JP2003531568A - 組換え型アデノウイルス - Google Patents

組換え型アデノウイルス

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Abstract

(57)【要約】 アデノウイルスにおいて、天然型ペントンファイバー（ファイバー尾部、ファイバー軸部および三量体化モチーフを含むファイバーノブを含む）が以下の変更をなされたものであって、すなわち細胞結合構造および天然型三量体化モティーフを含む天然型ノブが除去され、そして、新規細胞結合リガンドおよび外部の三量体化モティーフがウイルスファイバーに導入されるという変更をなされる。さらに、本発明はインビボまたはインビトロの方法によるヒト疾患の治療のための組換え型アデノウイルスに関する、またアデノウイルスゲノム中への組換え型アデノウイルスファイバーを導入するための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は変更向性を有する新規組換え型アデノウイルスに関する。より詳細に
は、前記組換え型アデノウイルスは、天然型ノブ構造を削除し、それを新規細胞
結合リガンドおよび外部の三量体化モチーフと置換することにより構築された。
本発明は、またヒト疾患の治療のための新規アデノウイルスに関する。また、ア
デノウイルスゲノムに組換え型アデノウイルスファイバーを導入するための方法
も含まれる。
【０００２】
【発明の背景】
臨床における遺伝子治療は1989年に導入された。当時の目的は、免疫系の遺伝
子欠損を修正するためのものであり、患者の欠損細胞への健常遺伝子のインビト
ロ導入、そして患者への治療細胞の輸血を介したものである。その時から、遺伝
子治療のための適用可能な方法は劇的に増加した。その導入の10年後の今日では
、例えば血管の疾患、ガン、炎症性疾患およびHIVのような伝染性疾患の治療の
ための遺伝子治療の使用を想定することができる。
【０００３】 しかしながら、現在、遺伝子治療はヒト医療における有用な方法ではない。主
な理由の1つは、遺伝子治療が、患者に注射することができ、かつ意図した細胞
のみの遺伝子を標的とする遺伝子担体またはベクターに供給される遺伝子のパッ
ケージングを要求するからである。この種のベクターは、これまで入手できなか
った。
【０００４】 アデノウイルス（Ad）はエンベロープのないDNAウイルスであり、60-85 nmの
直径を有する規則的な二十面体として形づくられる。細胞結合は二十面体のコー
ナーでビリオンに定着するファイバータンパク質を介して起こる。ファイバータ
ンパク質は、完全なビリオンの組立ておよび放出に必要ではない。ビリオン組立
ては感染細胞の核で起こる。
【０００５】 ファイバーポリペプチドのホモ三量体であるファイバータンパク質は、ビリオ
ンのペントン基部に対し非共有結合でファイバーに付着しているN-末端尾部（そ
してそれはさらに、核局在化シグナルを含む）； Ad3で6回繰り返され、並びにA
d2およびAd5で22回繰り返される、約15アミノ酸のファイバー軸部モチーフ(Chro
bozek J, Ruigrok RWH and Cusack S：Adenovirus Fiber, Current Topics in M
icrobiology and Immunology, 1995, p 163-200)； そして、C-末端球状ドメイ
ンであるノブ（細胞のAd受容体に結合するリガンドを含む）（既述の参照文献の
レビューを参照）、以上の3つの機能的に異なるパーツを含む。各々の軸部リピ
ートは、β-シートを形成する2つの3-アミノ酸領域および天然の拡張されたファ
イバー軸部のターンを構成する2つのアミノ酸領域を有する。三量体化した細胞
結合ドメインの結晶構造が決定され、それは他の逆平行β-サンドイッチと異な
るユニークなトポロジーを示した(Di Xia, Henry LJ, Gerard RD and Deisenhof
er J: Crystal structure of the receptor-binding domain of adenovirus typ
e 5 fiber protein at 1.7 Å resolution, Structure 2: 1259-1270, 1994）。
ビリオンのペントン基部に対するファイバーの結合は無細胞系においても起こり
得る、すなわち、ファイバーはファイバーなしのビリオンに結合することができ
る(Boudin M-L and Boulanger P: Assembly of Adenovirus Penton Base and Fi
ber, Virology, 116: 589-604,1982)。
【０００６】 ペントン基部に結合する能力および核に輸送される能力を保持するかぎり、フ
ァイバーが構造上の修飾に耐えうることが可能であると思われる。ウイルスの結
合特性を変えるために、Adファイバーを修飾するいくつかの試みが実施された。
