JP2003534805A - 変化した親和性を有する改変ウシアデノウイルス - Google Patents

変化した親和性を有する改変ウシアデノウイルス

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、キャプシドタンパク質中に改変を含む改変ウシアデノウイルスを提供し、このキャプシドタンパク質は、アデノウイルスの親和性と関連し、この改変は、変化した親和性と関連する。本発明は、アデノウイルスベクター、およびこのようなベクターを有する宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするこのポリヌクレオチドは、異種の哺乳動物のキャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドで置き換えられる。本発明はまた、このようなアデノウイルスを作製する方法、およびこのようなアデノウイルスを使用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願の引用） この出願は、２０００年５月３１日出願の米国仮出願番号６０／２０８，６７
８号の利益を主張する。
【０００２】 （技術分野） 本発明は、キャプシドタンパク質中の修飾を含み、かつ変化した親和性を呈す
るウシアデノウイルスに関する。本発明はまた、変化した親和性を有するウシア
デノウイルスの作製および使用の方法に関する。
【０００３】 （背景技術） アデノウイルスは、ヒトならびに家畜動物および実験動物において、腸内感染
または呼吸感染を引き起こす。このウシアデノウイルス（ＢＡＶ）は、２つのサ
ブグループに分けられた少なくとも９つの血清型を含む。これらのサブグループ
は、固相酵素免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイを用いた血清学的
研究、ウイルス中和試験、免疫電子顕微鏡法に基づいて、それらの宿主特異性お
よび臨床的症候群によって、特徴付けられている。サブグループ１ウイルスは、
ＢＡＶ１、ＢＡＶ２、ＢＡＶ３、およびＢＡＶ９を含み、そしてそれぞれは、確
立したウシ細胞において、ＢＡＶ４、ＢＡＶ５、ＢＡＶ６、ＢＡＶ７およびＢＡ
Ｖ８を含むサブグループ２と比較して良好に増殖する。
【０００４】 ＢＡＶ３は、１９６５年に最初に単離され、そしてＢＡＶ遺伝子型のうちで最
も良好に特徴付けられており、約３５ｋｂのゲノムを含む（Ｋｕｒｏｋａｗａら
（１９７８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２８：２１２−２１８）。Ｒｅｄｄｙら（１９９
８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２：１３９４）は、ＢＡＶ３
のヌクレオチド配列、ゲノム組織、および転写地図を開示する。Ｒｅｄｄｙら（
１９９９、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７３：９１３７）は、発
現ベクターとして複製欠損性ＢＡＶ３を開示する。ＢＡＶのサブグループ１の代
表物であるＢＡＶ３（Ｂａｒｔｈａ（１９６９）Ａｃｔａ Ｖｅｔ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｈｕｎｇ．１９：３１９−３２１）は、通常無症状感染を生じる（Ｄａ
ｒｂｙｓｈｉｒｅら（１９６５）．Ｊ Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈｏｌ．７５：３２７
−３３０）が、しかし時折、より重大な気道感染に関連する（Ｄａｒｂｙｓｈｉ
ｒｅら、１９６６ Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．７：８１−９３；Ｍａｔｔｓｏｎ
ら、１９８８ Ｊ．Ｖｅｔ Ｒｅｓ ４９：６７−６９）、ウシの普通の病原性
生物である。他のアデノウイルスのように、ＢＡＶ３は、直鎖状二本鎖ＤＮＡ分
子を含む直径７５ｎｍ（Ｎｉｉｙａｍａら（１９７５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１６：
６２１−６３３）の非エンベロープ性正二十面体粒子である。ハムスター中に注
入された場合、ＢＡＶ３は腫瘍を生じ得（Ｄａｒｂｙｓｈｉｒｅ、１９６６ Ｎ
ａｔｕｒｅ ２１１：１０２）、そしてウイルスＤＮＡはマウス、ハムスターま
たはラットの培養細胞の形態学的トランスフォーメーションを効率的にもたらし
得る（ＴｓｕｋａｍｏｔｏおよびＳｕｇｉｎｏ、１９７２ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９
：４６５−４７３；Ｍｏｔｏｉら、１９７２ Ｇａｎｎ ６３：４１５−４１８
）。交差ハイブリダイゼーションは、ゲノムの左末端ではないが、その近くのい
くつかの領域を含むゲノムの大部分の領域において、ＢＡＶ３とヒトアデノウイ
ルス２型（ＨＡｄ２）との間で観察された（Ｈｕら、１９８４ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．４９：６０４−６０８）。
【０００５】 ブタアデノウイルス（ＰＡＶ）感染は、脳炎、肺炎、腎臓病変および下痢と関
連付けられている。Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ（１９９２）「Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏ
ｆ Ｓｗｉｎｅ」（Ｌｅｍａｎら編）、第７版、Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ａｍｅｓ、ＩＡ．２２５−２２７頁を参照のこと
。ＰＡＶが、感染した子ブタの腸内における液性応答および粘膜抗体応答の両方
が刺激し得ることが示された。Ｔｕｂｏｌｙら（１９９３）Ｒｅｓ．ｉｎ Ｖｅ
ｔ．Ｓｃｉ．５４：３４５−３５０。交差中和研究は、少なくとも５つの血清型
のＰＡＶが存在することを示した。Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅら（１９７５）Ｊ．Ｃ
ｏｍｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８５：４３７−４４３；およびＨｉｒａｈａｒａら（１
９９０）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．５２：４０７−４０９を参照のこと。Ｐ
ＡＶゲノムについての以前の研究は、ＰＡＶ３型（ＰＡＶ−３）についての制限
地図の決定およびＰＡＶ−３の完全なゲノムを示す制限フラグメントのクローニ
ングを含んでいた。Ｒｅｄｄｙら（１９９３）Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ３
６：１６１−１６８を参照のこと。さらに、ＰＡＶ−１およびＰＡＶ−２につい
ての制限地図が決定された。Ｒｅｄｄｙら（１９９５ｂ）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ
．１４０：１９５−２００を参照のこと。
【０００６】 ヌクレオチド配列は、種々のＰＡＶ血清型のゲノムのセグメントについて決定
されている。ＰＡＶ−３のＥ３遺伝子、ｐＶＩＩＩ遺伝子およびファイバー遺伝
子の配列は、Ｒｅｄｄｙら（（１９９５）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３６：９７−１
０６）によって決定された。ＰＡＶ−１およびＰＡＶ−２のＥ３遺伝子、ｐＶＩ
ＩＩ遺伝子およびファイバー遺伝子は、Ｒｅｄｄｙら（（１９９６）Ｖｉｒｕｓ
Ｒｅｓ．４３：９９−１０９））によって配列決定され、一方、ＰＡＶ−４の
Ｅ３遺伝子、ｐＶＩＩＩ遺伝子およびファイバー遺伝子の配列は、Ｋｌｅｉｂｏ
ｅｋｅｒ（（１９９４）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３１：１７−２５）によって決定
された。このＰＡＶ−４ファイバー遺伝子配列は、Ｋｌｅｉｂｏｅｋｅｒ（（１
９９５）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３９：２９９−３０９）によって決定された。全
５つのＰＡＶ血清型（ＰＡＶ−１〜ＰＡＶ−５）に対する逆方向末端反復（ＩＴ
Ｒ）配列は、Ｒｅｄｄｙら（（１９９５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１２：２３７−
２３９）によって決定された。このＰＡＶ−３ペントン配列は、ＭｃＣｏｙら（
（１９９６）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４１：１３６７−１３７５）によって決
定された。ＰＡＶ−４のＥ１領域のヌクレオチド配列は、Ｋｌｅｉｂｏｅｋｅｒ
（（１９９５）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３６：２５９−２６８）によって決定され
た。ＰＡＶ−３のプロテアーゼ（２３Ｋ）遺伝子の配列は、ＭｃＣｏｙら（（１
９９６）ＤＮＡ Ｓｅｑ．６：２５１−２５４）によって決定された。ＰＡＶ−
３ヘキソン遺伝子（および２３Ｋプロテアーゼ遺伝子の１４個のＮ末端コドン）
の配列は、登録番号Ｕ３４５９２でＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されてい
る。ＰＡＶ−３ １００Ｋ遺伝子の配列は、登録番号Ｕ８２６２８でＧｅｎＢａ
ｎｋデータベースに寄託されている。ＰＡＶ−３ Ｅ４領域の配列は、Ｒｅｄｄ
ｙら（（１９９７）Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １５：８７−９０）によって決定
された。Ｖｒａｔｉら（１９９５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０９：４００−４０８
）は、ヒツジアデノウイルスの配列を開示する。
【０００７】 少なくとも４７の血清型のヒトアデノウイルスが記載されている。特定疾患に
関連した最も普通の血清型についての総論が公開されている。例えば、Ｆｏｙ
Ｈ．Ｍ．（１９８９）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ Ｉｎ Ｅｖａｎｓ ＡＳ（編
）．Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、７７−８９頁およびＲｕｂｉｎ Ｂ
．Ａ．（１９９３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｉｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍ
ｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、Ａｃｔａ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｈｕｎｇ ４０：３０３−３２３を参照のこと。ヒトア
デノウイルスのキャプシドは、正二十面体対称性を示し、そして２５２のキャプ
ソメアを含む。キャプソメアは、２４０個のヘキソンおよび各ペントン上に突き
出たファイバーを有する１２個のペントンからなる。そのペントンおよびヘキソ
ンは、異なるウイルスポリペプチドからそれぞれ誘導される。型特異的抗体の原
因であるこのファイバーは、ヒト株のうちで長さが変化する。このヘキソンは、
グループ特異的な補体結合抗体であり、一方、このペントンは、赤血球凝集反応
において特に活性である（ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ、Ｖａｃｃ
ｉｎｅｓ、第３版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｐｈｉｌａｄ
ｅｌｐｈｉａ、６０９−６２３頁）。このファイバー領域はホモ三量体のコンフ
ォメーションをとり、これは、アデノウイルスキャプシドの形成におけるペント
ンベースと成熟ファイバータンパク質との会合に必要である。ファイバーは、フ
ァイバー３量体のアミノ末端とペントンベース内の保存されたドメインとの間の
非共有結合的な相互作用によってペントンベースと会合する。アデノウイルスフ
ァイバータンパク質のカルボキシ末端の球状ノブドメインが、そのアデノウイル
スの第一の細胞レセプターに対して結合するためのリガンドであることが示され
ている（Ｋｒａｓｎｙｋｈら（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ、７０：６８３９）。３量体ファイバー分子の遠位のＣ末端ドメインは、特
定の第一のレセプターに対する高い親和性で結合するノブで終わる。結合後、ペ
ントンベースのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）モチーフは、第二のレセプタ
ーとして機能するαｖβ３型およびαｖβ５型の細胞インテグリンと相互作用す
る。この相互作用は、細胞内在化を引き起こし、これにより、ビリオンはエンド
ソーム中に存在する。このエンドソーム膜は、ペントンベースによって媒介され
る過程において溶解され、エンドソームの内容物が細胞質に放出される。これら
の過程の間、このビリオンは、次第に脱殻され、そしてこのアデノウイルスＤＮ
Ａは核中に輸送される（Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖら（２０００）Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：２５６７−２５８３）。
【０００８】 アデノウイルスおよびアデノウイルスベクターシステムの開発についての一般
的な背景の引用文献については、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
５２：４５６−４６７；Ｔａｋｉｆｆら（１９８１）Ｌａｎｃｅｔ １１：８
３２−８３４；Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ １１：６００３−６０２０；Ｇｒａｈａｍ（１９８４）ＥＭＢＯ
Ｊ ３：２９１７−２９２２；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
６７：５９１１−５９２１；およびＢｅｔｔら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８０２−８８０６を参照のこと。
【０００９】 アデノウイルスは一般的に、宿主細胞の感染に続いて溶解性の複製周期を経る
。感染細胞を溶解するのに加えて、アデノウイルスの複製過程は、宿主細胞のｍ
ＲＮＡの輸送および翻訳を阻害し、従って細胞タンパク質合成を阻害する。アデ
ノウイルスおよびアデノウイルス複製に関する総論については、Ｓｈｅｎｋ、Ｔ
．およびＨｏｒｗｉｔｚ、Ｍ．Ｓ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｆｉｅｌｄｓ
、Ｂ．Ｎ．ら編、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９９６）、第６７章および第６８章のそれぞれを参照のこと。
【００１０】 遺伝子工学の適用は、アデノウイルス発現システムをワクチンを得るために調
製するいくつかの試みを生じた。このような研究の例は、以下における開示を含
む：米国特許第４，５１０，２４５号（酵母宿主での発現のためのアデノウイル
スの主要後期プロモーター）；米国特許第４，９２０，２０９号（欠失した早期
領域３の位置に位置するＢ型肝炎表面抗原のコード遺伝子を有する生の組換え体
アデノウイルス７型）；欧州特許第３８９２８６号（ヒト細胞でのＨＣＭＶの主
要エンベロープ糖タンパク質に対する非欠損ヒトアデノウイルス５組換え体の発
現システム）；ＷＯ９１／１１５２５（Ｅ１Ａタンパク質を発現する細胞におけ
る生存可能な生の非病原的免疫原のイヌのアデノウイルス）；ならびにフランス
特許第２６４２７６７号（アデノウイルス２のＥ３領域に由来するリーダーおよ
び／またはプロモーターを含むベクター）。米国特許第６，００１，５９１号お
よび同第５，８２０，８６８号ならびに国際公開番号ＷＯ９５／１６０４８は、
ウシアデノウイルス発現ベクターシステムでの組換え体タンパク質の産生を開示
する。米国特許第５，９２２，５７６号は、組換え体アデノウイルス生成のため
のシステムを開示する。
【００１１】 Ｋｒａｓｎｙｋｈら（１９９６、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、
７０：６８３９）、Ｚａｂｎｅｒら（１９９９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ、７３：８６８９）およびＳｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖら、前出は、改
