KR20090038910A - 재조합 아데노바이러스 벡터의 조직 향성을 증가시키기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

재조합 아데노바이러스 벡터의 조직 향성을 증가시키기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 아데노바이러스에 제2의 섬유를 제공하는 재조합 세포를 사용함으로써 재조합 아데노바이러스의 향성(tropism)을 변경하는 것을 포함하는, 재조합 아데노바이러스의 조직 향성을 증가시키기 위한, 방법, 조성물 및 용도에 관한 것이다.

Description

재조합 아데노바이러스 벡터의 조직 향성을 증가시키기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR INCREASING TISSUE TROPISM OF RECOMBINANT ADENOVIRAL VECTORS}
본 발명은 재조합 아데노바이러스에 제2의 섬유를 제공하는 재조합 세포를 사용함으로써 재조합 아데노바이러스의 향성을 변경시키는 것을 포함하는, 재조합 아데노바이러스의 조직 향성(tropism)을 증가시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 변경된 향성을 갖는 재조합 아데노바이러스를 제조하는 방법 및 그것을 이용하는 방법에 관한 것이다.
아데노바이러스는 가축 및 실험용 동물에 있어서 뿐만 아니라 인간에 있어서 장 또는 호흡기 감염을 일으킨다. 아데노바이러스 섬유 단백질은 감수성 숙주 세포내로의 도입(entry)을 용이하게 하는 특이적 세포 수용체와 상호작용함으로써 바이러스 부착에 필수적 역할을 한다. 따라서, 그 섬유 단백질은 특정한 아데노바이러스의 특이적 조직 향성을 결정한다(Chroboczek et al, 1995). 그러므로, 그 섬유는 표적 세포로의 비리온 부착에 있어서 가장 중요한 바이러스 표면 분자로 인식되고 있다.
이러한 표적화 특성을 이용하기 위해서, 특정한 인간 아데노바이러스에 의해 운반된 섬유 단백질을 변화시키는데 몇몇 방법이 이용되어 왔다. 몇몇 접근법은 변형된 섬유 구조를 지닌 재조합 아데노바이러스(Wickham et al, 1997; Dimitriev et al, 1998; Wirtz et al, 1999), 단쇄 항체(scFv) (Watkins et al, 1997; Douglas et al, 1999), 키메라 섬유 단백질(Krasnykh et al, 1996; Stevenson et al, 1997) 및 다른 혈청형의 섬유 단백질의 교환(Gall et al, 1996)을 이용하는 것을 포함하여, 아데노바이러스 입자를 다른 세포 유형에 재표적화시키는데 수행되어 왔다. 이들 접근법은 바이러스 게놈 내로 외래 유전자를 혼입하기 위한 이미 제한된 이용가능한 공간을 감소시키는 아데노바이러스 게놈의 유전자 조작을 필요로 하거나, 또는 이중특이적 결합체(cojugate)를 아데노바이러스 입자와 결합시키는 것을 필요로 한다.
다른 접근법을 이용하면, 문헌(Von Seggern, et al. (1998))은 인간 아데노바이러스 혈청형 5 (HAdV5) 섬유 단백질을 안정하게 발현하는 세포주를 작제하였다. 이 세포주를 통해 HAdV3를 계대배양한 후, 바이러스 입자는 혈청형 5 섬유 단백질을 함유하였다. 이 세포주 중에서 섬유 결함 돌연변이체 HAdV의 성장은 섬유 양성 인간 아데노바이러스의 발생을 허용하였다.
추가로, 다수의 조절 유전자 중에서 결실부를 지닌 아데노바이러스 벡터의 상보성(complementation)을 가능하게 하는 유전자를 발현하는 세포주가 또한 보고되어 있다(Wang et al, 1995; Amalfitano et al, 1996; Amalfitano et al, 1997).
섬유-유도된 표적화에 대해 지금까지 공개된 논문들은 모두 아데노바이러스를 한 가지 특이적 표적 조직 유형으로부터 다른 특이적 표적 조직으로 재유도하는 것에 역점을 둔 것으로 보이며, 일부 경우에는 아데노바이러스가 부착할 수 있는 표적 세포를 크게 제한하는 것에 역점을 두는 것으로 보인다. 추가의 방법들이 재조합 아데노바이러스가 결합할 수 있는 동물에서 표적 조직 유형을 보다 넓히는데 여전히 필요하다. 그러한 방법들은 특정한 항원에 대해 발생되는 면역 반응의 양 및/또는 질, 또는 면역조절 분자의 치료적 효과를 증가 또는 상향 조절하는데 유용할 수 있다.
발명의 개요
본 발명은 재조합 아데노바이러스 게놈 내로 제2의 섬유 유전자를 유전자적으로 삽입할 필요 없이 재조합 아데노바이러스 벡터로의 제2의 섬유의 부가를 제공하기 위해 섬유 단백질을 발현하는 세포주를 이용한 것이다. 그와 같이 할 때, 그 세포 및 이를 사용하는 방법은 특정한 아데노바이러스의 특이적 조직 향성의 증가를 허용한다. 또한, 제2의 유전자가 재조합 아데노바이러스 내로 유전자적으로 삽입될 필요가 없다는 사실은 바이러스 외래 유전자의 삽입에 사용하고자 하는 바이러스 게놈 내에 보다 큰 공간을 허용한다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 아데노바이러스를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터로서, 상기 아데노바이러스는 그 아데노바이러스에 천연인(native) 섬유 유전자를 포함하고 추가로 그 아데노바이러스에 이종인 제2의 섬유 유전자를 포함하며, 상기 제2의 섬유 유전자는 그 제2의 섬유 유전자를 안정하게 발현하는 세포주 중에서 상기 재조합 아데노바이러스를 성장시킴으로써 재조합 아데노바이러스에 의해 획득되는 것인 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 그 아데노바이러스 벡터는 돼지류, 인간, 조류, 소류, 말류 및 양류 아데노바이러스로 구성되는 군으로부터 선택된 아데노바이러스 벡터(이들에 국한되는 것은 아님)를 비롯한 임의의 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 해당 기술 분야의 당업자는 다수의 아데노바이러스 혈청형이 있다는 것을 잘 알고 있으며, 본 발명에 사용하기 위한 아데노바이러스 벡터가 임의의 특이적 혈청형에 국한되는 것이 아니라는 것을 이해해야 한다. 본 발명은 특히 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물에 고려한 것이다. 그러한 조성물은 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물이다.
구체적인 실시태양에서, 아데노바이러스는 재조합 돼지류 아데노바이러스 혈청형(PAdV-1), 재조합 PAdV-2, 재조합 PAdV-3, 재조합 PAdV-4 및 재조합 PAdV-5, 재조합 PAdV-6 및 재조합 PAdV-7로 구성되는 군으로부터 선택된 재조합 돼지류 아데노바이러스일 수 있다. 돼지류 아데노바이러스 혈청형 PAdV-1 내지 PAdV-5는 해당 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 잘 특성화되어 있다. PAdV-6 및 PAdV-7도 또한 존재하며 특성화되어 있다(Kadoi et al., New Microbiol., 20:215-220, 1997; and Kadoi, New Microbiol., 20:89- 91, 1997). 바람직한 실시태양에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 재조합 PAdV-3이다.
다른 실시태양에서, 아데노바이러스는 재조합 HAdV, 재조합 소류 아데노바이러스 (BAdV), 재조합 양류 아데노바이러스 (OAdV), 재조합 쥐류 아데노바이러스 (MAdV), 재조합 원숭이류 아데노바이러스 (SAdV) 또는 재조합 개류 아데노바이러스 (CAdV)이다.
본 발명의 구체적인 재조합 아데노바이러스 벡터에서, 제2의 섬유 단백질은 PAdV-1, PAdV-2, PAdV-3, PAdV-4 및 PAdV-5로부터 선택된 섬유 단백질이다.
본 발명의 특정한 양태에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 제1 또는 제2의 섬유 단백질과는 상이한 제3의 섬유 단백질을 추가로 포함하는 아데노바이러스 벡터 (예를 들어, PAdV-기초한 벡터)이다.
바람직한 양태에서, 재조합 벡터 중에서 제2의 섬유 단백질은 PAdV-4로부터의 섬유 단백질을 포함한다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터는 복제 가능형 또는 복제 결함형일 수 있다. 예를 들어, 복제 결함형 벡터는 PAdV 게놈의 필수 영역에 삽입된 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 PAdV이며, 섬유 유전자를 안정하게 발현하는 세포주는 또한 이종 뉴클레오티드 서열이 삽입된 PAdV 게놈의 필수 영역을 발현한다.
복제 가능형인 예시적 재조합 아데노바이러스 벡터는 재조합 아데노바이러스가 아데노바이러스 게놈의 비-필수 영역에 삽입된 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것들이다. 이종 뉴클레오티드 서열은, 일부 실시태양에서, 면역조절물질(immunomodulator), 항원, 병원체, 면역원성 폴리펩티드, 치료적 폴리펩티드, 성장 호르몬 및 사이토카인으로 구성되는 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 이종 유전자일 수 있다.
본 발명의 또다른 양태는 아데노바이러스를 포함하는 숙주 세포로서, 상기 아데노바이러스는 그 돼지류 아데노바이러스에 천연인 섬유 유전자를 포함하고, 상기 숙주 세포는 그 아데노바이러스에 이종인 섬유 유전자를 발현하고, 돼지류 아데노바이러스에 의해 감염될 수 있는 재조합 세포인 것인 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 포유류 세포 또는 조류 세포일 수 있다. 예시적 포유류 세포는 돼지류 세포, 인간 세포, 소류 세포 및 양류 세포를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 특정한 양태에서, 세포는 재조합 돼지류 세포이다.
본 발명의 또다른 양태는 포유류 대상에서 면역 반응을 유도할 수 있는 조성물로서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 포유류에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 그 포유류 대상에게 그러한 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 기재하고 있다. 예를 들어, 포유류 대상은 돼지(pig)이다.
본 발명은 또한 아데노바이러스의 제조 방법으로서, 아데노바이러스 섬유 유전자를 발현하는 재조합 숙주 세포를, 그 세포를 아데노바이러스로 감염시키기에 적합한 조건하에 배양시키는 단계, 상기 세포를, 캡시드화(encapsidation)에 필수적인 아데노바이러스 서열(들), 및 이종 단백질을 코딩하는 이종 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터와 접촉시키는 단계로서, 재조합 아데노바이러스는 상기 숙주 세포 중의 섬유 유전자와는 다른 섬유 유전자를 포함하는 것인 단계, 및 임의로 아데노바이러스를 수확하는 단계를 포함하는 아데노바이러스의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적인 실시태양에서, 이종 단백질은 면역조절물질, 항원, 병원체, 면역원성 폴리펩티드, 치료적 폴리펩티드, 성장 호르몬 및 사이토카인으로 구성되는 군으로부터 선택된 단백질이다.
특정한 실시태양에서, 이러한 방법은 수확된 아데노바이러스 벡터가 재조합 숙주 세포와 접촉되지 않은 아데노바이러스 벡터와 비교될 때 보다 넓은 조직 특이성을 갖게 되는 것이다.
또한, 상기 언급된 방법에서, 아데노바이러스 벡터는 복제에 비필수적인 하나 이상의 아데노바이러스 단백질의 일부 또는 전부에서 임의로 결실될 수 있다.
본 발명은 또한 감염으로부터 포유류 숙주를 보호하는 백신으로서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 벡터 및 임의로 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 백신에 관한 것이다. 구체적인 실시태양에서, 비-필수 영역은 E3 영역, E4의 ORF 1-2 및 4-7, E4의 말단과 돼지류 아데노바이러스 게놈의 ITR 사이의 영역으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명에는 또한 아데노바이러스 섬유 유전자를 발현하는 숙주 세포, 및 발현 조절 서열의 조절하에 이종 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 재조합 아데노바이러스 벡터는 그 벡터의 아데노바이러스에 천연인 섬유 유전자를 포함하는 것인 조성물이 기재되어 있다. 바람직한 양태에서, 그 숙주 세포는 재조합 돼지류 아데노바이러스 벡터에 의해 감염된 것이다.
추가로, 본 발명은 치료 방법, 예를 들면 동물에게 치료적 유효량의 본 명세서에 설명된 백신을 투여하는 단계를 포함하는 동물의 백신투여 방법과 같은 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 방법은 재조합 아데노바이러스 벡터의 숙주 조직 세포 특이성을 증가시키는 방법으로서, 그 재조합 아데노바이러스의 섬유 단백질과 상이한 제2의 섬유 단백질을 포함하는 숙주 세포 중에서 그 재조합 아데노바이러스를 성장시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 그러한 방법에서, 재조합 아데노바이러스 벡터는 재조합 PAdV-1, 재조합 PAdV-2, 재조합 PAdV-3, 재조합 PAdV-4 및 재조합 PAdV-5로부터 선택된 재조합 PAdV일 수 있다. 제2의 섬유 단백질은 PAdV-1, PAdV-2, PAdV-3, PAdV-4 및 PAdV-5로부터 선택된 섬유 단백질인 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에서, 재조합 PAdV는 제1 또는 제2의 섬유 단백질과는 다른 제3의 섬유 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
재조합 아데노바이러스 벡터의 숙주 조직 세포 특이성을 증가시키는 바람직한 방법에서, 사용된 재조합 PAdV는 재조합 PAdV-3이다. 특정한 실시태양에서, 그러한 재조합 PAdV-3는 PAdV-4로부터의 섬유 단백질을 포함한다. 이러한 방법에서, 재조합 PAdV는 복제 가능형 또는 결함형일 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 재조합 PAdV는 PAdV 게놈의 비필수 영역내로 삽입된 이종 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예시적 실시태양에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 면역조절물질, 항원, 병원체, 면역원성 폴리펩티드, 치료적 폴리펩티드, 성장 호르몬 및 사이토카인으로 구성되는 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자이다.
본 발명의 다른 특징 및 잇점은 하기 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 해당 기술 분야의 당업자라면, 하기 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 실시태양을 나타내는 것으로 단지 예시의 목적으로만 제시되어 있다는 점을 이해해야 하는데, 그 이유는 본 발명의 사상 및 영역 내에 속하는 다양한 변경예 및 변형예가 그러한 상세한 설명으로부터 명백하게 이해할 수 있기 때문이다.
도면의 간단한 설명
하기 도면은 본 명세서의 일부를 구성하며, 본 발명의 양태를 보다 상세히 설명하기 위하여 포함된 것이다. 본 발명은 본 명세서에서 제시된 구체적인 실시태양의 상세한 설명과 함께 도면을 참조함으로써 더욱 잘 이해할 수 있을 것이다.
도 1. PAdV-4 섬유 유전자를 함유하는 플라스미드의 작제. a) PAdV-4 섬유 유전자를 PCR에 의해 PAdV-4 DNA로부터 증폭시키고, pGEM-T(Promega)내로 클로닝하여 플라스미드 pJJ392를 결과로 형성시켰다. b) PAdV-4 섬유 유전자를 포함하는 pJJ392로부터의 BamHI/BglII 단편을, 인간 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터-인핸서 (CMV) 프로모터 및 PAV-3 TPL 서열의 하류에 있는 플라스미드 pCI-PAdV-3 트리파르타이트 리더 (TPL)의 BamHI 부위로 삽입하여 pJJ741을 결과로 형성시켰다. c) PAdV-3TPL 및 PAdV-4 섬유 유전자를 함유하는 pJJ741의 NheI/Notl 단편을 pCI-neo(Promega)로 삽입함으로써 트랜스퍼 벡터 pJJ743을 작제하였다.
도 2. 세포주 중의 PAdV-4 섬유 DNA의 PCR 검출. 형질감염된 세포로부터의 게놈 DNA를 정제하고, PAdV-4 섬유 유전자의 존재에 대해 PCR로 테스트하였다. a) 레인 1 = PK15 클론 8, 레인 2 = PK15 클론 9, 레인 3 = pJJ743 대조군, M = 1Kb DNA 래더, b) 레인 1-5 = ST 클론 2-6, 레인 6 = 비형질감염된 ST DNA, 레인 7 = PADV-4 DNA, 레인 8 = pJJ743 대조군, c) 레인 9-15 = ST 클론 7-14, M = 1Kb DNA 래더.
도 3. 세포주로부터 PAdV-4 섬유 mRNA의 역전사 PCR (RT-PCR) 검출. 형질감염된 세포로부터 총 RNA를 준비하고, PCR에 의해 PAdV-4 섬유 유전자에 대하여 양성으로 나타난 클론을 RT-PCR에 의해 PAdV-4 섬유 mRNA 합성에 대해 테스트하였다. a) 레인 1 = PK15 클론 8, 레인 2= PK15 클론 9, M = 1Kb DNA 래더, b) 레인 1-6 = ST 클론 2,3,5,6,7 및 8, M = 1Kb DNA 래더.
도 4. PAdV-3 및 PAdV-4 섬유 단백질의 완전 아미노산 서열 및 펩티드 위치. 래빗 항-혈청을 발생시키기 위해 사용된 공통적 및 특이적 펩티드의 서열을 굵은 선으로 돋보이게 하고 밑줄을 그어 나타내었다(Reddy et al., 1995; Kleiboeker 1995).
도 5. 변형 백신 중의 PAdV-3 및 PAdV-4 섬유의 입증. 재조합 PAdV-글리코프로테인 55 (gp55)을 PKl5A 세포 (비변형) 또는 PK743 세포 (변형) 중에서 성장시켰다. 복제 바이러스 샘플 중에 존재하는 단백질을 SDS/PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로즈 상으로 블롯팅 처리하고, 공통적 섬유 펩티드에 대해 유발된 래빗 항체 (패널 a) 또는 PAdV-4 특이적 섬유 펩티드에 대해 유발된 래빗 항체 (패널 b)로 염색하였다. 레인 1 = 비변형 바이러스, 레인 2 = 변형 바이러스. 고범위 분자량 마커, 섬유 단백질의 위치 및 대략적인 분자량을 나타내었다.
도 6. 항원투여 후 돼지의 체온. 제0일째에는 돼지에게 백신투여하고, 제22일째에는 추가항원자극 투여량(booster dose)을 투여하였다. 제49일째에는 돼지를 CSFV(Classical swine fever virus)로 항원투여하였다. CSFV 항원투여를 수행한 후 각 돼지의 직장내 온도를 매일 측정하였다. 각 군의 돼지에 대한 평균 온도 및 표준 편차 막대를 나타내었다. ◆ = 비변형 rPAdV-gp55 s/c, ■ = 변형 rPAdV-gp55 s/c, ▲ = 비변형 rPAdV-gp55 oral, □ = 대조군, + = 안락사 처리함.
