CN103948944B - 一种广谱抗肿瘤双质粒可复制型dna疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，其活性成分包括：以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤抗原复合基因的抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA，以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤血管复合基因的抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE。本发明为抗肿瘤主动免疫治提供一种新的选择，应用前景广阔。

Description

一种广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗。

背景技术

治疗性疫苗概述

治疗性肿瘤疫苗是防治恶性肿瘤术后复发转移的重要技术手段，近年来发展迅速，2010年PROVENGE⑧(sipuleucel-T)成为首个获得批准进入临床使用的细胞疫苗，用于治疗激素抵抗的转移性前列腺癌。继预防性疫苗之后，目前，治疗性疫苗在国际疫苗研究领域异军突起，已经成为国际生物技术药物开发的热点领域。治疗性疫苗可通过重新唤起机体对靶抗原的免疫应答能力，在已患病个体诱导特异性免疫应答，清除病原体或异常细胞，使疾病得以治疗。

DNA疫苗由于能够通过MHCⅠ类抗原递呈途径诱导细胞免疫，特别是能够诱导抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(cytotoxicityTlymphocyte，CTL)活性，被公认为是一种具有良好应用前景的免疫治疗方法，对研究治疗重大慢性疾病的新型治疗性疫苗药物极为有利。然而近期研究表明DNA疫苗在大动物模型和人体试验中治疗效果欠佳，有必要对传统DNA疫苗进行升级换代或免疫增效。

近年来，国际上逐步发展起一种新型基因疫苗载体系统，称为复制子DNA疫苗(即可复制型DNA疫苗)，将具有“自主复制”功能的RNA病毒复制元件置于DNA疫苗载体中构建而成。用于开发复制子载体的主要是单股正链RNA病毒(如甲病毒)，其中以塞姆利基森林病毒SemLikiForestvirus(SFV)的研究最为广泛。与传统DNA疫苗相比，可复制型DNA疫苗在安全性和高效性两个方面都有重要突破。复制子DNA疫苗不仅可以“自主复制”高水平表达外源基因，而且在自主复制过程中产生的双链RNA中间体还是高效的免疫佐剂(能够刺激细胞因子及分子伴侣产生)，可同时诱导全身免疫、粘膜免疫、抗体应答和CTL反应。此外，复制子DNA疫苗的自我复制和转录均在胞浆内完成，被转染细胞最后会发生凋亡，因此不会与宿主染色体发生整合。新型复制子DNA疫苗既克服了常规DNA疫苗免疫力低下、安全性不能保障的缺陷，又保留了DNA疫苗稳定、低成本、激发免疫反应全面的优点。

众所周知，术后复发和转移是目前恶性肿瘤治疗的关键性难题，抗肿瘤主动免疫治疗有望通过激活患者体内的细胞免疫及体液免疫反应，建立机体对肿瘤抗原的免疫记忆，防止肿瘤的复发与转移。当前，治疗性疫苗已经成为国际生物技术药物开发的热点领域，本发明的发明人前期以塞姆利基森林病毒SemLikiForestvirus(SFV)可复制型衍生的真核表达载体pSFV1为骨架，构建了可复制型DNA载体pSVK，与传统DNA疫苗相比，可复制型DNA疫苗具有表达更高效、应用更安全、成本更低廉的优势。

肿瘤血管生成概述

健康成人的脉管系统是非常稳定的，除了卵巢黄体中血管周期性生长和妊娠期的血管生长等少数情况外，罕见新生血管生成。肿瘤血管生成的概念由JudahFolkman于1971年首次提出，它是指内皮细胞在相关刺激血管生成信号传导的作用下由相对静止转为快速生长，从而由已存在的血管组织中产生新生血管组织的过程，这是一个细胞与细胞、细胞与基质之间相互作用的多步骤复杂过程，包括内皮细胞增殖、转移、分化、细胞外基质降解及基底膜形成。1996年，Hanahan等又提出了“血管生成开关(angiogenicswitch)”的概念，将肿瘤的生长分为血管前期和血管期：血管前期的肿瘤细胞主要依靠被动扩散从周围组织获取氧气及营养物质并运走代谢废物，如果没有新生血管长入，肿瘤细胞将处于休眠状态或发生凋亡，肿瘤组织生长的最大直径不会超过1-2mm；血管期，由于新生血管的生成满足了肿瘤组织进一步生长代谢的需要，从而使肿瘤细胞不断分裂增殖，并且成为肿瘤组织浸润侵袭、远处转移的第一路径。另有研究表明，除实体肿瘤外，血管生成在血液恶性肿瘤的发病机理中同样发挥了重要作用。因此“血管生成开关”是恶性肿瘤早期的关键事件。在缺氧、炎症、代谢性应激等刺激原作用下，促血管生成因子呈现出明显的优势，打破了与血管生成抑制因子之间的平衡状态，促使内皮细胞增殖和血管形成。主要的促血管生成因子有：血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)、酸性/碱性成纤维细胞生长因子(acid/basicfibroblastgrowthfactor，aFGF/bFGF)、转化生长因子(transforminggrowthfactor，TGF)、胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor，IGF)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)、血管生成素(angiogenesis)等；主要的血管生成抑制因子有：TNF-α、血管抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、白介素-12(interleukin-12)等。血管内皮生长因子(VEGF)是目前发现的最为强大专一的促进血管内皮细胞增殖的因子。

1、VEGF及其受体VEGFR

人VEGF家族包括VEGF-A(即通常所指的VEGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、胎盘生长因子(placentagrowthfactor，PLGF)以及内分泌腺来源的血管内皮生长因子(endocrinegland-derivedvascularendothelialgrowthfactor，EG-VEGF)，其中VEGF-A是VEGF家族中最重要的成员，它是由二硫键共价相连的同源二聚体所构成的糖蛋白，相对分子量约34-46×10³kD，序列高度保守，因其mRNA剪切不同产生6种亚型：VEGF₁₂₁、VEGF₁₄₅、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₃、VEGF₁₈₉和VEGF₂₀₆，其中VEGF₁₆₅亚型是最重要的单体，发挥促进内皮细胞增殖的作用。

VEGFR家族目前发现有5种，其中VEGFR₁(Flt-1)、VEGFR₂(KDR/Flk-1)、VEGFR₃(Flt-4)属于酪氨酸激酶受体(receptortyrosinekinases，RTKs)超家族，另外两种为Npn(neuropillin)-1及Npn-2。VEGFR是VEGF生物信号传导级联通路的门户，VEGF与之结合后使其二聚体化，进一步激活受体酪氨酸激酶导致其自身磷酸化，受体自身磷酸化启动了下游通路(包括一系列第二信使的激活)。VEGFR₂由1356个氨基酸构成，与RTK家族其它成员一样，具有4个结构区域：细胞外7个免疫球蛋白样配体结合域，1个跨膜区域，膜内酪氨酸激酶区域及下游羧基末端区域。研究表明，第3个Ig样结构域对于配体结合起关键作用，第2和4个结构域能够调节配体结合速率，第5和6个结构域对于配体结合到受体后的固定是必须的，第1个Ig样结构域可能参与调控配体的结合。VEGFR₁主要是在胚胎发生过程中诱导VEGF-A与VEGFR₂结合，发挥其促血管生成作用；VEGFR₃信号通路主要参与调控淋巴管形成；VEGF/VEGFR₂信号通路是生理性及病理性血管生成最重要的限速步骤，对肿瘤的血管生成至关重要。因此，VEGF及VEGFR₂不仅是目前临床中各种抗肿瘤血管靶向治疗最主要的靶位，而且也是肿瘤学基础研究领域中的热点。

