JP2018515449A - 組換え抗体分子の単量体化方法 - Google Patents

組換え抗体分子の単量体化方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ａ）尿素及び／又は塩酸グアニジンから選択される変性剤で組成物を処理する変換ステップ；ｂ）ステップａ）が、還元剤の存在下で、又は還元剤との処理後に実施される、ことを含む、抗体分子が、１つのＶＨ及び１つのＶＬを含む目的の抗原に対する特異性を有する少なくとも１つのＦｖを含み、ここで、該ＶＨ及びＶＬは、１つ以上のリンカーを介して直接的又は間接的に連結され、それらの間のジスルフィド結合によって安定化されることを特徴とする、組換え発現された抗体分子の組成物中の単量体のパーセンテージを増加させる方法を提供する。

Description

本開示は、組換え発現された抗体分子の組成物中の単量体の量を増加させる方法及び本明細書中に記載される方法から得られた又は得られ得る組成物に関する。
治療用モノクロナール抗体は、治療剤の非常に重要なクラスになっている。ＷＯ２０１０／０１９４９３に開示されるように、これらの抗体分子の精製及び製剤化は、困難である。しかしながら、最高品質の材料のみが治療用途に使用されることは極めて重要である。
組換えタンパク質、特に原核生物中で発現されるものは、適切な三次元構図に折り畳まれないが、封入体とも呼ばれる不正確に折り畳まれたタンパク質の大きい凝集体を形成する場合、生物学的に活性でないことは周知である。そのようなタンパク質凝集体を効果的に変性及び溶解させるためのカオトロープの使用は、当該技術分野で公知である。例えば、ＷＯ２００７／０１４１７０は、組換えタンパク質組成物の凝集に関する多くの問題を論じ、酢酸ナトリウム及び／又は塩化ナトリウム及びカオトロピック剤を含む緩衝系を開示する。その方法は、酸性緩衝溶液中でカオトロープを使用して短鎖結合ドメイン及びＦＣ領域を含む小型モジューラー免疫製剤と呼ばれる特異的抗体フォーマットの解凝集に関して開示される。一本鎖結合ドメインは、安定化ジスルフィド結合を含まない。
新規な抗体フォーマットは、しばしば可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む少なくとも１つのＦｖ領域の存在を必要とし、ここで可変ドメインは、Ｃ末端で定常軽ドメイン（ＣＬ）又は定常重ドメイン（ＣＨ１）に結合している自然状態でない。天然に存在する全抗体分子において、ＣＬ及びＣＨ１ドメインの存在は、ＶＬ及びＶＨのペアリングを安定化させるように作用する。したがって、ＣＬ及びＣＨ１の非存在下、可変ドメインは、隣接分子の可変ドメインと動的に交換されやすい。この動的プロセスを停止させる１つの方法は、ｖ領域のペアリングをロックダウンし、動的交換を防止するＶＨとＶＬの間のジスルフィド結合の導入による。しかしながら、ジスルフィド結合の存在はまた、抗体の望ましくない多量体を安定化させるように作用することができる。
新規の抗体フォーマットはまた、しばしばリンカーを含む。しかしながら、１つの分子中の可変ドメインが別の分子中の可変ドメインとのと対合し、それによって、２つの分子を一緒に結合させる場合、リンカーの存在は、望ましくない多量体形成を生じ得る。次に、Ｆｖ中のジスルフィド結合の存在は、多量体種を安定化させるように作用する。
既知の二重特異性抗体フォーマットの例は、ＷＯ２０１０／０３５０１２及びＷＯ２０１１／０３６４６０に詳細に記載されるようなＦａｂ−ｄｓＦｖ抗体である。この抗体フォーマトは、図９に示されるように、２つ以上の単量体を含む多量体を形成する傾向を有する。同様の多量体はまた、ジスルフィド結合ｓｃＦｖ分子を含む組成物を生じ、ここで、ｓｃＦｖからのＶＨは、別のｓｃＦｖからのＶＬと対になり、２つのｓｃＦｖ分子が一緒に２つのｓｃＦｖの二量体を生じるジスルフィド安定化Ｆｖ対を形成する。別個の分子中の可変ドメインのさらなるペアリグは、より大きい多量体種を作製することができる。
クロマトグラフィーなどの精製の既知の方法は、より小さい単量体種からより大きな多量体種を分離することができるが、抗体のより低い全収量を必然的にもたらす。したがって、二重特異性抗体フォーマットについて、抗体の組成物における望ましくない多量体種の問題に取り組むための方法が非常に必要とされる。
本開示の方法は、抗体分子を含む組成物において単量体の量を減少させることによって上記の問題に対する解決策を提供する。本開示は、ヒト使用に適した単量体モノクルナール抗体分子の組成物を提供するのに特に有用である。
したがって、
ａ）尿素及び／又は塩酸グアニジンから選択される変性剤で組成物を処理する変換ステップ；
ｂ）ステップａ）が、還元剤の存在下で、又は還元剤との処理後に実施されることを含む、
抗体分子が、１つのＶＨ及び１つのＶＬを含む目的の抗原に対する特異性を有する少なくとも１つのＦｖを含み、ここで、該ＶＨ及びＶＬは、１つ以上のリンカーを介して直接的又は間接的に連結され、それらの間のジスルフィド結合によって安定化されることを特徴とする、組換え発現された抗体分子の組成物中の単量体のパーセンテージを増加させる方法が提供される。
組換え発現された抗体分子に本明細書中に記載されたプロセスを採用することは、組成物中の単量体の量を有利に増加させる。さらに、本明細書中の方法は、商業的規模で容易にかつ費用効果的に使用されることができる。
本発明の方法は、多量体種を単量体に変換することができ、それによって単量体のパーセンテージを増加させる。変換ステップは、還元剤がＶＨ及びＶＬ及び多量体種の間のジスルフィド結合を減少させて部分的に変性させ、それによって多量体を分解することを有利に可能にする。その方法はまた、ＶＨ及びＶＬドメインが、単一抗体分子内にＦｖ対を形成すること、及びＶＨとＶＬの間の安定化ジスルフィド結合の再形成が単量体を生じることを可能にする。したがって、正確に折り畳まれていないタンパク質凝集体を溶解するための尿素及びグアニジンの既知の使用とは対照的に、本発明者らは、驚くべきことに、尿素及び／又はグアニジン並びに還元剤を使用して、１つ以上のリンカーの存在によって形成された抗体多量体を変換し、抗体を完全に変性させることなく抗体単量体に対するジスルフィド結合を安定化させることができることを示している。本発明の方法はまた、所望の単量体を生成するために正しいジスルフィド結合を改質すること有利にも可能にする。
還元剤単独では、β−ｍｅａを使用して最大で２５％超えを提供しないことが示されている。しかしながら、還元剤と緩和な変性剤の組み合わせは、例えば８０％単量体の領域において、単量体の非常により高いレベルを提供することが示されている。
１つの態様において、単量体の濃度の増加は、２、３又は４倍である。本発明の方法は、好ましくは、単量体形態で少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％又は少なくとも９０％抗体を含む変換ステップ後の組換え抗体組成物を提供する。
１つの態様において、プロセスから得られた又は得られ得る組成物を提供する。
本発明はまた、処理で使用するための本明細書中で開示された方法から得られた組成物の使用を提供する。
図１は、ＳＥ−ＵＰＬＣ分析によって得られた、室温で、精製した抗体Ａ２６ Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖにβ−ｍｅａの添加後に得られた単量体％及び単量体量を示す。 図２Ａ＋２Ｂは、β−ｍｅａ及びグアニジンを用いる変換を実施後、抗体Ａ２６ Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖについてそれぞれ得られた単量体％及び単量体濃度を示す。 図２Ａ＋２Ｂは、β−ｍｅａ及びグアニジンを用いる変換を実施後、抗体Ａ２６ Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖについてそれぞれ得られた単量体％及び単量体濃度を示す。 図２Ｃ＋Ｄは、β−ｍｅａ及び尿素を用いる変換を実施後、抗体Ａ２６ Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖについてそれぞれ得られた単量体％及び収率を示す。 図２Ｃ＋Ｄは、β−ｍｅａ及び尿素を用いる変換を実施後、抗体Ａ２６ Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖについてそれぞれ得られた単量体％及び収率を示す。 図２Ｅは、β−ｍｅａ及び尿素を用いる変換を実施後、抗体Ａ２６ Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖについて得られた単量体の量を示す。 図３は、β−ｍｅａ及び尿素を用いる変換ステップの間、抗体Ａ２６ Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの組成物における単量体％の経時変化を示す。 図４は、パラメータの範囲に対する単量体収率％の等高線プロットを示す。 図５は、パラメータの範囲に対する単量体収率％の等高線プロットを示す。 図６は、尿素濃度及びβ−ｍｅａ濃度についてスイートスポットプロット単量体収率を示す。 図７は、変換ステップ前のＳＥ−ＵＰＬＣクロマトグラム供給材料を示す。 図８は、変換ステップ後のサンプルのＳＥ−ＵＰＬＣクロマトグラムを示し、試験条件は、４．７Ｍ尿素及び１１５ｍＭβ−ｍｅａであった。 図９は、単量体Ｆａｂ−ｄｓＦｖ及びＦａｂ−ｄｓＦｖの多量体バージョンを示す。 図１０〜１７は、様々な抗体分子配列及びその成分を示す。 図１０〜１７は、様々な抗体分子配列及びその成分を示す。 図１０〜１７は、様々な抗体分子配列及びその成分を示す。 図１０〜１７は、様々な抗体分子配列及びその成分を示す。 図１０〜１７は、様々な抗体分子配列及びその成分を示す。 図１０〜１７は、様々な抗体分子配列及びその成分を示す。 図１０〜１７は、様々な抗体分子配列及びその成分を示す。 図１０〜１７は、様々な抗体分子配列及びその成分を示す。 図１８は、抗体フォーマットの例を示す。 図１９は、抗体フォーマットの例を示す。
詳細な説明
本明細書中で使用される用語多量体又は多量体形態は、ドメインの全てが、正しく折り畳まれ、対合する、２つ以上の抗体単量体からのドメインからなる抗体形態を指す。例えば、多量体は、２つ以上の抗体単量体から形成され得、各ＶＨドメインは、ＶＬドメインと対になって、図９のＦａｂ−ｄｓＦｖについて示されるように、相補的Ｆｖ領域を形成する。
１つの態様において、本明細書中で用いられる単量体のパーセンテージを増加させることは、本開示のプロセスが適用された前に得られる単量体抗体分子パーセンテージと比較して、全体標的タンパク質収率のより高いパーセンテージである単量体抗体分子の数値を得ることを指す。例えば、パーセンテージ単量体は、抗体分子の初期収率の少なくとも３０％であり得、本プロセスを適用後、パーセンテージ単量体は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％であり得る。１つの態様において、単離された単量体の収率の絶対的な数値、すなわち収率は、本開示のプロセスを実施後、より高い。
本明細書中で使用される収率又は総タンパク質は、組成物中の抗体分子種の組み合わされた値を指す。１つの態様において、用いられる収率の値は、本開示による処理前の値である。
１つの態様において、用いられる収率の値は、本開示によるプロセスを実施後に回収される総タンパク質（抗体分子種）の量である。
本開示のプロセスを実施後に回収される総タンパク質（抗体分子種）は、必然的にいくらかの喪失をもたらすため、減少するだろう。
標的タンパク質は、発現される組換え抗体分子を指す。
組換えタンパク質は、組換え技術を用いて発現される抗体分子などのタンパク質である。
本明細書中で用いられる抗体濃度がフィード濃度を指さない限り、単量体及び多量体を含む全ての抗体種の濃度を標的とするタンパク質及びその多量体を含む物質を指す。１つの態様において、抗体濃度は、組成物から不純物を除去するプロテインＡ精製のステップ後の組成物中の抗体の濃度である。
本明細書中で使用される還元剤は、問題の分子中のジスルフィド結合を還元することができる還元剤、例えば、抗体を指す。１つ以上のジスルフィド結合を含む抗体の存在下での還元剤は、適切な条件下でジスルフィド結合、例えば−ＳＨ形態を還元する能力を有する。１つの態様において、還元剤自体は、単一チオール基、２つのチオール基又は３つ以上のチオール基を含む。あるいは、還元剤は、チオール基自体を含まない。
本明細書中で使用されるチオールは、エンティティー−ＳＨを含む基を指す。
１つの態様において、還元剤は、グルタチオン（ＧＳＨ）、エチレンスルファイト、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、塩酸塩などのその塩を含む２−メルカプトエチルアミン（ＢＭＥＡ、ｂＭＥＡ又はＢ−ｍｅａ、β−ｍｅａ又はβｍｅａとも呼ばれる）、システイン−ＨＣｌなどのシステイン、亜リン酸及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）、ＴＨＰ（トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン）を含む基から選択される。
還元剤、特に単一のチオール基を含むチオール還元剤の使用は、プロセスを実施後、すなわち、プロセスの終わりに特定の酸化ステップを実施する必要なく、自然に単量体形態の可変領域の間の所望のジスルフィド結合として有益である。１つのチオール基を含むチオール還元剤の例は、グルタチオン、メルカプトエタノール（２−メルカプトエタノールなど）、メルカプトエチルアミン（２−メルカプトエチルアミンなど）及びシステイン（システイン−ＨＣｌなど）を含むが、これらに限定されない。
１つの態様において、チオール還元剤は、メルカプトエタノール（２−メルカプトエタノールなど）、メルカプトエチルアミン（２−メルカプトエチルアミンなど）、特に２−メルカプトエチルアミン（ＢＭＥＡ、ｂＭＥＡ、又はＢ−ｍｅａ、又はβ−ｍｅａ又はβｍｅａとも呼ばれる）である。
本開示に係る方法のさらなる利点は、抗体分子が、用いられる条件によって、展開されないことである。すなわち、適切に折り畳まれたポリペプチド／タンパク質を展開することから生じる失活が、最小限に抑えられ、抗体をリフォールドする必要性が回避される。１つの態様において、抗体が、複数のジスルフィド結合を含む場合、抗体中の全てのジスルフィド結合が還元されるわけではない。したがって、いわゆるＦａｂ−ｄｓＦｖなどの分子において、Ｆａｂ断片及び抗体のＦｖにおける鎖内ジスルフィド結合は、本発明の方法によって還元されない。β−ｍｅａは、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ分子に対して特に有利である。
１つの態様において、還元剤の濃度は、１ｍＭ〜１５０ｍＭ、例えば、１０〜１５０ｍＭ、５０〜１５０ｍＭ、８０〜１５０ｍＭ、９０〜１４０、９５〜１３５ｍＭの範囲、例えば、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１３５、１４０、１４５又は１５０ｍＭである。
１つの態様において、尿素、グアニジン又はそれらの組み合わせの濃度は、１〜５モルの範囲である。
本明細書中で使用される尿素はまた、化学式ＣＯ（ＮＨ２）２でカルバミドとして知られている有機化合物を指す。
本明細書中で用いられるグアニジンは、式ＨＮＣ（ＮＨ２）２又はその塩を有する。好ましくは、塩酸グアニジンが使用される。