短いペプチドリガンドがノブのC末端に加えられ(Michael SI, Hoy JS, Curie DT
and Engles JT: Addition of a short peptide ligand to the adenvorirus fi
ber protein. Gene Therapy 2: 660-8,1995.)、そして、オクタペプチドがノブ
の「ループ」の1つに導入された。AdペントンへFLAGテトラ-アミノ酸モチーフを
導入することにより、通常Adに感染しない細胞をAdの標的にすることが可能であ
ることが示された。このことは双方に特異性のある抗体のターゲッティングによ
ってなされ、ここで一方の特異性は前記FLAGペプチドに対したものであり、そし
て他方は新規標的細胞に対したものである(Wickham TJ, Segal DM, Roelvink PW
, Carrion ME, Lizonova A, Lee GM and Kovesdi I: Targeted Adenovirus Gene
Transfer to Endothelial and Smooth Muscle Cells by Using Bispecific Ant
ibodies. J. Virol., 70: 6831-6838, 1996.)。したがって、ヒト遺伝子治療の
目的のために非常に有用な広範囲のヒト細胞をAdの標的とすることは可能なよう
である。これらの理由およびAdが遺伝子治療の適用のために広く使われていると
いう理由のため(Trapnell BC and Gorziglia: Gene therapy using adenoviral
vectors, Current Opinion in Biotechnology, 5: 617-625,1994）、ヒト遺伝子
治療に有用な組換え型の標的再設定（re-targeted）されたAd−ウイルスを作成
するための方法が今回開発された。
【０００７】 したがって、変更向性を有する組換え型アデノウイルスを提供することが本発
明の目的である。
【０００８】 本発明の別の目的は、ヒト疾患の治療のための組換え型アデノウイルスである
。
【０００９】 更なる本発明の目的は、アデノウイルスゲノムに組換え型アデノウイルスファ
イバーを導入するための方法である。
【００１０】
【発明の概要】
本発明の目的は、請求項に記載の組換え型アデノウイルスおよびウイルスファ
イバーを導入する方法によって達成される。
【００１１】 本発明によれば、変更向性を有する組換え型アデノウイルスが提供される。前
記アデノウイルスは、天然型ペントンファイバー（ファイバー尾部、ファイバー
軸部および三量体化モチーフを含むファイバーノブを含む）が変更されているこ
とを特徴とするものであり、前記天然ペントンファイバーにおいて細胞結合構造
および天然型三量体化モチーフを含む天然型ノブが削除され、そして新規細胞結
合リガンドおよび外部の三量体化モチーフがウイルスファイバーに導入されてい
ることを特徴とする。 前記構造的修飾は、遺伝子レベルでのDNA技術によって、或いはウイルスレベ
ルでの化学的または免疫学的手法によって実施された。
【００１２】 本発明の別の側面によると、上記で確認したように、アデノウイルスはヒト疾
患の治療のためにインビボまたはインビトロの方法で使用される。 本発明の更なる側面は、アデノウイルスゲノムに組換え型アデノウイルスファ
イバーを導入する方法であって、 a) 9kbの断片（Spelからゲノムの終端まで）をサブクローニングすることと、 b) さらにSaclとKpnl間の3kbの断片をサブクローニングすることと、 c) NdelとMunl間のファイバー遺伝子を削除し、そして、欠損した配列をXhol
サイトを含む配列表の配列番号13の配列で置換することと； d) 前記工程c)による構築物のNdelとXhol間の組換え型ファイバーを結合する
ことと； e) 大腸菌の相同組換えを利用して、Nhelで切断された前記9kbの断片に、前記
工程d)の構築物を再導入することと； f) 前記工程e)の組換え型9kb断片の分離、および、コスミドクローニングによ
って9kbの断片とゲノムの始点からSpelサイトまでの27kbの断片とを結合するこ
とによって、アデノウイルスゲノムを再構築すること、 を含む。
【００１３】
【発明の詳細な記載】
本発明において、Adの標的再設定（re-targeting）は、ファイバーへの新規細
胞結合リガンドの導入によって達成される（図1）。どのような細胞結合ペプチ
ド（例えばモノクローナル抗体またはそれの断片（単鎖断片としてであろうがFa
bとしてであろうが）、Ｔ細胞受容体またはそれの断片、RGDのようなインテグリ
ン結合ペプチドまたは上皮増殖因子のような成長因子）も使用することができる
。
【００１４】 これまでに適用されたリガンドは、上皮増殖因子（EGF）、アミノ酸モチーフR
GD、HLA-A1と関連するMAGE-1ペプチドに反応するT-細胞受容体クローンの単鎖断
