KR20200010498A - 트랜스진을 보유하는 재조합 아데노바이러스 - Google Patents

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KR20200010498A
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transgene
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adenovirus
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KR1020197038157A
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크리스토퍼 라슨
브라이언 오론스키
토니 알. 레이드
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에피센트알엑스, 인코포레이티드
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Abstract

2개의 바이러스 전사 단위 사이에 삽입된 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스를 포함하는 제제, 및 재조합 아데노바이러스를 사용하는 치료 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 뉴클레오티드 서열이 IX-E2 삽입 부위 및/또는 L5-E4 삽입 부위에 삽입된다.

Description

트랜스진을 보유하는 재조합 아데노바이러스
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 5월 26일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/511,822에 대한 우선권 및 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록에 대한 언급
본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신 텍스트 포맷으로 제공되고, 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 파일의 명칭은 EPRX_002_01WO_SeqList_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 약 128 KB이고, 2018년 5월 29일자로 작성되었고, EFS-웹을 통해 전자적으로 제출된다.
본 발명의 분야
본원에 기재된 본 발명은 일반적으로 바이러스학, 바이러스요법, 및 분자 생물학 분야에 관한 것이다.
질환, 예컨대 암을 치료하기 위한 바이러스요법의 사용은 치료 유전자 또는 트랜스진을 갖춘 복제-선택적 바이러스를 사용하는 것을 포괄한다. 바이러스요법제로 개발된 다양한 감염성 바이러스 종 중에서, 아데노바이러스는 정상인 비-형질전환된 세포에 대해 최소한으로 독성일 뿐만 아니라 다중 내인성 유전자로 구성된 그의 게놈은, 일반적으로 내인성 유전자의 결실 및 외인성 유전자의 삽입 형태로 이루어지는 조작에 적용가능하기 때문에, 가장 유망한 것 중 하나로 대두되었다. 이러한 조작의 불리한 면은 대부분의 내인성 유전자 결실 또는 외인성 유전자 부가가 바이러스의 복제 및 감염 잠재력을 감속 또는 감쇠시킨다는 것이다 (Larson et al., Oncotarget, 6(24):19976-89 (2015)).
이들 영역에 트랜스진을 보유하는 바이러스의 감소된 복제 효율은, 예컨대 암의 치료를 위한 종양용해 바이러스의 경우에 바이러스가 종양 내에서 증대되어 이웃 암성 세포를 감염시키는 능력을 손상시키고, 감염된 세포 내의 바이러스 게놈 카피의 수를 감소시키고, 따라서 치료 트랜스진의 전사를 감소시키고, 바이러스 제조에 요구되는 생산 배양물의 크기를 증가시킬 가능성이 있기 때문에, 바람직하지 않다. 따라서, 종양에서와 같은 표적화된 세포 또는 조직에서 높은 수준으로 복제하여 표적화된 세포 또는 조직을 특정한 외인성 유전자 생성물의 생산을 위한 "공장"으로 신속하게 전환시키는 재조합 아데노바이러스의 능력을 개선시키는 신규 방법에 대한 필요가 존재한다.
전형적으로, 종양용해 바이러스가 2종 이상의 개별 단백질 또는 폴리펩티드 쇄를 발현하게 하는 것은, 1개 초과의 바이러스 벡터의 사용, 또는 2개의 트랜스진 사이에서의 링커, 예컨대 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)의 사용을 필요로 한다. 둘 다의 방법은 유의한 결점을 갖는다. 2개 이상의 바이러스 벡터는 단일 세포 또는 조직 내에서 모두 잘 발현되지 않을 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, IRES의 하류의 서열은 상류의 서열보다 훨씬 더 낮은 수준으로 발현된다 (Mizuguchi et al., Mol. Ther. 1(4):376-82 (2000)). 또한, 비-내인성인 링커는 면역원성에 대한 잠재력을 갖는다. 따라서, 단일 바이러스 내에서 1종 초과의 펩티드 쇄를 발현하는 보다 효율적인 바이러스 벡터에 대한 필요가 존재한다.
본 발명은, 부분적으로, 바이러스 게놈 내의 2개의 바이러스 전사 단위 사이에 삽입된 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 아데노바이러스가 표적화된 세포 또는 조직에서 효율적으로 복제하고 뉴클레오티드 서열을 발현할 수 있으며, 이는 바이러스의 종양용해 활성에는 유의하게 영향을 미치지 않는다는 발견에 기초한다. 본 발명의 벡터는 2종 이상의 트랜스진의 동등한 수준을 목적으로 하는 경우 또는 이중 쇄 단백질로부터 완전한 천연 쇄를 발현시키고자 하는 경우에 유리하게 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 삽입 부위에 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제공하며, 여기서 삽입 부위는 제1 바이러스 전사 단위의 정지 코돈 및 제2 바이러스 전사 단위의 정지 코돈 사이에 위치하고, 여기서 제1 바이러스 전사 단위의 정지 코돈은, 제1 바이러스 전사 단위의 개시 부위가 제2 바이러스 전사 단위의 정지 코돈에 대한 것보다, 제2 바이러스 전사 단위의 정지 코돈에 더 가깝고, 여기서 제2 바이러스 전사 단위의 정지 코돈은, 제2 바이러스 전사 단위의 개시 부위가 제1 바이러스 전사 단위의 정지 코돈에 대한 것보다, 제1 바이러스 전사 단위의 정지 코돈에 더 가깝고, 여기서 뉴클레오티드 서열이 삽입되기 전에 제1 바이러스 전사 단위 및 제2 바이러스 전사 단위 사이에는 어떠한 바이러스 전사 단위도 존재하지 않는다.
특정 실시양태에서, 제1 바이러스 전사 단위는 아데노바이러스 IX 유전자이고, 제2 바이러스 전사 단위는 아데노바이러스 IVa2 유전자이다. 특정 실시양태에서, 제1 바이러스 전사 단위는 아데노바이러스 섬유 유전자이고, 제2 바이러스 전사 단위는 아데노바이러스 E4 유전자의 ORF6 또는 ORF6/7이다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 유형 5 아데노바이러스 (Ad5)이다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 유형 35 아데노바이러스 (Ad35)이다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 IX-E2 삽입 부위에 삽입된다. 특정 실시양태에서, IX-E2 삽입 부위는 아데노바이러스 IX 유전자의 정지 코돈 및 아데노바이러스 IVa2 유전자의 정지 코돈 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 약 4029 및 4093에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 4029 및 4050에 상응하는 뉴클레오티드, 4050 및 4070에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 4070 및 4093에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 약 3899 및 3970에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 3899 및 3920에 상응하는 뉴클레오티드, 3920 및 3940에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 3940 및 3970에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 L5-E4 삽입 부위에 삽입된다. 특정 실시양태에서, L5-E4 삽입 부위는 아데노바이러스 섬유 유전자의 정지 코돈 및 아데노바이러스 E4 유전자의 ORF6 또는 ORF6/7의 정지 코돈 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 32785 내지 32916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 32785 및 32800에 상응하는 뉴클레오티드, 32800 및 32820에 상응하는 뉴클레오티드, 32820 및 32840에 상응하는 뉴클레오티드, 32840 및 32860에 상응하는 뉴클레오티드, 32860 및 32880에 상응하는 뉴클레오티드, 32880 및 32900에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 약 32901 및 32916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 약 31799 및 31821에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 31799 및 32810에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 32810 및 31821에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다.
특정 실시양태에서, 상기 재조합 아데노바이러스는 E1b-19K 삽입 부위, E3 삽입 부위, 또는 E4 삽입 부위에 삽입된 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 개시 부위 및 E1b-55K의 개시 부위 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E1b-19k 삽입 부위는 E1b-19K의 개시 부위 및 E1b-19K의 정지 코돈 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 아데노바이러스 pVIII 유전자의 정지 코돈 및 아데노바이러스 섬유 유전자의 개시 부위 사이에 위치한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 IX-E2 삽입 부위에 삽입된 제1 뉴클레오티드 서열 및 L5-E4 삽입 부위에 삽입된 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.
특정 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 약 4029 및 4093에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 4029 및 4050에 상응하는 뉴클레오티드, 4050 및 4070에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 4070 및 4093에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 약 3899 및 3970에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열은 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 3899 및 3920에 상응하는 뉴클레오티드, 3920 및 3940에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 3940 및 3970에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다.
특정 실시양태에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 32785 내지 32916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 32785 및 32800에 상응하는 뉴클레오티드, 32800 및 32820에 상응하는 뉴클레오티드, 32820 및 32840에 상응하는 뉴클레오티드, 32840 및 32860에 상응하는 뉴클레오티드, 32860 및 32880에 상응하는 뉴클레오티드, 32880 및 32900에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 약 32901 및 32916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 약 31799 및 31821에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제2 뉴클레오티드 서열은 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 31799 및 32810에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 32810 및 31821에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열, 제1 뉴클레오티드 서열, 및/또는 제2 뉴클레오티드 서열은 적어도 1개의 트랜스진을 포함한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 프로모터를 추가로 포함하며, 여기서 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로: (i) 제1 폴리아데닐화 신호; (ii) 프로모터; (iii) 트랜스진; (iv) 제2 폴리아데닐화 신호; 및 (v) 제3 폴리아데닐화 신호를 포함하며; 여기서 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열, 제1 뉴클레오티드 서열, 및/또는 제2 뉴클레오티드 서열 (1개 이상의 트랜스진을 포함함)은 제1 폴리아데닐화 신호 및 제3 폴리아데닐화 신호 사이에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 트랜스진은 제1 폴리아데닐화 신호 및 제3 폴리아데닐화 신호 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제2 폴리아데닐화 신호는 제3 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 L5-E4 삽입 부위에 삽입되고, 제1 폴리아데닐화 신호는 섬유 (L5) 유전자의 폴리아데닐화 신호이고, 제2 폴리아데닐화 신호는 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호는 아데노바이러스 E4 유전자의 ORF6 또는 ORF6/7의 폴리아데닐화 신호이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 IX-E2 삽입 부위에 삽입되고, 제1 폴리아데닐화 신호는 IX 유전자의 폴리아데닐화 신호이고, 제2 폴리아데닐화 신호는 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호는 아데노바이러스 IVa2 유전자의 폴리아데닐화 신호이다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로: (i) 제1 폴리아데닐화 신호; (ii) 제2 폴리아데닐화 신호; (iii) 프로모터; (iv) 트랜스진; (v) 제3 폴리아데닐화 신호; 및 (vi) 제4 폴리아데닐화 신호를 포함하고, 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열, 제1 뉴클레오티드 서열, 및/또는 제2 뉴클레오티드 서열 (1개 이상의 트랜스진을 포함함)은 제1 폴리아데닐화 신호 및 제4 폴리아데닐화 신호 사이에 삽입된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 트랜스진은 제1 폴리아데닐화 신호 및 제4 폴리아데닐화 신호 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제2 폴리아데닐화 신호는 제1 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 제4 폴리아데닐화 신호는 제3 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 L5-E4 삽입 부위에 삽입되고, 제1 폴리아데닐화 신호는 섬유 (L5) 유전자의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호는 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제4 폴리아데닐화 신호는 아데노바이러스 E4 유전자의 ORF6 또는 ORF6/7의 폴리아데닐화 신호이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 IX-E2 삽입 부위에 삽입되고, 제1 폴리아데닐화 신호는 IX 유전자의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호는 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제4 폴리아데닐화 신호는 아데노바이러스 IVa2 유전자의 폴리아데닐화 신호이다.
특정 실시양태에서, 프로모터는 편재성 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 또는 종양-특이적 프로모터이다.
특정 실시양태에서, IX-E2 삽입 부위는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, L5-E4 삽입 부위는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 또는 130개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 컨센서스 코작 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 사멸 단백질 (ADP)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 부분적 또는 완전한 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 재조합 아데노바이러스는 E1b-19K 삽입 부위, E3 삽입 부위, 또는 E4 삽입 부위에 삽입된 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 개시 부위 및 E1b-55K의 개시 부위 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E1b-19k 삽입 부위는 E1b-19K의 개시 부위 및 E1b-19K의 정지 코돈 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 아데노바이러스 pVIII 유전자의 정지 코돈 및 아데노바이러스 섬유 유전자의 개시 부위 사이에 위치한다.
특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 개시 부위에 인접한 약 100 내지 약 305, 약 100 내지 약 300, 약 100 내지 약 250, 약 100 내지 약 200, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 305, 약 150 내지 약 300, 약 150 내지 약 250, 또는 약 150 내지 약 200개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 개시 부위에 인접한 약 200개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 202개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 1714-1917에 상응하는 결실을 포함하거나, 또는 제1 치료 트랜스진은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 1714 및 1917에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제1 치료 트랜스진은 CTGACCTC (서열식별번호: 3) 및 TCACCAGG (서열식별번호: 2) 사이에 삽입되고, 예를 들어 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로 CTGACCTC (서열식별번호: 3), 제1 치료 트랜스진, 및 TCACCAGG (서열식별번호: 2)를 포함한다.
특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 약 500 내지 약 3185, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 3185, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 3185, 약 1500 내지 약 3000, 약 1500 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 3185, 약 2000 내지 약 3000, 약 2000 내지 약 2500, 약 2500 내지 약 3185, 약 2500 내지 약 3000, 또는 약 3000 내지 약 3185개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 E3-10.5K의 정지 코돈 및 E3-14.7K의 정지 코돈 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위은 E3-10.5K의 정지 코돈에 인접한 약 500 내지 약 1551, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1551, 약 1000 내지 약 1500, 또는 약 1500 내지 약 1551개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 E3-10.5K의 정지 코돈에 인접한 약 1050개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하며, 예를 들어 E3 삽입 부위는 E3-10.5K의 정지 코돈에 인접한 1063개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 Ad5 dl309 E3 결실에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 29773-30836에 상응하는 결실을 포함하거나, 또는 제2 치료 트랜스진은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 29773 및 30836에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 뉴클레오티드 29119-30622에 상응하는 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 기능적 Pea3 결합 부위의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 바이러스는 E1a의 시작 부위의 약 -300 내지 약 -250 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실 또는 E1a의 시작 부위의 -305 내지 -255 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 195-244에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하고/거나, E1a 프로모터는 서열 GGTGTTTTGG (서열식별번호: 4)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 TATA 박스-기반 프로모터를 포함하고, 여기서 변형된 TATA 박스-기반 프로모터는 기능적 TATA 박스가 결여되어 있고, 과다증식성 세포에서 유전자의 선택적 발현을 허용하고/거나, 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터를 포함하고, 여기서 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터는 기능적 CAAT 박스가 결여되어 있고, 과다증식성 세포에서 유전자의 선택적 발현을 허용한다.
특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터는 초기 유전자 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터는 E1a 프로모터, E1b 프로모터, 또는 E4 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터는 E1a 프로모터이다.
특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 전체 TATA 박스의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 E1a 프로모터의 -27 내지 -24, -31 내지 -24, -44 내지 +54, 또는 -146 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 472 내지 475, 468 내지 475, 455 내지 552, 또는 353 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 5), AGTGCCCG (서열식별번호: 44) 및/또는 TATTCCCG (서열식별번호: 45)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터는 초기 유전자 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터는 E1a 프로모터, E1b 프로모터, 또는 E4 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터는 E1a 프로모터이다.
특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 전체 CAAT 박스의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 E1a 프로모터의 -76 내지 -68에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 423 내지 431에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 서열 TTCCGTGGCG (서열식별번호: 46)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 477 내지 484에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 삽입된 뉴클레오티드 서열은 제1 트랜스진을 포함하는 제1 뉴클레오티드 서열, 및 제2 트랜스진을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 링커에 의해 분리된다. 특정 실시양태에서, 링커는 프로테아제 또는 프로테아제들에 의해 절단가능한 펩티드를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 링커는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 또는 자기-절단 2A 펩티드를 코딩한다. IRES는, 예를 들어, 뇌심근염 바이러스 IRES, 구제역 바이러스 IRES, 및 폴리오바이러스 IRES로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 IX-E2 삽입 또는 L5-E4 삽입 부위에 삽입되고, 여기서 재조합 아데노바이러스는 E1b-19K 삽입 부위, E3 삽입 부위, 또는 E4 삽입 부위에 삽입된 제3 트랜스진을 포함하는 제3 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열, 제1 뉴클레오티드 서열, 제2 뉴클레오티드 서열, 및 제3 뉴클레오티드 서열 중 1개 이상은 1개 이상의 트랜스진을 포함한다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 또는 다량체 단백질, 또는 그의 일부를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및/또는 제2 트랜스진 중 1개 이상은 치료 활성을 갖는 RNA를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및/또는 제2 트랜스진 중 1개 이상은 적어도 1개의 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩한다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 면역조정 분자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 면역조정 분자는 공동자극 리간드, 시토카인, 또는 시토카인 수용체이다. 특정 실시양태에서, 면역조정 분자는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-7, IL-10, IL-10 트랩, IL-10R, IL-12A/p35, IL-12B/p40, IL-15, IL-15 수용체 융합 단백질, IL-23A/p19, IL24, IL-27, IL-33, IL-35, IL-15, IL-15 수용체 융합 단백질, TGF-β, TGF-β 트랩, IL-10 트랩, VEGF, 인돌아민-2,3-디옥시게나제 (IDO), 유도성 T-세포 공동-자극 리간드 (ICOS-L), CD80, CD137L, TNF-α, IFN-α, IFN- β, IFN-γ, 또는 GM-CSF, GITR 리간드 (GITRL), OX40 리간드 (OX40L), CD40 리간드 (CD40L), 약물-유도성 CD40 (iCD40), CD154, CD70, CD86, CD137, CD137L, BORIS/CTCFL, TNFSF9, FGF, ICAM, 포도칼릭신, 그의 기능적 단편, 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 항원-결합 분자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 항원-결합 분자는 항-PD-1 항체, 항-TGF-β 항체, 항-PD-L1 항체, 및 항-CTLA-4 항체, 또는 그의 기능적 단편이다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 항원 또는 항원에 대한 리간드를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 항원은 CAIX, CEA, CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD80, CD133, CD138, 시토메갈로바이러스 (CMV) 감염된 세포 항원, 4-1BB, EGP-2, EGP-40, EpCAM, erbB2, erbB3, erbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, KRAS, HPV E6, E7, BING-4, EphA3, 칼슘 활성화된 클로라이드 채널-2, 시클린 B1, 9D7, Ep-CAM, PRAME, SSX-2, 미성숙 라미닌 수용체, 폴레이트 수용체-a, 텔로머라제, 티로시나제, 멜란-A, NY-ESO-1, GD2, GD3, hTERT, IL13R-a2, x-경쇄, KDR, LeY, LI 세포 부착 분자, MAGE-A1, MAGE-A3, MART1, MART2, MUC1, 메소텔린, HER-2/neu, EGFRvIII, NKG2D 리간드, NY-ES0-1, gp100, TRP-1/-2, TRP-1/-2, P 폴리펩티드, MC1R, 전립선 특이적 항원, BRAF, 안드로겐-수용체, β-카테닌, BRCA1/2, CDK4, CML66, 피브로넥틴, p53, TGF-βRII, T 세포 수용체, 종양태아성 항원, 5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, 그의 기능적 단편, 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 독소를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 독소는 슈도모나스 외독소, 리신 독소, 또는 디프테리아 독소이다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 효소를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 효소는 베타-글루쿠로니다제, 베타-갈락토시다제, 베타-글루코시다제, 카르복시펩티다제, 베타-락타마제, 에스테라제, 메탈로프로테이나제, 렐락신, 콜라게나제, 스트렙토키나제, 아르기나제, NOS-2, 그의 단편, 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 세포 주기 제어제, 성장 인자, 항응고제, 전구약물 활성화 유전자, 종양 억제 유전자, 아폽토시스 유전자, 항혈소판제, 응고 인자, 낭성 섬유증 막횡단 전도도 조절자 (CFTR) 단백질, 그의 단편, 또는 그의 유도체를 코딩한다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 안지오스타틴, 엔도스타틴, 아세틸콜린, DKK1/Wnt, Ox40L, GITRL, 분비된 플라젤린, 티미딘 키나제, 그의 기능적 단편, 또는 그의 유도체를 코딩한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 종양용해성이다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 과다증식성 세포에서 선택적으로 복제한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 과다증식성 세포에서 트랜스진을 선택적으로 발현한다. 특정 실시양태에서, 과다증식성 세포는 종양 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 재조합 아데노바이러스 서열 중 임의의 것을 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공하며, 임의로 여기서 뉴클레오티드 서열은 cDNA이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 아데노바이러스 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 벡터를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 아데노바이러스 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 포함하는 단리된 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 세포를 상기 재조합 아데노바이러스 중 임의의 것의 유효량에 노출시켜 종양 세포의 증식을 억제하는 것을 포함하는, 종양 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상태는 암이다. 상기 방법은 대상체에게 본원에 기재된 재조합 아데노바이러스의 유효량을 투여하여 대상체에서 암 질환을 치료하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에게 상기 재조합 아데노바이러스 중 임의의 것의 유효량을 투여하여 종양 성장을 억제하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양은 흑색종, 피부의 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 두경부 종양, 유방 종양, 항문암, 자궁경부암, 비소세포 폐암, 중피종, 소세포 폐 종양, 신세포 암종, 전립선 종양, 위식도 종양, 결장직장 종양, 고환 종양, 방광 종양, 난소 종양, 간세포성 암종, 담관암종, 뇌 종양, 자궁내막 종양, 신경내분비 종양, 메르켈 세포 암종, 위장 기질 종양, 육종, 및 췌장 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 상기 재조합 아데노바이러스 중 임의의 것의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 감염, 당뇨병성 망막병증, 건선, 류마티스 관절염, 자궁내막증, 황반 변성 장애 및 양성 성장 장애, 예컨대 전립선 비대 및 지방종, 혈관 장애, 심혈관 질환, 간 경변증, 결합 조직 장애, 종양, 혈관성 병변, 궤양성 병변, 염증, 혈전증, 및 신생내막 형성으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 소아 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 성인이다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 근육내, 정맥내, 동맥내, 종양내, 피내, 흡입, 경피, 국소, 점안, 비강내, 경점막 및/또는 직장 투여에 의해 투여된다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법, 및 바이러스요법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 1종 이상의 면역 체크포인트 조정제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역 체크포인트 조정제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, 2B4, TIGIT, LAG3, Tim3, BTLA, CD160, GITR, KIR, 4-1BB, 및 CTLA4로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 분자의 억제제, 길항제, 또는 효능제이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 재조합 아데노바이러스 중 임의의 것 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
a) 상기 재조합 아데노바이러스 중 임의의 것 중 1종 이상;
b) 적어도 1종의 완충제;
c) 적어도 1종의 장성 개질제;
d) 적어도 1종의 당 또는 적어도 1종의 안정화제, 또는 둘 다
를 포함하며; 약 7.0 내지 약 9.0 범위의 pH를 갖는 아데노바이러스용 제제를 제공한다.
