TR201802778T4 - Hücre kaynaklı/vezikül bazlı mikrorna verilişi için yöntemler, sistemler ve kompozisyonlar. - Google Patents
Hücre kaynaklı/vezikül bazlı mikrorna verilişi için yöntemler, sistemler ve kompozisyonlar. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201802778T4 TR201802778T4 TR2018/02778T TR201802778T TR201802778T4 TR 201802778 T4 TR201802778 T4 TR 201802778T4 TR 2018/02778 T TR2018/02778 T TR 2018/02778T TR 201802778 T TR201802778 T TR 201802778T TR 201802778 T4 TR201802778 T4 TR 201802778T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- exosomes
- cells
- mir
- mirna
- mirnas
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 12
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims abstract description 168
- 108091043612 miR-146b stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 67
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 35
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 138
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 44
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 33
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 10
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 6
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 17
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 15
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 3
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 abstract description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 120
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 114
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 77
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 31
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 24
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 14
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 14
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 14
- 108091070751 Caenorhabditis elegans miR-67 stem-loop Proteins 0.000 description 13
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 13
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 13
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 13
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 12
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 12
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 12
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 12
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 11
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 10
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 208000002409 gliosarcoma Diseases 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 7
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 3
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 3
- 101150039808 Egfr gene Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091093082 MiR-146 Proteins 0.000 description 2
- -1 NF-KB Proteins 0.000 description 2
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 2
- 238000007428 craniotomy Methods 0.000 description 2
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 230000008519 endogenous mechanism Effects 0.000 description 2
- 108700021358 erbB-1 Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000001928 neurorestorative effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 208000030266 primary brain neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-1-piperidin-4-ylpyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CC(O)CN1C1CCNCC1 HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010061764 Chromosomal deletion Diseases 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000852483 Homo sapiens Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001011886 Homo sapiens Matrix metalloproteinase-16 Proteins 0.000 description 1
- 102100036342 Interleukin-1 receptor-associated kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100030200 Matrix metalloproteinase-16 Human genes 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000001738 Nervous System Trauma Diseases 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 102000003714 TNF receptor-associated factor 6 Human genes 0.000 description 1
- 108090000009 TNF receptor-associated factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001348 anti-glioma Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 208000029824 high grade glioma Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 201000011614 malignant glioma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 108091090951 miR-67 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000003253 miRNA assay Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002687 nonaqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000011338 personalized therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 108700010449 tumor-promoting protein Proteins 0.000 description 1
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2330/00—Production
- C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Mevcut buluş, beyin kanseri olan bir kişinin tedavisinde kullanılmak üzere miR-146b içeren eksozomlar olup, sınırlama olmaksızın, açıklamanın bazı yapılanmaları, mikroRNA'lar ile ilgili yöntemler, sistemler ve kompozisyonlar ve zararın veya hastalığın araştırılması, teşhisi ve tedavisinde kullanımı ile ilgili kompozisyonları içermesi ile ilgilidir.
Description
TEKNIK ALAN
Sinirlama olmaksizin, açiklamanin bazi yapilanmalari, mikroRNA'Iar ile ilgili yöntemler,
sistemler ve kompozisyonlar ve zararin veya hastaligin arastirilmasi, teshisi ve
tedavisinde kullanimi ile ilgili kompozisyonlari içerir.
ARKA PLAN
Teshis, kemoterapötikler ve cerrahi tekniklerdeki gelismelere ragmen, glioblastoma
multiforme ("GBM") gibi beyin kanserleri de dahil olmak üzere, ancak bunlarla sinirli
olmayan, bilinen tipteki kanserlerin prognozu zayif kalir.
Mikro RNA'lar ("miRNA" veya "miRs"), hücrelerdeki gen ekspresyonunu düzenleyebilir
ve terapötik fayda için kullanilabilir. Sinirlayici olmayan örnekler olarak, miRNA'lar
tümör progresyonunu inhibe etmek veya doku iyilesmesini artirmak için kullanilabilir.
Epidermal büyüme faktörü reseptörü ("EGFR") ve miR-146b ekspresyonunun
GBM'Ierde ters olarak körele oldugu gösterilmistir. Bununla birlikte, birçok EGFR
inhibitörü, genotip ve ilaç yaniti arasindaki iliskinin diger kanserlerde oldugu
durumlarda bile, GBM regresyonunu klinik olarak indükleme konusunda büyük ölçüde
basarisiz olmustur. Bundan baska, GBM'Ier çesitli genetik sapmalar sergiler. Bu
nedenle, GBM de dahil olmak üzere, ancak sadece bunlarla sinirli degildir, birçok
kanser için terapötik tedavilere ihtiyaç duyulmaktadir.
Efektif miRNA tedavisi için üstesinden gelinmesi gereken bir zorluk, terapötik
miRNA'larin hedef hücrelere, dokulara veya organlara etkin bir sekilde verilmesidir. Bir
miRNA-bazli tedaviyi gelistirmede baskin bir teknik zorluk, önemli miktarda miRNA'yi
etkili bir sekilde absorbe etmek ve birlestirmek için hedef hücrelerin alinmasidir.
Mevcut bulus, ekteki istemler ile tanimlanmaktadir. Bazi yapilanmalarin asagidaki
örnekleri, bulusu sadece burada açiklanan yapilanmalara sinirlamadan ve herhangi
bir yapilanma veya konudan vazgeçmeden saglanmistir.
Mevcut açiklamada, terapötik tedaviler için hücrelere, dokulara veya organlara etkili bir
sekilde hedeflenen, absorbe edilen ve/veya bunlara dahil edilen miRNA'lari kullanan
yöntemler, sistemler ve/veya kompozisyonlar saglanmaktadir. Açiklamanin bazi
yapilanmalari, miR-146b de dahil olmak üzere, fakat sadece bununla sinirli degildir,
bir veya daha fazla seçilmis miRNA'lar içeren modifiye edilmis eksozomlar veya diger
vezikülleri üretmek ve/veya uygulamak için yöntemler, sistemler ve/veya
kompozisyonlar içerir. Açiklamanin bazi yapilanmalarinda, sinirlama olmaksizin,
miRNA kodlayan plazmidler, multipotent mezensimal stromal hücreler ("MSC'Ier)
içeren, fakat bunlarla sinirli degildir, üretici hücreler transfekte edilir. Transfekte edilmis
miRNA'lari içeren eksozomlar bu hücrelerden toplanir ve zarardan veya hastaliktan
muzdarip olan bir kisiye uygulanmasi için kullanilir. Ilave olarak veya alternatif olarak,
modifiye eksozomlardan türetilen MiRNA'ya sahip üretici hücreler toplanabilir ve
hastaya uygulanabilir. Açiklamanin bazi yapilanmalari, insan dahil olmak üzere
memelilerin yaralanmalarini ve hastaliklarini tedavi etmek için bu tarz miRNA'larin,
modifiye edilmis eksozomlarin ve/veya üretici hücrelerin terapötik uygulanmasini ve
kullanilmasini içerir.
