KR20200006058A - 다중 트랜스진 재조합 아데노바이러스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 절단가능한 링커에 의해 분리된 2종 이상의 치료적 트랜스진, 예를 들어 이종이량체성 시토카인의 2개의 성분을 포함하는 재조합 바이러스에 관한 것이다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2017년 4월 12일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 62/484,841을 우선권으로 주장하며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명의 분야는 분자 생물학 및 바이러스학, 구체적으로 2종 이상의 치료적 트랜스진을 발현하는 재조합 바이러스에 관한 것이다.
암을 유발하는 근본적인 분자 메카니즘에 대한 폭넓은 지식에도 불구하고, 대부분의 진행된 암은 현재의 화학요법 및 방사선 프로토콜로 치유할 수 없다. 종양용해성 바이러스는 다양한 악성 종양에 대한 현재의 표준 치료를 상당히 증강시키는 가능성을 갖는 플랫폼 기술로서 부상하였다 (Kumar, S. et al. (2008) Current Opinion In Molecular Therapeutics 10(4):371-379; Kim, D. (2001) Expert Opinion On Biological Therapy 1(3):525-538; Kim D. (2000) Oncogene 19(56):6660-6669). 이들 바이러스는 감염-복제-용해 연쇄 반응을 통해 악성 세포를 직접적으로 파괴할 뿐만 아니라, 항종양 면역을 간접적으로 유도하는 종양용해제로서의 가능성을 보여주었다. 이들 면역 자극 성질은 바이러스가 복제할 때마다 카피되고 발현되는 치료적 트랜스진의 삽입에 의해 증강되었다.
이전에 개발된 종양용해성 바이러스는 정상 세포에서는 전사적으로 약화되지만 암 세포에서는 전사적으로 활성인 TAV-255로 지칭되는 종양용해성 혈청형 5 아데노바이러스 (Ad5)를 포함한다 (PCT 공개 번호 WO2010101921 참조). TAV-255 벡터가 이러한 종양 선택성을 달성하는 메카니즘은, 특이적인 DNA 서열과의 결합을 통해 바이러스가 숙주 세포에 진입된 후에 전사되는 가장 초기의 유전자인 E1a의 아데노바이러스 발현을 조절하는 단백질인, 전사 인자 Pea3 및 E2F에 대한 3개의 전사 인자 (TF) 결합 부위의 표적화된 결실을 통한 것으로 믿어진다.
지금까지의 노력에도 불구하고, 인간 환자에서 암 및 과다증식성 장애를 치료하기 위한 개선된 재조합 바이러스, 예를 들어 재조합 종양용해성 바이러스가 요구된다.
본 발명은 부분적으로 2종의 치료적 트랜스진을 발현하는 특정한 재조합 아데노바이러스, 예컨대 재조합 종양용해성 아데노바이러스의 경우, 2종의 치료적 트랜스진이 개재 절단 부위, 예를 들어 단백질분해적 절단 부위를 갖는 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현될 때, 각각의 치료적 트랜스진의 발현이 크게 증진될 수 있다는 발견에 기초한다. 이어서, 절단 부위는 번역 후에 1종 이상의 절단제, 예를 들어 내인성 또는 외인성 절단제에 의해 절단되어, 각각의 치료적 트랜스진에 의해 코딩된 성숙한 단백질 생성물을 생성할 수 있다. 이러한 접근법은 각각의 치료적 트랜스진의 화학량론적 발현 및 동시 전달을 보장하는 추가의 이익을 갖는다.
한 측면에서, 본 발명은 제1 치료적 트랜스진을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 제2 치료적 트랜스진을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열, 및 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 사이에 배치된 절단 부위를 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제공한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 연속해서 5'에서 3' 배향으로 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 예를 들어 제1 뉴클레오티드 서열과 제3 뉴클레오티드 서열 사이에 및/또는 제3 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 사이에 배치된 개재 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 또 다른 트랜스진 또는 조절성 서열을 함유하는 서열)이 없다. 특정 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 (임의적으로 제1 뉴클레오티드 서열의 제1 뉴클레오티드에 대해 5'에 위치하는) 단일 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
절단 부위는 단백질분해적 절단 부위, 예를 들어 진핵생물 세포의 소포체 또는 골지에 존재하는 프로테아제에 의해 절단되는 단백질분해적 절단 부위일 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질분해적 절단 부위는 푸린(furin) 절단 부위, 예를 들어 서열 RX1X2R (서열식별번호(SEQ ID NO): 6) (여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 Lys 또는 Arg임)을 포함하는 푸린 절단 부위, 예를 들어 서열 RAKR (서열식별번호: 7)을 포함하는 푸린 절단 부위이다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 유형 5 아데노바이러스 (Ad5) 또는 유형 2 아데노바이러스 (Ad2)이다.
특정 실시양태에서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오티드 서열은 E1b-19K의 시작 부위와 E1b-19K의 정지 부위 사이에 위치한 E1b-19k 삽입 부위에 삽입된다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위와 E1b-55K의 시작 부위 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 약 100 내지 약 305, 약 100 내지 약 300, 약 100 내지 약 250, 약 100 내지 약 200, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 305, 약 150 내지 약 300, 약 150 내지 약 250, 또는 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 약 200개 뉴클레오티드, 예를 들어 202 또는 203개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 1714-1917 또는 1714-1916에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 1714 및 1917에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 또는 1714 및 1916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오티드 서열은 CTGACCTC (서열식별번호: 2)와 TCACCAGG (서열식별번호: 3) 사이에 삽입되고, 예를 들어 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로 CTGACCTC (서열식별번호: 2), 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열, 제2 뉴클레오티드 서열, 및 TCACCAGG (서열식별번호: 3)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 기능적 Pea3 결합 부위의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 바이러스는 E1a의 개시 부위의 약 -300 내지 약 -250 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실, 예를 들어 E1a의 개시 부위의 -305 내지 -255 또는 -304 내지 -255 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 195-244에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하고/거나 E1a 프로모터는 서열 GGTGTTTTGG (서열식별번호: 4)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 기능적 TATA 박스의 결실, 예를 들어 전체 TATA 박스의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 바이러스는 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -27 내지 -24, -31 내지 -24, -44 내지 +54, 또는 -146 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하고, 이들은 각각 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 472 내지 475, 468 내지 475, 455 내지 552, 및 353 내지 552에 상응한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 5), AGTGCCCG (서열식별번호: 16) 또는 TATTCCCG (서열식별번호: 17)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하며, 이는 결실된 폴리뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열을 결합시킴으로서 생성된다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -29 내지 -26, -33 내지 -26, -44 내지 +52, 또는 -148 내지 +52에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 353 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 5)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하며, 이는 결실된 폴리뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열을 결합시킴으로서 생성된다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 기능적 CAAT 박스의 결실, 예를 들어 전체 CAAT 박스의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 바이러스는 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -76 내지 -68에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하며, 이는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 423 내지 431에 상응한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 서열 TTCCGTGGCG (서열식별번호: 18)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하며, 이는 결실된 폴리뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열을 결합시킴으로서 생성된다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 E3 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 약 500 내지 약 3185, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 3185, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 3185, 약 1500 내지 약 3000, 약 1500 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 3185, 약 2000 내지 약 3000, 약 2000 내지 약 2500, 약 2500 내지 약 3185, 약 2500 내지 약 3000 또는 약 3000 내지 약 3185개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실 부위는 pVIII의 정지 부위와 Fiber의 시작 부위 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 결실 부위는 E3-10.5K의 정지 부위와 E3-14.7K의 정지 부위 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 약 500 내지 약 1551, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1551, 약 1000 내지 약 1500 또는 약 1500 내지 약 1551개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 약 1050개 뉴클레오티드의 결실을 포함하며, 예를 들어 E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 1063 또는 1064개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 Ad5 dl309 E3 결실에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 29773-30836에 상응하는 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-gp19K의 정지 부위와 E3-14.7K의 정지 부위 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 약 500 내지 약 1824, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1824, 약 1000 내지 약 1500 또는 약 1500 내지 약 1824개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 약 1600개 뉴클레오티드의 결실을 포함하며, 예를 들어 E3 결실은 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 1622개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 29218-30839에 상응하는 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 E4 결실을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위와 우측 역전된 말단 반복부 (ITR) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위와 E4-ORF1의 시작 부위 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 2500, 약 1500 내지 약 2000 또는 약 2000 내지 약 2500개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위에 인접한 약 250 내지 약 1500, 약 250 내지 약 1250, 약 250 내지 약 1000, 약 250 내지 약 750, 약 250 내지 약 500, 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1250, 약 500 내지 약 1000, 약 500 내지 약 750, 750 내지 약 1500, 약 750 내지 약 1250, 약 750 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1500 또는 약 1000 내지 약 1250개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위에 인접한 약 1450개 뉴클레오티드의 결실을 포함하며, 예를 들어 E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위에 인접한 약 1449개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 34078-35526에 상응하는 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 치료적 트랜스진은 아세틸콜린, 항-CTLA-4 항체 중쇄 또는 경쇄, 항-PD-1 항체 중쇄 또는 경쇄, 항-PD-L1 항체 중쇄 또는 경쇄, BORIS/CTCFL, CD19, CD20, CD40L, CD70, CD80, CD86, CD137, CD137L, CD154, DKK1/Wnt, FGF, GITRL, GM-CSF, ICAM, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10 트랩, IL-15, IL-15 IL-15 수용체 융합 단백질, IL-17, IL-23, IL-23A/p19, IL-12B/p40, IL-24, IL-27, IL-27A/p28, IL-27B/EBI3, IL-35, 인터페론-감마, MAGE, NY-ESO-1, Ox40L, p53, 분비된 플라겔린, TGF-β, TGF-β 트랩, 티미딘 키나제, 및 TNF-알파로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩한다.
특정 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 치료적 트랜스진은 아세틸콜린, 항-CTLA-4 항체 중쇄 또는 경쇄, 항-PD-1 항체 중쇄 또는 경쇄, 항-PD-L1 항체 중쇄 또는 경쇄, BORIS/CTCFL, CD19, CD20, CD40L, CD70, CD80, CD86, CD137, CD137L, CD154, DKK1/Wnt, FGF, GITRL, GM-CSF, ICAM, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10 트랩, IL-12, IL-12A/p35, IL-12B/p40, IL-15, IL-15 IL-15 수용체 융합 단백질, IL-23A/p19, 인터페론-감마, MAGE, NY-ESO-1, Ox40L, p53, 분비된 플라겔린, TGF-β, TGF-β 트랩, 티미딘 키나제, 및 TNF-알파로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩한다.
특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진은 각각 이종이량체성 단백질, 예를 들어 이종이량체성 시토카인의 제1 및 제2 서브유닛을 코딩한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 임의의 상기 재조합 아데노바이러스에서, 제1 및/또는 제2 치료적 트랜스진은 IL-12A/p35 및 IL-12B/p40으로부터 선택되고, 예를 들어 제1 치료적 트랜스진은 IL-12B/p40을 코딩하고 제2 치료적 트랜스진은 IL-12A/p35를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 17-1000, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1013-1606 및/또는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 17-1606에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 서열식별번호: 8과 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 임의의 상기 재조합 아데노바이러스에서, 제1 및/또는 제2 치료적 트랜스진은 IL-23A/p19 및 IL-12B/p40으로부터 선택되고, 예를 들어 제1 치료적 트랜스진은 IL-12B/p40을 코딩하고 제2 치료적 트랜스진은 IL-23A/p19를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 17-1000, 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 1013-1582 및/또는 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 17-1582에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 서열식별번호: 9와 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 임의의 상기 재조합 바이러스는 선택적으로 과다증식성 세포에서 복제할 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 상기 재조합 바이러스는 선택적으로 과다증식성 세포에서 2종 이상의 치료적 트랜스진을 발현할 수 있다. 과다증식성 세포는 암 세포, 예를 들어 폐암 세포, 결장암 세포 및 췌장암 세포일 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 상기 재조합 바이러스는 종양용해성 바이러스일 수 있다.
특정 실시양태에서, 임의의 상기 재조합 아데노바이러스에서, 제1 및/또는 제2 치료적 트랜스진은 외인성 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되지 않는다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 크기는 조합하였을 때 약 500 내지 약 5000, 약 500 내지 약 4000, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 5000, 약 1000 내지 약 4000, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 5000, 약 2000 내지 약 4000, 약 2000 내지 약 3000, 약 3000 내지 약 5000, 약 3000 내지 약 4000 또는 약 4000 내지 5000개 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 크기는 조합하였을 때 약 500 내지 약 7000, 약 500 내지 약 6000, 약 500 내지 약 5000, 약 500 내지 약 4000, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 7000, 약 1000 내지 약 6000, 약 1000 내지 약 5000, 약 1000 내지 약 4000, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 7000, 약 2000 내지 약 6000, 약 2000 내지 약 5000, 약 2000 내지 약 4000, 약 2000 내지 약 3000, 약 3000 내지 약 7000, 약 3000 내지 약 6000, 약 3000 내지 약 5000, 약 3000 내지 약 4000, 약 4000 내지 약 7000, 약 4000 내지 약 6000, 약 4000 내지 약 5000개 뉴클레오티드, 약 5000 내지 약 7000, 약 5000 내지 약 6000 또는 약 6000 내지 약 7000개 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 크기는 조합하였을 때 적어도 약 500 내지 약 5000, 약 500 내지 약 4000, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 5000, 약 1000 내지 약 4000, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 5000, 약 2000 내지 약 4000, 약 2000 내지 약 3000, 약 3000 내지 약 5000, 약 3000 내지 약 4000 또는 약 4000 내지 5000개 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 크기는 조합하였을 때 적어도 약 500 내지 약 7000, 약 500 내지 약 6000, 약 500 내지 약 5000, 약 500 내지 약 4000, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 7000, 약 1000 내지 약 6000, 약 1000 내지 약 5000, 약 1000 내지 약 4000, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 7000, 약 2000 내지 약 6000, 약 2000 내지 약 5000, 약 2000 내지 약 4000, 약 2000 내지 약 3000, 약 3000 내지 약 7000, 약 3000 내지 약 6000, 약 3000 내지 약 5000, 약 3000 내지 약 4000, 약 4000 내지 약 7000, 약 4000 내지 약 6000, 약 4000 내지 약 5000개 뉴클레오티드, 약 5000 내지 약 7000, 약 5000 내지 약 6000 또는 약 6000 내지 약 7000개 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 크기는 조합하였을 때 적어도 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 3000, 약 4000 또는 약 5000개 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 크기는 조합하였을 때 적어도 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 3000, 약 4000, 약 5000개 뉴클레오티드, 약 6000 또는 약 7000개 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 크기는 조합하였을 때 약 1600개 뉴클레오티드, 약 1650개 뉴클레오티드, 또는 약 3100개 뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 각각의 재조합 아데노바이러스 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체에게 본원에 기재된 재조합 아데노바이러스의 유효량을 투여하여 대상체에서 암 질환을 치료하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암은 항문암, 기저 세포 암종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 암종, 담관암종, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 위식도암, 위장 (GI) 암, 위장 간질 종양, 간세포 암종, 부인과암, 두경부암, 혈액암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 신경내분비암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 소아암, 전립선암, 신세포 암종, 육종, 피부암, 소세포 폐암, 피부의 편평상피 세포 암종, 위암, 고환암 및 갑상선암으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 종양 세포의 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체에게 본원에 기재된 재조합 아데노바이러스의 유효량을 투여하여 종양 세포의 증식을 억제하는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 대상체에게 본원에 기재된 재조합 아데노바이러스의 유효량을 투여하여 종양 세포의 증식을 억제하는 것을 포함한다.
상기 각각의 방법에서, 재조합 아데노바이러스를 예를 들어 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법 및 바이러스요법으로부터 선택되는 1종 이상의 요법과 조합하여 투여할 수 있다. 상기 각각의 방법에서, 재조합 아데노바이러스의 유효량은 예를 들어 102-1015 플라크 형성 단위 (pfu)일 수 있다. 임의의 상기 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 인간, 예를 들어 소아 인간일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표적 세포에서 2종 이상의 치료적 트랜스진을 발현하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본원에 기재된 재조합 아데노바이러스의 유효량을 세포에 전달하여, 예를 들어 세포에 노출시켜 표적 트랜스진을 발현하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 2종의 치료적 트랜스진은 발현될 때 단일 폴리펩티드 쇄를 생성하고, 이는 번역 후에 2개의 폴리펩티드 쇄로 절단될 수 있다.
본 발명의 이들 및 다른 측면 및 이점은 하기 도면, 상세한 설명 및 청구범위에 의해 예시된다.
본 발명은 하기 도면을 참조하여 더욱 완벽하게 이해될 수 있다.
도 1은 ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 상이한 링커를 갖는 IL-12를 코딩하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포에 의한 IL-12 발현을 도시하는 그래프이다. 점은 3회 측정된 농도를 나타내고, 진한 막대는 평균을 나타내고, 오차 범위는 표준 펀차를 나타낸다.
도 2는 TAV-hIL-12-푸린 아데노바이러스 ("푸린"으로 표시됨), TAV-hIL-12-분리 아데노바이러스 ("분리"로 표시됨) 및 대조군 dl309 아데노바이러스로부터의 DNA의 PCR 생성물을 도시하는 겔이고, 이는 예상된 크기의 생성물을 입증한다.
도 3은 지정된 바이러스에 의한 감염 이후에 지정된 시점에서 ADS-12 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 보라색으로 염색한다.
도 4는 ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 TAV-Δ19k 및 TAV-mIL12-IRES로 감염된 ADS-12 세포로부터 IL-12 발현을 도시하는 막대 그래프이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 5는 ADS-12 세포에서 TAV-Δ19k 및 TAV-mIL-12-IRES의 바이러스 복제를 도시하는 막대 그래프이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 6은 ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 TAV-Δ19k, TAV-hIL-12-IRES, TAV-hIL-12-푸린, 또는 바이러스 없음으로 감염된 A549 세포로부터 IL-12 발현을 도시하는 막대 그래프이다.
도 7은 지정된 바이러스에 의한 감염 이후에 지정된 시점에서 A549 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 보라색으로 염색한다.
도 8은 A549 세포에서 TAV-Δ19k, TAV-hIL-12-IRES, 및 TAV-hIL-12-푸린의 바이러스 복제를 도시하는 막대 그래프이다.
도 9는 바이러스 TAV-mIL-12-푸린으로부터 IL-12의 발현을 도시하는 선 그래프이다. A549 세포를 지정된 MOI에서 감염시켰고, 조건화된 배지 중에서 IL-12 농도를 ELISA에 의해 지정된 시점에서 측정하였다. CT는 대조군 비감염 세포를 나타낸다.
도 10은 바이러스 TAV-mIL-23-푸린으로부터 IL-23의 발현 및 바이러스 TAV-mIL-27-푸린으로부터 IL-27의 발현을 도시하는 막대 그래프이다. A549 세포를 5의 MOI에서 감염시켰고, 조건화된 배지 중에서 각각의 바이러스에 대한 상응하는 시토카인의 농도를 감염 4 일 후에 ELISA에 의해 측정하였다.
도 1은 ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 상이한 링커를 갖는 IL-12를 코딩하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포에 의한 IL-12 발현을 도시하는 그래프이다. 점은 3회 측정된 농도를 나타내고, 진한 막대는 평균을 나타내고, 오차 범위는 표준 펀차를 나타낸다.
