JP2003509079A - キャプシド修飾された組換えアデノウィルスおよびその使用方法 - Google Patents

キャプシド修飾された組換えアデノウィルスおよびその使用方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明には、一本鎖抗体が主要でないキャプシドタンパク質であるpIIIaおよびpIX中に導入され、アデノウィルスベクターを特定の細胞の種類に目標付けることができる組換えアデノウィルスベクターが記載される。さらに、標的遺伝子治療において前記組換えアデノウィルスを使用する方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景関連出願の説明 本出願は、現在は放棄された、1999年9月24日に出願された米国仮特許出願第6
0/156,104号の恩恵を主張する。
【０００２】連邦基金 本発明は、国立衛生研究所からの交付金CA82961により得られた基金を使用し
て一部行われた。したがって、連邦政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】発明の背景 本発明は、概して、アデノウィルス遺伝子治療ベクターに関する。より詳細に
は、本発明は、アデノウィルス親和性が遺伝的に修飾されたアデノウィルス遺伝
子治療ベクターに関する。
【０００４】関連技術の説明 アデノウィルスベクター(Ad)は、様々の遺伝子治療用途に非常に有用であるこ
とが分かっている。この有用性は、インビトロおよびインビボの適用ついてのこ
れらのベクターの無比の供給有効性に主に由来する。しかしながら、この特性に
も関わらず、これらのベクターの十分な利益は、細胞特異的遺伝子供給能力がな
いことにより現在は損なわれている。特に、アデノウィルスの乱雑な親和性は、
標的化する、細胞特異的方法の遺伝子供給を妨げる。したがって、そのような細
胞特異的形質導入が必要な多くの遺伝子治療用途のために、現在のアデノウィル
スベクターは有用性が制限されている。
【０００５】 有効な、細胞特異的遺伝子供給の問題を扱うために、アデノウィルス親和性を
変化させるために様々の方法が開発されてきた。これらの方法には、アデノウィ
ルスキャプシドタンパク質の直接の化学的修飾、二重特異的複合体（例えば、キ
ャプシドタンパク質およびターゲティング成分）、および遺伝的キャプシド修飾
（例えば、遺伝的置換／挿入）が含まれる。前者の二つの方法により、アデノウ
ィルス再ターゲティング(re-targeting)の実行可能性が確立されたが、実際の産
生の問題並びに法規の承認の考慮により、アデノウィルス親和性への修飾が遺伝
的に導入される方法に最大の重要性が与えられた。
【０００６】 この目的のために、アデノウィルスの主要なキャプシドタンパク質、繊維、ペ
ントンおよびヘクソンの修飾によりアデノウィルス親和性を変化させる方法は、
親和性を拡大し、天然のアデノウィルスレセプター(CAR)から独立している。こ
れらの方法はさらに、アデノウィルスの天然の親和性を除去し得る。実験的には
、親和性の拡大は、標的細胞のマーカーに対して特異性を有するペプチドリガン
ドを組み込むことにより達成される。これは主に、繊維およびヘクソンの場所に
おいて、ペプチドRGD-4Cを組み込むことによる。RGD-4Cは、αvβ3およびαvβ5
クラスのインテグリンを認識する。さらに、同じ目的のために他の小さいペプチ
ドマーカーを使用する。これらの研究により、キャプシドへの遺伝的修飾によっ
て実際にアデノウィルスベクター親和性を変化させ、限られたおよび／または特
異的な範囲の遺伝子供給を達成できることが確立された。
【０００７】 留意すべきことは、ターゲティングの目的のために主要なキャプシドタンパク
質を修飾する関係において使用される場所は、小さいペプチドの組込みのみを可
能にする。現在まで、これらはファージ表示方法により同定されたペプチド、ま
たは短い生理的ペプチドリガンドから成る。しかしながら、ターゲティングモチ
ーフのこれらの種類のいずれも、細胞特異的な供給の目的を達成することに関し
て最適状態には及ばない。前者に関しては、ファージ表示技術により、有用なペ
プチドの非常に限られたレパートリーのみがこれまで同定されている。さらに、
これらのペプチドは、低親和性になる傾向がある。さらに、アデノウィルスベク
ターの関係において、そのようなターゲティングペプチドの適合度は、常に保存
されるわけではない。後者に関しては、利用できる生理的ペプチドによっては、
実際の遺伝子治療方法に必要な細胞の範囲までターゲティングされない。