変されたファイバー領域を有するヒトアデノウイルスベクターの生成を報告する
。Ｘｕら（１９９８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２４８：１５６−１６３）は、ヒトア
デノウイルス５型のファイバータンパク質細胞結合ドメインを保有するウシアデ
ノウイルスを開示する。
【００１２】 この本明細書中に引用された全ての特許および刊行物の開示は、それらの全体
が参考として援用される。
【００１３】 （発明の開示） 本発明は、キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌ
クレオチドに改変を含むアデノウイルス（好ましくは、ウシアデノウイルス）を
提供し、ここで、上記タンパク質またはそれらのフラグメントは、親和性と関連
し、そして上記改変は変更された親和性に関連する。本発明はさらに、改変され
たアデノウイルスを含む宿主細胞および方法を提供する。従って、本発明は、キ
ャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドに改
変を含むウシアデノウイルスベクターを提供し、ここで、上記タンパク質または
そのフラグメントは親和性と関連し、そして上記改変は変更された親和性に関連
する。いくつかの実施形態において、キャプシドタンパク質またはそのフラグメ
ントをコードするこのポリヌクレオチドは、異種の哺乳動物のキャプシドタンパ
ク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドで置き換えられる。
このキャプシドタンパク質またはそのフラグメントとしては、アデノウイルスの
ペントン、ヘキソン、またはファイバータンパク質、あるいはそれらのフラグメ
ントが挙げられる。いくつかの実施形態において、この改変は、ファイバータン
パク質のノブ領域をコードするポリヌクレオチドに存在する。他の実施形態にお
いて、ウシアデノウイルスのペントン、ヘキソンおよび／またはファイバータン
パク質をコードするポリヌクレオチドは、異種の哺乳動物アデノウイルスのペン
トン、ヘキソンおよび／またはファイバータンパク質をコードする少なくとも１
つのポリヌクレオチドでそれぞれ置き換えられる。さらなる実施形態において、
ウシアデノウイルスのペントンタンパク質またはそのフラグメントをコードする
ポリヌクレオチドは、異種の哺乳動物アデノウイルスのペントンタンパク質また
はそのフラグメントをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドで置き換え
られ；ウシアデノウイルスのヘキソンタンパク質またはそのフラグメントをコー
ドするポリヌクレオチドは、異種の哺乳動物アデノウイルスのヘキソンタンパク
質、またはそれらのフラグメントをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチ
ドで置き換えられ；あるいはウシアデノウイルスのファイバータンパク質または
ノブ領域のようなそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、異種の哺
乳動物アデノウイルスのファイバータンパク質またはファイバータンパク質の異
種ノブ領域のようなそのフラグメントをコードする少なくとも１つのポリヌクレ
オチドで置き換えられる。
【００１４】 さらなる実施形態において、異種の哺乳動物アデノウイルスとしては、ウシ、
ブタ、ヒツジ、イヌまたはヒトのアデノウイルスが挙げられる。さらなる実施形
態において、ウシアデノウイルスとしては、サブタイプ１アデノウイルス、そし
て特にＢＡＶ３、またはサブタイプ２アデノウイルスが挙げられる。他の実施形
態において、このウシアデノウイルスベクターはさらに、異種タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、この異種タンパ
ク質は治療的タンパク質である。他の実施形態において、この異種タンパク質と
しては、サイトカイン；リンホカイン；病原性生物によって認識される膜レセプ
ター、ジストロフィン；インスリン；細胞イオンチャネルに関与するタンパク質
；アンチセンスＲＮＡ；病原性遺伝子によって産生されるタンパク質の活性を阻
害し得るタンパク質、酵素活性阻害タンパク質、病原性タンパク質のタンパク質
改変体；抗原性エピトープ；主要組織適合遺伝子複合体のクラスＩおよびクラス
ＩＩタンパク質；抗体；免疫毒素；毒素；増殖因子または成長ホルモン；細胞レ
セプターまたはそれらのリガンド；腫瘍サプレッサー；細胞酵素；あるいは自殺
遺伝子が挙げられる。なお他の実施形態において、アデノウイルスベクターはＥ
１機能を欠いている。さらなる実施形態において、アデノウイルスベクターは、
Ｅ１遺伝子領域の部分的または全ての欠失を有する。さらなる実施形態において
、このアデノウイルスベクターはＥ３遺伝子領域の部分的または全ての欠失を有
する。なおさらなる実施形態において、異種タンパク質をコードするポリヌクレ
オチドは、アデノウイルスのＥ１遺伝子領域に挿入される。他の実施形態におい
て、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アデノウイルスのＥ３遺
伝子領域に挿入される。さらなる実施形態において、アデノウイルスベクターは
複製欠損性であり、そして、なおさらなる実施形態において、アデノウイルスベ
クターは複製能力がある。本発明はまた、キャプシドタンパク質またはそのフラ
グメントをコードするポリヌクレオチドに改変を有するウシアデノウイルスベク
ターを含む宿主細胞を含む。
【００１５】 本発明はまた、キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするポ
リヌクレオチドに改変を含む組換え体ウシアデノウイルスベクターを産生する方
法を提供し、この方法は、ウシアデノウイルスベクターを得る工程；およびキャ
プシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドに改変
を導入する工程を含み、ここで、上記キャプシドタンパク質またはそのフラグメ
ントは親和性に関連し、そして上記改変は変更された親和性に関連する。いくつ
かの実施形態において、この改変は、ウシアデノウイルスのペントン、ヘキソン
および／またはファイバータンパク質、あるいはそれらのフラグメントをコード
する少なくとも１つのポリヌクレオチドと、異種の哺乳動物のペントン、ヘキソ
ンおよび／またはファイバータンパク質、あるいはそれらのフラグメントをコー
ドする少なくとも１つのポリヌクレオチドとの置換である。他の実施形態におい
て、この改変はファイバータンパク質のノブ領域をコードするポリヌクレオチド
の置換である。さらなる実施形態において、このアデノウイルスベクターはさら
に、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００１６】 本発明はさらに、キャプシドタンパク質、またはそれらのフラグメントの改変
を含む組換え体ウシアデノウイルスを提供し、ここで上記キャプシドタンパク質
またはそのフラグメントは親和性に関連し、そして上記改変は変更された親和性
に関連する。さらなる実施形態において、組み換え体アデノウイルスは異種タン
パク質をコードするポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、異種
タンパク質をコードするポリヌクレオチドはアデノウイルスＥ１遺伝子領域に挿
入され；なおさらなる実施形態において、異種タンパク質をコードするポリヌク
レオチドはアデノウイルスＥ３遺伝子領域に挿入される。いくつかの実施形態に
おいて、組み換え体アデノウイルスは複製能力があり、そして他の実施形態にお
いて、組み換え体アデノウイルスは複製欠損性である。いくつかの実施形態にお
いて、組み換え体アデノウイルスは、ウシアデノウイルスのペントン、ヘキソン
および／またはファイバータンパク質、あるいはそれらのフラグメントをコード
する少なくとも１つのポリヌクレオチドと、異種の哺乳動物のペントン、ヘキソ
ンおよび／またはファイバータンパク質、あるいはそれらのフラグメントをコー
ドする少なくとも１つのポリヌクレオチドとの置換を含む。なおさらなる実施形
態において、組み換え体アデノウイルスは、ファイバータンパク質のノブ領域に
おける改変を含む。
【００１７】 本発明はまた、ウシアデノウイルスを含む免疫原性組成物を提供し、ここで上
記アデノウイルスはキャプシドタンパク質またはそのフラグメントにおける改変
をコードするポリヌクレオチドを含み、そして上記タンパク質またはそのフラグ
メントは親和性に関連し、そして上記改変は変更された親和性に関連する。いく
つかの実施形態において、このキャプシドタンパク質またはそのフラグメントと
しては、アデノウイルスのペントン、ヘキソンまたはファイバータンパク質、あ
るいはそれらのフラグメントが挙げられる。免疫原性組成物のいくつかの実施形
態において、この改変は、ウシキャプシドタンパク質またはそのフラグメントを
コードするポリヌクレオチドと、異種の哺乳動物アデノウイルスキャプシドタン
パク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドとの置換を含む。
免疫原性組成物の他の実施形態において、この改変は、ウシファイバータンパク
質のノブ領域をコードするポリヌクレオチドの、異種の哺乳動物アデノウイルス
のファイバータンパク質のノブ領域をコードするポリヌクレオチドでの置換を含
む。他の実施形態において、ウシアデノウイルスは、サブタイプ１アデノウイル
ス、特にＢＡＶ３、またはサブタイプ２アデノウイルスである。さらなる実施形
態において、免疫原性組成物は、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むウシアデノウイルスを含む。他の実施形態において、免疫原性組成物は、
サイトカイン；リンホカイン；病原性生物によって認識される膜レセプター、ジ
ストロフィン；インスリン；細胞イオンチャネルに関与するタンパク質；アンチ
センスＲＮＡ；病原性遺伝子によって産生されるタンパク質の活性を阻害し得る
タンパク質、酵素活性阻害タンパク質、病原性タンパク質のタンパク質改変体；
抗原性エピトープ；主要組織適合遺伝子複合体のクラスＩおよびクラスＩＩタン
パク質；抗体；免疫毒素；毒素；増殖因子または成長ホルモン；細胞レセプター
またはそれらのリガンド；腫瘍サプレッサー；細胞酵素；あるいは自殺遺伝子を
コードするポリヌクレオチドを含むウシアデノウイルスを含む。
【００１８】 本発明はまた、哺乳動物の被験体における免疫応答を誘導し得る有能な薬学的
組成物を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、改変されたキャ
プシドタンパク質またはそのフラグメントを有するウシアデノウイルスを含む免
疫原性組成物を含み、ここで、上記タンパク質またはそのフラグメントは親和性
に関連し、そして上記改変は変更された親和性に関連する。薬学的組成物のいく
つかの実施形態において、免疫原性組成物は、異種タンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドを含むウシアデノウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態に
おいて、この異種タンパク質は治療的タンパク質である。他の実施形態において
、この薬学的組成物はさらに、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。
【００１９】 本発明はまた、哺乳動物宿主において免疫応答を誘発して感染を防ぐための方
法を提供し、この方法は、本発明の薬学的組成物を必要のある哺乳動物宿主に投
与する工程を含む。本発明はまた、哺乳動物宿主における遺伝子送達の方法を提
供し、この方法は、改変されたキャプシドタンパク質またはそのフラグメントを
コードするポリヌクレオチドを含むウシアデノウイルスベクターをこの宿主に投
与する工程を含み、ここで、このタンパク質は親和性に関連し、そしてこの改変
は変更された親和性に関連し、そしてこのアデノウイルスベクターはさらに、異
種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態におい
て、この異種ポリヌクレオチドは治療的タンパク質をコードする。
【００２０】 （発明を実行するための最良の形態） 本発明者らは、変更された親和性を有する改善されたアデノウイルスベクター
（詳細には、改善されたウシアデノウイルスベクター）を発見し、そしてこれを
構築した。本発明のウシアデノウイルスベクターは、少なくとも１つのキャプシ
ドタンパク質をコードするポリヌクレオチド中に改変を含み、ここで、このタン
パク質またはそのフラグメントは、親和性と関連し、そしてその改変は、変更さ
れた親和性と関連する。
【００２１】 キャプシドタンパク質としては、ペントン、ヘキソンおよびファイバータンパ
ク質（ｆｉｂｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。本明細書中に例示される１
つの実施形態において、ＢＡＶ３アデノウイルスベクターを構築し（ＢＡＶ６０
０）、これは、ＢＡＶ３ファイバーノブ領域（ｆｉｂｅｒ ノブ ｒｅｇｉｏｎ
）とヒトアデノウイルス（Ａｄ５）ファイバーノブ領域との置換を含んだ。ＢＡ
Ｖ６００は、コントロールアデノウイルスと比較した場合、ヒト細胞株において
増加した形質導入を示した。
【００２２】 本発明は、キャプシドタンパク質が親和性と関連し、そして置換が変更された
親和性と関連する限りキャプシドタンパク質またはそのフラグメントの、異種哺
乳動物キャプシドタンパク質またはそのフラグメントとの置換含む、ウシアデノ
ウイルスベクターを含む。例えば、１つの実施形態において、ウシのファイバー
タンパク質のノブドメインを、種親水性を変更するために、ブタのファイバータ
ンパク質のノブ領域またはヒツジのファイバータンパク質のノブ領域と置換する
。このようなウシアデノウイルスベクターは、ブタアデノウイルスまたはヒツジ
アデノウイルスでそれぞれ初回免疫されたブタ哺乳動物またはヒツジ哺乳動物に
おいて免疫性をブーストするための免疫原として使用され得る。このような免疫
化プロトコルにおいて、ブースト免疫は、初回免疫の結果として産生されるブタ
哺乳動物またはヒツジ哺乳動物に対する任意の中和抗体の影響を回避しながら、
ブタ哺乳動物またはヒツジ哺乳動物に対して種特異性を有するウシアデノウイル
スの投与によって達成され得る。あるいは、別の実施形態において、ウシファイ
バータンパク質またはそのフラグメント（例えば、ノブ領域）を、ウシ細胞特異
性を変更するために、異種ウシファイバータンパク質またはそのフラグメント（
例えば、ファイバータンパク質のノブ領域）と置換する。１つの例において、ウ
シアデノウイルスサブタイプ１ファイバー領域またはそのフラグメント（例えば
、ノブドメイン）を、ウシ細胞型特異性を変更するために、ウシアデノウイルス
サブタイプ２ファイバー領域またはそのフラグメント（例えば、ノブドメイン）
と置換する。このようなウシアデノウイルスベクターは、特定の細胞または組織
を標的化するための免疫原として使用され得る。
【００２３】 本発明はまた、ウシキャプシドタンパク質またはそのフラグメントの、ヒトア
デノウイルスキャプシドタンパク質またはそのフラグメントとの置換を含むウシ
アデノウイルスの使用を含み、その結果、改変されたウシアデノウイルスは、ヒ
トに対する種特異性を有する。このようなウシアデノウイルスは、ヒト免疫化プ
ロトコルに使用され得、ここで、臨床患者におけるヒトアデノウイルス−５（Ｈ
ＡＶ−５）に対する既存の中和抗体は、ＨＡＶ−５の効果的な使用に対して障害
を示し得る。
【００２４】 さらに、標的細胞に治療効果を提供するために、１つ以上の異種治療タンパク
質が、アデノウイルスベクター中に存在し得る。
【００２５】 （定義） 本発明を記載する際に、以下の用語（以下に規定される）が使用される。
【００２６】 「アデノウイルスベクター（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）」または
「アデノウイルスベクター（ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）」（これら
は、交換可能に使用される）は、本発明のポリヌクレオチド構築物を含む。本発
明のポリヌクレオチド構築物は、いくつかの形態（ＤＮＡ、アデノウイルスコー
トにカプセル化されたＤＮＡ、別のウイルスもしくはウイルス様形態（例えば、
単純疱疹ウイルス、およびＡＡＶ）中にパッケージングされたＤＮＡ、リポソー
ムにカプセル化されたＤＮＡ、ポリリジンと複合体化したＤＮＡ、合成ポリカチ
オン性分子と複合体化したＤＮＡ、トランスフェリンと結合体化したＤＮＡ、お
よび分子を免疫学的に「マスクする」ためおよび／または半減期を増加させるた
