-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Fachgebiet der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein adenovirale Gentherapievektoren.
Spezifischer betrifft die vorliegende Erfindung adenovirale Gentherapievektoren,
bei welchen der adenovirale Tropismus genetisch modifiziert wurde.
-
Beschreibung des Stands
der Technik
-
Adenovirale
Vektoren (Ad) erwiesen sich als enormer Nutzen für eine Vielfalt von Gentherapieanwendungen.
Dieser Nutzen stammt weitgehend von der beispiellosen Abgabeeffizienz
dieser Vektoren für
in vitro- und in vivo-Anwendungen. Jedoch wird trotz dieser Eigenschaft
der vollständige
Vorteil dieser Vektoren gegenwärtig
durch den Mangel an zellspezifischer Genabgabefähigkeit untergraben. Spezifisch
hindert der breitgefächerte
Tropismus des Adenovirus eine Genabgabe auf eine gezielte, zellspezifische
Weise. Demnach haben gegenwärtige
adenovirale Vektoren für
viele Anwendungen der Gentherapie, wo solche zellspezifische Transduktion
benötigt
wird, begrenzten Nutzen.
-
Um
die Angelegenheit von effizienter, zellspezifischer Genabgabe anzugehen,
wurde eine Vielfalt von Strategien entwickelt, um den adenoviralen
Tropismus zu ändern.
Diese Herangehensweisen beinhalteten direkte chemische Modifikationen
der adenoviralen Kapsidproteine, bispezifische Komplexe (z.B. ein
Kapsidprotein und ein Targeting-Rest), und genetische Kapsidmodifikationen
(z.B. genetischer Ersatz/genetische Insertion). Während die
ersteren zwei Strategien die Durchführbarkeit des adenoviralen
Retargetings festlegten, wurde aufgrund praktischer Angelegenheiten
hinsichtlich Produktion sowie von Überlegungen zur behördlichen
Zulassung äußerste Wichtigkeit
auf die Herangehensweise gelegt, bei welcher Modifikationen des
adenoviralen Tropismus genetisch eingebracht werden.
-
Zu
diesem Zweck erweiterten Verfahren, die den adenoviralen Tropismus über Modifikationen
der adenoviralen Haupt-Kapsidproteine, der Fiber, des Pentons und
des Hexons, verändern,
den Tropismus so, dass er unabhängig
vom nativen adenoviralen Rezeptor (CAR) ist. Diese Verfahren können zusätzlich den
nativen Tropismus des Adenovirus verringern. Experimentell wurde
die Erweiterung des Tropismus über
den Einbau von Peptidliganden mit Spezifität für Ziel-Zellmarker erreicht.
Dies erfolgte weitgehend über
den Einbau des Peptids RGD-4C an Fiber- und Hexon-Örtlichkeiten. RGD-4C erkennt
Integrine der ανβ3- und der ανβ5-Klasse.
Zusätzlich
wurden andere kleine Peptidmarker zu demselben Zweck verwendet.
Diese Studien setzten fest, dass (eine) genetische Modifikationen)
an dem Kapsid in der Tat den Tropismus des adenoviralen Vektors ändern kann,
um einen begrenzten und/oder spezifischen Bereich der Genabgabe
zu erreichen.
-
Von
Beachtung ist, dass die Örtlichkeiten,
die im Zusammenhang der Modifikation von Haupt-Kapsidproteinen zu
Targeting-Zwecken verwendet werden, nur den Einbau von kleinen Peptiden
erlauben. Bis heute bestanden diese aus Peptiden, die über Phagendisplayverfahren
identifiziert wurden, oder kleinen physiologischen Peptidliganden.
Beide dieser Arten von Targeting-Motiven sind jedoch hinsichtlich
der Erreichung des Ziels von zellspezifischer Abgabe nicht optimal.
Hinsichtlich des Ersteren wurde nur ein überaus begrenztes Repertoire
von brauchbaren Peptiden über
Phagendisplaymethoden bisher identifiziert. Zusätzlich neigten diese Peptide
dazu, eine geringe Affinität
aufzuweisen. Darüber
hinaus wird die Genauigkeit von solchen Targeting-Peptiden im Kontext
des adenoviralen Vektors nicht immer bewahrt Hinsichtlich des Letzteren
erlauben erhältliche
physiologische Peptide nicht das Targeting auf den Bereich von Zellen,
welche für
einen praktischen Gentherapieansatz benötigt werden.