【０００８】 この点に関して、一本鎖抗体(scFvs)は、アデノウィルスターゲティングに使
用し得る非常に多様な特異性を有するモチーフを示す。さらに、一本鎖抗体は、
コグネイト標的に高い親和性を有する。これに基づいて、アデノウィルスキャプ
シド中に一本鎖抗体を組み込む能力、およびキメラ／組換えキャプシドタンパク
質の表示後に保存される一本鎖抗体の特異性／親和性は、アデノウィルス再ター
ゲティングのための遺伝的なキャプシド修飾方法の有用性を劇的に高める。繊維
、ヘクソン、およびペントンの場所において一本鎖抗体を形成できないことによ
り、代理のキャプシドタンパク質中に組み込まれる一本鎖抗体の能力を調べる必
要性が示される。
【０００９】 したがって、従来技術は、有用なターゲティング成分の遺伝的導入を可能とす
る代理のアデノウィルスキャプシドタンパク質において不十分である。本発明は
、当該技術におけるこの長年の必要および要求を満たす。
【００１０】 発明の概要 本発明には、アデノウィルスの「主要でない(minor)」キャプシドタンパク質
である、pIIIaおよびpIX中に一本鎖抗体のようなターゲティングペプチドを組み
込むことが記載される。pIIIaおよびpIXは、単量体としてアデノウィルスキャプ
シド上に存在し、このタンパク質は伸長されたアミノ末端外部領域を有する。し
たがって、場所および構造を考慮することにより、pIIIaおよびpIXは一本鎖抗体
および他のターゲティングペプチドを組み込み、アデノウィルスの遺伝的修飾お
よび再ターゲティングを達成するために理想的なキャプシドタンパク質であるこ
とが示される。
【００１１】 本発明の一つの目的は、細胞特異的ターゲティング能力を有する遺伝的に修飾
されたアデノウィルスベクターおよびこの遺伝的に修飾されたアデノウィルスベ
クターを作製する方法を提供することにある。
【００１２】 本発明の一つの実施の形態において、アデノウィルスが修飾されたアデノウィ
ルスキャプシドタンパク質をコードする修飾された遺伝子を含む、組換えアデノ
ウィルスが提供される。
【００１３】 本発明の別の実施の形態において、そのような治療が必要な個体に遺伝子治療
を提供する方法であって、アデノウィルスが修飾されたアデノウィルスキャプシ
ドタンパク質をコードする修飾された遺伝子を含む組換えアデノウィルスの有効
量を個体に適用する工程を含む方法が記載される。
【００１４】 本発明のさらに別の実施の形態において、特定の細胞の種類を形質導入するア
デノウィルスの能力を増加する方法であって、アデノウィルスキャプシドタンパ
ク質をコードする遺伝子を修飾する工程を含む方法が提供される。
【００１５】 本発明の他のおよびさらなる態様、特徴、および利点は、本発明の目下好まし
い実施の形態の以下の記載から明らかとなるであろう。これらの実施の形態は、
開示の目的のために与えられる。
【００１６】 図面の簡単な説明 上述された本発明の特徴、利点および目的が明らかになり詳細に理解されるよ
うに、添付の図面をここに記載する。これらの図面は明細書の一部を形成する。
しかしながら、添付の図面は本発明の好ましい実施の形態を示し、したがって本
発明の範囲を制限するものと考えるべきではないことに留意すべきである。
【００１７】 図１は、プラスミドpNEBpIIIaの線図を示す。
【００１８】 図２は、プラスミドpNEBpIIIa6Hの線図を示す。
【００１９】 図３は、プラスミドpAd5IIIa6Hisの線図を示す。
【００２０】 図４は、修飾されたAdゲノムのpIIIa遺伝子中の配列をコードする6Hisの存在
を示すPCR後の260bpのDNA断片の様子を示す。
【００２１】 図５は、プラスミドpシャトルの線図を示す。
【００２２】 図６は、プラスミドpSIXFlagの線図を示す。
【００２３】 図７は、プラスミドpAd5IXFlagの線図を示す。
【００２４】 図８は、IXキャプシドタンパク質中におけるFlagペプチドを含有するAdベクタ
ーのウェスタンブロット分析を示す。ヘクソンタンパク質中でFlagペプチドを含
有するAdpIXFlagまたはAd5hexFlagからのウィルスキャプソメアを電気泳動によ
り分離し、PVDF膜上に移し、抗−Flag M2モノクローナル抗体とともにインキュ
ベートした後、アルカリ性ホスファターゼで共役させた二次抗−マウスAbととも
にインキュベートした。15kDaのタンパク質バンドの存在は、Flagペプチドを含
有するタンパク質IXの予想分子量と一致する。
【００２５】 図９は、組み換えられたウィルスキャプシドタンパク質IXに関連するFlagペプ