１つの態様において、ステップａ）の変性剤は尿素である。１つの態様において、本開示に係る処理における尿素の濃度は、１〜５モル、例えば、２〜５モル、２．５〜５モル、３〜５モル、４〜５モル、４．０〜４．９モル又は４．５〜４．９モルの範囲、例えば２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８又は４．９モル、特に４．７である。１つの態様において、尿素の濃度は、５モル未満である。
１つの態様において、尿素の濃度は、３〜５Ｍの範囲であり、還元剤は、１０〜１５０ｍＭの範囲の濃度の２−メルカプトエチルアミンである。１つの態様において、尿素の濃度は、３〜５Ｍの範囲であり、還元剤は、５０〜１５０ｍＭの範囲の濃度の２−メルカプトエチルアミンである。１つの態様において、尿素の濃度は、３〜５Ｍの範囲であり、還元剤は、８０〜１５０ｍＭの範囲の濃度の２−メルカプトエチルアミンである。１つの態様において、尿素の濃度は、４〜５Ｍの範囲であり、還元剤は、８０〜１５０ｍＭの範囲の濃度の２−メルカプトエチルアミンである。１つの態様において、尿素の濃度は、４．５〜４．９Ｍの範囲であり、還元剤は、９５〜１３５ｍＭの範囲の濃度の２−メルカプトエチルアミンである。１つの態様において、尿素の濃度は、４．７Ｍであり、還元剤は、１１５ｍＭの濃度の２−メルカプトエチルアミンである。
１つの態様において、ステップａ）の変性剤は、塩酸グアニジン（グアニジンとも呼ばれる）である。１つの態様において、グアニジンの濃度は、１．０〜２．５Ｍ、１．０〜２．０Ｍ，０．５〜１．５Ｍ、例えば１．０Ｍから選択される。
１つの態様において、グアニジンの濃度は、０．５〜１．５Ｍの範囲であり、還元剤は、１０〜１５０ｍＭの範囲の濃度の２−メルカプトエチルアミンである。１つの態様において、グアニジンの濃度は、０．５〜１．５Ｍの範囲であり、還元剤は、１０〜５０ｍＭの範囲の濃度の２−メルカプトエチルアミンである。１つの態様において、グアニジンの濃度は、１．０Ｍであり、還元剤は、１０ｍＭの濃度の２−メルカプトエチルアミンである。
１つの態様において、尿素及びグアニジンの両方を、上記の特定の濃度でステップａ）において変性剤として一緒に使用する。あるいは、尿素又はグアニジンのいずれかを、ステップａ）において変性剤として使用する。
１つの態様において、還元剤を、尿素、グアニジン又はそれらの組み合わせを添加する前に、組換え抗体分子組成物に添加する。
１つの態様において、ステップａ）は、還元剤との処理後に実施され得る。この態様において、還元剤は、変性剤での処理の間に組成物中に残ってもよく、又は還元剤が、ステップａ）の前に除去される。還元剤が強ければ強いほど、前処理ステップに適する可能性が高く、ステップａ）の前に除去される可能性が高い。したがって、１つの態様において、還元剤が、亜リン酸、ＤＤＴ、ＴＣＥＰ及びＴＨＰから選択され、還元剤は、ステップａ）の前に除去される。必要な場合、還元剤は、透析ろ過などを含む所定の技術によって、ステップａ）の前に除去され得る。
あるいは、還元剤は、ステップａ）の変性剤で処理中に組成物中に残存し、これは、グルタチオン、メルカプトエタノール（２−メルカプトエタノールなど）、メルカプトエチルアミン（２−メルカプトエチルアミンなど）及びシステイン（システイン−ＨＣｌなど）から選択される還元剤など単一のチオール基を含む還元剤に特に有用である。
１つの態様において、還元剤は、尿素、グアニジン又はそれらの組み合わせの添加後、組換え抗体分子組成物に添加される。
１つの態様において、還元剤は、尿素、グアニジン又はそれらの組み合わせの添加と同時に、組換え抗体分子組成物に添加される。
上記態様において、還元剤は、ステップａ）の変性剤との処理前に添加され、ステップａ）の変性剤との処理中に組成物中に残るか、又は変性剤を添加後に添加されるか、又は変性剤と同時に添加され、還元剤は、透析ろ過などを含む所定の技術によってステップａ）中又は後に除去され得る。
１つの態様において、方法は、尿素及び／又はグアニジンを除去するさらなるステップを含む。
１つの態様において、尿素及び／又はグアニジンの除去後、方法は、抗体中の１つ以上のジスルフィド結合を改質するために、ステッププａ）の後に組成物を酸化条件に供するさらなるステップを含む。この態様は、亜リン酸、ＤＤＴ、ＴＣＥＰ又はＴＨＰなどの還元剤が使用される場合に有益であり得る。あるいは、方法は、ステッププａ）の後に組成物を酸化条件に供するステップを含まない。グルタチオン、メルカプトエタノール（２−メルカプトエタノールなど）、メルカプトエチルアミン（２−メルカプトエチルアミンなど）及びシステイン（システイン−ＨＣｌなど）などの単一のチオール基を含む還元剤が使用される場合に、酸化ステップは、特に必要ではない。
１つの態様において、方法が実施される温度は、周囲温度、例えば１５〜２５℃の範囲、例えば１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５℃である。適切には、方法は、１８〜２５℃、例えば１８〜２２℃の範囲で実施される。
本明細書中で用いられる範囲の温度は、組成物がプロセスの間にわたって同じ温度に保持されることを必ずしも意味しないが、組成物は、一般的には、方法が実施される期間中、記載された範囲の１つ以上の温度で保持される。処理中に温度がドリフトするか、又は範囲外にシフトする場合、コントローラは、所望の範囲内で組成物をもたらすステップをとるだろう。
本発明の方法において、変換ステップは、少なくとも５分、少なくとも１５分、又は少なくとも３０分間の期間、適切に実施される。１つの態様において、抗体分子組成物が本開示に従って処理される期間は、１〜７０時間、例えば２〜６０時間、例えば３〜５０時間、３〜１０時間、４〜６時間、５〜６時間、４．５〜５．５時間の範囲、特に４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５時間である。１つの態様において、期間は、約４〜６時間、例えば４〜５時間又は５〜６時間である。
１つの態様において、本開示に係る方法は、１００〜１２００ｒｐｍの範囲、例えば１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００又は１２００ｒｐｍで撹拌する場合に、撹拌を含む。
１つの態様において、プロセスの１つ以上のステップは、３．５〜９の範囲、例えば、３．８、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５又は８のｐＨで実施される。アミノ酸が組成物中に存在する１つの態様において、組成物のｐＨは、本開示に係る処理の前に、ｐＨ調整剤、例えば、リン酸を用いて、ｐＨ７に調整される。ｐＨ調整のこのステップは、約ｐＨ１０の高ｐＨであり得るリジンが添加される場合、特に有利である。この態様において、ｐＨ７へのｐＨ調整ステップの使用は、組換えタンパク質の収率を改善する。１つの態様において、プロセスの１つ以上のステップは、３．５〜９の範囲、例えば、３．８、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５又は８のｐＨで実施される。
１つの態様において、組成物中の抗体分子の濃度は、１〜５ｇ／Ｌの範囲、例えば２〜４又は２〜３ｇ／Ｌ、特に２．７５ｇ／Ｌである。
１つの態様において、抗体分子組成物は、０．１Ｍ〜８Ｍの間の濃度で塩を含まない。
１つの態様において、本発明の方法を実施するためのロバストな条件は、周囲温度で４〜８時間、例えば６時間、特に約２．７５ｇ／Ｌの抗体濃度で、４．５〜４．９Ｍ尿素、９５〜１３５ｍＭβ−ｍｅａを含む。
１つの態様において、本発明の方法を実施するためのロバストな条件は、周囲温度で４〜８時間、例えば６時間、特に約２．７５ｇ／Ｌの抗体濃度で、４．５〜４．９Ｍ尿素、１１０〜１２０ｍＭβ−ｍｅａを含む。
１つの態様において、方法は、１１５ｍＭのβ−メルカプトエチルアミン及び４．７Ｍの尿素の存在下で、約２０〜２５℃の温度で、約６時間実施される。有利には、全抗体収率は、９３％と高くてもよく、その７６％以上は単量体である。
本明細書中で用いられる抗体分子は、抗体（すなわち、全抗体）又はその結合断片を指す。
用語「抗体」は、完全な（全）抗体（すなわち２つの重鎖及び２つの軽鎖のエレメント、全抗体又はその結合断片を含む）に関する。本明細書中で用いられる結合断片は、「全抗体」の完全長重鎖又は軽鎖を含まない１、２、３以上の結合部位を含む抗体様分子を指す。１つの態様において、結合断片は、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン（複数可）を含まない。抗体の結合断片は、一本鎖抗体（すなわち全長重鎖及び軽鎖）；;Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ 又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価又は四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記の任意のエピトープ結合断片（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ, ２００５年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ. ２３（９）：１１２６−１１３６； Ａｄａｉｒ及びＬａｗｓｏｎ, ２００５, Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ − Ｏｎｌｉｎｅ ２（３）, ２０９−２１７参照）、例えばＷＯ２００９／０４０５６２に開示されるＦａｂＦｖフォーマット及びＷＯ２０１０／０３５０１２に開示されるそのジスルフィド安定化バージョンを含む。本明細書中で使用される用語「Ｆａｂ断片」は、ＶＬ（可変軽鎖）ドメイン及び軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）、及びＶＨ（可変重鎖）ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む軽鎖断片を含む抗体断片を指す。
抗体断片を作製し製造するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら, １９９８年, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５−１８１参照）。本開示において使用のための他の抗体断片は、ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されるＦａｂ及びＦａｂ’断片を含む。
典型的なＦａｂ’分子は、重鎖が可変領域ＶＨ、定常ドメインＣＨ１及びヒンジ領域を含み、軽鎖が、可変領域ＶＬ及び定常ドメインＣＬを含む重及び軽鎖対を含む。１つの態様において、Ｆａｂ’の二量体が提供され、例えば二量体化は、ヒンジを介し得る。
１つの態様において、組換え発現された抗体分子は、多重特異性抗体分子、例えば二重特異性抗体又は三重特異性抗体である。本明細書中で使用される「二重特異性分子」は、同じ又は異なる抗原を結合し得る２つの抗原結合部位を有する分子を指す。本明細書中で使用される「三重特異性分子」は、同じ又は異なる抗原を結合し得る３つの抗原結合部位を有する分子を指す。本明細書中で使用される「多重特異性抗体」は、２つ以上の結合ドメイン、例えば２又は３つの結合ドメインを有する本明細書中に記載される抗体分子を指す。１つの態様において、ドメインは全て、抗原上の同じエピトープに結合すること、又は抗原上の異なるエピトープに結合することを含む、同じ抗原に結合する。
本明細書中で用いられる「抗原結部位」は、分子の部分を指し、これは、可変領域の対、特に同族対を含み、標的抗原と特異的に相互作用する。結合部位、抗原結合部位、結合ドメインは、文脈がそうでないことを示さない限り、本明細書中で互換的に用いられる。
したがって、１つの態様において、抗体分子は、結合ドメインを含む。結合ドメインは、重鎖由来の３つ及び軽鎖由来の３つの６つのＣＤＲを含む。１つの態様において、各鎖由来の３つのＣＤＲは、フレームワークにあり、そのフレームワークと一緒になって可変領域を形成する。したがって、１つの態様において、抗体分子は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む抗原に対して特異的な結合ドメインを含む。本明細書中で用いられる活性断片は、結合断片と同義である。
本明細書中で用いられる「特異的に」は、それが特異的である抗原を認識するだけの抗原結合部位、又は例えば、５、６、７、８、９、１０倍高い結合親和性である非特異的である抗原に対する親和性と比較して特異的である抗原に対して有意により高い結合親和性を有する結合部位を指すことを意図される。結合親和性は、標準的なアッセイ、例えばＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴によって測定され得る。
抗体可変ドメイン中の残基は、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従って通常通り番号が付けられている。このシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ, ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ, ＮＩＨ, ＵＳＡ（米国国立衛生研究所、ＮＩＨの免疫学的タンタンパク質の配列）（以下、「Ｋａｂａｔら（上記参照）」）に記載される。この番号付けシステムは、別段の記載がある場合を除いて、本明細書中で使用される。
Ｋａｂａｔ残基の指定は、必ずしもアミノ酸残基の直線的な番号付けに直接対応するとは限らない。実際の線状アミノ酸配列は、基本可変ドメイン構造のフレームワーク又は相補性決定領域（ＣＤＲ）であろうとなかろうと、構造成分の短縮、又は挿入に対応する厳密なＫａｂａｔ番号付けよりも少ない又はさらなるアミノ酸を含み得る。残基の正しいＫａｂａｔの番号付けは、「標準的な」Ｋａｂａｔの番号付けされた配列との抗体の配列において、相同性の残基の配列によって与えられる抗体について決定され得る。
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けに従って残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａ （Ｃｈｏｔｈｉａ, Ｃ. ａｎｄ Ｌｅｓｋ, Ａ.Ｍ. Ｊ. Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ., １９６, ９０１−９１７ （１９８７年））によれば、ＣＤＲ−Ｈ１に相当するループは、残基２６〜残基３２に及ぶ。したがって、特に別に記載しない限り、本明細書中で用いられる「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔの番号付けシステム及びＣｈｏｔｈｉａのトポロジーループ定義との組み合わせによって記載されるように、残基２６〜３５を指すことが意図される。
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔの番号付けに従って残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。
本発明の方法において、抗体は、目的の抗原に対する特異性を有する少なくとも１つのＦｖ（ＶＨ／ＶＬ対）を含み、前記ＶＨ及びＶＬは、１つ以上のリンカーを介して直接的又は間接的に結合され、それらの間のジスルフィド結合によって安定化される。
