JPWO2006059638A1 - 抗hiv薬、これを構成するポリペプチド、ポリペプチドをコードする遺伝子、抗hiv薬の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.アクチノヒビン多量体を含むことを特徴とする抗HIV(ヒト免疫不全ウイルス)薬。
2.アクチノヒビン多量体が、
(a)配列番号1で表わされるポリペプチド、及び
(b)(a)のアミノ酸配列中の1個または複数のアミノ酸が欠失もしくは置換され、または付加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログ
から選択される複数のポリペプチド(同一であっても異なっていてもよい)を
50個以下のアミノ酸からなるリンカーで連結したものである前記1記載の抗HIV薬。
3.アクチノヒビン多量体がアクチノヒビン2量体である前記1または2記載の抗HIV薬。
4.前記リンカーが配列番号2で表わされるペプチド鎖である前記1〜3のいずかに記載の抗HIV薬。
5.さらにHisタグを含む前記1〜4のいずかに記載の抗HIV薬。
6.前記1〜5のいずれかに記載の抗HIV薬に対応するポリペプチド。
7.前記6に記載のポリペプチドをコードする塩基配列またはその相補鎖。
8.前記7に記載の塩基配列を宿主細胞に導入した形質転換体。
9.宿主細胞が大腸菌または放線菌である前記8に記載の形質転換体。
10.Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pET30:dAH株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号FERM BP−10161)である前記9に記載の形質転換体。
11.前記9〜10に記載の形質転換体を培養して形質転換体内または培養物中に前記6に記載のポリペプチドを産生させ、これを単離することを含む前記1〜5のいずれかに記載の抗HIV薬の製造方法。
本発明の第1の実施形態では、アクチノヒビン多量体を含むことを特徴とする抗HIV薬が提供される。ここで、アクチノヒビンは、
(a)配列番号1で表わされるポリペプチド、及び
(b)(a)のアミノ酸配列中の1個または複数のアミノ酸が欠失もしくは置換され、または付加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログを意味する。
(α)エンベロープ糖タンパク質(gp120、gp41)を発現した細胞(例えば、HeLa細胞)と
(β)CD4、HIV−1の侵入に必須なHIV−1の補助受容体(CXCR4またはCCR5)遺伝子を発現した細胞(例えば、HeLa細胞)
との融合の有無によって判定できる。実際的には、さらに、上記(α)に転写活性化タンパク質(Tat)遺伝子を、上記(β)にHIVのLTR(末端反復配列)とベータガラクトシダーゼ遺伝子を導入したものを用いる。このような細胞を用いることにより、細胞のHIV感染に伴いベータガラクトシダーゼが活性化するために、ベータガラクトシダーゼの基質であるX−gal(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−ベータ−ガラクトシド)の呈色により合胞体形成(HIV感染)の有無が判別できる。
本発明の第2の実施形態では、アクチノヒビン多量体を含むことを特徴とする上記抗HIV薬に対応するポリペプチドが提供される。ポリペプチドの詳細は抗HIV薬として説明したものと同様である。
本発明の第3の実施形態では、上記ポリペプチドをコードする塩基配列またはその相補鎖が提供される。
例えば、本発明により提供される塩基配列には、配列番号3のポリペプチドに対応する配列番号4の塩基配列(終止コドンを含む)が含まれるが、より一般的には、
(a')配列番号1で表わされるポリペプチドをコードする塩基配列、及び
(b')(a')のアミノ酸配列中の1個または複数のアミノ酸が欠失もしくは置換され、または付加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログをコードする塩基配列
から選択されるアクチノヒビンコード領域(複数個)を、リンカー配列をコードする塩基配列で連結した塩基配列が提供される。
本発明の第4の実施形態では、上記塩基配列を宿主細胞に導入した形質転換体が提供される。形質転換体は、アクチノヒビン多量体を安定して発現できるものであればよく、大腸菌、放線菌その他の細菌、真菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等が挙げられ、また、細胞融合、遺伝子操作などの手法により予め細胞工学的に変異させた細胞も、本発明の形質転換体の宿主に含まれる。
本発明の第4の実施形態では、前記形質転換体を培養して形質転換体内または培養物中に前記ポリペプチドを産生させ、これを単離することを含むアクチノヒビン多量体抗HIV薬の製造方法が提供される。
(1)アクチノヒビン2量体をコードする遺伝子の構築
図1に示した手順に従って、配列番号3で表わされるアクチノヒビン2量体をコードする遺伝子(配列番号4)を構築した。
pUC19:dAHを鋳型として、AA−1 LIC(配列番号11)及びTGA 114 LIC(配列番号12)を用いて94℃30秒、60℃30秒、72℃1分の条件(30サイクル)のPCRを行ない、アクチノヒビン2量体遺伝子を増幅した。得られたDNA断片をdGTP存在下でT4DNAポリメラーゼ反応を行なった後、大腸菌発現ベクターpET30 Xa/LICと連結し、アクチノヒビン2量体発現プラスミドpET30:dAHを構築した。
LA培地には硫酸カナマイシン(KM)、クロラムフェニコール(CM)をそれぞれ終濃度30μg/ml、34μg/mlとなるように加えたものを使用した。
