JP2014534978A - アルブミン結合抗体及びその結合断片 - Google Patents
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Abstract
Description
N末端から順に、第1の重鎖可変ドメイン(VH1)、CH1ドメイン及び第2の重鎖可変ドメイン(VH2)を含む重鎖、並びに
N末端から順に、第1の軽鎖可変ドメイン(VL1)、CLドメイン及び第2の軽鎖可変ドメイン(VL2)を含む軽鎖を含み、
前記重鎖及び軽鎖は、VH1及びVL1が第1の抗原結合部位を形成し、VH2及びVL2が第2の抗原結合部位を形成するように並べられ、
第2の抗原結合部位によって結合された抗原は、ヒト血清アルブミンであり、第2の重鎖可変ドメイン(VH2)は、配列番号1において示される配列を有し、第2の軽鎖可変ドメイン(VL2)は、配列番号3において示される配列を有する。
N末端から順に、第1の重鎖可変ドメイン(VH1)、CH1ドメイン及び第2の重鎖可変ドメイン(VH2)を含む重鎖、並びに
N末端から順に、第1の軽鎖可変ドメイン(VL1)、CLドメイン及び第2の軽鎖可変ドメイン(VL2)を含む軽鎖を含み、
前記重鎖及び軽鎖は、VH1及びVL1が第1の抗原結合部位を形成し、VH2及びVL2が第2の抗原結合部位を形成するように並べられ、
第2の抗原結合部位によって結合される抗原は、ヒト血清アルブミンであり、
第2の重鎖可変ドメイン(VH2)は、配列番号2において示される配列を有し、第2の軽鎖可変ドメイン(VL2)は、配列番号4において示される配列を有し、
第2の重鎖可変ドメイン(VH2)及び第2の軽鎖可変ドメイン(VL2)は、ジスルフィド結合によって連結される。
N末端から順に、第1の重鎖可変ドメイン(VH1)、CH1ドメイン、第2の重鎖可変ドメイン(VH2)及び第3の重鎖可変ドメイン(VH3)を含む重鎖、並びに
N末端から順に、第1の軽鎖可変ドメイン(VL1)、CLドメイン、第2の軽鎖可変ドメイン(VL2)及び第3の軽鎖可変ドメイン(VL3)を含む軽鎖を含み、
前記重鎖及び軽鎖は、VH1及びVL1が第1の抗原結合部位を形成し、VH2及びVL2が第2の抗原結合部位を形成し、VH3及びVL3が第3の抗原結合部位を形成するように並べられ、
第2の又は第3の抗原結合部位によって結合される抗原は、ヒト血清アルブミンであり、
第2の又は第3の重鎖可変ドメインは、配列番号1又は配列番号2において示される配列を有し、第2の又は第3の軽鎖可変ドメインは、配列番号3又は配列番号4において示される配列を有する。
コンピテントな大腸菌(E.coli)株を、形質転換及び慣用的培養物増殖のために用いた。DNA制限酵素及び修飾酵素を、Roche Diagnostics Ltd.及びNew England Biolabs.から得た。プラスミド調製を、Maxiプラスミド精製キット(QIAGEN、カタログ番号12165)を用いて実施した。DNA配列決定反応を、ABI Prism Big Dyeターミネーター配列決定キット(カタログ番号4304149)を用いて実施し、ABI 3100自動化シーケンサー(Applied Biosystems)上で実行した。データを、プログラムSequencher(Genecodes)を用いて分析した。オリゴヌクレオチドを、Sigma又はInvitrogenから得た。最初のV領域配列をコードする遺伝子を、DNA2.0による自動化合成アプローチによって構築し、修飾して、オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発によってグラフトバージョンを作製した。Fab−Fvの濃度を、タンパク質−GベースのHPLC方法によって決定した。
(A26Fab−645dsFvにおける645の異なるヒト化グラフトの作製及び分析)
我々は、以前に、WO2010/035012において、Fab−dsFv抗体形式(図1B)及び「645gH1gL1」として公知のヒト化抗アルブミン抗体を記載した。我々はまた、以前に、WO2010096418において、「A26」として公知のヒト化拮抗性抗OX40抗体の産生を記載した。我々は、645dsgH5gL4として公知の抗体「645」の新規な改善されたヒト化グラフトの産生、並びにFvコンポーネント内にグラフトを及びFabコンポーネント内に「A26」可変領域を組み込むFab−dsFv抗体分子の産生を記載する。645gH1及びgL1の配列は、図3(a)及び(b)、配列番号9及び10に示される。