１つの態様において、抗体又はその結合断片は、例えば、ジスルフィドが重鎖と軽鎖の間のような鎖間ジスルフィド結合及び／又は２つの重鎖の間のヒンジ領域である場合、さらなるジスルフィド結合を含む。
１つの態様において、組換え発現された抗体分子は、１つ以上、例えば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのジスルフィド結合を含む。１つの態様においで、ジスルフィドは、天然に存在する。１つの態様において、１つ以上のジスルフィドは、特定の位置にあるように操作される。１つの態様において、少なくとも１つの天然に存在するジスルフィド結合及び少なくとも１つの操作されたジスルフィド結合がある。本明細書中で用いられる操作されたジスルフィド結合は、ジスルフィド結合中の一方又は両方の硫黄が、組換え遺伝子工学技術によって導入された場所を指す。
ＶＨとＶＬの間のジスルフィド結合の位置は、限定されない。可変ドメイン中のジスルフィド結合の位置の例としては、以下を含む群から選択される位置を含むが、これらに限定されない：
・ＶＨ３７ ＋ ＶＬ９５Ｃ、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６, ７８１−７８８ Ｚｈｕら（１９９７年）参照；
・ＶＨ４４ ＋ ＶＬ１００、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３ ５４５１−５４５９ Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４年）；又はＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ. ２６９ Ｎｏ. ２８ ｐｐ.１８３２７−１８３３１ Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４年）；又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, ｖｏｌ.１０ ｎｏ.１２ ｐｐ.１４５３−１４５９ Ｒａｊａｇｏｐａｌら（１９９７年）参照；
・ＶＨ４４ ＋ ＶＬ１０５、例えば、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ. １１８, ８２５−８３１ Ｌｕｏら（１９９５年）参照；
・ＶＨ４５ ＋ ＶＬ８７、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６, ７８１−７８８ Ｚｈｕら（１９９７年）参照；
・ＶＨ５５ ＋ ＶＬ１０１、例えば、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７７ １３５−１３９ Ｙｏｕｎｇら（１９９５年）参照；
・ＶＨ１００ ＋ ＶＬ５０、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９ １３６２−１３６７ Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら（１９９０年）参照；
・ＶＨ１００ｂ ＋ ＶＬ４９；
・ＶＨ９８ ＋ ＶＬ４６、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６, ７８１−７８８ Ｚｈｕら（１９９７年）参照；
・ＶＨ１０１ ＋ ＶＬ４６；
・ＶＨ１０５ ＋ ＶＬ４３、例えば、Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ Ｖｏｌ. ９０ ｐｐ.７５３８−７５４２ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら（１９９３年）；又は Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９, ３５−４７ Ｊｕｎｇら（１９９４年）参照；
・ＶＨ１０６ ＋ ＶＬ５７、例えば、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７７ １３５−１３９ Ｙｏｕｎｇら（１９９５年）参照
及び分子内に位置する可変領域対におけるそれに対応する位置（複数可）。
したがって、１つの態様において、本発明の可変ドメイン対は、ＶＨ中の１つ及びＶＬ中の１つの２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合によって結合されてもよく、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ１００ｂ及びＶＬ４９、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０１及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３並びにＶＨ１０６及びＶＬ５7からなる群から選択される。１つの態様において、ジスルフィド結合は、位置ＶＨ４４とＶＬ１００の間に形成される。
上記のアミノ酸対は、ジスルフィド結合が形成されることがきるようなシステインによって置換に寄与する位置にある。システインは、公知技術によってこれらの所望の位置に操作されることができる。したがって、１つの態様において、本開示に係る操作されたシステインは、与えられたアミノ酸位置で自然に存在する残基が、システイン残基で置換されている場合を指す。
操作されたシステインの導入は、当該分野で公知の任意の方法を使用して実施されることができる。これらの方法は、ＰＣＲ伸長重複突然変異生成、部位特異的突然変異生成又はカセット突然変異生成を含むが、これらに限定されない（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ, Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ, ＮＹ, １９８９年； Ａｕｓｂｅｌら, Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ, Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＆ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ, ＮＹ, １９９３年参照）。部位特異的突然変異生成キットは、市販されており、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標） Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ, Ｌａ Ｊｏｌｌａ, ＣＡ）である。カセット突然変異生成は、Ｗｅｌｌｓら, １９８５年, Ｇｅｎｅ, ３４：３１５−３２３に基づいて実施されることができる。あるいは、突然変異体は、アニーリング、ライゲーション及びＰＣＲ増幅及び重複オリゴヌクレオチドのクローニングによる全遺伝子合成によって作製されることができる。
一般的には、ＶＨ及びＶＬが、１つ以上のリンカーを介して直接的又は間接的に結合され、それらの間のジスルフィド結合によって安定化されるＶＨ／ＶＬ対は、抗原結合部位を形成し、共同的に抗原に結合する相補的なＶＨ／ＶＬ対、すなわち、同じ抗原に対する親和性を有し、共同的に抗原に結合する相補的なＶＨ／ＶＬ対である。典型的には、それらは、同じ抗体に由来するＶＨ／ＶＬ対、例えば、宿主によってインビボで生成される抗体である。本明細書中で用いられる共同的な結合抗原は、可変領域が共に標的抗原を特異的に結合することを指す。
１つの態様において、抗体は、ＶＨは、Ｃ末端で重鎖定常ドメインＨ１に融合されず、ＶＬは、Ｃ末端で軽鎖定常領域ＣＬ（Ｃκ又はＣλ）に融合されない少なくとも１つのＦｖを含む。
ＶＨ及びＶＬドメインは、相互作用を形成することができ、これは、他の抗体分子中のＶＨ又はＶＬドメインとの相互作用を介して多量体形成を生じる。
Ｆｖにおいて、ＶＨ及びＶＬドメインは、１つ以上のさらなる分子にリンカーを介して互いに直接的に、又はリンカーを介して間接的に結合され得る。ＶＨとＶＬの間の結合は、別の分子中の前記ＶＨがＶＬとの対合する場合のような所定のＶＨ及びＶＬ対の間の関係を固定するか、又は規定し、元のＶＨとＶＬの間の関係が結合の存在によって維持されるので、多量体が形成される。
対照的に、ＶＨ及びＶＬドメインが１つ以上のリンカーによって結合されないＦｖにおいて、ドメインは、「離散」（呼吸とも呼ばれる）することができ、可変ドメインの１つが元のペアリングからではなく（しかしそれが置換する元の可変領域として同じ配列を有する）場合、次に分子は、単量体としてのみ改質されるだろう。
本発明でいうリンカーは、好ましくはジスルフィド結合ではない。抗体での使用に適したリンカーは、当該技術分野で周知である。リンカーは、１つ以上のアミノ酸を含み得る。さらなる態様において、リンカーは、２〜４０個のアミノ酸、例えば２〜３０個、２〜２０個又は２〜１０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーである。ペプチドリンカーの例は、以下に開示されるものを含む。
１つの態様において、リンカーは、配列３９〜９０で示される配列から選択される。


（Ｓ）は、配列５０〜５４で任意である。
剛性リンカーの例は、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号８９）、ＰＰＰＰ（配列番号９０）及びＰＰＰを含む。
本発明の１つの側面において、Ｆｖは、単一のリンカーによって直接的に結合されるＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。ＶＨドメイン及びＶＬフォメインを直接的に結合するための適切なリンカーは、上記に記載される。
１つの態様において、ＶＨ及びＶＬは、ＶＨ及びＶＬ可変ドメイン間のペプチドリンカー及び前記ＶＨとＶＬの間のドメイン間のジスルフィド結合との一本鎖可変断片である分子であるｄｓｓｃＦｖ分子とも呼ばれるジスルフィド安定化一本鎖可変断片を形成する。
この態様において、ｄｓｓｃＦｖ分子は、１つ以上のさらなる分子、好ましくは第２の抗体又はその結合断片に融合されて、二価、三価又は四価の抗体を形成し得る。ｄｓｓｃＦｖは、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン又はＶＨとＶＬの両方に位置し得る１つ以上のリンカーを介して１つ以上のさらなる分子に融合される。例えば、１つ以上のｄｓｓｃＦｖ分子は、抗体全体又はその結合断片の１つ以上の鎖のＣ末端又はＮ末端に融合され得る。例えば、２つ以上のｄｓｓｃＦｖ分子は、ダイアボディ、タンデムｓｃＦｖ（ｂｉｓ−ｄｓｓｃＦｖ）又はミニボディを形成して一緒に融合され得る。
Ｆｖ領域を介して多量体化する傾向を有し得る抗体フォーマットは、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、タンデムｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ−Ｆｃ、ｓｃダイアボディＣＨ３、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、ツーインワンＩｇＧ、二重Ｖ ドメインＩｇＧ、ＩｇＧ−Ｖ 及びＶ−Ｉｇを含む。ジスルフィド結合が、これらの構築物を安定するＦｖ又はｓｃＦｖで用いられる場合、次に、得られる単量体の収率を改善する本発明の方法を使用することが有益であり得る。
本発明のさらなる側面において、各ＶＨ及びＶＬは、第２の分子を介してＶＨ及びＶＬを間接的に結合するリンカーを含む。この側面において、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、別個のリンカーを介して第２の分子に結合される。各可変ドメインを第２の分子に結合するのに適したリンカーは、上記に記載される。第２の分子は、ＶＨとＶＬの間の間接的な結合を提供する。各ＶＬ及びＶＨは、ＶＨ及びＶＬドメインが共同的に標的抗原に結合することを可能にするために、適切な位置で第２の分子に結合される。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、ペプチド結合又はペプチドリンカーによって互いに直接的に結合されない。
この側面において、第２の分子は、好ましくは、二価、三価又は四価抗体を形成する第２抗体又はその結合断片である。１つの態様において、ＶＨ及びＶＬドメインは、抗体全体又はＦａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’又はＦ(ａｂ’)２を介して間接的に結合される。例えば、第２抗体がＦａｂである場合、ＶＨドメインは、第２抗体のＣＨ１などの重鎖定常領域のＣ末端に融合され得、ＶＬ単一ドメイン抗体は、第２抗体の軽鎖定常領域（Ｃκ又はＣλ）のＣ末端に融合され得、それによって、Ｆａｂ−ｄｓＦｖを形成する。Ｆａｂ−ｄｓＦｖ抗体は、ＷＯ２０１０／０３５０１２及びＷＯ２０１１／０３６４６０に詳細に記載され、両方は、参照により本明細書中に組み込まれる。
抗体は、例えば、ＷＯ２０１１／１１７６５３に開示されるジスルフィド安定化ＤＶＤ−Ｉｇ分子、又はＷＯ２０１１／０３０１０７に記載されるいわゆる（ＦａｂＦｖ）２Ｆｃごとのようなさらなる結合ドメインを含み得、それぞれは、参照により本明細書中に組み込まれる。したがって、本明細書中で用いられる抗体は、二価、三価又は四価抗体を含む。
本発明の方法で用いられ得る他の適切な抗体フォーマットは、ＦａｂＦｖＦｃ及び（ＦａｂＦｖ）２Ｆｃ抗体を開示するＷＯ２０１１／０３０１０７、ＰＥＧにコンジュゲートされるＦａｂ−ｄｓＦｖ抗体を開示するＷＯ２０１１／０６１４９２及びＦａｂ−ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖを開示するＷＯ２０１１／０８６０９１に記載され、それぞれが参照により本明細書中に組み込まれ、ジスルフィド結合は、Ｆｖ又はｓｃＦｖで用いられる。
単量体の収率を改善するために本発明の方法で用いられ得る他の適切な抗体フォーマットは、ＷＯ２０１５／１９７７７２に開示され、参照により本明細書中に組み込まれ、これは、以下を含むか、又は以下からなる多重特異性抗体分子を開示する：
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖；及び
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖；
ここで、ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は、重鎖定常領域、例えばそのドメイン１を表し；
Ｘは、結合又はリンカーを表し；
Ｙは、結合又はリンカーを表し；
Ｖ１は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し；
ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬは、軽鎖定常領域由来のドメイン、例えばＣκを表し；
Ｖ２は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し、
ここで、Ｖ１及びＶ２の少なくとも１つは、ｄｓｓｃＦｖである。
本明細書中で用いられる「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の可変ドメインの間のペプチドリンカーによって安定化される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むか、又はからなる一本鎖可変断片を指す。ＶＨ及びＶＬ可変ドメインは、任意の適切な配向性であり得、例えば、ＶＨのＣ末端は、ＶＬのＮ末端に結合され得るか、又はＶＬのＣ末端は、ＶＨのＮ末端に結合され得る。