チドの表面位置測定を示す。抗−Flag M2 Mabを含有するアフィニティカラムに
結合する流出または溶出液を、溶解緩衝剤により溶解させ、アガロースゲル上に
加えてウィルスDNAを視覚化した。高分子ウィルスDNAの主要なバンドをAd5IXFla
gの溶出画分および陽性対照AdhexFlagの溶出画分において視覚化したところ、ウ
ィルスDNAの主な量は陰性対照AdhexStagの流出画分中に見られた。
【００２６】 発明の詳細な説明 本発明には、代理のキャプシドタンパク質中への一本鎖抗体および他のターゲ
ティングペプチドの組込みが記載される。この点に関して、アデノウィルスは、
繊維、ヘクソンおよびペントンの主要なキャプシドタンパク質に加えていくつか
の「主要でない」キャプシドタンパク質を含有する。アデノウィルス再ターゲテ
ィングの目的について有用となるために、候補となるキャプシドタンパク質はア
デノウィルスビリオンの表面と結合する領域を有しなければならない。二つのそ
のようなキャプシドタンパク質は、pIXおよびpIIIaである。したがって、利用で
きる主要でないキャプシドタンパク質のうち、pIXおよびpIIIaは、遺伝的なキャ
プシド修飾によるアデノウィルス再ターゲティングの要求と矛盾しない独特の構
造的な特徴を示す。これらの二つの候補のタンパク質のうち、pIXの多重結合の
性質により、構造の研究に基づく遺伝的な修飾方法は失敗するかもしれない。他
方、pIIIaは単量体としてキャプシド上に存在し、このタンパク質は伸長された
アミノ末端外部領域を有する。したがって、タンパク質自身の場所、構造および
scFvsを組み込むための候補のキャプシドタンパク質としてのpIIIaおよびpIXを
示すアデノウィルスキャプシド上のタンパク質の構造配置により、遺伝的修飾お
よび再ターゲティングが達成される。
【００２７】 本発明は、遺伝的に修飾されたアデノウィルスベクターおよびその作製方法に
関する。
【００２８】 本発明はまた、アデノウィルスがアデノウィルスキャプシドタンパク質をコー
ドする修飾された遺伝子を含む組換えアデノウィルスに関する。
【００２９】 組換えアデノウィルスがさらに治療遺伝子を含む実施例において、本発明はさ
らに、そのような治療を必要とする個体に遺伝子治療を提供する方法であって、
アデノウィルスがアデノウィルスキャプシドタンパク質をコードする修飾された
遺伝子を含む組換えアデノウィルスの有効量を個体に投与する工程を含む方法に
関する。投与の代表的な方法は全身性のものであり、好ましい治療遺伝子は、単
純ヘルペスウィルス−チミジンキナーゼをコードする。単純ヘルペスウィルス−
チミジンキナーゼをコードする上述の治療遺伝子または同様に使用し得る他の抗
癌遺伝子は当業者により認識されるであろうが、本発明はさらに、そのような治
療が必要な個体中の腫瘍細胞を殺す方法であって、適切な組換えアデノウィルス
の有効量を個体に投与し、ガンシクロビルにより個体を治療する工程を含む方法
に関する。
【００３０】 本発明はさらに、アデノウィルスが特定の細胞の種類を形質導入する能力を増
加する方法であって、アデノウィルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子
を修飾する工程を含む方法に関する。
【００３１】 通常、キャプシドタンパク質をコードする遺伝子は、一本鎖抗体および他のタ
ーゲティングペプチドを該遺伝子に導入することにより修飾される。好ましくは
、一本鎖抗体は細胞の種類に特異的なタンパク質に方向付けられ、より好ましく
はタンパク質は細胞表面タンパク質である。通常、細胞の種類は腫瘍細胞である
。本発明はまた、キャプシドタンパク質をコードする修飾された遺伝子を含有し
さらに治療遺伝子を含む、ここに記載される組換えアデノウィルスを提供する。
【００３２】 好ましくは、キャプシド遺伝子は主要でないキャプシド遺伝子であり、より好
ましくは、この主要でない遺伝子はpIIIaおよびpIXである。通常、修飾されたキ
ャプシドタンパク質は、天然の表示特性を保有している。通常、修飾されたキャ
プシド遺伝子を含む組換えアデノウィルスは、CARから独立した遺伝子転移を示
す。さらに、本発明は、修飾されたキャプシド遺伝子を含み、さらにアデノウィ
ルス繊維ノブ(knob)への追加の修飾を有し、該繊維ノブへの修飾によりアデノウ
ィルスの天然の親和性が除去される組換えアデノウィルスに関する。
【００３３】 本発明の範囲および意図から離れずに、ここに開示される本発明に様々の置換
および修飾を行えることは当業者にとって自明であろう。