A26Fab−645dsFv(gL1)軽鎖(配列番号12)の全コード領域を、HCMV−MIEプロモーター及びSV40EポリA配列の制御下に、UCB哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。645dsFv(gL1)(配列番号10)の軽鎖可変領域を、重複PCR方法によって、645dsFv(gL4)(配列番号4)に突然変異した。A26Fab−645dsFv(gH1)重鎖(配列番号11)の全コード領域を、HCMV−MIEプロモーター及びSV40EポリA配列の制御下に、UCB哺乳動物発現ベクター内にクローニングした。645dsFv(gH1)(配列番号9)の重鎖可変領域を、重複PCR方法によって、645dsFv(gH5)(配列番号2)に突然変異した。構築物を、配列決定によって確かめた。
Invitrogenの293fectin形質移入試薬を使用して、製造者の指示に従って、HEK293細胞を、重鎖及び軽鎖プラスミドを用いて形質移入した。手短に述べると、25μgの重鎖プラスミドと25μgの軽鎖プラスミドを、100μlの293fectinと1700μlのOptipro培地と共に、20分間、室温でインキュベートした。その後、混合物を50mLの懸濁液中の50×106個のHEK293細胞に加え、6日間、振盪しながら37℃でインキュベーションした。6日後、上清を1500×gにて10分間の遠心分離によって回収して細胞を除去し、0.22μmの滅菌フィルターで濾過した。
約50mlの0.22μmフィルター濾過した上清を、10kDa分子量カットオフ膜を備えたAmicon Ultra−15濃縮機を用いて約2mlまで濃縮、4000×gにてスウィングアウトローター内で遠心分離した。1.8mlの濃縮した上清を、1ml/分にて20mMホスフェート、40mM NaCl pH7.4中で平衡化した1mlのGammabind Plus Sepharose(GE Healthcare)カラムに適用した。このカラムを、20mMホスフェート、40mM NaCl pH7.4で洗浄し、結合物質を、0.1Mグリシン/HCl pH2.7で溶出した。溶出ピークを回収し、2M Tris/HCl pH8.5にて約pH7にまでpHを調整した。pH調整した溶出物を、濃縮し、10kDa分子量カットオフ膜を備えたAmicon Ultra−15濃縮機を用いて、20mMホスフェート、150mM NaCl pH7.4中に限外濾過し、4000×gにてスウィングアウトローター内で遠心分離して、約0.3mlの最終容量にした。
タンパク質−G精製したサンプルを、サイズ排除HPLCによって分析した。このサンプルを、Superdex 200 10/300 GL Tricornカラム(GE Healthcare)上で分離し、均一濃度勾配のPBS pH7.4によって、1ml/分で展開した。ピーク検出は、280nmであり、且つ見かけ上の分子量が、既知の分子量のタンパク質対溶出容量の標準曲線と比較することによって計算した。645dsFvのヒト化グラフトのgH1gL1からgH5gL4への変化は、dsFv(データは示さず)の熱安定性において、又はdsFvのHSAへの結合の親和性において(データは示さず)、何ら変化なしに、発現されたA26Fab−645dsFvのモノマーの59%から71%までの百分率での増大(12%の増大)をもたらした。
2.1 A26 Fab−dsFv(645gH5gL4)結合OX40についてのBIAcore動態学
この及びすべてのその後の例において、A26 Fab−dsFv 645gH5gL4は、配列番号7において示される重鎖配列(図2(g))及び配列番号8において示される軽鎖配列(図2(h))を有し、すなわち、この重鎖は、配列番号5において示されたG4S、G4T、G4Sリンカーを含んだ(図2(e))。
