药物载体”和“剂量方案”的部分中进一步更加详细地描述。
另外，本发明涉及一种用于制造包括抗IL-20单克隆抗体或其IL-20结合片段或生物技术衍生物的组合物的方法，该制造包括以下步骤：通过在转化编码抗体、其IL-20结合片段或生物技术衍生物的DNA的重组宿主有机体中表达来制备抗体、其IL-20结合片段或生物技术衍生物。在一个实施方式中，该组合物是药物组合物，其中，在药物组合物的制造中，在制备抗体、其IL-20结合片段或生物技术衍生物的步骤之后，将抗体、其IL-20结合片段或生物技术衍生物与药学上可接受的载体混合，可选地在之间的一个或多个步骤之后进行混合。例如，在配制药物组合物之前，抗体或其IL-20结合片段可以从细胞培养物纯化至制药等级和/或衍生化(例如被聚乙二醇化或或被轭合至诊断标记物或药物)，从而获得药物组合物。
除了生化和基于细胞的体外测定之外，本发明的抗体的治疗功效可以在合适的动物模型中进行验证，如下文实施例部分中进一步详细描述的。
在一个实施方式中，该药物组合物还包括可用于治疗炎症或自身免疫性疾病(失调)的其他药剂，优选地，其中，所述药剂选自由非甾体抗炎药(NSAID)、皮质类固醇、抗组胺剂及它们的组合组成的组。另外地或可替换地，在另一实施方式中，该药物组合物还包括可用于治疗炎症相关疾病的其他药剂，其选自由免疫抑制药和抗炎药或“抗风湿”药组成的组。
在另一实施方式中，该组合物是诊断组合物或试剂盒并且还包括在基于免疫的诊断方法或基于核酸的诊断方法中常用的试剂。
此外，本发明提供了前述的抗IL-20抗体、其IL-20结合片段、合成的或生物技术变体或者如上文定义的组合物，其用于以下方法中：
(a)治疗或者预防免疫介导的或者自身免疫疾病或病症的进展；
(b)减轻与免疫介导的或自身免疫疾病或病症相关联的症状；和/或
(c)诊断或筛选受试者的免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的存在或者确定受试者发展免疫介导的或自身免疫的疾病或病症的风险；
其中，疾病或者病症与患者体内的IL-20的表达、升高的和/或不利的IL-20活性相关联。
如上文所指出的，由于它们的结合特异性，本发明的IL-20结合分子(诸如其抗体和片段)可以优选地用于上文限定的治疗、减轻、诊断和/或筛选与IL-20的表达、IL-20升高的和/或不利的活性相关联的和/或由它们引起的免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的方法中。
例如，在类风湿关节炎(RA)滑膜组织活检、牛皮癣皮肤损害和强直性脊柱炎(AS)中已经观察到表达、升高的和/或不利的IL-20活性，其中，IL-20表达的水平与炎症的严重性正相关(Kragstrup等人，Cytokine 41(2008)，16-23，Blumberg等人，Cell 104(2001)，9-19，Toyhama等人，Eur.J.Immunol.39(2009)，2779-88，同上)。除了类风湿关节炎(RA)、牛皮癣和强直性脊柱炎(AS)之外，还发现IL-20在功能上与几种其他疾病相关联，例如动脉硬化(Chen等人，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.26(2006)，2090-2095，同上)、急性肾功能衰竭(Li等人，Genes Immun.9(2008)，395-404，同上)、溃疡性结肠炎(Fonseca-Camarillo等人，J.Clin.Immunol.33(2013)，640-8，同上)、缺血性发作(Chen and ChangJ.Immunol.182(2009)，5003-12，同上)以及骨量减少和骨质疏松症(Hsu等人，J.Exp.Med.208(2011)，1849-1861，同上)。
并且，在非小细胞肺(NSCL)癌中(Baird等人，Eur.J.Cancer 47(2011)，1908-18，supra)和肌肉浸润性膀胱癌(Lee等人，PLoS One 7(2012)，e40267，supra)中已经观察到IL-20的增加的转录。IL-20及其受体亚基在临床口腔肿瘤组织以及乳腺癌组织中的表达比在非肿瘤组织中的表达更高(Hsu等人，Mol.Cancer Res.10(2012)1403-9，Hsu等人，J.Immunol.188(2012)1981-91，全部同上)。
因此，在一个实施方式中，提供了如上文限定的用于上述方法的抗IL-20抗体或其IL-20结合片段、合成的或生物技术变体或组合物，其中，所述疾病是自身免疫疾病，优选地选自由以下项组成的组：类风湿关节炎(RA)、强直性脊柱炎和包括但不限于牛皮癣关节炎的其他形式的脊柱性关节炎、牛皮癣、血管炎症和动脉硬化、过敏性皮炎和包括非小细胞肺(NSCL)癌、浸润性膀胱癌、口腔肿瘤和乳腺癌的癌症。
由于本文中存在的适于治疗例如与炎症相关联的疾病的大量分子，本发明还涉及治疗、诊断和/或预后这样的疾病(失调)的可能过程和结果的方法和本发明的分子的用途，优选地其中，免疫介导的或自身免疫疾病或病症与IL-20的表达、升高和/或有利的活性相关联。在一个实施方式中，提供了一种用于治疗这样的疾病的方法，该方法包括给予需要其的受试者治疗有效量的前述抗IL-20抗体、其IL-20结合片段、合成的或生物技术变体，组合时表现出本发明的抗体的特征的抗体混合物、抗独特型抗体或肽或基于肽的化合物。
此外，在一个实施方式中，本发明涉及一种治疗与IL-20的表达、升高的和/或不利的活性相关联的免疫介导的或自身免疫疾病或病症的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的配体结合分子，该配体结合分子包括：
(a)本发明的抗IL-20抗体或其IL-20结合片段的至少一个CDR；或
(b)如上文限定的至少一种抗独特型抗体和/或肽或基于肽的化合物。
基于使用仅一种对与疾病相关或引起疾病的特定抗原的表位特异性的单克隆抗体的治疗方法可能会存在若干缺点。例如，治疗的困难和可能的低效率可能起源于导致特定疾病而需要同时靶向若干种抗原的发病机理的多样性。此外，必须考虑患者群体的内在多样性，涉及例如不同患者或一个患者中给定抗原的多态性、糖基化的异质性或轻微变性，这可能至少导致所使用的单克隆抗体的降低的结合效率。这些缺点中的一些可以通过例如进行预处理筛选以确定抗原是否与旨在待治疗的患者免疫地相关以及确定在特定的患者中是否存在任何表位的变化来避免。然而，这种筛选经常由于治疗的紧急性或成本的限制而被省略。因此，本发明还涉及基于一次向患者应用多于一种类型的结合分子的方法，即涉及结合分子的混合物的应用。这些结合分子可以特异性地结合至不同表位处的IL-20，所应用的结合分子中的每一种均可以特异性地结合IL-20，或者若干种结合分子用于结合至IL-20的若干个表位。在本发明的结合分子针对(特异性地结合)作为抗原的IL-20的情况下，它们的结合特异性针对所述抗原的不同表位。这种混合物的使用被特别地设想成用于治疗患有自身免疫性疾病(诸如APS1)的患者，这种患者由于针对约3000个内源抗原的自身抗体的存在而经常不能使用一种特定抗体进行单一治疗。在这种情况下，期望利用本发明的具有相同或不同抗原特异性的两种或更多种单克隆抗体和/或肽和基于肽的化合物的组合疗法以实现症状的至少一些缓解。
因此，在一个实施方式中，提供了治疗疾病的另外的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的混合物，该混合物基本上由选自由以下项组成的组中的至少两种、三种、四种、五种和更多种组分组成：
(a)如上文限定的抗IL-20抗体、其IL-20结合片段、合成的或生物技术变体；和/或
(b)本发明的抗独特型抗体和/或本发明的肽或基于肽的化合物，该肽或基于肽的化合物包括由本发明的抗体或其抗原结合片段特异性识别的表位。
本发明自然地还扩展至下述诊断和预后方法，该诊断和预后方法针对诊断与IL-20的表达、升高的和/或不利的活性相关联的免疫介导的或自身免疫性病症和疾病，和/或预后疾病的发展，即其进展、对治疗的反应或恢复。因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种诊断受试者中与IL-20的表达、升高的和/或不利的活性相关联的免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的方法，该方法包括使受试者的生物样品与本发明的抗IL-20抗体或其IL-20结合片段接触，并且检测IL-20的存在。此外，在一个实施方式中，本发明涉及一种检测或确定所分离的生物样品中IL-20的方法，该方法包括将样品与本发明的抗IL-20抗体混合，允许抗体与存在于混合物中的IL-20形成复合物，并且检测存在于混合物中的复合物。
如上文已经提及的，在一个实施方式中，本发明涉及一种用于诊断与IL-20的表达相关联的免疫介导的或自身免疫性疾病或病症的试剂盒，所述试剂盒包括前述抗IL-20抗体、其IL-20结合片段、合成的或生物技术变体、抗独特型抗体或肽或基于肽的化合物、多核苷酸、载体或细胞，可选地连同试剂和/或使用说明书。
与本发明的试剂盒相关联的(例如在包括该试剂盒的容器内)可以是由调控药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通知，该通知反映了上述机构对制造、使用或销售用于人类给药的许可。另外地或可替换地，该试剂盒包括试剂和/或用于在合适的诊断测定中的使用说明书。组合物(即本发明的试剂盒)当然特别适合于诊断、预防和治疗伴随有IL-20表达的疾病或病症，特别适用于治疗如上文提及的疾病。在特别优选的实施方式中，疾病与IL-20的表达相关联。
在另一实施方式中，本发明涉及一种诊断组合物，其包括本发明的上述IL-20结合分子、抗体、抗原结合片段、肽或基于肽的化合物、多核苷酸、载体或细胞中的任一种以及可选地用于检测诸如在基于免疫或基于核酸的诊断方法中惯常使用的试剂的合适工具。本发明的抗体例如适合用于免疫测定，在该免疫测定中本发明的抗体可以以液相来使用或可以被结合至固相载体。可以利用本发明的抗体的免疫测定的实例是直接或者间接形式的竞争和非竞争免疫测定。这样的免疫测定的实例是放射免疫测定法(RIA)、夹层(免疫测定)、流式细胞术和蛋白质印迹测定。本发明的抗原和抗体可以结合至许多不同的载体并且用于分离与其特异性结合的细胞。已知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、右旋糖酐、尼龙、直链淀粉、天然的和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。为了本发明的目的，载体的性质可以是可溶或不可溶的。存在许多本领域技术人员已知的不同的标记物和标记方法。可以用于本发明中的标记物类型的实例包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物以及生物发光化合物；还参见上文讨论的实施方式。
在本文中，本发明还涉及特别为了该目的而设计的装置。例如，可以使用基于蛋白或基于抗体的阵列，其例如加载有源自IL-20和含有疾病相关的抗原的任一种抗原，以便检测可能在患有自身免疫性疾病的患者中存在的自身抗体。在Kusnezow等人，Mol.CellProteomics 5(2006)，1681-1696中总结了微阵列免疫测定的设计。因此，本发明还涉及加载有根据本发明识别的结合分子或抗原的微阵列。
本发明还利用和涉及IL-20拮抗剂的实施方式(例如现有技术中描述的抗IL-20抗体)，其适用于并且可用于本发明的人源化单克隆抗人IL-20抗体或其IL-20结合片段、合成的或生物技术变体。例如，国际申请WO2005/052000描述了尤其是大鼠抗人IL-20以及抗IL-20RA和抗IL-20RB单克隆抗体，包括它们在体外和在体内表征的装置和方法，以及它们的用途，其还可以根据本发明的人源化单克隆抗人IL-20抗体以及提及的其衍生物来应用。
因此，在另一实施方式中，本发明涉及一种用于减少或抑制造血细胞和造血祖细胞的IL-20诱导的增殖或分化的体外方法，该方法包括用组合物培养骨髓或外周血液细胞，该组合物包括本发明的人源化单克隆抗人IL-20抗体和提及的其衍生物、如本文中公开的免疫结合物或药物组合物，其中，所述减少或抑制是通过与在没有可溶性细胞因子中培养的骨髓或外周血液细胞相比，在骨髓或外周血液细胞中造血细胞的增殖或变异来测量的。造血细胞和造血祖细胞可以是淋巴样细胞，优选地淋巴样细胞是巨噬细胞或T细胞。
因此，原则上如本文所公开的本发明的人源化单克隆抗人IL-20抗体以及提及的其衍生物、免疫结合物和药物组合物可以根据IL-20拮抗剂和抗IL-20抗体的治疗用途中的任一种(特别地如在国际申请WO2005/052000中所描述的)而被应用。
定义和实施方式
除非另有说明，否则如本文中使用的术语和实施方式被给予如在国际申请WO2013/098419和WO2013/098420中所提供和使用的定义。作为补充，如本文中使用的常用术语被给予如在2000年修订和2003年再次印刷的Oxford Dictionary of Biochemistryand Molecular Biology,Oxford University Press，(牛津生物化学和分子生物学字典),牛津大学出版社，1997，ISBN 0 19 850673 2中所提供的定义。
需要注意的是，术语“一个(一种，a)”或“一种(an)”实体是指一个或多个该实体；例如“一种抗体”被理解成代表一种或多种抗体。因此，术语“一个”(或“一种(an)”)、“一个或多个(一种或多种)”以及“至少一个(至少一种)”在本文中可以互换使用。
术语“中和”和“中和抗体”分别如在本领域中常见的一样使用，即抗体是指降低或消除抗原或活微生物的至少某些生物活性。例如，本发明的抗IL-20抗体是中和抗体，例如在如在实施例中描述的测定中，如果有充足的量，则该抗体消除或降低了IL-20的活性。中和通常由50％抑制浓度(IC50)来定义，并且其可以基于中和滴定曲线(AUC)下的面积来统计估计。本文中描述和示出了本发明的示例性抗IL-20抗体的IC 50值，例如在KZ136-Nluc报道基因测定中示例性抗体20A10具有329.7ng/ml的人IL-20IC 50值，并且在化学发光细胞结合测定中具有4.03ng/ml的IC50值(分别为图5F左列和图8D)
肽和多肽
术语“肽”被理解为包括术语“多肽”和“蛋白”(其在本文中有时可能会互换使用)以及在其含义内的任何氨基酸序列，诸如本发明的重链和轻链可变区以及恒定区的那些氨基酸序列。类似地，蛋白和多肽的片段也是预期的，并且其在本文中可以被称为“肽”。然而，术语“肽”优选地表示氨基酸聚合物，该氨基酸聚合物包括至少5个连续氨基酸，优选地至少10个连续氨基酸，更优选地至少15个连续氨基酸，还更优选地至少20个连续氨基酸，以及特别优选地至少25个连续氨基酸。此外，根据本发明的肽通常具有不多于100个连续氨基酸，优选地少于80个连续氨基酸并且更优选地少于50个连续氨基酸。
如本文中使用的，术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，诸如本发明的抗体，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两种或多种氨基酸的任一个链或多个链，并且不指特定长度的产品。因此，“肽”、“二肽”、“三肽”、“寡肽”、“蛋白”、“氨基酸链”或用于指两种或多种氨基酸的一个链或多个链的任何其他术语均包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以由这些术语中的任一个代替或互换使用。
术语“多肽”还旨在是指多肽的表达后修饰的产物，该表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团进行的衍生化、蛋白水解切割(蛋白水解裂解，proteolytic cleavage)、或通过非天然存在的氨基酸进行的修饰。多肽可以源自天然生物源或可以通过重组技术生产，但未必由指定的核酸序列翻译。多肽可以以包括通过化学合成的任何方式生成。
本发明的多肽可以具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1000个或更多个，或者2000个或更多个氨基酸的尺寸。然而，术语“多肽”优选地表示包括至少100个氨基酸的氨基酸聚合物。多肽可以具有限定的三维结构，尽管它们不一定具有这样的结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠式的，并且不具有限定的三维结构的多肽却可以采用大量的不同构像，并被称为非折叠式的。如本文使用的，术语糖蛋白是指偶联至至少一种碳水化物部分的蛋白，该碳水化合物部分经由氨基酸残基(例如丝氨酸残基或天冬酰胺残基)的含氧侧链或含氮侧链附着于蛋白。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物是指并非处于其天然环境中的多肽。不需要特定水平的纯化。例如，分离的多肽可以从其原生的或天然的环境中移除。为了本发明的目的，如已经通过任何合适的技术分离、分馏或者部分或基本上纯化的原生或重组多肽一样，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被视为是分离的。
“重组肽、多肽或蛋白”是指通过重组DNA技术生产(即由通过对包括期望肽的融合蛋白编码的外源性重组DNA表达构建体转化的细胞、微生物或哺乳动物产生)的肽、多肽或蛋白。在大多数细菌培养物中表达的蛋白或肽通常将不含聚糖。在酵母中表达的蛋白或多肽可以具有与在哺乳动物细胞中表达的糖基化模式不同的糖基化模式。
作为本发明的多肽，还包括上述多肽的片段、衍生物、类似物和变体以及它们的任何组合。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括具有与天然肽的氨基酸序列足够相似的氨基酸序列的肽和多肽。术语“足够相似的”是指相对于第二氨基酸序列，第一氨基酸序列包括足够的或最少数量的相同的或等同的氨基酸残基，使得第一氨基酸序列和第二氨基酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，在本文中将包括至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或至少约100％相同的共同结构域的氨基酸序列限定为足够相似的。优选地，变体将与本发明的优选的肽的氨基酸序列，特别是类似于抗体或抗体片段，或者类似于包括由本发明的抗体或它们中任一种的片段、变体、衍生物或类似物识别的表位的合成肽或基于肽的化合物是足够相似的。这样的变体通常保留本发明的肽的功能活性，即被本发明的抗体结合。通过一种或多种氨基酸缺失、添加和/或替换，变体包括在氨基酸序列方面分别与原生和wt肽不同的肽。它们可以是天然存在的变体以及人工设计的变体。
当提及本发明的抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留相应的原生结合分子、抗体或多肽的抗原结合特性中的至少一些的任何多肽。本发明的多肽的片段包括蛋白水解片段以及缺失片段，除了在本文中其他地方讨论的特异性抗体片段之外。本发明的抗体和抗体多肽的变体包括如上文描述的片段，以及由于氨基酸替换、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以天然地存在或者是非天然存在的。可以使用本领域已知的突变技术来产生非天然存在的变体。变体多肽可以包括保守的或非保守的氨基酸替换、缺失或添加。本发明的结合分子的衍生物(例如本发明的抗体和抗体多肽)是已经被改变的多肽，从而呈现出在原生多肽上未发现的另外特征。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文中还可以称为“多肽类似物”。如本文中使用的，结合分子或其片段、抗体或者抗体多肽的“衍生物”是指具有通过功能侧基的反应而化学衍生的一个或多个残基的受试者多肽。作为“衍生物”，还包括含有二十个标准的氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的多肽。例如，4-羟脯氨酸可以替换脯氨酸；5-羟赖氨酸可以替换赖氨酸；3-甲基组氨酸可以替换组氨酸；高丝氨酸可以替换丝氨酸；以及鸟氨酸可以替换赖氨酸。
抗独特型抗体：
当提及抗体或其他结合分子时，术语“独特型抗体”包括与位于抗原结合位点处或附近的抗体可变区上的独特抗原肽序列结合的分子，由此抑制通过给定的自身抗体以其他方式引起的特定免疫反应。以类似的方式，可以使用包括由本发明的抗体特异性识别的表位的合成肽或基于肽的化合物。
可以以类似于其他抗体的方式获得抗独特型抗体。通过任何类型的交联(通过凝集(在浊度或比浊测定法中))、沉淀(放射免疫扩散)或夹心免疫测定(诸如ELISA)来检测特定的抗独特型抗体。美国专利申请No.20020142356提供了一种用于获得针对下述抗体的抗独特型单克隆抗体群的方法，该抗体对于高浓度、高分子量的靶抗原具有特异性，其中，所述抗独特型抗体群对于特异于所述靶抗原的所选抗体具有宽范围的结合亲和力，并且其中，可以选择针对特定应用具有所需亲和力的所述抗独特型抗体群的子集。
美国专利申请No.20020142356描述了使用抗体作为涂层并且使用抗独特型抗体作为检测的抗原的竞争性免疫测定，或者反之亦然。公开了使用抗独特型抗体替代抗原的其他参考文献包括Losman等人，Cancer Research 55(1995)(23suppl.S)：S5978-S5982；Becker等人，J.Immunol.Methods 192(1996)，73-85；Baral等人，Int.J.Cancer 92(2001)，88-95；以及Kohen等人，Food and Agriculture Immunology 12(2000)，193-201。抗独特型抗体在治疗疾病或对抗寄生虫的用途在本领域中是已知的；参见，例如Sacks等人，J.Exp..Medicine 155(1982)，1108-1119。
分子的相似性和/或同一性的确定：
通过将一种肽的氨基酸序列与第二种肽的序列进行比较来确定两种肽之间的“相类性”。如果是相同的或者保守的氨基酸替换，则一种肽的氨基酸与第二种肽的相应的氨基酸相似。保守替换包括在Dayhoff,M.O.，ed.，The Atlas of Protein Sequence andStructure 5，National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.(1978)中以及在Argos EMBO J.8(1989)，779-785中描述的那些。例如，属于以下组中之一的氨基酸代表保守的变化或者替换：-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；-Cys、Ser、Tyr、Thr；-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；-Lys、Arg、His；-Phe、Tyr、Trp、His；以及–Asp、Glu。
两个序列之间的百分比同一性或相似性的确定优选地使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA90：5873-5877的数学算法来完成。这样的算法被合并到在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge)上可以获得的Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的BLASTn和BLASTp程序中。
利用BLASTn和BLASTp程序的标准参数来进行百分比同一性或相似性的确定。
利用BLASTn程序来进行BLAST多核苷酸检索。关于常规参数，“最大靶序列”框可以设置成100，可以勾选“短查询串”框，“期望阈值”框可以设置成10，并且“字体大小”框可以设置成28。对于得分的参数，“配比/失配分数”可以设置成1、-2，而“空位成本”框可以设置成线性的。对于过滤器和掩避参数，可以不勾选“低复杂性区”框，可以不勾选“物种特异性重复”框，可以勾选“仅用于查询表的掩避”框，并且可以不勾选“掩避小写字母”框。
利用BLASTp程序来进行BLAST蛋白检索。关于常规参数，“最大靶序列”框可以设置成100，可以勾选“短查询串”框，“期望阈值”框可以设置成10，并且“字体大小”框可以设置成“3”。对于得分参数，“矩阵”框可以设置成“BLOSUM62”，“空位成本”框可以设置成“存在：11延伸：1”，“组成调整”框可以设置成“条件组成得分矩阵调整”。对于过滤器和掩避参数，可以不勾选“低复杂性区”框，可以不勾选“仅用于查询表的掩避”框，并且可以不勾选“掩避小写字母”框。
多核苷酸：
术语“多核苷酸”旨在涵盖单数核酸以及复数核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包括常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，如在肽核酸(PNA)中发现的酰胺键)。术语“核酸”是指在多核苷酸中存在的任何一个或多个核酸片段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸是指已经从其原生环境中移除的核酸分子、DNA或RAN。例如，为了本发明的目的，编码包括在载体中的抗体的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的核苷酸的另外的实例包括保持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的(部分地或基本上)纯化的多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的多核苷酸或者核酸还包括合成产生的这样的分子。此外，多核苷酸或核酸可以是调控元件或可以包括调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
如本文中使用的，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)没有被翻译成氨基酸，但其可以被认为是编码区的一部分，而任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等)都不是编码区的一部分。本发明的两个或多个编码区可以存在于单个多核苷酸构建体中，例如在单个载体上，或存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体都可以含有单个编码区，或者可以包括两个或更多个编码区，例如单个载体可以单独地编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。另外，本发明的载体、多核苷酸或者核酸可以编码融合或未融合至编码结合分子、抗体或片段、变体或其衍生物的核酸的异源编码区。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序，诸如分泌的信号肽或者异源功能域。
在某些实施方式中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包括对多肽编码的核酸的多核苷酸通常可以包括可操作性地与一个或多个编码区相关联的启动子和/或其他转录或翻译控制元件。可操作关联(结合，association)是指此时用于基因产物(例如多肽)的编码区以下列方式与一个或多个调控序列关联，即使得在一个或多个调控序列的影响或者控制下设置基因产物的表达。如果启动子功能的诱导导致编码期望的基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物的表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其相关联的启动子)是“可操作性关联的”或“可操作性连接的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区将可操作地与编码多肽的核酸相关联。启动子可以是仅在预定的细胞中指导DNA的实质性转录的细胞特异性启动子。除启动子之外的其他转录控制元件(例如增强子、操纵子、阻遏子以及转录终止信号)可以可操作地与多核苷酸相关联，以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其他转录控制区。
各种转录控制区对于本领域技术人员来说是已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子段(即刻早期的启动子，结合有内含子-A)、猿猴病毒40(早期启动子)以及逆转录病毒(诸如劳氏肉瘤病毒)。其他转录控制区包括源自脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β球蛋白)的那些，以及能够控制真核细胞中的基因表达的其他序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导型启动子(例如可由干扰素或白介素诱导的启动子)。
类似地，各种翻译控制元件对于本领域普通技术人员来说是已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及源自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也被称为CITE序列)。
在其他实施方式中，本发明的多核苷酸是例如以信使RNA(mRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或者任何其他RNA产物形式的RNA。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的其他编码区相关联，其指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长的蛋白链已经开始跨越粗面内质网排出，就从成熟蛋白切割该信号肽或分泌前导序列。本领域普通技术人员能够知晓的是，由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合至多肽的N端的信号肽，该信号肽从完整的或“全长”的多肽切割出来，以产生分泌的或“成熟”形式的多肽。在某些实施方式中，使用原生信号肽(例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或保留指导与其可操作地相关联的多肽的分泌的能力的序列的功能衍生物。可替换地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以用人组织纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β葡萄糖醛酸酶的前导序列替代。然而，细胞内产生本发明的多肽特别是免疫球蛋白及其片段也是可能的。
表达：
如本文中使用的术语“表达”是指一种过程，通过该过程，基因产生生化物质，例如RNA或者多肽。该过程包括细胞内的基因的功能存在的任何表现，包括但不限于基因敲落以及瞬时表达和稳定表达两者。其包括但不限于：将基因转录成信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物以及将这种mRNA翻译成一种或多种多肽。如果最终期望的产物是生化物质，则表达包括该生化物质和任何前体的创建。基因的表达产生“基因产物”。如本文中使用的，基因产物可以是核酸(例如由基因转录产生的小干扰RNA(siRNA)、信使RNA)，或者可以是由转录物翻译的多肽。本文中描述的基因产物还包括具有转录后修饰例如聚腺苷酸化的核酸，或具有翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白亚基相关联、蛋白水解切割等)的多肽。
可以利用各种表达载体/宿主系统来包含和表达多核苷酸序列。它们包括但不限于：微生物，诸如用重组噬菌体、质粒或者粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；感染有病毒表达载体(例如，杆状病毒)的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病病毒，TMV)或用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或者动物细胞系统。
为了在宿主细胞中表达肽、多肽或者融合蛋白(下文称为“产物”)，可以使用诸如以下的程序。可以将含有编码所述产物的DNA序列的限制片段克隆到含有在宿主细胞中运行的复制起点的和合适的选择标记的合适的重组质粒中。质粒可包括用于产物的可诱导表达的启动子(例如，pTrc(Amann等人，Gene 69(1988)，301 315)和pETl Id(Studier等人，Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,SanDiego,Calif.(1990)，60 89)。重组质粒可以通过例如电穿孔被引入到宿主细胞中，并且含有重组质粒的细胞可以通过选择质粒上的标记来识别。可以使用对于产物特异性的测定法来诱导和检测产物在宿主细胞中的表达。
在一些实施方式中，为了在宿主细胞中表达，可以优化编码产物/肽的DNA。例如，DNA可以包括用于一个或多个氨基酸的密码子，所述密码子相对于用于相同氨基酸的其他密码子在宿主细胞中占主导地位。