çiziMLERiN KISA AÇIKLAMASI
Açiklamanin bazi yapilanmalari, sadece örnekleme yoluyla ve diger yapilanmalardan
vazgeçmeksizin ekteki çizimlere referans ile tarif edilecektir; burada:
Sekil 1, bir miR-146b ekspresyon plazmidiyle transfekte edilmis MSC'Ierden gelen
eksozomlarin 9L glioma hücrelerinin kültürlerine uygulandiginda EGFR'yi ve NF-KB'yi
azalttigini gösteren bir veri sunumu ve görüntüleridir.
Sekil 2 bir eksozom bazli terapötik miRNA verilis sisteminin bir genel bakisidir.
Sekil 3 önemli derecede yüksek seviyelerde miR-146b içeren miR-146b ekspresyon
plazmid salim eksozomlari ile transfekte edilmis MSCJIerden elde edilen eksozomlari
gösteren bir veri sunumudur.
Sekil 4, 9L gliosarkoma tümör hücrelerinin canliligini azaltan bir miR-146b ekspresyon
plazmid salim eksozomlari ile transfekte edilmis MSC'lerden elde edilen eksozomlari
gösteren bir veri sunumudur.
Sekil 5, 9L gliosarkom tümörleri tasiyan siçanlara uygulandiginda tümör büyümesini
azaltan bir miR-146b ekspresyon plazmidi ile transfekte edilmis MSC'Ierden elde
edilen eksozomlari gösteren bir veri sunumu ve görüntüleridir.
Sekil 6, MSC kültür ortamindan izole edilen MSC eksozomlarinin bir elektron
mikrografini, M67-ekso ve M146-eks0 içindeki miR-146b ekspresyonunun gerçek
zamanli PCR bulgulari ve M67-ekso ve M146-ekso ile muamele edilmis 9L
hücrelerimdeki ß-aktin ve EGFR protein ekspresyonu için bir Western blot gösteren
görüntüler ve grafiklerdir.
Sekil 7, tümör implantasyonundan sonra kurban edilen siçanlardan alinan,
representatif H&E boyali koronal kesitlerin görüntüleri ve 9L ksenograft tümörlerinin
volumetrik ölçümünün bir grafigidir.
DETAYLI AÇIKLAMA
Sadece burada açiklanan yapilanmalara sinirlama getirmeksizin ve herhangi bir
yapilanma veya konudan vazgeçilmeksizin, açiklamanin bazi yapilanmalari, hedef
eksozom üreten hücrelerde miRNA ekspresyonunun modifiye edildigi ve eksozomlarin
veya diger veziküllerin, bu hücrelerden gelen ve/veya bu hücrelerin kendisindeki
miRNA'Iarin terapötik miRNAtnin hücrelere, dokulara veya organlara iletilmesi için
verilis araçlari olarak kullanildigi bir miRNA verilis sistemi içermektedir. Açiklamanin
bazi yapilanmalari, sinir sistemi yaralanmalari veya aksi takdirde azalmis hücre ve
sistem fonksiyonu ile sonuçlanabilen hastaliklarini içeren, fakat sadece bunlarla sinirli
olmayan, memelilerin yaralanmalarini ve hastaliklarini tedavi etmek için bu tür
indüklenmis hücrelerin terapötik uygulanmasini ve kullanimini içerir. Bu sekilde
farklilasmis MSC'Ierin ve/veya ortaya çikan hücrelerin indüklenmesi, bir hastada
hücre, doku veya organ hasarinin, soz konusu hastaya terapötik olarak etkili miktarda
bir ilgili miRNA veya bu arz miRNA'lar tarafindan indüklenmis farklilasmis MSCIerin
uygulanmasi ile tedavi edilmesi için kullanilabilir.
MiRNA ile tedavide baskin bir problem, hedef hücrelerin miRNA'yi etkili bir sekilde
absorbe etmesi ve içine almasidir. Açiklamanin bazi yapilanmalari terapötik
miRNA'lari tedavi için bir hastadaki doku veya baska yerlere etkin bir sekilde iletecektir.
Ornegin, açiklamanin bazi yapilanmalari bir kanser hastasina uygulanabilen bir veya
daha fazla anti-tümör miRNA türünü tasiyan Özel eksozomlar üretmek için kullanilabilir.
Alternatif olarak açiklamanin bazi yapilanmalari, inme geçirmis bir hastaya
uygulanabilen bir veya daha fazla nöro-restoratif miRNA türünü tasiyan özel
eksozomlar üretmek için kullanilabilir. Açiklamanin bazi yapilanmalari, tedavisinde
miRNA terapisinin faydali olacagi çoklu patolojilerin tedavisinde kullanilabilen,
özellestirilebilir bir miRNA verilis sistemini içermektedir.
MiRNA'Iar, hücrelerdeki gen ekspresyonunu düzenleyebilir ve terapötik fayda için
kullanilabilir. Ornegin, miRNA'Iar tüm'or ilerlemesini inhibe etmek veya doku
iyilesmesini artirmak için kullanilabilir. Etkili miRNA terapisi için üstesinden gelinmesi
gereken bir zorluk, etkilenen hücreye, dokulara veya organlara etkili bir sekilde
miRNA(lar) iletmektir.
Açiklamanin bazi yapilanmalari bir veya daha fazla türde miRNA ile eksozomlarin
paketlenmesini içerir ve miRNA hücre üretimi için endojen olabilir veya yabanci olabilir
veya yapay olarak tasarlanabilir (yalnizca bir örnek olarak orijinal DNA plazmid(ler)
tasarimi), çok yönlü bir miRNA verilis metodu içerirler. Ornegin, Iipozomlar veya
nanopartiküller gibi birçok nükleotid verilis araci, aracin nükleotid ile önceden
yüklenmesi veya baglanmasini gerektirirken, açiklamanin belirli yapilanmalari,
miRNA'yi olusturmak ve eksozomu yüklemek için üretici hücreleri kullanir.