도 2는 TAV-hIL-12-푸린 아데노바이러스 ("푸린"으로 표시됨), TAV-hIL-12-분리 아데노바이러스 ("분리"로 표시됨) 및 대조군 dl309 아데노바이러스로부터의 DNA의 PCR 생성물을 도시하는 겔이고, 이는 예상된 크기의 생성물을 입증한다.
도 3은 지정된 바이러스에 의한 감염 이후에 지정된 시점에서 ADS-12 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 보라색으로 염색한다.
도 4는 ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 TAV-Δ19k 및 TAV-mIL12-IRES로 감염된 ADS-12 세포로부터 IL-12 발현을 도시하는 막대 그래프이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 5는 ADS-12 세포에서 TAV-Δ19k 및 TAV-mIL-12-IRES의 바이러스 복제를 도시하는 막대 그래프이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 6은 ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 TAV-Δ19k, TAV-hIL-12-IRES, TAV-hIL-12-푸린, 또는 바이러스 없음으로 감염된 A549 세포로부터 IL-12 발현을 도시하는 막대 그래프이다.
도 7은 지정된 바이러스에 의한 감염 이후에 지정된 시점에서 A549 세포의 크리스탈 바이올렛 염색을 도시한다. 크리스탈 바이올렛은 생존가능한 세포를 보라색으로 염색한다.
도 8은 A549 세포에서 TAV-Δ19k, TAV-hIL-12-IRES, 및 TAV-hIL-12-푸린의 바이러스 복제를 도시하는 막대 그래프이다.
도 9는 바이러스 TAV-mIL-12-푸린으로부터 IL-12의 발현을 도시하는 선 그래프이다. A549 세포를 지정된 MOI에서 감염시켰고, 조건화된 배지 중에서 IL-12 농도를 ELISA에 의해 지정된 시점에서 측정하였다. CT는 대조군 비감염 세포를 나타낸다.
도 10은 바이러스 TAV-mIL-23-푸린으로부터 IL-23의 발현 및 바이러스 TAV-mIL-27-푸린으로부터 IL-27의 발현을 도시하는 막대 그래프이다. A549 세포를 5의 MOI에서 감염시켰고, 조건화된 배지 중에서 각각의 바이러스에 대한 상응하는 시토카인의 농도를 감염 4 일 후에 ELISA에 의해 측정하였다.
본 발명은 부분적으로 2종의 치료적 트랜스진을 발현하는 특정한 재조합 아데노바이러스, 예컨대 재조합 종양용해성 아데노바이러스의 경우, 2종의 치료적 트랜스진이 개재 절단 부위, 예를 들어 단백질분해적 절단 부위를 갖는 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현될 때, 각각의 치료적 트랜스진의 발현이 크게 증진될 수 있다는 발견에 기초한다. 이어서, 절단 부위는 번역 후에 1종 이상의 절단제, 예를 들어 내인성 또는 외인성 절단제에 의해 절단되어, 각각의 치료적 트랜스진에 의해 코딩된 성숙한 단백질 생성물을 생성할 수 있다. 이러한 접근법은 각각의 치료적 트랜스진의 화학량론적 발현 및 동시 전달을 보장하는 추가의 이익을 갖는다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 제1 치료적 트랜스진을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 제2 치료적 트랜스진을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열, 및 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 사이에 배치된 절단 부위를 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제공한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 연속해서 5'에서 3' 배향으로 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 예를 들어 제1 뉴클레오티드 서열과 제3 뉴클레오티드 서열 사이에 및/또는 제3 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 사이에 개재 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 또 다른 트랜스진 또는 조절성 서열을 함유하는 서열)이 없다. 특정 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 (임의적으로 제1 뉴클레오티드 서열의 제1 뉴클레오티드에 대해 5'에 위치하는) 단일 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현된다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 종양용해성 바이러스, 예를 들어 종양-선택적인 복제 및/또는 바이러스 매개된 용해를 나타내는 바이러스이다. 특정 실시양태에서, 종양용해성 바이러스는 치료적 트랜스진의 선택적인 발현을 가능하게 하고, 예를 들어 바이러스는 신생 세포에서 치료적 트랜스진의 발현을 허용하지만, 정상 세포에서는 발현을 약화시킨다. 특정 실시양태에서, 비-과다증식성 세포에서 치료적 트랜스진의 발현은 과다증식성 세포에서의 발현의 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10% 또는 약 5%이다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 비-과다증식성 세포에서 치료적 트랜스진의 검출가능한 발현을 나타내지 않는다. 치료적 트랜스진 발현은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 방법, 예를 들어 웨스턴 블롯 또는 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 과다증식성 세포는 암 세포, 예를 들어 암종, 육종, 백혈병, 림프종, 전립선암, 폐암, 위장관암, 결장직장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 위암, 갑상선암, 중피종, 간암, 신장암, 피부암, 두경부암 또는 뇌암 세포일 수 있다.
I. 바이러스
용어 "바이러스"는 단백질-합성 또는 에너지-생성 메카니즘을 갖지 않는 임의의 편성 세포내 기생충을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 바이러스 게놈은 RNA 또는 DNA일 수 있다. 본 발명의 실시에 유용한 바이러스에는 바람직하게는 바쿨로비리다에(baculoviridiae), 파르보비리다에(parvoviridiae), 피코르노비리다에(picornoviridiae), 헤르페스비리다에(herpesviridiae), 폭시이리다에(poxyiridae) 또는 아데노비리다에(adenoviridiae)로부터 선택되는, 재조합적으로 변형된 외피보유 또는 비-외피보유 DNA 및 RNA 바이러스가 포함된다. 재조합적으로 변형된 바이러스는 본원에서 "재조합 바이러스"로 지칭된다. 재조합 바이러스는 예를 들어 재조합 DNA 기술에 의해 복제 결함이 있거나, 조건부로 복제되거나 또는 복제에 능숙하도록 변형될 수 있고/거나 재조합 DNA 기술에 의해 외인성 트랜스진의 발현을 포함하도록 변형될 수 있다. 각각의 모 벡터 성질의 유리한 요소를 활용하는 키메라 바이러스 벡터 (예를 들어, 문헌 [Feng et al. (1997) Nature Biotechnology 15:866-870] 참조) 또한 본 발명의 실시에 유용할 수 있다. 일반적으로 치료할 종으로부터의 바이러스를 이용하는 것이 유리하지만, 일부 경우에는, 유리한 병원성 특징을 갖는 상이한 종으로부터 유래된 벡터를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 인간 유전자 요법을 위한 말 헤르페스 바이러스 벡터가 PCT 공개 번호 WO 98/27216에 기재되어 있다. 상기 벡터는 말 바이러스가 인간에 대해 병원성이 아니기 때문에 인간의 치료에 유용한 것으로 기재되어 있다. 유사하게, 양 아데노바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스 벡터에 대한 항체를 피하는 것으로 주장되었기 때문에 인간 유전자 요법에서 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 PCT 공개 번호 WO 97/06826에 기재되어 있다.
바람직하게는, 재조합 바이러스는 아데노바이러스이다. 아데노바이러스는 뉴클레오캡시드 및 이중 가닥 선형 DNA 게놈으로 구성된 중간 크기의 (90-100 nm) 비-외피보유 (네이키드) 정이십면체형 바이러스이다. 아데노바이러스는 숙주의 복제 기구를 이용하여 포유류 세포의 핵에서 복제한다. 용어 "아데노바이러스"는 인간, 소, 양, 말, 개, 돼지, 뮤린 및 원숭이 아데노바이러스 아속을 비롯하여 이에 제한되지는 않는 아데노비리다에 속의 임의의 바이러스를 지칭한다. 특히, 인간 아데노바이러스는 A-F 아속 뿐만 아니라 그의 개별 혈청형을 포함하며, 상기 개별 혈청형 및 A-F 아속에는 인간 아데노바이러스 유형 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Ad11a 및 Ad11p), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 및 91이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 인간 아데노바이러스 유형 2 및 5로부터 유래된 재조합 바이러스가 바람직하다. 달리 명시하지 않는다면, 모든 아데노바이러스 유형 5 뉴클레오티드 번호는 본원에서 서열식별번호: 1로 기재된 NCBI 참조 서열 AC_000008.1과 관련된 것이다.
아데노바이러스 복제 주기는 2 단계를 갖는다: 4종의 전사 단위 E1, E2, E3 및 E4가 발현되는 동안의 초기 단계, 및 후기 전사체가 주요 후기 프로모터 (MLP)로부터 주로 발현될 때 바이러스 DNA 합성의 개시 이후에 일어나는 후기 단계. 후기 메시지는 대부분의 바이러스 구조 단백질을 코딩한다. E1, E2 및 E4의 유전자 산물은 전사 활성화, 세포 형질전환, 바이러스 DNA 복제, 뿐만 아니라 다른 바이러스 기능을 담당하고, 바이러스 성장을 위해 필요하다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 기능적으로 관계가 있는 폴리뉴클레오티드 요소의 연결을 지칭한다. 핵산 서열은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 있을 때 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 유전자의 전사에 영향을 미치는 경우에 상기 유전자에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열은 전형적으로 연속적이다. 그러나, 일반적으로 인핸서는 프로모터로부터 몇몇 킬로염기만큼 분리되어 있을 때 기능하고, 인트론 서열은 다양한 길이를 가질 수 있기 때문에, 일부 폴리뉴클레오티드 요소는 작동가능하게 연결되지만 직접적으로 플랭킹되지는 않을 수 있고, 심지어 상이한 대립 유전자 또는 염색체와는 트랜스로 기능할 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 조절 서열 또는 프로모터에 대해 1개 이상의 변형을 갖는다. 조절 서열 또는 프로모터에 대한 변형은 조절 서열 또는 프로모터의 야생형 서열에 비해 1개 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환 또는 부가를 포함한다.
특정 실시양태에서, 조절 서열 또는 프로모터의 변형은, 예를 들어 일부를 결실시킴으로써 또는 결합 부위에 단일 점 돌연변이를 삽입시킴으로써, 전사 인자에 대한 친화도를 감소시키기 위해 전사 인자 결합 부위의 서열에 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 조절 서열은 신생 세포에서의 발현을 강화시키고/거나 정상 세포에서의 발현을 약화시킨다.
특정 실시양태에서, 변형된 조절 서열은 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, 아데노바이러스 E1a 및 E1b 유전자 (코딩 영역) 중 적어도 하나는 변형된 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, E1a 유전자는 변형된 조절 서열에 작동가능하게 연결된다.
E1a 조절 서열은 Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV 및 Pea3 V로 지정된, 전사 인자 Pea3에 대한 5개의 결합 부위를 함유하며, 여기서 Pea3 I은 E1a 시작 부위에 가장 근접한 Pea3 결합 부위이고, Pea3 V는 가장 멀리 있다. E1a 조절 서열은 또한 본원에서 E2F I 및 E2F II로 지정된, 전사 인자 E2F에 대한 결합 부위를 함유하며, 여기서 E2F I은 E1a 시작 부위에 가장 근접한 E2F 결합 부위이고, E2F II는 더욱 멀리 있다. E1a 시작 부위로부터, 결합 부위는 Pea3 I, E2F I, Pea3 II, E2F II, Pea3 III, Pea3 IV 및 Pea3 V로 정렬된다.
특정 실시양태에서, 이들 7가지 결합 부위 중 적어도 1개, 또는 7가지 기능적 결합 부위 중 적어도 1개가 결실된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "기능적 결합 부위"는 각각의 결합 파트너, 예를 들어 전사 인자에 결합할 수 있는 결합 부위, 예를 들어 상응하는 야생형 결합 부위 서열의 결합 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 또는 적어도 40%를 갖는 결합 부위를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비-기능적 결합 부위"는 예를 들어 상응하는 야생형 결합 부위 서열의 결합 활성의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 0%를 갖는 결합 부위를 지칭한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 기능적 Pea3 결합 부위의 결실, 예를 들어 전체 Pea3 결합 부위의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "기능적 Pea3 결합 부위"는 그의 각각의 전사 인자 (예를 들어, Pea3)에 결합할 수 있는 Pea3 결합 부위, 예를 들어 상응하는 야생형 Pea3 결합 부위 서열의 Pea3 결합 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 또는 적어도 40%를 갖는 Pea3 결합 부위를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비-기능적 Pea3 결합 부위"는 예를 들어 상응하는 야생형 Pea3 결합 부위 서열의 Pea3 결합 활성의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 0%를 갖는 Pea3 결합 부위를 지칭한다. Pea3 결합 부위가 Pea3에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 결합 검정에는 전기영동 이동성 변화 검정, 염색질 면역침강반응 검정, 및 DNAse 풋프린팅 검정이 포함된다.
특정 실시양태에서, 적어도 1개의 Pea3 결합 부위 또는 기능적 Pea3 결합 부위가 결실된다. 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV 및/또는 Pea3 V일 수 있다. 특정 실시양태에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV 및/또는 Pea3 V이다. 특정 실시양태에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 IV 및/또는 Pea3 V이다. 특정 실시양태에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 II 및/또는 Pea3 III이다. 특정 실시양태에서, 결실된 Pea3 결합 부위는 Pea3 II 및 Pea3 III 둘 다이다. 특정 실시양태에서, Pea3 I 결합 부위 또는 기능적 Pea3 I 결합 부위는 유지된다.
특정 실시양태에서, 적어도 1개의 E2F 결합 부위 또는 기능적 E2F 결합 부위가 결실된다. 특정 실시양태에서, 적어도 1개의 E2F 결합 부위 또는 기능적 E2F 결합 부위는 유지된다. 특정 실시양태에서, 유지된 E2F 결합 부위는 E2F I 및/또는 E2F II이다. 특정 실시양태에서, 유지된 E2F 결합 부위는 E2F II이다. 특정 실시양태에서, 총 결실은 본질적으로 Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV 및/또는 Pea3 V 중 1개 이상으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 적어도 1개의 E2F 결합 부위 또는 그의 기능적 부분의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 적어도 1개의 E2F 결합 부위 또는 그의 기능적 부분의 결실을 포함하고, Pea3 결합 부위의 결실은 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 바이러스는 E1a 개시 부위의 -304 내지 -255 상류에 위치하는, 예를 들어 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 195-244에 상응하는 50개 염기쌍 영역의 결실을 가지며, 이후에 TAV-255 결실로 지칭된다. 특정 실시양태에서, TAV-255 결실은 서열 GGTGTTTTGG (서열식별번호: 4)를 포함하는 E1a 프로모터를 생성한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 기능적 TATA 박스의 결실, 예를 들어 전체 TATA 박스의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "기능적 TATA 박스"는 TATA 박스 결합 단백질 (TBP)에 결합할 수 있는 TATA 박스, 예를 들어 상응하는 야생형 TATA 박스 서열의 TBP 결합 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 또는 적어도 40%를 갖는 TATA 박스를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비-기능적 TATA 박스"는 예를 들어 상응하는 야생형 TATA 박스 서열의 TBP 결합 활성의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 0%를 갖는 TATA 박스를 지칭한다. TBP가 TATA 박스에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 결합 검정에는 전기영동 이동성 변화 검정, 염색질 면역침강반응 검정, 및 DNAse 풋프린팅 검정이 포함된다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -27 내지 -24, -31 내지 -24, -44 내지 +54, 또는 -146 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하며, 이는 각각 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 472 내지 475, 468 내지 475, 455 내지 552, 및 353 내지 552에 상응한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -29 내지 -26, -33 내지 -26, -44 내지 +52, 또는 -148 내지 +52에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 353 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 5), AGTGCCCG (서열식별번호: 16), 또는 TATTCCCG (서열식별번호: 17)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하며, 이는 결실된 폴리뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열을 결합시킴으로서 생성된다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 5)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 기능적 CAAT 박스의 결실, 예를 들어 전체 CAAT 박스의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "기능적 CAAT 박스"는 C/EBP 또는 NF-Y 단백질에 결합할 수 있는 CAAT 박스, 예를 들어 상응하는 야생형 CAAT 박스 서열의 C/EBP 또는 NF-Y 결합 활성의 적어도 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 또는 적어도 40%를 갖는 CAAT 박스를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비-기능적 CAAT 박스"는 예를 들어 상응하는 야생형 CAAT 박스 서열의 C/EBP 또는 NF-Y 결합 활성의 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 0%를 갖는 CAAT 박스를 지칭한다. C/EBP 또는 NF-Y 단백질이 CAAT 박스에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 결합 검정에는 전기영동 이동성 변화 검정, 염색질 면역침강반응 검정, 및 DNAse 풋프린팅 검정이 포함된다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 유형 5 E1a 프로모터의 -76 내지 -68에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하며, 이는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 423 내지 431에 상응한다. 특정 실시양태에서, 바이러스는 서열 TTCCGTGGCG (서열식별번호: 18)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하며, 이는 결실된 폴리뉴클레오티드 서열을 플랭킹하는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열을 결합시킴으로서 생성된다.
아데노바이러스 E1b-19k 유전자는 주로 항-아폽토시스 유전자로서 기능하고, 세포성 항-아폽토시스 유전자, BCL-2의 동족체이다. 자손 바이러스 입자의 돌연변이 이전의 숙주 세포 사멸은 바이러스 복제를 제한하기 때문에, E1b-19k는 조기 세포 사멸을 방지하기 위해 El 카세트의 일부로서 발현되어, 감염을 진행시키고 성숙한 비리온을 생성한다. 따라서, 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위를 포함하는 재조합 아데노바이러스가 제공되며, 예를 들어 재조합 아데노바이러스는 E1b-19K 삽입 부위에 삽입된 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위 (즉, E1b-19k의 시작 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1714-1716에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 E1b-55K의 시작 부위 (즉, E1b-55k의 시작 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 2019-2021에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위 (즉, E1b-19k의 시작 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 1714-1716에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 E1b-19K의 정지 부위 (즉, E1b-19k의 정지 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 2242-2244에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다.
명세서 및 청구범위에 걸쳐, 2개 부위 사이의 삽입, 예를 들어 (i) 제1 유전자 (예를 들어, E1b-19k)의 시작 부위와 제2 유전자 (예를 들어, E1b-55K)의 시작 부위, (ii) 제1 유전자의 시작 부위와 제2 유전자의 정지 부위, (iii) 제1 유전자의 정지 부위와 제2 유전자의 시작 부위, 또는 (iv) 제1 유전자의 정지 부위와 제2 유전자의 정지 부위 사이의 삽입은, 삽입을 둘러싸는 주어진 시작 부위 또는 정지 부위를 구성하는 뉴클레오티드의 전부 또는 일부가 최종 바이러스에 존재하거나 부재할 수 있음을 의미하는 것으로 이해한다. 유사하게, 2개 뉴클레오티드 사이의 삽입은, 삽입을 둘러싸는 뉴클레오티드가 최종 바이러스에 존재하거나 부재할 수 있음을 의미하는 것으로 이해한다.
