JP2003534805A - 変化した親和性を有する改変ウシアデノウイルス - Google Patents
変化した親和性を有する改変ウシアデノウイルスInfo
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Abstract
Description
8号の利益を主張する。
るウシアデノウイルスに関する。本発明はまた、変化した親和性を有するウシア
デノウイルスの作製および使用の方法に関する。
または呼吸感染を引き起こす。このウシアデノウイルス(BAV)は、2つのサ
ブグループに分けられた少なくとも9つの血清型を含む。これらのサブグループ
は、固相酵素免疫アッセイ(ELISA)、免疫蛍光アッセイを用いた血清学的
研究、ウイルス中和試験、免疫電子顕微鏡法に基づいて、それらの宿主特異性お
よび臨床的症候群によって、特徴付けられている。サブグループ1ウイルスは、
BAV1、BAV2、BAV3、およびBAV9を含み、そしてそれぞれは、確
立したウシ細胞において、BAV4、BAV5、BAV6、BAV7およびBA
V8を含むサブグループ2と比較して良好に増殖する。
も良好に特徴付けられており、約35kbのゲノムを含む(Kurokawaら
(1978)J.Virol.28:212−218)。Reddyら(199
8、Journal of Virology、72:1394)は、BAV3
のヌクレオチド配列、ゲノム組織、および転写地図を開示する。Reddyら(
1999、Journal of Virology、73:9137)は、発
現ベクターとして複製欠損性BAV3を開示する。BAVのサブグループ1の代
表物であるBAV3(Bartha(1969)Acta Vet.Acad.
Sci.Hung.19:319−321)は、通常無症状感染を生じる(Da
rbyshireら(1965).J Comp.Pathol.75:327
−330)が、しかし時折、より重大な気道感染に関連する(Darbyshi
reら、1966 Res.Vet.Sci.7:81−93;Mattson
ら、1988 J.Vet Res 49:67−69)、ウシの普通の病原性
生物である。他のアデノウイルスのように、BAV3は、直鎖状二本鎖DNA分
子を含む直径75nm(Niiyamaら(1975)J.Virol.16:
621−633)の非エンベロープ性正二十面体粒子である。ハムスター中に注
入された場合、BAV3は腫瘍を生じ得(Darbyshire、1966 N
ature 211:102)、そしてウイルスDNAはマウス、ハムスターま
たはラットの培養細胞の形態学的トランスフォーメーションを効率的にもたらし
得る(TsukamotoおよびSugino、1972 J.Virol.9
:465−473;Motoiら、1972 Gann 63:415−418
)。交差ハイブリダイゼーションは、ゲノムの左末端ではないが、その近くのい
くつかの領域を含むゲノムの大部分の領域において、BAV3とヒトアデノウイ
ルス2型(HAd2)との間で観察された(Huら、1984 J.Virol
.49:604−608)。
連付けられている。Derbyshire(1992)「Diseases o
f Swine」(Lemanら編)、第7版、Iowa State Uni
versity Press、Ames、IA.225−227頁を参照のこと
。PAVが、感染した子ブタの腸内における液性応答および粘膜抗体応答の両方
が刺激し得ることが示された。Tubolyら(1993)Res.in Ve
t.Sci.54:345−350。交差中和研究は、少なくとも5つの血清型
のPAVが存在することを示した。Derbyshireら(1975)J.C
omp.Pathol.85:437−443;およびHiraharaら(1
990)Jpn.J.Vet.Sci.52:407−409を参照のこと。P
AVゲノムについての以前の研究は、PAV3型(PAV−3)についての制限
地図の決定およびPAV−3の完全なゲノムを示す制限フラグメントのクローニ
ングを含んでいた。Reddyら(1993)Intervirology 3
6:161−168を参照のこと。さらに、PAV−1およびPAV−2につい
ての制限地図が決定された。Reddyら(1995b)Arch.Virol
.140:195−200を参照のこと。
されている。PAV−3のE3遺伝子、pVIII遺伝子およびファイバー遺伝
子の配列は、Reddyら((1995)Virus Res.36:97−1
06)によって決定された。PAV−1およびPAV−2のE3遺伝子、pVI
II遺伝子およびファイバー遺伝子は、Reddyら((1996)Virus
Res.43:99−109))によって配列決定され、一方、PAV−4の
E3遺伝子、pVIII遺伝子およびファイバー遺伝子の配列は、Kleibo
eker((1994)Virus Res.31:17−25)によって決定
された。このPAV−4ファイバー遺伝子配列は、Kleiboeker((1
995)Virus Res.39:299−309)によって決定された。全
5つのPAV血清型(PAV−1〜PAV−5)に対する逆方向末端反復(IT
R)配列は、Reddyら((1995)Virology 212:237−
239)によって決定された。このPAV−3ペントン配列は、McCoyら(
(1996)Arch.Virol.141:1367−1375)によって決
定された。PAV−4のE1領域のヌクレオチド配列は、Kleiboeker
((1995)Virus Res.36:259−268)によって決定され
た。PAV−3のプロテアーゼ(23K)遺伝子の配列は、McCoyら((1
996)DNA Seq.6:251−254)によって決定された。PAV−
3ヘキソン遺伝子(および23Kプロテアーゼ遺伝子の14個のN末端コドン)
の配列は、登録番号U34592でGenBankデータベースに寄託されてい
る。PAV−3 100K遺伝子の配列は、登録番号U82628でGenBa
nkデータベースに寄託されている。PAV−3 E4領域の配列は、Redd
yら((1997)Virus Genes 15:87−90)によって決定
された。Vratiら(1995、Virology、209:400−408
)は、ヒツジアデノウイルスの配列を開示する。
関連した最も普通の血清型についての総論が公開されている。例えば、Foy
H.M.(1989)Adenoviruses In Evans AS(編
).Viral Infections of Humans.New Yor
k、Plenum Publishing、77−89頁およびRubin B
.A.(1993)Clinical picture and epidem
iology of adenovirus infections、Acta
Microbiol.Hung 40:303−323を参照のこと。ヒトア
デノウイルスのキャプシドは、正二十面体対称性を示し、そして252のキャプ
ソメアを含む。キャプソメアは、240個のヘキソンおよび各ペントン上に突き
出たファイバーを有する12個のペントンからなる。そのペントンおよびヘキソ
ンは、異なるウイルスポリペプチドからそれぞれ誘導される。型特異的抗体の原
因であるこのファイバーは、ヒト株のうちで長さが変化する。このヘキソンは、
グループ特異的な補体結合抗体であり、一方、このペントンは、赤血球凝集反応
において特に活性である(PlotkinおよびOrenstein、Vacc
ines、第3版、W.B.Saunders Company Philad
elphia、609−623頁)。このファイバー領域はホモ三量体のコンフ
ォメーションをとり、これは、アデノウイルスキャプシドの形成におけるペント
ンベースと成熟ファイバータンパク質との会合に必要である。ファイバーは、フ
ァイバー3量体のアミノ末端とペントンベース内の保存されたドメインとの間の
非共有結合的な相互作用によってペントンベースと会合する。アデノウイルスフ
ァイバータンパク質のカルボキシ末端の球状ノブドメインが、そのアデノウイル
スの第一の細胞レセプターに対して結合するためのリガンドであることが示され
ている(Krasnykhら(1996)Journal of Virolo
gy、70:6839)。3量体ファイバー分子の遠位のC末端ドメインは、特
定の第一のレセプターに対する高い親和性で結合するノブで終わる。結合後、ペ
ントンベースのArg−Gly−Asp(RGD)モチーフは、第二のレセプタ
ーとして機能するαvβ3型およびαvβ5型の細胞インテグリンと相互作用す
る。この相互作用は、細胞内在化を引き起こし、これにより、ビリオンはエンド
ソーム中に存在する。このエンドソーム膜は、ペントンベースによって媒介され
る過程において溶解され、エンドソームの内容物が細胞質に放出される。これら
の過程の間、このビリオンは、次第に脱殻され、そしてこのアデノウイルスDN
Aは核中に輸送される(Shayakhmetovら(2000)Journa
l of Virology 74:2567−2583)。
的な背景の引用文献については、Grahamら(1973)Virology
52:456−467;Takiffら(1981)Lancet 11:8
32−834;Berknerら(1983)Nucleic Acid Re
search 11:6003−6020;Graham(1984)EMBO
J 3:2917−2922;Bettら(1993)J.Virology
67:5911−5921;およびBettら(1994)Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 91:8802−8806を参照のこと。
。感染細胞を溶解するのに加えて、アデノウイルスの複製過程は、宿主細胞のm
RNAの輸送および翻訳を阻害し、従って細胞タンパク質合成を阻害する。アデ
ノウイルスおよびアデノウイルス複製に関する総論については、Shenk、T
.およびHorwitz、M.S.、Virology、第3版、Fields
、B.N.ら編、Raven Press Limited、New York
(1996)、第67章および第68章のそれぞれを参照のこと。
製するいくつかの試みを生じた。このような研究の例は、以下における開示を含
む:米国特許第4,510,245号(酵母宿主での発現のためのアデノウイル
スの主要後期プロモーター);米国特許第4,920,209号(欠失した早期
領域3の位置に位置するB型肝炎表面抗原のコード遺伝子を有する生の組換え体
アデノウイルス7型);欧州特許第389286号(ヒト細胞でのHCMVの主
要エンベロープ糖タンパク質に対する非欠損ヒトアデノウイルス5組換え体の発
現システム);WO91/11525(E1Aタンパク質を発現する細胞におけ
る生存可能な生の非病原的免疫原のイヌのアデノウイルス);ならびにフランス
特許第2642767号(アデノウイルス2のE3領域に由来するリーダーおよ
び/またはプロモーターを含むベクター)。米国特許第6,001,591号お
よび同第5,820,868号ならびに国際公開番号WO95/16048は、
ウシアデノウイルス発現ベクターシステムでの組換え体タンパク質の産生を開示
する。米国特許第5,922,576号は、組換え体アデノウイルス生成のため
のシステムを開示する。
70:6839)、Zabnerら(1999)Journal of Vir
ology、73:8689)およびShayakhmetovら、前出は、改
変されたファイバー領域を有するヒトアデノウイルスベクターの生成を報告する
。Xuら(1998、Virology、248:156−163)は、ヒトア
デノウイルス5型のファイバータンパク質細胞結合ドメインを保有するウシアデ
ノウイルスを開示する。
が参考として援用される。
クレオチドに改変を含むアデノウイルス(好ましくは、ウシアデノウイルス)を
提供し、ここで、上記タンパク質またはそれらのフラグメントは、親和性と関連
し、そして上記改変は変更された親和性に関連する。本発明はさらに、改変され
たアデノウイルスを含む宿主細胞および方法を提供する。従って、本発明は、キ
ャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドに改
変を含むウシアデノウイルスベクターを提供し、ここで、上記タンパク質または
そのフラグメントは親和性と関連し、そして上記改変は変更された親和性に関連
する。いくつかの実施形態において、キャプシドタンパク質またはそのフラグメ
ントをコードするこのポリヌクレオチドは、異種の哺乳動物のキャプシドタンパ
ク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドで置き換えられる。
このキャプシドタンパク質またはそのフラグメントとしては、アデノウイルスの
ペントン、ヘキソン、またはファイバータンパク質、あるいはそれらのフラグメ
ントが挙げられる。いくつかの実施形態において、この改変は、ファイバータン
パク質のノブ領域をコードするポリヌクレオチドに存在する。他の実施形態にお
いて、ウシアデノウイルスのペントン、ヘキソンおよび/またはファイバータン
パク質をコードするポリヌクレオチドは、異種の哺乳動物アデノウイルスのペン
トン、ヘキソンおよび/またはファイバータンパク質をコードする少なくとも1
つのポリヌクレオチドでそれぞれ置き換えられる。さらなる実施形態において、
ウシアデノウイルスのペントンタンパク質またはそのフラグメントをコードする