특정 실시양태에서, 상기 제제 중 임의의 것은 약 200 mOs/L 내지 약 800 mOs/L의 오스몰농도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 상기 제제 중 임의의 것 내의 재조합 아데노바이러스는 약 1 x 107 vp/mL 내지 1 x 1013 vp/mL의 농도이다.
본 발명의 이들 및 다른 측면 및 이점은 하기 도면, 상세한 설명 및 청구범위에 의해 예시된다.
본 발명은 하기 도면을 참조하여 보다 완전하게 이해될 수 있다.
도 1은 인간 Ad5의 게놈 편성을 도시한 그래프이다. 도면의 상단에서 게놈은 통상적인 좌측 말단으로부터 kbp로 표시되는 길이를 갖는 선으로 나타내어진다. 두꺼운 화살표는 초기 및 후기 전사 단위 (각각 흑색 및 회색)를 나타낸다. 개방 박스는 주요 인트론을 나타낸다. E4 유전자는 bp 단위의 길이를 갖는 선 척도로 확대된다. 1차 전사체는 5'에서 3' 방향으로 흑색 화살표로 제시되고, 각각의 잠재적 코딩 단백질은 개방 박스로 제시되고; 코딩 영역이 인트론 서열에 의해 분할된 단백질은 선에 의해 연결된 박스로 제시된다.
도 2는 바이러스 TAV-(E1B-19K)mGMCSF 또는 TAV-(L5-E4)mGMCSF로 감염되거나, 또는 비-감염 대조군으로서 유지된 A549, ADS-12, 및 WI-38 세포로부터의 마우스 GMCSF 발현 수준을 도시한다. 마우스 GMCSF 발현을 그의 조건화 배지에서 측정하였다.
도 3은 바이러스 TAV IX-WT L5-중공(Empty), TAV IX-WT L5-IL7, TAV IX-WT L5-GMCSF, 또는 TAV IX-GMCSF L5-IL7로 감염된 A549 세포로부터의 GMCSF 발현 수준을 도시한다. GMCSF 발현을 조건화 배지에서 측정하였다. GMCSF가 L5-E4 발현 카세트보다 IX-E2 발현 카세트에서 발현되었을 때 보다 높은 발현이 관찰되었다.
도 4는 IX-E2 삽입 부위의 초기 설계 및 수정된 설계를 도시한다.
도 5는 바이러스 (TAV-Δ19k, TAV-hIL12-푸린, TAV-TAV-IXrL5-중공, WT-IXrL5-hIL12, 또는 TAV-IXrL5-hIL12)로 삼중으로 감염되고, 감염 4일 후 크리스탈 바이올렛 (살아있는 세포를 자주색으로 염색함)으로 염색된 A549 세포를 도시한다.
도 6은 바이러스 (TAV-Δ19k, TAV-hIL12-푸린, TAV-TAV-IXrL5-중공, WT-IXrL5-hIL12, 또는 TAV-IXrL5-hIL12)로 감염된 A549 세포로부터의 IL-12 발현 수준을 도시한다. A549 세포를 표시된 바이러스로 삼중으로 감염시키고, 조건화 배지의 IL12를 감염 4일 후에 ELISA로 측정하였다.
도 7은 TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5SV40wt)KozakmGMCSF (SV40wt로 라벨링됨) 또는 TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF (hEF1A로 라벨링됨)로 감염된 A549 세포로부터의 IL-17 및 GMCSF 발현 수준을 도시한다.
도 8은 ADP 유전자 무손상 [TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF, +ADP로 라벨링됨] 또는 결실된 것 [TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF-ΔADP, ΔADP로 라벨링됨]으로 감염된 A549 세포로부터의 IL-17 및 GMCSF 발현 수준을 도시한다. 감염 후 표시된 시간에 조건화 배지를 수집하고, IL-7 및 GMCSF를 ELISA에서 측정하였다.
도 9는 바이러스 [TAV-mCD80(IRES)mCD137L(IRES)mICAM1, IRES로 라벨링됨], [TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1, 19K-IX-5로 라벨링됨], 또는 대조군 바이러스 [TAV-(19k)중공-(IX)중공-(L5)중공, 중공으로 라벨링됨]로 감염된 A549 세포에서의 CD80, CD137L, 및 ICAM1 염색을 도시한다.
도 10은 바이러스 [TAV-mCD80(IRES)mCD137L(IRES)mICAM1, IRES로 라벨링됨], [TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1, 19K-IX-5로 라벨링됨], 또는 대조군 바이러스 [TAV-(19k)중공-(IX)중공-(L5)중공, 중공으로 라벨링됨]로 감염된 HT29 세포에서의 CD80, CD137L, 및 ICAM1 염색을 도시한다.
도 11은 바이러스 [TAV-mCD80(IRES)mCD137L(IRES)mICAM1, IRES로 라벨링됨], [TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1, 19K-IX-5로 라벨링됨], 또는 대조군 바이러스 [TAV-(19k)중공-(IX)중공-(L5)중공, 중공으로 라벨링됨]로 감염된 ADS12 세포에서의 CD80, CD137L, 및 ICAM1 염색을 도시한다.
도 12는 바이러스 [TAV-mCD80(IRES)mCD137L(IRES)mICAM1, IRES로 라벨링됨], [TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1, 19K-IX-5로 라벨링됨], 또는 대조군 바이러스 [TAV-(19k)중공-(IX)중공-(L5)중공, 중공으로 라벨링됨]로 감염된 F244 세포에서의 CD80, CD137L, 및 ICAM1 염색을 도시한다.
도 13은 MOI 5로의 감염 후 A549 세포에서의 바이러스 TAV-IX5-중공 ("중공"으로 라벨링됨) 및 TAV-IX5-mIL12 ("mIL12"로 라벨링됨)의 종양용해 활성을 도시한다. 감염 후 표시된 날에 크리스탈 바이올렛을 사용하여 웰을 염색하였다.
도 14 바이러스 TAV-IX5-mIL12의 트랜스진 발현. A549 세포를 TAV-IX5-중공 ("중공"으로 라벨링됨) 또는 TAV-IX5-mIL12 ("mIL12"로 라벨링됨)로 MOI 5로 감염시키고, 감염 5일 후에 조건화 배지를 수집하고, ELISA에 사용하여 이종이량체 마우스 IL-12를 측정하였다. TAV-IX5-mIL12 바이러스에 의해 높은 수준의 마우스 IL-12가 발현되었지만, 대조군 TAV-IX5-중공 바이러스에 의해서는 그렇지 않았다. 막대는 삼중 샘플의 평균 IL-12 수준을 도시하고, 오차 막대는 표준 편차를 도시한다.
본 발명은, 부분적으로, 바이러스 게놈 내의 2개의 바이러스 전사 단위 사이에 삽입된 1개 이상의 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 아데노바이러스가 표적화된 세포 또는 조직에서 효율적으로 복제하고 뉴클레오티드 서열을 발현할 수 있다는 발견에 기초한다.
I. 재조합 아데노바이러스
아데노바이러스는 뉴클레오캡시드 및 이중 가닥 선형 DNA 게놈으로 구성된 비-외피보유 이십면체 바이러스이다. 아데노바이러스는 숙주의 복제 기구를 이용하여 포유동물 세포의 핵에서 복제한다. 용어 "아데노바이러스"는 인간, 소, 양, 말, 개, 돼지, 뮤린 및 원숭이 아데노바이러스 아속을 포함하나 이에 제한되지는 않는 아데노비리다에(Adenoviridae) 속의 임의의 바이러스를 지칭한다. 특히, 인간 아데노바이러스는 A-F 아속 뿐만 아니라 그의 개별 혈청형을 포함하며, 개별 혈청형 및 A-F 아속은 인간 아데노바이러스 유형 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Ad11a 및 Ad11p), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 및 91을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 소 아데노바이러스는 소 아데노바이러스 유형 1, 2, 3, 4, 7, 및 10을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 개 아데노바이러스는 개 유형 1 (계통 CLL, 글락소, RI261, 위트렉트, 토론토 26-61) 및 2를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 말 아데노바이러스는 말 유형 1 및 2를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 돼지 아데노바이러스는 돼지 유형 3 및 4를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 인간 아데노바이러스 유형 5 및 35로부터 유래된 재조합 바이러스가 제공된다. 용어 "바이러스 벡터" 및 "바이러스"는 단백질-합성 또는 에너지-생성 메카니즘을 갖지 않는 편성 세포내 기생충 중 임의의 것을 지칭하는 것으로 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
아데노바이러스 복제 사이클은 2개의 단계를 갖고: 초기 단계 동안은 전사 단위 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, 및 E4가 발현된다. 이들 전사 단위 내의 유전자에 의해 코딩된 단백질은 대부분, 바이러스 전사의 조절, 바이러스 DNA의 복제, 및 감염에 대한 숙주 반응의 억제에 수반된다. L1-L5 전사 단위는 바이러스 생식 사이클에서 나중에 전사되고, 대부분 바이러스 캡시드의 성분을 구성하거나 캡시드의 어셈블리에 수반되는 단백질을 코딩한다. L1-L5 전사 단위는 주로 주요 후기 프로모터 (MLP)로부터 발현된다.
성숙 아데노비리온의 일반 구조는 상이한 아데노바이러스 종 사이에서 보존된다. 아데노바이러스 캡시드는 3개의 주요 단백질 (II, III, 및 IV) 및 5개의 부차 단백질, VI, VIII, IX, IIIa, 및 IVa2로 구성된다. 본원에 사용된 "IVa2 유전자"는 IVa2 단백질을 코딩하는 유전자, 그의 변형된 버전, 및/또는 단편을 지칭한다. 본원에 사용된 "IX 유전자"는 IX 단백질을 코딩하는 유전자, 그의 변형된 버전, 및/또는 단편을 지칭한다.
Ad5 게놈의 개략도 및 E4 유전자의 세부도를 도 1에 제시한다. E4로부터의 1차 전사체는 대안적 스플라이싱 이벤트에 적용되고, 이는 7개의 상이한 폴리펩티드: ORF1, ORF2, ORF3, ORF3/4, ORF4, ORF5, ORF6, 및 ORF6/7을 코딩하는 것으로 예측된다 (Leppard et al., Journal of General Virology, 78:2131-8 (1997)). "ORF"는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 그의 변형된 버전, 및/또는 단편을 지칭하는 것으로 본원에서 사용된다.
또한, 섬유 단백질 (또한 단백질 IV 또는 SPIKE로도 공지됨)은 이십면체 캡시드의 각각의 정점으로부터 돌출된 스파이크를 형성한다. 본원에 사용된 "섬유 유전자"는, 또한 L5 유전자로도 공지된 섬유 단백질을 코딩하는 유전자, 그의 변형된 버전 및/또는 단편을 지칭한다.
A. 삽입 부위
한 측면에서, 본 발명은 삽입 부위에 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제공하며, 여기서 삽입 부위는 제1 바이러스 전사 단위의 정지 코돈 및 제2 바이러스 전사 단위의 정지 코돈 사이에 위치하고, 여기서 제1 바이러스 전사 단위의 정지 코돈은, 제1 바이러스 전사 단위의 개시 부위가 제2 바이러스 전사 단위의 정지 코돈에 대한 것보다, 제2 바이러스 전사 단위의 정지 코돈에 더 가깝고, 여기서 제2 바이러스 전사 단위의 정지 코돈은, 제2 바이러스 전사 단위의 개시 부위가 제1 바이러스 전사 단위의 정지 코돈에 대한 것보다, 제1 바이러스 전사 단위의 정지 코돈에 더 가깝다. 일부 실시양태에서, 제1 바이러스 전사 단위 및 제2 바이러스 전사 단위는 아데노바이러스 게놈에서 서로 인접하고, 예를 들어, 뉴클레오티드 서열이 삽입되기 전에 제1 바이러스 전사 단위 및 제2 바이러스 전사 단위 사이에는 어떠한 바이러스 전사 단위도 존재하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "바이러스 전사 단위"는 바이러스 게놈에서 전사 개시 부위로부터 전사 정지 부위까지 연장된 뉴클레오티드 서열의 선형 서열을 지칭한다. 바이러스 전사 단위는 자연 발생될 수 있거나, 변형될 수 있거나, 또는 그의 단편일 수 있다. 용어 "바이러스 전사 단위" 및 "바이러스 유전자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스이다. 일부 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 유형 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 또는 91이다. 일부 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 유형 5 아데노바이러스 (Ad5) 또는 유형 35 아데노바이러스 (Ad35)이다.
특정 실시양태에서, 제1 바이러스 전사 단위는 아데노바이러스 IX 유전자이고, 제2 바이러스 전사 단위는 아데노바이러스 IVa2 유전자이다. 특정 실시양태에서, 제1 바이러스 전사 단위는 아데노바이러스 섬유 유전자이고, 제2 바이러스 전사 단위는 아데노바이러스 E4 유전자의 ORF6 또는 ORF6/7이다.
특정 실시양태에서, 삽입 부위는 IX-E2 삽입 부위이다. 특정 실시양태에서, IX-E2 삽입 부위는 아데노바이러스 IX 유전자의 정지 코돈 및 아데노바이러스 IVa2 유전자의 정지 코돈 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 4029 및 4093에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 4029 및 4050에 상응하는 뉴클레오티드, 4051 및 4070에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 4071 및 4093에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 3899 및 3970에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 3899 및 3920에 상응하는 뉴클레오티드, 3920 및 3940에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 3940 및 3970에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다.
일부 실시양태에서, IX-E2 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 4029 및 4093에 상응하는 뉴클레오티드에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, IX-E2 삽입 부위는 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 3899 및 3970에 상응하는 뉴클레오티드에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 삽입 부위는 L5-E4 삽입 부위이다. 특정 실시양태에서, L5-E4 삽입 부위는 아데노바이러스 섬유 유전자의 정지 코돈 및 아데노바이러스 E4 유전자의 ORF6 또는 ORF6/7의 정지 코돈 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 32785 내지 32916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 32785 및 32800에 상응하는 뉴클레오티드, 32801 및 32820에 상응하는 뉴클레오티드, 32821 및 32840에 상응하는 뉴클레오티드, 32841 및 32860에 상응하는 뉴클레오티드, 32861 및 32880에 상응하는 뉴클레오티드, 32881 및 32900에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 32901 및 32916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 31799 및 31821에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 31799 및 32810에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 32810 및 31821에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다.
일부 실시양태에서, L5-E4 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 32785 내지 32916에 상응하는 뉴클레오티드에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에서, L5-E4 삽입 부위는 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 31799 및 31821에 상응하는 뉴클레오티드에 대해 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는다.
IX-E2 삽입 부위 및/또는 L5-E4 삽입 부위에 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된 재조합 아데노바이러스는 이전에 기재된 바 없다. 이러한 재조합 아데노바이러스는 예상외로, 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 매우 우수한 종양 선택적 발현을 나타낸다. 한 측면에서, 본 발명은 천연 단백질을 발현시키는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 이량체 또는 다량체 단백질과 같은 천연 구조를 발현시키는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표적 세포에서 2종 이상의 치료 트랜스진을 발현시키는 방법을 제공한다. 방법은 세포를 본원에 기재된 재조합 바이러스의 유효량에 노출시켜 표적 트랜스진을 발현시키는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 적어도 1개의 트랜스진을 포함한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 프로모터를 추가로 포함하며, 여기서 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로: (i) 제1 폴리아데닐화 신호; (ii) 프로모터; (iii) 트랜스진; (iv) 제2 폴리아데닐화 신호; 및 (v) 제3 폴리아데닐화 신호를 포함하며; 여기서 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열, 제1 뉴클레오티드 서열, 및/또는 제2 뉴클레오티드 서열은 제1 폴리아데닐화 신호 및 제3 폴리아데닐화 신호 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제2 폴리아데닐화 신호는 제3 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 L5-E4 삽입 부위에 삽입되고, 제1 폴리아데닐화 신호는 섬유 (L5) 유전자의 폴리아데닐화 신호이고, 제2 폴리아데닐화 신호는 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호는 아데노바이러스 E4 유전자의 ORF6 또는 ORF6/7의 폴리아데닐화 신호이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 IX-E2 삽입 부위에 삽입되고, 제1 폴리아데닐화 신호는 IX 유전자의 폴리아데닐화 신호이고, 제2 폴리아데닐화 신호는 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호는 아데노바이러스 IVa2 유전자의 폴리아데닐화 신호이다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로: (i) 제1 폴리아데닐화 신호; (ii) 제2 폴리아데닐화 신호; (iii) 프로모터; (iv) 트랜스진; (v) 제3 폴리아데닐화 신호; 및 (vi) 제4 폴리아데닐화 신호를 포함하고, 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열, 제1 뉴클레오티드 서열, 및/또는 제2 뉴클레오티드 서열은 제1 폴리아데닐화 신호 및 제4 폴리아데닐화 신호 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제2 폴리아데닐화 신호는 제1 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 제4 폴리아데닐화 신호는 제3 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 L5-E4 삽입 부위에 삽입되고, 제1 폴리아데닐화 신호는 섬유 (L5) 유전자의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호는 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제4 폴리아데닐화 신호는 아데노바이러스 E4 유전자의 ORF6 또는 ORF6/7의 폴리아데닐화 신호이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 IX-E2 삽입 부위에 삽입되고, 제1 폴리아데닐화 신호는 IX 유전자의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호는 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제4 폴리아데닐화 신호는 아데노바이러스 IVa2 유전자의 폴리아데닐화 신호이다.
용어 "프로모터"는 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오티드 영역을 지칭하는 것으로 그의 통상적인 의미로 본원에 사용되고, 여기서 조절 서열은, RNA 폴리머라제에 결합할 수 있고 하류 (3'-방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유래된다.
"작동가능하게 연결된"은 기재된 성분들이 그의 통상적 기능을 수행하도록 구성된, 요소의 배열을 지칭한다. 따라서, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 제어 서열은 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 코딩 서열의 발현을 지시하도록 기능하는 한, 제어 서열은 코딩 서열에 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 전사되지만 번역되지 않는 개재 서열이 프로모터 서열과 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
특정 실시양태에서, 프로모터는 편재성 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 또는 종양-특이적 프로모터이다.
일부 실시양태에서, 트랜스진은 편재성 프로모터, 예컨대 βAct 프로모터, EF1 프로모터, EGR1 프로모터, eIF4A1 프로모터, FerH 프로모터, FerL 프로모터, GAPDH 프로모터, GRP78 프로모터, GRP94 프로모터, HSP70 프로모터, β-Kin 프로모터, PGK-1 프로모터, ROSA 프로모터, 유비퀴틴 B 프로모터, SV40 프로모터, 또는 CMV 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 한 실시양태에서, 높은 수준의 구성적 발현이 바람직할 것이다. 유용한 구성적 프로모터의 예는, 비제한적으로, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (임의로 RSV 인핸서를 가짐), 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (임의로 CMV 인핸서를 가짐) (예를 들어, 문헌 [Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)] 참조], SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터 (인비트로젠(Invitrogen))를 포함한다. 외인적으로 공급되는 화합물에 의해 조절되는 유도성 프로모터가 또한 유용하고, 아연-유도성 양 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 덱사메타손 (Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템 (WO 98/10088); 엑디손 곤충 프로모터 (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), 테트라시클린-억제성 시스템 (Gossen et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), 테트라시클린-유도성 시스템 (Gossen et al., Science. 268:1766-1769 (1995), 또한 Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998) 참조), RU486-유도성 시스템 (Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) 및 Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)) 및 라파마이신-유도성 시스템 (Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997))을 포함한다. 이와 관련하여 유용할 수 있는 다른 유형의 유도성 프로모터는 특정 생리학적 상태, 예를 들어 온도, 급성기, 세포의 특정한 분화 상태에 의해 조절되는 것, 또는 단지 복제 세포에서만 조절되는 것이다.
또 다른 실시양태에서, 트랜스진에 대한 천연 프로모터가 사용될 것이다. 천연 프로모터는 트랜스진의 발현이 천연 발현을 모방해야 하는 것이 요구되는 경우에 바람직할 수 있다. 천연 프로모터는 트랜스진의 발현이 일시적으로 또는 발달상, 또는 조직-특이적 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야하는 경우에 사용될 수 있다. 추가 실시양태에서, 다른 천연 발현 제어 요소, 예컨대 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코작 컨센서스 서열이 또한 천연 발현을 모방하는데 사용될 수 있다.
