KR102204315B1 - 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 그의 용도 - Google Patents

인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA)에 특이적으로 결합하는 어피바디, 상기 어피바디를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 어피바디를 이용하여 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 약제학적 조성물 및 키트에 관한 것이다.

Description

인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 어피바디 및 그의 용도{AFFIBODY SPECIFIC TO HUMAN SERUM ALBUMIN AND ITS USE}
본 발명은 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA)에 특이적으로 결합하는 어피바디, 상기 어피바디를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 어피바디를 이용하여 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 약제학적 조성물 및 키트에 관한 것이다.
알부민은 인간혈청단백질의 약 50%를 차지하는 주요 혈장 단백질로, 하나의 긴 폴리펩타이드 사슬 (66.5 kDa)로 구성되어 있다. 이러한 인간 혈청 알부민 (Human serum albumin, HSA)은 삼투압을 유지, 혈액의 pH를 버퍼링, 혈액을 통해 호르몬, 지방산, 약 및 여러 중요한 물질을 수송하는 등 중요한 생리기능의 다양한 역할을 한다. HSA의 농도는 사람의 전반적인 건강상태를 나타내고, 통상적으로 기본 대사 패널에서 측정된다. 건강한 사람의 혈장 내 HSA 레벨은 전형적으로 ~50g/L (~750μM)이다. 플라즈마 내 HSA 레벨의 상당한 감소 (저알부민혈증 < 30g/L)는 간 부전, 신부전, 염증, 쇼크 및 영양실조를 나타낼 수 있다. 반대로, 소변 내 상승된 HSA 레벨 (단백뇨 또는 미세알부민뇨 > 30mg/L)는 당뇨병의 강화된 치료의 핵심 지표로서 널리 설정되었다. 미세알부민뇨는 당뇨병 및 비당뇨병 환자 중, 신장과 심장혈관 질환에 대한 초기 예후 마커 중 하나이다. 그러므로, 생물학적 유체 내 특히 낮은 농도 HSA의 검출은 진단과 예방에 중요하다.
한편, 어피바디(affibody)는 인공 단백질의 일종으로 인공항체의 일종이기도 하다. 황색포도구균(Staphylococcus aureus)의 단백질 A(SPA) 중 IgG 결합 영역인 58 아미노산 잔기를 사용한다. IgG와 결합 면을 형성하는 13 아미노산 잔기 부분을 무작위적인 배열과 치환한 라이브러리(library)를 구축하고, 그중에서 표적물질과 특이적으로 결합하는 것을 선별하는 것으로서 표적물질에 대한 어피바디(affibody)를 취득하게 된다. 어피바디(affibody)는 약 150kDa인 항체와 비교하면 약 6kDa 정도로 분자 크기가 작기 때문에 조직을 깊게 투과하기 쉬운 성질을 갖추고, 또한 열 또는 알칼리 등에 대한 내성도 갖는 등인 이점도 있다. 또한 어피바디는 박테리아를 이용해서 대량 생산하기 때문에 동물세포에서 생산하는 항체에 비해 저렴하게 제작할 수 있다. 그리고, 어피바디는 분자 조영제로서 이용 또는 친화력(affinity) 분리 등에도 이용되고 있다.
[선행문헌]
대한민국 공개특허 1. KR 10-2015-0117647 A
본 발명은 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA)에 특이적으로 결합하는 어피바디, 상기 어피바디를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 어피바디를 이용하여 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 약제학적 조성물 및 키트를 제공하고자 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "특이적으로 결합(specifically binding)"은 상기 어피바디가 인간 혈청 알부민 이외의 단백질에 실질적으로 결합하지 않거나 친화도에서 큰 차이를 보여 인간 혈청 알부민과 다른 단백질의 구별을 가능하게 하는 것을 의미한다.
제1구현예에 따르면,
본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA)에 특이적으로 결합하는 어피바디를 제공하고자 한다.