ポリヌクレオチドは、異種の哺乳動物アデノウイルスのペントンタンパク質また
はそのフラグメントをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドで置き換え
られ;ウシアデノウイルスのヘキソンタンパク質またはそのフラグメントをコー
ドするポリヌクレオチドは、異種の哺乳動物アデノウイルスのヘキソンタンパク
質、またはそれらのフラグメントをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチ
ドで置き換えられ;あるいはウシアデノウイルスのファイバータンパク質または
ノブ領域のようなそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、異種の哺
乳動物アデノウイルスのファイバータンパク質またはファイバータンパク質の異
種ノブ領域のようなそのフラグメントをコードする少なくとも1つのポリヌクレ
オチドで置き換えられる。
ブタ、ヒツジ、イヌまたはヒトのアデノウイルスが挙げられる。さらなる実施形
態において、ウシアデノウイルスとしては、サブタイプ1アデノウイルス、そし
て特にBAV3、またはサブタイプ2アデノウイルスが挙げられる。他の実施形
態において、このウシアデノウイルスベクターはさらに、異種タンパク質をコー
ドするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、この異種タンパ
ク質は治療的タンパク質である。他の実施形態において、この異種タンパク質と
しては、サイトカイン;リンホカイン;病原性生物によって認識される膜レセプ
ター、ジストロフィン;インスリン;細胞イオンチャネルに関与するタンパク質
;アンチセンスRNA;病原性遺伝子によって産生されるタンパク質の活性を阻
害し得るタンパク質、酵素活性阻害タンパク質、病原性タンパク質のタンパク質
改変体;抗原性エピトープ;主要組織適合遺伝子複合体のクラスIおよびクラス
IIタンパク質;抗体;免疫毒素;毒素;増殖因子または成長ホルモン;細胞レ
セプターまたはそれらのリガンド;腫瘍サプレッサー;細胞酵素;あるいは自殺
遺伝子が挙げられる。なお他の実施形態において、アデノウイルスベクターはE
1機能を欠いている。さらなる実施形態において、アデノウイルスベクターは、
E1遺伝子領域の部分的または全ての欠失を有する。さらなる実施形態において
、このアデノウイルスベクターはE3遺伝子領域の部分的または全ての欠失を有
する。なおさらなる実施形態において、異種タンパク質をコードするポリヌクレ
オチドは、アデノウイルスのE1遺伝子領域に挿入される。他の実施形態におい
て、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アデノウイルスのE3遺
伝子領域に挿入される。さらなる実施形態において、アデノウイルスベクターは
複製欠損性であり、そして、なおさらなる実施形態において、アデノウイルスベ
クターは複製能力がある。本発明はまた、キャプシドタンパク質またはそのフラ
グメントをコードするポリヌクレオチドに改変を有するウシアデノウイルスベク
ターを含む宿主細胞を含む。
リヌクレオチドに改変を含む組換え体ウシアデノウイルスベクターを産生する方
法を提供し、この方法は、ウシアデノウイルスベクターを得る工程;およびキャ
プシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドに改変
を導入する工程を含み、ここで、上記キャプシドタンパク質またはそのフラグメ
ントは親和性に関連し、そして上記改変は変更された親和性に関連する。いくつ
かの実施形態において、この改変は、ウシアデノウイルスのペントン、ヘキソン
および/またはファイバータンパク質、あるいはそれらのフラグメントをコード
する少なくとも1つのポリヌクレオチドと、異種の哺乳動物のペントン、ヘキソ
ンおよび/またはファイバータンパク質、あるいはそれらのフラグメントをコー
ドする少なくとも1つのポリヌクレオチドとの置換である。他の実施形態におい
て、この改変はファイバータンパク質のノブ領域をコードするポリヌクレオチド
の置換である。さらなる実施形態において、このアデノウイルスベクターはさら
に、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
を含む組換え体ウシアデノウイルスを提供し、ここで上記キャプシドタンパク質
またはそのフラグメントは親和性に関連し、そして上記改変は変更された親和性
に関連する。さらなる実施形態において、組み換え体アデノウイルスは異種タン
パク質をコードするポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態において、異種
タンパク質をコードするポリヌクレオチドはアデノウイルスE1遺伝子領域に挿
入され;なおさらなる実施形態において、異種タンパク質をコードするポリヌク
レオチドはアデノウイルスE3遺伝子領域に挿入される。いくつかの実施形態に
おいて、組み換え体アデノウイルスは複製能力があり、そして他の実施形態にお
いて、組み換え体アデノウイルスは複製欠損性である。いくつかの実施形態にお
いて、組み換え体アデノウイルスは、ウシアデノウイルスのペントン、ヘキソン
および/またはファイバータンパク質、あるいはそれらのフラグメントをコード
する少なくとも1つのポリヌクレオチドと、異種の哺乳動物のペントン、ヘキソ
ンおよび/またはファイバータンパク質、あるいはそれらのフラグメントをコー
ドする少なくとも1つのポリヌクレオチドとの置換を含む。なおさらなる実施形
態において、組み換え体アデノウイルスは、ファイバータンパク質のノブ領域に
おける改変を含む。
記アデノウイルスはキャプシドタンパク質またはそのフラグメントにおける改変
をコードするポリヌクレオチドを含み、そして上記タンパク質またはそのフラグ
メントは親和性に関連し、そして上記改変は変更された親和性に関連する。いく
つかの実施形態において、このキャプシドタンパク質またはそのフラグメントと
しては、アデノウイルスのペントン、ヘキソンまたはファイバータンパク質、あ
るいはそれらのフラグメントが挙げられる。免疫原性組成物のいくつかの実施形
態において、この改変は、ウシキャプシドタンパク質またはそのフラグメントを
コードするポリヌクレオチドと、異種の哺乳動物アデノウイルスキャプシドタン
パク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドとの置換を含む。
免疫原性組成物の他の実施形態において、この改変は、ウシファイバータンパク
質のノブ領域をコードするポリヌクレオチドの、異種の哺乳動物アデノウイルス
のファイバータンパク質のノブ領域をコードするポリヌクレオチドでの置換を含
む。他の実施形態において、ウシアデノウイルスは、サブタイプ1アデノウイル
ス、特にBAV3、またはサブタイプ2アデノウイルスである。さらなる実施形
態において、免疫原性組成物は、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むウシアデノウイルスを含む。他の実施形態において、免疫原性組成物は、
サイトカイン;リンホカイン;病原性生物によって認識される膜レセプター、ジ
ストロフィン;インスリン;細胞イオンチャネルに関与するタンパク質;アンチ
センスRNA;病原性遺伝子によって産生されるタンパク質の活性を阻害し得る
タンパク質、酵素活性阻害タンパク質、病原性タンパク質のタンパク質改変体;
抗原性エピトープ;主要組織適合遺伝子複合体のクラスIおよびクラスIIタン
パク質;抗体;免疫毒素;毒素;増殖因子または成長ホルモン;細胞レセプター
またはそれらのリガンド;腫瘍サプレッサー;細胞酵素;あるいは自殺遺伝子を
コードするポリヌクレオチドを含むウシアデノウイルスを含む。
組成物を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、改変されたキャ
プシドタンパク質またはそのフラグメントを有するウシアデノウイルスを含む免
疫原性組成物を含み、ここで、上記タンパク質またはそのフラグメントは親和性
に関連し、そして上記改変は変更された親和性に関連する。薬学的組成物のいく
つかの実施形態において、免疫原性組成物は、異種タンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドを含むウシアデノウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態に
おいて、この異種タンパク質は治療的タンパク質である。他の実施形態において
、この薬学的組成物はさらに、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。
法を提供し、この方法は、本発明の薬学的組成物を必要のある哺乳動物宿主に投
与する工程を含む。本発明はまた、哺乳動物宿主における遺伝子送達の方法を提
供し、この方法は、改変されたキャプシドタンパク質またはそのフラグメントを
コードするポリヌクレオチドを含むウシアデノウイルスベクターをこの宿主に投
与する工程を含み、ここで、このタンパク質は親和性に関連し、そしてこの改変
は変更された親和性に関連し、そしてこのアデノウイルスベクターはさらに、異
種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態におい
て、この異種ポリヌクレオチドは治療的タンパク質をコードする。
(詳細には、改善されたウシアデノウイルスベクター)を発見し、そしてこれを
構築した。本発明のウシアデノウイルスベクターは、少なくとも1つのキャプシ
ドタンパク質をコードするポリヌクレオチド中に改変を含み、ここで、このタン
パク質またはそのフラグメントは、親和性と関連し、そしてその改変は、変更さ
れた親和性と関連する。
ク質(fiber protein)が挙げられる。本明細書中に例示される1
つの実施形態において、BAV3アデノウイルスベクターを構築し(BAV60
0)、これは、BAV3ファイバーノブ領域(fiber ノブ region
)とヒトアデノウイルス(Ad5)ファイバーノブ領域との置換を含んだ。BA
V600は、コントロールアデノウイルスと比較した場合、ヒト細胞株において
増加した形質導入を示した。
親和性と関連する限りキャプシドタンパク質またはそのフラグメントの、異種哺
乳動物キャプシドタンパク質またはそのフラグメントとの置換含む、ウシアデノ
ウイルスベクターを含む。例えば、1つの実施形態において、ウシのファイバー
タンパク質のノブドメインを、種親水性を変更するために、ブタのファイバータ
ンパク質のノブ領域またはヒツジのファイバータンパク質のノブ領域と置換する
。このようなウシアデノウイルスベクターは、ブタアデノウイルスまたはヒツジ
アデノウイルスでそれぞれ初回免疫されたブタ哺乳動物またはヒツジ哺乳動物に
おいて免疫性をブーストするための免疫原として使用され得る。このような免疫
化プロトコルにおいて、ブースト免疫は、初回免疫の結果として産生されるブタ
哺乳動物またはヒツジ哺乳動物に対する任意の中和抗体の影響を回避しながら、
ブタ哺乳動物またはヒツジ哺乳動物に対して種特異性を有するウシアデノウイル
スの投与によって達成され得る。あるいは、別の実施形態において、ウシファイ
バータンパク質またはそのフラグメント(例えば、ノブ領域)を、ウシ細胞特異
性を変更するために、異種ウシファイバータンパク質またはそのフラグメント(
例えば、ファイバータンパク質のノブ領域)と置換する。1つの例において、ウ
シアデノウイルスサブタイプ1ファイバー領域またはそのフラグメント(例えば
、ノブドメイン)を、ウシ細胞型特異性を変更するために、ウシアデノウイルス
サブタイプ2ファイバー領域またはそのフラグメント(例えば、ノブドメイン)
と置換する。このようなウシアデノウイルスベクターは、特定の細胞または組織
を標的化するための免疫原として使用され得る。
デノウイルスキャプシドタンパク質またはそのフラグメントとの置換を含むウシ
アデノウイルスの使用を含み、その結果、改変されたウシアデノウイルスは、ヒ
トに対する種特異性を有する。このようなウシアデノウイルスは、ヒト免疫化プ
ロトコルに使用され得、ここで、臨床患者におけるヒトアデノウイルス−5(H
AV−5)に対する既存の中和抗体は、HAV−5の効果的な使用に対して障害
を示し得る。
質が、アデノウイルスベクター中に存在し得る。
「アデノウイルスベクター(adenoviral vector)」(これら
は、交換可能に使用される)は、本発明のポリヌクレオチド構築物を含む。本発
明のポリヌクレオチド構築物は、いくつかの形態(DNA、アデノウイルスコー
トにカプセル化されたDNA、別のウイルスもしくはウイルス様形態(例えば、
単純疱疹ウイルス、およびAAV)中にパッケージングされたDNA、リポソー
ムにカプセル化されたDNA、ポリリジンと複合体化したDNA、合成ポリカチ
オン性分子と複合体化したDNA、トランスフェリンと結合体化したDNA、お
よび分子を免疫学的に「マスクする」ためおよび/または半減期を増加させるた
めにPEGのような化合物に複合体化したDNA、ならびに非ウイルスタンパク
質に結合体化されたDNAが挙げられるが、これらに限定されない)の内のいず
れかであり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、DNAである。本明細書中
に使用される場合、「DNA」は、塩基A、T、CおよびGのみでなく、これら