트랜스진의 또 다른 실시양태는 조직-특이적 프로모터, 예컨대 B29 프로모터 (B 세포), CD14 프로모터 (단핵구 세포), CD43 프로모터 (백혈구& 혈소판), CD45 프로모터 (조혈 세포), CD68 프로모터 (대식세포), 데스민 프로모터 (근육), 엘라스타제-1 프로모터 (췌장 선방 세포), 엔도글린 프로모터 (내피 세포), 엔도글린 프로모터 (내피 세포), Flt-1 프로모터 (내피 세포) GFAP 프로모터 (성상세포), GPIIb 프로모터 (거핵구), ICAM-2 프로모터 (내피 세포), 마우스 INF-β 프로모터 (조혈 세포), Mb 프로모터 (근육), NphsI 프로모터 (족세포), OG-2 프로모터 (골모세포, 상아질모세포), SP-B 프로모터 (폐), SYN1 프로모터 (뉴런), WASP 프로모터 (조혈 세포), SV40/bAlb 프로모터 (간), 또는 SV40 / hAlb 프로모터 (간)에 작동가능하게 연결된 트랜스진을 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 특정 유형의 세포 또는 조직에서 활성이다. 예를 들어, 골격근에서의 발현이 요구되는 경우, 근육에서 활성인 프로모터가 사용되어야 한다. 이들은 골격 α-액틴, 미오신 경쇄 2A, 디스트로핀, 근육 크레아틴 키나제를 코딩하는 유전자로부터의 프로모터, 뿐만 아니라 자연-발생 프로모터보다 더 높은 활성을 갖는 합성 근육 프로모터를 포함한다 (문헌 [Li et al., Nat. Biotech., 17:241-245 (1999)] 참조). 조직-특이적인 프로모터의 예가 특히, 간 (알부민, 문헌 [Miyatake et al., J. Virol. 71:5124-32 (1997)]; B형 간염 바이러스 코어 프로모터, 문헌 [Sandig et al., Gene Ther., 3:1002-9 (1996)]; 알파-태아단백질 (AFP). 문헌 [Arbuthnot et al., Hum. Gene Ther., 7:1503-14 (1996)]), 골 오스테오칼신 (문헌 [Stein et al., Mol. Biol. Rep., 24:185-96 (1997)]), 골 시알로단백질 (문헌 [Chen et al., J. Bone Miner. Rep., 11:654-64 (1996)]), 림프구 (CD2, 문헌 [Hansal et al., J. Immumnol., 161:1063-8 (1998)]; 이뮤노글로불린 중쇄; T 세포 수용체 쇄), 뉴런, 예컨대 뉴런-특이적 엔올라제 (NSE) 프로모터 (문헌 [Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)]), 신경필라멘트 경쇄 유전자 (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)), 및 뉴런-특이적 vgf 유전자 (Piccioli et al., Neuron. 15:373-84 (1995))에 대해 공지되어 있다.
트랜스진의 또 다른 실시양태는 종양-특이적 프로모터, 예컨대 AFP 프로모터 (간세포성 암종), CCKAR 프로모터 (췌장암), CEA 프로모터 (상피암), c-erbB2 프로모터 (유방암 & 췌장암), COX-2 프로모터 (종양), E2F-1 프로모터 (종양), HE4 프로모터 (종양), LP 프로모터 (종양), MUC1 프로모터 (암종 세포), PSA 프로모터 (전립선 및 전립선암), 서바이빈 프로모터 (종양), TRP1 프로모터 (멜라닌세포 & 흑색종), Tyr 프로모터 (멜라닌세포 & 흑색종), CXCR4 프로모터 (종양), 또는 AFP/hAFP 프로모터 (간세포성 암종)에 작동가능하게 연결된 트랜스진을 포함한다. 종양-특이적 프로모터는 종양 세포에서 특이적으로 활성이다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 컨센서스 코작 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 사멸 단백질 (ADP)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 부분적 또는 완전한 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 IX-E2 삽입 부위에 삽입된 제1 뉴클레오티드 서열 및 L5-E4 삽입 부위에 삽입된 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제공한다. 이들 실시양태는 아데노바이러스가 2개 이상의 개별 외인성 트랜스진을 발현할 수 있게 한다. 이러한 접근법은 트랜스진을 연결하는 자기-절단가능한 링커를 갖는 2개의 트랜스진을 포함하는 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스에 비해, 그의 절단된 링커가 잠재적으로 면역원성일 수 있기 때문에, 특정 이점을 갖는다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로: (i) 제1 폴리아데닐화 신호; (ii) 프로모터; (iii) 제1 트랜스진을 포함하는 제1 뉴클레오티드 서열; (iv) 링커; (v) 제2 트랜스진을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; (vi) 제2 폴리아데닐화 신호; 및 (vii) 제3 폴리아데닐화 신호를 포함하며; 여기서 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, 제2 폴리아데닐화 신호는 제3 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로: (i) 제1 폴리아데닐화 신호; (ii) 제2 폴리아데닐화 신호; (iii) 프로모터; (iv) 제1 트랜스진을 포함하는 제1 뉴클레오티드 서열; (v) 링커; (vi) 제2 트랜스진을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; (vii) 제3 폴리아데닐화 신호; 및 (viii) 제4 폴리아데닐화 신호를 포함하며; 여기서 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, 제2 폴리아데닐화 신호는 제1 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 제4 폴리아데닐화 신호는 제3 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재한다.
특정 실시양태에서, IX-E2 삽입 부위는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, L5-E4 삽입 부위는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 또는 130개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 E1b-19K 삽입 부위, E3 삽입 부위, 또는 E4 삽입 부위에 삽입된 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 개시 부위 및 E1b-55K의 개시 부위 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 아데노바이러스 pVIII 유전자의 정지 코돈 및 아데노바이러스 섬유 유전자 (L5)의 개시 부위 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E4 삽입 부위는 ORF1의 개시 코돈 및 아데노바이러스 E4 유전자의 ORF6/7의 정지 코돈 사이에 위치한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 IX-E2 삽입 부위에 삽입된 제1 뉴클레오티드 서열 및 E1b-19K 삽입 부위에 삽입된 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 IX-E2 삽입 부위에 삽입된 제1 뉴클레오티드 서열 및 E3 삽입 부위에 삽입된 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 IX-E2 삽입 부위에 삽입된 제1 뉴클레오티드 서열 및 E4 삽입 부위에 삽입된 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 L5-E4 삽입 부위에 삽입된 제1 뉴클레오티드 서열 및 E1b-19K 삽입 부위에 삽입된 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 L5-E4 삽입 부위에 삽입된 제1 뉴클레오티드 서열 및 E3 삽입 부위에 삽입된 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 L5-E4 삽입 부위에 삽입된 제1 뉴클레오티드 서열 및 E4 삽입 부위에 삽입된 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 IX-E2 삽입 부위에 삽입된 제1 뉴클레오티드 서열 및 L5-E4 삽입 부위에 삽입된 제2 뉴클레오티드 서열, 및 E1b-19K 삽입 부위, E3 삽입 부위, 또는 E4 삽입 부위에 삽입된 제3 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
아데노바이러스 E1b-19k 유전자는 주로 항아폽토시스 유전자로서 기능하고, 세포성 항아폽토시스 유전자인 BCL-2의 상동체이다. 자손 바이러스 입자의 성숙 전의 숙주 세포 사멸은 바이러스 복제를 제한할 것이기 때문에, E1b-19k는 조기 세포 사멸을 방지하여 감염이 진행되도록 하고 성숙 비리온이 생성되도록 E1 카세트의 일부로서 발현된다. 따라서, 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위를 포함하는 재조합 바이러스가 제공되며, 예를 들어 아데노바이러스는 E1b-19K 삽입 부위에 삽입된 외인성 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 삽입 부위는 E1b-19K의 개시 부위 및 E1b-19K의 정지 코돈 사이에 위치한다.
특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 개시 부위에 인접한 약 100 내지 약 305, 약 100 내지 약 300, 약 100 내지 약 250, 약 100 내지 약 200, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 305, 약 150 내지 약 300, 약 150 내지 약 250, 또는 약 150 내지 약 200개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 개시 부위에 인접한 약 200개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 202개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 1714-1917에 상응하는 결실을 포함하거나, 또는 트랜스진을 코딩하는 외인성 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 1714 및 1917에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 트랜스진을 코딩하는 외인성 뉴클레오티드 서열은 CTGACCTC (서열식별번호: 3) 및 TCACCAGG (서열식별번호: 2) 사이에 삽입되고, 예를 들어 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로 CTGACCTC (서열식별번호: 3), 트랜스진을 코딩하는 외인성 뉴클레오티드 서열, 및 TCACCAGG (서열식별번호: 2)를 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 뉴클레오티드 1611-2153 또는 1611-1915에 상응하는 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 개시 부위에 인접한 약 100 내지 약 305, 약 100 내지 약 300, 약 100 내지 약 250, 약 100 내지 약 200, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 305, 약 150 내지 약 300, 약 150 내지 약 250, 또는 약 150 내지 약 200개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 개시 부위에 인접한 약 200개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 202개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 1714-1917에 상응하는 결실을 포함하거나, 또는 제1 치료 트랜스진은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 1714 및 1917에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제1 치료 트랜스진은 CTGACCTC (서열식별번호: 3) 및 TCACCAGG (서열식별번호: 2) 사이에 삽입되고, 예를 들어 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로 CTGACCTC (서열식별번호: 3), 제1 치료 트랜스진, 및 TCACCAGG (서열식별번호: 2)를 포함한다.
특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 약 500 내지 약 3185, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 3185, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 3185, 약 1500 내지 약 3000, 약 1500 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 3185, 약 2000 내지 약 3000, 약 2000 내지 약 2500, 약 2500 내지 약 3185, 약 2500 내지 약 3000, 또는 약 3000 내지 약 3185개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 E3-10.5K의 정지 코돈 및 E3-14.7K의 정지 코돈 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위은 E3-10.5K의 정지 코돈에 인접한 약 500 내지 약 1551, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1551, 약 1000 내지 약 1500, 또는 약 1500 내지 약 1551개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 E3-10.5K의 정지 코돈에 인접한 약 1050개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하며, 예를 들어 E3 삽입 부위는 E3-10.5K의 정지 코돈에 인접한 1063개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 Ad5 dl309 E3 결실에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 29773-30836에 상응하는 결실을 포함하거나, 또는 제2 치료 트랜스진은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 29773 및 30836에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 뉴클레오티드 27199-30622에 상응하는 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, E4 삽입 부위는 E4 유전자의 ORF 중 어느 하나, 즉 ORF1의 개시 코돈에서 ORF6/7의 정지 코돈 사이를 포함한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 E4 ORF1, 및/또는 E4 ORF2에 삽입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 전체 E4 영역 중 일부 또는 전체 E4 영역이 결실될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 바이러스 중 임의의 것에서, 재조합 아데노바이러스는 E4 결실을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 개시 부위 (즉, E4-ORF6/7의 개시 코돈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 34075-34077에 상응함) 및 우측 역전된 말단 반복부 (ITR; 예를 들어, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 35836-35938에 상응함) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 개시 부위 및 E4-ORF1의 개시 부위 (즉, E4-ORF1의 개시 코돈을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 35524-35526에 상응함) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 개시 부위 및 E4-ORF1의 개시 부위 사이의 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 2500, 약 1500 내지 약 2000, 또는 약 2000 내지 약 2500개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 개시 부위에 인접한 약 250 내지 약 1500, 약 250 내지 약 1250, 약 250 내지 약 1000, 약 250 내지 약 750, 약 250 내지 약 500, 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1250, 약 500 내지 약 1000, 약 500 내지 약 750, 750 내지 약 1500, 약 750 내지 약 1250, 약 750 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1500, 또는 약 1000 내지 약 1250개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 개시 부위에 인접한 약 1450개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하고, 예를 들어 E4 결실은 E4-ORF6/7의 개시 부위에 인접한 약 1449개의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 34078-35526 또는 34083-35541에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 뉴클레오티드 33004-34422 또는 31827-34415에 상응하는 결실을 포함한다.
B. 변형된 전사 제어 영역
이전에 개발된 종양용해 바이러스는 PCT 공개 번호 WO2010/101921에서 TAV-255로 지칭된 종양용해 혈청형 5 아데노바이러스 (Ad5)를 포함하며, 이는 정상 세포에서는 전사상 약화되지만 암 세포에서는 전사상 활성이다. TAV-255 벡터가 이러한 종양 선택성을 달성하는 메카니즘은, 특이적 DNA 서열과의 결합을 통해 바이러스가 숙주 세포 내로 진입한 후 전사되는 가장 초기의 유전자인 E1a의 아데노바이러스 발현을 조절하는 단백질인, 전사 인자 Pea3 및 E2F에 대한 3개의 전사 인자 (TF) 결합 부위의 표적화된 결실을 통하는 것으로 여겨진다. 이들 3개의 Pea3 및 E2F 결실은 성장-정지된 정상 세포에서 복제를 약화시키지만, 악성 세포에서는 그렇지 않고, 이는 이들 DNA 서열이 단지 암 세포에서의 전사 조절 및 성장을 위해서만 필요하다는 것을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 상기 재조합 아데노바이러스 중 임의의 것은 변형된 E1a 조절 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 기능적 Pea3 결합 부위의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 바이러스는 E1a의 시작 부위의 약 -300 내지 약 -250 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실 또는 E1a의 시작 부위의 -305 내지 -255 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 195-244에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하고/거나, E1a 프로모터는 서열 GGTGTTTTGG (서열식별번호: 4)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 TATA 박스-기반 프로모터를 포함하고, 여기서 변형된 TATA 박스-기반 프로모터는 기능적 TATA 박스가 결여되어 있고, 과다증식성 세포에서 유전자의 선택적 발현을 허용하고/거나, 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터를 포함하고, 여기서 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터는 기능적 CAAT 박스가 결여되어 있고, 과다증식성 세포에서 유전자의 선택적 발현을 허용한다.
특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터는 초기 유전자 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터는 E1a 프로모터, E1b 프로모터, 또는 E4 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터는 E1a 프로모터이다.
특정 실시양태에서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 전체 TATA 박스의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 E1a 프로모터의 -27 내지 -24, -31 내지 -24, -44 내지 +54, 또는 -146 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 472 내지 475, 468 내지 475, 455 내지 552, 또는 353 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결실은 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 477 내지 484에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 5), AGTGCCCG (서열식별번호: 44) 및/또는 TATTCCCG (서열식별번호: 45)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터는 초기 유전자 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터는 E1a 프로모터, E1b 프로모터, 또는 E4 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터는 E1a 프로모터이다.
특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 전체 CAAT 박스의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 E1a 프로모터의 -76 내지 -68에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 423 내지 431에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 서열 TTCCGTGGCG (서열식별번호: 46)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 477 내지 484에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 2종의 치료 트랜스진을 발현시키는 방법을 제공하며, 이는 발현될 경우 단일 폴리펩티드 쇄를 생산하고, 이는 번역 후에 2개의 폴리펩티드 쇄로 절단될 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 제1 트랜스진을 포함하는 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 트랜스진을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 여기서 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 링커에 의해 분리된다. 특정 실시양태에서, 링커는 프로테아제 또는 프로테아제들에 의해 절단가능한 펩티드를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 링커는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 코딩한다. IRES는, 예를 들어, 뇌심근염 바이러스 IRES, 구제역 바이러스 IRES, 및 폴리오바이러스 IRES로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 IX-E2 삽입 또는 L5-E4 삽입 부위에 삽입되고, 여기서 재조합 아데노바이러스는 E1b-19K 삽입 부위, E3 삽입 부위, 또는 E4 삽입 부위에 삽입된 제3 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 바이러스는 조절 서열 또는 프로모터에 대해 1개 이상의 변형을 갖는다. 조절 서열 또는 프로모터에 대한 변형은 조절 서열 또는 프로모터의 야생형 서열과 비교하여 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환, 또는 부가를 포함한다.
한 실시양태에서, 조절 서열 또는 프로모터의 변형은, 예를 들어 그의 부분을 결실시킴으로써 또는 결합 부위 내에 단일 점 돌연변이를 삽입함으로써, 전사 인자에 대한 친화도를 감소시키기 위한 전사 인자 결합 부위의 서열의 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가의 변형된 조절 서열은 신생물성 세포에서의 발현은 증진시키지만 정상 세포에서의 발현은 약화시킨다.
E1a 조절 서열은 Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, 및 Pea3 V로 지정된, 전사 인자 Pea3에 대한 5개의 결합 부위를 함유하며, 여기서 Pea3 I는 E1a 개시 부위에 가장 근접한 Pea3 결합 부위이고, Pea3 V는 가장 원위이다. E1a 조절 서열은 또한 본원에서 E2F I 및 E2F II로 지정된, 전사 인자 E2F에 대한 결합 부위를 함유하며, 여기서 E2F I는 E1a 개시 부위에 가장 근접한 E2F 결합 부위이고, E2F II는 보다 원위이다. E1a 개시 부위로부터, 결합 부위는 Pea3 I, E2F I, Pea3 II, E2F II, Pea3 III, Pea3 IV, 및 Pea3 V로 배열된다.
한 실시양태에서, 이들 7개의 결합 부위 중 적어도 1개, 또는 기능적 결합 부위가 결실된다. 본원에 사용된 "기능적 결합 부위"는 각각의 결합 파트너, 예를 들어 전사 인자에 결합할 수 있는 결합 부위, 예를 들어 상응하는 야생형 결합 부위 서열의 결합 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 또는 적어도 40%를 갖는 결합 부위를 지칭한다. 본원에 사용된 "비-기능적 결합 부위"는 예를 들어 상응하는 야생형 결합 부위 서열의 결합 활성의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 0%를 갖는 결합 부위를 지칭한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 기능적 Pea3 결합 부위의 결실, 예를 들어 전체 Pea3 결합 부위의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 본원에 사용된 "기능적 Pea3 결합 부위"는 그의 각각의 전사 인자 (예를 들어, Pea3)에 결합할 수 있는 Pea3 결합 부위, 예를 들어 상응하는 야생형 Pea3 결합 부위 서열의 Pea3 결합 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 또는 적어도 40%를 갖는 Pea3 결합 부위를 지칭한다. 본원에 사용된 "비-기능적 Pea3 결합 부위"는 예를 들어 상응하는 야생형 Pea3 결합 부위 서열의 Pea3 결합 활성의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 0%를 갖는 Pea3 결합 부위를 지칭한다. Pea3 결합 부위가 Pea3에 결합하는지 결정하기 위한 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 결합 검정은 전기영동 이동성 변화 검정, 염색질 면역침전 검정, 및 DNAse 풋프린팅 검정을 포함한다.
한 실시양태에서, 적어도 1개의 Pea3 결합 부위, 또는 기능적 Pea3 결합 부위가 결실된다. 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, 및/또는 Pea3 V일 수 있다. 한 실시양태에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, 및/또는 Pea3 V이다. 또 다른 실시양태에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 IV 및/또는 Pea3 V이다. 또 다른 실시양태에서 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 II 및/또는 Pea3 III이다. 또 다른 실시양태에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 II 및 Pea3 III 둘 다이다. 또 다른 실시양태에서, Pea3 I 결합 부위 또는 기능적 Pea3 I 결합 부위는 유지된다.
한 실시양태에서, 적어도 1개의 E2F 결합 부위 또는 기능적 E2F 결합 부위가 결실된다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 1개의 E2F 결합 부위 또는 기능적 E2F 결합 부위가 유지된다. 한 실시양태에서, 유지되는 E2F 결합 부위는 E2F I 및/또는 E2F II이다. 또 다른 실시양태에서, 유지되는 E2F 결합 부위는 E2F II이다. 또 다른 실시양태에서, 총 결실은 본질적으로 Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV, 및/또는 Pea3 V 중 1개 이상으로 이루어진다. 한 실시양태에서, 바이러스는 E1a 시작 부위의 -305에서 -255 상류에 위치하는 50개 염기쌍 영역, 예를 들어, 이하에서 TAV-255 결실로 지칭되는, Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 195-244에 상응하는 영역의 결실을 갖는다. 특정 실시양태에서, TAV-255 결실은 서열 GGTGTTTTGG (서열식별번호: 4)를 포함하는 E1a 프로모터를 생성한다.
한 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는, 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 공개 번호 WO2010101921 및 미국 공개 번호 20160017294A1에 기재된, TAV-255로 불리는 종양용해 혈청형 5 아데노바이러스 (Ad5)에서와 동일하거나 유사한 E1a 변형을 갖는다. TAV-255 벡터가 이러한 종양 선택성을 달성하는 메카니즘은, 특이적 DNA 서열과의 결합을 통해 바이러스가 숙주 세포 내로 진입한 후 전사되는 가장 초기의 유전자인 E1a의 아데노바이러스 발현을 조절하는 단백질인, 전사 인자 Pea3 및 E2F에 대한 3개의 전사 인자 (TF) 결합 부위의 표적화된 결실을 통하는 것으로 여겨진다. 이들 3개의 Pea3 및 E2F 결실은 성장-정지된 정상 세포에서 복제를 약화시키지만, 악성 세포에서는 그렇지 않고, 이는 이들 DNA 서열이 단지 암 세포에서의 전사 조절 및 성장을 위해서만 필요하다는 것을 나타낸다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 기능적 Pea3 결합 부위의 1개 이상의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 결실은 E1a의 시작 부위의 약 -300 내지 약 -250 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결실은 E1a의 시작 부위의 -305 내지 -255 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 195-244에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1a 프로모터는 서열 GGTGTTTTGG (서열식별번호: 4)를 포함한다.
한 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 E1A 영역에서 1개 이상의 E2F 전사 결합 부위 결실 없이 1개 이상의 Pea3 전사 결합 부위 결실을 포함한다. 다른 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 E1A 영역에서 1개 이상의 Pea3 전사 결합 부위 결실 없이 1개 이상의 E2F 전사 결합 부위 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 종양용해 아데노바이러스는 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 TATA 박스-기반 프로모터를 포함하고, 여기서 변형된 TATA 박스-기반 프로모터는 기능적 TATA 박스가 결여되어 있고, 과다증식성 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 유전자의 선택적 발현을 허용한다. 본원에 사용된 "기능적 TATA 박스"는 TATA 박스 결합 단백질 (TBP)에 결합할 수 있는 TATA 박스, 예를 들어 상응하는 야생형 TATA 박스 서열의 TBP 결합 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 또는 적어도 40%를 갖는 TATA 박스를 지칭한다. 본원에 사용된 "비-기능적 TATA 박스"는 예를 들어 상응하는 야생형 TATA 박스 서열의 TBP 결합 활성의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 0%를 갖는 TATA 박스를 지칭한다. TBP가 TATA 박스에 결합하는지 결정하기 위한 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 결합 검정은 전기영동 이동성 변화 검정, 염색질 면역침전 검정, 및 DNAse 풋프린팅 검정을 포함한다.
본원에 사용된 "변형된 TATA 박스"는 야생형 TATA 박스 서열과 비교하여 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환, 또는 부가를 갖는 TATA 박스를 지칭한다.
