KR102089121B1 - 종양살상형 아데노바이러스 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명에서 하나 이상의 변형을 포함하는 E1A 폴리펩티드 및 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf6/7 폴리펩티드를 포함하는 아데노바이러스를 제공하였다. 또한 본 발명에서 변형된 아데노바이러스를 포함하는 조성물 및 키트를 제공하였다. 추가적으로, 본 발명에서 하나 이상의 변형을 포함하는 E1A 폴리펩티드 및 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf6/7 폴리펩티드를 포함하는 아데노바이러스를 피험체에 투여하는 것을 포함하는 피험체에서 증식성 장애를 치료하는 방법을 제공하였다.

Description

종양살상형 아데노바이러스 조성물{ONCOLYTIC ADENOVIRUS COMPOSITIONS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2013년 3월 14일 출원된 미국 출원번호 61/782,932 건에 대하여 우선권 주장을 하고 있으며, 이는 참고문헌으로서 본 출원서에 온전한 형태로 병합되어 있다.
연방정부 지원 연구에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원의 연구비 번호 5T32GM007240-35의 지원을 받는 정부 펀드에 의해 완성되었다. 미국 정부는 본 발명의 일정 권리를 갖는다.
암은 매년 50만 명 이상의 죽음의 이유가 되는 복잡하고, 심신을 약화시키는 질병이다. 암에 대한 좀 더 효과적이고, 선택적이며 안전한 치료가 절실히 필요하다. 이러한 널리 퍼져있고 생명을 위협하는 질병에 대하여 화학요법 및 외과수술 같은 기존의 치료법은 모든 악성 세포를 거의 제거하지 못하고, 종종 치료 효과보다 더 큰 해로운 부작용을 나타내기도 한다.
현재 암 치료의 많은 단점을 다루는 잠재력을 갖춘 하나의 접근법은 종양살상형 아데노바이러스 치료법이다(문헌 Pesonen, S. et al., Molecular Pharmaceutics, 8(1): p. 12-28 (2010) 참조). 아데노바이러스(Ad)는 자기-증식형 생물학적 기계이다. 아데노바이러스는 단백질 외피에 덮힌 선형의 이중-나선의 36kb DNA 게놈으로 구성되어 있다. 아데노바이러스는 세포에 침투하여 복제를 위한 세포의 복제 기작을 탈취하고 어셈블리 형성시 세포를 벗어나기 위한 용균성 세포 죽음을 유발하여 주위의 세포로 침투한다. 이와 매우 동일한 세포내 조절은 암에서 변이에 의해 표적화된다. 암 세포 내 특이적으로 감염하여 복제하고 가능한 저항을 극복하면서 탐색 가능하고 파괴하여 멀리 전이하는 수천 개의 바이러스 자손을 방출하기 위해 암세포를 파열시키는 유도 미사일처럼 행동하는 합성 바이러스 생성에 이러한 지식을 이용할 수 있다. 따라서, 종양살상형 바이러스 디자인의 목표는 암 세포 내 특이적으로 복제하면서 정상 세포에는 피해를 주지 않는 바이러스를 제조하는 것이다. 하지만, 암 세포에서 선택적으로 복제하는 바이러스를 설계하는데 있어 도전과제가 있다. 이에, 암 세포에서 선택적으로 복제하는 추가 바이러스에 대한 요구가 있는 실정이다.
본원에서는 하나 이상의 변형(modification)을 포함하는 E1A 폴리펩티드, 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf6/7 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf1 폴리펩티드 또는 이의 조합을 포함하는 아데노바이러스를 제공한다. 변형된 아데노바이러스를 포함하는 조성물 및 키트가 또한 제공된다. 추가적으로, 하나 이상의 변형을 포함하는 E1A 폴리펩티드, 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf6/7 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf1 또는 이의 조합을 포함하는 아데노바이러스를 피험체에 투여하는 것을 포함하는 증식성 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
하나 이상의 구현예의 상세한 내역은 첨부한 도면 및 하기의 설명에 제시하였다. 다른 특징, 물건, 및 장점은 상세한 설명, 도면 및 청구항으로부터 자명할 것이다.
도 1은 종양살상형 바이러스 암 치료의 일반적인 원리를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 아데노바이러스(Ad)의 구조적 특징 및 박스와 표지된 유전자 내 전사 유닛을 포함하는 아데노바이러스 게놈의 맵을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 감염된 1차 작은 기도 상피 세포와 야생형 Ad5 및 "RB/p16/E2F 경로" 선택적인 바이러스로 감염시킨 종양 세포로부터의 세포 파쇄물의 면역블롯에 대한 이미지이다. 종양 및 1차 인간 세포는 야생형 바이러스, ONYX-838 (E1A ΔLXCXE) 또는 ONYX-411로 감염시켰고, 감염 후 다양한 시간대에서 회수하였다. 파쇄물은 바이러스 증식의 단위인 바이러스 캡시드 단백질(항-Ad5, 3가지 띠는 헥손, 펜톤 및 섬유를 포함함)의 발현에 대하여 분석하였다. ONYX-838은 종양 및 1차 폐 상피 세포에서 분별없이 증식하였다. ONYX-411은 E1A ΔLXCXE와 아데노바이러스 E1A, E1B 및 E4 영역의 세포 내 E2F 조절을 조합하였는데, 정상 세포에 대한 종앙 세포 내 선택적-복제를 입증하였다(Johnson et al., Cancer Cell 1(4):325-337 (2002) 참고). 하지만, E2F 프로모터는 결과적으로 재조합하였고 또한 종양 세포 내 야생형 바이러스 레벨에 대한 복제를 제한하였다.
도 4A 및 4B는 E2F를 활성화시키고 조절되지 않는 복제를 일으키기 위해 종양 변이들 및 아데노바이러스 초기 단백질이 합쳐져서 Rb/p16 종양 억제자 경로를 활성화시키는 것을 나타내는 모식도이다. 도 4A는 Rb/p16 신호전달 경로 종양 억제 기능의 손실을 유발하는 일반적인 변이를 나타내었다. 도 4B는 세포를 S-기로 유도하는 Rb 및 E2F를 직접적으로 조절해제시키는 아데노바이러스 단백질을 나타내었다.
도 5는 Rb-E2F 세포 주기 체크포인트를 조절해제하는 다양한 단백질을 아데노바이러스가 암호화한다는 것을 도식적으로 나타낸 것이다. 아데노바이러스 E1A는 보존된 LXCXE 모티프를 통해 세포내 Rb에 결합하고, E2F를 방출하여 바이러스 및 세포 내 DNA 복제에 필요한 세포 내 유전자의 전사를 활성화시킨다. E1A는 아데노바이러스가 Rb 체크포인트를 비활성화시키고 E2F 표적 유전자를 활성화시키는 중요한 메카니즘으로 판단된다. 부가적으로, 또 다른 아데노바이러스 단백질 E4orf6/7은 E2F-DP1 abd를 세포 및 바이러스 E2 프로모터 상에서 이량체화시켜서 전사 활성을 향상시켰다(문헌 Schaley, J., et al., Protein J. Virol., 74(5):2084-2093 (2000); Cress, et al., Genes & Development, 7(10):1850-61 (1993) 참고).
도 6은 본 발명 내 초기의 다양한 변이체 아데노바이러스의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다. 야생형 Ad5 게놈은 전사 유닛에 따라 모듈로 분리하였고, 모듈 각각은 다른 플라스미드에 배치하였다. 변이는 모듈 플라스미드 상에서 제조되었고, PCR-기반의 접근(AdSlicR)을 이용하여 모듈은 재조합 아데노바이러스의 생성을 가능하게 하는 완전한 게놈으로 재구성되었다.
도 7A 및 도 7B는 E4orf6/7 결실을 도식적으로 나타낸 것이다. 2개의 엑손은 E4ORF6/7을 암호화하였다. E4orf6 및 E4orf6/7은 동일한 개시 코돈을 이용하였고 58개 아미노산 N-말단 잔기를 공유하였다. E4orf6/7 전사체는 E4orf6/7 정지 코돈 이후에 즉시 스플라이싱되었다. 정지 코돈을 포함하는 E4orf6/7의 전체 2차 엑손은 결실되었다. 도 7A는 야생형 E4 영역을 나타내었다. 도 7B는 결과적인 E4 ΔE4orf6/7 영역을 나타내었다.
도 8A 및 8B는 변이체 Ad 감염된 세포 유래의 아데노바이러스 초기 E1A의 발현을 나타내는 세포 파쇄물의 면역블롯의 그림이다. 목(mock)(ΔE1), Ad-102(본원에서 AdSyn-C0102(야생형)으로 언급되어 있음), Ad-181(본원에서는 AdSyn-C0181으로 언급되어 있음)(E1A ΔLXCXE/ΔE4orf6/7), Ad-189(본원에서 AdSyn-C0-189으로 언급되어 있음)(E1A ΔLXCXE), 또는 ONYX-838 (E1A ΔCR2)로 감염된 세포이다. ONYX-838은 또한 E1A의 CR2 도메인 내 ΔLXCXE이 결핍되어 있다. 도 8A에서, 휴지기 인간 1차 작은 기도 상피세포(SAEC)는 MOI10에서 감염시켰다. 용해물은 E1A 발현에 대하여 분석하였다. Ad-102 (AdSyn-CO102)는 감염 중 후반 시기에 E1A 수준의 예측된 감소를 보여준다. 유사하게 Ad-189 (AdSyn-CO189) 및 ONYX-838는 감염 중 후반 시기에 E1A 수준의 감소를 보여줬지만, 보다 이른 시기에는 더 강한 발현을 보여준다. Ad-181 (AdSyn-CO181)는 감염 내내 E1A의 더 강하고 연속적인 발현을 보여주는데, 이는 아데노바이러스 생활주기를 통한 진행 실패의 표시이다. 도 8B에서, 컨플루언트 폐 선암(A549)는 MOI30에서 감염시켰다. 용해물은 E1A 발현에 대하여 분석하였다. 모든 감염은 감염 중 후반 시기에 E1A 수준의 예상된 감소를 보여주는데, 이는 전형적인 아데노바이러스 생활주기 진행의 표시이다.
도 9A 및 9B는 감염된 1차 및 종양 세포 내 세포의 사이클린의 발현 및 아데노바이러스 후반 단백질 발현을 보여주는 세포 용해물의 면역블롯의 도면이다. 세포는 목(ΔE1), Ad-102 (AdSyn-CO102) (야생형), Ad-181 (AdSyn-CO181) (E1A ΔLXCXE/ΔE4orf6/7), Ad-189 (AdSyn-CO189) (E1A ΔLXCXE), 또는 ONYX-838 (E1A ΔCR2)으로 감염되었다. 도 9A에서, 인간 1차 작은 기도 상피세포(SAEC)는 MOI10에서 감염시켰다. 야생형 및 E1A 변이를 갖는 바이러스 단독과는 대조적으로, Ad-181 (AdSyn-CO181)는 E2F-의존성 세포 주기 표적인 S기, 사이클린 A 및 사이클린 B 활성화에 실패하였다. 더욱이, Ad-181 (AdSyn-CO181) 및 Ad-210 (AdSyn-CO210)는 E4orf6/7 변이를 갖고 있는데, 후반 단백질 발현 및 복제에 대하여 결핍되었다. 이러한 양 결핍 모두는 Ad-210 (AdSyn-CO210)의 보다 적은 수준에 대하여 명백하다. 도 9B에서, 인간 폐 선암 세포(A549)는 MOI30에서 감염시켰다. 감염된 1차 세포와는 대조적으로, 후반 구조 단백질의 발현에서의 명백한 결핍은 없었고, 모든 감염된 A549 샘플에서 사이클린 A 및 사이클린 B는 여전히 존재하였다.
도 10A 및 도 10B는 감염된 SAEC 및 A549 내 FACS에 의해 PI를 이용하여 정량한 DNA 복제를 보여주는 FACS 히스토그램이다. 세포는 목(ΔE1), Ad-102 (AdSyn-CO102) (wildtype), Ad-181 (AdSyn-CO181) (E1A ΔLXCXE/ΔE4orf6/7), Ad-189 (AdSyn-CO189) (E1A ΔLXCXE), 또는 Ad-210 (AdSyn-CO210) (ΔE4orf6/7)로 감염시켰고, 감염 후 48시간에 수집하였다. 감염되지 않은 세포의 DNA 함량은 배경 프로필 내에 나타내었다. Y-축은 세포의 상대적인 풍부함이고, X-축은 DNA 양에 비례하는 세포 내 PI로부터의 형광이다. 도 10A에서, 휴지기 SAEC는 MOI10에서 감염시켰다. Ad-181 (AdSyn-CO181) 감염은 Ad-102 (AdSyn-CO102)에 비해 SAEC 내 강한 DNA 복제 결핍을 증명하였는데, 이는 감소된 바이러스 복제와 연관되어 있다. 보통의 결핍 또한 이 시점에서의 Ad-210 (AdSyn-CO210) 감염된 SAEC에서 명백하다. 도 10B에서, 인간 폐 선암 세포(A549)는 MOI30에서 감염시켰다. 어떠한 복제 결핍도 변이 바이러스 감염에서 명백히 나타나지 않았다.
도 11A 및 11B는 감염된 SAEC 및 A549로부터 아데노바이러스 파열(bursts)을 보여주는 그래프이다. 세포는 목 (ΔE1), Ad-102 (AdSyn-CO102) (야생형), Ad-181 (AdSyn-CO181) (E1A ΔLXCXE/ΔE4orf6/7), Ad-189 (AdSyn-CO189) (E1A ΔLXCXE), Ad-210 (AdSyn-CO210) (ΔE4orf6/7), 또는 ONYX-838 (E1A ΔCR2)로 감염시켰고, 배지는 감염 후 48시간 및 72시간에 수집하였다. 배지 내 감염성 바이러스 입자는 ELISA에 의해 정량하였다. 도 11A에서, 휴지기 SAEC는 MOI10에서 감염시켰다. 두 가지 Ad-181 (AdSyn-CO181) 및 Ad-210 (AdSyn-CO210) 감염 모두는 Ad-102 (AdSyn-CO102)에 비해 SAEC 내 강한 복제 결핍을 증명하였다. 도 11B에서, A549 세포는 MOI30에서 감염시켰다. 이 시점에서 Ad-210 (AdSyn-CO210)를 제외하고, 바이러스 복제의 결핍은 없었다.
도 12A 및 12B는 감염된 SAEC 및 A549의 감염 7일 후의 세포 생존성을 보여주는 그래프이다. 세포는 목 (ΔE1), Ad-102 (AdSyn-CO102) (야생형), Ad-181 (AdSyn-CO181) (E1A ΔLXCXE/ΔE4orf6/7), Ad-189 (AdSyn-CO189) (E1A ΔLXCXE), Ad-210 (AdSyn-CO210) (ΔE4orf6/7), 또는 ONYX-838 (E1A ΔCR2)의 연속 희석에 의해 감염시켰고, 세포 내 대사 활성은 WST-1 시험법(Roche, Basel, Switzerland)에 의해 정량하였다. 도 12A에 나타낸 바와 같이, Ad-102 (AdSyn-CO102)에 비교하여 Ad-181 (AdSyn-CO181)는 SAEC 내 감소된 세포-살상 능력을 제시하였다. 도 12B에 나타낸 바와 같이, 본 발명자가 자료를 갖고 있는 바이러스에서, 야생형에 비해 변이체 바이러스에 의한 세포 살상의 결핍은 없었다.
도 13A는 세포 용해물의 면역블롯의 도면이고 도 13B 및 13C는 정상 인간 성상세포(NHA) 내 감쇄된 감염을 갖는 Ad-181 (AdSyn-CO181)을 보여주는 그래프이다. 도 13A에서, MOI10 감염된 NHA는 아데노바이러스 후반 구조 단백질 발현 및 세포 사이클린 유도를 탐지하기 위한 면역블롯을 실시하였다. Ad-181(AdSyn-CO181)는 사이클린 A를 유도하지 않고, Ad-102 (AdSyn-CO102)에 비해 지연되고 감소된 후반 바이러스 단백질 발현을 입증하였는데, 이는 복제 효율의 표시이다. 도 13B에서, NHA는 일련의 바이러스로 감염시켰고, 배지 내 감염성 입자의 숫자는 감염 후 48시간 및 72시간에 정량하였다. Ad-181 (AdSyn-CO181) 및 Ad-189 (AdSyn-CO189)는 Ad-102 (AdSyn-CO102)에 비해 복제 결핍을 입증하였다. 도 13C에서, DNA 복제는 MOI 10으로 감염시킨 NHA에서 감염 후 48시간에 PI FACS에 의해 정량하였다. 감염되지 않은 세포의 DNA 함량은 히스토그램의 배경 프로파일로 나타내었다. Y-축은 세포의 상대적인 풍부함이고, X-축은 핵산의 양에 비례하는 세포 내 PI로부터의 형광이다. Ad-181 (AdSyn-CO181)는 Ad-102 (AdSyn-CO102)에 비해 DNA 복제의 감소된 유도를 입증하였고, 이는 감소된 바이러스 복제와 연관되어 있다.
도 14A는 감염된 신경교아종 U87 세포의 세포 용해물의 면역블롯의 도면이고 도 14B 및 14C는 변이체 Ads가 신경교아종 U87 세포 내에서 복제 결핍을 갖고 있지 않다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 14A에서, MOI20 감염된 U87 세포는 아데노바이러스 후반 구조 단백질 발현 및 세포내 사이클린 유도를 탐지하기 위한 면역블롯을 실시하였다. 도 14B에서, U87은 일련의 바이러스로 감염시켰고, 배지 내 감염성 입자의 숫자는 감염 48 시간 및 72 시간에 정량하였다. 도 14C에서, DNA 복제는 MOI 20 감염된 U87에서 감염 후 48시간에 PI FACS에 의해 정량하였다. 감염되지 않은 세포의 DNA 함량은 히스토그램의 배경 프로파일로 보여주었다. Y-축은 세포의 상대적 풍부함이고, X-축은 핵산의 양에 비례하는 세포 내 PI 유래의 형광이다.
도 15A는 신경교아종 U118 세포의 세포 용해물의 면역블롯의 도면이고 도 15B 및 15C는 변이체 Ads가 신경교아종 U118 세포 내에서 복제 결핍을 갖고 있지 않다는 것을 보여주는 그래프이다. 도 15A에서, MOI20 감염된 U118 세포는 아데노바이러스 후반 구조 단백질 발현 및 세포내 사이클린 유도를 탐지하기 위한 면역블롯을 실시하였다. 도 15B에서, U87은 일련의 바이러스로 감염시켰고, 배지 내 감염성 입자의 숫자는 감염 후 48 시간 및 72 시간에서 정량하였다. 도 15C에서, DNA 복제는 MOI 20 감염된 U118에서 감염 후 48시간에서 PI FACS에 의해 정량하였다. 감염되지 않은 세포의 DNA 함량은 히스토그램의 배경 프로파일로 보여주었다. Y-축은 세포의 상대적 풍부함이고, X-축은 핵산의 양에 비례하는 세포 내 PI 유래의 형광이다.
도 16A는 젤(겔)의 도면이고 도 16B 및 도 16C는 Ad-181 (AdSyn-CO181)가 인간 섬유아세포(IMR90) 내 보통의 복제 결핍을 갖고 있음을 보여주는 그래프이다. 도 16A에서, MOI10 감염된 섬유아세포는 후반 구조 단백질 발현을 탐지하기 위해 면역블롯을 실시하였다. Ad-181 (AdSyn-CO 181)은 Ad-102 (AdSyn-CO102)에 비해 지연되고 감소된 후기 바이러스 단백질 발현을 입증하는데, 이는 복제 효율의 표시이다. 도 16B에서, 섬유아세포는 일련의 바이러스로 감염시켰고, 배지 내 감염성 입자의 숫자는 감염 후 48 시간 및 72 시간에 정량하였다. 이 시점에서의 이러한 시험에서, 변이체 바이러스의 복제 능력 내 명확한 차이점이 없었다. 도 16C에서, DNA 복제는 MOI20 감염된 섬유아세포에서 감염 후 48 시간에서 PI FACS에 의해 정량하였다. 감염되지 않은 세포의 DNA 함량은 히스토그램의 배경 프로파일 내에 보여주었다. Y-축은 세포의 상대적 풍부함이고, X-축은 핵산의 양에 비례하는 세포 내 PI 유래의 형광이다. Ad-181 (AdSyn-CO181)은 Ad-102 (AdSyn-CO102)에 비해 DNA 복제의 감소된 유도를 입증하는데, 이는 감소된 바이러스 복제와 연관되어 있다.
도 17은 감염 10일 후에 감염된 1차 정상 인간 성상세포(NHA)의 세포 생존능을 보여주는 그래프이다. 세포는 야생형 및 변이체 바이러스의 연속 희석으로 감염시켰다(하기 표 1 참조). 대사 활성은 WST-1 시험(Roche, Basel, Switzerland)에 의해 정량하였다. 세포마다 3개 및 10개 감염성 입자에서의 세포 생존능은 바이러스에 의한 세포 살상을 2개 그룹인 더 적은 살상 및 더 많은 살상의 구분을 보여 준다. 더 적은 살상을 나타내는 바이러스 그룹은 Rb-결합 변이를 갖는 E1A 및 E4orf6/7의 결실을 갖는 E1A 두 가지 모두를 갖고 있다. 더 많은 살상을 나타내는 바이러스 그룹은 야생형 E1 또는 야생형 E4 중 어느 하나를 갖고 있다.
도 18은 감염된 휴지기 SAEC-hTERT 세포의 감염 9일 후 세포 생존능을 보여주는 그래프이다. 세포는 야생형 및 변이체 바이러스의 연속 희석으로 감염시켰다(하기 표 1 참조). 대사 활성은 WST-1 시험(Roche, Basel, Switzerland)에 의해 정량하였다. 세포마다 3개 및 10개 감염성 입자에서의 세포 생존능은 바이러스에 의한 세포 살상을 2개 그룹인 더 적은 살상 및 더 많은 살상의 구분을 보여 준다. 더 적은 살상을 나타내는 바이러스 그룹은 Rb-결합 변이를 갖는 E1A 및 E4orf6/7의 결실을 갖는 E1A 두 가지 모두를 갖고 있다. 더 많은 살상을 나타내는 바이러스 그룹은 야생형 E1 또는 야생형 E4 중 어느 하나를 갖고 있다.