[화학식 1]
VDNKFNKEX1X2X3AX4X5EIX6X7LPNLNX8X9QX10X11AFIX12SLX13DDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
(상기 화학식 1에서,
X1은 트립토판(W), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 시스테인(C), 아이소류신(I) 또는 발린(V)이고,
X2는 트립토판(W), 세스테인(C), 발린(V), 타이로신(Y), 페닐알라닌(F), 류신(L), 글라이신(G) 또는 발린(V)이고,
X3은 류신(L) 또는 타이로신(Y)
X4는 류신(L), 알라닌(A), 세린(S), 발린(V), 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W)이고,
X5는 트립토판(W), 류신(L), 발린(V), 세린(S) 또는 류신(L)이고,
X6은 티로산(Y) 또는 페닐알라닌(F)이고,
X7은 글루타민(Q) 또는 히스티딘(H)이고,
X8은 아스파라긴(N), 세스테인(C), 라이신(K), 트레오닌(T), 아르기닌(R), 타이로신(Y), 글루탐산(E), 글루타민(Q) 또는 아이소류신(I)이고,
X9는 아스파라긴(N) 또는 글루탐산(E)이고,
X10는 아이소류신(I) 또는 글루타민(Q)이고,
X11은 세린(S) 또는 트레오닌(T)이고,
X12는 트레오닌(T) 또는 히스티딘(H)이고,
X13은 글루타민(Q) 또는 라이신(K)을 나타낸다.)
본 명세서에서 사용된 용어 “아미노산”은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 또한, 상기 펩티드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산을 포함할 수 있다. 변역 후 변형은 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예를 들면, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예를 들면, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예를 들면, 이황화물 브릿지의 형성)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 상기 펩티드는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수도 있다. 인공 변이체뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 상기 보존성 치환은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신) 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)을 포함할 수 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 기술분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체로, 용어 “핵산”과 동등한 의미로 사용될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드(DNA), 리보뉴클레오티드(RNA), 뉴클레오티드 유사체, 및/또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid: PNA) 분자를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 어피바디에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 어피바디에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
제2구현예에 따르면,
본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA)에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하는 재조합 벡터를 제공하고자 한다.
[화학식 1]
VDNKFNKEX1X2X3AX4X5EIX6X7LPNLNX8X9QX10X11AFIX12SLX13DDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
(상기 화학식 1에서,
X1은 트립토판(W), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 시스테인(C), 아이소류신(I) 또는 발린(V)이고,
X2는 트립토판(W), 세스테인(C), 발린(V), 타이로신(Y), 페닐알라닌(F), 류신(L), 글라이신(G) 또는 발린(V)이고,
X3은 류신(L) 또는 타이로신(Y)
X4는 류신(L), 알라닌(A), 세린(S), 발린(V), 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W)이고,
X5는 트립토판(W), 류신(L), 발린(V), 세린(S) 또는 류신(L)이고,
X6은 티로산(Y) 또는 페닐알라닌(F)이고,
X7은 글루타민(Q) 또는 히스티딘(H)이고,
X8은 아스파라긴(N), 세스테인(C), 라이신(K), 트레오닌(T), 아르기닌(R), 타이로신(Y), 글루탐산(E), 글루타민(Q) 또는 아이소류신(I)이고,
X9는 아스파라긴(N) 또는 글루탐산(E)이고,
X10는 아이소류신(I) 또는 글루타민(Q)이고,
X11은 세린(S) 또는 트레오닌(T)이고,
X12는 트레오닌(T) 또는 히스티딘(H)이고,
X13은 글루타민(Q) 또는 라이신(K)을 나타낸다.)
본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물을 의미한다. 상기 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pACYC184 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환(transformation)"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 상기 형질전환 방법은 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아-매개 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "숙주세포"는 다른 미생물 또는 유전자를 기생시켜 영양을 공급하는 세포로, 벡터가 숙주세포에 형질전환됨으로써 숙주세포 내에서 다양한 유전적 또는 분자적 영향을 미치게 되는 세포를 의미한다. 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 같은 바실러스(Bacillus)속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 같은 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균; 락토바실러스와 엔테로코커스 등 유산균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 같은 효모; 동물세포 및 곤충 세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 재조합 벡터에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 재조합 벡터에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
제3구현예에 따르면,
본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA)에 특이적으로 결합하는 어피바디를 이용하여 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.