本明細書中で用いられる「ジスルフィド安定化一本鎖可変断片」又は「ｄｓｓｃＦｖ」は、ＶＨとＶＬ可変ドメインの間のペプチドリンカーによって安定化される一本鎖可変断片を指し、ＶＨとＶＬの間のドメイン間ジスルフィド結合も含む。
本明細書中で用いられる「ジスルフィド安定化可変断片」又は「ｄｓＦｖ」は、ＶＨとＶＬの間のペプチドリンカーを含まない一本鎖可変断片を指し、ＶＨとＶＬの間のドメイン間ジスルフィド結合によって代わりに安定化される。
本明細書中で用いられる「単一ドメイン抗体」又は「ｄｓＡｂ」は、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨなどの単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を指す。
抗体フォーマットの例を、図１８に示す。
１つの態様において、Ｖ１及びＶ２の両方は、ｄｓｓｃＦｖであり、この抗体フォーマットは、本明細書中でＦａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖとも呼ばれ得る。ＶＨ及びＶＬ可変ドメインは、任意の適切な配向性であり得、例えば、ＶＨのＣ末端は、ＶＬのＮ末端に結合され得るか、またＶＬのＣ末端は、ＶＨのＮ末端に結合され得る。
単量体収率を改善するために本発明の方法で用いられ得る他の適切な抗体フォーマットは、参照により本明細書中に取り込まれるＷＯ２０１３／０６８５７１の例４に記載され、これはＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ抗体フォーマットを開示する。抗体フォーマットの例を、図１９に示す。
１つの態様において、抗体は、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含まない。
１つの態様において、抗体断片は、例えば、それぞれが参照により本明細書中に取り込まれるＷＯ２０１０／０３５０１２及びＷＯ２０１１／０３６４６０に開示されるように、いわゆるＦａｂ−ｄｓＦｖフォーマットである。
１つの態様において、抗体は、ＷＯ２０１１／１１７６４８に開示されるようなジスルフィド安定化Ｆａｂである。１つの態様において、抗体は、ＷＯ２０１１／１１７６４８に開示されるようなジスルフィド安定化Ｆａｂではない。
１つの態様において、抗体は、ＯＸ４０に特異的な結合ドメインを含む。
１つの態様において、抗体は、血清アルブミンに特異的な結合ドメインを含む。
１つの態様において、抗体は、ＯＸ４０に特異的な結合ドメイン及び血清アルブミンに特異的な結合ドメイン、特にＦａｂ−ｄｓＦｖフォーマットを含み、例えば血清アルブミン結合ドメインは、Ｆｖタンパク質、特にＯＸ４０に特異的な二重特異性抗体Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖ及び本明細書中に参照によって取り込まれるＷＯ２０１３／０６８５６３に開示されるヒト血清アルブミンである。
本開示は、ヒトＯＸ４０及びヒト血清アルブミンに結合する二重特異性抗体融合タンパク質であって：
Ｎ末端からの配列において、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、ＣＨ１ドメイン及び第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）を含む重鎖；
Ｎ末端からの配列において、第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、ＣＬドメイン及び第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含む軽鎖を含み、
ここで前記重鎖及び軽鎖は、ＶＨ１及びＶＬ１が第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２及びＶＬ２は、第２の抗原結合部位を形成するように配列され、
第１の抗原結合部位によって結合される抗原は、ヒトＯＸ４０であり、第２の抗原結合部位によって結合される抗原は、ヒト血清アルブミンであり、特に
重鎖の第１の可変ドメイン（ＶＨ１）は、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列暗号２で示される配列及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３で示される配列を含み、軽鎖の第１の可変ドメイン（ＶＬ１）は、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６で示される配列を含み、
第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）は、配列番号１１で示される配列を有し、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、配列番号１２で示される配列を有し、及び
第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）及び第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、ジスルフィド結合によって結合される。
１つの態様において、ＣＨ１ドメインと第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の間にペプチドリンカーがある。１つの態様において、ＣＬドメインと第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の間にペプチドリンカーがある。１つの態様において、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）は、配列番号８で示される配列を含む。１つの態様において、第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）は、配列番号７で示される配列を含む。１つの態様において、重鎖は、配列番号１５で示される配列を含むか、又はからなる。１つの態様において、軽鎖は、配列番号１６で示される配列を含むか、又はからなる。
１つの態様において、抗体分子は、血清アルブミン結合ドメインを含み、例えば、配列番号２９又は３０で示される可変領域由来の１、２又は３つの重鎖ＣＤＲ、配列番号３１又は３２で示される可変領域由来の１、２、又は３つの軽鎖ＣＤＲ、特に配列番号２９又は３０で示される可変領域由来の３つの重鎖ＣＤＲ、例えばＣＤＲＨ１についてＣＤＲＨ１、ＣＤＨ２についてＣＤＲＨ２、ＣＤＨ３についてＣＤＲＨ３及び配列番号３１又は３２に示される可変領域由来の３つの軽鎖ＣＤＲ、例えばＣＤＲＬ１についてＣＤＲＬ１、ＣＤＬ２についてＣＤＲＬ２、ＣＤＬ３についてＣＤＲＬ３を含む。
１つの態様において、抗体分子は、配列番号３０に示される重鎖可変領域を含む。１つの態様において、抗体分子は、配列番号３２に示される軽鎖可変領域を含む。１つの態様において、抗体分子は、配列番号３０に示される重鎖可変領域及び配列番号３２に示される軽鎖可変領域を含む。
１つの態様において、重鎖は、配列番号１５又は１９を含むか、又はからなる。１つの態様において、軽鎖は、配列番号１６又は２０を含むか、又はからなる。１つの態様において、結合断片抗体分子は、配列番号１５及び１６、１５及び２０、１６及び１９又は１９又は２０を含む。したがって、１つの態様において、ヒトＯＸ４０及びヒト血清アルブミンに結合する二重特異性抗体融合タンパク質が提供され、重鎖は、配列番号１５で示される配列を含み、軽鎖は、配列番号１６で示されるは配列を含む。
１つの態様において、Ｆａｂ−ｄｓＦｖフォーマットなどの抗体分子は、参照により本明細書中に取り込まれるＷＯ２０１４／０１９７２７に開示されるものである。
１つの態様において、抗体分子は、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメイン、特に参照により本明細書中に取り込まれるＷＯ２０１３／０６８５７１に開示されるＣＤＲ又は可変領域を含む。
１つの態様において、本開示に係る抗体又は断片は、モノクロナールである。モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ, Ｎａｔｕｒｅ, １９７５年, ２５６, ４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら, Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ, １９８３年, ４, ７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら, “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”, ｐｐ. ７７−９６, Ａｌａｎ Ｒ. Ｌｉｓｓ, Ｉｎｃ., １９８５年）などの技術分野で公知の任意の方法によって調製され得る。
本開示の方法で用いられる抗体分子はまた、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ, Ｊ.ら, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ, １９９６年, ９３（１５）, ７８４３−７８４８、ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８及びＷＯ２００４／１０６３７７によって記載される方法によって、特異的抗体の生産のために選択される単一リンパ球から生じる免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニング及び発現することによって単一リンパ球抗体法を使用して生成され得る。
ヒト化抗体分子は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び非ヒト種由来の１つ以上のドナー残基を任意に含むヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する非ヒト種由来の抗体分子である（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９参照）。１つの態様において、本開示の方法に供される抗体分子は、ヒト化される。
本発明の方法で用いられる抗体はまた、当該技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使用して生成されることができ、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５年、１８２、４１−５０； Ａｍｅｓら、Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５年、１８４、１７７−１８６；ＫｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈらＥｕｒ. Ｊ. Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９４年、２４、９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ, １９９７年 １８７、９−１８；及び Ｂｕｒｔｏｎら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４年、５７、１９１−２８０； ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；及びＷＯ９５／２０４０１；及びＵＳ５，６９８，４２６；ＵＳ５，２２３，４０９；ＵＳ５，４０３，４８４；ＵＳ５，５８０，７１７、ＵＳ５，４２７，９０８；ＵＳ５，７５０，７５３；ＵＳ５，８２１，０４７；ＵＳ５，５７１，６９８；ＵＳ５，４２７，９０８；ＵＳ５，５１６，６３７；ＵＳ５，７８０，２２５；ＵＳ５，６５８,７２７；ＵＳ５，７３３，７４３；及びＵＳ５，９６９，１０８によって開示されるものを含む。
トランスジェニックマウス、又は他の哺乳動物を含む他の生物も、例えばファージ技術を使用して、ヒト化抗体を作製するために使用され得る。
完全ヒト抗体は、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）がすべてヒト起源であるか、又は必ずしも同じ抗体由来でないヒト起源の配列に実質的に同一である抗体である。完全ヒト抗体の例は、例えば、ＥＰ０５４６０７３、ＵＳ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０, ４２９、ＥＰ ０４３８４７４及びＥＰ０４６３１５１に一般的用語で記載されるように、例えば、上記のファージディスプレイ方法によって産生される抗体、及びマウス免疫グロブリン可変領域及び／又は定常領域遺伝子がそれらのヒト対応物によって置換されたマウスによって産生される抗体を含み得る。
本発明の方法において使用するための抗体物質は、抗体可変領域及び定常領域（複数可）をコードするＤＮＡの操作及び再発現を含む組換えＤＮＡ技術の使用によって調製され得る。標準的な分子生物技術を使用して、所望のアミノ酸又はドメインを修正、付加又は削除し得る。可変領域又は定常領域への任意の変更は、本明細書中で使用される用語「可変」及び「定常」領域によって依然として包含される。
抗体出発物質は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含む任意の種から得られ得る。抗体の部分は、１つ以上の種から得られ、例えば、抗体は、キメラであり得る。１つの例において、定常領域は、１つの種に由来し、可変領域は、別の種に由来する。抗体出発物質は、修飾され得る。別の例において、抗体の可変領域は、組換えＤＮＡ工学技術を使用して作製されている。そのような操作されたバージョンは、例えば天然抗体のアミノ酸配列の挿入、削除又は変更によって天然抗体可変領域から作製されるものを含む。このタイプの特定の例は、少なくとも１つのＣＤＲ、及び任意に、１つの抗体由来の１つ以上のフレームワークアミノ酸及び第２抗体由来の可変領域ドメインの残りを含む操作された可変領域ドメインを含む。これらの抗体を作製し、製造するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｂｏｓｓら、ＵＳ４，８１６，３９７；Ｃａｂｉｌｌｙら、ＵＳ６，３３１，４１５；Ｓｈｒａｄｅｒら、ＷＯ９２／０２５５１；Ｗａｒｄら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４；Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９年、Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ. ＵＳＡ, ８６, ３８３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３２２、３２３；Ｂｉｒｄら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３；Ｑｕｅｅｎら、ＵＳ５，５８５，０８９；Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ及びＡｄａｉｒ、１９９２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｇｅｎｅｔ. Ｅｎｇ. Ｒｅｖ、１０、１−１４２；Ｖｅｒｍａら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５−１８１参照）。
