CN103948943B - 一种可复制型肾癌治疗性dna疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可复制型肾癌治疗性DNA疫苗，是将复合基因sig‑tG250‑Fc‑GPI‑IRES‑GM/B7插入可复制型DNA疫苗载体pSVK中得到的。该疫苗是一种可以诱导自身抗肿瘤免疫反应的DNA疫苗，疫苗本身的安全性好，为恶性肿瘤的预防和治疗提供了新的方法和思路，应用前景广阔。

Description

一种可复制型肾癌治疗性DNA疫苗

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可复制型肾癌治疗性DNA疫苗。

背景技术

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是肾脏恶性程度较高的肿瘤之一，也是泌尿系常见的肿瘤。过去30年中肾细胞癌的发病率连年上升(Rohrmann K,Staehler M,Haseke N,et al.Immunotherapy in metastatic renal cell carcinoma.World J Urol(2005)23:196–201)。病人确诊时已经到了晚期，同时在行根治性切除术后的肾癌中也有20％-30％会发生转移，对于失去手术机会的RCC目前还没有令人满意的治疗方法(Schrader AJ,Varga Z,Hegele A,et al.Second-line strategies for metastatic renal cell carcinoma:classics and novel approaches.J Cancer Res Clin Oncol(2006)132:137–149)。因此，晚期肾癌治疗迫切需要更加有效的新型治疗方案。

随着肿瘤免疫学以及分子生物学方面研究的深入，肿瘤免疫治疗作为一种清除肿瘤细胞的新方法逐步受到重视，它是通过激活机体的免疫系统特异地清除肿瘤细胞，目前也逐步应用到肾癌的治疗研究中(1.Vissers JL,De Vries IJ,Schreurs MW,et al.The renal cell carcinoma-associated antigen G250encodes a human leukocyte antigen(HLA)-A2.1-restricted epitope recognized by cytotoxic T lymphocytes.Cancer Res,1999,59(21):5554–5559.2.Cho-Lea Tso,Amnon Zisman,Allan Pantuck,et al.Induction of G250-targeted and T-Cell-mediated Antitumor Activity against Renal Cell Carcinoma Using a Chimeric Fusion Protein Consisting of G250and Granulocyte/Monocyte-Colony Stimulating Factor.Cancer Research2001:61,7925–7933)。研究表明肾癌对放化疗都不敏感，但其免疫原性很高，这都使免疫治疗作为肾癌治疗的一种新型治疗手段而倍受重视(Mokelo P,et al.Vaccines,coming of age after200years.FEMS Microbiol Rev,2000,24(1):9-20.)。

一、新型可复制型疫苗载体系统

甲病毒(Alphavirus)是披膜病毒(togavirus family)家族成员之一，它可以在不同细胞内进行自我复制。最近，利用甲病毒的自我复制功能，借助病毒的复制元件构建而成的新型可复制型DNA疫苗，显示出良好的应用前景。本研究前期在塞姆利基森林病毒(SFV)的基础上构建而成的新型可复制型DNA疫苗载体pSVK。该疫 苗载体具备有以下优点：(1)载体本身具有很强的自我复制功能，外源基因能够得到有效表达；(2)其本身具有高效的复制和翻译功能，势必会占用宿主细胞的大部分资源，最终会引起宿主细胞的凋亡而被机体清除，降低了机体的免疫耐受；(3)转录和翻译的过程是在宿主细胞的细胞质内进行，能够大大降低外源基因与宿主细胞基因整合的概率，提高其安全性。

二、靶抗原的选择

G250是从肾癌细胞系中筛选和克隆出的一种具有良好组织特异性的肿瘤相关抗原，也叫碳酸酐酶IX(Carbonic Anhydrase IX，CAIX)(Na Kagaway,Uemure H,Hirao Y,et al.Radiation Hybrid Mapping of the Human MN/CA9Locus to Chromosome Band9p12–p13.Genomics,1998；53:118-119.)。G250基因位于染色体9p12-13上，共含有10898个碱基对，包含11个外显子和10个内含子。在低氧环境中，G250可以调节细胞的增殖，并在肿瘤发生和发展中发挥重要作用。有研究表明，用G250单克隆抗体进行组织染色，几乎所有肾透明细胞癌和其它大部分类型肾癌细胞中都有G250的表达，80％的转移灶也有表达，而正常肾脏组织中很少或基本不表达。G250内存在HLA-21限制性T淋巴细胞表位，可以在体外诱导G250特异性T淋巴细胞免疫活性(1.Opavsky R,Pastorekova S,Zeinik V,etal.Gene,anovel member of the carbinic angydase familu:structure and exon to protein domain relationships.Genomics,1996,33:480-487.2.Grabmaier K,Vissers JL,De Weijert MC,etal.Molecular cloning and immunogenicity of renal cell carcinoma-associated antigen G250.Int J Cancer,2000,85(6):865–870.)。所以在近几年对肾癌相关抗原的研究中，G250成了肾癌免疫治疗中的一个理想靶点。

Hideki等将G250基因克隆至腺病毒载体后转染人外周血单核细胞，以诱导外周血淋巴细胞的细胞毒性反应，研究结果证明，该载体能够引发CTL反应并可以裂解表达G250的自体肾癌肿瘤细胞，对肾细胞癌有很好的杀伤作用(Hideki Mukouyama,1 Nicolette K.et al.Generation of Kidney Cancer-Specific Antitumor Immune Responses Using Peripheral Blood Monocytes Transduced With a Recombinant Adenovirus Encoding Carbonic Anhydrase9.Clinical Cancer Research 2004,10:1421–1429.)。Uemura等的I期临床研究是用来源于G250的3个肽段制作肽疫苗，来治疗细胞因子抵抗性进展期肾细胞癌(Uemura H,Fujimoto K,Tanaka M,et al.APhase I Trial of Vaccination of CA9-Derived Peptides for HlA-A24-Positive Patients with Cytokine-Refractory Metastatic Renal Cell Carcinoma.Clin Cancer Res.2006(6):1768-1775.)。试验结果证实：病 人可以很好的耐受疫苗，无明显毒副反应；在大部分病人体内可以检测到肽特异性CTLs反应及体液反应，甚至有3例患者肾癌转移灶消失或缩小，目前该疫苗有望进入II期临床研究阶段。综上所述，人G250抗原是发展肾癌免疫基因治疗的理想靶点。

DNA疫苗作为免疫治疗的一种方式，已经在临床或临床前的实验研究中广泛开展。DNA疫苗因为其安全性好，特异性高且易于产业化等方面的优势成为肾癌免疫治疗的重要发展方向(Leclerc C,et al.New approaches in vaccine development.Comp Immunol Microbiol Infect Dis.2003,26(5-6):329-41.)。随着免疫学、分子生物学和细胞生物学技术的不断发展，更高效和更安全的疫苗形式不断出现，近年来，一种具有“自我复制”功能的、以RNA病毒复制元件为基础的可复制性DNA 疫苗的出现是DNA疫苗发展过程中的一个重大突破(1.Kenneth Lundstrom.Alphaviruses in Gene Therapy[J].Viruses，2009，1(1)，13-25.2.Schlesinger S.Alphavirus vectors:development and potential therapeutic applications.Expert Opin Biol Ther,2001,1(2):177-191.3.Jonathan OR,Sergey AD,KurtIK.Alphavirus vectors and vaccination[J].Rev Med Virol,2002,12:279-296.)。这种疫苗在被宿主体内的抗原递呈细胞摄取后被转录成RNA复制子，可利用宿主细胞内的大量RNA复制酶自我复制，实现肿瘤抗原基因的高效转录并诱导机体产生特异的细胞免疫和体液免疫应答，达到治疗肿瘤的目的(1.Wang Z,TroiloP J,Wang X,et al.Detection of integration of plasmid DNA into host genomic DNA following intramuscular injection and electroporation[J].Gene Ther,2004,11(8):711-721.2.Gupta PK,SS Dahiya,et al.Sindbis virus replicon-based DNA vaccine encoding Rabies virus glycoprotein elicits specific humoral and cellular immune response in dogs[J].Acta Virol.2009,53(2):83-88.)。这种疫苗集合了传统DNA疫苗、RNA疫苗以及RNA复制子疫苗的三种优势：(1)疫苗本身具有很强的自我复制功能，外源基因能够得到有效的表达；(2)疫苗的稳定性好，便于生产、储存还有运输；(3)由于疫苗本身具有高效的复制和翻译功能，势必会占用宿主细胞的大部分资源，最终会引起宿主细胞的凋亡而被机体清除，降低了机体的免疫耐受；(4)转录和翻译的过程是在宿主细胞的细胞质内进行，能够大大降低外源基因与宿主细胞基因整合的概率，提高其安全性。所以说，可复制性DNA疫苗在疫苗的开发和生产中具有非常广阔的前景，目前尚未出现可供肾癌治疗使用的可复制性DNA疫苗。