可替换地，可以通过在无细胞的提取物中体外合成蛋白来进行产物的表达，该无细胞的提取物也特别适合于并入用于功能性研究的修饰的或非天然的氨基酸；还参见下文。当过表达产物对宿主细胞有毒时，当产物是不可溶的或者形成包涵体时，或者当蛋白通过细胞内蛋白酶经历快速的蛋白质降解时，体外翻译系统的使用相对于体内基因表达可以具有优势。最频繁使用的无细胞翻译系统由来自兔网状细胞、小麦胚芽和大肠杆菌的提取物组成。全部被制备成包括异源RNA的翻译所需要的所有大分子组分(70S或者80S核糖体、tRNA、氨酰基tRNA合成酶、起始因子、延伸因子和终止因子等)的粗提取物。为了确保有效的翻译，每种提取物必须补充有氨基酸、能量源(ATP、GTP)、能量再生系统(用于真核系统的磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶，以及用于大肠杆菌裂解产物的磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶)以及本领域中已知的其他辅酶因子(Mg2+、K+等)。合适的转录/翻译系统是商业上可获得的，例如来自Promega Corporation、Roche Diagnostics以及Ambion，即Applied Biosystems(Anderson等人，Meth.Enzymol.101(1983)，635–644；Arduengo等人，The Role of Cell-Free Rabbit Reticulocyte Expression Systems in Functional Proteomics inKudlicki，Katzen和Bennett eds.，Cell-Free Expression Vol.2007.Austin，Tx：LandesBioscience，pp.1-18；Chen和Zubay Meth.Enzymol.101(1983)，674–90；Ezure等人，Biotechnol.Prog.22(2006)，1570–1577)。
宿主细胞：
关于本发明，宿主细胞可以是任何的原核或者真核细胞，诸如细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞或者人细胞。优选的真菌细胞是例如酵母属的那些真菌细胞，特别是物种酿酒酵母(S.cerevisiae)的那些真菌细胞。术语“原核”意指包括可以利用用于表达本发明的抗体或相应的免疫球蛋白链的DNA或RNA分子转化或者转染的所有细菌。原核宿主可以包括革兰氏阴性细菌以及革兰氏阳性细菌，诸如例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)枯草杆菌。术语“真核”意指包括酵母细胞、高等植物细胞、昆虫细胞和优选的哺乳动物细胞、最优选的HEK 293细胞、NSO细胞、CSO细胞以及CHO细胞。取决于重组生产过程中采用的宿主，由本发明的多核苷酸编码的抗体或者免疫球蛋白链可以是糖基化的或者可以是非糖基化的。本发明的抗体或者相应的免疫球蛋白链还包括起始蛋氨酸氨基酸残基。使用本领域普通技术人员通常已知的任何技术，本发明的多核苷酸可以用来转化或转染宿主。此外，用于制备融合的、可操作连接的基因并且在例如哺乳动物细胞和细菌中表达它们的方法在本领域中是已知的(Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989)。本文中描述的基因构建体和方法可以用于在真核或原核宿主中表达本发明的抗体或相应的免疫球蛋白链。通常，含有促进所插入的多核苷酸的有效转录的启动子序列的表达载体与宿主结合使用。表达载体通常含有复制起点、启动子、终止子以及能够提供所转化细胞的表型选择的特定基因。用于DNA序列的合适的源细胞以及用于免疫球蛋白表达和分泌的宿主细胞可以从诸如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的多个来源获得(通过引用合并到本文中的“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas，”Fifth edi-tion(1985)Rockville，Maryland，U.S.A.)。此外，包括本发明的细胞的转基因动物(优选地为哺乳动物)可以用于大规模生产本发明的抗体。
经转化的宿主可以在发酵器中生长，并且根据本领域中已知的技术进行培养，以实现最佳的细胞生长。一旦被表达，本发明的全部抗体、它们的二聚体、各个轻链和重链或其他免疫球蛋白形式可以根据本发明的标准程序被纯化，这些标准程序包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析法、凝胶电泳等；参见Scopes，“Protein Purification”，Springer Verlag，N.Y.(1982)。然后可以从生长介质、细胞裂解产物或者细胞膜组分中分离出本发明的抗体或其相应的一种或多种免疫球蛋白链。例如本发明的重组表达抗体或免疫球蛋白链的分离和纯化可以通过任何常规的方式进行，诸如例如制备性色谱分离和免疫学分离，诸如涉及使用针对例如本发明的抗体的恒定区的单克隆抗体或多克隆抗体的那些。对本领域技术员来说显而易见的是，本发明的抗体还可以进一步偶联至其他部分，以用于例如药物靶向和成像应用。这样的偶联可以在抗体或抗原表达之后化学地进行至附着位点，或者偶联产物可以在DNA水平上被工程化为本发明的抗体或抗原。然后在合适的宿主系统中表达DNA，并且如果必要的话，收集并且复性所表达的蛋白。
对于药物用途，具有至少约90％至95％同源性的基本上纯化的免疫球蛋白是优选的，并且具有98％至99％或更多的同源性的是最优选的。一旦纯化或部分地纯化成所需的同源性，则抗体可以在治疗上(包括体外)使用或者可以用于开发和执行测定程序。
本发明还涉及一种用于生产能够表达本发明的抗体或一种或多种其对应的免疫球蛋白链的方法，该方法大体上包括用本发明的多核苷酸或载体基因工程化细胞。通过本发明的方法获得的细胞可以用于例如测试本发明的抗体与其抗原的相互作用。
ELISA测定：
用于各种抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)包括基于比色法、化学发光法和荧光法的那些测定。ELISA已经成功地应用于确定血浆样品和尿液样品中的低量药物和其他抗原组分，不涉及提取步骤，并且易于实施。用于检测针对蛋白抗原的抗体的ELISA经常使用短合成肽与微量滴定板的塑料表面的直接结合。由于该肽的合成性质和使用高效液相色谱法的有效纯化方法，因此肽通常是非常纯的。短肽的缺点在于它们通常表示线性表位，而不表示构象或者不连续的表位。为了呈现构象表位，使用长肽或使用完整的原生蛋白。蛋白抗原与板的疏水性聚苯乙烯载体的直接结合可以导致所结合蛋白的部分或完全变性以及构象表位的丧失。用介导抗原的固定化(捕获ELISA)的抗体涂覆该板可以避免这种影响。
然而，经常地，过表达的重组蛋白是不可溶的，并且当待分析针对构象表位的抗体时需要在变性条件下进行纯化和复性。参见，例如，关于使用重组融合蛋白作为外壳蛋白的通用ELISA的美国专利申请No.20030044870。
结合分子：
如在本发明的上下文中使用的“结合分子”主要涉及抗体及其片段，但也可以指结合至本发明的“感兴趣的分子”的其他非抗体分子，其中，感兴趣的分子是被称为细胞因子的糖蛋白类的蛋白，特别是IL-20。在本发明的上文和下文的具体实施方式的描述中进一步详细地定义了本发明的感兴趣的分子。本发明的结合分子包括但不限于激素、受体、配体、主要组织相容性复合物(MHC)分子、诸如热休克蛋白(HSP)的伴侣蛋白以及细胞-细胞粘附分子(诸如钙粘着蛋白、整合素、C型凝集素以及免疫球蛋白(Ig)超家族中的成员)。因此，仅为了清楚起见并且不限制本发明的保护范围的情况下，下面的实施方式中的大多数是关于抗体和抗体样分子来进行讨论的，该抗体和抗体样分子代表了用于开发治疗和诊断药剂的优选的结合分子。
抗体：
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。抗体或免疫球蛋白是结合至如上文和下文中定义的本发明的感兴趣分子的分子，其至少包括重链的可变域，并且通常至少包括重链和轻链的可变域。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构被相对较好地理解；参见例如，Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring HarborLaboratory Press,2nd ed.1988)。术语“结合”和“识别”在关于本发明的结合分子(例如抗体)的结合亲和力方面可以互换地使用。
含有用以特异性结合至如上下文所定义的感兴趣分子的充足结构的任何抗体或免疫球蛋白片段在本文中可互换地表示为“结合分子”、“结合片段”或“免疫特异性片段”。
本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫特异性片段、变体或衍生物包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、灵长类化抗体、鼠源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段(例如Fab、Fab'和F(ab’)2)、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包括VL或VH域的片段、由Fab表达库产生的片段以及抗独特型(抗Id)抗体(包括例如，针对本文公开的抗体的抗Id抗体)。scFv分子是本领域中已知的并且例如描述在美国专利5，892，019中。在这方面，抗体的抗原结合片段也可以是域抗体(dAb)，其也称为单域抗体(sdAB)或纳米抗体TM(Ablynx公司，根特，比利时)，参见例如，DeHaard等人，J.Bacteriol.187(2005)，4531-4541；Holt等人，Trends Biotechnol.21(2003)，484-490。如下文将进一步详细讨论的，术语“免疫球蛋白”包括可以在生物化学上区分的各种宽泛种类的多肽。本领域技术人员将理解的是，重链被分类为在其中具有一些子类(例如，γ1-γ4)的γ、μ、α、δ或者ε(γ、μ、α、δ、ε)。这种链的性质就是将抗体的“类”分别确定为IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY。例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等的免疫球蛋白子类(同种型)被很好地表征，并且已知会赋予功能特化。本发明的免疫球蛋白或者抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等)或子类。鉴于本公开内容，本领域技术人员易于辨别这些类和同种型中的每一种的改进版本，并且因此在本发明的范围内。尽管所有的免疫球蛋白类清楚地在本发明的范围内，但下文的讨论将基本上针对免疫球蛋白分子的IgG类。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包括分子量约为23000道尔顿的两条相同的轻链多肽，和分子量为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。四条链通常通过二硫键以“Y”构型结合，其中，轻链括住(bracket)在“Y”的口处开始并继续通过可变区的重链。
如根据上文的表1中所列出的本发明的示例性抗IL-20抗体的分类明显的是，本发明的示例性抗体为IgG4或IgG1类，可能暗示在这些AIRE缺陷状态下在它们的启动中的调控T细胞应答和/或上皮细胞。这种发现通过等人，在Clin.Exp.Immunol.(2012)；doi:10.1111/cei.12024(其公开内容通过引用合并到本文中)中描述的在AIRE缺陷小鼠中发现的相应的自身抗体的分类来证实。因此，在本发明的优选实施方式中，本发明的抗体是IgG型，甚至更优选的是IgG4或IgG1。
IgG结构：
轻链被分类为κ或λ(κ、λ)。每条重链类可以与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链彼此共价地结合，并且当免疫球蛋白通过杂交瘤、B细胞或基因工程化的宿主细胞生成时，两条重链的“尾”部通过共价二硫键或非共价键互相结合。在重链中，氨基酸序列从Y构造的叉端处的N端持续到每条链的底部的C端。轻链和重链二者都被划分为结构性和功能性同源区。术语“恒定”和“可变”功能性地被使用。在该方面，将理解的是，轻链(VL)和重链(VH)这两个部分的可变域决定了抗原的识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定域赋予了重要的生物特性，诸如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区域的编号随着它们更加远离抗原结合位点或抗体的氨基端而增加。N端部分是可变区，并且在C端部分的是恒定区；CH3和CL域实际上分别包括重链和轻链的羧基端。
如上文指出的，可变区允许抗体选择性地识别并特异性结合抗原上的表位。也就是说，将抗体的VL域和VH域或互补决定区(CDR)的子集合并以形成限定三维抗原结合位点的可变区。这种四元的抗体结构形成存在于Y的每个臂的端部处的抗原结合位点。更具体地，抗原结合位点由VH和VL链中的每个链上的三个CDR限定。含有用以特异性地结合至本发明的感兴趣分子的充足结构的任何抗体或免疫球蛋白片段在本文中可互换地表示为“结合片段”或“免疫特异性片段”。
在天然存在的抗体中，抗体包括存在于每个抗原结合结构域中的有时被称为“互补决定区”或“CDR”的六个高变区，当抗体在含水环境中呈现其三维构造时，上述高变区是被具体定位成形成抗原结合结构域的氨基酸的短的、非连续的氨基酸序列。“CDR”位于显示了较少的分子间可变性的四个相对保守的“框架”区或“FR”的侧面。框架区主要采用了β折叠构象，并且CDR形成连接β折叠结构或在一些情况下形成β折叠结构的一部分的环。因此，框架区用于形成支架，该支架提供用于通过链间的非共价相互作用以正确的方向定位CDR。由定位的CDR形成的抗原结合域限定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。针对任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员可以容易地识别出分别包括CDR和框架区的氨基酸，这是因为它们已经被精确地定义；参见“Sequences of Proteins of Immunological Interest，”Kabat等人，U.S.Department of Health and Human Services，(1983)；以及Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196(1987)，901-917，将它们的全部内容通过引用并入到本文中。
在本领域中使用的和/或接受的术语存在两种或更多种定义的情况下，除非有明确相反说明，否则如本文中使用的术语的定义旨在包括所有这样的含义。具体的实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services，“Sequences of Proteinsof Immunological Interest”(1983)和Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196(1987)，901-917已经描述了该特定区，上述文献通过引用并入到本文中其中，其中当彼此互相比较时，该定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，指代抗体或其变体的CDR的任一定义的应用均旨在落入如本文中限定和使用的术语的范围内。作为比较，在表2中列出了包括如由上文引用的参考文献中的每一个定义的CDR的合适的氨基酸残基。包括特定CDR的确切残基编号将根据CDR的序列和大小发生变化。本领域技术人员可以常规地确定在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下哪些残基包括该抗体的人IgG亚型的特定高变区或CDR。
表2：CDR定义1
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
1表2中所有CDR定义的编号按照Kabat等人列出的编号惯例(参见下文)。
Kabat等人还定义了应用于任何抗体的针对可变域序列的编号系统。本领域普通技术人员可以明确地将该“Kabat编号”系统分配至任何可变域序列，而不依赖于超过序列本身的任何实验数据。如本文中使用的，“Kabat编号”是指由Kabat等人U.S.Dept.ofHealth and Human Services，“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)列出的编号系统。除非特别说明，否则对本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中的特定氨基酸残基位置的编号的引用依据Kabat编号系统，然而该系统是理论上的并且不能等同地应用于本发明的每种抗体。例如，取决于第一CDR的位置，后面的CDR可以在任一方向上移动。
在一个实施方式中，本发明的抗体不是具有五价结构的IgM或其衍生物。特别地，在本发明的具体应用中，特别是治疗用途，IgM比IgG和其他二价抗体或相应的结合分子的用处少，这是因为IgM由于它们的五价的结构及其缺乏亲和性成熟而经常表现出非特异性的交叉反应和非常低的亲和性。
在特别优选的实施方式中，本发明的抗体不是多克隆抗体，即其基本上由一个特定的抗体种类组成而不是从血浆免疫球蛋白样品中获得的混合物。
抗体片段，动物化：
包括单链抗体的抗体片段可以包括单独的或与以下项中的全部或部分组合的一个或多个可变区：铰链区、CH1域、CH2域和CH3域。结合至本发明的感兴趣的分子的片段也包括在本发明中，所述片段包括一个或多个可变区与铰链区、CH1域、CH2域以及CH3域的任何组合。与根据本发明的方法分离的单克隆抗体等同，特别是与人单克隆抗体等同的本发明的抗体或其免疫特异性片段可以来自任何动物来源，包括鸟和哺乳动物。优选地，抗体是人的、鼠的、驴的、兔的、上羊的、豚鼠的、骆驼的、羊驼的、马的或鸡的抗体。在另一实施方式中，可变区可以是软骨鱼纲起源(例如来自鲨鱼)。
在本发明的特别优选的实施方式中，抗体为从人受试者克隆的天然存在的人单克隆抗体或其结合片段、衍生物和变体，其与本发明的IL-20特异性结合，如上文和下文中(例如在表1中、特别是在图3至图10的附图中以及在例如实施例2和实施例5的实施例中)详细限定的。
可选地，根据数据库中的相关人种系可变区序列来排列和采用人抗体的框架区；参见例如由MRC蛋白质工程中心(英国，剑桥大学)(Cambridge，UK)的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。例如，被认为是可能从真正种系序列脱离的氨基酸可以是由于在克隆过程期间引入的PCR引物序列。与人工生成的类人抗体(诸如来自噬菌体展示抗体库或异源小鼠的单链抗体片段(scFv))相比，本发明的人单克隆抗体的特征在于：(i)使用人的免疫反应而非动物替代品来获得，即抗体已在人体中响应于它们的相关构象的天然IL-20而生成，(ii)已经保护了个体免受或至少显著地减少了疾病(例如，SLE)的症状的存在，以及(iii)因为抗体是人源的，因此针对自身抗原的交叉反应的风险被最小化。因此，根据本发明，术语“人单克隆抗体”、“人单克隆自身抗体”、“人抗体”等都用于表示人源的IL-20结合分子，即该结合分子已经从人细胞(诸如B细胞)或其杂交瘤细胞中分离出来，或者该结合分子的cDNA已经从人细胞(例如人记忆B细胞)的mRNA直接克隆出来。人抗体仍被认为是“人类的”，即使例如为了提高其结合特性而在抗体中进行了氨基酸替换。
源自人免疫球蛋白库或源自用于一种或多种人免疫球蛋白转基因动物并且不表达内源免疫球蛋白的抗体(如下文以及例如在Kucherlapati等人的美国专利NO.5,939,598中描述的)表示类人抗体，以便将它们与本发明的真正的人抗体区分开。
例如，类人抗体(诸如通常从噬菌体展示分离出来的合成的和半合成的抗体)的重链和轻链的配对不一定反映原始配对，这是因为其发生在原始的人B细胞中。因此，从如在现有技术中通常使用的重组表达库获得的Fab和scFv片段可以被认为是人工的，具有对免疫源性和稳定性的所有可能的相关影响。
相比之下，本发明提供了从所选择的人受试者分离的亲和性成熟的抗体，其通过它们的治疗效用来表征。
移植的抗体(等同物)
本发明还涉及含有分别源自本发明的抗体(诸如IL-20抗体)的CDR的移植的抗体(可互换地称为等同物)。这种移植的CDR包括动物源化抗体，其中来自本发明抗体的CDR已经被移植，或者其中含有一个或多个氨基酸替换的CDR是被移植的。CDR可以被直接移植到如上所述的人框架或来自动物源的抗体框架中。如果需要，也可以通过生成框架库来并入框架变化。CDR和/或框架序列的优化可以独立地执行并顺序组合，或者可以同时执行，如下文更详细描述的。
为了生成移植的抗体，本发明的抗体的供体CDR被移植到抗体受体可变区框架上。用于移植抗体和生成CDR变体以优化活性的方法已经在之前描述(参见例如，国际专利申请WO98/33919；WO00/78815；WO01/27160)。可以执行该程序以同时地实现供体CDR的移植和亲和性重新获取。同样地，该方法可以单独地使用或者与CDR移植组合地使用，以改进或优化可变区的结合亲和性。用于将供体CDR结合亲和性赋予到受体可变区上的方法可适用于重链和轻链可变区二者，并且因此可以用于同时移植和优化抗体可变区的结合亲和性。
供体CDR可以被改变成在供体CDR内的所有或所选位置处含有多个不同的氨基酸残基变化。例如，二十种天然存在的氨基酸残基的随机的或者偏向的结合，或者预选择的子集可以被引入到供体CDR中，用以产生CDR种类的不同群。将CDR变体种类包含到可变区的不同群中允许生成对于预定抗原呈现优化的结合亲和性的变体种类。在供体CDR位置中可以进行一系列可能的改变。可以被选择的上述可能改变中的一些或者全部可以被引入到移植性供体CDR的群中。CDR中的单个位置可以被选择以引入改变，或者可以针对活性组合和筛选具有改变的氨基酸的多个位置。
一种方法是通过在每个位置用例如所有二十种天然存在的氨基酸替换，沿着CDR改变所有的氨基酸位置。每个位置的替换可以发生在其他供体CDR氨基酸位置的环境中，使得CDR的重要部分保持真实供体CDR序列，并因此保持了供体CDR的结合亲和性。例如，无论是原生的或经改变的框架的受体可变区框架可以被移植有在CDR内的每个位置处包括单个位置替换的CDR群。类似地，受体可变区框架可以针对用于移植有下述CDR群，该CDR群包括多于一个的变化的位置以并入所有二十种氨基酸残基或氨基酸的子集。待移植的一个CDR或一组CDR内的一个或多个氨基酸位置可以被改变并且被移植到受体可变区框架中，以生成移植抗体的群。需要理解的是，如果需要，具有一个或多个改变位置的CDR可以与具有一个或多个改变位置的一个或多个其他CDR组合。
具有一个或多个改变位置的CDR变体种类的群可以与构成可变区的结合袋的任何或所有CDR组合。因此，受体可变区框架可以针对于在重链或轻链中的一个、两个或所有三个受体CDR位置处同时并入供体CDR变体群。选择哪个CDR或者具有氨基酸位置改变的针对靶的CDR的数量将取决于：例如，是否期望将完整的CDR移植到受体中，或者该方法是否是为了优化结合亲和性而进行的。
用于选择供体CDR氨基酸以改变用于将供体CDR结合亲和性赋予到抗体受体可变区框架上的另一方法是选择已知的或者容易识别的高度可变化的CDR位置。例如，可变区CDR3通常是高度可变化的。因此，该区可以在移植程序过程中选择地针对用于氨基酸位置改变，以单独地或连同相关受体可变框架改变一起确保结合亲和性再获取或者扩增。
鼠源化抗体：
如上文描述的通过移植生成的抗体的实例是鼠源化抗体。如本文中使用的，术语“鼠源化抗体”或“鼠源化免疫球蛋白”是指包括来自本发明的人抗体的一个或多个CDR的抗体；以及包括基于小鼠抗体序列的氨基酸替换和/或缺失和/或插入的人框架区的抗体。提供CDR的人免疫球蛋白被称为“亲代”或“受体”，并且提供框架改变的小鼠抗体被称为“供体”。不需要存在恒定区，但是如果存在恒定区，它们通常基本上相同于小鼠抗体的恒定区，即至少约85％-90％，优选地约95％或更多相同的。因此，在一些实施方式中，全长鼠源化人重链或轻链免疫球蛋白包括小鼠恒定区、人CDR以及具有多个“鼠源化”氨基酸替换的基本上人的框架。通常地，“鼠源化抗体”是包括鼠源化可变轻链和/或鼠源化可变重链的抗体。例如，鼠源化抗体将不会包括典型的嵌合抗体，例如，因为嵌合抗体的整个可变区是非小鼠的。已经通过“鼠源化”的过程“鼠源化”的修饰的抗体结合至与提供CDR的亲代抗体相同的抗原，并且与亲代抗体比较，该修饰抗体在小鼠中的免疫原性通常较低。
抗体片段：
如本文中使用的，术语“重链部分”包括源自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包括重链部分的多肽包括以下中的至少一种：CH1域、铰链(例如，上部、中部和/或下部铰链区)域、CH2域、CH3域或其变体或者片段。例如，用于本发明中使用的结合多肽可以包括包含CH1域的多肽链；包括CH1域、铰链域的至少一部分以及CH2域的多肽链；包括CH1域和CH3域的多肽链；包括CH1域、铰链域的至少一部分以及CH3域的多肽链，或者包括CH1域、铰链域的至少一部分、CH2域以及CH3域的多肽链。在另一实施方式中，本发明的多肽包括包含CH3域的多肽链。此外，用于本发明使用的结合多肽可以缺少CH2域的至少一部分(例如，CH2域的全部或一部分)。如上文所阐述的，本领域普通技术人员将会理解的是，这些域(例如，重链部分)可以被修饰以使得它们的氨基酸序列不同于天然存在的免疫球蛋白分子。
在本文公开的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一个多肽链的重链部分相同于该多聚体的第二多肽链上的那些重链部分。可替换地，本发明的含有重链部分的单体是不相同的。例如，每种单体可以包括不同的靶结合位点，从而形成例如双特异性抗体或者双抗体。
在另一实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物由单个多肽链(诸如scFv)组成，并且在细胞内表达(胞内抗体)用于可能的体内治疗以及诊断应用。
本文公开的用于诊断和治疗方法中的结合多肽的重链部分可以源自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可以包括源自IgG1分子的CH1域和源自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可以包括部分地源自IgG1分子并且部分地源自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，重链部分可以包括部分地源自IgG1分子和部分地源自IgG4分子的嵌合铰链。
因此，还如实施例中示例的，在一个实施方式中，本发明的抗体的恒定区或其部分(特别是CH2和/或CH3域，但可选地还是CH1域)与根据本发明的方法分离的原生人单克隆抗体的可变区异源。在本文中，在本发明的抗体的治疗应用的情况下，一种或多种异源恒定区优选为人源的，但是在动物研究的情况下，该一种或多种异源恒定区也可以是例如啮齿动物源的；同样参见实施例。
如本文中使用的，术语“轻链部分”包括源自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，轻链部分包括VL或CL域中的至少一种。
如先前指出的，各种免疫球蛋白类的恒定区的亚基结构和三维构造是公知的。如本文中使用的，术语“VH域”包括免疫球蛋白重链的氨基端可变域，并且术语“CH1域”包括免疫球蛋白重链的第一(主要为氨基端)恒定区域。CH1域邻近于VH域并且是到免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基端。
如本文中使用的，术语“CH2域”包括重链分子的部分，该重链分子使用常规编号方案的从例如抗体的约残基244延伸至残基360(残基244至360，Kabat编号系统；以及残基231至340，EU编号系统；参见Kabat等人，同上)。CH2域的独特在于其不与另一域紧密配对。相反地，在完整的原生IgG分子的两个CH2域之间插入两个N-连接的分支糖链。还记录有，CH3域从CH2域延伸至IgG分子的C端区，并且包括大约108个残基。
如本文中使用的，术语“铰链区”包括将CH1域连接至CH2域的重链分子的部分。这种铰链区包括大约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N端抗原结合区独立地移动。铰链区可以细分成三个不同的域：上部、中部和下部铰链域；参见Roux等人，J.Immunol.161(1998)，4083。
如本文中使用的，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包括可以与第二硫醇基形成二硫键或者桥的硫醇基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1区和CL区通过二硫键连接，并且两条重链通过两个二硫键在与使用Kabat编号系统的239和242(位置226或229，欧洲编号系统)相对应的位置处连接。
如本文中使用的，术语“连接的”、“融合的”或者“融合”是互换使用的。这些术语是指两种或更多种元件(要素)或组分通过包括化学偶联或重组方式在内的任何方法连接到一起。“框内融合”是指两个或更多个多核苷酸的开放阅读框(ORF)以保持原始ORF的正确翻译阅读框的方式形成连续的较长的ORF而进行的接合。因此，重组融合蛋白是含有相对应于由原始ORF编码的多肽的两个或更多个段(这些段通常实际上并不如此连接)的单种蛋白。尽管该阅读框因此在整个融合段被制成连续的，但是该片段可以通过例如框内连接序列在物理上或者空间上分开。例如，编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸可以在框内被融合，但是可以通过编码至少一个免疫球蛋白框架区或另外的CDR区的多核苷酸分开，只要“融合的”CDR被共同翻译为连续多肽的一部分。
表位：
用于抗体的肽或多肽表位的最小尺寸被认为是约四至五个氨基酸。肽或多肽表位优选地包括至少七个氨基酸，更优选地至少九个氨基酸并且最优选地在至少约15个至约30个氨基酸之间。因为CDR可以以其三级形式识别抗原肽或者多肽，所以包括表位的氨基酸不需要是连续的，并且在一些情况下，甚至可以不处于相同的肽链上。在本发明中，由本发明的抗体识别的肽或多肽表位包括本发明的感兴趣分子(即IL-20)的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、更优选地至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、约15个至约30个之间的或者约30个至约50个之间的连续的或非连续的氨基酸的序列。优选地，由本发明的抗体识别的肽含有15个至18个氨基酸。在优选的实施方式中，肽含有由来自具有序列PDHYTLRKISSLANSFLT SEQ ID NO：69的人IL-20的连续的序列组成的18个氨基酸。在另一优选的实施方式中，肽表位含有由序列DHYTLRKISSLANSF SEQ ID NO：70组成的15个氨基酸。
结合特性：
在本文中互换使用的“结合”或“识别”通常是指，结合分子(例如，抗体)经由其抗原结合域结合至预定表位，并且该结合引起抗原结合域和表位之间的一些互补性。根据这种定义，当抗体结合至表位时，该抗体被认为是经由其抗原结合域“特异性结合”至该表位比该抗体结合至随机的不相关表位更容易。术语“特异性”在本文中用于限定通过其某一抗体结合至某一表位的相对亲和性。例如，可以认为抗体“A”与抗体“B”相比具有针对给定表位的较高的特异性，或者可以说抗体“A”以其针对相关表位“D”所具有的更高的特异性结合至表位“C”。不相关的表位通常为非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白或者其他指定的多肽)的一部分，其可以用于估计给定结合分子的结合特异性。在该方面，术语“特异性结合”是指抗体以比其与非特异性抗原的结合的KD低至少两倍的KD与预定抗原结合。如本文使用的术语“高度特异性”结合意指针对特异性靶表位的抗体的相对KD比该抗体结合至其他配体的KD低至少10倍。
在存在的情况下，抗体与抗原的所有语法形式的术语“免疫球蛋白结合特性”或其他结合特性均是指抗体的特异性、亲和性、交叉反应性以及其他结合特性。
“优选地结合”是指结合分子(例如抗体)特异性地结合至表位比该抗体结合至相关的、类似的、同源的或者类似表位更容易。因此，“优选地结合”至给定表位的抗体将比结合至相关表位更容易结合至该给定表位，即使该抗体可能与相关表位交叉反应。
通过非限制的实例，如果结合分子(例如抗体)以比该抗体针对第二表位的离解常数(KD)低的KD结合所述第一表位，则可以认为该抗体优选地结合第一表位。在另一非限制实例中，如果抗体以比该抗体针对第二表位的KD低至少一个数量级的亲和性结合至第一表位，则可以认为该抗体优选地结合至第一抗原。在另一非限制的实例中，如果抗体以比该抗体针对第二表位的KD低至少两个数量级的亲和性结合第一表位，则可以认为该抗体优选地结合第一表位。
在另一非限制实例中，如果结合分子(例如，抗体)以比第二表位的解离率(offrate)(k(off))低的k(off)结合第一表位，那么可以认为该抗体优选地结合第一表位。在另一非限制的实例中，如果抗体以比该抗体针对第二表位的k(off)低至少一个数量级的亲和性结合第一表位，那么可以认为该抗体优选地结合第一表位。在另一非限制的实例中，如果抗体以针对第二表位的k(off)低至少两个数量级的亲和性结合第一表位，那么可以认为该抗体优选地结合第一表位。
本文公开的结合分子(例如，抗体或抗原结合片段、变体或衍生物)可以被认为以低于或等于5x 10-2秒-1、10-2秒-1、5x 10-3秒-1或l0-3秒-1的解离率(k(off))结合本发明的感兴趣的分子、其片段或变体。更优选地，本发明的抗体可以被认为以低于或等于5x 10-4秒-1、10-4秒-1、5x 10-5秒-1或10-5秒-1、5x 10-6秒-1、10-6秒-1、5x 10-7秒-1或者10-7秒-1的解离率(k(off))结合本发明的感兴趣的分子或其片段或变体。
本文公开的结合分子(例如，抗体或抗原结合片段、变体或衍生物)可以被认为以大于或等于103M-1秒-1、5x 103M-1秒-1、104M-1秒-1或5x 104M-1秒-1结合率(on rate)(k(on))结合本发明的感兴趣的分子或其片段或者变体。更优选地，本发明的抗体可以被认为以大于或等于105M-1秒-1、5x 105M-1秒-1、106M-1秒-1或5x 106M-1秒-1或者107M-1秒-1的结合率(k(on))结合本发明的感兴趣的分子或其片段或变体。