[화학식 1]
VDNKFNKEX1X2X3AX4X5EIX6X7LPNLNX8X9QX10X11AFIX12SLX13DDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
(상기 화학식 1에서,
X1은 트립토판(W), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 시스테인(C), 아이소류신(I) 또는 발린(V)이고,
X2는 트립토판(W), 세스테인(C), 발린(V), 타이로신(Y), 페닐알라닌(F), 류신(L), 글라이신(G) 또는 발린(V)이고,
X3은 류신(L) 또는 타이로신(Y)
X4는 류신(L), 알라닌(A), 세린(S), 발린(V), 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W)이고,
X5는 트립토판(W), 류신(L), 발린(V), 세린(S) 또는 류신(L)이고,
X6은 티로산(Y) 또는 페닐알라닌(F)이고,
X7은 글루타민(Q) 또는 히스티딘(H)이고,
X8은 아스파라긴(N), 세스테인(C), 라이신(K), 트레오닌(T), 아르기닌(R), 타이로신(Y), 글루탐산(E), 글루타민(Q) 또는 아이소류신(I)이고,
X9는 아스파라긴(N) 또는 글루탐산(E)이고,
X10는 아이소류신(I) 또는 글루타민(Q)이고,
X11은 세린(S) 또는 트레오닌(T)이고,
X12는 트레오닌(T) 또는 히스티딘(H)이고,
X13은 글루타민(Q) 또는 라이신(K)을 나타낸다.)
본 명세서에서 사용된 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 객체의 감수성 (susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것 (예를 들면, 뎅기열 바이러스의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후 (prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스 (therametrics) (예를 들면, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
제4구현예에 따르면,
본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA)에 특이적으로 결합하는 어피바디를 이용하여 인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 키트를 제공하고자 한다.
[화학식 1]
VDNKFNKEX1X2X3AX4X5EIX6X7LPNLNX8X9QX10X11AFIX12SLX13DDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
(상기 화학식 1에서,
X1은 트립토판(W), 페닐알라닌(F), 히스티딘(H), 시스테인(C), 아이소류신(I) 또는 발린(V)이고,
X2는 트립토판(W), 세스테인(C), 발린(V), 타이로신(Y), 페닐알라닌(F), 류신(L), 글라이신(G) 또는 발린(V)이고,
X3은 류신(L) 또는 타이로신(Y)
X4는 류신(L), 알라닌(A), 세린(S), 발린(V), 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W)이고,
X5는 트립토판(W), 류신(L), 발린(V), 세린(S) 또는 류신(L)이고,
X6은 티로산(Y) 또는 페닐알라닌(F)이고,
X7은 글루타민(Q) 또는 히스티딘(H)이고,
X8은 아스파라긴(N), 세스테인(C), 라이신(K), 트레오닌(T), 아르기닌(R), 타이로신(Y), 글루탐산(E), 글루타민(Q) 또는 아이소류신(I)이고,
X9는 아스파라긴(N) 또는 글루탐산(E)이고,
X10는 아이소류신(I) 또는 글루타민(Q)이고,
X11은 세린(S) 또는 트레오닌(T)이고,
X12는 트레오닌(T) 또는 히스티딘(H)이고,
X13은 글루타민(Q) 또는 라이신(K)을 나타낸다.)
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 어피바디는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 어피바디는 보다 높은 친화력으로 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있으므로, 일간 혈청 알부민의 검출 또는 진단에 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 HSA 바이오패닝 과정 중 Affibody 라이브러리의 바이오패닝의 5차 단계(0.5% PBST)에서 회수한 45개의 재조합 파아지의 HSA 및 Streptavidin에 대한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 2는 박테리아를 이용해서 발현후 정제한 Affibody13를 나타낸다. SDS-PAGE 상을 보면 크기가 약 7kDa이며 순도가 95% 이상으로 정제되었다.
도 3은 박테리아를 이용해서 발현후 정제한 Affibody29를 나타낸다. SDS-PAGE 상을 보면 크기가 약 7kDa이며 순도가 95% 이상으로 정제되었다.
도 4는 Affibody 13을 SPR을 이용하여 결합 테스트를 확인한 결과를 나타낸다. 10 uM, 20 uM, 30 uM, 40 uM, 50 uM 의 농도별로 확인하였고, Kd 값 6.42 uM 정도로 잘 붙음을 확인하였다.