도 7. 백신투여 후 NPLA 역가. 제0일째에는 돼지에게 백신투여하고, 제22일째에는 추가항원자극 투여량을 투여하였다. 제49일째에는 돼지를 CSFV로 항원투여하였다. 제0일째에는 전혈 샘플을 채취한 후에 일주일 간격으로 NPLA 항체 존재 여부에 대한 혈청 검정을 실시하였다. 백신투여된 군에 대한 평균 NPLA 역가를 나타내었다. ▒ = 비변형 rPAdV-gp55 s/c, □ = 변형 rPAdV-gp55 s/c, ■ = 변형 rPAdV-gp55 oral. ↓ = 백신투여.
도 8. 경구 백신투여된 돼지에서 CSFV 특이적 중화 항체의 발생. 제0일째에는 돼지에게 경구 백신투여하고, 제22일째에는 추가항원자극 투여량을 투여하였다. 제49일째에는 돼지를 CSFV로 항원투여하였다. 제0일째에는 전혈 샘플을 채취한 후에 일주일 간격으로 NPLA 항체 존재 여부에 대한 혈청 검정을 실시하였다. 백신투여된 군에 대한 평균 NPLA 역가를 나타내었다. □ = 비변형 rPAdV-gp55*, ▒ = 변형 rPAdV-gp55. * = 별도의 실험 데이터 (Hammond et al., 2003). ↓ = 백신투여.
도 9. 백신투여된 돼지에서 CSFV 특이적 중화 항체의 발생의 비교. 제0일째에는 돼지에게 경구 백신투여하고, 제22일째에는 추가항원 자극 투여량을 투여하였다. 돼지를 제49일에 CSFV로 항원투여하였다. 제0일째에는 전혈 샘플을 채취한 후에 일주일 간격으로 NPLA 항체 존재 여부에 대한 혈청 검정을 실시하였다. 백신투여된 군에 대한 평균 NPLA 역가를 나타내었다. ↓ = 백신투여, s/c = 비변형 백신 피하 투여, mod s/c = 변형 백신 피하 투여, oral = 비변형 백신 경구 투여*, mod oral = 변형 백신 경구 투여. * = 별도의 실험 데이터 (Hammond et al., 2003).
도 10. 돼지의 비장에서 CSFV 항원 검출. 사후 검시를 수행한 후, 비장 샘플을 CSFV 항원의 존재 여부에 대해 항원 포획 ELISA로 검정하였다. 군들에 대한 평균 항원 역가를 나타내었다. Pos = 양성 대조군 비장 샘플, neg = 음성 대조군 비장 샘플, + = 안락사 처리됨.
본 발명의 예시적 실시양태에 관한 상세한 설명
본 발명은 개선된 아데노바이러스 벡터의 발견 및 작제에 관한 것이다. 본 명세서에 기술된 방법과 조성물이 모델 시스템으로서 돼지류 아데노바이러스 벡터를 이용하여 예시되어 있긴 하지만, 본 발명의 방법은 돼지를 제외한 숙주를 감염시키는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하는데 사용하기 위해 쉽게 적용될 수 있다는 점을 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 본 발명의 방법 및 조성물은 재조합 아데노바이러스 벡터의 향성을 변경시키는데 사용되며, 그로써 벡터가 정상적으로 감염시키지 않는 조직을 표적화하는 벡터의 유용성을 증가시킨다. 본 발명에서는, 제2의 섬유 유전자를 발현하는 세포주 중에서 재조합 아데노바이러스 벡터를 성장시킴으로써 그러한 제2의 섬유 유전자가 재조합 아데노바이러스에 제공되며, 그러한 세포주 중에서의 성장은 재조합 아데노바이러스 벡터의 향성의 변경과 관련이 있다. 재조합 아데노바이러스가 증식되는 세포주에 함유된 제2의 섬유는 아데노바이러스가 세포주 내의 섬유 유전자가 특이적인 조직을 감염시키는 것을 허용한다. 이러한 발견을 이용하기 위한 방법 및 조성물은 본 발명에 고려된다.
본 명세서에서 "아데노바이러스 벡터"란 용어는 "아데노바이러스의 벡터"와 상호교환적으로 사용된다. 본 발명에 사용되는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터에 의해 전달될 단백질의 발현을 위한 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함하는 재조합 벡터이다. 폴리뉴클레오티드 작제물은 전달될 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 것이 바람직하다. 그러한 DNA는 뉴클레오티드 염기 A, T, C 및 G로 이루어질 수 있으나, 또한 그러한 염기의 임의 유사체 또는 변형된 형태를 포함할 수 있다. 그러한 유사체 또는 변형된 염기는 해당 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있으며, 메틸화 뉴클레오티드, 비하전된 결합 또는 티오에이트와 같은 뉴클레오티드간 변형, 당 유사체의 사용, 폴리아미드와 같은 변형 및/또는 대체 골격 구조를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 아데노바이러스 벡터는 표적 세포 중에서 복제 가능형 또는 복제 결함형일 수 있다. 벡터가 복제 결함형인 경우, 벡터는 복제를 용이하게 하기 위해서 헬퍼 세포 또는 헬퍼 바이러스를 사용하는 것을 필요로 할 수 있다. 복제 결함형 아데노바이러스의 복제를 촉진하기 위해서 헬퍼 세포 또는 헬퍼 바이러스를 사용하는 것은 통상적인 것이며, 해당 기술 분야에 잘 알려져 있다. 전형적으로, 그러한 헬퍼 세포는 재조합 아데노바이러스 벡터로부터 녹킹되어(knocked) 그 벡터가 복제 결함으로 되게 하는 실체의 기능을 제공한다. 한편, 복제 가능형 벡터는 그 벡터에 결함인 기능을 제공하는 제2 바이러스 또는 세포주를 필요로 하지 않는다는 점에서 "헬퍼-자유 바이러스 벡터"라고도 칭할 수 있다.
상기 설명된 바와 같이, 본 발명은 소정의 아데노바이러스 벡터의 향성을 변경시키기 위해, 예컨대, 아데노바이러스의 특이성을 변화시키기 위해 사용된다. "변경된 향성"이란 용어는 아데노바이러스의 조직 또는 세포 특이성 뿐만 아니라 종 특이성을 변화시키는 것을 포함한다. 본 발명의 예시적 실시태양에서, 아데노바이러스 벡터의 특이성은 벡터에 제2의 섬유 단백질을 제공함으로써 변경된다. 아데노바이러스 벡터에 있어 두 가지 섬유 단백질의 존재는 아데노바이러스 벡터 향성의 소정 변경을 달성한다.
A. 섬유 유전자
본 발명은 재조합 아데노바이러스 벡터의 향성을 변경시키기 위해 재조합 아데노바이러스에 제2의 섬유를 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 재조합 돼지류 아데노바이러스 벡터의 향성을 변경시키는 것을 포함한다. PAdV 감염은 뇌염, 폐렴, 신장 손상 및 설사와 관련되어 있다(Derbyshire (1992) In: "Diseases of Swine" (ed. Leman et al.), 7th edition, Iowa State University Press, Ames, Iowa. pp. 225-227). 또한, PAdV는 감염된 새끼 돼지의 장내에서 체액 반응 및 점막 항체 반응을 모두 자극할 수 있다(Tuboly et al. (1993) Res. in Vet. Sci. 54:345-350). 적어도 5종의 밝혀진 PAdV 혈청형이 있다(PAdV-1, PAdV-2, PAdV-3, PAdV-4, PAdV-5; Derbyshire et al. (1975) J. Comp. Pathol. 85:437-443; and Hirahara et al. (1990) Jpn. J. Vet. Sci. 52:407-409.). 이들 각각의 혈청형은 예컨대 돼지용 백신의 생산에 사용하기 위한 재조합 아데노바이러스 벡터를 제조하는데 쉽게 사용될 수 있다. PAdV-3의 전체 서열이 클로닝되어 있다(Reddy et al., 1998; U.S. Patent No. 6,492,343, 본 명세서에 참고 인용되어 있음). 또한, PAdV-1 및 PAdV-2 뿐만 아니라 PAdD V-3의 게놈은 제한 단편의 제한 맵핑 및 클로닝을 이용하여 광범위하게 특성화되어 있다. 문헌(Reddy et al. (1993) Intervirology 36:161-168; Reddy et al. (1995b) Arch. Virol. 140:195-200)을 참조할 수 있다.
각종 PAdV 혈청형의 각종 절편에 대한 뉴클레오티드 서열이 해당 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, PAdV-3 E3, pVIII 및 섬유 유전자가 문헌(Reddy et al. (1995) Virus Res. 36:97-106)에 제시되어 있다. PAdV-1 및 PAdV-2 E3, pVIII 및 섬유 유전자가 문헌(Reddy et al. (1996) Virus Res. 43:99-109)에 제시되어 있다. Kleibocker의 문헌은 PAdV-4 E3, pVIII 및 섬유 유전자 서열을 제공하고 있다(Kleiboeker 1994 Virus Res. 31:17-25). PAdV-4 섬유 유전자 서열이 결정되어 있다(Kleiboeker (1995) Virus Res. 39:299-309). PAdV-1, PAdV-2, PAdV-3, PAdV-4 및 PAdV-5 각각에 대한 역전 말단 반복 서열이 또한 해당 기술 분야의 당업계에 알려져 있다(Reddy et al (1995) Virology 212:237-239). PAdV-3 펜톤의 서열이 결정되어 있다(McCoy et al. (1996) Arch. Virol. 141:1367-1375). PAdV-4의 El 영역의 뉴클레오티드 서열이 문헌(Kleiboeker (1995) Virus Res. 36:259-268)에 제시되어 있다. PAdV-3의 프로테아제(23K) 유전자의 서열이 결정되어 있다(McCoy et al. (1996) DNA Seq. 6:251-254). PAdV-3 헥손 유전자의 서열 (및 23K 프로테아제 유전자의 14개 N-말단 코돈)이 진뱅크(GenBank) 데이터베이스에 승인번호 U34592로 기탁되어 있다. PAdV-3 1OOK 유전자의 서열이 진뱅크(GenBank) 데이터베이스에 승인번호 U82628로 기탁되어 있다. PAdV-3 E4 영역의 서열은 해당 기술 분야에 알려져 있다(Reddy et al. (1997) Virus Genes 15:87-90). 문헌(Vrati et al., 1995, Virology, 209:400-408)은 OAdV에 대한 서열을 개시하고 있다. PAdV-5에 대한 섬유 및 HNF-61 pVIII, ORF2, ORF3, ORF4 서열이 진뱅크 승인번호 AFl 86621로 제시되어 있다. PAdV-5의 완전 게놈 서열이 진뱅크 승인번호 AC_000009 BK000411로 제시되어 있으며, 여기서 섬유 유전자는 26487..27989 사이에 존재하고 진뱅크 승인번호 AP_000254로 배당되어 있다. 돼지류 아데노바이러스 C의 완전 서열이 진뱅크 승인번호 NC_002702로 제시되어 있으며, 여기서 섬유 유전자는 26487..27989 사이에 존재하고 진뱅크 승인번호 NP_108675.1로 배당되어 있다. PAdV-4의 섬유 유전자 서열은 진뱅크 승인번호 U25120으로 제시되어 있다.
인간 아데노바이러스 HAdV-3, HAdV-4, HAdV-5, HAdV-9 및 HAdV-35는 모두 해당 기술 분야에 잘 특성화되어 있으며, ATCC(American Type Culture Collection)로부터 이용가능하다. Ad5에 대한 국립 생물공학 정보 센터 진뱅크(National Center for Biotechnology Information GenBank) 승인번호는 M73260/M29978이고; Ad9에 대해서는 X74659이며; Ad35에 대해서는 U10272이다. 문헌(Chow et al.,1977, Cell 12:1-8)은 인간 아데노바이러스 2 서열을 개시하고 있고; 문헌(Davison et al., 1993, J. Mole. Biol. 234:1308-1316)은 HAdV-40의 DNA 서열을 개시하고 있으며; 문헌(Sprengel et al., 1994, J. Virol. 68:379-389)은 HAdV-12 DNA의 DNA 서열을 개시하고 있고; 문헌(Vrati et al., 1995, Virology, 209:400-408)은 OAdV에 대한 서열을 개시하고 있으며; 문헌(Morrison et al., 1997, J. Gen. Virol. 78:873-878)은 CAdV-I DNA 서열을 개시하고 있으며; 그리고 문헌(Reddy et al., 1998, Virology, 251:414)은 PAdV에 대한 DNA 서열을 개시하고 있다. 각종 인간 아데노바이러스의 섬유 서열은 진뱅크에서 승인번호 Y14241 (HAdV-28 섬유 유전자), Y14241 (HAdV- 17 섬유 유전자) 하에 이용가능하며; HAdV-17에 대한 완전 게놈 서열은 AC_000006 BK000406(여기서 섬유 CDS는 위치 30935..32035 사이에 존재하며, 진뱅크 승인번호 AP_000157.1로 배당되어 있음); X76706 (HAdV-15H9 (Morrison) 섬유 유전자), X76548(섬유 단백질에 대한 HAdV-31 유전자); AB 125751 (HAdV-6 섬유 유전자에 대한 완전 cds), AB125750 (HAdV-1 섬유 유전자에 대한 완전 cds), AB073168 (HAdV-34 섬유 유전자에 대한 완전 cds)로 왼전 게놈으로서 제시되어 있으며; 진뱅크 승인번호 S75136는 HAdV-8의 섬유 유전자의 서열을 나타낸다. HAdV-3 섬유 유전자의 부분 서열은 진뱅크 승인번호 AB 244095로 기탁되어 있고, 인간 아데노바이러스의 완전 게놈 서열은 섬유 서열이 위치 31368..32327(진뱅크 승인번호 ABB17809.1로 배당됨)에 위치되어 있음을 나타내는 진뱅크 승인번호 DQ086466로 기탁되어 있다. HAdV-12에 대한 완전 서열은 섬유 유전자 CDS가 위치 29368..31131(진뱅크 승인번호 AP_000135.1로 배당됨)에 존재하는 승인번호 AC_000005 BK000405로 제시되어 있다. 인간 아데노바이러스 5의 완전 서열은 섬유 CDS가 위치 31042..32787 (진뱅크 승인번호 AP_000226.1로 배당됨)에 존재하는 진뱅크 승인번호 AC_000008로 제시되어 있다. 인간 아데노바이러스 2의 완전 서열은 섬유 cds가 위치 31030..32778(진뱅크 승인번호 AP_000190.1로 배당됨)에 존재하는 진뱅크 승인번호 AC_000007 BK000407로 제시되어 있다. 섬유 단백질 스트레인:130H에 대한 HAdV-9 유전자의 서열은 진뱅크 승인번호 AB098565로 제시되어 있다. 또다른 HAdV-9 섬유 유전자 서열은 진뱅크 승인번호 X74659에 위치한다. HAdV-37에 대한 섬유 유전자는 진뱅크 승인번호 X94484로 제시되어 있다. HAdV-19에 대한 섬유 유전자는 진뱅크 승인번호 X94485로 제시되어 있다. HAdV-15에 대한 섬유 유전자는 진뱅크 승인번호 X72934로 제시되어 있다. HAdV-7에 대한 섬유 유전자는 (E3 영역과 함께) 진뱅크 승인번호 Z48954로 제시되어 있다. HAdV-4 섬유 유전자에 대한 서열은 진뱅크 승인번호 X76547로 제시되어 있다. HAdV-31 섬유 유전자에 대한 서열은 진뱅크 승인번호 X76548로 제시되어 있다. HAdV-8 섬유 유전자에 대한 서열은 진뱅크 승인번호 X74660으로 제시되어 있다. HAdV-3 섬유 유전자에 대한 서열은 진뱅크 승인번호 X01998 M12411로 제시되어 있다. HAdV-21 섬유 유전자에 대한 서열은 진뱅크 승인번호 AY380332로 제시되어 있다. HAdV-7 섬유 유전자에 대한 서열은 진뱅크 승인번호 AY380326으로 제시되어 있다.
원숭이류 아데노바이러스 1 완전 게놈은 진뱅크 승인번호 NC_006879로 제시되어 있으며, 여기서 섬유는 위치 28731..29822에 위치하고 뱅크 승인번호 YP_213988.1로 배당되어 있으며, 섬유 2 변이체는 진뱅크 승인번호 YP_213989.1로 배당되어 있다. 원숭이류 아데노바이러스 A의 완전 서열은 진뱅크 승인번호 NC_006144로 제시되어 있으며, 여기서 섬유는 29606..31246에 위치하고, 진뱅크 승인번호 YP_067930으로 배당되어 있다. 원숭이류 아데노바이러스 25의 완전 게놈 서열은 진뱅크 승인번호 AF394196으로 제시되어 있으며, 여기서 섬유 cds는 32137..33414에 존재하고, 진뱅크 승인번호 AAL35536.1로 배당되어 있다.
문헌(Reddy et al. (1998) Journal of Virology 72:1394)은 BAdV-3에 대한 뉴클레오티드 서열을 개시하고 있다. 그 서열에서, BAdV-3의 펜톤 영역은 12919에서 개시하여 14367에서 종결하고; 헥손 영역은 17809에서 개시하여 20517에서 종결하며; BAdV-3의 섬유 영역은 27968에서 개시하여 30898에서 종결한다. 섬유 서열 및 소류 아데노바이러스 유형 3 pVIII 유전자, 초기 영역 3 및 섬유 단백질의 서열은 진뱅크 승인번호 D16839로 기탁되어 있다. 소류 아데노바이러스 D의 완전 게놈은 NC_002685로 제시되어 있고, 여기서 섬유 유전자는 22343..23950 사이에 위치하는 것으로 주석되어 있고, 섬유 유전자는 진뱅크 승인번호 NP_077404.1로 제시되어 있다. 마찬가지로, 소류 아데노바이러스 A의 완전 게놈은 진뱅크 승인번호 NC_006324로 제시되어 있고, 여기서 섬유는 위치 27483..29294에 존재하며, 진뱅크 승인번호 YP_094049.1로 제시되어 있다. 소류 아데노바이러스 4 스트레인 THT/62, 완전 게놈은 진뱅크 승인번호 AF036092로 제시되어 있고, 여기서 섬유 유전자는 위치 22343..23950에 존재하고, 진뱅크 승인번호 AAK13185.1로 배당되어 있다. BAdV-3의 완전 서열은 진뱅크 승인번호 AC_000002 BK000401로 제시되어 있고, 여기서 섬유 cds는 27968..30898에 존재하고, 진뱅크 승인번호 AP_000041.1로 배당되어 있다. BAdV-2 섬유 및 17K 단백질 서열은 AF308811로 제시되어 있다.