특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 약 100 내지 약 305, 약 100 내지 약 300, 약 100 내지 약 250, 약 100 내지 약 200, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 305, 약 150 내지 약 300, 약 150 내지 약 250, 또는 약 150 내지 약 200개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 약 200개 뉴클레오티드, 예를 들어, 202 또는 203개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E1b-19K 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 1714-1917 또는 1714-1916에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 1714 및 1917에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 또는 1714 및 1916에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 CTGACCTC (서열식별번호: 2)와 TCACCAGG (서열식별번호: 3) 사이에 삽입되며, 예를 들어 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로 CTGACCTC (서열식별번호: 2), 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열, 제2 뉴클레오티드 서열, 및 TCACCAGG (서열식별번호: 3)를 포함한다. CTGACCTC (서열식별번호: 2) 및 TCACCAGG (서열식별번호: 3)은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 E1b-19K 삽입 부위에 대한 독특한 경계 서열을 정의한다. 명세서 및 청구범위에 걸쳐, 소정의 부위에 인접한 결실, 예를 들어 소정의 유전자의 시작 부위에 인접한 결실 또는 소정의 유전자의 정지 부위에 인접한 결실은, 주어진 시작 부위 또는 정지 부위를 구성하는 뉴클레오티드의 전부 또는 일부의 결실을 포함할 수 있거나 또는 결실을 포함하지 않을 수 있음을 의미하는 것으로 이해한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 E3 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 약 500 내지 약 3185, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 3185, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 3185, 약 1500 내지 약 3000, 약 1500 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 3185, 약 2000 내지 약 3000, 약 2000 내지 약 2500, 약 2500 내지 약 3185, 약 2500 내지 약 3000 또는 약 3000 내지 약 3185개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 pVIII의 정지 부위 (즉, pVIII의 정지 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 27855-27857에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 Fiber의 시작 부위 (즉, Fiber의 시작 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 31042-31044에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위 (즉, E3-10.5K의 정지 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 29770-29772에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 E3-14.7K의 정지 부위 (즉, E3-14.7K의 정지 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 30837-30839에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 약 500 내지 약 1551, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1551, 약 1000 내지 약 1500 또는 약 1500 내지 약 1551개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 약 1050개 뉴클레오티드의 결실을 포함하며, 예를 들어 E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 1063 또는 1064개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 Ad5 dl309 E3 결실에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 29773-30836에 상응하는 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-gp19K의 정지 부위 (즉, E3-gp19K의 정지 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 29215-29217에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 E3-14.7K의 정지 부위 (즉, E3-14.7K의 정지 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 30837-30839에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 약 500 내지 약 1824, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1824, 약 1000 내지 약 1500 또는 약 1500 내지 약 1824개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 약 1600개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 예를 들어, E3 결실은 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 1622개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 29218-30839에 상응하는 결실을 포함한다.
특정 실시양태에서, E3 삽입 부위를 포함하는 재조합 아데노바이러스가 제공되며, 예를 들어 재조합 아데노바이러스는 E3 삽입 부위에 삽입된 치료적 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 E3 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 약 500 내지 약 3185, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 3185, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 3185, 약 1500 내지 약 3000, 약 1500 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 3185, 약 2000 내지 약 3000, 약 2000 내지 약 2500, 약 2500 내지 약 3185, 약 2500 내지 약 3000 또는 약 3000 내지 약 3185개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 pVIII의 정지 부위 (즉, pVIII의 정지 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 27855-27857에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 Fiber의 시작 부위 (즉, Fiber의 시작 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 31042-31044에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위 (즉, E3-10.5K의 정지 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 29770-29772에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 E3-14.7K의 정지 부위 (즉, E3-14.7K의 정지 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 30837-30839에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 약 500 내지 약 1551, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1551, 약 1000 내지 약 1500 또는 약 1500 내지 약 1551개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 약 1050개 뉴클레오티드의 결실을 포함하며, 예를 들어 E3 결실은 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 1063 또는 1064개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 Ad5 dl309 E3 결실에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 29773-30836에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 29773 및 30836에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 CAGTATGA (서열식별번호: 19)와 TAATAAAAAA (서열식별번호: 20) 사이에 삽입되며, 예를 들어 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로 CAGTATGA (서열식별번호: 19), 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열, 제2 뉴클레오티드 서열, 및 TAATAAAAAA (서열식별번호: 20)를 포함한다. CAGTATGA (서열식별번호: 19) 및 TAATAAAAAA (서열식별번호: 20)은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1) 내에 E3 삽입 부위를 위한 독특한 경계 서열을 정의한다.
특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 E3-gp19K의 정지 부위 (즉, E3-gp19K의 정지 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 29215-29217에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 E3-14.7K의 정지 부위 (즉, E3-14.7K의 정지 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 30837-30839에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 약 500 내지 약 1824, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1824, 약 1000 내지 약 1500 또는 약 1500 내지 약 1824개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 약 1600개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 예를 들어, E3 삽입 부위는 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 1622개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E3 삽입 부위는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 29218-30839에 상응하는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 29218 및 30839에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 TGCCTTAA (서열식별번호: 21)와 TAAAAAAAAAT (서열식별번호: 22) 사이에 삽입되며, 예를 들어 재조합 아데노바이러스는 5'에서 3' 배향으로 TGCCTTAA (서열식별번호: 21), 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열, 제2 뉴클레오티드 서열, 및 TAAAAAAAAAT (서열식별번호: 22)를 포함한다. TGCCTTAA (서열식별번호: 21) 및 TAAAAAAAAAT (서열식별번호: 22)는 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1) 내에 E3 삽입 부위를 위한 독특한 경계 서열을 정의한다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 E4 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위 (즉, E4-ORF6/7의 시작 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 34075-34077에 상응하는 뉴클레오티드 서열)와 우측 역전된 말단 반복부 (ITR; 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 35836-35938에 상응함) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위와 E4-ORF1의 시작 부위 (즉, E4-ORF1의 시작 코돈을 코딩하는, 예를 들어 서열식별번호: 1의 뉴클레오티드 35524-35526에 상응하는 뉴클레오티드 서열) 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 뉴클레오티드 서열 E4-ORF6/7의 시작 부위와 E4-ORF1의 시작 부위 사이에 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 2500, 약 1500 내지 약 2000 또는 약 2000 내지 약 2500개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위에 인접한 약 250 내지 약 1500, 약 250 내지 약 1250, 약 250 내지 약 1000, 약 250 내지 약 750, 약 250 내지 약 500, 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1250, 약 500 내지 약 1000, 약 500 내지 약 750, 750 내지 약 1500, 약 750 내지 약 1250, 약 750 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1500 또는 약 1000 내지 약 1250개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위에 인접한 약 1450개 뉴클레오티드의 결실을 포함하며, 예를 들어 E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위에 인접한 약 1449개 뉴클레오티드의 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, E4 결실은 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 34078-35526에 상응하는 결실을 포함한다.
II. 바이러스의 생산 방법
본 발명의 재조합 바이러스를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 감염성 바이러스 입자의 생산이 가능하도록 적합한 조건 하에 형질감염된 또는 감염된 숙주 세포를 배양하는 것을 비롯한 통상적인 기술을 이용하여 적합한 숙주 세포주에서 개시된 바이러스를 생산한다. 바이러스 유전자를 코딩하는 핵산을 플라스미드에 도입시킬 수 있고, 통상적인 형질감염 또는 형질전환 기술을 통해 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 개시된 바이러스의 생산을 위한 예시적인 적합한 숙주 세포에는 인간 세포주 예컨대 HeLa, Hela-S3, HEK293, 911, A549, HER96 또는 PER-C6 세포가 포함된다. 구체적인 생산 및 정제 조건은 바이러스 및 이용되는 생산 시스템에 따라 달라질 것이다. 아데노바이러스의 경우, 바이러스 입자의 생성을 위한 전통적인 방법은, 공동-형질감염에 이어서, 셔틀 플라스미드 (일반적으로 아데노바이러스 게놈의 작은 하위 집합을 함유하고, 임의적으로 잠재적인 트랜스진 발현 카세트를 함유함) 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 (전체 아데노바이러스 게놈의 대부분을 함유함)의 후속적인 생체내 재조합이다.
아데노바이러스의 생성을 위한 대안적인 기술에는 박테리아 인공 염색체 (BAC) 시스템 (상보성 아데노바이러스 서열을 함유하는 2개의 플라스미드를 이용하는 recA+ 박테리아 균주에서 생체내 박테리아 재조합) 및 효모 인공 염색체 (YAC) 시스템을 이용하는 것이 포함된다.
생산 후에, 감염성 바이러스 입자를 배양물로부터 회수하고, 임의적으로 정제한다. 전형적인 정제 단계에는 플라크 정제, 원심분리, 예를 들어 염화세슘 구배 원심분리, 정화, 효소 처리, 예를 들어 벤조나제 또는 프로테아제 처리, 크로마토그래피 단계, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피 또는 여과 단계가 포함될 수 있다.
III. 치료적 트랜스진
개시된 재조합 아데노바이러스는 치료적 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 특정 시양태에서, 개시된 재조합 아데노바이러스는 각각 제1 및 제2 치료적 트랜스진을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
치료적 트랜스진은 치료적 핵산, 예를 들어 안티센스 RNA 또는 리보자임 RNA를 코딩할 수 있다. 치료적 트랜스진은 치료적 펩티드 또는 폴리펩티드, 예를 들어 아폽토시스 작용제, 항체, CTL 반응성 펩티드, 시토카인, 세포용해제, 세포독성제, 효소, 면역 반응을 유도하기 위해 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 이종성 항원, 면역자극제 또는 면역조절제, 인터페론, 용해성 펩티드, 종양단백질, 세포 사멸을 유도하는 과정을 촉매하는 폴리펩티드, 체세포에서의 유전자 결함을 보완하는 폴리펩티드, 종양 저해자 단백질, 백신 항원, 또는 임의의 이들의 조합물을 코딩할 수 있다.
특정 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 치료적 트랜스진은 아세틸콜린, 항-CTLA-4 항체 중쇄 또는 경쇄, 항-PD-1 항체 중쇄 또는 경쇄, 항-PD-L1 항체 중쇄 또는 경쇄, BORIS/CTCFL, CD19, CD20, CD40L, CD70, CD80, CD86, CD137, CD137L, CD154, DKK1/Wnt, FGF, GITRL, GM-CSF, ICAM, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10 트랩, IL-15, IL-15 IL-15 수용체 융합 단백질, IL-17, IL-23, IL-23A/p19, IL-12B/p40, IL-24, IL-27, IL-27A/p28, IL-27B/EBI3, IL-35, 인터페론-감마, MAGE, NY-ESO-1, Ox40L, p53, 분비된 플라겔린, TGF-β, TGF-β 트랩, 티미딘 키나제, 및 TNF-알파로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩한다.
특정 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 치료적 트랜스진은 아세틸콜린, 항-CTLA-4 항체 중쇄 또는 경쇄, 항-PD-1 항체 중쇄 또는 경쇄, 항-PD-L1 항체 중쇄 또는 경쇄, BORIS/CTCFL, CD19, CD20, CD40L, CD70, CD80, CD86, CD137, CD137L, CD154, DKK1/Wnt, FGF, GITRL, GM-CSF, ICAM, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10 트랩, IL-12, IL-12A/p35, IL-12B/p40, IL-15, IL-15 IL-15 수용체 융합 단백질, IL-23A/p19, 인터페론-감마, MAGE, NY-ESO-1, Ox40L, p53, 분비된 플라겔린, TGF-β, TGF-β 트랩, 티미딘 키나제, 및 TNF-알파로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩한다.
특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진은 각각 이종이량체성 단백질, 예를 들어 이종이량체성 시토카인의 제1 및 제2 서브유닛을 코딩한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 치료적 트랜스진은 이종이량체성 시토카인 IL-12를 구성하는 IL-12A/p35 및 IL-12B/p40으로부터 선택된다. 예를 들어, 제1 치료적 트랜스진은 IL-12B/p40을 코딩할 수 있고, 제2 치료적 트랜스진은 IL-12A/p35를 코딩할 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 17-1000, 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 1013-1606, 및/또는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 17-1606에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 서열식별번호: 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 서열식별번호: 8과 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
추가로, 특정 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 치료적 트랜스진은 이종이량체성 시토카인 IL-23을 구성하는 IL-23A/p19 및 IL-12B/p40으로부터 선택된다. 예를 들어, 제1 치료적 트랜스진은 IL-12B/p40을 코딩할 수 있고, 제2 치료적 트랜스진은 IL-23A/p19를 코딩할 수 있다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 17-1000, 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 1013-1582, 및/또는 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 17-1582에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 서열식별번호: 9와 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
추가로, 특정 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 치료적 트랜스진은 이종이량체성 시토카인 IL-23을 구성하는 IL-27A/p28 및 IL-27B/EBI3으로부터 선택된다.
서열 동일성은 관련 기술분야의 기술 내에 있는 다양한 방법으로, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인 (Megalign, DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 결정할 수 있다. 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 이용되는 알고리즘을 사용하는 BLAST (베이직 로칼 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool)) 분석 (Karlin et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Altschul, (1993) J. Mol. Evol. 36, 290-300; Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 참조로 포함됨)은 서열 유사성 검색을 위해 맞추어진다. 서열 데이터베이스를 검색하는데 있어서 기본적인 사안의 논의에 대해서는, 문헌 [Altschul et al., (1994) Nature Genetics 6:119-129 (전문이 본원에 참조로 포함됨)]를 참조한다. 관련 기술분야의 기술자는, 비교할 서열의 전장에 걸쳐서 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 결정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 히스토그램, 작도, 정렬, 기대치 (즉, 데이터베이스 서열에 대한 매칭을 보고하기 위한 통계적 유의성 임계치), 컷오프, 매트릭스 및 필터에 대한 검색 파라미터가 디폴트 설정에 있다. blastp, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 사용되는 디폴트 스코어링 매트릭스(default scoring matrix)는 BLOSUM62 매트릭스이다 (Henikoff et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 전문이 참조로 포함됨). 4종의 blastn 파라미터를 다음과 같이 조정할 수 있다: Q=10 (갭 생성 페널티); R=10 (갭 연장 페널티); wink=1 (질문에 따라 모든 wink.sup.th 위치에서 워드 히트를 생성함); 및 gapw=16 (내부에 갭이 있는 정렬이 생성되는 윈도우 폭을 설정함). 동등한 Blastp 파라미터 설정은 Q=9; R=2; wink=1; 및 gapw=32일 수 있다. 또한, NCBI (국립 생물공학 정보 센터, National Center for Biotechnology Information) BLAST 어드밴스드 옵션(Advanced Option) 파라미터 (예를 들어: -G, 갭 개방을 위한 값 [정수]: 디폴트 = 뉴클레오티드의 경우 5 / 단백질의 경우 11; -E, 갭 연장을 위한 값 [정수]: 디폴트 = 뉴클레오티드의 경우 2 / 단백질의 경우 1; -q, 뉴클레오티드 미스매치에 대한 페널티 [정수]: 디폴트 = -3; -r, 뉴클레오티드 매치에 대한 보상 [정수]: 디폴트 = 1; -e, 기대치 [실수]: 디폴트 = 10; -W, 워드 크기 [정수]: 디폴트 = 뉴클레오티드의 경우 11 / 메가블라스트의 경우 28 / 단백질의 경우 3; -y, 블라스트 연장에 대한 드롭오프 (X) (비트(bit)): 디폴트 = blastn의 경우 20 / 다른 경우 7; -X, 갭이 있는 정렬에 대한 X 드롭오프 값 (비트): 디폴트 = 모든 프로그램의 경우 15, blastn에는 적용되지 않음; 및 -Z, 갭이 있는 정렬에 대한 최종 X 드롭오프 값 (비트): blastn의 경우 50, 다른 경우 25)를 이용하여 검색을 수행할 수 있다. 쌍별 단백질 정렬을 위한 ClustalW를 또한 사용할 수 있다 (디폴트 파라미터에는 예를 들어 Blosum62 매트릭스 및 갭 개방 페널티 = 10 및 갭 연장 페널티 = 0.1이 포함될 수 있음). GCG 팩키지 버젼 10.0으로 입수가능한 서열들 사이의 베스트핏(Bestfit) 비교는 DNA 파라미터 GAP=50 (갭 생성 페널티) 및 LEN=3 (갭 연장 페널티)을 이용하고, 단백질 비교에서의 동등한 설정은 GAP=8 및 LEN=2이다.
특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 크기는 조합하였을 때 약 500 내지 약 5000, 약 500 내지 약 4000, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 5000, 약 1000 내지 약 4000, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 5000, 약 2000 내지 약 4000, 약 2000 내지 약 3000, 약 3000 내지 약 5000, 약 3000 내지 약 4000 또는 약 4000 내지 5000개 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 크기는 조합하였을 때 약 500 내지 약 7000, 약 500 내지 약 6000, 약 500 내지 약 5000, 약 500 내지 약 4000, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 7000, 약 1000 내지 약 6000, 약 1000 내지 약 5000, 약 1000 내지 약 4000, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 7000, 약 2000 내지 약 6000, 약 2000 내지 약 5000, 약 2000 내지 약 4000, 약 2000 내지 약 3000, 약 3000 내지 약 7000, 약 3000 내지 약 6000, 약 3000 내지 약 5000, 약 3000 내지 약 4000, 약 4000 내지 약 7000, 약 4000 내지 약 6000, 약 4000 내지 약 5000개 뉴클레오티드, 약 5000 내지 약 7000, 약 5000 내지 약 6000 또는 약 6000 내지 약 7000개 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 크기는 조합하였을 때 적어도 약 500 내지 약 5000, 약 500 내지 약 4000, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 5000, 약 1000 내지 약 4000, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 5000, 약 2000 내지 약 4000, 약 2000 내지 약 3000, 약 3000 내지 약 5000, 약 3000 내지 약 4000 또는 약 4000 내지 5000개 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 크기는 조합하였을 때 적어도 약 500 내지 약 7000, 약 500 내지 약 6000, 약 500 내지 약 5000, 약 500 내지 약 4000, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 7000, 약 1000 내지 약 6000, 약 1000 내지 약 5000, 약 1000 내지 약 4000, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 7000, 약 2000 내지 약 6000, 약 2000 내지 약 5000, 약 2000 내지 약 4000, 약 2000 내지 약 3000, 약 3000 내지 약 7000, 약 3000 내지 약 6000, 약 3000 내지 약 5000, 약 3000 내지 약 4000, 약 4000 내지 약 7000, 약 4000 내지 약 6000, 약 4000 내지 약 5000개 뉴클레오티드, 약 5000 내지 약 7000, 약 5000 내지 약 6000 또는 약 6000 내지 약 7000개 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 크기는 조합하였을 때 적어도 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 3000, 약 4000, 또는 약 5000개 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 크기는 조합하였을 때 적어도 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 3000, 약 4000, 약 5000개 뉴클레오티드, 약 6000, 또는 약 7000개 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 크기는 조합하였을 때 약 1600개 뉴클레오티드, 약 1650개 뉴클레오티드, 또는 약 3100개 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진은 링커에 의해 분리된다. 링커는 절단 부위, 예를 들어 단백질분해적 또는 비-단백질분해적 절단 부위, 또는 리보솜 스키핑 서열, 예를 들어 T2A 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진은 단백질분해적 절단 부위에 의해 분리된다. 특정 실시양태에서, 단백질분해적 절단 부위는 특정한 조직, 소기관 또는 세포내 구획에 존재하는 프로테아제에 의해 절단된다. 특정 실시양태에서, 링커는 단백질분해적 절단 부위, 및 단백질분해적 절단 이후에 디술피드 연결을 생성하는 2개의 시스테인 잔기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 단백질분해적 절단 부위는 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 푸린, PC1, PC2, PC3, 카텝신 B, 프로테이나제 3, 및 카스파제 3으로부터 선택되는 프로테아제에 의해 절단된다.