2、以VEGF/VEGFR₂为靶位的抗肿瘤血管生成主动免疫治疗

自2003年贝伐单抗(Bevacizumab)被FDA批准治疗结直肠癌以来，至今已有多种抗血管生成单克隆抗体被证实具有抗肿瘤的临床疗效，但这些药物不仅费用高昂，而且抗血管能力有限、血浆半衰期短，临床治疗经常需要大剂量长期静脉给药，由此带来较多毒副反应，使患者需要住院治疗及特殊护理，这些都给患者及医疗体系带来巨大的经济负担。随着分子免疫学及肿瘤免疫学的迅猛发展，肿瘤治疗性疫苗因其特异性高、针对性强且毒副作用小等特点，已经成为恶性肿瘤主动免疫治疗发展的重要方向，特别是以VEGF/VEGFR₂为靶位的抗肿瘤血管生成主动免疫治疗取得了令人鼓舞的研究进展。

经过多年的失败与努力，第一个肿瘤治疗性疫苗PROVENGE已经于2012年在美国由FDA批准上市用于治疗前列腺癌(CheeverMA,HiganoCS.PROVENGE(Sipuleucel-T)inprostatecancer:thefirstFDA-approvedtherapeuticcancervaccine.ClinCancerRes,2011,17:3520-3526.)，很多其它种类的肿瘤治疗性疫苗也处在不同的研究阶段，这些治疗性疫苗都是以肿瘤相关抗原(tumor-associatedantigens，TAA)为靶位的，而抗肿瘤血管生成主动免疫治疗攻击的是肿瘤组织中基因相对稳定且容易到达的血管系统，以内皮细胞中过表达的各种抗原为靶位，可以克服长期以来各种单纯攻击肿瘤细胞治疗的局限性，如肿瘤细胞的异质性、MHC抗原丢失、细胞水平上的免疫抑制及免疫逃避、以及血脑屏障等生理屏障的阻碍等，因此，抗肿瘤血管生成主动免疫治疗作为一种崭新的抗肿瘤治疗策略，呈现出诱人的前景。但是，抗肿瘤血管生成主动免疫治疗仍然存在以下一些不足:①肿瘤组织可能利用其它非VEGF信号通路诱导新生血管形成或利用血管生成拟态(即肿瘤细胞模拟并取代内皮细胞形成管腔样的结构)继续得到血供。②抗肿瘤血管生成治疗理论上只能抑制肿瘤组织生长，单纯的抗血管生成并不能彻底根除肿瘤细胞。大量研究也表明，抗血管生成治疗与传统治疗联合应用时会发挥更强的抗肿瘤作用。③抗血管生成治疗可能会引起高血压、心血管栓塞等不良反应，对正常伤口的愈合以及女性月经周期的变化也会产生一定的影响。总之，抗血管生成主动免疫治疗这一领域将来的发展有待于克服上述各种不足，有望为肿瘤患者提供一种崭新的治疗选择。

发明内容

本发明针对恶性肿瘤治疗中的核心难题“免疫耐受”，基于自主研发的复制子DNA疫苗载体pSVK，开展了系统性的免疫增效策略研究，并成功构建了一种新型的广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗。

本发明所提供的广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗的活性成分包括以下组分：

1)以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤抗原复合基因(CAVA)的抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗，命名为pSVK-CAVA，所述肿瘤抗原复合基因(CAVA)自5’端至3’端依次由凋亡抑制蛋白Survivin肿瘤抗原(SUR)基因、异位人绒毛膜促性腺激素hCGβ-CTP37(hmCTP)基因、人IgGFc段基因(GenBank号：Z17370)、GPI基因(GenBank号：XM676434)、IRES序列、GM-CSF基因(GenBank号：NM-000758)和B7.1基因(GenBank号：NM-005191)构成，肿瘤抗原复合基因(CAVA)的结构如图1所示；

2)以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤血管复合基因(CAVE)的抗肿瘤血管复制子DNA疫苗，命名为pSVK-CAVE，所述肿瘤血管复合基因(CAVE)自5’端至3’端依次由异种化的小鼠VEGFR2胞外1-4IgG样区域(肿瘤血管靶抗原)基因、人IgGFc段(GenBank号：Z17370)基因、GPI基因(GenBank号：XM676434)、IRES序列和人IL-12基因的p35亚基(GenBank号：GI24430218)和p40亚基(GenBank号：GI24497437)构成，肿瘤血管复合基因(CAVE)的结构如图2所示。

所述复制子DNA疫苗载体pSVK的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

所述肿瘤抗原复合蛋白(CAVA)的氨基酸序列如序列表中序列2(939aa)所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列3(3752bp)所示，抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA的核苷酸序列如序列表中序列4(14748bp)所示；

序列表中序列2由939个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1-91位氨基酸残基为凋亡抑制蛋白Survivin肿瘤抗原(SUR)，自氨基端第92-169位氨基酸残基为异位人绒毛膜促性腺激素hCGβ-CTP37(hmCTP)，自氨基端第170-499位氨基酸残基为人IgGFc段，自氨基端第500-533位氨基酸残基为GPI，自氨基端第534-677位氨基酸残基为GM-CSF，自氨基端第678-939位氨基酸残基为B7.1；

序列表中序列3由3752个碱基组成，自5’端第1-273位碱基编码凋亡抑制蛋白Survivin肿瘤抗原(SUR)基因，自5’端第274-507位碱基编码异位人绒毛膜促性腺激素hCGβ-CTP37(hmCTP)基因，自5’端第508-1774位碱基编码人IgGFc段，自5’端第1775-1901位碱基编码GPI融合基因，自5’端第1902-2549位碱基为IRES序列，自5’端第2550-2978位碱基编码GM-CSF基因，自5’端第2979-3752位碱基编码B7.1基因；

序列表中序列4由14748个碱基组成，自5’端第7484-11235位碱基编码CAVA基因，其余部分为pSVK载体序列。

所述肿瘤血管复合蛋白(CAVE)的氨基酸残基序列如序列表中序列5(1341aa)所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列6(4876bp)所示，抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE的核苷酸序列如序列表中序列7(15986bp)所示；