예를 들어, 바이러스는 E1a의 시작 부위의 -29 내지 -26, -33 내지 -26, -44 내지 +52, 또는 -148 내지 +52 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 353-552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, TATA 박스 결실은 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 5), AGTGCCCG (서열식별번호: 44) 및/또는 TATTCCCG (서열식별번호: 45)를 포함하는 E1a 프로모터를 생성한다.
특정 실시양태에서, 재조합 종양용해 아데노바이러스는 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터를 포함하고, 여기서 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터는 기능적 CAAT 박스가 결여되어 있고, 과다증식성 세포 및/또는 비-성장 정지된 세포에서 유전자의 선택적 발현을 허용한다. TATA 박스-기반 프로모터 및 CAAT 박스-기반 프로모터는 동일한 프로모터 (예를 들어, Ad5 E1a 프로모터)일 수 있거나, 또는 상이한 프로모터일 수 있다.
본원에 사용된 "CAAT 박스"는 C/EBP 또는 NF-Y 단백질에 결합할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. CAAT 박스는 전형적으로 GG(T/C)CAATCT의 컨센서스 서열을 포함한다.
본원에 사용된 "변형된 CAAT 박스"는 야생형 CAAT 박스 서열에 비해 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환, 또는 부가를 갖는 CAAT 박스를 지칭한다.
본원에 사용된 "기능적 CAAT 박스"는 C/EBP 또는 NF-Y 단백질에 결합할 수 있는 CAAT 박스, 예를 들어 상응하는 야생형 CAAT 박스 서열의 C/EBP 또는 NF-Y 결합 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 또는 적어도 40%를 갖는 CAAT 박스를 지칭한다. 본원에 사용된 "비-기능적 CAAT 박스"는 예를 들어 상응하는 야생형 CAAT 박스 서열의 C/EBP 또는 NF-Y 결합 활성의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 0%를 갖는 CAAT 박스를 지칭한다. C/EBP 또는 NF-Y 단백질이 CAAT 박스에 결합하는지 결정하기 위한 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 결합 검정은 전기영동 이동성 변화 검정, 염색질 면역침전 검정, 및 DNAse 풋프린팅 검정을 포함한다.
본원에 사용된 "CAAT 박스-기반 프로모터"는 CAAT 박스를 함유하는 임의의 유전자 프로모터를 지칭한다.
본원에 사용된 "변형된 CAAT 박스-기반 프로모터"는 야생형 CAAT 박스-기반 프로모터에 비해 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환, 또는 부가에 의해 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 CAAT 박스-기반 프로모터 서열의 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 CAAT 박스-기반 프로모터 서열의 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 CAAT 박스-기반 프로모터 서열의 전체 CAAT 박스의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 야생형 CAAT 박스-기반 프로모터 서열의 전체 CAAT 박스의 결실로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 전체 CAAT 박스-기반 프로모터의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 전체 CAAT 박스-기반 프로모터의 결실로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형은 별개의 기능적 프로모터 서열의 부가 또는 치환을 포함하지 않는다.
바이러스 유전자를 코딩하는 핵산은 플라스미드 내에 혼입될 수 있고, 통상적인 형질감염 또는 형질전환 기술을 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 구체적인 생산 및 정제 조건은 사용되는 바이러스 및 생산 시스템에 따라 달라질 것이다. 아데노바이러스의 경우, 바이러스 입자를 생성하는 전통적인 방법은 공동-형질감염, 이어서 셔틀 플라스미드 (통상적으로 아데노바이러스 게놈의 작은 하위세트를 함유하고, 임의로 잠재적인 트랜스진 발현 카세트를 함유함) 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 (전체 아데노바이러스 게놈의 대부분을 함유함)의 후속적인 생체내 재조합이다. 아데노바이러스의 생성을 위한 대안적 기술은 박테리아 인공 염색체 (BAC) 시스템, 상보적 아데노바이러스 서열을 함유하는 2개의 플라스미드를 사용하는 recA+ 박테리아 균주에서의 생체내 박테리아 재조합, 및 효모 인공 염색체 (YAC) 시스템의 사용을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 종양용해 바이러스, 예를 들어 종양-선택적 복제 및/또는 바이러스 매개 용해를 나타내는 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 비증식성 세포에 비해 과다증식성 세포, 예를 들어 암 세포, 종양 세포에서 치료 트랜스진의 선택적 발현을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 비-과다증식성 세포에서의 치료 트랜스진의 발현은 과다증식성 세포에서의 유전자의 발현의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 또는 약 5%이다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 비-과다증식성 세포에서 치료 트랜스진의 검출가능한 발현을 나타내지 않는다. 치료 트랜스진 발현은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 방법, 예를 들어 웨스턴 블롯 또는 ELISA에 의해 결정될 수 있다.
과다증식성 세포는 암 세포, 예를 들어 암종, 육종, 백혈병, 림프종, 전립선암, 폐암, 위장관암, 결장직장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 위암, 갑상선암, 중피종, 간암, 신장암, 피부암, 두경부암, 또는 뇌암 세포일 수 있다.
C. 트랜스진
본원에 개시된 재조합 아데노바이러스는 상기 삽입 부위 중 임의의 것, 예를 들어 IX-E2 삽입 부위, L5-E4 삽입 부위, E1b-19K 삽입 부위, E3 삽입 부위, 또는 E4 삽입 부위에 삽입된 1개 이상의 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 적어도 1개의 트랜스진을 포함한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 프로모터를 추가로 포함하며, 여기서 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로: (i) 제1 폴리아데닐화 신호; (ii) 프로모터; (iii) 트랜스진; (iv) 제2 폴리아데닐화 신호; 및 (v) 제3 폴리아데닐화 신호를 포함하며; 여기서 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열, 제1 뉴클레오티드 서열, 및/또는 제2 뉴클레오티드 서열은 제1 폴리아데닐화 신호 및 제3 폴리아데닐화 신호 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제2 폴리아데닐화 신호는 제3 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 L5-E4 삽입 부위에 삽입되고, 제1 폴리아데닐화 신호는 L5 전사 단위의 폴리아데닐화 신호이고, 제2 폴리아데닐화 신호는 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호는 E4 전사 단위의 폴리아데닐화 신호이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 IX-E2 삽입 부위에 삽입되고, 제1 폴리아데닐화 신호는 IX 전사 단위의 폴리아데닐화 신호이고, 제2 폴리아데닐화 신호는 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호는 아데노바이러스 IVa2 유전자의 폴리아데닐화 신호이다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로: (i) 제1 폴리아데닐화 신호; (ii) 제2 폴리아데닐화 신호; (iii) 프로모터; (iv) 트랜스진; (v) 제3 폴리아데닐화 신호; 및 (vi) 제4 폴리아데닐화 신호를 포함하고, 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열, 제1 뉴클레오티드 서열, 및/또는 제2 뉴클레오티드 서열은 제1 폴리아데닐화 신호 및 제4 폴리아데닐화 신호 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제2 폴리아데닐화 신호는 제1 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 제4 폴리아데닐화 신호는 제3 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 L5-E4 삽입 부위에 삽입되고, 제1 폴리아데닐화 신호는 L5 전사 단위의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호는 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제4 폴리아데닐화 신호는 E4 전사 단위의 폴리아데닐화 신호이다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 IX-E2 삽입 부위에 삽입되고, 제1 폴리아데닐화 신호는 IX 전사 단위의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호는 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제4 폴리아데닐화 신호는 아데노바이러스 IVa2 유전자의 폴리아데닐화 신호이다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 제1 트랜스진을 포함하는 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 트랜스진을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 여기서 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 링커에 의해 분리된다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 5'에서 3' 배향으로: (i) 제1 폴리아데닐화 신호; (ii) 프로모터; (iii) 제1 트랜스진을 포함하는 제1 뉴클레오티드 서열; (iv) 링커; (v) 제2 트랜스진을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; (vi) 제2 폴리아데닐화 신호; 및 (vii) 제3 폴리아데닐화 신호를 포함하며; 여기서 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, 제2 폴리아데닐화 신호는 제3 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 5'에서 3' 배향으로: (i) 제1 폴리아데닐화 신호; (ii) 제2 폴리아데닐화 신호; (iii) 프로모터; (iv) 제1 트랜스진을 포함하는 제1 뉴클레오티드 서열; (v) 링커; (vi) 제2 트랜스진을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열; (vii) 제3 폴리아데닐화 신호; 및 (viii) 제4 폴리아데닐화 신호를 포함하며; 여기서 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, 제2 폴리아데닐화 신호는 제1 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 제4 폴리아데닐화 신호는 제3 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재한다.
특정 실시양태에서, 링커는 프로테아제 또는 프로테아제들에 의해 절단가능한 펩티드를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 링커는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 또는 자기-절단 2A 펩티드를 코딩한다. IRES는, 예를 들어, 뇌심근염 바이러스 IRES, 구제역 바이러스 IRES, 및 폴리오바이러스 IRES로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열은 IX-E2 삽입 또는 L5-E4 삽입 부위에 삽입되고, 여기서 재조합 아데노바이러스는 E1b-19K 삽입 부위, E3 삽입 부위, 또는 E4 삽입 부위에 삽입된 제3 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열, 제1 뉴클레오티드 서열, 제2 뉴클레오티드 서열, 및 제3 뉴클레오티드 서열 중 1개 이상은 1개 이상의 트랜스진을 포함한다.
특정 실시양태에서, 뉴클레오티드 서열, 제1 뉴클레오티드 서열, 제2 뉴클레오티드 서열, 및 제3 뉴클레오티드 서열 중 1개 이상은
a) 전사 시작 영역;
b) 전사 시작 영역의 전사 제어 하에 있는 트랜스진을 포함하는 뉴클레오티드 서열; 및
c) 전사 종결 영역
을 포함한다.
일부 실시양태에서, 전사 시작 영역은 프로모터를 포함한다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 또는 다량체 단백질, 또는 그의 일부를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 치료 활성을 갖는 RNA를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 적어도 1개의 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩한다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 면역조정 분자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 면역조정 분자는 공동자극 리간드, 시토카인, 또는 시토카인 수용체이다. 특정 실시양태에서, 면역조정 분자는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-7, IL-10, IL-10 트랩, IL-10R, IL-12A/p35, IL-12B/p40, IL-15, IL-23A/p19, IL-24, IL-27, IL-33, IL-35, IL-15, IL-15 수용체 융합 단백질, TGF-β, TGF-β 트랩, IL-10 트랩, VEGF, VEGF 트랩, 인돌아민-2,3-디옥시게나제 (IDO), 유도성 T-세포 공동-자극 리간드 (ICOS-L), CD80, CD137L, TNF-α, IFN-α, IFN- β, IFN-γ, GM-CSF, GITR 리간드 (GITRL), OX40 리간드 (OX40L), CD40 리간드 (CD40L)/CD154, CD70, CD86, CD137, CD137L, BORIS/CTCFL, 골 형태발생 단백질 (BMP), TNFSF9, FGF, ICAM, 포도칼릭신, 그의 기능적 단편, 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 트랜스진은 N-에서 C-말단 배향으로 시토카인 수용체의 세포외 도메인의 가용성 부분; 아미노산 링커; 이뮤노글로불린 (Ig) 힌지 영역; 및 이뮤노글로불린 (Ig) Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 시토카인 수용체는 TGFβ 유형 II (TβRII) 수용체이다.
특정 실시양태에서, CD80 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 IX-E2 삽입 부위에 삽입되고, CD137L 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 L5-E4 삽입 부위에 삽입된다. 특정 실시양태에서, CD137L 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 IX-E2 삽입 부위에 삽입되고, CD80 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 L5-E4 삽입 부위에 삽입된다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 IL-12A/p35를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 기능적 단편, IL-12B/p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 기능적 단편, 및 IFN-α를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 이들 뉴클레오티드 서열은 IX-E2 삽입 부위, L5-E4 삽입 부위, E1b-19K 삽입 부위, E3 삽입 부위, 및/또는 E4 삽입 부위에 삽입될 수 있다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및/또는 제2 트랜스진 중 1개 이상은 항원-결합 분자를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 항원-결합 분자는 항-PD-1 항체, 항-TGF-β 항체, 항-PD-L1 항체, 및 항-CTLA-4 항체, 또는 그의 기능적 단편이다. 예시적인 항-PD-1 항체는 니볼루맙 (브리스톨-마이어스 스큅 캄파니(Bristol-Myers Squibb Co.)), 펨브롤리주맙 (키트루다(KEYTRUDA)®, 머크 & 캄파니(Merck & Co.)) 및 아테졸리주맙 (이전에 MPDL3280A), MEDI4736, 아벨루맙, 및 PDR001을 포함한다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 항원 또는 항원에 대한 리간드를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 항원은 CAIX, CEA, CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD80, CD133, CD135 (Flt3), Flt3I, CD138, 시토메갈로바이러스 (CMV) 감염된 세포 항원, 4-1BB, EGP-2, EGP-40, EpCAM, erbB2, erbB3, erbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, KRAS, HPV E6, E7, BING-4, EphA3, 칼슘 활성화된 클로라이드 채널-2, 시클린 B1, 9D7, SAP-1, PRAME, SSX-2, 미성숙 라미닌 수용체, 폴레이트 수용체-a, 텔로머라제, 티로시나제, 멜란-A, NY-ESO-1, GD2, GD3, hTERT, IL13R-a2, x-경쇄, KDR, LeY, LI 세포 부착 분자, MAGE-A1, MAGE-A3, MART1, MART2, MUC1, 메소텔린, HER-2/neu, EGFRvIII, NKG2D 리간드, NY-ES0-1, gp100, TRP-1/-2, TRP-1/-2, P 폴리펩티드, MC1R, 전립선 특이적 항원, BRAF, 안드로겐-수용체, β-카테닌, BRCA1/2, CDK4, CML66, 피브로넥틴, p53, TGF-βRII, T 세포 수용체, 종양태아성 항원, 5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, 그의 기능적 단편, 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 독소를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 독소는 슈도모나스 외독소, 리신 독소, 또는 디프테리아 독소이다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 효소를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 효소는 베타-글루쿠로니다제, 베타-갈락토시다제, 베타-글루코시다제, 카르복시펩티다제, 베타-락타마제, 에스테라제, 메탈로프로테이나제, 렐락신, 콜라게나제, 스트렙토키나제, 아르기나제, NOS-2, 그의 단편, 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 세포 주기 제어제, 성장 인자, 항응고제, 전구약물 활성화 유전자, 종양 억제 유전자, 아폽토시스 유전자, 항혈소판제, 응고 인자, 낭성 섬유증 막횡단 전도도 조절자 (CFTR) 단백질, 그의 단편, 또는 그의 유도체를 코딩한다.
특정 실시양태에서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상은 안지오스타틴, 엔도스타틴, 아세틸콜린, DKK1/Wnt, Ox40L, GITRL, 분비된 플라젤린, 티미딘 키나제, 그의 기능적 단편, 또는 그의 유도체를 코딩한다.
II. 치료 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 세포를 상기 재조합 아데노바이러스 중 임의의 것의 유효량에 노출시켜 종양 세포의 증식을 억제하는 것을 포함하는, 종양 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에게 상기 재조합 아데노바이러스 중 임의의 것의 유효량을 투여하여 종양 성장을 억제하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양은 HER2/neu 양성 종양이고, 재조합 아데노바이러스는 기능적 Pea3 결합 부위의 1개 이하의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, HER2/neu 양성 종양은 유방암, 위암, 난소암, 방광암, 타액선암, 자궁내막암, 췌장암, 또는 비소세포 폐암 (NSCLC)으로부터의 것이다.
특정 실시양태에서, 종양은 흑색종, 피부의 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 두경부 종양, 유방 종양, 항문암, 자궁경부암, 비소세포 폐암, 중피종, 소세포 폐 종양, 신세포 암종, 전립선 종양, 위식도 종양, 결장직장 종양, 고환 종양, 방광 종양, 난소 종양, 간세포성 암종, 담관암종, 뇌 종양, 자궁내막 종양, 신경내분비 종양, 메르켈 세포 암종, 위장 기질 종양, 육종, 및 췌장 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 개시된 재조합 아데노바이러스를 사용하여 다양한 의학적 적응증, 예를 들어 암을 치료할 수 있다. 본원에 사용된 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 대상체에서, 예를 들어 인간에서 질환을 치료하는 것을 의미한다. 이는 (a) 질환의 억제, 즉, 그의 발생의 저지; 및 (b) 질환의 완화, 즉, 질환 상태의 퇴행 유발을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 치료될 유기체를 지칭한다. 이러한 유기체는 바람직하게는 포유동물 (예를 들어, 뮤린, 원숭이, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 보다 바람직하게는 인간을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 대상체에서 과다증식성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 대상체에게 본원에 기재된 재조합 바이러스의 유효량을 투여하여 대상체에서 과다증식성 질환을 치료하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 과다증식성 질환은 암, 아테롬성동맥경화증, 류마티스 관절염, 건선, 루푸스, 특발성 폐 섬유증, 경피증 및 간경변증으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 과다증식성 질환은 암이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체에게 본원에 기재된 재조합 아데노바이러스의 유효량을 투여하여 대상체에서 암 질환을 치료하는 것을 포함한다.
암의 예는 고형 종양, 연부 조직 종양, 조혈 종양 및 전이성 병변을 포함한다. 조혈 종양의 예는 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수구성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 예를 들어, 형질전환된 CLL, 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종, 모발상 세포 백혈병, 골수이형성 증후군 (MDS), 림프종, 호지킨병, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 또는 리히터 증후군 (리히터 형질전환)을 포함한다. 고형 종양의 예는 다양한 기관계의 악성종양, 예를 들어 육종, 선암종, 및 암종, 예컨대 두경부 (인두 포함), 갑상선, 폐 (소세포 또는 비소세포 폐 암종 (NSCLC)), 유방, 림프, 위장 (예를 들어, 구강, 식도, 위, 간, 췌장, 소장, 결장 및 직장, 항문관), 생식기 및 비뇨생식관 (예를 들어, 신장, 요로상피, 방광, 난소, 자궁, 자궁경부, 자궁내막, 전립선, 고환), CNS (예를 들어, 신경 또는 신경교 세포, 예를 들어 신경모세포종 또는 신경교종), 또는 피부 (예를 들어, 흑색종)에 영향을 미치는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암은 흑색종, 피부의 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 두경부암, 유방암, 항문암, 자궁경부암, 비소세포 폐암, 중피종, 소세포 폐암, 신세포 암종, 전립선암, 위식도암, 결장직장암, 고환암, 방광암, 난소암, 간세포성 암종, 담관암종, 뇌암, 자궁내막암, 신경내분비암, 및 췌장암으로부터 선택된다.
특정 실시양태, 암은 비인두암, 기저 세포 암종, 활막암, 간세포성암, 신암, 결합 조직의 암, 흑색종, 폐암, 장암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 뇌암, 인후암, 구강암, 간암, 골암, 췌장암, 융모막암종, 가스트린종, 신경내분비, 크롬친화세포종, 프로락틴선종, T-세포 백혈병/림프종, 신경종, 폰 히펠-린다우병, 졸링거-엘리슨 증후군, 부신암, 항문암, 담관암, 방광암, 요관암, 뇌암, 핍지교종, 신경모세포종, 수막종, 척수 종양, 골암, 골연골종, 연골육종, 유잉 육종, 원인불명 원발성 부위의 암, 카르시노이드, 위장관의 카르시노이드, 섬유육종, 유방암, 파제트병, 자궁경부암, 결장직장암, 직장암, 식도암, 담낭암, 두부암, 안암, 경부암, 신장암, 윌름스 종양, 간암, 카포시 육종, 전립선암, 폐암, 고환암, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 구강암, 피부암, 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 내분비 췌장암, 글루카곤종, 췌장암, 부갑상선암, 음경암, 뇌하수체암, 연부 조직 육종, 망막모세포종, 소장암, 위암, 흉선암, 갑상선암, 영양막암, 포상 기태, 자궁암, 자궁내막암, 질암, 외음부암, 청신경종, 균상 식육종, 인슐린종, 카르시노이드 증후군, 소마토스타틴종, 치은암, 심장암, 구순암, 수막암, 구강암, 신경암, 구개암, 이하선암, 복막암, 인두암, 흉막암, 타액선암, 설암 및 편도암으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 본 발명은 종양 세포를 상기 재조합 아데노바이러스 중 임의의 것의 유효량에 노출시키는 것을 포함하는, 종양 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에게 상기 재조합 아데노바이러스 중 임의의 것의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양은 흑색종, 피부의 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 두경부 종양, 유방 종양, 항문암, 자궁경부암, 비소세포 폐암, 중피종, 소세포 폐 종양, 신세포 암종, 전립선 종양, 위식도 종양, 결장직장 종양, 고환 종양, 방광 종양, 난소 종양, 간세포성 암종, 담관암종, 뇌 종양, 자궁내막 종양, 신경내분비 종양, 메르켈 세포 암종, 위장 기질 종양, 육종, 및 췌장 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 상기 재조합 아데노바이러스 중 임의의 것의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 상태는 감염, 당뇨병성 망막병증, 건선, 류마티스 관절염, 자궁내막증, 황반 변성 장애 및 양성 성장 장애, 예컨대 전립선 비대 및 지방종, 혈관 장애, 심혈관 질환, 감염, 간 경변증, 결합 조직 장애, 종양, 혈관성 병변, 궤양성 병변, 염증, 혈전증, 및 신생내막 형성으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 소아 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 성인이다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 근육내, 정맥내, 동맥내, 또는 종양내 주사에 의해 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 피내, 흡입, 경피, 국소, 점안, 비강내, 경점막 및 직장 투여에 의해 투여된다.
특정 실시양태에서, 상기 재조합 아데노바이러스는 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법, 및 바이러스요법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 요법과 조합되어 대상체에게 투여된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 에를로티닙과 조합되어 투여된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 1종 이상의 면역 체크포인트 조정제와 조합되어 투여된다. 특정 실시양태에서, 면역 체크포인트 조정제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, 2B4, TIGIT, LAG3, Tim3, BTLA, CD160, GITR, KIR, 4-1BB, 및 CTLA4로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 분자의 억제제, 길항제, 또는 효능제이다. 일부 실시양태에서 면역 체크포인트 조정제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, 2B4, TIGIT, LAG3, Tim3, BTLA, CD160, GITR, KIR, 4-1BB, 및/또는 CTLA4에 대한 항체이다. 예시적인 항-PD-1 항체는 니볼루맙 (브리스톨-마이어스 스큅 캄파니), 펨브롤리주맙 (키트루다®, 머크 & 캄파니) 및 아테졸리주맙 (이전에 MPDL3280A), MEDI4736, 아벨루맙, 및 PDR001을 포함한다.