のアナログもしくはこれらの塩基の改変形態のうちのいずれか(例えば、メチル
化ヌクレオチド、ヌクレオチド間改変(例えば、非電荷連結およびチオエート)
、糖アナログの使用、ならびに改変された骨格構造および/または代替骨格構造
(例えば、ポリアミド))を含み得る。アデノウイルスベクターは、標的細胞に
おいて複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。
の特異性を変化させることをいう。用語「改変された親和性」は、種特異性の変
更ならびにアデノウイルスの組織特異性もしくは細胞特異性の変更を含む。本明
細書中に例示される実施形態において、種特異性は、キャプシドタンパク質また
はそのフラグメント(例えば、ファイバータンパク質、特に、ファイバータンパ
ク質のノブ領域)に改変を生成することによって、変更される。
のペントン、ヘキソンおよびファイバー領域を含む。キャプシドタンパク質は、
アデノウイルス親和性に直接的または間接的に影響を与える場合、親和性と関連
する。「変更された親和性と関連するキャプシドタンパク質の改変」は、本明細
書中に使用される場合、その特異性が変更されるように、キャプシドタンパク質
(すなわち、ペントン、ヘキソンもしくはファイバータンパク質領域、またはこ
れらのフラグメント(例えば、特異性が変更されるようなファイバー領域のノブ
ドメイン))をコードするポリヌクレオチドの改変を生成することをいう。「関
連する」とは、改変が、直接的または間接的のいずれかで、変更された親和性に
寄与することを意味する。本明細書中に例示される実施形態において、アデノウ
イルスにおいて種特異性を生成するために、この改変は、ウシキャプシドタンパ
ク質領域と異種哺乳動物キャプシドタンパク質領域との置換である。1つの種の
キャプシドタンパク質領域と異種キャプシドタンパク質領域との置換は、変更さ
れた組織特異性または変更された細胞特異性もまた生成し得る。
なわち、その独自の制御の下で複製し得る)任意の遺伝子エレメント(例えば、
プラスミド、染色体、ウイルス)である。
入/トランスフェクションのために設計されたポリヌクレオチド構築物をいう。
例えば、ベクターは、挿入ヌクレオチドの単離、増幅、および複製のために設計
された「クローニングベクター」であり得るか、宿主細胞中でのヌクレオチド配
列の発現のために設計された「発現ベクター」であり得るか、または組換えウイ
ルスまたはウイルス様粒子を産生するよう設計された「ウイルスベクター」であ
り得るか、もしくは1つより多くの型のベクターの属性を含む「シャトルベクタ
ー」であり得る。
び接種した動物において同一の子孫を生成し得るウイルスが意味される。
提供する第2ウイルスまたは第2細胞株を必要としないベクターである。
ヌクレオチド(アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン)のポリマー形態
をいう。この用語は、その分子の一次構造および二次構造のみをいい、いずれの
特定の三次構造にも限定されない。従って、この用語は、特に、直鎖状DNA分
子において見出される二本鎖DNA(例えば、ウイルス、プラスミド、および染
色体由来のDNAの制限フラグメント)を含む。特定の二本鎖DNA分子の構造
を議論する場合、配列は、DNAの転写されていない鎖(すなわち、mRNAに
相同な配列を有する鎖)に沿って5’から3’方向への配列のみを与えるという
通常の約束事に従って、本明細書中で記載され得る。
ボでポリペプチドに転写および翻訳されるDNA配列である。コード領域の境界
は、5’(アミノ)末端の開始コドンおよび3’(カルボキシ)末端の翻訳終止
コドンにより決定される。コード配列として、原核生物配列、真核生物mRNA
由来のcDNA、真核生物(例えば、哺乳動物)DNA由来のゲノムDNA配列
、ウイルスDNA、および合成DNA配列さえも挙げられ得るがこれらに限定さ
れない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列に対
して3’に位置する。
下流(3’方向)のコード配列の転写を開始し得るDNA調節領域である。本発
明を定義する目的のために、プロモーター配列は、コード配列の翻訳開始コドン
(ATG)によりその3’末端が結合しており、そしてバックグラウンドを超え
て検出可能なレベルで転写を開始するために必要な塩基またはエレメントの最小
数を含むように上流(5’方向)に延びている。プロモーター配列内では、転写
開始部位(ヌクレアーゼS1を用いたマッピングにより好適に規定されている)
、およびRNAポリメラーゼの結合の原因となるタンパク質結合ドメイン(コン
センサス配列)が見出される。真核生物プロモーターは、しばしば(しかし、い
つもではない)、「TATA」ボックスおよび「CAAT」ボックスを含む。原
核生物プロモーターは、−10および−35のコンセンサス配列に加えてシャイ
ン−ダルガーノ配列を含む。
スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ド
メイン、エンハンサー、翻訳終結配列などをいい、集合的に、宿主細胞における
コード領域の転写および翻訳を提供する。
モーター配列に結合し、そしてコード配列をmRNAへ転写し、次いでこのmR
NAがコード配列によりコードされるポリペプチドに翻訳される場合、細胞中の
制御配列に「作動可能に連結されている」か、または制御配列の「制御下にある
」。
され得る細胞である。
な外因性DNAにより「形質転換」されている。外因性DNAは、細胞のゲノム
を構成する染色体DNAに組込まれ(共有結合され)ていてもそうでなくてもよ
い。原核生物および酵母において、例えば、外因性DNAはエピソームエレメン
ト(例えば、プラスミド)上で維持され得る。安定に形質転換された細胞は、外
因性DNAが染色体に組込まれ、その結果、染色体の複製を通じて娘細胞により
遺伝される細胞である。哺乳動物細胞について、この安定性は、外因性DNAを
含む娘細胞の集団からなる細胞株またはクローンを確立する細胞の能力により実
証される。
。「細胞株」は、インビトロで多くの世代の間安定に増殖し得る初代細胞のクロ
ーンである。
い別のDNA分子内かまたはそのDNA分子に結合した同定可能なDNAのセグ
メントである。従って、異種領域がウイルス遺伝子をコードする場合、この遺伝
子は通常、供給源のウイルスまたはウイルスに感染した細胞のゲノムにおいてこ
のウイルスゲノムと隣接しないDNAにより隣接される。異種コード配列の別の
例は、そのコード配列自体が本来は見出されない構築物(例えば、ネイティブの
遺伝子と異なるコドンを有する合成配列)である。本明細書で用いられる場合、
対立遺伝子のバリエーションまたは天然に存在する変異現象は、DNAの異種領
域を生じない。アデノウイルスベクターを記載する際に本明細書で用いられる場
合、「異種哺乳動物キャプシド領域」は、そのキャプシド領域がアデノウイルス
の別の哺乳動物種から獲得可能であるか、または同一種の哺乳動物から獲得可能
であるが、異なるタイプまたはサブタイプのアデノウイルスからも獲得可能であ
ることを意味する。例えば、「異種哺乳動物キャプシドタンパク質」は、1つの
サブタイプのウシアデノウイルスキャプシドタンパク質と別のサブタイプのウシ
アデノウイルスキャプシドタンパク質との置換、およびウシアデノウイルスキャ
プシドタンパク質と別の種のキャプシドタンパク質(例えば、ヒトキャプシドタ
ンパク質)との置換、ならびにウシアデノウイルスキャプシドタンパク質領域と
別の血清型のウシアデノウイルスキャプシドタンパク質との置換を含む。
ttle)をいう。
ドを示すために本明細書で用いられる(他に注記されない限り)。用語「ポリペ
プチド」は、その最も広い意味(すなわち、ペプチド結合を介して連結した任意
のアミノ酸ポリマー(ジペプチド以上))において用いられる。従って、用語「
ポリペプチド」は、タンパク質、オリゴペプチド、タンパク質フラグメント、ア
ナログ、ムテイン、融合タンパク質などを含む。
デノウイルス感染細胞から回収されたタンパク質またはポリペプチドをいう。従
って、用語「ネイティブなBAVポリペプチド」は、天然に存在するBAVタン
パク質およびそのフラグメントを含む。「非ネイティブな」ポリペプチドは、組
換えDNA法によるか、または直接的な合成により生成されたポリペプチドをい
う。「組換え」ポリペプチドは、組換えDNA技術により生成された(すなわち
、所望のポリペプチドをコードする外来DNA構築物により形質転換された細胞
から生成された)ポリペプチドをいう。
くとも10%同質、より好ましくは60%同質性、そして最も好ましくは95%
同質である。
免疫系を刺激する1つ以上のエピトープを含む分子をいう。この用語はまた、「
免疫原」と交換可能に用いられる。
生成する宿主の免疫系を刺激しない1つ以上のエピトープを含む分子をいう。
認識される、抗原またはハプテン上の部位をいう。この用語はまた、「抗原性決
定基」または「抗原性決定部位」と交換可能に用いられる。
チンに対する細胞性および/または抗体媒介性の免疫応答の宿主における発生で
ある。通常、このような応答は、目的の組成物またはワクチンに含まれる抗原(
単数または複数)に特異的な、被験体が産生する抗体、B細胞、ヘルパーT細胞
、サプレッサーT細胞、および/または細胞障害性T細胞からなる。
疫原」は、それぞれ、ウイルス感染性を中和し、そして/もしくは免疫化された
宿主の保護を提供する抗体補完的または抗体依存的な細胞障害性を媒介するポリ
ペプチドまたはアミノ酸配列をいう。「免疫原性ポリペプチド」は、本明細書中
で用いられる場合、所望のタンパク質の全長(またはほぼ全長)配列またはその
免疫原性フラグメントを含む。
イルス感染性を中和し、そして/もしくは免疫化された宿主の保護を提供する抗
体補完的または抗体依存的な細胞障害性を媒介する抗体を誘導するポリペプチド
のフラグメントを意味する。このようなフラグメントは通常、少なくとも約5ア
ミノ酸長、そして好ましくは少なくとも約10〜15アミノ酸長である。このフ
ラグメントの長さに対する重要な上限はなく、ほぼ全長のタンパク質配列、また
は2つ以上の抗原のフラグメントを含む融合タンパク質さえも含み得る。用語「
処置」は、本明細書で用いられる場合、哺乳動物(例えば、ウシもしくはヒトま
たは他の哺乳動物)の処置であって、(i)感染または再感染の防止(予防)、
または(ii)感染の症状の減少または消滅、のいずれかの処置をいう。ワクチ
ンは、組換えBAV自体かまたは組換えBAVにより産生される組換え抗原を含
む。
する。
、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド(リボヌクレオチドまたはデオキシ
リボヌクレオチドのいずれか)をいう。これらの用語は、一本鎖、二本鎖、また
は三本鎖DNA、ゲノムDNA、cDNA、RNA、DNA−RNAハイブリッ
ド、もしくはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、あるいは他の天然の
ヌクレオチド塩基、化学的に改変されたヌクレオチド塩基、生化学的に改変され
たヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、または誘導体化したヌクレオ
チド塩基を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基(代表的には、
RNAまたはDNAにおいて見出され得る)、または改変もしくは置換された糖
もしくはリン酸基を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、合成サブ
ユニット(例えば、ホスホルアミデート)のポリマーを含み得、従って、オリゴ
デオキシヌクレオシドホスホルアミド(P−NH2)または混合ホスホラミデー
ト−ホスホジエステルオリゴマーであり得る。Peyrottesら(1996
)Nucleic Acids Res.24:1841−8;Chaturv
ediら(1996)Nucleic Acids Res.2318−23;
Schultzら、(1996)Nucleic Acids Res.24:
2966−73。ホスホロチオエート結合が、ホスホジエステル結合の代わりに
用いられ得る。Braunら(1988)J.Immunol.141:208
4−9;Latimerら(1995)Molec.Immunol.32:1
057−1064。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、化学的合成の一本鎖ポ
リヌクレオチド産物から、相補鎖を合成し、そして適切な条件下でこの鎖とアニ
ーリングさせるか、または適切なプライマーと共にDNAポリメラーゼを用いて
相補鎖をデノボで合成するかのいずれかにより獲得され得る。ポリヌクレオチド
配列に対する言及(例えば、配列番号の言及)はまた、その相補配列も含む。
メント、エキソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、
cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベ
クター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸
プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドとしては、改変ヌクレオチド(
例えば、メチル化ヌクレオチド、およびヌクレオチドアナログ)、ウラシル、他