发明内容

本发明目的在于提供一种可复制型肾癌治疗性DNA疫苗。

本发明所提供的可复制型肾癌治疗性DNA疫苗，是将复合基因sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7(简称G250FGB)插入可复制型DNA疫苗载体pSVK 中得到的，所述G250FGB复合基因是自5’端至3’端依次由tG250复合抗原基因、人IgG Fc段基因(GenBank号：Z17370)、GPI基因(GenBank号：XM676434)、GM/CSF基因(GenBank号：NM-000758)和B7.1基因(GenBank号：NM-005191)组成的融合基因。

其中，tG250复合抗原基因是异种化嵌合抗原基因，同时含有人肾癌抗原G250、猴和鼠的肾癌抗原CAIX基因，为了打破机体对自身抗原的免疫耐受，采用了分区段异种化抗原嵌合设计，使同源性较高的区段被异种化抗原代替，从而诱导不同种属间的交叉免疫反应。具体来讲，tG250抗原基因中自5’端第1-132、169-183、298-513位碱基分别为猴肾癌抗原CAIX基因(Genebank号：XM001088481)，自5’端第133-168、247-258、514-897、1084-1092位碱基分别为人G250基因，(Genebank号：AJ010158),而自5’端第184-246、259-297、898-1083、1093-1131位碱基分别为选取的是鼠肾癌抗原CAIX基因(Genebank号：BC120544)，tG250复合抗原基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

所述tG250复合抗原基因与人IgG Fc段和GPI基因融合，然后与GM/CSF基因和B7.1基因通过IRES序列相连组成G250FGB复合基因，其中，自5’端第70-201、238-252、367-582位碱基分别为猴肾癌抗原CAIX基因，自5’端第202-237、316-327、583-966、1153-1161位碱基分别为人G250基因，自5’端第253-315、328-366、967-1152、1162-1200位碱基分别为鼠肾癌抗原CAIX基因，自5’端第1201-2473位碱基为Fc段基因，自5’端第2474-2600位碱基为GPI基因，自5’端第2622-3246位碱基为IRES序列，自5’端第3253-3684位碱基为GM/CSF基因，自5’端第3709-4497位碱基为B7.1基因,所述G250FGB复合基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

将以pSVK为出发载体构建的携带复合基因sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7(简称G250FGB)的重组可复制型肾癌治疗性DNA疫苗命名为pSVK-G250FGB，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，其中，自5’端第7415-11913位碱基为G250FGB复合基因序列。

本发明的可复制型肾癌治疗性DNA疫苗pSVK-G250FGB可采用电穿孔肌肉内注射的方式进行免疫，免疫剂量一般为1-100μg/kg，疗程为1-6个月。免疫剂量和疗程可根据实际情况进行调整。

上述可复制型肾癌治疗性DNA疫苗在制备预防和治疗肾癌药物中的应用也属于 本发明的保护范围。

含有上述可复制型肾癌治疗性DNA疫苗的组合物也属于本发明的保护范围。

上述含有可复制型肾癌治疗性DNA疫苗的组合物在制备预防和治疗肾癌药物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种安全、高效的抗肾癌DNA疫苗，克服了传统DNA疫苗存在的问题，主要体现在以下几个方面：

创新策略1、高效可复制型DNA疫苗载体系统，前期以SFV RNA复制子衍生的真核表达载体pSFV1为骨架构建了具有自主知识产权的可复制型DNA疫苗载体。自行研发基于塞姆利基森林病毒复制子的可复制型DNA疫苗载体，能够“自主复制”高水平表达外源基因，而且载体抗性已经改造成为临床允许的卡那霉素抗性。基于该载体系统研发的基因疫苗，比常规DNA疫苗更加安全高效，诱导的免疫效力可比常规DNA疫苗提高1-2个数量级，是研究治疗性基因疫苗当前最先进的载体系统。

创新策略2、特异性肿瘤抗原异种化改造，抗原采用了肾细胞癌中高表达的肿瘤抗原tG250，并在设计的复合抗原中同时含有人、猴和鼠的CAIX基因，可打破机体的免疫耐受，诱导种与种的交叉性免疫应答。

创新策略3、加强抗原递呈能力，在复合抗原分子后，融合了人IgFc段，通过与抗原递呈细胞特别是DC细胞表面的相应受体结合，可以将抗原高效运送至抗原递呈细胞，实现高效的抗原加工和递呈。

创新策略4、分子内佐剂协同增效，本项目研制的可复制型DNA疫苗，载体具备较大的容纳空间。联合应用了GM-CSF、B7.1等分子内佐剂，可以在疫苗给药局部，协同创造活跃的免疫微环境，增强免疫共刺激，增强诱导高效的特异性细胞免疫和体液免疫。

创新策略5、高效诱导细胞免疫，治疗性疫苗，主要通过诱导细胞免疫清除体内残存的肿瘤细胞。可复制型DNA疫苗，能够模拟病毒自然感染过程(同时又无病毒感染的风险)，在细胞内表达抗原并通过MHC I类途径内源性递呈，激活CD8+T细胞反应。同时，抗原以细胞膜锚定形式表达，比分泌形式表达更容易诱导细胞免疫。

创新策略6、高效基因疫苗接种技术，利用电脉冲基因疫苗递送技术，大幅度提高了基因疫苗的免疫效力，为基因疫苗的临床应用提供了强大助力。通过瞬间脉冲电流增加靶细胞的渗透性而不杀伤细胞,外源DNA可以透过细胞膜进入细胞，使肌肉细胞摄取DNA质粒的效率比注射器直接肌注高100倍。而且更倾向于诱导TH1类细胞免疫应答。为肾癌治疗性基因疫苗发挥高效临床治疗作用提供了重要保障。

通过观察各组免疫小鼠的肿瘤形态学的改变，可以发现疫苗组小鼠的肿瘤生长受到了一定的抑制，小鼠移植瘤成瘤时间较其余各对照组较晚，肿瘤的瘤生长明显得到延缓，免疫后荷瘤小鼠的生存期明显延长，肿瘤生长抑制率达到91.16％，DNA疫苗免疫小鼠后能够有效延长荷瘤小鼠的生存时间。这些结果说明，DNA疫苗pSVK-G250FGB可以有效抑制肿瘤的生长并能够延长荷瘤小鼠的生存时间。没能到达100％抑瘤，分析可能是由于我们所采用的renca细胞系的侵袭性比较强，免疫原性较弱并MHCⅠ类分子的表达很低，因而会逃避部分免疫攻击的能力。