CAdV-1에 대한 완전 게놈 서열은 진뱅크 승인번호 AC_000003 BK000402로 제시되어 있고, 여기서 섬유 cds는 위치 25887..27518에 존재하는 것으로 주석되어 있으며, 단백질 및 관련된 코딩 서열은 진뱅크 승인번호 AP_000069.1로 기탁되어 있다. CAdV-2에 대한 코딩 서열은 진뱅크 승인번호 AC_000020 BK000403으로 제시되어 있고, 여기서 섬유 cds는 26592..28220에 위치하는 것으로 주석되어 있고, 단백질 및 관련된 코딩 서열은 진뱅크 승인번호 AP_000632.1로 기탁되어 있다. 진뱅크 승인번호 Z37498은 CAdV-2 섬유 유전자의 서열을 제시하고 있다.
OAdV-7에 대한 완전 게놈 서열은 진뱅크 승인번호 NC_004037로 제시되어 있고, 여기서 섬유 cds는 위치 22273..23904에 존재하는 것으로 주석되어 있고, 단백질과 관련된 코딩 서열은 진뱅크 승인번호 NP_659529.1로 기탁되어 있다.
고양이류 아데노바이러스의 섬유 서열은 진뱅크 승인번호 AY518270로 기탁되어 있다.
쥐류 아데노바이러스 A, 완전 게놈은 진뱅크 승인번호 NC_000942로 제시되어 있고, 여기서 섬유 유전자 cds는 25412..27253에 위치하고, 진뱅크 승인번호 NP_015554.1로 배당되어 있다.
진뱅크 승인번호 AC_000013 BK001451은 가금류 아데노바이러스 9의 완전 게놈을 나타내고, 여기서 섬유 CDS의 위치는 30161..31876에서 존재하는 것으로 주석되어 있으며, 단백질과 관련된 코딩 서열은 AP_000390.1로 기탁되어 있다. FAdV-IO 섬유 서열은 진뱅크 승인번호 AF007579로 제시되어 있다. 가금류 아데노바이러스 D 완전 게놈은 진뱅크 승인번호 NC_000899로 제시되어 있으며, 여기서 섬유 유전자 cds는 30161..31876에 위치하고, 진뱅크 승인번호 NP_050293.1로 배당되어 있다. 가금류 아데노바이러스 A 완전 게놈은 진뱅크 승인번호 NC_001720로 제시되어 있고, 여기서 섬유 유전자 CDS는 28363..30495에 위치하며, 진뱅크 승인번호 NP_043891.1로 배당되어 있다. 칠면조 아데노바이러스 3, 완전 게놈은 진뱅크 승인번호 AC_000016 BK001454로 제시되어 있고, 그의 섬유는 위치 22518..23882에 존재하는 것으로 주석되어 있으며, 진뱅크 승인번호 AP_000495.1로 배당되어 있다.
개구리 아데노바이러스 게놈 서열은 진뱅크 승인번호 NC_002501로 제시되어 있고, 여기서 섬유 cds는 위치 22343..23632에 위치하고, 진뱅크 승인번호 NP_062452.1로 배당되어 있다.
특정한 예시적 실시태양에서, 본 발명은 PAdV-4로부터의 섬유 서열을 이용한다. PAdV-4의 신규 섬유-코딩 서열의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:1로 주어진다. PAdV-1로부터의 신규 섬유-코딩 서열의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:2로 주어진다. PAdV-2로부터의 신규 섬유-코딩 서열의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호:3으로 주어진다.
상기 설명으로부터 쉽게 명백히 알 수 있는 바와 같이, 해당 기술 분야의 당업자는 각종 아데노바이러스 유형으로부터의 섬유 유전자에 대한 다수의 코딩 서열을 인지하고 있다. 본 명세서에서 본 발명은 이들 섬유 서열 중 어느 하나를 사용하지만 이에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 본 발명의 방법 및 조성물은 상기 언급된 섬유들 중 어느 것이든, 이들 섬유의 임의의 변이체, 또는 각종 다른 아데노바이러스 스트레인으로부터 확인된 섬유를 사용하여 수행할 수 있다. 해당 기술 분야의 당업자는 아데노바이러스의 게놈 조직화 지식을 통해 또는 상기 논의된 서열에 관한 지식을 통해 그러한 추가 섬유를 용이하게 확인할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 미국 특허 공보 2002 0034519(전문이 본 명세서에 참고 인용되어 있음)에서, 이것의 도면 12 내지 17은 HAdV-5 섬유 단백질 (도 12), BAdV-3 (도 13), 양류 아데노바이러스 287 섬유 단백질 (도 14); PAdV-3 섬유 단백질 (도 15); CAdV-2 섬유 단백질 (도 16); 다중배열 프로그램의 클러스탈(clustal) 방법을 이용한 포유류 아데노바이러스 섬유의 아미노산 배열을 도시한 도 17A-17G을 비롯한, 각종 섬유 단백질의 서열을 나타내는 바와 같이 매우 구체적인 주해를 갖고 있다.
본 발명의 예시적 실시태양에서, 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조에 이용되는 통상의 방법으로 제조되는 재조합 아데노바이러스 벡터는 그 재조합 아데노바이러스에 존재하는 섬유 유전자와는 다른 섬유 유전자를 발현하는 재조합 세포주인 세포주 중에서 증식시킨다. 재조합 아데노바이러스가 그 혈청형과 관련이 있는 섬유 유전자를 함유하는 것(예를 들어, 재조합 아데노바이러스가 PAdV-3-기초한 재조합 아데노바이러스인 경우, 그 재조합 아데노바이러스 내의 섬유 유전자는 천연 PAdV-3 섬유 유전자임)이 바람직하긴 하지만, 본 발명을 이용하여 그 천연 섬유 유전자가 변형되어 있는(예컨대, 다른 아데노바이러스의 섬유에 의해 치환되거나 천연 야생형 섬유 유전자와 다르게 돌연변이되어 있는) 재조합 아데노바이러스의 향성을 변경시키는 것도 가능하다는 점을 이해해야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "증식한다"란 용어는 "복제한다"라는 용어와 상호교환적으로 사용되며, 아데노바이러스 벡터가 재생산하거나 증폭할 수 있다는 것을 의미한다. 이들 용어는 해당 기술 분야에서 잘 이해되고 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 복제는 아데노바이러스 단백질의 생산을 포함하며, 일반적으로 아데노바이러스 벡터의 재생산을 유도한다. 복제는 해당 기술 분야에서 표준적이고 본 명세서에 기재된 검정법, 예컨대, 버스트(burst) 검정법 또는 플라크 검정법을 이용하여 측정할 수 있다. "복제" 및 "증식"은 바이러스 유전자 발현; 바이러스 단백질, 핵산 또는 기타 성분의 생산; 바이러스 성분의 완전 바이러스로의 팩킹; 및 세포 용해(이들에 국한되는 것은 아님)를 비롯한, 바이러스 제조 공정에 직접적으로 또는 간접적으로 관련된 임의의 활동을 포함한다.
예시적 실시태양에서, 제2의 섬유 단백질-코딩 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 또는 전부는 아데노바이러스 벡터가 증식될 재조합 숙주 세포에서 발현된다. 그 숙주세포에서의 재조합 아데노바이러스 벡터의 증식은 아데노바이러스 향성을 변경시킨다. 본 명세서에 개시된 특정한 실시태양에서, PAdV-4 섬유 유전자를 발현하는 재조합 세포가 제조된다. 예시적 실시태양에서, PAdV-4 섬유 유전자를 안정하게 발현하는 세포주가 발생된다. PAdV-3 섬유는 돼지의 장에서 세포에 대한 바이러스 부착을 용이하게 하는 반면, PAdV-4 혈청형 섬유는 돼지류 호흡관 세포에 대한 부착을 허용한다. CSFV의 gp55 유전자를 발현하는 현행 돼지류 아데노바이러스 재조합 벡터[Hammond et al., 2000]는 이들 세포주 중에서 천연 PAdV-3 섬유와 추가의 PAdV-4 섬유 단백질을 모두 함유하는 결과로 형성된 선조 바이러스와 함께 성장될 수 있다. 바이러스 캡시드 상의 상이한 2종의 섬유 단백질의 존재는 벡터의 세포 향성을 넓게 한다. 따라서, 벡터가 동물 중에 속하는 보다 많은 각종 세포 유형을 표적화 할 수 있고, 전달된 외래 유전자가 보다 큰 폭의 숙주 면역 반응에 노출될 수 있다. 또한, 외래 유전자 삽입을 위한 보다 넓은 공간을 제공하기 위해 섬유 유전자가 결실되도록 조작된 PAdV 벡터는 그 섬유 단백질을 발현하는 그러한 세포주를 통해 계대배양하면서 보충될 수 있다. 이러한 접근법은 추가의 DNA 팩키징 성능을 갖는 섬유 양성 바이러스의 생산을 허용한다.
그러한 세포주를 통한 PAdV의 성장은 숙주세포 표적 범위를 넓힘으로써 벡터의 효능을 증가시킬 것이며, 내부로 삽입될 수 있는 외래 유전 물질의 양을 증가시킬 것이고, 따라서 하나의 벡터에 수 개의 항원 또는 항원과 사이토카인과 같은 면역조절물질의 혼입 및 후속적인 전달을 허용할 것으로 기대된다.
"숙주 세포"란 외인성 DNA 서열에 의해 형질전환되어 있거나 형질전환될 수 있는 세포이다. 본 발명에서, 숙주 세포는 아데노바이러스 벡터의 복제를 지지할 수 있고(즉, 아데노바이러스에 의해 감염되어 그 내부에서 아데노바이러스가 증식할 수 있고), 섬유 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 외인성 DNA 서열에 의해 형질전환되는 것들이다. 세포의 "형질전환"은 세포내로의 외인성 DNA의 도입을 수반한다. 외인성 DNA는 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA에 통합될 수 있거나(공유결합될 수 있거나) 그러하지 않을 수 있지만, 본 발명에서 세포는 섬유 코딩 폴리뉴클레오티드에 의해 안정하게 형질전환된 것으로 이해해야 한다. 안정하게 형질전환된 세포는 외인성 DNA가 염색체내로 통합되어 그것이 염색체 복제를 통한 딸세포에 의해 유전되는 것이다. 포유류 세포의 경우, 이러한 안정성은 외인성 DNA를 함유하는 세포의 개체군으로 이루어지는 세포주 또는 클론을 달성하는 세포의 능력에 의해서 입증된다.
예시적 실시태양에서, 본 발명은 PAdV-4 섬유를 코딩하는 외인성 DNA에 의해 안정하게 형질전환되어 있는, 안정하게 형질전환된 돼지류 세포의 예를 제공한다. 보다 구체적으로, 두 가지 예시의 연속적(안정한) 세포주인 돼지 신장 15 (PKl5) 및 돼지 고환 (ST)를 조작하여 PAdV-4로부터의 섬유 유전자를 함유하고 발현하도록 한다. 이들 세포주는 각각 PK-743 및 ST-743로 명명된다. 섬유 유전자는 양 세포주 중의 PAdV-4 섬유 mRNA의 존재 여부를 입증함으로써 발현되는 것으로 제시된다. 두 섬유에 공통적인 펩티드 또는 PAdV-4 섬유에 특이적인 펩티드에 대해 유발된 래빗 폴리클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석은 변형된 바이러스 중에 두 가지 섬유가 존재한다는 것을 확실히 입증하여 보여준다. 세포주들은, PKl5A (비변형 대조군) 및 PK-743 (변형) 세포를 재조합 PAdV-3-gp55로 감염시키고, 세포가 80% 세포 병변 효과(cpe)를 나타낼 때 자손 바이러스를 수확하는 감염 연구에 사용한다.
자손 바이러스는 해당 기술 분야의 당업자에 알려진 표준 기법을 이용하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 자손 바이러스의 단백질 함량의 웨스턴 블롯 분석은 비리온 중에 PAdV-3 및 PAdV-4 섬유 단백질이 모두 존재한다는 것을 입증해 보여준다. PAdV-3 섬유의 기대된 분자량 밴드(45kD)는 두 바이러스 제제에 존재한 반면, PAdV-4 섬유의 기대된 분자량 밴드 (77kD)는 변형된 바이러스 제제에서 특이적으로 검출된다.
본 발명이 예시적인 돼지류 숙주 세포를 제공하고 있지만, 다른 적절한 숙주 세포가 용이하게 제조될 수 있고, 숙주 세포 중에서 아데노바이러스 게놈과 아데노바이러스 섬유 사이의 재조합을 지지하는 임의의 세포를 포함한다. 숙주 세포는 재조합 아데노바이러스 게놈을 함유하는 플라스미드에 의해 형질감염되어 숙주 세포 중에 바이러스 입자를 발생시키게 된다. 진핵 세포 및 포유류 세포주의 성장은 해당 기술 분야의 당업자에 잘 알려진 절차이다.
상기 언급된 바와 같이, 재조합 아데노바이러스 벡터의 제조는 해당 기술 분야의 당업자에 잘 알려진 기법을 이용한다. 그러한 기법을 이용하면, 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오티드 서열이 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 영역으로 삽입되어 재조합 아데노바이러스 벡터를 발생시키게 된다. 이러한 벡터의 제조는 소정의 아데노바이러스 게놈의 삽입 용량 및 삽입된 이종 서열을 발현하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 능력에 의해서만 제한된다. 일반적으로, 아데노바이러스 게놈은 재조합 아데노바이러스의 크기를 야생형 게놈 길이의 약 105%가 되게 증가시키고 바이러스 입자로 팩킹될 수 있는 상태로 유지되는 삽입물을 수용할 수 있다. 삽입 용량은 비-필수 영역의 결실 및/또는 필수 영역의 결실, 예를 들어, 기능이 El 기능을 제공하는 것과 같은 헬퍼 세포주에 의해 제공될 수 있는 El 기능 등의 결실에 의해 증가될 수 있다. 일부 실시태양에서, 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드가 아데노바이러스 E3 유전자 영역에 삽입된다. 다른 실시태양에서, E3 영역의 비-필수 영역이 결실되고, 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드가 결실에 의해 잔존하게 된 갭에 삽입된다. 일부 바람직한 실시태양에서, 재조합 아데노바이러스 벡터가 PAdV-3 기초한 아데노바이러스 벡터인 경우, 이종 유전자는 PAdV-3 E3에 대한 폴리아데닐화 시그널 후에 그리고 PAdV-3 섬유 유전자에 대한 ORF 개시 전에 위치한 PAdV-3 게놈 영역 내로 삽입될 수 있다.
일부 실시태양에서, 삽입 또는 결실 후 삽입이 아데노바이러스의 El 유전자 영역에서 존재하고, 이어서 벡터가 El 기능을 제공하는 헬퍼 세포주 중에서 증식되는 경우 아데노바이러스가 형성된다. 이종 유전자가 삽입될 수 있는 다른 영역은 E4 영역을 포함한다. 재조합 아데노바이러스 벡터가 PAdV-3 기초한 벡터인 경우, ORF3를 코딩하는 영역을 제외한 전체 E4 영역은 결실되어 이종 유전자를 위한 공간을 만들 수 있다. 문헌(Li et al.,Virus Research 104 (2004) 181-190)에 제시된 바와 같이, 게놈의 우측 말단에 위치하는 PAdV-3 E4 영역은 왼쪽 방향으로 전사되고, 7 개의 (pl-p7) ORF를 코딩하는 가능성을 갖는다. 이들 중 단지 ORF p3 만이 복제에 필수적이다. 사실, E4 영역의 나머지 전부가 아니라도 많은 부분이 바이러스를 복제 결함으로 만들지 않고도 용이하게 결손될 수 있으며, 따라서 이종 삽입부를 위한 보다 큰 공간을 허용하게 된다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 삽입은 삽입을 필요로 하는 아데노바이러스 게놈의 영역, 예컨대 소정의 치료적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 플라스미드를 작제함으로써 달성할 수 있다. 이어서, 그 플라스미드는 플라스미드의 아데노바이러스 부분에서 인식 서열을 갖는 제한 효소를 사용하여 절단하고, 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 제한 절단 부위에 삽입한다. 삽입된 이종 서열과 함께 아데노바이러스 게놈의 부분을 함유하는 플라스미드는 아데노바이러스 게놈 또는 아데노바이러스 게놈을 함유하는 선형 플라스미드와 함께 박테리아 세포(예를 들어, 이. 콜라이 등) 내로 동시 형질전환시킨다. 플라스미드 간의 상동 재조합은 삽입된 이종 서열을 함유하는 재조합 아데노바이러스 게놈을 발생시키게 된다. 이들 실시태양에서, 아데노바이러스 게놈은 전장 게놈일 수 있거나 본 명세서에 논의된 바와 같이 하나 이상의 결실부를 함유할 수 있다.
예컨대, 이종 서열의 삽입 부위를 제공하거나, 다른 부위에서의 추가의 삽입 용량을 제공하기 위한, 아데노바이러스 서열의 결실은 해당 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법으로 달성할 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 내에 클로닝된 아데노바이러스 서열에 있어서, 하나 이상의 제한 효소(아데노바이러스 삽입물내 적어도 하나의 인식 서열)에 의한 절단과 연이은 결찰은 몇몇 경우에 제한 효소 인식 부위들 사이의 서열의 결실을 형성하게 된다. 대안으로, 아데노바이러스 삽입부내 단일 제한 효소 인식 부위에서의 절단, 이어서 엑소뉴클레아제 처리, 이어서 결찰은, 제한 부위에 인접한 아데노바이러스 서열의 결실을 형성하게 된다. 상기 설명된 바와 같이 작제된, 하나 이상의 결실부와 함께 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 부분을 함유하는 플라스미드는 (전장 또는 결실된) 아데노바이러스 게놈 또는 전장 또는 결실된 게놈을 함유하는 플라스미드와 함께 박테리아 세포 내로 동시 형질감염되어 상동 재조합에 의해 하나 이상의 특이적 부위에서 결실을 갖는 재조합 게놈을 함유하는 플라스미드를 발생시킬 수 있다. 따라서, 그 결실부를 함유하는 아데노바이러스 비리온은, 본 명세서에 설명된 추가의 섬유 유전자를 함유하는 안정하게 형질전환된 세포(이에 국한되는 것은 아님)를 비롯한 포유류 세포를 재조합 아데노바이러스 게놈을 함유하는 플라스미드로 형질감염시킴으로써 얻을 수 있다.