序列表中序列5由1341个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1-416位氨基酸残基为小鼠VEGFR2胞外1-4IgG样区域(肿瘤血管靶抗原)，自氨基端第417-746位氨基酸残基为人IgGFc段，自氨基端第747-780位氨基酸残基为GPI，自氨基端第781-1341位氨基酸残基为人IL-12(包含p35和p40两个亚基)；

序列表中序列6由4876个碱基组成，自5’端第1-1248位碱基编码小鼠VEGFR2胞外1-4IgG样区域(肿瘤血管靶抗原)基因，自5’端第1249-2490位碱基编码人IgGFc段，自5’端第2491-2617位碱基编码GPI基因，自5’端第2618-3194位碱基为IRES序列，自5’端第3195-4876位碱基编码人IL-12(包含p35和p40两个亚基)基因；

序列表中序列7由15986个碱基组成，自5’端第7484-12458位碱基编码CAVE基因，其余部分为pSVK载体序列。

本发明的双质粒可复制型DNA疫苗可采用电穿孔肌肉内注射的方式进行免疫，免疫剂量一般为1-100μg(pSVK-CAVA1-100μg，pSVK-CAVE1-100μg，pSVK-CAVA与pSVK-CAVE的注射剂量比例为1：1)/kg，疗程为1-6个月。免疫剂量和疗程可根据实际情况进行调整。

本发明提供了一种广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，其活性成分是选择在多种实体肿瘤中广泛表达的两种肿瘤抗原hCG和Survivin，并选择与肿瘤血管新生关系密切的靶点VEGFR2，利用异种化抗原设计技术，配合多种免疫增效策略，可以有效打破肿瘤自身抗原的免疫耐受，激活高效的细胞免疫和体液免疫反应。通过预防模型免疫动物实验验证了pSVK-CAVA与pSVK-CAVE联合应用的抗肿瘤疗效，实验结果表明联合应用两种可复制型DNA疫苗pSVK-CAVA及pSVK-CAVE与单独应用及空白对照组相比，在小鼠体内可以诱导产生更强的特异性细胞和体液免疫反应，能够抑制移植瘤的生长，通过这两种疫苗的联合应用实现了：①直接攻击瘤细胞本身，抑制和清除术后残存的肿瘤细胞；②遏制肿瘤新生血管生成，使肿瘤生长缺乏足够的营养供应；③最终依靠激发的双重免疫反应，实现彻底控制肿瘤、并保持长期不复发状态，提高恶性肿瘤的临床治愈率。本发明通过构建新型双质粒可复制型抗肿瘤DNA疫苗，实现了特异性肿瘤抗原异种化改造、加强抗原递呈能力、分子内佐剂协同增效、高效诱导细胞免疫，有望打破恶性肿瘤治疗中“免疫耐受”这一核心难题，为抗肿瘤主动免疫治提供一种新的选择，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为肿瘤抗原复合基因的构成示意图

图2为肿瘤血管复合基因的构成示意图

图3为复制子DNA疫苗载体pSVK的物理图谱

图4为抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA的物理图谱

图5为携带肿瘤血管复合基因的重组质粒pVAX1-CAVE的物理图谱

图6为经酶切、纯化获得的pSVK载体及肿瘤血管复合基因目的片段的电泳检测结果

图7为pSVK-CAVE菌液的PCR鉴定结果

图8为抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE的物理图谱

图9为各组免疫小鼠皮下移植瘤成瘤时间

图10为各组小鼠体内移植瘤的生长曲线

图11为手术剥离各组小鼠肿瘤的离体瘤重

图12为皮下移植瘤攻击后各组小鼠的存活时间

图13为ELISA法检测免疫小鼠血清中的特异抗体的OD₄₅₀值

图14为ELISA检测各组小鼠血清中抗体与人VEGFR2交叉免疫反应OD450nm值

图15为免疫后各组小鼠IFN-γ分泌水平的ELISPOT检测结果

图16为小鼠皮下移植海藻酸盐包裹Renca肿瘤细胞颗粒表面毛细血管生成情况

图17为海藻酸盐包裹Renca肿瘤细胞颗粒表面毛细血管含血量检测结果

图18为免疫后小鼠肿瘤组织中毛细血管密度病理切片及免疫组化染色检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物由大连宝生物公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、制备广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗

本发明广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗的活性成分为抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA和抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE，具体构建方法如下：

一、构建抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA

以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤抗原复合基因(CAVA)的抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA。

其中，肿瘤抗原复合基因(CAVA)自5’端至3’端依次由凋亡抑制蛋白Survivin肿瘤抗原(SUR)基因、异位人绒毛膜促性腺激素hCGβ-CTP37(hmCTP)基因、人IgGFc段基因(GenBank号：Z17370)、GPI基因(GenBank号：XM676434)、IRES序列、GM-CSF基因(GenBank号：NM-000758)和B7.1基因(GenBank号：NM-005191)组成，肿瘤抗原复合基因的结构如图1所示。

抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA具体构建方法包括以下步骤：

1、构建复制子DNA疫苗载体pSVK

1.1构建携带PS与KANA融合基因(PS-KANA)的重组载体pUC19-PS-KANA

重组载体pUC19-PS-KANA的构建方法如下：

1)扩增PS基因：以含有氨苄青霉素抗性基因的复制子DNA疫苗载体pSCA1(构建方法参见文献YuYZ,SunZW,YuWY.ChineseJournalofBiotechnology,2005,21(5):33-38)为模板，在引物PSCA-F(5’-CCGTCTAGAGATCATAATCAGCCAT-3’)和PSCA-R(5’-CCGGCATGCCTCGAGACTAGTCTGTCAGACCAAG-3’)的引导下PCR扩增氨苄青霉素抗性基因的旁侧序列，所述5’端旁侧序列含有限制性内切酶XbaI识别位点，所述3’端旁侧序列含有限制性内切酶SphI识别位点；PCR反应体系为：10×PCR缓冲液10μl，MgCl₂(2.5mM)10μl，dNTPs混合物(2.5mM)8μl，合成引物(20μM)PSCA-F和PSCA-R各2μl，TaqDNA聚合酶(5U/μl)2μl，加去离子水至100μl；PCR反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃继续延伸10min；反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明经PCR扩增获得了全长1273bp的基因片段，回收并纯化该基因片段，测序，测序结果表明该基因片段的核苷酸与预期结果相符，将该基因片段命名为PS基因。然后，将PS基因用限制性内切酶XbaI和SphI进行双酶切后，与同样经XbaI和SphI双酶切的载体pUC19连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经浓度50μg/mL的氨苄青霉素抗性筛选，挑选阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定，鉴定结果表明用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带PS基因的重组载体，命名为pUC19-PS。