片（scTCR）(vd Bruggen P, Traversaari C, Chomez P, Lurquin D, De Plaen E
, vd Eynde B, Knuth A and Boon T: A Gene encoding an Antigen Recognized
by Cytolytic T Lymphocytes on a Human Melanoma, Science 13 December 1991
,1643-1647.)、ヒト腎臓癌細胞上のタンパク質抗原に反応することが示された高
い選択性を有するモノクローナル抗体G250の単鎖断片（scFv）(Oosterwijk E, R
uiter DJ, Hoedemaeker PhJ, et al: Monoclonal antibody G250 recognizes a
determinant present in renal-cell carcinoma and absent from normal kidne
y. Int J Cancer 38: 489-94,1986.)を含む。これまでG250は広範に評価されて
おり、臨床試験に供されている（既述の参照文献を参照）。
【００１５】 Adベクターは、許容性細胞に対して複製可能または複製不能なものとして作成
しうる。腫瘍療法において、複製可能なAdは腫瘍内で複製し、伝播するという潜
在的な利点を有している(Miller R and Curiel DT: Towards the use of replic
ative adenoviral vectors for cancer gene therapy, Gene Therapy 3: 557-55
9)。これは理論的に複製不能ベクターで獲得されるものに対して選ばれた効果器
メカニズムの増加を生じるだろう。さらに、伝染性のウイルスは感染細胞を害す
ることができる抗ウィルス免疫反応の惹起に加えて、感染細胞の細胞変性効果に
よる抗腫瘍効果に寄与することができる。
【００１６】 組換え型ファイバの構築、発現および評価 目的は、標的再設定したAdの構築を可能にするための変更された結合特性を有
する機能的Adファイバーを構築するための汎用方法を開発することである。
【００１７】 アデノウイルスファイバーペプチドは、いくつかの生物学的機能を備えており
、それは活性ウイルス粒子の産生の保持に必要である。以下に示すファイバー特
性は、機能的組換え型ファイバーペプチドの構築において重要なものであるとみ
なされる。
【００１８】 ・ 平行ホモ三量体を形成する能力。この機能は、野生型ファイバーノブのN-
末端アミノ酸配列によって担われ、そしてペントン基部に結合しうる、機能的細
胞結合ノブを形成するファイバーに必要である。
【００１９】 ・ ペントン・キャプソメアを形成するためにペントン基部に結合する能力。
この機能は野生型ファイバー尾部によって担われる。
【００２０】 ・ 標的細胞への付着を許容する細胞結合リガンドを発現する能力。この機能
は野生型ファイバーノブによって担われる。 ・アデノウイルスは感染細胞の核で組み立てられるので、感染細胞の核に輸送
される能力はウイルス形成に不可欠である。核局在シグナルは主に（しかし、お
そらくそれのみではない）野生型ファイバー尾部によって担われる。
【００２１】 第1段階において、組換え型ファイバーが構築され、そして転写/翻訳が対とな
った無細胞系の発現後にインビトロで評価をおこなった。SDS-PAGEおよびオート
ラジオグラフィーによる分析が、オープンリーディングフレームの存在を明らか
にするため、そして翻訳産物のサイズに関する情報を得るために実施される。次
の段階においては、ファイバーの機能研究を考慮して、組換え型ファイバーはバ
キュロウイルス中にクローン化され昆虫細胞で発現される。この種の研究には、
三量体化ファイバーのみが反応することが示されたモノクローナル抗体2A6.36で
の免疫染色によって評価されるような三量体形成能(Shin Hong J and Engler JA
: The amino terminus of the adenovirus fiber protein encodes the nuclear
localization signal, Virology 185: 758-767, 1991)、対応する受容体を発現
している細胞との結合能並びに溶液中またはビリオン上のペントン基部への結合
能によって証明されるような機能的リガンドの発現が含まれる。
【００２２】 組換え型ファイバーはPCRに基礎をおいた方法論で構築される(Clackson T, Gu
ssow D and Jones PT: General application of PCR to gene cloning and mani
pulation, in PCR, A Practical Approach, Eds McPherson MJ, Quirke P and T