通过一系列的免疫学指标的检测，对肾癌DNA疫苗可能发挥作用的免疫学机制进行初步的探讨。ELISA法检测免疫小鼠血清中hG250抗体IgG水平的结果显示，经过疫苗免疫后的疫苗组和单独抗原对照组小鼠血清中均能检测到针对hG250蛋白的特异抗体，并与对照组相比有统计学意义。通过ELISA检测免疫后2周的小鼠血清中细胞因子IFN-γ的水平，发现疫苗组的IFN-γ的水平远远高于对照组，反应了小鼠体内Th1免疫反应的一定程度的增强，而Th1免疫反应主要介导的是细胞毒性免疫反应，可能在杀伤肿瘤细胞方面发挥一定的作用。ELISPOT法检测免疫后小鼠特异性淋巴细胞IFN-γ的分泌情况，特异性的抗原hG250刺激淋巴细胞后通过预包被的IFN-γ单克隆抗体显色对所形成的斑点进行计数。结果证实疫苗组和单独抗原对照组小鼠可以诱导特异性的淋巴细胞的IFN-γ分泌，与阴性对照组存在显著差异。这些结果说明用本发明的DNA疫苗免疫后诱导出了小鼠T细胞的IFN-γ特异性分泌，而IFN-γ与T细胞介导的细胞毒性免疫反应密切相关。通过HE染色的肿瘤组织切片来观察免疫小鼠肿瘤组织中的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，在经DNA疫苗pSVK-G250FGB免疫的小鼠肿瘤组织局部，可以观察到明显的TIL浸润，这说明疫苗免疫后的小鼠肿瘤组织中成功募集了具有肿瘤杀伤作用的淋巴细胞。

综上所述，本发明提供了一种可以诱导自身抗肿瘤免疫反应的DNA疫苗，为恶性肿瘤的预防和治疗提供了新的方法和思路，应用前景广阔。原因在于，本发明利用甲病毒的自我复制功能和复制元件构建的新型可复制型DNA疫苗既能保留原来DNA疫苗的稳定性好，便于生产储存和运输的优势，又拥有RNA复制子，具有自我复制能力，外源基因容易高效表达的优势，并且其在高效表达的同时还会占用宿主细胞的资源，引起宿主细胞自我凋亡被机体清除，提高了疫苗本身的安全性，因此，本发明的DNA疫苗具有广阔的应用前景。但是本发明仍存在一些不足，如仅仅采用了renca这一种细胞模型，需要在其它细胞模型中最好是在肾癌转基因小鼠模型中进一步评价疫苗效果；其次，在免疫三次后接着就进行攻瘤，这样可以预先激活体内免疫反应，从而达到较好的抑瘤效果，但是随着肿瘤的生长其免疫抑制的能力也 在增强，因此仍需要进一步完善肿瘤形成后再进行疫苗免疫并观察其治疗效果的研究。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为转化有重组质粒pSVK-G250FGB的重组菌落的PCR快速鉴定结果

图2为重组质粒pSVK-G250FGB的单酶切鉴定结果

图3为重组载体pSVK-G250FGB的物理图谱

图4为Western印迹检测重组质粒pSVK-G250FGB在293T细胞中的表达情况

图5为免疫组化法检测肿瘤抗原G250在Balb/c小鼠体内的表达情况的检测结果

图6为PCR扩增的人G250基因的1.2％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图7为重组载体pIRES-neo-G250的双酶切鉴定结果

图8为重组载体pIRES-neo-G250的物理图谱

图9为稳定转染质粒pIRES-neo-G250的小鼠renca细胞株中人G250基因表达情况的RT-PCR检测结果

图10为稳定转染质粒pIRES-neo-G250的小鼠renca细胞株中人G250基因表达情况的流式细胞术检测结果

图11为稳定转染质粒pIRES-neo-G250的小鼠renca细胞株中人G250基因表达情况的免疫荧光法检测结果

图12为稳定转染质粒pIRES-neo-G250的小鼠renca细胞株中人G250基因表达情况的Western印迹法检测结果

图13为各组免疫小鼠皮下移植瘤成瘤时间

图14为各组免疫小鼠体内移植瘤的生长曲线

图15为手术剥离各组免疫小鼠的肿瘤组织

图16为各组免疫小鼠皮下移植瘤攻击25天后各组小鼠的平均瘤重

图17为各组免疫小鼠皮下移植瘤的肿瘤生长抑制率

图18为皮下移植瘤攻击后各组免疫小鼠的存活时间

图19为免疫小鼠血清中G250特异抗体的ELISA法检测结果(免疫小鼠血清稀释100倍后的OD450nm值)

图20为各组免疫小鼠血清中细胞因子IFN-γ浓度检测结果

图21为各组免疫小鼠脾细胞IFN-γ分泌水平的ELISPOT检测结果

图22为各组免疫小鼠脾细胞IFN-γ分泌水平的ELISPOT斑点数检测结果

图23为免疫小鼠肿瘤组织中的肿瘤浸润淋巴细胞的病理组织形态学观察结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:ALaboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物均由由Invitrogen生物技术有限公司合合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、可复制型肾癌治疗性DNA疫苗pSVK-G250FGB的构建与表达

一、构建可复制型DNA疫苗载体

1、构建携带PS与KANA融合基因(PS-KANA)的重组载体pUC19-PS-KANA

重组载体pUC19-PS-KANA的构建方法如下：

1)扩增PS基因：以含有氨苄青霉素抗性基因的复制子DNA疫苗载体pSCA1(构建方法参见文献Yu Y Z,Sun Z W,Yu W Y.Chinese Journal of Biotechnology,2005,21(5):33-38)为模板，在引物PSCA-F

(5’-CCGTCTAGAGATCATAATCAGCCAT-3’)和PSCA-R

(5’-CCGGCATGCCTCGAGACTAGTCTGTCAGACCAAG-3’)的引导下PCR扩增氨苄青霉素抗性基因的旁侧序列，所述5’端旁侧序列含有限制性内切酶Xba I识别位点，所述3’端旁侧序列含有限制性内切酶Sph I识别位点；PCR反应体系为：10×PCR缓冲液10μl，MgCl₂(2.5mM)10μl，dNTPs混合物(2.5mM)8μl，合成引物(20μM)PSCA-F和PSCA-R各2μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)2μl，加去离子水至100μl；PCR反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃继续延伸10min；反应结束后，对PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明经PCR扩增获得了全长1273bp的基因 片段，回收并纯化该基因片段，测序，测序结果表明该基因片段的核苷酸与预期结果相符，将该基因片段命名为PS基因。然后，将PS基因用限制性内切酶Xba I和Sph I进行双酶切后，与同样经Xba I和Sph I双酶切的载体pUC19连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经浓度50μg/mL的氨苄青霉素抗性筛选，挑选阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定，鉴定结果表明用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带PS基因的重组载体，命名为pUC19-PS。

2)获得PS与KANA融合基因(PS-KANA)：以含有卡那霉素抗性基因的载体pVAX1(购自Invitrogen公司)为模板，在引物KANA-F

(5’-CCGACTAGTATGATTGAACAAG-3’)和KANA-R

(5’-CCGCTCGAGTCAGAAGAACTCGTC-3’)的引导下PCR扩增5’端携带限制性内切酶Spe I识别位点、3’端携带限制性内切酶Xho I识别位点的卡那霉素抗性基因；PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μl，MgCl₂(2.5mM)5μl，dNTPs混合物(2.5mM)4μl，合成引物(20μM)KANA-F和KANA-R各1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)1μl，加去离子水至50μl；PCR反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃继续延伸10min；反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明经PCR扩增获得了全长795bp的基因片段，回收并纯化该基因片段，测序，测序结果表明该基因片段的核苷酸序列与预期结果相符，将该基因片段命名为KANA；然后将KANA基因用限制性内切酶SpeI和Xho I进行双酶切后，与同样经SpeI和Xho I双酶切的重组载体pUC19-PS(步骤1)得到)连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经浓度50μg/mL的氨苄青霉素抗性筛选，挑选阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定；鉴定结果表明用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带PS与KANA融合基因(PS-KANA)的重组载体，命名为pUC19-PS-KANA。