2)获得PS与KANA融合基因(PS-KANA)：以含有卡那霉素抗性基因的载体pVAX1(购自Invitrogen公司)为模板，在引物KANA-F(5’-CCGACTAGTATGATTGAACAAG-3’)和KANA-R(5’-CCGCTCGAGTCAGAAGAACTCGTC-3’)的引导下PCR扩增5’端携带限制性内切酶SpeI识别位点、3’端携带限制性内切酶XhoI识别位点的卡那霉素抗性基因；PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μl，MgCl₂(2.5mM)5μl，dNTPs混合物(2.5mM)4μl，合成引物(20μM)KANA-F和KANA-R各1μl，TaqDNA聚合酶(5U/μl)1μl，加去离子水至50μl；PCR反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃继续延伸10min；反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明经PCR扩增获得了全长795bp的基因片段，回收并纯化该基因片段，测序，测序结果表明该基因片段的核苷酸序列与预期结果相符，将该基因片段命名为KANA；然后将KANA基因用限制性内切酶SpeI和XhoI进行双酶切后，与同样经SpeI和XhoI双酶切的重组载体pUC19-PS(步骤1)得到)连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经浓度50μg/mL的氨苄青霉素抗性筛选，挑选阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定；鉴定结果表明用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带PS与KANA融合基因(PS-KANA)的重组载体，命名为pUC19-PS-KANA。

1.2获得复制子DNA疫苗载体pSVK

延续上述步骤，将复制子DNA载体pSCA1(以载体pSFV1为骨架，用CMVIE启动子替换SP6启动子，并在3’UTR下游插入BGH转录终止子，构建基于DNA的复制子载体pSCA1，使得在多克隆位点插入外源基因而构建的质粒DNA可直接转染细胞，无需体外转录RNA的繁琐操作[YuYZ,SunZW,YuWY.ChineseJournalofBiotechnology,2005,21(5):33-38])中的氨苄青霉素基因置换为卡那霉素基因，得到复制子DNA疫苗载体pSVK，进行以下步骤：

3)抗性基因置换：具体方法为：将载体pSCA1先用SphI单酶切，回收并纯化后在DNA聚合酶I(Klenow)的作用下，将酶切后产生的粘性末端补平后回收、纯化，再用SpeI进行单酶切并回收、纯化后作为目的载体(该目的载体的一端为平末端，另一端则是粘性末端SpeI)，经过该步操作载体pSCA1中的氨苄抗性基因及其旁侧序列已被酶切去除；将步骤2)得到的重组载体pUC19-PS-KANA先用HindⅢ单酶切，回收并纯化后在DNA聚合酶I(Klenow)的作用下，将酶切后产生的粘性末端补平后回收、纯化，然后再用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理，最后再用XbaI单酶切，回收并纯化2100bp的DNA片段(该DNA片段的一端为平末端，另一端为粘性末端XbaI)，该步酶切回收的DNA片段主要包含有pSCA1载体中氨苄抗性基因的旁侧序列与KANA抗性基因的融合基因即PS-KANA；利用SpeI和XbaI属于同尾酶的特性，将回收并纯化的目的载体和DNA片段连接，经该步操作，PS-KANA融合基因被连入载体pSCA1中原氨苄基因及其旁侧序列所在位置，实现了pSCA1载体中抗性基因的置换；

将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行抗性筛选，筛选结果表明连接产物转化入大肠杆菌DH5α中后在氨苄青霉素抗性的LB平板中不再生长，而在含有卡那霉素抗性的LB平板中生长良好，表明复制子DNA疫苗载体pSCA1中的氨苄青霉素基因被成功置换为卡那霉素基因；再进行PCR和酶切鉴定。

鉴定结果表明：用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带卡那霉素抗性基因的复制子DAN疫苗载体，命名为pSVK，测序结果表明pSVK的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其物理图谱如图3所示。

2、抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA(又称PSCK-2PFcGB)的构建

抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗命名为pSVK-CAVA(又称PSCK-2PFcGB)的构建方法参见博士论文：《新型可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的抑瘤活性及免疫学机制研究》，张亮，中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑，2012年第7期，公开日期，20120710。其中肿瘤抗原复合基因CAVA的氨基酸序列如序列表中序列2所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示，抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA的核苷酸序列如序列表中序列4所示，其物理图谱如图4所示。

序列表中序列2由939个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1-91位氨基酸残基为凋亡抑制蛋白Survivin肿瘤抗原(SUR)，自氨基端第92-169位氨基酸残基为异位人绒毛膜促性腺激素hCGβ-CTP37(hmCTP)，自氨基端第170-499位氨基酸残基为人IgGFc段，自氨基端第500-533位氨基酸残基为GPI，自氨基端第534-677位氨基酸残基为GM-CSF，自氨基端第678-939位氨基酸残基为B7.1；

序列表中序列3由3752个碱基组成，自5’端第1-273位碱基编码凋亡抑制蛋白Survivin肿瘤抗原(SUR)基因，自5’端第274-507位碱基编码异位人绒毛膜促性腺激素hCGβ-CTP37(hmCTP)基因，自5’端第508-1774位碱基编码人IgGFc段，自5’端第1775-1901位碱基编码GPI融合基因，自5’端第1902-2549位碱基为IRES序列，自5’端第2550-2978位碱基编码GM-CSF基因，自5’端第2979-3752位碱基编码B7.1基因；

序列表中序列4由14748个碱基组成，自5’端第7484-11235位碱基编码CAVA基因,其余部分为pSVK载体序列。

二、构建抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE

以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤血管复合基因(CAVE)的抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE。

肿瘤血管复合基因(CAVE)自5’端至3’端依次由异种化的小鼠VEGFR2胞外1-4IgG样区域(肿瘤血管靶抗原)基因、人IgGFc段(GenBank号：Z17370)基因、GPI基因(GenBank号：XM676434)、IRES序列和人IL-12p35亚基(GenBank号：GI24430218)和p40亚基(GenBank号：GI24497437)基因组成，肿瘤血管复合基因(CAVE)的结构如图2所示。

抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE具体构建方法包括以下步骤：

1、构建复制子DNA疫苗载体pSVK

与步骤一中内容相同。

2、构建重组质粒pVAX1-mVEGFR_2(1-4)FchIL12(简称pVAX1-CAVE)

携带肿瘤血管复合基因的重组质粒pVAX1-CAVE的构建方法参见硕士论文：《免疫增效型广谱抗肿瘤血管生成基因疫苗的基础研究》，王伟，公开日期2010年5月，其物理图谱如图5所示。

