CN116621966A - 治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用 - Google Patents
治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116621966A CN116621966A CN202310493868.9A CN202310493868A CN116621966A CN 116621966 A CN116621966 A CN 116621966A CN 202310493868 A CN202310493868 A CN 202310493868A CN 116621966 A CN116621966 A CN 116621966A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid molecule
- seq
- tumor
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 240
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 234
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 234
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 189
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 119
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims abstract description 59
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 48
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title abstract description 18
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 claims abstract description 108
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 claims abstract description 108
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 98
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 49
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 163
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 97
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 97
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 85
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 84
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 53
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 53
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 50
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 44
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 37
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 36
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 34
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 33
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 19
- DSNRWDQKZIEDDB-SQYFZQSCSA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-sn-glycerol) Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC DSNRWDQKZIEDDB-SQYFZQSCSA-N 0.000 claims description 18
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 18
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 14
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 12
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 11
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 11
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 10
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 10
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 claims description 9
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 claims description 9
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 8
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 7
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 6
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 6
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims description 5
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 claims description 4
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 claims description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000180579 Arca Species 0.000 claims description 2
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 claims description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108091028075 Circular RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002699 Digestive System Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 claims description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 claims description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 claims description 2
- QXAITBQSYVNQDR-ZIOPAAQOSA-N amitraz Chemical compound C=1C=C(C)C=C(C)C=1/N=C/N(C)\C=N\C1=CC=C(C)C=C1C QXAITBQSYVNQDR-ZIOPAAQOSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002587 amitraz Drugs 0.000 claims description 2
- 229950009791 durvalumab Drugs 0.000 claims description 2
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 claims description 2
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 claims description 2
- 208000025189 neoplasm of testis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 229950010773 pidilizumab Drugs 0.000 claims description 2
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 claims 6
- 102100032245 Dynein axonemal heavy chain 2 Human genes 0.000 claims 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 101001016199 Homo sapiens Dynein axonemal heavy chain 2 Proteins 0.000 claims 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 claims 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 239000005426 pharmaceutical component Substances 0.000 claims 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims 1
- 102000014154 Interleukin-12 Subunit p35 Human genes 0.000 abstract description 38
- 108010011301 Interleukin-12 Subunit p35 Proteins 0.000 abstract description 38
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 58
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 46
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 41
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 41
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 41
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 35
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 33
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 28
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 25
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 25
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 23
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 13
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 11
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 9
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 9
- 101001043807 Homo sapiens Interleukin-7 Proteins 0.000 description 8
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 8
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 8
- 102000052622 human IL7 Human genes 0.000 description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 8
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 7
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 5
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 5
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 5
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 5
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 229940066453 tecentriq Drugs 0.000 description 5
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 1-methylpseudouridine Chemical compound O=C1NC(=O)N(C)C=C1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UVBYMVOUBXYSFV-XUTVFYLZSA-N 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000959791 Canis lupus familiaris Interferon alpha-3 Proteins 0.000 description 3
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 238000002559 palpation Methods 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 3
- OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 7-methylguanosine Chemical compound C1=2N=C(N)NC(=O)C=2[N+](C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OGHAROSJZRTIOK-KQYNXXCUSA-O 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 2
