WO2006059638A1 - 抗ｈｉｖ薬、これを構成するポリペプチド、ポリペプチドをコードする遺伝子、抗ｈｉｖ薬の製造方法 - Google Patents

抗ｈｉｖ薬、これを構成するポリペプチド、ポリペプチドをコードする遺伝子、抗ｈｉｖ薬の製造方法 Download PDF

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actinohibin
polypeptide
hiv
hiv drug
transformant
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Haruo Tanaka
Junji Inokoshi
Satoshi Omura
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The Kitasato Gakuen Foundation
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
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    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
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    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)

Definitions

  • Anti-HIV drug polypeptide constituting the same, gene encoding polypeptide, method for producing anti-HIV drug
  • the present invention relates to an antiviral drug (anti-HIV drug) against human immunodeficiency virus (HIV), a polypeptide constituting the same, a DNA encoding the polypeptide, and a trait using the DNA.
  • the present invention relates to a transformed transformant and a method for producing the anti-HIV drug.
  • the present invention relates to an antiviral drug (anti-HIV drug) against HIV-1 virus, a polypeptide constituting the same, a DNA encoding the polypeptide, a transformant transformed using the DNA, and a method for producing the anti-HIV drug. .
  • Reverse transcriptase inhibitors are broadly classified into nucleotide inhibitors and non-nucleotide inhibitors, but long-term administration of nucleotide inhibitors shows serious side effects, and is about 1 year after the start of administration. It is known that resistant strains emerge. Non-nucleotide inhibitors have few side effects but have high specificity of action, so resistant strains appear early. Protease inhibitors, on the other hand, exhibit good antiviral activity alone, but their effects are almost temporary, and there is a decrease in sensitivity due to mutations in the amino acid sequence of HIV protease. There are also problems in terms of side effects such as low stability in the body and digestive disorders.
  • HIV infection is caused by adhesion to the host cell and entry into the cell through binding of HIV protein glycoprotein 120 (gpl20) to the host cell surface receptor CD4.
  • gpl20 HIV protein glycoprotein 120
  • CD4 HIV protein glycoprotein 120
  • an attempt was made to inhibit the binding between gpl20 and CD4.
  • attempts have been made to create soluble CD4 by genetic engineering and to administer it to the human body.
  • this method shows inhibitory activity in vitro, but has a short half-life in vivo. For this reason, anti-HIV activity was not observed.
  • human CD4 expressed in mouse cells did not cause infection, suggesting the presence of a second adhesion molecule.
  • this second receptor is a group of chemokine receptors.
  • HIV is divided into two types: macrophage-directed strains (M-tropic HIV) and T-cell strain-directed strains (T-tropic HIV). It was shown that the difference was due to the difference in the molecular type of the second receptor.
  • the target cell expresses a CC chemokine receptor 5 (CCR5: M-tropic HIV receptor) or CXC chemokine receptor 4 (CXCR4: T-tropic HIV receptor) as the second receptor! It became clear that the decision was made depending on whether or not. Based on these new findings, the mode of entry of HIV into target cells is now considered as follows. First, gpl20 binds to CD4 force, and then binds to host cell CCR5 or CXCR4.
  • the present inventor searches for metabolites produced by microorganisms and activates actinomycetes strain K97-0003 (December 9, 1998, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) It has been found that it has excellent HIV inhibitory activity at the Biodeposition Center (deposited as FERM BP-6670 in Japan, 305-8566, Tsukuba Sakai Higashi, Ibaraki Pref. It was shown that the active ingredient is a substance that inhibits syncytium formation of the mechanism outlined above (Patent Document 1: WO 00Z52043 pamphlet).
  • Patent Document 1 International Publication No. 00Z52043 Pamphlet
  • An object of the present invention is to provide an anti-HIV drug which is an anti-HIV drug by inhibiting syncytium formation and has a higher effect than the polypeptide of WO00Z52043.
  • the present invention provides the following anti-HIV drug, polypeptide, base sequence, transformant and method for producing the anti-HIV drug.
  • An anti-HIV (human immunodeficiency virus) drug characterized by containing a lactinohibin multimer.
  • anti-HIV drug according to any one of 1 to 4 above, further comprising a His tag.
  • the transformant according to 9 above which is Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS / pET30: dAH strain (Accessory Number FERM BP-10161, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST)).
  • Any of the above 1 to 5 comprising culturing the transformant described in 9 to 10 above to produce the polypeptide described in 6 above in the transformant or in the culture and isolating it.
  • an anti-HIV drug comprising an actinohibin multimer.
  • actinohibin is
  • polypeptide in which a part of the amino acid sequence listed in (b) above is deleted, substituted, or added is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 and at least 20%, preferably 30% or more, More preferably, it means a polypeptide having an amino acid sequence homology of 50% or more, more preferably 80% or more, and most preferably 90% or more. As long as syncytium formation inhibitory activity is shown, amino acid deletions, substitutions or additions can occur anywhere.
  • the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1 is composed of three homologous domains (1 to 38, 39 to 76, and 77 to 114 in SEQ ID NO: 1), and is composed of an actinohibin multimer (n-mer). In which 1 or 2 homologous domains are added.
  • the number (n) of actinohibin units contained in an actinohibin multimer (n-mer) is not particularly limited as long as it shows syncytium formation inhibitory activity, but usually 6 amounts in consideration of handling properties during purification. Less than body, preferably less than trimer, for example, dimer.
  • Syncytium formation inhibitory activity can be appropriately measured, for example,
  • Shed envelope glycoprotein (g p 120, gp41) cells that expressed (e.g., HeLa cells) and
  • CD4 cells expressing the HIV-1 co-receptor (CXCR4 or CCR5) gene essential for HIV-1 entry (eg, HeLa cells)
  • a transcriptionally active protein (Tat) gene is introduced into ( ⁇ ) above, and an HIV LTR (terminal repeat sequence) and beta-galatatosidase gene are introduced into (j8) above.
  • Tat transcriptionally active protein
  • HIV LTR terminal repeat sequence
  • beta-galatatosidase gene are introduced into (j8) above.
  • beta-galactosidase is activated as the cells are infected with HIV, so that the substrate for beta-galactosidase X-gal (5-bromo 4-chloro-1, 3-indolyl
  • the presence or absence of syncytium formation (HIV infection) can be determined by coloration of beta-galactosides.
  • the actinohibin multimer means that the amino acid sequences of the above (a) or (b) are linked directly or via an arbitrary linker sequence, and Contains sequences useful for polypeptide purification and handling.
  • the linker sequence is not particularly limited as long as it does not impair the anti-HIV action of the multimer. Usually, the sequence also has a power of 50 or less, preferably 20 or less, more preferably 15 or less amino acid residues. It is.
  • the polypeptide represented by SEQ ID NO: 2 is included.
  • the actinohibin multimer of the present invention includes the polypeptide of SEQ ID NO: 1 having the linker sequence of SEQ ID NO: 2 and the polypeptide having the polypeptide power of SEQ ID NO: 1 (shown as SEQ ID NO: 3). This polypeptide is a dimer and has the same structure as a force trimer.