삽입 부위는 아데노바이러스의 내인성 프로모터에 인접하여 전사적으로 하류에 존재할 수 있다. "내인성" 프로모터, 인핸서 또는 조절 영역은 아데노바이러스에 천연이거나 그로부터 유래된다. 삽입 부위로서 사용될 수 있는 소정의 프로모터 하류의 제한 효소 인식 서열은 삽입을 필요로 하는 아데노바이러스 게놈 서열의 일부 또는 전부의 지식으로부터 해당 기술 분야의 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 대안으로, 각종 시험관내 기법은 특정 부위에서 제한 효소 인식 서열의 삽입, 또는 제한 효소 인식 서열을 함유하지 않는 부위에서 이종 서열의 삽입을 허용하는데 이용가능하다. 그러한 방법은 하나 이상의 제한 효소 인식 서열의 삽입을 위한 올리고뉴클레오티드-매개된 헤테로듀플렉스 형성[예컨대, 문헌(Zoller et al. (1982) Nucleic Acids Res. 10:6487-6500); 문헌(Brennan et al. (1990) Roux's Arch. Dev. Biol. 199:89-96); 및 문헌(Kunkel et al. (1987) Meth. Enzymology 154:367-382) 참조] 및 보다 긴 서열의 삽입을 위한 PCR-매개된 방법[예를 들어, 문헌(Zheng et al. (1994) Virus Research 31:163-186) 참조]을 포함하나, 이들에 국한되는 것은 아니다.
내인성 프로모터의 하류에 존재하지 않는 부위에 삽입된 이종 서열의 발현은 또한 그 이종 서열과 함께 진핵세포에서 활성인 전사 조절 서열을 제공함으로써 달성할 수 있다. 그러한 전사 조절 서열은 세포성 프로모터, 예컨대, 바이러스 프로모터 등, 예컨대 헤르페스바이러스, 아데노바이러스 및 파포바바이러스 프로모터 등, 및 레트로바이러스 장쇄 말단 반복부 (LTR) 서열의 DNA 카피를 포함할 수 있다. 그러한 실시태양에서, 이종 유전자는 그 이종 유전자가 전사 조절 요소에 작동가능하게 연결되어 있는 발현 작제물 내로 도입된다.
특정한 예시적 실시태양에서, PAdV-4 섬유 유전자는 강한 구성적 전사를 위해 CMV 프로모터의 조절하에 위치한다. 바이러스 감염의 후기에 일어나는 바이러스 팩킹 동안 섬유 생산을 지속시키는 것이 바람직할 수 있다. 인간 아데노바이러스는 숙주 세포 번역 개시 인자를 불활성화시킴으로써 숙주 세포 단백질 합성을 중단시키는 것으로 밝혀졌다(Zhang et al., 1994). 그러므로, 후기 바이러스 메시지의 효율적인 번역은 PAdV-3 TPL 서열을 함유함으로써 유지되는 것으로 기대된다. TPL은 총 248개 뉴클레오티드(nt)에 이르는 3개의 엑손으로 이루어지며, 이들은 후기 바이러스 mRNA의 5' 말단에서 스플라이싱된다(Reddy et al., 1998). 서열은 mRNA의 5' 말단에서 보다 덜 규칙적인 구조를 제공하여 숙주 세포 개시 복합체로부터의 독립성을 부여함으로써 기능을 하는 것으로 생각된다 (Dolph et al., 1988; Dolph et al., 1990). 재조합 섬유 mRNA의 계속된 번역을 보장하기 위하여, PAdV-4 섬유 유전자는 pCI-TPL에서 PAdV-3 TPL 서열 하류에 위치한다. 루시퍼라제를 발현하는 작제물에 HAdV 5 TPL을 부가하는 것은 심지어는 비감염된 세포에서도 발현 수준을 증가시키는 것으로 보고되어 있다(Sheay et al., 1993).
이종 유전자의 발현을 조절하는데 사용될 수 있는 조절 서열은, 예를 들어, 전사 조절 서열, 프로모터, 인핸서, 상류 조절 도메인, 스플라이싱 시그널, 폴리아데닐화 시그널, 전사 종결 서열, 번역 조절 서열, 리보조옴 결합 부위 및 번역 종결 서열일 수 있다.
재조합 아데노바이러스 벡터의 제조는 플라스미드로서 클로닝된 아데노바이러스 게놈의 증식, 및 플라스미드 함유 세포로부터 감염성 바이러스의 구제(rescue)를 포함하는 것으로 이해해야 한다.
바이러스 핵산의 존재는, 하이브리드화 검정법, 폴리머라제 연쇄 반응, 및 다른 유형의 증폭 반응(이들에 국한되는 것은 아님)을 비롯한 해당 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 기법에 의해 검출할 수 있다. 마찬가지로, 단백질의 검출 방법도 해당 기술 분야의 당업자에 잘 알려져 있으며, 다양한 유형의 면역 검정법, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 효소 검정법, 면역조직화학 방법 등을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 진단용 키트는 또한 하이브리드의 형성, 선택 및 검출을 위한 완충액 및 용매뿐만 아니라 세포 파괴 및 핵산 정제를 위한 시약도 함유할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 아미노산 서열을 함유하는 진단용 키트는 또한 단백질의 단리를 위한 시약 및 면역 복합체의 형성, 단리, 정제 및/또는 검출을 위한 시약을 포함할 수 있다.
본 발명은 향성 변경을 위해 재조합 아데노바이러스 벡터를 변형시키는 것을 제공한다. 이러한 벡터는 다양한 외래 유전자 또는 뉴클레오티드 서열 또는 코딩 서열(원핵 및 진핵)을 표적 세포로 전달하는데 사용하는 것이 바람직하다. 그러한 벡터는 특히 광범위한 질병에 대한 보호를 제공하는 백신으로서 특히 유용하며, 많은 그러한 유전자가 이미 해당 기술 분야에 알려져 있다. 바이러스 백신은 DNA 백신(즉, 플라스미드, 벡터 또는 다른 통상적 캐리어를 사용하여 DNA를 돼지 내로 직접 주입한 것), 생백신, 변형 생백신, 불활성화 백신, 서브유닛 백신, 약독화 백신, 유전자적으로 조작된 백신 등을 포함하나 이들에 국한되는 것은 아니다.
아데노바이러스 내로 혼입되는 외인성(즉, 외래) 뉴클레오티드 서열은 유전자가 아니지만 다른 기능, 바람직하게는 치료적으로 중요한 기능을 갖는 해당 또는 다른 뉴클레오티드 서열의 하나 이상 이상의 유전자(들)로 구성될 수 있다. 본 발명의 내용에서, 해당 뉴클레오티드 서열 또는 유전자는 안티센스 RNA, 쇼트 헤어핀 RNA, 리보자임 또는 추후 해당 단백질로 번역되는 mRNA를 코딩할 수 있다. 그러한 뉴클레오티드 서열 또는 유전자는 게놈 DNA, 상보적 DNA (cDNA) 또는 혼합형(미니유전자, 적어도 하나의 인트론이 결실된 것)을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 서열 또는 유전자는 조절적 또는 치료적 기능, 성숙 단백질, 성숙 단백질 전구체, 특히 시그널 펩티드를 포함하는 전구체, 다양한 기원의 서열의 융합으로부터 유래된 키메라 단백질, 또는 개선되거나 개질된 생물학적 특성을 나타내는 천연 단백질의 돌연변이체를 코딩할 수 있다. 그러한 돌연변이체는 천연 단백질을 코딩하는 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드(들)의 결실, 치환 및/또는 부가에 의해, 천연 단백질을 코딩하는 서열에서의 임의 다른 유형의 변화, 예를 들어, 전위 또는 역위 등에 의해 얻어질 수 있다.
벡터에 의해 전달되는 유전자는 숙주 세포에서의 그 발현에 적절한 요소(DNA 조절 서열)의 조절하에 위치할 수 있다. 적절한 DNA 조절 서열은 유전자를 RNA (안티센스 RNA 또는 mRNA)로 전사하고, mRNA를 단백질로 번역하는데 필요한 요소들의 세트를 의미하는 것으로 이해해야 한다. 예를 들어, 이들 요소는 적어도 프로모터를 포함한다. 프로모터는 구성적 또는 조절가능한 프로모터일 수 있으며, 진핵, 원핵 또는 바이러스 기원, 심지어는 아데노바이러스 기원의 임의 유전자로부터나 단리될 수 있다. 대안으로, 그것은 해당 유전자의 천연 프로모터일 수 있다. 일반적으로, 본 발명에서 사용되는 프로모터는 조절 서열을 함유하도록 변형될 수 있다. 예시적 프로모터는 유전자가 소정의 조직 유형에 표적화되는 경우 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 통상적인 프로모터는, 다수의 세포 유형에서 발현을 허용하는 것으로서, HSV-1 TK (헤르페스바이러스 타입 1 티미딘 키나제) 유전자 프로모터, 아데노바이러스 MLP (주요 말기 프로모터), RSV (라우스 육종 바이러스) LTR (장쇄 말단 반복부), CMV 조기 프로모터, SV-40 조기 프로모터 및 PGK (포스포글리세레이트 키나제) 유전자 프로모터를 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다.
아데노바이러스 벡터에 의해 전달될 유전자는 인터페론 및 인터루킨과 같은 사이토카인을 코딩하는 유전자; 림포카인을 코딩하는 유전자; 병원성 유기체(바이러스, 세균 또는 기생충), 바람직하게는 HIV 바이러스 (인간 면역결핍 바이러스)에 의해 인식되는 수용체와 같은 세포막 수용체를 코딩하는 유전자; 인자 VIII 및 인자 IX와 같은 응집 인자를 코딩하는 유전자; 디스트로핀을 코딩하는 유전자; 숙주 세포의 면역성을 증가시키기 위해 항원성 에피토프를 코딩하는 유전자; 주요 조직적합성 복합체 클래스 I 및 II 단백질을 코딩하는 유전자뿐만 아니라 이들 유전자의 인듀서인 단백질을 코딩하는 유전자; 항체를 코딩하는 유전자; 면역 독소를 코딩하는 유전자; 독소를 코딩하는 유전자; 성장 인자 또는 성장 호르몬을 코딩하는 유전자; 세포 수용체 및 그 리간드를 코딩하는 유전자; 종양 억제제를 코딩하는 유전자; 종양 유전자(이에 국한되는 것은 아님)를 비롯한 심혈관 질환에 관련된 유전자; 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 신경 성장 인자 (NGF)(이들에 국한되는 것은 아님)를 비롯한 성장 인자를 코딩하는 유전자; Rb (망막아세포종) 유전자(이에 국한되는 것은 아님)를 비롯한 e-nos, 종양 억제 유전자; 리포단백질 리파제; 슈퍼옥시드 디스뮤타제(SOD); 카탈라제; 산소 및 자유 라디칼 스캐빈져; 아포리포단백질; 및 pai-1 (플라스미노겐 활성화제 억제제-1); 세포성 효소 또는 병원성 유기체에 의해 생산된 것들을 코딩하는 유전자; 및 자살 유전자를 비롯한 임의의 유전자일 수 있지만, 이들에 국한되는 것은 아니다.
특정 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 백신은 돼지 동물에서의 질병을 야기하는 것을 방지하기 위해 그 돼지에 백신투여하기 위해 제조된다. 예를 들어, 백신은 슈도라비스 바이러스 (PRV) gp50; 전염성 위장염 바이러스 (TGEV) S 유전자; 돼지류 로타바이러스 VP7 및 VP8 유전자; 돼지류 호흡기 및 생식기 증후군 (PRRS) 바이러스의 유전자, 특히 ORF 3, 5 및 7; 돼지류 전염성 설사 바이러스의 유전자; 돼지 콜레라 바이러스의 유전자; 돼지류 파르보바이러스의 유전자; 및 구제역 바이러스의 유전자; 돼지류 써코바이러스와 관련된 유전자; 및 돼지류 인플루엔자 바이러스의 유전자에 대해 유도될 수 있다. 대표적인 소류 병원성 항원은 소류 헤르페스 바이러스 타입 1; 돼지류 설사 바이러스; 소류 코로나바이러스; 및 구제역 바이러스 유전자를 포함한다. 대표적인 인간 병원성 항원은 HIV 바이러스 항원 및 간염 바이러스 항원을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다.
사이토카인 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 상피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 플레이오트로핀(pleiotrophin), 혈소판-유래 성장 인자, 에리트로포이에틴, 줄기세포 인자 (SCF), TNF-α와 같은 성장 인자; 인터페론-γ, 인터페론-β, 인터페론-α, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구-매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)와 같은 인터페론; 기질 세포-유래 인자-1, 매크로파지 콜로니 자극 인자, RANTES, IGF-1, SDF-1, MIPlα, MCP-1 및 MCP-2, 에오탁신, 에오탁신3, 에오탁신4, LKNl, MPIF-2 및 LD78베타, 백혈병 억제 인자 (LIF), 예를 들면 IL-1, IL-2, IL-3, IL4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8. IL-9, IL-lO, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25와 같은 인터루킨, TOLL-유사 수용체 및 리간드, 인테그린 수용체 등도 또한 본 발명의 벡터를 사용하여 전달할 수 있다.
일부 상황에서는, 전체 유전자를 벡터 내로 혼입하는 것이 바람직할 수 있지만, 야생형 유기체에서 발견된 바와 같은 완전 서열보다는 오히려 유전자의 뉴클레오티드 서열의 일부(이것은 보호 면역 반응 또는 특이적 생물학적 효과를 발생시키기에 충분함)만을 포함하는 다른 벡터를 작제할 수 있다는 점을 이해해야 한다. 유전자가 대다수의 인트론을 함유한 경우, cDNA가 바람직할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 유전자는 적절한 프로모터의 조절하에 삽입될 수 있다. 또한, 벡터는 또한 인핸서 요소 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 포유류 세포에서의 외래 유전자를 성공적인 발현 및 발현 카세트의 작제를 제공하는 프로모터 및 폴리아데닐화 서열은 해당 기술, 예를 들면, 미국 특허 제5,151,267호에 공지되어 있으며, 이 특허의 개시내용은 본 명세서에 참고 인용되어 있다.
"발현 카세트"란 용어는 세포 중에서 유전자 또는 유전자 서열을 발현할 수 있는 천연 또는 재조합 생산된 핵산 분자를 의미한다. 발현 카세트는 전형적으로 프로모터(전사 개시를 허용함), 및 하나 이상의 단백질 또는 RNA를 코딩하는 서열을 포함한다. 임의로, 발현 카세트는 전사 인핸서, 비-코딩 서열, 스플라이싱 시그널, 전사 종결 시그널 및 폴리아데닐화 시그널을 포함할 수 있다. RNA 발현 카세트는 전형적으로 번역 개시 코돈(번역 개시를 허용함), 및 하나 이상의 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 임의로, 발현 카세트는 번역 종결 시그널, 폴리아데노신 서열, 내부 리보조옴 도입 부위 (IRES), 및 비-코딩 서열을 포함할 수 있다. 임의로, 발현 카세트는 단백질로 번역되지 않는 유전자 또는 부분 유전자 서열을 포함할 수 있다. 핵산은 표적 세포의 DNA 또는 RNA 서열의 변화를 수행할 수 있다. 이는 하이브리드화, 다중 가닥 핵산 형성, 상동 재조합, 유전자 전환, RNA 간섭 및 이후 기술되는 다른 메커니즘에 의해 달성할 수 있다.
아데노바이러스 벡터는 1 초과의 외래 유전자를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 돼지, 인간, 소 및 다른 포유류에 영향을 미치는 광범위한 각종 질병으로부터 보호를 제공하는데 이용할 수 있다. 본 발명의 재조합 항원성 결정소 또는 재조합 생 바이러스 중 어느 것이든 항원성 결정소 백신 또는 생백신 벡터에 대해 설명된 바와 실질적으로 동일한 방식으로 제제화될 수 있고 사용될 수 있다.
본 발명의 예시적 실시태양은 이종 뉴클레오티드(또한 본 명세서에서 이종 핵산으로도 지칭됨)가 단백질을 코딩하는 것이 되도록 존재하긴 하지만, 이종 뉴클레오티드는 사실 세포 중의 존재 또는 전사를 필요로 하는 서열을 함유하는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 벡터는 예를 들어, 유전자의 기능, 전사 또는 번역을 서열 특이적 분해 또는 억제를 야기하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 전달하는데 사용될 수 있다. 그러한 이종 뉴클레오티드는 siRNA, microRNA, 간섭 RNA 또는 RNAi, dsRNA, 리보자임, 안티센스 폴리뉴클레오티드, 및 siRNA, microRNA, dsRNA, 리보자임 또는 안티센스 핵산을 코딩하는 DNA 발현 카세트를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. SiRNA는 전형적으로 15 내지 50 염기쌍, 바람직하게는 19 내지 25 염기쌍을 함유하며, 세포내 발현된 표적 유전자 또는 RNA와 동일하거나 거의 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 이중가닥 구조를 포함한다. siRNA는 두 개의 어닐링된 폴리뉴클레오티드로 이루어지거나 헤어핀 구조를 형성하는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드로 이루어진다. microRNA (mRNA)는 그 mRNA 표적의 파괴 또는 번역 억제를 유도하는 약 22개 뉴클레오티드 길이의, 작은 비-코딩 폴리뉴클레오티드이다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 유전자 또는 mRNA에 상보적인 서열을 포함한다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 모르폴리노, 2'-O-메틸 폴리뉴클레오티드, DNA, RNA 등을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 그러한 이종 뉴클레오티드 서열은 시험관 내에서 재조합으로 중합될 수 있거나, 키메라 서열을 함유할 수 있거나 또는 이들 군의 유도체일 수 있다. 이러한 서열은 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 합성 뉴클레오티드, 또는 표적 RNA 및(또는) 유전자가 억제되도록 임의의 적절한 조합을 함유할 수 있다.