도 19는 감염된 증식성 SAEC-hTERT 세포의 감염 9일 후 세포의 생존능을 보여주는 그래프이다. 세포는 야생형 및 변이체 바이러스의 연속 희석으로 감염시켰다(하기 표 1 참조). 대사 활성은 WST-1 시험(Roche, Basel, Switzerland)에 의해 정량하였다. 세포마다 3개 및 10개 감염성 입자에서의 세포 생존능은 바이러스에 의한 세포 살상을 2개 그룹인 더 적은 살상 및 더 많은 살상의 구분을 보여 준다. 더 적은 살상을 나타내는 바이러스 그룹은 Rb-결합 변이를 갖는 E1A 및 E4orf6/7의 결실을 갖는 E1A 두 가지 모두를 갖고 있다. 더 많은 살상을 나타내는 바이러스 그룹은 야생형 E1 또는 야생형 E4 중 어느 하나를 갖고 있다.
도 20은 감염된 A549 세포의 감염 7일 후 세포 생존능을 보여주는 그래프이다. 세포는 야생형 및 변이체 바이러스의 연속 희석으로 감염시켰다(하기 표 1 참조). 대사 활성은 WST-1 시험(Roche, Basel, Switzerland)에 의해 정량하였다.
도 21은 감염된 인간 유방암 세포(MDA MB 231)의 감염 7일 후 세포 생존능을 보여주는 그래프이다. 세포는 야생형 및 변이체 바이러스의 연속 희석으로 감염시켰다(하기 표 1 참조). 대사 활성은 WST-1 시험(Roche, Basel, Switzerland)에 의해 정량하였다.
도 22는 감염된 신경교아종 세포(U87)의 감염 7일 후 세포 생존능을 보여주는 그래프이다. 세포는 야생형 및 변이체 바이러스의 연속 희석으로 감염시켰다(하기 표 1 참조). 대사 활성은 WST-1 시험(Roche, Basel, Switzerland)에 의해 정량하였다.
도 23은 도 17 내지 22에 나타낸 감염된 1차 NHA, SAEC-hTERT (휴지기), SAEC-hTERT (증식성), A549, MDA MB 231, 및 U87에 대한 세포 생존능 시험의 정량을 보여주는 표이다.
도 24는 AdSyn-CO182 및 AdSyn-CO183로 감염시킨 293 세포의 CPE 현미경 이미지이다. AdSyn-CO182 및 AdSyn-CO183 두 가지 모두는 E1A LXCXE 및 E4orf6/7 변이를 포함하고, 부가적으로 E3-12.5K orf 내 삽입을 포함한다. AdSyn-CO182에서, E3-12.5K ORF는 형과 단백질 mCherry를 암호화하는 서열로 대체하였다. AdSyn-CO183에서, the E3-12.5K ORF는 비-절개성 FasL을 암호화하는 서열로 대체하였고, 이는 세포자살에 대한 신호이다.
Rb/p16/E2F 경로는 거의 모든 인간 암 내에서 변이 또는 예를 들어 바이러스 메카니즘 같은 다른 메카니즘에 의해 비활성화되었다. 예를 들면, 경로는 Rb 내 변이, p107 변이, p130 변이, p16 변이/후생적 침묵변이, 사이클린 변이 및 증폭, CDK 변이 및 증폭, 사이클린 의존성 키나아제 저해제를 감소조절하는 변이들, E2F 전사 인자 및 성장 인자 수용체 경로 변이들(EGFR, RTKs, RAS, PI-3K, PTEN, RAF, MYC)를 상향조절하는 변이들을 통해 비활성화될 수 있다. 하지만, 대부분의 현재 화학요법들은 E2F 전사 표적들을 저해하는 증식성 독소들이지만, 정상 세포에 대해서도 독성이 있고, 종종 의원성 합병증을 공격하기도 한다. 종양 변이체들 및 작은 DNA 바이러스 단백질들은 모여서 Rb를 비활성화시킨다. 아데노바이러스 E1A에 관한 연구들은 Rb 및 E2F에 대한 중대한 견해를 제공하였다. 종양살상형 아데노바이러스에 대한 본래의 개념은 E1AΔLXCXE 변이체이지만 제재는 최소한 1차 세포 배양 내에서는 선택적이지 않다. E1A는 Rb에 결합하고 보존된(CR2) LXCXE 모티프에 의해 Rb를 비활성화시키는데(문헌 Whyte, et al., Nature 334(6178):124-9 (1988) 참조), 이는 E2F 의존성 전사를 활성화시킨다(문헌 Kovesdi et al., PNAS 84(8):2180-4 (1987) 참조). 이는 E1A가 E2F를 활성화시키면 세포 내 게놈 및 바이러스 게놈 복제에 필요한 세포 유전자 및 바이러스 유전자의 발현을 유발하는 메카니즘을 통한 것으로 판단되었다. 따라서, 아데노바이러스 E1AΔCR2 변이체가 Rb/p16 종양 억제 경로 내 변이를 갖는 종양 세포 내에서 선택적으로 복제될 것이라고 제안되었다(문헌 Heise et al., Nat . Med . 6(10):1134-9 (2000) 참조). 하지만, 놀랍게도, E1AΔCR2 바이러스 변이체는 E2F를 활성화시켜서 1차 인간 상피 세포 내에서 복제되었다(문헌 Johnson et al., Cancer Cell 1(4):325-337 (2002) 참조). 본원에 기재된 바와 같이, 아데노바이러스는 E1A와는 별개로 E2F를 활성화시키는 부가적인 바이러스 단백질인 E4orf6//7을 암호화한다는 것이 발견되었다. 기존의 연구들은 바이러스 E2 프로모터의 전사를 활성화시키기 위해 E4orf6/7이 E2F 및 DP1에 결합한다는 것을 보여 주었다(Helin and Harlow, J. Virol . 68(8):5027-5035 (1994) 참조). E1A CR2 변이체가 여전히 E2F를 활성화시켜서 1차 세포 내에서 복제한다는 것을 고려하면, E4orf6/7이 E1A와는 별개로 S-기 진입 및 바이러스 복제를 유발하기 위해 E2F 의존성 세포내 표적을 활성화시킨다고 예측되었다. 따라서, 정상 세포 대비 종양 세포 내 선택적으로 복제하는 바이러스를 디자인하기 위해, 아데노바이러스는 E1A 및 E4orf6/7 모두에서 변이를 갖도록 디자인되었다. 따라서, 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, E1AΔCR2 및/또는 ΔE4orf6/7 화합물 변이를 갖는 신규 바이러스가 정상 세포 대비 암 세포 내 선택적인 용균성 복제를 진행하는지의 여부를 시험하였다. 야생형 바이러스 및 E1AΔCR2 바이러스와는 대조적으로, 캡시드 단백질 발현의 결핍, E2F 표적 유전자-사이클린 A 및 B의 유도 실패, S 기 진입 유발 및 바이러스 복제에 대한 실패에 의해 입증된 것처럼 E1AΔCR2/ΔE4orf6/7 바이러스 및 ΔE4orf6/7 바이러스 또한 1차 세포 내에서 복제가 잘 되지 않았다. 반대로, 이러한 바이러스들은 A549 세포 및 일련의 종양 세포주들 내에서 야생형(WT) 바이러스 수준으로 복제되었다. 따라서, 선택적인 암 치료용 제제인 아데노바이러스가 제공되었다.
본원에서 신규한 Rb/p16/E1F 종양 선택적인 종양살상형 바이러스 치료를 제공하였다. 이러한 바이러스들은 자가-투과적이고, 조절된 세포 죽음을 통해 종양 세포를 살상하며, 종양 내에서 뿐만 아니라 전이되는 부위까지 널리 퍼질 수 있는 자손을 생산할 수 있는 잠재력을 갖추고 있다.
정의
본원에 기재된 용어 "아데노바이러스"는 인간으로부터 분리된 52가지 이상의 아데노바이러스 서브타입, 다른 포유동물 및 조류로부터 유래된 많은 서브타입에 관한 것이다(문헌 Strauss, "Adenovirus infections in humans," in The Adenoviruses, Ginsberg, ed., Plenum Press, New York, N.Y., pp. 451 596 (1984) 참조). 용어 "아데노바이러스"는 본원에서 예를 들어 약어 "Ad" 이후에 Ad45 같이 혈청형을 지칭하는 숫자와 같이 사용할 수 있다. 용어는 선택적으로 2 가지 인간 혈청형 Ad2 및 Ad5에 선택적으로 적용하였다. 이러한 아데노바이러스들의 예시적인 핵산 서열은 인간 아데노바이러스 5(서열번호 7) 및 인간 아데노바이러스 2(서열번호 8)을 포함하는데, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "E1A"는 아데노바이러스 초기 영역 1A (E1A) 유전자 및 이 유전자로부터 발현된 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "E1A 폴리펩티드"는 E1A 유전자로부터 발현된 폴리펩티드를 의미하고, 그 용어는 아데노바이러스 혈청형들 중 어느 하나에 의해 생산된 E1A 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, E1A 폴리펩티드의 아미노산 서열은 적어도 유전자은행(GenBank) 접속 번호 CAE01147.1, AP_000161.1(서열번호 1) 및 AP_000197.1(서열번호 2)에서 확인할 수 있다. 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산들은 적어도 유전자은행 접속 번호 AC_000008.1(서열번호 7) 및 AC_000007.1(서열번호 8)에서 확인할 수 있다. 또한 서열번호 1 또는 서열번호 2에 대하여 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 E1A 폴리펩티드가 제공된다. E1A 폴리펩티드는 세포를 세포 주기로 유도시킴으로써 바이러스 게놈 복제에서의 역할을 갖추고 있다. 다양한 인간 및 유인원 아데노바이러스 혈청형들의 E1A 서열의 비교는 3가지 영역의 보존된 아미노산 서열 상동성을 확인하였다. Ad5 내에서, 보존된 영역 1(CR1)은 서열번호 2와 비교하여 아미노산 잔기 40-80 사이에서, CR2는 서열번호 2와 비교하여 아미노산 잔기 121-139 사이에서, CR3는 서열번호 2와 비교하여 잔기 140-188 사이에서 맵핑된다.
용어 "E4orf1"은 E4 유전자로부터 생산된 아데노바이러스 E4orf1 폴리펩티드를 지칭하며, 이는 아데노바이러스의 몇몇 개방형 판독틀을 포함한다. 예를 들면, E4orf1 폴리펩티드들의 아미노산 서열은 적어도 유전자은행 접속 번호 AP_000196.1(서열번호 5) 및 AP_000232.1(서열번호 6)에서 확인할 수 있다. 이러한 폴리펩티드들을 암호화하는 핵산들은 적어도 유전자은행 접속번호 AC_000008.1 (서열번호 7) 및 AC_000007.1(서열번호 8)에서 확인할 수 있다. 또한 서열번호 5 또는 서열번호 6에 대하여 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 E4orf1 폴리펩티드가 제공된다.
용어 "E4orf6/7"은 E4 유전자로부터 생산된 아데노바이러스 E4orf6/7 폴리펩티드를 지칭하며, 아데노바이러스의 몇몇 개방형 판독틀을 포함하고 있다. 용어 "E4orf6/7"은 아데노바이러스 혈청형 중 어느 하나로부터의 E4 유전자에 의해 생산된 E4orf6/7 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, E4orf6/7 폴리펩티드의 아미노산 서열들은 적어도 유전자은행 접속 번호 AP_000191.1(서열번호 3) 및 AP_000227.1(서열번호 4)에서 확인할 수 있다. 이러한 폴리펩티드들을 암호화하는 핵산들은 적어도 유전자은행 접속번호 AC_000008.1(서열번호 7) 및 AC_000007.1(서열번호 8)에서 확인할 수 있다. 또한 서열번호 3 또는 서열번호 4에 대하여 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 E4orf6/7 폴리펩티드가 제공된다.
"핵산"은 단일- 또는 이중-나선 형태 및 이의 보체들 내 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드에 관한 것이다. 그 용어는 알려진 뉴클레오티드 유사체들 또는 변형된 백본 잔기들 또는 연결들로 구성된 핵산들을 포함하는데, 상기 핵산들은 합성, 자연 발생적, 및 비-자연적으로 발생한 것이고, 참고 핵산과 같은 유사한 결합 특성을 갖추고, 참고 뉴클레오티드들과 유사한 방식으로 대사작용을 하였다. 그러한 유사체들의 예시들은 포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)를 포함하고, 이에 제한되지는 않는다.
달리 언급된 바가 없다면, 특별한 핵산 서열들은 또한 명시적으로 언급된 서열 뿐만 아니라 핵산의 보존적으로 변이된 변이체들(예를 들어 퇴화된 코돈 치환) 및 상보적인 서열을 명백하게 포함하였다. 바람직하게는, 퇴화 코돈 치환들은 하나 이상(또는 전체)의 선택된 코돈 내 3번째 위치가 혼합-염기 및/또는 디옥시이노신 잔기들이 치환된 형태로 서열을 제조함으로서 획득할 수 있다(문헌 Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol . Chem . 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol . Cell . Probes 8:91-98 (1994) 참조). 용어 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 올릭뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드에 대하여 상호교환하여 사용하였다.
특별한 핵산 서열은 또한 명백하게 "스플라이스 변이체들"을 포함하였다. 유사하게, 핵산에 의해 암호화된 특별한 단백질은 상기 핵산의 스플라이스 변이체에 의해 암호화된 모든 단백질을 포함하였다. "스플라이스 변이체들"은 명칭이 제안하는 바와 같이 유전자의 선택적 스플라이싱의 생성물이다. 전사 후에, 초기 핵산 전사체는 다른(선택적) 핵산 스플라이스 생성물이 다른 폴리펩티드들을 암호화하도록 스플라이싱될 수 있다. 스플라이스 변이체의 생산에 대한 메카니즘은 다양하지만, 엑손의 선택적 스플라이스를 포함하였다. 연속판독(read-through) 전사에 의해 같은 핵산으로부터 유래된 선택적 폴리펩티드들 또한 이러한 정의에 포함하였다. 스플라이스 생성물의 재조합 형태들을 포함하는 스플라이싱 반응의 어떠한 생성물들이라도 이러한 정의에 포함하였다. 칼륨 채널 스플라이스 변이체들의 예시는 참고문헌(Leicher, et al., J. Biol . Chem . 273(52):35095-35101 (1998)) 내에서 논의되었다.
핵산이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계가 되도록 배치되었을 때 핵산은 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체단백질로서 발현된다면 전구서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드에 대한 DNA에 대하여 작동가능하게 연결된다; 프로모터 또는 증강인자가 서열의 전사에 영향을 준다면 프로모터 또는 증강인자는 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 촉진하도록 배치된다면 리보솜 결합 부위는 암호화 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 서로 근처에 있고, 분비 리더의 경우는 연속적이며 해독 단계에 있는 것을 의미하였다. 하지만, 증강인자들은 연속성을 갖지 않는다. 연결은 유용한 절단 부위에서의 결합에 의해 성취되었다. 그러한 부위들이 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 연결자를 통상적인 실시에 부합하도록 사용하였다.
2 또는 그 이상의 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열 내 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 하기에 기재된 디폴트 매개변수를 갖는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘, 또는 수동 정렬 및 시각 조사(예를 들어, NCBI 웹 사이트 또는 유사 사이트 참조)를 사용하여 측정한 바에 따라 같거나, 또는 같은 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 퍼센트(예를 들어, 비교창 또는 지정된 영역에 대한 최대 상응에 대하여 비교 정렬하였을 때 약 60% 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 동일성)인 2 또는 그 이상의 서열 또는 부분서열에 관한 것이다. 그러면 그러한 서열은 "실질적으로 동일하다"고 언급하였다. 이러한 정의는 또한 시험 서열의 컴플리먼트에 관한 것이거나 컴플리먼트에 적용할 수 있다. 이러한 정의는 또한 치환된 서열뿐만 아니라 결실 및/또는 추가된 서열을 포함하였다. 하기에 기재된 바와 같이, 바람직한 알고리즘은 차이점 및 유사함에 대하여 설명할 수 있다. 바람직하게는 25개 길이의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 대해서만 동일서이 존재하거나, 보다 바람직하게는 50-100개 길이의 아미노산 또는 뉴클레오티드 영역에 대하여 동일성이 존재하였다.
서열 비교에 있어서, 시험 서열 비교에 대하여 전형적으로 하나의 서열은 참고 서열 역할을 하였다. 서열비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참고 서열은 컴퓨터 내로 입력하였고, 필요하다면 서열 조정을 지정하였고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정하였다. 바람직하게는, 디폴트 프로그램 매개변수를 사용할 수 있거나, 선택적 매개변수들을 지정할 수 있다. 그러면 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수들에 기반하여 참고 서열과 비교한 시험 서열에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산하였다.
본원에서 사용한 바와 같이 "비교창(comparison window)"은 2개 서열을 최적화 배열한 후에 하나의 서열이 동일한 숫자의 연속 위치의 참고 서열과 비교할 수 있는 20 내지 600으로 구성된 그룹, 통상적으로 50 내지 200, 보다 통상적으로는 100 내지 150으로 구성된 그룹으로부터 선택된 연속 위치 숫자 중 어느 하나인 단편에 대한 참고를 포함하였다. 비교를 위한 서열 정렬 방법들은 당 업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 배열은 예를 들어 국지적 상동성 알고리즘(Smith & Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482 (1981)), 상동성 배열 알로기즘(Needleman & Wunsch, J. Mol . Biol . 48:443 (1970)), 유사성 조사 방법(Pearson & Lipman, Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 85:2444 (1988)), 이러한 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(575 Science Dr., Madison, WI 유전학 컴퓨터 그룹, 위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지 내 GAP, BESTFIT, FASTS 및 TFSTA), 또는 수동 정렬 및 시각 조사(Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement) 참조)에 의해 실행할 수 있다.
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 측정하기에 적합한 알고리즘의 바람직한 예는 블라스트(BLAST) 및 블라스트 2.O 알고리즘이고, 이는 참고문헌(Nuc . Acids Res . 25:3389-3402 (1977) 및 Altschul et al ., J. Mol . Biol. 215:403-410 (1990))에 각각 기재되어 있다. 블라스트 및 블라스트 2.0은 본원에 기재된 매개변수들과 같이 핵산 및 단백질에 대한 퍼센트 서열 동일성에 측정에 사용하였다. 블라스트 분석을 위한 소프트웨어는 당 업계에 알려진 바이오테크놀로지 정보에 대한 국가 센터를 통해 공개적인 사용이 가능하였다. 이러한 알고리즘은 의문 서열 내 길이 W의 짧은 단어 확인에 의해 1차적으로 높은 수치의 서열 쌍(HSP) 확인을 포함하는데, 이는 데이터베이스 서열 내 같은 길이 단어와 정렬시 일부 양성-수치 역치 스코어 T와 일치하거나 충족하였다. T는 이웃한 단어 스코어 역치에 관한 것이다(Altschul et al ., supra 참조). 이러한 초기의 이웃 단어 히트는 이를 포함하는 더 긴 HSP를 찾는 검색의 개시를 위한 시드 역할을 하였다. 단어 히트는 누적되는 정렬 수치가 증가될 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양 방향으로 확장하였다. 누적 수치는 뉴클레오티드 서열에 대하여 매개변수 M(한 쌍의 일치하는 잔기에 대한 보상 수치; 항상 > 0 ) 및 N(불일치 잔기에 EOGS 벌칙 수치; 항상 < 0 )을 사용하여 계산하였다. 아미노산 서열에 대하여, 수치 매트릭스는 누적 수치 계산에 사용하였다. 각각의 방향에서의 단어 히트의 확장은 하기의 경우에 중지하였다: 누적 정렬 수치가 자체의 최대 획득 수치로부터 정량 X에 의해 벗어나는 경우; 하나 이상의 음성-수치 잔기 정렬의 누적에 의해, 누적 수치가 0 또는 그 이하로 향하는 경우; 또는 각각 서열의 말단에 도달하는 경우. 블라스트 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 민감도 및 속도를 결정하였다. BLASTN 프로그램(핵산 서열에 대한)은 디폴트로서 11의 단어길이(W), 10의 예측(E), M=5, N=-4 및 양 가닥의 비교를 사용하였다. 아미노산 서열에 대하여, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어길이, 10의 예측(E), 및 50의 BLOSUM62 수치화 매트릭스(Henikoff & Henikoff, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 89:10915 (1989) 참조) 정렬(B), 10의 예측(E), M=5, N=-4, 및 양 가닥의 비교를 사용하였다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 아미노산 잔기들의 중합체에 관한 것으로 상호교환하여 사용하였다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연적으로 발생하는 아미노산 중합체 뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생적 아미노산의 인공 화학 모방체인 아미노산 중합체에 적용하였다.
용어 "아미노산"은 자연 발생적인 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체 뿐만 아니라 자연 발생적 아미노산 및 합성 아미노산에 관한 것이다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 차후에 변이된, 예를 들어 하이드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린 같은 아미노산 뿐만 아니라 유전자 코드에 의해 암호화된 아미노산이다. 아미노산 유사체는 예를 들어, 수소, 카르복실 그룹, 아미노 그룹 및 R 그룹에 결합한 알파 탄소, 예를 들어 호모세린, 노르로이신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포니움 같이 자연 발생적인 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물에 관한 것이다. 그러한 유사체는 변이된 R 그룹(예를 들어, 노르로이신) 또는 변이된 펩티드 백본을 포함하였지만, 자연 발생적인 아미노산과 같은 동일한 기본 화학 구조를 유지하였다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와는 다르지만 자연 발생적인 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물에 관한 것이다.
아미노산은 본원에서 IUPAC 생화학 명명법 위원회에 의해 추천받는 아미노산의 통상적으로 알려진 3 글자 부호 또는 1-글자 부호에 의해 표시할 수 있다. 뉴클레오티드는 이와 달리 이의 통상적으로 허용되는 단일-글자 코드에 의해서 표시할 수 있다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 서열 및 핵산 서열에 모두 적용하였다. 특별한 핵산 서열에 관하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산, 또는 핵산이 본질적으로 동일한 서열에 대한 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우의 핵산에 관한 것이다. 유전자 코드의 퇴화성 때문에, 다수의 기능적으로 동일한 핵산은 주어진 단백질을 암호화하였다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화하였다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특성화되는 모든 위치에서, 코돈은 암호화된 폴리펩티드를 변형시키지 않는 상응하는 코돈으로 변형할 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "침묵 변이"이고, 이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종류이다. 본원에서 폴리펩티드를 암호화하는 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 설명하고 있다. 숙련된 이들은 핵산 내 각각의 코돈(메티오닌에 대한 일반적으로 유일한 코돈인 AUG 및 트립토판에 대한 일반적으로 유일한 코돈인 TGG 제외)이 변이되어 기능적으로 동일한 분자를 생산한다는 것을 인식할 것이다. 이에 따라, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 대한 각각의 침묵 변이는 발현 생성물에 관한 각각의 기재된 서열 내에서는 잠재적이지만 실제 탐침 서열에 관해서는 잠재적이지 않다.