3、抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE的构建

3.1pSVK及pVAX1-CAVE质粒的转化

将质粒pVAX1-CAVE和pSVK分别转化E.coli.DH5α感受态大肠杆菌，具体操作步骤如下：

a.从-70℃冰箱取2支感受态E.coli.DH5α，立即置于冰浴中，分别加入上述质粒各1μl，轻柔混匀后于4℃冰箱中冰浴30min；

b.冰浴结束后，将上述感受态细胞转移至42℃水浴锅中热休克90s；

c.热休克结束后，将感受态细胞重新放置在冰浴中静置1-2min；

d.取转化后的菌体分别均匀涂布于含10μg/mL(pSVK)、50μg/mL(pVAX1-CAVE)卡那霉素抗性的LB平板培养基上，37℃培养箱中倒置培养约12h；

e.培养结束后，挑取单一克隆菌落，分别接种于含有上述卡那霉素抗性的LB液体培养基中，置于37℃摇床中振荡培养过夜(10-12小时)。

3.2pSVK及pVAX1-CAVE质粒的小量提取

按照北京三博远志生物技术有限责任公司质粒小量提取试剂盒抽提这两种质粒，具体操作步骤参见质粒小量提取试剂盒说明书。

3.3pSVK载体的酶切、纯化

首先利用限制性内切酶SmaI对pSVK载体进行单酶切，使环状质粒线性化，获得拥有两个平端的线性化的pSVK载体，酶切体系如下：

然后，37℃水浴反应4小时，将酶切产物按照北京三博远志生物技术有限责任公司DNA纯化试剂盒操作说明进行纯化回收。

3.4肿瘤血管复合基因片段的获得

首先，用限制性内切酶NheI对pVAX1-CAVE重组质粒单酶切，酶切体系如下：

37℃水浴反应4小时后，将酶切产物按照3.3的方法进行纯化回收，得到了具有两个粘端的线性化的pVAX1-CAVE片段；

然后，利用Klenow大片段对线性化的pVAX1-CAVE的两个NheI单切后的粘性末端进行补平，补平体系如下：

37℃水浴反应90min，加入1mol/LEDTA1μl后72℃水浴15min灭活Klenow，将补平产物按照3.3的方法进行纯化回收，得到补平的线性化pVAX1-CAVE；

随后，利用限制性内切酶PmeⅠ(为平端酶)对补平后线性化的pVAX1-CAVE片段进行单酶切，酶切体系如下：

37℃水浴反应4小时后，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后，按照北京三博远志生物技术有限责任公司琼脂糖凝胶纯化试剂盒操作说明对大小约为5000bp的肿瘤血管复合基因片段进行切胶回收，具体步骤如下参见琼脂糖凝胶纯化试剂盒说明书。

3.5pSVK载体与肿瘤血管复合基因片段的连接及转化

将3.3与3.4中得到的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图6(M：DNAMarkerDL5000；1：肿瘤血管复合基因片段(约5100bp)；2：pSVK载体(约11000bp))所示，分别为具有两个平端的pSVK载体与酶切补平后两端也均为平端的肿瘤血管复合基因片段进行连接，连接体系如下：

16℃反应4h后，将连接产物转化至E.coli.DH5α感受态大肠杆菌中，菌体均匀涂布于含10μg/mL卡那霉素抗性的LB平板培养基上，37℃培养箱中倒置培养约12h，得到连接产物单一菌落培养菌液。

3.6重组质粒pSVK-CAVE的鉴定

3.6.1菌落PCR法鉴定

用移液器吸取1μl过夜培养的连接产物单一菌落培养菌液，100倍稀释后作为模板进行菌落PCR鉴定。由于肿瘤血管复合基因片段与pSVK载体是平端连接，故可能存在上下游正反向连接的问题，为了鉴定出正向连接的阳性克隆，在该重组质粒PCR鉴定引物的设计上，挑选了融合抗原片段(GM/B7.1)上的一部分序列及pSVK载体下游的一部分序列作为扩增对象，如果片段是正向连接即可扩增出13O0bp大小的DNA片段，如果反向连接，则不能扩增出任何片段。PCR鉴定引物如下：

上游：2pfcGB-F2:GATCCTGAAACTGAGCTCTATGCTGTTAGC(GC％＝46.67)

下游：2pfcGB-R2:CAATTGCGCAGGTCTTGTTGCG(GC％＝54.55)

PCR鉴定体系如下：

PCR扩增条件为：95℃预变性3min；循环参数(94℃变性45s，56℃退火45s、72℃延伸45s)，共30个循环；最后72℃继续延伸5min。

重组质粒pSVK-CAVE的PCR鉴定结果如图7(M：DNAMarkerDL2000；1-15:分别代表1-15号连接产物单一菌落培养菌液PCR产物)所示，经菌落PCR扩增，9号菌落的菌液PCR扩增出了13OObp的DNA片段，与预期结果相符。再提质粒，对其进行测序，测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的携带肿瘤血管复合基因的抗肿瘤血管的复制子DNA疫苗pSVK-CAVE，其物理图谱如图8所示，其中肿瘤血管复合基因CAVE的氨基酸残基序列如序列表中序列5所示，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示，抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE的核苷酸序列如序列表中序列7所示。

序列表中序列5由1341个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1-416位氨基酸残基为小鼠VEGFR2胞外1-4IgG样区域(肿瘤血管靶抗原)，自氨基端第417-746位氨基酸残基为人IgGFc段，自氨基端第747-780位氨基酸残基为GPI，自氨基端第781-1341位氨基酸残基为人IL-12(包含p35和p40两个亚基)；

序列表中序列6由4876个碱基组成，自5’端第1-1248位碱基编码小鼠VEGFR2胞外1-4IgG样区域(肿瘤血管靶抗原)基因，自5’端第1249-2490位碱基编码人IgGFc段，自5’端第2491-2617位碱基编码GPI基因，自5’端第2618-3194位碱基为IRES序列，自5’端第3195-4876位碱基编码人IL-12(包含p35和p40两个亚基)基因；

序列表中序列7由15986个碱基组成，自5’端第7484-12458位碱基编码CAVE基因,其余部分为pSVK载体序列。

实施例2、可复制型抗肿瘤DNA疫苗pSVK-CAVA与pSVK-CAVE联合应用的抑瘤活性及免疫学作用机制研究

一、检测可复制型抗肿瘤DNA疫苗pSVK-CAVA与pSVK-CAVE联合应用的抑瘤活性

1、实验方案

1.1实验动物分组

6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)随机分为5组，每组15只，5只进行肿瘤生长形态学观察、5只进行生存率观察、5只进行抑瘤功能免疫学作用机制检测。A组为pSVK-CAVA与pSVK-CAVE联合应用组；B组为pSVK-CAVA单独对照组；C组为pSVK-CAVE单独对照组；D组为pSVK空载体对照组；E组为PBS对照组。

1.2C57BL/6小鼠的免疫策略：

C57BL/6小鼠在进行移植瘤攻击前每隔7天，连续4次进行疫苗接种，免疫采用股四头肌肌肉注射并同时进行电脉冲刺激的方式进行，A组注射相应的两种DNA质粒各10μg/50μL/只，B、C、D组分别注射相应DNA质粒10μg/100μL/只，E组注射100μLPBS，在注射后约3min，用BTX公司活体基因电转仪ECM830在注射部位进行多点电刺激，电穿孔刺激的条件为：60V/cm，50ms，1Hz×6次。