Bir hastaya yabanci partiküllerin verilmesi immün cevaba neden olabilir. MSC gibi
hücreler kullanilirsa, hastanin kendi MSC'Ierini üretici hücreler olarak kullanmak
mümkündür; bu nedenle, verilis araçlarinin immün rejeksiyonundan kaçinilabilir veya
immün rejeksiyon azaltilmis olabilir.
Sinirlama olmaksizin, açiklamanin bazi yapilanmalari, miRNA içeren eksozom devam
eden üretimini içerir ve ayni zamanda, miRNA tasiyan eksozom üreten hücrelerin
transplantasyonunu saglar. Bir defa transfekte olunca, üretici hücreler uzun süreler
boyunca özel miRNA tasiyan eksozomlari ve miRNA'Iari üretebilir veya üretmeye
devam edebilir. MiRNA, miRNA'nin tüm dizisini içerebilir veya tüm dizinin hedeflenen
aktivitesini koruyan herhangi bir alt parçayi veya varyanti içerebilir. Bu yaratim veya
üretim, belirli avantajlar saglayabilir, fakat sadece bunlarla sinirli degildir, 1)
eksozomlar birçok zaman noktasinda toplanabilir ve birkaç günde veya haftada
hastaya gonderilebilir, ve 2) üretici hücrelerin kendileri, muamele edilecek olan dokuya,
ozel mRNA tasiyan eksozomlar ve yerinde miRNA'lar üretmek üzere transplante
edilebilirler.
MSC'Iere giren miRNA'Iarin ve diger bazi hücre tiplerinin sonradan eksozomlardaki
hücrelerden salindigini kesfettik. Sinirlayici olmayan bir 'Örnek olarak, C. elegans
miRNA ceI-miR-67'yi kodlayan bir DNA plazmiti ile MSC'Ieri transfekte ettigimizde, bu
MSC'Ierden salinan eksozomlarda bir ceI-miR-67 miRNA'nin çok oldugunu bulduk.
Eksozomlar diger hücrelere dahil edilebildiginden açiklama, hedef eksozom üreten
hücrelerde (bir sinirlandirici olmayan örnek olarak MSC'Ier) ve bu hücrelerden
eksozomlar ve/veya hücrelerin kendileri içinde miRNA ekspresyonunun modifiye
edildigi bir miRNA üretim ve verilis sistemi saglamaktadir, terap'otik miRNA(Iar)i
hücrelere, dokuya veya organlara almak için verilis araci olarak kullanilirlar.
Açiklamanin bazi yapilandirmalarinda, üretici hücreleri (MSC'Ier, 9L glioma hücreleri
ve HEK hücreleri), miRNA'lari kodlamak üzere tasarlanmis DNA plazmidleri ile
transfekte ettik. Açiklamanin bazi yapilanmalarinda ceI-miR-67 için kodlanmis
plazmidler (memeli hücrelerinde bulunmayan bir kontrol miRNA) ve miR-146b (daha
önce anti-tümör etkisine sahip oldugunu buldugumuz bir miRNA) kullandik. Bu
hücrelerden üretilen eksozomlari (1 gün, 2 gün ve 3 gün sonra) topladik ve RT-PCR
kullanarak cel-miR-67 plazmidiyle transfekte edilen hücrelerden sadece eksozomlarda
ceI-miR-67 tespit ettik. Ayrica, miR-146b plazmiti ile transfekte edilen eksozomlarda
yüksek derecede artmis seviyelerde (160X kontrole kadar) miR-146b tespit ettik. Diger
çalismalarimiza dayanarak, glioma hücrelerinin cel-miR-67 ile muamele edilmesinin
hücre canliligi üzerinde herhangi bir etkisi yok iken glioma hücrelerinin miR-146b ile
muamele edilmesinin, hücre canliligini ve tümör hücresi invazyonunu azaltacaktir.
Kromozom 10 üzerindeki delesyonlar, GBM'Ierde gözlenen en sik görülen kromozomal
degisikliklerdir ve vakalarin yaklasik olarak % 80'inde heterozigotluk kaybi gözlenir.
bulunur. U87-MG, U251 ve hücreler ile HFH66 primer insan glioblastoma hücrelerinin,
normal kortikal insan astrositlerinden çok daha az miR-146b eksprese ettigini bulduk.
EGFR gen amplifikasyonu tüm GBM'Ierin yaklasik % 40'inda gerçeklesir ve artmis
EGFR ekspresyonu glioma invazyonu ve malignite ile korelasyon gösterir. EGFR
sinyal agi, antikorlar, tirozin kinaz inhibitörleri veya asilari kullanarak reseptörün inhibe
edilmesi üzerinde yogun çaba sarf edilerek anti-tümör tedavisi için bir hedef
olmaktadir.
Çalismamizda, 9L gliosarkoma hücrelerini cel-miR-67 plazmidi ile transfekte edilmis
hücrelerden ve miR-146b plazmidi ile transfekte edilmis hücrelerden elde edilen
eksozomlar ve ayrica transfekte edilmemis hücrelerden elde edilen eksozomlar ile
muamele ettik. Tüm kontroller ile karsilastirildiginda MTT'yi kullanarak, miR-146b
plazmidi ile transfekte edilen hücrelerden elde edilen eksozomlarla muamele
edildiginde, glioma hücresi canliliginin önemli ölçüde azaldigini bulduk. Bu nedenle,
bir miR-146b plazmid ve üretici hücreler kullanilarak, efektif olarak ve etkili bir sekilde,
önemli bir anti-tümör etkisi ortaya çikaran miR-m146b'yi tümör hücrelerine uyguladik.