-
In
diesem Zusammenhang repräsentieren
Einzelkettenantikörper
(scFvs) Motive mit hoch diversen Spezifitäten, welche zum adenoviralen
Targeting ausgenutzt werden können.
Zusätzlich
besitzen Einzelkettenantikörper
hohe Affinitäten
zu verwandten Zielen. Auf dieser Grundlage würde die Fähigkeit, Einzelkettenantikörper in
das adenovirale Kapsid einzubauen, und damit die Einzelkettenantikörper-Spezifität/Affinität nach Darstellung
des chimären/rekombinanten
Kapsidproteins bewahrt bleibt, dramatisch den Nutzen von genetischen
Kapsidmodifikationsverfahren zum adenoviralen Retargeting steigern.
Die Unfähigkeit,
Einzelkettenantikörper
an Fiber-, Hexon- und Penton-Örtlichkeiten
aufzubauen, zeigte den Bedarf an, die Fähigkeit von in alternierenden
Kapsidproteinen einzubauenden Einzelkettenantikörpern zu untersuchen.
-
Demnach
ist der Stand der Technik unzureichend an alternierenden adenoviralen
Kapsidproteinen, welche die genetische Einführung eines brauchbaren Targeting-Restes
berücksichtigen.
Die vorliegende Erfindung erfüllt
diesen lange bestehenden Bedarf und Wunsch auf dem Gebiet der Technik.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung beschreibt den Einbau von Targeting-Peptiden
wie Einzelkettenantikörpern in
die „Neben-"Kapsidproteine pIIIa
und pIX des Adenovirus. pIIIa und pIX sind auf dem adenoviralen
Kapsid als Monomere anwesend und die Proteine haben erweiterte Aminoterminus-Ektodomänen. Demnach
deuten sowohl lokale als auch strukturelle Überlegungen darauf hin, dass
pIIIa und pIX die idealen Kapsidproteine sind, um Einzelkettenantikörper und
andere Targeting-Peptide einzubauen und genetische Modifikation
und Retargeting des Adenovirus zu erreichen.
-
Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, einen genetisch modifizierten
Adenovirus-Vektor mit Fähigkeit
zu zellspezifischem Targeting und Verfahren zur Herstellung dieses
genetisch modifizierten Adenovirus-Vektors bereitzustellen.
-
Demgemäß stellt
die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Adenovirus bereit, wobei
das Adenovirus ein modifiziertes Gen umfasst, welches ein modifiziertes
adenovirales Kapsidprotein codiert, wobei das Gen, welches das Kapsidprotein
codiert, durch das Einbringen einer Sequenz, welche einen Einzelkettenantikörper codiert,
in das Gen modifiziert ist.
-
Andere
und weitere Aspekte, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung
werden aus der folgenden Beschreibung der derzeit bevorzugten Ausführungsformen
der Erfindung ersichtlich werden. Diese Ausführungsformen werden zum Zweck
der Offenbarung gegeben.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER
ABBILDUNGEN
-
Die
angefügten
Grafiken wurden hierin einbezogen, sodass die voranstehend rezitierten
Merkmale, Vorteile und Aufgaben der Erfindung deutlich werden und
ausführlich
verstanden werden können.
Diese Abbildungen bilden einen Teil der Beschreibung. Es ist jedoch
zu beachten, dass die angefügten
Abbildungen bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung veranschaulichen und sie sollten nicht in Betracht
gezogen werden, den Umfang der Erfindung zu begrenzen.
-
1 zeigt
die schematische Darstellung von Plasmid pNEBpIIIa.
-
2 zeigt
die schematische Darstellung von Plasmid pNEBpIIIa6H.
-
3 zeigt
die schematische Darstellung von Plasmid pAd5IIIa6His.
-
4 zeigt
das Auftreten eines 260 bp-DNA-Fragments nach PCR, welches die Anwesenheit
einer 6His codierenden Sequenz in dem pIIIa-Gen des modifizierten
Ad-Genoms anzeigt.