2、获得复制子DNA疫苗载体pSVK

延续上述步骤，将复制子DNA载体pSCA1(以载体pSFV1为骨架，用CMV IE启动子替换SP6启动子，并在3’UTR下游插入BGH转录终止子，构建基于DNA的复制子载体pSCA1，使得在多克隆位点插入外源基因而构建的质粒DNA可直接转染细胞，无需体外转录RNA的繁琐操作[Yu Y Z,Sun Z W,Yu W Y.Chinese Journal of Biotechnology,2005,21(5):33-38])中的氨苄青霉素基因置换为卡那霉素基因，得到复制子DNA疫苗载体pSVK，进行以下步骤：

3)抗性基因置换：具体方法为：将载体pSCA1先用SphI单酶切，回收并纯化后在DNA聚合酶I(Klenow)的作用下，将酶切后产生的粘性末端补平后回收、纯化， 再用SpeI进行单酶切并回收、纯化后作为目的载体(该目的载体的一端为平末端，另一端则是粘性末端SpeI)，经过该步操作载体pSCA1中的氨苄抗性基因及其旁侧序列已被酶切去除；将步骤2)得到的重组载体pUC19-PS-KANA先用HindⅢ单酶切，回收并纯化后在DNA聚合酶I(Klenow)的作用下，将酶切后产生的粘性末端补平后回收、纯化，然后再用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)进行去磷酸化处理，最后再用Xba I单酶切，回收并纯化2100bp的DNA片段(该DNA片段的一端为平末端，另一端为粘性末端XbaI)，该步酶切回收的DNA片段主要包含有pSCA1载体中氨苄抗性基因的旁侧序列与KANA抗性基因的融合基因即PS-KANA；利用SpeI和XbaI属于同尾酶的特性，将回收并纯化的目的载体和DNA片段连接，经该步操作，PS-KANA融合基因被连入载体pSCA1中原氨苄基因及其旁侧序列所在位置，实现了pSCA1载体中抗性基因的置换；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行抗性筛选，筛选结果表明连接产物转化入大肠杆菌DH5α中后在氨苄青霉素抗性的LB平板中不再生长，而在含有卡那霉素抗性的LB平板中生长良好，表明复制子DNA疫苗载体pSCA1中的氨苄青霉素基因被成功置换为卡那霉素基因；再进行PCR和酶切鉴定，鉴定结果表明用上述方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带卡那霉素抗性基因的复制子DAN疫苗载体，命名为pSVK，测序结果表明pSVK的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

二、pSVK-G250FGB的构建

1、载体pSVK的酶切

用平端酶Sma I对pSVK空载体进行单酶切，这样将环形的pSVK质粒线性化并且拥有了两个平端，酶切体系见表1，酶切反应条件为37℃。

表1 pSVK载体的SmaI单酶切体系

2、G250FGB融合基因片段的获得

a.首先对质粒pVAX1-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7(构建方法参见硕士论文：田仁礼，G250异种化复合抗原抗肾癌基因疫苗的构建和表达；网络出版时间：2009.09.27)用Nhe I进行单酶切，然后用BssH II对线性化的

pVAX1-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7载体进行再次单酶切，酶切和补平操作的反应 体系见表2-4，经过该步操作即可获得两端均为平端的

sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7融合基因(即G250FGB)。

表2pVAX1-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7NheI单酶切体系

表3Nhe I单切后的纯化片段的粘末端补平体系

表4线性化pVAX1-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7质粒BssH II单酶切体系

3、pSVK载体与G250FGB融合基因的连接

将步骤1及3中得到的分别具有两个平末端的pSVK载体与G250FGB融合基因进行连接，连接体系见表5，连接条件为16℃连接6h。

表5融合基因sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7与pSVK载体连接体系

4、连接产物的转化和菌落PCR鉴定

将步骤4获得的连接产物转化E.coli.DH5α感受态大肠杆菌，具体操作步骤参见《Molecular Cloning:ALaboratory Manual》。

取0.5μl过夜培养12h的菌液稀释100倍作为模板，用PCR法进行初步鉴定，因为片段与载体是平端连接，为了确定正反向，所以选用设计的上游引物F(序列CAGGGTACTGGAGCAGAGACTCACTGACTC)和下游引物R(序列ATGAGGGGTCTCTGACTACACCGCCCTGTA)，目的片段大小约为1500bp。如果片段正向连接就可以扩增出相应片段，如果负向连接则不能扩增出目标片段。PCR扩增体系见表6，反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，扩增25个循环；72℃继续延伸6min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1(M：DNA Marker，1-8：转化有连接产物的培养生长的菌落的PCR扩增产物)所示，可以看到在1-8号菌落中8号菌落扩增出大小约为1500bp的片段，与预期结果一致。

表6重组质粒pSVK-G250FGB菌落PCR扩增体系

5、pSVK-G250FGB的酶切和测序鉴定

根据PCR鉴定结果，选择8号菌落接种于12mg/mL LB液体培养基中，在37℃、培养过夜(10-12小时)提取质粒，按照北京三博远志科技公司的质粒小量提取试剂盒说明进行操作。再用Nde I酶切所提取的质粒进行酶切鉴定，酶切体系见表7，酶切条件为37℃。重组质粒的酶切鉴定结果如图2(1：质粒pSVK-G250FGB，2：Nde I单切质粒pSVK-G250FGB，M：DNA Marker(15000))所示，可以看到经酶切获得了5400bp和10000bp的两条片段，大小与预期结果一致。同时还对阳性克隆送北京三博远志科技公司进行测序分析，进一步证明获得了插入序列及位置均正确的可复制型肾癌治疗性DNA疫苗pSVK-G250FGB，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，其中：自5’端第7415-11911位碱基为G250FGB复合基因序列，其中，自5’端第7484-7615、7652-7666、7781-7996位碱基分别为猴肾癌抗原CAIX基因，自5’ 端第7616-7651、7730-7741、7997-8380、8567-8575位碱基分别为人G250基因，自5’端第7667-7729、7742-7780、8381-8566、8576-8614位碱基分别为鼠肾癌抗原CAIX基因，自5’端第10036-10660位碱基为IRES序列，自5’端第10667-11098位碱基为GM/CSF基因，自5’端第11123-11911位碱基为B7.1基因。pSVK-G250FGB的物理图谱如图3所示。

表7pSVK-G250FGB的酶切鉴定体系

三、pSVK-G250FGB的体外表达验证

重组质粒pSVK-G250FGB的大量提取，按照去内毒素质粒大量提取试剂盒(天根生物公司)的说明书进行操作。

取对数生长期的293T细胞(购自北京协和细胞库)，胰酶消化后接种于6孔板，待细胞汇合度达60％至75％时，参照Invitrogen公司的lipofectamineTM2000说明书，将质粒pSVK-G250FGB和对照组pSVK空载体在lipofectamineTM2000的介导下转染入293T细胞，依照lipofectamineTM2000说明书中的方法进行转染。

转染细胞48h后，用0.25％胰酶消化，150μl三蒸水重悬后，沸水中煮10min裂解细胞，离心后取上清进行分离胶(10％)，浓缩胶(5％)SDS PAGE电泳(恒压80V，1.5h)，电转移至PVDF膜上(恒流180mA，2h)，50g/L脱脂奶粉室温振荡2h封闭，与1∶500稀释的一抗(抗人的B7.1抗体，以GAPDH为内参)4℃孵育过夜(10-12小时)，PBST洗膜3次，然后与1∶2000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(购自中杉金桥)室温孵育2h，PBST洗膜3次，ECL显色，Western印迹检测目的蛋白。结果如图4(1，转染重组质粒pSVK-G250FGB的293T组；2，转染pSVK空载体的293T组)所示，说明该疫苗pSVK-G250FGB在真核细胞中获得表达。