MiRNA'lar, hedef mRNA'Iarinin translasyonunu inhibe eder. MiR-146b, aralarinda
EGFR, NF-KB, IRAK1 ve TRAF6rnin bulundugu bazi tümör arttirici proteinlerin
üretimini inhibe edebilir. Western blot kullanarak, miR-146b plazmid ile transfekte
edilen hücrelerden elde edilen eksozomlarin, kontrol eksozomlari veya ceI-miR-67
plazmidi ile transfekte hücrelerden elde edilen eksozomlar ile muamele edilen hücreler
ile karsilastirildiginda, glioma hücrelerindeki EGFR, NF-KB, lRAK-1 ve TRAF6
ekspresyonunu önemli ölçüde azalttigini bulduk. Diger sistemlerde miR-146b'nin
hedefi olan diger proteinler, MMP16 gibi etkilenmemis olmasi, gözlemledigimiz etkinin
spesifik oldugunu göstermistir. Sekil 1, MSC eksozomlarina maruz birakildiktan sonra
glioma hücrelerinde ve astrositlerdeki protein ekspresyonunu göstermektedir.
ekso“) ile karsilastirildiginda 9L hücrelerde EGFR ve NF-KB protein ekspresyonunu
azaltmistir. NF-KB M146-ekso ayrica primer kortikal siçan astrositlerinde NF-KB
proteinini hafifçe düsürmüstür. Bu sonuçlar, eksozomlar içerisinde paketlenmis miR-
146b'nin, muamele görmüs tümör hücrelerinde hedeflenen proteinleri önemli ölçüde
inhibe edebildigini, fakat tümör disi astrositleri önemli ölçüde inhibe edemedigini
göstermektedir.
Açiklamanin bazi yapilanmalari, genis bir araliktaki hastalik veya yaralanmalarda
uygulanabilen yeni ve çok yönlü bir miRNA verilis sistemini içerir. Klinik olarak, anti-
tümör miRNA'Iar eksozomlar içine paketlenebilir ve bu eksozomlar hastaya
uygulanabilir. Bir veya daha fazla türdeki miRNA'yi verimli bir sekilde paketleme
kabiliyeti, çok yönlü bir miRNA verilis sistemiyle sonuçlanir. Böylece, ambalajlanan
miRNA'lara bagli olarak, genis bir araliktaki hastalik veya yaralanmalar, modifiye
edilmis eksozomlarla tedavi edilebilir.
Bundan baska, burada tarif edildigi sekilde, üretici hücreler, bir kisideki hedeflenen bir
bölgeye uygulanabilir ve böylece, özel miRNA tasiyan eksozomlarin lokal olarak
sürekli üretilmesi ve/veya seçilen miRNA'larin üretici hücrelerin kendisinden terapötik
olarak salinmasini saglanabilir.
Açiklamanin bazi yapilanmalari, sadece bunlarla sinirli olmayacak sekilde,
asagidakileri içeren 'özellikleri içerir: 1) hücre kaynakli veziküller gibi etkili bir miRNA
verilis yontemi hücre içine kolayca dahil edilir, 2) bir veya daha fazla miRNA türünü
içerebilen hücre kaynakli veziküllerin (sinirlayici olmayan bir örnek olarak, eksozomlar)
üretimi ve bunlar endojen olarak olusabilir veya özel olarak tasarlanmis miRNA'lardir,
3) çünkü herhangi bir miRNA(Iar) paketlenebilir, birçok farkli hastaligin tedavisinde
miRNA tasiyan eksozomlar üretilebilir, 4) eksozomlar tasiyan ex vivo miRNA'Iarin
devam eden bir temini için eksozom üreten hücrelerin kullanimi ve/veya miRNA
tasiyan eksozomlarin lokal olarak üretilmesi için in vivo transplantasyon, 5) miRNA
tasiyan eksozomlar üretmek için çoklu hücre tiplerinin kullanimi, 6) terapötik ilgi konusu
dokulari spesifik olarak hedeflemek üzere tasarlanmis modifiye hücreler ve/veya
eksozomlarin kullanimi, ve 7) eksozomlar dogal olarak ortaya çiktigi için advers
etkilerden kaçinilmasi veya bunlarin hafifletilmesi ve böylece özel miRNA tasiyan
eksozomlar uygulandiklarinda muhtemel daha az yan etkilere sahip olacaklardir.
Açiklamanin bazi yapilanmalari, modifiye edilmis eksozomlara ek olarak veya es
zamanli olarak benzer sekilde modifiye edilmis, hücre kaynakli membran veziküllerin
üretimi ve/veya uygulanmasini içerebilir.
Açiklamanin bazi yapilanmalari terapötik miRNA moleküllerini hastalarin dokularina
vermek için yöntemler, sistemler ve/veya kompozisyonlar içerir. Sekil 2*de gösterildigi
gibi, açiklamanin bazi yapilanmalari asagidaki basamaklarin bir veya daha fazlasini
içeren yöntemler ve/veya sistemler içerir: 1) terap'otik oldugu tespit edilen MiRNA'lar,
eksozom üreten hücrelerde eksprese edilir, 2) üretici hücreler, belirtilen terap'otik
miRNA'lari içeren eksozomlari salmaya baslarlar ve 3) terapötik miRNA içeren
eksozomlar toplanir ve hastaya verilir ve/veya terapbtik miRNA içeren eksozomlari
salmasi için üretici hücreler hastaya uygulama sonrasinda verilir.
Açiklamanin bazi yapilanmalari, yüksek konsantrasyonlarda bir veya daha fazla tipte
miRNA bulunan eksozomlarin paketlenmesini içerir ve bu miRNAlar, terapötik dozlar
halinde dokuya verilir. Paketlenmis miRNAlar, üretici hücrelere endojen olanlar olabilir,
ancak bunlar daha yüksek seviyelerde ek3presyona zorlanirlar veya terapötik ihtiyaca
uyacak sekilde suni olarak tasarlanmis miRNA'lar olabilirler. Ayni zamanda, ayni
eksozomlar içerisinde miRNA'Iarin bir kombinasyonu da paketlenebilir.
ORNEKLER
Asagidaki örnekler, bulusu yalnizca burada tarif edilen yapilanmalara sinirlamaksizin
ve herhangi bir yapilanmadan vazgeçmeksizin sunulmaktadir.