아미노산 서열에 관하여, 숙련된 이들은 암호화된 서열 내 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변형, 추가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 추가는 상기 변형이 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 "보존적으로 변형된 변이"라는 것을 인식할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 테이블은 당 업계에 잘 알려져 있다. 그러한 보존적으로 변형된 변이체들은 다형성 변이체, 종간 유사체 및 대립형질에 부가적이며 이를 배제하지는 않는다.
하기의 8 그룹은 각각 서로에 대하여 보존적 치환인 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌(A), 글라이신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S); 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예컨대, Creighton, Proteins (1984) 참조).
예컨대 세포, 바이러스, 핵산, 단백질 또는 벡터에 대하여 참조와 함께 사용시 용어 "재조합"은 세포, 바이러스, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이질적인 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변형에 의해 변이되거나, 또는 하나의 세포에서 유래된 세포가 변이되는 것을 나타내었다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 천연(비-재조합) 형태의 세포 내에서 발견되지 않는 유전자 또는 비정상적으로 발현되는 유전자를 발현하거나, 발현되는 또는 전혀 발현되지 않는 상황의 자연적인 유전자를 발현하였다.
관용구 "엄격한 혼성화 조건"은 탐침이 전형적으로 핵산의 복합한 혼합물 내에서 다른 서열이 아닌 자체의 표적 서열에 혼성화하는 조건에 관한 것이다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고 다른 환경에서 달라질 것이다. 더 긴 서열은 더 높은 온도에서 특이적으로 혼성화하였다. 핵산의 혼성화에 대한 확장된 안내는 참고문헌(Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)) 내에서 확인하였다. 일반적으로, 엄격한 조건은 확정된 이온 강도 pH에서 특이적 서열에 대한 열적 녹는 점(Tm)보다 약 5-10℃ 정도 낮게 선택되었다. Tm은 표적에 대하여 상보적인 탐침의 50%가 표적 서열에 평형(표적 서열이 과량으로 존재함에 따라, Tm에서 탐침의 50%가 평형상태에 사용됨)에서 혼성화하는 온도(확정된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도 하에서)이다. 엄격한 조건은 또한 포름아마이드 같은 불안정화 제제의 추가에 의해 성취할 수도 있다. 선택적이거나 특이적인 혼성화에 대하여, 양성 신호는 최소한 2회 배경이고, 바람직하게는 10회 배경 혼성화이다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 하기와 같을 수 있다: 50% 포름아마이드, 5x SSC 및 1% SDS, 42℃에서 배양, 또는 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서 배양, 65℃에서 0.2x SSC 및 0.1% SDS 내 세척.
핵산이 암호화하는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다면 엄격한 조건에서 서로 혼성화되지 않는 핵산은 여전히 충분하게 동일하였다. 예를 들어, 이러한 상황은 핵산의 일 복제본이 유전적 코드에 의해 허용되는 최대의 코돈 퇴화를 사용하여 제조되는 경우에 발생하였다. 그러한 경우에, 핵산은 전형적으로 적당히 엄격한 혼성화 조건에서 혼성화하였다. 예시적인 "적당히 엄격한 혼성화 조건"은 37℃에서 40% 포름아마이드, 1M 염화나트륨, 1% SDS를 포함하는 완충액 내 혼성화 및 45℃에서 1X SSC 내 세척을 포함하였다. 양성 혼성화는 최소한 2회의 배경이다. 보통의 숙련된 이들은 선택적인 혼성화 및 세척 조건을 사용하여 유사한 엄격한 조건을 제공할 수 있다는 것을 즉시 인식할 것이다. 혼성화 매개변수를 결정하는 추가적인 지침은 다수의 참고문헌(예컨대, Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al ., John Wiley & Sons 참조)에서 제공하였다.
PCR에 있어서, 어닐링 온도가 프라이머 길이에 따라 약 32℃에서 48℃까지 다양할 지라도 약 36℃의 온도는 낮은 엄격성의 증폭에 대하여 일반적이다. 높은 엄격성의 PCR 증폭에 대하여, 높은 엄격성의 어닐링 온도가 프라이머 길이 및 특이성에 따라 약 50℃에서 약 65℃까지 다양할 수 있을지라도 약 62℃의 온도가 일반적이다. 높은 엄격성 증폭 및 낮은 엄격성 증폭 모두에 대한 일반적인 사이클 조건은 30초 내지 2분간 90℃ 내지 95℃의 변성 단계, 30초 내지 2분간 지속되는 어닐링 단계, 및 1 내지 2분간 약 72℃의 연장 단계를 포함하였다. 낮은 엄격성 및 높은 엄격성 증폭에 대한 프로토콜 및 지침은 참고문헌(예컨대, Innis et al. (1990) PCR Protocols , A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y. 참조)에서 제공하였다.
용어 "재조합"은 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터에 대한 참조와 같이 사용시에 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 실험적 방법에 의해 변이된 것 또는 실험적 방법의 결과를 나타내는 것이다. 따라서, 예를 들어, 재조합 단백질은 실험적 방법에 의해 생산된 단백질을 포함하였다. 재조합 단백질은 천연(재조합이 아닌) 형태의 단백질 내에서 찾을 수 없는 아미노산 잔기를 포함할 수 있고 또는 변이된(예컨대, 표지된) 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
용어 "이질적인(heterologous))"은 핵산의 일부분에 대한 참조와 사용시 핵산이 사실상 서로 간에 동일한 관계 내에서 찾을 수 없는 둘 또는 그 이상의 하부서열을 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 핵산은 전형적으로 재조합으로 생산되는데, 상기 핵산은 예를 들어 하나의 소스로부터의 프로모터 및 다른 소스로부터의 암호화 영역 같은 신규한 기능적 핵산을 제조하기 위해 배열된 관련이 없는 유전자들로부터의 둘 또는 그 이상의 서열을 포함하고 있다. 유사하게, 이질적인 단백질은 단백질이 사실상 서로에 대해 동일한 관계 내에서 찾을 수 없는(예를 들어, 융합 단백질) 둘 또는 그 이상의 하부서열을 포함하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형(modification)"은 핵산 서열 또는 폴리펩티드 서열의 서열 내 변이에 관한 것이다. 예를 들어, 아미노산 서열 변형은 전형적으로 세 가지 클래스(치환, 삽입 또는 결실 변이체) 중 하나 이상에 속한다. 삽입은 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열 내 삽입 뿐만 아니라 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합을 포함한다. 결실은 단백질 서열로부터 하나 이상이 아미노산 잔기의 제거가 특징이다. 본원에 사용된 바와 같이, 부호 Δ 또는 델타는 결실에 관한 것이다. 예를 들어, E1AΔLXCXE는 LXCXE 도메인의 결실을 포함하는 E1A 폴리펩티드에 관한 것이다. 치환 변이는 최소한 하나의 잔기가 제거되고 다른 잔기가 제거된 위치에 삽입되는 것이다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기에 관한 것이지만, 한 번에 다수의 다른 위치에서 발생할 수도 있다. 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 어떠한 조합은 최종 구조물에 도달하도록 조합할 수 있다. 이러한 변이들은 단백질을 암호화하는 DNA 내 뉴클레오티드의 변이에 의해 변이를 암호화하는 DNA를 생산함으로써 실시할 수 있다. 알려진 서열을 갖는 DNA 내 결정된 위치에서의 삽입, 결실 및 치환 변이를 만드는 기술은 잘 알려져 있다. 변이 기술은 하나 이상의 폴리펩티드 영역을 암호화하는 DNA 서열을 조작하는 DNA 기술의 사용을 포함할 수 있다. 선택적으로, 변이 기술은 예를 들어, 재조합, M13 프라이머 변이생성 및 PCR 변이생성을 포함하였다.
용어 "형질감염" "형질도입" "형질감염하는" 또는 "형질도입하는"은 상호교환적으로 사용할 수 있고 핵산 분자 또는 단백질을 세포 내로 도입하는 과정으로 정의할 수 있다. 핵산은 비-바이러스 또는 바이러스-기반 방법을 사용하여 세포 내로 도입하였다. 핵산 분자는 완전한 단백질을 암호화하는 서열 또는 단백질의 기능적 부분을 암호화하는 서열일 수도 있다. 전형적으로, 핵산 벡터는 단백질 발현에 대하여 필요한 요소(예를 들어, 프로모터, 전사 개시 부위, 등)를 포함하고 있다. 형질전환의 비-바이러스 방법은 세포 내로 핵산 분자를 도입하는 전달 시스템으로서 바이러스 DNA 또는 바이러스 입자를 사용하지 않는 어떤 적절한 방법을 포함하였다. 예시적인 비-바이러스 형질감염 방법은 칼슘 인산염 형질감염, 리포좀 형질감염, 뉴클레오펙션(necleofection), 소노포레이션(sonoporation), 열 쇼크를 통한 형질감염, 마그네티펙션(magnetifection) 및 전기천공법을 포함하였다. 바이러스-기반 방법에 대하여, 어떤 유용한 바이러스 벡터를 본원에 기재된 방법에 사용할 수 있다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-연관 바이러스 벡터를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 일부 측면에서, 당 업계에 잘 알려진 표준 순서를 따라 아데노바이러스 벡터를 사용하여 핵산 분자는 세포 내로 도입하였다. 용어 "형질감염" 또는 "형질도입"은 또한 외부 환경으로부터 세포 내로의 단백질 도입에 관한 것이다. 전형적으로, 단백질의 형질도입 또는 형질감염은 세포 막의 관심 있는 단백질에 대한 교차가 가능한 펩티드 또는 단백질의 부착에 의존하였다(Ford et al. (2001) Gene Therapy 8:1-4 and Prochiantz (2007) Nat. Methods 4:119-20 참조).
용어 "대조군" 또는 "표준 대조군"은 시험 시료, 측정 또는 수치에 대한 비교로써, 참조의, 일반적으로 알려진 참조의 역할을 하는 시료, 측정, 또는 수치를 나타낸 것이다. 예를 들어, 시험 시료는 주어진 질병(예를 들어, 자가면역 질환, 감염성 자가면역 질환, 암, 감염성 질환, 면역 질환, 또는 다른 질환)을 갖는 것으로 예측되는 환자로부터 획득할 수 있고 알려진 정상(질병이 없는) 개인(예를 들어, 표준 대조군 피험체)와 비교할 수 있다. 표준 대조군은 또한 주어진 질병(다시 말하면 표준 대조군 구성원)을 갖지 않는, 예를 들어 유사한 의료 배경, 같은 나이, 체중 등을 갖는 건강한 개체인 유사한 개체들의 구성원(예컨대 표준 대조군 피험체)으로부터 모은 평균 측정 또는 수치를 나타낼 수 있다. 표준 대조군 수치는 또한 같은 개체로부터, 예를 들어 질병의 발병 이전에 환자로부터 더 일찍-획득한 시료로부터 획득할 수도 있다. 숙련된 이들은 다수의 매개 변수들(예컨대, RNA 수준, 단백질 수준, 특이적인 세포 형태, 특이적인 체내 유체들, 특이적인 조직, 활막세포, 활막유체, 활막 조직, 섬유아세포-유사 활막세포, 대식세포와 유사한 활막세포 등)의 측정에 대하여 표준 대조군을 계획할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
당 업계의 숙련된 이는 표준 대조군이 주어진 상황에서 가장 적절하고 표준 대조군 수치에 대한 비교에 근거한 자료를 분석할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 표준 대조군은 또한 자료의 유의성(예를 들어 통계적 유의성)을 결정하는데 가치가 있다. 예를 들어, 주어진 매개변수에 대한 수치가 표준 대조군 내 폭넓게 다양하다면, 시험 시료 내 다양성은 유의하게 고려하지 않을 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증식성 장애(proliferative disorder)"는 세포가 정상적인 조직 성장에 비해 보다 빠르게 증식하는 어떤 세포성 장애를 의미한다. 증식성 장애는 암을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암"은 백혈병, 암종(carcinoma) 및 육종(sarcoma)을 포함하고 포유동물 내 발견되는 모든 종류의 암, 신생물(neoplasm) 또는 악성 종양을 의미한다. 예시적인 암은 뇌, 유방, 자궁경부, 대장, 두경부, 간, 신장, 폐, 비소세포 폐, 흑색종, 중피종, 난소, 육종, 위, 자궁 및 수포세포종의 암을 포함한다. 부가적인 예는 호지킨 병, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 난소암, 횡문근육종, 1차 혈소판증가증, 1차 마크로글로불린혈증, 1차 뇌 종양, 암, 악성 췌장 인슐라노마, 악성암양종, 방광암, 전암 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경아세포종, 식도암, 비뇨생식관 암, 악성 고칼슘혈증, 자궁내막암, 부신피질 암, 내분비 및 외분비 췌장의 신생물, 전립선 암을 포함한다.
용어 "백혈병"은 넓은 의미로 혈액-형성 장기의 진행형인 악성 질환에 관한 것이고 일반적으로 왜곡된 증식, 백혈구 및 혈액과 골수 내 이의 전구체의 발달이 특징이다. 백혈병은 일반적으로 1) 질환-급성 또는 만성 기간 및 특성; 2) 관련된 세포의 형태; 골수성(골수에서 생긴), 림프성(림프에서 생긴), 또는 단핵성; 및 3) 혈액-백혈병성 또는 비백혈병성(아백혈병성) 내 비정상 세포 수의 증가 또는 비-증가를 기초로 임상적으로 분류되었다. P355 백혈병 모델은 생체 내(in vivo) 항-백혈병 활성의 예측으로서 널리 받아들여지고 있다. P355 시험 내 양성인 화합물은 일반적으로 처리된 백혈병의 형태에 관계 없이 생체 내 일정 수준의 항-백혈병 활성을 나타낸다고 믿고 있다. 따라서, 본 출원은 백혈병을 치료하는 방법, 및 바람직하게는 급성 비림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 급성 과립성 백혈병, 만성 과립성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 성인 T-세포 백혈병, 비백혈병성 백혈병, 류코시데믹(leukocythemic) 백혈병, 호염기성 백혈병, 아세포(blast cell) 백혈병, 소과의(bovine) 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 백혈병 진피, 배아 백혈병, 호산성 백혈병, 그로스(Gross') 백혈병, 모발세포 백혈병, 조혈세포 백혈병, 혈구모세포 백혈병, 림프형성 백혈병, 림프성 백혈병, 림프육종 세포 백혈병, 비만 세포 백혈병, 거핵구 백혈병, 작은골수모세포 백혈병, 단핵세포 백혈병, 골수아세포성 백혈병, 골수성 백혈병, 골수성 과립구 백혈병, 골수단구성 백혈병, 내겔리(Naegeli) 백혈병, 원형질 세포 백혈병, 다발성 골수종, 형질세포 백혈병, 전골수성 백혈병, 리더세포 백혈병, 실링(Schilling's) 백혈병, 줄기세포 백혈병, 무백혈성 백혈병, 및 미분화세포 백혈병을 치료하는 방법을 포함하였다.
용어 "육종"은 일반적으로 배아 연결 조직과 유사한 물질로 이루어진 종양에 관한 것으로 일반적으로 미소섬유 물질 또는 균질 물질 내 매립되어 단단히 묶인 세포로 구성되어 있다. 항-신생 티올-결합 미토콘드리아 산화제 및 항암제의 조합으로 치료할 수 있는 육종은 연골육종, 섬유육종, 림프육종, 흑색육종, 점액육종, 골육종, 아베메시(Abemethy's) 육종, 지방세포 육종, 지방육종, 포상 연부 육종, 사기질모세포 육종, 포도상 육종, 녹색종 육종, 융모막 육종, 배아 육종, 빌름스종양(Wilms' tumor) 육종, 자궁 내막 육종, 기질 육종, 유윙(Ewing) 육종, 근막 육종, 섬유모세포 육종, 거대세포 육종, 과립세포성 육종, 호지킨 육종, 특발성 복합 색소 출혈성 육종, B 세포의 면역아세포 육종, 림프종, T-세포의 면역아세포 육종, 젠센(Jensen's) 육종, 카포시 육종, 쿠퍼 세포 육종, 혈관 육종, 백혈성 육종, 악성 간엽세포종 육종, 골막주위 육종, 망상적혈구성 육종, 라우스 육종, 혈청담낭 육종, 윤활막 육종, 및 텔앤지에탈틱 육종을 포함한다.
용어 "흑색종"은 피부 및 다른 장기의 멜라닌세포 시스템으로부터 발생한 종양을 의미한다. 항신생 티올-결합 미토콘드리아 산화제 및 항암제의 조합으로 치료할 수 있는 흑색종은 예를 들어, 선단-주근깨 흑색종, 멜라닌 결핍 흑색종, 양성의 청소년 흑색종, 클라우드맨(Cloudman's) 흑색종, S91 흑색종, 하딩-파시(Harding-Passey) 흑색종, 청소년 흑색종, 악성 흑색점 흑색종, 악성 흑색종, 결절성 흑색종, 서브언갈(subungal) 흑색종, 및 표면적 스프레딩 흑색종을 포함한다.
용어 "암종"은 주위 조직에 침투하여 전이를 일으키려는 성향을 갖는 상피 세포로 이루어진 악성 신성장에 관한 것이다. 항신생 티올-결합 미토콘드리아 산화제 및 항암제의 조합으로 치료할 수 있는 예시적인 암종은 예를 들어, 선포 암종, 입상과 암종, 선양낭포암종, 선양 방광 암종, 선암종, 부신 피질 암종, 폐포 암종, 폐포세포 암종, 기저 세포 암종, 염기세포성 암종(carcinoma basocellulare), 기저세포상 암종, 기저편평세포 암종, 세기관지폐포 암종, 세기관지 암종, 기관지 암종, 대뇌모양 암종, 담관세포 암종, 융모막 암종, 교질 암종, 여드름 암종, 코퍼스 암종, 소공질 암종, 보호막 상의(en cuirasse) 암종, 암종 피각, 원통형 암종, 원통형 세포 암종, 관 암종, 굳은섬유(durum) 암종, 배아 암종, 대뇌양 암종, 에피에르모이드(epiermoid) 암종, 상피성 아데노이드 암종, 외장성 암종, 궤양 밖 암종, 암종 섬유, 젤라티니포르니(gelatiniforni) 암종, 젤라틴 암종, 거대세포 암종, 거대세포를 이루는 암종, 선상 암종, 과립막 세포 암종, 헤어-매트릭스 암종, 혈액성 암종, 간세포 암종, 허슬세포 암종, 히알린 암종, 하이페메프로이드(hypemephroid) 암종, 유아 배아성 암종, 전암상태(내 암종), 표피내 암종, 크롬페처(Krompecher's) 암종, 쿨치츠키-세포(Kulchitzky-cell) 암종, 대세포 암종, 렌즈모양 암종, 암종 렌즈형, 지방종성 암종, 림프상피성 암종, 암종 수질, 점막표피모양 암종, 점액암종, 점액성 암종, 암종 점액종증, 비인두 암종, 연맥세포 암종, 암종 골화체, 뼈 모양 암종, 유두 암종, 문맥주위 암종, 조직침투전 암종, 유극세포 암종, 풀 모양 암종, 신장의 신세포 암종, 저장세포 암종, 암종 육종증, 상악동(schneiderian) 암종, 경성 암종, 암종 소양증(scroti), 인환세포 암종, 암종 단통, 소세포 암종, 솔라노이드(solanoid) 암종, 회전 타원체 세포 암종, 방추세포 암종, 암종 해면체, 편평상피 암종, 편평상피세포 암종, 스트링(string) 암종, 암종 테랑지엑탁티컴(telangiectaticum), 혈관확장성 암종, 이행세포 암종, 암종 결절, 결절 암종, 사마귀 모양 암종, 및 암종 맥락막을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전이", "전이성" 및 "전이성 암"은 상호교환적으로 사용하였고 증식성 장애, 또는 장애 예를 들어 하나의 장기 또는 다른 비-인접 장기 또는 신체 일부로부터의 암의 확장에 관한 것이다. 암은 기원 위치, 예를 들어 유방에서 발생하는데, 상기 기원 위치는 1차 종양으로서, 예를 들어 1차 유방암을 의미하였다. 1차 종양 또는 기원 위치 내 일부 암세포는 국소 지역 내 주위 정상 조직을 관통하고 침투하는 능력 및/또는 체내 다른 위치 및 조직에 대하여 시스템을 통해 순환하는 림프 시스템 또는 혈관 시스템의 벽을 침투하는 능력을 얻는다. 1차 종양의 암세포로부터 형성된 두 번째로 임상적으로 탐지할 수 있는 종양은 전이성 또는 2차 종양으로 간주하였다. 암세포가 전이할 때, 전이성 종양 및 그 세포들은 본래 종양의 세포와 유사한 것으로 추정되었다. 따라서, 만약 폐암이 유방으로 전이한다면, 유방 위치에서의 2차 종양은 비정상 유방 세포가 아닌 비정상 폐 세포로 구성되어 있다. 유방 내 2차 종양은 전이성 폐암으로 간주하였다. 따라서, 문구 전이성 암은 개체가 1차 종양을 갖거나 가졌던 질환 및 하나 이상의 2차 종양을 갖는 질환에 관한 것이다. 문구 비-전이성 암 또는 전이성이 아닌 암을 갖는 개체는 개체들이 1차 종양을 갖지만 하나 이상의 2차 종양을 갖지 않는 질환에 관한 것이다. 예를 들어, 전이성 폐암은 1차 폐 종양 또는 1차 폐 종양 이력 및 예를 들어 유방 같은 2차 위치 또는 다수 위치에서의 하나 이상의 2차 종양을 갖는 개체 내 질환에 관한 것이다.