四、pSVK-G250FGB的体内表达验证

1、免疫组化的准备

a.将50μg/100μl重组质粒pSVK-G250FGB注射入babl/c小鼠的腿部肌肉组织，用ECM830型电转导入仪进行刺激，脉冲条件为：175V，50ms，8次。免疫后48h，颈椎脱臼法处死小鼠，手术剥取小鼠免疫部位股四头肌肌肉组织。然后在多 聚甲醛中固定，组织固定一周后即可用石蜡包埋固定后制备组织切片，具体方法参见免疫组化常规操作。

2、免疫组化检测G250在小鼠体内的表达情况

将制备好的石蜡切片进行免疫组化实验，具体的操作步骤如下：

a.脱蜡前将固定好的组织块儿在60℃恒温箱中烘烤20分钟；

b.将组织块置于二甲苯I中浸泡10min，在二甲苯II中再浸泡10min；

c.然后捞出组织块，依次放入无水乙醇中浸泡五分钟、95％乙醇中浸泡5min、75％乙醇中浸泡5min；

d.蒸馏水冲洗2-3次，PBS浸泡5min；

e.将3％H₂O₂滴加切片上，室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3次，2min/次；

f.滴加5-10％正常山羊血清封闭液，室温孵育20min；

g.倾去血清，不用洗涤，直接50μl滴加1:50稀释的一抗(兔抗人G250多克隆抗体，购自santa公司)4℃孵育过夜(10-12小时)；

h.将过夜孵育的切片置于37℃孵箱中复温45min，PBS冲洗3次，2min/次；

i.滴加1:200稀释的二抗(山羊抗鼠(兔)IgG-HRP多聚体，购自中杉金桥)50μl在切片上，37℃孵育30min；

j.PBS冲洗3次，2min/次；

k.DAB显色剂显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度；

l.自来水充分冲洗10min，苏木精复染2min，盐酸酒精分化；

m.自来水冲洗10-15min，脱水、透明、封片、镜检。

免疫组化法检测肿瘤抗原G250在Balb/c小鼠体内的表达情况的检测结果如图5所示，可以在免疫小鼠的肌肉组织内观察到数量不一的棕褐色颗粒，而用pSVK空载体免疫的对照小鼠肌肉组织中未能检测到目的蛋白的表达，说明pSVK-G250FGB经肌肉注射加电穿孔刺激在小鼠体内也获得有效表达。

实施例2、构建稳定表达人G250的renca小鼠细胞株及人G250小鼠肾癌荷瘤模型

因为在以G250为靶点的肾癌疫苗或免疫治疗的研究过程中需要稳定表达人G250小鼠肾癌模型，所以本部分实验的研究工作就是建立稳定表达人G250的renca小鼠细胞株及人G250小鼠肾癌荷瘤模型。具体采用PCR的方法扩增出人的G250基因，根据DNA重组技术定向插入到pIRES-neo真核表达载体中，得到重组表达质粒pIRES-neo-G250。用阳离子脂质体介导法将该质粒稳定转染到renca小鼠细胞中，通过调整G418的浓度筛选出阳性克隆，蛋白免疫印迹和免疫荧光测试验证人G250基因转染小鼠renca细胞株后的表达情况，利用上述细胞株分别以不同的浓度接种 Balb/c小鼠背部皮下组织，观察稳定转染外源基因后renca细胞的致瘤能力，建立表达人G250的小鼠肾癌荷瘤模型。具体构建方法，包括以下步骤：

一、构建重组表达载体pIRES-neo-G250

1、PCR扩增人G250基因

以构建的含有人G250基因的质粒载体(肖毅,高江平,高昆.人G250真核表达载体的构建及稳定转染B16细胞系的建立军医进修学院学报2010-06)为模板，在上游引物：5’-GCAATTGCAGAGGTTGCCGGATGCAG-3’和下游引物：5’-GAGATCTCTAGGCTAGTCTCGGCTAC-3’的引导下PCR扩增人G250基因，50μl PCR反应体系为：在50μl反应体系中加入cDNA模板1μl，Ex taq PCR Buffer5μl，dNTP4μl，上下游引物各1μl，Ex Taq酶0.5μl，加水补足至50μl，反应条件为:94℃5min；94℃50s；58℃50s；72℃50s；72℃7min扩增30个循环。PCR反应条件为：95℃预变性6min；然后94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸50s，共扩增32个循环；最后72℃延伸7min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6(M.DL2000标志物；1.G250；2.阴性对照)所示，可见扩增出一条清晰的1500bp左右的DNA条带，与预期大小一致。

2、pIRES-neo-G250的构建

将PCR扩增的人G250基因片段和载体pIRES-neo(购自CLONTECH公司)，分别用限制性内切酶EcoR I和BamH I进行双酶切，回收纯化后用连接酶(全式金公司)在16℃连接30min，连接体系见表8。

表8连接体系

将连接产物转化E.coli.DH5α感受态大肠杆菌，挑取单克隆摇菌提取质粒，分别用EcoR I和BamH I进行双酶切鉴定，酶切体系见表9，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图7(M.DL2000标志物；1.酶切后质粒；2.pIRES-neo-G250质粒)所示，重组质粒用EcoR I和BamH I双酶切后呈现约1500bp和5500bp左右的两条目的条带，与预期大小一致。将鉴定正确的质粒送Invitrogen公司进行测序，结果重组质粒的核苷酸序列与预计的序列完全相同，命名为pIRES-neo-G250，其物理图谱如图8所示。

表9重组质粒的双酶切鉴定体系

二、获得稳定表达人G250的小鼠renca细胞株

1、重组质粒pIRES-neo-G250的稳定转染

1.1大提重组质粒pIRES-neo-G250

取步骤一鉴定正确的菌液按照1：1000的比例加入到300mL含12mg/mL卡那霉素的LB培养基中，将含有培养基的烧瓶置于37℃培养箱中，200rpm振荡培养过夜(10-12小时)。培养结束后，大量提取质粒，按照去内毒素质粒大量提取试剂盒(天根生物公司)的说明书提取质粒，具体操作步骤见实施例1。

1.2重组质粒稳定转染小鼠renca细胞

1.2.1 G418浓度的确定

首先按照每孔100个细胞的密度将renca细胞平均分到96孔板中，浓度梯度为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μg/mL，复孔为2个，以10d杀死全部未转染renca细胞的G418的最低浓度为最终筛选浓度，结果确定实验G418筛选浓度为600mg/L。

1.2.2重组质粒的稳定转染

具体操作步骤如下：

a.将正常生长的一定数量的renca细胞接种到6孔板中，使其在24h后(转染当天)细胞汇合度达到70-80％；

b.在转染当天，首先准备转染复合物：转染A液：用250μl的I Reduced Serum Medium、溶解稀释4μg pIRES-neo-G250质粒DNA，轻柔混合；转染B液：用250μl的IReduced Serum Medium稀释溶解10μl的Lipofectamine ^TM2000；

c.室温下孵育5min；

d.孵育结束后，将转染B液轻轻滴加入转染A液，用移液器轻柔混匀，室温下孵 育20min；

e.利用转染复合物孵育这段时间，用IReduced Serum Medium轻柔对前一天分孔培养的renca细胞洗涤2次；

f.将孵育结束后的转染复合物轻柔加入到清洗好的细胞中，前后左右轻轻摇动，使其充分混匀，做好标记，放入5％CO₂、37℃的细胞培养箱中培养；

g.转染后6h更换含有10％新生牛血清的RPMI-1640培养基继续培养；

h.24h后按照1:3的比例将细胞传代至新的6孔板中培养；

i.在48h之后，将六孔板中细胞用胰酶消化，以1∶3的比例传代，56h后，按每瓶600mg/L终浓度加入G418。约7天，细胞出现大量死亡，此时每隔1天换1次液，持续加压到细胞不再死亡且以团簇生长为止。