특정 실시양태에서, 절단 부위는 진핵생물 세포의 소포체 또는 골지에 존재하는 프로테아제에 의해 절단되는 단백질분해적 절단 부위이다. 특정 실시양태에서, 단백질분해적 절단 부위는 푸린 절단 부위이다. 푸린은 보편적으로 발현되어 골지에서 국지화되는 프로테아제이며, 이는 컨센서스 서열 RX1X2R (서열식별번호: 6) (여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 Lys 또는 Arg임)을 인식하고, 마지막 Arg 이후에 절단된다. 푸린은 골지를 통해 수송되는 단백질의 프로펩티드를 절단하는데 있어서 생물학적 역할을 한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 단백질분해적 절단 부위는 서열 RX1X2R (서열식별번호: 6) (여기서, X1은 임의의 아미노산이고, X2는 Lys 또는 Arg임)을 포함하는 푸린 절단 부위, 예를 들어 서열 RAKR (서열식별번호: 7)을 포함하는 푸린 절단 부위이다.
III. 제약 조성물
치료적 사용을 위해, 본원에 개시된 재조합 아데노바이러스를 바람직하게는 제약상 허용되는 담체와 조합한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는 담체"는 합리적인 이익/위험 비에 비례하여 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증이 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 완충제, 담체 및 부형제를 의미한다. 담체(들)은 제형의 다른 성분과 적합성인 면에서 "허용가능해야" 하고, 수용자에게 유해하지 않아야 한다. 제약상 허용되는 담체에는 제약적 투여에 적합한 완충제, 용매, 분산 매질, 코팅, 등장화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 제약상 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
재조합 아데노바이러스를 함유하는 제약 조성물은 투여 단위 형태로 제시될 수 있고, 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화되어야 한다. 투여 경로의 예는 정맥내 (IV), 피내, 흡입, 경피, 국소, 경점막, 및 직장 투여이다. 유용한 제형은 제약 분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)]을 참조한다. 비경구 투여에 적합한 제형 성분에는 멸균 희석제 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 경화유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이팅제 예컨대 EDTA; 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및 긴장성 조정제 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스가 포함된다.
정맥내 투여의 경우, 적합한 담체에는 생리 식염수, 정균수, 크레모포어(Cremophor) ELTM (바스프(BASF), 뉴저지주 파시페니) 또는 인산염 완충된 식염수 (PBS)가 포함된다. 담체는 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하고, 미생물에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
제약 제형은 바람직하게는 멸균성이다. 멸균화는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물을 동결건조시키는 경우, 여과 멸균화는 동결건조 및 재구성 이전에 또는 이후에 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"은 유익한 또는 원하는 결과를 달성하는데 충분한 활성 성분의 양 (예를 들어, 재조합 아데노바이러스의 양)을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 용량으로 투여될 수 있고, 특정한 제형 또는 투여 경로에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
특정 실시양태에서, 활성 성분의 치료 유효량은 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예를 들어 1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 범위이다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스의 치료 유효량은 102 내지 1015 플라크 형성 단위 (pfu), 예를 들어 102 내지 1010, 102 내지 105, 105 내지 1015, 105 내지 1010, 또는 1010 내지 1015 플라크 형성 단위의 범위이다. 투여되는 양은 치료할 질환 또는 징후의 유형 및 정도, 환자의 전반적인 건강 상태, 활성 성분의 생체내 능력, 제약 제형, 투여 경로와 같은 변수에 따라 좌우될 것이다. 초기 용량은 원하는 혈관 수준 또는 조직 수준을 신속하게 달성하기 위해 상한을 넘어 증가될 수 있다. 대안적으로, 초기 용량은 최적 용량보다 적을 수 있고, 치료 과정 동안에 1일 용량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 인간 용량은 예를 들어 0.5 mg/kg에서 20 mg/kg까지 작동하도록 고안된 통상적인 I상 용량 증량 연구에서 최적화될 수 있다. 투여 빈도는 투여 경로, 투여량, 재조합 아데노바이러스의 혈청 반감기, 및 치료할 질환과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 예시적인 투여 빈도는 1일 1회, 주 1회, 2주마다 1회이다.
IV. 치료적 사용
본원에 개시된 재조합 아데노바이러스를 이용하여 다양한 의학적 징후, 예를 들어 암을 치료할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 대상체에서, 예를 들어 인간에서 질환을 치료하는 것을 의미한다. 여기에는 (a) 질환의 억제, 즉, 그의 발생의 저지; 및 (b) 질환의 완화, 즉, 질환 상태의 퇴행 유발이 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 치료되는 유기체를 지칭한다. 이러한 유기체에는 바람직하게는 포유류 (예를 들어, 뮤린, 원숭이, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 등)가 포함되나 이에 제한되지는 않고, 가장 바람직하게는 인간이 포함된다.
암의 예에는 고형 종양, 연조직 종양, 조혈성 종양 및 전이성 병변이 포함된다. 조혈성 종양의 예에는 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수구성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 예를 들어 형질전환된 CLL, 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종, 모발 세포 백혈병, 골수이형성 증후군 (MDS), 림프종, 호지킨병, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 또는 리히터 증후군 (리히터 형질전환)이 포함된다. 고형 종양의 예에는 악성 종양, 예를 들어 육종, 선암종, 및 다양한 기관계의 암종, 예컨대 두경부 (예컨대, 인두), 갑상선, 폐 (소세포 또는 비소세포 폐 암종 (NSCLC)), 유방, 림프, 위장 (예를 들어, 구강, 식도, 위, 간, 췌장, 소장, 결장 및 직장, 항문관), 생식기 및 비뇨생식관 (예를 들어, 신장, 요로상피, 방광, 난소, 자궁, 자궁경부, 자궁내막, 전립선, 고환), CNS (예를 들어, 신경 또는 교질 세포, 예를 들어 신경아세포종 또는 신경교종), 또는 피부 (예를 들어, 흑색종)에서 발병하는 것들이 포함된다.
특정 실시양태에서, 암은 항문암, 기저 세포 암종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 암종, 담관암종, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 위식도암, 위장 (GI) 암, 위장 간질 종양, 간세포 암종, 부인과암, 두경부암, 혈액암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 신경내분비암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 소아암, 전립선암, 신세포 암종, 육종, 피부암, 소세포 폐암, 피부의 편평상피 세포 암종, 위암, 고환암 및 갑상선암으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 암은 비인두암, 기저 세포 암종, 윤활막암, 간세포암, 신장암, 결합 조직의 암, 흑색종, 폐암, 대장암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 뇌암, 인후암, 구강암, 간암, 골암, 췌장암, 융모암종, 가스트린종, 신경내분비, 크롬친화세포종, 프로락틴종, T-세포 백혈병/림프종, 신경종, 폰 히펠-린다우(von Hippel-Lindau) 질환, 졸링어-엘리슨(Zollinger-Ellison) 증후군, 부신암, 항문암, 담관암, 방광암, 요관암, 뇌암, 희소돌기아교세포종, 신경모세포종, 수막종, 척수 종양, 골암, 골연골종, 연골육종, 유잉 육종, 미지의 원발성 부위의 암, 유암종, 위장관의 유암종, 섬유육종, 유방암, 페제트 질환, 자궁경부암, 결장직장암, 직장암, 식도암, 담낭암, 두부암, 안암, 경부암, 신장암, 윌름스 종양, 간암, 카포시 육종, 전립선암, 폐암, 고환암, 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 구강암, 피부암, 중피종, 다발성 골수종, 난소암, 내분비 췌장암, 글루카곤종, 췌장암, 부갑상선암, 음경암, 뇌하수체암, 연조직 육종, 망막모세포종, 소장암, 위암, 흉선암, 갑상선암, 영약막암, 포상기태, 자궁암, 자궁내막암, 질암, 외음부암, 청신경종, 균상 식육종, 인슐린종, 유암종 증후군, 소마토스타틴종, 치육암, 심장암, 구순암, 뇌척수막암, 구강암, 신경암, 구개암, 이하선암, 복막암, 인두암, 늑막암, 타액선암, 설암 및 편도암으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 하나 이상의 요법, 예를 들어 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법, 또는 바이러스요법과 조합되어 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 에를로티닙과 조합되어 투여된다. 특정 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 체크포인트 억제제, 예를 들어 항-CTLA-4 항체, 항-PD-1 항체, 또는 항-PD-L1 항체와 조합되어 투여된다. 예시적인 항-PD-1 항체에는 예를 들어 니볼루맙 (옵디보(Opdivo)®, 브리스톨-마이어스 스큅 캄파니(Bristol-Myers Squibb Co.)), 펨브롤리주맙 (케이트루다(Keytruda)®, 머크 샤프 앤드 돔 코퍼레이션(Merck Sharp & Dohme Corp.)), PDR001 (노바티스 파마슈티칼스(Novartis Pharmaceuticals)), 및 피딜리주맙 (CT-011, 큐어 테크(Cure Tech))이 포함된다. 예시적인 항-PD-L1 항체에는 예를 들어 아테졸리주맙 (테센트리크(Tecentriq)®, 제넨테크(Genentech)), 두발루맙 (아스트라제네카(AstraZeneca)), MEDI4736, 아벨루맙, 및 BMS 936559 (브리스톨 마이어스 스큅 캄파니)가 포함된다.
용어 "조합하여" 투여하는 것은, 본원에서 사용된 바와 같이, 대상체에서 장애의 발병 동안에 2종의 (또는 그 초과의) 상이한 치료를 대상체에게 전달하여, 환자에 대한 치료 효과가 한 시점에서 중첩되게 하는 것을 의미하는 것으로 이해한다. 특정 실시양태에서, 두번째 치료의 전달을 시작할 때 한 치료의 전달이 여전히 일어나고 있어서, 투여의 면에서 중첩된다. 이는 때때로 본원에서 "동시" 또는 "공동 전달"로 지칭된다. 다른 실시양태에서, 다른 치료의 전달을 시작하기 전에 한 치료의 전달이 종료된다. 이러한 경우의 일부 실시양태에서, 조합된 투여로 인해 치료가 더욱 효과적이다. 예를 들어, 두번째 치료는 더욱 효과적이며, 예를 들어 첫번째 치료의 부재 하에 두번째 치료를 투여한 경우에 확인되는 것에 비해, 더 적은 두번째 치료에도 동등한 효과가 확인되거나, 또는 두번째 치료가 더 큰 정도로 증상을 감소시키거나, 또는 유사한 상황이 첫번째 치료에서도 확인된다. 특정 실시양태에서, 장애와 관련된 증상 또는 다른 파라미터의 감소가 다른 치료의 부재 하에 전달된 한 치료에 의해 관찰되는 것보다 더 크도록 전달된다. 2종의 치료의 효과는 부분적으로 상가적이거나, 전체적으로 상가적이거나 또는 상가적인 것보다 더 크다. 두번째 치료가 전달될 때, 전달된 첫번째 치료의 효과가 여전히 검출가능하도록 전달될 수 있다.
특정 실시양태에서, 재조합 바이러스의 유효량은 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 측정함으로써 확인되고/거나, 대상체의 치료 방법은 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 측정하는 것을 추가로 포함한다. 암은 면역저해를 특징으로 할 수 있으며, 대상체에서 항원에 대한 면역 반응의 측정은 대상체에서 면역저해 수준의 지표일 수 있다. 따라서, 대상체에서 항원에 대한 면역 반응의 측정은 치료의 효능 및/또는 재조합 바이러스의 유효량의 지표일 수 있다. 대상체에서 항원에 대한 면역 반응은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원에 대한 면역 반응은, 대상체의 피부 상의 주사 부위에서 대상체에게 항원을 주사하고 주사 부위에서 염증의 경화 또는 양의 크기를 측정함으로써 측정된다. 특정 실시양태에서, 항원에 대한 면역 반응은 항원에 노출 시 대상체의 세포로부터의 시토카인 (예를 들어, 인터페론 감마, IL-4 및/또는 IL-5)의 방출에 의해 측정된다.
명세서에 걸쳐, 바이러스, 조성물 및 시스템이 특정한 성분을 갖거나, 포괄하는 또는 포함하는 것으로 기재되거나, 또는 공정 및 방법이 특정한 단계를 갖거나, 포괄하는 또는 포함하는 것으로 기재된 경우, 이는 추가적으로, 인용된 성분으로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어지는 본 발명의 조성물, 디바이스 및 시스템이 있고, 인용된 공정 단계로 본질적으로 이루어지거나 또는 그로 이루어진 본 발명에 따른 공정 및 방법이 있는 것으로 고려된다.
본 출원에서, 요소 또는 성분이 인용된 요소 또는 성분의 목록에 포함되고/거나 그로부터 선택되는 경우, 상기 요소 또는 성분이 인용된 요소 또는 성분 중 어느 하나일 수 있거나, 또는 상기 요소 또는 성분이 인용된 요소 또는 성분 중 2종 이상으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있음을 이해해야 한다.
추가로, 본원에 기재된 바이러스, 조성물, 시스템, 방법 또는 공정의 요소 및/또는 특징이, 본원에서 명백하건 암시적이건 간에, 본 발명의 개념 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 방식으로 조합될 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 특정한 바이러스가 언급된 경우, 문맥상 달리 이해되지 않는다면, 해당 바이러스는 본 발명의 조성물의 다양한 실시양태에서 및/또는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 달리 말하면, 본 출원 내에서, 실시양태는 명확하고 간결한 출원이 기재되고 도시되도록 하는 방식으로 기재되고 도시되었지만, 실시양태가 본원의 교시 및 발명(들)으로부터 벗어나지 않고 다양하게 조합되거나 분리될 수 있는 것으로 의도되고 그렇게 이해될 것이다. 예를 들어, 본원에 기재되고 도시된 모든 특징은 본원에 기재되고 도시된 본 발명(들)의 모든 측면에 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
문맥 및 용법상 달리 이해되지 않는다면, 표현 "중 적어도 하나"는 상기 표현 뒤에 있는 각각의 인용된 대상 및 인용된 대상의 2종 이상의 다양한 조합을 개별적으로 포함한다는 것을 이해해야 한다. 문맥상 달리 이해되지 않는다면, 3종 이상의 인용된 대상과 관련하여 표현 "및/또는"은 동일한 의미를 갖는 것으로 이해해야 한다.
달리 구체적으로 명시되지 않거나 문맥상 달리 이해되지 않는다면, 용어 "포함하다", "포함한다", "포함하는", "갖다", "갖는다", "갖는", "함유하다", "함유한다", 또는 "함유하는" 및 이들의 문법적으로 동등한 용어는 일반적으로 예를 들어 추가적인 인용되지 않은 요소 또는 단계를 배제하지 않고 개방형이고 비제한적인 것으로 이해되어야 한다.
본 출원의 다양한 곳에서, 바이러스, 조성물, 시스템, 공정 및 방법, 또는 이들의 특징이 그룹으로 또는 범위로 개시된다. 구체적으로, 상기 기재는 이러한 그룹 및 범위의 구성원들의 각각의 모든 개별 하위 조합을 포함하는 것으로 의도된다. 다른 예로, 1 내지 20 범위의 정수는 구체적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20을 개별적으로 개시하는 것으로 의도된다.
용어 "약"이 정량적인 값 앞에서 사용되는 경우, 또한 달리 구체적으로 명시하지 않는다면, 본 발명은 또한 구체적인 정량적인 값 자체를 포함한다. 달리 나타내거나 유추되지 않는다면, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 공칭 값으로부터 ±10% 변동을 나타낸다.
단계의 순서 또는 특정한 작용을 수행하는 순서는 본 발명이 작동가능하다면 중요하지 않음을 이해해야 한다. 더욱이, 2개 이상의 단계 또는 작동이 동시에 수행될 수 있다.
본원에서 임의의 모든 예, 또는 예시적인 용어, 예를 들어 "예컨대" 또는 "비롯한"의 사용은 단지 본 발명을 더욱 잘 예시하기 위해 의도된 것이며, 청구되지 않는다면 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 용어도 임의의 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실시에서 필수적임을 나타내는 것으로 파악되어서는 안된다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시적인 것이며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위 또는 내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 이종이량체성 IL-12의 발현
인터류킨 12 (IL-12)는 세포-매개된 면역을 촉진시키는 시토카인이다. IL-12는 2개의 별개의 단백질 쇄, IL-12A/p35 및 IL-12B/p40을 함유하며, 이들은 합하여 IL-12p70으로 표시되는 활성 이종이량체를 형성한다. 이 실시예는 IL-12 서브유닛 IL-12A/p35 및 IL-12B/p40 둘 다를 포함하는 인간 IL-12 이종이량체의 발현을 기재한다.
아데노바이러스 유형 5 게놈의 일부분을 보유하는 플라스미드 pAd1을 E1b-19k 영역의 시작 부위에서 SalI 부위 및 SalI 부위의 200개 염기쌍 3'에서 XhoI 부위를 보유하도록 변형시켜, 치료적 트랜스진의 삽입을 용이하게 하였다. 생성된 플라스미드는 이후 pAd1-Δ19k로 지칭된다.
변형된 E1b-19k 영역의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같으며, 융합된 SalI 및 XhoI 부위로부터의 잔류 염기는 밑줄로 나타내었다:
인간 IL-12A/p35를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 뇌심근염 바이러스 (EMCV) IRES, 이어서 인간 IL-12B/p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 pAd1-Δ19k의 변형된 E1b-19k 영역에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드는 이후 pAd1-hIL-12-IRES로 지칭된다. E1b-19k 영역에 삽입된 인간 IL-12A/p35를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 EMCV IRES, 이어서 인간 IL-12B/p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같으며, 여기서 IL-12A/p35 및 IL-12B/p40 코딩 영역은 대문자로 나타내고, IRES는 소문자로 나타내고, SalI 및 XhoI 제한 부위를 포함하는 플랭킹 E1b-19k 서열은 밑줄로 나타내었다:
추가로, 인간 IL-12B/p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 푸린 절단 부위 (RAKR)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 인간 IL-12A/p35를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 pAd1-Δ19k의 변형된 E1b-19k 영역에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드는 이후 pAd1-hIL-12-푸린으로 지칭된다. E1b-19k 영역에 삽입된 인간 IL-12B/p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 푸린 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 인간 IL-12A/p35를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같으며, 여기서 IL-12B/p40 및 IL-12A/p35 코딩 영역은 대문자로 나타내고, 푸린 절단 부위 코딩 영역은 소문자로 나타내고, SalI 및 XhoI 제한 부위를 포함하는 플랭킹 E1b-19k 서열은 밑줄로 나타내었다:
추가로, 인간 IL-12B/p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 2A 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 인간 IL-12A/p35를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 pAd1-Δ19k의 변형된 E1b-19k 영역에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드는 이후 pAd1-hIL-12-2A로 지칭된다. E1b-19k 영역에 삽입된 인간 IL-12B/p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 2A 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 인간 IL-12A/p35를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같으며, 여기서 IL-12B/p40 및 IL-12A/p35 코딩 영역은 대문자로 나타내고, 2A 코딩 영역은 소문자로 나타내고, SalI 및 XhoI 제한 부위를 포함하는 플랭킹 E1b-19k 서열은 밑줄로 나타내었다:
시험한 플라스미드에 대한 상세한 내용은 표 1에 제공되어 있다.
표 1
플라스미드를 HEK-293 세포에 일시적으로 감염시켰다. 조건화된 배지를 형질감염 4 일 후에 수집하였고, IL-12A/p35 및 IL-12B/p40 서브유닛의 이종이량체를 특이적으로 검출하는 ELISA (바이오레전드(Biolegend) 431704)에 의해 IL-12 농도를 측정하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 푸린 절단 부위 (pAd1-hIL-12-푸린)를 갖는 플라스미드는 IRES (pAd1-hIL-12-IRES) 또는 2A 펩티드 (pAd1-hIL-12-2A)를 이용하는 플라스미드에 비해 유의하게 더 높은 이종이량체성 IL-12 발현을 유도하였다.