１つの態様において、抗体は、同族対である結合ドメインを形成する可変ドメイン対を含む。本明細書中で用いられる同族対は、可変ドメインの天然対、すなわち単一の抗体又は抗体発現細胞から単離されるものを指すことが意図される。可変ドメインは、最適化及び／又はヒト化され得る。同族対由来の最適化／ヒト化可変ドメインは、依然として最適化／ヒト化後も同族対と考えられるだろう。
したがって、本開示は、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体分子を本明細書中に開示される方法に供することに及ぶ。
１つの態様において、抗体分子は標的抗原を特異的に結合する。本明細書中で用いられるように、特異的に結合するは、（それが特異的である）標的抗原又はリガンドに対して高い親和性を有する分子を指し、これは、低い又は非常に低い親和性（又は全くない）で特異的でない抗原又はリガンドを結合する。親和性を測定する方法は、当業者に公知であり、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）などのそのようなアッセイを含む。
抗体は、任意の標的抗原に対して特異的であり得る。抗原は、細胞関連タンパク質、例えば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、上皮細胞又は腫瘍細胞などの細胞表面タンパク質であり得るか、又は可溶性タンパク質であり得る。目的の抗原はまた、疾患又は感染の間にアップレギュレートされるタンパク質、例えば、レセプター及び／又はそれらの対応するリガンドなどの任意の医学的に関連するタンパク質であり得る。細胞表面タンパク質の特定の例は、接着分子、例えば、β１インテグリンなどのインテグリン、例えばＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン又はＬ−セレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＣＳＦ１又はＣＳＦ１−レセプター、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、ｄｕｄｕｌｉｎ２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、がん胎児性抗原 （ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、 ＫＤＲ及びＶＥＧＦ、ＰＤ−１、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＴＬ１Ａ、ＤＲ３、ＩＬ−７レセプターＡ及び適切な場合、それらのレセプターを含む。
可溶性抗原は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６又はＩＬ１７Ａ及び／又はＩＬ１７ＦなどのＩＬ−１７などのインターロイキン、ウイルス抗原、例えば、呼吸器合胞体ウイルス又はサイトメガロウイルス抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγなどのインターフェロン、腫瘍壊死因子ＴＮＦ（以前は腫瘍壊死因子αとして公知であり、本明細書中にＴＮＦ又はＴＮＦαとして言及される）、腫瘍壊死因子−β、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、及びＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−βなどの血小板由来成長因子、ＷＩＳＰ−１及び適切な場合は、そのレセプターを含む。他の抗原は、細菌細胞表面抗原、細菌毒素、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、Ｂ及びＣなどのウイルス、バイオテロ剤、放射性核種及び重金属、及びヘビ及びクモ毒液及び毒素を含む。
１つの態様において、方法は、ヒトへの投与に適した標準に抗体分子を精製し、次いでそれを製剤化するステップをさらに含む。
本明細書中に記載される方法を用いて精製される抗体分子は、高い結合親和性、特にナノモル又はピコモルを有する。
親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）を含む当該技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して測定され得る。１つの態様において、抗体又は結合断片は、約１００ｐＭ以上、例えば約５０ｐＭ以上、例えば約４０ｐＭ以上、特に３０ｐＭ以上の結合親和性を有する。１つの態様において、抗体又は結合断片は、完全にヒト又はヒト化され、約１００ｐＭ以上の結合親和性を有する。
本明細書中で用いられる天然に存在するドメインの誘導体は、例えばドメインの特性を最適化するために、望ましくない特性を排除することによってなど、天然に存在する配列中の１、２、３、４又は５個のアミノ酸が、置換又は欠失されている場合を指すことが意図され、ドメインの特徴付け機能（複数可）は保持される。
抗体が様々な翻訳後修飾を受け得ることが当業者によっても理解されるだろう。これらの修飾のタイプ及び程度は、分子を発現するために使用される宿主細胞株並びに培養条件にしばしば依存する。そのような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化のバリエーションを含み得る。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基（リジン又はアルギニンなど）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ、ＲＪ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ７０５：１２９−１３４、１９９５年に記載される）。これらの翻訳後変化は、分子の性質に影響を及ぼすことができ、したがって下流処理に影響を与える。
１つの態様において、本開示の方法で用いられる抗体組成物は、例えば２５ｍＭの濃度で酢酸ナトリウムを含まない。１つの態様において、本開示の方法で用いられる抗体組成物は、例えば２５ｍＭの濃度で塩化ナトリウムを含まない。
１つの態様において、本開示に係る変換ステップは、清澄化された上清に対して実施される。上清は、任意の適切な手段、例えば、遠心分離、ろ過などによって清澄化され得る。１つの態様において、上清は、０．２２ミクロンろ過を用いて清澄化される。
１つの態様において、プロテインＡクロマトグラフィーのステップは、熱変換ステップ前の上清について実施される。プロテインＡ精製は、この技術は、多量体をモノマーから分離することができるので、本明細書中で開示される抗体分子（特にＣＨ２ＣＨ３ドメインを含まないもの）のタイプの文脈において特に有利である。
プロテインＡクロマトグラフィーの使用は、単量体形態のＦｃ領域を含まないヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を回収するために使用されることができる。アビディティ効果が、ヒトＶＨ３ドメインとプロテインＡの結合の間で観察されている。この発見は、Ｆｃ領域とプロテインＡの間の相互作用について記載されておらず、抗体の単量体形態及び多量体形態を含む混合物からの単量体ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体の回収を可能にすることを考えると、驚くべきことである。
したがって、プロテインＡ精製のステップは、次のステップを含む：ａ）単量体形態又は多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を含む混合物をプロテインＡクロマトグラフィー材料に適用するステップ、ここで、前記プロテインＡは、前記抗体がプロテインＡに結合することを可能にする条件下で、ドメインＤ及び／又はＥを含み、及びｂ）多量体形態中のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体を回収するステップ、ここで、ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体は、Ｆｃ領域を含まない。あるいは、プロテインＡ精製のステップは、次のステップを含む：ａ）単量体及び多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体をプロテインＡクロマトグラフィー材料に適用するステップ、ここで、前記プロテインＡは、ドメインＤ及び／又はＥを含み、ｂ）プロテインＡへの前記抗体の結合を可能にするステップ、ｃ）単量体形態の抗体の結合を選択的に破壊する溶出緩衝液を適用するステップ、ｄ）得られた溶出液を回収するステップ、及び任意に、ｅ）多量体形態の抗体の結合を破棄する第２の溶出緩衝液を適用し、この第２の溶出液を回収するステップ、ここでヒトＶＨ３ドメイン含有抗体は、Ｆｃ領域を含まない。１つの態様において、抗体は、ＯＸ４０及びＷＯ２０１３／０６８５６３に開示されるヒト血清アルブミンに特異的な抗体Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖであり、プロテインＡ精製は、上記のように実施され、ここで、ステップｃ）において、溶出緩衝液が、ｐＨ３．５〜ｐＨ４．２、好ましくは、ｐＨ３．６〜ｐＨ４．１、ｐＨ３．７〜ｐＨ４．０、好ましくはｐＨ３．８〜ｐＨ３．９又はｐＨ３を有し、単量体の結合を破壊し、任意のステップｅ）において、溶出緩衝液は、多量体形態中の抗体の結合を破壊するｐＨ３．５未満、好ましくはｐＨ３．４未満、好ましくはｐＨ２．８〜ｐＨ３．２、好ましくはｐＨ２．９〜ｐＨ３．１、好ましくはｐＨ３．０を有する。
あるいは、プロテインＡ精製のステップは、次のステップを含む：ａ）単量体形態及び多量体形態のヒトＶＨ３ドメイン含有抗体をプロテインＡクロマトグラフィー材料に適用するステップ、ここで、前記プロテインＡは、ドメインＤ及び／又はＥを含み、ｂ）多量体形態の抗体の結合を可能にするステップ、ｃ）流入において、単量体形態の抗体を回収するステップ、及び任意に、ｄ）多量体形態中の抗体の結合を選択的に破壊する溶出緩衝液を適用するステップ、及びｅ）ｄ）から生じる溶出液を回収するステップ、ｄ）；ここで、ヒトＶＨ３ドメイン含有抗体は、Ｆｃ領域を含まない。
別の態様において、プロテインＡクロマトグラフィーは、変換ステップ前に実施されない。
１つの態様において、方法は、さらなる下流処理ステップを含む。１つの態様において、方法は、下流精製のさらなるステップを含み、例えば、ここで、下流処理は、疎水性相互作用クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーステップを含む。
下流処理ステップは、少なくとも１つのステップは、尿素及び／又はグアニジン及び抗体分子をさらに精製する還元剤との処理を行った後、使用されることを意味する。下流処理の例は、１つ以上のクロマトグラフィー、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（陰イオン交換クロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィー）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、プロテインＡクロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムなど）などの親和性クロマトグラフィーを含む。ポリペプチド及びタンパク質の下流処理に用いられる技術は、当業者に周知である。
１つの態様において、下流処理は、クロマトグラフィーステップ、特にイオン交換クロマトグラフィーを含む。１つの態様において、方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーステップに続いて、陽イオン交換クロマトグラフィーステップ又はその逆を含む。１つの態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィーが使用される。１つの態様において、混合モードクロマトグラフィーが使用される。１つの態様において、複数のクロマトグラフィーステップが使用される。
１つの態様において、方法は、ウイルス不活性化ステップを含み、例えば、所定のｐＨ、例えば低いｐＨで、所定の期間、タンパク質を含む組成物を保持する。
１つの態様において、最終下流処理ステップは、透析ろ過ステップ及び緩衝液交換であり、タンパク質の最終貯蔵緩衝液及び濃度を提供する。
１つの態様において、下流処理は、変換ステップ前に上記にように、タンパク質Ａ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムなど）精製を含む。
１つの態様において、下流処理は、ウイルス不活性化ステップ、続いて限外ろ過よび緩衝液交換、次に続いて陰イオン交換クロマトグラフィー及び続いて陽イオン交換クロマトグラフィー及びウイルスろ過ステップをさらに含む。
１つの態様において、変換ステップに続く下流処理は、ウイルス不活性化ステップ、続いて限外ろ過及び緩衝液交換、次に続いて陰イオン交換クロマトグラフィー及び続いて陽イオン交換クロマトグラフィー及びウイルスろ過ステップを含む。
１つの態様において、下流処理は、ウイルス不活性化ステップ、続いて限外ろ過及び緩衝液交換、次に続いて陽イオン交換クロマトグラフィー及び続いて陰イオン交換クロマトグラフィー及びウイルスろ過ステップをさらに含む。
他の下流処理ステップは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）又は混合モードクロマトグラフィーを含む。
１つの態様において、最終下流処理ステップは、透析ろ過ステップ及び緩衝液交換であり、タンパク質の最終貯蔵緩衝液及び濃度を提供する。
１つの態様において、本明細書中で開示される方法は、精製単量体抗体分子を１つ以上のエフェクター分子にコンジュゲートさせるさらなるステップを提供する。エフェクター分子は、抗体分子に結合することができる単一の部分を形成するように結合される単一のエフェクター分子又は２つ以上のそのような分子を含み得る。
エフェクター分子に結合される抗体を得ることが望ましい場合、これは、抗体が直接的に又はエフェクター分子にカップリング剤を介して結合される標準的な化学的手順又は組換えＤＮＡ手順によって調製され得る。そのようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートさせる技術は、当該技術分野で周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編, １９８７年、ｐｐ. ６２３−５３；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２年 , Ｉｍｍｕｎｏｌ. Ｒｅｖ.、６２：１１９−５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８３、６７−１２３参照）。特定の化学的手順は、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６及びＷＯ０３０３１６８１に記載されるものを含む。あるいは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、例えばＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載されるような組換えＤＮＡ手順を使用して結合を達成され得る。