- 108010017515 Interleukin-12 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000004560 Interleukin-12 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100030856 Myoglobin Human genes 0.000 description 2
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 208000007271 Substance Withdrawal Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 description 2
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001565 modulated differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 2
- 210000004985 myeloid-derived suppressor cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 2
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 238000011729 BALB/c nude mouse Methods 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006100 Bradykinesia Diseases 0.000 description 1
- 102100025248 C-X-C motif chemokine 10 Human genes 0.000 description 1
- 102100025279 C-X-C motif chemokine 11 Human genes 0.000 description 1
- 102100036170 C-X-C motif chemokine 9 Human genes 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001239 CD8-positive, alpha-beta cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 1
- 241000214054 Equine rhinitis A virus Species 0.000 description 1
- 101150089023 FASLG gene Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101000858088 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 10 Proteins 0.000 description 1
- 101000858060 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 11 Proteins 0.000 description 1
- 101000947172 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 1
- 101001009007 Homo sapiens Hemoglobin subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001003142 Homo sapiens Interleukin-12 receptor subunit beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000589305 Homo sapiens Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000006083 Hypokinesia Diseases 0.000 description 1
- 206010021113 Hypothermia Diseases 0.000 description 1
- 102100020790 Interleukin-12 receptor subunit beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100020792 Interleukin-12 receptor subunit beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710103840 Interleukin-12 receptor subunit beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000010782 Interleukin-7 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038498 Interleukin-7 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101150009057 JAK2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150074862 KLRC3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 101000611935 Mus musculus Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 102100022701 NKG2-E type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 108010004217 Natural Cytotoxicity Triggering Receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100032870 Natural cytotoxicity triggering receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100032851 Natural cytotoxicity triggering receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241001672814 Porcine teschovirus 1 Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229930185560 Pseudouridine Natural products 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N Pseudouridine C Natural products OC1C(O)C(CO)OC1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 102000005886 STAT4 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010019992 STAT4 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N beta-Pseudouridine Natural products OC1OC(CN2C=CC(=O)NC2=O)C(O)C1O WGDUUQDYDIIBKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000002631 hypothermal effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010832 independent-sample T-test Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009290 primary effect Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N pseudouridine Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=CNC(=O)NC1=O PTJWIQPHWPFNBW-GBNDHIKLSA-N 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N ribothymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009044 synergistic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000012447 xenograft mouse model Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5434—IL-12
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2013—IL-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2046—IL-7
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/208—IL-12
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
- A61K38/2086—IL-13 to IL-16
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
- A61K38/212—IFN-alpha
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
- A61K38/215—IFN-beta
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
- A61K38/217—IFN-gamma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5418—IL-7
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5443—IL-15
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及基因药物技术领域，尤其是涉及治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用。本发明提供的以编码白细胞介素IL‑12p35和p40亚基的核酸分子片段和编码IL‑7蛋白的核酸分子片段为主要组分的核酸分子或核酸分子混合物，并提供了包含上述核酸分子片段的不同组合形式的核酸分子，所述组合形式包括不同核酸分子片段的融合，和不同核酸分子片段以游离形式形成组合物，经验证，本发明提供的核酸分子片段采用游离形式组合或者制备成融合核酸分子均对实体瘤表现出有效的治疗作用。本发明进一步使用适配载体与上述核酸分子组合物或融合核酸分子复合得到核酸分子药物，并给出了相应的制备方法，以期缓解目前实体瘤治疗对药物的迫切需求。
Description
本申请要求申请日为2022年05月06日的中国专利申请(申请号：2022104869114，发明名称：治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用)的优先权，该中国专利申请的部分内容通过引用方式整体并入到本申请。
技术领域
本发明涉及基因药物技术领域，尤其是涉及治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用。
背景技术
肿瘤在临床上有实体瘤和非实体瘤之分，实体瘤及有形瘤，可通过临床检查如x线摄片、CT扫描，B超、或触诊扪及到的有形肿块称实体瘤，X线、CT扫描，B超及触诊无法看到或扪及到的肿瘤如血液病中的白血病就属于非实体瘤。
针对实体肿瘤的主流治疗4种方式：外科手术、化学治疗、放射治疗和靶向治疗。这些方法可以移除、毁损、杀伤、破坏肿瘤细胞，使病情缓解。根据肿瘤的种类，可以采用一种治疗方式，或采用多种治疗方式联合治疗。另外肿瘤免疫疗法发展迅速，已逐步发展成为继四种主流肿瘤治疗方式后的另一有效治疗手段；其中因核酸分子的优越特性，基于核酸分子的肿瘤免疫疗法也被提了出来。基于核酸分子的治疗，简单来讲就是利用化学修饰后的核酸分子进入细胞质中，利用细胞质内的自有核苷酸进行转录表达，生成机体所需要的蛋白质。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于，提供一种对实体瘤具有治疗效果的核酸分子或核酸分子混合物，该核酸分子或核酸分子混合物含有的多种核酸分子片段能够突破实体瘤的微环境屏障，对肿瘤细胞实现高效的抑制作用。
本发明的第二个目的在于，提供由上述核酸分子片段的核酸分子组合物或者融合核酸分子，以不同核酸分子片段的组合物形式，或者以不同核酸分子的融合形式用于治疗实体瘤药物治疗中。
本发明的第三个目的在于，提供一种核酸分子药物，所述核酸分子药物包括上述核酸分子组合物和/或融合核酸分子，并将其与适配的载体复合得到能够用于临床的治疗实体瘤的药物。
本发明还有一个目的在于，提供上述核酸分子药物的制备方法，通过将含有上述核酸分子的水相与含有载体组分的有机相混合，得到核酸分子药物，该方法简便易行，适合工业化推广。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供治疗性核酸分子或核酸分子混合物，所述核酸分子包括：核酸分子片段(A)，所述核酸分子片段(A)编码IL-7蛋白；和，核酸分子片段(B)；所述核酸分子片段(B)编码白细胞介素IL-12的p35和p40亚基。
本文中核酸或核酸分子指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，核酸或核酸分子包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。核酸或核酸分子的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。核酸或核酸分子编码的目的蛋白或多肽可选地为编码正义链或反义链。核酸或核酸分子酸可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。
IL-12主要由抗原递呈细胞如树突状细胞和巨噬细胞受到激活所产生。IL-12和细胞膜上的IL-12受体IL-12RB1以及IL-12RB2相结合，激活下游的Jak2和Tyk2，进而诱导STAT4磷酸化和二聚化，后者结合目标基因的启动子，调控基因表达，如IFNγ。IL-12可以活化NK细胞表达CD69和CD25，促进NK细胞的扩增。IL-12可以促进Th1细胞的分化和活化，进而活化杀伤性CD8+T细胞。IL-12可以促进巨噬细胞向促炎的M1型分化，而不是抗炎的M2型，进而诱导趋化因子CXCL9,CXCL10和CXCL11的表达，促进免疫细胞的招募和富集。
IL-7在包括淋巴节、骨髓、脾脏、皮肤、肺脏、肝脏等组织都有广泛表达。IL-7通过和IL-7受体相互作用，激活Jak-Stat5以及PI3K-AKT信号通路，从而调控下游基因的表达。IL-7可以提高NK、NKT、LAK以及CD8+T细胞的肿瘤杀伤功能。IL-7可以通过诱导T细胞和NK细胞表达穿孔素、IFNγ、FasL等增强其对肿瘤的杀伤能力。另外，IL-7可以通过刺激单核细胞释放IL-1β，IL-1α以及TNF-α，抑制肿瘤细胞的生长。IL-7可以下调CD8+T细胞上PD-1的表达，从而逆转T细胞衰竭。IL-7在维持记忆性T细胞的存活和扩增方面起着重要的作用。另外，在抗原撤回后，IL-7可以维持记忆性CD4+和CD8+T细胞池的平衡。