MSC'Iere veya diger hücrelere giren miRNA'Iarin, daha sonra eksozomlar halinde bol
miktarda paketlendigini ve hücrelerden salindigini bulduk. Tanitilan miRNA'lari içeren
bu eksozomlar kültür ortaminda izole edilebilirler. Ornek olarak, MSC'leri miRNA cel-
miR-67'yi kodlayan bir DNA plazmidi ile transfekte ettigimizde, bu MSC'lerden salinan
eksozomlarda bol miktarda cel-miR-67 miRNA bulduk. MiRNA cel-miR-67, memeli
MSC`Ieri tarafindan dogal olarak üretilmez. Dolayisiyla, dogal olmayan miRNA'lari
eksozomlar içine paketleyebilir, bu, açiklamanin bazi yapilanmalarinin, ilgili herhangi
bir geni hedef alacak sekilde özellestirilen küçük miRNA benzeri dizileri tasarlamak için
kullanilabilecegi anlamina gelir. MSC hücreleri, memeli MSC'Ierine özgü bir miRNA
olan rno-miR-146b ile transfekte edildiginde, miR-146b ile transfekte MSC'Ierden elde
edilen eksozomlarin, kontrol ile karsilastirildiginda önemli derecede daha yüksek
seviyelerde miR-146b içerdigini de beklenmedik bir sekilde bulduk (Sekil 3). MiR-146b
seviyelerinin, saf hücrelerden elde edilen eksozomlarla karsilastirildiginda, ilgili
gruplarin hücre gövdelerindeki miR-146b seviyelerine göre miR-146b üreten
hücrelerden elde edilen eksozomlarda rölatif olarak daha yüksek oldugunu tespit ettik.
Dahasi, miR-146b üreten hücrelerden elde edilen MSC eksozomlarinda tespit edilen
miR-146b seviyeleri, ceI-miR-67 üreten hücrelerden elde edilen eksozomlarda tespit
edilen ceI-miR-67'den, MSC eksozomlarinda naif düzeylerde miR-146b için normalize
edildiginde bile, birkaç kat daha yüksek seviyelere sürekli ve beklenmedik sekilde
yükselmistir. Bu veriler, miR-146b'nin üretici hücreler tarafindan eksozomlar içinde
tercih edilen sekliyle paketlendigini göstermektedir. Yukaridaki gibi eksozomlar, 9L,
HEK, astrositler veya oligodendrositler gibi bilinen diger hücre tiplerinden de
toplanabilir. Bununla birlikte, bilinen diger hücrelerin MSC'Ierin üretim kapasitesinden
yoksun oldugunu ve aslinda transfekte edildiklerinde, MSC'Ierin yeni ve son derece
verimli birere üretici hücre olduklarini bulduk. Buna ek olarak, bazi anti-tümör
miRNA'larin hücrelerdeki metabolik süreçleri bastirabildiginden, miR-146b ifadesinin
MSC`Ier tarafindan eksozom üretiminden ödün vermedigini veya önemli bir özellik
olarak, MSC canliligini önemli ölçüde degistirmedigini bulduk. Eksozomlar diger
hücrelere dahil edilebildiginden, terap'otik miRNA'lar için bir verilis araci olarak MSC
eksozomlarinin kullanimini gelistirdik.
Terapötik miRNA tedavisi için mevcut bir problem, hedef hücrelerin miRNA'yi etkin bir
sekilde absorbe etmesi ve içine almasidir. Açiklamanin bazi yapilanmalari, MSC gibi
hücrelerden kolaylikla absorbe edilebilen eksozomlari kullanir. Daha sonra terapötik
miRNA'yi veya terapötik miRNA'larin bir kombinasyonunu MSC eksozomlari içine
paketler ve eksozomlari verilis araci olarak kullaniriz. Ornegin açiklamanin bazi
yapilanmalari, kanser hastasina uygulanabilen bir veya daha fazla tipteki anti-tümör
miRNAryi tasiyan özel eksozomlarin üretilmesi için kullanilabilir. Alternatif olaraki
açiklamanin bazi yapilanmalari, Alzheimer hastaligi veya inme gibi nörolojik bir
hastaliga yakalanan bir hastaya uygulanacak nörorestoratif miRNA'lari tasiyan özel
eksozomlar üretmek için kullanilabilir. Açiklamanin bazi yapilanmalari, miRNA terapisi
ile tedavinin yararli olacagi çoklu patolojilerin tedavisinde kullanilabilen, özellestirilebilir
bir miRNA verilis sistemini içermektedir.
Anti-tümör miRNA miR-146b'yi MSC eksozomlarinda paketledik ve 9L gliosarkom
hücrelerini bu eksozomlar ile in vitro ortamda tedavi ettik. MTT hücre canliligi analizi
kullanilarak, 9L gliosarkom hücresi canliliginin, kontrolle karsilastirildiginda miR-146b
içeren MSC eksozomlari ile tedavi edildiginde önemli ölçüde azaldigini bulduk (Sekil
4, bir miR-146b ekspresyon plazmidi ile transfekte edilmis MSC'Ierden elde edilen
eksozomlarin, 9L gliosarkom tümör hücrelerinin hücre canliligini azalttigini
göstermektedir.). Bu nedenle, MSC eksozomlari içindeki miR-146b'yi paketlemek için
miR-146b plazmidini ve üretici hücreleri kullanarak, miR-146b'yi tümör hücrelerine
efektif olarak ve etkili bir sekilde uyguladik, bu da önemli bir anti-tümör etkisi ortaya
çikardi. MiR-146b tasiyan MSC eksozomlarinin miRNA'yi tümör hücrelerine aktarip
aktarmadigini belirlemek için, in vitro olarak miR-146b içeren MSC eksozomlarina
(M146-ekso) veya cel-miR-67 içeren eksozomlara (M67-ekso) 9L hücreleri maruz
biraktik. 24 saatlik tedaviden sonra. M146-ekso ile muamele edilen 9L hücrelerinde
tespit edilen miR-146b, M67-ekso ile muamele edilen hücreler ile karsilastirildiginda
8.5 ± 0.4 kat daha yüksek iken, M67-ekso ile muamele edilen 9L hücrelerinde cel-miR-
67 tespit edilmis, ancak M146-ekso ile muamele edilmis hücrelerde tespit edilmemistir.
Bu MSC eksozomlarinin tümör hücreleri içine plazmid tarafindan eksprese edilmis
miRNA'Iar verilebilecegini göstermistir.