1.2.3稳定转染细胞的单克隆化

稳定转染后，按每瓶600mg/L终浓度加入G418。约7天，细胞出现大量死亡，此时每隔1天换1次液，持续加压到细胞不再死亡且以团簇生长为止，即可得到稳定转染细胞的混合克隆。然后按照有限稀释法进行单克隆化操作，即可得到单克隆细胞株。

2、稳定转染pIRES-neo-G250细胞株的G250表达能力检测

2.1RT-PCR检测：详细步骤可参见《Molecular Cloning:ALaboratory Manual》，TRIZOL法提取所筛选的单克隆细胞株的总RNA，逆转录合成其cDNA，逆转录体系见表10，该步骤均在冰上进行，逆转录的条件为：30℃10min，42℃60min，99℃5min，4℃5min。

表10单克隆细胞总RNA的逆转录体系

然后进行PCR反应，以逆转录所得的单克隆细胞的cDNA为模板，在上游引物GCAATTGCAGAGGTTGCCCCGGATGCAG)和下游引物GAGATCTCTAGGCTCCAGTCTCGGCTAC的引导下进行PCR扩增，PCR反应体系见表11，反应条件为：95℃预变性6min；然后94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸50s，72℃延伸7min，扩增32个循环。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图9(A.转染pIRES-neo-G250实验组；B. pIRES-neo空白对照组)所示，可见实验组可扩增出一条清晰的1500bp的DNA条带，与预期大小一致，表明pIRES-neo-G250转染小鼠renca细胞中人G250基因获得表达。

表11逆转录所得单克隆细胞cDNA PCR体系

2.2流式细胞术检测：

转染细胞48h后，用0.25％的胰酶消化6孔板的细胞，冰浴预冷的含有2％新生小牛血清的PBS清洗细胞3遍，实验组和对照组的细胞同时用兔抗人的一抗(购自santa公司)4℃孵育40min，含2％的新生牛血清的PBS清洗细胞3遍后，同时加入FITC标记的二抗山羊抗兔IgG(购自中杉金桥公司)，4℃孵育40min，2％的新生牛血清的PBS清洗细胞3遍后，1％的多聚甲醛重悬细胞，进行流式细胞术检测。

胰酶消化实验组(转染pIRES-neo-G250)和对照组(转染pIRES-neo空质粒)的renca细胞，进行抗体标记后，进行流式细胞术检测，结果如图10(A.对照组；B.转染pIRES-neo-G250组)所示，发现实验组转染48h后的renca细胞中有G250基因表达，且阳性表达率为99.49％，说明该基因可以在真核细胞中正常表达。

2.3免疫荧光法检测

取实验组(转染pIRES-neo-G250)和对照组(转染pIRES-neo空质粒)的293T细胞，进行抗体标记(标记方法见2.2)后，在激光共聚焦显微镜下观察。结果如图11【A.转染pIRES-neo空质粒对照组(×400)(标尺：50μm)；B.转染pIRES-neo-G250组(×400)(标尺：50μm)】所示，发现实验组转染了重组质粒pIRES-neo-G250的renca细胞上有红色荧光，说明该重组质粒中的G250基因可以在renca细胞中表达。

2.4Western印迹检测

转染细胞48h后，取实验组(转染pIRES-neo-G250)和对照组(转染pIRES-neo空质粒)的renca细胞，用0.25％的胰酶消化，150μl三蒸水重悬后，沸水中煮10min裂解细胞，离心后取上清进行1％SDS-PAGE电泳(恒压80V，1.5h)，电转移至PVDF膜上(恒流180mA，2h)，50g/L脱脂奶粉室温振荡2h封闭，与1∶500稀释的一抗(兔 抗人G250多克隆抗体，购自santa公司)4℃孵育过夜(10-12小时)，PBST洗膜3次，然后与1∶2000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(购自中杉金桥公司)室温孵育2h，PBST洗膜3次，ECL显色检测目的蛋白，分离胶和浓缩胶的制备方法见表12和表13。

结果如图12(A.转染pIRES-neo-G250组；B.对照组)所示，发现实验组能够检测到G250的蛋白条带，而对照组则没有相应的条带，用GADPH作为内参，均有GADPH蛋白条带，表明获得了稳定表达人G250的小鼠renca细胞株。

表1210％分离胶(pH8.8)的制备

表134％浓缩胶(pH6.8)的制备

三、构建人G250小鼠肾癌荷瘤模型

为了验证步骤二获得的稳定表达人G250的小鼠renca单克隆细胞能否保持原有的致瘤能力，将对数生长期的renca转染细胞收集起来，1×PBS洗三遍后，分别以4×10⁵、2×10⁵、2×10⁵个细胞于小鼠背部皮下接种，观察小鼠的成瘤情况。

结果如表14所示，三种细胞浓度均能导致小鼠成瘤，表明人G250小鼠肾癌模型 构建成功。同时，随着肿瘤细胞接种量的降低，荷瘤小鼠的成瘤时间也随之延长。

表14不同浓度renca单克隆细胞接种小鼠后的成瘤天数

实施例3、可复制型肾癌治疗性DNA疫苗pSVK-G250FGB的抑瘤活性检测及免疫学机制的研究

实施例3中，图13-图22中E组小鼠免疫所用质粒在图中标注为pSVK-sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7与可复制型肾癌治疗性DNA疫苗pSVK-G250FGB为同一质粒，只是命名繁简有差异，特此说明。

将实施例1构建好的肾癌治疗性DNA疫苗pSVK-G250FGB用肌肉注射加电穿孔递送的方式，免疫接种实施例2获得的荷瘤小鼠。通过观察记录各组小鼠肿瘤生长情况，研究可复制型DNA疫苗pSVK-G250FGB的抑瘤活性。采用ELISA法检测免疫小鼠血清中的特异抗体滴度，采用Elispot法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的激活，采用病理组织切片观察免疫小鼠的离体肿瘤组织内浸润的淋巴细胞来探讨其发挥作用可能的免疫学机制。

一、检测可复制型肾癌治疗性DNA疫苗的抑瘤活性

1、疫苗制备

1.1构建pSVK-sig-tG250-Fc-GPI质粒

利用pSVK-G250FGB中融合抗原片段上游的BamHI和IRES序列上游的PvuI进行双酶切,即可获得两条线性化的DNA片段，其中一条大小约为2600bp的DNA片段即为G250融合抗原片段sig-tG250-Fc-GPI，利用klenow片段将其两端的粘性末端补平后，克隆入pSVK载体中，即可得到重组质粒pSVK-sig-tG250-Fc-GPI，pSVK-sig-tG250-Fc-GPI的核苷酸序列如序列表中序列5所示。

1.2构建pSVK-IRES-GM/B7佐剂

构建方法：利用1.1中酶切后剩余的pSVK载体及IRES-GM/B7.1片段进行操作，由于酶切后的两个粘性末端并非同尾酶，所以将这条片段两端补平，然后利用连接酶使其自连成环状质粒，即可得到重组质粒，pSVK-IRES-GM/B7的核苷酸序列如序列表中序列6所示。