【００３４】 本発明にしたがって、当業者の範囲内で従来の分子生物学、微生物学、および
組換えDNA技術を使用してもよい。そのような技術は、文献中で十分に説明され
ている。例えば、Maniatis, Fritsch & Sambrook, “分子クローニング：実験マ
ニュアル(1982)”；“DNAクローニング：実際のアプローチ、”Volumes I and I
I(D.N.Glover et al. 1985)；“オリゴヌクレオチド合成”(M.J. Gait ed. 1984
)；“核酸ハイブリダイゼーション”(B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1985)；
“転写および翻訳”(B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984)；“動物細胞培養
”(R.I. Freshney, ed. 1986)；“不朽化細胞および酵素”(IRL Press, 1986)；
B. Perbal,“分子クローニングのための実用的ガイド”(1984)参照。
【００３５】 本発明の新しい遺伝的に修飾されたアデノウィルスベクターを使用して、薬剤
組成物を調製できることが明確に予想される。そのような場合、薬剤組成物は本
発明の新しい遺伝的に修飾されたアデノウィルスベクターおよび薬学的に許容で
きるキャリアを含む。当該技術において通常の知識を有する者は、不当な実験を
せずに、本発明のこの遺伝的に修飾されたアデノウィルスベクターを投与する適
切な投与量および経路を容易に測定できるであろう。治療のためにインビボで使
用される場合、本発明の遺伝的に修飾されたアデノウィルスベクターを、治療上
有効な量、すなわち腫瘍の苦しみを除去するまたは減少する量で患者または動物
に投与する。通常は非経口的に、好ましくは静脈注射により投与されるが、他の
投与の経路を適切に使用してもよい。
【００３６】 投与量および投薬量は、癌（原発性または転移性）およびその個体群の性質、
特定の遺伝的に修飾されたアデノウィルスベクターの特徴、例えば治療の指針、
患者、患者の病歴および他の要因などに依存する。投与される遺伝的に修飾され
たアデノウィルスベクターは通常、約109から約1012分子までの範囲である。
【００３７】 この計画を、治療の負の効果に対して均衡を保ちながら有効性を最適にするま
で続ける。ここに引用される、Remington’s Pharmaceutical Science, 17th Ed
. (1990) Mark Publishing Co., Easton, Penn.; and Goodman and Gilman’s:
The Pharmacological Basis of Therapeutics 8th Ed (1990) Pergamon Press参
照。
【００３８】 非経口的な投与について、遺伝的に修飾されたアデノウィルスベクターは、最
も一般的には、薬学的に許容できる非経口的賦形剤に関連して単位投薬量注射可
能形態（溶液、懸濁液、乳濁液）に調製される。そのような賦形剤は好ましくは
、非毒性および非治療的である。そのような賦形剤の例は、水、塩水、リンゲル
溶液、デキストロース溶液、および5%ヒト血清アルブミンである。固定油および
エチルオレイン酸剤のような非水溶性の賦形剤を使用してもよい。リポソームを
キャリアとして使用してもよい。賦形剤は、等浸透圧性および化学的安定性を強
める基質、例えば緩衝剤および防腐剤のような添加物を少量含有する。遺伝的に
修飾されたアデノウィルスベクターは通常、約109から約1012分子までの濃度で
そのような賦形剤中で調製される。
【００３９】実施例１ アデノウィルスキャプシドのIIIaタンパク質の遺伝的修飾 アデノウィルスキャプシドタンパク質である、pIIIaおよびpIXは、精製標識ま
たはターゲティングリガンドとして作用し得る異種ペプチド配列のキャリアとし
て使用することができ、したがってウィルス精製または／およびターゲティング
に使用し得る。概念の第一の証明として、6つのHis標識をpIIIaのアミノ末端に
組み込み、小さい8つのアミノ酸ペプチド標識−Flag（Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
Asp Lys、配列番号1）をpIXのカルボキシ末端に組み込んだ。適切な親和性培地
(affinity medium)への結合による修飾されたウィルスを精製する能力を測定し
た。
【００４０】実施例２ 組換えプラスミドの構造 pIIIa遺伝子の修飾のためのシャトルベクターを産生するために、完全なAd5ゲ