细胞因子的生物学功能上存在相互协同作用。IL-7可以提高IL-12受体在NK细胞和T细胞上的表达，使后者对IL-12更敏感。IL-7可以协同IL-12提高IFN-γ的表达。IL-12和IL-7可以协同激活T细胞和NK细胞，并提高其对肿瘤细胞的杀伤能力。IL-12和IL-7协同作用诱导NK细胞表达NKG2E，NKp44，和NKp46，促进NK细胞的成熟。IL-12和IL-7协同作用诱导抗原递呈细胞表达HLA-DR，促进其抗原递呈能力。IL-12和IL-7协同作用增强T细胞扩增，维持肿瘤浸润淋巴细胞。IL-7可以提高肿瘤浸润CD8+T细胞的TCR多样性，而IL-12和IL-7协同作用，提高少量部分T细胞克隆的比例，从而增强T细胞克隆性。这一协同作用激活肿瘤浸润T细胞并增强抗肿瘤活性。
在可选的实施方式中，所述核酸分子还包括核酸分子片段(C)，所述核酸分子片段(C)包括编码如下蛋白的核酸片段：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、IL-15和IL-2中的至少一种，其中所述核酸分子片段(C)编码IFN-α，IFN-α能够提高树突状细胞的抗原递呈能力，并促进其向淋巴结的迁移。IFN-α通过诱导穿孔素和颗粒酶的释放，提高免疫细胞的杀伤能力。IFN-α可以抑制Treg和MDSC的免疫抑制性功能和细胞扩增能力。IFN-α可以促进M1型巨噬细胞的分化。此外，IFN-α还可以通过抑制肿瘤细胞的细胞周期、促进细胞终端分化以及诱导细胞凋亡等机制，发挥直接的抗肿瘤作用。
在可选的实施方式中，基于细胞因子IL-12、IL-7和IFN-α的生物学功能以及之间的协同作用，在抗肿瘤治疗领域中，在可选的实施方式中，这三个细胞因子的联合应用，预期达到如下的主要功效：诱导Th1细胞的分化和活化，诱导NK细胞的成熟，激活并促进T细胞和NK细胞的扩增，以及对肿瘤的杀伤能力，维持记忆性T细胞的存活和扩增；促进巨噬细胞向促炎的M1型分化，增强树突状细胞的抗原递呈能力，通过诱导趋化因子的表达，促进免疫细胞的招募和向肿瘤组织的浸润；逆转T细胞衰竭，抑制Treg和MDSC的功能；直接抑制肿瘤细胞的生长，诱导细胞凋亡。
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(A)编码的IL-7的氨基酸序列如SEQ IDNO.42所示，或，包含与SEQ ID NO.42至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与SEQ ID NO.42至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在可选的实施方式中，核酸分子片段(A)的核苷酸序列选自：SEQ ID NO.22～24和SEQ ID NO.47～49中的任意一种。其中，SEQ ID NO.22～24为RNA序列，SEQ ID NO.47～49为DNA序列。
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(A)的核苷酸序列选自：与SEQ ID NO.22～24和SEQ ID NO.47～49至少70％、75％、80％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列中的任意一种。
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(B)编码的IL-12的p35亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示，或，包含与SEQ ID NO.39至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与SEQ ID NO.39至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(B)编码的IL-12的p40亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示，或，包含与SEQ ID NO.40至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与SEQ ID NO.40至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在可选的实施方式中，核酸分子片段(B)编码的IL-12的p35亚基和p40亚基通过氨基酸序列为SEQ ID NO.41(GSSGGGGSPGGGSS)所示的linker连接。
在可选的实施方式中，核酸分子片段(B)的核苷酸序列选自：SEQ ID NO.19～21和SEQ ID NO.44～46中的任意一种。其中，SEQ ID NO.19～21为RNA序列，SEQ ID NO.44～46为DNA序列。
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(B)的核苷酸序列选自：与SEQ ID NO.19～21和SEQ ID NO.44～46至少70％、75％、80％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列中的任意一种。
在可选的实施方式中，核酸分子片段(C)编码的IFN-α多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.43所示，或，包含与SEQ ID NO.43至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与SEQ ID NO.43至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在可选的实施方式中，核酸分子片段(C)的核苷酸序列选自：SEQ ID NO.26～28和SEQ ID NO.50～52中的任意一种。其中，SEQ ID NO.26～28为RNA序列，SEQ ID NO.50～52为DNA序列。
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(C)的核苷酸序列选自：与SEQ ID NO.26～28和SEQ ID NO.50～52至少70％、75％、80％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列中的任意一种。
在可选的实施方式中，核酸分子片段(A)、核酸分子片段(B)和/或核酸分子片段(C)可以通过序列优化手段优化mRNA序列，改善与体内施用后的表达功效相关的特性：例如提高mRNA稳定性、增加靶组织中的翻译功效、减少表达的截短蛋白的数量、改善表达的蛋白质的折叠或防止其错误折叠、降低表达产物的毒性、减少由表达产物引起的细胞死亡、增加和/或减少蛋白质聚集，得到改善特性的mRNA。序列优化的目的还包括：保持结构和功能完整性的同时优化基于核酸的治疗剂的配制和递送的特征；克服表达的阈值；提高表达率；半衰期和/或蛋白质浓度；优化蛋白质定位；以及避免不利的生物响应如免疫响应和/或降解途径。序列优化手段包括：(1)根据特定器官和/或宿主生物体中的密码子频率进行密码子优化以确保恰当折叠和适当表达；(2)调节G/C含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；(3)使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基串(base runs)最小化；(4)定制转录和翻译控制区；(5)减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。
两个核苷酸序列之间的「序列同一性」指示序列之间相同核苷酸的百分比。两个氨基酸序列之间的「序列同一性」指示序列之间相同氨基酸的百分比。
术语「％同一性」或类似术语是指，在最佳比对下，待比较序列之间相同核苷酸或氨基酸之百分比。该百分比为纯粹统计学的，且两个序列之间的差异可能为(但不一定)随机分布于待比较序列之整个长度上。两个序列之比较通常藉由在最佳比对之后，相对于片段或「比较窗口」比较改等序列而进行，以鉴别对应序列之局部区。
在可选的实施方式中，所述核酸分子包括DNA分子和/或RNA分子。
在可选的实施方式中，所述DNA分子包括链状DNA分子和/或环状DNA分子。
在可选的实施方式中，所述RNA分子包括mRNA或环形RNA。
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段的5’端和/或3’端具有保护性修饰基团。
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段为mRNA片段，所述mRNA片段的5’端修饰基团选自ARCA、m7G(5"")ppp(5"")(2""OMeA)pG、m7G(5"")ppp(5"")(2""OMeG)pG、m7(3""OMeG)(5"")ppp(5"")(2""OMeG)pG、m7(3""OMeG)(5"")ppp(5"")(2""OMeA)pG、mCAP、dmCAP、tmCAP或dmCAP。
在可选的实施方式中，所述mRNA片段的3’端保护性修饰基团为poly(A)，所述poly(A)长度为50～200，优选为80～200。
在可选的实施方式中，所述mRNA片段还含有5’UTR；
在可选的实施方式中，所述5’UTR的长度优选为10～200个核苷酸，优选为15～100个核苷酸；
在可选的实施方式中，所述5’UTR包括KOZAK序列或DNAH2 5’UTR；
在可选的实施方式中，KOZAK序列的核苷酸序列如SEQ ID.NO.16所示；
在可选的实施方式中，DNAH2 5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID.NO.38所示；
在可选的实施方式中，所述mRNA片段还含有3’UTR；
在可选的实施方式中，3’UTR序列如SEQ ID.NO.1～10所示，SEQ ID.NO.1来自肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)，SEQ ID.NO.2来自肌红蛋白(Myoglobin)，SEQ ID.NO.3来自肌动蛋白(α-actin)，SEQ ID.NO.4来自白蛋白(Albumin)，SEQ ID.NO.5和7来自组胺球蛋白(a-globin)，SEQ ID.NO.6来自胶原蛋白(Col6a2；collagen,type IV,alpha 2)，SEQID.NO.10来自血红蛋白HBA2。
在可选的实施方式中，mRNA由5’端至3’端依次包括5’帽子、5’UTR、ORF、3’UTR和3’poly(A)尾端。
在可选的实施方式中，基于提供的RNA序列，本领域普通技术人员将能得到相应的DNA序列(例如尿嘧啶转换为胸腺嘧啶)。同样地，基于所提供的DNA序列，本领域普通技术人员将得到相应的RNA序列(例如胸腺嘧啶转换为尿嘧啶)。在可选的实施方式中，基于提供的RNA或DNA序列，本领域普通技术人员将能得到相应的氨基酸序列。
在可选的实施方式中，mRNA中的一个或多个尿苷用修饰核苷进行置换。在一些实施方案中，置换尿苷的修饰核苷为假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
第二方面，本发明提供第一治疗性核酸分子组合物，所述第一治疗性核酸分子组合物包括，前述实施方式任一项所述的核酸分子混合物。
在可选的实施方式中，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。
第三方面，本发明提供治疗性融合核酸分子，所述治疗性融合核酸分子包括前述实施方式任一项所述的核酸分子，所述核酸分子包括核酸分子片段(A)和核酸分子片段(B)，在可选的实施方式中，还包括核酸分子片段(C)。
在可选的实施方式中，至少任意两个核酸分子片段通过linker连接。
在可选的实施方式中，融合核酸分子中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。
第四方面，本发明提供第二治疗性核酸分子组合物，所述第二治疗性核酸分子组合物包括前述实施方式所述第一治疗性核酸分子组合物和前述实施方式所述治疗性融合核酸分子的组合。
在可选的实施方式中，所述第二治疗性核酸分子组合物中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。
第五方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的核酸分子或核酸分子混合物、前述实施方式所述的第一治疗性核酸分子组合物、前述实施方式所述的治疗性融合核酸分子或前述实施方式所述的第二治疗性核酸分子组合物在制备抗实体瘤药物或者实体瘤药物药效评价中的应用。
在可选的实施方式中，所述核酸分子或核酸分子混合物中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。
在可选的实施方式中，所述实体瘤包括上皮肿瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、前列腺瘤、卵巢瘤、肾细胞瘤、胃肠道瘤、肝瘤、结肠直肠瘤、血管瘤、间皮瘤、胰脏瘤、乳房瘤、肉瘤、肺瘤、结肠瘤、脑瘤、黑色素瘤、小细胞肺瘤、神经母细胞瘤、睾丸瘤、癌瘤、腺癌瘤、神经胶质瘤、精细胞癌瘤、视网膜母细胞瘤或骨肉瘤。
第六方面，本发明提供治疗实体瘤的核酸分子药物，所述核酸分子药物包括核酸分子组分和包裹核酸分子组分的载体；
所述核酸分子组分选自前述实施方式任一项所述的治疗性核酸分子或核酸分子混合物、前述实施方式所述的第一治疗性核酸分子组合物、前述实施方式所述的治疗性融合核酸分子或前述实施方式所述的第二治疗性核酸分子组合物。
在可选的实施方式中，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。
在可选的实施方式中，融合核酸分子中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，融合核酸分子中每种核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。
在可选的实施方式中，所述载体包括脂质体纳米颗粒。
在可选的实施方式中，所述核酸分子组分中的每一种游离的核酸分子片段或融合核酸分子均被脂质体纳米颗粒独立包裹。
在可选的实施方式中，至少两种游离的核酸分子片段或融合核酸分子均被脂质体纳米颗粒独立包裹。例如两种游离的核酸分子片段，或三种游离的核酸分子片段，或融合核酸分子均被脂质体纳米颗粒独立包裹。
在可选的实施方式中，至少两种游离的核酸分子片段被脂质体纳米颗粒共同包裹。例如两种游离的核酸分子片段，或三种游离的核酸分子片段被脂质体纳米颗粒共同包裹。
在可选的实施方式中，至少一种游离的核酸分子片段和一种融合核酸分子被脂质体纳米颗粒共同包裹。
在可选的实施方式中，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括20％～50％的阳离子脂质，例如可以为但不限于为20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％；20％～50％的DOPG，例如可以为但不限于为20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％；5％～20％的胆固醇，例如可以为但不限于为5％、10％、15％或20％；和1％～5％的PEG-DMG，例如可以为但不限于为1％、2％、3％、4％或5％。
在可选的实施方式中，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括50％的Dlin-MC3-DMA、10％的DOPG、38.5％的胆固醇和1.5％的PEG-DMG。
在可选的实施方式中，还包括治疗性蛋白或治疗性化学药用组分。
在可选的实施方式中，所述治疗性蛋白包括阿替利珠单抗。
第七方面，本发明提供前述实施方式任一项所述核酸分子药物的制备方法，将游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子溶解于缓冲液中得到水相，量取脂质体纳米颗粒各脂质组分溶于有机溶剂得到有机相，混合水相和有机相后去除有机相得到核酸分子药物。
在可选的实施方式中，所述水相和有机相的体积比为1：2～4，优选为1:3。
在可选的实施方式中，所述缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液或醋酸钠，优选为柠檬酸盐缓冲液。
在可选的实施方式中，所述缓冲液的pH为3～7，优选为4。
在可选的实施方式中，水相中游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL，优选为0.1mg/mL。
在可选的实施方式中，所述有机溶剂选自C1～C4低碳醇，优选为无水乙醇。
在可选的实施方式中，所述有机相中脂质组分的浓度为5mg/mL～7mg/mL，优选为6mg/mL。
在可选的实施方式中，使用微流控混合水相和有机相，采用切向流过滤有机溶剂；