-
5 zeigt
eine schematische Darstellung von Plasmid pShuttle.
-
6 zeigt
eine schematische Darstellung von Plasmid pSIXFlag.
-
7 zeigt
die schematische Darstellung von Plasmid pAd5IXFlag.
-
8 zeigt
eine Western-Blot-Analyse des Ad-Vektors, welcher den Flag-Peptidmarker in dem IX-Kapsidprotein
enthält.
Virale Kapsomere von AdpIXFlag oder Ad5hexFlag, welches das Flag-Peptid
im Hexon-Protein enthält,
wurden durch Elektrophorese getrennt, auf eine PVDF-Membran übertragen
und mit monoclonalem anti-Flag-M2-Antikörper inkubiert, gefolgt von
Inkubation mit sekundärem
anti-Maus Ak, konjugiert mit alkalischer Phosphatase. Die Anwesenheit
einer Proteinbande von 15 kDa entspricht dem erwarteten Molekulargewicht
von Protein IX, welches das Flag-Peptid enthält.
-
9 zeigt
die Oberflächenlokalisierung
von Flag-Peptid im Zusammenhang von zusammen gelagertem viralem
Kapsidprotein IX. Durchfluss oder Eluate, welche an eine Affinitätssäule binden,
die anti-Flag-M2-Mak enthält,
wurden durch Lysepuffer lysiert und auf ein Agarosegel geladen,
um virale DNA sichtbar zu machen. Hauptbanden von hochmolekularer
viraler DNA wurden in den Eluatfraktionen von Ad5IXFlag und in der
von AdhexFlag der Positivkontrolle sichtbar gemacht, während die
Hauptmenge von viraler DNA in der Durchflussfraktion der AdhexStag-Negativkontrolle
gefunden wurde.
-
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung beschreibt den Einbau von Einzelkettenantikörpern und
anderer Targeting-Peptide in alternierende Kapsidproteine. In diesem
Zusammenhang enthält
das Adenovirus mehrere „Neben-"Kapsidproteine zusätzlich zu
den Hauptkapsidproteinen Fiber, Hexon und Penton. Um brauchbar für adenovirale
Retargeting-Zwecke zu sein, müssen
Kandidaten-Kapsidproteine Domänen
besitzen, die mit der Oberfläche
des adenoviralen Virions assoziiert sind. Zwei solcher Kapsidproteine
sind pIX und pIIIa. Demnach zeigen von den erhältlichen Nebenkapsidproteinen
pIX und pIIIa einzigartige strukturelle Merkmale im Einklang mit
den Anforderungen des adenoviralen Retargeting über genetische Kapsidmodifikation.
Von diesen zwei Kandidaten-Proteinen würden möglicherweise aufgrund der multimeren
Beschaffenheit von pIX genetische Modifikationsstrategien auf der
Grundlage von strukturellen Überlegungen
vereitelt werden. Andererseits ist pIIIa auf dem Kapsid als ein
Monomer anwesend und das Protein hat eine erweiterte Aminoterminus-Ektodomäne. Demnach
weisen sowohl Örtlichkeit,
Struktur des Proteins selbst als auch strukturelle Anordnung des Proteins
auf dem adenoviralen Kapsid auf pIIIa und pIX als Kandidaten-Kapsidproteine
zum Einbau von scFvs hin, um dadurch genetische Modifikation und
Retargeting zu erreichen.
-
Die
vorliegende Erfindung verweist auf ein rekombinantes Adenovirus,
wobei das Adenovirus ein modifiziertes Gen umfasst, welches ein
adenovirales Kapsidprotein codiert, wobei das Gen, welches das Kapsidprotein
codiert, durch das Einbringen einer Sequenz, welche einen Einzelkettenantikörper codiert,
in das Gen modifiziert ist.