제약 제제는 바람직하게는 멸균된다. 멸균은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조된 경우, 동결건조 및 재구성 전 또는 후에 여과 멸균이 수행될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 유리하거나 목적하는 결과를 달성하기에 충분한 활성 성분의 양 (예를 들어, 본 발명의 재조합 바이러스의 양)을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있으며, 특정한 제제화 또는 투여 경로로 제한하는 것으로 의도되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 활성 성분의 치료 유효량은 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예를 들어 1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 범위이다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스의 치료 유효량은 102 내지 1015 플라크 형성 단위 (pfu), 예를 들어 102 내지 1010, 102 내지 105, 105 내지 1015, 105 내지 1010, 또는 1010 내지 1015 플라크 형성 단위이다. 투여되는 양은 치료될 질환 또는 적응증의 유형 및 정도, 환자의 전반적 건강, 항체의 생체내 효력, 제약 제제, 및 투여 경로와 같은 변수에 좌우될 것이다. 초기 투여량은 목적하는 혈액-수준 또는 조직-수준을 신속하게 달성하기 위해 상한 수준을 넘어 증가될 수 있다. 대안적으로, 초기 투여량은 최적 투여량보다 적을 수 있고, 1일 투여량은 치료 과정 동안 점진적으로 증가될 수 있다. 인간 투여량은, 예를 들어 0.5 mg/kg에서 20 mg/kg까지 진행되도록 설계된 통상적인 I 단계 용량 증량 연구에서 최적화될 수 있다. 투여 빈도는 투여 경로, 투여량, 바이러스의 혈청 반감기, 및 치료할 질환과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 예시적인 투여 빈도는 1일에 1회, 1주에 1회 및 2주마다 1회이다. 하나의 투여 경로는 비경구, 예를 들어 정맥내 주입이다. 바이러스-기반 약물의 제제화는 관련 기술분야의 통상의 기술 내에 있다. 특정 실시양태에서, 재조합 바이러스는 동결건조되고, 이어서 투여 시에 완충 염수 중에 재구성된다.
본원에 사용된 용어 "조합되어" 투여된다는 것은, 대상체가 장애를 앓고 있는 과정 동안 환자에 대한 치료의 효과가 한 시점에 중첩되도록 2종 (또는 그 초과)의 상이한 치료가 대상체에게 전달된다는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 특정 실시양태에서, 하나의 치료의 전달은 제2의 전달을 시작할 때 여전히 계속되며, 이는 투여의 면에서 중첩된다. 이는 때때로 본원에서 "동시" 또는 "공동 전달"로 지칭된다. 다른 실시양태에서, 하나의 치료의 전달은 다른 치료의 전달을 시작하기 전에 종료된다. 어느 하나의 경우의 일부 실시양태에서, 치료는 조합 투여로 인해 보다 효과적이다. 예를 들어, 제2 치료가 보다 효과적이며, 예를 들어, 더 적은 제2 치료에 의해 등가의 효과가 관찰되거나, 또는 제2 치료가 제1 치료의 부재 하에 투여된 경우에 관찰될 것보다 더 큰 정도로 제2 치료가 증상을 감소시키거나, 또는 제1 치료에 의해 유사한 상황이 관찰된다. 특정 실시양태에서, 장애와 관련된 증상 또는 다른 파라미터의 감소가 다른 치료의 부재 하에 전달된 하나의 치료에 의해 관찰되는 것보다 더 크도록 전달이 이루어진다. 2종의 치료의 효과는 부분적으로 상가적이거나, 전체적으로 상가적이거나, 또는 상가적 효과를 초과할 수 있다. 전달은 전달되는 제1 치료의 효과가 제2 치료가 전달될 때 여전히 검출가능하도록 이루어질 수 있다.
III. 제약 조성물/제제
본 개시내용은 또한 상기 재조합 아데노바이러스 중 임의의 것 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 합리적인 이익/위험 비에 부합하는, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 완충제, 담체 및 부형제를 의미한다. 담체(들)는 제제의 다른 성분과 상용성의 면에서 "허용되"어야 하고 수용자에게 유해하지 않아야 한다. 제약상 허용되는 담체는 제약 투여와 상용성인 완충제, 용매, 분산 매질, 코팅, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본원에 개시된 재조합 아데노바이러스를 함유하는 제약 조성물 및 제제는 그의 의도된 투여 경로와 상용성이도록 제제화될 수 있다. 투여 경로의 예는 근육내, 정맥내, 동맥내, 또는 종양내 피내, 흡입, 경피, 국소, 경점막 및 직장 투여이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 재조합 아데노바이러스의 안정화 및 저장을 위한 아데노바이러스 제제를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은
e) 상기 재조합 아데노바이러스 중 임의의 것의 1종 이상;
f) 적어도 1종의 완충제;
g) 적어도 1종의 장성 개질제;
h) 적어도 1종의 당 또는 적어도 1종의 안정화제, 또는 둘 다
를 포함하며; 약 7.0 내지 약 9.0 범위의 pH를 갖는 아데노바이러스용 제제를 제공한다.
특정 실시양태에서, 안정화제는 글리세롤이다. 특정 실시양태에서, 안정화제는 약 2% 내지 약 5% (v/v)이다.
특정 실시양태에서, 완충제는 트리스 (트리스-HCl 및/또는 모노-트리스 포함), TES, HEPES, 브루신 4수화물, EPPS, 트리신, 또는 히스티딘이다. 특정 실시양태에서, 완충제는 약 1mM 내지 약 30 mM의 농도이다.
일부 실시양태에서, 장성 개질제는 MgCl2, MnCl2, CaCl2, ZnCl2, NaCl, 또는 KCl이다. 한 실시양태에서, 장성 개질제는 NaCl이다. 한 실시양태에서, 장성 개질제는 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도이다. 한 실시양태에서, 장성 개질제는 약 10 mM 내지 약 250 mM의 농도이다. 한 실시양태에서, 장성 개질제는 약 25 mM 내지 약 100 mM의 농도이다. 한 실시양태에서, 장성 개질제는 약 25 mM의 농도이다.
특정 실시양태에서, 제제는 제1 장성 개질제 및 제2 장성 개질제를 포함하며, 여기서 제1 장성 개질제는 1가 양이온이고, 제2 장성 개질제는 2가 양이온이다. 특정 실시양태에서, 1가 양이온은 NaCl 또는 KCl이다. 특정 실시양태에서, 2가 양이온은 MgCl2, MnCl2, CaCl2, 또는 ZnCl2이다. 특정 실시양태에서, 장성 개질제 또는 2가 양이온은 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도이다.
일부 실시양태에서, 당은 수크로스 또는 트레할로스이다. 한 실시양태에서, 당은 수크로스이다. 한 실시양태에서, 당은 중량 대 부피 백분율이 약 2% 내지 약 8%이다. 한 실시양태에서, 당은 중량 대 부피 백분율이 약 3% 내지 약 5%이다. 한 실시양태에서, 당은 중량 대 부피 백분율이 약 5%이다.
특정 실시양태에서, 상기 제제 중 임의의 것은 적어도 1종의 비이온성 계면활성제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트-80 또는 폴리소르베이트-40이다. 한 실시양태에서, 비이온성 계면활성제는 약 0.001% 내지 약 1%의 농도이다. 한 실시양태에서, 비이온성 계면활성제는 약 0.02%의 농도이다.
특정 실시양태에서, 상기 제제 중 임의의 것은 적어도 1종의 자유 라디칼 산화 억제제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 자유 라디칼 산화 억제제는 EDTA이다. 한 실시양태에서, 자유 라디칼 산화 억제제는 약 0.01 mM 내지 약 5 mM의 농도이다. 한 실시양태에서, 자유 라디칼 산화 억제제는 약 0.05 mM 내지 약 2 mM의 농도이다. 한 실시양태에서, 자유 라디칼 산화 억제제는 약 0.1 mM의 농도이다.
특정 실시양태에서, 상기 제제 중 임의의 것은 적어도 1종의 동결보호제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 동결보호제는 EtOH이다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 약 0.01% 내지 5%의 농도이다. 일부 실시양태에서, 동결보호제는 약 0.1% 내지 2%의 농도이다. 한 실시양태에서, 동결보호제는 약 0.5%의 농도이다.
일부 실시양태에서, 제제는 약 200 mOs/L 내지 약 800 mOs/L의 오스몰농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 300 mOs/L 내지 약 600 mOs/L의 오스몰농도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 400 mOs/L 내지 약 500 mOs/L의 오스몰농도를 갖는다.
특정 실시양태에서, 상기 제제 중 임의의 것에서 재조합 종양용해 아데노바이러스는 약 1 x 107 vp/mL 내지 1 x 1013 vp/mL의 농도이다.
특정 실시양태에서, 제제는 약 20 mM 트리스, 약 25 mM NaCl, 약 2.5% 글리세롤을 포함하고, 제제는 약 8.0의 pH를 갖는다. 특정 실시양태에서, 제제는 약 20 mM 트리스, 약 25 mM NaCl, 약 3-5% 수크로스를 포함하고, 제제는 약 8.0의 pH를 갖는다. 특정 실시양태에서, 제제는 약 10 mM 트리스, 약 75 mM NaCl, 약 5% 수크로스, 약 0.02% 폴리소르베이트-80, 약 1 mM MgCl2, 약 0.1 mM EDTA, 약 0.5% EtOH를 포함하고, 제제는 약 8.0의 pH를 갖는다.
특정 실시양태에서, 상기 제제 중 임의의 것은 적어도 1종의 면역보조제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역보조제는 1) 명반, 2) 사포닌, 3) 비이온성 중합체 계면활성제, 4) 모노포스포릴 지질 A, 5) 뮤라밀 디펩티드, 및 6) 시토카인으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 상기 제제 중 임의의 것은 적어도 1종의 염료를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 제제 중 임의의 것은 적어도 1종의 가역적 프로테아제 억제제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 가역적 프로테아제 억제제는 L3/p23 시스테인 프로테아제의 억제제이다. 특정 실시양태에서, 상기 제제 중 임의의 것은 항산화제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항산화제는 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B6, 비타민 B12, 폴산, 또는 폴레이트이다.
표현 "중 적어도 하나"는 문맥상 및 사용상 달리 이해되지 않는 한, 그러한 표현 다음에 오는 언급된 객체들 및 언급된 객체들 중 2개 이상의 것의 다양한 조합을 각각 개별적으로 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 문맥상 달리 이해되지 않는 한, 3개 이상의 언급된 객체와 관련하여 표현 "및/또는"은 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
그의 문법적 등가물을 포함하여 용어 "포함하다," "포함한다," "포함하는," "갖다," "갖는다," "갖는," "함유하다," "함유한다," 또는 "함유하는"의 사용은, 달리 구체적으로 언급되거나 문맥으로부터 이해되지 않는 한, 일반적으로 예를 들어 추가의 미언급된 요소 또는 단계를 배제하지 않는 개방형의 비제한적 용어로서 이해되어야 한다.
용어 "약"이 정량적 값 앞에 사용된 경우에, 본 발명은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 특정 정량적 값 그 자체를 또한 포함한다. 본원에 사용된 용어 "약"은 달리 나타내거나 암시되지 않는 한, 공칭 값으로부터 ±10% 편차를 지칭한다.
단계의 순서 또는 특정 활동을 수행하는 순서는 본 발명이 작동가능하다면 중요하지 않은 것으로 이해되어야 한다. 게다가, 2 이상의 단계 또는 활동은 동시에 수행될 수 있다.
본원에서 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 어휘, 예를 들어 "예컨대" 또는 "포함한"의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위해 의도되며, 청구되지 않은 한 본 발명의 범주를 제한하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 어휘도 임의의 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실시에 필수적인 것임을 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
하기 작업 실시예는 예시적인 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않고, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 다른 실시양태가 이용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.
실시예 1
예시적인 IX-E2 삽입 부위의 뉴클레오티드 서열 (NCBI 참조 서열 AC_000008.1 (서열식별번호: 1)에 따른 뉴클레오티드 4029 내지 4093 넘버링)은 하기와 같다. 아데노바이러스 IX 유전자의 정지 코돈 (좌측 "TAA"; 서열식별번호: 8) 및 아데노바이러스 IVa2 유전자의 정지 코돈 (우측 "TTA"; 서열식별번호: 9)은 밑줄표시된다.
Figure pct00001
실시예 2
예시적인 L5-E4 삽입 부위의 뉴클레오티드 서열 (NCBI 참조 서열 AC_000008.1 (서열식별번호: 1)에 따른 뉴클레오티드 32785 내지 32916 넘버링)은 하기와 같다. 아데노바이러스 섬유 유전자의 정지 코돈 (좌측 "TAA"; 서열식별번호: 8) 및 아데노바이러스 E4 유전자의 ORF6/7의 정지 코돈 (우측 "TCA"; 서열식별번호: 10)은 밑줄표시된다.
Figure pct00002
실시예 3
L5-E4 부위에서 발현 카세트 내로 클로닝된 트랜스진을 갖는 바이러스를 생성하기 위해, 아데노바이러스 뉴클레오티드 서열 (E3 영역 내의 RIDα, RIDβ, 및 14.7k 유전자 및 E4 영역 내의 ORF1-ORF4 유전자의 결실을 함유함)을 갖는 플라스미드를, L5-E4 부위 내로 개재 SwaI 제한 부위 ("ATTTAAAT" 서열식별번호: 11)와 SV40 프로모터 및 종결인자를 갖는 발현 카세트를 삽입함으로써 변형시켰다. 이러한 변형된 뉴클레오티드 서열은, L5 전사 단위의 폴리아데닐화 신호 ("AATAAA" 서열식별번호: 12)로부터 E4 전사 단위의 폴리아데닐화 신호 ("TTTATT" 서열식별번호: 13)까지 하기와 같다:
서열식별번호: 14 [L5 초기 중공]
Figure pct00003
서열식별번호: 14에서, L5 및 E4 전사 단위의 폴리아데닐화 신호, 및 SwaI 제한 부위의 뉴클레오티드는 밑줄표시된다.
이어서, 마우스 GMCSF를 코딩하는 트랜스진을 SwaI 부위 내로 클로닝하여, 하기 서열을 생성하였다:
서열식별번호: 15 [L5 초기 mGMCSF]
Figure pct00004
서열식별번호: 15에서, L5 및 E4 전사 단위의 폴리아데닐화 신호, 및 SwaI 제한 부위의 잔류 뉴클레오티드는 밑줄표시되고, 마우스 GMCSF를 코딩하는 트랜스진은 볼드체표시된다.
바이러스 TAV-(L5-E4)mGMCSF는 (아데노바이러스 유형 5의 dl309 균주와 비교하여) 하기 변형을 보유하도록 생성하였다: 암성 세포에서 선택적 복제를 부여하기 위한 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, 바이러스 E1B-55K 유전자로 연장되지 않는 바이러스 E1B-19K 유전자의 5' 말단의 결실, E3 RIDα, RIDβ, 및 14.7k 유전자의 결실, 서열식별번호: 15의 서열, 및 E4 ORF1-ORF4 유전자의 결실.
mGMCSF 발현에 대해 시험하기 위해: A549 세포 (인간 암 세포주), ADS-12 세포 (마우스 암 세포주), 및 WI38 세포 (인간 정상 세포주)를 TAV-(L5-E4)mGMCSF로 MOI (감염 다중도) 5로 감염시켰다. 대조군으로서, 추가의 세포를 감염의 부재 하에 배양하거나, 또는 아데노바이러스 유형 5의 dl309 균주와 비교하여 하기의 변형을 보유하는 바이러스 TAV-(E1B-19K)mGMCSF로 감염시켰다: E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, 및 E1B-55K 유전자의 파괴 없이 E1B-19K 유전자의 5' 말단을 대체한 mGMCSF 유전자. 감염 4일 후, 조건화 배지를 사용하여 ELISA에서 마우스 GMCSF 발현을 측정하였다. 결과를 도 2에 제시한다: 둘 다의 바이러스는 A549 세포에서 높은 발현 수준, ADS-12 세포에서 중간 정도 발현, 및 WI38 세포에서 낮은 발현 수준을 나타내었다.
실시예 4
IX-E2 부위에의 발현 카세트 삽입을 조사하기 위해, 처음에 본 발명자들은 트랜스진의 삽입을 용이하게 하기 위해 프로모터와 종결인자 사이에 NotI 제한 부위 ("GCGGCCGC" 서열식별번호: 16)를 포함하는 시토메갈로바이러스 극초기 프로모터 (CMV 프로모터) 및 소 성장 호르몬의 전사 종결인자 (BGH 종결인자)를 갖는 발현 카세트를 삽입하였다. 그의 뉴클레오티드 서열은 IX의 폴리아데닐화 신호 ("AATAAA" 서열식별번호: 12)로부터 E2 전사 단위의 폴리아데닐화 신호 ("TTTATT" 서열식별번호: 13)까지 하기와 같다:
서열식별번호: 17 [IX 초기 중공]
Figure pct00005
IX 및 E2 전사체의 폴리아데닐화 신호, 및 NotI 제한 부위는 밑줄표시된다.
바이러스 TAV IX-WT L5-중공은 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, IX-E2 부위 내의 야생형 바이러스 서열, 및 서열 서열식별번호: 14 (L5-E4 부위 내의 중공 발현 카세트)를 보유하였다. 바이러스 TAV IX-WT L5-IL7은 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, IX-E2 부위 내의 야생형 바이러스 서열, 및 서열식별번호: 14의 L5-E4 카세트 내로 클로닝된 서열 서열식별번호: 18 (하기 참조, 대문자는 마우스 IL-7 유전자를 표시하고, 소문자는 밑줄표시된 SwaI 제한 부위로부터의 잔류 뉴클레오티드를 포함한 L5-E4 발현 카세트로부터의 플랭킹 뉴클레오티드를 나타냄)을 보유하였다:
서열식별번호: 18 [L5 mIL7]
Figure pct00006
바이러스 TAV IX-WT L5-GMCSF는 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, IX-E2 부위 내의 야생형 바이러스 서열, 및 서열식별번호: 14의 L5-E4 카세트 내로 클로닝된 서열 서열식별번호: 19 (대문자는 마우스 GMCSF 유전자를 표시하고, 소문자는 밑줄표시된 SwaI 제한 부위로부터의 잔류 뉴클레오티드를 포함한 L5-E4 발현 카세트로부터의 플랭킹 뉴클레오티드를 나타냄)를 보유하였다. 이러한 바이러스는 야생형 마우스 GMCSF는 보유하지만 서열식별번호: 15에 제시된 바이러스 TAV-(L5-E4)mGMCSF에 사용된 마우스 GMCSF의 코돈-최적화된 형태는 보유하지 않는다.
서열식별번호: 19 [L5 wt mGMCSF]
Figure pct00007
바이러스 TAV IX-GMCSF L5-IL7은 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, 서열식별번호: 17의 IX-E2 카세트 내로 클로닝된 서열 서열식별번호: 20 (대문자는 마우스 GMCSF 유전자를 표시하고, 소문자는 밑줄표시된 NotI 제한 부위로부터의 잔류 뉴클레오티드를 포함하여 IX-E2 발현 카세트의 플랭킹 뉴클레오티드를 나타냄), 및 서열식별번호: 18 및 서열식별번호: 14에 도시된 바와 같은 L5-E4 카세트 내로 클로닝된 마우스 IL-7을 보유하였다. 마우스 GMCSF의 서열은 바이러스 TAV IX-WT L5-GMCSF 및 TAV IX-GMCSF L5-IL7에서 동일하지만, 하나의 바이러스의 IX-E2 발현 카세트 및 다른 바이러스의 L5-E4 발현 카세트에 삽입되었다.
서열식별번호: 20 [IX wt mGMCSF]
Figure pct00008
이들 바이러스로부터의 트랜스진 발현에 대해 시험하기 위해, A549 세포를 바이러스로 MOI 5로 감염시키고, 4일 후에 조건화 배지를 수집하고, IL-7 및 GMCSF에 대한 ELISA에 사용하였다. GMCSF에 대한 ELISA는, 도 3에 도시된 바와 같이, SV40 프로모터에 의해 구동되는 L5-E4 부위의 카세트로부터의 발현보다 CMV 프로모터에 의해 구동되는 IX-E2 부위의 카세트로부터 실질적으로 더 높은 발현을 나타내었다.
실시예 5
초기 IX-E2 설계의 바이러스에서 (도 4), 본 발명자들은 의도하는 것과 반대 방향으로 전사를 구동하는 CMV 프로모터에 대한 임의의 가능성을 차단함으로써 바이러스 성장을 추가로 최적화할 수 있다고 추측하였다 (Seila et al., Science. (2008) 322(5909):1849-51). 따라서, 본 발명자들은 이러한 부위의 삽입물을 수정하여 삽입물의 5' 및 3' 말단 둘 다가 폴리아데닐화 전사체에 대해 정상 바이러스 유전자로부터 삽입물쪽으로, 뿐만 아니라 삽입물에서 정상 바이러스 유전자를 향하도록 배향된 폴리아데닐화 신호를 함유하게 하였다. 도 4의 수정된 IX-E2 설계를 참조한다.
수정된 삽입물의 뉴클레오티드 서열은, IX 전사체의 폴리아데닐화 신호로부터 E2 전사체의 폴리아데닐화 신호까지, 하기와 같다:
서열식별번호: 21 [IX 수정된 중공]
Figure pct00009
각각의 정방향 폴리아데닐화 신호 ("AATAAA" 서열식별번호: 12) 및 역방향 폴리아데닐화 신호 ("TTTATT" 서열식별번호: 13), 및 NotI 부위 ("GCGGCCGC" 서열식별번호: 16)는 밑줄표시된다. 수정된 IX-E2 설계를 갖는 발현 카세트를 보유하는 바이러스가 초기 IX-E2 설계를 갖는 바이러스보다 더 효율적으로 성장하였다.