如果结合分子(例如，抗体)优先结合到给定表位到这样的程度，使得在一定程度上阻止参考抗体与该表位的结合，则该抗体被认为竞争性抑制该参考抗体与该给定表位的结合。竞争抑制可以通过本领域中已知的任何方法(例如，竞争ELISA测定)来确定。抗体可以被认为竞争抑制参考抗体与给定表位至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％的结合。
如本文中使用，术语“亲和力”是指单个表位与结合分子(例如，免疫球蛋白)的CDR结合强度的测量；参见例如，Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，2nd ed.(1988)27-28页。如本文中使用的，术语“亲合力(avidity)”是指免疫球蛋白群和抗原之间的复合物的总体稳定性，也就是说，免疫球蛋白混合物和抗原的功能组合强度；参照例如，Harlow第29-34页。亲合力涉及群中单个免疫球蛋白分子与特异性表位的亲和力以及免疫球蛋白和抗原的化合价。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构的抗原(诸如聚合物)之间的相互作用将是高亲和力中的一种。可以使用任何合适的方法在实验上确定抗体对抗原的亲和性和亲合力；参照例如，Berzofsky等人，“Antibody-Antigen Interactions(抗体抗原相互作用)”In FundamentalImmunology，Paul，W.E.，Ed.，Raven Press New York，N Y(1984)，Kuby JanisImmunology，W.H.Freeman and Company New York，N Y(1992)，以及其中描述的方法。用于测量抗体对抗原的亲合性的常规方法包括ELISA、RIA以及表面等离子体共振。如果在不同的条件(例如盐浓度、pH)下进行测量，则所测量的特定抗体-抗原互相作用的亲和力可以变化。因此，亲合力以及其他抗原结合参数(例如，KD、IC50)的测量优选地用抗体和抗原的标准的溶液以及标准的缓冲剂进行。
本发明的结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或其衍生物)也可以根据它们的交叉反应性进行描述或具体化。如本文中使用的，术语“交叉反应性”是指对一种抗原特异性的抗体与第二抗原的反应的能力；两种不同抗原物质之间的相关联性的测量。因此，如果抗体结合至诱导其形成的表位不同的一个表位，那么该抗体是交叉反应性的。交叉反应性表位通常含有许多相同的互补性结构特征作为诱导表位，并且在一些情况下，实际上可能比原始的(最初的，original)更适合。
例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，原因在于它们结合相关的但不相同的表位，例如与参照表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％以及至少50％的同一性(如使用本领域已知的和本文中描述的方法计算得来的)的表位。如果抗体并不与与参考表位具有少于95％、少于90％、少于85％、少于80％、少于75％、少于70％、少于65％、少于60％、少于55％以及少于50％的同一性(如使用本领域已知的和本文中描述的方法计算得来的)表位结合，则可以认为该抗体具有较少的交叉反应性或不具有交叉反应性。如果抗体不与某一表位任何其他类似物、直系同源物或同系物结合，则可以认为该抗体针对该表位“高度特异性”。
本发明的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，也可以根据它们与本发明的感兴趣分子的结合亲和性进行描述或具体化。优选的结合亲和力包括具有少于5x 10-2M、10-2M、5x 10-3M、10-3M、5x 10-4M、10-4M、5x 10-5M、10-5M、5x 10-6M、10-6M、5x 10-7M、10-7M、5x 10-8M、10-8M、5x 10-9M、10-9M、5x 10-10M、10-10M、5x 10-11M、10-11M、5x 10-12M、10- 12M、5x 10-13M、10-13M、5x 10-14M、10-14M、5x 10-15M或者10-15M的解离系数或者KD的那些结合亲和力。通常，抗体以10-7M或更少的解离系数(KD)结合至其预定抗原。优选地，抗体以10-9M或更少的解离系数(KD)且还更优选地以10-11M或更少的解离系数(KD)与其同源抗原结合。
抗体的修饰：
免疫球蛋白或其编码的cDNA可以被进一步修饰。因此，在另外的实施方式中，本发明的方法包括生产嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段、双特异抗体、融合抗体、标记抗体或这些中任一种的类似物的一个或多个步骤中的任一个。相应的方法是本领域技术人员已知的，并且例如在Harlow和Lane“Antibodies，A Laboratory Manual”，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988中进行了描述。当所述抗体的衍生物通过噬菌体展示技术获得时，如在BIAcore(芯片)系统中应用的表面等离子共振可以用于增加结合至由本发明提供的抗体中任一种的表位相同的表位的噬菌体抗体的效率(Schier Human AntibodiesHybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。例如，在国际申请WO89/09622中描述了嵌合抗体的生产。在例如欧洲申请EP 239 400A1和国际申请WO90/07861中描述了用于生产人源化抗体的方法。根据本发明的待利用的抗体的其他来源是所谓的异源抗体。在国际申请WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096和WO 96/33735中描述了用于在小鼠中产生异源抗体(诸如人抗体)的一般原理。如上文讨论的，除了完整抗体之外，本发明的抗体可以以各种形式存在；包括例如Fv、Fab和F(ab)2以及单链；参见例如国际申请WO88/09344。
使用本领域已知的惯用技术(例如，通过单独地或者组合地使用本领域中已知的氨基酸的一个或多个缺失、一个或多个插入、一个或多个替换、一个或多个添加和/或一个或多个重组和/或一个或多个任何其他修饰)可以进一步修饰本发明的抗体或其相应的一种或多种免疫球蛋白链。用于在免疫球蛋白链的氨基酸序列处的DNA序列中引入这种修饰的方法是本领域技术人员公知的；参见例如，Sambrook,Molecular Cloning A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，Current Protocols inMolecular Biology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1994)。本发明的抗体的修饰包括在一个或多个组成氨基酸处的化学和/或酶衍生化，包括侧链修饰；主链修饰；以及N端和C端修饰，包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化以及碳水化合物或者脂质部分、辅酶因子等的附着。同样地，本发明包括嵌合蛋白的生产，该嵌合蛋白包括在氨基端融合至异源分子(诸如标记或药物)的所描述的抗体或其一些片段。以这种方式生成的抗原结合分子可以用于将药物分别定位至表达患病细胞和组织的合适的表面结构的细胞。这种对细胞的靶向和结合可以有助于治疗或诊断活性剂的递送以及基因治疗/基因递送。具有本发明的抗体的分子/颗粒会特异性地结合至表达特定的感兴趣抗原的细胞/组织，并且因此可以具有诊断的和治疗的用途。
样品:
如本文使用的，术语“样品”或“生物样品”是指从受试者或者患者获得的任何生物材料。在一个方面，样品可以包括血液、脑脊髓液(“CSF”)或者尿液。在其他方面，样品可以包括全血、血浆、从外周血(PBMC)富集的单核细胞(诸如淋巴细胞(即T细胞、NK细胞或者B细胞)、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和嗜碱粒细胞)；以及培养的细胞(例如，来自受试者的B细胞)。样品还可以包括含有肿瘤组织的活检或组织样品。在又一方面，样品可以包括全细胞和/或该细胞的裂解物。在一个实施方式中，样品包括外周血单核细胞(PBMC)。样品可以通过本领域中已知的方法来收集。
疾病和失调：
除非另有说明，否则术语“失调”和“疾病”在本文中可互换使用。如本文中使用的术语“自身免疫失调”是起因于并且针对个体自身组织或器官或其共分离或表现或者由其引起病症的疾病或者失调。自身免疫疾病主要是由适应性免疫应答的调节异常引起的，并且形成针对自身结构的自身抗体或自身反应性T细胞。几乎所有的自身免疫疾病都具有炎症成分。自身炎性疾病主要是炎症性的，并且一些经典的自身炎性疾病是由先天炎症通路中的基因缺陷引起的。在自身炎性疾病中，未发现自身反应性的T细胞或者自身抗体。在许多这些自身免疫和自身炎症失调中，可能存在多个临床和实验标记，包括但不限于高丙种球蛋白血症(血丙种球蛋白过多，hypergammaglobulinemia)、高水平的自身抗体、组织中的抗原-抗体复合物沉积、来自皮质类固醇或免疫抑制治疗的益处以及在受影响的组织中的淋巴样细胞聚集。不限制于关于B细胞介导的自身免疫失调的理论，据信B细胞通过大量的机械途径证明了在人自身免疫疾病中的致病作用，所述机械途径包括自身抗体生产、免疫复合物形成、树突细胞和T细胞活化、细胞因子合成、直接趋化因子释放以及提供用于异位新淋巴生成的病灶。这些途径中的每一种均可能不同程度地参与到自身免疫疾病的病理(病变)中。
如本文中使用，“自身免疫失调”可以是器官特异性疾病(即免疫应答特异性地针对器官系统，诸如内分泌系统、造血系统、皮肤、心肺系统、肠胃和肝脏系统、肾脏系统、甲状腺、耳朵、神经肌肉系统、中枢神经系统等)，或者可以是可以影响多个器官系统的全身性疾病，包括但不限于系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿关节炎(RA)、多肌炎、自身免疫多内分泌腺病综合征1型(APS1)/自身免疫多内分泌腺病念珠菌病外皮层的营养不良(APECED)等。优选地，这种疾病包括但不限于多发性硬化(MS)、炎性肠疾病(IBD)、各种形式的自身免疫类风湿病失调(包括但不限于类风湿关节炎、亚成体类风湿关节炎、牛皮癣、牛皮癣关节炎、强直性脊柱炎、脊柱关节炎、牛皮癣关节炎、干燥综合征、硬皮病、狼疮(包括但不限于SLE和狼疮性肾炎)、多肌炎/皮肌炎以及牛皮癣关节炎)、自身免疫皮肤病失调(包括但不限于牛皮癣、天胞疮组疾病、大包性类天胞疮疾病以及皮肤红斑狼疮)以及自身免疫内分泌失调(包括但不限于诸如糖尿病相关自身免疫疾病诸如1型或者胰岛素依赖型糖尿病(T1DM或IDDM)、自身免疫甲状腺疾病(包括但不限于Graves疾病和甲状腺炎))以及影响自身免疫生成的疾病(包括但不限于自身免疫多内分泌腺病1型(APS1)/自身免疫多内分泌腺病念珠菌病外胚层的营养不良(APECED)以及重症肌无力(MG/胸腺瘤))。优选地，疾病包括例如SLE、RA、脊柱关节炎、牛皮癣关节炎、牛皮癣、干燥综合征、格雷夫斯病、甲状腺炎、血管球性肾炎和APS1。还更优选的是RA和SLE，并且最优选的是SLE。
最近已经描述了IL-20拮抗剂(诸如抗IL-20抗体)的其他医学用途，例如在国际申请WO2010/042634中用于预防或治疗类风湿关节炎和骨质疏松症；在国际申请WO2014/025767中用于减少肝脏纤维化；在国际申请WO2014/025775中用于治疗过敏性呼吸道疾病(例如哮喘或支气管气道阻塞)，以及在国际申请WO2014/036384中用于促进患有骨折受试者的骨折愈合。
标记和诊断：
标记剂可以直接或者间接地偶联至本发明的抗体或抗原，例如用于制备免疫结合物。间接偶联的一个实例是通过使用间隔基(spacer)部分。此外，本发明的抗体可以包括另外的域，所述域通过共价键或者非共价键连接。根据本领域已知的和上文描述的方法这种连接可以基于基因融合，或者可以通过例如在国际申请WO94/04686中描述的化学交联来执行。在包括本发明的抗体的融合蛋白中存在的另外的域可以优选地通过柔性连接物(linker)(有利地是多肽连接物)进行连接，其中，所述多肽连接物包括多个亲水性肽键合的氨基酸，其长度足够跨过所述另外的域的C端端部和本发明的抗体的N端端部之间的距离，或者反之亦然。治疗或诊断活性剂可以通过各种方式偶联至本发明的抗体或其抗原结合片段。这包括例如单链融合蛋白，其包括通过共价的方法(诸如肽连接)偶联至治疗或诊断活性剂的本发明的抗体的可变区。另外的实例包括下述分子，该分子包括共价地或非共价地偶联至另外的分子的至少一个抗原结合片段，包括以下非限制性示例性列表中的那些。Traunecker，Int.J.Cancer Surp.SuDP 7(1992)，51-52描述了双特异性抗体试剂janusin，其中，针对CD3的Fv区偶联至可溶的CD4或其他配体(诸如OVCA和IL-7)。类似地，本发明的抗体的可变区可以被构造成Fv分子并且偶联至可替换的配体(诸如在引用文献中示出的那些)。Higgins J.Infect.Disease 166(1992)，198-202描述了由针对GP120的V3区中的特定序列的抗体交联的OKT3组成的异共轭抗体(异轭合抗体/异缀合抗体/杂缀合抗体，hetero-conjugate antibody)。这种异共轭抗体还可以至少使用在本发明的抗体中含有的可变区来构造。特异性抗体的另外的实例包括Fanger，Cancer Treat.Res.68(1993)，181-194和Fanger，Crit.Rev.Immunol.12(1992)，101-124中描述的那些。作为包括常规抗体的免疫毒素的结合物(缀合物)在本领域中已经被广泛地描述。通过常规的偶联技术可以将毒素偶联至抗体或者将含有蛋白毒素部分的免疫毒素生产为融合蛋白。可以以相应的方式来使用本发明的抗体，以获得这种免疫毒素。这种免疫毒素的示例是通过Byers SeminarsCell.Biol.2(1991)，59-70和通过Fanger，Immunol.Today 12(1991)，51-54描述的那些。
上文描述的融合蛋白还可以包括用于蛋白酶的可切割的连接物或切割位点。这些间隔基部分进而可以是不可溶的或可溶的(Diener等人，Science231(1986)，148)，并且可以被选择成用以使药物能在靶位点从抗原释放。可以偶联至本发明的抗体和抗原的用于免疫疗法的治疗剂的实例是趋化因子、归巢分子、药物、放射性同位素、凝集素和毒素。可以共轭于本发明的抗体和抗原的药物取决于旨在使用共轭的分子的疾病环境。例如，对用于治疗肿瘤疾病的靶特异性的抗体可以共轭于被经典地称为抗肿瘤药(诸如丝裂霉素C、柔红霉素(daunorubicin)和长春花碱)的化合物。在使用本发明的放射性同位素共轭的抗体或抗原用于例如肿瘤免疫疗法的过程下，取决于诸如白细胞分布以及稳定性和发射的因素，某些同位素可能比其他同位素更优选。取决于自身免疫应答，一些发射体可以优选于其他的发射体。通常，在免疫疗法中发射放射性同位素的α和β颗粒是优选的。优选的是短范围高能α发射物，诸如212Bi。用于治疗目的可以结合至本发明的抗体或抗原的放射性同位素的实例为125I、131I、90Y、67Cu、212Bi、212At、211Pb、47Sc、109Pd以及188Re。可以偶联至本发明的抗体或抗原的其他治疗剂以及在体外和在体内的治疗方案是本领域普通技术人员已知的或者可以由本领域普通技术人员容易地确定。用于标记的合适的放射性同位素的非限制性实例为198Au、212Bi、11C、14C、57Co、67Cu、18F、67Ga、68Ga、3H、197Hg、166Ho、111In、113m In、123I、125I、127I、131I、111In、177Lu、15O、13N、32P、33P、203Pb、186Re、188Re、105Rh、97Ru、35S、153Sm和99m Tc。适合于标记的其他分子是荧光或发光染料、磁性颗粒、金属和可以通过二级(辅助)酶或结合步骤检测到的分子(诸如酶或肽标签)。适合于用作本发明标记的商业的荧光探针在Handbook ofFluorescent Probes and Research Products，第8版中被列出来，将该文献的公开内容通过引用并入到本文中。适合于基于磁性颗粒基测定(MPA)的磁性颗粒可以选自顺磁体测量、反磁性体材料、含铁磁体材料和超顺磁体材料。
用于诊断目的的在分子和细胞生物化学中的一般方法可以在这种标准的教科书中发现，如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版(Sambrook等人，HarborLaboratory Press 2001)；Short Protocols in Molecular Biology，第4版(Ausubel等人，eds.,John Wiley&Sons 1999)；Protein Methods(Bollag等人，John Wiley&Sons1996)。用于诊断目的的试剂、检测装置和试剂盒可以从商业的供应商(诸如PharmaciaDiagnostics、Amersham、BioRad、Stratagene、Invitrogen以及Sigma-Aldrich)以及从在本文引用的参考文献(特别是专利文献)中的任一个给出的来源得到。
治疗和药物：
如本文中使用的，术语“治疗(treat)”或者“治疗(处理，treatment)”是指治疗性治疗和预防性或防范性措施，其中，目的是防止或者减缓(减轻)不理想的生理变化或失调，诸如自身免疫和/或自身炎症性疾病的发展。无论是可检测的还是不可检测的，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病的稳定(即不恶化)状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分的或者全部的)。“治疗(treatment)”还可以指与不接受治疗的期望的存活期相比，延长存活期。需要治疗的那些对象包括：已经患有病症或者失调的那些对象，以及易患有该病症或失调的那些对象，或者要预防该病症或失调的表现的那些对象。
如果没有另外说明，则术语“药物(drug)”、“药品(medicine)”或者“药剂(药物，medicament)”在本文中互换使用，并且应该包括但不限于以下所有：(A)内用或外用的制品、药品以及制剂，以及旨在用于诊断、治愈、减轻、治疗或者防止人或者其他动物疾病的任何物质或者物质的混合物；以及(B)旨在影响人体或其他动物身体的结构或任何功能的制品、药品和制剂(除了食物)；以及(C)旨在用于(A)项和(B)项中规定的任何制品的组分的制品。术语“药物(drug)”、“药品(medicine)”或者“药剂(medicament)”应该包括旨在用于人或其他动物中的制剂的完整配方，其包括一种或多种“药剂”、“化合物”、“物质”或“(化学)组合物”并且在一些其他情况下还包括其他药学上无活性的赋形剂作为填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、粘合剂或者在人或其他动物的身体内的预定目标位置(例如，在皮肤上，在胃或肠中)确保“药物”，“药品”或“药剂”的容易运输，崩解，解聚，溶出和生物可用性。术语“试剂”、“化合物”或“物质”在本文中可互换使用，并且在更具体的上下文中，应当包括，但不限于所有的药理学活性剂，即诱导期望的生物学或药理学效果或研究或测试用于通过本发明的方法诱导这样的可能的药理作用的能力的试剂。
“抗风湿药物”和免疫抑制药物的实例包括氯喹、羟基氯喹、硫代苯酸金钠(myocrisin)、醋硫葡金(金诺芬，auranofm)、柳氮磺胺吡啶、甲氨蝶呤、来氟米特、依那西普、英夫利昔单抗(加口服和皮下用甲氨蝶呤)、阿达木单抗等、硫唑嘌呤、D-青霉胶、金盐(口服)、金盐(肌内的)、米诺环素、包括环孢霉素A和局部用环孢霉素的环孢霉素、他克莫司、霉酚酸酯、环磷酰胺、葡萄球菌蛋白A(Goodyear和Silveman J.Exp.Med.,197()，2003)，125-39)，包括它们的盐和衍生物等。
“非甾体抗炎药物”或“NSAID”的实例包括阿司匹林、乙酰水杨酸、布洛芬和布洛芬缓释、非诺洛芬、吡罗昔康、氟比洛芬、萘普生、酪洛芬、萘普生、替诺昔康、扑炎痛、双氯芬酸、萘普生、纳布美通、消炎痛、酪洛芬、甲灭酸、双氯芬酸、芬布芬、阿扎丙宗、阿西美辛、噻洛芬酸、消炎痛、舒林酸、甲苯酰吡啶乙酸、苯基丁氮酮、双氯芬酸以及双氯芬酸缓释、环氧合酶(COX)-2抑制剂(诸如GR 253035、MK966、塞来昔布(4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-lH-吡唑-1-基)、苯磺酰胺和伐地考昔)以及美洛昔康包括它们的盐和衍生物等。优选地，它们是阿司匹林、萘普生、布洛芬、消炎痛、或甲苯酰吡啶乙酸(托美丁)。这样的NSAID可选地与诸如可待因、曲马朵和/或三氢可待因的止痛剂或诸如吗啡的麻醉药一起使用。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指任何受试者，特别是哺乳动物受试者，例如人类患者，对于他们来说，诊断、预后、预防或治疗是期望的。
药物载体：
可以从本领域技术人员已知的相应文献中获取药学上可接受的载体和给药路径。本发明的药物组合物可以根据本领域已知的方法配制；参见例如Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy(2000)，费城科学大学，ISBN0-683-306472，VaccineProtocols.第2版，Robinson等人，Humana Press、Totowa、New Jersey，美国，2003；BangaTherapeutic Peptides and Proteins：Formulation,Processing,and DeliverySystems.第2版，Taylor和Francis.(2006)，ISBN：0-8493-1630-8。合适的药物载体的实例在本领域中是已知的，并且包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂、诸如油/水乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包括这种载体的组合物可以通过公知的常规的方法来配制。这些药物组合物可以以合适的剂量给予受试者。合适的组合物的给药可以通过不同的途径来实现。实例包括经由口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、真皮下、经皮、鞘内的和颅内的方法给予包括药学上可接受的载体的组合物。诸如鼻用喷雾制剂的气溶胶制剂包括具有防腐剂和等渗剂的活性剂的纯化水溶液或其他溶液。这样的制剂优选地被调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。本发明中也设想用于口服给予的药物组合物，诸如单域抗体分子(例如“nanobodies(纳米抗体)TM”)等。这样的口服制剂可以是片剂、胶囊、颗粒、液体或者半固体形式。片剂可以包括固体载体，诸如明胶或者佐剂。用于直肠或阴道给药的制剂可以呈现为具有合适载体的栓剂；还参见O'Hagan等人，Nature Reviews，Drug Discovery 2(2003)，727-735。有关适合于各种类型给药的配方的进一步的指导可以在Remington'sPharmaceutical Sciences，Mace Publishing Company，Philadelphia，PA，17th ed.(1985)以及相应的更新中找到。对于用于药物递送的方法的简短评述，参见LangerScience 249(1990)，1527-1533。
剂量方案：
剂量方案将由主治医生和临床因素确定。如在医学领域中已知的，用于任何一名患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待给予的特定化合物、性别、给药的时间和途径、一般健康状况以及待同时给予的其他药物。典型的剂量可以例如在0.001μg至1000μg的范围内(或者具有在该范围内用于表达或者用于抑制表达的核酸)；然而，特别是考虑到前述因素，还预想低于或者高于该示例性范围的剂量。通常，作为药物组合物的常规给予的方案应该在每天1μg至10mg单位的范围内。如果方案是连续输注，则还应该分别在1μg至10mg单位/kg体重/分钟的范围内。可以通过定期评估来监测进程。用于胃肠外给药的制剂包括无菌水溶液或者非水溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油的植物油以及诸如油酸乙酯的可注射的有机酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液，林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或固定油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的那些)等。防腐剂和其他的添加剂也可以存在，诸如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体等。此外，根据药物组合物的预期用途，本发明的药物组合物还可以包括另外的药剂(试剂)，诸如抗肿瘤药剂和细胞毒性药物。
另外，其他药剂的共同给予或顺序给予可以是期望的。治疗有效剂量或量是指足以减轻症状或病症的活性成分的量。这种的化合物的治疗功效和毒性可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，例如ED50(在50％的种群中治疗有效的剂量)以及LD50(对50％的种群致命的剂量)。在治疗和毒性作用之间的剂量比是治疗指数，并且其可以被表示为LD50/ED50的比率。优选地，组合物中的治疗剂以足以防止炎症或抑制免疫应答的量存在。
本发明的说明书和实施例公开并涵盖了这些和其他实施方式。可以使用例如电子设备从公共图书馆和数据库来检索关于根据本发明待采用的材料、方法、用途和化合物中的任一种的其他文献。例如可以利用美国国家生物技术信息中心和/或美国国立卫生研究院的国家医学图书馆主办的公共数据库“PubMed”。进一步的数据库和网址，诸如欧洲分子生物实验室(EMBL)的一部分的欧洲生物信息研究所(EBI)的那些，对于本领域技术人员来说是已知的，并且可以使用互联网搜索引擎获得。在Berks TIBTECH 12(1994)，352-364中给出了在生物技术中专利信息和用于追溯检索和用于当前了解的专利信息相关来源的概述。
上文公开内容大体上描述了本发明。在整个说明书中引用了若干文献。在紧接权利要求书之前的说明书的末尾处可以找到完整的文献资料出处。所有引用的参考文献(包括如在整个本申请中引用的参考文献、授权的专利、公开的专利申请，包括在背景技术部分和制造商的说明书、使用指南等中的公开内容)的内容通过引用明确地合并到本文中；然而，并未承认任何引用的文件确实是关于本发明的现有技术。
通过参照以下具体实施例可以获得更加全面的理解，文中提供的这些具体实施例仅在于说明性的目的。
实施例
后面的实施例1至实施例10以及对应的图1至图18进一步说明了本发明，但并不能认为是以任何方式对本发明的范围的限制。可以在引用的文献中找到常规方法(诸如本文中应用的那些)的详细描述；还参见由Beers和Berkow编辑的第十七版“The Merck Manualof Diagnosis and Therapy”(Merck&Co.，Inc.,2003)。除非另有说明，否则本发明的实践都将应用本领域的技术内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。
分子遗传学和基因工程的方法通常描述在以下文献的现行版本中：MolecularCloning：A Laboratory Manual，(Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)；DNA Cloning，Volumes I and II(Glover编辑，1985)；Oligonucleotide Synthesis(Gait编辑，1984)；Nucleic Acid Hybridization(Hames和Higgins编辑，1984)；Transcription AndTranslation(Hames和Higgins编辑，1984)；Culture Of Animal Cells(Freshney和Alan,Liss,Inc.,1987)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller和Calos编辑)；Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in MolecularBiology，第3版(Ausubel等人编辑)；以及Recombinant DNA Methodology(Wu编辑,Academic Press).Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(Miller和Calos编辑，1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154和155(Wu等人编辑)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the treatise,Methods In Enzymology(AcademicPress,Inc.,N.Y.)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayerand Walker编辑，Academic Press,London,1987)；Handbook Of ExperimentalImmunology,Volumes I-IV(Weir和Blackwell编辑，1986)。本公开内容中所提及的用于基因操作的试剂、克隆载体和试剂盒可从商业供应商(诸如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Promega和Clontech)获得。在Large Scale Mammalian Cell Culture(Hu等人，Curr.Opin.Biotechnol.8(1997)，148)；Serum-free Media(Kitano，Biotechnology 17(1991)，73)；Large Scale Mammalian Cell Culture(Curr.Opin.Biotechnol.2(1991)，375)；以及Suspension Culture of Mammalian Cells(Birch等人，BioprocessTechnol.19(1990),251)中概述了细胞培养和培养基收集的通用技术。
实施例1：通过LIPS测定、候选抗IL-20抗体的克隆和重组表达来检测患者血清中的人细胞因子特异性抗体
LIPS测定用于在患有遗传病症APECED(自身免疫性多内分泌腺病念珠菌病外胚层营养发育不良，还称为自身免疫性多内分泌腺病1型(APS1))的患者的血清中IL-20抗体的差异分析。IL-20与高斯荧光素酶在N端融合并且通过HEK293细胞的瞬时转染来表达，如在申请人的国际申请WO2013/098419中的第158页的实施例10和第165-167页的实施例15中描述的，该国际申请的公开内容通用引用合并到本文中，使用的引用物在下文的表3中示出。
该规程描述了用于通过荧光素酶免疫沉淀反应系统(LIPS)技术来检测抗体的实验程序。
材料：
·多层筛选(MultiScreen)HTS过滤板，Millipore#MSBVN1B50
·重组蛋白G琼脂糖珠，Exalpha#X1197
·缓冲液A(50mM的Tris、pH 7.5、100mM的NaCl、5mM的MgCl2、1％的Triton X-100)，
·荧光素酶测定系统，Promega#E1501
·高斯荧光素酶测定试剂、靶系统GAR-2B
·Luc抗原(储存在-80℃，浓度(LU/ml))
.PBS
硬件：
.旋转混合器
·多筛选HTS真空歧管，Millipore#MSVMHTS00
·145 0MicroBeta TriLux液体闪烁计数仪&光度计，Perkin Elmer
·胜利者X5多标记读板仪，Perkin Elmer
·多通道移液管：Biohit 30-300μl
·Eppendorf离心机5415D
方法:
·小心重悬悬蛋白G琼脂糖，取必要的量(每一个板约200μl的悬浮液，使100μl为排出的培养基)。300g离心5分钟，检查排出的体积并且用缓冲液A(3x体积)洗涤一次，300g5分钟。在缓冲液A中重悬，使得25μl的悬浮液将含有1μl的排出的蛋白G琼脂糖。(这对将蛋白G琼脂糖以通常需要的量等分到管中是有用的)。
·添加25μl/孔的1:100稀释的患者血清(稀释在缓冲液A中)。
·添加25μl/孔的蛋白G琼脂糖悬浮液。
·在室温下将板在旋转混合器上孵育1小时。
·稀释Luc抗原以使得将106(5*105)光度单位(LU)添加到50μl的缓冲液A中。添加50μl/孔的Luc抗原稀释液。
·在室温下将板在旋转混合器上孵育1小时。
·在真空歧管上洗涤板。每个孔用200μl的缓冲液A洗涤5次，然后用200μl的PBS洗涤两次。使用一叠纸巾或者过滤纸吸干板，以确保去除板的顶部和底部的水分。
·使用高斯构建体，添加10μl/孔的高斯底物并且震动2秒。根据仪器手册中的说明，立刻在5秒内读取发光值。使用萤火虫构建体，添加20μl/孔的荧光素酶底物并且震动2秒。根据仪器手册中的说明，立刻在5秒钟内读取发光值。
表3：在其N端具有高斯荧光素酶的IL-20。使用p高斯1(Molecular Pathology，University of Tartu，Estonia)哺乳动物表达载体将不具有信号序列(25-176aa)的全长IL-20克隆到在IL-20的N端具有高斯荧光素酶基因的融合物中(到EcoRI和NotI位点中)。在转染成HEK293细胞后，将细胞培养上清液用作基于荧光素酶的免疫沉淀测定中的抗原。