本明細書中で使用される用語エフェクター分子は、例えば、抗腫瘍薬、薬物、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体断片、合成又は天然に存在するポリマー、核酸及びその断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子及び蛍光化合物又はＮＭＲ又はＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物などのレポーター基を含む。
エフェクター分子の例は、細胞毒素又は細胞に有害な（例えば死滅させる）任意の薬剤を含む細胞障害性薬剤を含み得る。例は、コンブレタスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンギスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン及びそれらの類似体又はホモログを含む。
エフェクター分子はまた、代謝拮抗物質（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオルラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシンン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）、及び抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）を含むが、これらに限定されない。
他のエフェクター分子は、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化放射性核種、又はアルキルホスホオコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬物を含み得るが、これらに限定されない。
他のエフェクター分子は、タンパク質、ペプチド及び酵素を含む。目的の酵素は、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼを含むが、これらに限定されない。目的のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドは、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ，シュードモーナス外毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノーゲンアクチベーターなどのタンパク質、血栓剤又は血管新生阻害剤、例えば、アンギオスタチン又はエンドスタチン、又は、リンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファジコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）若しくは他の成長因子及び免疫グロブリンなどの生物反応修飾物質を含むが、これらに限定されない。
他のエフェクター分子は、例えば、診断で有用な検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子放出断層撮影に使用するため）、及び非放射性常磁性金属イオンを含む。一般的には、診断剤として使用のための抗体にコンジュゲートされることができる金属イオンについてＵＳ４，７４１，９００を参照されたい。適切な酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含み；適切な補欠分子族は、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンを含み；適切な蛍光物質は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド及びフィコエリトリンを含み；適切な発酵性物質は、ルミノールを含み；適切な生物発光物質は、ルフィフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含み；及び適切な放射性核種は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃを含む。
別の例において、エフェクター分子は、インビボで抗体の半減期を増加させ、及び／又は抗体の免疫原生を低下させ、及び／又は免疫系に対する上皮障壁を横切る抗体の送達を増強し得る。このタイプの適切なエフェクター分子の例は、ＷＯ０５／１１７９８４に記載されるもののようなポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はアルブミン結合化合物を含む。
エフェクター分子がポリマーである場合、それは、一般的には、合成又は天然に存在するポリマー、例えば、任意に置換された直鎖又は分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン又はポリオキシアルキレンポリマー又は分枝若しくは非分枝状多糖類、例えばホモ−又はヘテロ−多糖類であり得る。
上記合成ポリマー上に存在し得る特定の任意の置換基は、１つ以上のヒドロキシ基、メチル基又はメトキシ基を含む。
合成ポリマーの特定の例は、任意には、置換直鎖又は分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）又はそれらの誘導体、特に、任意には、置換ポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体を含む。特定の天然に存在するポリマーは、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はそれらの誘導体を含む。
本明細書中で使用される「誘導体」は、反応性誘導体、例えばマレイミドなどのチオール選択的反応性基を含むことが意図される。反応性基は、直接的に又はリンカーセグメントを介してポリマーに結合され得る。そのような基の残基はいくつかの場合、開示の抗体とポリマーの間の結合基として生成物の一部を形成するだろうことが理解されるだろう。
ポリマーのサイズは、所望に応じて変えることができるが、一般的には、５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば５０００〜４００００Ｄａ、例えば２００００〜４００００Ｄａの平均分子量範囲であるだろう。ポリマーサイズは、特に、例えば腫瘍などの特定の組織に局在する能力、又は循環半減期を延長する能力について生成物の意図された使用に基づいて選択され得る（評価のために、Ｃｈａｐｍａｎ、２００２年、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１−５４５参照）。したがって、例えば、生成物が循環を離れて組織を振盪することが意図される場合、例えば、腫瘍の治療での使用のために、例えば、約５０００Ｄａの分子量を有する低分子量ポリマーを使用することが有利であり得る。生成物が循環中に留まる用途について、例えば２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲の分子量を有する高分子量ポリマーを使用することが有利であり得る。
適切なポリマーは、例えば、ポリ（エチレングリコール）又は、特に、メトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体などのポリアルキレンポリマー、及び特に約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリアルキレンポリマーを含む。
１つの例において、本発明で使用する抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合される。１つの特定の例において、ＰＥＧ分子は、抗体中に存在する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ酸、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を介して結合され得る。そのようなアミノ酸は、抗体中に天然に存在し得るか、又は組換えＤＮＡ法を使用して抗体中に操作され得る（例えばＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ５，６６７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１参照）。１つの例において、本発明の分子は、エフェクター分子の結合を可能にするために、その重鎖のＣ末端への１つ以上のアミノ酸の付加である修飾抗体である。複数の部分は、２つ以上のＰＥＧ分子を結合するために使用されることができる。１つの態様において、ＰＥＧ分子は、軽鎖中のシステイン１７１に結合され、例えば、参照により本明細書中に組み込まれるＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい。
適切には、ＰＥＧ分子は、抗体に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合される。修飾された抗体に結合する各ポリマー分子は、抗体に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合され得る。共有結合は、一般的には、ジスルフィド結合、又は特に硫黄−炭素結合である。チオール基が、付着点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えば、マレイミドなどのチオール選択的誘導体及びシステイン誘導体が使用され得る。活性化されたポリマーは、上記のようなポリマー修飾抗体の調製で出発材料として使用され得る。活性化されたポリマーは、上記のようなポリマー修飾抗体の調製において出発物質として使用され得る。活性化されたポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えばイミドアセトアミド、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどのチオール反応性基を含む任意のポリマーであり得る。そのような出発物質は、商業的に入手可能であり得るか（例えばＮｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ., Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ, ＡＬ, ＵＳＡから）、又は従来の化学的手順を使用して商業的に利用可能な出発物質から調製され得る。特定のＰＥＧ分子は、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）を含む。
１つの態様において、本開示は、本明細書中に開示される方法から得られた又は得られ得る抗体分子に及ぶ。
１つの態様において、方法は、そのコンジュゲートされたバージョンを含む代表的な方法から得られた抗体分子をヒトでの使用に適した医薬製剤として製剤化するさらなるステップを含む。
したがって、本発明は、薬学的に許容可能な添加剤、希釈剤又は担体の１つ以上と一緒に、本発明の抗体を添加及び混合することを含む医薬組成物又は診断組成物の調製のための処理ステップも提供する。
本開示の方法から得られる抗体分子は、医薬組成物又は診断組成物中の唯一の活性成分であり得るか、又は他の抗体成分、例えば、抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１β、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ、又は抗ＬＰＳ抗体、又はキサンチンなどの非抗体成分によって達成され得る。他の適切な活性成分は、耐性を誘導することができる抗体、例えば、抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４抗体を含む。
さらなる態様において、本開示に係る抗体又は組成物は、さらなる薬学的に活性な薬剤、例えば、コルチコステロイド（例えば、プロピオン酸フルチカゾン）及び／又はβ２−アゴニスト（例えば、サルブタモール、サルメテロール又はフォルモテロール）又は細胞成長及び増殖の阻害剤（例えば、ラパマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサート）又は代替的なＣＤ２８及び／又はＣＤ４０阻害剤と組み合わせて用いられる。１つの態様において、阻害剤は、小分子である。１つの別の態様において、阻害剤は、標的に特異的な抗体である。
医薬組成物は、本発明の抗体の治療有効量を適切に含む。本明細書中に使用される用語「治療有効量」は、標的疾患又は状態を治療、改善又は予防するため、又は検出可能な治療若しくは予防効果を発揮するために必要な治療剤の量を指す。治療有効量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常は、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類のいずれかで最初に推定されることができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために使用され得る。そのような情報は、次に、ヒトにおける投与のための有用な用量及び経路を決定するために使用されることができる。
ヒト対象の正確な治療有効量は、疾患状態の重篤度、対象の一般的な健康状態、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ（複数可）、反応感受性及び治療に対する耐性／応答に依存するだろう。この量は、日常的な実験によって決定されることができ、臨床医の判断の範囲内である。一般的には、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇだろう。医薬組成物は、投与量当たり本発明の活性薬剤の所定量を含有する単位用量形態で都合よく提供され得る。
組成物は、患者に個々に投与され得るか、又は他の薬剤、薬物又はホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、逐次的に、又は別々に）投与され得る。
本発明の抗体が投与される用量は、治療される状態の性質、例えば、存在する疾患／炎症の程度、分子が予防的に使用されるか、又は既存の状態を治療するかに依存する。
用量の頻度は、抗体の半減期及びその効果の持続期間に依存するだろう。抗体が短い半減期（例えば、２〜１０時間）を有する場合、１日当たり１回以上の用量を与えることが必要であり得る。あるいは、抗体が長い半減期（例えば、２〜１５日）を有する場合、１日１回、１週間に１回、又は１日又は２ヶ月ごとに１回の用量を与える必要があり得る。
薬学的に許容可能な担体は、組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生をそれ自体が誘導すべきではなく、有害であってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子などの大きくて、ゆっくり代謝される巨大分子であり得る。