BIA(Biamolecular Interaction Analysis)を、BIAcore T200(GE Healthcare)を用いて実施した。Affinipure F(ab’)2断片ヤギ抗ヒトIgG、F(ab’)2断片特異的(Jackson ImmunoResearch)を、CM5センサーチップ上に、≒5000応答単位(RU)の捕捉レベルまでのアミン結合化学を介して固定化した。HBS−EP緩衝液(10mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05%界面活性剤P20、GE Healthcare)を、ランニング緩衝液として、10μL/分の流速で使用した。0.75μg/mLにおけるFab−Fvの10μL注入を、固定化抗ヒトIgG−F(ab’)2による捕捉のために使用した。ヒト血清アルブミン(HSA)、マウス血清アルブミン(MSA)及びカニクイザル血清アルブミン(CSA)を、30μL/分の流速で、種々の濃度(50nM〜6.25nM)における捕捉したFab−Fvにわたって滴定した。表面を、流速10μL/分における50mM HClの2×10μL注入、その後の5mM NaOHの5μL注入によって再産生した。バックグラウンド減算結合曲線を、T200評価ソフトウェア(バージョン1.0)を用い、標準的手順に従って分析した。動態学パラメータを、フィッティングアルゴリズムから決定した。
ヒトOX40及びヒト血清アルブミンのA26Fab−dsFvへの同時結合を、評価した。A26 Fab−dsFv構築物を、A26Fab−dsFvアルブミンの結合についてのBiacore動態学についての方法において述べたとおりに、センサーチップ表面に捕捉した。50nM HAS、25nM OX40又は50nM HSA及び25nM OX40の終濃度を有する混合溶液を、捕捉したA26 Fab−dsFvにわたって別個に滴定した。合わせたHSA/OX40溶液についての結合応答は、別個の注入の応答の合計と同等であった。このことは、Fab−dsFvが、ヒトOX40及びHSAの両方への同時の結合が可能であることを確認した。
方法:
ヒト活性化CD4+OX40+T細胞に対するA26 Fab−Fv結合。
PBMCを、Ficoll勾配上で分離することによって単離し、4μg/mL PHA−Lによって、3日間37℃、5% CO2、100%湿度にて活性化させた。CD4+T細胞を、磁気ビーズ(CD4+ T Cell Isolation Kit II for Human;Miltenyi Biotec)を用いたネガティブ選択によって単離した。約1×105個の細胞を、Facs緩衝液(PBS/0.2% BSA/0.09% NaN3)又は5% HSAを補ったFacs緩衝液のいずれかにおける抗体の存在下で、4℃にてインキュベートした。抗体の終濃度は、48nM〜0.0005nMの範囲に及んだ。この細胞を、PBS中で洗浄し、その後、FACScalibur(Becton Dickinson)を用いたフローサイトメトリによって分析した。2つの滴定データセットを、1つはA26 Fab−dsFvを含み、第2は非特異的結合を決定するために無関係の対照Fab−Fvを含む、両緩衝液条件下で作成した。結合抗体のモル数を、種々の、しかし既知の量の蛍光色素を含むビーズの使用により作成された標準曲線から内挿された値を用いることによって、計算した。幾何平均蛍光値を、細胞及びビーズのフローサイトメトリ分析において決定した。非特異的結合を、A26 Fab−dsFv値から減算し、こうして作成された特異的結合曲線を、1部位結合等式(Graphpad Prism(登録商標))を用いた非線形回帰によって分析し、KDを決定した。細胞表面発現抗原についてのA26 Fab−dsFvの親和性を決定するために、活性化CD4+OX40+T細胞及びAlexa Fluor 488標識A26 Fab−dsFvを用いて、飽和結合実験を実施した。非常に小さな画分の抗体のみが、結合曲線の任意の点において受容体に結合したと仮定して、抗体濃度の一定範囲にわたって平衡である抗体の受容体に対する特異的結合を、KDを決定するために使用した。
抗体の受容体との会合の割合=Kon×[受容体遊離]×[抗体遊離]
受容体−抗体複合体の解離の割合=Koff×[受容体−抗体]
平衡において、会合率及び解離率は、同等であり、結合等温線を説明する等式が、導かれる;セミログプロット上にて、結合は、S字である。KDは、koff/konによって規定され、結合曲線から、最大半量の結合が起こる濃度として計算され得る。
AlexaFluor488標識A26 Fab−Fvの活性化ヒトCD4+OX40+T細胞への結合を、5ログ濃度範囲にわたるフローサイトメトリによって測定した。