めにＰＥＧのような化合物に複合体化したＤＮＡ、ならびに非ウイルスタンパク
質に結合体化されたＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない）の内のいず
れかであり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。本明細書中
に使用される場合、「ＤＮＡ」は、塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧのみでなく、これら
のアナログもしくはこれらの塩基の改変形態のうちのいずれか（例えば、メチル
化ヌクレオチド、ヌクレオチド間改変（例えば、非電荷連結およびチオエート）
、糖アナログの使用、ならびに改変された骨格構造および／または代替骨格構造
（例えば、ポリアミド））を含み得る。アデノウイルスベクターは、標的細胞に
おいて複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。
【００２７】 本明細書中に使用される場合、用語「変更された親和性」は、アデノウイルス
の特異性を変化させることをいう。用語「改変された親和性」は、種特異性の変
更ならびにアデノウイルスの組織特異性もしくは細胞特異性の変更を含む。本明
細書中に例示される実施形態において、種特異性は、キャプシドタンパク質また
はそのフラグメント（例えば、ファイバータンパク質、特に、ファイバータンパ
ク質のノブ領域）に改変を生成することによって、変更される。
【００２８】 「キャプシドタンパク質」は、本明細書中に使用される場合、アデノウイルス
のペントン、ヘキソンおよびファイバー領域を含む。キャプシドタンパク質は、
アデノウイルス親和性に直接的または間接的に影響を与える場合、親和性と関連
する。「変更された親和性と関連するキャプシドタンパク質の改変」は、本明細
書中に使用される場合、その特異性が変更されるように、キャプシドタンパク質
（すなわち、ペントン、ヘキソンもしくはファイバータンパク質領域、またはこ
れらのフラグメント（例えば、特異性が変更されるようなファイバー領域のノブ
ドメイン））をコードするポリヌクレオチドの改変を生成することをいう。「関
連する」とは、改変が、直接的または間接的のいずれかで、変更された親和性に
寄与することを意味する。本明細書中に例示される実施形態において、アデノウ
イルスにおいて種特異性を生成するために、この改変は、ウシキャプシドタンパ
ク質領域と異種哺乳動物キャプシドタンパク質領域との置換である。１つの種の
キャプシドタンパク質領域と異種キャプシドタンパク質領域との置換は、変更さ
れた組織特異性または変更された細胞特異性もまた生成し得る。
【００２９】 「レプリコン」は、インビボでのＤＮＡ複製の自律的単位として機能する（す
なわち、その独自の制御の下で複製し得る）任意の遺伝子エレメント（例えば、
プラスミド、染色体、ウイルス）である。
【００３０】 本明細書で用いられる場合、用語「ベクター」は、１つ以上の細胞型の形質導
入／トランスフェクションのために設計されたポリヌクレオチド構築物をいう。
例えば、ベクターは、挿入ヌクレオチドの単離、増幅、および複製のために設計
された「クローニングベクター」であり得るか、宿主細胞中でのヌクレオチド配
列の発現のために設計された「発現ベクター」であり得るか、または組換えウイ
ルスまたはウイルス様粒子を産生するよう設計された「ウイルスベクター」であ
り得るか、もしくは１つより多くの型のベクターの属性を含む「シャトルベクタ
ー」であり得る。
【００３１】 「殺された」ウイルスと対照的に、「生存ウイルス」により、組織培養物およ
び接種した動物において同一の子孫を生成し得るウイルスが意味される。
【００３２】 「ヘルパーフリーウイルスベクター」は、そのベクターに欠失しているものを
提供する第２ウイルスまたは第２細胞株を必要としないベクターである。
【００３３】 「二本鎖ＤＮＡ分子」は、その通常の二本鎖ヘリックスにおけるデオキシリボ
ヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）のポリマー形態
をいう。この用語は、その分子の一次構造および二次構造のみをいい、いずれの
特定の三次構造にも限定されない。従って、この用語は、特に、直鎖状ＤＮＡ分
子において見出される二本鎖ＤＮＡ（例えば、ウイルス、プラスミド、および染
色体由来のＤＮＡの制限フラグメント）を含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造
を議論する場合、配列は、ＤＮＡの転写されていない鎖（すなわち、ｍＲＮＡに
相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’方向への配列のみを与えるという
通常の約束事に従って、本明細書中で記載され得る。
【００３４】 ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に配置される場合、インビ
ボでポリペプチドに転写および翻訳されるＤＮＡ配列である。コード領域の境界
は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止
コドンにより決定される。コード配列として、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡ
由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列
、ウイルスＤＮＡ、および合成ＤＮＡ配列さえも挙げられ得るがこれらに限定さ
れない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列に対
して３’に位置する。
【００３５】 「転写プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして
下流（３’方向）のコード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発
明を定義する目的のために、プロモーター配列は、コード配列の翻訳開始コドン
（ＡＴＧ）によりその３’末端が結合しており、そしてバックグラウンドを超え
て検出可能なレベルで転写を開始するために必要な塩基またはエレメントの最小
数を含むように上流（５’方向）に延びている。プロモーター配列内では、転写
開始部位（ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングにより好適に規定されている）
、およびＲＮＡポリメラーゼの結合の原因となるタンパク質結合ドメイン（コン
センサス配列）が見出される。真核生物プロモーターは、しばしば（しかし、い
つもではない）、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＡＴ」ボックスを含む。原
核生物プロモーターは、−１０および−３５のコンセンサス配列に加えてシャイ
ン−ダルガーノ配列を含む。
【００３６】 ＤＮＡ「制御配列」は、集合的に、プロモーター配列、リボソーム結合部位、
スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ド
メイン、エンハンサー、翻訳終結配列などをいい、集合的に、宿主細胞における
コード領域の転写および翻訳を提供する。
【００３７】 コード配列またはタンパク質をコードする配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロ
モーター配列に結合し、そしてコード配列をｍＲＮＡへ転写し、次いでこのｍＲ
ＮＡがコード配列によりコードされるポリペプチドに翻訳される場合、細胞中の
制御配列に「作動可能に連結されている」か、または制御配列の「制御下にある
」。
【００３８】 「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡ配列により形質転換されたか、または形質転換
され得る細胞である。
【００３９】 細胞は、このような外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入される場合、このよう
な外因性ＤＮＡにより「形質転換」されている。外因性ＤＮＡは、細胞のゲノム
を構成する染色体ＤＮＡに組込まれ（共有結合され）ていてもそうでなくてもよ
い。原核生物および酵母において、例えば、外因性ＤＮＡはエピソームエレメン
ト（例えば、プラスミド）上で維持され得る。安定に形質転換された細胞は、外
因性ＤＮＡが染色体に組込まれ、その結果、染色体の複製を通じて娘細胞により
遺伝される細胞である。哺乳動物細胞について、この安定性は、外因性ＤＮＡを
含む娘細胞の集団からなる細胞株またはクローンを確立する細胞の能力により実
証される。
【００４０】 「クローン」は、単一の細胞または共通の祖先に由来する娘細胞の集団である
。「細胞株」は、インビトロで多くの世代の間安定に増殖し得る初代細胞のクロ
ーンである。
【００４１】 ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、本来、他のＤＮＡ分子と関連して見出されな
い別のＤＮＡ分子内かまたはそのＤＮＡ分子に結合した同定可能なＤＮＡのセグ
メントである。従って、異種領域がウイルス遺伝子をコードする場合、この遺伝
子は通常、供給源のウイルスまたはウイルスに感染した細胞のゲノムにおいてこ
のウイルスゲノムと隣接しないＤＮＡにより隣接される。異種コード配列の別の
例は、そのコード配列自体が本来は見出されない構築物（例えば、ネイティブの
遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）である。本明細書で用いられる場合、
対立遺伝子のバリエーションまたは天然に存在する変異現象は、ＤＮＡの異種領
域を生じない。アデノウイルスベクターを記載する際に本明細書で用いられる場
合、「異種哺乳動物キャプシド領域」は、そのキャプシド領域がアデノウイルス
の別の哺乳動物種から獲得可能であるか、または同一種の哺乳動物から獲得可能
であるが、異なるタイプまたはサブタイプのアデノウイルスからも獲得可能であ
ることを意味する。例えば、「異種哺乳動物キャプシドタンパク質」は、１つの
サブタイプのウシアデノウイルスキャプシドタンパク質と別のサブタイプのウシ
アデノウイルスキャプシドタンパク質との置換、およびウシアデノウイルスキャ
プシドタンパク質と別の種のキャプシドタンパク質（例えば、ヒトキャプシドタ
ンパク質）との置換、ならびにウシアデノウイルスキャプシドタンパク質領域と
別の血清型のウシアデノウイルスキャプシドタンパク質との置換を含む。
【００４２】 「ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）宿主」は、任意の品種、成体または幼体のウシ（ｃａ
ｔｔｌｅ）をいう。
【００４３】 用語「タンパク質」は、それぞれポリペプチドまたはグリコシル化ポリペプチ
ドを示すために本明細書で用いられる（他に注記されない限り）。用語「ポリペ
プチド」は、その最も広い意味（すなわち、ペプチド結合を介して連結した任意
のアミノ酸ポリマー（ジペプチド以上））において用いられる。従って、用語「
ポリペプチド」は、タンパク質、オリゴペプチド、タンパク質フラグメント、ア
ナログ、ムテイン、融合タンパク質などを含む。
【００４４】 「ネイティブな」タンパク質またはポリペプチドは、アデノウイルスまたはア
デノウイルス感染細胞から回収されたタンパク質またはポリペプチドをいう。従
って、用語「ネイティブなＢＡＶポリペプチド」は、天然に存在するＢＡＶタン
パク質およびそのフラグメントを含む。「非ネイティブな」ポリペプチドは、組
換えＤＮＡ法によるか、または直接的な合成により生成されたポリペプチドをい
う。「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により生成された（すなわち
、所望のポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞
から生成された）ポリペプチドをいう。
【００４５】 「実質的に純粋な」タンパク質は、他のタンパク質を含まず、好ましくは少な
くとも１０％同質、より好ましくは６０％同質性、そして最も好ましくは９５％
同質である。
【００４６】 「抗原」は、体液性および／または細胞性の抗原特異的応答を生成する宿主の
免疫系を刺激する１つ以上のエピトープを含む分子をいう。この用語はまた、「
免疫原」と交換可能に用いられる。
【００４７】 「ハプテン」は、キャリアに連結されない限り、体液性または細胞性の応答を
生成する宿主の免疫系を刺激しない１つ以上のエピトープを含む分子をいう。
【００４８】 用語「エピトープ」は、特異的な抗体分子が結合するか、またはＴ細胞により
認識される、抗原またはハプテン上の部位をいう。この用語はまた、「抗原性決
定基」または「抗原性決定部位」と交換可能に用いられる。
【００４９】 組成物またはワクチンに対する「免疫学的応答」は、目的の組成物またはワク
チンに対する細胞性および／または抗体媒介性の免疫応答の宿主における発生で
ある。通常、このような応答は、目的の組成物またはワクチンに含まれる抗原（
単数または複数）に特異的な、被験体が産生する抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞
、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞障害性Ｔ細胞からなる。
【００５０】 用語「免疫原性ポリペプチド」および「免疫原性アミノ酸配列」ならびに「免
疫原」は、それぞれ、ウイルス感染性を中和し、そして／もしくは免疫化された
宿主の保護を提供する抗体補完的または抗体依存的な細胞障害性を媒介するポリ
ペプチドまたはアミノ酸配列をいう。「免疫原性ポリペプチド」は、本明細書中
で用いられる場合、所望のタンパク質の全長（またはほぼ全長）配列またはその
免疫原性フラグメントを含む。
【００５１】 「免疫原性フラグメント」は、１つ以上のエピトープを含み、それによってウ
イルス感染性を中和し、そして／もしくは免疫化された宿主の保護を提供する抗
体補完的または抗体依存的な細胞障害性を媒介する抗体を誘導するポリペプチド
のフラグメントを意味する。このようなフラグメントは通常、少なくとも約５ア
ミノ酸長、そして好ましくは少なくとも約１０〜１５アミノ酸長である。このフ
ラグメントの長さに対する重要な上限はなく、ほぼ全長のタンパク質配列、また
は２つ以上の抗原のフラグメントを含む融合タンパク質さえも含み得る。用語「
処置」は、本明細書で用いられる場合、哺乳動物（例えば、ウシもしくはヒトま
たは他の哺乳動物）の処置であって、（ｉ）感染または再感染の防止（予防）、
または（ｉｉ）感染の症状の減少または消滅、のいずれかの処置をいう。ワクチ
ンは、組換えＢＡＶ自体かまたは組換えＢＡＶにより産生される組換え抗原を含
む。
【００５２】 「感染性の」は、細胞中へウイルスゲノムを送達する能力を有することを意味
する。
【００５３】 用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書で交換可能に用いられ
、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシ
リボヌクレオチドのいずれか）をいう。これらの用語は、一本鎖、二本鎖、また
は三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッ
ド、もしくはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、あるいは他の天然の
ヌクレオチド塩基、化学的に改変されたヌクレオチド塩基、生化学的に改変され
たヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、または誘導体化したヌクレオ
チド塩基を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（代表的には、
ＲＮＡまたはＤＮＡにおいて見出され得る）、または改変もしくは置換された糖
もしくはリン酸基を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、合成サブ
ユニット（例えば、ホスホルアミデート）のポリマーを含み得、従って、オリゴ
デオキシヌクレオシドホスホルアミド（Ｐ−ＮＨ２）または混合ホスホラミデー
ト−ホスホジエステルオリゴマーであり得る。Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら（１９９６
）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：１８４１−８；Ｃｈａｔｕｒｖ
ｅｄｉら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３１８−２３；
Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：