优选地，所述微流控的流速为>3ml/min，进一步优选为12mL/min。
在可选的实施方式中，混合后还包括浓缩步骤，所述浓缩步骤使游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子的终浓度为50μg/mL～200μg/mL，优选为100μg/mL。
第八方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包括前述实施方式任一项所述的核酸分子药物，或采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的核酸分子药物。
在可选的实施方式中，所述药物组合物还包括蛋白类药物，所述蛋白类药物选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗DC20抗体、抗Her2抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗VEGFR抗体、抗EGFR抗体、抗RANKL抗体、抗CD30抗体、抗VEGFR2抗体、抗GD2抗体、抗CD38抗体、抗CD22抗体和抗CD33抗体中的至少一种。
在可选的实施方式中，所述药物组合物还包括阿替利珠单抗、纳武单抗、帕母单抗、pidilizumab、阿唑单抗、durvalumab、阿曲单抗和伊匹木单抗中的至少一种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的以编码IL-7蛋白，和，编码白细胞介素IL-12的p35和p40亚基的核酸分子片段为主要组分的核酸分子或核酸分子混合物，能够全面激活多种免疫细胞活性，实现对实体瘤的有效治疗。
本发明还提供了包含上述核酸分子片段的不同组合形式的核酸分子，所述组合形式包括不同核酸分子片段的融合，和不同核酸分子片段以游离形式形成组合物，经验证，本发明提供的两类核酸分子片段无论是采用游离形式组合，还是制备成融合核酸分子均对实体瘤表现出有效的治疗作用。
本发明还进一步使用适配载体与上述核酸分子组合物或融合核酸分子复合得到核酸分子药物，并给出了相应的制备方法，以期缓解目前实体瘤治疗对药物的迫切需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中各组小鼠实验中肿瘤接种位置示意图；
图2为本发明实施例1中5组实验肿瘤体积变化曲线图；
图3为本发明实施例3中5组实验肿瘤体积变化曲线图；
图4为本发明实施例4中4组实验肿瘤体积变化曲线图；
图5为本发明实施例5中小鼠实物图；
图6为本发明实施例5中3组实验肿瘤体积变化曲线图；
图7为本发明实施例6中肿瘤中浸润的白细胞比例检测结果；
图8为本发明实施例18中各实验组肿瘤体积随注射天数变化曲线；
图9为本发明实施例18中各实验组每只老鼠的肿瘤体积变化；
图10为本发明实施例19中各实验组肿瘤体积变化曲线图；
图11为本发明实施例20中各实验组的相对肿瘤抑制率曲线；
图12为本发明实施例20中各实验组肿瘤体积随注射天数变化曲线；
图13A和图13B为本发明实施例20中各实验组每只老鼠的肿瘤体积变化；
图14为本发明实施例21中各实验组肿瘤体积随注射天数变化曲线；
图15为本发明实施例22中G1～G6的小鼠的肿瘤体积变化。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了证明本发明提供的治疗性核酸分子或核酸分子混合物对于实体瘤具有治疗作用，本发明构建了实体瘤治疗作用的评价方法，具体步骤如下：
1、小鼠CT26肿瘤模型的构建
实验动物的选择(1)品系：BALB/c，(2)级别：SPF级，(3)周龄：7.6～8.7周，(4)性别：雌。
肿瘤接种：复苏并传代培养CT26.WT细胞，复苏代次为N+8。收集对数生长期的CT26.WT细胞(接种代次为N+11)，去除培养液并用PBS洗两次后接种，接种量：1×106cells/100μL/只，接种位置如图1所示的1号位。
2、小鼠KM12肿瘤模型的构建
实验动物的选择(1)品系：SCID小鼠，(2)级别：SPF级，(3)周龄：10周，(4)性别：雌。
肿瘤接种：复苏并传代培养KM-12细胞细胞，复苏代次为N+8。收集对数生长期的KM-12细胞细胞，去除培养液并用PBS洗两次后接种，接种量：5×106cells/200μL/只，接种位置如图1所示的1号位。
3、小鼠Cal27肿瘤模型的构建
实验动物的选择(1)品系：BALB/c裸鼠，(2)级别：SPF级，(3)周龄：4-6周，(4)性别：雄性。
肿瘤接种：复苏并传代培养Cal27细胞，复苏代次为N+8。收集对数生长期的Cal27细胞(接种代次为N+11)，去除培养液并用PBS洗两次后接种，接种量：5×109cells/L/只，接种位置如图1所示的2号位。
4、小鼠NCI-N87肿瘤模型的构建
实验动物的选择(1)品系：SCID，(2)级别：SPF级，(3)周龄：11周，(4)性别：雌。
肿瘤接种：复苏并传代培养NCI-N87细胞，复苏代次为N+8。收集对数生长期的NCI-N87细胞(接种代次为N+11)，去除培养液并用PBS洗两次后接种，接种量：3.0×106cells/200μL/只，接种位置如图1所示的1号位。
5、小鼠A375肿瘤模型的构建
实验动物的选择(1)品系：SCID，(2)级别：SPF级，(3)周龄：6～8周，(4)性别：雌。
肿瘤接种：复苏并传代培养A375细胞，复苏代次为N+8。收集对数生长期的A375细胞(接种代次为N+11)，去除培养液并用PBS洗两次后接种，接种量：5×106cells/200μL/只，接种位置如图1所示的1号位。
6、小鼠NCI-H1975肿瘤模型的构建
实验动物的选择(1)品系：NSG，(2)级别：SPF级，(3)周龄：10周，(4)性别：雌。
肿瘤接种：复苏并传代培养NCI-H1975细胞，复苏代次为N+8。收集对数生长期的NCI-H1975细胞(接种代次为N+11)，去除培养液并用PBS洗两次后接种，接种量：1×106cells/100μL/只，接种位置如图1所示的1号位。
7、小鼠MDA-MB-231肿瘤模型的构建
实验动物的选择(1)种属：小鼠；(2)品系：huHSC-NCG-hIL15(T038070)；(3)级别：SPF级；(4)周龄：16.7周(接种时周龄)；(5)性别：雌。
人源化小鼠鉴定：huHSC-NCG-hIL15免疫重建后8.7周，小鼠外周血流式细胞学分析如下指标：hCD45+、hCD3+、CD4、CD8、NK(hCD56+、hCD16+)。hCD45+细胞占活细胞平均比例为24.82％，hCD56+/hCD45+平均比例为10.8％，判断人源化模型构建成功；进行细胞扩增。
肿瘤接种：复苏并传代培养MDA-MB-231细胞，复苏代次为N+23。免疫重建后12.5周收集对数生长期的MDA-MB-231细胞(接种代次为N+33)，去除培养液并用PBS洗两次后接种，接种量：5×106cells/100μL/只(基质胶1:1)，接种位置如图1所示3号位。
8、动物安乐
在实验过程中，观测肿瘤大小、称量小鼠体重及临床病理评定。并根据临床观察进行临床分数(体重、小鼠姿态、活动性、毛发、皮肤等方面)评定。若实验小鼠产生如下的指标，将进行动物安乐处理：(1)当单只小鼠肿瘤体积超3000mm3，按单只小鼠进行安乐；(2)持续稀便；(3)活动迟缓(不能进食或饮水)；(4)弓背，侧卧；(5)活动减少，出现肌肉萎缩症状；(6)呼吸困难；(7)进程性体温降低；(8)瘫痪，痉挛；(9)持续流血；(10)由于肿瘤太大或其他原因导致动物不能够正常行动；(11)由于严重的腹水或腹围增大导致动物不能够正常行动。
9、指标计算公式
瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm3)＝0.5×肿瘤长径×肿瘤短径2。
TGITV(相对肿瘤抑制率)计算公式：
Vnt：编号为n的小鼠在第t天的肿瘤体积；
Vn0：编号为n的小鼠在第0天的肿瘤体积；
RTVn：编号为n的小鼠在第t天的肿瘤相对体积；
mean RTVtreat：给药组RTV平均值；
mean RTVvehicle：Vehicle组RTV平均值；
TGITW(肿瘤重量变化)计算公式：
mean TWtreat:给药组小鼠终点处理时肿瘤重量的平均值；
mean TWvehicle:Vehicle组小鼠终点处理时肿瘤重量的平均值。
10、统计分析
实验结果以平均值±标准误差(Mean±SEM)表示。两组样本之间比较采用独立样本T检验(T-Test)，数据使用SPSS进行分析，P<0.05为具有显著性差异，作图软件为Graphpad prism。
本发明提供了一种含有mRNA脂质纳米颗粒的制备方法，在未特殊说明情况下，以下实施例中注射给药使用的mRNA均采用单独包裹阳离子脂质得到的脂质纳米颗粒的给药方式。单独包裹阳离子脂质得到的脂质纳米颗粒的制备方法参考实施例8或实施例15，共同包裹阳离子脂质得到的脂质纳米颗粒的制备方法参考实施例7、9、16或17。本领域技术人员可以根据核酸分子的种类和数量参考上述制备方法制备脂质纳米颗粒。下述实施例中，SEQID NO.11～15、SEQ ID NO.25的核苷酸序列为鼠源，SEQ ID NO.17～24，SEQ ID NO.26～29的核苷酸序列为人源。
需要说明的是，下述实施例中使用的含有一个开放阅读框的mRNA的结构为由5’端至3’端依次包括5’帽子、5’UTR、ORF、3’UTR和3’poly(A)尾端。5’帽子为：5’UTR的序列如SEQID NO.38所示，ORF例如选自前述SEQ ID NO.11～15和SEQ ID NO.17～29中的任意一种，3’UTR序列如SEQ ID NO.10所示，3’poly(A)尾长度为：100A。mRNA序列中的尿苷由全部置换为N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。原位注射给药在本文中为肿瘤内注射给药(肿瘤内注射给药的意思是在肿瘤内部注射给药，也就是接触肿瘤之任何位置处注入治疗剂。)
实施例1
本实施例对编码不同多肽的mRNA组合对于肿瘤抑制率的影响进行考察。
以上述CT26肿瘤模型为实验模型进行5组实验，每组小鼠数量为8只，
组1.1(G1)给药为生理盐水，给药频次为每周两次，给药周期为3周；组1.2(G2)为编码IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.14所示)、编码IL-7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.15所示)和编码GM-CSF的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.25所示)组成的混合物。
组1.3(G3)为编码IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.14所示)、编码IL-7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.15所示)、编码IFN-α的mRNA(核苷酸序列如SEQID No.13所示)和编码GM-CSF的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.25所示)组成的混合物。组1.4(G4)为编码IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.14所示)、编码IL-15的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.11所示)、编码IFN-α的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.13所示)和编码GM-CSF的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.25所示)组成的混合物。组1.5(G5)为编码IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.14所示)、编码IL-7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.15所示)和编码IFN-α的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.13所示)组成的混合物。
mRNA混合物的给药频次为每周一次，给药周期为3周，5组小鼠给药方式均为原位注射给药，其中每组mRNA的给药剂量总量为0.12mg/kg，每组内的不同RNA等量给药。分组后25天设置为实验终点，测试五组实验对肿瘤的影响。经上述计算方法验证，其中IL-12+IL-7+GM-CSF(G2组)对小鼠结肠癌细胞CT26的相对肿瘤抑制率(TGITV)为36.46％；IL-12+IL-7+IFN-α+GM-CSF(G3组)、IL-12+IL-15+IFN-α+GM-CSF(G4组)、IL-12+IL-7+IFN-α(G5组)对小鼠结肠癌细胞CT26的相对肿瘤抑制率(TGITV)为98.56％、97.67％、97.07％，但G3～G5组的相对肿瘤抑制率(TGITV)无显著性差异(P>0.05)。肿瘤体积随注射天数变化曲线结果如图2所示。
除此之外，本发明还对针对mRNA三组分混合物IL-12+IL-7+IFN-α进行了其他的成分筛选，将mRNA三组分混合物IL-12+IL-7+IFN-α中的IFN-α替换为IFN-β或IFN-γ后，得到的相对肿瘤抑制率(TGITV)分别为67％和75％，略低于IFN-α。
实施例2
本实施例考察同一多肽片段的不同mRNA序列体外表达多肽片段的能力。
本实施例通过体外转录方法制备了上述3条IL-7mRNA(序列分别为SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24)、3条IL-12mRNA(序列分别为SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21)、3条IFN-αmRNA(序列分别为SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27和SEQ IDNO.28)分别转染HEK293细胞。首先采用4×105个细胞/ml的密度进行HEK293细胞的铺板，24小时后细胞融合状态大约为80％时进行细胞转染。转染时加入6孔板的1个孔的HEK293细胞中的转染体系中包括2μg mRNA和转染试剂Lipofectamine MessagerMAX(ThermoFisherScientific)，具体转染操作按照转染试剂产品说明书进行。
24小时之后分别收集细胞上清和细胞裂解液，再通过ELISA的方法分别检测mRNA表达的蛋白的高低。
| 编码IL-12多肽的mRNA序列 | 相对表达量 |
| SEQ ID NO.19 | 1.5 |
| SEQ ID NO.20 | 1 |
| SEQ ID NO.21 | 0.9 |
| 编码IL-7多肽的mRNA序列 | 相对表达量 |
| SEQ ID NO.22 | 1.5 |
| SEQ ID NO.23 | 1 |
| SEQ ID NO.24 | 0.8 |
| 编码IFN-α多肽的mRNA序列 | 相对表达量 |
| SEQ ID NO.26 | 1.6 |
| SEQ ID NO.27 | 0.8 |
| SEQ ID NO.28 | 1 |
本发明中列举的IL-12mRNA的3段序列、IL-7mRNA的3段序列、IFN-αmRNA的3段序列，从常用密码子频次、GC含量、基因的mRNA二级结构(如mRNA自由能)、cis-acting mRNA不稳定序列、RNase剪切位点和重复单元等指标方面没有显著的差异，但是从转录的结果可以看出，SEQ ID NO.19的IL-12mRNA序列转染细胞中的IL-12表达量高于SEQ ID NO.20和SEQID NO.21的IL-12mRNA序列；SEQ ID NO.22的IL-7mRNA序列转染细胞中的IL-7表达量高于SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24的IL-7mRNA序列；SEQ ID NO.26的IFN-αmRNA序列转染细胞中的IFN-αmRNA表达量高于SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28的IFN-αmRNA序列。
本发明对mRNA三组分混合物(IL-12+IL-7+IFN-α)中IL-12mRNA的ORF采用IL-12mRNA的3段序列中任意一种，在根据各段序列的IL-12表达量进行给药剂量调整时，不影响肿瘤消退、相对肿瘤抑制率(TGITV)、免疫记忆、与抗肿瘤药物联用等效果。该效果也同样适用于IL-7和IFN-α。