  • An example of an additional sequence useful for polypeptide purification and handling includes a His tag.
  • a His tag is, for example, a His tag.
  • actinohibin multimer exhibits excellent activity, but actinohibin has been shown to bind to the high mannose sugar chain of gp 120, and the binding as a cluster has an anti-HIV effect. There is a possibility that it can be raised.
  • polypeptide corresponding to the above-mentioned anti-HIV drug, comprising an actinohibin multimer.
  • the details of the polypeptide are the same as those described for the anti-HIV drug.
  • a base sequence encoding the above polypeptide or a complementary strand thereof is provided.
  • the nucleotide sequence provided by the present invention includes the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 (including the stop codon) corresponding to the polypeptide of SEQ ID NO: 3, more generally () A base sequence encoding the represented polypeptide, and
  • (b ′) a base sequence encoding a homolog having syncytium formation inhibitory activity, wherein one or more amino acids in the amino acid sequence of (a ′) are deleted, substituted, or added
  • a base sequence in which a plurality of selected actinohibin coding regions are linked by a base sequence encoding a linker sequence is provided.
  • the significance of the homolog, linker sequence and syncytium formation inhibitory activity is as described above.
  • the homolog is at least 20%, preferably 30% or more, more preferably 50% or more, more preferably 80% or more, and most preferably 90%, with the base sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It has the above homology.
  • the actinohibin monomer may be one in which a base sequence corresponding to one or two homologous domains is added to a base sequence corresponding to the force multimer of three homologous domains.
  • the number of nactinohibin coding regions contained in the nucleotide sequence (n) is not particularly limited as long as the finally obtained actinohibin multimer exhibits syncytium formation inhibitory activity. In consideration of the properties and the like, it is usually 6 or less, preferably 3 or less, for example, 2.
  • the base sequence according to the present invention may also include a sequence useful for production of a polypeptide.
  • a sequence useful for production of a polypeptide For example, if it is necessary or advantageous to express an actinohibin multimer in an organism first as a precursor polypeptide and post-translationally modify to obtain the actinohibin multimer as a mature protein A base sequence may be included. Examples of such a base sequence include a signal peptide sequence region used for secretion outside a microorganism. It may also contain sequences useful for polypeptide purification and handling. Examples of such a base sequence include a base sequence corresponding to the His tag.
  • the base sequence encoding the polypeptide may be encoded by a degenerate codon, but suitable for expression in the transformant described in the next section.
  • a base sequence is preferred.
  • the base sequence may be any of the above complementary strands.
  • Transformants include Escherichia coli, actinomycetes and other bacteria, fungi, yeast, animal cells, insect cells, etc., as long as they can stably express actinohibin multimers. Cells previously mutated by cell engineering by a technique such as manipulation are also included in the host of the transformant of the present invention.
  • the host cells are Escherichia coli and actinomycetes, and as an example of such a transformant, Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS / pET30: dAH strain (on November 10, 2004, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (deposited as FERM BP-10161 in Japan, 305-8 566, 1st, Tsukuba 1-chome, Ibaraki) Can be mentioned.
  • Transformants can be generated by any method known in the art! (For example, Joseph Sambrook et al., "Molecular and loning, 3rd Ed. (Cold bpnng Harbor Laboratory Press (2001 See))).
  • production of an actinohibin multimer anti-HIV drug comprising culturing the transformant to produce the polypeptide in or in the transformant and isolating it.
  • a usual culture method used for culturing the transformant is applied.
  • a medium to be used any of a natural medium and a synthetic medium can be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like that can be used by transformants.
  • Carbon sources include carbohydrates such as glucose, mannose, maltose, and molasses, organic acids such as citrate, malic acid, acetic acid, and fumaric acid, alcohols such as methanol and ethanol, methane, ethane, propane, and n — Hydrocarbons such as paraffin, amino acids such as glutamic acid, glycerol, etc. are used.
  • Nitrogen sources include ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, and ammonium phosphate, aspartic acid, glutamine, cystine, and alanine.
  • Amino acids, urea, peptone, meat extract, yeast extract, dry yeast, corn 'stip' liquor, soy flour, soluble 'vegetable' protein, cottonseed oil, soy casein, casamino acid, pharma media, etc. are used.
  • potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, cobalt sulfate, zinc sulfate, calcium pantothenate, molybdenum Ammonium acid, potassium aluminum sulfate, barium carbonate, calcium carbonate , Salt cobalt, salt, etc. are used.
  • substances that promote the growth of bacterial cells or the production of actinohibin multimers such as trace amounts of metal salts, vitamins, and thyamine can be added to the medium as necessary.
  • transformants when a transformant requires a specific substance, it is necessary to cover what is necessary for growth. Any of these may be used as long as they are useful for the production of actinohibin multimers.
  • transformants particularly those known as culture materials for Escherichia coli and actinomycetes can be used.
  • the shaking culture method using a liquid medium, the aeration and stirring culture method and the like are preferable.
  • the culture temperature can be applied as long as the transformant grows and can produce actinohibin multimers.
  • the culture can be appropriately selected according to the properties of the transformant.
  • the actinohibin multimer in the culture is present in the culture solution, the culture solution containing the bacterial cells can be collected and used as is, but generally, by filtration, centrifugation, etc. according to a conventional method.
  • the actinohibin multimer solution after separating the actinohibin multimer and the transformant in the culture solution is used.
  • the resulting culture is collected by filtration or centrifugation, and then collected by a mechanical method or enzymatic method such as lysozyme. Disrupte by the method, and if necessary, add a chelating agent such as EDTA and Z or a surfactant to solubilize the transformant cells, and separate and collect as an aqueous solution.
  • a chelating agent such as EDTA and Z or a surfactant
  • the actinohibin multimer-containing solution thus obtained is subjected to, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting-out treatment with ammonium sulfate, sodium sulfate or the like, or a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone. It may be precipitated by a fractional precipitation method.
  • This precipitate can be dissolved in water and dialyzed through a semipermeable membrane to remove lower molecular weight impurities. Further, it may be purified by gel filtration using an adsorbent or a gel filter, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, or reverse phase chromatography. In particular, in an embodiment in which an actinohibin multimer containing a His tag is produced, it can be purified by a column having a stationary phase having high affinity for the His tag such as Ni, Zn, Cu, and Co.
  • a purified actinohibin multimer can be obtained by treating the solution containing actinohibin multimer obtained by these means by vacuum concentration, lyophilization or the like. Also, if necessary, remove peptides added to actinohibin multimers (for example, His tag). Please leave.
  • SEQ ID NO: 4 a gene (SEQ ID NO: 4) encoding an actinohibin dimer represented by SEQ ID NO: 3 was constructed.
  • the synthetic oligonucleotides Link-sen (SEQ ID NO: 5) and Link-asn (SEQ ID NO: 6) are added to the 3 'terminal side and 5' terminal side, respectively, and the 11 base homologous sequence site
  • PCR was performed under the conditions of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute (30 cycles).