용어 "투여량(용량)(dose)" 및 "복용량(dosage)"은 본원에서 상호교환적으로 사용하였다. 투여량은 각각의 투여시 개체에 주어지는 활성 구성성분의 양에 관한 것이다. 투여량은 주어진 치료법에 대한 정상 투여량의 범위, 투여 빈도; 개체의 크기 및 내성; 상태의 심각성; 부작용의 위험; 및 투여 경로를 포함하는 다수의 인자들에 따라 다양할 수 있다. 숙련된 이는 투여량이 상기 인자들에 따라 또는 치료 진행에 근거하여 변할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 용어 "제형"은 약학적 또는 약학적 조성물의 특별한 형식에 관한 것이고 투여 경로에 의존한다. 예를 들어, 하나의 제형은 예컨대 흡입제에 대한 분무화용 액체 형태, 예컨대 경구 전달을 위한 정제 또는 액체, 또는 예컨대 주사를 위한 살린(saline) 용액일 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 상태, 질환 또는 장애 또는 상태와 연관된 증상의 "치료(treating)" 또는 "치료(treatment of)"는 임상적 결과를 포함하여 유용한 결과 또는 바람직한 결과를 획득하기 위한 접근에 관한 것이다. 유용한 또는 바람직한 임상 결과는 부분적이거나 전체적인 하나 이상의 증상 또는 상태의 완화 또는 개선; 상태, 질병 또는 장애 정도의 축소; 증상, 질병 또는 장애 상태의 안정화; 증상, 질병 또는 장애 발전의 억제; 증상, 질병 또는 장애 진행의 지연 또는 늦춤; 증상, 질병 또는 장애의 축소 또는 완화; 및 차도를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. "치료"는 또한 치료가 없을 때 예측되는 개체의 연장되는 생존을 의미할 수도 있다. "치료"는 또한 증상, 질환 또는 장애의 진행 억제; 일부 경우에 증상, 질환 또는 장애의 영구적인 진행 정지를 포함할 지라도, 증상, 질환 또는 장애에 대한 일시적인 진행 정지;를 의미할 수도 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 치료(treatment, treat 또는 treating)는 프로테아제의 발현이 특징인 질환 또는 상태에 대한 하나 이상의 증상의 효과; 또는 프로테아제의 발현이 특징인 질환 또는 상태의 증상을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 따라서 개시된 방법 내, 치료는 형성된 질환 또는 상태의 심각성에서; 또는 질환 또는 상태의 증상에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 감소에 관한 것이다. 예를 들어, 대조군에 비교하여 개체 내 질병의 하나 이상의 증상 내 10% 감소가 있다면 질병을 치료하는 방법은 치료로 간주하였다. 따라서 감소는 본래 수준 또는 대조군 수준에 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 10% 내지 100% 사이의 어떠한 퍼센트 감소라도 될 수 있다. 치료는 필연적으로 질환, 상태의 치유 또는 완전한 제거, 또는 질환 또는 상태의 증상에 관한 것이 아니라는 것을 이해할 것이다. 추가적으로, 본원에 기재된 바와 같이, 감소, 줄임 또는 저해에 대한 참조는 대조군 수준에 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 변화를 포함하고, 그러한 용어는 완전한 제거를 포함할 수 있지만 필연적으로 완전한 제거를 포함하지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이 "치료적으로 유효한 투여량(용량) 또는 양"은 투여시 효과(예를 들어 질병 치료 또는 예방)를 생성하는 양을 의미한다. 정확한 투여량 및 조성은 치료의 목적에 의존하고, 알려진 기술을 사용하여 당 업계의 숙련된 이들이 확인할 것이다(예컨대, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003), and Pickar, Dosage Calculations (1999) 참조). 예를 들어, 주어진 매개변수에 대하여, 치료적으로 유효한 양은 최소한 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 또는 최소한 100%의 증가 또는 감소를 나타낼 것이다. 치료 효능은 또한 "-배" 증가 또는 감소로서 나타낼 수도 있다. 예를 들어, 치료적으로 유효한 양은 최소한 1,2-배, 1.5-배, 2-배, 5-배 또는 표준 대조군 이상의 효과로서 나타낼 수도 있다. 치료적으로 유효한 투여량 또는 양은 질병의 하나 이상의 증상을 개선할 수도 있다. 투여에 의한 효과가 질병이 발달할 위험에 있는 인간의 치료인 경우, 치료적으로 유효한 투여량 또는 양은 질병의 개시 또는 질병의 하나 이상의 증상을 억제 또는 지연할 수도 있다.
용어 "약학적으로 허용되는 염" 또는 "약학적으로 허용되는 담체"는 본원에 기재된 화합물에서 발견되는 특별한 구성요소에 따라, 상대적으로 비독성 산 또는 염기를 사용하여 제조되는 활성 화합물의 염을 포함하는 것을 의미한다. 본 출원의 화합물이 상대적으로 산성 기능성을 포함할 때, 염기 추가 염은 그러한 화합물에 중성 형태를 니트(neat) 또는 적절한 비활성 용매 내 충분한 양의 바람직한 염기와 접촉시켜서 획득할 수 있다. 약학적으로 허용되는 염기 투여 염의 예는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모니움, 유기 아미노, 또는 마그네슘 염, 또는 유사한 염을 포함한다. 본 출원의 화합물이 상대적으로 염기 기능성을 포함할 때, 산 첨가 염은 그러한 화합물의 중성 형태를 니트 또는 적절한 비활성 용매 내 충분한 양의 바람직한 산과 접촉하여 획득할 수 있다. 약학적으로 허용되는 산 첨가 염의 예는 아세트산, 프로피온산, 이소부틸산, 말레익산, 말로닌산, 벤조익산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 락틱산, 만델산, 프탈산, 벤젠술폰산, p-토릴술폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄술폰산, 및 이와 유사한 산 같은 상대적으로 비독성인 유기산으로부터 유래한 염뿐만 아니라 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 단일수소탄산, 인산, 단일수소인산, 요오드화수소산, 또는 아인산 및 이의 유사체 같은 무기 산으로부터 유래된 염을 포함하였다. 또한 아르기네이트 같은 아미노산 및 그 유사체의 염, 및 글루쿠론산 또는 갈라투노릭산(galatunoric acid) 같은 유기산 및 그 유사체의 염을 포함하였다(예컨대, 문헌 Berge et al ., Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19 (1977) 참조). 당 업계의 숙련된 이들에게 알려진 다른 치료적으로 허용되는 담체들은 본 출원의 조성물에 대하여 적합하였다.
"피험체", "개체" 또는 "환자"는 본원 내 상호교환적으로 사용하였고, 이는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간에 관한 것이다. 포유동물은 쥐과 동물, 유인원, 인간, 가축, 스포츠 동물 및 애완동물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 시험관 내(in vitro) 또는 시험관 내 배양에서 획득한 생물학적 완전체의 조직, 세포 및 이의 자손이 또한 포함되었다.
본원에 사용된 바와 같이, "Rb 결핍" 종양 또는 세포, 또는 "Rb 결핍 표현형을 갖는 종양 또는 세포"는 종양 억제자 Rb의 수준이 정상 또는 대조군 세포 또는 Rb 경로가 방해받거나 비활성화된 것보다 낮은 종양 또는 세포이다. 용어 "Rb 경로" 또는 "Rb 신호전달 경로"는 적어도 부분적으로, pRb/p107, E2F-1/-2/-3, 및 G1 사이클린/cdk 복합체를 포함하는 pRb 활성에 영향을 주는 분자를 지칭한다. 현재 알려지지 않은 분자들 또한 이 정의 내 포함될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "종양살상형 바이러스"는 증식성 장애, 예를 들어 암 세포의 세포를 선택적으로 살상하는 바이러스이다. 암세포의 살상은 살아있는 세포 계산, 세포변성 효과, 죽은 신생 세포의 세포자살, 암 세포 내 바이러스 단백질의 합성(예를 들어, 대사적 표지, 바이러스 단백질의 웨스턴 분석, 또는 복제에 필요한 바이러스 유전자의 역 전사 중합효소 사슬 반응), 또는 종양의 크기 감소 같은 당 업계에 구축된 방법에 의해 탐지할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "복제 결핍 바이러스"는 바이러스 복제를 지지하는 주어진 표현형을 갖는 미리결정된 세포 집단(예를 들어, pRb 신호전달 경로 내 분자에 대한 반응하는 종양 세포) 내 우선적으로 세포 증식을 억제하고, 세포 용균을 일으키거나 세포자살(종합적으로 고려된 살상)을 유발하는 바이러스에 관한 것이다. 그러한 바이러스는 세포 증식을 저해할 수 없고, 세포 용균을 유발할 수 없고, 세포자살을 유발할 수 없고 또는 미리결정된 세포 표현형을 갖지 않는 세포 내 증식할 수 없거나, 그러한 능력에 제한이 있다.
변형된 아데노바이러스
본원에서 하나 이상의 변형을 포함하는 E1A 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf6/7 폴리펩티드를 포함하는 아데노바이러스(Ads)를 제공하였다. 아데노바이러스는 선택적으로 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf1 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 또한 하나 이상의 변형을 포함하는 E1A 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf1 폴리펩티드를 포함하는 아데노바이러스(Ads)를 제공하였다. 따라서, E1A, E4orf1 및 E4orf6/7 내 변형을 포함하는 변형된 아데노바이러스를 제공하였다. 제공된 변형 아데노바이러스는 종양살상형이다. 제공된 변형 아데노바이러스는 또한 탈조절된 E2F 및 정상 세포 주기 체크포인트를 갖는 암 세포에서 선택적으로 복제하였다. 제공된 변형 아데노바이러스는 비활성 Rb/p16 종양 억제인자 경로를 갖는 세포 내에서 선택적으로 복제하였다. 제공된 변형 아데노바이러스는 국제 공개 특허 WO2012/024350 및 WO2013/138505 내 기재된 변형을 포함하는 하나 이상의 추가적인 변형을 포함할 수 있고, 상기 문헌은 온전한 형태로 본문에 병합되어 있다.
용어 "변형된 아데노바이러스"는 자연계에서 발견되지 않는 유전자 서열을 갖는 아데노바이러스(예컨대 비-야생형 아데노바이러스)에 관한 것이다. 선택적으로, 변이된 아데노바이러스는 재조합 아데노바이러스이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 E1A"는 폴리펩티드 또는 핵산 서열 각각에 하나 이상의 변형을 포함하는 E1A 폴리펩티드 및/또는 E1A 폴리펩티드를 암호화하는 E1A 유전자 또는 핵산 서열에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 E4orf1"은 폴리펩티드 또는 핵산 서열 각각에 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf1 폴리펩티드 및/또는 E4orf1 폴리펩티드를 암호화하는 E1orf1 유전자 또는 핵산 서열에 관한 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형된 E4orf6/7"은 폴리펩티드 또는 핵산 서열 각각에 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf6/7 폴리펩티드 및/또는 E4orf6/7 폴리펩티드를 암호화하는 E1orf6/7 유전자 또는 핵산 서열에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "Rb/p16/E2F 복제 손상 또는 결핍"은 세포 감염시, Rb/p107/p130/p16/E2F/CDK-사이클린 체크포인트를 포함하는 기능성 세포내 "포켓 단백질 패밀리" 멤버의 정상 수준에서 아데노바이러스 복제가 부분적으로 또는 완전히 약화된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 감염된 세포가 Rb/p16 경로 손상되거나 결핍되면(즉, 감염된 세포가 Rb/p16 경로 내 정상 수준의 완전한 기능성 Rb 또는 다른 단백질을 발현하지 않는다), Rb/p16/E2F 경로 복제가 손상된 아데노바이러스는 정상적으로 진행할 것이다. 반대로, 세포가 정상 수준의 기능성 Rb를 발현한다면(즉 정상 활성을 갖는 Rb이고, 또한 본원에서 "Rb 발현 세포"를 의미함), Rb 복제가 손상되거나 결핍된 아데노바이러스의 복제는 약화되거나 억제되었다. 세포는 정상 수준의 Rb 발현이 실패하거나(즉 Rb 유전자의 조절(예컨대 프로모터) 영역에 대한 변이) 또는 정상 Rb 활성 이하를 갖는 변이된 Rb를 발현함으로써 Rb가 손상되거나 결핍될 수도 있다. 정상 수준의 Rb 및 정상적인 Rb 활성 수준은 건강하고 같은 형태의 질병 없는 세포에서 확인하였다. 따라서, Rb가 손상된 세포는 변이된 Rb 유전자를 포함하였다. 선택적으로, Rb 손상 세포는 Rb 유전자가 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 게놈을 포함한다. Rb 손상 세포는 암(예컨대 신생의) 세포일 수도 있다. 정상적인 Rb 기능의 손실을 야기할 수 있는 다른 게놈 손상은 CDK 변이, 사이클린 변이 및 증폭, p16 변이 및/또는 후생학적 침묵, p107 변이, p130 변이, 및 성장 인자 수용체 경로 변이를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "Rb/p16 종양 억제(자) 경로" 또는 "Rb/p16 경로"는 망막아종 단백질(RB), 및 Cdk, E2f, 비전형 단백질 키나아제 C, 및 Skp2를 포함하지만 이에 제한되지 않는 경로 내 다른 단백질/단백질 패밀리를 포함하는 분자 신호전달의 전체 신호전달 경로에 관한 것이다. 용어 "손상된 또는 결실된 Rb/p16 종양 억제 경로"는 신호전달 경로 내 하나 이상의 분자가 손상되거나 결실된 것으로, 예컨대 정상 수준 발현 또는 단백질의 실패 또는 정상 이하의 활성을 갖는 변이된 단백질을 발현하여 경로가 비정상적으로 기능하는 것을 의미한다. 그러한 결함은 자유로운 E2F의 높은 발현 수준 및 E2F 프로모터의 높은 활성을 야기하였다. 따라서, Rb/p16 종양 억제 경로 내에서 단백질의 정상 수준 발현의 실패 또는 정상 이하의 활성을 갖는 변이된 단백질 발현에 의해 세포는 Rb/p16 경로가 손상되거나 결핍될 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "E1A 손상", "E1A 결핍", "E4orf1 결핍", "E4orf1 손상", "E4orf6/7 손상" 및 "E4orf6/7 결핍"은 아데노바이러스가 정상 수준 및/또는 완전히 기능적인 E1A, E4orf1 또는 E4orf6/7 유전자 생성물을 생산할 수 없다는 것을 의미한다. 예를 들어, E1A, E4orf1 또는 E4orf6/7 유전자 생성물의 정상 수준 발현이 실패하거나(예컨대 E1A, E4orf1 또는 E4orf6/7 유전자의 조절(예컨대 프로모터) 영역에 대한 변이), 또는 정상 활성 이하의 E1A, E4orf1 또는 E4orf6/7 유전자 생성물을 포함하는 변이된 E1A, E4orf1 또는 E4orf6/7 유전자 생성물을 발현함으로써 바이러스는 E1A, E4orf1, 또는 E4orf6/7이 결핍되거나 손상될 수 있다. 따라서, E1A, E1orf1 및/또는 E4orf6/7 결핍 아데노바이러스는 변이된 E1A, E4orf1 및/또는 E4orf6/7 유전자를 포함한다. 선택적으로, E1A, E1orf1 및/또는 E4orf6/7 결핍 아데노바이러스는 E1A, E4orf1 및/또는 E4orf6/7 유전자가 완전히 또는 부분적으로 결실된 게놈을 포함한다. 아데노바이러스의 E1A 및 E4 영역은 알려졌고 본원 실시예 전반 및 실시예 내에 기재된 방법, 및 당 업계에 알려진 다른 실시예 내 기재된 방법을 이용하여 변이시킬 수 있다. 예를 들어 참고문헌(국제 공개 출원번호 WO 1998/046779, 미국 특허번호 8465732, 국제 공개 출원 번호 2012/024350)을 참고하고, 상기 참고문헌은 본원 내 참고문헌으로서 온전한 형태로 병합되어 있다. 실시예에 의해, E1A 폴리펩티드의 아미노산 서열은 최소한 유전자은행 접속 번호 CAE01147.1, AP_000161.1(서열번호 1) 및 AP_000197.1(서열번호 2)에서 찾을 수 있고 E4orf6/7 폴리펩티드의 아미노산 서열은 최소한 유전자은행 접속 번호 AP_000191.1(서열번호 3) 및 AP_000227.1(서열번호 4)에서 찾을 수 있다. E4orf1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 유전자은행 접속 번호 AP_000196.1(서열번호 5) 및 AP_000232.1(서열번호 6)에서 찾을 수 있다. 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산들은 최소한 유전자은행 접속 번호 AC_000008.1(서열번호 7) 및 AC_000007.1(서열번호 8)에서 찾을 수 있다. 또한 서열번호 1 또는 서열번호 2에 대하여 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 E1A 폴리펩티드, 서열번호 5 또는 서열 번호 6에 대하여 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 E4orf1 폴리펩티드, 서열번호 3 또는 서열번호 4에 대하여 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 서열 동일성을 갖는 E4orf6/7 폴리펩티드를 제공하였다.
단백질(Rb, E1A 유전자 생성물, E4orf1 유전자 생성물, E4orf6/7 유전자 생성물 같은)의 수준 및 활성을 측정하는 증폭/발현 방법들, 면역조직화학 방법들, FISH 및 감춰진 항원 시험들, 서던 블로팅, 또는 PCR 기술들 같은 다양한 시험들이 유효하다. 더욱이, 단백질 발현 또는 증폭은 생체 내 진단 시험들, 예컨대 단백질에 결합하여 탐지되고 탐지가능한 표지(예컨대 방사선활성 동위원소)가 부착된 분자(항체 같은)를 투여하고 표지의 위치에 대하여 환자를 외부에서 스캐닝함으로써 측정할 수 있다. 따라서, 세포들 내 단백질 수준들의 측정 방법들은 일반적으로 당 업계에 알려져 있고 본원에 적용가능하게 제공된 방법들 및 조성물들과 관련된 단백질 수준들 및/또는 활성들을 측정하는데 사용할 수도 있다. 이러한 시험들은 E1A, E4orf1, 및 E4orf6/7 폴리펩티드 및 이의 조합들 내 변이들의 효과를 측정하기 위해, 예컨대 변이들이 폴리펩티드의 정상 수준 또는 완전히 기능적인 유전자 생성물을 생산할 수 없는 아데노바이러스를 야기하는지를 측정하고 E1A, E4orf1 및 E4orf6/7 폴리펩티드 또는 이의 조합들의 하나 이상의 전체 또는 일부의 결실을 포함하는 아데노바이러스를 확증하기 위해 사용할 수 있다.
Rb 결핍 세포에서 선택적으로 복제하는 아데노바이러스(Ads)를 제공하였다. 바람직하게는, 하나 이상의 변형을 포함하는 E1A 폴리펩티드, 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf6/7 폴리펩티드, 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf1 폴리펩티드 및 이의 다양한 조합들을 포함하는 아데노바이러스를 제공하였다. 또한 E1A 유전자, E4orf1 유전자, 및/또는 E4orf6/7 유전자의 전체 또는 일부가 결실된 게놈을 포함하는 아데노바이러스를 제공하였다. 따라서, E4orf1 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열이 결핍 및/또는 E4orf6/7 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열이 결핍되고 하나 이상의 변형을 포함하는 E1A를 암호화하는 핵산을 갖는 게놈을 포함하는 아데노바이러스를 제공하였다. 상기 논의된 바와 같이, 용어 "변형"은 유전자 또는 아미노산 서열 내 변이에 관한 것이다. 변이들은 삽입, 치환 및 결실을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 아미노산 서열 변이는 전형적으로 세 가지 종류 중 하나 이상으로 나뉘어진다: 치환적, 삽입적 또는 결실적 변이. 삽입은 단일 또는 복수의 아미노산 잔기의 서열 사이 삽입뿐만 아니라 아미노 및/또는 말단 융합을 포함한다. 결실은 단백질 서열로부터 하나 이상의 아미노산 잔기들의 제거가 특징이 된다. 아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기에 관한 것이지만, 한 번에 다수의 다른 위치에서 발생할 수 있다. 치환적 변이는 최소한 하나의 잔기가 제거되고 다른 잔기가 제거된 위치에 삽입되는 변이이다. 치환, 결실, 삽입 또는 이의 어떠한 조합도 최종 구조물(construct)에 도달하기 위해 결합될 수 있다.
경우에 따라, E1A의 변형은 E1A의 Rb 결합부위의 변형을 포함한다. 선택적으로, E1A의 변형은 E1A 폴리펩티드의 122-126 아미노산 잔기, 예컨대 서열번호 1 또는 서열번호 2에 비교하여 122-126 아미노산 잔기의 하나 이상의 변형을 포함한다. 선택적으로, 상기 변형은 결실이다. 따라서, 선택적으로, E1A 및/또는 E4orf6/7의 변형은 결실을 포함한다. 선택적으로, E1A의 변형은 예컨대 서열번호 1 또는 서열번호 2에 비교하여 E1A의 아미노산 잔기 122-126의 결실이다. 선택적으로, 변형은 ΔLXCXE로서 전반적으로 알려진 E1A의 보존된 LXCXE 모티프 내 결실이다. 실시예 형태로서, 보존된 모티프는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 122-126에서 찾을 수 있다. E4orf6/7은 도 2 및 도 6에 나타낸 2개의 엑손에 의해 암호화된다. 선택적으로, E4orf6/7의 변형은 E4orf6/7 엑손의 하나 또는 2개 모두의 변이를 포함한다. 선택적으로, E4orf6/7의 변형은 E4orf6/7 엑손의 하나 또는 둘 모두의 결실이다. 선택적으로, E4orf6/7의 변형은 ΔE4orf6/7이다. 선택적으로, 아데노바이러스는 Ad E1A ΔLXCXE/ ΔE4orf6/7 또는 AdSyn-CO181로서 전반적으로 알려진 E1A ΔLXCXE 및 ΔE4orf6/7를 포함한다.
따라서, 하나 이상의 변형을 포함하는 E1A 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf6/7 폴리펩티드를 포함하는 아데노바이러스를 제공하였다. E1A 폴리펩티드는 E1A의 Rb 결합 부위 내 변형을 포함할 수 있다. E1A 폴리펩티드는 2개의 Rb 결합 부위를 포함할 수 있고, 여기서 E1A 폴리펩티드는 2개 모두의 Rb 결합 부위 내 변형을 포함한다. 선택적으로, E1A 폴리펩티드는 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 120-130 내 하나 이상에서의 변형, E1A 폴리페바이드의 아미노산 잔기 122-126 내 하나 이상에서의 변형, E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 35-55 내 하나 이상에서의 변형, E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 37-49 내 하나 이상에서의 변형, 또는 이의 조합된 변형을 포함한다. 예를 들어, 변형은 서열번호 1 또는 서열번호 2와 비교하여 아미노산 잔기 120-130, 122-126, 35-55, 37-49 또는 이의 조합 내 하나 이상에서 발생할 수 있다. 실시예 형태로서, E1A 폴리펩티드는 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 122-126 내 하나 이상에서의 변형 및 아미노산 잔기 37-49 내 하나 이상의 변형을 포함할 수 있는데, 여기서 E1A 폴리펩티드는 선택적으로 서열번호 1 또는 서열번호 2를 포함한다. 따라서, 제공된 E1A 폴리펩티드는 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다. 선택적으로, E1A 폴리펩티드는 잔기 Y47, 잔기 C124 또는 두 잔기 Y47 및 C124 모두에서의 치환을 포함하는데, 여기서 E1A는 선택적으로 서열번호 1 또는 서열번호 2를 포함한다. 대안으로서 또는 부가적으로, E1A 폴리펩티드는 결실을 포함한다. 선택적으로 결실은 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 122-126의 결실 및/또는 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 2-11의 결실이다. 선택적으로, E1A 폴리펩티드는 결실 ΔLXCXE를 포함한다. 상기 논의된 바와 같이, 변형될 E1A 폴리펩티드는 서열번호 1 또는 서열번호 2를 포함할 수 있다.