在测定中使用了一共来自30个患者的血清，其由APS1-1至APS1-30的代码表示。如图2中示出的，来自患者APS1-9的血清显示出抗IL-20抗体的最高滴度。因此，患者APS1-9被用作用于克隆候选抗IL-20抗体的记忆B细胞的来源。如在国际申请WO 2013/098419和WO2013/098420中描述的那样进行记忆B细胞分离、培养和抗体分离，不同之处在于，分离的和分析的抗体的特异性是针对如上文和下文中限定的IL-20而不是IL-17和IL-22，其特别用于所提及的国际申请中；参见其中的实施例部分，特别是WO 2013/098419的第117到120页的实施例1和实施例2以及第168-171页的实施例17，以及WO 2013/098420的第27到31页的实施例1至4，将这些参考文献的公开内容均通过引用合并到本申请中。
实施例2：候选抗IL-20抗体的EC50ELISA测定
如在国际申请WO 2013/098419中描述的，进行本发明的人抗体的分子克隆和随后的抗体生产和纯化，参见该国际申请的实施例部分，特别是其中第117-120页的实施例1至实施例3，将其公开内容通过引用合并到本文中。本发明的示例性抗IL-20抗体与具有高斯荧光素酶(g1IL-20和g2IL-20)的人IL-20的融合蛋白的EC50结合通过Gluc夹心ELSIA来确定。用抗Gluc Ab(1μg/ml)包被板，结合Gluc抗原并且结合MAB的连续稀释液持续2小时。随后洗涤该板，并且用抗人HRP轭合的二级抗体检测MAB的结合(Jackson ImmunoResearch，Europe Ltd.，Cambridgeshire，UK)。使用Prism4 GraphPad软件在通过标绘浓度的log(对数)对OD 450nm测量值获得的S 形剂量-应答曲线(变化的斜率，4个参数)上计算引起与各抗原的最大结合的一半的MAB的浓度(EC50，ng/ml)，关于结果参见图3和下面的表4。
表4：MAB结合至g1IL-20和g2IL-20的EC50值的汇总。MAB 2A11、6E11、6H2、7D1和20A10确实结合至g1IL-20和g2IL-20。MAB 7D1仅在非常高的浓度时结合于g1IL-20，表明了EC50结合高于5μg/ml。
实施例3：人源化抗IL-20单克隆抗体中和重组IL-20和IL-20受体介导的STAT3激活
对所研究的细胞因子应答的细胞系执行中和测定。结合至受体的配体通常激活对应的信号通路、使转录因子易位至细胞核，并且上调应答者基因(responder gene)转录、翻译以及(如果适用)产品分泌。使用的细胞因子浓度选自剂量-应答曲线的线性部分的开始处，以使测定的灵敏度最大化。为了测试抗体的中和能力，用连续稀释的血清、上清液或者纯化的抗体样品预孵育最佳浓度的靶细胞因子。结果表达为抗体的滴度或浓度，其示出了在阳性对照和阴性对照之间的中间值。
在第一组实验中，使人源化抗IL-20单克隆抗体经受磷酸STAT3测定，用于评估它们在瞬时表达I型和II型IL-20受体的HEK 293T MSR细胞中对重组IL-20介导的STAT3激活的中和活性(图4)。
磷酸STAT3测定
将2000个HEK 293T MSR细胞(Cat.No.R79507,Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)接种到96孔组织培养板中(Corning Inc.,Corning,NY,USA)。第二天，用IL20RA-Myc-DDK和IL20RB-Myc-DDK(I型IL-20受体；Cat.No.RC212546和RC213197，OriGene，Rockville，MD，USA)或者IL22RA(Cat.No.SC322566，OriGene)和IL20RB-Myc-DDK表达质粒(II型IL-20受体)共转染细胞。转染之后的第二天，将重组IL-20与抗IL-20mAb或对照IgG混合，并且在37℃预孵育1小时。在预孵育之后，混合物用于在37℃下刺激瞬时表达IL-20受体的HEK 293TMSR细胞40分钟。刺激之后，用补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的CelLyticTM M裂解缓冲液(Cat.No.C2978、P5726、P0044、P8340、SIGMA-ALDRICH、St.Louis、MO、USA)来裂解细胞，并且在台式离心机中以13,000RPM、4℃下清除所收集的裂解产物。裂解产物经受还原性(reducing)SDS-PAGE并且印记(blot)到硝化纤维素膜上。在室温下用含有0.25％的牛明胶、150mM的NaCl、5mM的EDTA、50mM的Tris/HCl(pH 7.5)、0.05％的Triton X-100的缓冲液封闭膜1小时，随后用针对磷酸化STAT3的兔单克隆抗体(Tyr705，在封闭缓冲液中1:2000稀释，Cat.No.9145，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)或α微管蛋白(1:2500稀释，Cat.No.2125，Cell Signaling Technology)在4℃下孵育过夜。第二天，用封闭缓冲液洗涤印记三次，随后用针对兔IgG的辣根过氧化物酶连接的二级抗体(在封闭缓冲液中以1:20000稀释，Cat.No.111-035-144，Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，USA)孵育。在三次额外的洗涤步骤之后，添加ECL底物(Cat.No.34087，Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL，USA)并且通过射线自显迹法来可视化反应条带。通过在恢复蛋白质印迹剥离缓冲液(Restore Western Blot Stripping Buffer)中孵育来移除结合的抗体(Cat.No.21059，Thermo Fisher Scientific)，并且使用兔单克隆抗STAT3血清来显现总的STAT3水平(1:1000稀释，Cat.No.12640，Cell Signaling Technology)。用小鼠单克隆抗DDK血清(1:1000稀释，Cat.No.TA50011，OriGene)和用针对IL-20RA和IL-22RA的兔多克隆血清(分别以1:500和1:1000稀释，Cat.No.06-1073和06-1077，Millipore，Billerica，MA，USA)来显现IL-20受体亚基的表达。
表5：在中和测定中使用的重组蛋白的列表(白介素)
作为对照，rhIL-20和rmIL-20在瞬时表达I型和II型的IL-20受体的HEK 293T MSR细胞中诱导STAT3的剂量依赖性磷酸化作用。总共的和磷酸化的STAT3以及IL-20RB-Myc-DDK水平的检测(图4A)。
如图4B中示出的，抗体20A10和7D1以及2A11是最有效的中和抗体。然而，这部分地与从实施例2中获得的结果和图3中示出的结果可预期的结果相反，其中，例如抗体6E11显示出比抗体7D1更高的结合亲和性，并且抗体2A11基本上进行的比抗体7D1更好。
接下来，在pSTAT3蛋白质印迹测定中进行针对rmIL-20的20A10的滴定。瞬时表达I型的IL-20受体的HEK 293T MSR细胞保持未处理，或者如(图6A)所示的，在不存在抗体(-)或存在示例性抗体20A10(+)的情况下用25ng/ml的rmIL-20刺激。细胞裂解产物经受SDS-PAGE，并且pSTAT3水平在蛋白质印迹中显现。总的STAT3水平作为加载对照。通过绘制剂量反应曲线并且检查IL-20抗体20A10对逆转IL-20活性的滴定，计算出1,867ng/ml的IC 50，其支持了针对rmIL-20的MAb 20A10结合至I型的IL-20受体的高度中和活性(图6B)。
实施例4：人源化抗IL-20单克隆抗体中和KZ136-NLuc报道基因的rhIL-20和IL-20受体介导的诱导
鉴于上文中从实施例2中获得的和图3中示出的候选抗IL-20抗体的EC50ELISA测定的结果与实施例3中获得的和图4B中示出的磷酸STAT3测定的结果的不一致性，并且为了验证候选抗IL-20抗体7D1、20A10和2A11在中和IL-20受体的IL-20介导的诱导中的有效性，建立了KZ136-Nluc报道基因中和测定法。
KZ136-Nluc报道基因测定
KZ136-Nluc报道基因构建体的生成
如由Poulsen及其同事最初描述的KZ136-Nluc报道基因构建体(Poulsen等人，Signal Transduction via the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway Inducedby Binding of Coagulation Factor VIIa to Tissue Factor，JBC，1998)编码可诱导的萤火虫荧光素酶，其之前是c-fos启动子的片段(nucleotides 649–747，GenBankTMaccession number K00650)。紧接着上游，该构建体的特征为c-fos、p21WAF1、β-酪蛋白以及Fcg RI基因的四个STAT结合元件以及血清应答元件。原始的KZ136构建体最初用于生成稳定的细胞系。本文描述的KZ136-NLuc报道基因编码明显更亮的纳米荧光素酶，并且适合于瞬时共转染实验。含有侧翼是NheI和XhoI限制位点的KZ136启动子序列的构建体经由基因合成生成。使用NheI和XhoI双重限制来切割KZ136启动子序列，随后连接到用相同的限制酶消化的纳米荧光素酶-编码的Pnl2.1靶载体(Cat.No.N1061，Promega)中(参见图5A中的构建体的图表)。
KZ136-NLuc报道基因中和测定
将10,000个HEK 293T MSR细胞接种到白色半区域96孔组织培养板中(Cat.No.3688，Corning Inc.)。第二天，使用Fugene HD(Cat.No.E2311，Promega，Madison，WI，USA)将细胞与20ng的KZ136-纳米荧光素酶报道基因以及80ng的IL-20受体构建体共转染。转染之后的第二天，用含有具有或不具有已经在37℃下预孵育1小时的抗IL-20mAb或对照人IgG(huIgG) 的120ng/ml的重组人(rh)IL-20(图5C、图5D)或200ng/ml的重组小鼠(rm)IL-20(图5E)的混合物的培养基刺激细胞24小时。在24小时的刺激之后，根据制造商的说明书(Cat.No.N1130，Promega)进行了荧光素酶测定。
作为对照，rhIL-20和rmIL-20诱导在用I型的IL-20受体和KZ136-NLuc瞬时转染的HEK 293T MSR细胞中的KZ136-NLuc报道基因构建体(图5B)。通过KZ136-NLuc报道基因测定，使用rhIL-20(图5C、图5D)或rmIL-20(图5E)进行了示例性人源化IL-20mAb 20A10、7D1和2A11的IC50分析。在图5F中总结了该结果，证明了20A10的IL-20中和能力。如在磷酸STAT3测定中已经看到的(图4B)，与具有较高效率的抗体7D1和2A11相比，针对rhIL-20结合至I型IL-20受体，抗体20A10显示出了最高的中和能力(图5F左栏)。
实施例5：在化学发光细胞结合测定中，人源化抗IL-20单克隆抗体中和IL-20与IL-20受体的结合
由于LIPS测定不能预测候选抗体的拮抗活性(即中和活性)，所以根据本发明已经开发了用于评估感兴趣的配体与表达一种或多种相关受体的细胞的结合的新的测定法，其用于确定针对配体的候选抗体是否阻止其结合至细胞上的一种或多种相应受体的能力。
如图7A中示出的，根据本发明的新方法，感兴趣的配体被标记并且被提供作为包括报道基因的融合蛋白，即诸如高斯荧光素酶的荧光素酶融合蛋白。配体的细胞结合是通过细胞相关联的报道基因(即荧光素酶活性)测量的。这种测定允许评估针对配体的抗体是否阻止其结合至细胞上的相应受体的能力(图7G和图7H)。
表6：在中和测定中使用的重组蛋白的列表(所有蛋白)
首先，已经分离了人源化抗IFN-α单克隆抗体，并且在发光细胞结合测定(LCBA)中证明适合于人IFN与高斯荧光素酶的受体结合和中和融合蛋白。对于示例性的抗IFN-α抗体和IFNA亚型以及分子的详细描述，参见申请人的共同待审的国际申请WO2015/001013，将其公开内容通过引用合并到本文中，特别是实施例1至实施例9、表1和图1公开了IgG1、κ、IFNA的可变区和恒定区(VH、VL、CH、CL)区的核苷酸和氨基酸序列，例如除了IFNA亚型之外识别抗体5D1、13B11、19D11、25C3、31B4以及抗体26B9和8H1的IFNA2、-4和-14有效地识别了IFNW(干扰素ω)以及它们的包括IFNA亚型分子源的功能特征。对于用于克隆高斯荧光素酶IFN融合和高斯荧光素酶IL-22融合构建体的引物序列，参见申请人在2013年7月4日公开的国际申请WO 2013/098419，该公开内容通过引用合并到本文中。
一种或多种干扰素-高斯荧光素酶
将30,000个HEK 293T MSR细胞接种到白色半区域96孔组织培养板(Cat.No.3688,Corning Inc.)中。第二天，将瞬时表达人IFN高斯荧光素酶融合蛋白的HEK 293T细胞的上清液与抗IFN mAb、对照IgG或过量浓度的未标记的重组IFNA2混合，并且在37℃预孵育1小时。在预孵育之后，混合物用于在37℃下刺激HEK 293T MSR细胞40分钟。结合后，用PBS洗涤细胞三次，并且根据制造商的说明书，使用高斯闪光测定试剂盒(Cat.No.16159,ThermoFisher Scientific)进行了高斯荧光素酶测定。
图7G中示出的该实验的结果证明了IFNA5-高斯荧光素酶融合蛋白(g1IFNA5)与HEK 293T MSR细胞的结合由未标记的重组人(rh)IFNA2(3μg/ml)和示例性的人源化单克隆IFN抗体19D11(1.7μg/ml)抑制。此外，g1IFNA2、A4、A5、A6、A7、A8、A10、A14、A16、A17和A21融合蛋白与HEK 293T MSR细胞的结合由示例性的人源化单克隆IFN抗体19D11抑制。相反，g1IFNB和W的结合不受19D11影响并且所有g1IFN的结合不受对照人抗体(huIgG)影响(图7H)。抗体浓度：5μg/ml。
其次，已经分离了人源IL-22单克隆抗体，并且证明在发光细胞结合测定(LCBA)中适合于人IL-22与高斯荧光素酶的受体结合和中和融合蛋白。对于示例性的抗IL-22抗体和分子的详细描述，参见申请人的国际申请WO 2013/098419，该公开内容通过引用合并到本文中。
IL-22高斯荧光素酶
根据制造商的说明书(Cat.No.15040-066，Invitrogen)，用Versene分离COLO 205结肠直肠癌细胞并且用PBS洗涤两次。将8x105个细胞转移到V型底96孔板中(Cat.No.24957，Thermo Fisher Scientific)，该板已经用每个孔200μl的COLO 205完全培养基(RPMI 1640GlutaMAX，10％的胎牛血清，分别为Cat.No.61870-044和10109155，Invitrogen)封闭了1小时。将瞬时表达人IL-20高斯荧光素酶融合蛋白的HEK 293T细胞的上清液与抗IL-22mAb、对照IgG或过量浓度的未标记的重组IL-22混合，并且在37℃下预孵育1小时。在预孵育之后，混合物用于在37℃下刺激V型底96孔板中的COLO205细胞1小时。结合后，用PBS洗涤细胞三次，然后根据制造商的说明书(Cat.No.16159,Thermo FisherScientific)使用高斯闪光测定试剂盒进行高斯荧光素酶测定。在添加荧光素酶底物之前，裂解细胞或不裂解细胞。
人IL-22高斯荧光素酶融合蛋白特异性地结合至COLO 205细胞。如所示的，在不存在抑制剂(-)或存在竞争性抑制剂的情况下，用表达IL-22高斯荧光素酶融合蛋白(g2IL-22)的HEK 293T细胞的上清液孵育细胞。在图14A中示出的该实验的结果证明了g2IL-22与COLO 205细胞的结合由未标记的rhIL-22抑制，而不是由不相关的rhIFNA2抑制。如所示的，在不存在抑制剂或存在未标记的rhIL-22或rhIFNA2(每个1μg/ml)的情况下，用含有HEK293T细胞的上清液的g2IL-22孵育COLO 205细胞。在记录光输出之前，裂解细胞或者不裂解细胞。图14B证明了g2IL-22与COLO 205细胞的结合是通过示例性的人源化IL-22单克隆抗体30G1以剂量依赖方式抑制的。结合不受对照人抗体(huIgG)影响。
第三，由于LIPS测定已经不能预测候选抗体的拮抗活性(即中和活性)，所以根据本发明已经开发了一种用于评估感兴趣的配体与表达一种或多种相关受体的细胞的结合的新的测定法，其用于确定针对配体的候选抗体是否阻止其结合至细胞上的一种或多种相应受体的能力。
由于该原因，首先采用了实施例3中描述的磷酸STAT3测定，以便研究一种或两种受体(即I型和II型的IL-20受体)以及用报道基因标记的配体(即IL-20高斯荧光素酶融合蛋白)在测定中是否是生物活性的。如图7C和图7D中示出的，IL-20高斯荧光素酶融合蛋白(g1IL-20)是功能活性的。用连续稀释的g1IL-20上清液或用对照培养基(NC)孵育细胞。在蛋白质印迹中检测总的和磷酸化的STAT3、IL-20RB-Myc-DDK、IL-20RA-Myc-DDK和IL-22RA(RA亚基)(图7A)。作为对照，示出了IL-20融合蛋白特异性地结合至表达IL-20受体I型的两种亚基的HEK 293T MSR细胞(图7D)。结合由未标记的rhIL-20(3μg/ml)消除。因此，含有IL-20高斯荧光素酶融合蛋白的HEK 293T的上清液特异性地激活了瞬时表达I型和II型的IL-20受体的HEK 293T MSR细胞中的STAT3。
因此，配体和配体结合域的结合特性应该基本上类似于体内的结合特性，由于该原因，谨慎地预期用本发明的测定法来识别的和获得的活化剂和拮抗剂在体内也是生物活性的。
作为下一步，候选抗体经受用于评估它们中和活性的化学发光细胞结合测定。
化学发光细胞结合测定
对于IL-20化学发光细胞结合测定，将10,000个HEK 293T MSR细胞接种到白色半区域96孔组织培养板(Cat.No.3688,Corning Inc.)中。第二天，用IL20RA-Myc-DDK和IL20RB-Myc-DDK(I型IL-20受体；Cat.No.RC212546和RC213197，OriGene，Rockville，MD，USA)或者IL22RA(Cat.No.SC322566，OriGene)和IL20RB-Myc-DDK表达质粒(II型IL-20受体)共转染细胞。转染之后的第二天，将瞬时表达人IL-20高斯荧光素酶融合蛋白的HEK293T细胞的上清液与抗IL-20mAb、对照IgG或过量浓度的未标记重组IL-20混合，并且在37℃下预孵育1小时。预孵育之后，混合物用于在37℃下刺激瞬时表达IL-20受体的HEK 293TMSR细胞30分钟。结合后，用PBS洗涤细胞三次，然后根据制造商的说明书(Cat.No.16159，Thermo Fisher Scientific)使用高斯闪光测定试剂盒进行了高斯荧光素酶测定。
如图7E和图7F中示出的，在细胞结合测定中观察到的效果密切地反映了实施例3和实施例4以及图4至图6中针对候选抗体观察到的中和活性的水平。作为对照，g1IL-20与表达I型的IL-20受体的HEK 293T MSR细胞的结合是通过rhIL-20、rmIL-20和示例性的人源IL-20单克隆抗体20A10以剂量依赖性方式抑制的(图7E)。结合不受不相关的rhIL-32γ和对照人IgG(huIgG)的影响。示例性的抗IL-20抗体2A11、20A10和7D1中和了g1IL-20与瞬时表达I型和II型的IL-20受体的HEK 293T MSR细胞的结合。未标记的rhIL-20(1μg/ml)用作阳性对照。抗体浓度：5μg/ml(图7F)。与磷酸STAT3测定(实施例3)和KZ136-Nluc报道基因中和测定(实施例4)的结果一致，抗IL-20抗体20A10示出了最高的抑制性(即中和活性)，而MAb2A11和7D1仅示出了g1IL-20结合至两种I型和II型的IL-20受体的轻微较弱的中和能力。相比之下，抗IL-20抗体6E11显示了g1IL-20结合至I型的中度中和能力，但缺乏针对II型的IL-20受体的中和能力。对于MAb 6H2可以观察到没有或者大大降低的中和能力。
因此，本发明的新的细胞配体受体结合测定法提供了用于预测候选化合物特别是抗配体抗体的生物活性(即中和活性)的可靠的方法，该方法显著简化了识别和获得治疗上有用的抗体，否则首先已经不能进一步追踪或识别该抗体。
事实上，在化学发光细胞结合测定中人源化抗IL-20单克隆抗体的其他IC50(半数最低(50％)抑制浓度)的分析证明了示例性IL-20抗体20A10、7D1和2A11对IL-20的有效的中和能力(图8)。为了该目的，如所示的(图8A：20A10、图8B：7D1和图8C：2A11)，在存在人源IL-20单克隆抗体的情况下，用g1IL-2 0上清液孵育瞬时表达I型或II型的IL-20受体的HEK293T MSR细胞。图8D概述了示例性抗体20A10、7D1和2A11的IC50值，其支持由磷酸STAT3测定(实施例3)和由KZ136-NLuc报道基因中和测定(实施例4)获得的数据，抗IL-20抗体20A10示出了最高的中和活性。MAb 2A11仅示出了与20A10一样的轻微较弱的中和能力。相比之下，MAb 7D1似乎需要最高的IC50来抑制g1IL-20结合至I型或II型的IL-20受体。
实施例6：与人-小鼠嵌合构建体的交叉竞争以及抗IL-20抗体20A10、2A11、7D1和6E11的交叉反应
为了确定不同结合位点的数目，检查了抗IL-20MAB与不同抗原结合位点的差异结合。为了该目的，用人(hMAB)或小鼠(hmMAB)Fc表达MAB，并且通过Gluc夹心ELISA进行交叉竞争实验。GLuc-Il20由预包被的兔抗GLuc抗体捕获。在大量人MAB存在的情况下，通过针对初级抗体的Fc部分的HRP轭合的二级抗体来检测hmMAB的结合(参见图9A中实验设置的方案)。
方法：
用在PBS中以1/250稀释的兔抗GLuc抗体(NEB，E8023S)30μl/孔在4℃下对96孔微孔板(Costar,USA)包被过夜。用PBS-T洗涤板，并且在室温下用含有2％的BSA(Sigma，Buchs，Switzerland)的PBS封闭1小时。以2x106LU/孔的最终浓度添加30μl的GLuc-IL-20，并且在室温下孵育2小时。将嵌合抗体与人竞争性抗体以在30μl的PBS中0.5μg/ml对3μg/ml的最终浓度预混合，并且被添加到板中。在室温下孵育2小时后，用PBS-T洗涤板，并且使用辣根过氧化物酶轭合的羊抗小鼠IgG Fcγ特异性抗体(Jackson Immuno Research，在0.5％的BSA-PBS中1:500)来测定人-小鼠嵌合抗体的结合，随后使用TMB底物溶液(Sigma，Buchs，Switzerland)测量HRP活性。
如从下文图9B至图9F和表7中可以看出的，嵌合抗IL-20抗体20A10(hm)、2A11(hm)和6E11(hm)仅与它们的同源人对应物竞争，指示了每种人源化抗体IL-20抗体20A10、2A11和6E11识别IL-20的不同结合位点。相比之下，嵌合抗IL-20抗体7D1(hm)不仅与其人对应物竞争，还与人源IL-20抗体6H2竞争，指示了这些抗体的可能的部分重叠的表位。
然而，考虑到在实施例3-5和图4B、图7F和图8D中示出的功能测定，抗体7D1似乎有效地中和了IL-20活性。因此，假设抗体7D1和6H2的表位是不相同的，但是是重叠的，或者由于空间位阻抗体干扰了与IL-20的结合。
考虑到根据本发明进行的实验，证明尤其在结合亲和性/特异性和中和活性之间缺乏关系，显然本发明的新的细胞配体结合测定在选择和提供用于治疗用途的抗IL-20抗体时是有用的和必要的。然而，似乎没有有效地中和IL-20活性的本发明的IL-20抗体也是有用的，例如在诊断应用中。
表7：本发明的示例性抗体的交叉竞争实验的结果。在添加具有小鼠Fc的MAB(hmMAB)之前，添加大量的人MAB(hMAB)到用相应的抗原包被的板。
另外地，研究了本发明的示例性人源化抗体IL-20单克隆抗体6E11、2A11和20A10与小鼠以及人IL-20的结合，以通过GLuc夹心ELISA确定和比较针对小鼠和人IL-20表位的交叉反应性(参见图10A中的实验设置的方案)。
方法：
用在PBS中的以1/250稀释的兔抗GLuc抗体(NEB，E8023S)30μl/孔在4℃下包被96孔微孔板(Costar,USA)过夜。用PBS-T洗涤板，并且在室温下用含有2％的BSA(Sigma，Buchs，Switzerland的)PBS封闭1小时。以2x106LU/孔的最终浓度添加30μl的GLuc-IL-20，并且在室温下孵育2小时。将竞争抗原重组人IL-20和重组小鼠IL-20以从10μg/ml到4.6ng/ml范围的连续稀释滴定至待测试的抗体(1μg/ml的固定浓度)。将每孔30μl的混合物在室温下在孔中孵育1.5小时。用PBS-T洗涤板，并且使用辣根过氧化物酶轭合的羊抗人IgG Fcγ特异性抗体(Jackson ImmunoResearch，Europe Ltd.，Cambridgeshire，UK)来确定在存在竞争物的情况下人IgG与感兴趣的抗原的结合，随后使用TMB底物溶液(TMB，Sigma，Buchs，Switzerland)测量HRP活性。
如图10B至图10D中示出的，人IL-20可以抑制所有测试的抗IL-20抗体与g2IL-20的结合。鼠IL-20可以抑制除了6E11之外的所有测试的抗IL-20抗体与g2IL-20的结合。因此，示例性的抗IL-20抗体2A11和20A10示出了物种交叉反应性，而MAb 6E11仅识别hIL-20。然而，考虑到实施例3至实施例5中和图4B中示出的功能测定，抗体2A11在中和mIL-20方面不如MAb 20A10有效。2A11是强的结合剂，但显然地识别了IL-20的一个区，该区不涉及IL-20和其受体之间的相互作用。2A11和7D1较弱地中和rhIL-20，但示出了对GLuc IL-20更好的中和。该结果进一步证明了尤其是结合亲和性/特异性和结合活性之间的关系的缺乏。显然，本发明的新的细胞配体结合测定在选择和提供用于治疗用途的抗IL-20抗体方面是有用的和必要的。然而，似乎没有有效地中和IL-20活性的本发明的IL-20抗体也是有用的，例如在诊断应用中。
实施例7：受试者抗体的验证
考虑到它们在动物疾病模型中人IL-20的中和活性，测试了由本发明提供的抗体。当进行这种实验时，必须保证人IL-20在小鼠中诱导患病的表形，并且保证在本发明的所测试的IL-20抗体和鼠IL-20同源物之间不发生交叉反应。因为在现有技术中不能获得适合的IL-20的模型系统，因此本实施例描述和提供了这样的一种系统，以测试不与小鼠IL-20交叉反应的IL-20中和抗体。
耳朵炎症测定
通过在既定的第1天、第3天、第6天和第8天隔天地使用30号针头向8周龄C57BL/6J(WT；来自Charles River)小鼠的每只耳朵中皮内注射人细胞因子IL-20或PBS对照(20μl/耳朵、1000ng/耳朵、2000ng/小鼠/天)，来诱发耳朵炎症表型。关于本发明的示例性抗IL-202A11、7D1和20A10抗体减少所诱发的耳朵炎症表型的中和潜力，在这些动物上测试使用这些抗体的治疗。在第0天和第6天对动物施用两次2A11、7D1和20A10或对照人IgG的IP注射[200μg]。在第10天处死小鼠。
为了测试本发明的抗体的潜在的治疗效果，通过在IL-20注射之前每日测量在IL-20给药期间利用Mitutoyo数字测微计获取动物的耳朵厚度测量值。此外，在治疗期间已经监测了体重，然而，由于应用的治疗，未在任何动物组中观察到显著的体重变化。另外，在处死动物之后，进行耳朵的H&E(苏木精(hematoxylin)和伊红；参见Harris，H.F.，J.Appl.Microscopy III(1900)，777-781和Mallory，F.B.:Pathologicaltechnique.Philadelphia，Saunders，(1938))组织学染色。这些实验表明，在2A11、7D1和20A10中和抗体存在的情况下，通过皮内注射人IL-20对耳部肿胀的诱导降低；参见图11。这从第6天开始到不同程度的统计显著性是显著的。在小鼠模型中示例性的抗IL-20抗体2A11、7D1和20A10能够中和所注射的IL-20。因此，本文呈现的数据表明本发明的抗IL-20抗体在细胞因子诱导的耳炎症试验中针对IL-20是有效的，证明了本发明的IL-20特异性结合分子的治疗价值。
实施例8：使用表面等离子体共振(SPR)技术的抗体亲和性测量
对于本发明的抗体的亲和性测定，根据制造商的说明书，使用Biacore T200 SPR仪器(GE Healthcare(医疗保健)公司)进行表面等离子体共振SPR测量。将CM5芯片与抗huIgG Fc小鼠IgG1mAb(GE Healthcare(医疗保健)公司)偶联，并且捕获抗IL-20抗体至饱和。作为分析物，将人和小鼠IL20以1.5nm至100nm的浓度在重复运行中应用。通过仪器分析软件使用1:1结合拟合确定升率和降率以及所得的KD(图12)。
实施例9：使用受试者抗体的跨膜版本作为配体结合域的LCBA测定法
在图15和图16中描述了对受试者抗体26B9的血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)-跨膜(TM)介导的表面表达的构建体、序列信息以及参考；更多细节还参见上文中的附图阐明。
配体-结合至跨膜抗体
将30,000个HEK 293T MSR细胞接种到白色半区域96孔组织培养板(Cat.No.3688,Corning Inc.)中。在接种期间，用使用Fugene HD(Cat.No.E2311，Promega，Madison，WI，USA)编码抗IFN mAb 26B9(26B9-TM)(SEQ ID:67,Ho等人，Proc.Natl.Acad.Sci.103(2006)，637-9642；Zhou等人，Mabs 2(2010)，08–518)的跨膜版本的100ng的cDNA转染细胞(图17、图18)。在基于细胞的ELISA中转染后48小时，分析表面抗体(26B9-TM)表达(图17A)。转染后48小时，瞬时表达人IFNW-高斯荧光素酶融合蛋白(g1 IFNW)的HEK 293T细胞的上清液用于在37℃下刺激之前转染的HEK 293T MSR细胞40分钟。可替换地，将g1IFNW上清液与抗IFN mAb或对照IgG混合，并且在37℃下预孵育1小时。在预孵育之后，混合物用于在37℃下刺激瞬时表达26B9-TM的HEK 293T MSR细胞40分钟。结合后，用PBS洗涤细胞三次，并且根据制造商的说明书(Cat.No.16159,Thermo Fisher Scientific)使用高斯闪光测定开展高斯荧光素酶测定，示出了g1IFNW特异性地结合至表达26B9-TM的细胞(图17B)。单体Fv的PDGFR介导的表面表达和PDGFR域的其他参考描述在Ho等人的Proc.Natl.Acad.Sci.103(2006)，9637-9642中。完整的IgG的PDGFR介导的表面表达描述在Zhou等人Mabs 2(2010)，508–518中。
抗IFNW抗体的交叉竞争测定
上文的实验设置也已经用于测试本发明的示例性抗体26B9、31B4和8H1之间的交叉竞争(参见图18)。用编码26B9-TM的cDNA逆转染HEK 293T MSR细胞。在转染之后的48小时，将g1IFNW与可溶性抗IFNW抗体26B9、31B4、8H1或对照IgG(huIgG)混合并预孵育1小时。孵育之后，将混合物添加至已转染的细胞中，并且在化学发光细胞结合测定中分析结合。如图18中示出的，g1IFNW与26B9-TM的结合由可溶性26B9和克隆地相关的31B4抗体以剂量依赖性方式竞争。相比之下，结合不受对照IgG 或示例性的抗IFNW抗体8H1的影响。这些结果指示了示例性抗体26B9和31B4共享了相似的表位，而8H1似乎结合至不同的表位。
实施例10：抗IL-20单克隆抗体的抗原绘图
MAB与它们的相应的抗原的结合区可以通过例如PepStarTM分析来进行绘图。因此，将重叠的18聚体肽(14个氨基酸重叠)设计成分别覆盖了包括所有已知变体的人和鼠IL-20。肽(图13B的人IL-21和图13C的鼠Il-20)和全长抗原(作为阳性对照；图13A)被点涂到微阵列上，并且用初级抗体孵育肽微阵列，随后用针对初级抗体的Fc部分的荧光标记的二级抗体孵育。为了避免由空间位阻引起的假阳性，将优化的亲水接头部分插入在玻璃表面和抗原衍生肽序列之间。
此外，合成了包括人IL-20的序列101-PDHYTLRKISSLANSFL-117(SEQ ID No:72)的一组17个肽，用于由丙氨酸扫描进行的表位表征。在此，每个单独的氨基酸由丙氨酸独立地取代，用以评估其对抗体结合的贡献。
将样品以1μg/ml的浓度印到微阵列载玻片上。随后用本发明的抗体在30℃下在封闭缓冲液中孵育微阵列60分钟。为了检测，使用了在封闭缓冲液中稀释的浓度为1μg/ml的Cy5-抗人IgG(JIR 209-175-082)二级抗体，并且在30℃下孵育60分钟。此外，具有荧光标记的二级抗体的孵育仅进行作为对照实验，用以检测潜在的假阳性信号。在每个步骤之前，用洗涤缓冲液洗涤微阵列。为了分析，在蛋白序列上绘制信号强度，以允许识别线性表位。
缓冲液和溶液
50mM的TBS-缓冲液，包括0.1％的Tween 20(吐温20)(JPT)，pH 7.2
3mM的SSC缓冲液(JPT)，pH 7.0
封闭缓冲液(Pierce International,Superblock TBS T20,order#(订单号)37536)
硬件和软件
肽微阵列(JPT Peptide Technologies GmbH，Berlin，Germany；batch#(批号)2611)
Axon Genepix扫描仪4200AL
斑点识别软件GenePix