실시예 2: IL-12 발현 아데노바이러스
이 실시예는 인간 IL-12 서브유닛 IL-12A/p35 및 IL-12B/p40을 발현하는 재조합 유형 5 (Ad5) 아데노바이러스를 기재한다.
E1a 개시의 -304 내지 -255 상류에 위치한 뉴클레오티드 영역의 결실을 보유하는 아데노바이러스 유형 5 바이러스를 구축하였고, 이는 E1a 발현이 암-선택적이게 만든다 (미국 특허 번호 9,073,980에서 이전에 기재됨). 생성된 바이러스는 이후 TAV로 지칭된다.
TAV는 E1b-19k 영역의 시작 부위에서 SalI 부위 및 SalI 부위의 200개 염기쌍 3'에서 XhoI 부위를 보유하도록 추가로 변형시켜, 치료적 트랜스진의 삽입을 용이하게 하였다. 생성된 바이러스는 이후 TAV-Δ19k로 지칭된다. 변형된 E1b-19k 영역의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같으며, 융합된 SalI 및 XhoI 부위로부터의 잔류 염기는 밑줄로 나타내었다:
TAV-Δ19k는 E3 영역에서 dl309 붕괴를 보유하였다. 바이러스 게놈이 너무 커서 바이러스 캡시드에 팩킹되지 않는 치료적 트랜스진을 보유하는 바이러스를 생성하기 위해, TAV-Δ19k를 E3 영역의 전체 RIDα, RIDβ 및 14.7k 유전자를 결실시키도록 추가로 변형시켰다. 생성된 바이러스는 이후 TAV-Δ19k-ΔE3으로 지칭된다. 변형된 E3 영역의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같으며, 하이픈은 결실 지점을 나타낸다:
인간 IL-12B/p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 푸린 절단 부위 (RAKR)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 인간 IL-12A/p35를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 TAV-Δ19k-ΔE3의 변형된 E1b-19k 영역에 클로닝하였다. 생성된 바이러스는 이후 TAV-hIL-12-푸린으로 지칭된다. E1b-19k 영역에 삽입된 인간 IL-12B/p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 푸린 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 인간 IL-12A/p35를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같으며, 여기서 IL-12B/p40 및 IL-12A/p35 코딩 영역은 대문자로 나타내고, 푸린 절단 부위 코딩 영역은 소문자로 나타내고, SalI 및 XhoI 제한 부위를 포함하는 플랭킹 E1b-19k 서열은 밑줄로 나타내었다:
추가로, 인간 IL-12B/p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 TAV-Δ19k-ΔE3의 변형된 E1b-19k 영역에 클로닝하였고, 인간 IL-12A/p35를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 TAV-Δ19k-ΔE3의 변형된 E3 영역에 클로닝하였다. 생성된 바이러스는 이후 TAV-hIL-12-분리로 지칭된다. E1b-19k 영역에 삽입된 인간 IL-12B/p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같으며, 여기서 SalI 및 XhoI 제한 부위를 포함하는 플랭킹 E1b-19k 서열은 밑줄로 나타내었다:
E3 영역에 삽입된 인간 IL-12A/p35를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같으며, 여기서 플랭킹 아데노바이러스 서열은 밑줄로 나타내었다:
시험한 바이러스에 대한 상세한 내용은 표 2에 제공되어 있다.
표 2
이들 바이러스 뿐만 아니라 대조군 바이러스 (dl309)의 용해물로부터 바이러스 게놈 DNA를 E1A 프로모터를 플랭킹하는 프라이머에 의해, E1b-19k 영역을 플랭킹하는 프라이머에 의해, 및 E3 RIDα, RIDβ 및 14.7k 영역을 플랭킹하는 프라이머에 의해 PCR 증폭시켜, 원하는 요소의 존재를 확인하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 바이러스는 원하는 특징, 즉, 예상된 크기의 PCR 생성물을 가졌다. 두 바이러스 모두에서 IL-12 코딩 영역을 확인을 위해 서열분석하였다.
실시예 3: IL-23 발현 아데노바이러스
이 실시예는 인간 IL-23 서브유닛 IL-23A/p19 및 IL-12B/p40을 발현하는 재조합 아데노바이러스 유형 5 (Ad5)를 기재한다.
TAV-Δ19k-ΔE3 바이러스를 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성하였다. 인간 IL-12B/p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 푸린 절단 부위 (RAKR)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 인간 IL-23A/p19를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 TAV-Δ19k-ΔE3의 변형된 E1b-19k 영역에 클로닝하였다. 생성된 바이러스는 이후 TAV-hIL-23-푸린으로 지칭된다. E1b-19k 영역에 삽입된 인간 IL-12B/p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 푸린 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 인간 IL-23A/p19를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같으며, 여기서 IL-12B/p40 및 IL-23A/p19 코딩 영역은 대문자로 나타내고, 푸린 절단 부위 코딩 영역은 소문자로 나타내고, SalI 및 XhoI 제한 부위를 포함하는 플랭킹 E1b-19k 서열은 밑줄로 나타내었다:
실시예 4: IL-12 발현 아데노바이러스
이 실시예는 IRES를 이용하여 마우스 IL-12 서브유닛 IL-12A 및 IL-12B를 발현하는 재조합 아데노바이러스 유형 5 (Ad5)를 기재한다.
TAV, TAV-Δ19k, 및 TAV-Δ19k-ΔE3 바이러스를 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성하였다. 마우스 IL-12A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 EMCV IRES, 이어서 마우스 IL-12B를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 TAV-Δ19k-ΔE3의 변형된 E1b-19k 영역에 클로닝하였다. 생성된 바이러스는 이후 TAV-mIL-12-IRES로 지칭된다. E1b-19k 영역에 삽입된 마우스 IL-12A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 EMCV IRES, 이어서 마우스 IL-12B를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같으며, 여기서 마우스 IL-12B 및 IL-12A 코딩 영역은 대문자로 나타내고, IRES는 소문자로 나타내고, 플랭킹 제한 부위 및 아데노바이러스 서열은 밑줄로 나타내었다:
TAV-mIL-12-IRES의 세포독성 활성을 시험하였다. ADS-12 (마우스 폐암) 세포를 10의 감염 다중도 (MOI)에서 TAV-mIL12-IRES, TAV-Δ19k 바이러스, 또는 바이러스 없음으로 감염시키고, 생존가능한 세포를 보라색으로 염색하는 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, TAV-mIL12-IRES는 세포독성 활성을 보유하였지만, 대조군 TAV-Δ19k 바이러스에 비해 낮은 수준이었다.
TAV-mIL-12-IRES로부터 IL-12 발현을 시험하였다. ADS-12 세포를 5의 MOI에서 TAV-Δ19k 또는 TAV-mIL-12-IRES로 감염시켰다. 조건화된 배지를 감염 5 일 후에 수집하였고, IL-12 농도를 IL-12 이종이량체에 대해 특이적인 ELISA에 의해 측정하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, TAV-Δ19k로 감염된 세포로부터는 검출가능한 발현이 없는 반면에, TAV-mIL-12-IRES로 감염된 세포는 67 ng/ml의 IL-12 이종이량체를 발현하였다.
TAV-mIL-12-IRES의 바이러스 복제를 시험하였다. ADS-12 세포를 5의 MOI에서 TAV-mIL12-IRES 또는 TAV-Δ19k로 감염시켰다. 배지 및 세포 용해물을 감염 5 일 후에 수확하였고 적정하였다. 감염된 ADS-12 세포당 바이러스의 플라크-형성 단위 (PFU)의 수를 측정함으로써 바이러스 복제를 검정하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, TAV-mIL-12-는 TAV-Δ19k에 비해 ADS-12 세포에서 낮은 수준으로 복제하였다.
실시예 5: IL-12 발현 아데노바이러스
이 실시예는 IRES를 이용하여 인간 IL-12 서브유닛 IL-12A 및 IL-12B를 발현하는 재조합 아데노바이러스 및 푸린 절단 부위를 이용하여 인간 IL-12 서브유닛 IL-12A 및 IL-12B를 발현하는 재조합 아데노바이러스를 기재한다.
TAV, TAV-Δ19k, TAV-Δ19k-ΔE3, 및 TAV-hIL-12-푸린 바이러스를 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성하였다. 추가로, 인간 IL-12A/p35를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 EMCV IRES, 이어서 인간 IL-12B/p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 TAV-Δ19k-ΔE3의 변형된 E1b-19k 영역에 클로닝하였다. 생성된 아데노바이러스는 이후 TAV-hIL-12-IRES로 지칭된다. E1b-19k 영역에 삽입된 인간 IL-12A/p35를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 EMCV IRES, 이어서 인간 IL-12B/p40을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같으며, 여기서 IL-12A/p35 및 IL-12B/p40 코딩 영역은 대문자로 나타내고, IRES는 소문자로 나타내고, SalI 및 XhoI 제한 부위를 포함하는 플랭킹 E1b-19k 서열은 밑줄로 나타내었다:
TAV-hIL-12-푸린 및 TAV-hIL-12-IRES로부터 IL-12 발현을 시험하였다. A549 세포를 5의 MOI에서 TAV-Δ19k, TAV-hIL-12-IRES, TAV-hIL-12-푸린, 또는 바이러스 없음으로 감염시켰다. 조건화된 배지를 감염 4 일 후에 수집하였고, IL-12 농도를 ELISA (바이오레전드 431704)에 의해 측정하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, TAV-hIL-12-푸린 (170 ng/ml)으로부터의 발현은 TAV-hIL-12-IRES (23 ng/ml)로부터에 비해 더 높았다.
TAV-hIL-12-푸린의 세포독성 활성을 시험하였다. A549 세포를 5의 MOI에서 TAV-Δ19k, TAV-hIL12-푸린, 또는 바이러스 없음으로 감염시켰고, 생존가능한 세포를 보라색으로 염색하는 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, TAV-hIL12-푸린은 대조군 TAV-Δ19k 바이러스와 유사한 수준으로 세포독성 활성을 유지하였다.
TAV-hIL-12-푸린 및 TAV-hIL-12-IRES의 바이러스 복제를 시험하였다. A549 세포를 5의 MOI에서 TAV-hIL-12-푸린, TAV-hIL-12-IRES, 또는 TAV-Δ19k로 감염시켰다. 배지 및 세포 용해물을 감염 6 일 후에 수확하였고, 적정하였다. 감염된 A549 세포당 바이러스의 플라크-형성 단위 (PFU)의 수를 측정함으로써 바이러스 복제를 검정하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, TAV-hIL-12-푸린은 TAV-hIL-12-IRES에 비해 더욱 효율적으로 복제하였다.
실시예 6: IL-12, IL-23 및 IL-27 발현 아데노바이러스
이 실시예는 푸린 절단 부위를 이용하여 마우스 IL-12, IL-23 및 IL-27 중 2개의 서브유닛을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 기재한다.
TAV, TAV-Δ19k, 및 TAV-Δ19k-ΔE3 바이러스를 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성하였다. 마우스 IL-12B를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 푸린 절단 부위 (RAKR)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 마우스 IL-12A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 TAV-Δ19k-ΔE3의 변형된 E1b-19k 영역에 클로닝하였다. 생성된 바이러스는 이후 TAV-mIL-12-푸린으로 지칭된다. E1b-19k 영역에 삽입된 마우스 IL-12B를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 푸린 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 마우스 IL-12A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같으며, 여기서 IL-12B 및 IL-12A 코딩 영역은 대문자로 나타내고, 푸린 절단 부위 코딩 영역은 소문자로 나타내고, SalI 및 XhoI 제한 부위를 포함하는 플랭킹 E1b-19k 서열은 밑줄로 나타내었다:
추가로, 마우스 IL-12B를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 푸린 절단 부위 (RAKR)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 마우스 IL-23A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 TAV-Δ19k-ΔE3의 변형된 E1b-19k 영역에 클로닝하였다. 생성된 바이러스는 이후 TAV-mIL-23-푸린으로 지칭된다. E1b-19k 영역에 삽입된 마우스 IL-12B를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 푸린 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 마우스 IL-23A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같으며, 여기서 IL-12B 및 IL-23A 코딩 영역은 대문자로 나타내고, 푸린 절단 부위 코딩 영역은 소문자로 나타내고, SalI 및 XhoI 제한 부위를 포함하는 플랭킹 E1b-19k 서열은 밑줄로 나타내었다:
추가로, 마우스 IL-27B를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 푸린 절단 부위 (RAKR)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 마우스 IL-27A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 TAV-Δ19k-ΔE3의 변형된 E1b-19k 영역에 클로닝하였다. 생성된 바이러스는 이후 TAV-mIL-27-푸린으로 지칭된다. E1b-19k 영역에 삽입된 마우스 IL-27B를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 푸린 절단 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이어서 마우스 IL-27A를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 다음과 같으며, 여기서 IL-27B 및 IL-27A 코딩 영역은 대문자로 나타내고, 푸린 절단 부위 코딩 영역은 소문자로 나타내고, SalI 및 XhoI 제한 부위를 포함하는 플랭킹 E1b-19k 서열은 밑줄로 나타내었다:
TAV-mIL-12-푸린으로부터 IL-12 발현을 시험하였다. A549 세포를 1, 5 또는 10의 MOI에서 TAV-mIL-12-푸린 또는 바이러스 없음으로 감염시켰다. 조건화된 배지를 감염 이후 다양한 시점에서 수집하였고, IL-12 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, IL-12는 용량-의존적 및 시간-의존적 방식으로 발현되었다.
TAV-mIL-23-푸린 및 TAV-mIL-27-푸린으로부터 IL-23 및 IL-27 발현을 시험하였다. A549 세포를 5의 MOI에서 TAV-mIL-23-푸린, TAV-mIL-27-푸린, 또는 바이러스 없음으로 감염시켰다. 조건화된 배지를 감염 4 일 후에 수집하였고, IL-23 및 IL-27 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 두 바이러스 모두 상응하는 이종이량체성 시토카인을 발현하였다.
참조로의 포함
본원에서 언급된 각각의 특허 문헌 및 과학 기사의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 참조로 포함된다.
등가물
본 발명은 그의 개념 또는 필수 특징으로부터 벗어나지 않고 다른 특정한 형태로 실시될 수 있다. 따라서, 상기 실시양태는 본원에 기재된 본 발명을 제한하기 보다는 오히려 모든 측면에서 예시적인 것으로 고려되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 설명에 의해서가 아니라 첨부된 청구범위에 의해 지정되고, 청구범위의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화가 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> EpicentRx, Inc.