A26 Fab−Fvについての代表的結合曲線を、図4に示す。
5の異なるドナー由来の活性化細胞上で得られた平均KD値は、145pMであった。
scFvとしての645gL4gH5の発現
プラスミド構築
scFvを、2つの近接に関連するUCB修飾哺乳動物発現プラスミドのうちの1つから発現した;pVKΔPvuIIを、HL方向におけるscFvのクローニング及び発現のために使用し、他方で、pKHΔEcoRVを、LH方向におけるscFvのクローニング及び発現のために使用した。すべてのscFvを、20アミノ酸リンカーペプチド、(GGGGS)4(配列番号17)及びC末端10×Hisタグを含むように設計した。scFvアクセプタープラスミド362HL及び240LHは、vH(PvuII及びXhoI)及びvL(EcoRV及びBsiWI)のFW1−FW4境界において独自の制限部位をコードし、その後の2工程ライゲーションにおけるscFv可変領域の制限クローニングを可能にした。645gH5 vH及び645gL4 vLをコードする遺伝子を、DNA2.0によって合成し、ジスルフィド安定化(ds)scFvを産生するために、Kabat位置vH44及びvL100においてシステイン揺らぎを有した。これらのV−領域遺伝子を、PvuII及びXhoI(vH)又はEcoRV及びBsiWI(vL)を用いてアクセプターscFvプラスミド内にクローニングし、首尾よいライゲーションを、DNA配列決定によって確認した。
HEK293F細胞(106細胞/mlにて50mlの培養物)を、50μgプラスミドDNAによってトランスフェクトし、37℃にてFreeStyle(商標)培地中で培養した。上清を、トランスフェクションの6日後に回収し、scFvを、バッチNi2+−NTA精製によって精製した。精製タンパク質を、濃縮し、その後の生理学的性質決定のために、PBSに緩衝液交換した。
Thermofluorアッセイを実施し、精製分子の熱安定性を評価した。精製タンパク質(0.1mg/ml)を、SYPRO(登録商標)Orange色素(Invitrogen)と混合し、この混合物を、384 PCR光学ウェルプレート内に4連で分注した。サンプルを、20℃〜99℃の温度範囲にわたって、1.1℃/分のランプ速度で、7900HT Fast Real−Time PCR System(Agilent Technologies)上で分析した。ウェルあたりの蛍光強度変化を、温度に対してプロットし、得られたスロープの変曲点を使用して、Tmを得た。
精製タンパク質(10μg及び50μg)を、Superdex 200 10/300 GL Tricorn Column(GE Healthcare)上のサイズ排除HPLCによって分析した。PBS pH7.4の均一濃度勾配を流速1ml/分で使用し、214nm及び280nmにおいてUV検出を行った。
645gH5gL4 HLdは、97%のモノマー及び75.6℃のTmを与えた。
645gH5gL4 HLは、86%のモノマー及び75.6℃のTmを与えた。
FabA−dsscFv融合物の構築
哺乳動物細胞における発現のためのプラスミド
一本鎖Fv(scFv)を、ヒト血清アルブミン結合抗体の軽鎖及び重鎖可変領域ドメイン(配列番号1及び3又は2及び4)を、HL方向における柔軟なリンカー(配列番号17)を介して連結することにより、構築した。点突然変異を、DNA配列内に、Fvの重鎖及び軽鎖の両方のフレームワーク領域中の選択された残基で導入した。突然変異は、Fvの重鎖と軽鎖との間に鎖間ジスルフィド結合を作製するために導入され、ジスルフィド連結されたscFv(dsscFv)を形成した。FabA−dsscFv融合タンパク質を、dsscFvを、軽鎖領域(カッパ定常領域のKm3アロタイプを有する)又はFabAの重鎖(ヒトガンマ−1CH1定常領域、γ1イソ型)のいずれかの定常領域のC末端に融合することによって、構築した。柔軟な(配列番号18及び5)リンカーを使用し、scFvをcカッパ領域(配列番号19)又はCHI領域(配列番号20)に、それぞれ連結した。FabA−dsscFv(CL−dsscFv)、FabA−dsscFv(CH1−dsscFv)、FabA軽鎖及びFabA重鎖を、化学的に製造し、次いで、哺乳動物発現ベクター内に、HCMV−MIEプロモーター及びSV40EポリA配列の制御下でクローニングした。
Claims (15)