예시적 실시태양에서, 변형 rPAdV-gp55는 PKl5-743 세포에서 성장되거나, rPAdV-gp55는 비변형 PKl5A 세포에서 성장된다. 이어서 이를 시판용 라지 화이트종 돼지(Large White Pigs)에 피하 또는 경구 경로에 의해 투여한다. 변형된 백신은 피하 주사 또는 경구 투여되는 경우 돼지는 CSFV에 의한 치사량의 항원투여로부터 완전 보호된다. 또한, 피하 경로에 의해 투여된 변형 백신은 비변형 백신 군에서 검출된 것 보다 더 큰, 최고 수준의 NPLA 항체를 나타낸다. 종래의 연구는, 비변형 백신이 경구 경로에 의해 투여되는 경우, 항원투여 전에, 심지어는 추가항원자극 투여량의 투여 후에도 NPLA 항체 역가를 검출할 수 없다는 점을 입증해 보여준다[Hammond et al., 2001; Hammond et al., 2003]. 그러나, 변형 백신을 단지 단회 투여량만으로 투여한 후에도 경구 투여군에서 매우 유의적인 수준의 NPLA 항체가 검출되는데, 이러한 수준은 2차 투여량의 투여에 의해 추가항원자극된다. 이는 PAdV-3 및 PAdV-4 섬유 단백질을 둘 다 함유하는 변형 백신이 비변형 백신보다 돼지에서 보다 넓은 각종 조직에 표적화되고, 결과적으로 숙주에서 보다 강력한 면역 반응을 발생시킨다는 점을 나타내는 증거가 된다.
본 발명에서 특히 고려되는 것은, 본 발명의 방법에 따라 제조된 치료적 유효량의 재조합 아데노바이러스 벡터, 재조합 아데노바이러스 또는 재조합 단백질을 약학적으로 허용가능한 비히클 및/또는 보조제와 조합하여 포함하는 약학 조성물이다. 그러한 약학 조성물의 제조와 투여량 결정은 해당 기술 분야에 잘 알려진 기법에 따라 수행할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 전신 투여 (예를 들어, 정맥내, 기관지내, 혈관내, 폐내, 복강내, 비내, 비경구, 장내, 근육내, 피하, 종양내 또는 두개내 투여), 경구 투여, 에어로졸 투여 또는 폐내 점적주입을 비롯한 임의의 공지된 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 투여는 단회 투여량으로 또는 특정 시간 간격을 두고 1회 이상 반복된 투여량으로 수행할 수 있다. 적절한 투여 경로 및 용량은 상황 (예컨대, 치료받고 있는 개체, 치료하고자 하는 질병 또는 해당 유전자 또는 폴리펩티드)에 따라 변하지만, 해당 기술 분야의 당업자에 의해서는 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명은 추가로 섬유 유전자를 함유한 세포주에서 증식되지 않은 재조합 벡터에 비해 변경된 향성을 갖는, 치료적 유효량의 재조합 아데노바이러스 벡터 (예를 들어, PAdV-3 아데노바이러스 벡터)를 치료를 필요로 하는 포유류 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 사용되는 항원은 천연 또는 재조합 항원성 폴리펩티드 또는 단편일 수 있다. 그 항원은 부분 서열, 전장 서열 또는 심지어는 융합체 (예를 들어, 재조합 숙주 세포를 위한 적절한 리더 서열을 갖거나 다른 병원체에 대한 추가 항원 서열을 갖는 것)일 수 있다. 본 발명의 바이러스 시스템에 의해 발현될 바람직한 항원성 폴리펩티드는 항원을 코딩하는 전장 (또는 거의 전장) 서열을 함유한다. 대안으로, 항원성인 보다 짧은 길이의 서열(즉, 하나 이상의 에피토프를 코딩한 것)이 사용될 수도 있다. 그 보다 짧은 길이의 서열은 시험관내 검정법에서 바이러스 감염성을 중화시키는 항체를 유도할 수 있는 에피토프로서 정의된 "중화 에피토프"를 코딩할 수 있다. 펩티드는 숙주에서 "보호적 면역 반응" 즉, 면역화된 숙주를 감염으로부터 보호하는 항체- 및/또는 세포-매개된 면역 반응을 유발할 수 있는 "보호적 에피토프"를 코딩해야 한다.
본 발명에서 사용된 항원은, 특히 짧은 올리고펩티드로 이루어지는 경우, 백신 캐리어에 결합될 수 있다. 백신 캐리어는 해당 기술 분야에 잘 알려져 있다: 예를 들어, 소류 혈청 알부민 (BSA), 인간 혈청 알부민 (HSA) 및 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH: keyhole limpet hemocyanin)이 있다.
삽입될 수 있는 소정의 항원에 대한 유전자 또는 그의 코딩 서열은 포유류에서 질병을 유발하는 유기체의 것들, 특히 구제역 바이러스, 소류 로타바이러스, 소류 코로나바이러스, 소류 헤르페스 바이러스 타입 1, 소류 호흡기 합포체 바이러스, 소류 파라인플루엔자 바이러스 타입 3 (BPI-3), 소류 설사 바이러스, 파스퇴렐레아 헤몰리티카 (Pasteurella haemolytica), 헤모필러스 솜너스(Haemophilus somnus)와 같은 소류 병원체 등의 것들을 포함한다. 인간 병원체의 항원을 코딩하는 유전자가 또한 본 발명의 실시에 유용하다. 외래 유전자 또는 단편을 운반하는 본 발명의 백신은 또한 적절한 경구용 캐리어 중에, 예컨대, 장용 코팅된 제형으로 경구 투여될 수 있다. 경구용 제제는 통상적으로 사용되는 부형제, 예를 들어, 약학 등급의 만니톨, 락토오즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린 셀룰로즈, 탄산마그네슘 등을 포함한다. 경구용 백신 조성물은 액제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 서방형 제제 또는 분제의 형태로 투여될 수 있으며, 이들 형태는 약 10% 내지 약 95%의 활성 성분, 바람직하게는 약 25% 내지 약 70%의 활성 성분을 포함한다. 경구 및/또는 비내 백신투여는 전신 면역성과 병행하여 점막 면역성(이것은 호흡관 및 위장관을 감염시키는 병원체에 대항하는 보호에 중요한 역할을 함)을 유발하는데 바람직할 수 있다.
백신은 또한 좌제로 제제화될 수 있다. 좌제의 경우, 백신 조성물은 통상의 결합제 및 캐리어, 예를 들어, 폴리알칼라인 글리콜 또는 트리글리세리드를 포함한다. 그러한 좌제는 활성 성분을 약 0.5% 내지 약 10% (w/w), 바람직하게는 약 1% 내지 약 2%의 범위로 함유하는 혼합물로부터 성형시킬 수 있다.
동물에 본 발명의 백신 조성물(들)을 투여하는 프로토콜은 본 발명의 개시내용의 관점에서 보면 해당 기술 분야의 기술에 속한다. 해당 기술 분야의 당업자는 항원성 단편에 대한 항체- 및/또는 T-세포 매개된 면역 반응 또는 다른 형태의 치료적 또는 예방적 효과를 유도하는데 효과적인 투여량으로 백신 조성물의 농도를 선택한다. 그 용량은 넓은 범위 내에 속하며, 결정적인 것이 아니다. 전형적으로, 백신 조성물은 용이한 비히클 부피, 예컨대, 약 1 내지 10 cc 중의 서브유닛 항원 약 1 내지 약 1,000 마이크로그램으로 전달되는 방식으로 투여된다. 단회 면역화에서 그 용량은 약 1 내지 약 500 마이크로그램의 서브유닛 항원, 보다 바람직하게는 약 5 내지 10 내지 약 100 내지 200 마이크로그램(예를 들어, 5 내지 200 마이크로그램)의 서브유닛 항원을 전달한다.
투여 시기가 또한 중요할 수 있다. 예를 들어, 1차 접종을 수행할 수 있고, 필요한 경우, 후속적으로 추가항원자극 접종을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 임의적이기는 하지만, 초기 면역화한지 수 주 내지 수 개월 후에 동물에 2차의 추가항원자극 면역화를 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 질병에 대하여 지속적인 높은 수준의 보호를 보장하기 위해서는, 규칙적인 간격, 예를 들면 수 년마다 1회로 추가항원자극 면역화를 재수행하는 것이 바람직할 수 있다. 대안으로, 초기 투여량은 경구 투여할 수 있고 이어서 후기 접종을 수행할 수 있거나, 또는 그 반대로도 수행할 수 있다. 바람직한 백신투여 프로토콜은 통상적인 백신투여 프로토콜 실험을 통해 달성할 수 있다.
생체내 재조합 바이러스 백신을 투여하는 모든 경로에 대한 용량은 숙주/환자의 크기, 보호가 필요한 감염의 성질, 캐리어 등을 비롯한 각종 인자에 따라 달라지며, 해당 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 비제한적인 예로서, 103 pfu 내지 1015 pfu, 바람직하게는 104 내지 1013 pfu, 보다 바람직하게는 105 내지 1011 pfu의 용량이 사용될 수 있다. 시험관내 서브유닛 백신에서와 같이, 추가 용량은 관련된 임상적 인자에 의해 결정되는 바와 같이 제시될 수 있다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 재조합 세포주는 섬유 영역, 예를 들어, 실시예에 나타낸 바와 같은 PADV-4의 섬유 영역을 포함하는 발현 카세트를 작제하며, 그리고 이것으로 숙주 세포를 형질전환하여, 재조합 아데노바이러스의 향성을 변경하고자 하는 본 발명의 목적을 위한 제2의 섬유 유전자를 함유하는 세포를 제공함으로써, 생산된다. 이러한 재조합 세포주는 제2의 섬유가 아데노바이러스 벡터 내로 삽입되는 것을 허용할 수 있다. 이러한 세포주는, DNA-매개된 동시-형질감염(cotransfection)을 수행한 후 생체내 재조합을 통해, 외래 유전자 또는 단편을 코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열에 의해 교체된 섬유 유전자 결실부를 갖는 재조합 벡터를 발생시키는데 극히 유용하다. 추가로, 숙주 세포는 또한 아데노바이러스 게놈에 대해 코딩된 하나 이상의 필수적 기능을 제공할 수 있으며, 여기서 세포주는 특정한 결함성 재조합 아데노바이러스 벡터에 결여되어 있는 기능(들)을 제공한다. 따라서, 섬유를 함유하는 재조합 세포주는 또한 예컨대, 헬퍼 바이러스와 함께 동시 감염시키는 것을 통해, 또는 특정 바이러스 기능을 코딩하는 바이러스 게놈의 단편을 안정한 형태로 통합시키거나 다른 방식으로 유지하는 것을 통해 바이러스 기능을 제공할 수 있는 상보적 세포주일 수 있다.
본 발명의 재조합 포유류, 특히 돼지류 세포주는 단백질의 재조합 생산에도 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 유전자 전달을 필요로 하는 포유류, 예컨대 돼지류, 소류, 인간, 양류, 개류, 고양이류 또는 기타 포유동물에게 유전자 전달을 제공하여, 유전자 결함을 조절하고/조절하거나, 치료적 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 제공하고/제공하거나, 유전자 돌연변이를 유도하거나 수정하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 예컨대, 유전적 질병, 감염성 질병, 심혈관 질병 및 바이러스 감염(이들에 국한되는 것은 아님)을 비롯한 병태의 치료에 이용할 수 있다. 이러한 종류의 기법은 현재 해당 기술 분야의 당업자에 의해 각종 질병 병태를 치료하는데 사용되고 있다. 통상의 유전자 요법에 사용하기 위해 혼입될 수 있는 외래 유전자, 뉴클레오티드 서열 또는 그 부분은 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절 유전자, 인간 미니디스트로핀 유전자, 알파-1-안티트립신 유전자, 심혈관 질환에 관련된 유전자 등을 포함한다.
특히, 인간에 있어서 유전자 전달에 관련된 본 발명의 실시는 유전적 질병 (예를 들어, 혈우병, 지중해 빈혈, 기종, 고셔(Gaucher's) 질환, 낭포성 섬유증, 두첸(Duchenne) 근육 이영양증, 두첸(Duchenne's) 또는 벡커(Becker's) 근증 등), 암, 바이러스 질병 (예를 들어, AIDS, 헤르페스바이러스 감염증, 사이토메갈로바이러스 감염증 및 파필로마바이러스 감염증), 심혈관 질병 등(이들에 국한되는 것은 아님)을 비롯한 질병의 예방 또는 치료를 의도한다. 본 발명의 목적에 있어서, 본 발명의 방법으로 제조된 벡터, 세포 및 바이러스 입자는 대상에 생체외 (즉, 환자로부터 제거된 세포(들)로) 도입되거나, 또는 치료하고자 하는 대상에 직접 생체내 도입될 수 있다.
본 실시예에서는 PAdV-4 섬유 유전자를 안정하게 발현하는 세포주의 생산을 위한 방법 및 조성물에 관한 예시적 교시내용을 제시하였다. 현쟁 돼지류 아데노바이러스 재조합 벡터, 예를 들어, 돼지 콜레라 바이러스 (CSFV)의 gp55 유전자를 발현하는 PAdV-3 벡터[Hammond et al., 2000]를 이들 세포주 중에서 성장시켜, 천연 PAdV-3 섬유 및 추가의 PAdV-4 섬유 단백질을 둘 다 함유하는 선조 바이러스를 결과로 형성할 수 있었다. 바이러스 캡시드 상의 상이한 두 가지 단백질의 존재는 벡터의 세포 향성을 넓혔다. 그와 같이 함으로써, 벡터는 동물내 보다 많은 각종 세포 유형을 표적화 할 수 있고, 전달된 외래 유전자를 보다 넓은 폭의 숙주 면역 반응에 노출시킬 수 있었다. 또한, 섬유 유전자가 결실되도록 조작하여 외래 유전자 삽입을 위한 더 많은 공간을 제공할 수있는 재조합 벡터는 그러한 섬유 단백질을 코딩하는 세포주 중에서 계대배양함으로써 보완될 수 있다. 이러한 접근법은 추가의 DNA 팩키징 성능을 갖는 섬유 양성 바이러스의 생산을 허용하였다.
실시예 1: 재료 및 방법
세포 및 바이러스: ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입한 돼지류 신장 세포 (PK-15) (ATCC-CCL-33)를 5% 송아지 태아 혈청(FCS), 10 mM N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄-술폰산(HEPES), 1% Na-피루베이트 및 2 mM 글루타민으로 보충된 얼스 (Earle's) 변형 이글 배지 (EMEM) 중에서 성장시켰다. 미국 농무부-동식물 검역소(United States Department of Agriculture - Animal and Plant Health Inspection Services (USDA-APHIS))로부터의 돼지 고환 세포(ST)를 10% FCS, 10 mM HEPES, 1% Na-피루베이트, 0.25% 락트알부민 가수분해물(LAH) 및 2 mM 글루타민으로 보충된 EMEM 중에 유지시켰다.
돼지류 아데노바이러스를 2% FCS로 보충된 EMEM 중에 유지시킨 1차 돼지류 신장(1°PK) 세포 중에서 성장시키고, 세포의 90%가 세포변성 효과(CPE)를 나타낼 때 수확하였다. 모든 배지는 2.5 μg/ml 펀지존 (Squibb), 100 단위/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신 (CSL)으로 추가 보충되었다.
바이러스 DNA 제조: 바이러스 DNA는 허트 Hirt (1967)의 방법에 따라 문헌 (Shinagawa et al. (1983))에 기재된 바와 같은 약간의 변형을 가하여 제조하였으며, 제한 효소 절단은 제조자의 설명서에 따라 수행하였다.
플라스미드 DNA 제조: 플라스미드 DNA는 제조자의 설명서에 따라 퀴아젠 (Qiagen) 시스템을 이용하여 제조하였다.
PAdV-4 DNA로부터 PAdV-4 섬유 유전자의 단리: PADV-4 섬유 유전자는 하기 프라이머 쌍을 이용하여 PAdV-4 DNA로부터 PCR에 의해 증폭하였다:
Figure 112009010323237-PCT00001
PCR은 PCR 슈퍼믹스 (Life technologies)를 사용하여, 94 ℃ 1 분, 50 ℃ 2 분 및 72 ℃ 30 초의 30 사이클(사이클마다 30초 연장됨)의 연장 프로토콜로 수행하였다.
플라스미드 작제물: PAdV-4 섬유 PCR 생성물을 겔 정제하고, pGEM-T (Promega) 내로 결찰하여 플라스미드 PJJ392 (도 1a))를 생성하였다. 제한 효소 절단한 후, PAdV-4 섬유 유전자를 함유하는 pJJ392로부터의 BamHI/BglII 단편을 플라스미드 pCI-TPL 중의 BamHI 부위 내로 삽입하여 pJJ741 (도 1b))를 산출하였다. TPL-PADV-4 섬유 유전자를 함유하는 pJJ741의 NheI/NotI 단편을 pCIneo (Promega)내로 삽입하여 트랜스퍼 벡터 pJJ743를 작제하였다 (도 1c)). 플라스미드 작제물은 제한 효소 절단에 의해 정확한 삽입부의 존재 여부에 대해 검사하고, TPL 서열의 5'에 결합하는 프라이머 5' TTT ACT GGG CTT GTC GAG ACA G 3'를 사용하여 시퀀싱함으로써 확인하였다.
안정한 세포주의 생산 및 특성화: ST 및 PK-15 세포를 각각의 배지에서 성장시키고, 약 5 x 106개 세포를 20 μg XmnI 선형 플라스미드 pJJ743 DNA로, 바이오-래드 진펄서(Bio-Rad Genepulser, 셋팅 300 V, 960 μF 및 ∞ Ω)를 사용하여 전기천공하였다. 세포를 1.25% DMSO로 보충된 각각의 배지 (Melkonyan et al., 1996) 중에 밤새 방치하여 회수하였다. 이어서, 배양액에 800 (ST) 또는 1000 (PK15) μg/ml G418 (Promega)를 가하여 G418 내성 세포를 선택하였다. 희석액을 제한하여 개별 클론을 단리하고 연장시켰다. 클론을 PCR에 의해 섬유 유전자의 존재에 대해 스크리닝하고, 섬유 mRNA의 발현을 RT-PCR로 확인하였다.
게놈 DNA의 정제: 형질감염된 세포로부터의 게놈 DNA를 DNeasy 조직 키트 (Qiagen)를 사용하여 제조자의 설명서에 따라 정제하였다.
PCR 조건 및 프라이머: PCR을 PCR 슈퍼믹스 (Gibco BRL)를 사용하여 94 ℃에서 10분 1 사이클, 94 ℃ 1 분, 5O ℃ 1 분, 및 72 ℃ 2 분의 30 사이클 및 72 ℃에서 10분 최종 연장으로 된 표준 프로토콜로 수행하였다. 프라이머 쌍 5' GCA CTG GAC TCG GAT GGA CA 및 3' AGC TGC TTG GTC CTG CGT CT 3'를 예상된 밴드 804 bp로 PADV-4 섬유 유전자 검출에 사용하였다.