-
Bei
Fällen,
wenn das rekombinante Adenovirus weiterhin ein therapeutisches Gen
umfasst, ist das rekombinante Adenovirus der vorliegenden Erfindung
brauchbar für
ein Verfahren der Bereitstellung von Gentherapie an ein Individuum,
das eine solche Behandlung braucht, umfassend die Schritte: Verabreichung
einer wirksamen Menge eines rekombinanten Adenovirus an das Individuum,
wobei das Adenovirus ein modifiziertes Gen umfasst, welches ein
adenovirales Kapsidprotein codiert. Ein repräsentatives Mittel der Verabreichung ist
systemisch, und ein bevorzugtes therapeutisches Gen codiert eine
Thymidinkinase des Herpes simplex-Virus. Wenn das therapeutische Gen der
vorstehenden Ausführungsform
eine Thymidinkinase des Herpes simplex-Virus oder andere Antikrebsgene
codiert, welche auf eine ähnliche
Weise verwendet werden könnten,
wie durch einen normalen Fachmann erkannt werden würde, ist
das rekombinante Adenovirus der vorliegenden Erfindung weiterhin
brauchbar für
ein Verfahren zum Abtöten
von Tumorzellen in einem Individuum, das eine solche Behandlung
braucht, umfassend die Schritte: Verabreichung einer wirksamen Menge
des geeigneten rekombinanten Adenovirus an das Individuum und Behandlung
des Individuums mit Ganciclovir.
-
Das
Gen, welches das Kapsidprotein codiert, wird durch das Einbringen
einer Sequenz, welche einen Einzelkettenantikörper codiert, in das Gen modifiziert.
Vorzugsweise ist der Einzelkettenantikörper gegen ein für einen
Zelltyp spezifisches Protein gerichtet, und stärker bevorzugt ist das Protein
ein Zelloberflächenprotein.
Allgemein ist der Zelltyp eine Tumorzelle. Die vorliegende Erfindung
stellt auch ein hierin beschriebenes rekombinantes Adenovirus bereit,
welches ein modifiziertes Gen enthält, welches ein Kapsidprotein
codiert, und weiterhin ein therapeutische Gen umfasst.
-
Vorzugsweise
ist das Kapsidgen ein Nebenkapsidgen und stärker bevorzugt sind die Nebenkapsidgene
pIIIa und pIX. Allgemein behält
das modifizierte Kapsidprotein sein natürliches Darstellungsprofil
bei. Normalerweise zeigt das rekombinante Adenovirus, welches das
modifizierte Kapsidgen umfasst, CAR-unabhängigen Gentransfer. Zusätzlich ist
die vorliegende Erfindung auf ein rekombinantes Adenovirus gerichtet,
welches das modifizierte Kapsidgen umfasst und welches weiterhin
eine zusätzliche
Modifikation an einem Fiber-Knoten des Adenovirus umfasst, wobei
die Modifikation des Fiber-Knotens dadurch den nativen Tropismus des
Adenovirus verringert.
-
Es
wird für
den Fachmann ersichtlich werden, dass verschiedene Substitutionen
und Modifikationen an der hierin offenbarten Erfindung gemacht werden
können.
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung können
konventionelle Molekularbiologie-, Mikrobiologie- und rekombinante
DNA-Methoden innerhalb des Stands der Technik angewandt werden.
Solche Methoden werden vollständig
in der Literatur erklärt.
S. z.B. Maniatis, Fritsch & Sambrook, „Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (1982); „DNA Cloning: A Practical
Approach," Band
I und II (Hrsg. D.N. Glover, 1985); „Oligonucleotide Synthesis" (Hrsg. M.J. Gait,
1984); „Nucleic
Acid Hybridization" (Hrsg.
B.D. Hames & S.J.
Higgins, 1985); „Transcription
and Translation" (Hrsg:
B.D. Hames & S.J.
Higgins, 1984); „Animal
Cell Culture" (Hrsg.
R.I. Freshney, 1986); „Immobilized
Cells And Enzyme" (IRL
Press, 1986); B. Perbal, „A
Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).
-
Es
wird spezifisch in Betracht gezogen, dass Arzneimittel unter Verwendung
des neuen genetisch modifizierten andenoviralen Vektors der vorliegenden
Erfindung hergestellt werden können.
In solch einem Fall umfasst das Arzneimittel den neuen genetisch
modifizierten andenoviralen Vektor der vorliegenden Erfindung und
einen pharmazeutisch verträglichen
Träger.