실시예 6
바이러스 TAV-IXrL5-중공은 바이러스 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, 서열식별번호: 21 (수정된 IX-E2 설계의 중공 발현 카세트) 및 서열식별번호: 14 (L5-E4 부위 내의 중공 발현 카세트)를 보유하였다. 바이러스 TAV-IXrL5-hIL12는 바이러스 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, 수정된 IX-E2 발현 카세트 내의 인간 IL12A 쇄를 코딩하는 유전자 (서열식별번호: 22로 도시됨), 및 L5-E4 발현 카세트 내의 인간 IL12B 쇄를 코딩하는 유전자 (서열식별번호: 23으로 도시됨)를 보유한다. 서열식별번호: 22에서, 각각의 정방향 폴리아데닐화 신호 ("AATAAA" 서열식별번호: 12) 및 역방향 폴리아데닐화 신호 ("TTTATT" 서열식별번호: 13), 및 NotI 부위로부터의 잔류 뉴클레오티드는 밑줄표시되고, 인간 IL12A 쇄를 코딩하는 유전자는 볼드체표시된다. 서열식별번호: 23에서, L5 및 E4 전사 단위의 폴리아데닐화 신호, 및 SwaI 제한 부위의 잔류 뉴클레오티드는 밑줄표시되고, 인간 IL12B 쇄를 코딩하는 유전자는 볼드체표시된다.
서열식별번호: 22 [IX 수정된 hIL12A]
Figure pct00010
서열식별번호: 23 [L5 초기 hIL12B]
Figure pct00011
E1A 프로모터에서 TAV-255 결실을 보유하는 대신 야생형 E1A 프로모터를 보유하는 것을 제외하고, TAV-IXrL5-hIL12와 동일한 게놈 구조를 갖는 바이러스 WT-IXrL5-hIL12를 생성하였다. 이들 바이러스 각각은 또한 E3 RIDα, RIDβ, 및 14.7k 유전자의 결실 및 E4 ORF1-ORF4 유전자의 결실을 갖는다.
이러한 설계 접근법을 종양용해 아데노바이러스 내로 IL12를 혼입시키는 또 다른 전략과 비교하기 위해, 본 발명자들은 E1B-19K 부위에 보유된 푸린 절단 부위 (아미노산 RAKR; 서열식별번호: 24)에 의해 연결된 인간 IL12A 및 IL12B 쇄를 코딩하는 유전자를 보유하는 아데노바이러스를 시험하였다. 융합 단백질이 세포에 의해 합성될 때, 푸린 부위는 골지 내의 효소 푸린에 의해 RAKR 서열의 마지막 R과 다음 아미노산 (성숙 IL12A의 제1 아미노산) 사이에서 절단되었다. 본 발명자들은 이전에, 링커로서 푸린 절단 부위를 사용하는 것은 이종이량체 IL12 단백질의 높은 수준 발현으로 이어진다는 것을 발견하였다. 융합 유전자의 핵산 서열 (대문자), 클로닝에 사용된 플랭킹 SalI 및 XhoI 제한 부위 (밑줄표시), 및 아데노바이러스 게놈에 삽입된 부위를 나타내는 아데노바이러스 뉴클레오티드 (소문자)는 하기와 같다:
서열식별번호: 25 [hIL12 푸린]
Figure pct00012
바이러스 TAV-hIL12-푸린은 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실 및 E1B-19K 영역 내의 서열식별번호: 25를 보유한다. 대조군 바이러스 TAV-Δ19k는 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실 및 E1B-19K 영역의 결실을 보유한다.
종양용해 활성 및 IL12 발현에 대해 시험하기 위해, A549 세포를 TAV-Δ19k, TAV-hIL12-푸린, TAV-TAV-IXrL5-중공, 및 TAV-IXrL5-hIL12로 MOI 5로 삼중으로 감염시켰다. 감염 4일 후에, 조건화 배지를 수집하고, 오직 어셈블리된 IL12A-IL12B 이종이량체만을 검출하는 ELISA에서 IL12를 측정하고, 나머지 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 도 5에 제시된 바와 같이, TAV-hIL12-푸린은 상응하는 대조군 바이러스 TAV-Δ19k보다 약간 덜 용해성이었고, 이는 트랜스진을 E1B-19K 영역에 삽입하였을 때의 본 발명자들의 일반적 경험과 일치하였으며, 한편 TAV-IXrL5-hIL12는 TAV-IXrL5-중공 및 TAV-Δ19k만큼 용해성이었다. 이는 IX-E2 및 L5-E4 영역에의 발현 카세트의 삽입이 바이러스 적합성에 최소의 영향을 미치고, 이와 관련하여 E1B-19K 영역에의 트랜스진의 삽입보다 뛰어날 수 있다는 것을 입증하였다.
도 6에 제시된 바와 같이, TAV-hIL12-푸린은 IX-E2 및 L5-E4 카세트를 사용한 바이러스보다 더 높은 수준의 IL12를 발현하였다. 이는 2개의 발현 카세트 중 적어도 1개가 준최적일 수 있다는 것을 시사하였고, 설계를 개선시키기 위한 추가의 조사를 촉발하였다. 그러나, TAV-hIL12-푸린으로부터 생성된 IL12 단백질은 IL12B 쇄의 C-말단에 비-천연 RAKR 서열 (잔류 푸린 인식 부위)을 함유하고, 이는 바람직하지 않은 생체내 효과, 예컨대 트랜스진에 대한 면역원성 또는 천연 IL12에 대한 면역원성으로 이어질 수 있는 반면에, TAV-IXrL5-hIL12에 의해 생성된 IL12는 그것이 완전히 천연이라는 이점을 갖는다.
실시예 7
IX-E2 카세트와 비교하여 L5-E4 카세트로부터 비교적 낮은 발현이 관찰된 것에 기초하여, 본 발명자들은 L5-E4 카세트가 IL-12 이종이량체의 낮은 발현의 원인인 것으로 가설화하였다. 본 발명자들은 L5-E4 영역을, IX-E2 영역에 대해 사용한 접근법과 유사하게, 양쪽 말단에 양방향성 폴리아데닐화 신호를 포함하도록 수정하였다.
뉴클레오티드 서열 서열식별번호: 26을 L5-E4 영역 내로 클로닝하였고, L5 및 E4 전사체의 5' 및 3' 말단의 폴리아데닐화 신호 및 모든 폴리아데닐화 신호 및 SwaI 제한 부위를 밑줄표시하여 제시한다.
서열식별번호: 26 [L5 수정된 SV40]
Figure pct00013
바이러스 TAV-(IXr)중공-(L5r)중공은 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, 서열식별번호: 21에 제시된 IX-E2 영역에 트랜스진이 부재하는 수정된 IX-E2 카세트, 및 서열식별번호: 26에 제시된 L5-E4 영역에 트랜스진이 부재하는 수정된 L5-E4 카세트로 만들어졌다.
바이러스 TAV-(IXr)mIL7-(L5r)mGMCSF는 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, 서열식별번호: 20에 제시된 바와 같은 NotI 부위 내로 클로닝된 마우스 GMCSF 유전자를 갖는 서열식별번호: 21에 제시된 수정된 IX-E2 카세트, 및 서열식별번호: 18에 제시된 바와 같은 SwaI 부위 내로 클로닝된 마우스 IL-7 유전자를 갖는 서열식별번호: 26에 제시된 수정된 L5-E4 카세트를 함유하였다.
바이러스 TAV-(IXr)mGMCSF-(L5r)mIL7은 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, 서열식별번호: 27에 제시된 바와 같은 NotI 부위 내로 클로닝된 마우스 IL-7 유전자를 갖는 서열식별번호: 21에 제시된 수정된 IX-E2 카세트, 및 서열식별번호: 19에 제시된 바와 같은 SwaI 부위 내로 클로닝된 마우스 GMCSF 유전자를 갖는 서열식별번호: 26에 제시된 수정된 L5-E4 카세트를 함유하였다. 따라서, 바이러스 TAV-(IXr)mGMCSF-(L5r)mIL7 및 TAV-(IXr)mIL7-(L5r)mGMCSF는 단지, IL-7 및 GMCSF의 유전자가 어느 부위: 수정된 IX-E2 또는 수정된 L5-E4 부위에 삽입되었는지만이 상이하였다.
서열식별번호: 27 [IX mIL7]
Figure pct00014
이들 바이러스로부터의 트랜스진 발현을 시험하기 위해, A549 세포를 각각의 바이러스로 MOI 5로 삼중으로 감염시켰다. 조건화 배지를 4일 후에 수집하고, GMCSF 및 IL-7을 ELISA에서 측정하였다. IL-7 및 GMCSF 둘 다의 경우, 수정된 L5-E4 부위보다 수정된 IX-E2 부위에 유전자를 보유하는 바이러스로부터 발현이 더 높았다. 이는 CMV 프로모터를 사용하는 IX-E2 내의 발현 카세트가 SV40 프로모터를 사용하는 L5-E4 내의 카세트보다 더 높은 수준으로 발현하고, 양방향성 폴리아데닐화 신호를 포함하도록 L5-E4 부위를 수정하는 것에 의해 영향을 받지 않는다는 이전의 발견을 확인시켜주었다.
실시예 8
이어서, 본 발명자들은 L5-E4 부위에서 프로모터를 추가로 개선시키는 것을 조사하였다. 초기에 사용된 SV40 프로모터는 주요 전사 개시 부위에서 G (야생형 SV40 서열의 것)에서 T (L5-E4 삽입물 내의 것)로의 점 돌연변이를 가졌고, 따라서 본 발명자들은 서열식별번호: 28에 제시된 바와 같이 뉴클레오티드가 야생형 G로 역변화된 L5-E4 삽입물을 생성하였고, 여기서 이전에 돌연변이된 뉴클레오티드, 폴리아데닐화 신호, 및 SwaI 제한 부위는 밑줄표시된다. 본 발명자들은 또한 상이한 프로모터를 사용하여 조사하였고, SV40 프로모터 대신 인간 EF1A 프로모터를 사용하는 L5-E4 삽입물을 생성하였다. 서열식별번호: 29는 인간 EF1A 프로모터를 사용하는 L5-E4 삽입물을 나타내며, 이는 L5 전사체로부터의 폴리아데닐화 신호로부터 E4 전사체의 폴리아데닐화 신호까지 제시되고, 폴리아데닐화 신호 및 SwaI 제한 부위는 밑줄표시된다.
서열식별번호: 28 [L5 수정된 SV40 wt 중공]
Figure pct00015
서열식별번호: 29 [L5 수정된 EF1A 중공]
Figure pct00016
L5-E4 내의 이들 수정된 발현 카세트를 시험하기 위해, 본 발명자들은 IX-E2 부위에 마우스 IL-7 유전자를 보유하는 바이러스 및 새로운 L5-E4 부위에 마우스 GMCSF 유전자를 보유하는 바이러스를 생성하였다. IX-E2 부위에 사용된 마우스 IL-7 유전자를, 코딩된 단백질 서열은 변화시키지 않지만 내부 AATAAA 서열을 제거하는 동의 서열로 치환하는, 서열 AATAAA를 갖는 유전자의 3' 말단 근처의 2개의 영역에 침묵 돌연변이를 도입함으로써 변형시켰고 (이는 폴리아데닐화 신호로 프로세싱되어 감소된 발현으로 이어질 수 있음); 서열식별번호: 30은 IL-7 코딩 뉴클레오티드가 대문자로 표시되고, 돌연변이가 밑줄표시되고, IX-E2 카세트의 플랭킹 뉴클레오티드는 밑줄표시된 NotI 부위로부터의 잔류 뉴클레오티드와 함께 소문자로 표시된 뉴클레오티드 서열을 보여준다. L5-E4 부위 내의 마우스 GMCSF 유전자의 발현을 개선시키기 위한 시도로, 컨센서스 코작 서열 (뉴클레오티드 GCCACC)을 SwaI 부위의 잔류 뉴클레오티드 및 GMCSF 유전자의 개시 코돈 사이에 포함시켰고; 서열식별번호: 31은 마우스 GMCSF 유전자 및 코작 서열이 대문자로 표시되고, 코작 서열이 밑줄표시되고, L5-E4 카세트의 플랭킹 뉴클레오티드는 밑줄표시된 SwaI 부위로부터의 잔류 뉴클레오티드와 함께 소문자로 표시된 뉴클레오티드 서열을 보여준다.
서열식별번호: 30 [mIL7 no poly-A]
Figure pct00017
서열식별번호: 31 [mGMCSF Kozak]
Figure pct00018
바이러스 TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5SV40wt)KozakmGMCSF는 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, 서열식별번호: 30에 제시된 바와 같은 NotI 부위 내로 클로닝된 잠재적 내부 폴리아데닐화 부위에 동의 돌연변이를 갖는 마우스 IL-7 유전자를 갖는 서열식별번호: 21에 제시된 수정된 IX-E2 삽입물, 및 서열식별번호: 31에 제시된 바와 같은 SwaI 부위 내로 클로닝된 컨센서스 코작 서열을 포함하는 마우스 GMCSF 유전자를 갖는 서열식별번호: 28에 제시된 야생형 SV40 프로모터를 갖는 L5-E4 삽입물을 함유하였다. 바이러스 TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF는 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, 서열식별번호: 30에 제시된 바와 같은 NotI 부위 내로 클로닝된 잠재적 내부 폴리아데닐화 부위에 동의 돌연변이를 갖는 마우스 IL-7 유전자를 갖는 서열식별번호: 21에 제시된 수정된 IX-E2 삽입물, 및 서열식별번호: 31에 제시된 바와 같은 SwaI 부위 내로 클로닝된 컨센서스 코작 서열을 포함하는 마우스 GMCSF 유전자를 갖는 서열식별번호: 29에 제시된 인간 EF1A 프로모터를 갖는 L5-E4 삽입물을 함유한다.
이들 바이러스를 트랜스진 발현에 대해 시험하기 위해, A549 세포를 2종의 바이러스로 MOI 5로 삼중으로 감염시켰다. 4일 후, 조건화 배지를 수집하고, ELISA에 사용하여 IL-7 및 GMCSF 발현을 측정하였다. 결과를 도 7에 제시한다. 인간 EF1A 프로모터는 적절히 더 높게 발현시켰고, 추가의 개발을 위해 선택되었다. 바이러스 TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF를 SF-BMAdR 281 세포 (A549 세포로부터 유래됨)의 무혈청 현탁 배양물 중에서 증폭시키고, 세포를 용해시키고, 바이러스를 크로마토그래피로 정제하고, 25 mM NaCl, 20 mM 트리스, 2.5% 글리세롤을 함유하는 pH 8 완충제 내로 투석함으로써, 상기 바이러스를 마우스 실험을 위한 제약 작용제로서 제조하였다. 이에 따라 제조된 바이러스는 바이러스 입자 농도 5.8 x 1011 vp/ml 및 감염 역가 3.0 x 1010 IU/ml를 가졌다.
실시예 9
본 발명자들은 아데노바이러스 사멸 단백질 (ADP)의 결실이 트랜스진의 발현을 개선시킬 수 있는지 추가로 조사하였다. ADP는 바이러스 복제 동안 후기에 발현되고, 숙주 세포를 용해시켜 자손 비리온을 방출하므로, 따라서 그의 제거는 세포가 생존하게 하고 사멸되기 전에 트랜스진을 더 오래 발현하게 할 수 있다. TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF 바이러스에 사용된 E3 RIDα, RIDβ, 및 14.7K 결실 상황 하의 ADP 유전자의 뉴클레오티드 서열을 서열식별번호: 32에 제시하며, 여기서 ADP를 코딩하는 뉴클레오티드는 대문자로 표시되고, E3 RIDα, RIDβ, 및 14.7K 결실 부위는 하이픈으로 표시되고, 플랭킹 아데노바이러스 뉴클레오티드는 소문자로 표시된다. ΔADP 결실을 생성하기 위해, 서열식별번호: 32 내의 밑줄표시된 뉴클레오티드를 결실시켰다.
서열식별번호: 32 [ADP]
Figure pct00019
바이러스 TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF-ΔADP를, 그것이 또한 서열식별번호: 32의 밑줄표시된 바와 같은 ADP 유전자의 뉴클레오티드의 결실을 함유하는 것을 제외하고, TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF와 동일한 게놈으로 생성하였다.
ADP 결실이 보다 장기간의 보다 높은 트랜스진 발현으로 이어지는지 시험하기 위해, A549 세포를 TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF 및 TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF-ΔADP로 MOI 5로 감염시키고, 감염 후 3일마다 조건화 배지를 수집하여 ELISA에서 IL-7 및 GMCSF를 측정하였다. 결과를 도 8에 제시한다. 실험 과정 동안 세포가 관찰되었고 세포 사멸이 TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF에 의한 감염 후 약 3일부터 TAV-(IXr)mIL7noPA-(L5EF1A)KozakmGMCSF-ΔADP에 의한 감염 후 약 9일까지 지연되었지만, 2종의 바이러스 사이의 트랜스진 발현 수준에서는 확실한 차이가 존재하지 않았다. 그러므로, 이러한 실험에서와 같이 가용성 시토카인의 발현은 증진되지 않았지만, 감염된 세포 표면 상에서의 공동자극 분자의 발현과 같은 일부 적용의 경우, ADP를 결실시키는 것이 세포가 더 오래 생존하고 그의 표면 상의 공동자극 분자가 더 긴 기간에 걸쳐 표적 세포를 활성화시킬 수 있으므로 유리할 수 있었다.
실시예 10
이어서 본 발명자들은 3종의 트랜스진: 공동자극 분자 CD80 및 CD137L 및 부착 분자 ICAM1을 발현하는 바이러스의 설계의 일부로서 IX-E2 및 L5-E4 부위를 사용하였다. 본 발명자들은 이전에 바이러스 E1B-19K 유전자의 5' 말단 대신 모든 3종의 이들 트랜스진을 보유하고 3종의 트랜스진 각각의 사이에 IRES가 존재하는 바이러스를 생성하였다. E1B-19K 영역 내의 그러한 바이러스의 뉴클레오티드 서열을, 5' 플랭킹 아데노바이러스 뉴클레오티드 서열 및 클로닝에 사용된 SalI 제한 부위 (소문자), 마우스 CD80 (대문자), 뇌심근염 바이러스로부터의 IRES (소문자), 마우스 CD137L (대문자), 구제역 바이러스로부터의 IRES (소문자), 마우스 ICAM1 (대문자), 및 클로닝에 사용된 XhoI 제한 부위를 포함하는 3' 플랭킹 아데노바이러스 뉴클레오티드 서열과 함께 서열식별번호: 33에 제시한다. 그러한 바이러스, TAV-mCD80(IRES)mCD137L(IRES)mICAM1은 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, E1B-19K 부위 내의 서열식별번호: 33, 및 E3 영역 ADP, RIDα, RIDβ, 및 14.7K 유전자 및 E4 영역 ORF1-4 유전자의 결실을 함유한다.
서열식별번호: 33 [Costim IRES]
Figure pct00020
Figure pct00021
본 발명자들은 IRES 다음의 유전자의 발현이, IRES에 의해 번역이 개시되지 않는 유전자와 비교하여 일반적으로 불량하다는 것을 발견하였고, 따라서 본 발명자들은 대안적 전략으로서 IX-E2 및 L5-E4 부위를 사용하여 조사하였다. 본 발명자들은 서열식별번호: 34에 제시된 바와 같은 E1B-19K 부위 내의 마우스 CD80 (CD80 유전자는 대문자로 표시되고 플랭킹 아데노바이러스 서열 및 제한 부위는 소문자로 표시됨) (이는 다른 바이러스에서 사용되는 SalI 및 XhoI 제한 부위 대신 Bsu36I 제한 부위를 사용함), 서열식별번호: 35에 제시된 바와 같은 NotI 부위에 삽입된 CD137L 유전자를 갖는 서열식별번호: 21의 IX-E2 부위 내의 마우스 CD137L 유전자 (CD137L 유전자는 대문자로 표시되고 플랭킹 발현 카세트 서열 및 잔류 NotI 제한 부위는 소문자로 표시됨), 및 서열식별번호: 36에 제시된 바와 같은 SwaI 부위에 삽입된 ICAM1 유전자를 갖는 서열식별번호: 29의 L5-E4 부위 내의 마우스 ICAM1 유전자 (ICAM1 유전자는 대문자로 표시되고 플랭킹 발현 카세트 서열 및 잔류 SwaI 부위는 소문자로 표시됨)를 보유하는 바이러스 TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1을 생성하였다. 이러한 바이러스는 또한 E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, E3 영역 ADP, RIDα, RIDβ, 및 14.7K 유전자의 결실, 및 E4 영역 ORF1-4 유전자의 결실을 함유한다.
서열식별번호: 34 [19k mCD80]
Figure pct00022
서열식별번호: 35 [IX mCD137L]
Figure pct00023
서열식별번호: 36 [L5 mICAM1]
Figure pct00024
이들 2종의 바이러스로부터의 발현에 대해 시험하기 위해: A549 세포, HT29 세포, ADS12 세포, 및 F244 세포를 TAV-mCD80(IRES)mCD137L(IRES)mICAM1, TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1, 또는 TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1과 동일한 구조를 갖지만 트랜스진은 부재하는 대조군 바이러스 TAV-(19k)중공-(IX)중공-(L5)중공으로 MOI 3으로 감염시켰다. 2일 후에, 세포를 CD80, CD137L 및 ICAM1에 대해 염색하였고, 결과를 도 9-도 12에 제시한다. TAV-mCD80(IRES)mCD137L(IRES)mICAM1에서 IRES 다음에 발현된 경우 CD137L 및 ICAM1 유전자의 발현은 불량하였지만, TAV-(19k)mCD80-(IX)mCD137L-(L5)mICAM1에 의한 IX-E2 및 L5-E4 부위로부터의 그러한 유전자의 발현은 강건하였다.