对于在人和鼠IL-20的18聚体肽的肽阵列上的本发明的示例性的抗体20A10、2A11、6E11和7D1已经分别进行这种肽绘制。在图13中示出了该测定的结果。示例性的抗体20A10特异性地结合至IL-20的肽20(PDHYTLRKISSLANSFLT SEQ ID NO：69)(图13D)，然而其并没有结合至由氨基酸序列NYQTPDHYTLRKISSLAN(SEQ ID NO：71)组成的肽19。因此，抗体20A10的结合特异性不同于国际申请WO2010/000721中描述的抗IL-20抗体15D2和5B7的结合特异性，其结合至IL-20的肽19和肽20两者(在本申请中称为为抗体5B7的肽25和肽26，以及抗体15D2的肽86和肽87；参见WO2010/000721的图6A、图6B、图7A和图7B中)。
在交叉竞争测定中(图10C)，示例性的抗体2A11结合至鼠IL-20，但并未在微阵列上(图13A)，而本发明的示例性抗IL-20抗体20A10在两种情况下都结合至鼠和人IL-20(图10D和图13A)。如通过丙氨酸扫描示出的(图13G)，肽20的序列内的几个残基对于与示例性抗体20A10的相互作用是重要的，如果这些重要的氨基酸被取代，则它们的结合被消除或者至少严重地减少。
特定氨基酸对示例性抗体20A10的结合的重要性总结在15aa表位区的以下的结构转录中：101-PDHYTLRKISSLANSFLT-118，其中，对于通过示例性的抗体20A10结合来说重要的氨基酸以粗体、斜体和下划线指示，相互作用和不太重要的氨基酸通过下划线指示。相比之下，在用于WO2010/000721中描述的抗体5B7和15D2的末端缺失和丙氨酸扫描表位测绘建议12个氨基酸的较小的线性表位形成H103-N114，然而其中，仅发现三个氨基酸位置(H103、S111和N114)对于通过抗体5B7和15D2的结合是不变的和重要的；参见WO 2010/000721中实施例7和实施例8中以及图7和图8中的丙氨酸扫描数据。
另一有趣的观察是，虽然抗体20A10结合至全长人和鼠IL-20(图10D、图12C和在微阵列图13A的上下文中)，但其在阵列抗原绘制测定中不结合至源自小鼠IL-20的相应的肽，其在其氨基酸序列中仅在Y104H和T118I位置处与人IL-20 101-118肽不同，其中，后者对于20A10结合似乎是不必要的，也不是任何其他小鼠IL-20衍生的18聚体肽(图13C)。因此，抗体20A10可以识别人和小鼠IL-20的构象表位，其还可以通过人IL-20衍生的肽101-PDHYTLRKISSLANSFLT-118(SEQ ID NO：69)来形成或模仿，或其中，这种肽的氨基酸序列代表了这种构象表位的主要成分。因此，抗体20A10的大表位区和其对源自小鼠IL-20的肽的结合的缺失，使得这种肽对于IL-20是高度特异的，由于该原因，与其他细胞因子(例如IL-10和IL-10样细胞因子)的交叉反应是不太可能的。
序列表
<110> 因美诺克股份公司
<120> 人源化抗人IL20抗体和用于识别抗细胞因子抗体的测定法
<130> PN1651505PZC
<140> PCT/EP2015/065244
<141> 2015-07-03
<150> EP 14 175 585.0
<151> 2014-07-03
<150> EP 14 175 673.4
<151> 2014-07-03
<160> 72
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 375
<212> DNA
<213> 人类（智人）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(375)
<223> 20A10-VH 可变重链 (VH) 序列; 20A10: IgG4, κ
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(198)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(342)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR3
<400> 1
cag gtg cag ctg gtg caa tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
tca gtg aag gtc tcc tgc aag act tct gga ggc acc ttc agc acc tct 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Ser
20 25 30
act ctc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga cag ggt ctt gag tgg ctg 144
Thr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
gga gga atg atc cct atc ctt agt aga aca acg tac gcg cag aag ttt 192
Gly Gly Met Ile Pro Ile Leu Ser Arg Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
cag ggc aga ctc acg att acc gcg gac gaa ccc acg agc acg tcc tac 240
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Pro Thr Ser Thr Ser Tyr
65 70 75 80
atg gaa ctg agc agc ctg aaa tct gag gac acg gcc gtc tat tac tgt 288
Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg acc gag ggg gaa gtt tct gcc gcg cac aac tac tac tac gga atg 336
Ala Thr Glu Gly Glu Val Ser Ala Ala His Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 375
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 125
<212> PRT
<213> 人类
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Ser
20 25 30
Thr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Gly Met Ile Pro Ile Leu Ser Arg Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Pro Thr Ser Thr Ser Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Glu Gly Glu Val Ser Ala Ala His Asn Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 336
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(336)
<223> 20A10-VL 可变轻链 (VL) 序列; κ型
<220>
<221> V_区
<222> (70)..(117)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CR1
<220>
<221> V_区
<222> (163)..(183)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CR2
<220>
<221> V_区
<222> (280)..(306)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CR3
<400> 3
gat att gtg ctg act cag tct cca ctc tac ctg ccc gtc acc cct gga 48
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Tyr Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
gag ccg gcc tcc atc tcc tgc agg tct agt cag agc ctc ctg cat gga 96
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly
20 25 30
aat gga cac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tct 144
Asn Gly His Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
cca cag ctc ctg atc tat ttg ggt tct aat cgg gcc tcc ggg gtc cct 192
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gat ttt aca ctg aaa atc 240
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
agc aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac tgc atg caa act 288
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Thr
85 90 95
cta cat act gta ttc act ttc ggc cct ggg acc aga gtg gat atc aaa 336
Leu His Thr Val Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Val Asp Ile Lys
100 105 110
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人类
<400> 4
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Tyr Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly
20 25 30
Asn Gly His Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Thr
85 90 95
Leu His Thr Val Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Val Asp Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 981
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(981)
<223> 20A10-CH 恒定重链 (CH) 序列
<400> 5
gct tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gcg ccc tgc tcc agg 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
agc acc tcc gag agc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acg aag acc 240
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
tac acc tgc aac gta gat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
aga gtt gag tcc aaa tat ggt ccc cca tgc cca tca tgc cca gca cct 336
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
gag ttc ctg ggg gga cca tca gtc ttc ctg ttc ccc cca aaa ccc aag 384
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
gac act ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc acg tgc gtg gtg gtg 432
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
gac gtg agc cag gaa gac ccc gag gtc cag ttc aac tgg tac gtg gat 480
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag ttc 528
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac 576
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa ggc ctc 624
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
ccg tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga 672
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
gag cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cag gag gag atg acc aag 720
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tac ccc agc gac 768
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag 816
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc 864
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
agg cta acc gtg gac aag agc agg tgg cag gag ggg aat gtc ttc tca 912
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac aca cag aag agc 960
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
ctc tcc ctg tct ctg ggt aaa 981
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 6
<211> 327
<212> PRT
<213> 人类
<400> 6
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 7
<211> 321
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> 20A10-CL 恒定轻链 (CL) 序列
<400> 7
cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt 321
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人类
<400> 8
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 9
<211> 360
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<223> 2A11-VH 可变重链 (VH) 序列; 2A11: IgG1, λ
<220>
<221> V_区
<222> (88)..(102)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(192)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(327)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 9
cag gtg cat ctg gtt cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc 48
Gln Val His Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc aac aat ttt 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Asn Phe
20 25 30
ccc atg agt tgg gtg cga cag gcc cct gga cga ggg ctt gag tgg atg 144
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gca ggg atc atc cct gta ttt ggt tcg gca aac tat gca cag cag ttt 192
Ala Gly Ile Ile Pro Val Phe Gly Ser Ala Asn Tyr Ala Gln Gln Phe
50 55 60
cac ggc aga gtc acc att agc gcg gac ata tcc acg agc acg gtg tcc 240
His Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ser Thr Ser Thr Val Ser
65 70 75 80
atg gaa ctg aat gac ttg aaa tct gag gac acg ggc gtt tat tat tgt 288
Met Glu Leu Asn Asp Leu Lys Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg att agt gga gat gag gac aac tgg atc atg aac ttt tgg ggc cag 336
Ala Ile Ser Gly Asp Glu Asp Asn Trp Ile Met Asn Phe Trp Gly Gln
100 105 110
gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 360
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 120
<212> PRT
<213> 人类
<400> 10
Gln Val His Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Asn Asn Phe
20 25 30
Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Ala Gly Ile Ile Pro Val Phe Gly Ser Ala Asn Tyr Ala Gln Gln Phe
50 55 60
His Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Ile Ser Thr Ser Thr Val Ser
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Asp Leu Lys Ser Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Ser Gly Asp Glu Asp Asn Trp Ile Met Asn Phe Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 378
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(360)
<223> 2A11-VL 可变轻链 (VL) 序列; λ型
<220>
<221> V_region
<222> (67)..(108)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_region
<222> (154)..(174)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_region
<222> (271)..(306)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<400> 11
cag tct ttg ctg acg cag ccg ccc tca gtg tct ggg gcc cca ggg cag 48
Gln Ser Leu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
aga gtc acc atc tcc tgc act ggg agc agc tcc aac atc ggg gca ggt 96
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
tat gat gtg cac tgg tac cag caa gtt cca ggg aca gcc ccc aaa ctc 144
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
ctc atc tat gga aac aga aat cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc 192
Leu Ile Tyr Gly Asn Arg Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
tct ggc tcc aag tct ggc acg tca gcc tcc ctg gcc atc act ggg ctc 240
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
cag gct gag gat gag gct gat tat tac tgc cag tcc tat gac agc agc 288
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
ctg agt ggt cat gcg gtg ttc ggc gga ggg acc aag gtg acc gtc cta 336
Leu Ser Gly His Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
cgt cag ccc aag gct gcc ccc tcg gtcactctgt tcccgccc 378
Arg Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser
115 120
<210> 12
<211> 120
<212> PRT
<213> 人类
<400> 12
Gln Ser Leu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Gly Asn Arg Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser
85 90 95
Leu Ser Gly His Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
Arg Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser
115 120
<210> 13
<211> 990
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(990)
<223> 2A11-CH 恒定重链 (CH) 序列
<400> 13
gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 240
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
aga gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 336
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 384
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 432
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 528
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 576
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 624
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 672
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag 720
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 816
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 912
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
cag aag agc ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa 990
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 14
<211> 330
<212> PRT
<213> 人类
<400> 14
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 15
<211> 276
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(276)
<223> 2A11-CL 恒定轻链 (CL) 序列
<220>
<221> 混杂_特征
<222> (229)..(276)
<223> 非序列而是从数据库获得的
<400> 15
tcc tct gag gag ctt caa gcc aac aag gcc aca ctg gtg tgt ctc ata 48
Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile
1 5 10 15
agt gac ttc tac ccg gga gcc gtg aca gtg gcc tgg aag gca gat agc 96
Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser
20 25 30
agc ccc gtc aag gcg gga gtg gag acc acc aca ccc tcc aaa caa agc 144
Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser
35 40 45
aac aac aag tac gcg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct gag cag 192
Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln
50 55 60
tgg aag tcc cac aga agc tac agc tgc cag gtc acg cat gaa ggg agc 240
Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser
65 70 75 80
acc gtg gag aag aca gtg gcc cct aca gaa tgt tca 276
Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
85 90
<210> 16
<211> 92
<212> PRT
<213> 人类
<400> 16
Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile
1 5 10 15
Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser
20 25 30
Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser
35 40 45
Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln
50 55 60
Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser
65 70 75 80
Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
85 90
<210> 17
<211> 363
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(363)
<223> 7D1-VH 可变重链 (VH) 序列; 7D1: IgG1, λ
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(198)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(330)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 17
gaa gtg caa ctg gtg gcg tct ggg gga gac ttc ata cag cct ggc agg 48
Glu Val Gln Leu Val Ala Ser Gly Gly Asp Phe Ile Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc aag ttt gat gat tat 96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
gcc atg ttc tgg gtc cgg caa gtt cca ggg agg ggc ctg gag tgg gtc 144
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
tca ggg att agt tgg agt agt gat aag atg gcc tat gtg gac tct gtg 192
Ser Gly Ile Ser Trp Ser Ser Asp Lys Met Ala Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
aag ggc cgc ttt acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac acc ctc tat 240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
ttg caa atg aac aat ctg aga cct gac gac acg gcc ttc tac tac tgt 288
Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca aag ggc gga ttt agc agt gtc tgg aac tac ttt gac ttc tgg ggc 336
Ala Lys Gly Gly Phe Ser Ser Val Trp Asn Tyr Phe Asp Phe Trp Gly
100 105 110
cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 121
<212> PRT
<213> 人类
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Ala Ser Gly Gly Asp Phe Ile Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Lys Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Ser Ser Asp Lys Met Ala Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Phe Ser Ser Val Trp Asn Tyr Phe Asp Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 19