세포 mRNA의 RT-PCR 정제: 형질감염된 세포로부터의 총 RNA를 RNeasy 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제하였다.
RT-PCR 제1 가닥 cDNA 합성: mRNA를 cDNA로, 제1 가닥 cDNA 합성용 슈퍼스크립트 예비증폭 시스템 (SUPERSCRIPT Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (Gibco BRL))을 사용하여 제조자의 설명서에 따라 전환하였다.
표적 cDNA의 RT-PCR 증폭: 표적 cDNA를 상기 설명한 PCR 프로토콜 및 프라이머를 사용하여 증폭하였다.
rPAdV-gp55 스톡의 생산: PK15A, PK15-743, ST 및 ST-743 세포를 90% 컨플루언시로 배양한 후에 rPAdV-gp55로 감염시켰다. 200 μl의 rPAdVgp55를 세포 시이트에 가하고, 37 ℃에서 1 시간 동안 흡착시켰다. 20ml의 EMEM (최종 농도 2% FCS로 보충됨)을 가하였다. 플라스크를 37°C, 5% CO2 중에서 항온 처리하고, cpe를 매일 관찰하였다. 플라스크가 70 내지 80% cpe를 나타낼 때, 바이러스를 세 번의 냉동/해동을 통해 수확하였다.
정제된 바이러스 스톡의 제조: 각 군의 플라스크로부터 유래한 상등액을 합하여 주안 (Jouan) C3000 벤치 원심분리기에서, 20 분간 2000 rpm로 원심분리하여 맑게 하였다. 이어서, 상등액을 SW28 초원심분리기 튜브에 경사 분리하고, 벡크만 (Beckman) LM-80 초원심분리기에서 90 분간 25,000 rpm로 20 ℃에서 원심분리하였다. 상등액을 폐기하고, 바이러스 펠릿을 500 μl TE에 재현탁시켰다. 물질을 필요로 할 때까지 -20 ℃에서 1.5 ml 스크류 캡 튜브(Sarstedt)에 보관하였다.
불연속 슈크로즈 밀도 구배를 이용한 정제: 미정제 바이러스 제제를 NTE 중의 60% (w/v), 30% (w/v) 및 20% (w/v)의 3가지 슈크로즈 농도를 포함하는 SW28 초원심분리기 튜브 중에서 제조된 불연속 슈크로즈 밀도 구배를 이용하여 추가 정제하였다. 1 ml의 바이러스 스톡을 구배에 따라 주의하여 층상화하고, 튜브를 벡크만 LM-80 초원심분리기에서 28,000 rpm로 2 시간 동안, 4 ℃에서 원심 분리하였다. 정제된 바이러스를 5 ml 시린지 및 19 게이지 니들을 사용하여 제거하고, SW28 초원심분리기 튜브 내로 넣은 후 TE로 채웠다. 이어서, 정제된 바이러스를 벡크만 LM-80 초원심분리기에서 90분, 25,000 rpm, 20 ℃에서 펠렛화하여 슈크로즈를 제거하였다. 펠렛을 최종적으로 TE 중에 재현탁시키고, 필요로 할 때까지 -20 ℃에 보관하였다.
섬유 특이적 펩티드 래빗 항혈청의 발생: PAdV-3 및 PAdV-4 섬유 단백질의 아미노산 서열(Reddy et al., 1995; Kleiboeker 1995)을 비교하고, 두 개의 합성 펩티드(Auspep Pty Ltd-Australia)를 설계하여 생산하였다. 펩티드 1은 PAdV-3와 PAdV-4 사이에 보존된 섬유 단백질의 영역을 포함하였고, 펩티드 2는 PAdV-4 섬유에 특이적인 서열을 포함하였다.
PAdV-3/PAdV-4 공통적 펩티드: CGGDFDPVYPYD
PAdV-4 특이적 펩티드: CAAASEEMPAPPEA
PAdV-3 및 PAdV-4 섬유 단백질의 완전 아미노산 서열 및 두 개의 펩티드의 위치는 도 5에 나타내었다. 래빗에서 면역 반응을 발생시키기 위해 두 개의 펩티드를 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌)에 결합시켰다. 두 펩티드 결합체를 래빗에 주사하여 표 1에 나타난 바와 같은 특이적 항혈청을 생산하였다.
표 1: 각각의 날짜에서 임의의 처리를 수행하기 전에 래빗으로부터 채혈하였다. 2 마리 암컷 백색 래빗에게 보조제 중의 특이적 펩티드를 투여하고, 다른 2 마리 암컷 백색 래빗에게 보조제 중의 공통적 펩티드를 투여하였다. 제1의 2개 투여량에 사용된 보조제는 Quil A였고, 나머지 투약량에 사용된 보조제는 IFA (불완전 프로이트 보조제)였다. 보조제 중의 펩티드(4 x 250μl)의 총 1 ml를 피하 경로를 통해 투여하였다. 제113 일째에 래빗으로부터 채혈하고, 혈청을 분리하여 필요로 할 때까지 ~2O ℃에서 보관하였다.
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정제된 바이러스의 PAdV-4 섬유 존재 여부에 대한 검사: SDS-PAGE 겔 분석. 정제된 바이러스 샘플을 8-12% 비스-트리스(Bis-Tris) SDS-PAGE 프리캐스트 겔 (Invitrogen)상에서 PADV-3 및 PADV-4 섬유 단백질의 존재 여부에 대해 분석하였다. 전기영동을 수행한 후, 단백질을 1 시간 동안, 100 V에서 면역-블롯팅하여 니트로셀룰로즈 멤브레인 상으로 옮겼다. 이어서, 멤브레인을 TBS/3% 소류 혈청 알부민 중에서, 4 ℃에서 밤새 차단하였다.
정제된 바이러스의 PAdV-4 섬유 존재 여부에 대한 검사: 웨스턴 블롯 분석. 모든 세척과 항체 항온 처리는 실온에서 수행하였다. 멤브레인을 TBS-트윈/트리톤 중에 5분간 2회, TBS로 10분간 1회 세척하였다. 폴리클로날 래빗 항-섬유 항체를 TBS/3% BSA 중의 1/200 희석액으로 멤브레인에 가한 후 1 시간 동안 항온 처리하였다. 멤브레인을 TBS-트윈/트리톤 중에 5분간 2회, TBS 중에 10분간 1회 세척하였 다. 멤브레인은 호스-래디쉬 퍼옥시다제(HRP) (Sigma)에 결합된 염소 항-래빗 항체를 사용하여 5% 탈지유/블로토 용액 중의 1/500 희석액으로 항온 처리하였다. 이어서, 멤브레인을 상기한 바와 같이 세척하고, 강화형 화학발광 (ECL) 검출법(Amersham Pharmacia Biotech Ltd)을 이용하여 단백질 밴드를 시각화하였다.
돼지 실험을 이용한 생체내 분석: PK15-743 세포 중에서 성장된 변형 rPAdV-gp55, 또는 비변형 PK15A 세포 중에서 성장된 rPAdV-gp55를 상업적으로 구입가능한 라지 화이트종 돼지(Large White Pig)에 하기 섭생에 따라 투여하였다:
제0일째: 모든 돼지로부터 채혈하고, 백신투여하였다.
제1군: 1차 투여량 - 2 x 105 TCID50 비변형 rPAdV-gp55 백신, 피하주사
제2군: 1차 투여량 - 2 x 105 TCID50 변형 rPAdV-gp55, 피하 주사
제3군: 1차 투여량 - 2 x 105 TCID50 변형 rPAdV-gp55, 경구 경로
제22일째:
제1군: 2차 추가항원자극 투여량 - 2 x 105 TCID50 비변형 rPAdV- gp55 백신, 피하 주사
제2군: 2차 추가항원자극 투여량 - 2 x 105 TCID50 변형 rPAdV-gp55 백 신, 피하 주사
제3군: 2차 추가항원자극 투여량 - 2 x 105 TCID50 변형 rPAdV-gp55, 경구 경로
제47일째: 두 마리의 청정한(clean), 연령 및 중량을 맞춘 돼지를 항원투여 바이러스 대조군으로 구입하였다.
제49일째: 청정한 대조군을 비롯한 모든 돼지에게 치사 투여량의 CSFV 웨이브릿지 ('Weybridge') 스트레인(1000 TCID50)를 피하 주사하여 항원투여하였다. 항원투여 후 직장내 온도를 매일 기록하고, 모든 돼지를 식욕 상실, 횡와위(recumbency), 설사 및 발 상의 발적으로서 나타난 질병의 임상적 징후에 대하여 매일 모니터링하였다. 돼지를 실험 종료시에 또는 심각한 임상적 증상을 나타낼 때 안락사 처리하고, 비장을 CSFV 항원 검출을 위해 제거하였다. 모든 안락사된 돼지에 대하여 사후 검사를 실시하였다.
CSFV에 대한 혈청 중화 항체의 검출: 일주일 간격으로 돼지로부터 채혈하고 혈청은 문헌(Terpstra and colleagues, [1984])에 기재된 바와 같은 중화 퍼옥시다제-결합 검정법(NPLA)에 의해 CSFV에 대한 중화 항체의 존재 여부에 대해 테스트하였다. NPLA 역가는 50%의 복제 배양액 중에서 200 TCID50의 웨이브릿지 스트레인을 중화시키는 혈청 희석율의 역수로서 표현하였다.
항원 포획 ELISA: 항원투여된 돼지의 비장 중의 CSFV 항원의 존재를 항원 포획 ELISA [Shannon et al., 1993]로 측정하였다.
실시예 2: 벡터, 세포주 및 바이러스 제조의 결과
PAdV-4 섬유를 함유하는 트랜스퍼 벡터의 발생: 뉴클레오티드 시퀀싱은 트랜스퍼 벡터 pJJ743가 PAdV-3 TPL 서열의 하류에 PAdV-4 섬유 유전자를 함유하고 있다는 것을 확인해주었다 (도 1c)).
PAd V-4 섬유 단백질을 구성적으로 발현하는 세포주의 발생: ST 및 PK-15 세포를 트랜스퍼 벡터 pJJ743로 형질감염시키고, G418로 선택하여 통합된 DNA를 함유하는 클론을 달성하였다. 두 개의 PK-15 클론(8 및 9)을 PCR 테스트하였는데, PAdV-4 섬유 유전자를 함유하는 것으로 나타났다 (도 2a). pJJ743로 형질감염된 12개의 ST 클론(2-14)을 PCR로 테스트하였으며, 10개의 클론 (2,3,5,6,7,8 및 11-14)은 PAdV-4 섬유 유전자를 함유하는 것으로 나타났다(도 2b 및 2c). 이어서, 양성 클론을 세포유형, 그 다음 접두사 743, 및 이어서 클론 번호를 붙여, 예를 들어, PK15-743-9와 같이 명명하였다.
이어서, 이들 세포 클론 중에서의 섬유 mRNA의 발현을 RT-PCR로 평가하였다.
세포주 PKl 5-743-9 및 ST-743-2,5,6 및 8에서는 다량의 섬유 4 mRNA가 검출되었다 (도 3a 및 3b).
성장 특성: 섬유 유전자를 삽입한 후, PK-15-743 및 ST 743 세포는 부모 세포주보다 훨씬 느리게 성장하였다.
PAdV-4 섬유 존재 여부에 대한 정제된 바이러스의 검사: 세포주 PKl5-743-9를 rPAdV-gp55로 감염시키고, 세포가 80% cpe를 나타낼 때 바이러스를 수확하였다. 바이러스를 정제하고, 샘플을 8-12% SDS-PAGE 겔 상에 분리하였다. 나일론 멤브레 인으로 옮긴 후, 상술한 두 가지 펩티드에 대해 유발된 래빗 항혈청을 사용하여, PAdV-3 및 PAdV-4 섬유 단백질의 존재 여부에 대해 웨스턴 블롯으로 샘플을 분석하였다.
PAdV 3 및 4 섬유의 공통적 에피토프에 대하여 유발된 펩티드 항혈청으로 처리되는 경우, PAdV-3 섬유의 예상된 분자량(45kD)에 상응하는 밴드의 이중항을 비변형 PK15 세포 중에서 성장된 rPAdV-gp55를 함유하는 레인에서 볼 수 있었다 (도 5a, 레인 1). 이와 대조적으로, 변형 PKl5-743-9 세포에서 성장된 rPAdV-gp55를 함유하는 레인은 PAdV-3 섬유에 상응하는 이중항, 및 PAdV-4 섬유의 기대된 분자량 (77kD)에서의 추가 밴드를 함유하였다 (도 5a, 레인 2). PAdV-4 섬유 상의 특이적인 에피토프에 대하여 유발된 펩티드 항혈청으로 처리되는 경우, 비변형 PK15 세포 중에서 성장된 rPAdV-gp55를 함유하는 레인에서는 아무런 밴드도 검출되지 않았고 (도 5b, 레인 1), 반면에 변형 PKl5-743-9 세포 중에서 성장된 rPAdV-gp55를 함유하는 레인에서는 PAdV-4 섬유의 기대된 분자량에서 단일 밴드가 나타났다 (도 5b, 레인 2).
실시예 3: 돼지 백신투여 연구의 결과
변형 섬유 프로필을 갖는 rPAdV-gp55의 효능을 테스트하기 위한 돼지 시험: PAdV-3 및 PAdV-4 혈청형 섬유를 둘 다 갖는 변형 rPAdV-gp55 백신의 효능을 테스트하기 위하여, 라지 화이트종 돼지의 군에 변형 또는 비변형 백신의 2개 투여량을 투여하고, CSFV에 의한 치사량 항원투여에 대한 감수성을 측정하였다. 또한, 경구 경로에 의해 투여된 경우, 중화 항체를 유도하고 보호를 제공하는 변형 백신의 능 력도 테스트하였다.
백신투여에 대한 돼지의 반응: 둘 중 하나의 백신 제제를 둘 중 하나의 경로로 백신투여한 후 돼지에 대한 부작용은 없었다. 체온 증가나 임상적 징후의 출현도 없었다.
항원투여 후 돼지 체온: 대조군 돼지 및 각 군의 백신투여된 돼지에 대한 매일 평균 체온 및 표준 오차는 도 6에 도시하였다.
대조군 돼지: 대조군 돼지들은 제4일까지 열을 발생시키고, CSF 임상적 증후를 나타내었으며, 그 중 한 마리는 제4일 내지 5일에 이르는 밤새 동안 죽었으며, 한 마리 돼지는 항원투여 후 (p.c) 7일째에 날에 심각한 질병으로 인하여 안락사 처리하였다.
제1군: 비변형 rPAdV-gp55의 투여량을 피하 투여한 돼지 중 어느 것도 실험 종료까지 열을 발생시키지 않았고 또한 임의의 CSF 임상적 징후도 나타내지 않았다.
제2군: 변형 rPAdV-gp55의 투여량을 피하 투여한 돼지 중 어느 것도 실험 종료시까지 열을 발생시키지 않았고 또한 임의의 CSF 임상적 증후도 나타내지 않았다.
제3군: 변형 rPAdV-gp55의 투여량을 경구 투여한 세 마리 돼지 중 둘은 실험 종료시까지 열을 발생시키지 않았고 또한 임의의 CSF의 임상적 증후도 나타내지 않았다. 나머지 한 마리 돼지는 2일의 분리된 비연속적 일자에서 40 ℃를 넘는 체온을 나타냈으나, 실험 종료시까지 다른 CSF 임상적 징후를 나타내지 않았 다. 중요한 것은 항원투여 기간 동안 그 군의 평균 체온이 40 ℃ 이상으로 상승하지 않았다는 점이다.
CSFV 특이적 중화 항체의 발생: 제0일 및 그 후로는 실험 종료시까지 일주일 간격으로 모든 돼지로부터 채혈한 후, NPLA (Terpstra et al., 1984)에 의해 CSFV에 대한 중화 항체 존재 여부에 대해 혈청을 테스트하였다. NPLA 역가는 도 7 내지 9에 나타내었다.
대조군 돼지: 대조군 돼지는 검출가능한 CSFV 중화 항체를 발생시키지 않았다.
제1군: 모든 돼지는 백신투여 후 14일째 되는 날까지 검출가능한 CSFV 중화 항체를 발생시켰으며, 그 중 한 마리 돼지는 제7일째에 검출가능한 역가를 나타내었다. 그 수준은 2차 투여량의 투여로 추가항원자극되었다. 모든 돼지는 항원투여에 생존하였고, 항원투여 후 역가는 >8192이었다.
제2군: 모든 돼지는 백신투여 후 14일째 되는 날까지 검출가능한 CSFV 중화 항체를 발생시켰고, 그 수준은 2차 투여량의 투여로 추가항원자극되었다. 모든 돼지는 항원투여에 생존하였고, 항원투여 후 역가는 >8192이었다.
제3군: 모든 돼지는 백신투여 후 14일째 되는 날까지 검출가능한 CSFV 중화 항체를 발생시켰고, 그 수준은 2차 투여량의 투여로 추가항원자극되었다. 모든 돼지는 항원투여에 생존하였고, 항원투여 후 역가는 >8192이었다.
돼지 비장 중의 CSFV 항원 존재 여부에 대한 테스트: 항원투여된 돼지의 비장 중의 CSFV 항원의 존재 여부를 항원 포획 ELISA로 측정하고[Shannon et al., 1993], 그 수준을 도 9에 나타내었다.
대조군 돼지: 대조군 돼지는 비장 중에 높은 수준의 항원을 가졌는데, 이는 실험 종료시에도 감염이 지속되고 있다는 것을 나타낸다.
제1군: 비장 중의 CSFV 항원에 대해 양성인 돼지는 없었는데, 이는 실험 종료시에 모든 돼지에 질병 및 바이러스가 없다는 것을 입증한다.
제2군: 비장 중의 CSFV 항원에 대해 양성인 돼지는 없었는데, 이는 실험 종료시에 모든 돼지에 질병 및 바이러스가 없다는 것을 입증한다.
제3군: 비장 중의 CSFV 항원에 대해 양성인 돼지는 없었는데, 이는 실험 종료시에 모든 돼지에 질병 및 바이러스가 없다는 것을 입증한다.
상기 기술된 연구로부터 입증된 바에 따르면, PAdV-4 섬유 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터가 PKl5 및 ST 세포내로 형질감염되고, PAdV-4 섬유를 발현하는 안정하게 형질감염된 세포주가 생산되었다.
재조합 PADV-3 (rPAdV-gp55)는 PAdV-4 섬유를 발현하는 PK15-743 세포주를 통해 계대배양한 후 PAdV-3 및 PAdV-4 혈청형 섬유를 둘 다 함유하는 것으로 나타났다. 이 변형 재조합 백신을 돼지에 투여하고, 그 효능을 CSFV 항원투여 시험에서 평가하였다.