aylor GR, IRL Press, Oxford, p 187,1992)、例えばPCR-ライゲーション-PCR (
Alvaro Ali S, Steinkasserer A: PCR-ligation-PCR Mutagenesis: A Protocol
for Creating Gene Fusions and Mutations, BioTechniques 18: 746-750,1995)
、そして、スプライシングバイオーバーラップエクステンション（SOE; splicin
g by overlap extension）(Horton RM and Pease LR: Recombination and mutag
enesis of DNA sequences using PCR, in McPherson MJ (ed), Directed Mutage
nesis, IRL Press 1991, p 217)である。クローニングは通常の方法に従って実
施される。組換え型ファイバはPerkin Elmer ABI Prismを使用してシークエンス
され、哺乳類細胞および昆虫細胞において発現され、ファイバー尾部、三量体フ
ァイバーおよび新規細胞結合リガンドに特異的なモノクローナル抗体で染色され
る。以下のパラメータは免疫染色後に評価される、 ・三量体化 ・核輸送 ・新規細胞結合リガンドの発現 最後に、組換え型ファイバーは後述する新しく発明された手順によってAdゲノ
ムに導入され、そして組換え型ウイルス粒子が産生される。 本発明は、更に制限されない実施例で以下に例示される。
【００２３】
【実施例】
実施例1： ノブが外部三量体化モチーフで置換される位置にファイバーペプチドが作成さ
れる（外部三量体化モチーフはファイバー軸部で終結するTLWTモチーフの後に導
入される）。
【００２４】 外部三量体化モチーフの導入の目的は二つの側面を有する、すなわち、a)天然
型三量体化シグナルを含んでいるノブのみならず、ファイバーの細胞結合部をも
除去するため、そしてb)同時に必要な三量体化シグナルを供給するためである。
2つの異なるアミノ酸モチーフが使用された、すなわち、ヒトの「肺サーファク
タントタンパク質D」由来の36アミノ酸「ネック領域ペプチド（ Neck Region Pe
ptide)」＝NRP（配列表の配列番号1）(. Hoppe H-J, Barlow PN and Reid KBM:
A parallel three stranded helicalbundle at the nucleation site of collag
en triplehelix formation. FEBS Letters 344: 191-195 (1994).)、そして、ポ
ジション1および4のロイシン残基がイソロイシン残基で置換された31アミノ酸「
ジッパー」モチーフ=pII（配列表の配列番号2）(Harbury PB, Tao Zhang, Kim P
S and Alber T: A Switch Between Two-, Three-, and Four-Stranded Coiled C
oils in GCN4 Leucine Zipper Mutants. Science 262: 1401-1407, 1993.)であ
る。 本計画における、これらの三量体化モチーフに対するDNA配列は合成され、ク
ローン化され、シークエンスされる。
【００２５】 ノブの細胞結合機能を置換するために、外部三量体化アミノ酸モチーフに加え
て、新規細胞結合リガンドがファイバーに導入される。
【００２６】 組換え型ファイバーの核輸送効率を増大するために、何例かにおいて外部の核
局在配列がファイバーに付加される。
【００２７】 更なる態様において、ファイバーは付加的に感染細胞のサイトゾルでファイバ
ーの寿命を増やす配列を含み、それにより核への輸送およびウイルスの組み立て
を増強する。この種の配列は、例えば野生型ノブまたは配列番号10〜12において
存在する配列である。
【００２８】 以下に示すファイバーのタイプは、上述の方法を使用して構築される（図2を
参照）。野生型ファイバーの配列は、配列番号14として配列表に示される。
【００２９】 タイプA 三量体化モチーフがファイバー軸部の下流のファイバー遺伝子（ファイバーノ
ブの最初の4つのアミノ酸を構成するTLWTモチーフの後に）に、または任意の軸
部リピート（残りの軸部リピートは除去されている）の第2のターン部位（ター
ンb）の下流のファイバー遺伝子に融合される。
【００３０】 新規細胞結合リガンドが、三量体化シグナルの下流に導入され、前記三量体化
シグナルは三量体化シグナルと細胞結合リガンドの間に付加されるアミノ酸リン
カーモチーフを有する。
【００３１】 タイプB タイプAと類似するが、三量体化シグナルのすぐ上流に導入されたリンカーモ
チーフを有する。
【００３２】 タイプC 三量体化モチーフが第1の軸部リピートの後に導入され、その後に軸部リピー