<211> 330
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(330)
<223> 7D1-VL 可变轻链 (VL) 序列; λ型
<220>
<221> V_区
<222> (67)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(171)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (268)..(297)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 19
cag tct gtt ctg act caa cca ccc tca gcg tct ggg acc ccc ggg cag 48
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
aca gtc atc atc tct tgt tct gga acc acc tcc aac atc ggc agt aat 96
Thr Val Ile Ile Ser Cys Ser Gly Thr Thr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
act gta agc tgg tac cgg caa ctc cca ggg gcg gcc ccc aaa ctc ctc 144
Thr Val Ser Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
atc ttt act tat aat cag cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc tct 192
Ile Phe Thr Tyr Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
ggc tcc aag tct ggc acc tct gcc tcc ctg gcc atc agt ggc ctc cag 240
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
tct gac gat gag gct gat tat tac tgt gcc gtg tgg gat gac gcc ctg 288
Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Asp Ala Leu
85 90 95
ggt ggt tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta 330
Gly Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 20
<211> 110
<212> PRT
<213> 人类
<400> 20
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ile Ile Ser Cys Ser Gly Thr Thr Ser Asn Ile Gly Ser Asn
20 25 30
Thr Val Ser Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Phe Thr Tyr Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Val Trp Asp Asp Ala Leu
85 90 95
Gly Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 21
<211> 990
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(990)
<223> 7D1-CH 恒定重链 (CH) 序列
<400> 21
gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 240
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
aga gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 336
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 384
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 432
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 528
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 576
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 624
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 672
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag 720
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 816
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 912
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
cag aag agc ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa 990
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 22
<211> 330
<212> PRT
<213> 人类
<400> 22
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 23
<211> 318
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(318)
<223> 7D1-CL 恒定轻链 (CL) 序列
<220>
<221> 混杂_特征
<222> (270)..(318)
<223> 非序列而是从数据库获得的
<400> 23
ggt cag ccc aag gct gcc ccc tcg gtc act ctg ttc ccg ccc tcc tct 48
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
gag gag ctt caa gcc aac aag gcc aca ctg gtg tgt ctc ata agt gac 96
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
ttc tac ccg gga gcc gtg aca gtg gcc tgg aag gca gat agc agc ccc 144
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
gtc aag gcg gga gtg gag acc acc aca ccc tcc aaa caa agc aac aac 192
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
aag tac gcg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct gag cag tgg aag 240
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
tcc cac aaa agc tac agc tgc cag gtc acg cat gaa ggg agc acc gtg 288
Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
gag aag aca gtg gcc cct aca gaa tgt tca 318
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 24
<211> 106
<212> PRT
<213> 人类
<400> 24
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 25
<211> 366
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(366)
<223> 6E11-VH 可变重链 (VH) 序列; 6E11: IgG1, κ
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(198)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(333)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 25
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gca gag gtg aag aag cct ggg tcc 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
tca gtg aag gtc tcc tgc aag gcc tct ggc ggc acc ttc cgc aac tat 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
gcg atc aac tgg gtg cgg cag gcc ccg aga caa gga ctt gag tgg atg 144
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gga agc ctc gtc cct atg ttt acc tca cca acg tac gca cag aag ttt 192
Gly Ser Leu Val Pro Met Phe Thr Ser Pro Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
cgg ggc aga gtc acg ata agc gcg gac gag tcc acg gcc aca tcc tcc 240
Arg Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser Thr Ala Thr Ser Ser
65 70 75 80
atg gaa ctg acc agc ctg aca tct gaa gac acg gcc gtc tac ttc tgt 288
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
tct gca gat ggc tac aag ggc ggc ctc ttt tac ggt atg aat gtc tgg 336
Ser Ala Asp Gly Tyr Lys Gly Gly Leu Phe Tyr Gly Met Asn Val Trp
100 105 110
ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tct tca 366
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 122
<212> PRT
<213> 人类
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Arg Asn Tyr
20 25 30
Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ser Leu Val Pro Met Phe Thr Ser Pro Thr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Glu Ser Thr Ala Thr Ser Ser
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ser Ala Asp Gly Tyr Lys Gly Gly Leu Phe Tyr Gly Met Asn Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 339
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<223> 6E11-VL 可变轻链 (VL) 序列; κ型
<220>
<221> V_区
<222> (70)..(120)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (166)..(186)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (283)..(309)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 27
gac atc gtg ttg acc cag tct cca gaa tcc ctg gct gtg tct ctg ggc 48
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gag agg gcc acc atc aac tgc aag tct agc cag agt gtt tta tac agc 96
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
tcc aac agt aag aac tac tta gct tgg ttc cag cag aaa cct gga cag 144
Ser Asn Ser Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
cct cct aaa ctt ctc att tat tgg gca tct acc cgg gaa tcc ggg gtc 192
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
cct gat cgc ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
atc acc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cac caa 288
Ile Thr Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
tat cat act cta cct cga acg ttc ggc cac ggg acc aag gtt gag atc 336
Tyr His Thr Leu Pro Arg Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 28
<211> 113
<212> PRT
<213> 人类
<400> 28
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Ser Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Thr Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr His Thr Leu Pro Arg Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 29
<211> 987
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(987)
<223> 6E11-CH 恒定重链 (CH) 序列
<220>
<221> 混杂_特征
<222> (100)..(987)
<223> 非序列而是从数据库获得的
<400> 29
gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 240
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
aaa gtt ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca 336
Lys Val Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa 384
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg 432
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac 480
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag 528
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
cag tac aac agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac 576
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa 624
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag 672
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg 720
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc 768
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac 816
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc 864
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc 912
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag 960
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 987
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 30
<211> 329
<212> PRT
<213> 人类
<400> 30
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 31
<211> 321
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> 6E11-CL 恒定轻链 (CL) 序列
<400> 31
cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt 321
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人类
<400> 32
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 33
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL20 特定 26bp, 两侧有EcoRI位点
<400> 33
tttggatcct actgaagaca ctcaatttgg gaagctg 37
<210> 34
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL20 特定 26bp, 两侧有 NotI 位点
<400> 34
tttgcggccg cctattctgt ctcctccatc cattgca 37
<210> 35
<211> 372
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(372)
<223> 26B9-VH 可变重链 (VH) 序列; 26B9: IgG1, κ
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(111)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(201)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(339)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 35
cag ata cta ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag ccc acg gag 48
Gln Ile Leu Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc acc tgt agt gtc tct ggt gac tcc atc agt gat agt 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Asp Ser
20 25 30
agt cac tac tgg gcc tgg att cgc cag ccc cca ggg aag gga cca gag 144
Ser His Tyr Trp Ala Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Pro Glu
35 40 45
tgg att ggc agt gtc tat ttt agt tcg atg acc cac tac aac ccg tcc 192
Trp Ile Gly Ser Val Tyr Phe Ser Ser Met Thr His Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
ctc aaa agt cgc gtc agc atc tcc gtt gac aag ccc aag aac cag ttc 240
Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Lys Pro Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
tcc tta aaa gtg acc tct gtg act gtc gcc gac acg gcc aca tat tac 288
Ser Leu Lys Val Thr Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
tgt gcg aga caa gcc ctt gcc cga gtc gga gcc atg aat tgg ttc gac 336
Cys Ala Arg Gln Ala Leu Ala Arg Val Gly Ala Met Asn Trp Phe Asp
100 105 110
ccc tgg ggc cag gga tct ctg gtc aca gtc tcc tca 372
Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 124
<212> PRT
<213> 人类
<400> 36
Gln Ile Leu Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Asp Ser
20 25 30
Ser His Tyr Trp Ala Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Pro Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Val Tyr Phe Ser Ser Met Thr His Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Val Asp Lys Pro Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Val Thr Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gln Ala Leu Ala Arg Val Gly Ala Met Asn Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 37
<211> 339
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<223> 26B9-VL 可变轻链 (VL) 序列, κ型
<220>
<221> V_区
<222> (70)..(120)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (166)..(186)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (283)..(309)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<400> 37
gac atc ata atg acc cag tct cca gac tcc ctg cct gtg tct ctg ggc 48
Asp Ile Ile Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gag ggg gtc acc atc aac tgc aag tcc agc cag agc gtc ttt ttc acc 96
Glu Gly Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Thr
20 25 30
tcc agt aat aag agt tgt tta gct tgg tat cag cag aag cca gga aag 144
Ser Ser Asn Lys Ser Cys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
tct ccc aaa ttg ctc att tac tgg gca tca acc cgc caa tcc ggg gtc 192
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
cct gac cga ttc aga ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc tct ctc acc 240
Pro Asp Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr
65 70 75 80
atc acc agt ctg cag gct gaa gat gtg gct gtt tat ttc tgt cag cag 288
Ile Thr Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
tgt cag aca tcc cct ccc act ttc ggc gga ggg acc agg ttg gag atc 336
Cys Gln Thr Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
aaa 339
Lys
<210> 38
<211> 113
<212> PRT
<213> 人类
<400> 38
Asp Ile Ile Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Gly Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Thr
20 25 30
Ser Ser Asn Lys Ser Cys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr
65 70 75 80
Ile Thr Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Cys Gln Thr Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 39
<211> 993
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(993)
<223> 26B9-CH 恒定重链 (CH) 序列
<400> 39
gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 240
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
aga gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 336
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 384
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 432
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 528
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 576
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 624
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 672
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag 720
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 816
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 912
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
cag aag agc ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa tga 993
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 40
<211> 330
<212> PRT
<213> 人类
<400> 40
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 41
<211> 324
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<223> 26B9-CL 恒定κ链 (CL) 序列
<400> 41
cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 324
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人类
<400> 42
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 43
<211> 372
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(372)
<223> 31B4-VH 恒定重链 (VH) 序列; 31B4: IgG1, κ
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(111)
<223> 互补决定区(CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (154)..(201)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (298)..(339)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 43
cag ata cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg agg ccc acg gag 48
Gln Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Thr Glu
1 5 10 15
acc ctg tcc ctc act tgt agt gtc tct ggt gac tcc atc agt cag agt 96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Gln Ser
20 25 30