도 5는 Affibody 29을 SPR을 이용하여 결합 테스트를 확인한 결과를 나타낸다. 10 uM, 20 uM, 30 uM, 40 uM의 농도별로 확인하였고, Kd 값 620 nM 정도로 잘 붙음을 확인하였다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이하의 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1 : Affibody 라이브러리에서 재조합 파아지 생산
-80℃에 저장된 Affibody 라이브러리에서 재조합 파아지를 생산하였다. 30ml SB 액체배지에 -80℃에 보관된 라이브러리 1ml을 추가하여 20분 동안 37℃에서 200rpm의 속도로 혼합하여 배양하였다. 여기에 Helper phage(1.84x10pfu) 과 암피실린(최종 농도 50μg/ml)을 넣고 다시 한 시간 동안 같은 조건으로 배양하였다. 그리고 암피실린(50μg/ml) 및 카나마이신(10μg/ml)이 포함된 SB 액체배지 30ml에 옮겨 같은 조건으로 16시간 이상 배양하여 재조합 파아지를 생산하였다. 배양액을 4℃에서 5,000rpm의 속도로 10분 동안 원심 분리하여 얻은 상층액에 PEG/NaCl을 5:1 비율로 혼합하고 얼음에 1시간 동안 방치시킨 후, 4℃에서 20분 동안 13,000rpm의 속도로 원심 분리하여 상층액은 조심스럽게 제거하고 1ml의 PBS로 펠렛을 재현탁시켰다.
실시예 2. Affibody-HSA(Human Serum Albumin)의 바이오패닝
HSA(5ug/ml)을 96well high binding plate의 8개의 well에 50ul씩 넣은 후, 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였고, 다음날 PBS 200ul로 1회 세척한 후, 2% Gelatin 200ul를 넣고 상온에서 2시간 동안 블록킹한 후, 용액을 모두 버리고 PBS 200ul로 3회 세척하였다. 여기에 Affibody 재조합 파아지 포함용액 400ul 및 2% Gelatin 400ul을 혼합하여 웰당 100ul씩 넣고 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 8개 웰의 용액을 모두 제거하고 0.05% PBST(Tween-20)로 3회 세척한 뒤 0.2M 글리신(pH 2.2)을 웰당 100ul씩 넣어 10분간 파아지를 용리시키고 800ul E-tube에 모아 여기에 1M Tris(pH 9.0) 200ul를 넣어 중화시켰다. 각 바이오패닝마다 인풋 파아지 및 아웃풋 파아지의 수를 측정하기 위해 OD=0.7인 E. coli 세포에 섞어 주어 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 패닝을 반복하기 위해 HSA 아웃풋 파아지 500ul를 5ml의 E. coli 세포와 섞어 37℃에서 200rpm의 속도로 30분 동안 혼합하며 배양한 후, 암피실린(50μg/ml) 및 헬퍼 파아지(1.84x10pfu) 첨가하여 같은 방법으로 30분 동안 배양하였다. 그 다음 암피실린(50μg/ml)과 카나마이신(10μg/ml)이 포함된 50ml SB 배지에 옮겨 같은 방법으로 하루 동안 배양하였다. 배양액을 4℃에서 5,000rpm의 속도로 10분동안 원심 분리하여 상층액에 PEG/NaCl [20% PEG(w/v) 및 15% NaCl(w/v)]을 5:1 비율로 첨가한 후 얼음에 1시간 동안 정치시켰다. 4℃에서 13,000rpm의 속도로 20분 동안 원심분리 후 상층액을 완전히 제거하고 1ml의 PBS 용액으로 파아지 펠렛을 현탁한 다음 2차 바이패닝에 사용하였다. 각 패닝 단계마다 상기와 동일한 방법을 사용했으며, 세척과정만 단계별로 각각 3회, 5회, 7회로 (0.05% PBST) 증가시켰다. 3번째 패닝 후 세척 조건을 0.05%, 0.5% PBST(Tween-20)로 두 조건으로 설정하여 총 6차에 걸쳐 바이오 패닝을 실시하고 각패닝 단계에서 회수한 파아지 펩타이드들의 아웃풋 파이지/인풋 파아지의 비율을 하기의 표 1에 나타내었다.