제공된 아데노바이러스에서, E4orf6/7 폴리펩티드는 E4orf6/7 엑손의 하나 또는 둘 모두의 변형을 포함할 수 있다. 따라서, E4orf6/7 폴리펩티드는 삽입, 치환, 및 결실 및 이의 조합으로 구성된 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 선택적으로, E4orf6/7 폴리펩티드는 E4orf6/7 엑손의 하나 또는 두 개 모두의 결실을 포함한다. 선택적으로, E4orf6/7은 예컨대 서열번호 3 또는 4와 비교하여 4 내지 38, 4 내지 58 또는 38 내지 58의 N-말단 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 N-말단 결실을 포함한다. 예컨대 문헌(Schaley et al., J. Virol . 79(4):2301-8 (2005))을 참조하고, 상기 문헌은 본원에 온전한 형태로 병합되어 있다. 선택적으로, E4orf6/7 폴리펩티드는 dl355, dl356, 및 dl366으로 구성된 군으로부터 선택된 변이를 포함하고(문헌 Huang and Hearing, Genes & Development 3:1699-1710 (1989) 참조), 상기 문헌은 본원에 온전한 형태로 병합되어 있다. 상기 논의된 바와 같이, 변형을 위한 E4orf6/7 폴리펩티드는 서열번호 3 또는 서열번호 4를 포함할 수 있다.
제공된 아데노바이러스에서, 아데노바이러스는 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf1 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 선택적으로, E4orf1 폴리펩티드는 하나 이상의 결실을 포함한다. 선택적으로, E4orf1 폴리펩티드는 E4orf1의 C-말단 구역 내 결실을 포함한다. 선택적으로, E4orf1 폴리펩티드는 E4orf1 폴리펩티드의 C-말단 구역 내 마지막 4개 아미노산의 결실을 포함한다. 선택적으로, E4orf1 폴리펩티드는 E4orf1 폴리펩티드의 잔기 125-128의 결실을 포함하는데, 여기서 선택적으로 E4orf1 폴리펩티드는 서열번호 5 또는 서열번호 6을 포함한다. 선택적으로, E4orf1 폴리펩티드는 D68A, P17A, Y26A, L109A, P117A, E3A, L5A, G13T, P31A, G58T, E85A, 및 L86A로 구성된 군으로부터 선택된 변형을 포함한다(문헌 Chung et al., J. Virol. 81(9):4787-97 (2007) 참조, 상기 문헌은 본원에 온전한 형태로 병합되어 있음). 상기 논의된 바와 같이, 변형을 위한 E4orf1 폴리펩티드는 서열번호 5 또는 서열번호 6을 포함할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 변형을 포함하는 E1A 폴리펩티드 및 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf1 폴리펩티드를 포함하는 아데노바이러스도 또한 제공하였다. 상기 기재된 바와 같이, 아데노바이러스는 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf6/7 폴리펩티드를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한 본원에서 상기 기재된 변형된 아데노바이러스를 암호화하는 핵산을 제공하였다. 선택적으로, 변형된 아데노바이러스를 암호화하는 하나의 핵산(예컨대 하나의 플라스미드)을 제공하였다. 선택적으로, 변형된 아데노바이러스를 암호화화는 다량의 핵산(예컨대 다량의 플라스미드)을 제공하였다.
변형은 당 업계에 알려진 다수의 방법을 이용하여 바이러스의 핵산 내에 생성하였다. 예를 들어, 부위 지정 변이생성은 핵산 서열을 변형하기 위해 사용할 수 있다. 부위-지정 변이생성의 가장 일반적인 방법 중의 하나는 올리고뉴클레오티드-지정 변이생성이다. 올리고뉴클레오티드-지정 변이생성에서, 서열 내 원하는 변화를 암호화하는 올리고뉴클레오티드는 관심 있는 DNA의 하나의 가닥에 어닐링시키고 DNA 합성을 위한 프라이머 역할을 한다. 이러한 방식에서, 서열 변화를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 새로이 합성되는 가닥으로 병합하였다(예컨대, 문헌(Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488; Kunkel et al., 1987, Meth. Enzymol., 154:367; Lewis & Thompson, 1990, Nucl. Acids Res., 18:3439; Bohnsack, 1996, Meth. Mol. Biol., 57:1; Deng & Nickoloff, 1992, Anal. Biochem., 200:81; and Shimada, 1996, Meth. Mol. Biol., 57:157. 참조). 다른 방법들은 서열 내 변형을 도입하기 위해 당 업계에서 통상적으로 사용하였다. 예를 들어, 변형된 핵산은 PCR 또는 화학 합성을 사용하여 생성하였고, 또는 아미노산 서열 내 원하는 변화를 포함하는 폴리펩티드는 화학적으로 합성할 수 있다(예컨대, 문헌 Bang & Kent, 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:5014-9 및 본원내 문헌 참조). 바이러스가 보통 성장하지 않은 세포 형태(예컨대, 인간 세포)에서의 선택 및/또는 화학적 변이생성(예를 들어 문헌 Rudd & Lemay, 2005, J. Gen. Virology, 86:1489-97 참조)은 또한 바이러스의 핵산 내 변형을 생성하기 위하여 사용할 수 있다.
또한 본원에 전반적으로 기재된 변형된 아데노바이러스로 감염된 세포를 제공하였다. 세포는 상기 기재된 변형된 아데노바이러스에 의해 형질전환될 수 있다. 선택적으로, 세포는 상기 기재된 변형된 아데노바이러스의 유전 물질의 흡수, 병합 및 발현의 결과로서 유전적으로 변화하였다. 선택적으로, 세포는 인간 세포 같은 포유동물 세포이다. 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 같은 포유동물 아데노바이러스일 수도 있다. 선택적으로, 세포는 양서류 세포(예컨대, 개구리 세포) 또는 파충류 세포(예컨대, 뱀 세포)이다.
조성물
본원에서 변형된 바이러스(또는 변형된 아데노바이러스를 암호화하는 하나 이상의 핵산)을 포함하는 조성물을 제공하였다. 조성물은 선택적으로 시험관 내 또는 생체 내 배합 및 투여에 적합하다. 선택적으로, 조성물은 제공된 제제 및 약학적으로 허용가능한 담체의 하나 이상을 포함한다. 적절한 담체 및 이의 배합은 선행문헌에 기재되어 있다(문헌 Remington : The Science and Practice of Pharmacy , 22 nd Edition, Loyd V. Allen et al., editors, Pharmaceutical Press (2012) 참조). 약학적으로 허용가능한 담체는 생물학적이지 않거나 바람직한 재료를 의미하고, 예컨대 재료는 피험체에 투여하는데, 재료가 포함된 약학적 조성물의 다른 구성요소와 해로운 방식으로 원하지 않는 생물학적 효과 또는 상호작용을 일으키지 않는다. 피험체에 투여하면, 담체는 선택적으로 피험체 내 활성 성분의 분해를 최소화하고 부정적인 부작용을 최소화하도록 선별하였다.
변형된 바이러스(또는, 변형된 아데노바이러스를 암호화하는 하나 이상의 핵산)는 정맥투여, 예컨대 한 회 분 투여 또는 일정 기간 연속적인 투여, 근육 내, 복강 내, 뇌척수내, 피하 내, 관절 내, 활막 내, 척추 강내, 경구, 국부의, 종양 내 또는 흡입 경로 같은 알려진 방법에 따라 투여하였다. 투여는 국지적으로 또는 전체적일 수 있다. 조성물은 국부, 경구, 비경구, 정맥내, 관절내, 복강 내, 근육내, 피하내, 강 내, 피부를 통해, 간 내, 두개 내, 분무/흡입, 또는 기관지경의 설치를 포함하는 투여의 여러 경로 중 어느 하나에 따라 투여할 수 있다. 따라서, 조성물은 국지적 또는 전반적 치료가 바람직한지의 여부 및 치료하려는 범위에 따라 다양한 방법으로 투여하였다.
투여를 위한 조성물은 일반적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 바람직하게는 수용성 담체 내 녹인 본원에 기재된 바와 같은 제제(agent)(예컨대 변형된 바이러스 또는 변형된 바이러스를 암호화하는 하나 이상의 핵산)를 포함할 것이다. 예컨대 완충된 살린 및 그 유사체 같은 다양한 수용성 담체를 사용하였다. 이러한 용액들은 살균하여 일반적으로 불필요한 물질이 제거되어 있다. 이러한 조성물은 통상적인, 잘 알려진 살균 기술에 의해 살균할 수 있다. 조성물은 pH 적정 및 완충 제제, 독성 적정 제제 및 그 유사체, 예를 들어 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 젖산나트륨 및 그 유사체 같은 적절한 생리적 조건에 대한 필요에 따라 허용가능한 보조 물질을 포함할 수 있다. 이러한 배합 내 활성 제제의 농도는 폭넓게 다양할 수 있고, 활성 제제 및 기타 같은 종류의 것은 선택한 투여의 특별한 방법 및 피험체의 요구에 부합하여 유체의 부피, 점도, 체중에 근거하여 주로 선택할 것이다.
변형된 바이러스의 특별한 약학적 조성물은 바람직한 순도를 갖는 변형된 아데노바이러스(또는 변형된 아데노바이러스를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 핵산), 부가적인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 안정화제와 같이 혼합하여 제조할 수 있다. 이러한 제제(제형)는 동결건조된 제제 또는 수용액일 수 있다.
허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용한 투여량 및 농도에서 수령인에게 비독성이다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 아세트산염, 인산염, 시트르산염 및 다른 유기산: 항산화제(예컨대, 아스코르빈산) 보존제 분자량 폴리펩티드; 혈청 알부민 또는 젤라틴 같은 단백질, 또는 폴리비닐피롤리돈 같은 친수성 중합체; 및 아미노산, 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트 시약; 및 이온성 및 비-이온성 계면활성제(예컨대, 폴리소르베이트); 나트륨 같은 염-형성 카운터-이온; 금속 복합체(예컨대 아연-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 표면활성제일 수도 있다. 변형된 아데노바이러스(또는 변형된 아데노바이러스를 암호화하는 하나 이상의 핵산)은 감염성 단위의 어떤 적절한 농도에서 제형화할 수도 있다.
경구 투여에 적합한 제형은 (a) 물, 살린 또는 PEG 400 같은 희석제 내 부유시킨 변이된 아데노바이러스의 유효량 같은 액체 용액; (b) 액체, 고체, 과립제 또는 젤라틴 같은 활성 성분의 미리결정된 양을 각각 포함하는 캡슐, 봉지 또는 정제; (c) 적절한 액체 내의 부유물; 및 (d) 적절한 유제로 구성할 수 있다. 정제 형태는 하나 이상의 락토오스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 인산 칼슘, 옥수수 전분, 감자 전분, 미세결정질 셀룰로오스, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 활석, 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 및 다른 부형제들, 착색제, 충전제, 결합제, 희석제, 완충제, 습윤제, 보존제, 방향제, 염료, 붕해제, 및 약학적으로 양립할 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 정제 형태는 당 업계에 알려진 활성 성분, 담체에 부가하여, 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 및 아카시아 유제, 젤 및 유사한 것을 포함하는 비활성 염기 내 활성 성분을 포함하는 정제뿐만 아니라 향이 있는 활성 성분, 예컨대 수크로스를 포함할 수 있다.
단독 또는 다른 적절한 구성요소와의 조합된 변형된 아데노바이러스(또는 변형된 아데노바이러스를 암호화하는 하나 이상의 핵산)는 흡입을 통해 투여하도록 연무제 제형으로(예컨대, 변형된 아데노바이러스가 "분무될 수" 있음) 만들 수 있다. 연무제 제형은 디클로로디플로로메탄, 프로판, 질소, 및 이와 유사한 것 같은 가압된 적절한 추진체 내 배치할 수 있다.
예를 들어, 관절내(관절 안의), 정맥내, 근육내, 종양내, 피내, 복강내, 피하 경로 같은 비경구 투여에 적합한 제형은 수용성 및 비-수용성 용액, 등장성의 멸균된 주입 용액을 포함하는데, 상기 용액은 항산화제, 완충액, 세균발육 저지제, 및 투여받는 수령인의 혈액과 등장성인 제형을 만드는 용질;, 및 부유제, 가용화제, 농조화제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수용성 및 비-수용성 멸균 부유제를 포함할 수 있다. 제공된 방법 내에서, 조성물은 예를 들어, 정맥 주입, 경구, 국부, 복강내, 방광내, 종양내 또는 척추관 내로 투여할 수 있다. 비경구적 투여, 종양내 투여 및 정맥내 투여는 투여의 바람직한 방법이다. 화합물의 제형은 앰플이나 바이알 같은 단일-투여량 또는 복수-투여량을 밀폐시킨 용기 내 제공할 수 있다.
주입 용액 및 부유액은 상기 기재된 종류의 멸균 파우더, 과립제, 및 정제로부터 제조할 수 있다. 생체 외(Ex vivo) 치료를 위해 아데노바이러스에 의해 형질도입되거나 감염된 세포 또는 핵산으로 형질감염된 세포 또한 상기 기재된 바와 같이 정맥내 또는 비경구적으로 투여할 수 있다.
약학적 제조는 단위 투여 형태에서 바람직하다. 이러한 형태에서, 제조는 활성화 성분의 적절한 양을 담는 단위 투여량으로 세분화하였다. 따라서, 약학적 조성물은 투여 방법에 따른 다양한 단위 투여 형태로 투여할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여에 적합한 단위 투여 형태는 파우더, 정제, 알약, 캡슐 및 캔디(lozenge)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
치료 방법
제공된 변형된 아데노바이러스 및/또는 변형된 아데노바이러스를 포함하는 조성물은 치료적 또는 예방을 위한 치료를 위해 투여할 수 있다.
따라서, 피험체 내 증식성 장애를 치료하는 방법을 제공하였다. 그 방법은 피험체에 제공된 바이러스 또는 조성물을 제공하는 것을 포함한다. 전반적으로 기재된 바에 따라, 아데노바이러스 또는 약학적 조성물은 정맥내, 혈관내, 수막강내, 근육내, 피하, 복강내, 또는 경구를 포함하는 다수의 방법으로 투여하지만, 이에 제한되지는 않는다. 선택적으로, 투여 방법은 피험체에 하나 이상의 추가적인 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 선택적으로, 치료제는 화학요법제이다.
전반적으로 기재된 바와 같이, 증식성 장애는 암일 수 있다. 선택적으로, 증식성 장애는 폐암, 전립선 암, 결장 암, 유방암, 갑상선 암, 신장 암, 간암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택하였다. 선택적으로, 증식성 장애는 전이성이다. 상기 논의된 바와 같이, 암은 빠른 증식성 세포 성장 또는 신생물이 특징인 온혈 동물 내 비정상 상태 또는 조건을 포함한다. 전이성 질환은 악성 또는 양성 암 및 종양(암종, 육종 또는 선종 포함)뿐만 아니라 백혈병 같은 신생물 분산을 포함하는 악성 또는 약성 신생물을 포함한다. 신생물은 일반적으로 정상보다 매우 빠른 세포 증식에 의해 성장하는 비정상 조직으로 인식되고, 새로운 성장을 개시하는 자극이 중지된 후에도 계속 성장할 수 있다. 전이성 질환은 예를 들어, 단핵세포 및 골수성 모두의 백혈병, 선암, 선종, 선상세포종, 방광암, 뇌암, 버킷 림프종, 유방 암종, 자궁경부 암종, 대장 암종, 신장 암종, 간 암종, 폐 암종, 난소 암종, 췌장 암종, 전립선 암종, 직장 암종, 피부 암종, 위 암종, 고환 암종, 갑상선 암종, 연골육종, 융모막암종, 섬유종, 섬유육종, 교아세포종, 신경교종, 간세포암, 조직구종, 평활근모세포종, 흉선종, 빌름스종양을 포함하는 종양 뿐만 아니라 유선, 뇌하수체, 갑상선 또는 전립선의 종양 같은 종양; 뇌, 간, 뇌막, 뼈, 난소, 자궁, 자궁경부 및 기타 같은 종류 부위의 종양 같은 종양을 포함한다. 전이성 질환은 예를 들어, 1차 및 전이성 고형암을 포함하는 종양, 혈관종, 흑색종, 육종(카포시 육종뿐만 아니라 뼈 및 연조직으로부터 발생한 육종 포함)뿐만 아니라 유방, 대장, 직장, 폐, 구강인두, 하인두, 식도, 위, 췌장, 간, 담낭 및 담관, 소장, 요로(신장, 방광 및 요로상피 포함), 여성 생식기(융모막 암종 및 임신성 영양아층증 뿐만 아니라 자궁경부, 자궁 및 난소를 포함), 남성 생식기(전립선, 정낭, 고환 및 생식세포 종양을 포함), 내분비샘(갑상선, 부신 및 뇌하수체 포함) 및 피부의 암종, 및 뇌, 신경, 눈, 및 뇌척수막의 종양(성상세포종, 신경교종, 교아세포종, 망막아종, 신경종, 신경아 세포종, 신경초종, 및 수막종을 포함)을 포함하는 종양 뿐만 아니라 유선, 뇌하수체, 갑상선 또는 전립선의 종양 같은 종양; 뇌, 간, 뇌막, 뼈, 난소, 자궁, 자궁경부 및 기타 같은 종류 부위의 종양 같은 종양을 포함한다. 일부 측면에서, 림프종(호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종 모두)의 치료 뿐만 아니라 백혈병(예컨대, 녹색종, 형질세포종 및 플라크 및 균상 식육종의 종양 및 피부의 T-세포 림프종/백혈병)같은 조혈성 악성종양으로부터 발생한 고형암은 치료할 수 있다. 부가적으로, 치료는 본원에 기재된 종양으로부터의 전이 예방에 사용할 수도 있다.
치료법 적용에서, 조성물은 증식성 장애 또는 질환(예컨대, 암)으로 고통받는 피험체에 대하여 "치료적 유효 용량"으로 투여하였다. 이러한 사용에 효과적인 양은 장애의 심각성 및 환자 건강의 일반적인 상태에 의존할 것이다. 조성물의 단일 또는 복수 투여는 환자가 필요로 하거나 내성을 보임에 따른 투여량 및 빈도에 의존하여 투여할 수 있다. "환자" 또는 "피험체"는 인간 및 다른 동물, 특히 포유동물 모두를 포함한다. 따라서, 방법은 인간 치료 및 수의학 적용 모두에 적용할 것이다.
변형된 서열을 포함하는 바이러스의 유효량은 개체 기반에 따라 결정되고, 최소한 부분적으로 사용된 특별한 바이러스에 따라 결정되었다. 예를 들어, 인간의 치료에 대하여, 바이러스의 대략 103 내지 1012 플라크 형성 단위(PFU)는 존재하는 증식성 세포 또는 신생물의 형태, 크기 및 수에 따라 사용하였다. 유효량은 1 kg 체중에 대하여 약 1.0 pfu에서 약 1015 pfu까지일 수도 있다(예컨대, 1 kg 체중에 대하여 약 102 pfu에서 약 1013 pfu). 바이러스는 단일 투여 또는 복수 투여(예컨대, 2회, 3회, 4회, 6회, 또는 그 이상의 투여)로 투여하였다. 복수 투여는 동시에 또는 순차적으로(예컨대, 몇 일 또는 몇 주의 기간 동안) 투여하였다. 변이된 서열을 갖는 바이러스를 이용한 치료는 며칠에서 몇 달까지 또는 질병의 축소가 획득될 때까지 지속하였다.
선택적으로, 제공된 방법은 피험체에 하나 이상의 추가적인 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 제공된 방법은 다른 암 치료, 방사선 치료, 호르몬 치료 또는 화학치료와 조합할 수도 있다. 적절한 추가적인 치료제는 화학요법제, CDK 저해제, 항-염증제, 항생제, 항바이러스제, 면역제, 비타민, 성장인자, 및 호르몬으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함하였고, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 제공된 방법은 선택적으로, 피험체에 알려진 항암 화합물 또는 화학요법제를 투여하는 것을 포함한다. 화학요법제는 5-플루오로우라실; 마이토신 C; 메토트렉사트; 수산화요소, 시클로포스파미드; 다카르바진; 미토산트론; 앤쓰라사이클린(에피루비신 및 독소루비신); 허셉틴 같은 수용체에 대한 항체; 에토포시드; 프레그나좀; 타모시펜 같은 호르몬 치료 및 항-에스트로겐; 인터페론; 방향화효소 저해제; 프로게스테론 제제; 및 LHRH 유사체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. CDK(사이클린-의존성 키나아제) 저해제는 CKD의 기능을 저해하는 제제이다. 제공된 방법 내 사용에 적합한 CDK 저해제는 AG-024322, AT7519, AZD5438, 플라보피리돌, 인디술람, P1446A-05, PD-0332991, 및 P276-00를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다(예컨대 문헌 Lapenna et al., Nature Reviews, 8:547-566 (2009) 참조, 상기 문헌은 본원에 온전한 형태로 병합되어 있음). 제제 및 투여량의 선택은 치료해야 할 주어진 질병에 근거하여 당 업계의 숙련된 이에 의해 즉시 결정할 수 있다. 조합된 투여는 구분된 제형 또는 단일 약학적 제형을 사용한 각각 순서 내 공동투여 및 연속적인 투여를 심사숙고하는데, 바람직하게는 두 가지(또는 모든) 활성 제제가 동시에 이들의 생물학적 활성을 발휘하는 시간 주기가 있다. 제제 또는 조성물의 조합은 동반하여(예컨대, 혼합물로써), 구분되지만 동시에(예컨대, 구분된 정맥 라인으로) 또는 순차적으로(예컨대, 하나의 제제를 먼저 투여하고 이후에 두번째 제제를 투여) 투여할 수 있다. 따라서, 용어 조합은 둘 또는 그 이상의 제제 또는 조합의 동반한, 동시의 또는 순차적인 투여에 사용하였다.