  • the actinohibin gene (N—AH gene) corresponding to the N-terminal side of the actinohibin dimer is used as a serotype 2A3K containing the AH gene cloned from actin-producing bacteria.
  • PCR using various synthetic oligonucleotide primers AA—IBam (SEQ ID NO: 7) and AH— Link (SEQ ID NO: 8) at 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute (30 cycles) Created by.
  • the resulting N-AH gene has 15 base pairs of the 5 'end of the linker gene added to the 3' end of the actinohibin gene.
  • the actinohibin gene (C-AH gene) corresponding to the C-terminal side of the actinohibin dimer was prepared as follows. In other words, PCR was performed under conditions of 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1 minute (30 cycles) using Link-dAH (SEQ ID NO: 9) and TGAEco (SEQ ID NO: 10) with plasmid 2A3K as a saddle. Was done. The resulting C-AH gene has 15 bases of the 3 'end of the linker gene added to the 5' end of the actinohibin gene.
  • the linker gene and C AH gene are in a saddle type, and the SOE method (Horton, RM, Hunt, HD, Ho, SN, Pull en, j and Pease, LR Engineering hvona genes without the use of restriction enz PCR was performed according to Gene 77, 61-68 (1989), and a LAH gene was prepared by adding a linker gene to the 5 'end of the actinohibin gene.
  • N-AH gene and the LAH gene thus obtained were digested with restriction enzymes BamHI, HindIII, HindIII, and EcoRI, respectively.
  • the obtained two DNA fragments were mixed with E. coli cloning vector pUC19 digested with BamH I and EcoR I and ligated using T4 DNA ligase.
  • Escherichia coli JM109 was transformed with this solution to prepare plasmid pUCl9: dAH containing the actinohibin dimer gene.
  • pUC19: dAH as a saddle, using AA-1 LIC (SEQ ID NO: 11) and TGA 114 LIC (SEQ ID NO: 12), 94 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute (30 cycles) PCR was performed to amplify the actinohibin dimer gene.
  • the obtained DNA fragment was subjected to T4 DNA polymerase reaction in the presence of dGTP, and then ligated with an E. coli expression vector pET30 Xa / LIC to construct an actinohibin dimer expression plasmid pET30: dAH.
  • kanamycin sulfate (KM) and chloramphenicol (CM) were added to final concentrations of 30 gZml and 34 gZml, respectively.
  • Actinobine dimer expression plasmid pET30 formed on LA medium Escherichia coli BL21 (DE3) plysS transformed with dAH (November 10, 2004, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Japan) 305-8566, Ibaraki Prefecture Tsukuba Sakai Higashi 1-chome, 1st, center 6) deposited with the accession number FERM BP— 10161.) colonies of 2% glucose, KM (30 ⁇ g / ml) and CM ( Inoculated into 1 ml of LB medium containing 34 ⁇ g / ml) and cultured at 37 ° C with shaking.
  • Actinohibin dimer expression plasmid pET30 E. coli BL21 (DE3) plysS transformed by the same procedure as in Example 1, (3) except that actinohibin (monomer) expression plasmid pET30: AH was used instead of dAH. Actinohibin (monomer) was expressed in
  • An actinohibin fusion protein was prepared and purified by the following procedure and tested for its anti-HIV effect.
  • Escherichia coli expressing His-tagged actinohibin dimer according to Example 1 was suspended in 10 ml of binding buffer (5 mM imidazole, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.9)). did. Take an interval of 30 seconds every minute, destroy the cells by applying ultrasonic waves for a total of 5 minutes, and centrifuge the obtained bacterial extract at 8,370 X g for 10 minutes at 4 ° C. Divided into supernatant and precipitate. The resulting precipitate was dissolved in a binding buffer containing 6M guanidine hydrochloride (hereinafter referred to as binding buffer DN), and centrifuged at 8,370 Xg for 10 minutes at 4 ° C to remove the precipitate.
  • binding buffer DN 6M guanidine hydrochloride
  • the column was filled with 10 ml of ODS resin suspended in acetonitrile, and the column was washed with 50 ml of an equal volume of acetonitrile: 0.01% trifluoroacetic acid (TFA), and then acetonitrile: 0.0 1% TF A 5: The column was equilibrated with 50 ml of 95 mixture.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • HeLaZCD4ZLTR cells adjusted to 1.6 x 10 5 cells Zml in DME medium 50 1 was seeded in each hole of the rate, and 10 1 each of the sample solution diluted in each stage with serum-free DME medium was added thereto. Furthermore, HeL al35ZT-env (Ttropic HIV-1-derived envelope glycoprotein) ZTat cells prepared at 1.6 X 10 5 cells / ml were inoculated in a volume of 50 1 in each well at 37 ° C in a 5% CO stream. C. cultured for 24 hours. Excluding the culture solution
  • Chromogenic substrate solution 100 ⁇ 1 ( ⁇ — -Trophe-Lubeta 1 D-galactopyranoside 20 ⁇ and ⁇ —buffer (60 mM disodium hydrogen phosphate, 40 mM sodium dihydrogen phosphate, 10 mM potassium chloride, ImM magnesium sulfate) , 50mM2—Mercaptoethanol, pH 7.0) 80 1)) and react at 37 ° C for 80 minutes, and then add 2Ma CO to each hole.
  • Chromogenic substrate solution 100 ⁇ 1 ( ⁇ — -Trophe-Lubeta 1 D-galactopyranoside 20 ⁇ and ⁇ —buffer (60 mM disodium hydrogen phosphate, 40 mM sodium dihydrogen phosphate, 10 mM potassium chloride, ImM magnesium sulfate) , 50mM2—Mercaptoethanol, pH 7.0) 80 1)) and react at 37 ° C for 80 minutes, and then add 2Ma CO to each hole.
  • the absorbance at 405 nm was measured using a PAWER WAVE X340 (BIO TEC INSTROMENTS CO.).
  • the syncytium formation rate was obtained from the following formula.
  • Syncytium formation rate (absorbance of the hole to which the sample was added Z absorbance of the sample) X 1 0 0
  • Table 1 shows the 50% inhibitory concentration (IC) for syncytium formation of the actinohibin fusion protein thus obtained.
  • a His tag-actinohibin monomer fusion protein was also prepared by the same operation as the preparation of the above His tag-actinohibin dimer fusion protein, and the syncytium formation rate was determined. The results are also shown in Table 1.
  • the actinohibin dimer fusion protein according to the present invention has a syncytium formation inhibitory capacity two or more times that of the actinohibin monomer fusion protein.
  • His tag reduces syncytium formation inhibition ability to about 7 to 1/8.
  • the 50% inhibitory concentration of actin-hibin dimer fusion protein without His tag is estimated to be about 0.03 M.
  • the actinohibin multimeric protein of the present invention inhibits syncytium formation, which is a critical pathway in HIV infection. This is thought to be due to the mechanism of action similar to the inhibition of syncytium formation by actinohibin, and is considered to prevent not only T-tropic HIV but also M-tropic HIV infection.