2、实验动物分组

6-8周龄雌性Balb/c小鼠随机分为5组，每组15只，5只进行肿瘤生长形态学观察、5只进行生存期观察、5只进行抑瘤功能的免疫学作用机制检测。A组为PBS对照组(配方：(135mM NaCl,2.7mM KCl,1.5mM KH2PO4,and8mM K2HPO4，pH7.2)，B组为pSVK空载体组，C组为pSVK-IRES-GM/B7佐剂对照组，D组pSVK-sig-tG250-Fc-GPI抗原对照组，E组为pSVK-G250FGB疫苗组。

3、Balb/c小鼠的免疫策略

6-8周龄雌性Balb/c小鼠在进行移植瘤攻击前每隔一周进行疫苗免疫，共免疫三次，免疫方法采用股四头肌肌肉注射后电穿孔刺激的增加质粒的递送，各组分别注射相应的DNA质粒5μg/100μl/只，在注射后约30s，用BTX公司活体基因电转仪ECM830在注射部位进行多点电刺激，脉冲条件是：200V/cm，50ms，1Hz×6次。

4、肿瘤攻击方案

收获对数生长期的实施例2获得的稳定表达人G250的小鼠renca(hG250)细胞，制备单细胞悬液，PBS冲洗两次，调整细胞浓度分别至1×10⁶个/mL，于末次免疫后3天在小鼠背部右侧皮下接种100μl细胞悬液即1×10⁵个/只。

5、可复制型肾癌治疗性DNA疫苗抑瘤活性观察

皮下移植瘤攻击后，观察小鼠体内肿瘤的生长情况。从可触及肿瘤结节起，记录各组小鼠的成瘤时间；接着，每间隔两天用游标卡尺测量并记录移植瘤的垂直长径和垂直短径，依照公式计算移植瘤体积，绘制小鼠体内移植瘤的生长曲线；待移植瘤生长至一定天数时，每组断颈处死5只小鼠，手术剥取肿瘤组织并称取瘤重，依照公式计肿瘤的抑制率。公式如下：

肿瘤体积(mm³)＝0.5×垂直长径×(垂直短径)²；

肿瘤生长抑制率(％)＝(对照组平均瘤重-免疫组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。

6、可复制型肾癌治疗性DNA疫苗抑瘤活性检测结果

6.1免疫小鼠移植瘤形成时间

末次免疫后3d，观察进行皮下移植瘤攻击的各组Balb/c小鼠，以能明确触及到肿瘤为各只小鼠成瘤的时间终点，记录各组小鼠的移植瘤成瘤时间。

结果如图13和表15所示，发现各免疫组间存在不同程度的差别。其中，A组成瘤最早，B、C组之间没有显著差异(P＞0.05)，D、E组的小鼠成瘤时间较晚，其中E组在第17天才触摸到肿瘤结节的形成，与对照组有非常显著差异(P＜0.01)，说明该疫苗能显著抑制肿瘤的生长。

表15各组免疫小鼠皮下移植瘤的成瘤时间

注：^*与对照组比成瘤时间显著性差异(P<0.05)；

^**与对照组比成瘤时间非常显著性差异(P<0.01)

6.2免疫小鼠的皮下移植瘤生长情况

从小鼠皮下移植瘤攻击后开始至颈椎脱臼法处死小鼠的30天内，每隔两天用游标卡尺测量一次肿瘤的垂直长径和垂直短径，并通过公式计算每组小鼠体内肿瘤的平均体积，绘制其肿瘤生长曲线。对每次测量的结果进行统计学分析。

各组小鼠体内移植瘤的生长曲线如图14所示，可以看出，A、B组之间并无显著差异(P>0.05)，E组与对照组比较生长明显延缓，有显著差异(P<0.05)，说明该疫苗能显著抑制肿瘤的生长。

6.3疫苗对荷瘤小鼠皮下移植瘤生长的抑制作用

皮下移植瘤攻击后，颈椎脱臼法处死每组各5只小鼠，轻柔剥取肿瘤组织，拍照并称量各组瘤重。

手术剥离各组小鼠的肿瘤组织如图15(A组为PBS对照组，B组为pSVK空载体组，C组为pSVK-IRES-GM/B7佐剂对照组，D组pSVK-sig-tG250-Fc-GPI抗原对照组，E组为pSVK-G250FGB疫苗组)所示，各组免疫小鼠皮下移植瘤攻击25天后各组小鼠的平均瘤重如图16所示，各组小鼠皮下移植瘤的肿瘤生长抑制率如图17所示，各组免疫小鼠对肿瘤的瘤重以及肿瘤抑制率如表16所示，结果显示，A、B、C组三个组之间无明显差异(P>0.05)(C组一只老鼠中途死亡)，E组移植瘤明显缓慢，差异显著(P<0.05)，有一只老鼠在处死时未长肿瘤，说明该疫苗能显著抑制肿瘤的生长。

表16各组免疫小鼠对肿瘤的瘤重以及肿瘤抑制率

注：^*与对照组比成瘤时间显著性差异(P<0.05)；

^**与对照组比成瘤时间非常显著性差异(P<0.01)

6.4皮下移植瘤攻击后小鼠的存活情况

皮下移植瘤攻击后观察各组小鼠的存活情况。皮下移植瘤攻击后各组小鼠的存活时间如图18(A组为PBS对照组，B组为pSVK空载体组，C组为pSVK-IRES-GM/B7佐剂对照组，D组pSVK-sig-tG250-Fc-GPI抗原对照组，E组为pSVK-G250FGB疫苗组)所示，可以看出，A、B、C三个组的小鼠在攻瘤后50天内均全部死亡；E组小鼠在攻瘤后48天后出现第一只死亡，最后一只直达第75天才死亡，疫苗组小鼠的生存率与其余各组相比存在显著性差异(P＜0.05)，说明该疫苗能显著抑制肿瘤的生长。

二、本发明可复制型肾癌治疗性DNA疫苗诱导的抗肿瘤效应的免疫学机制

通过检测免疫后各组小鼠体内免疫学指标，对本发明可复制型肾癌治疗性DNA疫苗发挥作用可能的机制进行初步的研究。

1、ELISA法检测免疫小鼠血清中的特异抗体

末次免疫后第7天，通过小鼠眼眶静脉取血，室温放置3h后，4℃、3000rpm离心10min，取上层血清分装，-70℃保存备用。用原核表达纯化的hG250蛋白包被ELISA板，检测免疫小鼠血清中特异的抗体滴度。具体操作方法如下：

a.包被：纯化的hG250蛋白用包被液稀释至终浓度为1.0μg/mL，100μl/孔包被ELISA板即hG250蛋白100ng/孔，同时用BSA100ng/孔作为阴性对照包被酶联板，4℃静置包被过夜(10-12小时)；

b.洗涤：将ELISA板孔中包被液扣出，用PBST洗涤5次，每次放到脱色摇床中轻微震荡1min，在吸水纸上扣干；

c.封闭：用3％BSA-PBS100μl/孔，37℃封闭2h后弃去封闭液，PBST洗板5次，在吸水纸上扣干；

d.检测：将小鼠血清样品用PBS倍比稀释后依次加入酶联板，100ul/孔，37℃孵育1h；

e.二抗标记：PBST洗板5次后吸水纸上扣干，加入1：5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(购自中杉金桥)，37℃孵育1h；

f.显色：PBST洗5次后吸水纸上扣干，加入TMB显色液100μl，37℃显色15min，加入1M H₂SO₄100μl/孔终止反应；

g.测OD值：使用酶联仪检测450nm的OD值。

末次免疫后两周，各组免疫小鼠血清中G250特异抗体的ELISA法检测结果如图19(免疫小鼠血清稀释100倍后的OD450nm值；A组为PBS对照组，B组为pSVK空载体组，C组为pSVK-IRES-GM/B7佐剂对照组，D组pSVK-sig-tG250-Fc-GPI抗原对照组，E组为pSVK-G250FGB疫苗组)所示，可以看出E组的OD值远远大于对照组， 说明该疫苗能够激起小鼠的体液免疫应答。