实施例3
本实施例考察不同给药剂量对于肿瘤抑制效果的影响。
以上述小鼠MDA-MB-231肿瘤模型为实验模型，在构建后第16天(免疫重建后14.8周)，挑选30只人源化荷瘤小鼠根据肿瘤体积随机分成5组，每组6只。分组当天定义为D0天，并于分组当天D0天开始给药。分组剩余小鼠安乐处理。
组3.1(G1)给药方案：生理盐水，组3.2(G2)给药方案：5mg/kg Tecentriq(阳性药)，组3.3(G3)给药方案：0.032mg/kg mRNA三组分混合物(IL-12+IL-7+IFN-α，SEQ IDNO.19+SEQ ID NO.22+SEQ ID NO.26)，组3.4(G4)组给药方案：0.16mg/kg mRNA三组分混合物(IL-12+IL-7+IFN-α，SEQ ID NO.19+SEQ ID NO.22+SEQ ID NO.26)，组3.5(G5)组给药方案：0.8mg/kg mRNA三组分混合物(IL-12+IL-7+IFN-α，SEQ ID NO.19+SEQ ID NO.22+SEQID NO.26)。G1～G5的小鼠的肿瘤体积变化如图3所示。
根据停药时肿瘤体积数据统计分析，与对照组相比：G2组Tecentriq(TGITV＝19.67％)可显著抑制肿瘤生长(P<0.05*)；G3组低剂量(TGITV＝45.52％)、G4组(TGITV＝73.94％)和G5组(TGITV＝95.10％)均可显著抑制肿瘤生长(P<0.001***)。
本试验评价不同剂量的受试物mRNA三组分混合物以及阳性药Tecentriq在huHSC-NCG-hIL15小鼠皮下负荷MDA-MB-231乳腺癌肿瘤模型中的药效学作用。以上实验数据表明，在当前的测试系统下，与对照组G1相比，阳性药Tecentriq在肿瘤生长阶段表现出显著肿瘤抑制效果(TGITV＝19.67％，P＝0.021*)。低、中、高三个剂量的受试物mRNA三组分混合物在肿瘤体积与对照组G1相比均表现出显著的肿瘤抑制效果。
实施例4
本实施例测试(1)含三种组分的IL-12+IL-7+IFN-α(SEQ ID NO.14+SEQ ID NO.15+SEQ ID NO.13)单个药物；和(2)该单个药物与蛋白类药物(以抗PD-1抗体为例)联合给药的抗肿瘤效果。
在本实验中，选择野生型BALB/c小鼠模型，接种小鼠结肠癌细胞CT26，分别在肿瘤细胞接种后10天、17天和24天连续三次进行(1)瘤内注射前述的单个药物；和(2)单个药物与抗PD-1抗体的联合给药，并与(3)抗PD-1抗体阳性药进行对比，结果如图4所示，含三种不同组分mRNA的单个药物以及其与抗PD-1抗体联用在野生型BALB/c小鼠模型中，对小鼠结肠癌细胞CT26的相对肿瘤抑制率(TGITV)分别为99.06％、98.39％，而抗PD-1抗体阳性药的相对肿瘤抑制率为47.78％。由以上结果可以得出，在考察IL-12+IL-7+IFN-α三种组分形成的单药以及其与抗PD-1抗体联用时，对于CT26小鼠结肠癌细胞的抗肿瘤活性差异性分析时，从本次实验结果的相对肿瘤抑制率(TGITV)来看，与对照组生理盐水(G1)相比，当单独使用IL-12+IL-7+IFN-α组合成药时(G3)，相对肿瘤抑制率(TGITV)为99.06％，其抗肿瘤活性效果极好，因此在与抗PD-1抗体进行联合用药(G4，TGITV为98.39％)时，未能展现出抗PD-1抗体的联合协同作用。但单独使用IL-12+IL-7+IFN-α组合成药时，其抗肿瘤活性明显优于单独使用抗PD-1抗体(G2，TGITV为47.78％)，其相对肿瘤抑制率(TGITV)具有显著性差异。
实施例5
本实施例考察注射含IL-12+IL-7+IFN-α三种组分的LNP制剂后，肿瘤消退的小鼠，是否能产生免疫记忆。
本实施例选择肿瘤消退的小鼠，重新接种小鼠结肠癌细胞CT26，分别在肿瘤细胞接种后，于D0、D4、D7、D11、D13、D15、D18、D20、D22、D25、D27、D32、D34观测肿瘤大小，直到该动物首次药后81天，结果如图5和图6所示。
G1为未曾注射过IL-12+IL-7+IFN-α三种组分的小鼠6只；G2为注射过IL-12+IL-7+IFN-α三种组分联合抗PD-1抗体，且肿瘤消退的小鼠6只；G3为单独注射过IL-12+IL-7+IFN-α三种组分，且肿瘤消退的小鼠6只。
其中G1分为G1-1和G1-2，G1-1只接种小鼠结肠癌细胞CT26，G1-2除了接种小鼠结肠癌细胞CT26外，在D15天注射IL-12+IL-7+IFN-α三种组分。
结果显示：1)完全未注射IL-12+IL-7+IFN-α三种组分的G1-1小鼠，在11天后，肿瘤体积达到111.84±1.86mm3，至实验终点时肿瘤体积达到2702.94±485.22mm3；
2)D15天注射IL-12+IL-7+IFN-α三种组分的G1-2小鼠，在11天后，肿瘤体积达到99.71±8.26mm3，至实验终点时肿瘤体积达到249.38±162.09mm3；
3)肿瘤消退重新接种肿瘤细胞的G2和G3小鼠,直到试验终点，依然未见有肿瘤生长。
由以上结果可以得出，在注射IL-12+IL-7+IFN-α三种组分后，可起到使肿瘤消退的效果，而在肿瘤消退后，重新接种肿瘤细胞，同样也可起到抑制肿瘤生长的效果，说明在注射IL-12+IL-7+IFN-α后，可以在动物体内形成长时间的免疫记忆。
实施例6
本实施例考察在肿瘤局部同时注射鼠源IL-12+鼠源IL-7+鼠源IFN-α三种组分时(核苷酸序列如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.13所示)，肿瘤中浸润的白细胞比例。
在本实施例中，选择野生型BALB/c小鼠模型，接种小鼠结肠癌细胞CT26，分别在肿瘤细胞接种后10天、17天连续两次进行瘤内注射含前述三种组分的制剂(G3组和G4组)，并与m PD-1阳性药(G2组)进行对比，阳性药采用腹腔注射，分别在肿瘤细胞接种后10天、14天和17天连续三次进行注射。其中G3组为按照实施例8所述的方法制备的三种组分的制剂，G4为按照实施例7所述的方法制备的三种组分的制剂，结果如图7所示，IL-12+IL-7+IFN-α三种组分成药时，肿瘤中浸润的T Cell、NK Cell、gMDSC、mMDSC、Macrophages、CD4+T和CD25+CD4+的细胞与生理盐水注射组有显著性差异。由以上结果可以得出，G3组和G4组(IL-12+IL-7+IFN-α)肿瘤中浸润的白细胞比例较G1(生理盐水)和G2(m PD-1阳性药)组有上升趋势，G3组和G4组肿瘤中T细胞浸润比例(包括CD4+辅助T细胞和CD8+杀伤T细胞)增加较多，与药效实验中对肿瘤的抑制结果较一致；且G3组和G4组在药效实验中的结果较为一致。
为了评价在各种癌症类型中肿瘤内注射mRNA三组分混合物(IL-12+IL-7+IFN-α)的效果，如前所描述建立五种异种移植小鼠模型：KM12(CRC)、Cal27(头颈癌)、NCI-N87(胃癌)、A375(黑色素瘤)及NCI-H1975(NSCLC)。带有KM12(CRC)、Cal27(头颈癌)、NCI-N87(胃癌)、A375(黑色素瘤)及NCI-H1975(NSCLC)肿瘤的小鼠接受mRNA三组分混合物(IL-12+IL-7+IFN-α(核苷酸序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.26所示))，经测试各肿瘤模型小鼠中，肿瘤中浸润的T Cell、NK Cell、gMDSC、mMDSC、Macrophages、CD4+T和CD25+CD4+的细胞与生理盐水注射组有显著性差异。
实施例7
本实施例提供了同时包裹编码三种多肽的mRNA的脂质纳米颗粒的制备方法，所述三种多肽为IL-12p35和p40亚基、IL-7多肽和IFN-α多肽。所述脂质纳米颗粒的脂质组分按照摩尔百分比计包括Dlin-MC3-DMA 50％、DOPG 10％、胆固醇38.5％和PEG-DMG 1.5％。
具体制备方法如下：
(a)将编码IL-12p35和p40亚基多肽的mRNA、编码IL-7多肽的mRNA、编码IFN-α多肽的mRNA按照质量比1:1:1溶解于pH4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml，得到水相。
(b)按照配方量将Dlin-MC3-DMA、DOPG、胆固醇和PEG-DMG按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6mg/mL，得到有机相。
(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12mL/min的流速混合，混合液立刻用pH7.4的PBS溶液稀释100倍，并使用切向流过滤(TFF)除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的mRNA的浓度为100μg/ml，得到包含编码IL-12多肽的RNA、编码IL-7多肽的RNA、编码IFN-α多肽的RNA的脂质纳米颗粒。
实施例8
本实施例提供了分别包裹编码三种多肽的mRNA的脂质纳米颗粒的制备方法，所述三种多肽为IL-12p35和p40亚基、IL-7多肽和IFN-α多肽。所述脂质纳米颗粒的脂质组分按照摩尔百分比计包括Dlin-MC3-DMA 50％、DOPG 10％、胆固醇38.5％和PEG-DMG 1.5％。
具体制备方法如下：
(1)编码IL-12多肽的RNA的脂质纳米颗粒
(a)将编码IL-12p35和p40亚基多肽的mRNA溶解于pH4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml，得到水相。
(b)按照配方量将Dlin-MC3-DMA、DOPG、胆固醇和PEG-DMG按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6mg/mL，得到有机相。
(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12mL/min的流速混合，混合液立刻用pH7.4的PBS溶液稀释100倍，并使用切向流过滤(TFF)除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的mRNA的浓度为100μg/ml，得到包含编码IL-12多肽的RNA的脂质纳米颗粒。
(2)按照本实施例步骤(1)制备编码IL-7多肽的RNA的脂质纳米颗粒和IFN-α多肽的RNA的脂质纳米颗粒；
(3)将编码三种多肽的RNA脂质纳米颗粒按照质量比1:1:1混合，得到包含编码IL-12多肽的RNA、编码IL-7多肽的RNA、编码IFN-α多肽的RNA的脂质纳米颗粒。
实施例9
本实施例提供了同时包裹编码三种多肽的DNA质粒的脂质纳米颗粒的制备方法，所述三种多肽为IL-12p35和p40亚基、IL-7多肽和IFN-α多肽，编码三种多肽的DNA分别被整合在3种不同的质粒中。所述脂质纳米颗粒的脂质组分按照摩尔百分比计包括Dlin-MC3-DMA 50％、DOPG 10％、胆固醇38.5％和PEG-DMG 1.5％。
具体制备方法如下：
(a)将编码IL-12p35和p40亚基多肽的DNA质粒、编码IL-7多肽的DNA质粒、编码IFN-α多肽的DNA质粒按照质量比1:1:1溶解于pH4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml，得到水相。
(b)按照配方量将Dlin-MC3-DMA、DOPG、胆固醇和PEG-DMG按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6mg/mL，得到有机相。
(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12mL/min的流速混合，混合液立刻用pH7.4的PBS溶液稀释100倍，并使用切向流过滤(TFF)除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的mRNA的浓度为100μg/ml，得到包含编码IL-12多肽的DNA质粒、编码IL-7多肽的DNA质粒、编码IFN-α多肽的DNA质粒的脂质纳米颗粒。
实施例10
本实施例提供了治疗性融合核酸分子。
融合RNA分子的结构：融合RNA分子包括编码IL-12和IL-7，除此之外还包括但不限于非翻译区(UTR，如5’UTR或3’UTR)、5’帽区、聚A尾区、起始区、终止区、信号序列区、linker序列以及其组合。
其中linker序列编码的蛋白质切割信号，包含至少一个蛋白质切割位点。编码的蛋白切割信号可以包括但不限于蛋白前体转化酶(或激素前体转化酶)，凝血酶和/或因子Xa蛋白切割信号，例如使用Furin切割位点(furin cleavage site，FCS)(参考US7374930B2)。选择FCS的一个好处是Furin广泛分布在大多数细胞类型中，本发明的融合RNA可以在体内几乎任何类型的细胞中有效表达活性多肽。
Furin切割位点的DNA序列为CGTCAACGTCGT(SEQ ID NO.30)；在融合RNA中Furin切割位点的RNA序列为CGUCAACGUCGU(SEQ ID NO.31)。
以包括编码IL-12和IL-7多肽的部分的融合RNA的结构为例说明：5帽子’——5’UTR——起始区——编码IL-12的RNA——linker——编码IL-7的RNA——3’UTR——终止区——3’polyA尾。
Linker可以是例如可切割接头或蛋白酶敏感接头。Linker选可切割接头F2A接头(具有氨基酸序列GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP，SEQ ID NO.32)、P2A接头(具有氨基酸序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP，SEQ ID NO.33)、T2A接头(具有氨基酸序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP，SEQ ID NO.34)、E2A接头(例如，具有氨基酸序列GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP，SEQ ID NO.35)及其组合组成的组。
自切割肽可以是但不限于2A肽。本领域中已知的2A肽包括例如口蹄疫病毒(FMDV)2A肽、马鼻炎A病毒2A肽、明脉扁刺蛾病毒2A肽和猪捷申病毒-1 2A肽。若干病毒使用2A肽通过核糖体跳跃由一种转录物产生两种蛋白质，使得正常肽键在2A肽序列处削弱，导致由一个翻译事件产生两种不连续的蛋白质。编码2A肽的多核苷酸序列包括但不限于以下序列(可通过本文所述和/或本领域中已知的方法对2A肽的多核苷酸序列进行修饰或密码子优化)：
(1)
GGAAGCGGAGCUACUAACUUCAGCCUGCUGAAGCAGGCUGGAGACGUGGAGGAGAACCCUGGACCU(SEQ ID NO.36)；
或者，(2)
UCCGGACUCAGAUCCGGGGAUCUCAAAAUUGUCGCUCCUGUCAAACAAACUCUUAACUUUGAUUUACUCAAACUGGCTGGGGAUGUAGAAAGCAAUCCAGGTCCACUC(SEQ ID NO.37)。
下述实施例中治疗性融合核酸分子的结构为：5帽子’——5’UTR——起始区——编码IL-12的RNA——linker——编码IL-7的RNA——3’UTR——终止区——3’polyA尾；其中5’帽区为m7Gppp(5’)(2’-OMeA)pG(7-甲基鸟苷三磷酸-2-甲氧基单磷酸鸟苷帽类似物；CAP1-GAG)；5’UTR序列为SEQ ID No.38所示；起始区序列为启动子序列，具体为AUG；编码IL-12的RNA如SEQ ID No.19所示；linker的RNA如SEQ ID No.31所示；编码IL-7的RNA如SEQID No.22所示；3’UTR序列如SEQ ID No.10所示；终止区序列为终止子序列，具体为UAA；聚A尾区也称为poly(A)，长度为100A。
其中在融合RNA分子中，核酸片段(B)(即编码IL-12的RNA)可以在靠近5’端，如上所示；也可以靠近3’端，具体结构为5帽子’——5’UTR——起始区——编码IL-7的RNA——linker——编码IL-12的RNA——3’UTR——终止区——3’polyA尾。
实施例11
本实施例提供了治疗性融合核酸分子。与实施例10的区别仅在于融合RNA分子的结构，本实施例融合RNA分子包括编码IL-12、IL-7和IFN-α多肽的部分，除此之外还包括但不限于非翻译区(UTR，如5’UTR或3’UTR)、5’帽区、聚A尾区、起始区、终止区、信号序列区、linker序列以及其组合。