MSC eksozomlari içinde paketlenmis bir anti-tümör miRNA'nin in vivo tümör
büyümesini azaltip azaltmayacagini belirlemek için, 9L gliosarkom beyin tümörü
tasiyan siçanlari, intra-tümör uygulamasi yoluyla, bu miR-146b içeren MSC
eksozomlari paketi ile tedavi ettik. 24 adet Fischer siçani 9L gliosarkoma ile implante
edilmistir. 5 gün sonra, cel-miR-67 ile transfekte edilmis MSC'Ierden (kontrol) elde
edilmis cel-miR-67 içeren eksozomlar, MiR-146b ile transfekte edilmis MSC'Ierden
elde edilmis miR-146b içeren eksozomlar veya salin tedavisi, intra tümör enjeksiyonu
yoluyla uygulanmistir (her tedavi grubu n=8). Tümör implantasyonundan 10 gün sonra
hayvanlar kesilmis ve tümör hacmi hesaplanmistir. Sekil 5'de gösterildigi gibi, miR-
146b içeren MSC eksozomlariyla yapilan tedavi, cel-miR-67 içeren MSC eksozom
kontrol ile karsilastirildiginda 9L gliosarkom tümörü tasiyan siçanlarda tümör
büyümesini önemli ölçüde azaltmistir (cel-miR-67, siçan mRNA'sinda baglanma
yerlerine sahip degildir). (Sekil 5 açiklamalari: PBS (sadece araç), M146-ekso veya
ceI-miR-67 eksozomlari ("M67-ekso"), tümör implantindan 5 gün sonra intra-tümör
enjeksiyonu ile uygulandi. Hayvanlar, implanttan 10 gün sonra (her grup için n=8)
kurban edildi. Çubuklar standart sapma.)
Eksozomlar genellikle, miRNA içerebilen çok çesitli memeli hücreleri tarafindan
salinan 30-150 nm boyutundaki keseciklerdir. MSC eksozomlarinin anti-tümör
miRNA'Iarin verilisi için bir araç olarak kullanilip kullanilamayacagini belirlemek için
MSC'Ieri bir miR-146b ekspresyon plazmidi ile transfekte ettik ve MSC'ler tarafindan
salinan eksozomlari topladik. MiR-146 eksprese eden MSC'lerden türetilen
eksozomlarin intra tümör enjeksiyonu, bir primer beyin tümörü olan fare modelinde
glioma ksenograft büyümesini önemli ölçüde azaltmistir.
Aberant gen ekspresyonu, GBM'Ier de dahil olmak üzere kanserde miRNA
disfonksiyonunun bir mekanizmasidir ve miRNA'Iar, normal dokuyla
karsilastirildiginda GBM içinde farkli sekilde eksprese edilirler. Insan mir-146b, bu
motilitesini ve istilasini azaltir ve EGFR mRNA, miR-146b susturulmasi için bir
baglanma hedefidir. EGFR gen amplifikasyonu tüm GBM'Ierin yaklasik % 40'inda
gerçeklesir ve artmis EGFR, glioma invazyonu ve malignitesi ile korelasyon gösterir.
MiR-146b'nin in vivo olarak bir anti-glioma miRNA olarak islev görüp göremeyecegini
belirlemek için primer beyin tümörünün 9L ksenograft modelini kullandik.
Materyaller ve metotlar:
Tümör implantasyonu.
Erkek Fischer siçanlari (250-275 9) kullanilmistir. Koronal sütüre dogru sag hemisfer
üzerinde 2 mm çapli kraniotomi yapildi. Bir Hamilton siringa kullanarak, tümör hücreleri
3.5 mm derinlikte, saga 3.0 mm ve bregma'nin 1.0 mm önüne enjekte edildi. Siçanlar,
dakika ara ile ile implante edildi. Kraniotomi Horsley
kemik mumu ile örtülmüs ve ensizyon 4-0 ipek sütür (Ethicon) ile kapatilmistir.
Hayvanlar, tümör implantasyonundan, tedaviden ve öldürülmeden önce tartildi. Tedavi
gruplari arasinda agrilik bakimindan istatistiksel olarak anlamli bir farklilik saptanmadi.
Siçanlar, i.p. ketamin (100 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) uygulanmasi ile anestezi
altinda implantasyondan 10 gün sonra öldürülmüstür. Hayvanlar % 0.9 salin ile
vasküler yikamayi takiben % 10 formalin ile perfüze edildi. Beyinler çikarildi, sabitlendi
ve parafin içine gömülü olan 2 mm kalinliginda bloklar halinde kesildi. Kesitler
hematoksilin ve eozin ile boyandi. Tümör hacmini ölçmek için her koronal bölüm içinde,
MClD yazilimi (lnterFocus Imaging) kullanilmasi ile tümörün sinir çizgisini izleyerek
tümör alani ölçüldü ve kesit kalinligi ile izlenen alan çarpilarak bölüm hacmi tespit
Plazmidler ve MSC transfeksiyonu
CeI-miR-67 ve hsa-miR-146b ekspresyon plazmidleri (GenScript) kullanildi. CeI-miR-
67'ye göre kullanilan plazmid pRNA-CMV3.1/Puro plazmidi idi, SEK lD NO: 1; ayrica
burada referans olarak dahil edilen http:l/www.genscript.com/vector/SD1233-
pRNA_CMV3_1_Pur0.htmI'ye bakiniz. Eklenen ceI-miR-67 dizisi SEQ lD NO: 2'yi
içermektedir. Has-miR-146b ile ilgili olarak kullanilan plazmid, SEK lD NO: 3; pEP-miR
plazmidi idi, ayrica burada referans olarak dahil edilen
http://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/MlR-1468.pdf'e bakiniz. Eklenen has-
miR-146b dizisi SEK ID NO: 4'ü içermektedir. MSC transfeksiyonu elektroporasyon
kullanilarak gerçeklestirildi. MSC transfeksiyonu elektroporasyon kullanilarak
gerçeklestirildi. 2 x 106 MSC, 2 mg plazmid DNA'si içeren 150 pl lngenio
Elektroporasyon Çözeltisinde (Mirus) süspanse edildi. Bir Amaxa Nükleofektör
Cihazi'nda elektroporasyon için A-33 programi kullanildi. Transfekte edilen hücreler,
ml eksiksiz kültür ortaminda yeniden süspanse edildi, santrifüj edildi ve daha sonra
Eksozom hazirlanmasi ve toplanmasi.