ノムを含有するプラスミドpTG36021からのPmlI−断片DNA(4055bp)を、プラスミ
ドpNEB193中のSmaI部位とHincII部位との間にクローニングした。pNEB193の関係
においてpIIIa遺伝子を含有するPmlI−断片の正しい位置付けを制限分析により
確かめ、構成されたプラスミドをpNEBpIIIaと称する（図１）。
【００４１】 6つのヒスチジン標識をpIIIaタンパク質のアミノ末端部に導入するために、テ
ンプレートとしてPmlI−断片DNAおよび以下の2対のプライマーを使用してPCRを
行った：１）pIIIaN.F：5’−CGCGAGGAGGTGGCTATAGGACTGA（配列番号2）、pIIIa
N6His.L：5’−ATGGTGATGGTGATGGTGCATCTGATCAGAAACATC（配列番号3）；２）pII
IaN.R：5’−TTCGGCCAGCGCGTTTACGATC（配列番号4）、pIIIaN6His.U：5’−CACC
ATCACCATCACCATATGCAAGACGCAAC（配列番号5）。
【００４２】 プライマーpIIIaN6His.UおよびpIIIaN6His.LをpIIIa遺伝子の5’端に一部相補
的となり6Hisをコードするように設計した。第1のPCR後に産生された7440および
261bpのDNA産物を、プライマーpIIIaN.FおよびpIIIaN.Rを使用する第2のPCRによ
り連結し、ATGコドンの直後に導入された6Hisをコードする配列を有するpIIIa遺
伝子の5’末端部に対応するDNA断片(983bp)が産生される。
【００４３】 遺伝子の修飾された部分をシャトルベクター中に挿入するために、pNEBpIIIa
をMluIおよびBsmIで切断し、ベクター部分を精製し、その後PCR産物の対応するM
luI−BsmI断片(738bp)と連結した。ライゲーション混合物による大腸菌の形質転
換後、MluI−BsmI断片の存在についてプラスミドクローンを分析した。6Hishっ
よう史記をコードするクローニングされたPCRで作製されたDNA配列の適切な構造
の確認を、配列分析により行った。適切な6His−コード配列を含有するプラスミ
ドをpNEBpIIIa6H（図２）と称し、Ad5ゲノム中に修飾を導入するためのシャトル
ベクターとして使用した。
【００４４】 pIIIaについて修飾された遺伝子を含有するAd5ゲノムを得るために、シャトル
ベクターpNEBpIIIa6Hを、既述のようにPmeIで切断されたプラスミドDNApTG36021
による大腸菌BJ5183中の相同DNA組換えに使用した[1]。この組換えの結果として
得られたプラスミドをpAd5IIIa6Hisと称した（図３）。N末端6His標識をコード
する組換えIIIa遺伝子を含有するAdベクターであるAd5IIIa6Hisを、既述の方法
によりPacIで切断したpAd5IIIa6Hisを有する293細胞のトランスフェクションに
より産生した[1]。
【００４５】実施例３ Adベクターゲノム中の6Hisコード配列のインサートの確認 PCRを使用して、AdゲノムのpIIIa遺伝子中の6Hisコード配列の存在を示した。
センスプライマーN6His.U（5’−ATG CAC CAT CAC CAT CAC CAT ATG、配列番号6
）を、6Hisコード配列に相補的となるように設計した。PIIIa遺伝子の5’端の26
0bp下流の配列に相補的なプライマーpIIIaN.R（5’−TTC GGC CAG CGC GTT TAC
GAT C、配列番号4）をアンチセンスプライマーとして使用した。10日間のトラン
スフェクション後のウィルスプラークを含有する293細胞の単層の溶解物をPCRの
テンプレートとして使用した。PCR後の260bpDNA断片の出現（図４）により、修
飾されたAdゲノムのpIIIa遺伝子中の6Hisコード配列の存在が示される。
【００４６】実施例４ AdキャプシドのIXタンパク質の遺伝的修飾 Flagペプチド（Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys、配列番号1）をIXタンパク
質のC末端に組み込むためのシャトルベクターを産生するために、AdEasyベクタ
ー系を使用した[2]。オリゴヌクレオチドFLAGc.U：5’−CTG CCG ATT ATA AGG A
TG ACG ATG ACA AGT(配列番号7)およびFLAGc.L：5’−ACT TGT CAT CGT CAT CCT