の糖および連結基(例えば、フルオロリボースおよびチオエート)、ならびにヌ
クレオチド分枝(branch)を含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレ
オチド成分により介在され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分と結合
体化することにより、重合後にさらに改変され得る。この定義に含まれる他の型
の改変は、キャップ、天然に存在するヌクレオチドの1つ以上のアナログとの置
換、およびそのポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポ
リヌクレオチド、または固体支持体に取りつけるための手段の導入である。好ま
しくは、ポリヌクレオチドはDNAである。本明細書で用いる場合、「DNA」
は、塩基A、T、C、およびGだけでなく、任意のそれらのアナログまたはこれ
らの塩基の改変形態(例えば、メチル化ヌクレオチド)、ヌクレオチド間改変体
(例えば、非荷電結合およびチオエート)、糖アナログの使用、ならびに改変骨
格構造および/または代替骨格構造(例えば、ポリアミド)も含む。
配列を比較して、塩基の割合が同一である別の配列の平均値に対する特定の割合
(80%、85%、90%、または95%)の「配列同一性」を有する。このア
ラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該分野で公知のソ
フトウェアプログラムを用いて決定され得る(例えば、Current Pro
tocols in Molecular Biology(F.M.Ausu
belら編、1987年)補遺30、7.7.18節、表7.7.1に記載され
るプログラム)。好ましいアラインメントプログラムは、ALIGN Plus
(Scientific and Educational Software
、Pennsylvania)であり、好ましくは以下のようなデフォルト設定
を使用する:ミスマッチ=2;オープンギャップ=0;伸長ギャップ=2。
レオチド配列(通常、DNA配列)の転写が、転写の開始または促進に寄与する
エレメントにそれが作動可能に連結されていることに依存することを示す。「作
動可能に連結される」は、エレメントが機能することを可能にする配列にある並
置をいう。
用語であり、そして細胞の通常の生化学的または生物学的活性が損なわれる(す
なわち、阻害される)状態をいう。これらの活性としては、代謝;細胞複製;D
NA複製;転写;翻訳;分子の取り込み、が挙げられるがこれらに限定されない
。「細胞障害性」は、細胞死および/または細胞溶解を含む。細胞障害性を示す
アッセイ(例えば、色素除去、3H−チミジンの取り込み、およびプラークアッ
セイ)は当該分野で公知である。
子」もしくは「導入遺伝子」は、野生型アデノウイルスに存在しない任意のポリ
ヌクレオチドまたは遺伝子である。好ましくは、導入遺伝子はまた、アデノウイ
ルスベクターの導入前に標的細胞において発現または存在しない。
、アデノウイルス遺伝子に関連も由来もしないプロモーターまたはエンハンサー
である。
たはコントロール領域は、アデノウイルスに対してネイティブであるか、または
これに由来する。
か、またはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞
は、単一の宿主細胞の子孫を含み、そしてこの子孫は、天然の、偶然の、または
計画的な変異および/または変化に起因して、本来の親細胞と完全に同一である
(形態または全DNAの相補性において)必要はない。宿主細胞は、本発明のア
デノウイルスベクターを用いて、インビボまたはインビトロでトランスフェクト
または感染させた細胞を含む。
スベクターの再生または増殖する能力をいう。これらの用語は、当該分野で十分
に理解される。本発明の目的のために、複製はアデノウイルスタンパク質の産生
に関し、そして一般的に、アデノウイルスの繁殖に関する。複製は、当該分野で
標準的なアッセイおよび本明細書に記載されるアッセイ(例えば、バーストアッ
セイまたはプラークアッセイ)を用いて測定され得る。「複製」および「増殖」
は、ウイルス製造のプロセスに直接的にかまたは関節的に関与する任意の活性(
ウイルス遺伝子の発現;ウイルスタンパク質、核酸、または他の要素の生成;ウ
イルス成分の完全なウイルスへのパッケージング;および細胞溶解)を含む。
いて同一の連続的な配列として存在することを意味する。この用語は、配列番号
の一部分または領域、ならびに配列番号中に含まれる配列全体を包含する。
して診断アッセイまたはモニタリングアッセイにおいて用いられ得る。この定義
は、生物学的起源の血液および他の液体サンプル、固体組織サンプル(例えば、
生体標本もしくは組織培養物またはそれらの由来となる細胞)、およびそれらの
子孫を包含する。この定義はまた、それらの獲得後に任意の方法で操作された(
例えば、試薬による処理、可溶化、または特定の成分(例えば、タンパク質また
はポリヌクレオチド)の濃縮により)サンプルを含む。用語「生物学的サンプル
」は臨床的サンプルを包含し、そしてまた、培養物、細胞上清、細胞溶解物、血
清、血漿、生物学的流体、および組織サンプル中の細胞を含む。
好ましくはヒトである。哺乳動物としては、家畜動物、競技用動物、げっ歯類、
霊長類、およびペットが挙げられるがこれらに限定されない。
すのに十分な量である。有効量は、1つ以上の投与において投与され得る。本発
明の目的のために、アデノウイルスベクターの有効量は、疾患状態の進行を和ら
げるか、改善するか、安定化させるか、逆転させるか、緩慢にする、または遅延
させるのに十分な量である。
)」およびその同義語は、それらの包括的な意味(すなわち、用語「含む(in
cluding)」およびその対応する同義語と等価な意味)において用いられ
る。
さない限り、複数の参照を含む。
イルスベクターを構築する方法および変更された親和性を有する組換えアデノウ
イルスを提供する。好ましい実施形態において、このアデノウイルスは、ウシア
デノウイルス(例えば、サブタイプ1アデノウイルス(特にBAV3)またはサ
ブタイプ2アデノウイルス)である。例示的な実施形態において、親和性に関連
するウシキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の一部または
全ては欠失され、そしてアデノウイルスの親和性を変更する異種哺乳動物キャプ
シドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と置換される。本明細書に開
示される特定の実施形態において、ウシ線維タンパク質の小頭部(ノブ)領域は
、ヒトの線維タンパク質の小頭部領域と置換される。本発明はまた、細胞の特異
性を変更するために、親和性に関連する1つのウシ血清型アデノウイルスキャプ
シドタンパク質の、親和性に関連する異種性ウシ血清型アデノウイルスキャプシ
ドタンパク質との置換を含むアデノウイルスを包含する。
配列番号1)を参照のこと。mRNAの転写マッピングおよびcDNAクローン
の配列決定から得たBAV3ゲノムの転写地図を図2に示す。BAV3ゲノムの
大きさ(34,446bp)および組織全体は、HAVのそれと類似している可
能性があるが、特定の相違が存在する。Reddyら(1998)前出。BAV
3ゲノムの顕著な特徴の1つは、比較的小さい大きさのE3コード領域(151
7bp)である。Mittalら(1992)J.Gen.Virol.73:
3295−3300;Mittalら(1993)J.Gen.Virol.7
4:2825;およびReddyら(1998)前出。BAV3 E3領域およ
びそのRNA転写物の配列の分析は、BAV3 E3が少なくとも4つのタンパ
ク質をコードし得ることを示唆し、そのうちの1つ(121R)は、HAV5の
14.7kDaタンパク質との限定された相同性を示す。Idamakanti
(1998)「Molecular characterization of
E3 region of bovine adenovirus−3」、M
.Sc.thesis、University of Saskatchewa
n、Saskatoon、Saskatchewan。
1394は、BAV3のヌクレオチド配列を開示する。BAV3のポリヌクレオ
チド配列において、ペントン領域は12919で開始し、そして14367で終
了し;ヘキソン領域は17809で開始し、そして20517で終了し;線維領
域は27968で開始し、そして30898で終了する。線維タンパク質の小頭
部領域(またはドメイン)は、図4に示されるように残基TLWTモチーフの後
で開始する。この線維タンパク質はまた、シャフトおよびテイル領域(またはド
メイン)を含む。
メリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)から入手可能である。Ad
5に関するNational Center for Biotechnolo
gy Information GenBank登録番号はM73260/M2
9978であり;Ad9についてはX74659であり;そしてAd35につい
てはU10272である。Chowら(1977、Cell 12:1−8)は
ヒトアデノウイルス2配列を開示し;Davisonら(1993、J.Mol
e.Biol.234:1308−1316)は40型ヒトアデノウイルスのD
NA配列を開示し;Sprengenら(1994、J.Virol.68:3
79−389)は12型ヒトアデノウイルスDNAのDNA配列を開示し;Vr
atiら(1995、Virology、209:400−408)はヒツジア
デノウイルスの配列を開示し;Morrisonら(1997、J.Gen.V
irol.78:873−878)は1型イヌアデノウイルスDNA配列を開示
し;そしてReddyら(1998、Virology、251:414)はブ
タアデノウイルスのDNA配列を開示する。
域のPCRプライマーを提供する。HAV−5線維タンパク質を図12に示し;
図13はウシアデノウイルス−3(BAV−3)線維タンパク質のアミノ酸配列
を示し;図14はヒツジアデノウイルス287線維タンパク質のアミノ酸配列を
示し;図15はブタアデノウイルス−3(PAV−3)線維タンパク質のアミノ
酸配列を示し;図16はイヌアデノウイルス−2(CAV−2)線維タンパク質
のアミノ酸配列を示し;そして図17A〜17Gは、マルチアラインプログラム
のclustal法を用いて、哺乳動物アデノウイルス線維領域のアミノ酸アラ
インメントを示す。線維領域の小頭部ドメインは、代表的に、アミノ酸残基モチ
ーフTLWT(ヒンジ領域)の後に開始する(図4を参照のこと)(1つの例外
は、ヒツジアデノウイスル線維領域である)。
トランスフェクションの前かまたは後のいずれかに、BAVゲノムを用いてイン
ビトロまたはインビボで組換えが行なわれ得る。
または各々がBAV配列を含む、2つ以上のプラスミド間の組換えを支持する任
意の細胞が挙げられる。組換えは、一般的に、原核生物細胞(例えば、E.co
li)において実施され、一方、ウイルス粒子を生成するためのウイルスゲノム
を含むプラスミドのトランスフェクトは真核生物細胞(好ましくは、哺乳動物、
より好ましくはウシ細胞培物、最も好ましくはMDBKまたはPFBR細胞、お
よびそれらの等価物)において実施される。細菌細胞培養物の増殖ならびに真核
生物細胞および哺乳動物細胞株の培養および維持は、当業者に周知の手順である
。
入されて、組換えBAV(BAVゲノムの挿入物収容能およびこの組換えBAV
が挿入された異種配列を発現する能力によってのみ限定される)を生成し得る。
一般的に、アデノウイルスゲノムは、ゲノム長の約5%の挿入物を受け入れ得、
そしてウイルス粒子にパッケージングされる能力を保持し得る。この挿入物収容
能は、非必須領域の欠失および/または必須領域(例えば、E1領域(E1領域
の機能は、ヘルパー細胞株(例えば、E1機能を提供する細胞)により提供yさ
れる))の欠失により増大され得る。いくつかの実施形態において、タンパク質
をコードする異種ポリヌクレオチドは、アデノウイルスE1遺伝子領域に挿入さ
れる。いくつかの実施形態において、アデノウイルスは、E1領域の一部または
全ての欠失を有し、そしてE1機能を提供するヘルパー細胞株中で増殖される。
さらに他の実施形態において、タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドは
、アデノウイルスE3遺伝子領域に挿入される。他の実施形態において、アデノ
ウイルスは、E3領域の一部または全ての欠失を有する。
領域(例えば、キャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド)を含むプ
ラスミドを構築することによって達成され得る。さらに、所望の治療的タンパク
質をコードするポリヌクレオチドは、ウシアデノウイルスに挿入され得る。次い
でこのプラスミドは、プラスミドのBAV部分に認識配列を有する制限酵素を用
いて消化され、そして異種ポリヌクレオチド配列は、制限消化の部位に挿入され
る。プラスミド(挿入された異種配列を有するBAVゲノムの部分を含む)を、
BAVゲノムまたはBAVゲノムを含む直鎖状プラスミドと共に、細菌細胞(例
えば、E.coliのような)中に同時形質転換し、ここで、BAVゲノムは、
全長ゲノムであり得るか、または1つ以上の欠失を含み得る。プラスミド間の相