- 配列番号1又は配列番号2において示される配列を有する重鎖可変ドメインを含む、血清アルブミン結合抗体又はその断片。
- 配列番号3又は配列番号4において示される配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、血清アルブミン結合抗体又はその断片。
- 配列番号1において示される配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号3において示される配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、血清アルブミン結合抗体又はその断片。
- 配列番号2において示される配列を有する重鎖可変ドメイン及び配列番号4に示される配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、血清アルブミン結合抗体又はその断片。
- Fab、修飾Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、単一可変ドメイン抗体、scFv、二価、三価若しくは四価の抗体、Bis−scFv、ディアボディ、トリアボディ、トライボディ、DVD−Ig及びBiTEからなる群より選択される、請求項1から4までのいずれか一項に記載の血清アルブミン結合抗体又はその断片。
- N末端から順に、第1の重鎖可変ドメイン(VH1)、CH1ドメイン及び第2の重鎖可変ドメイン(VH2)を含む重鎖、並びに
N末端から順に、第1の軽鎖可変ドメイン(VL1)、CLドメイン及び第2の軽鎖可変ドメイン(VL2)を含む軽鎖を含み、
前記重鎖及び軽鎖は、VH1及びVL1が第1の抗原結合部位を形成し、VH2及びVL2が第2の抗原結合部位を形成するように並べられ、
第2の抗原結合部位によって結合される抗原は、ヒト血清アルブミンであり、第2の重鎖可変ドメイン(VH2)は、配列番号1において示される配列を有し、第2の軽鎖可変ドメイン(VL2)は、配列番号3において示される配列を有し、
第2の重鎖可変ドメイン(VH2)及び第2の軽鎖可変ドメイン(VL2)は、ジスルフィド結合によって、任意選択で、連結されている、二重特異性抗体融合タンパク質。 - N末端から順に、第1の重鎖可変ドメイン(VH1)、CH1ドメイン及び第2の重鎖可変ドメイン(VH2)を含む重鎖、並びに
N末端から順に、第1の軽鎖可変ドメイン(VL1)、CLドメイン及び第2の軽鎖可変ドメイン(VL2)を含む軽鎖を含み、
前記重鎖及び軽鎖は、VH1及びVL1が第1の抗原結合部位を形成し、VH2及びVL2が第2の抗原結合部位を形成するように並べられ、
第2の抗原結合部位によって結合される抗原は、ヒト血清アルブミンであり、
第2の重鎖可変ドメイン(VH2)は、配列番号2において示される配列を有し、第2の軽鎖可変ドメイン(VL2)は、配列番号4において示される配列を有し、
第2の重鎖可変ドメイン(VH2)及び第2軽鎖可変ドメイン(VL2)は、ジスルフィド結合によって、任意選択で、連結されている、二重特異性抗体融合タンパク質。 - 請求項1から7までのいずれか一項に記載の抗体又は断片をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項8に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項8に記載のポリヌクレオチド又は請求項9に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項10に記載の宿主細胞から、請求項1から7までのいずれか一項に記載の抗体又は断片を発現することを含む、請求項1から7までのいずれか一項に記載の抗体又は断片を産生する方法。
- 請求項1から7までのいずれか一項に記載の抗体又は断片を含む医薬製剤。
- 医薬の製造における、請求項1から7までのいずれか一項に記載の抗体又は断片の使用。
- 処置における使用のための、請求項1から7までのいずれか一項に記載の抗体又は断片。
- 請求項1から7までのいずれか一項に記載の抗体又は断片を含む抗体分子の治療有効量を投与する工程を含む、それを必要とする患者を処置する方法。
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