Ein Fachmann würde
leicht ohne ungebührliches
Experimentieren die geeigneten Dosierungen und Wege der Verabreichung
dieses genetisch modifizierten adenoviralen Vektors der vorliegenden
Erfindung bestimmen können.
Wenn in vivo für
Therapie verwendet, wird der genetisch modifizierte adenovirale
Vektor der vorliegenden Erfindung dem Patienten oder dem Tier in
therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht, d.h. Mengen, welche
die Tumorbelastung beseitigen oder verringern. Er wird normalerweise
parenteral verabreicht werden, vorzugsweise intravenös, aber
andere Wege der Verabreichung werden als geeignet verwendet werden.
-
Die
Dosis und das Dosierungsschema wird von der Beschaffenheit des Krebses
(primär
oder metastasenbildend) und seiner Population, den Merkmalen des
besonderen genetisch modifizierten adenoviralen Vektors, z.B. seinem
therapeutischen Index, dem Patienten, der Krankengeschichte des
Patienten und anderen Faktoren abhängen. Die Menge des verabreichten
genetisch modifizierten adenoviralen Vektors wird normalerweise
im Bereich von etwa 109 bis etwa 1012 Teilchen sein.
-
Der
Zeitplan wird, um die Wirksamkeit zu optimieren, unter Abwägung negativer
Wirkungen der Behandlung fortgesetzt werden. S. Remington's Pharmaceutical
Science, 17. Aufl. (1990) Mark Publishing Co., Easton, Penn; und
Goodman and Gilman's:
The Pharmaceutical Basis of Therapeutics 8. Aufl. (1990) Pergamon
Press; welche hierin durch Bezugnahme eingegliedert sind.
-
Zur
parenteralen Verabreichung wird der genetisch modifizierte adenovirale
Vektor meistens normalerweise in einer injizierbaren Form (Lösung, Suspension,
Emulsion) einer Einheitsdosierung in Verbindung mit einem pharmazeutisch
verträglichen
parenteralen Vehikel formuliert werden. Solche Vehikel sind vorzugsweise
nicht giftig und nicht therapeutisch. Beispiele solcher Vehikel
sind Wasser, Salzlösung,
Ringer-Lösung,
Dextroselösung
und 5% menschliches Serumalbumin. Nicht-wässrige Vehikel wie fette Öle und Ethyloleat
können auch
verwendet werden. Liposomen können
als Träger
verwendet werden. Das Vehikel kann geringe Mengen von Zusätzen enthalten,
wie Substanzen, welche Isotonie und chemische Stabilität steigern,
z.B. Puffer und Konservierungsmittel. Der genetisch modifizierte
adenovirale Vektor wird normalerweise in solchen Vehikeln bei Konzentrationen
von etwa 109 bis etwa 1012 Teilchen
formuliert werden.
-
BEISPIEL 1
-
Genetische Modifikation
des IIIa-Proteins vom Adenoviruskagsid
-
Als
Adenoviruskapsidproteine können
pIIIa und pIX als ein Träger
von heterologen Peptidsequenzen verwendet werden, welche als Reinigungsmarker
oder Targeting-Liganden dienen können
und daher zur Virusreinigung oder/und zum Targeting angewendet werden
können.
Für den
Anfangsbeweis des Konzepts wurde ein Sechs-His-Marker in den Amino-Terminus
von pIIIa eingebaut und ein kleiner 8-Aminosäuren-Peptid-Marker
Flag
(Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys, SEQ ID No. 1)
wurde in den
Carboxy-Terminus von pIX eingebaut. Die Möglichkeit, die modifizierten
Viren durch Bindung an ein relevantes Affinitätsmittel zu reinigen, wurde
gezeigt.
-
BEISPIEL 2
-
Konstruktion von rekombinanten
Plasmiden
-
Um
den Shuttle-Vektor für
die Modifikation des pIIIa-Gens herzustellen, wurde die DNA (4055
bp) des PmlI-Fragments vom Plasmid pTG36021, welches das vollständige Ad5-Genom
enthält,
zwischen SmaI- und HincII-Stellen in dem Plasmid pNEB193 cloniert.