TAT AAT CGG CAG（配列番号8）を、FlagペプチドをコードするDNA二重鎖を形成
するように設計した。DNA二重鎖をpIXコード配列の3’端に位置するDraI部位に
クローニングした。Flagオリゴのクローニングを、オリゴ二重鎖を有するpシャ
トルプラスミド（図５）から単離したDNAのBsrGI-DraIおよびDraI-BstXIのライ
ゲーションおよびpシャトルプラスミド中のBsrGI部位とBstXI部位との間の生じ
たDNA断片のその後のサブクローニングにより行った。ライゲーション混合物に
よる大腸菌の形質転換後、プラスミドクローンを、Ad5ゲノム中の3904の位置に
対して設計した上流プライマー（5’−AGT TGA CGG CTC TTT TGG CAC A、配列番
号9）およびより下流のプライマーとしてFLAGcLを使用するPCRによりFlag−オリ
ゴインサートの存在について分析した。その後Psi Iを使用する切断により、Fla
g−オリゴの内部に作製されたPsi I部位の存在についてPCR−陽性クローンを分
析した。
【００４７】 pIX遺伝子の3’端中にクローニングされたFlag−オリゴの適切な構造の配列分
析後、生じたプラスミドであるpSIXFlag（図６）を、記載されるようにAdゲノム
を含有するプラスミドDNA pAdEazy1による大腸菌BJ5183における相同DNA組換え
に使用した[2]。この組換えの結果として得られたプラスミドをpAd5IXFlag（図
７）と称し、C末端Flagペプチドをコードする組換えIX遺伝子を含有するAdベク
ターの産生に使用した。AdベクターであるAd5IXFlagを、既述の方法によりPacI
で切断したpAd5IXFlagによる293細胞のトランスフェクションにより産生した。
【００４８】実施例５ アデノウィルスキャプシド中のFlagペプチドの存在の確認 ウィルスキャプシド中のタンパク質IXを含有するFlagペプチドの存在について
産生されたAdベクターを特徴付けるために、ウェスタンブロット分析を行った。
CsCl勾配上で精製されたウィルスをLemmli緩衝剤中で煮沸し、SDS-PAGE上に加え
、ウィルスキャプシドのタンパク質を分離した。ヘクソンタンパク質中でFlagペ
プチドを含有するAdベクターであるAd5hexFlagを、ウェスタンブロットについて
の陽性対照として使用した。電気泳動中に分離されたウィルスキャプソメアを、
PVDF膜上に移し、抗−FlagM2 MAbとともにインキュベートした後、アルカリ性ホ
スファターゼで共役させた二次抗−マウスAbとともにインキュベーションした。
ウェスタンブロット分析により、Flagペプチドを含有するタンパク質IXの予想分
子量に一致する15kDaのタンパク質バンドの存在が示された。
【００４９】 産生されたウィルスの組み換えられたウィルスキャプシドに関連するFlagペプ
チドの表面局在を示すために、アフィニティカラム精製を行った。ヘクソンタン
パク質中の利用できるFlagおよびStrepTagペプチドを含有するAdベクターを、精
製のための陽性および陰性対照としてそれぞれ使用した。CsCl−精製されたウィ
ルスを抗−Flag M2 MAbアガロースビーズ上に加え、次にカラムを洗浄して結合
していないウィルスを除去した。カラムに結合したウィルスを、10分間56℃でウ
ィルス溶解緩衝剤（0.6% SDS；10mM EDTA；100μg/mlプロテインキナーゼK）と
ともにアガロースビーズをインキュベーションすることにより溶解し、ビリオン
からウィルスDNAを解放した。M2 MAbに結合せずにカラムを通過したビリオン（
流出）を、溶解緩衝剤とともにインキュベーションすることにより溶解した。産
生されたAd5IXFlagの精製を通して集められた流出および溶出画分および対照ウ
ィルスのアリコートをアガロースゲル上に加え、ウィルスDNAを視覚化した。DNA
電気泳動により、Ad5IXFlagおよび陽性対照ウィルスの溶出画分中の高分子をウ
ィルスDNAの主要なバンドの存在が示された（図９参照）。StrepTagペプチドを
含有する陰性対照ウィルスの場合、ウィルスDNAの主要量は、流出画分中に見ら
れた。これらのデータにより、IXタンパク質のC末端中に組み込まれたFlagペプ
チドは、アデノウィルスキャプシドの外表面上に示され、会合したウィルス粒子
に関連する結合相互作用を受けやすいということが強く示される。