<120> MULTIPLE TRANSGENE RECOMBINANT ADENOVIRUS
<130> RDX-031WO
<150> US 62/484,841
<151> 2017-04-12
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 35938
<212> DNA
<213> Adenovirus type 5
<400> 1
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggccgcggg 360
gactttgacc gtttacgtgg agactcgccc aggtgttttt ctcaggtgtt ttccgcgttc 420
cgggtcaaag ttggcgtttt attattatag tcagctgacg tgtagtgtat ttatacccgg 480
tgagttcctc aagaggccac tcttgagtgc cagcgagtag agttttctcc tccgagccgc 540
tccgacaccg ggactgaaaa tgagacatat tatctgccac ggaggtgtta ttaccgaaga 600
aatggccgcc agtcttttgg accagctgat cgaagaggta ctggctgata atcttccacc 660
tcctagccat tttgaaccac ctacccttca cgaactgtat gatttagacg tgacggcccc 720
cgaagatccc aacgaggagg cggtttcgca gatttttccc gactctgtaa tgttggcggt 780
gcaggaaggg attgacttac tcacttttcc gccggcgccc ggttctccgg agccgcctca 840
cctttcccgg cagcccgagc agccggagca gagagccttg ggtccggttt ctatgccaaa 900
ccttgtaccg gaggtgatcg atcttacctg ccacgaggct ggctttccac ccagtgacga 960
cgaggatgaa gagggtgagg agtttgtgtt agattatgtg gagcaccccg ggcacggttg 1020
caggtcttgt cattatcacc ggaggaatac gggggaccca gatattatgt gttcgctttg 1080
ctatatgagg acctgtggca tgtttgtcta cagtaagtga aaattatggg cagtgggtga 1140
tagagtggtg ggtttggtgt ggtaattttt tttttaattt ttacagtttt gtggtttaaa 1200
gaattttgta ttgtgatttt tttaaaaggt cctgtgtctg aacctgagcc tgagcccgag 1260
ccagaaccgg agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa tggcgcctgc tatcctgaga 1320
cgcccgacat cacctgtgtc tagagaatgc aatagtagta cggatagctg tgactccggt 1380
ccttctaaca cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc tgtgccccat taaaccagtt 1440
gccgtgagag ttggtgggcg tcgccaggct gtggaatgta tcgaggactt gcttaacgag 1500
cctgggcaac ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc cataaggtgt aaacctgtga 1560
ttgcgtgtgt ggttaacgcc tttgtttgct gaatgagttg atgtaagttt aataaagggt 1620
gagataatgt ttaacttgca tggcgtgtta aatggggcgg ggcttaaagg gtatataatg 1680
cgccgtgggc taatcttggt tacatctgac ctcatggagg cttgggagtg tttggaagat 1740
ttttctgctg tgcgtaactt gctggaacag agctctaaca gtacctcttg gttttggagg 1800
tttctgtggg gctcatccca ggcaaagtta gtctgcagaa ttaaggagga ttacaagtgg 1860
gaatttgaag agcttttgaa atcctgtggt gagctgtttg attctttgaa tctgggtcac 1920
caggcgcttt tccaagagaa ggtcatcaag actttggatt tttccacacc ggggcgcgct 1980
gcggctgctg ttgctttttt gagttttata aaggataaat ggagcgaaga aacccatctg 2040
agcggggggt acctgctgga ttttctggcc atgcatctgt ggagagcggt tgtgagacac 2100
aagaatcgcc tgctactgtt gtcttccgtc cgcccggcga taataccgac ggaggagcag 2160
cagcagcagc aggaggaagc caggcggcgg cggcaggagc agagcccatg gaacccgaga 2220
gccggcctgg accctcggga atgaatgttg tacaggtggc tgaactgtat ccagaactga 2280
gacgcatttt gacaattaca gaggatgggc aggggctaaa gggggtaaag agggagcggg 2340
gggcttgtga ggctacagag gaggctagga atctagcttt tagcttaatg accagacacc 2400
gtcctgagtg tattactttt caacagatca aggataattg cgctaatgag cttgatctgc 2460
tggcgcagaa gtattccata gagcagctga ccacttactg gctgcagcca ggggatgatt 2520
ttgaggaggc tattagggta tatgcaaagg tggcacttag gccagattgc aagtacaaga 2580
tcagcaaact tgtaaatatc aggaattgtt gctacatttc tgggaacggg gccgaggtgg 2640
agatagatac ggaggatagg gtggccttta gatgtagcat gataaatatg tggccggggg 2700
tgcttggcat ggacggggtg gttattatga atgtaaggtt tactggcccc aattttagcg 2760
gtacggtttt cctggccaat accaacctta tcctacacgg tgtaagcttc tatgggttta 2820
acaatacctg tgtggaagcc tggaccgatg taagggttcg gggctgtgcc ttttactgct 2880
gctggaaggg ggtggtgtgt cgccccaaaa gcagggcttc aattaagaaa tgcctctttg 2940
aaaggtgtac cttgggtatc ctgtctgagg gtaactccag ggtgcgccac aatgtggcct 3000
ccgactgtgg ttgcttcatg ctagtgaaaa gcgtggctgt gattaagcat aacatggtat 3060
gtggcaactg cgaggacagg gcctctcaga tgctgacctg ctcggacggc aactgtcacc 3120
tgctgaagac cattcacgta gccagccact ctcgcaaggc ctggccagtg tttgagcata 3180
acatactgac ccgctgttcc ttgcatttgg gtaacaggag gggggtgttc ctaccttacc 3240
aatgcaattt gagtcacact aagatattgc ttgagcccga gagcatgtcc aaggtgaacc 3300
tgaacggggt gtttgacatg accatgaaga tctggaaggt gctgaggtac gatgagaccc 3360
gcaccaggtg cagaccctgc gagtgtggcg gtaaacatat taggaaccag cctgtgatgc 3420
tggatgtgac cgaggagctg aggcccgatc acttggtgct ggcctgcacc cgcgctgagt 3480
ttggctctag cgatgaagat acagattgag gtactgaaat gtgtgggcgt ggcttaaggg 3540
tgggaaagaa tatataaggt gggggtctta tgtagttttg tatctgtttt gcagcagccg 3600
ccgccgccat gagcaccaac tcgtttgatg gaagcattgt gagctcatat ttgacaacgc 3660
gcatgccccc atgggccggg gtgcgtcaga atgtgatggg ctccagcatt gatggtcgcc 3720
ccgtcctgcc cgcaaactct actaccttga cctacgagac cgtgtctgga acgccgttgg 3780
agactgcagc ctccgccgcc gcttcagccg ctgcagccac cgcccgcggg attgtgactg 3840
actttgcttt cctgagcccg cttgcaagca gtgcagcttc ccgttcatcc gcccgcgatg 3900
acaagttgac ggctcttttg gcacaattgg attctttgac ccgggaactt aatgtcgttt 3960
ctcagcagct gttggatctg cgccagcagg tttctgccct gaaggcttcc tcccctccca 4020
atgcggttta aaacataaat aaaaaaccag actctgtttg gatttggatc aagcaagtgt 4080
cttgctgtct ttatttaggg gttttgcgcg cgcggtaggc ccgggaccag cggtctcggt 4140
cgttgagggt cctgtgtatt ttttccagga cgtggtaaag gtgactctgg atgttcagat 4200
acatgggcat aagcccgtct ctggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctgcg 4260
gggtggtgtt gtagatgatc cagtcgtagc aggagcgctg ggcgtggtgc ctaaaaatgt 4320
ctttcagtag caagctgatt gccaggggca ggcccttggt gtaagtgttt acaaagcggt 4380
taagctggga tgggtgcata cgtggggata tgagatgcat cttggactgt atttttaggt 4440
tggctatgtt cccagccata tccctccggg gattcatgtt gtgcagaacc accagcacag 4500
tgtatccggt gcacttggga aatttgtcat gtagcttaga aggaaatgcg tggaagaact 4560
tggagacgcc cttgtgacct ccaagatttt ccatgcattc gtccataatg atggcaatgg 4620
gcccacgggc ggcggcctgg gcgaagatat ttctgggatc actaacgtca tagttgtgtt 4680
ccaggatgag atcgtcatag gccattttta caaagcgcgg gcggagggtg ccagactgcg 4740
gtataatggt tccatccggc ccaggggcgt agttaccctc acagatttgc atttcccacg 4800
ctttgagttc agatgggggg atcatgtcta cctgcggggc gatgaagaaa acggtttccg 4860
gggtagggga gatcagctgg gaagaaagca ggttcctgag cagctgcgac ttaccgcagc 4920
cggtgggccc gtaaatcaca cctattaccg ggtgcaactg gtagttaaga gagctgcagc 4980
tgccgtcatc cctgagcagg ggggccactt cgttaagcat gtccctgact cgcatgtttt 5040
ccctgaccaa atccgccaga aggcgctcgc cgcccagcga tagcagttct tgcaaggaag 5100
caaagttttt caacggtttg agaccgtccg ccgtaggcat gcttttgagc gtttgaccaa 5160
gcagttccag gcggtcccac agctcggtca cctgctctac ggcatctcga tccagcatat 5220
ctcctcgttt cgcgggttgg ggcggctttc gctgtacggc agtagtcggt gctcgtccag 5280
acgggccagg gtcatgtctt tccacgggcg cagggtcctc gtcagcgtag tctgggtcac 5340
ggtgaagggg tgcgctccgg gctgcgcgct ggccagggtg cgcttgaggc tggtcctgct 5400
ggtgctgaag cgctgccggt cttcgccctg cgcgtcggcc aggtagcatt tgaccatggt 5460
gtcatagtcc agcccctccg cggcgtggcc cttggcgcgc agcttgccct tggaggaggc 5520
gccgcacgag gggcagtgca gacttttgag ggcgtagagc ttgggcgcga gaaataccga 5580
ttccggggag taggcatccg cgccgcaggc cccgcagacg gtctcgcatt ccacgagcca 5640
ggtgagctct ggccgttcgg ggtcaaaaac caggtttccc ccatgctttt tgatgcgttt 5700
cttacctctg gtttccatga gccggtgtcc acgctcggtg acgaaaaggc tgtccgtgtc 5760
cccgtataca gacttgagag gcctgtcctc gagcggtgtt ccgcggtcct cctcgtatag 5820
aaactcggac cactctgaga caaaggctcg cgtccaggcc agcacgaagg aggctaagtg 5880
ggaggggtag cggtcgttgt ccactagggg gtccactcgc tccagggtgt gaagacacat 5940
gtcgccctct tcggcatcaa ggaaggtgat tggtttgtag gtgtaggcca cgtgaccggg 6000
tgttcctgaa ggggggctat aaaagggggt gggggcgcgt tcgtcctcac tctcttccgc 6060
atcgctgtct gcgagggcca gctgttgggg tgagtactcc ctctgaaaag cgggcatgac 6120
ttctgcgcta agattgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatattca cctggcccgc 6180
ggtgatgcct ttgagggtgg ccgcatccat ctggtcagaa aagacaatct ttttgttgtc 6240
aagcttggtg gcaaacgacc cgtagagggc gttggacagc aacttggcga tggagcgcag 6300
ggtttggttt ttgtcgcgat cggcgcgctc cttggccgcg atgtttagct gcacgtattc 6360
gcgcgcaacg caccgccatt cgggaaagac ggtggtgcgc tcgtcgggca ccaggtgcac 6420
gcgccaaccg cggttgtgca gggtgacaag gtcaacgctg gtggctacct ctccgcgtag 6480
gcgctcgttg gtccagcaga ggcggccgcc cttgcgcgag cagaatggcg gtagggggtc 6540
tagctgcgtc tcgtccgggg ggtctgcgtc cacggtaaag accccgggca gcaggcgcgc 6600
gtcgaagtag tctatcttgc atccttgcaa gtctagcgcc tgctgccatg cgcgggcggc 6660
aagcgcgcgc tcgtatgggt tgagtggggg accccatggc atggggtggg tgagcgcgga 6720
ggcgtacatg ccgcaaatgt cgtaaacgta gaggggctct ctgagtattc caagatatgt 6780
agggtagcat cttccaccgc ggatgctggc gcgcacgtaa tcgtatagtt cgtgcgaggg 6840
agcgaggagg tcgggaccga ggttgctacg ggcgggctgc tctgctcgga agactatctg 6900
cctgaagatg gcatgtgagt tggatgatat ggttggacgc tggaagacgt tgaagctggc 6960
gtctgtgaga cctaccgcgt cacgcacgaa ggaggcgtag gagtcgcgca gcttgttgac 7020
cagctcggcg gtgacctgca cgtctagggc gcagtagtcc agggtttcct tgatgatgtc 7080
atacttatcc tgtccctttt ttttccacag ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc 7140
tttccagtac tcttggatcg gaaacccgtc ggcctccgaa cggtaagagc ctagcatgta 7200
gaactggttg acggcctggt aggcgcagca tcccttttct acgggtagcg cgtatgcctg 7260
cgcggccttc cggagcgagg tgtgggtgag cgcaaaggtg tccctgacca tgactttgag 7320
gtactggtat ttgaagtcag tgtcgtcgca tccgccctgc tcccagagca aaaagtccgt 7380
gcgctttttg gaacgcggat ttggcagggc gaaggtgaca tcgttgaaga gtatctttcc 7440
cgcgcgaggc ataaagttgc gtgtgatgcg gaagggtccc ggcacctcgg aacggttgtt 7500
aattacctgg gcggcgagca cgatctcgtc aaagccgttg atgttgtggc ccacaatgta 7560
aagttccaag aagcgcggga tgcccttgat ggaaggcaat tttttaagtt cctcgtaggt 7620
gagctcttca ggggagctga gcccgtgctc tgaaagggcc cagtctgcaa gatgagggtt 7680
ggaagcgacg aatgagctcc acaggtcacg ggccattagc atttgcaggt ggtcgcgaaa 7740
ggtcctaaac tggcgaccta tggccatttt ttctggggtg atgcagtaga aggtaagcgg 7800
gtcttgttcc cagcggtccc atccaaggtt cgcggctagg tctcgcgcgg cagtcactag 7860
aggctcatct ccgccgaact tcatgaccag catgaagggc acgagctgct tcccaaaggc 7920
ccccatccaa gtataggtct ctacatcgta ggtgacaaag agacgctcgg tgcgaggatg 7980
cgagccgatc gggaagaact ggatctcccg ccaccaattg gaggagtggc tattgatgtg 8040
gtgaaagtag aagtccctgc gacgggccga acactcgtgc tggcttttgt aaaaacgtgc 8100
gcagtactgg cagcggtgca cgggctgtac atcctgcacg aggttgacct gacgaccgcg 8160
cacaaggaag cagagtggga atttgagccc ctcgcctggc gggtttggct ggtggtcttc 8220
tacttcggct gcttgtcctt gaccgtctgg ctgctcgagg ggagttacgg tggatcggac 8280
caccacgccg cgcgagccca aagtccagat gtccgcgcgc ggcggtcgga gcttgatgac 8340
aacatcgcgc agatgggagc tgtccatggt ctggagctcc cgcggcgtca ggtcaggcgg 8400
gagctcctgc aggtttacct cgcatagacg ggtcagggcg cgggctagat ccaggtgata 8460
cctaatttcc aggggctggt tggtggcggc gtcgatggct tgcaagaggc cgcatccccg 8520
cggcgcgact acggtaccgc gcggcgggcg gtgggccgcg ggggtgtcct tggatgatgc 8580
atctaaaagc ggtgacgcgg gcgagccccc ggaggtaggg ggggctccgg acccgccggg 8640
agagggggca ggggcacgtc ggcgccgcgc gcgggcagga gctggtgctg cgcgcgtagg 8700
ttgctggcga acgcgacgac gcggcggttg atctcctgaa tctggcgcct ctgcgtgaag 8760
acgacgggcc cggtgagctt gagcctgaaa gagagttcga cagaatcaat ttcggtgtcg 8820
ttgacggcgg cctggcgcaa aatctcctgc acgtctcctg agttgtcttg ataggcgatc 8880
tcggccatga actgctcgat ctcttcctcc tggagatctc cgcgtccggc tcgctccacg 8940
gtggcggcga ggtcgttgga aatgcgggcc atgagctgcg agaaggcgtt gaggcctccc 9000
tcgttccaga cgcggctgta gaccacgccc ccttcggcat cgcgggcgcg catgaccacc 9060
tgcgcgagat tgagctccac gtgccgggcg aagacggcgt agtttcgcag gcgctgaaag 9120
aggtagttga gggtggtggc ggtgtgttct gccacgaaga agtacataac ccagcgtcgc 9180
aacgtggatt cgttgatatc ccccaaggcc tcaaggcgct ccatggcctc gtagaagtcc 9240
acggcgaagt tgaaaaactg ggagttgcgc gccgacacgg ttaactcctc ctccagaaga 9300
cggatgagct cggcgacagt gtcgcgcacc tcgcgctcaa aggctacagg ggcctcttct 9360
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acctgcgtga gggtagactg gaagtcatcc atgtccacaa agcggtggta tgcgcccgtg 10200
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ttttcccaga tgcatccggt gctgcggcag atgcgccccc ctcctcagca gcggcaagag 11100
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atcttgaagt cgcagttggg gcctccgccc tgcgcgcgcg agttgcgata cacagggttg 22680
cagcactgga acactatcag cgccgggtgg tgcacgctgg ccagcacgct cttgtcggag 22740
atcagatccg cgtccaggtc ctccgcgttg ctcagggcga acggagtcaa ctttggtagc 22800
tgccttccca aaaagggcgc gtgcccaggc tttgagttgc actcgcaccg tagtggcatc 22860
aaaaggtgac cgtgcccggt ctgggcgtta ggatacagcg cctgcataaa agccttgatc 22920
tgcttaaaag ccacctgagc ctttgcgcct tcagagaaga acatgccgca agacttgccg 22980
gaaaactgat tggccggaca ggccgcgtcg tgcacgcagc accttgcgtc ggtgttggag 23040
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ttcatcaccg taatttcact ttccgcttcg ctgggctctt cctcttcctc ttgcgtccgc 23580
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cgccatcctg taaacgccac cgtcttcacc cgcccaagca aaccaaggcg aaccttacct 28260
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ctacgagaga acctctccga gctcagctac tccatcagaa aaaacaccac cctccttacc 28380
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caaaaagtta gcattataat tagaatagga tttaaacccc ccggtcattt cctgctcaat 29340
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ctgcctaggc aaaatagcac cctcccgctc cagaacaaca tacagcgctt ccacagcggc 35520
agccataaca gtcagcctta ccagtaaaaa agaaaaccta ttaaaaaaac accactcgac 35580
acggcaccag ctcaatcagt cacagtgtaa aaaagggcca agtgcagagc gagtatatat 35640
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tttcccacgt tacgtaactt cccattttaa gaaaactaca attcccaaca catacaagtt 35820
actccgccct aaaacctacg tcacccgccc cgttcccacg ccccgcgcca cgtcacaaac 35880
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<210> 2
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<212> DNA
<213> Adenovirus type 5
<400> 2
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<210> 3
<211> 8
<212> DNA
<213> Adenovirus type 5
<400> 3
tcaccagg 8
<210> 4
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence resulting from TAV-255 deletion
<400> 4
ggtgttttgg 10
<210> 5
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence resulting from exemplary E1A promoter TATA box deletion
<400> 5
ctaggactg 9
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Furin cleavage site
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be Lys or Arg
<400> 6
Arg Xaa Xaa Arg
1
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Furin cleavage site
<400> 7
Arg Ala Lys Arg
1
<210> 8
<211> 1622
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-12B/p40 - furin - IL-12A/p35 in modified E1b-19k region
<400> 8
atctgacctc gtcgacatgt gtcaccagca gttggtcatc tcttggtttt ccctggtttt 60
tctggcatct cccctcgtgg ccatatggga actgaagaaa gatgtttatg tcgtagaatt 120
ggattggtat ccggatgccc ctggagaaat ggtggtcctc acctgtgaca cccctgaaga 180
agatggtatc acctggacct tggaccagag cagtgaggtc ttaggctctg gcaaaaccct 240
gaccatccaa gtcaaagagt ttggagatgc tggccagtac acctgtcaca aaggaggcga 300
ggttctaagc cattcgctcc tgctgcttca caaaaaggaa gatggaattt ggtccactga 360
tattttaaag gaccagaaag aacccaaaaa taagaccttt ctaagatgcg aggccaagaa 420
ttattctgga cgtttcacct gctggtggct gacgacaatc agtactgatt tgacattcag 480
tgtcaaaagc agcagaggct cttctgaccc ccaaggggtg acgtgcggag ctgctacact 540
ctctgcagag agagtcagag gggacaacaa ggagtatgag tactcagtgg agtgccagga 600
ggacagtgcc tgcccagctg ctgaggagag tctgcccatt gaggtcatgg tggatgccgt 660
tcacaagctc aagtatgaaa actacaccag cagcttcttc atcagggaca tcatcaaacc 720
tgacccaccc aagaacttgc agctgaagcc attaaagaat tctcggcagg tggaggtcag 780
ctgggagtac cctgacacct ggagtactcc acattcctac ttctccctga cattctgcgt 840
tcaggtccag ggcaagagca agagagaaaa gaaagataga gtcttcacgg acaagacctc 900
agccacggtc atctgccgca aaaatgccag cattagcgtg cgggcccagg accgctacta 960
tagctcatct tggagcgaat gggcatctgt gccctgcagt cgtgctaagc gaagaaacct 1020
ccccgtggcc actccagacc caggaatgtt cccatgcctt caccactccc aaaacctgct 1080
gagggccgtc agcaacatgc tccagaaggc cagacaaact ctagaatttt acccttgcac 1140
ttctgaagag attgatcatg aagatatcac aaaagataaa accagcacag tggaggcctg 1200
tttaccattg gaattaacca agaatgagag ttgcctaaat tccagagaga cctctttcat 1260
aactaatggg agttgcctgg cctccagaaa gacctctttt atgatggccc tgtgccttag 1320
tagtatttat gaagacttga agatgtacca ggtggagttc aagaccatga atgcaaagct 1380
tctgatggat cctaagaggc agatctttct agatcaaaac atgctggcag ttattgatga 1440
gctgatgcag gccctgaatt tcaacagtga gactgtgcca caaaaatcct cccttgaaga 1500
accggatttt tataaaacta aaatcaagct ctgcatactt cttcatgctt tcagaattcg 1560
ggcagtgact attgatagag tgatgagcta tctgaatgct tcctaactcg agtcaccagg 1620
cg 1622
<210> 9
<211> 1598
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-12B/p40 - furin - IL-23A/p19 in modified E1b-19k region
<400> 9
atctgacctc gtcgacatgt gtcaccagca gttggtcatc tcttggtttt ccctggtttt 60
tctggcatct cccctcgtgg ccatatggga actgaagaaa gatgtttatg tcgtagaatt 120
ggattggtat ccggatgccc ctggagaaat ggtggtcctc acctgtgaca cccctgaaga 180
agatggtatc acctggacct tggaccagag cagtgaggtc ttaggctctg gcaaaaccct 240