패닝 단계 (조건) 인풋 파아지 아웃풋 파아지 output/input
1 Binding 상온 1hr
Washing 3회
(0.05% PBST)		 1.36X1011 2.7X106 1.98X10-5
2 Binding 상온 1hr
Washing 5회
(0.05% PBST)		 7.48X1010 1.46X10
Figure 112018114284317-pat00001
 19.5X10-5
3 Binding 상온 1hr
Washing 7회
(0.05% PBST)		 2.4X109 9.0X10
Figure 112018114284317-pat00002
 37.5X10-5
4 Binding 상온 1hr
Washing 5회
(0.5% PBST)		 2.84X1011 1.8X107 6.3X10-5
5 Binding 상온 1hr
Washing 7회
(0.5% PBST)		 7.48X1010 1.32X105 0.17X10-5
6 Binding 상온 1hr
Washing 9회
(0.5% PBST)		 9.2X109 1.9X106 2.06X10-4
실시예 3: HSA에 특이적인 파아지 검색(colony ELISA)
상기 표 1에서 아웃풋 파아지/인풋 파아지 비율이 가장 높은 바이오패닝 단계에서 회수한 파아지를 E. coli 세포에 감염시킨 후 플라크가 플레이트당 100-200개 정도가 되도록 도말하였다. 멸균된 팁을 이용하여 플라크 50개를 1ml의 SB-암피실린(50 μg/ml) 배양액에 접종한 후 37℃에서 5시간 동안 진탕 배양하여 헬퍼 파아지를 10ul씩 첨가하여 37℃에서 200rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 배양액을 12,000rpm의 속도로 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 회수한 후 2% BSA를 넣고 이를 파아지 검색에 사용하였다. 96웰 ELISA 플레이트에 5μg/ml의 HSA, Streptavidin을 각 웰당 50ul씩 50개의 웰에 넣고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰의 단백질을 제거하고 2% Gelatin을 사용하여 상온에서 2시간 동안 블록킹한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 파아지 용액 100ul씩을 모든 웰에 분주하고 30℃에서 1시간 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 3회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항-M13항체(GE Healthcare)를 1:3,000으로 희석하여 100ul씩 분주하고 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척한 후 TMB용액 100ul를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100ul의 1M HSO를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450nm에서 흡광도를 측정하여 Streptavidin에 비해 2배 이상 흡광도가 높은 클론들을 선택하였다. 이들의 플라스미드를 정제하여 시퀀싱을 의뢰하였다(Bioneer, Daejeon, Korea). 시퀀싱 프라이머는 GATTACGCCAAGCTTTGGAGC를 사용하였다.
실시예 4: 스크리닝해서 찾은 HSA-Affibody phage의 특이성 test
96웰 ELISA 플레이트에 5μg/ml의 HSA, Streptavidin, VEGF, TNFα, Gelatin을 각 웰당 50ul씩 well에 넣고 4℃에서 하루 동안 방치하였다. 다음날 모든 웰의 단백질을 제거하고 2% Gelatin을 사용하여 상온에서 2시간 동안 블록킹한 뒤, 용액을 모두 버리고 0.1% PBST로 3회 세척하였다. 각 클론별로 증폭된 파아지 용액 Affibody13, Affibody29 파아지를 각각 100ul씩을 모든 웰에 분주하고 30℃에서 1시간 동안 정치하였다. 0.1% PBST 용액으로 3회 세척한 다음 HRP-컨쥬게이트 항-M13항체(GE Healthcare)를 1:1,000으로 희석하여 100ul씩 분주하고 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 0.1% PBST로 3회 세척한 후 TMB용액 100ul를 분주하여 발색반응을 유도한 다음 100ul의 1M HSO를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450nm에서 흡광도를 측정하여 HSA에 대한 특이성을 확인하였다 (도 1). 시퀀싱을 통해 HSA 특이적 결합능을 가지는 Affibody 13 및 29의 아미노산 서열을 하기의 표 2에 나타내었다.
HSA@Affibody5 VDNKFNKEFCCAALEIVLLPNLNCQQMKAFIKSLNDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
HSA@Affibody22 VDNKFNKEWVFAAWEIFLLPNLNKYQMKAFIHSLNDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
HSA@Affibody8
(Output)		 VDNKFNKEWYLALWEIFILPNLNTEQTIAFIKSLQDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
HSA@Affibody29 VDNKFNKEWWLALWEIYQLPNLNNNQISAFITSLQDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
HSA@Affibody13 VDNKFNKEWWYALWEIFHLPNLNNEQQTAFIHSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
HSA@Affibody8
(Input)		 VDNKFNKEHCVALVEIFMLPNLNRNQACAFIESLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
HSA@Affibody14 VDNKFNKECFLALSEIFYLPNLNYYQNNAFISSLRDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
HSA@Affibody10 VDNKFNKECVSASVEIVLLPNLNEIQTQAFISSLWDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
HSA@Affibody41 VDNKFNKECLVAVVEIWPLPNLNTRQQKAFINSLMDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
HSA@Affibody7 VDNKFNKEIGPAFLEILSLPNLNQCQDVAFISSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
HSA@Affibody12 VDNKFNNEVVWAWLEIVTLPNLNIAQFAAFINSLDDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKAA
실시예 5: HSA-Affibody의 발현 및 정제