ト１７〜２１が引続いている。新規細胞結合リガンドが、三量体化シグナルの下
流に導入され、前記三量体化シグナルは三量体化シグナルと細胞結合リガンドの
間に付加されるアミノ酸リンカーモチーフを有する。
【００３３】 タイプD 細胞結合リガンドがファイバー軸部の制限酵素部位NhelとHpalの間に導入され
、リガンドの上流および下流の両方に付加されたアミノ酸リンカーを有する。 タイプD/Δ これはタイプ Dの変種であり、タイプ Dの細胞結合リガンドの下流のファイバ
ー軸部が除去されたものである。タイプDおよび（D/Δ）は、通常のノブ並びに
タイプ AおよびBでのような外部の三量体化シグナルで置換されたノブで構築さ
れる。
【００３４】 タイプE タイプAと類似するが、外部の三量体化モチーフのすぐ上流に保持されるノブ
部分を有する。
【００３５】 以下に示す、アミノ酸モチーフが上記のファイバー構築物のリンカーとして使
用される、すなわち、 ・ Psedomonasの外毒素に由来する配列番号3 ・ 組織プロトロンビン・アクチベーターに由来する配列番号4 ・ マウス免疫グロブリンのヒンジ領域に由来する配列番号5 ・ StaphylococcalプロテインAに由来する配列番号6 ・ ヒトIgG3のヒンジ領域に由来する配列番号7 ・ ヒトAd5の軸部リピート17に由来する配列番号8 である。
【００３６】 組換え型ファイバーは分泌型タンパク質として、バキュロウイルスにクローン
化されSf9細胞で発現される、および／またはpSecTagベクターにクローン化され
COS細胞で発現される。
【００３７】 発現はモノクローナル抗体4D2.5（抗Ad5ファイバー抗体）および2A6.36（抗三
量体化Ad5ファイバー抗体）による免疫染色により調べられる。発現と三量体化
は、長さおよび三量体化モチーフにかかわりなく全ての組換え型ファイバーにお
いて明らかである。
【００３８】 三量体を形成しえることが示され、そして、新規細胞結合リガンドを発現する
種々の構築されたファイバーが表1に示される。この結果は、本発明技術が新規
細胞結合リガンドを発現する三量体ファイバーを生成することができることを示
すものである。したがって、この種のファイバーを有する機能的ウイルスを作る
ことは可能なはずである。
【００３９】
【表１−１】
【００４０】
【表１−２】 実施例2： 組換え型ファイバーの核局在（表2および3） 核局在は、相当するバキュロウイルスクローンによる感染２４時間後のSf9細
胞中のファイバーの免疫染色によって評価された。結果のいくつかは、下記の表
2に示されている。いくつかの組換え型ファイバーにおいて、ファイバー尾部の
核配送シグナル（nuclear addressing signal）の存在にもかかわらず、Sf9細胞
中でひどく減弱された核局在を示すことがこれらの実験から明らかである。
【００４１】
【表２】 組換え型および天然型ファイバーはまた、pcDNA 3.1ベクターにクローニング
後、COS細胞のサイトゾルで選択的発現された。この場合、ファイバー尾部の天
然型核局在化シグナルの存在のために、ファイバーが核で検出されるだろうこと
が期待された。しかしながら、核の局在化はこれまで野生型ファイバーにおいて
、そして、単鎖−T-細胞受容体（single-chain T-cell receptors）を有するフ
ァイバー（すなわち、最も効果的なウイルスを生産したファイバー）においての
み検出されている（下記参照）。
【００４２】 ファイバーの核局在化がウイルス組立てにとって決定的なので、外部の核局在
化シグナル（NLS）（ここでは配列番号９のアミノ酸配列を有するSV40ラージT-
抗原の NLS）(Fisher-Fantuzzi L and Vesco C: Cell-Dependent Efficiency of
Reiterated Nuclear Signals in a Mutant Simian Virus 40 Oncoprotein Targ
eted to the Nucleus. Mol Cell Biol, 8: 5495-5503,1988)を加えることによっ
て核配送（nuclear addressing）の効率を改善する試みが実施される。外部のNL
S配列はRGDモチーフのすぐ上流に付加される。調査された事例において、外部NL
Sの存在が核局在を劇的に改善したことが認められた。実際、上述したように、
外部NLSを欠くファイバー構築物は、トランスフェクションされた細胞で検出さ
れなかった（表3）。
【００４３】
【表３】 上に示された証拠は、組換え型ファイバーが完全な尾部領域（下記も参照のこ
と）の存在にもかかわらず核に不十分に輸送され、そして、この現象がファイバ
ー構築物への外部NLSの導入によって修正されるだろうという仮説を支持する。
【００４４】 実施例3： ビリオンへの組換え型ファイバーの導入方法 Adゲノムの野生型ファイバーは、下記の方法（図3を参照）によって組換え型
ファイバーと交換される。