실시예 11
상기 기재된 실험은 인간 아데노바이러스 유형 5에 기초한 아데노바이러스를 사용하였지만, 다른 아데노바이러스는 매우 유사한 구조를 갖고, 상기 기재된 IX-E2 및 L5-E4 부위에 상동인 명확하게 확인가능한 부위를 갖는다. 예를 들어, 인간 아데노바이러스 유형 35는 서열식별번호: 37에 제시된 IX-E2 부위의 서열을 갖고, 서열식별번호: 38에 제시된 L5-E4 부위의 서열을 가지며, 여기서 폴리아데닐화 신호는 각각의 서열에 밑줄표시된다.
서열식별번호: 37 [Ad35 wt IX-E2]
Figure pct00025
서열식별번호: 38 [Ad35 wt L5-E4]
Figure pct00026
발현 카세트가 이들 부위 내로 삽입될 수 있는지 결정하기 위해, IX-E2 부위를 서열식별번호: 39에 제시된 바와 같은 아데노바이러스 유형 5 수정된 IX-E2 부위에 사용된 것과 동일한 서열로 변형시키고 (발현 카세트는 아데노바이러스 유형 5에서와 반대 배향으로 삽입되므로, 소문자로 표시된 플랭킹 바이러스 서열은 서열식별번호: 37에 제시된 통상적인 주석의 역 상보체임), L5-E4 부위를 서열식별번호: 40에 제시된 바와 같은 EF1A 프로모터를 갖는 아데노바이러스 유형 5 부위에 사용된 것과 동일한 서열로 변형시켰다. 부위 IX-E2 및 L5-E4 내의 그러한 발현 카세트 둘 다, 뿐만 아니라 E3 RIDα, RIDβ, 및 14.7K 유전자 및 E4 ORF1-4 유전자의 결실을 보유하는 아데노바이러스 유형 35가 회생되었고, 이는 이들 부위가 아데노바이러스의 다른 혈청형에서 발현 카세트의 삽입을 위해 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 서로 대면하는 폴리아데닐화 부위를 갖는 2개의 인접한 전사 단위 사이에 발현 카세트를 삽입하는 전략은 원칙적으로 아데노바이러스에 제한되지 않고, 잠재적으로 다른 바이러스에도 또한 적용될 수 있다.
서열식별번호: 39 [Ad35 IX-E2 카세트]
Figure pct00027
서열식별번호: 40 [Ad35 L5-E4 카세트]
Figure pct00028
실시예 12
본 발명자들은 전임상 실험에서 모델로서 사용하기 위한 마우스 IL12A 및 IL12B 유전자를 보유하는 바이러스를 생성하기 위해 수정된 IX-E2 및 L5-E4 부위를 사용하였다. 마우스 IL12A에 대한 유전자를 서열식별번호: 21에 제시된 발현 카세트를 사용하여 수정된 IX-E2 부위의 NotI 제한 부위 내로 클로닝하여 서열식별번호: 42의 서열을 생성하였고, 여기서 NotI 제한 부위의 잔류 뉴클레오티드는 밑줄표시된다. 마우스 IL12B에 대한 유전자를 서열식별번호: 29에 제시된 EF1A 프로모터를 사용하는 발현 카세트를 사용하여 L5-E4 부위의 SwaI 제한 부위 내로 클로닝하여 서열식별번호: 43의 서열을 생성하였고, 여기서 SwaI 제한 부위의 잔류 뉴클레오티드는 밑줄표시된다.
서열식별번호: 42
Figure pct00029
서열식별번호: 43
Figure pct00030
E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, 서열식별번호: 21에 제시된 트랜스진이 부재하는 IX-E2 발현 카세트, 및 서열식별번호: 29에 제시된 트랜스진이 부재하는 L5-E4 발현 카세트를 보유하는 바이러스 TAV-IX5-중공을 생성하였다. E1A 프로모터 내의 TAV-255 결실, 서열식별번호: 42의 마우스 IL12A 유전자를 포함하는 IX-E2 발현 카세트, 및 서열식별번호: 43의 마우스 IL12B 유전자를 포함하는 L5-E4 발현 카세트를 보유하는 바이러스 TAV-IX5-mIL12를 생성하였다.
이들 바이러스를 종양용해에 대해 시험하기 위해, A549 세포를 TAV-IX5-중공 또는 TAV-IX5-mIL12 바이러스로 MOI 5로 감염시키거나, 또는 비-감염 대조군으로 유지시키고, 웰을 감염 후 2일마다 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 도 13에 제시된 바와 같이, 중공 대조군 바이러스 및 마우스 IL-12를 보유하는 바이러스 둘 다는 4-6일 내에 용해성이었다.
트랜스진 발현에 대해 시험하기 위해, A549 세포를 TAV-IX5-중공 또는 TAV-IX5-mIL12 바이러스로 MOI 5로 삼중으로 감염시키고, 감염 5일 후에 조건화 배지를 수집하여, 마우스 IL12A 및 마우스 IL12B 쇄 둘 다를 갖는 이종이량체만을 검출하는 ELISA를 사용하여 마우스 IL-12를 측정하였다. 도 14에 제시된 바와 같이, TAV-IX5-mIL12는 높은 수준의 IL-12 이종이량체의 발현을 유도하였다.
인간 아데노바이러스 5, 완전 게놈
NCBI 참조 서열: AC_000008.1 (서열식별번호: 1)
>AC_000008.1 인간 아데노바이러스 5, 완전 게놈
Figure pct00031
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Figure pct00033
Figure pct00034
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Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
인간 아데노바이러스 35, 완전 게놈
NCBI 참조 서열: AC_000019.1 (서열식별번호: 41)
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
참조로 포함
본원에 언급된 각각의 특허 문헌 및 과학 논문의 전체 개시내용은 모든 목적상 참조로 포함된다.
등가물
본 발명은 그의 취지 또는 본질적인 특징으로부터 벗어나지 않는 다른 구체적 형태로 구현될 수 있다. 따라서, 상기 실시양태는 모든 측면에서 본원에 기재된 본 발명을 제한하기보다는 예시하는 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범주는 상기 설명에 의해서가 아니라 첨부된 청구범위에 의해 지정되고, 청구범위의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화가 그 안에 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> EpicentRx, Inc. Larson, Christopher Oronsky, Bryan Reid, Tony R. <120> RECOMBINANT ADENOVIRUSES CARRYING TRANSGENES <130> EPRX-002/01WO 330096-2019 <150> US 62/511,822 <151> 2017-05-26 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 35938 <212> DNA <213> Human adenovirus 5 <400> 1 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60 ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120 gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180 gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240 taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300 agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360 gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420 cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg 480 tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540 tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga 600 aatggccgcc agtcttttgg accagctgat cgaagaggta ctggctgata atcttccacc 660 tcctagccat tttgaaccac ctacccttca cgaactgtat gatttagacg tgacggcccc 720 cgaagatccc aacgaggagg cggtttcgca gatttttccc gactctgtaa tgttggcggt 780 gcaggaaggg attgacttac tcacttttcc gccggcgccc ggttctccgg agccgcctca 840 cctttcccgg cagcccgagc agccggagca gagagccttg ggtccggttt ctatgccaaa 900 ccttgtaccg gaggtgatcg atcttacctg ccacgaggct ggctttccac ccagtgacga 960 cgaggatgaa gagggtgagg agtttgtgtt agattatgtg gagcaccccg ggcacggttg 1020 caggtcttgt cattatcacc ggaggaatac gggggaccca gatattatgt gttcgctttg 1080 ctatatgagg acctgtggca tgtttgtcta cagtaagtga aaattatggg cagtgggtga 1140 tagagtggtg ggtttggtgt ggtaattttt tttttaattt ttacagtttt gtggtttaaa 1200 gaattttgta ttgtgatttt tttaaaaggt cctgtgtctg aacctgagcc tgagcccgag 1260 ccagaaccgg agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa tggcgcctgc tatcctgaga 1320 cgcccgacat cacctgtgtc tagagaatgc aatagtagta cggatagctg tgactccggt 1380 ccttctaaca cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc tgtgccccat taaaccagtt 1440 gccgtgagag ttggtgggcg tcgccaggct gtggaatgta tcgaggactt gcttaacgag 1500 cctgggcaac ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc cataaggtgt aaacctgtga 1560 ttgcgtgtgt ggttaacgcc tttgtttgct gaatgagttg atgtaagttt aataaagggt 1620 gagataatgt ttaacttgca tggcgtgtta aatggggcgg ggcttaaagg gtatataatg 1680 cgccgtgggc taatcttggt tacatctgac ctcatggagg cttgggagtg tttggaagat 1740 ttttctgctg tgcgtaactt gctggaacag agctctaaca gtacctcttg gttttggagg 1800 tttctgtggg gctcatccca ggcaaagtta gtctgcagaa ttaaggagga ttacaagtgg 1860 gaatttgaag agcttttgaa atcctgtggt gagctgtttg attctttgaa tctgggtcac 1920 caggcgcttt tccaagagaa ggtcatcaag actttggatt tttccacacc ggggcgcgct 1980 gcggctgctg ttgctttttt gagttttata aaggataaat ggagcgaaga aacccatctg 2040 agcggggggt acctgctgga ttttctggcc atgcatctgt ggagagcggt tgtgagacac 2100 aagaatcgcc tgctactgtt gtcttccgtc cgcccggcga taataccgac ggaggagcag 2160 cagcagcagc aggaggaagc caggcggcgg cggcaggagc agagcccatg gaacccgaga 2220 gccggcctgg accctcggga atgaatgttg tacaggtggc tgaactgtat ccagaactga 2280 gacgcatttt gacaattaca gaggatgggc aggggctaaa gggggtaaag agggagcggg 2340 gggcttgtga ggctacagag gaggctagga atctagcttt tagcttaatg accagacacc 2400 gtcctgagtg tattactttt caacagatca aggataattg cgctaatgag cttgatctgc 2460 tggcgcagaa gtattccata gagcagctga ccacttactg gctgcagcca ggggatgatt 2520 ttgaggaggc tattagggta tatgcaaagg tggcacttag gccagattgc aagtacaaga 2580 tcagcaaact tgtaaatatc aggaattgtt gctacatttc tgggaacggg gccgaggtgg 2640 agatagatac ggaggatagg gtggccttta gatgtagcat gataaatatg tggccggggg 2700 tgcttggcat ggacggggtg gttattatga atgtaaggtt tactggcccc aattttagcg 2760 gtacggtttt cctggccaat accaacctta tcctacacgg tgtaagcttc tatgggttta 2820 acaatacctg tgtggaagcc tggaccgatg taagggttcg gggctgtgcc ttttactgct 2880 gctggaaggg ggtggtgtgt cgccccaaaa gcagggcttc aattaagaaa tgcctctttg 2940 aaaggtgtac cttgggtatc ctgtctgagg gtaactccag ggtgcgccac aatgtggcct 3000 ccgactgtgg ttgcttcatg ctagtgaaaa gcgtggctgt gattaagcat aacatggtat 3060 gtggcaactg cgaggacagg gcctctcaga tgctgacctg ctcggacggc aactgtcacc 3120 tgctgaagac cattcacgta gccagccact ctcgcaaggc ctggccagtg tttgagcata 3180 acatactgac ccgctgttcc ttgcatttgg gtaacaggag gggggtgttc ctaccttacc 3240 aatgcaattt gagtcacact aagatattgc ttgagcccga gagcatgtcc aaggtgaacc 3300 tgaacggggt gtttgacatg accatgaaga tctggaaggt gctgaggtac gatgagaccc 3360 gcaccaggtg cagaccctgc gagtgtggcg gtaaacatat taggaaccag cctgtgatgc 3420 tggatgtgac cgaggagctg aggcccgatc acttggtgct ggcctgcacc cgcgctgagt 3480 ttggctctag cgatgaagat acagattgag gtactgaaat gtgtgggcgt ggcttaaggg 3540 tgggaaagaa tatataaggt gggggtctta tgtagttttg tatctgtttt gcagcagccg 3600 ccgccgccat gagcaccaac tcgtttgatg gaagcattgt gagctcatat ttgacaacgc 3660 gcatgccccc atgggccggg gtgcgtcaga atgtgatggg ctccagcatt gatggtcgcc 3720 ccgtcctgcc cgcaaactct actaccttga cctacgagac cgtgtctgga acgccgttgg 3780 agactgcagc ctccgccgcc gcttcagccg ctgcagccac cgcccgcggg attgtgactg 3840 actttgcttt cctgagcccg cttgcaagca gtgcagcttc ccgttcatcc gcccgcgatg 3900 acaagttgac ggctcttttg gcacaattgg attctttgac ccgggaactt aatgtcgttt 3960 ctcagcagct gttggatctg cgccagcagg tttctgccct gaaggcttcc tcccctccca 4020 atgcggttta aaacataaat aaaaaaccag actctgtttg gatttggatc aagcaagtgt 4080 cttgctgtct ttatttaggg gttttgcgcg cgcggtaggc ccgggaccag cggtctcggt 4140 cgttgagggt cctgtgtatt ttttccagga cgtggtaaag gtgactctgg atgttcagat 4200 acatgggcat aagcccgtct ctggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctgcg 4260 gggtggtgtt gtagatgatc cagtcgtagc aggagcgctg ggcgtggtgc ctaaaaatgt 4320 ctttcagtag caagctgatt gccaggggca ggcccttggt gtaagtgttt acaaagcggt 4380 taagctggga tgggtgcata cgtggggata tgagatgcat cttggactgt atttttaggt 4440 tggctatgtt cccagccata tccctccggg gattcatgtt gtgcagaacc accagcacag 4500 tgtatccggt gcacttggga aatttgtcat gtagcttaga aggaaatgcg tggaagaact 4560 tggagacgcc cttgtgacct ccaagatttt ccatgcattc gtccataatg atggcaatgg 4620 gcccacgggc ggcggcctgg gcgaagatat ttctgggatc actaacgtca tagttgtgtt 4680 ccaggatgag atcgtcatag gccattttta caaagcgcgg gcggagggtg ccagactgcg 4740 gtataatggt tccatccggc ccaggggcgt agttaccctc acagatttgc atttcccacg 4800 ctttgagttc agatgggggg atcatgtcta cctgcggggc gatgaagaaa acggtttccg 4860 gggtagggga gatcagctgg gaagaaagca ggttcctgag cagctgcgac ttaccgcagc 4920 cggtgggccc gtaaatcaca cctattaccg ggtgcaactg gtagttaaga gagctgcagc 4980 tgccgtcatc cctgagcagg ggggccactt cgttaagcat gtccctgact cgcatgtttt 5040 ccctgaccaa atccgccaga aggcgctcgc cgcccagcga tagcagttct tgcaaggaag 5100 caaagttttt caacggtttg agaccgtccg ccgtaggcat gcttttgagc gtttgaccaa 5160 gcagttccag gcggtcccac agctcggtca cctgctctac ggcatctcga tccagcatat 5220 ctcctcgttt cgcgggttgg ggcggctttc gctgtacggc agtagtcggt gctcgtccag 5280 acgggccagg gtcatgtctt tccacgggcg cagggtcctc gtcagcgtag tctgggtcac 5340 ggtgaagggg tgcgctccgg gctgcgcgct ggccagggtg cgcttgaggc tggtcctgct 5400 ggtgctgaag cgctgccggt cttcgccctg cgcgtcggcc aggtagcatt tgaccatggt 5460 gtcatagtcc agcccctccg cggcgtggcc cttggcgcgc agcttgccct tggaggaggc 5520 gccgcacgag gggcagtgca gacttttgag ggcgtagagc ttgggcgcga gaaataccga 5580 ttccggggag taggcatccg cgccgcaggc cccgcagacg gtctcgcatt ccacgagcca 5640 ggtgagctct ggccgttcgg ggtcaaaaac caggtttccc ccatgctttt tgatgcgttt 5700 cttacctctg gtttccatga gccggtgtcc acgctcggtg acgaaaaggc tgtccgtgtc 5760 cccgtataca gacttgagag gcctgtcctc gagcggtgtt ccgcggtcct cctcgtatag 5820 aaactcggac cactctgaga caaaggctcg cgtccaggcc agcacgaagg aggctaagtg 5880 ggaggggtag cggtcgttgt ccactagggg gtccactcgc tccagggtgt gaagacacat 5940 gtcgccctct tcggcatcaa ggaaggtgat tggtttgtag gtgtaggcca cgtgaccggg 6000 tgttcctgaa ggggggctat aaaagggggt gggggcgcgt tcgtcctcac tctcttccgc 6060 atcgctgtct gcgagggcca gctgttgggg tgagtactcc ctctgaaaag cgggcatgac 6120 ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca cctggcccgc 6180 ggtgatgcct ttgagggtgg ccgcatccat ctggtcagaa aagacaatct ttttgttgtc 6240 aagcttggtg gcaaacgacc cgtagagggc gttggacagc aacttggcga tggagcgcag 6300 ggtttggttt ttgtcgcgat cggcgcgctc cttggccgcg atgtttagct gcacgtattc 6360 gcgcgcaacg caccgccatt cgggaaagac ggtggtgcgc tcgtcgggca ccaggtgcac 6420 gcgccaaccg cggttgtgca gggtgacaag gtcaacgctg gtggctacct ctccgcgtag 6480 gcgctcgttg gtccagcaga ggcggccgcc cttgcgcgag 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the NotI restriction site of the revised IX-E2 site with an expression cassette <400> 42 ctatagggag acccgcggcc atgtgtcaat cacgctacct cctctttttg gccacccttg 60 ccctcctaaa ccacctcagt ttggccaggg tcattccagt ctctggacct gccaggtgtc 120 ttagccagtc ccgaaacctg ctgaagacca cagatgacat ggtgaagacg gccagagaaa 180 aactgaaaca ttattcctgc actgctgaag acatcgatca tgaagacatc acacgggacc 240 aaaccagcac attgaagacc tgtttaccac tggaactaca caagaacgag agttgcctgg 300 ctactagaga gacttcttcc acaacaagag ggagctgcct gcccccacag aagacgtctt 360 tgatgatgac cctgtgcctt ggtagcatct atgaggactt gaagatgtac cagacagagt 420 tccaggccat caacgcagca cttcagaatc acaaccatca gcagatcatt ctagacaagg 480 gcatgctggt ggccatcgat gagctgatgc agtctctgaa tcataatggc gagactctgc 540 gccagaaacc tcctgtggga gaagcagacc cttacagagt gaaaatgaag ctctgcatcc 600 tgcttcacgc cttcagcacc cgcgtcgtga ccatcaacag ggtgatgggc tatctgagct 660 ccgcctgagg ccgctgtgcc ttctagtt 688 <210> 43 <211> 1048 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse IL12B cloned into the SwaI restriction site of the L5-E4 site with an expression cassette using the EF1A promoter <400> 43 ttgccgccag aacacaattt atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg 60 ttttgctggt gtctccactc atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag 120 aggtggactg gactcccgat gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg 180 aagaagatga catcacctgg acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga 240 ccctgaccat cactgtcaaa gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag 300 gcgagactct gagccactca catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca 360 ctgaaatttt aaaaaatttc aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact 420 ccggacggtt cacgtgctca tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca 480 agagcagtag cagttcccct gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg 540 cagagaaggt cacactggac caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg 600 atgtcacctg cccaactgcc gaggagaccc tgcccattga actggcgttg gaagcacggc 660 agcagaataa atatgagaac tacagcacca gcttcttcat cagggacatc atcaaaccag 720 acccgcccaa gaacttgcag atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg 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Claims (153)

  1. 삽입 부위에 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스이며, 여기서 삽입 부위는 제1 바이러스 전사 단위의 정지 코돈 및 제2 바이러스 전사 단위의 정지 코돈 사이에 위치하고,
    여기서 제1 바이러스 전사 단위의 정지 코돈은, 제1 바이러스 전사 단위의 개시 부위가 제2 바이러스 전사 단위의 정지 코돈에 대한 것보다, 제2 바이러스 전사 단위의 정지 코돈에 더 가깝고,
    여기서 제2 바이러스 전사 단위의 정지 코돈은, 제2 바이러스 전사 단위의 개시 부위가 제1 바이러스 전사 단위의 정지 코돈에 대한 것보다, 제1 바이러스 전사 단위의 정지 코돈에 더 가깝고,
    여기서 뉴클레오티드 서열이 삽입되기 전에 제1 바이러스 전사 단위 및 제2 바이러스 전사 단위 사이에는 어떠한 바이러스 전사 단위도 존재하지 않는 것인 재조합 아데노바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 제1 바이러스 전사 단위가 아데노바이러스 IX 유전자이고, 제2 바이러스 전사 단위가 아데노바이러스 IVa2 유전자인 재조합 아데노바이러스.
  3. 제1항에 있어서, 제1 바이러스 전사 단위가 아데노바이러스 섬유 유전자이고, 제2 바이러스 전사 단위가 아데노바이러스 E4 유전자의 ORF6 또는 ORF6/7인 재조합 아데노바이러스.