본원에 교시된 방법에 따라, 피험체는 본원에 제공된 하나 이상의 제제의 유효량을 투여하였다. 용어 유효량 및 유효 투여량은 상호교환적으로 사용하였다. 용어 유효량은 바람직한 생리적 반응(예컨대, 암세포 살상)을 생성하는데 필요한 어떤 양으로 정의하였다. 치료용 제제는 전형적으로 매일 약 0.001 ㎎/㎏ 내지 약 1000 ㎎/㎏의 초기 투여량에서 투여하였다. 약 0.01 ㎎/㎏ 내지 약 500 ㎎/㎏, 또는 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 200 ㎎/㎏, 또는 약 1 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏, 또는 약 10 ㎎/㎏ 내지 50 ㎎/㎏ 범위의 투여량을 사용할 수 있다. 하지만, 피험체의 요구, 치료하려는 상황의 심각성, 및 사용하려는 화합물에 따라 투여량은 달라질 수 있다. 예를 들어, 투여량은 특별한 피험체 내 진단된 암의 형태 및 단계를 고려하여 경험적으로 결정할 수도 있다. 제공된 방법의 내용에서, 피험체에 대해 투여된 투여량은 시간이 지나서 환자 내 유익한 치료적 반응에 영향을 주기에 충분해야 한다. 특별한 상황에 대한 적절한 투여량의 결정은 의사의 숙련도 내에 있다. 따라서, 제제 투여에 대한 유효량과 계획은 당 업계의 숙련된 이에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 투여에 대한 투여량 범위는 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상이 영향을 받는(예컨대, 감소 또는 지연) 원하는 효과를 생성하기에 충분할 정도로 넓다. 투여량은 같은 원치않는 교차-반응, 과민성 반응, 및 기타 같은 종류의 것 같은 충분히 부정적인 부작용을 일으킬 정도로 넓지 않아야 한다. 일반적으로, 투여량은 나이, 상태, 성별, 질병의 형태, 질병 또는 장애의 정도, 투여 경로, 또는 다른 약제가 치료계획 내 포함되어 있는지의 여부에 따라 달라질 것이고, 투여량은 당 업계의 숙련된 이에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 사용 금지 사유의 사건 내 개별적인 내과의사에 의해 조정될 수 있다. 투여량은 다양할 수 있고 하루 또는 며칠 동안 매일 한 번 또는 그 이상의 투여 방식으로 투여할 수 있다. 안내지침은 약학적 생성물의 주어진 종류에 관한 적절한 투여량에 대하여 문구 내에서 확인할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 치료(treatment, treat 또는 treating)는 단백질 분해효소의 발현에 의해 특징이 되는 질병 또는 상태의 하나 이상의 증상에 대한 효과, 또는 단백질 분해효소의 발현에 의해 특징이 되는 질병 또는 상태의 증상에 대한 효과를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 따라서, 개시된 방법 내에서, 치료는 확립된 질병, 상태, 또는, 질병 또는 상태의 증상의 심각성에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 감소에 관한 것이다. 예를 들어, 질병 치료에 대한 방법은 대조군에 비교하여 피험체 내 질병의 하나 이상의 증상에서 10% 감소가 있다면 치료로 간주하였다. 따라서 감소는 본래 수준 또는 대조군 수준에 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 또는 어떠한 퍼센트 감소가 될 수도 있다. 치료는 반드시 질환, 상태, 또는 질환 또는 상태의 치유, 또는 완전한 제거에 관한 것은 아니라는 것을 이해할 것이다. 추가적으로, 본원에 사용된 바와 같이, 감소, 축소, 또는 저해에 대한 언급은 대조군 수준에 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상의 변화를 포함한다.
키트
본원에서 제공된 변형된 아데노바이러스 및/또는 변형된 아데노바이러스를 포함하는 조성물의 하나 이상을 포함하는 키트를 제공하였다. 따라서, 하나 이상의 변형을 포함하는 E1A 폴리펩티드 및/또는 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf6/7 폴리펩티드 및/또는 아데노바이러스를 포함하는 조성물로 구성된 아데노바이러스(Ads)를 포함하는 키트를 제공하였다. 선택적으로, 아데노바이러스는 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf1 폴리펩티드를 추가적으로 포함한다. 또한 하나 이상의 변형을 포함하는 E1A 폴리펩티드 및 하나 이상의 변형을 포함하는 E1orf1 폴리펩티드 및/또는 아데노바이러스로 구성된 조성물을 포함하는 아데노바이러스(Ads)를 포함하는 키트를 제공하였다. 선택적으로, 조성물은 약학적 조성물이다. 선택적으로, 키트는 하나 이상의 부가적인 치료용 제제를 추가적으로 포함한다. 선택적으로, 치료용 제제는 화학요법제이다. 본원에서 제공된 약학적 조성물의 하나 이상 및 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트를 제공하였다. 선택적으로, 키트는 Rb/p16 종양 억제 경로 결핍 세포 내에서 선택적으로 복제하는 아데노바이러스를 포함하는 조성물의 1회 또는 그 이상의 투여에 대한 유효량을 포함한다. 선택적으로, 아데노바이러스는 상향조절된 E2F 활성을 갖는 세포에서 선별적으로 증식한다. 선택적으로, 조성물은 용기(예컨대, 병 또는 패킷) 내에 있다. 선택적으로, 키트는 예를 들어, 주사기, 바늘, 튜빙, 카테터, 패치 및 기타 같은 종류의 것 같은 조성물 투여 방법을 포함한다. 키트는 또한 사용 전에 멸균 및/또는 희석을 필요로 하는 제형 및/또는 재료를 포함한다.
개시된 방법 및 조성물에 대하여 사용할 수 있는, 개시된 방법 및 조성물과 같이 사용할 수 있는, 개시된 방법 및 조성물의 제조에 사용할 수 있는 재료, 조성물, 및 구성요소 및 개시된 방법 및 조성물의 생성물이 개시되어 있다. 이러한 재료 및 다른 재료가 본원에 개시되어 있고, 이러한 재료들의 조합, 부분집합, 상호작용, 그룹 및 기타 내용이 각각의 다양한 개별 조합 또는 집단 조합의 특이한 참조 및 이러한 화합물의 순열이 명쾌하게 개시되지 않는 반면, 각각은 본원에 특별히 고려되어 상세하게 기재된다는 것이 개시된다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 방법이 개시되고, 논의되고, 다수의 분자를 만들 수 있는 다수의 변이가 논의된다면, 각각의 조합, 모든 조합, 방법의 순열, 및 가능한 변이는 바람직하게는 반대로 지정되지 않으면 특별히 고려해야 한다. 비슷하게, 이러한 것의 부분집합 또는 조합 또한 특별히 고려되어 개시되었다. 이러한 개념은 이러한 공개사실의 모든 측면에 대하여 적용하였고, 상기 공개사실은 개시된 조성물을 사용한 방법 내 단계를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 실시할 수 있는 다양한 추가적인 단계가 있다면, 이러한 추가적인 단계 각각은 어떠한 특별한 방법 단계 또는 공개된 방법 단계의 조합을 사용하여 실시할 수 있고, 그러한 각각의 조합 또는 조합의 부분집합은 특별히 고려하고 공개를 심의해야 한다는 것이 이해되고 있다.
본원에 인용된 공개문헌 및 문헌의 인용에 사용된 재료는 온전한 형태로 참고문헌에 의해 본원 내 구체적으로 병합되어 있다.
다수의 실험예가 개시되어 있다. 그럼에도 불구하고, 다양한 변화가 만들어 질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 다른 실험예들도 청구항의 범위 내에 있다.
실시예
실시예 1. 조절해제된 E2F 활성을 갖는 종양 세포 내에서 선택적으로 복제되는 종양살상형 아데노바이러스
변형된 아데노바이러스는 하기의 참고문헌에 따라 제조하였다. 게이트웨이 DONR 벡터를 사용하였다. 인간 Ad5 DNA로부터, E1 모듈을 PCR에 의해 획득하였고 상기 E1 모듈은 SLIC를 사용하여 벡터 pDONR P1P4 내로 삽입하였다. attL1 및 attL4 재조합 부위를 포함하는 pDONR P1P4 백본은 PCR을 사용하여 증폭하였고 SLIC에 의해 Ad5 E1 모듈과 조합하였다. attB5 및 attB3r 재조합 부위가 인접된 생성물을 제조하기 위해 PCR을 사용하여 E3 모듈을 획득하였다. 생성물은 게이트웨이 BP 반응에 의해 pDONR P5P3r 벡터로 삽입하였다. attB3 및 attB2 재조합 부위가 인접된 생성물을 제조하기 위해 PCR을 사용하여 E4 모듈을 획득하였다. 생성물은 게이트웨이 BP 반응에 의해 pNOR P3P2 벡터로 삽입하였다. pDONR P5P2 벡터 유래의 attR5-ccdB-Cm(r)-attR2 단편은 PCR을 사용하여 증폭하였고 Adsembly DEST 벡터로 삽입하였다("MultiSite Gateway® Pro Plus", Cat# 12537-100; and Sone, T. et al. J Biotechnol. 2008 Sep 10;136(3-4):113-21 참고). Adsembly 방법은 국제 공개 특허 WO 2012/024351 내에 기재되어 있고, 이는 참고문헌으로서 온전한 형태로 본 출원서에 병합하였다.
벡터 백본은 3가지 다른 소스로부터 유래한 부분들로 구성되어 있다. Amp(r) 카세트 및 lacZ 유전자는 플라스미드 pUC19로부터 증폭하였다. Amp(r) 카세트 및 lacZ 유전자는 플라스미드 pSB3K5-I52002로부터 획득된 p15A 복제 개시점 및 BioBricksiGEM 2007 파트 분포의 일부와 조합하였다. 낮은 복제수(10-12)에서 플라스미드를 유지하는 p15A 개시점은 E1 독성을 낮추는데 필요하다. 최종적으로, 자기-절제 바이러스를 만들기 위해, 제한효소 ISce I에 대한 포유동물 발현 카세트는 플라스미드 pADZ5-CV5-E3+로부터 PCR에 의해 증폭하였다. 상기 카세트는 벡터 백본에 클로닝하여 p15A-SceI으로 명명된 벡터를 제조하였다. 상기 벡터는 유전체 어셈블리를 개시하기 위해 사용된 벡터이다. 유전자 모듈은 야생형 Ad5 바이러스 또는 플라스미드 pAd/CMVV5/DEST(Invitrogen)로부터 정제된 어느 하나의 DNA로부터 모두 획득하였다.
인간 Ad5에 대한 DEST 벡터에 관하여, E2 및 L3 모듈은 3-단편 SLIC에 의해 플라스미드 p15A-SceI로 삽입하였다. attR5 및 attR2에 의해 인접된 ccdB 및 Chlor(r)을 발현하는 카운터셀렉션 마커는 플라스미드 pDONR P5P2로부터 PCR을 이용하여 획득하였다. 2차 카운터셀렉션 마커는 벡터 pDONR P1P4로부터 PCR을 이용하여 획득하였다. 2개의 카운터셀렉션 마커들은 DEST 벡터를 생성하기 위한 E2 및 L4 모듈의 말단에 작용하는 독특한 제한효소를 사용하여 절단한 후에 p15A-SceI E2-L4의 좌측 및 우측 측면에 삽입하였다.
Amp(r) 카세트:플라스미드 pUC19에 대하여, p15A 기원:플라스미스 pSB3K5-I52002는 BioBricksiGEM2007 부분 분포의 일부이다. 아데노바이러스 유전자 모듈에 관하여, DNA는 Ad5 입자 또는 플라스미드 pAd/CMV/V5/DEST(Invitrogen)로부터 정제하였다. DONR 벡터 pDONR P1P4, P5P2, P5P3R, P3P2는 Jon Chesnut(Invitrogen)로부터 제공받았다.
PCR에 관하여, 모든 PCR은 Phusion 효소(NEB)를 사용하여 실시하였다. Ad5로부터 아데노바이러스 유전자 모듈을 획득하기 위한 PCR은 1x HF 완충액, 각각의 dNTP 200μM, 각각의 프라이머 0.5μM, 및 10ng 템플릿을 사용하여 실시하였다. E2-L2 모듈에 대하여, 3% DMSO를 추가하였다. 템플릿은 플라스미드 pAd/PL-DEST(Invitrogen; E2-L2, L3-L4 및 E4 모듈을 위해) 또는 Ad5 게놈 DNA(E1 및 E3 모듈을 위해)이다. PCR 조건은 하기와 같다. E2-L2 및 L3-L4: 98℃ 30초 - 98℃ 10초, 65℃ 30초(2 사이클마다 온도 1℃ 감소), 72℃ 7분 10사이클 - 98℃ 10초, 60℃ 30초, 72℃ 8분 29 사이클 - 72℃ 10분 - 4℃ 유지. E3: 98℃ 30초 - 98℃ 10초, 70℃ 30초(매 사이클마다 온도 0.5℃ 감소), 72℃ 2분 30초 10사이클 - 98℃ 10초, 68℃ 30초, 72℃ 2분 30초 25 사이클 - 72℃ 10분 - 4℃ 유지. E4: 98℃ 30초 - 98℃ 10초, 63℃ 30초(매 사이클마다 온도 0.5℃ 감소), 72℃ 2분 6 사이클 - 98℃ 10초, 60℃ 30초, 72℃ 2분 29 사이클 - 72℃ 5분 - 4℃ 유지.
정제된 바이러스로부터 바이러스 게놈 DNA 획득에 관하여, 10mM Tris pH8, 5mM EDTA, 200mM NaCl, 및 0.2% SDS를 포함하는 300㎕ 용해 완충액에 정제된 바이러스는 100㎕까지 추가하였다. 혼합물은 60℃에서 5분간 배양하였고, 이후에 단백질 분해효소 K 스톡(~20㎎/㎖) 5㎕를 추가하였고, 이후에 60℃에서 1시간 동안 배양하였다. 샘플은 이후에 얼음에 5분간 방치하였고, 15000g에서 15분간 회전시켰다. 상층액은 제거하고 동일 부피의 이소프로판올을 추가하여 잘 혼합하였고, 15분간 15000g 4℃에서 회전시켰다. 펠릿은 70% 에탄올로 세척하였고 4℃에서 15분간 재회전시켰다. 펠릿은 건조시켜서 재부유시켜서 사용하였다.
SLIC에 관하여, 선형 단편은 핵산말단분해효소를 상온에서 20분간 20㎕ 반응물(50mM Tris pH8, 10mM MgCl2, 50㎍/㎖ BSA, 200mM Urea, 5mM DTT, 및 0.5㎕ T4 DNA 중합효소)에서 처리하였다. 반응은 0.5M EDTA 1㎕를 추가하여 중지시켰고, 이후에 75℃에서 20분간 배양하였다. 그리고 나서 새로운 튜브 내 약 20㎕ 부피가 되도록 동량의 T4-처리한 DNA를 혼합하였다. 2 단편을 조합한 SLIC에 대하여, 각 반응물 10㎕를 사용하였다. 3 단편을 조합하는 SLIC에 대하여, 각 반응물 7㎕를 사용하였다. 단편들은 65℃까지 10분간 가열하여 어닐링하였고, 이후에 천천히 냉각하여 매 5초마다 온도 0.5℃ 감소시켜서 25℃까지 감소시켰다. 어닐링 후에, 반응물 5 ㎕는 형질전환시켜서 클론을 스크리닝하였다.
AdSlicR에 대하여, 3-단편 SLIC 반응은 T4-처리한 p15A-SceI(PCR에 의해 선형화된) 100ng, 및 E2 및 E3 모듈(각각의 진입 벡터로부터 PCR에 의해 획득된) 각각 300ng을 사용하여 실시하였다. 이는 벡터 p15A-SceI E2-L4를 생성하였다. p15A-SceI E2-L4 5㎍은 SwaI으로 절단하였고 Qiagen QiaexII를 사용하여 젤 정제를 실시하였다. E3 및 E4 모듈은 각각이 진입 벡터로부터 PCR에 의해 획득하였다. 선형화된 벡터(450ng) 및 PCR 생성물(200ng) 각각은 T4 DNA 중합효소를 처리하였고 벡터 150-200ng 및 각각의 모듈 PCR을 100ng까지 사용하여 SLIC를 통상적으로 실시하였다. 양성 클론을 분리한 후에, 새로운 베터 5㎍은 PacI으로 절단하였고 젤에서 정제하였고, 이후에 E1 PCR 생성물(T4-처리된 100ng)과 새로운 SLIC 반응에서 조합하였다. 이는 게놈 어셈블리를 완성시켰고, 플라스미드는 바이러스를 재구성하기 위한 형질감염을 위해 준비하였다.
E1 및 E4 변이 영역의 제조에 대하여, 각각의 모듈 진입 벡터에 대한 조작을 실시하였다. 벡터 백본을 갖는 E1 모듈은 프라이머를 사용하여 PCR하여 LTCHE 서열(잔기 122-126) 결핍된 생성물을 제조하였고, 이후에 SLIC를 사용하 원형화하여 pENTR-E1-E1A-ΔLXCXE를 생성하였다. 선택적으로, 벡터 백본을 갖는 E1 모듈은 프라이머를 사용한 PCR하여 Y47을 H로, 잔기 C124를 G로 변이 또는 잔기 2-11을 결실시키는 생성물을 제조하여 각각 pENTR-E1-E1A-Y47H, pENTR-E1-E1A-C124G, 또는 pENTR-E1-E1A-Δ2-11를 생성하였다. 이러한 생성물은 추가적인 PCR 변이를 위한 템플릿으로 사용하였고 이러한 변이(pENTR-E1-E1A-Y47H-C124G 및 pENTR-E1- E1A-Y47H-C124G-Δ2-11)의 조합을 생성하였다. 벡터 백본을 갖는 E4 모듈은 프라이머를 사용하여 PCR하여 E4orf6 정지 코돈의 하류의 E4orf6/7-특이적 엑손 서열(297bp)이 결핍된 생성물을 제조하여 pENTR-E4-ΔE4orf6/7을 생성하였다. 이러한 생성물은 또한 프라이머를 사용하는 PCR을 위한 템플릿으로 사용하여 PDZ-결합 모티프 결실 또는 전체 E4orf1 서열 결실된 생성물(각각 pENTR-E4-ΔE4orf6/7-E4orf1ΔPDZb 및 pENTR-E4-ΔE4orf6/7-ΔE4orf1)을 제조하였다.
변이를 갖는 완전한 바이러스 게놈을 제조하기 위해, 야생형 E3 모듈 및 야생형 E4 또는 변이체 E4 모듈과의 조합한 p15A-SceI E2-L4, 이후에 야생형 E1 또는 변이체 E1과 조합한 p15A-SceI E2-L4를 사용한 AdSlciR을 실시하였다. 야생형 AdSlciR 아데노바이러스는 하기에 나타낸 표 1에 표시하였다.
E1 및 E4 아데노바이러스 내 아데노바이러스 변형
구분 E1 E4
Ad-102 [AdSyn-CO102] 야생형 야생형
Ad-210 [AdSyn-CO210] 야생형 dE4orf6/7
AdSyn-CO283 야생형 E4orf1 dPDZb, dE4orf6/7
AdSyn-CO284 야생형 dE4orf1, dE4orf6/7
Ad-189 [AdSyn-CO189] E1A dLXCXE 야생형
Ad-181 [AdSyn-CO181] E1A dLXCXE dE4orf6/7
AdSyn-CO285 E1A dLXCXE E4orf1 dPDZb, dE4orf6/7
AdSyn-CO286 E1A dLXCXE dE4orf1, dE4orf6/7
AdSyn-CO235 E1A C124G 야생형
AdSyn-CO287 E1A C124G dE4orf6/7
AdSyn-CO288 E1A C124G E4orf1 dPDZb, dE4orf6/7
AdSyn-CO289 E1A C124G dE4orf1, dE4orf6/7
AdSyn-CO236 E1A d2-11 야생형
AdSyn-CO290 E1A d2-11 dE4orf6/7
AdSyn-CO291 E1A d2-11 E4orf1 dPDZb, dE4orf6/7
AdSyn-CO292 E1A d2-11 dE4orf1, dE4orf6/7
AdSyn-CO238 E1A Y47H, C124G 야생형
AdSyn-CO293 E1A Y47H, C124G dE4orf6/7
AdSyn-CO294 E1A Y47H, C124G E4orf1 dPDZb, dE4orf6/7
AdSyn-CO295 E1A Y47H, C124G dE4orf1, dE4orf6/7
AdSyn-CO244 E1A Y47H, C124G, d2-11 야생형
AdSyn-CO296 E1A Y47H, C124G, d2-11 dE4orf6/7
AdSyn-CO297 E1A Y47H, C124G, d2-11 E4orf1 dPDZb, dE4orf6/7
AdSyn-CO298 E1A Y47H, C124G, d2-11 dE4orf1, dE4orf6/7
바이러스 생산, 농축 및 정제에 관하여, 293 E4 세포는 감염성 입자로 감염시켰고, CPE가 명백한 감염 후 대략 48시간에 세포를 수집하여 500g에서 5분간 원심분리에 의해 분리하였다. 세포는 TMN 완충액(10 mM TrisCl pH 7.5, 1 mM MgCl2, 150 mM NaCl) 내에서 3회의 동결융해에 의해 용해시켰고, 세포 잔해물은 3000g 및 3500g의 2라운드 원심분리에 의해 제거하였다. 염화세슘 구배(0.5g/㎖)를 사용하여 37000g에서 18-24시간 동안 초원심분리하여 바이러스 입자의 띠를 형성시켰다. 띠를 모아서 10% 글리세롤을 포함하는 TMN 완충액 내 10k Slide-A-Lyzer® 투석 카세트(Thermo Scientific)에서 하룻밤 동안 4℃에서 투석을 실시하였고, 이후에 -80℃에서 저장하였다. 항-아데노바이러스 5형 1차 항체(ab6982, Abcam), 및 면역적으로 순수한(ImmunoPure) 항-토끼 알카라인 탈인산효소 2차 항체(Thermo Scientific)을 이용하는 세포-기반의 연속 희석 감염 ELISA에 의해 적정된 야생형 표준에 대하여 정제된 바이러스의 역가를 결정하였다.