【００４５】 Pacl-Pacl断片としてAd5ゲノム全体を含んでいるプラスミドpTG3602 (Chartie
r C, Degryse E, Gantzer M, Dieterle A, Pavirani A and Mehtali M: Efficie
nt generation of Recombinant Adenovirus Vectors by Homologous Recombinat
ion i Escherichia Coli, J Virol, 70: 4805-4810,1996)が、開始材料として使
用される。SpelとPacl間および野生型ファイバー遺伝子を含むゲノムの約9kb断
片 はpBluescriptに別々にクローン化される。この断片から、SaclとKpnl間の約
3kb断片が更にサブクローニングされる。ファイバーのNdelサイトのN末端側のヌ
クレオチド上流を除く天然型ファイバー遺伝子の削除（Ndelサイトとファイバー
の停止コドンの３８塩基後のMunlサイトの間で）は3kbの断片においてなされる
。前記の削除された配列は配列番号13で置き換えられる、配列番号13はNdelおよ
びMunlサイト、並びに停止コドンとMunlサイト間の野生型ゲノム配列を元に戻す
。それに加えて、前記の付加配列（配列番号13）は、NdelとXhol間のファイバ-
が削除された3kb断片（3kbファイバーシャトル）に組換え型ファイバーを結合す
ることを考慮したXholサイトを含む。
【００４６】 組換え型ファイバーを有する前記3kbのファイバーシャトルは、大腸菌での相
同組換えを利用して、Nhelで切断された前記9kbの断片に再導入される（前述の
文献を参照）。前記の工程で生じる組換え型9kb断片は、最後にSpelおよびPacl
によりベクターから切り出され、コスミドクローニングによって分離された27kb
の断片に連結される。
【００４７】 期待される特性をもつ挿入物の存在は、全てのコスミドクローンについてPCR
によって検査される。また、コスミドクローンはHind IIIおよびゲル上で検査さ
れる期待されるサイズの制限酵素断片の存在によって限定される。
【００４８】 組換え型AdゲノムはPac 1での制限後に分離され、適切な細胞のトランスフェ
クションに使用される。プラークの出現は、トランスフェクションされた培養細
胞の顕微鏡検査によって決定される。
【００４９】 ウイルス上清は、最初のトランスフェクション培養細胞から回収され、第２の
培養細胞の感染に使用される。細胞変性効果およびプラークの出現は、顕微鏡検
査によって監視される。
【００５０】 ウイルスへの導入が成功した特定のファイバー構築物は、図4aおよび4bに示さ
れる。 結論： ヒト疾患の治療に役立つ遺伝子治療のために、特定の細胞または特定の組織を
標的としうる注射可能なベクターが必要とされる(Miller N and Vile R: Target
ed vectors for gene therapy. FASEB J, 9: 190-199,1995)。
【００５１】 本発明はノブを欠く三量体化能を有するファイバー（trimerisation-competen
t fibers）による方法を記載する。前記三量体化能を有するファイバーは作成可
能で、ウイルスに導入でき、そして、外来リガンドの挿入に耐えうるファイバー
軸部内に座位する新規細胞結合リガンドを有するものである。また、組換え型フ
ァイバーの細胞内輸送の重要性も確認された。本発明技術を使用して作成された
組換え型ウイルスは、ヒト医療に非常に有用であろう。ここに記載される技術の
組み合わせ、そしてファージディスプレイによる細胞結合リガンドの同定によっ
て、標的の遺伝子治療において事実上無制限の機会が生み出されるだろう。
【００５２】 これまでヒトT細胞受容体クローンの単鎖断片（scTCR）を具備し三量体化能を
有するファイバーは存在しており、機能的ウイルスに導入されている。単鎖抗体
は大きく非常に複雑なペプチドなので、他のscAbsおよび細胞結合リガンド（例
えばファージ-ディスプレイによってペプチドライブラリーより同定されたペプ
チド）もまた同じ技術を利用してAdファイバーに組み込まれ、ウイルスに導入さ
れることは非常にありえる事態であろう。
【００５３】 本発明によって標的再設定されるAdがヒトの遺伝子治療に適用されるだろう、
この際、多くの方式が存在する。
【００５４】 腫瘍疾患の場合、以下のオプションが存在する： I. 腫瘍にトランスジーンを導入するベクターの使用、例えば、 ・ 腫瘍抑制遺伝子 ・ 「自殺」遺伝子 ・ 免疫調節物質（immune modulatory substances）または腫瘍抗原の遺伝子 ・ 抗血管新生因子（anti angiogenetic factors）の遺伝子 など、そして、 II. 伝染性ウイルスの使用。これは非複製型ベクターの使用に対して付加的な
価値を有しており、ウイルスは腫瘍内の細胞から細胞に伝播することができ、こ