【００５０】 以下の文献をここに引用する： １．Chartier et al. (1996) J. Virol. 70:4805-4810. ２．He et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA. 95(5):2509-14. 本明細書中に記載される特許または刊行物は、いずれも本発明が関する当業者
のレベルを示すものである。さらに、これらの特許および刊行物は、それぞれの
刊行物が明確におよび個別的に示され引用されるのと同じ程度まで、ここに引用
される。
【００５１】 本発明を、目標を達成するためにおよび上述の目的および利点、並びにそれに
固有の目標、目的および利点を得るために適合させることができることは、当業
者にとって自明である。ここに記載される方法、手順、処理、分子、および特定
の化合物とともに本発明の実施例は、好ましい実施の形態の目下代表例であり、
具体例であり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。特許請求
の範囲により定められる本発明の意図に含まれる本発明の変化および他の用途を
、当業者は思いつくであろう。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドpNEBpIIIaの線図
【図２】 プラスミドpNEBpIIIa6Hの線図
【図３】 プラスミドpAd5IIIa6Hisの線図
【図４】 修飾されたAdゲノムのpIIIa遺伝子中の配列をコードする6Hisの存在を示すPCR
後の260bpのDNA断片の様子を示す図
【図５】 プラスミドpシャトルの線図
【図６】 プラスミドpSIXFlagの線図
【図７】 プラスミドpAd5IXFlagの線図
【図８】 IXキャプシドタンパク質中におけるFlagペプチドを含有するAdベクターのウェ
スタンブロット分析を示す図
【図９】 組み換えられたウィルスキャプシドタンパク質IXに関連するFlagペプチドの表
面位置測定を示す図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92 //(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 DA02 EA02 FA10 FA20 GA11 HA17 4B065 AA93X AA95Y AB01 BA01 CA44 4C084 AA13 MA02 NA13 NA14 ZB261 ZB262 4C086 AA01 AA02 CB07 MA02 MA03 MA04 NA05 NA13 ZB26 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 NA05 NA13 NA14 ZB26

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 修飾されたアデノウィルスキャプシドタンパク質をコードす
    る修飾された遺伝子を有することを特徴とする組換えアデノウィルス。
  2. 【請求項２】 前記キャプシドタンパク質をコードする遺伝子が、一本鎖抗
    体を該遺伝子中に導入することにより修飾されることを特徴とする請求項１記載
    の組換えアデノウィルス。
  3. 【請求項３】 前記一本鎖抗体があるタンパク質に方向付けられ、該タンパ
    ク質が細胞の種類に特異的であることを特徴とする請求項２記載の組換えアデノ
    ウィルス。
  4. 【請求項４】 前記細胞の種類が、腫瘍細胞であることを特徴とする請求項
    ３記載の組換えアデノウィルス。
  5. 【請求項５】 前記タンパク質が、細胞表面タンパク質であることを特徴と
    する請求項３記載の組換えアデノウィルス。
  6. 【請求項６】 前記キャプシド遺伝子が、主要でないキャプシド遺伝子であ
    ることを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウィルス。
  7. 【請求項７】 前記主要でないキャプシド遺伝子が、pIIIaおよびpIXからな
    る群より選択されることを特徴とする請求項６記載の組換えアデノウィルス。
  8. 【請求項８】 前記修飾されたキャプシドタンパク質が、天然の表示特性を
    保有することを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウィルス。
  9. 【請求項９】 前記アデノウィルスが、CARから独立した遺伝子転移を示す
    ことを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウィルス。
  10. 【請求項１０】 前記アデノウィルスがさらに、アデノウィルス繊維ノブへ