agt cat tac tgg gcc tgg att cgc cag ccc cca ggg aag gga cca gaa 144
Ser His Tyr Trp Ala Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Pro Glu
35 40 45
tgg att ggc agt gtc tat ttt agc tcg atg acc cac tac aac ccg tcc 192
Trp Ile Gly Ser Val Tyr Phe Ser Ser Met Thr His Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
ctc aca agt cgc gtc agc atc tcc att gac aag gcc atg aat aag ttc 240
Leu Thr Ser Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Lys Ala Met Asn Lys Phe
65 70 75 80
tcc tta aaa gtg acc tct gtg act gtc gcc gac acg gcc aca tat tac 288
Ser Leu Lys Val Thr Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
tgt gcg aga cag gcc ctt gcc cga gtc gga gcc atg aat tgg ttc gac 336
Cys Ala Arg Gln Ala Leu Ala Arg Val Gly Ala Met Asn Trp Phe Asp
100 105 110
ccc tgg ggc cag gga tct ctg gtc aca gtc tcc tca 372
Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 44
<211> 124
<212> PRT
<213> 人类
<400> 44
Gln Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Gln Ser
20 25 30
Ser His Tyr Trp Ala Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Pro Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Val Tyr Phe Ser Ser Met Thr His Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Thr Ser Arg Val Ser Ile Ser Ile Asp Lys Ala Met Asn Lys Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Val Thr Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gln Ala Leu Ala Arg Val Gly Ala Met Asn Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 45
<211> 339
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(339)
<223> 31B4-VL 可变轻链 (VL) 序列, κ 型
<220>
<221> V_区
<222> (70)..(120)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (166)..(186)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (283)..(309)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<400> 45
gac atc ata atg acc cag tct cca gag tcc ctg cct gtg tct ctg ggc 48
Asp Ile Ile Met Thr Gln Ser Pro Glu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gag ggg gtc acc atc aac tgc aag tcc agc cag agc gtc ttt ttc acc 96
Glu Gly Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Thr
20 25 30
tcc agt aat agg agt tgt tta gct tgg tat cag cag aag cca gga cag 144
Ser Ser Asn Arg Ser Cys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
tct ccc aaa ttg ctc att tac tgg gca tca acc cgc caa tcc ggg gtc 192
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
cct gac cga ttc aca ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc tct ctc acc 240
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr
65 70 75 80
atc gcc ggt ctg cag gtt gaa gat gtg gct gtt tat ttc tgt cag cag 288
Ile Ala Gly Leu Gln Val Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
tgt cac gca tcc cct ccc act ttc ggc ggc ggg acc agg ttg gag ctc 336
Cys His Ala Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Leu
100 105 110
aga 339
Arg
<210> 46
<211> 113
<212> PRT
<213> 人类
<400> 46
Asp Ile Ile Met Thr Gln Ser Pro Glu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Gly Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Thr
20 25 30
Ser Ser Asn Arg Ser Cys Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gln Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ala Gly Leu Gln Val Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
Cys His Ala Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Leu
100 105 110
Arg
<210> 47
<211> 993
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(993)
<223> 31B4-CH 恒定重链 (CH) 序列
<400> 47
gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 240
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
aga gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 336
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 384
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 432
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 528
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 576
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 624
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 672
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag 720
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 816
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 912
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
cag aag agc ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa tga 993
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 48
<211> 330
<212> PRT
<213> 人类
<400> 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 49
<211> 324
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<223> 31B4-CL 恒定κ链 (CL) 序列
<220>
<221> 混杂_特征（misc_feature）
<222> (268)..(324)
<223> 非序列而是从数据库获得的
<400> 49
cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 324
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人类
<400> 50
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 51
<211> 372
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(372)
<223> 8H1-VH 可变重链 (VH) 序列; 8H1: κ
<220>
<221> V-区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V-区
<222> (148)..(198)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V-区
<222> (295)..(339)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<400> 51
cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga cag acc ttc acc agt gat 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gln Thr Phe Thr Ser Asp
20 25 30
gat atc aac tgg gtg cga cag gcc cct gga cag ggg cta gag tgg atg 144
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gga tgg agg aac cct aac act cag gac acg ggc tat gca cag aag ttc 192
Gly Trp Arg Asn Pro Asn Thr Gln Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
cac ggc aga ctc acc ttg acc agc aac agt tcc ata agt aca tcc tat 240
His Gly Arg Leu Thr Leu Thr Ser Asn Ser Ser Ile Ser Thr Ser Tyr
65 70 75 80
ctg gag ttg agc ggc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 288
Leu Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg aga gcg ggg act tcg acc ttg acc ggc cac tac ttc gct ttg ggg 336
Ala Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Thr Gly His Tyr Phe Ala Leu Gly
100 105 110
gtc tgg ggc cag ggg acc acg gtc atc gtc tcc tca 372
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 124
<212> PRT
<213> 人类
<400> 52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gln Thr Phe Thr Ser Asp
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Arg Asn Pro Asn Thr Gln Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
His Gly Arg Leu Thr Leu Thr Ser Asn Ser Ser Ile Ser Thr Ser Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Gly Thr Ser Thr Leu Thr Gly His Tyr Phe Ala Leu Gly
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 321
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(321)
<223> 8H1-VL 可变轻链 (VL) 序列, κ型
<220>
<221> V_区
<222> (70)..(102)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(165)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (265)..(291)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<400> 53
gac atc cag ctg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtc acc atc act tgt cag gcg act cag gat att agc aaa tat 96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gtc cct aaa ctc ctg atc 144
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
tac gaa aca tcc aat ttg gaa gta ggg gtc cca tca agg ttc agt gga 192
Tyr Glu Thr Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
agt ggg tct ggg aca cat ttt act ctc acc atc agc agc ctg cag gct 240
Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
gaa gat ttt gca aca tat tac tgt caa cag tat gag aat ttc ccg ttc 288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Asn Phe Pro Phe
85 90 95
act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa 321
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人类
<400> 54
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Thr Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Thr Ser Asn Leu Glu Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Asn Phe Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 55
<211> 990
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(990)
<223> 8H1-CH 恒定重链 (CH) 序列
<400> 55
gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 240
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
aga gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 336
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 384
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 432
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 528
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 576
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 624
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 672
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag 720
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 816
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 912
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
cag aag agc ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa 990
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 56
<211> 330
<212> PRT
<213> 人类
<400> 56
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 57
<211> 324
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<223> 8H1-CL 恒定κ链 (CL) 序列
<400> 57
cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 324
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人类
<400> 58
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 59
<211> 378
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<223> 19D11-VH 可变重链 (VH) 序列; 19D11: IgG1, κ
<220>
<221> 混杂_特征
<222> (1)..(18)
<223> 非序列而是从数据库获得的
<220>
<221> V_区
<222> (91)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (148)..(198)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (295)..(345)
<223> 互补决定区 (CDR) VH-CDR3
<220>
<221> 混杂_特征
<222> (361)..(378)
<223> 非序列而是从数据库获得的
<400> 59
gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gct gag gtg aag agg cct ggg tcg 48
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
tcg gtg agg gtc tcc tgc agg gct tct gga gac acc ttc agc agt tac 96
Ser Val Arg Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Asp Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
cct atc agt tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctt gag tgg atg 144
Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
gga agg atc ctc cct gcc ctt ggt gtc aca aac tac gct cag aac ttc 192
Gly Arg Ile Leu Pro Ala Leu Gly Val Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
cgg ggc aga atc acg att acc gcg gac aag tcg ccc ctc aca gcc tac 240
Arg Gly Arg Ile Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Pro Leu Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ttg gaa ctg agt agc ctc aga ttt gag gac acg gcc gtg tat tac tgt 288
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcg agt ccc agt gcg gac ata att cct tcg att ttg ggg acg acc ctc 336
Ala Ser Pro Ser Ala Asp Ile Ile Pro Ser Ile Leu Gly Thr Thr Leu
100 105 110
ttt gcc ttc tgg ggc cag gga agc ctg gtc acc gtc tcc tca 378
Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 60
<211> 126
<212> PRT
<213> 人类
<400> 60
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Arg Val Ser Cys Arg Ala Ser Gly Asp Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Pro Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Leu Pro Ala Leu Gly Val Thr Asn Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Ile Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Pro Leu Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Ser Ala Asp Ile Ile Pro Ser Ile Leu Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 61
<211> 330
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(330)
<223> 19D11-VL 可变轻链 (VL) 序列, κ型
<220>
<221> 混杂_特征
<222> (1)..(18)
<223> 非序列而是从数据库获得的
<220>
<221> V_区
<222> (70)..(105)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR1
<220>
<221> V_区
<222> (151)..(171)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR2
<220>
<221> V_区
<222> (268)..(300)
<223> 互补决定区 (CDR) VL-CDR3
<220>
<221> 混杂_特征
<222> (312)..(330)
<223> 非序列而是从数据库获得的
<400> 61
gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ctg tct ccg ggg 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa ggg gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag aat gtt agc aga cac 96
Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Ser Arg His
20 25 30
tac tta acc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag tct ccc cgg ctc ctc 144
Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu
35 40 45
atc tat ggt ggc tcc agc agg gcc act ggc gtc cca gac agg ttc agt 192
Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
ggc ggt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agg ctg gag 240
Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
cct gaa gac ttt gca gtg ttt tac tgc cag agc tat cat agc cca cct 288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Ser Tyr His Ser Pro Pro
85 90 95
cct gtg tac act ttc ggc cag ggg acc aag gtg gag atc aaa 330
Pro Val Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 62
<211> 110
<212> PRT
<213> 人类
<400> 62
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Ser Arg His
20 25 30
Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Gly Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Ser Tyr His Ser Pro Pro
85 90 95
Pro Val Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 63
<211> 993
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(993)
<223> 19D11-CL 恒定κ链 (CL)序列
<220>
<221> 混杂_特征
<222> (966)..(966)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> 混杂_特征
<222> (968)..(968)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 63
gcc tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac 96
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc 144
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc 192
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc 240
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag 288
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
aga gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc 336
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca 384
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc 432
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg 480
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag 528
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg 576
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac 624
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg 672
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag 720
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat 768
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac 816
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 864
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
ctc tat agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac 912
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg 960
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
cag aan anc ctc tcc ctg tcc ccg ggt aaa tga 993
Gln Xaa Xaa Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 64
<211> 330
<212> PRT
<213> 人类
<220>
<221> 混杂_特征
<222> (322)..(322)
<223> 在322位置处的“Xaa”替代赖氨酸或天冬酰胺.