2、ELISA法检测免疫后小鼠血清中IFN-γ水平的变化

按照欣博盛生物公司的小鼠IFN-γ检测试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下：

a.小鼠血清的稀释的处理：将小鼠血清样品用样品稀释液将免疫后7天的小鼠血清稀释2倍，备用。

b.标准品的配制:加入标准品和标本通用稀释液1.0mL至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为1000pg/mL)。然后根据说明书进行稀释。(标准曲线使用以下浓度：500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、0pg/mL)。

c.从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条，密封口袋，放回4℃。

d.空白孔加标准品和标本通用稀释液，其余加入稀释好的不同浓度标准品(100μl/孔)，并加入已经稀释好的小鼠血清，按照100μl/孔加入到相应孔中。用封板胶纸封住反应孔，36℃孵育90min，提前20分钟准备生物素化抗体工作液。

e.用双蒸水1:20稀释浓缩洗涤液配制洗涤工作液，洗板5次。

f.空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵育60min，提前20分钟准备酶结合物工作液，避光室温(22-25℃)放置。

g.洗板5次，空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100μl/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30min。

h.洗板5次，加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15min。

i.加入终止液100ul/孔,混匀后即刻测量OD450值(3min内)。在仪器保存读数结果。根据读数结果及标准品浓度绘制标准曲线计算各组小鼠血清中IFN-γ的浓度。

末次免疫后两周，各组免疫小鼠血清中细胞因子IFN-γ浓度检测结果如图20(A组为PBS对照组，B组为pSVK空载体组，C组为pSVK-IRES-GM/B7佐剂对照组，D组pSVK-sig-tG250-Fc-GPI抗原对照组，E组为pSVK-G250FGB疫苗组)所示，A组的浓度为18.77ng/mL，B组的浓度为19.93ng/mL，C组浓度为46.65ng/mL，D组浓度为48.59ng/mL，E组的浓度为83.28ng/mL,其中E组和A组比较免疫小鼠血清中的IFN-γ浓度存在显著性差异，该疫苗能够激起小鼠的体液免疫应答。

3、ELISPOT法检测免疫小鼠脾细胞特异IFN-γ的分泌水平

无菌获得各组免疫小鼠的脾淋巴细胞，以hG250蛋白作为刺激物对各组淋巴细胞进行刺激，用ELISPOT法检测免疫小鼠脾细胞特异IFN-γ的分泌水平，具体方法包括以下步骤：

a.在末次免疫后第2周，断颈处死各组免疫后小鼠，浸泡于75％乙醇中5min后放入紫外线照射消毒过的超净台内；

b.无菌条件下手术取出小鼠脾脏，将脾脏剪碎后置入200目细胞筛中，接着将细胞筛放入无血清的1640培养基的平皿中，用研磨棒尽量将脾研磨均匀；

c.用无血清的1640培养基轻轻将细胞筛中的淋巴细胞冲出；

d.将5mL小鼠淋巴细胞分离液加入到离心管中，将步骤c所得到的脾细胞悬液沿管壁缓慢滴加在淋巴细胞分离液上方(注意不要将两者混合)，室温下2500rpm离心30min；

e.离心后取液体分为三层，取中层白膜，加入10mL无血清的1640培养基清洗淋巴细胞2次(1500rpm，10min)；重悬于10mL无血清培养基中并计数。

f.ELISPOT板中加入200μL的RPMI-1640培养基或者Lympho-Spot^TM无血清培养基，室温静置10分钟左右，倾倒。

g.每孔加入不同浓度的细胞，100μL/well。细胞在孔中的分布要尽量均匀。

h.正对照每孔加入10μL PHA(或者其它刺激物)，终浓度2-20ug/mL。

i.加入hG250蛋白到实验孔，加完刺激物之后，不要再拍击ELISPOT板。

j.当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入37℃、5％CO₂培养箱培养16-36小时。注意：碰撞会引起细胞移位，造成斑点模糊、拖尾。在整个培养过程中应避免移动、碰撞培养板，并尽量减少开关培养箱的次数。

k.第二天，倾倒孔内的细胞及培养基。

l.裂解细胞：每孔加入200μL冰冷的去离子水，4℃冰箱冰浴10分钟(低渗法裂解细胞)。

m.洗板：每孔用200μL1×Washing buffer洗涤5-7次，每次30秒。最后一次，在吸水纸上扣干。

n.检测抗体孵育：每孔加入100μL稀释好的生物素标记的抗体，37℃孵育1小时。

o.洗板：每孔用200μL 1×Washing buffer洗涤5次，每次30秒。最后一次，在吸水纸上扣干。

p.亲和素孵育：每孔加入100μL稀释好的酶标亲和素，37℃孵育1小时。

q.洗板：每孔用200μL 1×Washing buffer洗涤5次，每次30秒。最后一次，在吸水纸上扣干。

r.显色：照试剂配制说明，配好AEC显色液。每孔加入100μL的显色液，室温避光静置15-45分钟(在20-25℃，显色25分钟较合适)。

s.待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板 倒扣在吸水纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30分钟，让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂。

t.ELISPOT板斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。

免疫后各组小鼠IFN-γ分泌水平的ELISPOT斑点数检测结果如图21(A组为PBS 对照组，B组为pSVK空载体组，C组为pSVK-IRES-GM/B7佐剂对照组，D组pSVK-sig-tG250-Fc-GPI抗原对照组，E组为pSVK-G250FGB疫苗组)所示，各免疫组小鼠脾细胞ELISPOT计数结果如表17所示，D组和E组均能检测到T细胞的免疫反应，并在斑点数进行分析后发现，D组、E组与其它各组相比，有显著差异，该疫苗能够激起小鼠的细胞免疫应答。

表17各免疫组小鼠脾细胞IFN-γ分泌水平的ELISPOT计数结果

注：^*与对照组比成瘤时间显著性差异(P<0.05)；

^**与对照组比成瘤时间非常显著性差异(P<0.01)

4、病理组织形态学观察免疫小鼠肿瘤组织肿瘤浸润淋巴细胞

免疫四周后的疫苗组小鼠，利用苏木素-伊红(HE)染色法对免疫小鼠肿瘤组织石蜡切片进行染色，观察免疫小鼠肿瘤组织的形态学变化，同时观察免疫小鼠的肿瘤组织中是否存在浸润的淋巴细胞(TIL)。

结果如图23(图A表示20×视野，图B表示40×视野)所示，在经DNA疫苗pSVK-G250FGB免疫的小鼠肿瘤组织局部，可以观察到明显的TIL浸润(图中黑色箭头所指)，说明该疫苗能给激发TIL浸润以达到缩小肿瘤的目的。

Claims (5)

1.一种可复制型肾癌治疗性DNA疫苗，是将复合基因sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7，简称G250FGB，插入序列表中序列1所示可复制型DNA疫苗载体pSVK中得到的，所述G250FGB复合基因是自5’端至3’端依次由序列表中序列2所示tG250复合抗原基因、人IgG Fc段基因、GPI基因、GM/CSF基因和B7.1基因组成的融合基因，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。

2.根据权利要求1所述的可复制型肾癌治疗性DNA疫苗，其特征在于：命名为pSVK-G250FGB的可复制型肾癌治疗性DNA疫苗的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

3.权利要求1或2所述可复制型肾癌治疗性DNA疫苗在制备预防和治疗肾癌药物中的应用。

4.含有权利要求1或2任一所述可复制型肾癌治疗性DNA疫苗的组合物。

5.权利要求4所述含有可复制型肾癌治疗性DNA疫苗的组合物在制备预防和治疗肾癌药物中的应用。