２９６６−７３。ホスホロチオエート結合が、ホスホジエステル結合の代わりに
用いられ得る。Ｂｒａｕｎら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：２０８
４−９；Ｌａｔｉｍｅｒら（１９９５）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１
０５７−１０６４。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、化学的合成の一本鎖ポ
リヌクレオチド産物から、相補鎖を合成し、そして適切な条件下でこの鎖とアニ
ーリングさせるか、または適切なプライマーと共にＤＮＡポリメラーゼを用いて
相補鎖をデノボで合成するかのいずれかにより獲得され得る。ポリヌクレオチド
配列に対する言及（例えば、配列番号の言及）はまた、その相補配列も含む。
【００５４】 以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグ
メント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、
ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベ
クター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸
プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドとしては、改変ヌクレオチド（
例えば、メチル化ヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログ）、ウラシル、他
の糖および連結基（例えば、フルオロリボースおよびチオエート）、ならびにヌ
クレオチド分枝（ｂｒａｎｃｈ）を含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレ
オチド成分により介在され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分と結合
体化することにより、重合後にさらに改変され得る。この定義に含まれる他の型
の改変は、キャップ、天然に存在するヌクレオチドの１つ以上のアナログとの置
換、およびそのポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポ
リヌクレオチド、または固体支持体に取りつけるための手段の導入である。好ま
しくは、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。本明細書で用いる場合、「ＤＮＡ」
は、塩基Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧだけでなく、任意のそれらのアナログまたはこれ
らの塩基の改変形態（例えば、メチル化ヌクレオチド）、ヌクレオチド間改変体
（例えば、非荷電結合およびチオエート）、糖アナログの使用、ならびに改変骨
格構造および／または代替骨格構造（例えば、ポリアミド）も含む。
【００５５】 ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域は、整列させた場合に、２つの
配列を比較して、塩基の割合が同一である別の配列の平均値に対する特定の割合
（８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有する。このア
ラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該分野で公知のソ
フトウェアプログラムを用いて決定され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕ
ｂｅｌら編、１９８７年）補遺３０、７．７．１８節、表７．７．１に記載され
るプログラム）。好ましいアラインメントプログラムは、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ
（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ
、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）であり、好ましくは以下のようなデフォルト設定
を使用する：ミスマッチ＝２；オープンギャップ＝０；伸長ギャップ＝２。
【００５６】 「転写制御下」は、当該分野で十分に理解される用語であり、そしてポリヌク
レオチド配列（通常、ＤＮＡ配列）の転写が、転写の開始または促進に寄与する
エレメントにそれが作動可能に連結されていることに依存することを示す。「作
動可能に連結される」は、エレメントが機能することを可能にする配列にある並
置をいう。
【００５７】 本明細書で用いられる場合、「細胞障害性」は、当該分野で十分に理解される
用語であり、そして細胞の通常の生化学的または生物学的活性が損なわれる（す
なわち、阻害される）状態をいう。これらの活性としては、代謝；細胞複製；Ｄ
ＮＡ複製；転写；翻訳；分子の取り込み、が挙げられるがこれらに限定されない
。「細胞障害性」は、細胞死および／または細胞溶解を含む。細胞障害性を示す
アッセイ（例えば、色素除去、３Ｈ−チミジンの取り込み、およびプラークアッ
セイ）は当該分野で公知である。
【００５８】 アデノウイルスの文脈において、「異種ポリヌクレオチド」または「異種遺伝
子」もしくは「導入遺伝子」は、野生型アデノウイルスに存在しない任意のポリ
ヌクレオチドまたは遺伝子である。好ましくは、導入遺伝子はまた、アデノウイ
ルスベクターの導入前に標的細胞において発現または存在しない。
【００５９】 アデノウイルスの文脈において、「異種」プロモーターまたはエンハンサーは
、アデノウイルス遺伝子に関連も由来もしないプロモーターまたはエンハンサー
である。
【００６０】 アデノウイルスの文脈において、「内因性」プロモーター、エンハンサー、ま
たはコントロール領域は、アデノウイルスに対してネイティブであるか、または
これに由来する。
【００６１】 「宿主細胞」は、本発明のアデノウイルスベクターのレシピエントであり得る
か、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞
は、単一の宿主細胞の子孫を含み、そしてこの子孫は、天然の、偶然の、または
計画的な変異および／または変化に起因して、本来の親細胞と完全に同一である
（形態または全ＤＮＡの相補性において）必要はない。宿主細胞は、本発明のア
デノウイルスベクターを用いて、インビボまたはインビトロでトランスフェクト
または感染させた細胞を含む。
【００６２】 「複製」および「増殖」は交換可能に用いられ、そして本発明のアデノウイル
スベクターの再生または増殖する能力をいう。これらの用語は、当該分野で十分
に理解される。本発明の目的のために、複製はアデノウイルスタンパク質の産生
に関し、そして一般的に、アデノウイルスの繁殖に関する。複製は、当該分野で
標準的なアッセイおよび本明細書に記載されるアッセイ（例えば、バーストアッ
セイまたはプラークアッセイ）を用いて測定され得る。「複製」および「増殖」
は、ウイルス製造のプロセスに直接的にかまたは関節的に関与する任意の活性（
ウイルス遺伝子の発現；ウイルスタンパク質、核酸、または他の要素の生成；ウ
イルス成分の完全なウイルスへのパッケージング；および細胞溶解）を含む。
【００６３】 配列番号に「示される」ポリヌクレオチド配列は、その配列が、配列番号にお
いて同一の連続的な配列として存在することを意味する。この用語は、配列番号
の一部分または領域、ならびに配列番号中に含まれる配列全体を包含する。
【００６４】 「生物学的サンプル」は、個体から獲得される種々のサンプル型を包含し、そ
して診断アッセイまたはモニタリングアッセイにおいて用いられ得る。この定義
は、生物学的起源の血液および他の液体サンプル、固体組織サンプル（例えば、
生体標本もしくは組織培養物またはそれらの由来となる細胞）、およびそれらの
子孫を包含する。この定義はまた、それらの獲得後に任意の方法で操作された（
例えば、試薬による処理、可溶化、または特定の成分（例えば、タンパク質また
はポリヌクレオチド）の濃縮により）サンプルを含む。用語「生物学的サンプル
」は臨床的サンプルを包含し、そしてまた、培養物、細胞上清、細胞溶解物、血
清、血漿、生物学的流体、および組織サンプル中の細胞を含む。
【００６５】 「個体」または「哺乳動物被験体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より
好ましくはヒトである。哺乳動物としては、家畜動物、競技用動物、げっ歯類、
霊長類、およびペットが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６６】 「有効量」は、有益な結果または所望の結果（臨床的な結果を含む）をもたら
すのに十分な量である。有効量は、１つ以上の投与において投与され得る。本発
明の目的のために、アデノウイルスベクターの有効量は、疾患状態の進行を和ら
げるか、改善するか、安定化させるか、逆転させるか、緩慢にする、または遅延
させるのに十分な量である。
【００６７】 「発現」は、転写および／または翻訳を含む。
【００６８】 本明細書で用いられる場合、用語「含む（包含する）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ
）」およびその同義語は、それらの包括的な意味（すなわち、用語「含む（ｉｎ
ｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその対応する同義語と等価な意味）において用いられ
る。
【００６９】 「Ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その文脈が明らかにそうでないと示
さない限り、複数の参照を含む。
【００７０】 （詳細な説明） 本発明は、親和性に関連するキャプシドタンパク質を同定し、そしてアデノウ
イルスベクターを構築する方法および変更された親和性を有する組換えアデノウ
イルスを提供する。好ましい実施形態において、このアデノウイルスは、ウシア
デノウイルス（例えば、サブタイプ１アデノウイルス（特にＢＡＶ３）またはサ
ブタイプ２アデノウイルス）である。例示的な実施形態において、親和性に関連
するウシキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の一部または
全ては欠失され、そしてアデノウイルスの親和性を変更する異種哺乳動物キャプ
シドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と置換される。本明細書に開
示される特定の実施形態において、ウシ線維タンパク質の小頭部（ノブ）領域は
、ヒトの線維タンパク質の小頭部領域と置換される。本発明はまた、細胞の特異
性を変更するために、親和性に関連する１つのウシ血清型アデノウイルスキャプ
シドタンパク質の、親和性に関連する異種性ウシ血清型アデノウイルスキャプシ
ドタンパク質との置換を含むアデノウイルスを包含する。
【００７１】 ＢＡＶ３ゲノムの完全なヌクレオチド配列は、本明細書で開示される。図１（
配列番号１）を参照のこと。ｍＲＮＡの転写マッピングおよびｃＤＮＡクローン
の配列決定から得たＢＡＶ３ゲノムの転写地図を図２に示す。ＢＡＶ３ゲノムの
大きさ（３４，４４６ｂｐ）および組織全体は、ＨＡＶのそれと類似している可
能性があるが、特定の相違が存在する。Ｒｅｄｄｙら（１９９８）前出。ＢＡＶ
３ゲノムの顕著な特徴の１つは、比較的小さい大きさのＥ３コード領域（１５１
７ｂｐ）である。Ｍｉｔｔａｌら（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：
３２９５−３３００；Ｍｉｔｔａｌら（１９９３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７
４：２８２５；およびＲｅｄｄｙら（１９９８）前出。ＢＡＶ３ Ｅ３領域およ
びそのＲＮＡ転写物の配列の分析は、ＢＡＶ３ Ｅ３が少なくとも４つのタンパ
ク質をコードし得ることを示唆し、そのうちの１つ（１２１Ｒ）は、ＨＡＶ５の
１４．７ｋＤａタンパク質との限定された相同性を示す。Ｉｄａｍａｋａｎｔｉ
（１９９８）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｅ３ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−３」、Ｍ
．Ｓｃ．ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａ
ｎ、Ｓａｓｋａｔｏｏｎ、Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ。
【００７２】 Ｒｅｄｄｙら（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：
１３９４は、ＢＡＶ３のヌクレオチド配列を開示する。ＢＡＶ３のポリヌクレオ
チド配列において、ペントン領域は１２９１９で開始し、そして１４３６７で終
了し；ヘキソン領域は１７８０９で開始し、そして２０５１７で終了し；線維領
域は２７９６８で開始し、そして３０８９８で終了する。線維タンパク質の小頭
部領域（またはドメイン）は、図４に示されるように残基ＴＬＷＴモチーフの後
で開始する。この線維タンパク質はまた、シャフトおよびテイル領域（またはド
メイン）を含む。
【００７３】 ヒトアデノウイルスＡｄ３、Ａｄ４、Ａｄ５、Ａｄ９、およびＡｄ３５は、ア
メリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能である。Ａｄ
５に関するＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＧｅｎＢａｎｋ登録番号はＭ７３２６０／Ｍ２
９９７８であり；Ａｄ９についてはＸ７４６５９であり；そしてＡｄ３５につい
てはＵ１０２７２である。Ｃｈｏｗら（１９７７、Ｃｅｌｌ １２：１−８）は
ヒトアデノウイルス２配列を開示し；Ｄａｖｉｓｏｎら（１９９３、Ｊ．Ｍｏｌ
ｅ．Ｂｉｏｌ．２３４：１３０８−１３１６）は４０型ヒトアデノウイルスのＤ
ＮＡ配列を開示し；Ｓｐｒｅｎｇｅｎら（１９９４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：３
７９−３８９）は１２型ヒトアデノウイルスＤＮＡのＤＮＡ配列を開示し；Ｖｒ
ａｔｉら（１９９５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０９：４００−４０８）はヒツジア
デノウイルスの配列を開示し；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９９７、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖ
ｉｒｏｌ．７８：８７３−８７８）は１型イヌアデノウイルスＤＮＡ配列を開示
し；そしてＲｅｄｄｙら（１９９８、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２５１：４１４）はブ
タアデノウイルスのＤＮＡ配列を開示する。
【００７４】 Ｓｈａｙａｋｈｍｅｔｏｖら（前出）はヒトＡｄ９およびヒトＡｄ３５線維領
域のＰＣＲプライマーを提供する。ＨＡＶ−５線維タンパク質を図１２に示し；
図１３はウシアデノウイルス−３（ＢＡＶ−３）線維タンパク質のアミノ酸配列
を示し；図１４はヒツジアデノウイルス２８７線維タンパク質のアミノ酸配列を
示し；図１５はブタアデノウイルス−３（ＰＡＶ−３）線維タンパク質のアミノ
酸配列を示し；図１６はイヌアデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）線維タンパク質
のアミノ酸配列を示し；そして図１７Ａ〜１７Ｇは、マルチアラインプログラム
のｃｌｕｓｔａｌ法を用いて、哺乳動物アデノウイルス線維領域のアミノ酸アラ
インメントを示す。線維領域の小頭部ドメインは、代表的に、アミノ酸残基モチ
ーフＴＬＷＴ（ヒンジ領域）の後に開始する（図４を参照のこと）（１つの例外
は、ヒツジアデノウイスル線維領域である）。
【００７５】 次いで、アデノウイルスベクター構築物は、適切な宿主細胞の形質転換または
トランスフェクションの前かまたは後のいずれかに、ＢＡＶゲノムを用いてイン
ビトロまたはインビボで組換えが行なわれ得る。
【００７６】 適切な宿主細胞として、ＢＡＶゲノムとＢＡＶ配列を含むプラスミドとの間、
または各々がＢＡＶ配列を含む、２つ以上のプラスミド間の組換えを支持する任
意の細胞が挙げられる。組換えは、一般的に、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）において実施され、一方、ウイルス粒子を生成するためのウイルスゲノム