1.3皮下移植瘤攻击方案：

在末次免疫后3天进行移植瘤攻击。收取对数生长期的B16-hCGβ单克隆细胞(博士论文：《新型可复制型抗肿瘤DNA疫苗PSCK-2PFcGB的抑瘤活性及免疫学机制研究》，张亮，中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑，2012年第7期，公开日期，20120710)，PBS洗涤2次后制备单细胞悬液，调整细胞浓度分别至7.5×10⁵个/mL，于末次免疫后3天在小鼠背部右侧皮下接种7.5×10⁴个/100μL/只细胞悬液。在移植瘤攻击后30-35天断颈处死每组5只小鼠，手术剥取肿瘤组织并记录各种数据。

1.4DNA疫苗抑瘤活性观察

皮下移植瘤攻击后，观察小鼠体内肿瘤的生长情况。可触及肿瘤结节时，记录各组小鼠的成瘤时间；接着每间隔一天用游标卡尺测量并记录移植瘤的垂直长径和垂直短径，依照公式计算移植瘤体积，绘制小鼠体内移植瘤的生长曲线；待移植瘤生长至30天时，断颈处死每组各5只小鼠，手术剥取肿瘤组织并称取瘤重，依照公式计算肿瘤的抑制率，计算公式如下：

肿瘤体积(mm³)＝0.5×垂直长径×(垂直短径)²；

皮下移植瘤攻击后，观察小鼠体内肿瘤的生长情况，记录各组荷瘤小鼠的生存时间。

1.5统计学处理

应用SPSS17.0软件包进行统计分析，各免疫组小鼠成瘤时间和离体肿瘤体积、重量的比较采用完全随机的单因素方差分析(onewayANOVA)，两组样本之间的数据差异进行t检验(Student’st-test)，多组之间的数据差异选择卡方检验，生长曲线采用对数秩检验(log-ranktest)，生存时间曲线采用Kaplan–Meier法进行统计，以P<0.05作为统计学差异显著性标准，P<0.01作为统计学差异非常显著的标准。

2、实验结果

2.1免疫小鼠移植瘤形成时间

末次免疫后3d后，对各组C57BL/6小鼠进行皮下移植瘤攻击，以能明确触及到肿瘤为各只小鼠成瘤的时间，记录各组小鼠的移植瘤成瘤时间。

结果如图9所示，可以看出，各免疫组间存在不同程度的差别，空载体组和PBS组的成瘤时间最早，接种后第11天可触及肿瘤，第14天小鼠全部成瘤；pSVK-CAVA组与pSVK-CAVE组11天可触及肿瘤，20天全部成瘤，pSVK-CAVA和pSVK-CAVE联合应用组第17天可触及肿瘤，第29天7只小鼠成瘤，3只小鼠实验结束未成瘤。

2.2免疫小鼠的皮下移植瘤生长

从小鼠皮下移植瘤攻击后开始至颈椎脱臼法处死小鼠的40天，每隔一天用游标卡尺测量一次肿瘤的垂直长径和垂直短径，并通过公式计算每组小鼠体内肿瘤的平均体积，绘制其肿瘤生长曲线。对每次测量的结果进行统计学分析。各组肿瘤生长曲线如图10所示，从第26天开始，pSVK-CAVA和pSVK-CAVE联合应用组及单独应用组小鼠皮下的移植瘤体积与pSVK空载体及PBS组之间存在显著性差异(P<0.05)，且联合应用组较单独应用组间也存在显著差异(P<0.05)，单独应用组间的差异不大。对肿瘤生长曲线进行线性回归并对其斜率做t检验，可见疫苗pSVK-CAVA与pSVK-CAVE免疫小鼠后肿瘤生长受到了抑制，且以pSVK-CAVA和pSVK-CAVE联合应用组的效果更为显著。

2.3疫苗免疫对荷瘤小鼠皮下移植瘤生长的抑制作用

皮下移植瘤攻击后，颈椎脱臼法处死每组小鼠，轻柔剥取肿瘤组织，拍照并称量各组瘤重。结果如图11所示，单独应用疫苗组及联合应用疫苗组的平均瘤重较空载体及PBS组存在显著性差异(P＜0.01)，联合应用组较单独应用抑制肿瘤生长效果更为显著(P＜0.01)；根据公式计算各组疫苗对肿瘤的抑制率，计算公式如下：肿瘤抑制率(％)＝(对照组平均瘤重－免疫组平均瘤重)/对照组平均瘤重。

2.4皮下移植瘤攻击后小鼠的存活情况

皮下移植瘤攻击后观察各组小鼠的存活情况，结果如图12所示，可以看出，pSVK组及PBS组小鼠在40天左右出现死亡，pSVK-CAVA与pSVK-CAVE疫苗单独应用组在50天左右出现死亡，而pSVK-CAVA和pSVK-CAVE联合应用组在55天后出现死亡；pSVK-CAVA和pSVK-CAVE联合应用组肿瘤攻击后60天仍有80％存活，而其余四组的生存率均已降至50％以下，pSVK-CAVA和pSVK-CAVE联合应用组小鼠的生存率与其余各组相比存在显著性差异(P＜0.05)。

二、可复制型抗肿瘤DNA疫苗pSVK-CAVA与pSVK-CAVE联合应用产生的抗肿瘤效应的免疫学作用机制研究

通过检测免疫后各组小鼠体内免疫学指标，对可复制型抗肿瘤DNA疫苗pSVK-CAVA与pSVK-CAVE联合应用发挥抗肿瘤效应可能的机制进行初步的研究，具体检测如下：

2.1.1ELISA法检测免疫小鼠血清中的特异抗体

末次免疫后对各组3只小鼠第14天(2w)、28天(4w)，通过小鼠眼眶静脉取血，室温放置3h后，4℃、3000rpm离心10min，取上层血清分装，-70℃保存备用。分别用纯化的经原核表达的融合蛋白mVEGFR2D1-4/GST(王伟，殷小涛，李云奇，田仁礼，阎瑾琦，高江平，于继云.小鼠VEGFR2胞外1-4IgG样结构域的原核表达、纯化及活性鉴定.南方医科大学学报.2013(1)，其氨基酸序列如序列表中序列8所示)、β-hcg/GST(其氨基酸残基序列如序列表中序列9所示)；Survivin/GST(其氨基酸残基序列如序列表中序列10所示)包被ELISA板，检测免疫小鼠血清中特异的抗体，具体操作方法如下：

a.包被：将纯化的融合蛋白用包被液稀释至终浓度为2.0μg/mL，100μL/孔包被ELISA板即mPSCA蛋白200ng/孔，同时用BSA100ng/孔作为阴性对照包被酶联板，4℃静置包被10-12小时；