  • the anti-HIV effect of the actinohibin dimer protein of the present invention is more than twice that of the actinohibin monomer fusion protein, and shows a remarkable effect even in a very small amount.
  • an anti-HIV drug polypeptide that can be used as a preventive or therapeutic drug for AIDS is provided.
  • the gene encoding the actinohibin multimeric protein of the present invention can be introduced into various hosts and produced as a recombinant actinohibin multimeric protein, and can be easily produced.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram summarizing a method for constructing an actinohibin dimer.

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Abstract

　本発明は、アクチノヒビン多量体を含むことを特徴とする抗ＨＩＶ薬、アクチノヒビン多量体であるポリペプチド、それをコードする遺伝子及び抗ＨＩＶ薬の製造方法であり、合胞体形成を阻害することによる抗ＨＩＶ薬であってさらに効果を高めた抗ＨＩＶ薬の提供を目的とする。

Description

明 細 書
抗 HIV薬、これを構成するポリペプチド、ポリペプチドをコードする遺伝子 、抗 HIV薬の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、ヒト免疫不全ウイノレス (HIV： human immuno deficiency virus)に対する抗 ウィルス薬（抗 HIV薬）、これを構成するポリペプチド、このポリペプチドをコードする DNA、この DNAを用いて形質転換した形質転換体及び前記抗 HIV薬の製造方法 に関する。特に HIV—1ウィルスに対する抗ウィルス薬 (抗 HIV薬）、これを構成する ポリペプチド、このポリペプチドをコードする DNA、この DNAを用いて形質転換した 形質転換体及び前記抗 HIV薬の製造方法に関する。
背景技術
[0002] 現在、 HIVウィルスにより引き起こされる後天性免疫不全症候群 (AIDS)に対する 治療剤としては、逆転写酵素阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤が用いられている。
[0003] 逆転写酵素阻害剤は、ヌクレオチド系阻害剤と非ヌクレオチド系阻害剤に大別され るが、ヌクレオチド系阻害剤の長期投与は重篤な副作用を示し、投与開始後 1年程 度で耐性株が出現することが知られている。また、非ヌクレオチド系阻害剤は、副作 用は少ないが作用の特異性が高いために、耐性株が早期に出現する。一方、プロテ ァーゼ阻害剤は単独でも良好な抗ウィルス活性を示すが、その効果はおおむね一 時的で、 HIVプロテアーゼのアミノ酸配列の変異による感受性の低下が見られる。ま た、体内での安定性が低いこと及び消化器障害などの副作用の点で問題がある。
[0004] HIVの感染は、 HIV表面蛋白質である glycoprotein 120 (gpl20)と、宿主細胞 表面の受容体である CD4との結合を介して、宿主細胞に接着して細胞内へ侵入す ることにより成立する。したがって、 gpl20と CD4の結合を阻害する物質は HIVと細 胞の接着を阻害し、 HIVの感染を防御できると期待されるため、 gpl20と CD4との結 合を阻害する試みがなされた。一例として、可溶性の CD4を遺伝子工学的に作成し て、ヒトの体内に投与するような試みなども行なわれた。しかしながら、このような方法 では試験管内では阻害活性が認められるものの、生体内では半減期が短いなどの 理由で、抗 HIV活性は認められなカゝつた。また、ヒトの CD4をマウスの細胞に発現さ せても感染が起こらないことが明らかとなり、第 2の接着分子の存在が示唆されてい た。
[0005] 近年、この第 2の受容体が、一群のケモカイン受容体であるとの報告が相次いだ。
HIVは、マクロファージ指向性を示す株 (M—トロピック HIV)と T細胞株指向性を示 す株 (T—トロピック HIV)の 2種類に大別される力 これらのウィルス株間に見られる 細胞指向性の差が、第 2受容体の分子種の違いによることが示された。すなわち、標 的細胞が第 2受容体として CCケモカイン受容体 5 (CCR5： M—トロピック HIV受容 体）または CXCケモカイン受容体 4 (CXCR4 :T—トロピック HIV受容体）の!、ずれを 発現しているかの違いにより、決定されることが明ら力となった。これらの新たな知見 から現在、 HIVの標的細胞への侵入様式は次のように考えられている。まず、 gpl2 0と CD4力結合し、続いて宿主細胞の CCR5又は CXCR4と結合する。これにより gp 120の構造が変化して glycoprotein 1 (gp41)が裸出し、細胞膜と融合することに より感染が成立する。また、該当するケモカインは HIVのケモカイン受容体への結合 を競合的にブロックし、 HIVの感染を抑制する。この一連の発見は感染と発症の機 構の解明を加速しただけでなぐ抗 HIV戦略にも新たな視点を提供した。
[0006] かかる視点の下、本発明者は、微生物の生産する代謝産物の中から探索し、放線 菌菌株 K97— 0003株（1998年 12月 9日に、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国， 305-8566,茨城県つくば巿東 1丁目 1番地中央 第 6)に受託番号 FERM BP— 6670として寄託）の培養液力 優れた HIV阻害活性 を有することを見出し、その活性成分が上に概説する機構の合胞体形成を阻害する 物質であることを示した (特許文献 1：国際公開第 00Z52043号パンフレット)。
[0007] 特許文献 1：国際公開第 00Z52043号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、合胞体形成を阻害することによる抗 HIV薬であって WO00Z52043の ポリペプチドよりもさらに効果を高めた抗 HIV薬の提供を目的とする。
課題を解決するための手段 [0009] 本発明者は、 WO00Z52043で開示する 114アミノ酸残基のポリペプチド（配列番 号 1)についてさらに検討を行なった結果、その多量体がより大きな抗 HIV効果を有 することを見出し、本発明を完成するに至った。
[0010] すなわち、本発明は、以下の抗 HIV薬、ポリペプチド、塩基配列、形質転換体及び 抗 HIV薬の製造方法を提供する。
1.ァクチノヒビン多量体を含むことを特徴とする抗 HIV (ヒト免疫不全ウィルス)薬。
2.ァクチノヒビン多量体が、
(a)配列番号 1で表わされるポリペプチド、及び
(b) (a)のアミノ酸配列中の 1個または複数のアミノ酸が欠失もしくは置換され、または付 加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログ
力も選択される複数のポリペプチド（同一であっても異なって 、てもよ 、）を
50個以下のアミノ酸力もなるリンカ一で連結したものである前記 1記載の抗 HIV薬。
3.ァクチノヒビン多量体がァクチノヒビン 2量体である前記 1または 2記載の抗 HIV薬
4.前記リンカ一が配列番号 2で表わされるペプチド鎖である前記 1〜3のいずかに記 載の抗 HIV薬。
5.さらに Hisタグを含む前記 1〜4の!、ずかに記載の抗 HIV薬。
6.前記 1〜5のいずれかに記載の抗 HIV薬に対応するポリペプチド。
7.前記 6に記載のポリペプチドをコードする塩基配列またはその相補鎖。
8.前記 7に記載の塩基配列を宿主細胞に導入した形質転換体。
9.宿主細胞が大腸菌または放線菌である前記 8に記載の形質転換体。
10. Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS/pET30:dAH株（独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センター受託番号 FERM BP— 10161)である前記 9に記 載の形質転換体。
11.前記 9〜 10に記載の形質転換体を培養して形質転換体内または培養物中に前 記 6に記載のポリペプチドを産生させ、これを単離することを含む前記 1〜5のいずれ かに記載の抗 HIV薬の製造方法。
発明を実施するための最良の形態 [0011] 抗 HIV薬
本発明の第 1の実施形態では、ァクチノヒビン多量体を含むことを特徴とする抗 HI V薬が提供される。ここで、ァクチノヒビンは、
(a)配列番号 1で表わされるポリペプチド、及び
(b) (a)のアミノ酸配列中の 1個または複数のアミノ酸が欠失もしくは置換され、または付 加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログを意味する。
[0012] 上記 (b)に挙げるアミノ酸配列の一部が欠損、置換し、若しくは付加されたポリぺプ チドとは、配列番号 1記載のアミノ酸配列と、少なくとも 20%、好ましくは 30%以上、よ り好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 80%以上、最も好ましくは 90%以上のァミノ 酸配列の相同性を有するポリペプチドを意味する。合胞体形成阻害活性が示される 限りにおいて、アミノ酸の欠失、置換または付カ卩は、任意の場所で生じ得る。
[0013] また、配列番号 1で表わされるポリペプチドは 3つの相同ドメイン (配列番号 1中、 1 〜38、 39〜76及び 77〜114)力 構成されており、ァクチノヒビン多量体（n量体）に 1または 2個の相同ドメインが付加されたものも含まれる。ァクチノヒビン多量体 (n量 体）に含まれるァクチノヒビン単位の数 (n)は、合胞体形成阻害活性を示す限りにお いて特に限定されないが、精製時の取扱性等を考慮して通常は 6量体以下、好まし くは 3量体以下、例えば、 2量体である。
[0014] 合胞体形成阻害活性は、適宜、測定され得るが、例えば、
(ひ)エンベロープ糖タンパク質 (gp 120、 gp41)を発現した細胞（例えば、 HeLa細胞 )と
( β )CD4、 HIV- 1の侵入に必須な HIV— 1の補助受容体（CXCR4または CCR5) 遺伝子を発現した細胞 (例えば、 HeLa細胞）
との融合の有無によって判定できる。実際的には、さらに、上記（α )に転写活性ィ匕タ ンパク質 (Tat)遺伝子を、上記（ j8 )に HIVの LTR (末端反復配列）とベータガラタト シダーゼ遺伝子を導入したものを用いる。このような細胞を用いることにより、細胞の HIV感染に伴 、ベータガラクトシダーゼが活性ィ匕するために、ベータガラクトシダー ゼの基質である X— gal ( 5—ブロモ 4—クロ口一 3—インドリル一ベータ一ガラクトシ ド)の呈色により合胞体形成 (HIV感染)の有無が判別できる。 [0015] また、本発明にお 、てァクチノヒビン多量体とは、上記 (a)または (b)のアミノ酸配列が 直接に、または任意のリンカ一配列を介して連結したものを意味し、さらに、ポリぺプ チドの精製や取扱に有用な配列を含んでもょ 、。
[0016] リンカ一配列は、多量体の抗 HIV作用を害しないものであれば特に限定されない 力 通常、 50個以下、好ましくは 20個以下、より好ましくは 15個以下のアミノ酸残基 力もなる配列である。例えば、配列番号 2によって示されるポリペプチドが含まれる。 従って、本発明のァクチノヒビン多量体には、配列番号 1のポリペプチド 配列番号 2 のリンカ一配列-配列番号 1のポリペプチド力もなるポリペプチド (配列番号 3として 示す）が含まれる。このポリペプチドは 2量体である力 3量体以上の構造も同様であ る。
[0017] また、ポリペプチドの精製や取扱に有用な付加配列の例としては、 Hisタグが挙げら れる。その他、 GSTタグも使用できる力 一般にこれらの修飾配列は抗 HIV作用を低 下させる。 Hisタグは例えば、 Hisタグである。
6
[0018] ァクチノヒビン多量体が優れた活性を示す理由は明らかではな 、が、ァクチノヒビン は gp 120の高マンノース糖鎖に結合することが明らかになつており、クラスタ一として の結合が抗 HIV効果を高めて 、る可能性が考えられる。
[0019] ポリペプチド
本発明の第 2の実施形態では、ァクチノヒビン多量体を含むことを特徴とする上記 抗 HIV薬に対応するポリペプチドが提供される。ポリペプチドの詳細は抗 HIV薬とし て説明したものと同様である。
[0020] 塩某配列
本発明の第 3の実施形態では、上記ポリペプチドをコードする塩基配列またはその 相補鎖が提供される。
例えば、本発明により提供される塩基配列には、配列番号 3のポリペプチドに対応 する配列番号 4の塩基配列（終止コドンを含む）が含まれる力 より一般的には、 ( )配列番号 1で表わされるポリペプチドをコードする塩基配列、及び
(b')(a')のアミノ酸配列中の 1個または複数のアミノ酸が欠失もしくは置換され、または 付加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログをコードする塩基配列 力 選択されるァクチノヒビンコード領域 (複数個）を、リンカ一配列をコードする塩基 配列で連結した塩基配列が提供される。
[0021] ここで、ホモログ、リンカ一配列及び合胞体形成阻害活性の意義は上記の通りであ る。例えば、ホモログは、配列番号 1記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、少 なくとも 20%、好ましくは 30%以上、より好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 80% 以上、最も好ましくは 90%以上の相同性を有する。また、前述の通り、ァクチノヒビン 単量体は 3個の相同ドメイン力 なる力 多量体相当の塩基配列に 1または 2個の相 同ドメインに相当する塩基配列が付加されたものでもよい。塩基配列に含まれるァク チノヒビンコード領域の数 (n)は、最終的に得られるァクチノヒビン多量体が合胞体形 成阻害活性を示す限りにおいて特に限定されないが、上記の通り、精製時の取扱性 等を考慮して通常は 6以下、好ましくは 3以下、例えば、 2である。