1차의 인간 작은 기도 상피 세포(SAEC)의 감염 중 아데노바이러스 단백질 발현의 측정에 대하여, 12-웰 플레이트 내 휴지기 SAEC는 MOI 30 아데노바이러스로 감염시켰고, 배지는 감염 후 4시간에 세포에 대해 교환하였다. 감염 후 24, 36, 및 48시간에, 세포는 냉각 PBS로 세척하였고, 500㎕ 냉각 PBS 내에 회수하였고, 4℃에서 5분 동안 5000rpm에서 펠릿화하였고, 재빨리 결빙시켜서 -80℃에 보관하였다. 세포 펠릿은 컵 소니케이터(4℃, 60 진폭에서 2x60 펄스) 내 초음파분해를 포함하여, RIPA 완충액(100 mM Tris pH7.4, 300 mM NaCl, 2mM EDTA, 2% Triton X, 2% deoxycholate, 2 mM NaF, 0.2 mM NaVO4, 2 mM DTT) 내 1시간 동안 4℃에서 용해시켰다. 세포 잔해는 13000rpm에서 20분간 4℃에서 원심분리하여 펠릿화하였다. 단백질 농도는 Bio-rad's DCTM 단백질 시험법에 의해 결정하였고, 샘플의 단백질 농도는 정상화시켰다(normalize). 젤 전기영동은 제조사의 프로토콜에 따라 Life Technologies' Novex® NuPAGE® SDS-PAGE 젤을 사용하여 실시하였다. 단백질은 웨스턴 블롯에 의해 탐지하였다. 단백질을 탐지하기 위해 사용된 1차 항체는 하기와 같다: E1A (ab28305, Abcam), β-액틴 (A5441, Sigma), Ad5 후기 단백질 (ab6982, Abcam), 사이클린 A (Ab-6 6E6, NeoMarkers), 사이클린 B (Ab-3 GNS1, NeoMarkers). Life Technologies사의 Alexa Fluor® 항체는 2차 항체로 사용하였고, 신호는 LI-책 ODYSSEY® 장치를 사용하여 탐지하였다. 폐 암세포주 A549 세포 및 인간의 정상 성상세포(NHA)의 감염 중 아데노바이러스 단백질 발현 측정에 관하여, 12-웰 플레이트의 컨플루언트(confluent) 세포를 MOI 10인 아데노바이러스로 감염시켰고 SAEC에 관해서 기재된 바와 유사하게 실시하였다. 교아세포종 U87 세포, 교아세포종 U118 세포, 인간 혈관 내피 세포(HuVEC) 및 인간 섬유아세포의 감염 중 아데노바이러스 단백질 발현의 측정에 관하여, 12-웰 플레이트 내 컨플루언트 세포는 MOI 20인 아데노바이러스로 감염시켰고, SAEC에 관해서 기재된 바와 같이 유사하게 실시하였다.
세포 사이클 분석에 관하여, 세포는 단백질 발현에서와 동일한 MOI를 사용하여 감염시켰다. 세포는 플레이트로부터 트립신을 사용하여 떼어내었고, 냉각 PBS를 사용하여 세척하였다. 세포는 500㎕ 냉각 PBS를 사용하여 재부유시켰고, pH2.8인 냉각된 70% 에탄올/15mM 글라이신 3㎖을 사용하여 고정시켰다. 샘플은 4℃에 보관하였고, FACS 사용 전에 세포는 펠릿화하였고, 냉각 PBS로 세척하여 프로피디움 요오드화물(PI)/RNase A 용액 내 재부유시킨 후, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 각각의 샘플에 대하여 최소한 10K 사건을 수집하였다.
감염으로부터 아데노바이러스 파열(burst, 버스트)에 관하여, 12-웰 플레이트 내 휴지기 세포는 MOI 1 또는 10인 아데노바이러스로 감염시켰고, 배지는 감염 후 4시간에 세포에 대하여 교환하였다. 웰로부터의 배지는 감염-후 48시간 및 72시간에 수집하였고, 급속 냉동한 후 녹여서 4℃에서 5분간 7K rpm에서 원심분리하여 세포 잔해를 펠릿화하였다. 배지의 부피를 측정하였고, 급속 냉동하여 -80℃에 보관하였다. 배지 내 바이러스의 역가는 항-아데노바이러스 5형 1차 항체(ab6982, Abcam) 및 면역적으로 순수한 항-토끼 알카라인 탈인산효소 2차 항체(Thermo Scientific)을 이용하여 세포-기반의 연속 희석 감염 ELISA에 의해 역가된 야생형 표준에 대하여 결정하였다.
세포 생존 시험에 관하여, 세포는 96-웰 플레이트에 분주하였고, MOI 30에서 연속 희석에 의해 3회 반복 감염시켰다. MOI 10 감염된 웰 내 완전한 CPE가 있는 7-10일에 감염 후에, 대사 활동은 제조사의 설명서에 따라 세포 증식 제제 WST-1(Roche)를 사용하여 측정하였다.
자료는 도 1-16에 나타내었다. 상기 논의된 바와 같이, 암은 추가적인 치료 방식을 필요로 하는 문제성 질병이 되고 있다. 그러한 하나의 치료는 종양살상형 바이러스를 포함한다. 종양살상형 바이러스 암 치료법의 일반적인 논리를 도식적으로 나타내는 도 1을 참고해야 한다. 아데노바이러스는 종양살상형 바이러스로서의 사용에 대하여 연구되는 바이러스 중의 한 가지이다. 도 2는 아데노바이러스(Ad)의 구조적 특징 및 박스와 표지된 유전자 내 전사 유닛을 포함하는 아데노바이러스 게놈의 맵을 도식적으로 나타낸 것이다. 망막아종(Rb) 종양 억제 신호전달 경로 기능은 Rb의 직접적인 변이, 변이/메틸화에 의해 CDK-저해제 p16 기능의 손실 또는 CDK/사이클린의 증폭에 의해 대부분의 모든 인간의 암 내에 손실되어 있다. 일반적인 비-분열세포 내에, Rb는 저인산화 상태로 남아 있고 표적 프로모터에서 전사 인자 E2F에 결합하여, 염색질-재구성 복합체를 끌어들여서 히스톤-변이 활성 뿐만 아니라 E2F 전사촉진 도메인을 가림으로써 전사를 억제하고 있다. 세포 주기의 G1-S 전이 중에, CDKs는 E2F 억제를 완화시키는 Rb를 인산화시킨다. 아데노바이러스는 Rb 종양 억제 신호전달 경로를 비활성화시켜서 세포가 복제증식하고 바이러스 게놈을 재생하도록 강요하는 초기 바이러스 종양단백질을 발현시킨다. 아데노바이러스 E1A는 LXCXE 모티프에 의해 부분적으로 Rb에 결합하여 자체의 종양 억제 활성의 조절을 손상시켰다. 그리하여 E1A 내 LXCXE 모티프의 결실은 Rb 비활성화를 제거하여, 선택적으로 복제하는 바이러스(ONYX-838)를 만든다고 제안하고 있다. 하지만, 참고문헌(Johnson et al., Cancer Cell, 1(4):325-337 (2002))는 Ad E1A LXCXE 변이는 S-상 진입, 바이러스 DNA 복제 및 후기 단백질 발현을 억제하기에 충분하지 않다는 증거를 제시하였고, 이는 본 발명에 기재된 실시예로부터의 결과에 상응하였다. E1A 변이체의 Rb 선택성은 논란이 될 지라도, 이러한 변이는 악성 뇌종양에 대한 임상 II 단계 시험으로 이동하는 종양살상형 바이러스(DNX-2401)에 대한 기본으로서 정방향으로 진행되고 있다. 높은 Rb-선택성을 얻기 위한 시도에서, 아데노바이러스 E1 및 E4 구역에 대한 프로모터를 E2F 프로모터로 대체하고, ONYX-411을 생성하기 위한 E1A ΔLXCXE 모티프와 조합하도록 아데노바이러스를 제조하였다(문헌 Johnson et al., Cancer Cell, 1(4):325-337 (2002); and Dubensky et al., Cancer Cell, 1(4):307-309 (2002) 참조). 이러한 바이러스를 시험하기 위해, 암 및 1차 인간 세포는 야생형 바이러스, ONYX-838(E1A LXCXE) 또는 ONYX-411로서 감염시켰고 감염 후 다양한 시간대에 회수하였다(도 3). 도 3에 나타낸 바와 같이, ONYX-838은 종양 및 1차 폐 상피 세포에서 분별없이 증식하였다. 아데노바이러스스 E1A, E1B 및 E4 구역의 세포내 E2F 조절과 E1A ΔLXCXE를 조합한 ONYX-411(도 2 참조)은 종양 세포 및 정상세포에 대하여 선택적인 증식을 나타내었다(문헌 Johnson et al., Cancer Cell 1(4):325-337 (2002) 참조). 하지만, E2F 프로모터는 재조합되고, 또한 종양 세포 내 야생형 바이러스 수준에 대하여 증식을 제한하였다. 따라서, 이러한 바이러스는 여전히 문제가 되고 있다.
본원에 기재된 바와 같이, E1A에 의한 Rb 억제로부터 E2F 방출과는 별로도 추가적인 아데노바이러스 단백질 E4orf6/7이 있는데, 이는 세포 프로모터 및 아데노바이러스 프로모터에서 E2F 단백질을 추가적으로 안정화시킨다. 또한, E1A 및 E4orf6/7은 E2F-매개성 전사를 유발하여 S-기 개시를 일으키는데, 동시에 바이러스 DNA 게놈을 증폭시킨다. 따라서, 기능성 Rb가 결핍된 종양 세포에 대한 선택적인 종양살살형 바이러스 치료법인 E1A 변이 및 E4orf6/7 변이를 모두 포함하는 아데노바이러스를 본원에서 제공하였다. 바람직하게는, E1A/E4orf6/7 내 화합물 변이를 조작하여 변이가 종양 세포 내 선택적으로 증식하는지 1차 세포 내에서 증식하는지의 여부를 결정하였다. 이러한 변이의 조합이 암에 대한 효과적이고, 자가-증폭적인 치료법이 된다고 제안하였다. 도 4A 및 4B는 조절되지 않는 증식을 일으키기 위해 종양 변이들 및 아데노바이러스 초기 단백질이 합쳐져서 Rb 신호전달경로를 활성화시키는 것을 나타내는 모식도이다. A) Rb-종양 억제 기능의 손실을 유발하는 통상적인 변이들. B) 아데노바이러스 단백질이 세포가 S-기에 진입하도록 직접적으로 Rb 및 E2F를 조절해제하였다. 도 5는 Rb-E2F 세포 주기 체크포인트를 조절해제하는 다양한 단백질을 아데노바이러스가 암호화한다는 것을 도식적으로 나타낸 것이다. 아데노바이러스 E1A는 세포내 Rb에 결합하고, E2F가 방출되어 전사를 활성화하였다. 아데노바이러스 E4orf6/7은 프로모터 상에서 E2F를 안정화시켜서 하류의 유전자 발현을 향상시켰다. 도 6은 본 발명의 변이체 아데노바이러스의 구조를 모식적으로 나타내는 것이다. 야생형 Ad5 게놈은 전사 단위에 따라 분리되었고, 모듈 각각은 다른 플라스미드 내에 배치되었다. 변이는 모듈 플라스미드 상에서 만들어졌고, AdSlicR을 사용하여 모듈은 재조합 아데노바이러스의 생성을 가능하게 하는 완전한 게놈으로 재구성되었다. 도 7은 E4orf6/7 결실을 도식적으로 나타낸 것이다. 2개의 엑손은 E4orf6/7을 암호화하였다. E4orf6 및 E4orf6/7은 동일한 개시 코돈을 사용하였고 58개 아미노산 N-말단 잔기를 공유하였다. E4orf6/7 전사체는 E4orf6 정지 코돈 이후에 즉시 스플라이싱되었다. 정지 코돈을 포함하는 E4orf6/7의 전체 2차 엑손은 결실되었다. 도 7A는 야생형 E4 영역을 나타내었다. 도 7B는 E4 내 E4orf6/7 영역을 결실시킨 결과를 나타내었다.
상기 바이러스를 시험하기 위해, 세포는 목 (ΔE1), Ad-102 (AdSyn-CO102) (야생형), Ad-181 (AdSyn-CO181) (E1A ΔLXCXE/ΔE4orf6/7), Ad-189 (AdSyn-CO189) (E1A ΔLXCXE), 또는 ONYX-838 (E1A ΔCR2)로 감염시켰다. ONYX-838은 또한 E1A의 CR2 도메인 내 LXCXE가 결실되었다. 휴지기 인간 1차 작은 기도 상피 세포(SAEC)는 MOI 10에서 감염시켰다. Ad-102(AdSyn-C0102)는 감염 중 후기에 E1A 수준의 예상된 감소를 나타내었다(도 8A). 유사하게 Ad-189(AdSyn-C0189) 및 ONYX-838은 감염 중 후기에 E1A 레벨 감소를 나타내었지만, 더 이른 시간대에는 더 강한 발현을 나타내었다. Ad-181(AdSyn-C0181)은 감염 내내 E1A의 더 강하고 연속적인 발현을 나타내었는데, 이는 아데노바이러스 생활주기를 통한 진행 실패의 표시이다. 컨플루언트 폐 선암 세포(A549)는 MOI30에서 감염시켰다. 모든 감염은 감염 중 후반부에 E1A 레벨의 예상된 감소를 나타내는데, 이는 전형적인 아데노바이러스 생활주기의 진행의 표시이다(도 8B). 아데노바이러스 후반 단백질 및 변이체 아데노바이러스의 사이클린 발현에 대한 테스트는 도 9에 나타내었다. 후반 구조 단백질의 발현에서 명백한 결실이 없고, 사이클린은 모든 감염된 A549 샘플 내에 존재하여 남아 있었다. 감염된 SAEC 및 A549 세포의 DNA 복제는 도 10에 나타내었다. 어떠한 DNA 복제 결핍도 어느 하나의 변이체 바이러스 감염에서 명백하지 않았다. 도 11은 감염된 SAEC 및 A549로부터의 파열된 아데노바이러스를 나타내었다. 이러한 파열 시험을 이용한 이러한 시간대에서 Ad-210(AdSyn-C0210)가 예외적인데, 바이러스 복제의 결핍은 없었다. 도 12는 감염 7일 후의 감염된 SAEC 및 A549의 세포 생존을 나타내었다. 상기 바이러스 중에서 야생형에 비해 변이체 바이러스에 의한 세포 죽음에서의 결핍이 나타나지 않았다. 도 13은 변이체 바이러스는 도 14 및 도 15가 신경교아종 U87 및 U118 세포 각각에서 복제 결핍을 갖지 않음을 나타내는 정상적인 인간 별아교세포(NHA) 내 억제된 감염을 갖는 것을 나타내었다.
따라서, 이러한 결과는 야생형 및 E1AΔCR2 바이러스와 대조적으로 E1AΔCR2/ΔE4orf6/7 및 ΔE4orf6/7 바이러스는 캡시드 단백질 발현의 결핍, E2F 표적 유전자-사이클린 A 및 B의 유도 실패, S 기 진입 및 바이러스 복제 유발의 실패에 의해 검증된 바와 같이 1차 세포 내에서 부실하게 복제된다는 것을 보여 준다(도 9, 10 및 11 참조). 대조적으로, 이러한 바이러스는 A549 세포 및 일련의 종양 세포주 내에서 야생형(WT) 바이러스 레벨에 맞게 증식하였다. 따라서, 제공된 아데노바이러스는 선택적인 암 치료제이다.
E4orf1(표 1 참조) 내 변이를 포함하는 더 큰 세트의 변이체 바이러스의 복제 특이성에 대한 결과는 도 17-22에 나타내었고 도 23에 요약하였다. 도 17은 감염 10일 후 감염됨 1차 정상 인간 벌아교세포(NHA)의 세포 생존성을 나타내는 그래프이다. 도 18은 감염 9일 후에 감염된 휴지기 정상 작은 기도 상피세포(SAEC-hTERT)의 세포 생존성을 나타내는 그래프이다. 도 19는 감염 10일 후에 감염되어 증식중인 SAEC-hTERT 세포의 세포 생존성을 나타내는 그래프이다. 도 20은 감염된 인간 폐 선암(A549)의 세포 생존성을 나타내는 그래프이다. 도 21은 감염 7일 후 감염된 인간 유방암 세포(MDA MB 231)의 세포 생존성을 나타내는 그래프이다. 도 22는 감염 7일 후 감염된 신경고아종 세포(U87)의 세포 생존성을 나타내는 그래프이다. 도 23은 감염 7일 후에 감염된 1차 NHA, SAEC-hTERT(휴지기), SAEC-hTERT(증식중), A549, MDA MB 231 및 U87 세포에 대한 세포 생존성 시험의 정량결과를 나타내는 열지도 표이다. 이러한 자료는 E1A 및 E4orf6/7의 다양한 변이의 조합은 결과적으로 결핍된 Rb 종양 억제 경로를 갖는 암 세포 내에서 특이적으로 증식하는 선택적인 종양살상형 아데노바이러스가 된다는 것을 나타내었다.
구현예
구현예 1. 하나 이상의 변형을 포함하는 E1A 폴리펩티드 및 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf6/7 폴리펩티드를 포함하는 아데노바이러스.
구현예 2. 구현예 1에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 E1A의 Rb 결합 부위 내 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 3. 구현예 1에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 2개의 Rb 결합 부위를 포함하고, 상기 E1A 폴리펩티드는 2개의 Rb 결합 부위 모두에서의 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 4. 구현예 1에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 120-130의 하나 이상에서 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 5. 구현예 1에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 122-126의 하나 이상에서 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 6. 구현예 1-5 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 35-55의 하나 이상에서 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 7. 구현예 1-6 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 37-49의 하나 이상에서 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 8. 구현예 1-7 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 결실을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 9. 구현예 8에 있어서, 상기 결실은 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 122-126의 결실인 아데노바이러스.
구현예 10. 구현예 8에서, 상기 결실은 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 2-11의 결실인 아데노바이러스.
구현예 11. 구현예 1에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 결실 ΔLXCXE를 포함하는 아데노바이러스.
구현예 12. 구현예 1-11 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 하나 이상의 치환을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 13. 구현예 12에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 잔기 Y47, 잔기 C124 또는 잔기 Y47 및 C124 둘다에서 치환을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 14. 구현예 12에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 Y47H 치환을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 15. 구현예 12에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 C124G 치환을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 16. 구현예 12에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 Y47H 및 C124G 치환을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 17. 구현예 12-16 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 아미노산 잔기 2-11의 결실을 더 포함하는 아데노바이러스.
구현예 18. 구현예 1에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 E1A의 아미노산 잔기 122-126의 결실 및 잔기 Y47에서의 치환을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 19. 구현예 1-18 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 서열번호 1을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 20. 구현예 1-18 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 서열번호 2를 포함하는 아데노바이러스.
구현예 21. 시험에 1-20 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E4orf6/7 폴리펩티드는 E4orf6/7 엑손 중 하나 또는 둘다에서 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 22. 구현예 1-20 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E4orf6/7 폴리펩티드는 E4orf6/7 엑손 중 하나 또는 둘다의 결실을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 23. 구현예 1-22 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E4orf6/7는 서열번호 3을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 24. 구현예 1-22 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E4orf6/7는 서열번호 4를 포함하는 아데노바이러스.
구현예 25. 구현예 1-24 중 어느 하나의 구현예에서, 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf1 폴리펩티드를 더 포함하는 아데노바이러스.
구현예 26. 구현예 25에서, 상기 E4orf1 폴리펩티드는 하나 이상의 결실을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 27. 구현예 25에서, 상기 E4orf1 폴리펩티드는 E4orf1의 C-말단 영역 내 결실을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 28. 구현예 25에서, 상기 E4orf1 폴리펩티드는 E4orf1 폴리펩티드의 잔기 125-128의 결실을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 29. 구현예 25-28 중 어느 하나의 구현예에서, E4orf1 폴리펩티드는 서열번호 5를 포함하는 아데노바이러스.
구현예 30. 하나 이상의 변형을 포함하는 E1A 폴리펩티드 및 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf1 폴리펩티드를 포함하는 아데노바이러스.
구현예 31. 구현예 30에서, 상기 E4orf1은 하나 이상의 결실을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 32. 구현예 31에서, 상기 E4orf1 폴리펩티드는 E4orf1의 C-말단 영역에서 결실을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 33. 구현예 31에서, 상기 E4orf1 폴리펩티드는 E4orf1 폴리펩티드의 잔기 125-128의 결실을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 34. 구현예 30-33 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 E1A의 Rb 결합 부위 내 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 35. 구현예 34에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 2개의 Rb 결합 부위를 포함하고 상기 E1A 폴리펩티드는 2개의 Rb 결합 부위 모두에서 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 36. 구현예 30-33 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 120-130의 하나 이상에서 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 37. 구현예 30-33 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 122-126의 하나 이상에서 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 38. 구현예 30-33 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 35-55의 하나 이상에서 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 39. 구현예 30-33 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 37-49의 하나 이상에서 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 40. 구현예 30-33 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 결실을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 41. 구현예 40에서, 상기 결실은 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 122-126 결실인 아데노바이러스.
구현예 42. 구현예 40에서, 상기 결실은 E1A 폴리펩티드 아미노산 잔기 2-11의 결실인 아데노바이러스.
구현예 43. 구현예 30-33 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 ΔLXCXE 결실을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 44. 구현예 30-33 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 하나 이상의 치환을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 45. 구현예 44에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 잔기 Y47, 잔기 C124 또는 Y47 및 C124 둘다에서의 치환을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 46. 구현예 44에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 Y47H 치환을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 47. 구현예 44에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 C124G 치환을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 48. 구현예 44에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 Y47H 및 C124G 치환을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 49. 구현예 44-48 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 아미노산 잔기 2-11의 결실을 더 포함하는 아데노바이러스.
구현예 50. 구현예 30-33 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 E1A의 아미노산 잔기 122-126의 결실 및 잔기 Y47에서의 치환을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 51. 구현예 30-50 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 서열번호 1을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 52. 구현예 30-50 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E1A 폴리펩티드는 서열번호 2를 포함하는 아데노바이러스.
구현예 53. 구현예 1-52 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 아데노바이러스는 Rb 결핍 세포에서 선택적으로 복제되는 아데노바이러스.
구현예 54. 구현예 1-53 중 어느 하나의 구현예의 아데노바이러스 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
구현예 55. 구현예 54의 약학 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
구현예 56. 구현예 55에서, 하나 이상의 추가 치료제를 더 포함하는 키트.
구현예 56. 구현예 56에서, 상기 치료제는 화학요법제인 키트.
구현예 58. 구현예 1-53 중 어느 하나의 구현예의 아데노바이러스 또는 구현예 54의 약학 조성물을 피험체에 투여하는 것을 포함하는 피험체에서 증식성 질환을 치료하는 방법.
구현예 59. 구현예 58에서, 상기 아데노바이러스 또는 약학 조성물은 정맥내, 혈관내, 수막강내(intrathecally), 근육내, 피하, 복강내, 또는 경구 투여되는 방법.