b.洗涤：将ELISA板孔中包被液扣出，用PBST洗涤5次，每次放到脱色摇床中轻微振荡1min，在吸水纸上扣干；

c.封闭：用3％BSA-PBS100μL/孔，37℃封闭2h后弃去封闭液，PBST洗板5次，在吸水纸上扣干；

d.检测：将各组小鼠血清样品用PBS稀释200倍后依次加入酶联板，100μl/孔，37℃孵育1h；

e.二抗标记：PBST洗板5次后吸水纸上扣干，加入1：5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1h；

f.显色：PBST洗5次后吸水纸上扣干，加入TMB显色液100μL，37℃显色15min，加入1MH₂SO₄100μL/孔终止反应；

g.测OD值：酶联仪检测450nm的OD值。

结果如图13所示，可以看出，疫苗免疫组抗体显著高于不含抗原成分的对照组pSVK组及PBS组(P＜0.01)，免疫4w后血清抗体含量较2w有所下降，检测到mVEGFR2D1-4/GST抗体，说明小鼠经疫苗pSVK-CAVE免疫后产生了针对肿瘤新生血管抗原VEGFR₂的抗体；检测到β-hcg/GST抗体，说明小鼠经疫苗pSVK-CAVA免疫后产生了针对肿瘤广谱抗原hCG的抗体；检测到Survivin/GST抗体，说明小鼠经疫苗pSVK-CAVA免疫后产生了针对肿瘤广谱抗原Survivin的抗体。

2.1.2ELISA检测免疫后小鼠血清抗体与人VEGFR2产生的交叉免疫反应

用经表达纯化的sKDR/GST融合蛋白(其氨基酸残基序列如序列表中序列11所示)包被ELISA板，检测血清中抗体与sKDR/GST交叉免疫反应，测量各组血清OD值。实pSVK-CAVE疫苗免疫小鼠后，在血清中产生的特异性anti-mouseVEGFR2抗体能够与人VEGFR2(sKDR)产生交叉免疫反应，结果参见图14所示，可以看出，小鼠经疫苗pSVK-CAVE免疫后产生的针对肿瘤新生血管抗原VEGFR₂的抗体，与人VEGFR2(sKDR)能够产生交叉免疫反应，且疫苗免疫组抗体显著高于pSVK及PBS对照组(P＜0.01)，免疫4w后血清抗体含量较2w有所下降。因此可以推断，该疫苗应用于人体后，可通过其异种化抗原优势诱导人体产生特异性抗体，攻击内皮细胞表面的VEGFR2受体，抑制肿瘤血管生成，免疫4w后血清抗体含量较2w有所下降。

2.2ELISPOT法检测免疫小鼠脾细胞特异IFN-γ的分泌水平

2.2.1分离免疫小鼠脾脏淋巴细胞悬液

a.在末次免疫后第2周，断颈处死各组免疫后小鼠，浸泡于75％乙醇中5min后放入紫外线照射消毒过的超净台内；

b.无菌条件下手术取出小鼠脾脏，将脾脏剪碎后置入200目细胞筛中，接着将细胞筛放入无血清的1640培养基的平皿中，用研磨棒尽量将脾研磨均匀；

c.用无血清的1640培养基轻轻将细胞筛中的淋巴细胞冲出；

d.将5mL小鼠淋巴细胞分离液加入到离心管中，将步骤c所得到的脾细胞悬液沿管壁缓慢滴加在淋巴细胞分离液上方(注意不要将两者混合)，室温下2500rpm离心30min；

e.离心后取液体分为三层，取中层白膜，加入10mL无血清的1640培养基清洗淋巴细胞2次(1500rpm/min，10min)，重悬于10mL无血清培养基中并计数。

2.2.2ELISPOT法检测免疫小鼠脾细胞IFN-γ分泌水平

第一天：接种细胞，加入刺激物并培养：

a.整个实验设置1组正对照(PMA刺激)，每一个细胞样品(同一只实验小鼠)设1组负对照(不加刺激物)，还要设置1组背景负对照(不含细胞，只加培养基和所有检测试剂)；

b.取出预包被好的板，先加入200μl的Lympho-Spot^TM无血清培养基室温静置10min活化板，然后将其倾倒；

c.细胞上板：按照实验卡片的安排，接种不同浓度的细胞，100μl/well，细胞在孔中的分布要尽量均匀；

d.

(1)正对照：细胞浓度为2×10⁵细胞/孔。

(2)细胞样品：样品细胞浓度为4×10⁵细胞/孔。

(3)背景负对照：加入100μl的Lympho-Spot^TM无血清培养基。

e.正对照孔加入10μlPMA+Ionomoycin，终浓度1μg/mL，能有效刺激IFN-γ分泌；

f.加入刺激物：mVEGFR2D1-4/GST融合蛋白、β-hCGs/GST融合蛋及Survivin/GST融合蛋白及sKDR/GST融各20μg/孔；

g.加完所有的样品之后，放入37℃、CO₂培养箱培养36h。

第二天：培养后操作(不再需要无菌操作)

a.裂解细胞：倾倒孔内的细胞及培养基，加入200μl/孔冰冷的去离子水，4℃冰箱放置10min低渗裂解细胞；

b.洗涤：倾倒孔内液体，1×Washingbuffer200μl/孔，洗涤5-7次，每次停留1min后扣出洗涤液，最后一次，在吸水纸上扣干；

c.检测抗体孵育：每孔加入100μL稀释好的生物素标记检测抗体，37℃孵育1h；

d.洗涤：倾倒孔内液体，1×Washingbuffer，200μl/孔，洗涤5次，每次停留1min后扣出洗涤液，最后一次，在吸水纸上扣干；

e.酶标亲和素孵育：每孔加入100μL稀释好的酶标亲和素，37℃孵育1小时；

f.洗涤：倾倒孔内液体，1×Washingbuffer，200μl/孔，洗涤5次，每次停留1min后扣出洗涤液，最后一次，在吸水纸上扣干；

g.显色：将新鲜配制的AEC显色液工作液加入各实验孔，100μl/孔。室温避光静置15-45min，每隔5-10min检查1次；

h.待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水纸上，扣干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30min，让膜自然晾干；

i.将ELISPOT板置于BiosysBioreader自动读板机内，调节好合适的参数，记录斑点的各种参数，做统计分析。

将抗原肽mVEGFR2D1-4/GST、β-hcg/GST、Survivin/GST加入到实验孔，浓度为20μg/孔。以多肽作为刺激物对无菌分离的各组免疫小鼠的淋巴细胞进行刺激，在共培养期间特异性抗原肽激活T淋巴细胞，分泌IFN-γ并被预包被在板上的IFN-γ单克隆抗体捕获，通过酶联显色的方式变成斑点，而对特异抗原肽没有反应的细胞则不会受到刺激释放细胞因子。

实验结果如图15所示，pSVK-CAVA和pSVK-CAVE联合免疫组与单独疫苗组免疫组小鼠均能检测到特异性淋巴细胞的IFN-γ分泌，pSVK空载体可以检测到非特异性的IFN-γ分泌，统计分析小鼠脾细胞分泌的所产生的斑点数，发现疫苗免疫组较pSVK空载体组及PBS组存在显著差异(P＜0.05)。