[0022] さらに、本発明による塩基配列は、ポリペプチドの産生に有用な配列も含んでもよ い。例えば、生物体内でァクチノヒビン多量体を発現させる際に最初に前駆体ポリべ プチドとして形成し、翻訳後修飾してァクチノヒビン多量体を成熟タンパク質として得 ることが必要または有利な場合は、そのような塩基配列を含んでもよい。このような塩 基配列としては、微生物外への分泌に用いられるシグナルペプチド配列領域が挙げ られる。また、ポリペプチドの精製、取扱に有用な配列も含んでもよい。このような塩 基配列としては、 Hisタグに相当する塩基配列が挙げられる。
[0023] なお、本願にお!、て、ポリペプチドをコードする塩基配列とは、縮重コドンの 、ずれ によりコードされるものでもよいが、次項で述べる形質転換体中での発現に適した塩 基配列であることが好ましい。また、塩基配列は以上のいずれかの相補鎖であっても よい。
[0024] 形皙転龍
本発明の第 4の実施形態では、上記塩基配列を宿主細胞に導入した形質転換体 が提供される。形質転換体は、ァクチノヒビン多量体を安定して発現できるものであ ればよぐ大腸菌、放線菌その他の細菌、真菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等が挙 げられ、また、細胞融合、遺伝子操作などの手法により予め細胞工学的に変異させ た細胞も、本発明の形質転換体の宿主に含まれる。 [0025] 特に好ましくは、宿主細胞は、大腸菌及び放線菌であり、このような形質転換体の 一例としては、 Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS/pET30:dAH株（2004年 11月 10 日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国， 305 - 8 566,茨城県つくば巿東 1丁目 1番地中央第 6)に受託番号 FERM BP— 10161と して寄託された。）が挙げられる。
[0026] 形質転換体は当技術分野で知られて!/、る任意の方法により作成できる（例えば、 Jo seph Sambrook et al., "Molecularし loning , 3rd Ed. (Cold bpnng Harbor Laboratory Press(2001))参照）。
[0027] 抗 HIV薬の製造方法
本発明の第 4の実施形態では、前記形質転換体を培養して形質転換体内または 培養物中に前記ポリペプチドを産生させ、これを単離することを含むァクチノヒビン多 量体抗 HIV薬の製造方法が提供される。
[0028] 本発明の形質転換体の培養に際しては、その形質転換体の培養に用いられる通 常の培養方法が適用される。用いる培地は形質転換体の資化し得る炭素源、窒素 源、無機物などを程よく含有する培地であれば天然培地、合成培地いずれも用いる ことができる。
[0029] 炭素源としては、グルコース、マンノース、マルトース、糖蜜などの炭水化物、クェン 酸、リンゴ酸、酢酸、フマール酸などの有機酸、メタノール、エタノールなどのアルコ ール、メタン、ェタン、プロパン、 n—パラフィンなどの炭化水素、グルタミン酸などのァ ミノ酸ある ヽはグリセロールなどが用いられる。
[0030] 窒素源としては塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、硝酸アンモ-ゥム、リン酸ァ ンモ -ゥムなどのアンモ-ゥム塩、ァスパラギン酸、グルタミン、シスチン、ァラニンな どのアミノ酸、尿素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーン'スチープ'リ カー、大豆粉、ソルブル'ベジタブル 'プロテイン、綿実油、大豆カゼイン、カザミノ酸 、ファーマメディアなどが用いられる。無機物としてはリン酸一水素カリウム、リン酸二 水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸 第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、パントテン酸カルシウム、 モリブデン酸アンモ-ゥム、硫酸アルミニウムカリウム、炭酸バリウム、炭酸カルシウム 、塩ィヒコバルト、食塩などが用いられる。その他必要に応じて培地に微量の金属塩、 ビタミン、サイァミンなど菌体の増殖あるいはァクチノヒビン多量体の生産を促進する 物質を加えることができる。また形質転換体が特定の物質を要求する場合は、生育 に必要なものをカ卩えることが必要である。これらのものはァクチノヒビン多量体の生産 に役立つものであればよぐ例えば、形質転換体、特に、大腸菌や放線菌の培養材 料として公知のものはすべて用いることができる。
[0031] 形質転換体、特に微生物の大量培養には液体培地を用いた振盪培養法、通気撹 拌培養法などが好ましい。培養温度は形質転換体が発育し、ァクチノヒビン多量体を 生産できる範囲で適用できる。培養は形質転換体の性質に応じて、適宜選択して行 なうことができる。培養物中のァクチノヒビン多量体が培養液中に存在する場合には 、菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には常法にし たがって、ろ過、遠心分離などにより培養液中のァクチノヒビン多量体と形質転換体と を分離した後のァクチノヒビン多量体溶液が使用される。ァクチノヒビン多量体が形質 転換体内に存在する場合は、得られた培養物をろ過または遠心分離などの手段によ り、菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法 で破壊し、また必要に応じて EDTA等のキレート剤および Zまたは界面活性剤を添 加して形質転換体細胞を可溶化して、水溶液として分離採取する。
[0032] このようにして得たァクチノヒビン多量体含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、 更に、硫安、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノ ール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。次いで
、この沈殿物を水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純物を除 去することができる。また吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマ トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーにより精製してもよ い。特に Hisタグを含むァクチノヒビン多量体を産生させる態様では、 Ni、 Zn、 Cu、 C oなど Hisタグに対する親和性の高い固定相を有するカラムにより精製可能である。
[0033] これらの手段を用いて得られるァクチノヒビン多量体含有溶液を、減圧濃縮、凍結 乾燥等で処理することより、精製されたァクチノヒビン多量体を得ることができる。また 、必要に応じて、ァクチノヒビン多量体に付加されたペプチド (例えば、 Hisタグ)を除 去してちょい。
実施例
[0034] 以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明を制限 するものではない。
[0035] 実施例 1
(1)ァクチノヒビン 2量体をコードする遺伝子の構築
図 1に示した手順に従って、配列番号 3で表わされるァクチノヒビン 2量体をコード する遺伝子 (配列番号 4)を構築した。