LA培地上に形成されたアクチノヒビン2量体発現プラスミドpET30:dAHで形質転換した大腸菌BL21(DE3)plysS(2004年11月10日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国,305−8566,茨城県つくば市東1丁目1番地中央第6)に受託番号FERM BP−10161として寄託した。)のコロニーを2%グルコース、KM(30μg/ml)及びCM(34μg/ml)を含むLB培地1mlに植菌し、37℃で一晩振とう培養した。この菌液8mlをKM(30μg/ml)及びCM(34μg/ml)を含むLB培地800mlに加えて37℃で振とう培養した。O.D.600nmの値が0.3に達したところでイソプロピルβ−チオガラクトピラノシド(IPTG)を終濃度1mMとなるように加え、再び37℃で2時間振とう培養した。
(1)アクチノヒビン(単量体)発現プラスミドの構築
プラスミド2A3Kを鋳型として、前記AA−1 LIC(配列番号11)及び前記TGA 114 LIC(配列番号12)を用いて94℃30秒、60℃30秒、72℃1分の条件(30サイクル)のPCRを行ない、配列番号1のアクチノヒビン遺伝子を増幅した。得られたDNA断片をdGTP存在下でT4DNAポリメラーゼ反応を行なった後、大腸菌発現ベクターpET30 Xa/LICと連結し、アクチノヒビン(単量体)発現プラスミドpET30:AHを構築した。
アクチノヒビン2量体発現プラスミドpET30:dAHに代えてアクチノヒビン(単量体)発現プラスミドpET30:AHを用いたほかは、実施例1の(3)と同様な操作により形質転換した大腸菌BL21(DE3)plysSにアクチノヒビン(単量体)を発現させた。
以下の手順によりアクチノヒビン融合タンパク質を調製・精製し、その抗HIV効果について試験した。
5mlの金属キレートSepharose 4Bを15ml容プラスチックチューブに入れ、10mlのmilliQ水を加え穏やかに撹拌した後、264×g、3分間、室温で遠心分離し、上清を除いた。5mlのチャージバッファー(50mMNiSO4)を加え撹拌して樹脂を活性化し、10mlのmilliQ水で2回洗浄した後、10mlの結合バッファー(DN)で樹脂を平衡化した。
アセトニトリルに懸濁したODS樹脂10mlをカラムに充填し、アセトニトリル:0.01%トリフルオロ酢酸(TFA)の等量混液50mlでカラムを洗浄した後、アセトニトリル:0.01%TFAの5:95混液50mlでカラムを平衡化した。金属セファロースSepharose 4Bで精製したHisタグ−アクチノヒビン2量体融合タンパク質をカラムの上端に乗せ、アセトニトリル:0.01%TFAの5:95混液50mlでカラムを洗浄した後、アセトニトリル:0.01%トリフルオロ酢酸(TFA)の等量混液50mlでカラムに吸着したHisタグ−アクチノヒビン2量体融合タンパク質を溶出した。得られた溶出液を濃縮乾固した後、milliQ水に溶解した。
ODSカラムで脱塩した試料溶液を少量のMilliQ水に溶解し、高速液体クロマトグラフィー(PEGASIL−B 10φ×250mm、SSC センシュー科学株式会社)にかけ、アセトニトリル:0.01%TFAの5:95混液とアセトニトリル:0.01%TFAの70:30混液を用いた30分の直線濃度勾配で、220nmの吸収を検出しながら3ml/分の流速において、12分と16分に出現するピ―クを集めた。この各分画を溶液のpHが中性付近になるまで凍結乾燥を繰り返した後、milliQ水に溶解した。
DME培地で1.6×105細胞/mlに調整したHeLa/CD4/LTR細胞を96穴プレートの各穴に50μlずつ播種し、ここに、無血清DME培地で各段階に希釈した試料溶液を、各穴に10μlずつ添加した。さらに、1.6×105細胞/mlに調製したHeLa135/T−env(TトロピックHIV−1由来エンベロープ糖タンパク質)/Tat細胞を、各穴に50μlずつ接種し、5%CO2気流下、37℃で24時間培養した。培養液を除き細胞溶解液20μlずつ各穴に加え、室温で約15分間放置した。発色基質液100μl(o−ニトロフェニル−ベータ−D−ガラクトピラノシド20μlとZ−バッファー(60mMリン酸水素二ナトリウム、40mMリン酸二水素ナトリウム、10mM塩化カリウム、1mM硫酸マグネシウム、50mM2−メルカプトエタノール、pH7.0)80μlの混液)を加えて、37℃で80分間反応させた後、反応停止液2MNa2CO3を25μlずつ各穴に添加し、PAWER WAVE X340(BIO TEC INSTROMENTS CO.)を用いて405nmにおける吸光度を測定した。得られた吸光度から合胞体形成率を下記の式より求めた。
Claims (11)
- アクチノヒビン多量体を含むことを特徴とする抗HIV(ヒト免疫不全ウイルス)薬。
- アクチノヒビン多量体が、
(a)配列番号1で表わされるポリペプチド、及び
(b)(a)のアミノ酸配列中の1個または複数のアミノ酸が欠失もしくは置換され、または付加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログ
から選択される複数のポリペプチド(同一であっても異なっていてもよい)を
50個以下のアミノ酸からなるリンカーで連結したものである請求項1記載の抗HIV薬。 - アクチノヒビン多量体がアクチノヒビン2量体である請求項1または2記載の抗HIV薬。
- 前記リンカーが配列番号2で表わされるペプチド鎖である請求項1〜3のいずかに記載の抗HIV薬。
- さらにHisタグを含む請求項1〜4のいずかに記載の抗HIV薬。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の抗HIV薬に対応するポリペプチド。
- 請求項6に記載のポリペプチドをコードする塩基配列またはその相補鎖。
- 請求項7に記載の塩基配列を宿主細胞に導入した形質転換体。
- 宿主細胞が大腸菌または放線菌である請求項8に記載の形質転換体。
- Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pET30:dAH株(独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号FERM BP−10161)である請求項9に記載の形質転換体。
- 請求項9〜10に記載の形質転換体を培養して形質転換体内または培養物中に請求項6に記載のポリペプチドを産生させ、これを単離することを含む請求項1〜5のいずれかに記載の抗HIV薬の製造方法。
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