同組換えは、挿入された異種配列を含む組換えBAVゲノムを生成する。
部位における挿入についてのさらなる能力を提供するために、当業者に周知の方
法によって達成され得る。例えば、プラスミド中にクローニングされ、1つ以上
の制限酵素(BAV挿入物において少なくとも1つの認識配列を有する)で消化
され、その後ライゲーションされるBAV配列は、いくつかの場合において、制
限酵素認識部位間の配列の欠失を生じる。あるいは、BAV挿入物内の単一の制
限酵素認識部位での消化(その後、エキソヌクレアーゼ処理が続き、その後ライ
ゲーションが続く)は、制限部位に隣接したBAV配列の欠失を生じる。上記の
ように構築された、1つ以上の欠失を有するBAVゲノムの1つ以上の部分を含
むプラスミドは、相同組換えによって、1つ以上の特定の部位に欠失を有する組
換えBAVゲノムを含むプラスミドを生成するために、BAVゲノム(全長もし
くは欠失した)または全長BAVゲノムもしくは欠失したBAVゲノムのいずれ
かを含むプラスミドと共に、細菌細胞に同時トランスフェクトされ得る。次いで
、欠失を含むBAVビリオンは、哺乳動物細胞(MDBK細胞またはPFBR細
胞およびこれらの等価物を含むがこれらに限定されない)の、組換えBAVゲノ
ムを含むプラスミドとのトランスフェクションによって得られ得る。
、かつその(転写的な意味で)下流に存在する。BAVプロモーターの位置およ
びBAVプロモーターの下流の制限酵素認識配列(挿入部位として使用するため
の)は、本明細書中に提供されるBAVヌクレオチド配列から当業者によって容
易に決定され得る。あるいは、種々のインビトロ技術が、特定の部位における制
限酵素認識配列の挿入のために、または制限酵素認識配列を含まない部位に異種
配列を挿入するために使用され得る。このような方法としては、1つ以上の酵素
認識配列の挿入のためのオリゴヌクレオチド媒介ヘテロ二重鎖形成(例えば、Z
ollerら(1982)Nucleic Acids Res.10:648
7−6500;Brennanら(1990)Roux’s Arch.Dev
.Biol.199:89−96;およびKunkelら(1987)Meth
.Enzymology 154:367−382を参照のこと)およびより長
い配列の挿入のためのPCR媒介方法(例えば、Zhengら(1994)Vi
rus Research 31:163−186を参照のこと)を含むが、こ
れらに限定されない。
、BAVプロモーターの下流ではない部位に挿入された異種配列の発現を得るこ
ともまた可能である。このような転写調節配列としては、例えば、ウシhsp7
0プロモーターのような細胞性プロモーター、ならびに例えば、ヘルペスウイル
スプロモーター、アデノウイルスプロモーターおよびパポバウイルスプロモータ
ーのようなウイルスプロモーター、そしてレトロウイルス長末端反復(LTR)
配列のDNAコピーが挙げられ得る。
ニングされたBAVゲノムを作成し得る;そしてクローニングされたBAVゲノ
ムは、プラスミドとして増殖され得る。例えば、米国特許第5,922,576
号を参照のこと。感染性ウイルスは、プラスミド含有細胞からレスキューされた
クローニングされたBAVゲノムでの哺乳動物細胞のトランスフェクションによ
って得られ得る。
列を提供する。調節配列は、例えば、転写調節配列、プロモーター、エンハンサ
ー、上流調節ドメイン、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、転
写終結配列、翻訳調節配列、リボソーム結合部位および翻訳終結配列であり得る
。
て増殖され得、そして感染性ウイルスは、プラスミド含有細胞からレスキューさ
れ得る。
反応、および他の型の増幅反応を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の
技術によって検出され得る。同様に、種々の型の免疫アッセイ、ELISA、ウ
エスタンブロッティング、酵素学的アッセイ、免疫組織化学などを含むがこれら
に限定されない、タンパク質の検出のための方法は、当業者に周知である。本発
明のヌクレオチド配列を含む診断キットはまた、細胞破壊および核酸精製のため
の試薬、ならびにハイブリッドの形成、選択および検出のための緩衝液および溶
媒を含み得る。本発明のポリペプチドまたはアミノ酸配列を含む診断キットはま
た、タンパク質の単離のための、ならびに免疫複合体の形成、単離、精製および
/または検出のための試薬を含み得る。
真核生物)は、本発明に従って、特に、広範な疾患に対する保護を提供するため
に、ウシアデノウイルスヌクレオチド配列(例えば、DNA)中に挿入され得、
そして多数のこのような遺伝子は、すでに当該分野で公知である。従来、遺伝子
または配列のための安全な、簡便かつ効果的なワクチンベクター、ならびに種々
の遺伝子治療適用において使用され得る遺伝子移入のための安全で、効果的な手
段を提供することが、問題であった。
治療目的の1つ以上の遺伝子からなり得る。本発明の文脈において、目的の遺伝
子は、アンチセンスRNA、リボザイム、または次いで目的のタンパク質に翻訳
されるmRNAのいずれかをコードし得る。目的の遺伝子は、ゲノム型、相補D
NA(cDNA)型または混合型(ミニ遺伝子、ここで、少なくとも1つのイン
トロンが欠失している)の遺伝子であり得る。目的の遺伝子は、成熟タンパク質
、成熟タンパク質の前駆体、特に、分泌されることが意図され従ってシグナルペ
プチドを含む前駆体、多様な起源の配列の融合に起因するキメラタンパク質、ま
たは改善されたかもしくは改変された生物学的特性を示す天然のタンパク質をコ
ードし得る。このような変異体は、天然のタンパク質をコードする遺伝子の1つ
以上のヌクレオチドの欠失、置換および/または付加、あるいは天然のタンパク
質をコードする配列における任意の他の型の変化(例えば、遺伝子転移または逆
位)によって得られ得る。
配列)の制御下に配置され得る。適切なDNA制御配列は、RNA(アンチセン
スRNAまたはmRNA)への遺伝子の転写のために、そしてmRNAのタンパ
ク質への翻訳のために必要なエレメントのセットを意味することが理解されてい
る。転写に必要なエレメントの間で、プロモーターは、特別な重要性を想定する
。これは、構成性プロモーターまたは調節性プロモーターであり得、そして真核
生物、原核生物またはウイルス起源、およびアデノウイルス起源でさえの任意の
遺伝子から単離され得る。あるいは、これは目的の遺伝子の天然のプロモーター
であり得る。一般的には、本発明において使用されるプロモーターは、調節配列
を含むように改変され得る。例としては、本発明での使用における目的の遺伝子
は、リンパ性宿主細胞へのその移行を標的化することが所望である場合、免疫グ
ロブリン遺伝子のプロモーターの制御下に配置される。例えば、多数の細胞型に
おける発現を可能にする、HSV−1 TK(1型ヘルペスウイルスチミジンキ
ナーゼ)遺伝子プロモーター、アデノウイルスMLP(主要後期プロモーター)
、特にヒト2型アデノウイルス、RSV(ラウス肉腫ウイルス)LTR(長末端
反復)、CMV(サイトメガロウイルス)初期プロモーター、およびPGK(ホ
スホグリセリン酸キナーゼ)遺伝子プロモーターがまた、言及され得る。
線維タンパク質領域の、異種哺乳動物線維タンパク質領域での置換によって、B
AVにおいて実証されている。本発明はまた、1つのウシ血清型アデノウイルス
線維領域の、別のウシ血清型アデノウイルス線維領域での置換を包含し、ここで
、この置換は、変更されたウシ細胞特異性と関連している。あるいは、組換えB
AVベクターの特定の細胞型への標的化は、組換えヘキソンおよび/または線維
遺伝子を構築することによって達成され得る。これらの遺伝子のタンパク質産物
は、宿主細胞認識に関与している;従って、これらの遺伝子は、ウイルスが代替
の宿主細胞を認識するのを可能にするペプチド配列を含むように改変され得る。
され得る: −インターフェロンおよびインターロイキンのようなサイトカインをコードす
る遺伝子; −リンホカインをコードする遺伝子; −病原性生物生物(ウイルス、細菌、または寄生生物)、好ましくはHIVウ
イルス(ヒト免疫不全ウイルス)によって認識されるレセプターのような膜レセ
プターをコードする遺伝子; −第VIII因子および第IX因子のような凝固因子をコードする遺伝子; −ジストロフィンをコードする遺伝子; −インスリンをコードする遺伝子; −細胞性イオンチャネル(例えば、CFTR(嚢胞性線維症膜貫通伝導性調節
因子)タンパク質)において直接的または間接的に関与するタンパク質をコード
する遺伝子; −アンチセンスRNA、病原性生物生物のゲノム中に存在する病原性遺伝子に
よって生成されるタンパク質の活性を阻害し得るタンパク質、または発現が調節
解除される細胞性遺伝子(例えば、オンコジーン)の活性を阻害し得るタンパク
質(もしくはこれらをコードする遺伝子)をコードする遺伝子; −酵素活性を阻害するタンパク質(例えば、α1−アンチトリプシンまたはウ
イルスプロテアーゼインヒビターのような)をコードする遺伝子; −それらの生物学的機能を損なうように変異された病原性タンパク質の改変体
(例えば、標的配列への結合について天然タンパク質と競合し得、それによりH
IVの活性化を妨げ得るHIVウイルスのtatタンパク質のトランス優性改変
体)をコードする遺伝子; −宿主細胞の免疫を増加するために抗原性エピトープをコードする遺伝子; −主要組織適合性複合体クラスIおよびクラスIIタンパク質をコードする遺
伝子、ならびにこれらの遺伝子の誘導物質であるタンパク質をコードする遺伝子
; −抗体をコードする遺伝子; −免疫毒素をコードする遺伝子; −毒素をコードする遺伝子; −増殖因子または増殖ホルモンをコードする遺伝子; −細胞レセプターおよびこれらのリガンドをコードする遺伝子; −腫瘍サプレッサーをコードする遺伝子; −以下を含むがこれらに限定されない、心血管疾患に関与する遺伝子:オンコ
ジーン;線維芽細胞増殖因子(FGF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、およ
び神経増殖因子(NGF)を含むがこれらに限定されない増殖因子をコードする
遺伝子;e−nos;Rb(網膜芽細胞腫)遺伝子を含むがこれらに限定されな
い、腫瘍サプレッサー遺伝子;リポタンパク質リパーゼ;スーパーオキシドジス
ムターゼ(SOD);カタラーゼ;酸素およびフリーラジカルスカベンジャー;
アポリポタンパク質;およびpai−1(プラスミノーゲン活性化因子インビタ
ー−1); −細胞性酵素または病原性生物生物によって生成される酵素をコードする遺伝
子;ならびに −自殺遺伝子。HSV−1 TK自殺遺伝子は、例として言及され得る。この
ウイルスTK酵素は、特定のヌクレオシドアナログ(アシクロビルまたはガンシ
クロビルのような)について、細胞性TK酵素と比較して、顕著に大きい親和性
を示す。この酵素は、ヌクレオシドアナログをモノリン酸化された分子に変換し
、これら自身は、細胞性酵素によって有毒なヌクレオチド前駆体に変換され得る
。これらのヌクレオチドアナログは、複製しているDNA分子に組み込まれ得、
従って、取り込みは、分裂細胞のDNAにおいて主に発生する。この取り込みは
、癌細胞のような分裂細胞の特定の破壊を生じ得る。
て使用され得る。
チド配列のフラグメントのみが使用され得る(ここで、これらのフラグメントは
、保護的な免疫応答または特定の生物学的効果を生成するために十分である)こ
とはまた、可能である。利用可能な場合、合成遺伝子またはそのフラグメントも
また使用され得る。しかし、本発明は、広範な種々の遺伝子、フラグメントなど
を用いて使用され得、そして上に示されるものに限定されない。
含み得るか、またはRNAウイルスに由来し得、これらの場合、相補的なDNA
コピー(cDNA)が使用され得る。
ンサーエレメントおよびポリアデニル化配列を含むと共に発現ベクターに挿入さ
れ得る。哺乳動物細胞における外来遺伝子の首尾良い発現および発現カセットの
構築を提供する多数の真核生物プロモーターならびにポリアデニル化配列は、当
該分野で公知である(例えば、米国特許第5,151,267号(この開示は、
本明細書中で参考として援用される))。プロモーターは、公知の基準に従って
、免疫原性タンパク質の最適な発現を与えるように選択され、これらは次いで体
液性、細胞媒介性および粘膜性免疫応答を十分に生じる。
ンパク質は、それ自身免疫原性であり得る。1つより多くの外来遺伝子が、ウイ
ルスゲノムに挿入されて、1つより多くの有効なタンパク質の首尾良い生成が得
られ得る。
冒す広範な種々の疾患に対する保護を提供することが可能である。本発明の組換
え抗原性決定因子または生きている組換えウイルスのいずれかは、抗原性決定の
ワクチンまたは生きているワクチンベクターについて記載されたのと実質的に同
じ様式で処方および使用され得る。
み合わせて、本発明の方法に従って調製された、治療的有効量の組換えアデノウ
イルスベクター、組換えアデノウイルスまたは組換えタンパク質を含む薬学的組
成物を含む。このような薬学的組成物は、当該分野で周知の技術に従って調製さ
れ得、そして投薬量が決定され得る。本発明の薬学的組成物は、全身的(例えば
、静脈内、気管内、血管内、肺内、腹腔内、鼻腔内、非経口、腸内、筋肉内、皮
下、腫瘍内もしくは頭蓋内)を含むがこれらに限定されない任意の公知の投与経
路によってか、またはエアロゾル適用もしくは肺内滴下によって、投与され得る
。投与は、単回用量でか、または特定の時間間隔後に一回以上の反復用量で行な