薬学的に許容可能な塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸の塩を使用されることができる。
治療用組成物中の薬学的に許容可能な担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含み得る。さらに、湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助物質は、そのような組成物中に存在し得る。そのような担体は、患者による摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁剤として製剤化される医薬組成物を可能にする。
投与に適した形態は、例えば、注射又は注入による、例えば、ボーラス注射又は連続注入による非経口投与に適した形態を含む。生成物が、注射又は注入である場合、それは、油性又は水性賦形剤中の懸濁液、溶液又は乳濁液の形態をとり得、懸濁剤、保存剤及び／又は分散剤などの製剤を含み得る。あるいは、本開示の分子は、適切な滅菌液体との使用前に、再構成のために、乾燥形態であり得る。
製剤化されると、本発明の組成物は、対象に直接投与されることができる。処理される対象は、動物であることができる。しかしながら、１つ以上の態様において、組成物は、ヒト対象への投与のために適用される。
適切には、本開示に係る製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体の等電点の値に類似せず、例えば、製剤のｐＨが７である場合、８〜９又はそれ以上のｐｌが適切であり得る。理論に縛られることを望むものではないが、これは、最終的には、改善された安定性を有する最終製剤を提供でき、例えば、抗体は、溶液中に残ると考えられる。
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳質内、経皮、経皮的（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、膣内又は直腸経路を含む任意の多くの経路によって投与され得るが、これらに限定されない。皮下噴霧器はまた、本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る。典型的には、治療組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製され得る。注射前の液体、又は懸濁液、又は液体賦形剤に適した固体形態はまた調製され得る。
組成物の直接送達は、一般的には、注射、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内によって達成されるか、又は組織の間質腔に送達されるだろう。組成物はまた、病変部に投与されることができる。投薬治療は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであり得る。
組成物中の活性成分は、抗体であることが理解されるだろう。そのように、胃腸管の分解を受けやすいだろう。したがって、組成物が、消化管を使用する経路によって投与されるべき場合、組成物は、分解から抗体を保護するが、消化管からの吸収された後に抗体を放出する薬剤を含む必要があるだろう。
薬学的に許容可能な担体の徹底的な議論は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ, Ｎ.Ｊ. １９９１年）において利用可能である。
１つの態様において、製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
適切な吸入可能な調製物は、吸入可能な粉末、高圧ガスを含む軽量エアロゾル又は高圧ガスを含まない吸入可能な溶液を含む。活性物質を含む本開示に係る吸入可能な粉末は、上記活性物質単独又は生理学的に許容可能な添加剤との上記活性物質の混合物のみからなり得る。
これらの吸入可能な粉末は、単糖類（例えばグルコース又はアラビノース）、二糖類（例えばラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖及び多糖類（例えばデキストラン）、ポリアルコール（例えばソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えばナトリウム、塩素、炭酸カルシウム）又は互いのこれらの混合物を含み得る。単糖類又は二糖類は、特にそれらの水和物の形態で、排他的ではないが、ラクトース又はグルコースの使用に適切に使用される。
肺での沈着のための粒子は、１〜９ミクロン未満、例えば０．１〜５μｍ、特に１〜５μｍなど、１０ミクロン未満の粒径を必要とする。活性成分（抗体など）の粒径は、最も重要である。
吸入可能なエアロゾルを調製するために使用されることができる推進ガスは、当該技術分野で公知である。適切な推進ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタンなどの炭化水素及びメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンのハロ炭化及び／又はフッ素化誘導体などのハロ炭化水素から選択される。上記推進ガスは、それら単独又はそれらの混合物として使用され得る。
特に適切な推進ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記ハロゲン化炭化水素のうちＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）及びそれらの混合物が、特に適している。
推進ガス含有吸入可能エアロゾルはまた、共溶媒、安定剤、界面活性化薬剤（界面活性剤）、抗酸化剤、潤滑剤及びｐＨを調製するための手段などの他の成分を含有し得る。
本発明に係る推進ガス含有吸入可能エアロゾルは、５重量％までの活性物質を含み得る。本発明に係るエアロゾルは、例えば、活性成分の０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％又は０．５〜１重量％を含み得る。
あるいは、肺への局所投与はまた、例えば噴霧器などの装置、例えば圧縮機に接続される噴霧器（例えば、Ｐａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ, Ｉｎｃ., Ｒｉｃｈｍｏｎｄ, Ｖａによって製造されるＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）に接続されるＰａｒｉ ＬＣ−Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）噴霧器）を使用して、液体溶液又は懸濁液製剤の投与によってであり得る。
本明細書中の方法から得られた抗体又は結合断片は、溶媒中、例えば溶液又は懸濁液の形態で分散して送達されることができる。適切な生理学的溶液、例えば、生理食塩水又は他の薬学的に許容可能な溶媒又は緩衝溶液中に懸濁されることができる。当該技術分野で公知の緩衝溶液は、約４．０〜５．０のｐＨを達成するように、水１Ｌ当たり０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｇのポリソルベート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含み得る。懸濁液は、例えば、凍結乾燥された分子を使用することができる。
治療用懸濁液又は溶液製剤はまた、１つ以上の添加剤を含むことができる。添加剤は、当該技術分野で周知であり、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液及び重炭酸緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールを含む。溶液又は懸濁液は、リポソーム又は生分解性ミクロスフェアに封入されることができる。製剤は、一般的には、滅菌製造プロセスを用いて実質的に滅菌形態で提供されるだろう。
これは、製剤のために使用される緩衝溶媒／溶液のろ過、無菌緩衝溶媒溶液中の分子の無菌懸濁、及び当業者によく知られている方法による無菌容器への製剤の分散による製造及び殺菌を含み得る。
本開示に係る噴霧可能な製剤は、例えば、ホイルエンベロープに包装された単回投与単位（例えば、密閉されたプラスチック容器又はバイアル）として提供され得る。各バイアルは、溶媒／溶液緩衝液の体積、例えば２ｍＬの単位用量を含む。
本明細書の文脈に含まれることは、含むことを意味することが意図される。技術的に適切な場合、本発明の態様を組み合わせ得る。本明細書中の任意に積極的に記載される態様は、否定的な免責事項の基礎として使用され得る。
本発明を以下の実施例を参照して説明するが、これらは単なる例示であり、本発明の範囲を制限するものと決して解釈すべきではない。
例１：抗体分子物質の調製
ＣＨＯ発現及びＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの清澄化
ヒトＯＸ４０及び軽鎖配列Ａ２６ Ｆａｂ Ｌｉｇｈｔ−（３ｘＧ４Ｓ）−６４５ｄｓＦｖ（ｇＬ４）（配列番号１６）及び重鎖配列Ａ２６ Ｆａｂ Ｈｅａｖｙ−（Ｇ４Ｓ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｓ）−６４５ｄｓＦｖ（ｇＨ５）（配列番号１５）を有する血清アルブミンに結合する構築物は、安定なジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ ＤＧ４４）において発現された。これは、選択可能なマーカーとしてのＤＨＦＲに対する遺伝子及び生成物をコードする遺伝子の両方を含むプラスミドベクターを用いた製造業者の指示に従って、Ｎｕｃｌｅｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用してトランスフェクションによって生成された。トランスフェクトされた細胞は、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く培地中、及びＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサートの存在下で選択された。
細胞株を、接種段階全体を通して２０ｎＭメトトレキサートを含む培地で培養した。次に、細胞をメトトレキサートの非存在下で培養する。最終培養ステップのために、細胞を、メトトレキサートの非存在下で培地中で１４日間８０Ｌステンレス鋼バイオリアクター中で培養した。１４日目のバイオリアクターは、ディスクスタック遠心分離によって回収し、続いて複数のろ過ステップを行い、清澄化した上清を生成した。
哺乳動物発現Ａ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖのプロテインＡ精製
清澄化されたＣＨＯ上清を、必要なスケールに応じたカラムサイズの範囲で充填された９．４ｍｌのＨｉＳｃｒｅｅｎ（連続した２つのカラム）ＭａｂＳｅｌｅｃｔクロマトグラフィー樹脂に適用した。カラムは、Ｄｅｌｂｅｃｃｏｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ （ＰＢＳ）ｐＨ７．４又は１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４中で平衡化した。充填後、ＰＢＳ平衡緩衝液でカラムを洗浄した。次に結合した物質を、ｐＨ３．４で０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液で溶出した。回収された溶出ピークを、２ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．５で約ｐＨ７にｐＨ調整した。ｐＨ調整された溶出を、１０ｋＤａの分子量カットオフ遠心分離濃縮機又は接線流限外ろ過膜を使用して、ｐＨ７．４のＰＢＳリン酸緩衝液に緩衝液交換した。
例２：単量体収率に対する還元剤のみの効果、並びに還元剤及び変性剤の組み合わせの効果
還元剤のみ
フィードは、例１に記載のように精製された抗体、濃度１ｇ／Ｌ及び１５％単量体であった。実験は、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中、室温で、１ｍＬのフィード容積で行った。使用した還元剤は、５０ｍＭのβ−ｍｅａであった。分析を実施する前に、サンプルを、ＰＢＳで緩衝液交換して還元剤を除去した。
単量体のパーセンテージを、０〜２３時間にわたって分析した。
還元剤と変性剤の組み合わせ
フィードは、例１で提供される精製された抗体、濃度１．１ｇ／Ｌ及び１４％単量体であった。
３Ｍ尿素を変性剤として使用し、還元剤として５０ｍＭβ−ｍｅａを使用した。尿素を最初にフィードに添加し、続いて還元剤を添加した。還元剤の添加後、時間点はβ−ｍｅａの添加直後（標識された０時間）の最初の５時間までサンプリングした。すべてのサンプルを緩衝液交換し、次にＳＥ ＵＰＬＣで分析した。実験は、室温で行った。
結果を表２に示す。

ＨＭＷＳ＝高分子量種
ＳＥ−ＨＰＬＣ分析を使用して、単量体％及び単量体量を決定した。図１も参照。
変性剤として３Ｍ尿素及び５０ｍＭβ−ｍｅａの使用は、単量体の有意に改善されたパーセンテージを提供するが、単量体量を増加させることがわかる。尿素は、Ｆａｂの重鎖間のジスルフィド結合を減少させることなく単量体に対する多量体の変換を達成することができた。
結論：Ｆａｂ鎖間ジスルフィド結合を保持しながらＦｖ鎖間ジスルフィド結合を減少させるために、β−ｍｅａは、変換反応の最適な還元剤として同定された。試験された他の還元剤（データ示さず）は、ＳＥ分析によって単量体％を増加させるようであったが、続くＳＤＳ ＰＡＧＥ分析で見られるように、それらは、鎖間ジスルフィド結合の両方を減少させ、したがって、Ｆａｂ−ｄｓＦｖの変換で有用でない。
濃度を変化させることと還元剤と変性剤の組み合わせ
多量体種を単量体に変換するための最適条件を同定するために、スクリーニング試験を変性剤及び還元剤の濃度を変化させて実施した。例１で提供されるように、フィードは精製抗体であった。各実験は、室温で、１２００ｒｐｍの混合速度、１．１ｇ／Ｌのフィード濃度及び５ｍＬのサンプル容積で実施した。尿素を最初にフィードに添加し、すぐには還元剤を加えた。時間経過サンプルを、０〜５時間で採取した。サンプルを、変換ステップの終わりに、−２０℃ですぐに凍結した。１日後、サンプルを、０．２２μｍろ過し、ＳＥ ＵＰＬＣによって分析した。変性剤及び還元剤が依然として存在するので、変換反応は、分析まで継続した。試験された変性剤は、尿素及び塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）であった。
サンプルに対して実施されたサイズ排除クロマトグラフィーの結果を、図２Ａ〜Ｅに示す。
１０ｍＭβ−ｍｅａを有する１Ｍグアニジンは、最も高い単量体収率を与えた（図２Ｂ参照）。
８１％単量体を、３Ｍ尿素及び５０ｍＭβ−ｍｅａサンプルにおいて見た（図２Ｃ参照）。１０ｍＭのβ−ｍｅａのみでさえ、７７％単量体が、３Ｍ尿素サンプルで見られた（図２Ｃ）。１Ｍ尿素サンプルは、３Ｍ尿素サンプルと比較して、単量体％の有意な増加を依然として有したが、％単量体の低下があった。
図２Ｄ及び２Ｅに示されるように、収率％及び単量体濃度を示すが、３Ｍ尿素、５０ｍＭβ−ｍｅａで、２時間後、収率について８４．７％及び０．７９ｇ／Ｌの単量体であった（フィードより５倍高い）。３Ｍ尿素、１０ｍＭβ−ｍｅａ、及び１Ｍ尿素、５０ｍＭβ−ｍｅａサンプルでも高い単量体回収率であった。５Ｍ尿素は、これらのサンプルでいくらかの生成物損失をもたらした。