2x106 MSC, % 20 Fetal Sigir Serumu ile takviye edilmis 10 ml Dulbecco's Modifiye
Eagle Ortami içine ekildi. 48 saat sonra, eksozomlar MSC ortamindan ExoQuick-TC
(System Biosciences, CA) kullanilarak izole edildi. Eksozom pelletler 10 ug/ul toplam
protein konsantrasyonunda steril PBS içerisinde yeniden süspanse edildi. Eksozom
süspansiyonlar buz üzerine yerlestirildi ve toplandiktan sonraki 6 saat içinde
hayvanlara uygulandi. Elektron mikroskopisi ile görüntülenen eksozomlar,
glutaraldehid (5 pg/pl) içinde 30 dakika sabitlestirildi.
Eksozom tedavisi
Tedavi için, 5 pl M67-ekso veya M146-ekso süspansiyonu, her bir hayvana, tümör
implantasyonundan 5 gün sonra intra-tümör enjeksiyonu yoluyla enjekte edildi. Bir
Hamilton siringa kullanarak, eksozom süspansiyonu veya PBS araci, 5 dakikalik
araliklarla tümör implantasyonu ile ayni koordinatlara enjekte edildi. Gerçek zamanli
PCR, tedavi için kullanilan M67-ekso ve M146-ekso içinde rolatif cel-miR-67
ekspresyonunu ve miR-146b ekspresyonunu belirlemek için kullanildi. MiR-146b,
ekso'da tespit edilmedi, ancak M67-ekso'da 33.2 ± 2.3'Iük bir CT degeri ile tespit edildi.
Gerçek zamanli PCR
MiRNA ekspresyonunu analiz etmek için, MSC hücreleri, 9L hücreleri veya MSC
eksozomlari Qiazol reaktifi içinde eritildi ve toplam RNA, miRNeasy Mini kiti (Qiagen)
kullanilarak izole edildi. Revers transkripsiyon, miRNA Reverse Transcription Kit
(Applied Biosystems) ile gerçeklestirildi ve cDNA, olgun miRNA dizileri için spesifik
TaqMan miRNA tayinleri (Applied Biosystems) ile amplifiye edildi. 40 amplifikasyon
siklusu gerçeklestirildi. Rölatif miRNA ekspresyonunu belirlemek için 2-AACT yöntemi
kullanildi. 40 amplifikasyon döngüsünde bir BT'ye ulasilamazsa, ölçülen miRNA'nin
tespit edilmedigi kabul edildi.
Western blot.
2 x 105 9L hücreler 6 oyuklu bir plakaya ekildi ve gece boyunca kültüre birakildi. 5 pl
PBS içinde M67-ekso veya M146-ekso (50 mg toplam protein) kültür ortamina ilave
edildi. 24 saat sonra 9L hücreler eritildi ve EGFR ve ß-aktini saptamak için Western
blot kullanildi (Santa Cruz Biotechnology). Protein konsantrasyonu, bir BCA protein
test kiti (Pierce) kullanilarak hesaplandi. Görsellestirme için SuperSignal West Pico
Chemiluminescent Substrat (Pierce) ve Kodak X-omat filmi (Kodak) pozu kullanildi.
Istatistiksel analiz.
Veriler ortalama ± s.e.m olarak gösterilmektedir. P-degerleri tek yönlü ANOVE ve
Student's t testi kullanilarak hesaplanmistir. Bir p degeri 0.05 veya daha az ise
istatistiksel olarak anlamli kabul edilmistir.
Sonuçlar:
MSC'Ierin miR-146b'yi salgilanmis eksozomlar içine paketleyip paketlemeyecegini
belirlemek için farelerden elde edilen MSC'leri miR-146b'yi kodlayan bir plazmid ile
veya siçanda bilinen bir mRNA baglanma hedefine sahip olmayan ceI-miR-67 ile
transfekte ettik. Transfeksiyondan 48 saat sonra, eksozomlar ortamdan izole edildi ve
miR-146b ve ceI-miR-67 MSC'Ier ve ekstraselüler eksozomlar içinde ölçüldü. Sekil 6A,
miR-146b veya ceI-miR-67 ekspresyon plazmidleri ile transfekte edilmis MSC'lerden
elde edilen eksozomlarini göstermektedir. (Sekil 6A: MSC kültür ortamindan izole
edilen MSC eksozomlarinin elektron mikrografisi, Scalebar = 500 nm). miR-146b
MSC'lerde 7.16 ± 3.7 kat daha yüksekti ve miR-146b ekspresyon plazmid ile
transfeksiyonundan sonra sirasiyla cel-miR-67 plazmid ile transfekte edilmis
MSC'Ierdeki ve bunlarin eksozomlardaki miR-146 seviyeleri ile karsilastirildiginda
MSC eksozomlarinda 7.3 ± 1.7 kat daha yüksekti. (Sekil GB: M67-ekso ve M146-ekso
içinde (n = 7) miR-146b ekspresyonunun gerçek zamanli PCR saptamasi. Veriler
ortalama ± s.e.m.; karsilastirma iki tarafli t-testidir.). CeI-miR-67, miR-146b plazmid ile
transfekte edilmis MSC'Ierde veya bunlarin eksozomlarinda (M146-ekso) tespit
edilmedi, ancak cel-miR-67 plazmid ile transfekte edilmis MSC'Ierde ve bunlarin
eksozomlarinda (M67-ekso) tespit edildi. Bu veriler, plazmidle ekprese edilmis
miRNA'nin endojen mekanizmalarla MSC eksozomlari içine etkili bir sekilde
paketlendigini göstermektedir.
MiR-146b tasiyan MSC eksozomlarinin miRNA'yi tümör hücrelerine aktarip
aktarmayacagini belirlemek için, 9L hücreleri in vitro olarak M146-ekso veya M6?-
ekso'ya maruz biraktik. 24 saat sonra, M146-ekso ile muamele edilen 9L hücrelerimde
tespit edilen miR-146b, M67-ekso ile muamele edilen hücreler ile karsilastirildiginda,
8.5 ± 0.4 kat daha yüksek iken, M67-ekso ile muamele edilen 9L hücrelerinde ceI-miR-
67 tespit edildi, ancak M146-ekso ile muamele edilmis hücreler tespit edilmedi.