  4. IX-E2 삽입 부위에 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스이며, 여기서 IX-E2 삽입 부위는 아데노바이러스 IX 유전자의 정지 코돈 및 아데노바이러스 IVa2 유전자의 정지 코돈 사이에 위치하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  5. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 4029 및 4093에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  6. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 3899 및 3970에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  7. 제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 4029 및 4050에 상응하는 뉴클레오티드, 4050 및 4070에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 4070 및 4093에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  8. 제1항, 제2항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 3899 및 3920에 상응하는 뉴클레오티드, 3920 및 3940에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 3940 및 3970에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  9. L5-E4 삽입 부위에 삽입된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스이며, 여기서 L5-E4 삽입 부위는 아데노바이러스 섬유 유전자의 정지 코돈 및 아데노바이러스 E4 유전자의 ORF6 또는 ORF6/7의 정지 코돈 사이에 위치하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  10. 제1항, 제3항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 32785 내지 32916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  11. 제1항, 제3항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 32785 및 32800에 상응하는 뉴클레오티드, 32800 및 32820에 상응하는 뉴클레오티드, 32820 및 32840에 상응하는 뉴클레오티드, 32840 및 32860에 상응하는 뉴클레오티드, 32860 및 32880에 상응하는 뉴클레오티드, 32880 및 32900에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 32900 및 32916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  12. 제1항, 제3항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 31799 및 31821에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  13. 제1항, 제3항, 제9항 및 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 31799 및 32810에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 32810 및 31821에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  14. IX-E2 삽입 부위에 삽입된 제1 뉴클레오티드 서열 및 L5-E4 삽입 부위에 삽입된 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스이며, 여기서 IX-E2 삽입 부위는 아데노바이러스 IX 유전자의 정지 코돈 및 아데노바이러스 IVa2 유전자의 정지 코돈 사이에 위치하고, L5-E4 삽입 부위는 아데노바이러스 섬유 유전자의 정지 코돈 및 아데노바이러스 E4 유전자의 ORF6 또는 ORF6/7의 정지 코돈 사이에 위치하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  15. 제14항에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 4029 및 4093에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 4029 및 4050에 상응하는 뉴클레오티드, 4050 및 4070에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 4070 및 4093에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  17. 제14항에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열이 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 3899 및 3970에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  18. 제14항 또는 제15항에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열이 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 3899 및 3920에 상응하는 뉴클레오티드, 3920 및 3940에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 3940 및 3970에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 32785 내지 32916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 32785 및 32800에 상응하는 뉴클레오티드, 32801 및 32820에 상응하는 뉴클레오티드, 32821 및 32840에 상응하는 뉴클레오티드, 32841 및 32860에 상응하는 뉴클레오티드, 32861 및 32880에 상응하는 뉴클레오티드, 32881 및 32900에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 32901 및 32916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  21. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 41)의 31799 및 31821에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  22. 제14항 내지 제18항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열이 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 31799 및 32810에 상응하는 뉴클레오티드, 또는 32810 및 31821에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  23. 제4항 내지 제8항 및 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, IX-E2 삽입 부위가 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  24. 제9항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, L5-E4 삽입 부위가 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 또는 130개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 적어도 1개의 트랜스진을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  26. 제25항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 프로모터를 추가로 포함하고, 여기서 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 재조합 아데노바이러스.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 5'에서 3' 배향으로
    (i) 제1 폴리아데닐화 신호;
    (ii) 프로모터;
    (iii) 트랜스진;
    (iv) 제2 폴리아데닐화 신호; 및
    (v) 제3 폴리아데닐화 신호
    를 포함하며; 여기서 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 트랜스진은 제1 폴리아데닐화 신호 및 제3 폴리아데닐화 신호 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
  28. 제27항에 있어서, 제1 폴리아데닐화 신호가 섬유 (L5) 유전자의 폴리아데닐화 신호이고, 제2 폴리아데닐화 신호가 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호가 아데노바이러스 E4 유전자의 ORF6 또는 ORF6/7의 폴리아데닐화 신호이거나, 또는 제1 폴리아데닐화 신호가 IX 유전자의 폴리아데닐화 신호이고, 제2 폴리아데닐화 신호가 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호가 아데노바이러스 IVa2 유전자의 폴리아데닐화 신호인 재조합 아데노바이러스.
  29. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 5'에서 3' 배향으로
    (i) 제1 폴리아데닐화 신호;
    (ii) 제2 폴리아데닐화 신호;
    (iii) 프로모터;
    (iv) 트랜스진;
    (v) 제3 폴리아데닐화 신호; 및
    (vi) 제4 폴리아데닐화 신호
    를 포함하며; 여기서 트랜스진은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 트랜스진은 제1 폴리아데닐화 신호 및 제4 폴리아데닐화 신호 사이에 삽입되고, 제2 폴리아데닐화 신호는 제1 폴리아데닐화 신호와 반대 전사 방향으로 존재하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  30. 제29항에 있어서, 제1 폴리아데닐화 신호가 섬유 (L5) 유전자의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호가 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제4 폴리아데닐화 신호가 아데노바이러스 E4 유전자의 ORF6 또는 ORF6/7의 폴리아데닐화 신호이거나, 또는 제1 폴리아데닐화 신호가 IX 유전자의 폴리아데닐화 신호이고, 제3 폴리아데닐화 신호가 트랜스진의 폴리아데닐화 신호이고, 제4 폴리아데닐화 신호가 아데노바이러스 IVa2 유전자의 폴리아데닐화 신호인 재조합 아데노바이러스.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 편재성 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 또는 종양-특이적 프로모터인 재조합 아데노바이러스.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위, E3 삽입 부위, 또는 E4 삽입 부위에 삽입된 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 제1 트랜스진을 포함하는 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 트랜스진을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 링커에 의해 분리된 것인 재조합 아데노바이러스.
  34. 제33항에 있어서, 링커가 프로테아제 또는 프로테아제들에 의해 절단가능한 펩티드를 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 링커가 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 또는 자기-절단 2A 펩티드를 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  36. 제32항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 E1b-19K의 개시 부위 및 E1b-19K의 정지 코돈 사이에 위치하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  37. 제32항 또는 제36항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 E1b-19K의 개시 부위에 인접한 약 100 내지 약 305, 약 100 내지 약 300, 약 100 내지 약 250, 약 100 내지 약 200, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 305, 약 150 내지 약 300, 약 150 내지 약 250, 또는 약 150 내지 약 200개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  38. 제32항, 제36항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 E1b-19K의 개시 부위에 인접한 약 200개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  39. 제32항, 제36항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 1714-1917에 상응하는 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  40. 제32항, 제36항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 뉴클레오티드 1611-2153에 상응하는 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  41. 제32항에 있어서, E3 삽입 부위가 아데노바이러스 pVIII 유전자의 정지 코돈 및 아데노바이러스 섬유 유전자의 개시 부위 사이에 위치하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  42. 제32항 또는 제41항에 있어서, E3 삽입 부위가 E3-10.5K의 정지 코돈 및 E3-14.7K의 정지 코돈 사이에 위치하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  43. 제32항, 제41항 및 제42항 중 어느 한 항에 있어서, E3 삽입 부위가 약 500 내지 약 3185, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 3185, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 3185, 약 1500 내지 약 3000, 약 1500 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 3185, 약 2000 내지 약 3000, 약 2000 내지 약 2500, 약 2500 내지 약 3185, 약 2500 내지 약 3000, 또는 약 3000 내지 약 3185개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  44. 제32항 및 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, E3 삽입 부위가 E3-10.5K의 정지 코돈에 인접한 약 500 내지 약 1551, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1551, 약 1000 내지 약 1500, 또는 약 1500 내지 약 1551개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  45. 제32항 및 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, E3 삽입 부위가 E3-10.5K의 정지 코돈에 인접한 약 1,050개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  46. 제32항 및 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, E3 삽입 부위가 E3-10.5K의 정지 코돈 다음에 1,063개의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  47. 제32항 및 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, E3 삽입 부위가 Ad5 dl309 E3 결실에 상응하는 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  48. 제32항 및 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, E3 삽입 부위가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 29773-30836에 상응하는 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  49. 제32항 및 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, E3 삽입 부위가 Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 뉴클레오티드 29119-30622에 상응하는 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 기능적 Pea3 결합 부위의 1개 이상의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  51. 제50항에 있어서, 결실이 E1a의 시작 부위의 약 -300 내지 약 -250 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  52. 제50항에 있어서, 결실이 E1a의 시작 부위의 -305 내지 -255 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  53. 제50항에 있어서, 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 195-244에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  54. 제50항에 있어서, E1a 프로모터가 서열 GGTGTTTTGG (서열식별번호: 4)를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, E1A 영역에서 1개 이상의 E2F 전사 결합 부위 결실 없이 1개 이상의 Pea3 전사 결합 부위 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  56. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, E1A 영역에서 1개 이상의 Pea3 전사 결합 부위 결실 없이 1개 이상의 E2F 전사 결합 부위 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  57. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 TATA 박스-기반 프로모터를 포함하고, 여기서 변형된 TATA 박스-기반 프로모터는 기능적 TATA 박스가 결여되어 있고, 과다증식성 세포에서 유전자의 선택적 발현을 허용하고/거나, 유전자에 작동가능하게 연결된 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터를 포함하고, 여기서 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터는 기능적 CAAT 박스가 결여되어 있고, 과다증식성 세포에서 유전자의 선택적 발현을 허용하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  58. 제57항에 있어서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터가 초기 유전자 프로모터인 재조합 아데노바이러스.
  59. 제58항에 있어서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터가 E1a 프로모터, E1b 프로모터, 또는 E4 프로모터인 재조합 아데노바이러스.
  60. 제59항에 있어서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터가 E1a 프로모터인 재조합 아데노바이러스.
  61. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 TATA 박스-기반 프로모터에 포함된 변형이 전체 TATA 박스의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  62. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, E1a 프로모터의 -27 내지 -24에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  63. 제57항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, E1a 프로모터의 -31 내지 -24에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  64. 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, E1a 프로모터의 -44 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  65. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, E1a 프로모터의 -146 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  66. 제57항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 472 내지 475에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  67. 제66항에 있어서, Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 468 내지 475에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  68. 제67항에 있어서, Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 455 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  69. 제68항에 있어서, Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 353 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  70. 제57항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 5), AGTGCCCG (서열식별번호: 44) 및/또는 TATTCCCG (서열식별번호: 45)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  71. 제57항에 있어서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터가 초기 유전자 프로모터인 재조합 아데노바이러스.
  72. 제71항에 있어서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터가 E1a 프로모터, E1b 프로모터, 또는 E4 프로모터인 재조합 아데노바이러스.
  73. 제72항에 있어서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터가 E1a 프로모터인 재조합 아데노바이러스.
  74. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 CAAT 박스-기반 프로모터에 포함된 변형이 전체 CAAT 박스의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  75. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, E1a 프로모터의 -76 내지 -68에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  76. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 423 내지 431에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  77. 제71항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 TTCCGTGGCG (서열식별번호: 46)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  78. 제57항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, Ad35 게놈 (서열식별번호: 41)의 477 내지 484에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  79. 제25항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상이 단량체, 이량체, 삼량체, 사량체, 또는 다량체 단백질을 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  80. 제25항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상이 치료 활성을 갖는 RNA를 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  81. 제25항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상이 적어도 1개의 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  82. 제25항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상이 면역조정 분자를 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  83. 제82항에 있어서, 면역조정 분자가 공동자극 리간드, 시토카인 또는 시토카인 수용체인 재조합 아데노바이러스.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 면역조정 분자가 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-7, IL-10, IL-10 트랩, IL-10R, IL-12A/p35, IL-12B/p40, IL-15, IL-23A/p19, IL24, IL-27, IL-33, IL-35, IL-15, IL-15 수용체 융합 단백질, TGF-β, TGF-β 트랩, IL-10 트랩, VEGF, 인돌아민-2,3-디옥시게나제 (IDO), 유도성 T-세포 공동-자극 리간드 (ICOS-L), CD80, CD137L, TNF-α, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 또는 GM-CSF, GITR 리간드 (GITRL), OX40 리간드 (OX40L), CD40 리간드 (CD40L), 약물-유도성 CD40 (iCD40), CD154, CD70, CD86, CD137, CD137L, BORIS/CTCFL, 골 형태발생 단백질 (BMP), TNFSF9, FGF, ICAM, 포도칼릭신, 그의 기능적 단편, 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 재조합 아데노바이러스.
  85. 제25항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상이 항원-결합 분자를 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  86. 제85항에 있어서, 항원-결합 분자가 항-PD-1 항체, 항-TGF-β 항체, 항-PD-L1 항체, 및 항-CTLA-4 항체, 또는 그의 기능적 단편인 재조합 아데노바이러스.
  87. 제25항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상이 항원 또는 항원에 대한 리간드를 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  88. 제87항에 있어서, 항원이 CAIX, CEA, CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD80, CD133, CD135 (Flt3), Flt3I, CD138, 시토메갈로바이러스 (CMV) 감염된 세포 항원, 4-1BB, EGP-2, EGP-40, EpCAM, erbB2, erbB3, erbB4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, KRAS, HPV E6, E7, BING-4, EphA3, 칼슘 활성화된 클로라이드 채널-2, 시클린 B1, 9D7, Ep-CAM, SAP-1, PRAME, SSX-2, 미성숙 라미닌 수용체, 폴레이트 수용체-a, 텔로머라제, 티로시나제, 멜란-A, NY-ESO-1, GD2, GD3, hTERT, IL13R-a2, x-경쇄, KDR, LeY, LI 세포 부착 분자, MAGE-A1, MAGE-A3, MART1, MART2, MUC1, 메소텔린, HER-2/neu, EGFRvIII, NKG2D 리간드, NY-ES0-1, gp100, TRP-1/-2, TRP-1/-2, P 폴리펩티드, MC1R, 전립선 특이적 항원, BRAF, 안드로겐-수용체, β-카테닌, BRCA1/2, CDK4, CML66, 피브로넥틴, p53, TGF-βRII, T 세포 수용체, 종양태아성 항원, 5T4, PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2, WT-1, 그의 기능적 단편, 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 재조합 아데노바이러스.
  89. 제25항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상이 독소를 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  90. 제89항에 있어서, 독소가 슈도모나스 외독소, 리신 독소, 또는 디프테리아 독소인 재조합 아데노바이러스.
  91. 제25항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상이 효소를 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  92. 제91항에 있어서, 효소가 베타-글루쿠로니다제, 베타-갈락토시다제, 베타-글루코시다제, 카르복시펩티다제, 베타-락타마제, 에스테라제, 메탈로프로테이나제, 렐락신, 콜라게나제, 스트렙토키나제, 아르기나제, NOS-2, 그의 단편, 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 재조합 아데노바이러스.
  93. 제25항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상이 세포 주기 제어제, 성장 인자, 항응고제, 전구약물 활성화 유전자, 종양 억제 유전자, 아폽토시스 유전자, 항혈소판제, 응고 인자, 낭성 섬유증 막횡단 전도도 조절자 (CFTR) 단백질, 그의 단편, 또는 그의 유도체를 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  94. 제25항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스진, 제1 트랜스진, 및 제2 트랜스진 중 1개 이상이 안지오스타틴, 엔도스타틴, 아세틸콜린, DKK1/Wnt, Ox40L, GITRL, 분비된 플라젤린, 티미딘 키나제, 그의 기능적 단편, 또는 그의 유도체를 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
  95. 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 5 아데노바이러스 (Ad5) 또는 유형 35 아데노바이러스 (Ad35)인 재조합 아데노바이러스.
  96. 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 종양용해성인 재조합 아데노바이러스.
  97. 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 과다증식성 세포에서 선택적으로 복제하는 재조합 아데노바이러스.
  98. 제1항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 과다증식성 세포에서 트랜스진을 선택적으로 발현하는 재조합 아데노바이러스.
  99. 제97항 또는 제98항에 있어서, 과다증식성 세포가 종양 세포인 재조합 아데노바이러스.
  100. 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스를 포함하는 단리된 뉴클레오티드 서열이며, 임의로 cDNA인 단리된 뉴클레오티드 서열.
  101. 제100항의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 벡터.
  102. 제100항의 뉴클레오티드 서열 또는 제101항의 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  103. 종양 세포를 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스의 유효량에 노출시켜 종양 세포의 증식을 억제하는 것을 포함하는, 종양 세포의 증식을 억제하는 방법.
  104. 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스의 유효량을 투여하여 종양의 성장을 억제하는 것을 포함하는, 종양 성장의 억제를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법.
  105. 제104항에 있어서, 종양이 HER2/neu 양성 종양이고, 재조합 아데노바이러스가 기능적 Pea3 결합 부위의 1개 이하의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함하는 것인 방법.
  106. 제105항에 있어서, HER2/neu 양성 종양이 유방암, 위암, 난소암, 방광암, 타액선암, 자궁내막암, 췌장암, 또는 비소세포 폐암 (NSCLC)으로부터의 것인 방법.
  107. 제103항 또는 제104항에 있어서, 종양이 흑색종, 피부의 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 두경부 종양, 유방 종양, 항문암, 자궁경부암, 비소세포 폐암, 중피종, 소세포 폐 종양, 신세포 암종, 전립선 종양, 위식도 종양, 결장직장 종양, 고환 종양, 방광 종양, 난소 종양, 간세포성 암종, 담관암종, 뇌 종양, 자궁내막 종양, 신경내분비 종양, 메르켈 세포 암종, 위장 기질 종양, 육종, 및 췌장 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  108. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스의 유효량을 투여하여 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  109. 제108항에 있어서, 암이 흑색종, 피부의 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 두경부암, 유방암, 항문암, 자궁경부암, 비소세포 폐암, 중피종, 소세포 폐암, 신세포 암종, 전립선암, 위식도암, 결장직장암, 고환암, 방광암, 난소암, 간세포성 암종, 담관암종, 뇌암, 자궁내막암, 신경내분비암, 메르켈 세포 암종, 위장 기질 종양, 육종, 전립선암, 백혈병, 림프종 및 췌장암으로부터 선택된 것인 방법.
  110. 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하는 방법.
  111. 제110항에 있어서, 질환 또는 상태가 감염, 당뇨병성 망막병증, 건선, 류마티스 관절염, 자궁내막증, 황반 변성 장애 및 양성 성장 장애, 예컨대 전립선 비대 및 지방종, 혈관 장애, 심혈관 질환, 감염, 간 경변증, 결합 조직 장애, 종양, 혈관성 병변, 궤양성 병변, 염증, 혈전증, 및 신생내막 형성으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  112. 제104항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
  113. 제104항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  114. 제113항에 있어서, 대상체가 소아 인간인 방법.
  115. 제113항에 있어서, 대상체가 성인인 방법.
  116. 제104항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 아데노바이러스가 근육내, 정맥내, 동맥내, 종양내, 피내, 흡입, 경피, 국소, 점안, 비강내, 경점막, 또는 직장 투여에 의해 투여되는 것인 방법.
  117. 제104항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법, 및 바이러스요법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  118. 제104항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 1종 이상의 면역 체크포인트 조정제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  119. 제117항에 있어서, 면역 체크포인트 조정제가 PD-1, PD-L1, PD-L2, 2B4, TIGIT, LAG3, Tim3, BTLA, CD160, GITR, KIR, 4-1BB, 및 CTLA4로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 분자의 억제제, 길항제, 또는 효능제인 방법.
  120. 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
  121. (a) 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스;
    (b) 적어도 1종의 완충제;
    (c) 적어도 1종의 장성 개질제;
    (d) 적어도 1종의 당 또는 적어도 1종의 안정화제, 또는 둘 다
    를 포함하며; 약 7.0 내지 약 9.0 범위의 pH를 갖는 아데노바이러스용 제제.
  122. 제121항에 있어서, 안정화제가 글리세롤인 제제.
  123. 제121항 또는 제122항에 있어서, 안정화제가 약 2% 내지 약 5% (v/v)인 제제.
  124. 제121항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제가 트리스인 제제.
  125. 제121항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 완충제가 약 1mM 내지 약 30 mM의 농도인 제제.
  126. 제119항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 장성 개질제가 NaCl인 제제.
  127. 제119항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 장성 개질제가 약 10 mM 내지 약 250 mM의 농도인 제제.
  128. 제119항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 장성 개질제 및 제2 장성 개질제를 포함하며, 여기서 제1 장성 개질제는 1가 양이온이고, 제2 장성 개질제는 2가 양이온인 제제.
  129. 제119항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 장성 개질제 또는 2가 양이온이 MgCl2인 제제.
  130. 제119항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 장성 개질제 또는 2가 양이온이 약 0.1 mM 내지 약 5 mM의 농도인 제제.
  131. 제119항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 당이 수크로스인 제제.
  132. 제119항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 당이 약 2% 내지 약 8%의 중량 대 부피 백분율인 제제.
  133. 제119항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 비이온성 계면활성제를 추가로 포함하는 제제.
  134. 제133항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 폴리소르베이트-80 또는 폴리소르베이트-40인 제제.
  135. 제133항 또는 제134항에 있어서, 비이온성 계면활성제가 약 0.001% 내지 약 1%의 농도인 제제.
  136. 제119항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 자유 라디칼 산화 억제제를 추가로 포함하는 제제.
  137. 제136항에 있어서, 자유 라디칼 산화 억제제가 EDTA인 제제.
  138. 제136항 또는 제137항에 있어서, 자유 라디칼 산화 억제제가 약 0.01 mM 내지 약 5 mM의 농도인 제제.
  139. 제119항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 동결보호제를 추가로 포함하는 제제.
  140. 제139항에 있어서, 동결보호제가 EtOH인 제제.
  141. 제139항 또는 제140항에 있어서, 동결보호제가 약 0.5%의 농도인 제제.
  142. 제119항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 약 200 mOs/L 내지 약 800 mOs/L의 오스몰농도를 갖는 제제.
  143. 제119항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 아데노바이러스가 약 1 x 107 vp/mL 내지 1 x 1013 vp/mL의 농도인 제제.
  144. 제119항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 약 20 mM 트리스, 약 25 mM NaCl, 약 2.5% 글리세롤을 포함하고, 약 8.0의 pH를 갖는 제제.
  145. 제119항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 약 20 mM 트리스, 약 25 mM NaCl, 약 3-5% 수크로스를 포함하고, 약 8.0의 pH를 갖는 제제.
  146. 제119항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 mM 트리스, 약 75 mM NaCl, 약 5% 수크로스, 약 0.02% 폴리소르베이트-80, 약 1 mM MgCl2, 약 0.1 mM EDTA, 약 0.5% EtOH를 포함하고, 약 8.0의 pH를 갖는 제제.
  147. 제119항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 면역보조제를 추가로 포함하는 제제.
  148. 제147항에 있어서, 면역보조제가 1) 명반, 2) 사포닌, 3) 비이온성 중합체 계면활성제, 4) 모노포스포릴 지질 A, 5) 뮤라밀 디펩티드, 및 6) 시토카인으로부터 선택된 것인 제제.
  149. 제119항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 염료를 추가로 포함하는 제제.
  150. 제119항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 가역적 프로테아제 억제제를 추가로 포함하는 제제.
  151. 제150항에 있어서, 가역적 프로테아제 억제제가 L3/p23 시스테인 프로테아제의 억제제인 제제.
  152. 제119항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1종의 항산화제를 추가로 포함하는 제제.
  153. 제152항에 있어서, 항산화제가 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B6, 비타민 B12, 폴산, 또는 폴레이트인 제제.
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