のことにより腫瘍上での初期接触（initial hit）を増大させる。腫瘍細胞破壊
は、ベクターに設計される細胞破壊機構だけでなく、ウイルス感染それ自体に関
連する細胞破壊およびウイルス感染細胞における体の免疫応答による攻撃によっ
ても生じるだろう。この原則は、変異p53腫瘍細胞のみで複製するように遺伝子
を操作されたアデノウイルスの直接の腫瘍内注射によりヒトにおいてすでに証明
されている。大きな「頭頸部]（head-and-neck)腫瘍でのこれらの限定的試験は
、公知のいかなる形式の治療法にも抵抗性である１１の治療した腫瘍中の２つで
完全な後退という結果を得る、部分的に奨励されるものであった。
【００５５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明において実施される天然型ファイバーに対する修飾の概要。
【図２】 組換え型アデノウイルスファイバー。
【図３】 Adゲノムに組換え型ファイバー遺伝子を導入する方法。
【図４ａ】 トランスフェクトされた細胞上（および二次培養で）で、CPE/プラークを呈す
る能力のある、Adゲノム中に導入された組換え型ファイバー。
【図４ｂ】 トランスフェクトされた細胞上（および二次培養で）で、CPE/プラークを呈す
る能力のある、Adゲノム中に導入された組換え型ファイバー。
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１０月４日（２００１．１０．４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ａ６１Ｐ 35/00 37/48 Ｃ１２Ｎ 7/00 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 DA02 EA02 GA11 HA01 4B065 AA41Y AA90X AA90Y AA91X AA91Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA01 AA02 AA13 BA01 BA08 CA53 DA35 DA38 DC01 DC21 MA05 MA55 NA14 ZB262 4C087 AA01 AA03 BC83 MA55 NA06 NA14 ZB26

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 変更向性（changed tropism）を有する組換え型アデノウイ
    ルスであって、天然型ペントンファイバー（ファイバー尾部、ファイバー軸部お
    よび三量体化モチーフを有するファイバーノブを含む）が以下の変更をなされた
    ものであること、すなわち、細胞結合構造および天然型三量体化モチーフを含ん
    でいる天然型ノブが削除され、そして、新規細胞結合リガンドおよび外部の三量
    体化モチーフがウイルスファイバーに導入されたことを特徴とする組換え型アデ
    ノウイルス。
  2. 【請求項２】 請求項1に記載のアデノウイルスであって、該構造的修飾が
    、遺伝子レベルでのDNA技術によって、或いはウイルスレベルでの化学的または
    免疫学的手法によって実施されることを特徴とするアデノウイルス。
  3. 【請求項３】 複製可能（replication competent）または複製不能（repli
    cation in-competent）である、請求項1に記載のアデノウイルス。
  4. 【請求項４】 前記新規細胞結合リガンドがファイバー軸部に導入されてい
    ることを特徴とする、請求項1に記載のアデノウイルス。
  5. 【請求項５】 請求項1に記載のアデノウイルスであって、前記新規細胞結
    合リガンドがファイバー軸部リピートの下流に導入されていることを特徴とする
    アデノウイルス。
  6. 【請求項６】 請求項4に記載のアデノウイルスであって、前記新規細胞結
    合リガンドが前記ファイバー軸部の制限酵素認識部位NhelとHpalの間に導入され
    ていることを特徴とするアデノウイルス。
  7. 【請求項７】 請求項4に記載のアデノウイルスであって、アミノ酸リンカ
    ーが細胞結合リガンドの上流および下流に導入されていることを特徴とするアデ
    ノウイルス。
  8. 【請求項８】 請求項4に記載のアデノウイルスであって、制限酵素認識部
    位Hpalの下流の軸部リピートが削除されていることを特徴とするアデノウイルス
    。
  9. 【請求項９】 請求項1に記載のアデノウイルスであって、リンカーとして
    のアミノ酸リンカーモチーフが、前記ファイバー軸部と前記三量体化モチーフ間
    および／または前記三量体化モチーフと前記細胞結合リガンド間に付加されてい
    ることを特徴とするアデノウイルス。
  10. 【請求項１０】 請求項9に記載のアデノウイルスであって、前記アミノ酸
    リンカーモチーフが、Psedomonas外毒素に由来する配列番号3； 組織プロトロン