治疗性融合核酸分子的结构为5帽子’——5’UTR——起始区——编码IL-12的RNA——linker——编码IL-7的RNA——linker——编码IFN-α的RNA——3’UTR——终止区——3’polyA尾；其中5’帽区为m7Gppp(5’)(2’-OMeA)pG(7-甲基鸟苷三磷酸-2-甲氧基单磷酸鸟苷帽类似物；CAP1-GAG)；5’UTR序列为SEQ ID No.38所示；起始区序列为启动子序列，具体为AUG；编码IL-12的RNA如SEQ ID No.19所示；linker的RNA如SEQ ID No.31所示；编码IL-7的RNA如SEQ ID No.22所示；编码IFN-α的RNA如SEQ ID No.26所示；3’UTR序列如SEQ ID No.10所示；终止区序列为终止子序列，具体为UAA；聚A尾区也称为poly(A)，长度为100A。
其中融合RNA分子中核酸片段(A)、核酸片段(B)、核酸片段(C)之间的相对顺序可以替换，例如可以为5帽子’——5’UTR——起始区——编码IL-12的RNA——linker——编码IFN-α的RNA——linker——编码IL-7的RNA——3’UTR——终止区——3’polyA尾、5帽子’——5’UTR——起始区——编码IL-12的RNA——linker——编码IL-7的RNA——linker——编码IFN-α的RNA——3’UTR——终止区——3’polyA尾、5帽子’——5’UTR——起始区——编码IL-7的RNA——linker——编码IFN-α的RNA——linker——编码IL-12的RNA——3’UTR——终止区——3’polyA尾、5帽子’——5’UTR——起始区——编码IL-7的RNA——linker——编码IL-12的RNA——linker——编码IFN-α的RNA——3’UTR——终止区——3’polyA尾、5帽子’——5’UTR——起始区——编码IFN-α的RNA——linker——编码IL-7的RNA——linker——编码IL-12的RNA——3’UTR——终止区——3’polyA尾、5帽子’——5’UTR——起始区——编码IL-7的RNA——linker——编码IL-12的RNA——linker——编码IFN-α的RNA——3’UTR——终止区——3’polyA尾、5帽子’——5’UTR——起始区——编码IFN-α的RNA——linker——编码IL-12的RNA——linker——编码IL-7的RNA——3’UTR——终止区——3’polyA尾。
实施例12
本实施例提供了治疗性融合核酸分子的LNP制剂，制备方法如下：所述融合核酸分子mRNA编码IL-12p35和p40亚基和IL-7多肽。融合核酸分子mRNA结构如实施例10所述。所述脂质纳米颗粒的脂质组分按照摩尔百分比计包括Dlin-MC3-DMA 50％、DOPG 10％、胆固醇38.5％和PEG-DMG 1.5％。
具体制备方法如下：
(a)将治疗性融合核酸分子mRNA溶解于pH4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml，得到水相。
(b)按照配方量将Dlin-MC3-DMA、DOPG、胆固醇和PEG-DMG按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6mg/mL，得到有机相。
(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12mL/min的流速混合，混合液立刻用pH7.4的PBS溶液稀释100倍，并使用切向流过滤(TFF)除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的mRNA的浓度为100μg/ml，得到包含治疗性融合核酸分子mRNA的脂质纳米颗粒。
实施例13
本实施例提供了治疗性融合核酸分子的LNP制剂，与实施例12的区别仅在于所述融合核酸分子mRNA编码IL-12p35和p40亚基、IL-7多肽和IFN-α多肽。
实施例14
将实施例13制备的包含治疗性融合核酸分子mRNA的脂质纳米颗粒与实施例9制备的包含编码IL-12多肽的DNA质粒、编码IL-7多肽的DNA质粒、编码IFN-α多肽的DNA质粒的脂质纳米颗粒按照质量比1:1混合，得到第二治疗性核酸分子组合物。
实施例15
本实施例提供了分别包裹编码两种多肽的mRNA的脂质纳米颗粒的制备方法，所述两种多肽为IL-12p35和p40亚基、IL-7多肽多肽。所述脂质纳米颗粒的脂质组分按照摩尔百分比计包括Dlin-MC3-DMA 50％、DOPG 10％、胆固醇38.5％和PEG-DMG 1.5％。
具体制备方法如下：
(1)编码IL-12多肽的RNA的脂质纳米颗粒
(a)将编码IL-12p35和p40亚基多肽的mRNA溶解于pH4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml，得到水相。
(b)按照配方量将Dlin-MC3-DMA、DOPG、胆固醇和PEG-DMG按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6mg/mL，得到有机相。
(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12mL/min的流速混合，混合液立刻用pH7.4的PBS溶液稀释100倍，并使用切向流过滤(TFF)除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的mRNA的浓度为100μg/ml，得到包含编码IL-12多肽的RNA的脂质纳米颗粒。
(2)按照本实施例步骤(1)制备编码IL-7多肽的RNA的脂质纳米颗粒；
(3)将编码两种多肽的RNA脂质纳米颗粒按照质量比1:1混合，得到包含编码IL-12多肽的RNA和编码IL-7多肽的RNA的脂质纳米颗粒。
实施例16
本实施例提供了同时包裹编码两种多肽的mRNA的脂质纳米颗粒的制备方法，所述两种多肽为IL-12p35和p40亚基和IL-7多肽。所述脂质纳米颗粒的脂质组分按照摩尔百分比计包括Dlin-MC3-DMA50％、DOPG 10％、胆固醇38.5％和PEG-DMG 1.5％。
具体制备方法如下：
(a)将编码IL-12p35和p40亚基多肽的mRNA和编码IL-7多肽的mRNA按照质量比1:1溶解于pH4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml，得到水相。
(b)按照配方量将Dlin-MC3-DMA、DOPG、胆固醇和PEG-DMG按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6mg/mL，得到有机相。
(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12mL/min的流速混合，混合液立刻用pH7.4的PBS溶液稀释100倍，并使用切向流过滤(TFF)除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的mRNA的浓度为100μg/ml，得到包含编码IL-12多肽的RNA和编码IL-7多肽的RNA的脂质纳米颗粒。
实施例17
本实施例提供了同时包裹编码两种多肽的DNA的脂质纳米颗粒的制备方法，所述两种多肽为IL-12p35和p40亚基和IL-7多肽，编码两种多肽的DNA分别整合在2种不同的质粒中。所述脂质纳米颗粒的脂质组分按照摩尔百分比计包括Dlin-MC3-DMA 50％、DOPG10％、胆固醇38.5％和PEG-DMG 1.5％。
具体制备方法如下：
(a)将编码IL-12p35和p40亚基多肽的DNA质粒、编码IL-7多肽的DNA质粒按照质量比1:1溶解于pH4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml，得到水相。
(b)按照配方量将Dlin-MC3-DMA、DOPG、胆固醇和PEG-DMG按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6mg/mL，得到有机相。
(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12mL/min的流速混合，混合液立刻用pH7.4的PBS溶液稀释100倍，并使用切向流过滤(TFF)除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的DNA的浓度为100μg/ml，得到包含编码IL-12多肽的DNA质粒、编码IL-7多肽的DNA质粒的脂质纳米颗粒。
实施例18
本实施例对编码不同多肽的mRNA组合对于肿瘤抑制率的影响进行考察，每种组合包含编码两种多肽的mRNA，其中G1组至G5组的mRNA混合物按照实施例15制备的方法制备。
以上述小鼠CT26肿瘤模型为实验模型进行6组实验，每组小鼠数量为6只：
F1组给药为萤光素酶mRNA的混合物，给药剂量为0.06mpk；
F2组为编码鼠源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)的混合物，给药剂量为0.04mpk每只；
F3组为编码鼠源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)和编码鼠源IL7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)组成的混合物，给药剂量为IL-120.02mpk每只+IL7 0.02mpk每只；
F4组为编码鼠源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)和编码鼠源IL15的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)组成的混合物，给药剂量为IL-120.02mpk每只+IL15 0.02mpk每只；
F5组为编码鼠源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)和编码鼠源IL2的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)组成的混合物，给药剂量为IL-120.02mpk每只+IL2 0.02mpk每只；
F6组为PD-1抗体，给药剂量为10mpk。
mRNA混合物的给药频次为每周一次，给药周期为3周，6组小鼠给药方式均为原位注射给药。分组后21天设置为实验终点，测试六组实验对肿瘤的影响。
经上述计算方法验证，在实验终点，PD-1抗体(F6组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为76.22％；IL-12(F2组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为32.66％；IL-12+IL7(F3组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为54.38％；IL-12+IL15(F4组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为49.70％；IL-12+IL2(F5组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为-3.36％。各实验组肿瘤体积随注射天数变化曲线结果如图8所示，各实验组每只老鼠的肿瘤体积变化如图9所示。
实施例19
为了考察注射含IL-12+IL-7两种组分的LNP制剂后，肿瘤消退的小鼠，是否能产生免疫记忆，提供了本实施例。本实施例选择肿瘤消退的小鼠，在首次给药(IL-12+IL7各0.04mpk)47天时重新接种小鼠结肠癌细胞CT26(5×10^5/100μL/只)，在重新肿瘤细胞接种后据首次给药第61天、68天、71天、75天和77天观测肿瘤大小，结果如图所示。
G1为未曾注射过IL-12+IL-7两种组分的小鼠6只；G2为注射过鼠源IL-12(核苷酸序列如SEQ ID No.14所示)+鼠源IL-7(核苷酸序列如SEQ ID No.13所示)两种组分且肿瘤消退的小鼠2只。
结果显示：1)完全未注射IL-12+IL-7两种组分的G1小鼠至实验终点时肿瘤体积达到462.44±86.92mm3；
2)肿瘤消退重新接种肿瘤细胞的G2小鼠,直到试验终点，依然未见有肿瘤生长。
由以上结果可以得出，在注射IL-12+IL-7两种组分后，可起到使肿瘤消退的效果，而在肿瘤消退后，重新接种肿瘤细胞，同样也可起到抑制肿瘤生长的效果，说明在注射IL-12+IL-7后，可以在动物体内形成长时间的免疫记忆。各实验组肿瘤体积变化曲线图如图10所示。
实施例20
本实施例对编码鼠源不同多肽的mRNA组合对于肿瘤抑制率的影响进行考察。其中G1组至G8组的mRNA混合物按照实施例8或实施例15制备的方法制备。
以上述小鼠CT26肿瘤模型为实验模型进行9组实验，每组小鼠数量为6只，
G1组给药为萤光素酶mRNA，给药剂量为0.06mpk；
G2组为编码鼠源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)，给药剂量为0.02mpk每只；
G3组为编码鼠源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)，给药剂量为0.04mpk每只；
G4组为编码鼠源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)的混合物，给药剂量为0.08mpk每只；
G5组为编码鼠源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)和编码鼠源IL7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)组成的混合物，给药剂量为IL-120.02mpk每只+IL7 0.02mpk每只；
G6组为编码鼠源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)、编码鼠源IL7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)和编码鼠源IFN-α的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)组成的混合物，给药剂量为IL-12 0.02mpk每只+IL7 0.02mpk每只+IFN-α0.02mpk每只；
G7组为编码鼠源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)、编码鼠源IL7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)和编码鼠源IL15的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)组成的混合物，给药剂量为IL-12 0.02mpk每只+IL7 0.02mpk每只+IL15 0.02mpk每只；
G8组为编码鼠源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)、编码鼠源IL7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)和编码鼠源IL2的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示)组成的混合物，给药剂量为IL-12 0.02mpk每只+IL7 0.02mpk每只+IL2 0.02mpk每只；
G9组为PD-1抗体，给药剂量为10mpk。
mRNA混合物的给药频次为每周一次，给药周期为3周，9组小鼠给药方式均为原位注射给药。分组后21天设置为实验终点，测试九组实验对肿瘤的影响。
经上述计算方法验证，在实验终点，PD-1抗体(G9组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为76.22％；IL-12+IL7+IFN-α(G6组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为72.27％；IL-12+IL7(G5组)、G4组、IL-12+IL7+IL15(G8组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)分别为54.38％、54.41％和56.22％；其他组的相对肿瘤抑制率(TGITV)都低于40％。各实验组的相对肿瘤抑制率(TGITV)曲线如图11所示；各实验组肿瘤体积随注射天数变化曲线结果如图12所示。各实验组每只老鼠的肿瘤体积变化如图13A和图13B所示。
实施例21