2.3藻酸盐包裹肿瘤细胞检测抗肿瘤血管生成情况

2.3.1海藻酸盐包裹Renca肿瘤细胞悬滴的制备：

收集对数生长期Renca细胞计数后用1.5％海藻酸盐溶液重悬，最终细胞浓度约为1×10⁶/mL，将细胞悬液用滴管均匀滴入80mMCaCl₂中，均匀振荡孵育30min，可形成胶东状的包裹肿瘤细胞的藻酸盐悬滴。

2.3.2将海藻酸盐包裹Renca肿瘤细胞悬滴的移植

取实验各组小鼠2只，乙醚麻醉后于超净台中进行无菌手术操作，75％酒精消毒背部皮肤，切开皮肤及皮下组织，切口约1cm，止血钳钝性分离皮下组织，将制备好的藻酸盐悬滴移植入小鼠皮下，间断缝合切口，75％酒精消毒切口。

2.3.3小鼠皮下移植海藻酸盐包裹Renca肿瘤细胞观察评价抗血管生成效果

小鼠皮下移植海藻酸盐包裹Renca肿瘤细胞悬滴后14d，尾静脉注射1％FITC标记的右旋糖苷(100mg/kg)，10mim后颈椎脱臼法处死小鼠，解剖暴露移植的藻酸盐悬滴，观察表面毛细血管生成情况并照相照相，立即将取出移植的藻酸盐颗粒，将其浸泡于含有1mL生理盐水的烧杯中，使藻酸盐颗粒表面毛细血管中的血液充分溶解于生理盐水中，立即荧光分光光度计读取492nm的OD值，通过生理盐水中FITC标记的右旋糖苷含量计算血液含量，计算公式如下：

小鼠皮下移植海藻酸盐包裹Renca肿瘤细胞颗粒表面毛细血管生成情况如图16(A:双质粒疫苗；B:pSVK-CAVA单独应用；C:pSVK-CAVE单独应用；D:PBS空白对照；E:pSVK空载体；F:海藻酸盐移植物横切面)所示，可见pSVK-CAVA和pSVK-CAVE联合免疫组(图A)及pSVK-CAVE(图C)组藻酸盐颗粒表面毛细血管显著少于pSVK-CAVA组(图B)及对照组(图E)，而藻酸盐颗粒内部无毛细血管生成(图F)。

海藻酸盐包裹Renca肿瘤细胞颗粒表面毛细血管含血量检测结果如图17所示，结果证实pSVK组及PBS组的含血量显著多于pSVK-CAVA和pSVK-CAVE联合免疫组及pSVK-CAVE免疫组(P＜0.01)。

2.4病理切片及免疫组化染色检测免疫后小鼠肿瘤组织中毛细血管密度

将各组小鼠处死后，完整剥离肿瘤组织，立即用福尔马林溶液浸泡固定，送雪邦病理服务公司进行HE及免疫组化染色(免疫组化一抗用Rabitanti-CD31抗体染色，SantaCruz公司产品)。显微镜下计数高倍镜视野下毛细血管含量。

小鼠肿瘤组织中毛细血管密度检测结果如图18(A:双质粒疫苗；B:pSVK-CAVA单独应用；C:pSVK-CAVE单独应用；D:PBS空白对照；E:PSVK空载体)所示，结果表明双质粒疫苗组(3.267±1.15个/高倍镜视野)及pSVK-CAVE组(4.34±2.25个/高倍镜视野)显著低于pSVK空载体组(12.33±2.31个/高倍镜视野)及空白对照组(15.67±3.06个/高倍镜视野)。

通过观察各免疫组小鼠的肿瘤生长趋势我们可以看出，pSVK-CAVA、pSVK-CAVE双质粒疫苗组及pSVK-CAVA、pSVK-CAVE单独应用组均产生了较强的抗瘤效应，对B16-hCGβ⁺肿瘤细胞的攻击具有明显的保护作用：小鼠移植瘤成瘤时间较各对照组明显滞后；移植瘤生长明显延缓；荷瘤小鼠生存期明显延长；肿瘤生长抑制率达到45.93％-80.50％，并且双质粒疫苗组的抗瘤效应明显优于单独应用组。血清抗体IgG水平的ELISA检测结果显示，经过双质粒疫苗及单独疫苗免疫的小鼠血清均能检测到针对人Survivin、β-hCG及小鼠VEGFR2的特异抗体，这说明DNA疫苗进入小鼠机体后，融合抗原基因片段翻译而成的蛋白质被蛋白酶体复合物降解成短肽片段，一部分短肽片段进入溶酶体与MHC-II类分子结合形成复合物，该复合物可提呈给B细胞，在CD4⁺T细胞辅助下，刺激B细胞产生中和抗体，诱发机体产生了体液免疫应答。通过ELISPOT方法，检测免疫各组小鼠T淋巴细胞IFN-γ分泌情况，结果显示三种合成的融合蛋白抗原均能有效刺激疫苗免疫组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ，证实可复制型DNA疫苗诱导小鼠机体产生了有效的细胞免疫应答反应，双质粒疫苗组效果更加，考虑协同增效诱导细胞免疫反应功效的原因为适当剂量的抗血管生成治疗可使肿瘤血管生成正常化，从而创造出肿瘤免疫支持微环境，促进CD8+细胞浸润并激活。最后，通过海藻酸盐包裹肿瘤细胞移植物实验证实双质粒疫苗组及pSVK-CAVE组肿瘤表面的毛细血管形成显著少于其余个实验组，免疫组化染色证实双质粒疫苗组及pSVK-CAVE组肿瘤组织中毛细血管内皮数显著少于其余各实验组，表明双质粒疫苗组及pSVK-CAVE组中肿瘤新生血管生成明显受到了抑制。

Claims (5)

1.一种广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，其活性成分包括以下组分：

1)以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤抗原复合基因CAVA的抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗，命名为pSVK-CAVA，所述肿瘤抗原复合基因CAVA的核苷酸序列如序列表中序列3所示；

2)以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤血管复合基因CAVE的抗肿瘤血管复制子DNA疫苗，命名为pSVK-CAVE，所述肿瘤血管复合基因CAVE的核苷酸序列如序列表中序列6所示；

所述复制子DNA疫苗载体pSVK的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

2.根据权利要求1所述的广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，其特征在于：肿瘤抗原复合蛋白CAVA的氨基酸残基序列如序列表中序列2所示。

3.根据权利要求2所述的广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，抗肿瘤抗原复制子DNA疫苗pSVK-CAVA的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

4.根据权利要求1或2或3所述的广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，其特征在于：肿瘤血管复合蛋白CAVE的氨基酸残基序列如序列表中序列5所示。

5.根据权利要求4所述的广谱抗肿瘤双质粒可复制型DNA疫苗，其特征在于：抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE的核苷酸序列如序列表中序列7所示。