を含むプラスミドのトランスフェクトは真核生物細胞（好ましくは、哺乳動物、
より好ましくはウシ細胞培物、最も好ましくはＭＤＢＫまたはＰＦＢＲ細胞、お
よびそれらの等価物）において実施される。細菌細胞培養物の増殖ならびに真核
生物細胞および哺乳動物細胞株の培養および維持は、当業者に周知の手順である
。
【００７７】 １つ以上の異種ポリヌクレオチド配列が、ＢＡＶゲノムの１つ以上の領域に挿
入されて、組換えＢＡＶ（ＢＡＶゲノムの挿入物収容能およびこの組換えＢＡＶ
が挿入された異種配列を発現する能力によってのみ限定される）を生成し得る。
一般的に、アデノウイルスゲノムは、ゲノム長の約５％の挿入物を受け入れ得、
そしてウイルス粒子にパッケージングされる能力を保持し得る。この挿入物収容
能は、非必須領域の欠失および／または必須領域（例えば、Ｅ１領域（Ｅ１領域
の機能は、ヘルパー細胞株（例えば、Ｅ１機能を提供する細胞）により提供ｙさ
れる））の欠失により増大され得る。いくつかの実施形態において、タンパク質
をコードする異種ポリヌクレオチドは、アデノウイルスＥ１遺伝子領域に挿入さ
れる。いくつかの実施形態において、アデノウイルスは、Ｅ１領域の一部または
全ての欠失を有し、そしてＥ１機能を提供するヘルパー細胞株中で増殖される。
さらに他の実施形態において、タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドは
、アデノウイルスＥ３遺伝子領域に挿入される。他の実施形態において、アデノ
ウイルスは、Ｅ３領域の一部または全ての欠失を有する。
【００７８】 本発明の１つの実施形態において、挿入は、挿入が所望されてＢＡＶゲノムの
領域（例えば、キャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド）を含むプ
ラスミドを構築することによって達成され得る。さらに、所望の治療的タンパク
質をコードするポリヌクレオチドは、ウシアデノウイルスに挿入され得る。次い
でこのプラスミドは、プラスミドのＢＡＶ部分に認識配列を有する制限酵素を用
いて消化され、そして異種ポリヌクレオチド配列は、制限消化の部位に挿入され
る。プラスミド（挿入された異種配列を有するＢＡＶゲノムの部分を含む）を、
ＢＡＶゲノムまたはＢＡＶゲノムを含む直鎖状プラスミドと共に、細菌細胞（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような）中に同時形質転換し、ここで、ＢＡＶゲノムは、
全長ゲノムであり得るか、または１つ以上の欠失を含み得る。プラスミド間の相
同組換えは、挿入された異種配列を含む組換えＢＡＶゲノムを生成する。
【００７９】 ＢＡＶ配列の欠失は、異種配列の挿入の部位を提供するために、または異なる
部位における挿入についてのさらなる能力を提供するために、当業者に周知の方
法によって達成され得る。例えば、プラスミド中にクローニングされ、１つ以上
の制限酵素（ＢＡＶ挿入物において少なくとも１つの認識配列を有する）で消化
され、その後ライゲーションされるＢＡＶ配列は、いくつかの場合において、制
限酵素認識部位間の配列の欠失を生じる。あるいは、ＢＡＶ挿入物内の単一の制
限酵素認識部位での消化（その後、エキソヌクレアーゼ処理が続き、その後ライ
ゲーションが続く）は、制限部位に隣接したＢＡＶ配列の欠失を生じる。上記の
ように構築された、１つ以上の欠失を有するＢＡＶゲノムの１つ以上の部分を含
むプラスミドは、相同組換えによって、１つ以上の特定の部位に欠失を有する組
換えＢＡＶゲノムを含むプラスミドを生成するために、ＢＡＶゲノム（全長もし
くは欠失した）または全長ＢＡＶゲノムもしくは欠失したＢＡＶゲノムのいずれ
かを含むプラスミドと共に、細菌細胞に同時トランスフェクトされ得る。次いで
、欠失を含むＢＡＶビリオンは、哺乳動物細胞（ＭＤＢＫ細胞またはＰＦＢＲ細
胞およびこれらの等価物を含むがこれらに限定されない）の、組換えＢＡＶゲノ
ムを含むプラスミドとのトランスフェクションによって得られ得る。
【００８０】 本発明の１つの実施形態において、挿入部位は、ＢＡＶプロモーターに隣接し
、かつその（転写的な意味で）下流に存在する。ＢＡＶプロモーターの位置およ
びＢＡＶプロモーターの下流の制限酵素認識配列（挿入部位として使用するため
の）は、本明細書中に提供されるＢＡＶヌクレオチド配列から当業者によって容
易に決定され得る。あるいは、種々のインビトロ技術が、特定の部位における制
限酵素認識配列の挿入のために、または制限酵素認識配列を含まない部位に異種
配列を挿入するために使用され得る。このような方法としては、１つ以上の酵素
認識配列の挿入のためのオリゴヌクレオチド媒介ヘテロ二重鎖形成（例えば、Ｚ
ｏｌｌｅｒら（１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８
７−６５００；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９９０）Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ
．Ｂｉｏｌ．１９９：８９−９６；およびＫｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈ
．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５４：３６７−３８２を参照のこと）およびより長
い配列の挿入のためのＰＣＲ媒介方法（例えば、Ｚｈｅｎｇら（１９９４）Ｖｉ
ｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１：１６３−１８６を参照のこと）を含むが、こ
れらに限定されない。
【００８１】 異種配列が、真核生物細胞において活性である転写調節配列をさらに含む場合
、ＢＡＶプロモーターの下流ではない部位に挿入された異種配列の発現を得るこ
ともまた可能である。このような転写調節配列としては、例えば、ウシｈｓｐ７
０プロモーターのような細胞性プロモーター、ならびに例えば、ヘルペスウイル
スプロモーター、アデノウイルスプロモーターおよびパポバウイルスプロモータ
ーのようなウイルスプロモーター、そしてレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）
配列のＤＮＡコピーが挙げられ得る。
【００８２】 別の実施形態において、原核生物細胞における相同組換えを使用して、クロー
ニングされたＢＡＶゲノムを作成し得る；そしてクローニングされたＢＡＶゲノ
ムは、プラスミドとして増殖され得る。例えば、米国特許第５，９２２，５７６
号を参照のこと。感染性ウイルスは、プラスミド含有細胞からレスキューされた
クローニングされたＢＡＶゲノムでの哺乳動物細胞のトランスフェクションによ
って得られ得る。
【００８３】 本発明はまた、異種遺伝子の発現を調節するために使用され得るＢＡＶ調節配
列を提供する。調節配列は、例えば、転写調節配列、プロモーター、エンハンサ
ー、上流調節ドメイン、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、転
写終結配列、翻訳調節配列、リボソーム結合部位および翻訳終結配列であり得る
。
【００８４】 別の実施形態において、クローニングされたＢＡＶゲノムは、プラスミドとし
て増殖され得、そして感染性ウイルスは、プラスミド含有細胞からレスキューさ
れ得る。
【００８５】 ウイルス核酸の存在は、ハイブリダイゼーションアッセイ、ポリメラーゼ連鎖
反応、および他の型の増幅反応を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の
技術によって検出され得る。同様に、種々の型の免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウ
エスタンブロッティング、酵素学的アッセイ、免疫組織化学などを含むがこれら
に限定されない、タンパク質の検出のための方法は、当業者に周知である。本発
明のヌクレオチド配列を含む診断キットはまた、細胞破壊および核酸精製のため
の試薬、ならびにハイブリッドの形成、選択および検出のための緩衝液および溶
媒を含み得る。本発明のポリペプチドまたはアミノ酸配列を含む診断キットはま
た、タンパク質の単離のための、ならびに免疫複合体の形成、単離、精製および
／または検出のための試薬を含み得る。
【００８６】 種々の外来遺伝子またはヌクレオチド配列またはコード配列（原核生物および
真核生物）は、本発明に従って、特に、広範な疾患に対する保護を提供するため
に、ウシアデノウイルスヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ）中に挿入され得、
そして多数のこのような遺伝子は、すでに当該分野で公知である。従来、遺伝子
または配列のための安全な、簡便かつ効果的なワクチンベクター、ならびに種々
の遺伝子治療適用において使用され得る遺伝子移入のための安全で、効果的な手
段を提供することが、問題であった。
【００８７】 外因性（すなわち、外来の）ヌクレオチド配列は、目的の、そして好ましくは
治療目的の１つ以上の遺伝子からなり得る。本発明の文脈において、目的の遺伝
子は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、または次いで目的のタンパク質に翻訳
されるｍＲＮＡのいずれかをコードし得る。目的の遺伝子は、ゲノム型、相補Ｄ
ＮＡ（ｃＤＮＡ）型または混合型（ミニ遺伝子、ここで、少なくとも１つのイン
トロンが欠失している）の遺伝子であり得る。目的の遺伝子は、成熟タンパク質
、成熟タンパク質の前駆体、特に、分泌されることが意図され従ってシグナルペ
プチドを含む前駆体、多様な起源の配列の融合に起因するキメラタンパク質、ま
たは改善されたかもしくは改変された生物学的特性を示す天然のタンパク質をコ
ードし得る。このような変異体は、天然のタンパク質をコードする遺伝子の１つ
以上のヌクレオチドの欠失、置換および／または付加、あるいは天然のタンパク
質をコードする配列における任意の他の型の変化（例えば、遺伝子転移または逆
位）によって得られ得る。
【００８８】 目的の遺伝子は、宿主細胞におけるその発現に適したエレメント（ＤＮＡ制御
配列）の制御下に配置され得る。適切なＤＮＡ制御配列は、ＲＮＡ（アンチセン
スＲＮＡまたはｍＲＮＡ）への遺伝子の転写のために、そしてｍＲＮＡのタンパ
ク質への翻訳のために必要なエレメントのセットを意味することが理解されてい
る。転写に必要なエレメントの間で、プロモーターは、特別な重要性を想定する
。これは、構成性プロモーターまたは調節性プロモーターであり得、そして真核
生物、原核生物またはウイルス起源、およびアデノウイルス起源でさえの任意の
遺伝子から単離され得る。あるいは、これは目的の遺伝子の天然のプロモーター
であり得る。一般的には、本発明において使用されるプロモーターは、調節配列
を含むように改変され得る。例としては、本発明での使用における目的の遺伝子
は、リンパ性宿主細胞へのその移行を標的化することが所望である場合、免疫グ
ロブリン遺伝子のプロモーターの制御下に配置される。例えば、多数の細胞型に
おける発現を可能にする、ＨＳＶ−１ ＴＫ（１型ヘルペスウイルスチミジンキ
ナーゼ）遺伝子プロモーター、アデノウイルスＭＬＰ（主要後期プロモーター）
、特にヒト２型アデノウイルス、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）ＬＴＲ（長末端
反復）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）初期プロモーター、およびＰＧＫ（ホ
スホグリセリン酸キナーゼ）遺伝子プロモーターがまた、言及され得る。
【００８９】 本明細書中に開示されるように、種の親和性を変更することは、ネイティブな
線維タンパク質領域の、異種哺乳動物線維タンパク質領域での置換によって、Ｂ
ＡＶにおいて実証されている。本発明はまた、１つのウシ血清型アデノウイルス
線維領域の、別のウシ血清型アデノウイルス線維領域での置換を包含し、ここで
、この置換は、変更されたウシ細胞特異性と関連している。あるいは、組換えＢ
ＡＶベクターの特定の細胞型への標的化は、組換えヘキソンおよび／または線維
遺伝子を構築することによって達成され得る。これらの遺伝子のタンパク質産物
は、宿主細胞認識に関与している；従って、これらの遺伝子は、ウイルスが代替
の宿主細胞を認識するのを可能にするペプチド配列を含むように改変され得る。
【００９０】 本発明の文脈中において有用である目的の遺伝子の間で、以下の遺伝子が言及
され得る： −インターフェロンおよびインターロイキンのようなサイトカインをコードす
る遺伝子； −リンホカインをコードする遺伝子； −病原性生物生物（ウイルス、細菌、または寄生生物）、好ましくはＨＩＶウ
イルス（ヒト免疫不全ウイルス）によって認識されるレセプターのような膜レセ
プターをコードする遺伝子； −第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子のような凝固因子をコードする遺伝子； −ジストロフィンをコードする遺伝子； −インスリンをコードする遺伝子； −細胞性イオンチャネル（例えば、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜貫通伝導性調節
因子）タンパク質）において直接的または間接的に関与するタンパク質をコード
する遺伝子； −アンチセンスＲＮＡ、病原性生物生物のゲノム中に存在する病原性遺伝子に
よって生成されるタンパク質の活性を阻害し得るタンパク質、または発現が調節
解除される細胞性遺伝子（例えば、オンコジーン）の活性を阻害し得るタンパク
質（もしくはこれらをコードする遺伝子）をコードする遺伝子； −酵素活性を阻害するタンパク質（例えば、α１−アンチトリプシンまたはウ
イルスプロテアーゼインヒビターのような）をコードする遺伝子； −それらの生物学的機能を損なうように変異された病原性タンパク質の改変体
（例えば、標的配列への結合について天然タンパク質と競合し得、それによりＨ
ＩＶの活性化を妨げ得るＨＩＶウイルスのｔａｔタンパク質のトランス優性改変
体）をコードする遺伝子； −宿主細胞の免疫を増加するために抗原性エピトープをコードする遺伝子； −主要組織適合性複合体クラスＩおよびクラスＩＩタンパク質をコードする遺
伝子、ならびにこれらの遺伝子の誘導物質であるタンパク質をコードする遺伝子
； −抗体をコードする遺伝子； −免疫毒素をコードする遺伝子； −毒素をコードする遺伝子； −増殖因子または増殖ホルモンをコードする遺伝子； −細胞レセプターおよびこれらのリガンドをコードする遺伝子； −腫瘍サプレッサーをコードする遺伝子； −以下を含むがこれらに限定されない、心血管疾患に関与する遺伝子：オンコ
ジーン；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、およ
び神経増殖因子（ＮＧＦ）を含むがこれらに限定されない増殖因子をコードする
遺伝子；ｅ−ｎｏｓ；Ｒｂ（網膜芽細胞腫）遺伝子を含むがこれらに限定されな
い、腫瘍サプレッサー遺伝子；リポタンパク質リパーゼ；スーパーオキシドジス
ムターゼ（ＳＯＤ）；カタラーゼ；酸素およびフリーラジカルスカベンジャー；
アポリポタンパク質；およびｐａｉ−１（プラスミノーゲン活性化因子インビタ
ー−１）； −細胞性酵素または病原性生物生物によって生成される酵素をコードする遺伝
子；ならびに −自殺遺伝子。ＨＳＶ−１ ＴＫ自殺遺伝子は、例として言及され得る。この
ウイルスＴＫ酵素は、特定のヌクレオシドアナログ（アシクロビルまたはガンシ
クロビルのような）について、細胞性ＴＫ酵素と比較して、顕著に大きい親和性
を示す。この酵素は、ヌクレオシドアナログをモノリン酸化された分子に変換し
、これら自身は、細胞性酵素によって有毒なヌクレオチド前駆体に変換され得る
。これらのヌクレオチドアナログは、複製しているＤＮＡ分子に組み込まれ得、
従って、取り込みは、分裂細胞のＤＮＡにおいて主に発生する。この取り込みは
、癌細胞のような分裂細胞の特定の破壊を生じ得る。
【００９１】 この列挙は限定的なものではなく、目的の他の遺伝子は、本発明の状況におい
て使用され得る。
【００９２】 野生型生物において見出されるような完全な配列ではなく、遺伝子のヌクレオ
チド配列のフラグメントのみが使用され得る（ここで、これらのフラグメントは
、保護的な免疫応答または特定の生物学的効果を生成するために十分である）こ
とはまた、可能である。利用可能な場合、合成遺伝子またはそのフラグメントも
また使用され得る。しかし、本発明は、広範な種々の遺伝子、フラグメントなど
を用いて使用され得、そして上に示されるものに限定されない。
【００９３】 いくつかの場合において、特定の抗原に対する遺伝子は、多数のイントロンを
含み得るか、またはＲＮＡウイルスに由来し得、これらの場合、相補的なＤＮＡ
コピー（ｃＤＮＡ）が使用され得る。
【００９４】 遺伝子の首尾良い発現を生じるために、遺伝子は、適切なプロモーターエンハ