結論：３Ｍ尿素を変性剤として使用した結果は、非常に有望であり、単量体の５倍増加をもたらしたが、グアニジンでは単量体における４倍増加が見られた。
例３：尿素変換時間的経過
尿素変換の時間的経過研究を、ＳＥ ＵＰＬＣカラムで実施した。フィードは、例１で提供されるように精製抗体であった。２つのサンプルを、１．５ｍＬバイアル中で調製し、ＳＥ ＵＰＬＣカラムに流した。尿素を最初にフィードに添加し、すぐに還元剤を加えた。時間点は４０分毎で行った。サンプルの条件は、以下の通りであった：
・０．５ｇ／Ｌのフィード濃度、２０ｍＭのβ−ｍｅａ濃度、ｐＨ８．６、４Ｍ尿素濃度
・５．０ｇ／Ｌのフィード濃度、１００ｍＭのβ−ｍｅａ濃度、ｐＨ５．４、４Ｍ尿素濃度。
サンプルコンパートメントの温度を１０℃に設定し、これは、室温での反応に関し、反応の速度を低下させるであろう。ＳＥ−ＵＰＬＣ分析から得られた結果を、図３に示す。
例４：パラメータスクリーング−１
β−ｍｅａを還元剤として、尿素を変性剤として用いる変換ステップの最適条件を見出すために、変換反応に最も大きな効果を有すると考えられるパラメータを検討した。これらは、フィード濃度、尿素濃度、β−ｍｅａ濃度及びｐＨであった（表３参照）。フィードは、例１で提供されるように精製抗体であった。フィード材料は、１５％単量体を含み、全ての変換ステップで使用される時間は、５時間であった。尿素を最初にフィードに添加し、すぐに還元剤を加えた。
変換ステップは、９６深層ウェルプレートで実施され、各実験を繰り返し、実験は、ＴＥＣＡＮロボットを用いて行った。実験は室温で行い、サンプルは、ＳＥ ＵＰＬＣにより分析した。測定された応答は、単量体％、総収率及び単量体収率であった。
実験設計を表５に示す。
サンプルをＳＥ−ＨＰＬＣで分析し、その結果を表６に示す。
単量体収率％の等高線図を、図１６に示す。
単量体％を最大にするための最適条件は、最も高い還元剤濃度（１００ｍＭβ−ｍｅａ）及び最も高い変性剤濃度（４Ｍ尿素）であった。
尿素濃度は、単量体％に対して強い正の効果を有した。β−ｍｅａ濃度は、単量体％に対してより弱い効果を有した。パラメータ範囲のこの第１のスクリーニングから、さらなる範囲を続く第２スクリーニングのために選択した。これらは、β−ｍｅａ濃度について８０〜１５０ｍＭ及び尿素濃度について２．５〜５Ｍであった。これらの範囲は、タンパク質が一本鎖形成を妨げる限界であるため選択された。
例５：パラメータスクリーニング−２
単量体収率を最大限にするための最適条件を見出すために、第２のパラメータ範囲スクリーニングを、例４から有望な範囲を選択することにより実施した。第２のスクリーニングのために選択された範囲を、表７に示す。
例１で提供されるように、フィードは、精製抗体であった。変換ステップは、９６深層ウェルプレートで行い、各実験を繰り返し、実験は、ＴＥＣＡＮロボットを用いて調製した。フィード材料は、１５％の単量体を含み、全ての変換ステップに使用された時間は、５時間であった。尿素を最初にフィードに添加し、すぐに続いて還元剤を加えた。実験を室温で実施し、サンプルをろ過後、ＳＥ ＵＰＬＣによって分析した。モデルは、複数の線形回帰を使用してフィッティングされた。
この研究で得られた結果を表８に示す。
以前のスクリーニング研究のように、尿素濃度は、単量体％に対して最も強い（正の）効果を有したが、β−ｍｅａは、調査した範囲にわたってはるかにより小さい（正の）効果を有した。β−ｍｅａの濃度を８０ｍＭ〜１５０ｍＭに変化させることは、変換反応にほとんど影響を与えなかった。
実験において、２．５Ｍ尿素を含むことは低収率を有したが、３．８Ｍの尿素濃度を有する全ての他の実験及び上記の全ては、同様に有意に改善された収率を有した。単量体収率％の等高線プロットを、図５に示す。
したがって、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ変換が、組換え発現されたポリペプチドを８０〜１５０ｍＭのβ−ｍｅａ及び３．８〜５Ｍの尿素で処理することによってされた場合、単量体のパーセンテージが増加したことがわかった。
例６：ロバスト性試験
上記例５に見られる６０％の単量体収率のための実験空間にわたるスイートプロットを、図６に示す。
この領域における５つの実験点を選択して、例５からの結果を確認し、変換ステップを実施するロバストな空間を提供した。ｐＨは、単量体収率に有意な影響を及ぼさないことが示されたので、全ての実験を、ｐＨ７で行った。
例１で提供されるように、フィードは、精製抗体であった。サンプルのフィード濃度は、２．７５ｇ／Ｌであり、この１５％は、単量体であった。ＳＥ ＵＰＬＣ分析からの実験点及び結果を表９に示す。変換ステップを、６時間行った。
５つの実験にわたって、単量体収率は、７１〜７７％の範囲で変化した。収率及び単量体応答％はまた、実験を通してかなり一貫していた。
４．７Ｍ尿素及び１１５ｍＭβ−ｍｅａを使用する表９の実験５からの変換ステップの前後のサンプルのＳＥ−ＵＰＬＣクロマトグラムを、図７及び図８に示す。
例７：２Ｌスケールでの変換
ＣＨＯ発現及びＡ２６Ｆａｂ−６４５ｄｓＦｖの清澄化は、例１の通りに実施され、２Ｌスケール実験のフィードとして清澄化培養液を提供した。変換実験は、２Ｌの変換用量を使用して、２Ｌ発酵容器で実施した。抗体の濃度は、２．２ｇ／Ｌであり、そのうちの３０％が単量体であった。実験条件を表１０に示し、変換ステップを１７時間実施した。実験において、還元剤β−ｍｅａを最初に加え、続いて尿素を加えた。サンプルをＳＥ ＵＰＬＣで分析した。

製造スケールで使用されるものの代表する容器で、変換ステップを２Ｌスケ−ルまでスケールアップすることが可能であった。β−ｍｅａ及び尿素との変換ステップ後、単量体の量を有意に増加させることができた。
結論：
変換ステップのロバストな条件を同定し、これは次の通りであった：４．５〜４．９Ｍ尿素、９５〜１３５ｍＭβ−ｍｅａ、６時間、フィード濃度２．７５ｇ／Ｌ。
最もロバストな条件を、次の通りであることを確認した：４．７Ｍ尿素、１１５ｍＭβ−ｍｅａ、６時間、フィード濃度２．７５ｇ／Ｌ。
これらの最もロバストな条件を使用して、単量体％は、驚くべきことに１５％から８２％に増加した。変換ステップの収率は、９３％であり、７６％の単量体収率であった。フィード中の単量体濃度は、０．４ｇ／Ｌであり、変換後の生成物中の単量体濃度は、２．０ｇ／Ｌであった。これは、変換ステップ後の単量体の量において予想外の５倍増加である。
変換ステップは、製造スケールのものの代表する容器を使用して、３Ｍ尿素及び５０ｍＭβ−ｍｅａを使用して、２Ｌスケールまでうまくスケールアップした。

Claims (27)

  1. ａ）尿素及び／又は塩酸グアニジンから選択される変性剤で組成物を処理する変換ステップ；
    ｂ）ステップａ）が、還元剤の存在下で、又は還元剤との処理後に実施される、
    ことを含む、
    抗体分子が、１つのＶＨ及び１つのＶＬを含む目的の抗原に対する特異性を有する少なくとも１つのＦｖを含み、ここで、該ＶＨ及びＶＬは、１つ以上のリンカーを介して直接的又は間接的に連結され、それらの間のジスルフィド結合によって安定化されることを特徴とする、組換え発現された抗体分子の組成物中の単量体のパーセンテージを増加させる方法。
  2. 前記還元剤が、グルタチオン（ＧＨＳ）、エチルスルファイト、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、２−メルカプトエチルアミン（ＢＭＥＡ）、システイン−ＨＣｌ及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記還元剤が、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）及び２−メルカプトエチルアミン（ＢＭＥＡ）、特に２−メルカプトエチルアミンから選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記２−メルカプトエチルアミンは、１０〜１５０ミリモルである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記２−メルカプトエチルアミンは、５０〜１５０ミリモルである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記２−メルカプトエチルアミンは、９５〜１３５ミリモル、例えば、１１０〜１２０ミリモルである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記変性剤は尿素であり、１〜５モルの濃度である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記尿素は、３〜５モルの濃度である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記尿素は、４．５〜４．９モル、例えば４．７モルの濃度である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記変性剤は、塩酸グアニジンであり、１〜２モルの濃度である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ステップａ）は、２〜７０時間、例えば３〜５０時間、例えば４〜２５時間、特に４〜６時間、例えば６時間の範囲の期間実施される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記方法が、室温で実施される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記抗体は、０．５ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌの範囲の濃度である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記変換ステップは、付随する撹拌の存在下で実施される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 撹拌速度は、１００〜１２００ｒｐｍの範囲である、請求項１４に記載の方法。
  16. 下流精製のさらなるステップを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 下流処理は、ステップクロマトグラフィーを含む、請求項１６に記載の方法。
  18. １つ以上のリンカーを介して直接的又は間接的に結合され、それらの間のジスルフィド結合によって安定化されるＶＨ及びＶＬは、抗原結合部位を形成する相補的ＶＨ／ＶＬ対である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ＶＨ及びＶＬは、リンカーを介して直接結合される、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
  20. 前記抗体は、ｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖ、 Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｓｄＡｂ、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖから選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 各ＶＨ及びＶＬは、第２の抗体を介してＶＨ及びＶＬを間接的に結合するリンカーを含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
  22. 前記抗体は、Ｆａｂ−ｄｓＦｖである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記抗体は、ヒトＯＸ４０及びヒト血清アルブミンに結合する二重特異性抗体融合タンパク質であって：
    Ｎ末端から順に、第１の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）、ＣＨ１ドメイン及び第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）を含む重鎖、
    Ｎ末端から順に、第１の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）、ＣＬドメイン及び第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含む軽鎖、
    を含み、
    ここで、該重鎖及び軽鎖は、ＶＨ１及びＶＬ１が第１の抗原結合部位を形成し、ＶＨ２及びＶＬ２が第２の抗原結合部位を形成するように整列され、
    第１の抗原結合部位によって結合される抗原は、ヒトＯＸ４０であり、第２の抗原結合部位によって結合される抗原は、ヒト血清アルブミンである、
    請求項２２に記載の方法。
  24. 前記重鎖の第１の可変ドメイン（ＶＨ１）は、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号２で示される配列及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号３で示される配列を含み、軽鎖の第１の可変ドメイン（ＶＬ１）は、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号４で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号５で示される配列及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号６で示される配列を含み、
    ここで第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）は、配列番号１１で示される配列を有し、第２の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、配列番号１２で示される配列を有し、及び
    第２の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）及び第２に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）は、ジスルフィド結合によって結合される、
    請求項２３に記載の方法。
  25. 抗体分子の多量体種を単量体に変換するための２−メルカプトエチルアミン並びに尿素及び塩酸グアニジンから選択される変性剤を含む組成物であって、該抗体分子は、１つのＶＨ及び１つのＶＬを含む目的の抗原に対して特異性を有する少なくとも１つのＦｖを含み、該ＶＨ及びＶＬは、１つ以上のリンカーを介して直接的又は間接的に結合され、それらの間のジスルフィド結合によって安定化される、上記組成物。
  26. 前記尿素は、３〜５モルであり、２−メルカプトエチルアミンは、８０〜１５０ミリモルである、請求項２５に記載の組成物。
  27. 抗体分子の多量体種を単量体に変換するための２−メルカプトエチルアミン並びに尿素及び塩酸グアニジンから選択される変性剤を含む組成物の使用であって、該抗体分子は、１つのＶＨ及び１つのＶＬを含む目的の抗原に対して特異性を有する少なくとも１つのＦｖを含み、ここで、該ＶＨ及びＶＬは、１つ以上のリンカーを介して直接的又は間接的に連結され、それらの間のジスルフィド結合によって安定化される、上記使用。
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