Die korrekte Orientierung des PmlI-Fragments, welches das pIIIa-Gen im Zusammenhang
von pNEB193 enthält,
wurde durch Restriktionsanalyse bestätigt und das konstruierte Plasmid
wurde pNEBpIIIa (1) genannt.
-
Um
den Sechs-Histidin-Marker in den aminoterminalen Teil des pIIIa-Proteins
einzubringen, wurde PCR durchgeführt
unter Verwendung von DNA des PmlI-Fragments als Matrize und zwei Primerpaaren:
1)
pIIIaN.F: 5'-CGCGAGGAGGTGGCTATAGGACTGA
(SEQ ID No. 2), pIIIaN6His.L: 5'-ATGGTGATGGTGATGGTGCATCTGATCAGAAACATC
(SEQ ID No. 3); 2) pIIIaN.R: 5'-TTCGGCCAGCGCGTTTACGATC (SEQ
ID No. 4), pIIIaN6His.U: 5'-CACCATCACCATCACCATATGCAAGACGCAAC
(SEQ ID No. 5).
-
Die
Primer pIIIaN6His.U und pIIIaN6His.L wurden entworfen, um teilweise
komplementär
zum 5'-Ende des
pIIIa-Gens zu sein und 6His zu codieren. Die DNA-Produkte von 7440 und 261 bp, welche
nach der ersten PCR hergestellt worden waren, wurden durch eine
zweite PCR unter Verwendung der Primer pIIIaN.F und pIIIaN.R verbunden,
wodurch ein DNA-Fragment (983 bp), welches dem 5'-terminalen
Anteil des pIIIa-Gens entspricht, mit der Sequenz erzeugt wurde,
welche 6His codiert, welches direkt nach dem ATG-Codon eingebracht
worden war.
-
Um
den modifizierten Teil des Gens in den Shuttle-Vektor einzubringen,
wurde pNEBpIIIa mit MluI und BsmI verdaut, der Vektorteil wurde
gereinigt und dann mit entsprechendem MluI-BsmI-Fragment (738 bp)
des PCR-Produkts ligiert. Nach Transformation von E. coli mit dem
Ligierungsgemisch wurden Plasmidclone auf Anwesenheit des MluI-BsmI-Fragments
analysiert. Die Bestätigung
der korrekten Struktur der clonierten, durch PCR hervorgebrachten
DNA-Sequenz, welche den 6His-Marker codiert, wurde durch Sequenzanalyse ausgeführt. Das
Plasmid, welches die korrekte 6His-codierende Sequenz enthielt,
wurde pNEBpIIIa6H (2) genannt und als Shuttle-Vektor
verwendet, um die Modifikation in das Ad5-Genom einzubringen.
-
Um
das Ad5-Genom, welches das modifizierte Gen für pIIIa enthält, zu erhalten,
wurde der Shuttle-Vektor pNEBpIIIa6H zur homologen DNA-Rekombination
in Escherichia coli BJ5183 mit PmeI-verdauter Plasmid-DNA pTG36021
verwendet, wie früher
beschrieben [1]. Das als Ergebnis dieser Rekombination erhaltende
Plasmid wurde pAd5IIIa6His (3) genannt.
Der Ad-Vektor Ad5IIIa6His, welcher das rekombinante IIIa-Gen enthält, das
den N-terminalen 6His-Marker codiert, wurde durch Transfektion von
293 Zellen mit PacI-verdautem pAd5IIIa6His durch das früher beschriebene
Verfahren [1] hergestellt.
-
BEISPIEL 3
-
Bestätigung der Insertion der 6His-codierenden
Sequenz im Ad-Vektor-Genom
-
PCR
wurde verwendet, um die Anwesenheit der 6His codierenden Sequenz
im pIIIa-Gen des Ad-Genoms zu zeigen. Der Sense-Primer N6His.U (5'-ATG CAC CAT CAC
CAT CAC CAT ATG, SEQ ID No. 6) wurde entworfen, um komplementär zu der
6His codierenden Sequenz zu sein. Der zu der Sequenz 260 bp stromabwärts vom
5'-Ende des pIIIa-Gens
komplementäre
Primer pIIIaN.R (5'-TTC
GGC CAG CGC GTT TAC GAT C, SEQ ID No. 4 wurde als Antisense-Primer
verwendet. Das Lysat der einzelligen Schicht von 293-Zellen, welche virale
Plaques 10 Tage nach Transfektion enthielt, wurde als Matrize für die PCR
verwendet. Das Auftreten des 260 bp-DNA-Fragments nach der PCR (4)
zeigt die Anwesenheit der 6His codierenden Sequenz in dem pIIIa-Gen
des modifizierten Ad-Genoms an.