변형 백신은, 피하 주사 또는 경구 경로로 투여된 경우, CSFV 치사량 항원투여로부터 돼지를 완전히 보호하였다. 각각 변형 및 비변형 백신을 투여한 돼지들 사이에는 항원투여 후 체온 반응의 유의적인 차이 또는 비장으로부터 CSFV 항원의 제거율의 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 그러나, 피하 경로에 의해 투여된 변 형 백신은 전체 3 군 중에서 가장 높은 수준의 NPLA 항체를 발생시켰는데, 이는 비변형 백신투여 군에서 검출되는 것보다 높았다. 또한, 발명자들은 이전에 비변형 백신이 경구 경로에 의해 투여되는 경우 항원투여 전에는 심지어는 추가항원자극 투여량의 투여 후에도 NPLA 항체 역가가 검출될 수 없다는 점을 입증한 바 있다[Hammond et al., 2001; Hammond et al., 2003]. 본 실험에서는, 경구 투여 군에서 단지 단회 투여량만으로 투여한 후에도 매우 유의적인 수준의 NPLA 항체가 검출되었으며, 이러한 수준은 2차 투여량의 투여에 의해 추가항원자극되었다. 이러한 발견은 PADV-3 및 PAdV-4 섬유 단백질을 모두 함유하는 변형 백신이 비변형 백신보다 돼지에 있어서 보다 넓은 각종 조직에 표적화되고, 결과적으로 숙주에서 보다 광범한 면역 반응을 발생시킨다는 매우 우수한 증거를 제공한다.
상기 데이터로부터, 변형 rPAdV-gp55는 경구 투여시에 gp55에 대한 혈청 중화 항체를 발생시키는데 효과적인 반면, 비변형 백신은 그러하지 않다는 결론을 내릴 수 있다. 사실, PAdV-3 및 PAdV-4 섬유를 모두 갖는 키메라 백신은 돼지에 있어서 면역 반응의 크기를 변경시키고/변경시키거나 증가시켰다. 그러한 백신은 유효한 경구 전달을 허용하기 위해서 생산될 수도 있다. 본 명세서에 교시된 예시적 실시태양가 주어진 바에 따르면, 개발된 기법은 PAdV-4 섬유를 임의의 PAdV-3-기초된 백신 내로 혼입하여 표적화 전달에 의해 효능을 개선한다. 또한, 이중 섬유 시스템의 이용이 재조합 아데노바이러스 백신의 증가된 향성을 허용하는 다른 아데노바이러스 벡터 및 세포주도 생산될 수 있다.
본 발명에 추가의 기술적 배경을 제공하는 문헌상 다수의 참고문헌이 존재한 다. 이러한 참고문헌 중 일부는 하기 제공되며, 그 전체 내용이 본 명세서에 참고 인용되어 있다.
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Figure 112009010323237-PCT00004
Figure 112009010323237-PCT00005
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서열 정보
서열 번호 1: 우측 말단(rhe: right hand end)을 향하는 섬유로부터 유래한 2250개 염기 서열로부터의 PadV4 섬유 유전자. PAdV3 섬유와의 우수한 매칭(굵은 글씨 부분)이 존재하지만, 모든 후속 서열은 새로운 것이다.
Figure 112009010323237-PCT00007
Figure 112009010323237-PCT00008
서열 번호 2: 우측 말단(rhe)을 향하는 PadVl로부터 유래한 섬유로부터의 1858개 염기 서열. 일부 섹션(굵은 글씨 부분)에는 PAdV3과의 우수한 매칭이 존재하고, 정상적인 글씨체 부분에는 새로운 서열이 존재한다.
Figure 112009010323237-PCT00009
Figure 112009010323237-PCT00010
서열 번호 3: 우측 말단(rhe)을 향하는 PadV2 섬유로부터의 969개 염기 서열. PAdV3의 완전 rhe를 포함하는 일부 섹션(굵은 글씨 부분)에는 PAdV3과의 우수한 매칭이 존재하고, 정상 글씨체 부분에는 새로운 서열이 존재한다.
Figure 112009010323237-PCT00011
Figure 112009010323237-PCT00012
서열 번호:4 제2 데이터 세트로부터의 PAdV2 섬유. 1176개 염기 서열은 PAdV3와의 우수한 매칭을 제공하지만, 좌측 말단(굵은 글씨 부분)을 향하는 역배향으로 존재하는데, 이는 최종 프라이머가 아마도 게놈의 양 말단을 ITR로부터 떼어내어 이중 서열 정보를 제공하였다는 것을 제시한다.
Figure 112009010323237-PCT00013
Figure 112009010323237-PCT00014
서열 번호:5 PAdV2 콘티그의 역 상보성
Figure 112009010323237-PCT00015
서열목록
Figure 112009010323237-PCT00016
Figure 112009010323237-PCT00017
Figure 112009010323237-PCT00018
Figure 112009010323237-PCT00019
Figure 112009010323237-PCT00020
Figure 112009010323237-PCT00021
Figure 112009010323237-PCT00022
Figure 112009010323237-PCT00023
Figure 112009010323237-PCT00024
Figure 112009010323237-PCT00025
SEQUENCE LISTING <110> Hammond, Jeffrey Johnson, Michael A. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR INCREASING TISSUE TROPISM OF RECOMBINANT ADENOVIRAL VECTORS <130> 19822WO01 <140> PCT/IB 07/002710 <141> 2007-07-27 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2162 <212> DNA <213> Porcine adenovirus 4 <400> 1 aacccacctg gaacaccaag tgccagatgc tccagttttt tctaccgcgg gagtttcgaa 60 agtttaccct cagatactgt agtcagacac aaagatgtaa ctgccwgcat gagaaagttt 120 attggcaata aagctactgg aaacgatgcg tgtggtgatc tttccccctc ccccaaattt 180 cattttgtaa cataccctat gggaaggccc cggcccacag tcagccacag tctcaagttg 240 ctccagctca ggtgaggtaa tgctgatgaa cccaggcgat atcagtctcg catccaaggt 300 gtgatccaaa ctctgtgaaa atcatactcc gcttgtaaac tttcgccaag gcaccggggt 360 tccatacacc atcaatcttc gcagacgtcg ccgccgtgcg ccgtcccgaa aagccgggta 420 gaacactctc ggtcgaggtc ccccaactct cagcaaccta aaagcctcct gaagcaactc 480 cctgctctga accgcacact gcctcacatc acgttcatgc agagacatac atccagtaca 540 caagcgtata aagtagtaat tagttgcagt acagagaaat ttcacagacg ggcctgacag 600 ttgctgcttc aaaagccaaa agtcattccc ctgtctgcag caaaacacca caaagtgcag 660 ccccgccacc atataggagc ccctgcaaga gatagcttta ggtaagtcaa cacacaccct 720 cttctgcata ccagatgaag ctgcggttaa agaaacagcc cctgggatca cagacgtagc 780 caaaggtctt caccaccaca ctcctagccc tacattgcaa gagagtgrgg gctgtcacag 840 ktgrmcaatg tatagaaagc acctctcgac catacaagta atttccccsa awacagattg 900 tttaactcca aggscccggg ggccagaccc atcccagttc tacggagaca ttgcaaagtg 960 gagccagaag caaccaaatc ccaaggcacc ggaagatcta agtaagctgt gaaacatgct 1020 gcaggtggag tggtgcttac cgctccaact agatgcttag agtcacatgg ttcaacagaa 1080 gtcattgtcc tggaagagga agagggaaag cattaaagca ccgaaacagc tcaatggggg 1140 ggctggtgtg gtacacagcc accatacggg aaccaagaaa agtcaacagg ccagaggcca 1200 aatcctgctg ggactccgga gttgcaaaca gccgagagcc cgccgtgact gtgatagtgt 1260 gcctgccttg aggtaaatca agcatgcagc aacaatgcag aaaagactca gagcgagtac 1320 cagggcgagt ttccaaatca aagcgaatca gcaagtaatc ataaaccaag gatctgatca 1380 catccagcca aagswckwcm cgaaggcaaa gtaggatccc ctggcacatc cgtgatgtac 1440 aggtgccagg accaagcgct gtacacgaaa gtgccggacg ccatcttgcg tacagatcac 1500 tgacccgtgg agccgaaacc gccggcaccc ctgtcggtag gctgcaggtc gtccaccagc 1560 tggcacacgg gtctctcaaa tttcaggaaa accagctgcg cgatccggtc cccgggagcg 1620 ataaacacag gcagaggccc actgttcgcc aacagcactt tcactcgcct gtaagtccgg 1680 gtcaattgtt cccgcacaga cgtacacgcc gcgcaacgac aactcgatcg tgaaaaaatc 1740 tgcccgtagg gcccaggcgg aggacttatg gcgatcccag aacggatgat agttcggtcc 1800 cccggttcca tgatacgagc ctccggcgag caaaacgtct atcccccgtg aagccgccgt 1860 accgaaaaca gccggccccc cccgtcccgc taacttcccc tttaagatcc ggagtggtcc 1920 tgacggctca gagggaaaaa ccgcgaaaaa attccgcgaa ctccgcaaaa acccgaacgg 1980 agtaccgccc ccgggaatcc gtgaactgac attggccgac ttttatggcg cccggcatgt 2040 cgatagtgac aatacgggaa gggaaccaat tcacgcattc tgggcagtgt gggagaaagc 2100 ggacttacac aatgtgtctt cgcaccacgg gaaaagatta ctcgatacct cataaggtga 2160 tg 2162 <210> 2 <211> 1732 <212> DNA <213> Porcine Adenovirus 1 <400> 2 tataaaccag ttccaccatg ggaccgaaga agcagaagcg cgagctcccc gaggacttcg 60 atccagtcta cccctatgac gccccgcagc tgcagatcaa tccacccttc gtcagcgggg 120 acggattcca ccaatccgtg gacggggtgc tgtccctgca catcgcaccg cccctcgtct 180 ttgacaacac cagggccctc accctggcct tcggggatgg tctacagctc tttaacaaca 240 agctcatcgt tgccactgag ggatctgggc tggtcatcac cacggatggc aagctggtcc 300 tccaggtcac ctcccccctc accctagcac ccgatggcat ctcccctgtc cctgggcccc 360 cggtctctct agctcaagat gacaagactc agccstgcaa ggtcacatct cccctgcagc 420 tccaaaagca actccctcgc cctttccctc ggcagcggtc tccaaaacac cgagggtggc 480 cgtagcttgt caagctgggg gctggtctca ccacggacaa cagtcagtca gtgacagtca 540 aggtgggaga cggtcttaag ctgaacgaag gagggctgct caccgtcccc gtaacagcac 600 cacttgtgtc cggcgcaccc ggactatcac tttaactact cctccactga tttcgaactt 660 gataacggca gcctccgtct gcgtcctaag ccgatctccg tcacggcgcc actgcaatct 720 accgctgaca ccatctccct gaagtattct gacactgact tctctttgga ggataacacc 780 accctcactt taacacctaa attaaaaccg tacacactgt ggaccggtaa ttcagataca 840 gctaatgtga tcctcaatca cagctccacc cccaatggta cattatttct atgtctgaca 900 cgtgtgggtg grtagtttta gcactttgcc ctgaagacat catccctaca tttagtgata 960 tgacaaacag ctatcttatt tttgatactt tgtcgactca gactctcact tataggagtt 1020 tgattagatc aacacgacgt cattagccca cagtccacag gactcagtcc agcctggtta 1080 atgccaagca cctttattta ccctaactca tcgggctcaa ctttgacatc attcgtaaga 1140 attaaagcaa caaatgttca tgtggatatc agagtcaaca gcctctccac taacggtttt 1200 agtcttcagt ttgaatttga aaacatgatc atctccagtg ccttctccac ctcctacggg 1260 accttctgct acgtgcccca gagtgcctag agaaccctgg ccgtcagccg gcctccccct 1320 tcccatacca cccggtagac cacccgctcc atgtttctgt atgtgttctc ctcccgccgc 1380 ttgtgcagca ccacctcccg ctgctcgagc tgaggatccg tgatggacac aaagccagga 1440 agacacatcc tcagctccgt gggggcgtcc aacaactgtt tgtgcaagga aaatatgaaa 1500 caataaagac tcagagaaaa acaagttcat atgatttttt cttttattga ttgggggatt 1560 tgattcaggt ggggtgtaca tatcacaaaa aaatcacatc agcagctaca ccctggaaac 1620 attcagacag gggtaaggac agcgccctca gcttctggaa caaacattag aaatatttaa 1680 ctcgtcttgg agctaacact ctttttccca gaacacataa acatcctgta ga 1732 <210> 3 <211> 968 <212> DNA <213> Porcine Adenovirus 2 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (229)..(229) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (258)..(258) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (284)..(284) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (305)..(305) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (382)..(382) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (445)..(445) <223> n is a, c, g, or t <400> 3 agtggggttc aaaaaagtta cataancgcg cttctcgtgc agagagagcc gggnanngcg 60 cctcttcagc agtgggtcgt gggccgtgag agggggctga tgggaagatg gccggtgact 120 cctctcgccc cgctttcggc ttctcctcgt ctcgctctcc ttgtctctct ctgtgtcagc 180 gcagaaacta gtgtgagcga acaacgcgag ggggccggtg atatacccnc agctgatgtg 240 gccacagctg ctatcggnta atcactaccc catcgtacga tcgnaattcc cccgcctcct 300 cgttncgatt aacccaccca gaagtctcgg gaattcccgc cagccgggct ccgacccgcg 360 acgtgcggac tttgaccccg cncctcggac attgaccggt cccacgccac gtcactttcc 420 cactcgacgt cccgttcccg cgctncgtca cacccctctc catgaatctg ctgcaaccgc 480 ctcgaaccct ctcttccaat caactcgcca ttaaaggggc aataaaagtg tagggtatat 540 ggattgatga tggcccaggt gaccaggtcc gagcgcttga tcgattccgt gggaagtgga 600 tgtcagctaa gctcctaatg acaaccgcca accacggctg cagaagctct tccctctaga 660 gacgcgagct agcatagaca tactccatct atacactcgc cgtagacaat gtcatacgca 720 aatgggagga ctaaggacat cccggatcca ccacctggga tgtactccat ccatcgggac 780 acttaaacag caataagaaa gacgcaattg ttgacgcaga aatttggcta gagaggcggg 840 caggactcat gagcctagag accacccaat tgggaaagtg acctcccctc cccccgtgga 900 aaacgtggta tcaaacgaga tcgacaatgc aattcggtca ctttaggggt acgaggatat 960 atcacgga 968 <210> 4 <211> 1174 <212> DNA <213> Porcine Adenovirus 2 <400> 4 aaaaaaggca ggagcgatga ttgatagctc gaggaatagc tcagtcacca catcccttcc 60 ctgcaccact tataagggta tatataggca gagacacaga caatcagtca tcatcacatg 120 ctgtttattg aggttaatga ttaatcgcgg gggcgcttca tagacaggtc caaaggttgt 180 tcgctgcatg agtcatagca gtacttcctc ttgcgtcctg gcaggtctcc aagtcccggg 240 gaacccgacc tgtgaggtgc tggagaaaca gcttctaaaa agacaaaaaa tgggaaatag 300 cacatgagat ttcttacaag cactttttcc tttttttcca cataatccca caaatgtcca 360 aaaacactca ccatagacag caaaggcatg catcctcatg tagcacagac tgcacttcag 420 attggggtcc ttggagtgaa agcgatggta atcacaagag cggcagttca caccaggtac 480 ctcggggcag tccaacacaa acggagggtg gcgcaagtgg gtcctcaaac accacatcag 540 ccagttcaga cagcacctcc gcagccaccg cgctgatatc ctcctcatta ctgtccccct 600 cttctggggg gtccatctca aagaccccct gagagccacc tgagtcacca gcggcactcc 660 caccactgtc ctcagctaca cccccctcag tcacaatcac ctccacctcg tccacactgt 720 ccagccactc gtccggcagt ccatcgacca gactctccca gcacggctca cagaagccct 780 catcccccgg agaggggtcg cgcagatcca ccgggtccca ttccagcacc ggcaccacct 840 cggggtttcc gtcccagtcc aggtgaagtc tgttcgccat gtcgagggtc tgttccgctg 900 agagaaaact ctactccctt cggactcaag agtagtgact ctcgggcgct gcgcggacta 960 tatacactga ggagaaaaaa tacacccaca cacgtcatct cgggcgggcg ccgcgacctc 1020 tcagcgcgaa ggaaaccccg gctcaggtga atggtgtccc gtcgtcagtg gggatacgag 1080 cggcgacggt gtgtggaaat gccacaccgg agggcgaggg tcagtccaaa agcaaaaatt 1140 cccgctaact tccacttgtt ggaaatatct ctgc 1174 <210> 5 <211> 1176 <212> DNA <213> Porcine Adenovirus 2 <400> 5 gcagagatat ttccaacaag tggaagttag cgggaatttt tgcttttgga ctgaccctcg 60 ccctccggtg tggcatttcc acacaccgtc gccgctcgta tccccactga cgacgggaca 120 ccattcacct gagccggggt ttccttcgcg ctgagaggtc gcggcgcccg cccgagatga 180 cgtgtgtggg tgtatttttt ctcctcagtg tatatagtcc gcgcagcgcc cgagagtcac 240 tactcttgag tccgaaggga gtagagtttt ctctcagcgg aacagaccct cgacatggcg 300 aacagacttc acctggactg ggacggaaac cccgaggtgg tgccggtgct ggaatgggac 360 ccggtggatc tgcgcgaccc ctctccgggg gatgagggct tctgtgagcc gtgctgggag 420 agtctggtcg atggactgcc ggacgagtgg ctggacagtg tggacgaggt ggaggtgatt 480 gtgactgagg ggggtgtagc tgaggacagt ggtgggagtg ccgctggtga ctcaggtggc 540 tctcaggggg tctttgagat ggacccccca gaagaggggg acagtaatga ggaggatatc 600 agcgcggtgg ctgcggaggt gctgtctgaa ctggctgatg tggtgtttga ggacccactt 660 gcgccaccct ctccgtttgt gttggactgc cccgaggtac ctggtgtgaa ctgccgctct 720 tgtgattacc atcgctttca ctccaaggac cccaatctga agtgcagtct gtgctacatg 780 aggatgcatg cctttgctgt ctatggtgag tgtttttgga catttgtggg attatgtgga 840 aaaaaaggaa aaagtgcttg taagaaatct catgtgctat ttcccatttt ttgtcttttt 900 agaagctgtt tctccagcac ctcacaggtc gggttccccg ggacttggag acctgccagg 960 acgcaagagg aagtactgct atgactcatg cagcgaacaa cctttggacc tgtctatgaa 1020 gcgcccccgc gattaatcat taacctcaat aaacagcatg