gaccatccaa gtcaaagagt ttggagatgc tggccagtac acctgtcaca aaggaggcga 300
ggttctaagc cattcgctcc tgctgcttca caaaaaggaa gatggaattt ggtccactga 360
tattttaaag gaccagaaag aacccaaaaa taagaccttt ctaagatgcg aggccaagaa 420
ttattctgga cgtttcacct gctggtggct gacgacaatc agtactgatt tgacattcag 480
tgtcaaaagc agcagaggct cttctgaccc ccaaggggtg acgtgcggag ctgctacact 540
ctctgcagag agagtcagag gggacaacaa ggagtatgag tactcagtgg agtgccagga 600
ggacagtgcc tgcccagctg ctgaggagag tctgcccatt gaggtcatgg tggatgccgt 660
tcacaagctc aagtatgaaa actacaccag cagcttcttc atcagggaca tcatcaaacc 720
tgacccaccc aagaacttgc agctgaagcc attaaagaat tctcggcagg tggaggtcag 780
ctgggagtac cctgacacct ggagtactcc acattcctac ttctccctga cattctgcgt 840
tcaggtccag ggcaagagca agagagaaaa gaaagataga gtcttcacgg acaagacctc 900
agccacggtc atctgccgca aaaatgccag cattagcgtg cgggcccagg accgctacta 960
tagctcatct tggagcgaat gggcatctgt gccctgcagt cgtgctaagc gaatgctggg 1020
gagcagagct gtaatgctgc tgttgctgct gccctggaca gctcagggca gagctgtgcc 1080
tgggggcagc agccctgcct ggactcagtg ccagcagctt tcacagaagc tctgcacact 1140
ggcctggagt gcacatccac tagtgggaca catggatcta agagaagagg gagatgaaga 1200
gactacaaat gatgttcccc atatccagtg tggagatggc tgtgaccccc aaggactcag 1260
ggacaacagt cagttctgct tgcaaaggat ccaccagggt ctgatttttt atgagaagct 1320
gctaggatcg gatattttca caggggagcc ttctctgctc cctgatagcc ctgtgggcca 1380
gcttcatgcc tccctactgg gcctcagcca actcctgcag cctgagggtc accactggga 1440
gactcagcag attccaagcc tcagtcccag ccagccatgg cagcgtctcc ttctccgctt 1500
caaaatcctt cgcagcctcc aggcctttgt ggctgtagcc gcccgggtct ttgcccatgg 1560
agcagcaacc ctgagtccct aactcgagtc accaggcg 1598
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exempalry modified E1b-19k region
<400> 10
atcttggtta catctgacct cgtcgagtca ccaggcgctt ttccaa 46
<210> 11
<211> 2340
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-12B/p40 - IRES- IL-12A/p35 in modified E1b-19k region
<400> 11
atctgacctc gtcgacatgt ggccccctgg gtcagcctcc cagccaccgc cctcacctgc 60
cgcggccaca ggtctgcatc cagcggctcg ccctgtgtcc ctgcagtgcc ggctcagcat 120
gtgtccagcg cgcagcctcc tccttgtggc taccctggtc ctcctggacc acctcagttt 180
ggccagaaac ctccccgtgg ccactccaga cccaggaatg ttcccatgcc ttcaccactc 240
ccaaaacctg ctgagggccg tcagcaacat gctccagaag gccagacaaa ctctagaatt 300
ttacccttgc acttctgaag agattgatca tgaagatatc acaaaagata aaaccagcac 360
agtggaggcc tgtttaccat tggaattaac caagaatgag agttgcctaa attccagaga 420
gacctctttc ataactaatg ggagttgcct ggcctccaga aagacctctt ttatgatggc 480
cctgtgcctt agtagtattt atgaagactt gaagatgtac caggtggagt tcaagaccat 540
gaatgcaaag cttctgatgg atcctaagag gcagatcttt ctagatcaaa acatgctggc 600
agttattgat gagctgatgc aggccctgaa tttcaacagt gagactgtgc cacaaaaatc 660
ctcccttgaa gaaccggatt tttataaaac taaaatcaag ctctgcatac ttcttcatgc 720
tttcagaatt cgggcagtga ctattgatag agtgatgagc tatctgaatg cttcctaata 780
ataacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg tgcgtttgtc tatatgttat 840
tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg gaaacctggc cctgtcttct 900
tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg aatgcaaggt ctgttgaatg 960
tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca aacaacgtct gtagcgaccc 1020
tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct ctgcggccaa aagccacgtg 1080
tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca cgttgtgagt tggatagttg 1140
tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa ggggctgaag gatgcccaga 1200
aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg cacatgcttt acatgtgttt 1260
agtcgaggtt aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa 1320
aacacgatga taatatgtgt caccagcagt tggtcatctc ttggttttcc ctggtttttc 1380
tggcatctcc cctcgtggcc atatgggaac tgaagaaaga tgtttatgtc gtagaattgg 1440
attggtatcc ggatgcccct ggagaaatgg tggtcctcac ctgtgacacc cctgaagaag 1500
atggtatcac ctggaccttg gaccagagca gtgaggtctt aggctctggc aaaaccctga 1560
ccatccaagt caaagagttt ggagatgctg gccagtacac ctgtcacaaa ggaggcgagg 1620
ttctaagcca ttcgctcctg ctgcttcaca aaaaggaaga tggaatttgg tccactgata 1680
ttttaaagga ccagaaagaa cccaaaaata agacctttct aagatgcgag gccaagaatt 1740
attctggacg tttcacctgc tggtggctga cgacaatcag tactgatttg acattcagtg 1800
tcaaaagcag cagaggctct tctgaccccc aaggggtgac gtgcggagct gctacactct 1860
ctgcagagag agtcagaggg gacaacaagg agtatgagta ctcagtggag tgccaggagg 1920
acagtgcctg cccagctgct gaggagagtc tgcccattga ggtcatggtg gatgccgttc 1980
acaagctcaa gtatgaaaac tacaccagca gcttcttcat cagggacatc atcaaacctg 2040
acccacccaa gaacttgcag ctgaagccat taaagaattc tcggcaggtg gaggtcagct 2100
gggagtaccc tgacacctgg agtactccac attcctactt ctccctgaca ttctgcgttc 2160
aggtccaggg caagagcaag agagaaaaga aagatagagt cttcacggac aagacctcag 2220
ccacggtcat ctgccgcaaa aatgccagca ttagcgtgcg ggcccaggac cgctactata 2280
gctcatcttg gagcgaatgg gcatctgtgc cctgcagtta gtaactcgag tcaccaggcg 2340
<210> 12
<211> 1667
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-12B/p40 - 2A - IL-12A/p35 in modified E1b-19k region
<400> 12
atctgacctc gtcgacatgt gtcaccagca gttggtcatc tcttggtttt ccctggtttt 60
tctggcatct cccctcgtgg ccatatggga actgaagaaa gatgtttatg tcgtagaatt 120
ggattggtat ccggatgccc ctggagaaat ggtggtcctc acctgtgaca cccctgaaga 180
agatggtatc acctggacct tggaccagag cagtgaggtc ttaggctctg gcaaaaccct 240
gaccatccaa gtcaaagagt ttggagatgc tggccagtac acctgtcaca aaggaggcga 300
ggttctaagc cattcgctcc tgctgcttca caaaaaggaa gatggaattt ggtccactga 360
tattttaaag gaccagaaag aacccaaaaa taagaccttt ctaagatgcg aggccaagaa 420
ttattctgga cgtttcacct gctggtggct gacgacaatc agtactgatt tgacattcag 480
tgtcaaaagc agcagaggct cttctgaccc ccaaggggtg acgtgcggag ctgctacact 540
ctctgcagag agagtcagag gggacaacaa ggagtatgag tactcagtgg agtgccagga 600
ggacagtgcc tgcccagctg ctgaggagag tctgcccatt gaggtcatgg tggatgccgt 660
tcacaagctc aagtatgaaa actacaccag cagcttcttc atcagggaca tcatcaaacc 720
tgacccaccc aagaacttgc agctgaagcc attaaagaat tctcggcagg tggaggtcag 780
ctgggagtac cctgacacct ggagtactcc acattcctac ttctccctga cattctgcgt 840
tcaggtccag ggcaagagca agagagaaaa gaaagataga gtcttcacgg acaagacctc 900
agccacggtc atctgccgca aaaatgccag cattagcgtg cgggcccagg accgctacta 960
tagctcatct tggagcgaat gggcatctgt gccctgcagt cttctgaact tcgacctcct 1020
caagttggcg ggagacgttg agtccaaccc cgggcccaga aacctccccg tggccactcc 1080
agacccagga atgttcccat gccttcacca ctcccaaaac ctgctgaggg ccgtcagcaa 1140
catgctccag aaggccagac aaactctaga attttaccct tgcacttctg aagagattga 1200
tcatgaagat atcacaaaag ataaaaccag cacagtggag gcctgtttac cattggaatt 1260
aaccaagaat gagagttgcc taaattccag agagacctct ttcataacta atgggagttg 1320
cctggcctcc agaaagacct cttttatgat ggccctgtgc cttagtagta tttatgaaga 1380
cttgaagatg taccaggtgg agttcaagac catgaatgca aagcttctga tggatcctaa 1440
gaggcagatc tttctagatc aaaacatgct ggcagttatt gatgagctga tgcaggccct 1500
gaatttcaac agtgagactg tgccacaaaa atcctccctt gaagaaccgg atttttataa 1560
aactaaaatc aagctctgca tacttcttca tgctttcaga attcgggcag tgactattga 1620
tagagtgatg agctatctga atgcttccta actcgagtca ccaggcg 1667
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exempalry modified E3 region
<400> 13
tcttttctct tacagtatga taataaaaaa aaataataaa gcatcactta 50
<210> 14
<211> 1022
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-12B/p40 in modified E1b-19k region
<400> 14
atctgacctc gtcgacatgt gtcaccagca gttggtcatc tcttggtttt ccctggtttt 60
tctggcatct cccctcgtgg ccatatggga actgaagaaa gatgtttatg tcgtagaatt 120
ggattggtat ccggatgccc ctggagaaat ggtggtcctc acctgtgaca cccctgaaga 180
agatggtatc acctggacct tggaccagag cagtgaggtc ttaggctctg gcaaaaccct 240
gaccatccaa gtcaaagagt ttggagatgc tggccagtac acctgtcaca aaggaggcga 300
ggttctaagc cattcgctcc tgctgcttca caaaaaggaa gatggaattt ggtccactga 360
tattttaaag gaccagaaag aacccaaaaa taagaccttt ctaagatgcg aggccaagaa 420
ttattctgga cgtttcacct gctggtggct gacgacaatc agtactgatt tgacattcag 480
tgtcaaaagc agcagaggct cttctgaccc ccaaggggtg acgtgcggag ctgctacact 540
ctctgcagag agagtcagag gggacaacaa ggagtatgag tactcagtgg agtgccagga 600
ggacagtgcc tgcccagctg ctgaggagag tctgcccatt gaggtcatgg tggatgccgt 660
tcacaagctc aagtatgaaa actacaccag cagcttcttc atcagggaca tcatcaaacc 720
tgacccaccc aagaacttgc agctgaagcc attaaagaat tctcggcagg tggaggtcag 780
ctgggagtac cctgacacct ggagtactcc acattcctac ttctccctga cattctgcgt 840
tcaggtccag ggcaagagca agagagaaaa gaaagataga gtcttcacgg acaagacctc 900
agccacggtc atctgccgca aaaatgccag cattagcgtg cgggcccagg accgctacta 960
tagctcatct tggagcgaat gggcatctgt gccctgcagt tagtaactcg agtcaccagg 1020
cg 1022
<210> 15
<211> 834
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-12A/p35 in modified E3 region
<400> 15
atgttctttt ctcttacagt atgattaaat gagacatgtg gccccctggg tctgcctccc 60
aaccaccgcc ctcacctgcc gcggccactg gtctgcatcc tgcggctcgc cctgtgtccc 120
tgcaatgccg gctctccatg tgtcctgcgc gctccctcct ccttgtggct accctggtcc 180
tcctggacca cctctctttg gcccgaaacc tccccgtggc cactcctgac cctggaatgt 240
tcccatgcct tcaccactcc caaaacctgc tgcgggccgt ctccaacatg ctccaaaaag 300
cccgacaaac tcttgaattt tacccttgca cttctgaaga aattgatcat gaagatatca 360
caaaagataa aacctccact gtggaagcct gtttaccatt ggaattaacc aaaaatgaat 420
cttgcctaaa ttcccgagaa acctctttca taactaatgg gtcttgcctg gcctcccgaa 480
aaacctcttt tatgatggcc ctgtgccttt cttctattta tgaagacttg aaaatgtacc 540
aagtggaatt caaaaccatg aatgcaaaac ttctgatgga tcctaaacgg caaatctttc 600
ttgatcaaaa catgctggct gttattgatg aactgatgca agccctgaat ttcaactctg 660
aaactgtgcc acaaaaatcc tcccttgaag aaccggattt ttataaaact aaaatcaaac 720
tctgcatact tcttcatgct ttccgaattc gggctgtgac tattgatcga gtgatgtcct 780
atctgaatgc ttcctaatga ggtctcaaag atcttattcc ctttaactaa taaa 834
<210> 16
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence resulting from exemplary E1A promoter TATA box deletion
<400> 16
agtgcccg 8
<210> 17
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence resulting from exemplary E1A promoter TATA box deletion
<400> 17
tattcccg 8
<210> 18
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence resulting from exemplary E1A promoter CAAT box deletion
<400> 18
ttccgtggcg 10
<210> 19
<211> 8
<212> DNA
<213> Adenovirus type 5
<400> 19
cagtatga 8
<210> 20
<211> 10
<212> DNA
<213> Adenovirus type 5
<400> 20
taataaaaaa 10
<210> 21
<211> 8
<212> DNA
<213> Adenovirus type 5
<400> 21
tgccttaa 8
<210> 22
<211> 11
<212> DNA
<213> Adenovirus type 5
<400> 22
taaaaaaaaa t 11
<210> 23
<211> 2242
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse IL-12A - IRES - mouse IL-12B in modified E1b-19k region
<400> 23
ctgacctcgt cgacatgtgt caatcacgct acctcctctt tttggccacc cttgccctcc 60
taaaccacct cagtttggcc agagtgatcc ctgtgtccgg ccctgccaga tgcctgagcc 120
agagcagaaa cctgctgaaa accaccgacg acatggtgaa aaccgccaga gagaagctga 180
agcactacag ctgcacagcc gaggacatcg accacgagga catcacccgg gaccagacct 240
ccaccctgaa aacctgcctg cccctggaac tgcataagaa cgagagctgc ctggccaccc 300
gcgagacaag cagcaccacc agaggcagct gtctgccccc ccagaaaacc agcctgatga 360
tgaccctgtg cctgggcagc atctacgagg acctgaagat gtaccagacc gagttccagg 420
ccatcaacgc cgccctgcag aaccacaacc accagcagat catcctggac aagggcatgc 480
tggtggccat cgacgagctg atgcagagcc tgaaccacaa cggcgaaacc ctgagacaga 540
aaccccccgt gggcgaggcc gacccctaca gagtgaagat gaagctgtgc atcctgctgc 600
acgccttcag caccagagtg gtgacaatca acagagtgat gggctacctg agcagcgcct 660
gataacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta 720
ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc 780
ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat 840
gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc 900
ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt 960
gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt 1020
gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag 1080
aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt 1140
tagtcgaggt taaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg ggacgtggtt ttcctttgaa 1200
aaacacgatg ataatatgtg cccccagaag ctgaccatca gttggttcgc catcgtgctg 1260
ctggtgtccc ccctgatggc catgtgggag ctggaaaagg acgtgtacgt ggtggaagtg 1320
gactggaccc ccgacgcccc tggcgagaca gtgaacctga cctgcgacac ccccgaagag 1380
gacgacatca cctggaccag cgaccagaga cacggcgtga tcggcagcgg caagaccctg 1440
acaatcaccg tgaaagagtt tctggacgcc ggccagtaca cctgtcacaa gggcggcgag 1500
acactgagcc actcccatct gctgctgcac aagaaagaga acggcatctg gtccaccgag 1560
atcctgaaga acttcaagaa caagaccttc ctgaagtgcg aggcccccaa ctacagcggc 1620
agattcacct gtagctggct ggtgcagaga aacatggacc tgaagttcaa catcaagagc 1680
agcagcagct cccccgacag cagagccgtg acctgtggca tggccagcct gagcgccgag 1740
aaagtgaccc tggaccagag agactacgag aagtacagcg tgtcctgcca ggaagatgtc 1800
acctgcccca ccgccgagga aaccctgcct atcgagctgg ccctggaagc cagacagcag 1860
aacaaatacg agaactactc taccagcttc ttcatccggg acatcatcaa gcccgacccc 1920
cccaagaacc tgcagatgaa gcccctgaag aacagccagg tggaagtgtc ctgggagtac 1980
cccgacagct ggtccacccc ccacagctac ttcagcctga agttcttcgt gcggatccag 2040
cgcaagaaag aaaagatgaa ggaaaccgag gaaggctgca accagaaagg cgctttcctg 2100
gtggaaaaga ccagcaccga ggtgcagtgc aagggcggca acgtgtgcgt gcaggcccag 2160
gaccggtact acaacagcag ctgcagcaag tgggcctgcg tgccctgtag agtgcgctct 2220
tgactcgagt caccaggcgc tt 2242
<210> 24
<211> 1631
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse IL-12B - furin - mouse IL-12A in modified E1b-19k region
<400> 24
atctgacctc gtcgacatgt gtcctcagaa gctaaccatc tcctggtttg ccatcgtttt 60
gctggtgtct ccactcatgg ccatgtggga gctggagaaa gacgtttatg ttgtagaggt 120
ggactggact cccgatgccc ctggagaaac agtgaacctc acctgtgaca cgcctgaaga 180
agatgacatc acctggacct cagaccagag acatggagtc ataggctctg gaaagaccct 240
gaccatcact gtcaaagagt ttctagatgc tggccagtac acctgccaca aaggaggcga 300
gactctgagc cactcacatc tgctgctcca caagaaggaa aatggaattt ggtccactga 360
aattttaaaa aatttcaaaa acaagacttt cctgaagtgt gaagcaccaa attactccgg 420
acggttcacg tgctcatggc tggtgcaaag aaacatggac ttgaagttca acatcaagag 480
cagtagcagt tcccctgact ctcgggcagt gacatgtgga atggcgtctc tgtctgcaga 540
gaaggtcaca ctggaccaaa gggactatga gaagtattca gtgtcctgcc aggaggatgt 600
cacctgccca actgccgagg agaccctgcc cattgaactg gcgttggaag cacggcagca 660
gaataaatat gagaactaca gcaccagctt cttcatcagg gacatcatca aaccagaccc 720
gcccaagaac ttgcagatga agcctttgaa gaactcacag gtggaggtca gctgggagta 780
ccctgactcc tggagcactc cccattccta cttctccctc aagttctttg ttcgaatcca 840
gcgcaagaaa gaaaagatga aggagacaga ggaggggtgt aaccagaaag gtgcgttcct 900
cgtagagaag acatctaccg aagtccaatg caaaggcggg aatgtctgcg tgcaagctca 960
ggatcgctat tacaattcct catgcagcaa gtgggcatgt gttccctgca gggtccgatc 1020
ccgtgctaag cgaagggtca ttccagtctc tggacctgcc aggtgtctta gccagtcccg 1080
aaacctgctg aagaccacag atgacatggt gaagacggcc agagaaaaac tgaaacatta 1140
ttcctgcact gctgaagaca tcgatcatga agacatcaca cgggaccaaa ccagcacatt 1200
gaagacctgt ttaccactgg aactacacaa gaacgagagt tgcctggcta ctagagagac 1260
ttcttccaca acaagaggga gctgcctgcc cccacagaag acgtctttga tgatgaccct 1320
gtgccttggt agcatctatg aggacttgaa gatgtaccag acagagttcc aggccatcaa 1380
cgcagcactt cagaatcaca accatcagca gatcattcta gacaagggca tgctggtggc 1440
catcgatgag ctgatgcagt ctctgaatca taatggcgag actctgcgcc agaaacctcc 1500
tgtgggagaa gcagaccctt acagagtgaa aatgaagctc tgcatcctgc ttcacgcctt 1560
cagcacccgc gtcgtgacca tcaacagggt gatgggctat ctgagctccg cctgactcga 1620
gtcaccaggc g 1631
<210> 25
<211> 1577
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse IL-12B - furin - mouse IL-23A in modified E1b-19k region
<400> 25
atctgacctc gtcgacatgt gtcctcagaa gctaaccatc tcctggtttg ccatcgtttt 60
gctggtgtct ccactcatgg ccatgtggga gctggagaaa gacgtttatg ttgtagaggt 120
ggactggact cccgatgccc ctggagaaac agtgaacctc acctgtgaca cgcctgaaga 180
agatgacatc acctggacct cagaccagag acatggagtc ataggctctg gaaagaccct 240
gaccatcact gtcaaagagt ttctagatgc tggccagtac acctgccaca aaggaggcga 300
gactctgagc cactcacatc tgctgctcca caagaaggaa aatggaattt ggtccactga 360
aattttaaaa aatttcaaaa acaagacttt cctgaagtgt gaagcaccaa attactccgg 420
acggttcacg tgctcatggc tggtgcaaag aaacatggac ttgaagttca acatcaagag 480
cagtagcagt tcccctgact ctcgggcagt gacatgtgga atggcgtctc tgtctgcaga 540
gaaggtcaca ctggaccaaa gggactatga gaagtattca gtgtcctgcc aggaggatgt 600
cacctgccca actgccgagg agaccctgcc cattgaactg gcgttggaag cacggcagca 660
gaataaatat gagaactaca gcaccagctt cttcatcagg gacatcatca aaccagaccc 720
gcccaagaac ttgcagatga agcctttgaa gaactcacag gtggaggtca gctgggagta 780
ccctgactcc tggagcactc cccattccta cttctccctc aagttctttg ttcgaatcca 840