    の追加の修飾を有し、前記繊維ノブへの該修飾により前記アデノウィルスの天然
    の親和性が除去されることを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウィルス。
  11. 【請求項１１】 前記アデノウィルスをコードするアデノウィルスベクター
    がさらに、治療遺伝子を有することを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウ
    ィルス。
  12. 【請求項１２】 そのような治療が必要な個体に遺伝子治療を提供する方法
    であって、 該個体に請求項１１記載の前記組換えアデノウィルスの有効量を投与する工程
    を含むことを特徴とする方法。
  13. 【請求項１３】 前記投与が全身性であることを特徴とする請求項１２記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】 前記治療遺伝子が、単純ヘルペスウィルス−チミジンキナ
    ーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１１記載の組換えアデノウィルス。
  15. 【請求項１５】 そのような治療が必要な個体中の腫瘍細胞を殺す方法であ
    って、 該個体に請求項１４記載の前記組換えアデノウィルスの有効量を投与し、 該個体をガンシクロビルで治療する、 各工程を含むことを特徴とする方法。
  16. 【請求項１６】 前記投与が全身性であることを特徴とする請求項１５記載
    の方法。
  17. 【請求項１７】 アデノウィルスが特定の細胞の種類を形質導入する能力を
    増加させる方法であって、 アデノウィルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を修飾する工程を含
    み、該修飾により前記アデノウィルスが特定の細胞の種類を形質導入する能力が
    増加されることを特徴とする方法。
  18. 【請求項１８】 前記キャプシドタンパク質をコードする前記遺伝子が、一
    本鎖抗体を該遺伝子中に導入することにより修飾されることを特徴とする請求項
    １７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記一本鎖抗体があるタンパク質に方向付けられ、該タン
    パク質が細胞の種類に特異的であることを特徴とする請求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前期細胞の種類が腫瘍細胞であることを特徴とする請求項
    １９記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記タンパク質が、細胞表面タンパク質であることを特徴
    とする請求項１９記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記キャプシド遺伝子が、主要でないキャプシド遺伝子で
    あることを特徴とする請求項１７記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記主要でないキャプシド遺伝子が、pIIIaおよびpIXから
    なる群より選択されることを特徴とする請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記修飾されたキャプシドタンパク質が、天然の表示特性
    を保有することを特徴とする請求項１７記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記アデノウィルスが、CARから独立した遺伝子転移を示
    すことを特徴とする請求項１７記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記アデノウィルスがさらに、アデノウィルス繊維ノブへ
    の追加の修飾を有し、前記繊維ノブへの該修飾により前記アデノウィルスの天然
    の親和性が除去されることを特徴とする請求項１７記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記アデノウィルスをコードするアデノウィルスベクター
    がさらに、治療遺伝子を有することを特徴とする請求項１７記載の方法。
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