[0036] はじめに、 2個のァクチノヒビン遺伝子を連結するための 13アミノ酸残基をコードす るリンカ一遺伝子を次のようにして作成した。
[0037] すなわち、合成オリゴヌクレオチド Link— sen (配列番号 5)及び Link— asn (配列 番号 6)をそれぞれの 3 '末端側と 5 '末端側に付加されて 、る 11塩基の相同配列の 部位でァニールさせ、プライマーダイマーを形成させた後、これを 94°C30秒、 60°C3 0秒、 72°C1分（30サイクル）の条件で PCRを行なった。
[0038] 次に、ァクチノヒビン 2量体の N末端側に相当するァクチノヒビン遺伝子 (N—AH遺 伝子）を、ァクチノヒビン生産菌よりクローユングされた AH遺伝子を保持するプラスミ ド 2A3Kを铸型として、 2種の合成オリゴヌクレオチドプライマー AA— IBam (配列番 号 7)及び AH— Link (配列番号 8)を用いて、 94°C30秒、 60°C30秒、 72°C1分（30 サイクル)の条件で PCRにより作成した。得られた N—AH遺伝子はァクチノヒビン遺 伝子の 3 '末端にリンカ一遺伝子の 5 '末端側 15塩基対分が付加して 、る。
[0039] ァクチノヒビン 2量体の C末端側に相当するァクチノヒビン遺伝子 (C— AH遺伝子） は次のように作成した。すなわち、プラスミド 2A3Kを铸型として Link— dAH (配列番 号 9)及び TGAEco (配列番号 10)を用いて、 94°C30秒、 60°C30秒、 72°C1分の 条件（30サイクル)で PCRを行なった。得られた C— AH遺伝子は、ァクチノヒビン遺 伝子の 5 '末端にリンカ一遺伝子の 3 '末端側 15塩基が付加されている。
[0040] リンカ一遺伝子と C AH遺伝子を铸型とし、既出の合成オリゴヌクレオチドである L ink— sen及び TGAEcoを用いて SOE法 (Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pull en, j. . and Pease, L.R. Engineering hvona genes without the use of restriction enz ymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77, 61〜68 (1989》による PCRを行 な ヽ、ァクチノヒビン遺伝子の 5 '末端にリンカ一遺伝子を付加させた L AH遺伝子 を作成した。
[0041] このようにして得られた N— AH遺伝子と L AH遺伝子を、それぞれ制限酵素 Ba mH I, Hind ΙΠ及び Hind III、 EcoR Iで消化した。得られた 2つの DNA断片を BamH Iと EcoR Iで消化した大腸菌クロー-ングベクター pUC19と混合し、 T4 DNAリガーゼを用いて連結した。この溶液で大腸菌 JM109を形質転換し、ァクチノ ヒビン 2量体遺伝子を含むプラスミド pUCl 9： dAHを作成した。
[0042] (2)ァクチノヒビン 2量体発現プラスミドの構築
pUC19 : dAHを铸型として、 AA— 1 LIC (配列番号 11)及び TGA 114 LIC ( 配列番号 12)を用いて 94°C30秒、 60°C30秒、 72°C 1分の条件（30サイクル）の PC Rを行ない、ァクチノヒビン 2量体遺伝子を増幅した。得られた DNA断片を dGTP存 在下で T4DNAポリメラーゼ反応を行なった後、大腸菌発現ベクター pET30 Xa/ LICと連結し、ァクチノヒビン 2量体発現プラスミド pET30： dAHを構築した。
[0043] (3)大腸菌によるァクチノヒビン 2量体の発現
LA培地には硫酸カナマイシン (KM)、クロラムフエ二コール (CM)をそれぞれ終濃 度 30 gZml、 34 gZmlとなるように加えたものを使用した。
LA培地上に形成されたァクチノヒビン 2量体発現プラスミド pET30： dAHで形質転 換した大腸菌 BL21 (DE3) plysS (2004年 11月 10日に、独立行政法人産業技術 総合研究所特許生物寄託センター（日本国， 305 - 8566,茨城県つくば巿東 1丁 目 1番地中央第 6)に受託番号 FERM BP— 10161として寄託した。 )のコロニーを 2%グルコース、 KM (30 μ g/ml)及び CM (34 μ g/ml)を含む LB培地 lmlに植 菌し、 37°Cでー晚振とう培養した。この菌液 8mlを KM (30 μ g/ml)及び CM (34 μ gZml)を含む LB培地 800mlに加えて 37°Cで振とう培養した。 O. D. 600nmの値 が 0. 3に達したところでイソプロピル |8—チォガラクトピラノシド (IPTG)を終濃度 lm Mとなるように加え、再び 37°Cで 2時間振とう培養した。
[0044] 培地を氷水で急冷して大腸菌の増殖を停止させた後、培養液を 12, 000 X gで 15 分間、 4°Cで遠心分離し、菌体を集めた。得られた菌体を PBS (—）で 2回洗浄した後 、— 20°Cで保存した。
[0045] 比較例 1
(1)ァクチノヒビン (単量体)発現プラスミドの構築
プラスミド 2A3Kを铸型として、前記 AA— 1 LIC (配列番号 11)及び前記 TGA 1 14 LIC (配列番号 12)を用いて 94°C30秒、 60°C30秒、 72°C1分の条件（30サイ クル）の PCRを行ない、配列番号 1のァクチノヒビン遺伝子を増幅した。得られた DN A断片を dGTP存在下で T4DNAポリメラーゼ反応を行なった後、大腸菌発現べクタ 一 pET30 XaZLICと連結し、ァクチノヒビン（単量体）発現プラスミド pET30： AHを 構築した。
[0046] (2)大腸菌によるァクチノヒビン (単量体)の発現
ァクチノヒビン 2量体発現プラスミド pET30： dAHに代えてァクチノヒビン（単量体） 発現プラスミド pET30 :AHを用いたほかは、実施例 1の（3)と同様な操作により形質 転換した大腸菌 BL21 (DE3) plysSにァクチノヒビン (単量体)を発現させた。
[0047] 実施例 2
以下の手順によりァクチノヒビン融合タンパク質を調製'精製し、その抗 HIV効果に ついて試験した。
[0048] (1)大腸菌抽出液の調製
[0049] 実施例 1に準じて His—タグ付ァクチノヒビン 2量体を菌体内に発現させた大腸菌を 結合バッファー（5mMイミダゾール、 0. 5MNaCl、 20mMTris -HCl(pH7. 9) ) 10 mlに懸濁した。 1分毎に 30秒間のインターバルをとり、計 5分間超音波をかけて菌体 を破壊し、得られた菌抽出液を 8, 370 X g、 10分間、 4°Cで遠心分離を行い、上清と 沈澱に分けた。得られた沈殿を 6Mグァ-ジン塩酸を含む結合バッファー（以下、結 合バッファー DN)に溶解し、 8, 370 X g、 10分間、 4°Cで遠心分離を行い、沈殿を 除いた。
[0050] (2)金属キレート Sepharose 4Bを用いたァフィユティークロマトグラフィー
5mlの金属キレート Sepharose 4Bを 15ml容プラスチックチューブに入れ、 10ml の milliQ水を加え穏やかに撹拌した後、 264 X g、 3分間、室温で遠心分離し、上清 を除いた。 5mlのチャージバッファー（50mMNiSO )を加え撹拌して榭脂を活性ィ匕 し、 10mlの milliQ水で 2回洗浄した後、 10mlの結合バッファー（DN)で榭脂を平衡 化した。