<220>
<221> 混杂_特征
<222> (323)..(323)
<223> 在322位置处的“Xaa”替代天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或异亮氨酸.
<400> 64
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Xaa Xaa Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 65
<211> 324
<212> DNA
<213> 人类
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<223> 19D11-CL 恒定κ链 (CL) 序列
<400> 65
cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag 48
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc 96
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa 144
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc 192
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag 240
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg 288
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 324
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 66
<211> 107
<212> PRT
<213> 人类
<400> 66
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 67
<211> 183
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 横跨膜区区的序列
<220>
<221> 混杂_结构
<222> (1)..(30)
<223> myc-表位
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(183)
<220>
<221> 混杂_结构
<222> (34)..(183)
<223> PDGFR 横跨膜域
<400> 67
gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg aat gct gtg ggc cag gac 48
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ala Val Gly Gln Asp
1 5 10 15
acg cag gag gtc atc gtg gtg cca cac tcc ttg ccc ttt aag gtg gtg 96
Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu Pro Phe Lys Val Val
20 25 30
gtg atc tca gcc atc ctg gcc ctg gtg gtg ctc acc atc atc tcc ctt 144
Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Ile Ile Ser Leu
35 40 45
atc atc ctc atc atg ctt tgg cag aag aag cca cgt tag 183
Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro Arg
50 55 60
<210> 68
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 综合构象
<400> 68
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ala Val Gly Gln Asp
1 5 10 15
Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu Pro Phe Lys Val Val
20 25 30
Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Ile Ile Ser Leu
35 40 45
Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro Arg
50 55 60
<210> 69
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IL-20的肽片段
<220>
<221> 结合
<222> (1)..(18)
<223> 由mAB 20A10具体结合的IL-20-肽 20
<400> 69
Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe
1 5 10 15
Leu Thr
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IL-20的肽片段
<220>
<221> 结合
<222> (1)..(15)
<223> 由mAB 20A10具体结合的IL-20肽20的15aa片段
<400> 70
Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe
1 5 10 15
<210> 71
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人IL-20的肽片段
<220>
<221> 结合
<222> (1)..(18)
<223> WO 2010/000721中描述了IL-20-肽19未由mAB 20A10结合,而是具体地由5B7和15D2结合
<400> 71
Asn Tyr Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu
1 5 10 15
Ala Asn
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由丙氨酸扫描表征的用于表位的肽
<220>
<221> 结合
<222> (1)..(17)
<223> 由丙氨酸扫描表征的用于表位的肽
<400> 72
Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu Ala Asn Ser Phe
1 5 10 15
Leu

Claims (32)

1.一种人源化单克隆抗人白介素20(IL-20)抗体或其IL-20结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物，优选地在其可变区中包括：
(a)在以下项中描述的VH和/或VL可变区氨基酸序列的至少一个互补决定区(CDR)：
(i)图1(VH)(SEQ ID Nos：2、10、18和26)；以及
(ii)图1(VL)(SEQ ID NOs：4、12、20和28)；
(b)如图1中描述的VH和/或VL区的氨基酸序列；
(c)由从(a)的所述氨基酸序列中的任一种的部分改变所得到的氨基酸序列组成的至少一个CDR；或者
(d)包括从(b)的所述氨基酸序列的部分改变所得到的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区。
2.根据权利要求1所述的抗体或IL-20结合片段，其能够减少或中和IL-20的生物活性。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或IL-20结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物，其识别由氨基酸序列101-PDHYTLRKISSLANSFLT-118(SEQ ID NO：69)、102-DHYTLRKISSLANSF-116(SEQ ID NO：70)或101-PDHYTLRKISSLANSFL-117(SEQ ID No：72)组成的IL-20衍生肽，其中，P101、I109、S110和/或L117能够由另一氨基酸取代，优选地由丙氨酸取代，并且其不识别或基本上不识别由氨基酸序列97-NYQTPDHYTLRKISSLAN-114(SEQ ID NO：71)组成的肽。
4.根据权利要求1或2所述的抗体或IL-20结合片段，其基本上不结合和/或中和鼠IL-20。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的抗体或IL-20结合片段，其中，所述生物活性是：
(a)人IL-20在基于细胞的STAT(信号转导子和转录激活子)激活测定法中发信号；
(b)IL-20细胞因子细胞表面受体结合的抑制；
(c)人IL-20R I型/II型受体复合物的人IL-20介导的激活；和/或
(d)人IL-20的促炎活性。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体或IL-20结合片段，其中，至少所述CDR与图1中所示的相应CDR是至少70％、优选地80％并且更优选地至少90％相同的，和/或所述VH和/或VL可变区的框架区的所述氨基酸序列与图1中所示的相应框架区是至少70％、优选地80％并且更优选地至少90％相同的。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或IL-20结合片段，其是Ig1或IgG4。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体或其IL-20结合片段，包括CH和/或CL恒定区，所述CH和/或CL恒定区包括选自表1中列出的CH和CL氨基酸序列(SEQ ID NOs.：6、14、22和30)的氨基酸序列或具有至少60％同一性的氨基酸序列。
9.一种与根据权利要求1至8中任一项所述的抗体竞争用于结合至人IL-20的抗体或抗原结合分子。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体，所述抗体选自由单链Fv片段(scFv)、F(ab’)片段、F(ab)片段和F(ab’)2片段组成的组。
11.一种编码至少根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或抗原结合片段的一个免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸。
12.一种包括根据权利要求11所述的多核苷酸的载体。
13.一种包括根据权利要求11所述的多核苷酸或根据权利要求12所述的载体的宿主细胞。
14.一种由根据权利要求12所述的多核苷酸编码的抗体或其一个或多个免疫球蛋白链。
15.一种包括根据权利要求1至10中任一项所述的抗IL-20抗体或IL-20结合片段或通过培养根据权利要求13所述的细胞获得的免疫结合物，所述免疫结合物优选地包括放射性核素、酶、底物、辅因子、荧光标记、化学发光标记、肽标签、重金属、磁性颗粒、药物或毒素。
16.一种包括根据权利要求1至10或14中任一项所述的抗IL-20抗体或IL-20结合片段、根据权利要求15所述的免疫结合物、根据权利要求11所述的多核苷酸、根据权利要求12所述的载体、根据权利要求13所述的细胞的组合物，优选地其中，所述组合物是：
(a)药物组合物，并且还包括药学上可接受的载体，并且可选地还包括用于治疗炎性疾病的额外的药剂；或
(b)诊断组合物或试剂盒，并且还包括常规用于基于免疫的诊断方法或者基于核酸的诊断方法中的试剂。
17.一种用于评估感兴趣的配体与配体结合域的结合的方法，包括：
(a)使表达可选地包括细胞内功能区(2)的所述配体结合域的靶细胞(1)与包括用报道基因(4)标记的所述感兴趣的配体(3)的样品接触；以及
(b)确定报道基因活性(6)；
其中，与对照相比，报道基因活性的增加表明所述感兴趣的配体与所述配体结合域的结合。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述结合域源自受体或抗配体抗体，和/或所述配体是细胞因子，优选地是干扰素或白介素。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中，所述配体结合域和/或所述配体是生物活性的。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法，其中，所述细胞、配体和/或配体结合域是哺乳动物的，优选地是人源的。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中，所述报道基因是可检测的酶，所述可检测的酶优选地选自由以下项组成的组：荧光素酶、辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，最优选地是高斯或NanoLuc荧光素酶。
22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中，所标记的配体是重组融合蛋白，其优选地通过宿主细胞表达和分泌。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞内源地、瞬时地或稳定地表达所述配体结合域和/或根据权利要求6所述的方法，其中，所述宿主细胞瞬时地表达所述融合蛋白。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中，所述样品包括所述宿主细胞的培养物的上清液，优选地其中，所述对照物是没有上清液的培养基或者是没有表达和分泌所述融合蛋白的相同种类细胞的培养物的上清液。
25.根据权利要求17至24中任一项所述的方法，其中，所述靶细胞和/或宿主细胞是HEK293T MSR细胞或COLO 205结肠直肠癌细胞，优选地其中，(i)所述靶细胞是瞬时表达I型和II型的IL-20受体的HEK 293TMSR细胞，并且所述样品包括表达IL-20荧光素酶融合蛋白的HEK 293T细胞的上清液；或者(ii)所述靶细胞是瞬时表达跨膜抗干扰素ω(IFNW)抗体的HEK 293T MSR细胞，并且所述样品包括表达IFNW荧光素酶融合蛋白的HEK 293T细胞的上清液。
26.一种用于确定测试样品是否包括感兴趣的配体与其同源配体结合域结合的激动剂或拮抗剂的测定法，包括根据权利要求17至25中任一项所述的方法的步骤，其中，在步骤(a)之前或在步骤(a)期间，所述配体和/或所述靶细胞经受所述测试样品(7)并且在步骤(b)中，与在没有所述测试样品的情况下或者在存在对照物的情况下的报道基因活性相比：
(i)报道基因活性的增加指示激动剂；以及
(ii)报道基因活性的降低指示拮抗剂。
27.根据权利要求26所述的测定法，其中，所述测试样品包括(i)抗配体抗体、其配体结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物或(ii)抗配体受体(LR)抗体、其LR结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物，优选地其中，所述抗体是人源化抗体；并且可选地其中，所述对照物是非配体结合抗体或非LR结合抗体。
28.根据权利要求26或27所述的测定法，其中，所述样品源自体液，所述体液优选地是从疑似包含抗配体或抗LR抗体的受试者获得的血清，优选地其中，所述受试者患有自身免疫疾病或炎性疾病、病源感染、癌症。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的测定法，其中，所述配体利用所述测试样品预孵育，或者作为对照利用非配体结合分子或非LR结合分子或过量浓度的未标记配体预孵育。
30.一种制备人源化单克隆抗配体抗体或其配体结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物的方法，其中，从获自哺乳动物的样品中分离表达单克隆抗体的B细胞，优选地其中，所述哺乳动物感染有受损的中枢和/或外周耐受性或者丧失自身耐受性，诸如自身免疫性多内分泌腺病-念珠菌病-外胚层营养不良(APECED)，所述方法包括：
(a)针对抗配体抗体的存在来测定样品；
(b)纯化B细胞，所述B细胞优选地为来自已经被识别为含有抗配体抗体的样品的记忆B细胞；
(c)培养所述B细胞，可选地针对所述抗体的生物活性测定所述B细胞的样品，以及
(i)分离所述单克隆抗体；或
(ii)从所述B细胞或记忆B细胞获得用于所述抗体的至少所述可变区的免疫球蛋白基因谱，以及
(d)使用所述谱来在宿主细胞中表达所述抗体或其配体结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物，并且分离所述抗体或其配体结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物；
(e)测定所述抗体或其配体结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物的样品的生物活性；可选地还包括以下步骤：
(f)将所分离的抗体或其配体结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物与药学上可接受的载体混合；
其特征在于，所述配体是根据前述权利要求中任一项限定的配体，并且在步骤(a)、(c)和/或(e)中测定所述样品是根据权利要求26至29中任一项所述的测定法进行的。
31.一种用于制备药物组合物的方法，所述药物组合物包括抗配体抗体或其配体结合片段、合成衍生物或生物技术衍生物，其用于治疗自身免疫性疾病、炎性疾病、癌症或由配体结合至受体介导的疾病，所述方法包括：
(a)提供抗配体抗体；
(b)使所述抗体经受根据权利要求26至29中任一项所述的测定法；以及
(c)仅当所述抗体被确定为拮抗剂或激动剂时，在药物组合物中配制抗体或其衍生物。
32.一种用于进行根据权利要求17至25、30或31中任一项所述的方法或根据权利要求26至29中任一项所述的测定法的试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)包含用报道基因(4)标记的感兴趣配体(3)的样品或用于制备其的装置；
(b)表达可选地包括细胞内功能区(2)的所述配体结合域的靶细胞(1)或用于制备其的装置；
(c)可选的用于确定报道基因活性(6)的装置(5)；
所述试剂盒优选地还包括用于进行根据权利要求17至25、30或31中任一项所述的方法或根据权利要求26至29中任一项所述的测定法的说明书。
CN201580036506.0A 2014-07-03 2015-07-03 人源化抗人il20抗体及用于识别抗细胞因子抗体的测定法 Pending CN106536554A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14175673 2014-07-03
EP14175673.4 2014-07-03
EP14175585.0 2014-07-03
EP14175585 2014-07-03
PCT/EP2015/065244 WO2016001424A2 (en) 2014-07-03 2015-07-03 Human-derived anti-human il-20 antibodies and assay for the identification of anti-cytokine antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106536554A true CN106536554A (zh) 2017-03-22

Family

ID=53510874

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580036506.0A Pending CN106536554A (zh) 2014-07-03 2015-07-03 人源化抗人il20抗体及用于识别抗细胞因子抗体的测定法

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20170189524A1 (zh)
EP (1) EP3164153A2 (zh)
JP (1) JP2017527262A (zh)
KR (1) KR20170027795A (zh)
CN (1) CN106536554A (zh)
AU (1) AU2015282844A1 (zh)
CA (1) CA2950499A1 (zh)
WO (1) WO2016001424A2 (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005052000A2 (en) * 2003-11-21 2005-06-09 Zymogenetics, Inc. Anti-il-20 antibodies and binding partners and methods of using in inflammation
CN103052403A (zh) * 2010-04-16 2013-04-17 成功大学 通过阻断il-20受体活性治疗与il-20受体介导的信号通路相关的病症
WO2013098419A1 (en) * 2011-12-28 2013-07-04 Immunoqure Ag Method of providing monoclonal auto-antibodies with desired specificity
WO2013177157A1 (en) * 2012-05-22 2013-11-28 National Cheng Kung University Humanized anti-il-20 antibody and uses thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6309636B1 (en) * 1995-09-14 2001-10-30 Cancer Research Institute Of Contra Costa Recombinant peptides derived from the Mc3 anti-BA46 antibody, methods of use thereof, and methods of humanizing antibody peptides

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005052000A2 (en) * 2003-11-21 2005-06-09 Zymogenetics, Inc. Anti-il-20 antibodies and binding partners and methods of using in inflammation
CN103052403A (zh) * 2010-04-16 2013-04-17 成功大学 通过阻断il-20受体活性治疗与il-20受体介导的信号通路相关的病症
WO2013098419A1 (en) * 2011-12-28 2013-07-04 Immunoqure Ag Method of providing monoclonal auto-antibodies with desired specificity
WO2013177157A1 (en) * 2012-05-22 2013-11-28 National Cheng Kung University Humanized anti-il-20 antibody and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTONIUS G. ROLINK, ET AL.: "MONOCLONAL ANTIBODIES REACTIVE WITH THE MOUSE INTERLEUKIN 5 RECEPTOR", 《J. EXP. MED.》 *
KATHRYN E. LUKER ET AL.: "Bioluminescent CXCL12 Fusion Protein for Cellular Studies of CXCR4 and CXCR7", 《BIOTECHNIQUES》 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2015282844A1 (en) 2016-12-15
WO2016001424A3 (en) 2016-04-21
EP3164153A2 (en) 2017-05-10
JP2017527262A (ja) 2017-09-21
WO2016001424A2 (en) 2016-01-07
KR20170027795A (ko) 2017-03-10
WO2016001424A9 (en) 2017-01-26
CA2950499A1 (en) 2016-01-07
US20170189524A1 (en) 2017-07-06
AU2015282844A9 (en) 2017-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107636014B (zh) 抗癌融合多肽
US11440964B2 (en) Method for treating a pathological condition involving the activation or proliferation of CD127 positive cells with an anti-CD127 antibody
CN106573979A (zh) 抗axl抗体
CN106573980A (zh) 抗axl抗体
US11945861B2 (en) Human anti-IFN-α antibodies
JP2023010810A (ja) 抗ＳＩＲＰｇ抗体の新規の使用
JP2022523710A (ja) Ｃｄ４４に特異的な抗体
JP2022514693A (ja) Ｍｕｃ１８に特異的な抗体
CN105518024A (zh) 人抗il-32抗体
JP2022514786A (ja) Ｍｕｃ１８に特異的な抗体
KR20230034944A (ko) Abcb5에 특이적인 항체 및 그의 용도
CN106536554A (zh) 人源化抗人il20抗体及用于识别抗细胞因子抗体的测定法
WO2023029089A1 (zh) 抗cd3人源化抗体
KR20230166120A (ko) 새로운 tnfr2 결합 분자
KR20220157686A (ko) 항-bcam 항체 또는 그의 항원 결합 단편

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170322