-
BEISPIEL 4
-
Genetische Modifikation
des IX-Proteins des Ad-Kapsids
-
Um
den Shuttle-Vektor zum Einbau des Flag-Peptids (Asp Tyr Lys Asp
Asp Asp Asp Lys, SEQ ID No. 1) in den C-Terminus des IX-Proteins
herzustellen, wurde das AdEasy-Vektor-System verwendet [2]. Die
Oligonucleotide FLAGc.U: 5'-CTG
CCG ATT ATA AGG ATG ACG ATG ACA AGT (SEQ ID No. 7) und FLAGc.L: 5'-ACT TGT CAT CGT
CAT CCT TAT AAT CGG CAG (SEQ ID No. 8) wurden entworfen, um doppelsträngige DNA
zu bilden, welche das Flag-Peptid codiert. Die doppelsträngige DNA
wurde in die Dral-Stelle cloniert, welche am 3'-Ende
der pIX codierenden Sequenz angeordnet war. Die Clonierung des Flag-Oligos
wurde durch Ligierung der BsrGI-DraI- und DraI-BstXI-Fragmente von
DNA, welche aus dem pShuttle-Plasmid (5) isoliert
worden war, mit Oligo-Doppelstrang und nachfolgender Clonierung
des resultierenden DNA-Fragments zwischen BsrGI und BstXI-Stellen
im pShuttle-Plasmid durchgeführt.
Nach Transformation von E. coli mit dem Ligierungsgemisch wurden
die Plasmidklone auf die Anwesenheit der Flag-Oligo-Insertion durch PCR unter Verwendung
des oberen Primers, der für
die Position von 3904 im Ad5-Genom (5'-AGT TGA CGG CTC TTT TGG CAC A, SEQ
ID No. 9) entworfen war, und von FLAGcL als unteren Primer analysiert.
Der PCR-positive Clon wurde dann auf die Anwesenheit der PsiI-Stelle,
welche innerhalb des Flag-Oligos konstruiert war, durch Verdau mit
PsiI analysiert.
-
Nach
Sequenzanalyse der korrekten Struktur des Flag-Oligos, welches in
das 3'-Ende des
pIX-Gens cloniert worden war, wurde das resultierende Plasmid pSIXFlag
(6) zur homologen DNA-Rekombination in Escherichia
coli BJ5183 mit Plasmid-DNA pAdEazy1, welche das Ad-Genom enthielt,
wie beschrieben [2], verwendet. Das als Ergebnis dieser Rekombination
erhaltene Plasmid wurde pAd5IXFlag (7) genannt
und wurde verwendet, um den Ad-Vektor herzustellen, welcher das
rekombinante IX-Gen enthält,
das für
das C-terminale Flag-Peptid codiert. Der Ad-Vektor AdIXFlag wurde
durch Transfektion von 293-Zellen mit PacI-verdautem pAd5IXFlag durch das früher beschriebene
Verfahren [2] hergestellt.
-
BEISPIEL 5
-
Bestätigung der Anwesenheit des
Flag-Peptids in dem adenoviralen Kapsid
-
Um
den hergestellten Ad-Vektor auf die Anwesenheit des Flag-Peptids
zu charakterisieren, welches das Protein IX in dem viralen Kapsid
enthält,
wurde eine Western-Blot-Analyse ausgeführt. Das im CsCl-Gradienten
gereinigte Virus wurde in Lemmli-Puffer gekocht und auf ein SDS-PAGE-Gel
geladen, um die Proteine des viralen Kapsids zu trennen. Der Ad-Vektor
Ad5hexFlag, welcher das Flag-Peptid im Hexon-Protein enthält, wurde
als Positivkontrolle für
den Western-Blot verwendet. Virale Kapsomere, die während der
Elektrophorese getrennt wurden, wurden auf PVDF-Membran übertragen
und mit anti-Flag-M2-MAk inkubiert, gefolgt von Inkubation mit sekundärem anti-Maus-Ak,
konjugiert mit alkalischer Phosphatase. Die Western-Blot-Analyse enthüllte die
Anwesenheit einer Proteinbande von 15 kDa, welche dem erwarteten
Molekulargewicht von Protein IX entspricht, welches das Flag-Peptid
enthält
(8).