われ得る。適切な投与経路および投薬は、状況(例えば、処置される個体、処置
される障害または目的の遺伝子もしくはポリペプチド)に従って変化するが、当
業者によって決定され得る。
BAVベクター、組換えBAV、または宿主細胞が、処置を必要とする哺乳動物
被験体に投与される。
性ペプチドまたはフラグメントであり得る。これらは、部分配列、全長配列、ま
たは融合体(例えば、組換え宿主についての適切なリーダー配列を有するか、ま
たは別の病原性生物についてさらなる抗原配列を有する)でさえあり得る。本発
明のウイルス系によって発現される好ましい抗原性ポリペプチドは、抗原をコー
ドする全長(または全長に近い)配列を含む。あるいは、抗原性である(すなわ
ち、1つ以上のエピトープをコードする)より短い配列が使用され得る。より短
い配列は、インビトロアッセイにおいて、ウイルス感染力を中和する抗体を惹起
し得るエピトープとして定義される「中和エピトープ」をコードし得る。好まし
くは、このペプチドは、宿主において「保護的な免疫応答」(すなわち、感染か
ら免疫された宿主を保護する抗体および/または細胞媒介免疫応答)を惹起し得
る「保護エピトープ」をコードするはずである。
場合、ワクチンキャリアに結合体化され得る。ワクチンキャリア:例えば、ウシ
血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン(HSA)およびキーホールリ
ンペットヘモシアニン(KLH)は、当該分野で周知である。好ましいキャリア
タンパク質、ロタウイルスVP6は、EPO公開番号0259149において開
示され、この開示は、本明細書中に参考として援用される。
乳動物において疾患を引き起こす生物体(特に、ウシロタウイルス、ウシコロナ
ウイルス、1型ウシヘルペスウイルス、ウシRSウイルス、3型ウシパラインフ
ルエンザウイルス(BPI−3)、ウシ下痢ウイルス、Pasteurella
haemolytica、Haemophilus somnusなどのよう
なウシ病原性生物)の遺伝子が挙げられる。ヒト病原性生物の抗原をコードする
遺伝子はまた、本発明の実施において有用である。外来遺伝子またはフラグメン
トを保有する本発明のワクチンはまた、適切な経口キャリア(例えば、腸溶性投
薬形態)で経口投与され得る。経口処方物は、以下のような通常利用される賦形
剤を含む:例えば、薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステア
リン酸マグネシウム、サッカリンセルロースナトリウム、炭酸マグネシウムなど
。経口ワクチン組成物は、約10%〜約95%の活性成分、好ましくは、約25
%〜約70%の活性成分を含む、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放
性の処方物、または散剤の形態をとり得る。経口および/または経鼻のワクチン
接種は、全身性免疫とともに粘膜免疫(これは、気道および胃腸管に感染する病
原性生物に対する予防において重要な役割を果たす)を惹起することが好ましく
あり得る。
は、慣用的な結合剤およびキャリア(例えば、ポリアルカリのグリコールまたは
またはトリグリセリド)を含む。このような坐剤は、約0.5%〜約10%(w
/w)、好ましくは、約1%〜約2%の範囲内で活性成分を含有する混合物から
形成され得る。
から当業者の範囲内である。当業者は、抗原性フラグメントに対する抗体および
/またはT細胞媒介免疫応答を惹起するのに有効な用量でのワクチン組成物の濃
度を選択する。広範な制限内において、投薬量が重要であるとは考えられない。
代表的には、ワクチン組成物は、好都合な容量(例えば、約1〜10cc)のビ
ヒクル中約1〜約1,000μgの間のサブユニット抗原を送達する様式で投与
される。好ましくは、単回免疫における投薬量は、約1〜約500μgのサブユ
ニット抗原、より好ましくは、約5〜10から約100〜200μg(例えば、
5〜200μg)のサブユニット抗原を送達する。
ましくは、必要な場合、次のブースター接種を行ってもよい。必要に応じてでは
あるが、最初の免疫から数週間から数ヶ月後に、動物に対して2回目のブースタ
ー免疫を投与することもまた好ましくあり得る。疾患に対する高レベルの予防が
維持されることを保証するために、定期的な間隔で(例えば、数年毎に1回)、
それらの動物にブースター免疫を再投与することが役立ち得る。あるいは、開始
投薬が、経口投与に引き続いて、後に予防接種され得るか、またはその逆の場合
も同様である。好ましいワクチン接種プロトコルは、慣例のワクチン接種プロト
コル実験を通して確立され得る。
挙げられる種々の因子(患者の大きさ、予防が必要とされる感染の性質、キャリ
アなど)に依存し、そして当業者によって容易に決定され得る。非限定例として
、103pfuと1015pfuとの間、好ましくは105pfuと1013p
fuとの間、より好ましくは、106pfuと1011pfuとの間などの投薬
量が用いられ得る。インビトロサブユニットワクチンを用いる場合、さらなる投
薬量が、関連した臨床的因子によって決定されるように提供され得る。
よび/または他の必須の遺伝子領域を含む発現カセットを構築し、そして、変更
された親和性を有するよう改変され、かつE1機能を欠損する複製欠損ウシアデ
ノウイルスとともに使用するために、E1タンパク質を発現する補完細胞株また
は培養物を提供するよう、この発現カセットを用いて宿主細胞を形質転換するこ
とによって産生される。これらの組換え補完細胞株は、E1配列を欠失した欠損
組換えBAVが所望の外来遺伝子またはそのフラグメント(これは、必要に応じ
て組換えBAV内にコードされる)を複製および発現させることを可能にする。
これらの細胞株はまた、外来遺伝子またはフラグメントについてコードする異種
のヌクレオチド配列によって置換されたE3遺伝子欠失を有する、組換えBAV
を、DNA媒介同時トランスフェクション後のインビボでの組換えによって産生
するのに非常に有用である。より一般的には、BAVゲノムによってコードされ
る1つ以上の必須機能を欠損する、欠損BAVベクターは、適切な補完細胞にお
いて伝播され得、ここで、特定の補完細胞株は、特定の欠損組換えBAVベクタ
ーにおいて欠損している機能を提供する。補完細胞株は、例えば、ヘルペスウイ
ルスとの同時感染によってか、または特定のウイルスの機能をコードするウイル
スゲノムのフラグメントを組み込むかさもなくば安定な形態に維持することによ
って、ウイルスの機能を提供し得る。
用いてBAVゲノムを切断して、E1遺伝子領域配列またはE3遺伝子領域配列
をそれぞれ含むゲノムの左末端または右末端を示すDNAフラグメントを生成し
、そして左末端フラグメントまたは右末端フラグメントをクローニングビヒクル
(例えば、プラスミド)中に挿入し、その後、少なくとも1つの異種DNA配列
を外因性プロモーターの制御を伴うかまたは伴わずに、E1またはE3欠失中に
挿入することによって獲得し得る。組換え発現カセットは、適切な細胞内でBA
Vゲノムと接触し、そして相同組換えまたは他の慣用的な遺伝子操作方法によっ
て、組換えBAVゲノムは得られる。適切な細胞としては、原核生物細胞(例え
ば、E.coliなど)および真核生物細胞の両方が挙げられる。適切な真核生
物細胞の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:MDBK細胞
、アデノウイルスのE1機能を発現するMDBK細胞、初代ウシ胎仔網膜細胞お
よび既に列挙した細胞の機能と等価な機能を発現する細胞。E1領域またはE3
領域を含む制限酵素断片以外のBAVゲノムの制限酵素断片はまた、本発明の実
施に有用であり、そしてクローニングビヒクル中に挿入され得、その結果、異種
配列は、E1を有さないBAV配列およびE3を有さないBAV配列中に挿入さ
れてもよい。次いで、これらのDNA構築物は、上記のような適切な宿主細胞の
形質転換またはトランスフェクションの前かまたは後のいずれかにBAVゲノム
を用いてインビトロまたはインビボで組換えが行われ得る。本発明の目的につい
て、BAVゲノムは、全長ゲノム、または得られた組換えBAVゲノムが複製お
よびパッケージングに必要とされるBAV配列を含む限り、組換えるフラグメン
ト内を欠失した領域以外の領域中に欠失を含むゲノムのいずれかであり得る。上
記の細胞のような原核生物細胞および真核生物細胞におけるトランスフェクショ
ン、細胞培養ならびに組換えのための方法は、当業者に周知である。
または欠失され得る任意のウイルス領域の機能は、そのベクターが欠如する機能
を発現するウイルスとの細胞の同時感染によって(補完細胞株を提供するため)
供給され得る。
、適切な補完細胞株(すなわちヘルパー細胞株)中で増殖されなければならない
。ヒトアデノウイルスにおいて、E4領域(ORF3およびORF6/7)中の
特定のオープンリーディングフレームは、ウイルスの複製に必須である。BAV
−3のE4領域中の類似のオープンリーディングフレームにおける欠失は、ウイ
ルスベクターの増殖のためにヘルパー細胞株の使用を必要とし得る。
子をトランス活性化し、それ故、恒常的にE1タンパク質を発現する細胞株は、
細胞のポリペプチドを正常細胞株よりも高レベルで発現し得る。本発明の組換え
哺乳動物(特にウシ)細胞株を用いて、以下のようなタンパク質を含むポリペプ
チドを調製し、そして単離し得る:(a)アデノウイルスE1Aタンパク質と会
合するタンパク質(例えば、p300、網膜芽細胞腫(Rb)タンパク質、サイ
クリン、キナーゼなど);(b)アデノウイルスE1Bタンパク質と会合するタ
ンパク質(例えば、p53など);(c)増殖因子(例えば、上皮細胞増殖因子
(EGF)、トランスフォーミング増殖因子(TGF)など);(d)レセプタ
ー(例えば、上皮細胞増殖因子レセプター(EGF−R)、線維芽細胞増殖因子
レセプター(FGF−R)、腫瘍壊死因子レセプター(TNF−R)、インスリ
ン様増殖因子レセプター(IGF−R)、主要組織適合遺伝子複合体クラスIレ
セプターなど);(e)プロトオンコジーンによってコードされるタンパク質(
例えば、タンパク質キナーゼ(チロシン特異的タンパク質キナーゼおよびセリン
またはスレオニンに特異的なタンパク質キナーゼ)、p21タンパク質(GTP
ase活性を有するグアニンヌクレオチド結合タンパク質)など);(f)他の
細胞性タンパク質(例えば、アクチン、コラーゲン、フィブロネクチン、インテ
グリン、リンタンパク質、プロテオグリカン、ヒストンなど)、ならびに(g)
転写の調節に関連するタンパク質(例えば、TATAボックス結合タンパク質(
TBP)、TBP随伴因子(TAFs)、Sp1結合タンパク質など)。
レオチドを提供するため、および/または遺伝子変異を誘導もしくは補正するた
めに、哺乳動物(例えば、ウシまたはヒトまたはそれを必要とする他の哺乳動物
)に遺伝子送達を提供する方法を含む。本方法は、例えば、以下を含むがこれら
に限定されない状態の処置において用いられ得る:遺伝性疾患、心臓血管疾患、
およびウイルス感染。本方法は、キャプシドタンパク質、またはそのフラグメン
ト中の改変を含む生きた組換えウシアデノウイルスをこの哺乳動物に投与するこ
とを含み、ここで、このキャプシドタンパク質は親和性と関連し、そしてこの改
変体は変更された親和性と関連し、そしてここで、このアデノウイルスベクター
はさらに、この組換えウイルスベクターのゲノムがこの哺乳動物のゲノムに組み
込まれるか、または独立的かつ染色体外に保持されて、標的器官もしくは組織中
で必要とされる遺伝子の発現を提供する条件下で、欠損のない形態のこの遺伝子
をコードする外来ポリヌクレオチド配列を含む。これらの種類の技術は上述に提
供された例に限定されない種々の疾患状態の処置のために、当業者によって一般
に用いられている。慣用的な遺伝子治療における使用のために組込まれ得る、外
来遺伝子、ヌクレオチド配列またはそれらの部分の例としては、嚢胞性線維症膜
貫通調節遺伝子、ヒトミニジストロフィン(minidystrophin)遺
伝子、α−1−抗トリプシン遺伝子、心臓血管疾患に関連する遺伝子などが挙げ
られる。
これらに限定されない疾患の予防または処置のために意図される:遺伝病(例え
ば、血友病、サラセミア、気腫、ゴシェ病、嚢胞性線維症、デュシェーヌ筋ジス
トロフィー、デュシェーヌミオパシーまたはベッカーミオパシーなど)、癌、ウ
イルス疾患(例えば、AIDS、ヘルペスウイルス感染、サイトメガロウイルス
感染および乳頭腫ウイルス属感染)、心臓血管疾患など。本発明の目的について
、本発明の方法によって調製されたベクター、細胞およびウイルス粒子は、エキ
ソビボ(すなわち、患者から回収された細胞における)または処置される身体へ
直接的にインビボでのいずれかで被験体に導入され得る。
ではない。 (実施例) (実施例1:ヒトファイバー遺伝子を含むBAV600の構築) 変更された親和性を有するBAV−3ベクターを生成するために、BAV−3
のテイルおよびシャフトに融合したHAV−5ファイバーノブを含むキメラファ
イバー遺伝子構築物を、Reddyら、1999(前出)に記載のBAV304
のBAV−3ゲノム中に組込んだ(図3)。野生型BAV−3ファイバー遺伝子
の正確な置換について、先に作製したプラスミドpBAV301.gfp(Re
ddyら、1999)をBAV−3ファイバーの改変のために用いた。得られた
移入ベクターpBAV−301.G5FKは、E3領域、キメラBAV−3/H
AV−5ファイバー遺伝子、およびE4中に挿入したCMVプロモーター駆動性
の緑色蛍光タンパク質(GFP)発現カセットを含んだ。この移入ベクターを用