ンサーエレメントおよびポリアデニル化配列を含むと共に発現ベクターに挿入さ
れ得る。哺乳動物細胞における外来遺伝子の首尾良い発現および発現カセットの
構築を提供する多数の真核生物プロモーターならびにポリアデニル化配列は、当
該分野で公知である（例えば、米国特許第５，１５１，２６７号（この開示は、
本明細書中で参考として援用される））。プロモーターは、公知の基準に従って
、免疫原性タンパク質の最適な発現を与えるように選択され、これらは次いで体
液性、細胞媒介性および粘膜性免疫応答を十分に生じる。
【００９５】 組換えウイルス感染細胞においてインビボでの発現によって生成される外来タ
ンパク質は、それ自身免疫原性であり得る。１つより多くの外来遺伝子が、ウイ
ルスゲノムに挿入されて、１つより多くの有効なタンパク質の首尾良い生成が得
られ得る。
【００９６】 従って、本発明の組換えウイルスを用いて、ウシ、ヒトおよび他の哺乳動物を
冒す広範な種々の疾患に対する保護を提供することが可能である。本発明の組換
え抗原性決定因子または生きている組換えウイルスのいずれかは、抗原性決定の
ワクチンまたは生きているワクチンベクターについて記載されたのと実質的に同
じ様式で処方および使用され得る。
【００９７】 本発明はまた、薬学的に受容可能なビヒクルおよび／またはアジュバントと組
み合わせて、本発明の方法に従って調製された、治療的有効量の組換えアデノウ
イルスベクター、組換えアデノウイルスまたは組換えタンパク質を含む薬学的組
成物を含む。このような薬学的組成物は、当該分野で周知の技術に従って調製さ
れ得、そして投薬量が決定され得る。本発明の薬学的組成物は、全身的（例えば
、静脈内、気管内、血管内、肺内、腹腔内、鼻腔内、非経口、腸内、筋肉内、皮
下、腫瘍内もしくは頭蓋内）を含むがこれらに限定されない任意の公知の投与経
路によってか、またはエアロゾル適用もしくは肺内滴下によって、投与され得る
。投与は、単回用量でか、または特定の時間間隔後に一回以上の反復用量で行な
われ得る。適切な投与経路および投薬は、状況（例えば、処置される個体、処置
される障害または目的の遺伝子もしくはポリペプチド）に従って変化するが、当
業者によって決定され得る。
【００９８】 本発明はまた、処置方法を包含し、この方法に従って、本発明の治療有効量の
ＢＡＶベクター、組換えＢＡＶ、または宿主細胞が、処置を必要とする哺乳動物
被験体に投与される。
【００９９】 本発明において使用される抗原は、ネイティブまたは組換えのいずれかの抗原
性ペプチドまたはフラグメントであり得る。これらは、部分配列、全長配列、ま
たは融合体（例えば、組換え宿主についての適切なリーダー配列を有するか、ま
たは別の病原性生物についてさらなる抗原配列を有する）でさえあり得る。本発
明のウイルス系によって発現される好ましい抗原性ポリペプチドは、抗原をコー
ドする全長（または全長に近い）配列を含む。あるいは、抗原性である（すなわ
ち、１つ以上のエピトープをコードする）より短い配列が使用され得る。より短
い配列は、インビトロアッセイにおいて、ウイルス感染力を中和する抗体を惹起
し得るエピトープとして定義される「中和エピトープ」をコードし得る。好まし
くは、このペプチドは、宿主において「保護的な免疫応答」（すなわち、感染か
ら免疫された宿主を保護する抗体および／または細胞媒介免疫応答）を惹起し得
る「保護エピトープ」をコードするはずである。
【０１００】 本発明において使用される抗原は、特に、短いオリゴペプチドから構成される
場合、ワクチンキャリアに結合体化され得る。ワクチンキャリア：例えば、ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびキーホールリ
ンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は、当該分野で周知である。好ましいキャリア
タンパク質、ロタウイルスＶＰ６は、ＥＰＯ公開番号０２５９１４９において開
示され、この開示は、本明細書中に参考として援用される。
【０１０１】 挿入され得る所望の抗原についての遺伝子またはそのコード配列としては、哺
乳動物において疾患を引き起こす生物体（特に、ウシロタウイルス、ウシコロナ
ウイルス、１型ウシヘルペスウイルス、ウシＲＳウイルス、３型ウシパラインフ
ルエンザウイルス（ＢＰＩ−３）、ウシ下痢ウイルス、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ
ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓなどのよう
なウシ病原性生物）の遺伝子が挙げられる。ヒト病原性生物の抗原をコードする
遺伝子はまた、本発明の実施において有用である。外来遺伝子またはフラグメン
トを保有する本発明のワクチンはまた、適切な経口キャリア（例えば、腸溶性投
薬形態）で経口投与され得る。経口処方物は、以下のような通常利用される賦形
剤を含む：例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステア
リン酸マグネシウム、サッカリンセルロースナトリウム、炭酸マグネシウムなど
。経口ワクチン組成物は、約１０％〜約９５％の活性成分、好ましくは、約２５
％〜約７０％の活性成分を含む、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放
性の処方物、または散剤の形態をとり得る。経口および／または経鼻のワクチン
接種は、全身性免疫とともに粘膜免疫（これは、気道および胃腸管に感染する病
原性生物に対する予防において重要な役割を果たす）を惹起することが好ましく
あり得る。
【０１０２】 さらに、ワクチンは、坐剤中に処方され得る。坐剤について、ワクチン組成物
は、慣用的な結合剤およびキャリア（例えば、ポリアルカリのグリコールまたは
またはトリグリセリド）を含む。このような坐剤は、約０．５％〜約１０％（ｗ
／ｗ）、好ましくは、約１％〜約２％の範囲内で活性成分を含有する混合物から
形成され得る。
【０１０３】 本発明のワクチン組成物を動物に投与するためのプロトコルは、本開示の観点
から当業者の範囲内である。当業者は、抗原性フラグメントに対する抗体および
／またはＴ細胞媒介免疫応答を惹起するのに有効な用量でのワクチン組成物の濃
度を選択する。広範な制限内において、投薬量が重要であるとは考えられない。
代表的には、ワクチン組成物は、好都合な容量（例えば、約１〜１０ｃｃ）のビ
ヒクル中約１〜約１，０００μｇの間のサブユニット抗原を送達する様式で投与
される。好ましくは、単回免疫における投薬量は、約１〜約５００μｇのサブユ
ニット抗原、より好ましくは、約５〜１０から約１００〜２００μｇ（例えば、
５〜２００μｇ）のサブユニット抗原を送達する。
【０１０４】 投与のタイミングもまた、重要であり得る。例えば、最初の接種に続いて、好
ましくは、必要な場合、次のブースター接種を行ってもよい。必要に応じてでは
あるが、最初の免疫から数週間から数ヶ月後に、動物に対して２回目のブースタ
ー免疫を投与することもまた好ましくあり得る。疾患に対する高レベルの予防が
維持されることを保証するために、定期的な間隔で（例えば、数年毎に１回）、
それらの動物にブースター免疫を再投与することが役立ち得る。あるいは、開始
投薬が、経口投与に引き続いて、後に予防接種され得るか、またはその逆の場合
も同様である。好ましいワクチン接種プロトコルは、慣例のワクチン接種プロト
コル実験を通して確立され得る。
【０１０５】 インビボ組換えウイルスワクチンの投与経路全てについての投薬量は、以下に
挙げられる種々の因子（患者の大きさ、予防が必要とされる感染の性質、キャリ
アなど）に依存し、そして当業者によって容易に決定され得る。非限定例として
、１０３ｐｆｕと１０１５ｐｆｕとの間、好ましくは１０５ｐｆｕと１０１３ｐ
ｆｕとの間、より好ましくは、１０６ｐｆｕと１０１１ｐｆｕとの間などの投薬
量が用いられ得る。インビトロサブユニットワクチンを用いる場合、さらなる投
薬量が、関連した臨床的因子によって決定されるように提供され得る。
【０１０６】 本発明のいくつかの実施形態において、組換え細胞株は、ＢＡＶ Ｅ１領域お
よび／または他の必須の遺伝子領域を含む発現カセットを構築し、そして、変更
された親和性を有するよう改変され、かつＥ１機能を欠損する複製欠損ウシアデ
ノウイルスとともに使用するために、Ｅ１タンパク質を発現する補完細胞株また
は培養物を提供するよう、この発現カセットを用いて宿主細胞を形質転換するこ
とによって産生される。これらの組換え補完細胞株は、Ｅ１配列を欠失した欠損
組換えＢＡＶが所望の外来遺伝子またはそのフラグメント（これは、必要に応じ
て組換えＢＡＶ内にコードされる）を複製および発現させることを可能にする。
これらの細胞株はまた、外来遺伝子またはフラグメントについてコードする異種
のヌクレオチド配列によって置換されたＥ３遺伝子欠失を有する、組換えＢＡＶ
を、ＤＮＡ媒介同時トランスフェクション後のインビボでの組換えによって産生
するのに非常に有用である。より一般的には、ＢＡＶゲノムによってコードされ
る１つ以上の必須機能を欠損する、欠損ＢＡＶベクターは、適切な補完細胞にお
いて伝播され得、ここで、特定の補完細胞株は、特定の欠損組換えＢＡＶベクタ
ーにおいて欠損している機能を提供する。補完細胞株は、例えば、ヘルペスウイ
ルスとの同時感染によってか、または特定のウイルスの機能をコードするウイル
スゲノムのフラグメントを組み込むかさもなくば安定な形態に維持することによ
って、ウイルスの機能を提供し得る。
【０１０７】 本発明の１つの実施形態において、組換え発現カセットは、適切な制限酵素を
用いてＢＡＶゲノムを切断して、Ｅ１遺伝子領域配列またはＥ３遺伝子領域配列
をそれぞれ含むゲノムの左末端または右末端を示すＤＮＡフラグメントを生成し
、そして左末端フラグメントまたは右末端フラグメントをクローニングビヒクル
（例えば、プラスミド）中に挿入し、その後、少なくとも１つの異種ＤＮＡ配列
を外因性プロモーターの制御を伴うかまたは伴わずに、Ｅ１またはＥ３欠失中に
挿入することによって獲得し得る。組換え発現カセットは、適切な細胞内でＢＡ
Ｖゲノムと接触し、そして相同組換えまたは他の慣用的な遺伝子操作方法によっ
て、組換えＢＡＶゲノムは得られる。適切な細胞としては、原核生物細胞（例え
ば、Ｅ．ｃｏｌｉなど）および真核生物細胞の両方が挙げられる。適切な真核生
物細胞の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＭＤＢＫ細胞
、アデノウイルスのＥ１機能を発現するＭＤＢＫ細胞、初代ウシ胎仔網膜細胞お
よび既に列挙した細胞の機能と等価な機能を発現する細胞。Ｅ１領域またはＥ３
領域を含む制限酵素断片以外のＢＡＶゲノムの制限酵素断片はまた、本発明の実
施に有用であり、そしてクローニングビヒクル中に挿入され得、その結果、異種
配列は、Ｅ１を有さないＢＡＶ配列およびＥ３を有さないＢＡＶ配列中に挿入さ
れてもよい。次いで、これらのＤＮＡ構築物は、上記のような適切な宿主細胞の
形質転換またはトランスフェクションの前かまたは後のいずれかにＢＡＶゲノム
を用いてインビトロまたはインビボで組換えが行われ得る。本発明の目的につい
て、ＢＡＶゲノムは、全長ゲノム、または得られた組換えＢＡＶゲノムが複製お
よびパッケージングに必要とされるＢＡＶ配列を含む限り、組換えるフラグメン
ト内を欠失した領域以外の領域中に欠失を含むゲノムのいずれかであり得る。上
記の細胞のような原核生物細胞および真核生物細胞におけるトランスフェクショ
ン、細胞培養ならびに組換えのための方法は、当業者に周知である。
【０１０８】 本発明の別の実施形態において、任意の特定のウイルスベクターにおける変異
または欠失され得る任意のウイルス領域の機能は、そのベクターが欠如する機能
を発現するウイルスとの細胞の同時感染によって（補完細胞株を提供するため）
供給され得る。
【０１０９】 挿入が、ウイルスの複製に必須の遺伝子中になされる場合、アデノウイルスは
、適切な補完細胞株（すなわちヘルパー細胞株）中で増殖されなければならない
。ヒトアデノウイルスにおいて、Ｅ４領域（ＯＲＦ３およびＯＲＦ６／７）中の
特定のオープンリーディングフレームは、ウイルスの複製に必須である。ＢＡＶ
−３のＥ４領域中の類似のオープンリーディングフレームにおける欠失は、ウイ
ルスベクターの増殖のためにヘルパー細胞株の使用を必要とし得る。
【０１１０】 本発明のアデノウイルスのＢＡＶ Ｅ１遺伝子産物は、ほとんどの細胞の遺伝
子をトランス活性化し、それ故、恒常的にＥ１タンパク質を発現する細胞株は、
細胞のポリペプチドを正常細胞株よりも高レベルで発現し得る。本発明の組換え
哺乳動物（特にウシ）細胞株を用いて、以下のようなタンパク質を含むポリペプ
チドを調製し、そして単離し得る：（ａ）アデノウイルスＥ１Ａタンパク質と会
合するタンパク質（例えば、ｐ３００、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質、サイ
クリン、キナーゼなど）；（ｂ）アデノウイルスＥ１Ｂタンパク質と会合するタ
ンパク質（例えば、ｐ５３など）；（ｃ）増殖因子（例えば、上皮細胞増殖因子
（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）など）；（ｄ）レセプタ
ー（例えば、上皮細胞増殖因子レセプター（ＥＧＦ−Ｒ）、線維芽細胞増殖因子
レセプター（ＦＧＦ−Ｒ）、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒ）、インスリ
ン様増殖因子レセプター（ＩＧＦ−Ｒ）、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩレ
セプターなど）；（ｅ）プロトオンコジーンによってコードされるタンパク質（
例えば、タンパク質キナーゼ（チロシン特異的タンパク質キナーゼおよびセリン
またはスレオニンに特異的なタンパク質キナーゼ）、ｐ２１タンパク質（ＧＴＰ
ａｓｅ活性を有するグアニンヌクレオチド結合タンパク質）など）；（ｆ）他の
細胞性タンパク質（例えば、アクチン、コラーゲン、フィブロネクチン、インテ
グリン、リンタンパク質、プロテオグリカン、ヒストンなど）、ならびに（ｇ）
転写の調節に関連するタンパク質（例えば、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（
ＴＢＰ）、ＴＢＰ随伴因子（ＴＡＦｓ）、Ｓｐ１結合タンパク質など）。
【０１１１】 本発明はまた、遺伝子欠失を制御するため、治療用遺伝子もしくは治療用ヌク
レオチドを提供するため、および／または遺伝子変異を誘導もしくは補正するた
めに、哺乳動物（例えば、ウシまたはヒトまたはそれを必要とする他の哺乳動物
）に遺伝子送達を提供する方法を含む。本方法は、例えば、以下を含むがこれら
に限定されない状態の処置において用いられ得る：遺伝性疾患、心臓血管疾患、
およびウイルス感染。本方法は、キャプシドタンパク質、またはそのフラグメン
ト中の改変を含む生きた組換えウシアデノウイルスをこの哺乳動物に投与するこ
とを含み、ここで、このキャプシドタンパク質は親和性と関連し、そしてこの改
変体は変更された親和性と関連し、そしてここで、このアデノウイルスベクター
はさらに、この組換えウイルスベクターのゲノムがこの哺乳動物のゲノムに組み
込まれるか、または独立的かつ染色体外に保持されて、標的器官もしくは組織中
で必要とされる遺伝子の発現を提供する条件下で、欠損のない形態のこの遺伝子
をコードする外来ポリヌクレオチド配列を含む。これらの種類の技術は上述に提
供された例に限定されない種々の疾患状態の処置のために、当業者によって一般
に用いられている。慣用的な遺伝子治療における使用のために組込まれ得る、外
来遺伝子、ヌクレオチド配列またはそれらの部分の例としては、嚢胞性線維症膜
貫通調節遺伝子、ヒトミニジストロフィン（ｍｉｎｉｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）遺
伝子、α−１−抗トリプシン遺伝子、心臓血管疾患に関連する遺伝子などが挙げ
られる。
【０１１２】 特に、ヒトにおける遺伝子送達に関する本発明の実施は、以下が挙げられるが
これらに限定されない疾患の予防または処置のために意図される：遺伝病（例え
ば、血友病、サラセミア、気腫、ゴシェ病、嚢胞性線維症、デュシェーヌ筋ジス
トロフィー、デュシェーヌミオパシーまたはベッカーミオパシーなど）、癌、ウ
イルス疾患（例えば、ＡＩＤＳ、ヘルペスウイルス感染、サイトメガロウイルス
感染および乳頭腫ウイルス属感染）、心臓血管疾患など。本発明の目的について
、本発明の方法によって調製されたベクター、細胞およびウイルス粒子は、エキ
ソビボ（すなわち、患者から回収された細胞における）または処置される身体へ
直接的にインビボでのいずれかで被験体に導入され得る。
【０１１３】 以下の実施例は例証するために提供されるのであって、本発明を限定するもの
ではない。 （実施例） （実施例１：ヒトファイバー遺伝子を含むＢＡＶ６００の構築） 変更された親和性を有するＢＡＶ−３ベクターを生成するために、ＢＡＶ−３