    ビンアクチベーターに由来する配列番号4； マウス免疫グロブリンのヒンジ領域
    に由来する配列番号5； StaphylococcalプロテインAに由来する配列番号6； ヒ
    トIgG3のヒンジ領域に由来する配列番号7； ヒトAd5の軸部リピート17に由来す
    る配列番号8の何れか１つであることを特徴とするアデノウイルス。
  11. 【請求項１１】 請求項1〜10の何れか1項に記載のアデノウイルスであって
    、前記新規細胞結合リガンドが細胞結合ペプチドの何れか１つであることを特徴
    とするアデノウイルス。
  12. 【請求項１２】 請求項11に記載のアデノウイルスであって、前記細胞結合
    リガンドが、モノクローナル抗体またはそれの断片（単鎖断片（a single chain
    fragment）またはFabとして）、Ｔ細胞受容体またはそれの断片、RGDのような
    インテグリン結合ペプチドまたは上皮増殖因子のような成長因子であることを特
    徴とするアデノウイルス。
  13. 【請求項１３】 配列番号10〜12の何れか１つの配列を含む、請求項12に記
    載のアデノウイルス。
  14. 【請求項１４】 請求項12に記載のアデノウイルスであって、前記単鎖断片
    が、配列番号15を有する重鎖可変領域および配列番号16を有する軽鎖可変領域を
    具備するモノクローナル抗体G250の単鎖断片であることを特徴とするアデノウイ
    ルス。
  15. 【請求項１５】 請求項1に記載のアデノウイルスであって、前記外部の三
    量体化モチーフが、α−へリックスコイルドコイルモチーフまたは機能的に三量
    体化したファイバーを供与し得る他の何れか１つのペプチドであることを特徴と
    するアデノウイルス。
  16. 【請求項１６】 請求項15に記載のアデノウイルスであって、前記外部の三
    量体化モチーフが、ヒト肺サーファクタントタンパク質D（配列番号1）のネック
    領域ペプチド、或いはポジション1および4のロイシン残基がイソロイシン残基に
    置換されている31アミノ酸「ジッパー」モチーフ（配列番号2）であることを特
    徴とするアデノウイルス。
  17. 【請求項１７】 請求項1〜16の何れか1項に記載のアデノウイルスであって
    、外部の核局在シグナル（NLS）が、前記ファイバーに導入されていることを特
    徴とするアデノウイルス。
  18. 【請求項１８】 前記NLSがSV40ラージT抗原NLSであることを特徴とする、
    請求項17に記載のアデノウイルス。
  19. 【請求項１９】 請求項1〜18の何れか1項に記載のアデノウイルスであって
    、前記ファイバーが付加的に感染細胞のサイトゾル中で前記ファイバーの寿命を
    増加する配列を含み、このことにより核への輸送およびウイルス組立てを増強す
    ることを特徴とするアデノウイルス。
  20. 【請求項２０】 前記配列が前記野生型ノブに存在することを特徴とする、
    請求項19に記載のアデノウイルス。
  21. 【請求項２１】 前記配列が配列番号10〜12に記載の何れか１つであること
    を特徴とする、請求項20に記載のアデノウイルス。
  22. 【請求項２２】 インビボまたはインビトロの方法によるヒト疾患の治療の
    ための、請求項1〜21の何れか1項に記載のアデノウイルス。
  23. 【請求項２３】 変更向性を有する組換え型アデノウイルスを生産する方法
    であって、 I. 以下の工程a)〜f)、 a) 9kbの断片（Spelからゲノムの終端まで）をサブクローニングすること、 b) 更にSaclとKpnl間の3kb断片をサブクローニングすること、 c) NdelとMunl間の前記天然型ペントンファイバーをコードする前記天然型
    ファイバー遺伝子を削除し、そして欠失した配列をXholサイトを有する配列番号
    13と置換すること、 d) 前記工程c)の構築物のNdelとXhol間をコードする組換え型ファイバー遺
    伝子を結合すること、 e) 大腸菌の相同組換えを利用して、Nhelで切断された前記9kbの断片に前記
    工程d)の構造物の再導入すること、 f) 前記工程e)の組換え型9kb断片を分離し、そしてコスミドクローニングに
    よってゲノムの開始部位から前記Spel部位までの27kb断片に9kb断片を結合する
    ことによって前記アデノウイルスゲノムを再構築すること、 によってアデノウイルスゲノムへ組換え型アデノウイルスファイバーを導入する
    ことと、 II. 細胞での前記組換え型アデノウイルスの発現を可能にするために、前記工
    程f)で得られたアデノウイルスで該細胞をトランスフェクションすることと、 を含む方法。
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