-
Um
die Oberflächenlokalisierung
des Flag-Peptids im Zusammenhang des zusammengelagerten viralen
Kapsids des hergestellten Virus zu zeigen, wurde Affinitätssäulen-Reinigung
durchgeführt.
Die Ad-Vektoren, welche zugängliche
Flag- und StrepMarker-Peptide
im Hexon-Protein enthielten, wurden jeweils als Positiv- und Negativkontrolle
für die
Reinigung verwendet. Das CsCl-gereinigte Virus wurde auf die Säule geladen,
welche anti-Flag-M2-MAk-Agarosekügelchen
enthielt, und die Säule
wurde dann gewaschen, um ungebundenes Virus zu beseitigen. Das an
die Säule
gebundene Virus wurde durch Inkubation der Agarose-Kügelchen
mit viralem Lysepuffer (0.6% SDS; 10 mM EDTA; 100 μg/ml Proteinase
K) für
10 Min. bei 56°C
lysiert, um virale DNA aus den Virionen freizusetzen. Die Virionen,
die die Säule
ohne Bindung an M2-MAk (Durchfluss) passieren, wurden durch Inkubation
mit Lysepuffer ebenso lysiert. Aliquots von Durchfluss- und Eluatfraktionen,
welche während
der ganzen Reinigung von hergestelltem Ad5IXFlag gesammelt worden
waren, sowie Kontrollviren wurden auf ein Agarosegel geladen, um
die virale DNA sichtbar zu machen. Die Elektrophorese der DNA enthüllte die
Anwesenheit von Hauptbanden von hochmolekularer viraler DNA in Eluatfraktionen von
Ad5IXFlag und dem Virus der Positivkontrolle (9).
Im Fall des Virus der Negativkontrolle, welches das StrepMarker-Peptid
enthielt, wurde die Hauptmenge der viralen DNA in der Durchflussfraktion
gefunden. Diese Daten zeigen stark an, dass das in den C-Terminus von IX-Protein
eingebaute Flag-Peptid auf der äußeren Oberfläche des
adenoviralen Kapsids dargestellt wird und für Bindungswechselwirkungen
im Zusammenhang des zusammengelagerten viralen Teilchens zugänglich ist.
-
Die
folgenden Literaturhinweise wurden hierin angeführt:
- 1. Chartier et
al. (1996) J. Virol. 70:4805-4810.
- 2. He et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA. 95(5):2509–14.
-
Beliebige
in dieser Patentschrift erwähnten
Patente oder Veröffentlichungen
sind indikativ für
das Niveau des Fachmanns, auf den sich die Erfindung bezieht.
-
Ein
Fachmann wird sich leicht bewusst sein, dass die vorliegende Erfindung
gut angepasst ist, um die Aufgaben auszuführen und die erwähnten Zwecke
und Vorteile zu erhalten, sowie jene Aufgaben auszuführen und
Zwecke und Vorteile zu erhalten, die inhärent in der Erfingung enthalten
sind. Die vorliegenden Beispiele zusammen mit den hierin beschriebenen
Verfahren, Abläufen,
Behandlungen, Molekülen
und spezifischen Verbindungen sind derzeit repräsentativ für bevorzugte Ausführungsformen,
sind beispielhaft und sind nicht als Begrenzungen des Umfangs der
Erfindung beabsichtigt. Änderungen
hierin und andere Anwendungen werden sich für den Fachmann ergeben und
sind innerhalb des Umfangs der Patentansprüche umgeben. SEQUENZPROTOKOLL