구현예 60. 구현예 58 또는 구현예 59에서, 하나 이상의 추가 치료제를 피험체에 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
구현예 61. 구현예 60에서, 상기 치료제는 화학요법제인 방법.
구현예 62. 구현예 58-61 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 증식성 질환은 폐암, 전립선암, 대장암(colorectal cancer), 유방암, 갑상선암, 신장암, 간암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
구현예 63. 구현예 58-62 중 어느 하나의 구현예에서, 대략 103 내지 1012 플라크 형성 단위의 아데노바이러스를 피험체에 투여하는 방법.
구현예 64. 구현예 58-63 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 증식성 질환은 전이성인 방법.
구현예 65. 하나 이상의 변형을 포함하는 E1A 및 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf6/7을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 66. 구현예 65에서, 상기 E1A의 변형은 E1A의 Rb 결합 부위에서의 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 67. 구현예 65에서, 상기 E1A의 변형은 E1A 폴리펩티드의 아미노산 잔기 122-126의 하나 이상에서의 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 68. 구현예 65에서, 상기 E1A의 변형은 결실을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 69. 구현예 65에서, 상기 결실은 E1A의 아미노산 잔기 122-126의 결실인 아데노바이러스.
구현예 70. 구현예 65에서, 상기 E1A의 변형은 ΔLXCXE인 아데노바이러스.
구현예 71. 구현예 65-70 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E4orf6/7의 변형은 E4orf6/7 엑손의 하나 또는 둘다에서의 변형을 포함하는 아데노바이러스.
구현예 72. 구현예 65-70 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E4orf6/7의 변형은 E4orf6/7 엑손의 하나 또는 둘다의 결실인 아데노바이러스.
구현예 73. 구현예 65-70 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 E4orf6/7의 변형은 ΔE4orf6/7인 아데노바이러스.
구현예 74. 구현예 65에서, 상기 아데노바이러스는 E1A ΔLXCXE 및 ΔE4orf6/7를 포함하는 아데노바이러스.
구현예 75. 구현예 65-74 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 아데노바이러스는 Rb 결핍 세포에서 선택적으로 복제되는 아데노바이러스.
구현예 76. 구현예 65-75 중 어느 하나의 구현예의 아데노바이러스 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
구현예 77. 구현예 76의 약학 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
구현예 78. 구현예 77에서, 하나 이상의 추가 치료제를 더 포함하는 키트.
구현예 79. 구현예 78에서, 상기 치료제는 화학요법제인 키트.
구현예 80. 구현예 65-75 중 어느 하나의 구현예의 아데노바이러스 또는 구현예 76의 약학 조성물을 피험체에 투여하는 것을 포함하는 피험체에서 증식성 질환을 치료하는 방법.
구현예 81. 구현예 80에서, 상기 아데노바이러스 또는 약학 조성물은 정맥내, 혈관내, 수막강내, 근육내, 피하, 복강내, 또는 경구 투여되는 방법.
구현예 82. 구현예 80 또는 81에서, 피험체에 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
구현예 83. 구현예 82에서, 상기 치료제는 화학요법제인 방법.
구현예 84. 구현예 65-83 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 증식성 질환은 폐암, 전립선암, 대장암, 유방암, 갑상선암, 신장암, 간암 및 백혈병으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
구현예 85. 구현예 65-84 중 어느 하나의 구현예에서, 대략 103 내지 1012 플라크 형성 단위의 아데노바이러스를 피험체에 투여하는 방법.
구현예 86. 구현예 65-85 중 어느 하나의 구현예에서, 상기 증식성 질환은 전이성인 방법.
SEQUENCE LISTING <110> Salk Institute for Biological Studies <120> Oncolytic Adenovirus Compositions <130> 92150-008610PC-901439 <150> 61/782,932 <151> 2013-03-14 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 289 <212> PRT <213> Human adenovirus type 2 <400> 1 Met Arg His Ile Ile Cys His Gly Gly Val Ile Thr Glu Glu Met Ala 1 5 10 15 Ala Ser Leu Leu Asp Gln Leu Ile Glu Glu Val Leu Ala Asp Asn Leu 20 25 30 Pro Pro Pro Ser His Phe Glu Pro Pro Thr Leu His Glu Leu Tyr Asp 35 40 45 Leu Asp Val Thr Ala Pro Glu Asp Pro Asn Glu Glu Ala Val Ser Gln 50 55 60 Ile Phe Pro Glu Ser Val Met Leu Ala Val Gln Glu Gly Ile Asp Leu 65 70 75 80 Phe Thr Phe Pro Pro Ala Pro Gly Ser Pro Glu Pro Pro His Leu Ser 85 90 95 Arg Gln Pro Glu Gln Pro Glu Gln Arg Ala Leu Gly Pro Val Ser Met 100 105 110 Pro Asn Leu Val Pro Glu Val Ile Asp Leu Thr Cys His Glu Ala Gly 115 120 125 Phe Pro Pro Ser Asp Asp Glu Asp Glu Glu Gly Glu Glu Phe Val Leu 130 135 140 Asp Tyr Val Glu His Pro Gly His Gly Cys Arg Ser Cys His Tyr His 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tacagaaatt agaatctact ggggctcctg tcgccatcct gtgaacgcca 28260 ccgtttttac ccacccaaag cagaccaaag caaacctcac ctccggtttg cacaagcggg 28320 ccaataagta ccttacctgg tactttaacg gctcttcatt tgtaatttac aacagtttcc 28380 agcgagacga agtaagtttg ccacacaacc ttctcggctt caactacacc gtcaagaaaa 28440 acaccaccac caccaccctc ctcacctgcc gggaacgtac gagtgcgtca ccggttgctg 28500 cgcccacacc tacagcctga gcgtaaccag acattactcc catttttcca aaacaggagg 28560 tgagctcaac tcccggaact caggtcaaaa aagcattttg cggggtgctg ggatttttta 28620 attaagtata tgagcaattc aagtaactct acaagcttgt ctaatttttc tggaattggg 28680 gtcggggtta tccttactct tgtaattctg tttattctta tactagcact tctgtgcctt 28740 agggttgccg cctgctgcac gcacgtttgt acctattgtc agctttttaa acgctggggg 28800 caacatccaa gatgaggtac atgattttag gcttgctcgc ccttgcggca gtctgcagcg 28860 ctgccaaaaa ggttgagttt aaggaaccag cttgcaatgt tacatttaaa tcagaagcta 28920 atgaatgcac tactcttata aaatgcacca cagaacatga aaagcttatt attcgccaca 28980 aagacaaaat tggcaagtat gctgtatatg ctatttggca gccaggtgac actaacgact 29040 ataatgtcac agtcttccaa ggtgaaaatc gtaaaacttt tatgtataaa tttccatttt 29100 atgaaatgtg cgatattacc atgtacatga gcaaacagta caagttgtgg cccccacaaa 29160 agtgtttaga gaacactggc accttttgtt ccaccgctct gcttattaca gcgcttgctt 29220 tggtatgtac cttactttat ctcaaataca aaagcagacg cagttttatt gatgaaaaga 29280 aaatgccttg attttccgct tgcttgtatt cccctggaca atttactcta tgtgggatat 29340 gctccaggcg ggcaagatta tacccacaac cttcaaatca aactttcctg gacgttagcg 29400 cctgatttct gccagcgcct gcactgcaaa tttgatcaaa cccagcttca gcttgcctgc 29460 tccagagatg accggctcaa ccatcgcgcc cacaacggac tatcgcaaca ccactgctac 29520 cggactaaca tctgccctaa atttacccca agttcatgcc tttgtcaatg actgggcgag 29580 cttggacatg tggtggtttt ccatagcgct tatgtttgtt tgccttatta ttatgtggct 29640 tatttgttgc ctaaagcgca gacgcgccag accccccatc tataggccta tcattgtgct 29700 caacccacac aatgaaaaaa ttcatagatt ggacggtctg aaaccatgtt ctcttctttt 29760 acagtatgat taaatgagac atgattcctc gagttcttat attattgacc cttgttgcgc 29820 ttttctgtgc gtgctctaca ttggccgcgg tcgctcacat cgaagtagat tgcatcccac 29880 ctttcacagt ttacctgctt tacggatttg tcacccttat cctcatctgc agcctcgtca 29940 ctgtagtcat cgccttcatt cagttcattg actgggtttg tgtgcgcatt gcgtacctca 30000 ggcaccatcc gcaatacaga gacaggacta tagctgatct tctcagaatt ctttaattat 30060 gaaacggagt gtcatttttg ttttgctgat tttttgcgcc ctacctgtgc tttgctccca 30120 aacctcagcg cctcccaaaa gacatatttc ctgcagattc actcaaatat ggaacattcc 30180 cagctgctac aacaaacaga gcgatttgtc agaagcctgg ttatacgcca tcatctctgt 30240 catggttttt tgcagtacca tttttgccct agccatatat ccataccttg acattggctg 30300 gaatgccata gatgccatga accaccctac tttcccagtg cccgctgtca taccactgca 30360 acaggttatt gccccaatca atcagcctcg ccccccttct cccaccccca ctgagattag 30420 ctactttaat ttgacaggtg gagatgactg aatctctaga tctagaattg gatggaatta 30480 acaccgaaca gcgcctacta gaaaggcgca aggcggcgtc cgagcgagaa cgcctaaaac 30540 aagaagttga agacatggtt aacctacacc agtgtaaaag aggtatcttt tgtgtggtca 30600 agcaggccaa acttacctac gaaaaaacca ctaccggcaa ccgcctcagc tacaagctac 30660 ccacccagcg ccaaaaactg gtgcttatgg tgggagaaaa acctatcacc gtcacccagc 30720 actcggcaga aacagagggc tgcctgcact tcccctatca gggtccagag gacctctgca 30780 ctcttattaa aaccatgtgt ggtattagag atcttattcc attcaactaa cataaacaca 30840 caataaatta cttacttaaa atcagtcagc aaatctttgt ccagcttatt cagcatcacc 30900 tcctttcctt cctcccaact ctggtatctc agccgccttt tagctgcaaa ctttctccaa 30960 agtttaaatg ggatgtcaaa ttcctcatgt tcttgtccct ccgcacccac tatcttcata 31020 ttgttgcaga tgaaacgcgc cagaccgtct gaagacacct tcaaccccgt gtatccatat 31080 gacacagaaa ccgggcctcc aactgtgccc tttcttaccc ctccatttgt ttcacccaat 31140 ggtttccaag aaagtccccc tggagttctc tctctacgcg tctccgaacc tttggacacc 31200 tcccacggca tgcttgcgct taaaatgggc agcggtctta ccctagacaa ggccggaaac 31260 ctcacctccc aaaatgtaac cactgttact cagccactta aaaaaacaaa gtcaaacata 31320 agtttggaca cctccgcacc acttacaatt acctcaggcg ccctaacagt ggcaaccacc 31380 gctcctctga tagttactag cggcgctctt agcgtacagt cacaagcccc actgaccgtg 31440 caagactcca aactaagcat tgctactaaa gggcccatta cagtgtcaga tggaaagcta 31500 gccctgcaaa catcagcccc cctctctggc agtgacagcg acacccttac tgtaactgca 31560 tcacccccgc taactactgc cacgggtagc ttgggcatta acatggaaga tcctatttat 31620 gtaaataatg gaaaaatagg aattaaaata agcggtcctt tgcaagtagc acaaaactcc 31680 gatacactaa cagtagttac tggaccaggt gtcaccgttg aacaaaactc ccttagaacc 31740 aaagttgcag gagctattgg ttatgattca tcaaacaaca tggaaattaa aacgggcggt 31800 ggcatgcgta taaataacaa cttgttaatt ctagatgtgg attacccatt tgatgctcaa 31860 acaaaactac gtcttaaact ggggcaggga cccctgtata ttaatgcatc tcataacttg 31920 gacataaact ataacagagg cctatacctt tttaatgcat caaacaatac taaaaaactg 31980 gaagttagca taaaaaaatc cagtggacta aactttgata atactgccat agctataaat 32040 gcaggaaagg gtctggagtt tgatacaaac acatctgagt ctccagatat caacccaata 32100 aaaactaaaa ttggctctgg cattgattac aatgaaaacg gtgccatgat tactaaactt 32160 ggagcgggtt taagctttga caactcaggg gccattacaa taggaaacaa aaatgatgac 32220 aaacttaccc tgtggacaac cccagaccca tctcctaact gcagaattca ttcagataat 32280 gactgcaaat ttactttggt tcttacaaaa tgtgggagtc aagtactagc tactgtagct 32340 gctttggctg tatctggaga tctttcatcc atgacaggca ccgttgcaag tgttagtata 32400 ttccttagat ttgaccaaaa cggtgttcta atggagaact cctcacttaa aaaacattac 32460 tggaacttta gaaatgggaa ctcaactaat gcaaatccat acacaaatgc agttggattt 32520 atgcctaacc ttctagccta tccaaaaacc caaagtcaaa ctgctaaaaa taacattgtc 32580 agtcaagttt acttgcatgg tgataaaact aaacctatga tacttaccat tacacttaat 32640 ggcactagtg aatccacaga aactagcgag gtaagcactt actctatgtc ttttacatgg 32700 tcctgggaaa gtggaaaata caccactgaa acttttgcta ccaactctta caccttctcc 32760 tacattgccc aggaataaag aatcgtgaac ctgttgcatg ttatgtttca acgtgtttat 32820 ttttcaattg cagaaaattt caagtcattt ttcattcagt agtatagccc caccaccaca 32880 tagcttatat tgatcaccgt accttaatca aactcacaga accctagtat tcaacctgcc 32940 acctccctcc caacacacag agtacacagt cctttctccc cggctggcct taaaaagcat 33000 catatcatgg gtaacagaca tattcttagg tgttatattc cacacggttt cctgtcgagc 33060 caaacgctca tcagtgatat taataaactc cccgggcagc tcgcttaagt tcatgtcgct 33120 gtccagctgc tgagccacag gctgctgtcc aacttgcggt tgctcaacgg gcggcgaagg 33180 ggaagtccac gcctacatgg gggtagagtc ataatcgtgc atcaggatag ggcggtggtg 33240 ctgcagcagc gcgcgaataa actgctgccg ccgccgctcc gtcctgcagg aatacaacat 33300 ggcagtggtc tcctcagcga tgattcgcac cgcccgcagc atgagacgcc ttgtcctccg 33360 ggcacagcag cgcaccctga tctcacttaa atcagcacag taactgcagc acagcaccac 33420 aatattgttc aaaatcccac agtgcaaggc gctgtatcca aagctcatgg cggggaccac 33480 agaacccacg tggccatcat accacaagcg caggtagatt aagtggcgac ccctcataaa 33540 cacgctggac ataaacatta cctcttttgg catgttgtaa ttcaccacct cccggtacca 33600 tataaacctc tgattaaaca tggcgccatc caccaccatc ctaaaccagc tggccaaaac 33660 ctgcccgccg gctatgcact gcagggaacc gggactggaa caatgacagt ggagagccca 33720 ggactcgtaa ccatggatca tcatgctcgt catgatatca atgttggcac aacacaggca 33780 cacgtgcata cacttcctca ggattacaag ctcctcccgc gtcagaacca tatcccaggg 33840 aacaacccat tcctgaatca gcgtaaatcc cacactgcag ggaagacctc gcacgtaact 33900 cacgttgtgc attgtcaaag tgttacattc gggcagcagc ggatgatcct ccagtatggt 33960 agcgcgggtc tctgtctcaa aaggaggtag gcgatcccta ctgtacggag tgcgccgaga 34020 caaccgagat cgtgttggtc gtagtgtcat gccaaatgga acgccggacg tagtcatatt 34080 tcctgaagca aaaccaggtg cgggcgtgac aaacagatct gcgtctccgg tctcgtcgct 34140 tagctcgctc tgtgtagtag ttgtagtata tccactctct caaagcatcc aggcgccccc 34200 tggcttcggg ttctatgtaa actccttcat gcgccgctgc cctgataaca tccaccaccg 34260 cagaataagc cacacccagc caacctacac attcgttctg cgagtcacac acgggaggag 34320 cgggaagagc tggaagaacc atgttttttt tttttttatt ccaaaagatt atccaaaacc 34380 tcaaaatgaa gatctattaa gtgaacgcgc tcccctccgg tggcgtggtc aaactctaca 34440 gccaaagaac agataatggc atttgtaaga tgttgcacaa tggcttccaa aaggcaaact 34500 gccctcacgt ccaagtggac gtaaaggcta aacccttcag ggtgaatctc ctctataaac 34560 attccagcac cttcaaccat gcccaaataa ttttcatctc gccaccttat caatatgtct 34620 ctaagcaaat cccgaatatt aagtccggcc attgtaaaaa tctgctccag agcgccctcc 34680 accttcagcc tcaagcagcg aatcatgatt gcaaaaattc aggttcctca cagacctgta 34740 taagattcaa aagcggaaca ttaacaaaaa taccgcgatc ccgtaggtcc cttcgcaggg 34800 ccagctgaac ataatcgtgc aggtctgcac ggaccagcgc ggccacttcc ccgccaggaa 34860 ccatgacaaa agaacccaca ctgattatga cacgcatact cggagctatg ctaaccagcg 34920 tagcccctat gtaagcttgt tgcatgggcg gcgatataaa atgcaaggtg ctgctcaaaa 34980 aatcaggcaa agcctcgcgc aaaaaagcaa gcacatcgta gtcatgctca tgcagataaa 35040 ggcaggtaag ttccggaacc accacagaaa aagacaccat ttttctctca aacatgtctg 35100 cgggttcctg cattaaacac aaaataaaat aacaaaaaaa aacatttaaa cattagaagc 35160 ctgtcttaca acaggaaaaa caacccttat aagcataaga cggactacgg ccatgccggc 35220 gtgaccgtaa aaaaactggt caccgtgatt aaaaagcacc accgacagtt cctcggtcat 35280 gtccggagtc ataatgtaag actcggtaaa cacatcaggt tggttaacat cggtcagtgc 35340 taaaaagcga ccgaaatagc ccgggggaat acatacccgc aggcgtagag acaacattac 35400 agcccccata ggaggtataa caaaattaat aggagagaaa aacacataaa cacctgaaaa 35460 accctcctgc ctaggcaaaa tagcaccctc ccgctccaga acaacataca gcgcttccac 35520 agcggcagcc ataacagtca gccttaccag taaaaaaacc tattaaaaaa caccactcga 35580 cacggcacca gctcaatcag tcacagtgta aaaagggcca agtacagagc gagtatatat 35640 aggactaaaa aatgacgtaa cggttaaagt ccacaaaaaa cacccagaaa accgcacgcg 35700 aacctacgcc cagaaacgaa agccaaaaaa cccacaactt cctcaaatct tcacttccgt 35760 tttcccacga tacgtcactt cccattttaa aaaaactaca attcccaata catgcaagtt 35820 actccgccct aaaacctacg tcacccgccc cgttcccacg ccccgcgcca cgtcacaaac 35880 tccaccccct cattatcata ttggcttcaa tccaaaataa ggtatattat gatgatg 35937

Claims (64)

  1. (i) Rb 결합 부위에서의 변형을 포함하는 E1A 폴리펩티드; 및
    (ii) 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf6/7 폴리펩티드, 또는 E4orf6/7 유전자 전체의 결실
    을 포함하고, Rb 결핍 세포에서 선택적으로 복제하는 재조합 아데노바이러스.
  2. 제1항에 있어서, E1A 폴리펩티드는 2개의 Rb 결합 부위를 포함하고 E1A 폴리펩티드는 상기 2개의 Rb 결합 부위 모두에서의 변형을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, E1A 폴리펩티드는 LXCXE 모티프의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  4. 제3항에 있어서, E1A 폴리펩티드는 아미노산 잔기 122-126의 결실, 아미노산 잔기 2-11의 결실, 또는 둘 모두를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, E1A 폴리펩티드는 잔기 Y47에서의 치환, 잔기 C124에서의 치환, 또는 둘 모두를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  6. 제5항에 있어서, 잔기 Y47에서의 치환이 Y47H 치환이거나, 또는 잔기 C124에서의 치환이 C124G 치환이거나, 또는 둘 모두인 재조합 아데노바이러스.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, E4orf6/7 폴리펩티드는 E4orf6/7 엑손 중 하나의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf1 폴리펩티드; 또는
    E4orf1 유전자 전체의 결실
    을 더 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  9. 제8항에 있어서, E4orf1 폴리펩티드는 C-말단 영역에서의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  10. 제9항에 있어서, E4orf1 폴리펩티드는 C-말단 영역 내 마지막 4개 아미노산의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  11. 제9항에 있어서, E4orf1 폴리펩티드는 잔기 125-128의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  12. (i) Rb 결합 부위에서의 변형을 포함하는 E1A 폴리펩티드; 및
    (ii) 하나 이상의 변형을 포함하는 E4orf1 폴리펩티드, 또는 E4orf1 유전자 전체의 결실
    을 포함하고, Rb 결핍 세포에서 선택적으로 복제하는 재조합 아데노바이러스.
  13. 제12항에 있어서, E1A 폴리펩티드는 2개의 Rb 결합 부위를 포함하고 E1A 폴리펩티드는 상기 2개의 Rb 결합 부위 모두에서의 변형을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  14. 제12항에 또는 제13항에 있어서, E1A 폴리펩티드는 LXCXE 모티프의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  15. 제14항에 있어서, E1A 폴리펩티드는 아미노산 잔기 122-126의 결실, 아미노산 잔기 2-11의 결실, 또는 둘 모두를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  16. 제12항 또는 제13항에 있어서, E1A 폴리펩티드는 잔기 Y47에서의 치환, 잔기 C124에서의 치환, 또는 둘 모두를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  17. 제16항에 있어서, 잔기 Y47에서의 치환이 Y47H 치환이거나, 또는 잔기 C124에서의 치환이 C124G 치환이거나, 또는 둘 모두인 재조합 아데노바이러스.
  18. 제12항 또는 제13항에 있어서, E4orf1 폴리펩티드는 C-말단 영역에서의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  19. 제18항에 있어서, E4orf1 폴리펩티드는 C-말단 영역 내 마지막 4개 아미노산의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  20. 제18항에 있어서, E4orf1 폴리펩티드는 잔기 125-128의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  21. 제1항, 제2항, 제12항 및 제13항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스를 포함하는, 피험체에서 암을 치료하기 위한 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 재조합 아데노바이러스가 정맥내, 혈관내, 수막강내, 근육내, 피하, 복강내, 또는 경구 투여되는 것인 약학 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 암이 폐암, 전립선암, 대장암, 유방암, 갑상선암, 신장암, 간암 또는 백혈병인 약학 조성물.
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