のテイルおよびシャフトに融合したＨＡＶ−５ファイバーノブを含むキメラファ
イバー遺伝子構築物を、Ｒｅｄｄｙら、１９９９（前出）に記載のＢＡＶ３０４
のＢＡＶ−３ゲノム中に組込んだ（図３）。野生型ＢＡＶ−３ファイバー遺伝子
の正確な置換について、先に作製したプラスミドｐＢＡＶ３０１．ｇｆｐ（Ｒｅ
ｄｄｙら、１９９９）をＢＡＶ−３ファイバーの改変のために用いた。得られた
移入ベクターｐＢＡＶ−３０１．Ｇ５ＦＫは、Ｅ３領域、キメラＢＡＶ−３／Ｈ
ＡＶ−５ファイバー遺伝子、およびＥ４中に挿入したＣＭＶプロモーター駆動性
の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現カセットを含んだ。この移入ベクターを用
いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＪ５１８３（Ｃｈａｒｔｉｅｒら、１９９６）における
相同組換えによって、Ｅ３欠失ＢＡＶ−３の感染性プラスミド（ｐ．ＦＢＡＶ３
０２（Ｚａｋｈａｒｔｃｈｏｕｋら、１９９８））の骨格中へのＧＦＰカセット
および改変したファイバー遺伝子を組込み、プラスミドｐＦＢＡＶ−６００を作
製した。ウイルスゲノムを、ＰａｃＩ消化によってこのプラスミドから遊離し、
そしてこのウイルスゲノムを用いて、細胞株（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ１５６）
（Ｅ１タンパク質を発現するウシ胎仔網膜細胞）にトランスフェクトした（Ｒｅ
ｄｄｙら、１９９９、前出を参照のこと）。この対応キメラウイルスＢＡＶ６０
０を、トランスフェクション後２１日間産生した。
【０１１４】 （実施例２：ＢＡＶ６００の特徴付け） Ｅ１タンパク質を発現するウシ胎仔網膜細胞（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ１５６
）のトランスフェクションから得たＢＡＶ６００を、ＭＤＢＫ細胞中で増大させ
、そしてこのウイルスＤＮＡを感染した細胞から抽出した。このＤＮＡを、制限
酵素ＢｇｌＩＩを用いた消化の後、アガロースゲル電気泳動で分析した（図５Ａ
）。図５Ａ〜図５Ｂに示すように、親のＢＡＶ３０２およびＢＡＶ３０４は両方
とも、ウイルスゲノムの右末端に５．４ｋｂのＢｇｌＩＩフラグメントを有した
。ＨＡＶ−５ファイバーノブ領域は、ＢＡＶ６００ゲノム内にさらなるＢｇｌＩ
Ｉ制限酵素部位を導入する。従って、１．５ｋｂおよび３．９ｋｂの診断用のフ
ラグメントを、ＢｇｌＩＩ消化の後、見出した。ＨＡＶ−５ファイバーノブプロ
ーブを用いたサザンブロット解析は、ＢｇｌＩＩ消化されたＢＡＶ６００につい
て予測したハイブリダイゼーションパターンを実証した（図５Ｂ）。
【０１１５】 組換えＢＡＶ６００によるキメラＢＡＶ−３およびＨＡＶ−５ファイバータン
パク質の発現およびアセンブリを、免疫沈降アッセイによって試験した。親（Ｂ
ＡＶ３０４；Ｒｅｄｄｙら、１９９９、前出）およびキメラ（ＢＡＶ６００）の
ウイルス感染されたＭＤＢＫ細胞の溶解物由来の代謝的に放射性標識された免疫
沈降物を、変性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。全長のファイバーを含む野
生型ＨＡＶ−５をまた解析した。免疫沈降アッセイを、ＢＡＶ３ファイバーノブ
に特異的なウサギポリクローナル抗体および抗ファイバーモノクローナル抗体（
ＩＤ６．１４）を用いて実施した。ＩＤ６．１４抗体は、三量体化したＨＡＶ−
５ファイバーノブを認識し、ノブドメインに結合することによってＨＡＶ−５を
中和する（Ｄｏｕｇｌａｓら、１９９６）。図６に示すように、ＢＡＶ−３およ
びＢＡＶ３０４ウイルスは、およそ１００ｋＤａの大きさを有するファイバータ
ンパク質を含む。これらのファイバータンパク質は、ＢＡＶ３ファイバーノブに
特異的なウサギポリクローナル抗体と反応する。一方、ＨＡＶ−５は、およそ６
４ｋＤａの大きさを有するファイバータンパク質を含む。ＢＡＶ６００キメラウ
イルス内のＨＡＶ−５ファイバーノブの存在は、ＨＡＶ−５ノブに特異的なモノ
クローナル抗体ＩＤ６．１４を用いた免疫沈降解析によって確認した。
【０１１６】 ファイバーキメラウイルスＢＡＶ６００の生物学的力価を、ＢＡＶ−３と親ウ
イルスＢＡＶ３０４とで比較した。ＭＤＢＫ細胞の単層を用いて決定した生物学
的力価は、ＢＡＶ−３、ＢＡＶ３０４、およびＢＡＶ６００について、それぞれ
１０８ＰＦＵ／ｍｌ、１０６ＰＦＵ／ｍｌ、および１０５ＰＦＵ／ｍｌの最大プ
ラーク形成力価を示した。その結果は、ファイバー改変およびＥ３領域へのＧＦ
Ｐの挿入がウイルスの細胞産生を有意に変更することを示唆した。
【０１１７】 （実施例３：ＢＡＶ６００によるヒト細胞株の形質導入） 異なるヒト細胞株におけるＢＡＶ３０４およびＢＡＶ６００の形質導入効率を
特徴付けるため、ＦＡＣＳ解析を実施して、異なるウイルスの投入（ｉｎｐｕｔ
）での各細胞株の形質導入の割合を決定した（図７Ａ）。Ｔ２５フラスコ中で増
殖させた細胞を、ＢＡＶ３０４またはＢＡＶ６００のいずれかを用いて１ＭＯＩ
および５ＭＯＩにて感染させた。感染から４８時間後、ＧＦＰ蛍光陽性細胞の割
合を、フローサイトメトリによって決定した。各細胞株の形質導入の割合を定量
し、そしてその画分の用量を図７Ｂに示す。２９３細胞は、両方のウイルスを用
いた形質導入に同程度の感受性があった（これは、ＨＡＶ−５レセプターおよび
ＢＡＶ−３レセプターが両方とも細胞表面上に存在することを示す）。ＢＡＶ３
０４を用いたＨｅＬａ細胞およびＨＥｐ−２細胞の形質導入は、用量依存的であ
り、１ＭＯＩにてそれぞれ約６％および１％、５ＭＯＩにてそれぞれ約２５％お
よび５％であった。両方の細胞を、ＢＡＶ６００を用いて効果的に形質導入した
。ＢＡＶ６００を用いた形質導入の割合は、１ＭＯＩにてさえ最大のレベルに達
する（ＨｅＬａおよびＨｅｐ−２についてそれぞれ９４％および９３％）。一方
、ＢＡＶ６００を用いたＡ５４９細胞のより低効率の形質導入を観察した。一緒
に取得したこれらのデータは、ＨＡＶ５ファイバーノブを含むＢＡＶ６００がヒ
ト細胞株の形質導入においてＢＡＶ３０４ベクターよりも明らかに優れていたこ
とを実証する。
【０１１８】 （実施例４：ヒト血清におけるＨＡＶ−５中和抗体およびＢＡＶ−３中和抗体
） 臨床的患者におけるＨＡＶ−５に対する既存の中和化抗体は、ヒト遺伝子治療
プロトコルにおいてＨＡＶ−５の効果的な使用に対して主な障壁を示す。ＨＡＶ
−５誘導ベクターに対する代替ベクターとしてＢＡＶ−３の使用についての可能
性を検討するために、既存の抗ＨＡＶ−５中和化抗体がまた、ＢＡＶ−３とも交
差反応性であったかを決定した。臨床患者由来のヒト血清のランダムな１０５個
のサンプルを試験した。３つ（５０番、９７番、および１０２番）が、１：８０
０〜１，６０００の間で変化するより高い力価のＨＡＶ−５中和抗体を含むこと
を見出した。これらの血清を、ＭＤＢＫ細胞におけるＢＡＶ−３誘導プラーク形
成を阻害するこれらの能力について試験した。本発明者らのデータは、これらの
ＨＡＶ−５陽性血清のいずれもが１／５０の希釈でＢＡＶ−３誘導プラーク形成
に対して影響を示さなかったことを実証した。
【０１１９】 （実施例５：ヒト細胞株におけるＢＡＶ−３の複製） ウイルス産生およびウイルス感染の時間経過を異なるヒト細胞株において研究
して、ＢＡＶ−３の増殖についての許容度の程度を決定した。各細胞株（ＨｅＬ
ａ、ＨＥｐ−２、２９３およびＡ５４９）のコンフルエントな単層培養物を、１
０ＭＯＩにてＢＡＶ−３を用いて感染させ、そして感染後の異なる時間間隔での
ウイルス産生を、ＭＤＢＫ細胞の単層における細胞溶解物の滴定によってアッセ
イした。許容ＭＤＢＫ細胞におけるウイルスの増殖は、感染から４８時間後には
、予測通り、１０８ｐｆｕ／ｍｌの最大収量という結果となった。一方、４つの
ヒト細胞株全てにおけるＢＡＶ−３産生のレベルは着実に減少し、このことは、
これらのヒト細胞株においてウイルス複製の完全な欠如が存在することを示唆し
ていた。
【０１２０】 （実施例６：ヒト細胞株における初期ＢＡＶ−３タンパク質および後期ＢＡＶ
３タンパク質の発現） ウイルスタンパク質としては、初期タンパク質（低分子量のＥ１Ｂ（Ｅ１Ｂ
ｓｍａｌｌ）および一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質［ＤＢＰ］）ならびに後期タン
パク質（ペントン塩基およびファイバー）が挙げられる。ヒト細胞株における初
期ウイルスタンパク質および後期ウイルスタンパク質の発現を同定するため、ウ
イルスタンパク質の産生をウェスタンイムノブロット法によって解析した。培養
物を、１０ＭＯＩにてＢＡＶ−３を用いて感染させた。感染後の間隔にて、細胞
抽出物を各培養物から調製し、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、そしてニ
トロセルロースに転写した。ニトロセルロースシート上に固定化した抗原を、低
分子量のＥ１Ｂ、ＤＢＰ、ペントン塩基、およびファイバーのそれぞれに対する
ウサギポリクローナル抗体の反応によってプローブ化した。予測通り、低分子量
のＥ１ＢおよびＤＢＰ抗血清は、ＢＡＶ−３感染ＭＤＢＫ細胞由来の１９ｋＤａ
および５０ｋＤａのバンドとそれぞれ反応した。対照的に、２９３細胞株を除く
全てのヒト細胞株は、抗低分子量Ｅ１Ｂポリクローナル抗体または抗ＤＢＰポリ
クローナル抗体と陽性の反応を示さなかった。どの構造タンパク質も、ＢＡＶ−
３感染ヒト細胞株から検出されなかった。これらの結果は、本研究において試験
したヒト細胞の大部分においてＢＡＶ−３の複製が低分子量のＥ１Ｂレベルでブ
ロックされたことを示した。
【０１２１】 （実施例７：ＨＡＶ−５ファイバーノブに特異的なモノクローナル抗体による
ＢＡＶ６００の中和化） ＨＡＶ−５ファイバーノブを保有するＢＡＶ６００がＨＡＶ−５ノブに特異的
な抗体によって中和されるはずだと仮定した。この仮説を確証するために、１０
０ｐｆｕのＢＡＶ−３またはＢＡＶ６００を含む二連のアリコートを、ＢＡＶ３
ファイバーノブに特異的なウサギポリクローナル抗体またはＨＡＶ−５ファイバ
ーノブドメインに対するモノクローナル抗体（ＩＤ６．１４）を連続的二倍希釈
をして室温にて２時間インキュベートした。次いで、ＭＤＢＫ細胞を予めインキ
ュベートしたＢＡＶ−３ウイルスまたはＢＡＶ６００ウイルスを用いて感染させ
た。細胞を１４日間インキュベートして、完全にＣＰＥを発達させた。これらの
データは、いずれのウイルスも正常なウサギ血清由来の血清またはウシヘルペス
ウイルスｇＤタンパク質に特異的なコントロールモノクローナル抗体２Ｃ８によ
って中和されなかったことを示す。ＢＡＶ−３およびＢＡＶ６００をそれぞれ、
ＢＡＶ３ファイバーノブ（１：８００）およびＩＤ６．１４（１：３，２００）
それぞれに特異的なウサギポリクローナル抗体によって中和した。しかし、いず
れのウイルスも、１：５０の希釈でさえ相互の抗血清によって中和されなかった
。このことは、ＢＡＶ６００がＨＡＶ−５ファイバーノブを保有することをさら
に確証した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜１Ｓは、ＢＡＶ３ゲノムの完全ヌクレオチド配列を示す。ＢＡＶ３に
ついてのポリヌクレオチド配列において、ペントン領域は、１２９１９で開始し
、そして１４３６７で終了する：ヘキソン領域は、１７８０９で開始し、そして
２０５１７で終了する；ファイバー領域は、２７９６８で開始し、そして３０８
９８で終了する。ファイバー領域のノブドメインは、図４に示されるように、４
残基（ＴＬＷＴ）後に開始する。
【図２】 図２は、ｍＲＮＡの転写マッピングおよびｃＤＮＡクローンの配列決定による
、ＢＡＶ３ゲノムの転写マップを示す。
【図３】 図３は、ＨＡＶ−５ファイバーノブタンパク質を発現するＢＡＶ６００の構築
物を示す。
【図４】 図４は、ＢＡＶ６００の特徴付けを示す。
【図５】 図５Ａ〜５Ｂは、制限酵素Ｂｇｌ ＩＩ消化によるＢＡＶ６００の分析を示す
。図５Ａは、ゲル電気泳動を示し、そして図５Ｂは、サザンブロットを示す。
【図６】 図６は、ＢＡＶ６００によるＨＡＶ−５ファイバーノブの発現を示す。
【図７】 図７Ａ〜７Ｂは、ＢＡＶ６００によるヒト細胞株の形質導入を示す。図７Ａは
、１のＭＯＩでの結果を示し、一方、図７Ｂは、５のＭＯＩでの結果を示す。
【図８】 図８は、ヒト細胞のＢＡＶ３０４形質導入およびＢＡＶ６００形質導入のＦＡ
ＣＳ分析を示す。
【図９】 図９は、ヒト細胞株（ＨｅＬａ細胞、ＨＥｐ−２細胞、Ａ５４９細胞、２９３
細胞およびＭＤＢＫ細胞）における初期ＢＡＶ−３タンパク質および後期ＢＡＶ
−３タンパク質の発現を示す。
【図１０】 図１０は、ヒト細胞におけるＢＡＶ３複製を示す。
【図１１】 図１１は、ＨＡＶ−５ファイバーノブ領域に対して特異的なモノクローナル抗
体によるＢＡＶ６００の中和を示す。
【図１２】 図１２は、ヒトアデノウイルス５（ＨＡＶ−４）ファイバータンパク質につい
てのアミノ酸配列を示す。
【図１３】 図１３は、ウシアデノウイルス−３（ＢＡＶ−３）ファイバータンパク質につ
いてのアミノ酸配列を示す。
【図１４】 図１４は、ヒツジアデノウイルス２８７ファイバータンパク質のアミノ酸配列
を示す。
【図１５】 図１５は、ブタアデノウイルス−３（ＰＡＶ−３）ファイバータンパク質のア
ミノ酸配列を示す。
【図１６】 図１６は、イヌアデノウイルス−２（ＣＡＶ−２）ファイバータンパク質のア
ミノ酸配列を示す。
【図１７】 図１７Ａ〜１７Ｇは、多重整列プログラムのｃｌｕｓｔａｌ方法を用いた、種
々の哺乳動物アデノウイルスファイバー領域のアミノ酸整列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/02 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 7/00 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 7/00 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA02 BA03 BA07 BA21 BA38 BA41 BA61 BA63 BA80 CA01 CA06 CA07 DA02 DA03 EA02 EA04 FA02 FA10 GA11 GA18 HA01 4B065 AA90X AA90Y AA93X AA93Y AA95Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA26 CA27 CA44 CA45 CA46 4C084 AA13 MA02 NA14 ZB07 ZB31 4C085 BB06 BB11 BB17 BB23 DD61 EE01 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 MA02 NA13 NA14 ZB07 ZB31

Claims (63)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードする
    ポリヌクレオチド中に改変を含むウシアデノウイルスベクターであって、ここで
    該キャプシドタンパク質またはそのフラグメントは、親和性と関連し、ここで該
    改変は、変化した親和性と関連する、ウシアデノウイルスベクター。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
    前記キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチ
    ドが、異種哺乳動物キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードする
    ポリヌクレオチドと置換されている、アデノウイルスベクター。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
    前記キャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、ペントンタンパク質また
    はそのフラグメントである、アデノウイルスベクター。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
    前記キャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、ヘキソンタンパク質また
    はそのフラグメントである、アデノウイルスベクター。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
    前記キャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、ファイバータンパク質ま
    たはそのフラグメントである、アデノウイルスベクター。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
    前記改変がファイバータンパク質のノブ領域にある、アデノウイルスベクター。