gcgcaagaaa gaaaagatga aggagacaga ggaggggtgt aaccagaaag gtgcgttcct 900
cgtagagaag acatctaccg aagtccaatg caaaggcggg aatgtctgcg tgcaagctca 960
ggatcgctat tacaattcct catgcagcaa gtgggcatgt gttccctgca gggtccgatc 1020
ccgtgctaag cgagtgccta ggagtagcag tcctgactgg gctcagtgcc agcagctctc 1080
tcggaatctc tgcatgctag cctggaacgc acatgcacca gcgggacata tgaatctact 1140
aagagaagaa gaggatgaag agactaaaaa taatgtgccc cgtatccagt gtgaagatgg 1200
ttgtgaccca caaggactca aggacaacag ccagttctgc ttgcaaagga tccgccaagg 1260
tctggctttt tataagcacc tgcttgactc tgacatcttc aaaggggagc ctgctctact 1320
ccctgatagc cccatggagc aacttcacac ctccctacta ggactcagcc aactcctcca 1380
gccagaggat cacccccggg agacccaaca gatgcccagc ctgagttcta gtcagcagtg 1440
gcagcgcccc cttctccgtt ccaagatcct tcgaagcctc caggcctttt tggccatagc 1500
tgcccgggtc tttgcccacg gagcagcaac tctgactgag cccttagtgc caacagctta 1560
actcgagtca ccaggcg 1577
<210> 26
<211> 1349
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse IL-27B - furin - mouse IL-27A in modified E1b-19k region
<400> 26
atctgacctc gtcgacatgt ccaagctgct cttcctgtca cttgccctct gggccagccg 60
ctcccctggt tacactgaaa cagctctcgt ggctctaagc cagcccagag tgcaatgcca 120
tgcttctcgg tatcccgtgg ccgtggactg ctcctggact cctctccagg ctcccaactc 180
caccagatcc acgtccttca ttgccactta caggctcggt gtggccaccc agcagcagag 240
ccagccctgc ctacaacgga gcccccaggc ctcccgatgc accatccccg acgtgcacct 300
gttctccacg gtgccctaca tgctaaatgt cactgcagtg cacccaggcg gcgccagcag 360
cagcctccta gcctttgtgg ctgagcgaat catcaagccg gaccctccgg aaggcgtgcg 420
cctgcgcaca gcgggacagc gcctgcaggt gctctggcat ccccctgctt cctggccctt 480
cccggacatc ttctctctca agtaccgact ccgctaccgg cgccgaggag cctctcactt 540
ccgccaggtg ggacccattg aagccacgac tttcaccctc aggaactcga aaccccatgc 600
caagtattgc atccaggtgt cagctcagga cctcacagat tatgggaaac caagtgactg 660
gagcctccct gggcaagtag aaagtgcacc ccataagccc cgtgctaagc gattcccaac 720
agaccccctg agccttcaag agctgcgcag ggaattcaca gtcagcctgt accttgccag 780
gaagctgctc tctgaggttc agggctatgt ccacagcttt gctgaatctc gattgccagg 840
agtgaacctg gacctcctgc ccctgggata ccatcttccc aatgtttccc tgactttcca 900
ggcatggcat cacctctctg actctgagag actctgcttc ctcgctacca cacttcggcc 960
cttccctgcc atgctgggag ggctggggac ccaggggacc tggaccagct cagagaggga 1020
gcagctgtgg gccatgaggc tggatctccg ggacctgcac aggcacctcc gctttcaggt 1080
gctggctgca ggattcaaat gttcaaagga agaggaagac aaggaggaag aggaagagga 1140
ggaagaagaa gaaaagaagc tgcccctagg ggctctgggt ggccccaatc aggtgtcatc 1200
ccaagtgtcc tggccccagc tgctctatac ctaccagctc cttcactccc tggagcttgt 1260
cctgtctcgg gctgttcggg acctgctgct gctgtccctg cccaggcgcc caggctcagc 1320
ctgggattcc taactcgagt caccaggcg 1349
Claims (102)
- 제1 치료적 트랜스진을 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열, 제2 치료적 트랜스진을 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열, 및 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 사이에 배치된 절단 부위를 코딩하는 제3 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제1항에 있어서, 5'에서 3' 배향으로 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 연속해서 5'에서 3' 배향으로 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열이, 임의적으로 제1 뉴클레오티드 서열의 제1 뉴클레오티드에 대해 5'에 위치하는, 단일 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열이 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현되는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유형 5 아데노바이러스 (Ad5) 또는 유형 2 아데노바이러스 (Ad2)인 재조합 아데노바이러스.
- 제6항에 있어서, 유형 5 아데노바이러스 (Ad5)인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 부위가 단백질분해적 절단 부위인 재조합 아데노바이러스.
- 제8항에 있어서, 단백질분해적 절단 부위가 진핵생물 세포의 소포체 또는 골지에 존재하는 프로테아제에 의해 절단되는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 단백질분해적 절단 부위가 푸린 절단 부위인 재조합 아데노바이러스.
- 제10항에 있어서, 푸린 절단 부위가 RX1X2R (서열식별번호: 6)을 포함하고, 여기서 X1이 임의의 아미노산이고, X2가 Lys 또는 Arg인 재조합 아데노바이러스.
- 제11항에 있어서, 푸린 절단 부위가 RAKR (서열식별번호: 7)을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오티드 서열이 E1b-19K의 시작 부위와 E1b-19K의 정지 부위 사이에 위치한 E1b-19k 삽입 부위에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제13항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 E1b-19K의 시작 부위와 E1b-55K의 시작 부위 사이에 위치하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 약 200개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제15항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 202개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제15항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 E1b-19K의 시작 부위에 인접한 203개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 1714-1916에 상응하는 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, E1b-19K 삽입 부위가 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 1714-1917에 상응하는 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열이 CTGACCTC (서열식별번호: 2)와 TCACCAGG (서열식별번호: 3) 사이에 삽입된 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 5'에서 3' 배향으로 CTGACCTC (서열식별번호: 2), 제1 뉴클레오티드 서열, 제3 뉴클레오티드 서열, 제2 뉴클레오티드 서열, 및 TCACCAGG (서열식별번호: 3)를 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 기능적 Pea3 결합 부위의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제22항에 있어서, 결실이 E1a의 개시 부위의 약 -300 내지 약 -250 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 결실이 E1a의 개시 부위의 -304 내지 -255 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제22항 또는 제23항에 있어서, 결실이 E1a의 개시 부위의 -305 내지 -255 상류에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 195-244에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, E1a 프로모터가 서열 GGTGTTTTGG (서열식별번호: 4)를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 기능적 TATA 박스의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제28항에 있어서, 결실이 전체 TATA 박스의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제28항 또는 제29항에 있어서, 결실이 E1a 프로모터의 -27 내지 -24에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 결실이 E1a 프로모터의 -31 내지 -24에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 결실이 E1a 프로모터의 -44 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 결실이 E1a 프로모터의 -146 내지 +54에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 472 내지 475에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 468 내지 475에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 455 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 353 내지 552에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 5), AGTGCCCG (서열식별번호: 16) 및/또는 TATTCCCG (서열식별번호: 17)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제38항에 있어서, 서열 CTAGGACTG (서열식별번호: 5)를 포함하는 바이러스를 생성하는 폴리뉴클레오티드 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 기능적 CAAT 박스의 결실을 갖는 E1a 프로모터를 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제40항에 있어서, 결실이 전체 CAAT 박스의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제40항 또는 제41항에 있어서, 결실이 E1a 프로모터의 -76 내지 -68에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 423 내지 431에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제40항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, E1a 프로모터가 서열 TTCCGTGGCG (서열식별번호: 18)를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, E3 결실을 추가로 포함하고, E3 결실은 pVIII의 정지 부위와 Fiber의 시작 부위 사이에 위치하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제45항에 있어서, E3 결실이 E3-10.5K의 정지 부위와 E3-14.7K의 정지 부위 사이에 위치하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제45항 또는 제46항에 있어서, E3 결실이 약 500 내지 약 3185, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 3185, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 3185, 약 1500 내지 약 3000, 약 1500 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 3185, 약 2000 내지 약 3000, 약 2000 내지 약 2500, 약 2500 내지 약 3185, 약 2500 내지 약 3000 또는 약 3000 내지 약 3185개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, E3 결실이 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 약 500 내지 약 1551, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1551, 약 1000 내지 약 1500 또는 약 1500 내지 약 1551개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, E3 결실이 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 약 1050개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, E3 결실이 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 1063개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, E3 결실이 E3-10.5K의 정지 부위에 인접한 1064개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, E3 결실이 Ad5 dl309 E3 결실에 상응하는 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, E3 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 29773-30836에 상응하는 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제45항에 있어서, E3 결실이 E3-gp19K의 정지 부위와 E3-14.7K의 정지 부위 사이에 위치하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제54항에 있어서, E3 결실이 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 약 500 내지 약 1824, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1824, 약 1000 내지 약 1500 또는 약 1500 내지 약 1824개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제54항 또는 제55항에 있어서, E3 결실이 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 약 1600개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, E3 결실이 E3-gp19K의 정지 부위에 인접한 1622개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, E3 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 29218-30839에 상응하는 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, E4 결실을 추가로 포함하고, E4 결실은 E4-ORF6/7의 시작 부위와 우측 역전된 말단 반복부 (ITR) 사이에 위치하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제59항에 있어서, E4 결실이 E4-ORF6/7의 시작 부위와 E4-ORF1의 시작 부위 사이에 위치하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제59항 또는 제60항에 있어서, E4 결실이 약 500 내지 약 2500, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 2500, 약 1000 내지 약 2000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1500 내지 약 2500, 약 1500 내지 약 2000 또는 약 2000 내지 약 2500개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, E4 결실이 E4-ORF6/7의 시작 부위에 인접한 약 250 내지 약 1500, 약 250 내지 약 1250, 약 250 내지 약 1000, 약 250 내지 약 750, 약 250 내지 약 500, 500 내지 약 1500, 약 500 내지 약 1250, 약 500 내지 약 1000, 약 500 내지 약 750, 750 내지 약 1500, 약 750 내지 약 1250, 약 750 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 1500, 약 1000 내지 약 1250 또는 약 1250 내지 약 1500개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, E4 결실이 E4-ORF6/7의 시작 부위에 인접한 약 1450개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, E4 결실이 E4-ORF6/7의 시작 부위에 인접한 1449개 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, E4 결실이 Ad5 게놈 (서열식별번호: 1)의 뉴클레오티드 34078-35526에 상응하는 결실을 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 치료적 트랜스진이 아세틸콜린, 항-PD-1 항체 중쇄 또는 경쇄, 항-PD-L1 항체 중쇄 또는 경쇄, BORIS/CTCFL, CD19, CD20, CD80, CD86, CD137, CD137L, CD154, DKK1/Wnt, FGF, ICAM, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-17, IL-23, IL-23A/p19, p40, IL-24, IL-27, IL-27A/p28, IL-27B/EBI3, IL-35, 인터페론-감마, MAGE, NY-ESO-1, p53, TGF-β, TGF-β 트랩, 및 티미딘 키나제로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 치료적 트랜스진이 아세틸콜린, 항-PD-1 항체 중쇄 또는 경쇄, 항-PD-L1 항체 중쇄 또는 경쇄, BORIS/CTCFL, CD19, CD20, CD80, CD86, CD137, CD137L, CD154, DKK1/Wnt, FGF, ICAM, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-23A/p19, p40, 인터페론-감마, MAGE, NY-ESO-1, p53, TGF-β, TGF-β 트랩, 및 티미딘 키나제로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진이 각각 이종이량체성 시토카인의 제1 및 제2 서브유닛을 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제68항에 있어서, 제1 및/또는 제2 치료적 트랜스진이 IL-23A/p19 및 p40으로부터 선택되는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제69항에 있어서, 제1 치료적 트랜스진이 p40을 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제69항 또는 제70항에 있어서, 제2 치료적 트랜스진이 IL-23A/p19를 코딩하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 17-1000에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 1013-1582에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제69항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 17-1582에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 서열식별번호: 9와 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 치료적 트랜스진이 외인성 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되지 않은 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 조합된 크기가 약 500 내지 약 5000, 약 500 내지 약 4000, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 5000, 약 1000 내지 약 4000, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 5000, 약 2000 내지 약 4000, 약 2000 내지 약 3000, 약 3000 내지 약 5000, 약 3000 내지 약 4000 또는 약 4000 내지 5000개 뉴클레오티드를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 조합된 크기가 약 500 내지 약 7000, 약 500 내지 약 6000, 약 500 내지 약 5000, 약 500 내지 약 4000, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 7000, 약 1000 내지 약 6000, 약 1000 내지 약 5000, 약 1000 내지 약 4000, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 7000, 약 2000 내지 약 6000, 약 2000 내지 약 5000, 약 2000 내지 약 4000, 약 2000 내지 약 3000, 약 3000 내지 약 7000, 약 3000 내지 약 6000, 약 3000 내지 약 5000, 약 3000 내지 약 4000, 약 4000 내지 약 7000, 약 4000 내지 약 6000, 약 4000 내지 약 5000개 뉴클레오티드, 약 5000 내지 약 7000, 약 5000 내지 약 6000 또는 약 6000 내지 약 7000개 뉴클레오티드를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 조합된 크기가 적어도 약 500 내지 약 5000, 약 500 내지 약 4000, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 5000, 약 1000 내지 약 4000, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 5000, 약 2000 내지 약 4000, 약 2000 내지 약 3000, 약 3000 내지 약 5000, 약 3000 내지 약 4000 또는 약 4000 내지 5000개 뉴클레오티드를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 조합된 크기가 적어도 약 500 내지 약 7000, 약 500 내지 약 6000, 약 500 내지 약 5000, 약 500 내지 약 4000, 약 500 내지 약 3000, 약 500 내지 약 2000, 약 500 내지 약 1000, 약 1000 내지 약 7000, 약 1000 내지 약 6000, 약 1000 내지 약 5000, 약 1000 내지 약 4000, 약 1000 내지 약 3000, 약 1000 내지 약 2000, 약 2000 내지 약 7000, 약 2000 내지 약 6000, 약 2000 내지 약 5000, 약 2000 내지 약 4000, 약 2000 내지 약 3000, 약 3000 내지 약 7000, 약 3000 내지 약 6000, 약 3000 내지 약 5000, 약 3000 내지 약 4000, 약 4000 내지 약 7000, 약 4000 내지 약 6000, 약 4000 내지 약 5000개 뉴클레오티드, 약 5000 내지 약 7000, 약 5000 내지 약 6000 또는 약 6000 내지 약 7000개 뉴클레오티드를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 조합된 크기가 적어도 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 3000, 약 4000 또는 약 5000개 뉴클레오티드를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 조합된 크기가 적어도 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 3000, 약 4000, 약 5000개 뉴클레오티드, 약 6000 또는 약 7000개 뉴클레오티드를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 조합된 크기가 약 1600개 뉴클레오티드를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 조합된 크기가 약 1650개 뉴클레오티드를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 치료적 트랜스진의 조합된 크기가 약 3100개 뉴클레오티드를 포함하는 것인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 과다증식성 세포에서 선택적으로 복제하는 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 과다증식성 세포에서 제1 및/또는 제2 치료적 트랜스진을 선택적으로 발현하는 재조합 아데노바이러스.
- 제86항 또는 제87항에 있어서, 과다증식성 세포가 암 세포인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 종양용해성 바이러스인 재조합 아데노바이러스.
- 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
- 표적 세포를 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스의 유효량에 노출시켜 2종의 치료적 트랜스진을 발현하는 것을 포함하는, 표적 세포에서 2종의 치료적 트랜스진을 발현하는 방법.
- 제91항에 있어서, 2종의 치료적 트랜스진이 발현될 때 단일 폴리펩티드 쇄를 생성하는 것인 방법.
- 제92항에 있어서, 단일 폴리펩티드 쇄가 번역 후에 2개의 폴리펩티드 쇄로 절단되는 것인 방법.
- 종양 세포를 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스의 유효량에 노출시켜 종양 세포의 증식을 억제하는 것을 포함하는, 종양 세포의 증식을 억제하는 방법.
- 종양 성장의 억제가 필요한 대상체에게 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스의 유효량을 투여하여 종양의 성장을 억제하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법.
- 암의 치료가 필요한 대상체에게 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스의 유효량을 투여하여 상기 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법.
- 제96항에 있어서, 암이 항문암, 기저 세포 암종, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 암종, 담관암종, 자궁경부암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 위식도암, 위장 (GI) 암, 위장 간질 종양, 간세포 암종, 부인과암, 두경부암, 혈액암, 신장암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 신경내분비암, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 소아암, 전립선암, 신세포 암종, 육종, 피부암, 소세포 폐암, 피부의 편평상피 세포 암종, 위암, 고환암 및 갑상선암으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제96항에 있어서, 암이 흑색종, 피부의 편평상피 세포 암종, 기저 세포 암종, 두경부암, 유방암, 항문암, 자궁경부암, 비소세포 폐암, 중피종, 소세포 폐암, 신세포 암종, 전립선암, 위식도암, 결장직장암, 고환암, 방광암, 난소암, 간세포 암종, 담관암종, 뇌암, 자궁내막암, 신경내분비암, 메르켈 세포 암종, 위장 간질 종양, 육종 및 췌장암으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 아데노바이러스를 수술, 방사선, 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법, 및 바이러스요법으로부터 선택되는 1종 이상의 요법과 조합하여 투여하는 것인 방법.
- 제94항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 아데노바이러스의 유효량이 102-1015 플라크 형성 단위 (pfu)인 방법.
- 제95항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
- 제101항에 있어서, 대상체가 소아 인간인 방법.
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Legal Events
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---|---|---|---|
E902 | Notification of reason for refusal |