[0051] 50ml容プラスチックチューブに活性ィ匕した榭脂 5mlと（1)で調製した試料を混合し 、結合バッファー（DN)で全量を 50mlとし、室温で 1時間穏やかに振とうした。榭脂を 10mlの結合バッファー（DN)で洗浄した後カラムに充填し、 50mlの結合バッファー (DN)で榭脂を洗浄した。次に、 50mlの 6Mグァ-ジン塩酸を含む洗浄バッファー（ 60mMイミダゾール、 0. 5MNaCl、 20mMTris-HCl (pH7. 9) )で榭脂を洗浄した 後、 50mlの 6Mグァ-ジン塩酸を含む溶出バッファー（500mMイミダゾール、 0. 5 MNaCl、 20mMTris-HCl (pH7. 9) )で榭脂に吸着した Hisタグ一ァクチノヒビン 2 量体融合タンパク質を溶出した。
[0052] (3) ODSカラムクロマトグラフィー
ァセトニトリルに懸濁した ODS榭脂 10mlをカラムに充填し、ァセトニトリル： 0. 01% トリフルォロ酢酸 (TFA)の等量混液 50mlでカラムを洗浄した後、ァセトニトリル： 0. 0 1%TF Aの 5 : 95混液 50mlでカラムを平衡化した。金属セファロース Sepharose 4 Bで精製した Hisタグ一ァクチノヒビン 2量体融合タンパク質をカラムの上端に乗せ、 ァセトニトリル： 0. 01%TFAの 5 : 95混液 50mlでカラムを洗浄した後、ァセトニトリル : 0. 01%トリフルォロ酢酸 (TFA)の等量混液 50mlでカラムに吸着した Hisタグ—ァ クチノヒビン 2量体融合タンパク質を溶出した。得られた溶出液を濃縮乾固した後、 m illiQ水に溶解した。
[0053] (4) ODSカラムを用いた HPLC
ODSカラムで脱塩した試料溶液を少量の MilliQ水に溶解し、高速液体クロマトグ ラフィー（PEGASIL— B 10 X 250mm, SSC センシユー科学株式会社）にか け、ァセトニトリル： 0. 01%TFAの 5 : 95混液とァセトニトリル： 0. 01%TFAの 70 : 3 0混液を用いた 30分の直線濃度勾配で、 220nmの吸収を検出しながら 3mlZ分の 流速において、 12分と 16分に出現するピークを集めた。この各分画を溶液の pHが 中性付近になるまで凍結乾燥を繰り返した後、 milliQ水に溶解した。
[0054] (5)合胞体形成阻害活性の測定
DME培地で 1. 6 X 105細胞 Zmlに調整した HeLaZCD4ZLTR細胞を 96穴プ レートの各穴に 50 1ずつ播種し、ここに、無血清 DME培地で各段階に希釈した試 料溶液を、各穴に 10 1ずつ添加した。さらに、 1. 6 X 105細胞/ mlに調製した HeL al35ZT— env(Tトロピック HIV— 1由来エンベロープ糖タンパク質） ZTat細胞を、 各穴に 50 1ずつ接種し、 5%CO気流下、 37°Cで 24時間培養した。培養液を除き
2
細胞溶解液 20 μ 1ずつ各穴に加え、室温で約 15分間放置した。発色基質液 100 μ 1 (ο— -トロフエ-ルーベータ一 D—ガラクトピラノシド 20 ΐと Ζ—バッファー（60mMリ ン酸水素ニナトリウム、 40mMリン酸二水素ナトリウム、 10mM塩化カリウム、 ImM硫 酸マグネシウム、 50mM2—メルカプトエタノール、 pH7. 0) 80 1の混液）をカ卩えて 、 37°Cで 80分間反応させた後、反応停止液 2MNa COを 25 1ずつ各穴に添カロし
2 3
、 PAWER WAVE X340 (BIO TEC INSTROMENTS CO. )を用いて 405 nmにおける吸光度を測定した。得られた吸光度力も合胞体形成率を下記の式より求 めた。
[0055] [数 1]
合胞体形成率 = (試料を添加した穴の吸光度 Zコント π—ルの吸光度） X 1 0 0
[0056] このようにして得たァクチノヒビン融合タンパク質の合胞体形成に対する 50%阻害 濃度 (IC )を表 1に示す。
50
[0057] なお、上記の Hisタグ—ァクチノヒビン 2量体融合タンパク質の調製と同様の操作に より、 Hisタグーアクチノヒビン単量体融合タンパク質も調製し、合胞体形成率を求め た。この結果も併せて表 1に示す。
[0058] [表 1]
Figure imgf000015_0001
上記の結果から、本発明によるァクチノヒビン 2量体融合タンパク質はァクチノヒビン 単量体融合タンパク質に比較して 2倍以上の合胞体形成阻害能力を有することがわ かる。
[0059] なお、 Hisタグは合胞体形成阻害能力を 7〜8分の 1程度に低下させることが知られ ており、 Hisタグなしのァクチノヒビン 2量体融合タンパク質の合胞体形成 50%阻害 濃度は 0. 03 M程度と推定される。
産業上の利用可能性
[0060] 本発明のァクチノヒビン多量体タンパク質は、 HIV感染におけるクリティカルな経路 である合胞体形成を阻害する。これは、ァクチノヒビンによる合胞体形成阻害と同様 な作用機序によるものと考えられるため、 T—トロピック HIVのみならず、 M—トロピッ ク HIVの感染をも防止すると考えられる。また、例えば、本発明のァクチノヒビン 2量 体タンパク質の抗 HIV効果はァクチノヒビン単量体融合タンパク質に比較して 2倍以 上であり、非常に少量で顕著な効果を示す。このように、本発明によれば、 AIDSの 予防、治療薬として利用することが可能な抗 HIV薬ポリペプチドが提供される。また、 本発明のァクチノヒビン多量体タンパク質をコードする遺伝子は、種々の宿主に導入 して組み換えァクチノヒビン多量体タンパク質として生産することが可能であり容易に 生産することが可能である。
図面の簡単な説明
[0061] [図 1]ァクチノヒビン 2量体の構築方法をまとめた説明図である。

Claims

請求の範囲
[I] ァクチノヒビン多量体を含むことを特徴とする抗 HIV (ヒト免疫不全ウィルス)薬。
[2] ァクチノヒビン多量体が、
(a)配列番号 1で表わされるポリペプチド、及び
(b) (a)のアミノ酸配列中の 1個または複数のアミノ酸が欠失もしくは置換され、または付 加されてなる合胞体形成阻害活性を有するホモログ
力も選択される複数のポリペプチド（同一であっても異なって 、てもよ 、）を
50個以下のアミノ酸力もなるリンカ一で連結したものである請求項 1記載の抗 HIV薬
[3] ァクチノヒビン多量体がァクチノヒビン 2量体である請求項 1または 2記載の抗 HIV 薬。
[4] 前記リンカ一が配列番号 2で表わされるペプチド鎖である請求項 1〜3のいずかに 記載の抗 HIV薬。
[5] さらに Hisタグを含む請求項 1〜4のいずかに記載の抗 HIV薬。
[6] 請求項 1〜5のいずれかに記載の抗 HIV薬に対応するポリペプチド。
[7] 請求項 6に記載のポリペプチドをコードする塩基配列またはその相補鎖。
[8] 請求項 7に記載の塩基配列を宿主細胞に導入した形質転換体。
[9] 宿主細胞が大腸菌または放線菌である請求項 8に記載の形質転換体。
[10] Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS/pET30:dAH株（独立行政法人産業技術総合研 究所特許生物寄託センター受託番号 FERM BP— 10161)である請求項 9に記載 の形質転換体。
[II] 請求項 9〜10に記載の形質転換体を培養して形質転換体内または培養物中に請 求項 6に記載のポリペプチドを産生させ、これを単離することを含む請求項 1〜5のい ずれかに記載の抗 HIV薬の製造方法。
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