  7. 【請求項７】 請求項３に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
    前記ウシアデノウイルスペントン領域またはそのフラグメントが、少なくとも１
    つの異種哺乳動物ペントンアデノウイルス領域またはそのフラグメントで置換さ
    れている、アデノウイルスベクター。
  8. 【請求項８】 請求項４に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
    前記ウシアデノウイルスヘキソン領域またはそのフラグメントが、少なくとも１
    つの異種哺乳動物アデノウイルスヘキソン領域またはそのフラグメントで置換さ
    れている、アデノウイルスベクター。
  9. 【請求項９】 請求項５に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
    前記ウシアデノウイルスファイバー領域またはそのフラグメントが、少なくとも
    １つの異種哺乳動物アデノウイルスファイバー領域またはそのフラグメントで置
    換されている、アデノウイルスベクター。
  10. 【請求項１０】 請求項２に記載のアデノウイルスベクターであって、前記
    異種哺乳動物アデノウイルスキャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、
    ブタアデノウイルスキャプシドタンパク質、ヒツジアデノウイルスキャプシドタ
    ンパク質、イヌアデノウイルスキャプシドタンパク質またはヒトアデノウイルス
    キャプシドタンパク質あるいはそれらのフラグメントを含む、アデノウイルスベ
    クター。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載のアデノウイルスベクターであって、前
    記異種哺乳動物アデノウイルスキャプシドタンパク質またはそのフラグメントが
    、ヒトアデノウイルスキャプシドタンパク質またはそのフラグメントである、ア
    デノウイルスベクター。
  12. 【請求項１２】 請求項１に記載のアデノウイルスベクターであって、ここ
    でアデノウイルスが、アデノウイルスサブタイプ１型である、アデノウイルスベ
    クター。
  13. 【請求項１３】 請求項１に記載のアデノウイルスベクターであって、ここ
    でアデノウイルスが、アデノウイルスサブタイプ２型である、アデノウイルスベ
    クター。
  14. 【請求項１４】 前記アデノウイルスベクターがＢＡＶ３である、請求項１
    ２に記載のアデノウイルスベクター。
  15. 【請求項１５】 請求項１４に記載のアデノウイルスベクターであって、こ
    こで前記改変が、異種哺乳動物アデノウイルスベクターファイバータンパク質ま
    たはそのフラグメントによるＢＡＶ３ファイバータンパク質またはそのフラグメ
    ントの置換である、アデノウイルスベクター。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載のアデノウイルスベクターであって、前
    記哺乳動物アデノウイルスファイバータンパク質またはそのフラグメントが、ブ
    タアデノウイルスファイバータンパク質、ヒツジアデノウイルスファイバータン
    パク質、イヌアデノウイルスファイバータンパク質またはヒトアデノウイルスフ
    ァイバータンパク質を含む、アデノウイルスベクター。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に記載のアデノウイルスベクターであって、こ
    こで前記哺乳動物アデノウイルスファイバータンパク質が、ヒトアデノウイルス
    ファイバータンパク質である、アデノウイルスベクター。
  18. 【請求項１８】 請求項１に記載のアデノウイルスベクターであって、ここ
    で該ベクターが、Ｅ１機能を欠く、アデノウイルスベクター。
  19. 【請求項１９】 請求項１８に記載のアデノウイルスベクターであって、こ
    こで該ベクターが、前記Ｅ１遺伝子領域の一部または全ての欠損を有する、アデ
    ノウイルスベクター。
  20. 【請求項２０】 請求項１に記載のアデノウイルスベクターであって、ここ
    で該ベクターが、Ｅ３遺伝子領域の一部または全ての欠損を有する、アデノウイ
    ルスベクター。
  21. 【請求項２１】 請求項１に記載のアデノウイルスベクターであって、ここ
    で該ベクターがさらに、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、
    アデノウイルスベクター。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載のアデノウイルスベクターであって、前
    記異種タンパク質が、以下： サイトカイン；リンホカイン；病原性生物により認識される膜レセプター、ジ
    ストロフィン；インスリン；細胞イオンチャネルに関与するタンパク質；アンチ
    センスＲＮＡ；病原性遺伝子によって産生されるタンパク質の活性を阻害し得る
    タンパク質、酵素活性を阻害するタンパク質、病原性タンパク質のタンパク質改
    変体；抗原性エピトープ；主要組織適合遺伝子複合体クラスＩタンパク質および
    主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩタンパク質；抗体；免疫毒素；毒素；成長
    因子または成長ホルモン；細胞レセプターまたは細胞レセプターのリガンド；腫
    瘍サプレッサー；細胞性酵素；または自殺遺伝子 を含む、アデノウイルスベクター。
  23. 【請求項２３】 請求項２２に記載のアデノウイルスであって、ここで前記
    異種タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、アデノウイルスＥ１遺伝
    子領域中に挿入されている、アデノウイルス。
  24. 【請求項２４】 請求項２２に記載のアデノウイルスであって、ここで前記
    異種タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、アデノウイルスＥ３遺伝
    子領域中に挿入されている、アデノウイルス。
  25. 【請求項２５】 該ベクターが複製能を有する、請求項１に記載のアデノウ
    イルスベクター。
  26. 【請求項２６】 該ベクターが複製欠損性である、請求項１に記載のアデノ
    ウイルスベクター。
  27. 【請求項２７】 請求項１に記載のウシアデノウイルスベクターを含む、宿
    主細胞。
  28. 【請求項２８】 請求項２１に記載のウシアデノウイルスベクターを含む、
    宿主細胞。
  29. 【請求項２９】 キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードす
    るポリヌクレオチド中に改変を含む組換えウシアデノウイルスベクターを産生す
    る方法であって、該方法は、ウシアデノウイルスベクターを得る工程；およびキ
    ャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド中に
    改変を導入する工程を包含し、ここで該キャプシドタンパク質またはそのフラグ
    メントは、親和性と関連し、該改変が、変化した親和性と関連する、方法。
  30. 【請求項３０】 請求項２９に記載の方法であって、ここで前記キャプシド
    タンパク質またはそのフラグメントが、ペントンタンパク質またはそのフラグメ
    ントである、方法。
  31. 【請求項３１】 請求項２９に記載の方法であって、ここで前記キャプシド
    タンパク質またはそのフラグメントが、ヘキソンタンパク質またはそのフラグメ
    ントである、方法。
  32. 【請求項３２】 請求項２９に記載の方法であって、ここで前記キャプシド
    タンパク質またはそのフラグメントが、ファイバータンパク質またはそのフラグ
    メントである、方法。
  33. 【請求項３３】 請求項２９に記載の方法であって、ここで前記アデノウイ
    ルスベクターが、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、
    方法。
  34. 【請求項３４】 前記ウシアデノウイルスが、サブタイプ１型のウシアデノ
    ウイルスである、請求項２９に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードす
    るポリヌクレオチド中に改変を含む組換えウシアデノウイルスであって、ここで
    該キャプシドタンパク質またはそのフラグメントは、親和性に関し、そして該改
    変は、変化した親和性に関する、組換えウシアデノウイルス。
  36. 【請求項３６】 異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含
    む、請求項３５に記載の組換えアデノウイルス。
  37. 【請求項３７】 請求項３６に記載の組換えアデノウイルスであって、ここ
    で前記異種タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、アデノウイルスＥ
    １遺伝子領域中に挿入されている、組換えアデノウイルス。
  38. 【請求項３８】 請求項３６に記載の組換えアデノウイルスであって、ここ
    で前記異種タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、アデノウイルスＥ
    ３遺伝子領域中に挿入されている、組換えアデノウイルス。
  39. 【請求項３９】 請求項３５に記載の組換えアデノウイルスであって、ここ
    で前記キャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、ペントンタンパク質ま
    たはそのフラグメントである、組換えアデノウイルス。
  40. 【請求項４０】 請求項３５に記載の組換えアデノウイルスであって、ここ
    で前記キャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、ヘキソンタンパク質ま
    たはそのフラグメントである、組換えアデノウイルス。
  41. 【請求項４１】 請求項３５に記載の組換えアデノウイルスであって、ここ
    で前記キャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、ファイバータンパク質
    またはそのフラグメントである、組換えアデノウイルス。
  42. 【請求項４２】 請求項４１に記載の組換えアデノウイルスであって、ここ
    で前記改変が、ファイバータンパク質のノブ領域中にある、組換えアデノウイル
    ス。
  43. 【請求項４３】 ウシアデノウイルスを含む免疫原性組成物であって、ここ
    で該アデノウイルスは、キャプシドタンパク質またはそのフラグメント中の改変
    をコードするポリヌクレオチドを含み、そして該タンパク質またはフラグメント
    は、親和性と関連し、そして該改変は、変化した親和性と関連する、免疫原性組
    成物。
  44. 【請求項４４】 請求項４３に記載の免疫原性組成物であって、ここで前記
    キャプシドタンパク質が、ペントンタンパク質またはそのフラグメントである、
    免疫原性組成物。
  45. 【請求項４５】 請求項４３に記載の免疫原性組成物であって、ここで前記
    キャプシドタンパク質が、ヘキソンタンパク質またはそのフラグメントである、
    免疫原性組成物。
  46. 【請求項４６】 請求項４３に記載の免疫原性組成物であって、ここで前記
    キャプシドタンパク質が、ファイバータンパク質またはそのフラグメントである
    、免疫原性組成物。
  47. 【請求項４７】 請求項４６に記載の免疫原性組成物であって、ここで前記
    キャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、ファイバータンパク質のノブ
    ドメインである、免疫原性組成物。
  48. 【請求項４８】 請求項４３に記載の免疫原性組成物であって、ここで前記
    改変が、哺乳動物アデノウイルスファイバータンパク質またはそのフラグメント
    によるウシファイバータンパク質またはそのフラグメントの置換である、免疫原
    性組成物。
  49. 【請求項４９】 請求項４８に記載の免疫原性組成物であって、ここで前記
    哺乳動物ファイバータンパク質が、ヒトアデノウイルスファイバータンパク質で
    ある、免疫原性組成物。
  50. 【請求項５０】 前記ウシアデノウイルスが、サブタイプ１型アデノウイル
    スである、請求項４３に記載の免疫原性組成物。
  51. 【請求項５１】 前記ウシアデノウイルスが、ＢＡＶ３である、請求項５０
    に記載の免疫原性組成物。
  52. 【請求項５２】 請求項４３に記載の免疫原性組成物であって、ここで前記
    ウシアデノウイルスが、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、
    免疫原性組成物。
  53. 【請求項５３】 哺乳動物被験体において免疫応答を誘導し得る薬学的組成
    物であって、請求項５２に記載の免疫原性組成物を含む、薬学的組成物。
  54. 【請求項５４】 薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項５３に記
    載の薬学的組成物。
  55. 【請求項５５】 感染を防御するために哺乳動物宿主において免疫応答を惹
    起する方法であって、請求項５４に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含す
    る、方法。
  56. 【請求項５６】 請求項５５に記載の方法であって、前記タンパク質が、以
    下： サイトカイン；リンホカイン；病原性生物により認識される膜レセプター、ジ
    ストロフィン；インスリン；細胞イオンチャネルに関与するタンパク質；アンチ
    センスＲＮＡ；病原性遺伝子によって産生されるタンパク質の活性を阻害し得る
    タンパク質、酵素活性を阻害するタンパク質、病原性タンパク質のタンパク質改
    変体；抗原性エピトープ；主要組織適合遺伝子複合体クラスＩタンパク質および
    主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩタンパク質；抗体；免疫毒素；毒素；成長
    因子または成長ホルモン；細胞レセプターまたは細胞レセプターのリガンド；腫
    瘍サプレッサー；細胞性酵素；または自殺遺伝子 を含む、方法。
  57. 【請求項５７】 哺乳動物宿主における遺伝子送達の方法であって、該方法
    は、改変されたキャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリ
    ヌクレオチドを含むウシアデノウイルスベクターを、該宿主に投与する工程を包
    含し、ここで該タンパク質は、親和性と関連し、そして該改変は、変化した親和
    性と関連し、そして該アデノウイルスベクターは、異種タンパク質をコードする
    ポリヌクレオチドをさらに含む、方法。
  58. 【請求項５８】 前記異種ポリヌクレオチドが治療タンパク質をコードする
    、請求項５７に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 請求項５７に記載の方法であって、ここで前記キャプシド
    タンパク質またはそのフラグメントが、ペントンタンパク質またはそのフラグメ
    ントである、方法。
  60. 【請求項６０】 請求項５７に記載の方法であって、ここで前記キャプシド
    タンパク質またはそのフラグメントが、ヘキソンタンパク質またはそのフラグメ
    ントである、方法。
  61. 【請求項６１】 請求項５７に記載の方法であって、ここで前記キャプシド
    タンパク質またはそのフラグメントが、ファイバータンパク質またはそのフラグ
    メントである、方法。
  62. 【請求項６２】 前記改変が、ファイバータンパク質のノブ領域中にある、
    請求項６１に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 請求項５７に記載の方法であって、ここで前記哺乳動物宿
    主が、ヒトであり、そして前記改変が、ヒトファイバータンパク質またはそのフ
    ラグメントによるウシアデノウイルスファイバータンパク質またはそのフラグメ
    ントの置換である、方法。
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