tgatgatgac tgattgtctg 1080 tgtctctgcc tatatatacc cttataagtg gtgcagggaa gggatgtggt gactgagcta 1140 ttcctcgagc tatcaatcat cgctcctgcc tttttt 1176 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Porcine adenovirus 4 <400> 6 ttttggatcc atgaagcggt ccgtcccgtc 30 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Porcine adenovirus 4 <400> 7 ttttagatct ctacagtatc tgagggtaaa c 31 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Porcine adenovirus 4 <400> 8 tttactgggc ttgtcgagac ag 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Porcine adenovirus 4 <400> 9 gcactggact cggatggaca 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Porcine adenovirus 4 <400> 10 agctgcttgg tcctgcgt 18 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Porcine adenovirus 4 <400> 11 Cys Gly Gly Asp Phe Asp Pro Val Tyr Pro Tyr Asp 1 5 10 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Porcine adenovirus 4 <400> 12 Cys Ala Ala Ala Ser Glu Glu Met Pro Ala Pro Pro Glu Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 460 <212> PRT <213> Porcine adenovirus 3 <400> 13 Met Gly Pro Lys Lys Gln Lys Arg Glu Leu Pro Glu Asp Phe Asp Pro 1 5 10 15 Val Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Gln Leu Gln Ile Asn Pro Pro Phe Val 20 25 30 Ser Gly Asp Gly Phe Asn Gln Ser Val Asp Gly Val Leu Ser Leu His 35 40 45 Ile Ala Pro Pro Leu Val Phe Asp Asn Thr Arg Ala Leu Thr Leu Ala 50 55 60 Phe Gly Gly Gly Leu Gln Leu Ser Gly Lys Gln Leu Val Val Ala Thr 65 70 75 80 Glu Gly Ser Gly Leu Thr Thr Asn Pro Asp Gly Lys Leu Val Leu Lys 85 90 95 Val Lys Ser Pro Ile Thr Leu Thr Ala Glu Gly Ile Ser Leu Ser Leu 100 105 110 Gly Pro Gly Leu Ser Asn Ser Glu Thr Gly Leu Ser Leu Gln Val Thr 115 120 125 Ala Pro Leu Gln Phe Gln Gly Asn Ala Leu Thr Leu Pro Leu Ala Ala 130 135 140 Gly Leu Gln Asn Thr Asp Gly Gly Met Gly Val Lys Leu Gly Ser Gly 145 150 155 160 Leu Thr Thr Asp Asn Ser Gln Ala Val Thr Val Gln Val Gly Asn Gly 165 170 175 Leu Gln Leu Asn Gly Glu Gly Gln Leu Thr Val Pro Ala Thr Ala Pro 180 185 190 Leu Val Ser Gly Ser Ala Gly Ile Ser Phe Asn Tyr Ser Ser Asn Asp 195 200 205 Phe Val Leu Asp Asn Asp Ser Leu Ser Leu Arg Pro Lys Ala Ile Ser 210 215 220 Val Thr Pro Pro Leu Gln Ser Thr Glu Asp Thr Ile Ser Leu Asn Tyr 225 230 235 240 Ser Asn Asp Phe Ser Val Asp Asn Gly Ala Leu Thr Leu Ala Pro Thr 245 250 255 Phe Lys Pro Tyr Thr Leu Trp Thr Gly Ala Ser Pro Thr Ala Asn Val 260 265 270 Ile Leu Thr Asn Thr Thr Thr Pro Asn Gly Thr Phe Phe Leu Cys Leu 275 280 285 Thr Arg Val Gly Gly Leu Val Leu Gly Ser Phe Ala Leu Lys Ser Ser 290 295 300 Ile Asp Leu Thr Ser Met Thr Lys Lys Val Asn Phe Ile Phe Asp Gly 305 310 315 320 Ala Gly Arg Leu Gln Ser Asp Ser Thr Tyr Lys Gly Arg Phe Gly Phe 325 330 335 Arg Ser Asn Asp Ser Val Ile Glu Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ser Pro 340 345 350 Ala Trp Leu Met Pro Ser Thr Phe Ile Tyr Pro Arg Asn Thr Ser Gly 355 360 365 Ser Ser Leu Thr Ser Phe Val Tyr Ile Asn Gln Thr Tyr Val His Val 370 375 380 Asp Ile Lys Val Asn Thr Leu Ser Thr Asn Gly Tyr Ser Leu Glu Phe 385 390 395 400 Asn Phe Gln Asn Met Ser Phe Ser Ala Pro Phe Ser Thr Ser Tyr Gly 405 410 415 Thr Phe Cys Tyr Val Pro Arg Arg Thr Thr His Arg Pro Arg His Gly 420 425 430 Pro Phe Ser Leu Arg Glu Arg Arg His Leu Phe Gln Leu Leu Gln Gln 435 440 445 Cys Gly Gly Asp Phe Asp Pro Val Tyr Pro Tyr Asp 450 455 460 <210> 14 <211> 703 <212> PRT <213> Porcine adenovirus 4 <400> 14 Met Lys Arg Ser Val Pro Ser Asp Phe Asn Pro Val Tyr Pro Tyr Asp 1 5 10 15 Tyr Gln Pro Ile Ser Leu Met Pro Ala Phe Tyr Asp Asn Tyr Gly Phe 20 25 30 His Glu Gly Pro Ser Gly Val Leu Ser Leu Asn Ile Ala Asn Pro Leu 35 40 45 Gly Tyr Thr Pro Arg Lys Lys Leu Cys Leu Lys Leu Gly Glu Gly Leu 50 55 60 Ala Leu Asp Ser Asp Gly His Leu Arg Val Gln Ile Pro Asp Met Gln 65 70 75 80 Ala Gln Pro Pro Leu Leu Tyr Gln Gly His Arg Leu Ser Leu Leu Phe 85 90 95 Asp Ala Asp Ala Gly Phe His Leu Thr Glu Asp Gly Ala Leu Ser Leu 100 105 110 Thr Lys Thr Leu Val Tyr Pro Thr Leu Trp Thr Gly Pro Ala Pro Glu 115 120 125 Ala Asn Val Thr Phe Ser Gly Glu Asn Ser Pro Ser Gly Ile Leu Arg 130 135 140 Leu Cys Leu Ser Arg Thr Gly Gly Thr Val Ile Gly Thr Leu Ser Val 145 150 155 160 Gln Gly Ser Leu Thr Asn Pro Ser Thr Gly Gln Thr Leu Gly Met Asn 165 170 175 Leu Tyr Phe Asp Ala Asp Gly Asn Val Leu Ser Glu Ser Asn Leu Val 180 185 190 Arg Gly Ser Trp Gly Met Lys Asp Gln Asp Thr Leu Val Thr Pro Ile 195 200 205 Ala Asn Gly Gln Tyr Leu Met Pro Asn Leu Thr Ala Tyr Pro Arg Leu 210 215 220 Ile Gln Thr Leu Thr Ser Ser Tyr Ile Tyr Thr Gln Ala His Leu Asp 225 230 235 240 His Asn Asn Ser Val Val Asp Ile Lys Ile Gly Leu Asn Thr Asp Leu 245 250 255 Arg Pro Thr Ala Ala Tyr Gly Leu Ser Phe Thr Met Thr Phe Thr Asn 260 265 270 Ser Pro Pro Thr Ser Phe Gly Thr Asp Leu Val Gln Phe Gly Tyr Leu 275 280 285 Gly Gln Asp Ser Ser Pro Ser Phe Leu Arg Glu Leu Pro Leu Ala Ser 290 295 300 Glu Ala Gly Tyr Phe Gly Lys Leu Ala Ala Ala Ser Glu Glu Met Pro 305 310 315 320 Ala Pro Pro Glu Ala Gln Thr Gln Asp Gln Ala Ala Glu Glu Pro Pro 325 330 335 Ala Pro Ala Glu Ala Glu Ala Pro Ala Pro Ala Glu Ala Glu Ala Glu 340 345 350 Ala Glu Pro Pro Arg Lys Pro Pro Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu Tyr 355 360 365 Asn Arg Val His Ser Asp Thr Arg Ala Glu Asp Thr Pro Thr Ser Pro 370 375 380 Glu Leu Val Thr Thr Leu Pro Asp Pro Phe Val Leu Pro Leu Pro Asp 385 390 395 400 Gly Val Pro Thr Gly Ala Ser Ile Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Pro 405 410 415 Ser Ala Val Phe Phe Thr Leu Asp Leu Val Thr Gly Pro Ala Ser Leu 420 425 430 Ala Leu His Phe Asn Val Arg Leu Pro Leu Glu Gly Glu Lys His Ile 435 440 445 Val Cys Asn Ser Arg Glu Gly Ser Ser Asn Trp Gly Glu Glu Val Arg 450 455 460 Pro Gln Glu Phe Pro Phe Glu Arg Glu Lys Pro Phe Val Leu Val Ile 465 470 475 480 Val Ile Gln Ser Asp Thr Tyr Gln Ile Thr Val Asn Gly Lys Pro Leu 485 490 495 Val Asp Phe Pro Gln Arg Leu Gln Gly Ile Thr Arg Ala Ser Leu Ser 500 505 510 Gly Asp Leu Val Phe Thr Arg Leu Thr Met Tyr Pro Pro Gly Asp Pro 515 520 525 Arg Pro Thr Thr Leu Leu Pro Pro Pro Ala Ala Pro Leu Asp Val Ile 530 535 540 Pro Asp Ala Tyr Val Leu Asn Leu Pro Thr Gly Leu Thr Pro Arg Thr 545 550 555 560 Leu Leu Thr Val Thr Gly Thr Pro Thr Pro Leu Ala Glu Phe Phe Ile 565 570 575 Val Asn Leu Val Tyr Asp Leu His Tyr Asp Ser Lys Asn Val Ala Leu 580 585 590 His Phe Asn Val Gly Phe Thr Ser Asp Ser Lys Gly His Ile Ala Cys 595 600 605 Asn Ala Arg Met Asn Gly Thr Trp Gly Ser Glu Ile Thr Val Ser Asp 610 615 620 Phe Pro Phe Gln Arg Gly Lys Pro Phe Thr Leu Gln Ile Leu Thr Arg 625 630 635 640 Glu Ala Asp Phe Gln Val Leu Val Asp Lys Gln Pro Leu Thr Gln Phe 645 650 655 Gln Tyr Arg Leu Lys Glu Leu Asp Gln Ile Lys Tyr Val His Met Phe 660 665 670 Gly His Val Val Gln Thr His Leu Glu His Gln Val Pro Asp Thr Pro 675 680 685 Val Phe Ser Thr Ala Gly Val Ser Lys Val Tyr Pro Gln Ile Leu 690 695 700

Claims (41)

  1. 아데노바이러스를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터로서, 상기 아데노바이러스는 상기 아데노바이러스에 천연인 섬유 유전자를 포함하고, 추가로 상기 아데노바이러스에 이종인 제2의 섬유 유전자를 포함하며, 상기 제2의 섬유 유전자는 상기 제2의 섬유 유전자를 안정하게 발현하는 세포주 중에서 상기 재조합 아데노바이러스를 성장시킴으로써 상기 재조합 아데노바이러스에 의해 획득되는 것인 재조합 아데노바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터가 돼지류, 인간, 조류, 소류, 말류 및 양류 아데노바이러스로 구성되는 군으로부터 선택된 아데노바이러스 벡터인 재조합 아데노바이러스 벡터.
  3. 제1항의 재조합 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 재조합 PAdV-1, 재조합 PAdV-2, 재조합 PAdV-3, 재조합 PAdV-4, 재조합 PAdV-5, 재조합 PAdV-6 및 재조합 PAdV-7로 구성되는 군으로부터 선택된 재조합 돼지류 아데노바이러스인 재조합 아데노바이러 스 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 아데노바이러스가 재조합 인간 아데노바이러스 (HAdV), 재조합 소류 아데노바이러스 (BAdV), 재조합 양류 아데노바이러스 (OAdV), 재조합 쥐류 아데노바이러스 (MAdV), 재조합 원숭이류 아데노바이러스 (SAdV) 또는 재조합 개류 아데노바이러스 (CAdV)인 재조합 아데노바이러스 벡터.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제2의 섬유 단백질이 PAdV-1, PAdV-2, PAdV-3, PAdV-4 및 PAdV-5로부터 선택된 섬유 단백질인 재조합 아데노바이러스 벡터.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제조합 아데노바이러스 벡터는 상기 제1 또는 제2의 섬유 단백질과 다른 제3의 섬유 단백질을 추가로 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스 벡터.
  9. 제5항에 있어서, 상기 재조합 PAdV가 재조합 PAdV-3인 재조합 아데노바이러스 벡터.
  10. 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 PAdV-4로부터의 섬유 단백질을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스 벡터.
  11. 제1항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스 벡터가 복제-가능형인 재조합 아데노바이러스 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 상기 재조합 PAdV가 복제-결함형인 재조합 돼지류 아데노바이러스 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 재조합 PAdV는 PAdV 게놈의 필수 영역에 삽입된 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 섬유 유전자를 안정하게 발현하는 세포주는 또한 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 삽입되는 PAdV 게놈의 필수 영역을 발현하는 것인 재조합 돼지류 아데노바이러스 벡터.
  14. 제1항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 게놈의 비필수 영역에 삽입된 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 면역조절물질, 항원, 병원체, 면역원성 폴리펩티드, 치료적 폴리펩티드, 성장 호르몬 및 사이토카인으로 구성되는 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자인 방법.
  16. 아데노바이러스를 포함하는 숙주 세포로서, 상기 아데노바이러스는 상기 돼 지류 아데노바이러스에 천연인 섬유 유전자를 포함하고, 상기 숙주 세포는 상기 아데노바이러스에 이종인 섬유 유전자를 발현하고 돼지류 아데노바이러스에 의해 감염될 수 있는 재조합 세포인 것인 숙주 세포.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세포가 포유류 세포 또는 조류 세포인 숙주 세포.
  18. 제16항에 있어서, 상기 세포가 돼지류 세포, 인간 세포, 소류 세포 및 양류 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 포유류 세포인 숙주 세포.
  19. 제16항에 있어서, 상기 세포가 재조합 돼지류 세포인 숙주 세포.
  20. 포유류 대상에서 면역 반응을 유도할 수 있는 조성물로서, 제1항의 재조합 아데노바이러스 벡터 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 조성물.
  21. 포유류 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 제20항의 조성물을 그 포유류 대상에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 포유류 대상이 돼지인 방법.
  23. 아데노바이러스의 제조 방법으로서,
    아데노바이러스 섬유 유전자를 발현하는 재조합 숙주 세포를, 상기 세포를 아데노바이러스로 감염시키기에 적합한 조건하에, 배양하는 단계,
    상기 세포를, 캡시드화(encapsidation)에 필수적인 아데노바이러스 서열(들) 및 이종 단백질을 코딩하는 이종 유전자를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터와 접촉시키는 단계로서, 상기 재조합 아데노바이러스는 상기 숙주 세포 중의 섬유 유전자와 상이한 섬유 유전자를 포함하는 것인 단계, 및
    임의로 상기 아데노바이러스를 수확하는 단계
    를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 수확된 아데노바이러스 벡터는 상기 재조합 숙주 세포와 접촉하지 않은 아데노바이러스 벡터와 비교할 때 보다 넓은 조직 특이성을 포함하는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 복제에 비-필수적인 하나 이상의 아데노바이러스 단백질의 일부 또는 전부에서 임의로 결실되어 있는 것인 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 이종 단백질이 면역조절물질, 항원, 병원체, 면역원성 폴리펩티드, 치료적 폴리펩티드, 성장 호르몬 및 사이토카인으로 구성되는 군으로부터 선택된 단백질인 방법.
  27. 포유류 숙주를 감염으로부터 보호하기 위한 백신으로서, 제1항의 재조합 아데노바이러스 벡터 및 임의로 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 백신.
  28. 제24항에 있어서, 상기 비-필수 영역은 E3 영역, E4의 ORF 1-2 및 4-7, E4의 말단과 돼지류 아데노바이러스 게놈의 ITR 사이의 영역으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  29. 아데노바이러스 섬유 유전자를 발현하는 숙주 세포, 및 발현 조절 서열의 조절하에 이종 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 재조합 아데노바이러스 벡터는 상기 벡터의 아데노바이러스에 천연인 섬유 유전자를 포함하는 것인 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 상기 숙주 세포는 상기 재조합 돼지류 아데노바이러스 벡터로 감염된 것인 조성물.
  31. 동물의 백신투여 방법으로서, 상기 동물에게 치료적 유효량의 제27항의 백신을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  32. 재조합 아데노바이러스 벡터의 숙주 조직 세포 특이성을 증가시키는 방법으 로서, 상기 재조합 아데노바이러스를, 상기 재조합 아데노바이러스의 섬유 단백질과 상이한 제2의 섬유 단백질을 포함하는 숙주 세포중에서 성장시키는 단계를 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스 벡터가 재조합 PADV-1, 재조합 PADV-2, 재조합 PADV-3, 재조합 PADV-4 및 재조합 PADV-5로부터 선택된 재조합 돼지류 아데노바이러스인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 제2 섬유 단백질이 PADV-1, PADV-2, PADV-3, PADV-4 및 PADV-5로부터 선택된 섬유 단백질인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 재조합 PADV는 상기 제1 또는 제2의 섬유 단백질과 상이한 제3의 섬유 단백질을 추가로 포함하는 것인 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 재조합 PADV가 재조합 PADV-3인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 재조합 PADV-3은 PADV-4로부터의 섬유 단백질을 포함하는 것인 방법.
  38. 제33항에 있어서, 상기 재조합 PADV가 복제 가능형인 방법.
  39. 제33항에 있어서, 상기 재조합 PADV가 복제 결함형인 방법.
  40. 제33항에 있어서, 상기 재조합 PADV는 PADV 게놈의 비-필수 영역에 삽입된 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오티드 서열이 면역조절물질, 항원, 병원체, 면역원성 폴리펩티드, 치료적 폴리펩티드, 성장 호르몬 및 사이토카인으로 구성되는 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 유전자인 방법.
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