상기 표 2의 HSA-Affibody 13 및 29의 유전자를 바이오니아에서 합성하여 expression vector pBT7-N-His에 클로닝하였다. 이를 BL21 세포에 형질 전환한 후 암피실린이 포함된 아가 배지에 도말하였다. 한천 평판 배지에서 자란 군락을 암피실린(50μg/ml)이 포함된 5ml의 LB 배지에 접종한 뒤 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 글리세롤과 1:1 비율로 혼합하여 stock 1ml을 만들어 -80℃ deepfreezer에 보관하였다. 암피실린(50μg/ml)이 포함된 20ml의 LB 배지에 stock 100ul를 접종하여 37℃에서 220rpm의 속도로 혼합하면서 하루 동안 배양한 후, 암피실린(50μg/ml)이 포함된 400ml의 LB 배지에 옮겨 OD=0.7까지 배양하였다. 이후 1mM 이소프로필-β-D-키오갈락토피라노사이드(IPTG)를 넣어주어 15℃에서 220rpm의 속도로 하루 동안 배양하였다. 4℃에서 4000xg로 10분 동안 원심 분리하여 침전된 세포들을 제외한 상층액을 모두 제거하고, 라이시스 버퍼(50mM sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 10mM imidazole)로 현탁시켰다. -80℃에 하루 동안 보관한 후 꺼내어 완전히 녹인 후, PMSF(Phenyl methane sulfonyl fluoride) 10mg을 Isopropanol 1ml에 녹인 후 용해된 E. coli에 1ml 넣었다. 소니케이터를 이용하여 E. coli를 용해시킨 후에 4℃에서 13,000rpm의 속도로 1시간 동안 원심 분리했다. 증류수와 라이시스 버퍼로 Ni-NTA 친화성 레진(Elposbio, Daejeon, Korea)을 세척한 후 상층액을 레진에 결합시켰다. Washing buffer(50mM sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 20mM imidazole) 600ml로 washing 후 일루션 버퍼(50mM 소sodium phosphate(pH 8.0), 300mM NaCl 및 250mM imidazole)을 이용하여 N-말단 His-tag Affibody 단백질을 용출시켜 획득하였다. 이렇게 획득한 단백질을 Centrifugal Filter(Merck Milipore Ltd, lreland)에 넣고 4℃에서 4,000rpm의 속도로 10min 원심 분리하여 농축 후 PBS를 넣고 같은 방법으로 5회 Buffer change하여 순도 높은 HSA-Affibody 13 및 29 단백질을 얻었다 (도 2 및 3).
실시예 6: HSA에 대한 HSA-Affibody의 SPR 바인딩 테스트
정제한 HSA-affibody 13 및 29를 Biacore3000(Biacore AB, Uppsala, Sweden)을 이용하여 바인딩 실험을 진행하였다. HSA 단백질을 EDC/NHS을 이용하여 CM5 칩(Biacore)에 고정하였다. 러닝 버퍼로는 PBS(pH 7.4)을 사용하였고, 플로우는 분당 30 ㎕로 흘리면서 10 uM의 affibody를 흘려주면서 바인딩 결합도를 확인하였다 (도 4 및 5).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Institute of Ceramic Engineering and Technology <120> AFFIBODY SPECIFIC TO HUMAN SERUM ALBUMIN AND ITS USE <130> DP-2018-0274 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 1 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Trp Leu Ala Leu Trp Glu Ile 1 5 10 15 Tyr Gln Leu Pro Asn Leu Asn Asn Asn Gln Ile Ser Ala Phe Ile Thr 20 25 30 Ser Leu Gln Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala 50 55 60 <210> 2 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE <400> 2 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Trp Trp Tyr Ala Leu Trp Glu Ile 1 5 10 15 Phe His Leu Pro Asn Leu Asn Asn Glu Gln Gln Thr Ala Phe Ile His 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Ala 50 55 60

Claims (10)

  1. 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산을 포함하는 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA)에 특이적으로 결합하는 어피바디.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 어피바디는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인, 어피바디.
  4. 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산을 포함하는 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA)에 특이적으로 결합하는 어피바디를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 삭제
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 어피바디는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인, 재조합 벡터.
  7. 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산을 포함하는 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA)에 특이적으로 결합하는 어피바디를 이용하여 인간 혈청 알부민의 검출을 위한 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 어피바디는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
  9. 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산을 포함하는 인간 혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA)에 특이적으로 결합하는 어피바디를 이용하여 인간 혈청 알부민의 검출을 위한 키트.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 어피바디는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인, 키트.
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