いて、E.coli BJ5183(Chartierら、1996)における
相同組換えによって、E3欠失BAV−3の感染性プラスミド(p.FBAV3
02(Zakhartchoukら、1998))の骨格中へのGFPカセット
および改変したファイバー遺伝子を組込み、プラスミドpFBAV−600を作
製した。ウイルスゲノムを、PacI消化によってこのプラスミドから遊離し、
そしてこのウイルスゲノムを用いて、細胞株(ATCC登録番号PTA156)
(E1タンパク質を発現するウシ胎仔網膜細胞)にトランスフェクトした(Re
ddyら、1999、前出を参照のこと)。この対応キメラウイルスBAV60
0を、トランスフェクション後21日間産生した。
)のトランスフェクションから得たBAV600を、MDBK細胞中で増大させ
、そしてこのウイルスDNAを感染した細胞から抽出した。このDNAを、制限
酵素BglIIを用いた消化の後、アガロースゲル電気泳動で分析した(図5A
)。図5A〜図5Bに示すように、親のBAV302およびBAV304は両方
とも、ウイルスゲノムの右末端に5.4kbのBglIIフラグメントを有した
。HAV−5ファイバーノブ領域は、BAV600ゲノム内にさらなるBglI
I制限酵素部位を導入する。従って、1.5kbおよび3.9kbの診断用のフ
ラグメントを、BglII消化の後、見出した。HAV−5ファイバーノブプロ
ーブを用いたサザンブロット解析は、BglII消化されたBAV600につい
て予測したハイブリダイゼーションパターンを実証した(図5B)。
パク質の発現およびアセンブリを、免疫沈降アッセイによって試験した。親(B
AV304;Reddyら、1999、前出)およびキメラ(BAV600)の
ウイルス感染されたMDBK細胞の溶解物由来の代謝的に放射性標識された免疫
沈降物を、変性条件下でSDS−PAGEに供した。全長のファイバーを含む野
生型HAV−5をまた解析した。免疫沈降アッセイを、BAV3ファイバーノブ
に特異的なウサギポリクローナル抗体および抗ファイバーモノクローナル抗体(
ID6.14)を用いて実施した。ID6.14抗体は、三量体化したHAV−
5ファイバーノブを認識し、ノブドメインに結合することによってHAV−5を
中和する(Douglasら、1996)。図6に示すように、BAV−3およ
びBAV304ウイルスは、およそ100kDaの大きさを有するファイバータ
ンパク質を含む。これらのファイバータンパク質は、BAV3ファイバーノブに
特異的なウサギポリクローナル抗体と反応する。一方、HAV−5は、およそ6
4kDaの大きさを有するファイバータンパク質を含む。BAV600キメラウ
イルス内のHAV−5ファイバーノブの存在は、HAV−5ノブに特異的なモノ
クローナル抗体ID6.14を用いた免疫沈降解析によって確認した。
イルスBAV304とで比較した。MDBK細胞の単層を用いて決定した生物学
的力価は、BAV−3、BAV304、およびBAV600について、それぞれ
108PFU/ml、106PFU/ml、および105PFU/mlの最大プ
ラーク形成力価を示した。その結果は、ファイバー改変およびE3領域へのGF
Pの挿入がウイルスの細胞産生を有意に変更することを示唆した。
特徴付けるため、FACS解析を実施して、異なるウイルスの投入(input
)での各細胞株の形質導入の割合を決定した(図7A)。T25フラスコ中で増
殖させた細胞を、BAV304またはBAV600のいずれかを用いて1MOI
および5MOIにて感染させた。感染から48時間後、GFP蛍光陽性細胞の割
合を、フローサイトメトリによって決定した。各細胞株の形質導入の割合を定量
し、そしてその画分の用量を図7Bに示す。293細胞は、両方のウイルスを用
いた形質導入に同程度の感受性があった(これは、HAV−5レセプターおよび
BAV−3レセプターが両方とも細胞表面上に存在することを示す)。BAV3
04を用いたHeLa細胞およびHEp−2細胞の形質導入は、用量依存的であ
り、1MOIにてそれぞれ約6%および1%、5MOIにてそれぞれ約25%お
よび5%であった。両方の細胞を、BAV600を用いて効果的に形質導入した
。BAV600を用いた形質導入の割合は、1MOIにてさえ最大のレベルに達
する(HeLaおよびHep−2についてそれぞれ94%および93%)。一方
、BAV600を用いたA549細胞のより低効率の形質導入を観察した。一緒
に取得したこれらのデータは、HAV5ファイバーノブを含むBAV600がヒ
ト細胞株の形質導入においてBAV304ベクターよりも明らかに優れていたこ
とを実証する。
) 臨床的患者におけるHAV−5に対する既存の中和化抗体は、ヒト遺伝子治療
プロトコルにおいてHAV−5の効果的な使用に対して主な障壁を示す。HAV
−5誘導ベクターに対する代替ベクターとしてBAV−3の使用についての可能
性を検討するために、既存の抗HAV−5中和化抗体がまた、BAV−3とも交
差反応性であったかを決定した。臨床患者由来のヒト血清のランダムな105個
のサンプルを試験した。3つ(50番、97番、および102番)が、1:80
0〜1,6000の間で変化するより高い力価のHAV−5中和抗体を含むこと
を見出した。これらの血清を、MDBK細胞におけるBAV−3誘導プラーク形
成を阻害するこれらの能力について試験した。本発明者らのデータは、これらの
HAV−5陽性血清のいずれもが1/50の希釈でBAV−3誘導プラーク形成
に対して影響を示さなかったことを実証した。
して、BAV−3の増殖についての許容度の程度を決定した。各細胞株(HeL
a、HEp−2、293およびA549)のコンフルエントな単層培養物を、1
0MOIにてBAV−3を用いて感染させ、そして感染後の異なる時間間隔での
ウイルス産生を、MDBK細胞の単層における細胞溶解物の滴定によってアッセ
イした。許容MDBK細胞におけるウイルスの増殖は、感染から48時間後には
、予測通り、108pfu/mlの最大収量という結果となった。一方、4つの
ヒト細胞株全てにおけるBAV−3産生のレベルは着実に減少し、このことは、
これらのヒト細胞株においてウイルス複製の完全な欠如が存在することを示唆し
ていた。
3タンパク質の発現) ウイルスタンパク質としては、初期タンパク質(低分子量のE1B(E1B
small)および一本鎖DNA結合タンパク質[DBP])ならびに後期タン
パク質(ペントン塩基およびファイバー)が挙げられる。ヒト細胞株における初
期ウイルスタンパク質および後期ウイルスタンパク質の発現を同定するため、ウ
イルスタンパク質の産生をウェスタンイムノブロット法によって解析した。培養
物を、10MOIにてBAV−3を用いて感染させた。感染後の間隔にて、細胞
抽出物を各培養物から調製し、10%のSDS−PAGE上で分離し、そしてニ
トロセルロースに転写した。ニトロセルロースシート上に固定化した抗原を、低
分子量のE1B、DBP、ペントン塩基、およびファイバーのそれぞれに対する
ウサギポリクローナル抗体の反応によってプローブ化した。予測通り、低分子量
のE1BおよびDBP抗血清は、BAV−3感染MDBK細胞由来の19kDa
および50kDaのバンドとそれぞれ反応した。対照的に、293細胞株を除く
全てのヒト細胞株は、抗低分子量E1Bポリクローナル抗体または抗DBPポリ
クローナル抗体と陽性の反応を示さなかった。どの構造タンパク質も、BAV−
3感染ヒト細胞株から検出されなかった。これらの結果は、本研究において試験
したヒト細胞の大部分においてBAV−3の複製が低分子量のE1Bレベルでブ
ロックされたことを示した。
BAV600の中和化) HAV−5ファイバーノブを保有するBAV600がHAV−5ノブに特異的
な抗体によって中和されるはずだと仮定した。この仮説を確証するために、10
0pfuのBAV−3またはBAV600を含む二連のアリコートを、BAV3
ファイバーノブに特異的なウサギポリクローナル抗体またはHAV−5ファイバ
ーノブドメインに対するモノクローナル抗体(ID6.14)を連続的二倍希釈
をして室温にて2時間インキュベートした。次いで、MDBK細胞を予めインキ
ュベートしたBAV−3ウイルスまたはBAV600ウイルスを用いて感染させ
た。細胞を14日間インキュベートして、完全にCPEを発達させた。これらの
データは、いずれのウイルスも正常なウサギ血清由来の血清またはウシヘルペス
ウイルスgDタンパク質に特異的なコントロールモノクローナル抗体2C8によ
って中和されなかったことを示す。BAV−3およびBAV600をそれぞれ、
BAV3ファイバーノブ(1:800)およびID6.14(1:3,200)
それぞれに特異的なウサギポリクローナル抗体によって中和した。しかし、いず
れのウイルスも、1:50の希釈でさえ相互の抗血清によって中和されなかった
。このことは、BAV600がHAV−5ファイバーノブを保有することをさら
に確証した。
ついてのポリヌクレオチド配列において、ペントン領域は、12919で開始し
、そして14367で終了する:ヘキソン領域は、17809で開始し、そして
20517で終了する;ファイバー領域は、27968で開始し、そして308
98で終了する。ファイバー領域のノブドメインは、図4に示されるように、4
残基(TLWT)後に開始する。
、BAV3ゲノムの転写マップを示す。
物を示す。
。図5Aは、ゲル電気泳動を示し、そして図5Bは、サザンブロットを示す。
、1のMOIでの結果を示し、一方、図7Bは、5のMOIでの結果を示す。
CS分析を示す。
細胞およびMDBK細胞)における初期BAV−3タンパク質および後期BAV
−3タンパク質の発現を示す。
体によるBAV600の中和を示す。
てのアミノ酸配列を示す。
いてのアミノ酸配列を示す。
を示す。
ミノ酸配列を示す。
ミノ酸配列を示す。
々の哺乳動物アデノウイルスファイバー領域のアミノ酸整列を示す。
Claims (63)
- 【請求項1】 キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードする
ポリヌクレオチド中に改変を含むウシアデノウイルスベクターであって、ここで
該キャプシドタンパク質またはそのフラグメントは、親和性と関連し、ここで該
改変は、変化した親和性と関連する、ウシアデノウイルスベクター。 - 【請求項2】 請求項1に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
前記キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチ
ドが、異種哺乳動物キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードする
ポリヌクレオチドと置換されている、アデノウイルスベクター。 - 【請求項3】 請求項1に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
前記キャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、ペントンタンパク質また
はそのフラグメントである、アデノウイルスベクター。 - 【請求項4】 請求項1に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
前記キャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、ヘキソンタンパク質また
はそのフラグメントである、アデノウイルスベクター。 - 【請求項5】 請求項1に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
前記キャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、ファイバータンパク質ま
たはそのフラグメントである、アデノウイルスベクター。 - 【請求項6】 請求項5に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
前記改変がファイバータンパク質のノブ領域にある、アデノウイルスベクター。 - 【請求項7】 請求項3に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
前記ウシアデノウイルスペントン領域またはそのフラグメントが、少なくとも1
つの異種哺乳動物ペントンアデノウイルス領域またはそのフラグメントで置換さ
れている、アデノウイルスベクター。 - 【請求項8】 請求項4に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
前記ウシアデノウイルスヘキソン領域またはそのフラグメントが、少なくとも1
つの異種哺乳動物アデノウイルスヘキソン領域またはそのフラグメントで置換さ
れている、アデノウイルスベクター。 - 【請求項9】 請求項5に記載のアデノウイルスベクターであって、ここで
前記ウシアデノウイルスファイバー領域またはそのフラグメントが、少なくとも
1つの異種哺乳動物アデノウイルスファイバー領域またはそのフラグメントで置
換されている、アデノウイルスベクター。 - 【請求項10】 請求項2に記載のアデノウイルスベクターであって、前記
異種哺乳動物アデノウイルスキャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、
ブタアデノウイルスキャプシドタンパク質、ヒツジアデノウイルスキャプシドタ
ンパク質、イヌアデノウイルスキャプシドタンパク質またはヒトアデノウイルス