本实施例对编码鼠源不同多肽的mRNA组合对于肿瘤抑制率的影响进行考察。其中F3组至F6组的mRNA混合物按照实施例15制备的方法制备。
以上述小鼠CT26肿瘤模型为实验模型进行6组实验，每组小鼠数量为6只：
F1组给药为生理盐水；
F2组为mPD1 Ab，给药剂量为10mpk；
F3组为编码鼠源IL7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)，给药剂量为IL71.2mpk每只；
F4组为编码鼠源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)，给药剂量为1.2mpk每只；
F5组为编码鼠源IFN-α的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)，给药剂量为1.2mpk每只；
F6组为编码鼠源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)、编码鼠源IL7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示)和编码鼠源IFN-α的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)组成的混合物，给药剂量为IL-12 1.2mpk每只+IL7 1.2mpk每只+IFN-α1.2mpk每只。
mRNA混合物的给药频次为每周一次，给药周期为3周，6组小鼠给药方式均为原位注射给药。分组后20天设置为实验终点，测试六组实验对肿瘤的影响。
经上述计算方法验证，在实验终点，mPD1 Ab(F2组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为41.49％；IL7(F3组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为9.32％；IL-12(F4组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为95.01％；IFN-α(F5组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为55.88％；IL-12+IL7+IFN-α(F6组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为94.78％。各实验组肿瘤体积随注射天数变化曲线结果如图14所示。
实施例22
本实施例考察不同给药剂量对于肿瘤抑制效果的影响。
以上述小鼠MDA-MB-231肿瘤模型为实验模型，在构建后第16天(免疫重建后14.8周)，挑选30只人源化荷瘤小鼠根据肿瘤体积随机分成7组，每组6只。分组当天定义为D0天，并于分组当天D0天开始给药。分组剩余小鼠安乐处理。
组G1给药方案：萤光素酶mRNA的混合物，给药剂量为0.06mpk；
组G2给药方案：编码人源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.19所示)，给药剂量为0.04mpk每只；
组G3给药方案：编码人源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.19所示)、编码人源IL-7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.22所示)和编码人源IFN-α的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.26所示)的混合物，混合物中三种RNA重量比例为1:1:1，给药剂量为0.022mpk每只；
组G4给药方案：编码人源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.19所示)、编码人源IL-7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.22所示)和编码人源IFN-α的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.26所示)的混合物，混合物中三种RNA重量比例为1:1:1，给药剂量为0.067mpk每只；
组G5给药方案：编码人源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.19所示)、编码人源IL-7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.22所示)和编码人源IFN-α的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.26所示)的混合物，混合物中三种RNA重量比例为1:1:1，给药剂量为0.2mpk每只；
组G6给药方案：10mpk Tecentriq(阳性药)。G1～G6的小鼠的肿瘤体积变化如图15所示。
根据停药时肿瘤体积数据统计分析，与对照组相比：G2组IL-12(TGITV＝35.67％)可显著抑制肿瘤生长(P<0.05*)；G3组低剂量(TGITV＝58.50％)、G4组(TGITV＝61.39％)和G5组(TGITV＝82.34％)均可显著抑制肿瘤生长(P<0.05*)。
本试验评价不同剂量的受试物mRNA三组分混合物以及阳性药Tecentriq在huHSC-NCG-hIL15小鼠皮下负荷MDA-MB-231乳腺癌肿瘤模型中的药效学作用。以上实验数据表明，在当前的测试系统下，低、中、高三个剂量的受试物mRNA三组分混合物在肿瘤体积与对照组G1相比均表现出显著的肿瘤抑制效果。
实施例23
实验方法：本实施例对不同工艺制备的编码多肽的mRNA组合的混合物对于肿瘤抑制率的影响进行考察。其中T1组的mRNA混合物按照实施例12制备的方法制备；T2组的mRNA混合物按照实施例16制备的方法制备；T3组和T4组的mRNA混合物按照实施例15制备的方法制备。
以上述小鼠MDA-MB-231肿瘤模型为实验模型进行4组实验，每组小鼠数量为6只，
组2.1(T1)为编码人源IL-12和人源化IL-7融合蛋白的mRNA(开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID No.19和SEQ ID No.22所示)，给药剂量为0.04mpk；
组2.2(T2)为编码人源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.19所示)和编码人源IL-7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.22所示)的混合物，给药剂量为IL-12mRNA0.02mpk每只，IL-7mRNA0.02mpk每只；
组2.3(T3)为编码人源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.19所示)和编码人源IL-7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.22所示)组成的混合物，给药剂量为IL-12 0.02mpk每只+IL-7 0.02mpk每只；
组2.4(T4)给药为萤光素酶mRNA，给药剂量为0.48mpk。
mRNA混合物的给药频次为每周一次，给药周期为3周，6组小鼠给药方式均为原位注射给药。分组后33天设置为实验终点，测试六组实验对肿瘤的影响。
经上述计算方法验证，在实验终点，T1组的相对肿瘤抑制率(TGITV)为53.21％；T2组的相对肿瘤抑制率(TGITV)为54.78％；T3组的相对肿瘤抑制率(TGITV)为54.34％。
实施例24
实验方法：本实施例对编码不同多肽的mRNA组合对于肿瘤抑制率的影响进行考察。其中P2组、P3组和P4组的mRNA混合物按照实施例15制备的方法制备。
以上述小鼠MDA-MB-231肿瘤模型为实验模型进行4组实验，每组小鼠数量为6只。
P1组给药为萤光素酶mRNA的混合物，给药剂量为0.48mpk。
P2组为编码人源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.19所示)和编码人源IL-7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.22所示)组成的混合物，给药剂量为IL-120.02mpk每只+IL-7 0.02mpk每只。
P3组为编码人源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.19所示)和编码人源IL-7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.23所示)组成的混合物，给药剂量为IL-120.02mpk每只+IL-7 0.02mpk每只。
P4组为编码人源IL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.19所示)和编码人源IL-7的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID No.24所示)组成的混合物，给药剂量为IL-120.024mpk每只+IL-7 0.024mpk每只。
mRNA混合物的给药频次为每周一次，给药周期为3周，5组小鼠给药方式均为原位注射给药。分组后33天设置为实验终点，测试五组实验对肿瘤的影响。
经上述计算方法验证，在实验终点，P2组的相对肿瘤抑制率(TGITV)为54.38％；P3组的相对肿瘤抑制率(TGITV)为50.23％；P4组的相对肿瘤抑制率(TGITV)为55.01％。
本发明对IL-12+IL-7中IL-7mRNA的ORF采用IL-7mRNA 3段序列中任意一种，在根据各段序列的IL-7mRNA表达量进行给药剂量调整时，不影响肿瘤消退、相对肿瘤抑制率(TGITV)等效果；对IL-12+IL-7中IL-12mRNA的ORF采用IL-12mRNA的3段序列(如SEQ IDNo.19-21所示)中任意一种，在根据各段序列的IL-12表达量进行给药剂量调整时，不影响肿瘤消退、相对肿瘤抑制率(TGITV)等效果。
实施例25
本实施例提供了药物组合物，包括如下的组分：
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.治疗性核酸分子或核酸分子混合物，其特征在于，所述核酸分子包括：核酸分子片段(A)，所述核酸分子片段(A)编码IL-7蛋白；和，核酸分子片段(B)，所述核酸分子片段(B)编码白细胞介素IL-12的p35和p40亚基。
2.根据权利要求1所述的治疗性核酸分子或核酸分子混合物，其特征在于，还包括核酸分子片段(C)，所述核酸分子片段(C)包括编码如下蛋白的核酸片段：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、GM-CSF、IL-15和IL-2中的至少一种；
优选地，所述核酸分子片段(C)编码IFN-α；
优选地，所述核酸分子片段(A)编码的IL-7的氨基酸序列如SEQ ID NO.42所示，或，包含与SEQ ID NO.42至少80％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述核酸分子片段(A)的核苷酸序列选自：SEQ ID NO.22～24和SEQ ID NO.47～49中的任意一种；或，选自与SEQ ID NO.22～24和SEQ ID NO.47～49至少70％同一性的核苷酸序列中的任意一种；
优选地，所述核酸分子片段(B)编码的IL-12的p35亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示，或，包含与SEQ ID NO.39至少80％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述核酸分子片段(B)编码的IL-12的p40亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示，或，包含与SEQ ID NO.40至少80％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述核酸分子片段(B)编码的IL-12的p35亚基和p40亚基通过氨基酸序列为SEQ ID NO.41所示的linker连接；
优选地，所述核酸分子片段(B)的核苷酸序列选自：SEQ ID NO.19～21和SEQ ID NO.44～46中的任意一种；或，选自与SEQ ID NO.19～21和SEQ ID NO.44～46至少70％同一性的核苷酸序列中的任意一种；
优选地，所述核酸分子片段(C)编码的IFN-α多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.43所示，或，包含与SEQ ID NO.43至少80％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述核酸分子片段(C)的核苷酸序列选自：SEQ ID NO.26～28和SEQ ID NO.50～52中的任意一种，或，选自与SEQ ID NO.26～28和SEQ ID NO.50～52至少70％同一性的核苷酸序列中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的治疗性核酸分子或核酸分子混合物，其特征在于，所述核酸分子包括DNA分子和/或RNA分子；
优选地，所述DNA分子包括链状DNA分子和/或环状DNA分子；
优选地，所述RNA分子包括mRNA或环形RNA；
优选地，所述核酸分子片段的5’端和/或3’端具有修饰基团；
优选地，所述核酸分子片段为mRNA片段，所述mRNA片段的5’端修饰基团选自ARCA、m7G(5”)ppp(5”)(2”OMeA)pG、m7G(5”)ppp(5”)(2”OMeG)pG、m7(3”OMeG)(5”)ppp(5”)(2”OMeG)pG、m7(3”OMeG)(5”)ppp(5”)(2”OMeA)pG、mCAP、dmCAP、tmCAP或dmCAP；
优选地，所述mRNA片段的3’端保护性修饰基团为poly(A)，所述poly(A)长度为50～200，优选为80～200；
优选地，所述mRNA片段还含有5’UTR；
优选地，所述5’UTR的长度优选为10～200个核苷酸，优选为15～100个核苷酸；
优选地，所述5’UTR包括KOZAK序列或DNAH2 5’UTR；
优选地，KOZAK序列的核苷酸序列如SEQ ID.NO.16所示；
优选地，DNAH2 5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID.NO.38所示；
优选地，所述mRNA片段还含有3’UTR；
优选地，3’UTR序列如SEQ ID.NO.1～10所示；
优选地，mRNA由5’端至3’端依次包括5’帽子、5’UTR、ORF、3’UTR和3’poly(A)尾端。
4.第一治疗性核酸分子组合物，其特征在于，所述第一治疗性核酸分子组合物包括，权利要求1～3任一项所述的核酸分子混合物；
优选地，所述第一治疗性核酸分子组合物中每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1～1:10。
5.治疗性融合核酸分子，其特征在于，所述治疗性融合核酸分子包括权利要求1～3任一项中所述的核酸分子；
优选地，至少任意两个核酸分子片段通过linker连接；
优选地，所述治疗性融合核酸分子中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10。
6.第二治疗性核酸分子组合物，其特征在于，所述第二治疗性核酸分子组合物包括权利要求4所述第一治疗性核酸分子组合物和权利要求5所述治疗性融合核酸分子的组合；
优选地，所述第二治疗性核酸分子组合物中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10。
7.权利要求1～3任一项所述的治疗性核酸分子或核酸分子混合物、权利要求4所述的第一治疗性核酸分子组合物、权利要求5所述的治疗性融合核酸分子或权利要求6所述的第二治疗性核酸分子组合物在制备抗实体瘤药物或者实体瘤药物药效评价中的应用；
优选地，所述实体瘤包括上皮肿瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、前列腺瘤、卵巢瘤、肾细胞瘤、胃肠道瘤、肝瘤、结肠直肠瘤、血管瘤、间皮瘤、胰脏瘤、乳房瘤、肉瘤、肺瘤、结肠瘤、脑瘤、黑色素瘤、小细胞肺瘤、神经母细胞瘤、睾丸瘤、癌瘤、腺癌瘤、神经胶质瘤、精细胞癌瘤、视网膜母细胞瘤或骨肉瘤。
8.治疗实体瘤的核酸分子药物，其特征在于，所述核酸分子药物包括核酸分子组分和包裹核酸分子组分的载体；
所述核酸分子组分选自权利要求1～3任一项所述的治疗性核酸分子或核酸分子混合物、权利要求4所述的第一治疗性核酸分子组合物、权利要求5所述的治疗性融合核酸分子或权利要求6所述的第二治疗性核酸分子组合物；
优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；
优选地，融合核酸分子中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；
优选地，所述载体包括脂质体纳米颗粒；
优选地，所述核酸分子组分中的每一种游离的核酸分子片段或融合核酸分子均被脂质体纳米颗粒独立包裹；
优选地，至少两种游离的核酸分子片段或融合核酸分子均被脂质体纳米颗粒独立包裹；
优选地，至少两种游离的核酸分子片段被脂质体纳米颗粒共同包裹；
优选地，至少一种游离的核酸分子片段和融合核酸分子被脂质体纳米颗粒共同包裹；
优选地，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括20％～50％的阳离子脂质、20％～50％的DOPG、5％～20％的胆固醇和1％～5％的PEG-DMG；
优选地，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括50％的Dlin-MC3-DMA、10％的DOPG、38.5％的胆固醇和1.5％的PEG-DMG；
优选地，还包括治疗性蛋白或治疗性化学药用组分；
优选地，所述治疗性蛋白包括阿替利珠单抗。
9.权利要求8所述核酸分子药物的制备方法，其特征在于，将游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子溶解于缓冲液中得到水相，量取包裹载体的各组分溶于有机溶剂得到有机相，混合水相和有机相后去除有机相得到核酸分子药物；
优选地，所述水相和有机相的体积比为1：2～4，进一步优选为1:3；
优选地，所述缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液或醋酸钠，进一步优选为柠檬酸盐缓冲液；
优选地，所述缓冲液的pH为3～7，进一步优选为4；
优选地，水相中游离的核酸分子片段或融合核酸分子的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL，进一步优选为0.1mg/mL；
优选地，所述有机溶剂选自C1～C4低碳醇，进一步优选为无水乙醇；
优选地，所述有机相中脂质组分的浓度为5mg/mL～7mg/mL，进一步优选为6mg/mL；
优选地，使用微流控混合水相和有机相，采用切向流过滤有机溶剂；
优选地，所述微流控的流速为>3ml/min，进一步优选为12mL/min；
优选地，混合后还包括浓缩步骤，所述浓缩步骤使游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子的终浓度为50μg/mL～200μg/mL，进一步优选为100μg/mL。
10.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求8所述核酸分子药物或者采用权利要求9所述制备方法制备得到的核酸分子药物；
优选地，所述药物组合物还包括蛋白类药物，所述蛋白类药物选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗DC20抗体、抗Her2抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗VEGFR抗体、抗EGFR抗体、抗RANKL抗体、抗CD30抗体、抗VEGFR2抗体、抗GD2抗体、抗CD38抗体、抗CD22抗体和抗CD33抗体中的至少一种；
优选地，所述药物组合物还包括阿替利珠单抗、纳武单抗、帕母单抗、pidilizumab、阿唑单抗、durvalumab、阿曲单抗和伊匹木单抗中的至少一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/CN2023/092440 WO2023213320A1 (zh) | 2022-05-06 | 2023-05-06 | 治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210486911 | 2022-05-06 | ||
| CN2022104869114 | 2022-05-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116621966A true CN116621966A (zh) | 2023-08-22 |
Family
ID=87457152
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310493853.2A Active CN116535491B (zh) | 2022-05-06 | 2023-05-04 | 治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用 |
| CN202310493868.9A Pending CN116621966A (zh) | 2022-05-06 | 2023-05-04 | 治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用 |
| CN202310493206.1A Pending CN116621965A (zh) | 2022-05-06 | 2023-05-04 | 治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310493853.2A Active CN116535491B (zh) | 2022-05-06 | 2023-05-04 | 治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310493206.1A Pending CN116621965A (zh) | 2022-05-06 | 2023-05-04 | 治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (3) | CN116535491B (zh) |
| WO (1) | WO2023213320A1 (zh) |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2592380A1 (en) * | 1997-11-20 | 1999-06-03 | Vical Incorporated | Treatment of cancer using cytokine-expressing polynucleotides and compositions therefor |
| AU3755800A (en) * | 1999-03-15 | 2000-10-04 | Introgen Therapeutics, Inc. | Dendritic cells transduced with a wild-type self gene elicit potent antitumor immune responses |
| WO2000062815A2 (en) * | 1999-04-15 | 2000-10-26 | Glaxo Group Limited | Novel pharmaceutical composition suitable for gene therapy |
| WO2006124700A2 (en) * | 2005-05-12 | 2006-11-23 | Introgen Therapeutics, Inc. | P53 vaccines for the treatment of cancers |
| AU2007266306A1 (en) * | 2006-05-26 | 2007-12-06 | Apollo Life Sciences Limited | An isolated IL-12 molecule or chimeric molecules thereof |
| WO2008134879A1 (en) * | 2007-05-04 | 2008-11-13 | University Health Network | Il-12 immunotherapy for cancer |
| CN101684472A (zh) * | 2008-09-26 | 2010-03-31 | 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 | 包含p53基因的重组融合蛋白和重组体及其用途 |
| CN103948944B (zh) * | 2013-05-20 | 2016-06-01 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 一种广谱抗肿瘤双质粒可复制型dna疫苗 |
| JP7246930B2 (ja) * | 2016-05-18 | 2023-03-28 | モデルナティエックス インコーポレイテッド | インターロイキン－１２（ｉｌ１２）をコードするポリヌクレオチドおよびその使用 |
| CN108250303B (zh) * | 2016-12-19 | 2023-01-03 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 单域抗体融合蛋白及其应用 |
| EA201990822A1 (ru) * | 2017-04-12 | 2020-01-09 | Эписентарикс, Инк. | Иммуномодулирующие слитые белки |
| CA3103372A1 (en) * | 2018-06-27 | 2020-01-02 | Precigen, Inc. | In vivo controlled combination therapy for treatment of cancer |
| US11642409B2 (en) * | 2019-06-26 | 2023-05-09 | Massachusetts Insttute of Technology | Immunomodulatory fusion protein-metal hydroxide complexes and methods thereof |
| CN114341164A (zh) * | 2019-07-24 | 2022-04-12 | 昆士兰医学研究所理事会 | 用于多瘤病毒的免疫疗法 |
| CN114401997A (zh) * | 2019-09-28 | 2022-04-26 | 奥美药业有限公司 | 细胞因子前药和双前药 |
| CN114350709A (zh) * | 2021-09-18 | 2022-04-15 | 梁亚龙 | 一种经修饰的溶瘤性腺病毒载体 |
-
2023
- 2023-05-04 CN CN202310493853.2A patent/CN116535491B/zh active Active
- 2023-05-04 CN CN202310493868.9A patent/CN116621966A/zh active Pending
- 2023-05-04 CN CN202310493206.1A patent/CN116621965A/zh active Pending
- 2023-05-06 WO PCT/CN2023/092440 patent/WO2023213320A1/zh unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116621965A (zh) | 2023-08-22 |
| WO2023213320A1 (zh) | 2023-11-09 |
| CN116535491A (zh) | 2023-08-04 |
| CN116535491B (zh) | 2024-03-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2689160C2 (ru) | Противораковая таргетная иммунотерапия с применением il-12 | |
| CN110256583B (zh) | 一种il-2突变体与抗体的融合蛋白及其应用 | |
| TW201930340A (zh) | 新抗原及其用途 | |
| TW202015719A (zh) | 新抗原及其用途 | |
| US10980859B2 (en) | In vivo individualized systemic immunotherapeutic method and device | |
| US20180128833A1 (en) | Methods of treating with tumor membrane vesicle-based immunotherapy and predicting therapeutic response thereto | |
| CN113773402B (zh) | 一种双靶点嵌合抗原受体、核酸分子、载体、细胞及药物组合物 | |
| US11786569B2 (en) | Expression of metabolic modulators in tumor microenvironment to improve tumor therapy | |
| CN103347514B (zh) | Fgfr1胞外域组合疗法 | |
| TW202146435A (zh) | 含有病原性抗原及免疫刺激物之組合物 | |
| US20140205609A1 (en) | Methods for inducing systemic immune responses to cancer | |
| JP2022512901A (ja) | Ｂ細胞を活性化するｃｄ７３抗体 | |
| JP6517175B2 (ja) | Ｂ７−１−ｐｅ４０ｋｄｅｌ外毒素融合遺伝子に基づくｄｎａワクチンおよびその使用 | |
| US20230287075A1 (en) | Dual cytokine fusion proteins comprising multi-subunit cytokines | |
| CN116621966A (zh) | 治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用 | |
| JP7412576B2 (ja) | 腎がんの相乗的治療におけるペグインターフェロンおよびプロトオンコジーン産物標的阻害剤の適用 | |
| WO2022040341A1 (en) | Abscopal therapy for cancer | |
| WO2020176880A1 (en) | Induction of highly efficacious anti-tumor and immune modulating activity: cell-free off the shelf therapeutic modality | |
| WO2023118411A1 (en) | Immunostimulatory mrna compositions and uses thereof | |
| CA3019999A1 (en) | Porous silicon microparticle-based cancer vaccines and methods for potentiating anti-tumoral immunity | |
| WO2020160409A1 (en) | Methods of treating cancer using a combination of tumor membrane vesicles and metformin | |
| CN113789347B (zh) | Fgl1/caix双靶点疫苗在治疗肾癌和肾癌肺转移中的应用 | |
| CN115804853A (zh) | 包含rna分子的组合物及其在制备瘤内注射剂中的用途 | |
| WO2023196988A1 (en) | Methods of use of mrnas encoding il-12 | |
| WO2023167973A1 (en) | Cancer vaccines and methods of use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40090392 Country of ref document: HK |