キャプシドタンパク質あるいはそれらのフラグメントを含む、アデノウイルスベ
クター。 - 【請求項11】 請求項10に記載のアデノウイルスベクターであって、前
記異種哺乳動物アデノウイルスキャプシドタンパク質またはそのフラグメントが
、ヒトアデノウイルスキャプシドタンパク質またはそのフラグメントである、ア
デノウイルスベクター。 - 【請求項12】 請求項1に記載のアデノウイルスベクターであって、ここ
でアデノウイルスが、アデノウイルスサブタイプ1型である、アデノウイルスベ
クター。 - 【請求項13】 請求項1に記載のアデノウイルスベクターであって、ここ
でアデノウイルスが、アデノウイルスサブタイプ2型である、アデノウイルスベ
クター。 - 【請求項14】 前記アデノウイルスベクターがBAV3である、請求項1
2に記載のアデノウイルスベクター。 - 【請求項15】 請求項14に記載のアデノウイルスベクターであって、こ
こで前記改変が、異種哺乳動物アデノウイルスベクターファイバータンパク質ま
たはそのフラグメントによるBAV3ファイバータンパク質またはそのフラグメ
ントの置換である、アデノウイルスベクター。 - 【請求項16】 請求項15に記載のアデノウイルスベクターであって、前
記哺乳動物アデノウイルスファイバータンパク質またはそのフラグメントが、ブ
タアデノウイルスファイバータンパク質、ヒツジアデノウイルスファイバータン
パク質、イヌアデノウイルスファイバータンパク質またはヒトアデノウイルスフ
ァイバータンパク質を含む、アデノウイルスベクター。 - 【請求項17】 請求項16に記載のアデノウイルスベクターであって、こ
こで前記哺乳動物アデノウイルスファイバータンパク質が、ヒトアデノウイルス
ファイバータンパク質である、アデノウイルスベクター。 - 【請求項18】 請求項1に記載のアデノウイルスベクターであって、ここ
で該ベクターが、E1機能を欠く、アデノウイルスベクター。 - 【請求項19】 請求項18に記載のアデノウイルスベクターであって、こ
こで該ベクターが、前記E1遺伝子領域の一部または全ての欠損を有する、アデ
ノウイルスベクター。 - 【請求項20】 請求項1に記載のアデノウイルスベクターであって、ここ
で該ベクターが、E3遺伝子領域の一部または全ての欠損を有する、アデノウイ
ルスベクター。 - 【請求項21】 請求項1に記載のアデノウイルスベクターであって、ここ
で該ベクターがさらに、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、
アデノウイルスベクター。 - 【請求項22】 請求項21に記載のアデノウイルスベクターであって、前
記異種タンパク質が、以下: サイトカイン;リンホカイン;病原性生物により認識される膜レセプター、ジ
ストロフィン;インスリン;細胞イオンチャネルに関与するタンパク質;アンチ
センスRNA;病原性遺伝子によって産生されるタンパク質の活性を阻害し得る
タンパク質、酵素活性を阻害するタンパク質、病原性タンパク質のタンパク質改
変体;抗原性エピトープ;主要組織適合遺伝子複合体クラスIタンパク質および
主要組織適合遺伝子複合体クラスIIタンパク質;抗体;免疫毒素;毒素;成長
因子または成長ホルモン;細胞レセプターまたは細胞レセプターのリガンド;腫
瘍サプレッサー;細胞性酵素;または自殺遺伝子 を含む、アデノウイルスベクター。 - 【請求項23】 請求項22に記載のアデノウイルスであって、ここで前記
異種タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、アデノウイルスE1遺伝
子領域中に挿入されている、アデノウイルス。 - 【請求項24】 請求項22に記載のアデノウイルスであって、ここで前記
異種タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、アデノウイルスE3遺伝
子領域中に挿入されている、アデノウイルス。 - 【請求項25】 該ベクターが複製能を有する、請求項1に記載のアデノウ
イルスベクター。 - 【請求項26】 該ベクターが複製欠損性である、請求項1に記載のアデノ
ウイルスベクター。 - 【請求項27】 請求項1に記載のウシアデノウイルスベクターを含む、宿
主細胞。 - 【請求項28】 請求項21に記載のウシアデノウイルスベクターを含む、
宿主細胞。 - 【請求項29】 キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードす
るポリヌクレオチド中に改変を含む組換えウシアデノウイルスベクターを産生す
る方法であって、該方法は、ウシアデノウイルスベクターを得る工程;およびキ
ャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド中に
改変を導入する工程を包含し、ここで該キャプシドタンパク質またはそのフラグ
メントは、親和性と関連し、該改変が、変化した親和性と関連する、方法。 - 【請求項30】 請求項29に記載の方法であって、ここで前記キャプシド
タンパク質またはそのフラグメントが、ペントンタンパク質またはそのフラグメ
ントである、方法。 - 【請求項31】 請求項29に記載の方法であって、ここで前記キャプシド
タンパク質またはそのフラグメントが、ヘキソンタンパク質またはそのフラグメ
ントである、方法。 - 【請求項32】 請求項29に記載の方法であって、ここで前記キャプシド
タンパク質またはそのフラグメントが、ファイバータンパク質またはそのフラグ
メントである、方法。 - 【請求項33】 請求項29に記載の方法であって、ここで前記アデノウイ
ルスベクターが、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、
方法。 - 【請求項34】 前記ウシアデノウイルスが、サブタイプ1型のウシアデノ
ウイルスである、請求項29に記載の方法。 - 【請求項35】 キャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードす
るポリヌクレオチド中に改変を含む組換えウシアデノウイルスであって、ここで
該キャプシドタンパク質またはそのフラグメントは、親和性に関し、そして該改
変は、変化した親和性に関する、組換えウシアデノウイルス。 - 【請求項36】 異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含
む、請求項35に記載の組換えアデノウイルス。 - 【請求項37】 請求項36に記載の組換えアデノウイルスであって、ここ
で前記異種タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、アデノウイルスE
1遺伝子領域中に挿入されている、組換えアデノウイルス。 - 【請求項38】 請求項36に記載の組換えアデノウイルスであって、ここ
で前記異種タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、アデノウイルスE
3遺伝子領域中に挿入されている、組換えアデノウイルス。 - 【請求項39】 請求項35に記載の組換えアデノウイルスであって、ここ
で前記キャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、ペントンタンパク質ま
たはそのフラグメントである、組換えアデノウイルス。 - 【請求項40】 請求項35に記載の組換えアデノウイルスであって、ここ
で前記キャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、ヘキソンタンパク質ま
たはそのフラグメントである、組換えアデノウイルス。 - 【請求項41】 請求項35に記載の組換えアデノウイルスであって、ここ
で前記キャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、ファイバータンパク質
またはそのフラグメントである、組換えアデノウイルス。 - 【請求項42】 請求項41に記載の組換えアデノウイルスであって、ここ
で前記改変が、ファイバータンパク質のノブ領域中にある、組換えアデノウイル
ス。 - 【請求項43】 ウシアデノウイルスを含む免疫原性組成物であって、ここ
で該アデノウイルスは、キャプシドタンパク質またはそのフラグメント中の改変
をコードするポリヌクレオチドを含み、そして該タンパク質またはフラグメント
は、親和性と関連し、そして該改変は、変化した親和性と関連する、免疫原性組
成物。 - 【請求項44】 請求項43に記載の免疫原性組成物であって、ここで前記
キャプシドタンパク質が、ペントンタンパク質またはそのフラグメントである、
免疫原性組成物。 - 【請求項45】 請求項43に記載の免疫原性組成物であって、ここで前記
キャプシドタンパク質が、ヘキソンタンパク質またはそのフラグメントである、
免疫原性組成物。 - 【請求項46】 請求項43に記載の免疫原性組成物であって、ここで前記
キャプシドタンパク質が、ファイバータンパク質またはそのフラグメントである
、免疫原性組成物。 - 【請求項47】 請求項46に記載の免疫原性組成物であって、ここで前記
キャプシドタンパク質またはそのフラグメントが、ファイバータンパク質のノブ
ドメインである、免疫原性組成物。 - 【請求項48】 請求項43に記載の免疫原性組成物であって、ここで前記
改変が、哺乳動物アデノウイルスファイバータンパク質またはそのフラグメント
によるウシファイバータンパク質またはそのフラグメントの置換である、免疫原
性組成物。 - 【請求項49】 請求項48に記載の免疫原性組成物であって、ここで前記
哺乳動物ファイバータンパク質が、ヒトアデノウイルスファイバータンパク質で
ある、免疫原性組成物。 - 【請求項50】 前記ウシアデノウイルスが、サブタイプ1型アデノウイル
スである、請求項43に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項51】 前記ウシアデノウイルスが、BAV3である、請求項50
に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項52】 請求項43に記載の免疫原性組成物であって、ここで前記
ウシアデノウイルスが、異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、
免疫原性組成物。 - 【請求項53】 哺乳動物被験体において免疫応答を誘導し得る薬学的組成
物であって、請求項52に記載の免疫原性組成物を含む、薬学的組成物。 - 【請求項54】 薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項53に記
載の薬学的組成物。 - 【請求項55】 感染を防御するために哺乳動物宿主において免疫応答を惹
起する方法であって、請求項54に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含す
る、方法。 - 【請求項56】 請求項55に記載の方法であって、前記タンパク質が、以
下: サイトカイン;リンホカイン;病原性生物により認識される膜レセプター、ジ
ストロフィン;インスリン;細胞イオンチャネルに関与するタンパク質;アンチ
センスRNA;病原性遺伝子によって産生されるタンパク質の活性を阻害し得る
タンパク質、酵素活性を阻害するタンパク質、病原性タンパク質のタンパク質改
変体;抗原性エピトープ;主要組織適合遺伝子複合体クラスIタンパク質および
主要組織適合遺伝子複合体クラスIIタンパク質;抗体;免疫毒素;毒素;成長
因子または成長ホルモン;細胞レセプターまたは細胞レセプターのリガンド;腫
瘍サプレッサー;細胞性酵素;または自殺遺伝子 を含む、方法。 - 【請求項57】 哺乳動物宿主における遺伝子送達の方法であって、該方法
は、改変されたキャプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードするポリ
ヌクレオチドを含むウシアデノウイルスベクターを、該宿主に投与する工程を包
含し、ここで該タンパク質は、親和性と関連し、そして該改変は、変化した親和
性と関連し、そして該アデノウイルスベクターは、異種タンパク質をコードする
ポリヌクレオチドをさらに含む、方法。 - 【請求項58】 前記異種ポリヌクレオチドが治療タンパク質をコードする
、請求項57に記載の方法。 - 【請求項59】 請求項57に記載の方法であって、ここで前記キャプシド
タンパク質またはそのフラグメントが、ペントンタンパク質またはそのフラグメ
ントである、方法。 - 【請求項60】 請求項57に記載の方法であって、ここで前記キャプシド
タンパク質またはそのフラグメントが、ヘキソンタンパク質またはそのフラグメ
ントである、方法。 - 【請求項61】 請求項57に記載の方法であって、ここで前記キャプシド
タンパク質またはそのフラグメントが、ファイバータンパク質またはそのフラグ
メントである、方法。 - 【請求項62】 前記改変が、ファイバータンパク質のノブ領域中にある、
請求項61に記載の方法。 - 【請求項63】 請求項57に記載の方法であって、ここで前記哺乳動物宿
主が、ヒトであり、そして前記改変が、ヒトファイバータンパク質またはそのフ
ラグメントによるウシアデノウイルスファイバータンパク質またはそのフラグメ
ントの置換である、方法。
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