Dolayisiyla MSC eksozomlar in vitro olarak tümör hücreleri içine plazmid ile eksprese
edilen miRNArlar verebilir. M146-ekso'nun tümör hücreleri içinde hedef protein
ekspresyonunu degistirip degistiremeyecegini belirlemek için, in vitro ortamda 9L
hücreleri M146-ekso'ya maruz biraktik ve 24 saat sonra, EGFR protein seviyeleri, M67-
ekso ile muamele edilmis 9L hücreler ile karsilastirildiginda M146-ekso ile muamele
edilmis 9L hücrelerde daha düsük bulundu (Sekil GC: M67-ekso ve M146-ekso ile
muamele edilmis 9L hücrelerinde ß-aktin ve EGFR protein ekspresyonu için Western
blot). Bu bulgular bize, MSC eksozomlar ile verilen miR-146b'nin alici tümör
hücrelerinde fonksiyonel olarak aktif oldugunu göstermektedir.
Son olarak, M146-ekso'nun in vivo olarak anti-tümör etkisinin olup olmadigini
belirlemek için, 9L gliosarkom tasiyan Fischer siçanlara M146-ekso veya M67-ekso (5
ul'lik hacimde 50 pg toplam protein) uyguladik. Intrakranyal tümör ksenograft
implantasyonundan 5 gün sonra bir intra-tümör M146-ekso enjeksiyonunun, implant
sonrasi 10. günde tümör hacminde M67-ekso veya araçla muamele edilen kontrol ile
karsilastirildiginda önemli bir azalmaya yol açtigini bulduk (Sekil 7-A: Tümör
implantasyonundan 10 gün sonra öldürülen siçanlardan alinan H&E boyali koronal
kesit örnekleri; B: Tümör implantasyonundan 10 gün sonra ve PBS, M67-ekso veya
M146-ekso ile muameleden 5 gün sonra 9L ksenograft tümörlerinin hacimsel ölçümü
(her grup n=8). ANOVA: p = 0.042. Veriler ortalama ± s.e.m. Post hoc çoklu
karsilastirmalar iki tarafli t-testleridir.). Bu veriler bize, M146-eks0'nun siçan beyninde
bir anti-tümör etki ortaya çikardigini gösterdi.
Burada, bir 50 mg M146-ekso intra-tümör enjeksiyonu, siçan beyninde glioma
ksenograft büyümesini önemli ölçüde azaltmistir. Bulgularimiz bize, MSC eksozomlari
içine spesifik terapötik miRNA'nin aktarilmasinin en azindan malign glioma için yeni
bir tedavi stratejisi oldugunu göstermektedir.
Burada açiklandigi gibi, açiklamanin bazi yapilanmalari, MSC'lerde üretilen ve
endojen mekanizmalarla ekstraselüler eksozomlara yüklenen terapötik miRNA'nin
tümörü tedavi etmek için kullanildigi yeni bir tedaviyi içerir.
Ekzosomlarin biyolojik verilis araçlari olarak kullanimina ilgi artmaktadir. Eksozomlar,
alici hücreler tarafindan alinir, böylece hücresel süreçler degistirilebilir. Eksozomlarin
akut immün reddi ortaya çikarmadigina dair bazi kanitlar vardir ve bunlar canli
olmadiklari için tümör olusturma riski tasimazlar. Eksozomlar muhtemelen otolog
hücrelerin kullanilmasi ile kültür içinde ölçekli olarak üretilebilir ve eksozom üreten
hücreler, çoklu terapötik miRNA'Iari içerebilir ve da kisiye özgü tedavi saglayabilir.
Çalismalarimiz, MSC eksozomlari içinde paketlenmis miRNA'nin kültürdeki tümör
hücreleri tarafindan birlestirildigini göstermektedir. /n vivo tedaviler için, eksozomlari
dogrudan intra-tümör enjeksiyonu ile verdik. Fonksiyonel miRNA'larin glioma hücreleri
arasinda aktarildigina dair göstergeler vardir, bu da terapötik miRNA'larin tümör
boyunca dagilabilecegini düsündürmektedir.
MSC'leri üretici hücreler olarak kullandik. Bununla birlikte, diger hücre tipleri,
miRNA'lari eksozomlar içinde paketlemek için de kullanilabilir. Transfekte edildiginde,
üretici hücreler uzun süreler boyunca özel miRNA tasiyan eksozomlar olusturabilir.
Böylece, eksozomlar çoklu zaman noktalarinda toplanabilirler ve birkaç günde veya
haftada hastaya verilebilirler ya da üretici hücrelerin kendileri, o bölgede özel miRNA
tasiyan eksozomlar üretmek için tedavi edilecek dokuya transplante edilebilirler.
Dahasi, üretici hücreler potansiyel herhangi bir immün komplikasyonunu sinirlamak
Için hastanin kendi kemik iligi veya diger organlarindan toplanabilirler.
Klinik ortamda, terapötik miRNA'lar eksozomlar içine paketlenebilir ve bu eksozomlar
hastaya uygulanabilir. Böylece, paketlenen miRNA'lara bagli olarak, bu özel
eksozomlar ile çok çesitli hastaliklar tedavi edilebilir.
Klinik ortamda, terapötik miRNA'lar eksozomlar içinde paketlenebilir ve bu eksozomlar
dondurulabilir ve hastaya gelecekte verilmek üzere saklanabilir. Böylece hastaligin
durumuna bagli olarak, hastanin hücreleri daha sonraki bir zamanda verilebilecek özel
eksozomlar üretmek için kullanilabilir.
miRNA'lar, miRNA`lari eksozomlar içerisinde paketlemek için MSC'lerin içine (veya
diger üretici hücrelere) sokulabilir. Bununla birlikte, miRNA'larin MSC'lerin içine girisi,
MSC'lerin kendilerini ve daha da önemlisi ürettikleri eksozomlarin yapisini
degistirebilir. Böylece, eksozomlarin (ve diger bilesenlerinin) ortaya çikan
modifikasyonu, paketlenmis miRNA'lara ek olarak terapötik etkiye sahip olabilir.
MSC`ler (veya diger üretici hücreler) salinan eksozomlari modifiye etmek amaciyla
miRNA'lar ile transfekte edilebilir.
Bundan dolayi, sinirlama olmaksizin ve konudan vazgeçilmeksizin, açiklamanin bazi
yapilanmalari, bu tür miRNA'larin seçici olarak uygulanmasi yoluyla memelilerin
hastalik veya yaralanmalarini önlemek, kontrol etmek veya hafifletmek için bir veya
daha fazla seçilmis miRNA'Iar ve/veya bunlari içeren üretici hücreleri (kolektif olarak
Bu tarz hastalik veya yaralanmayi modifiye eksozom/üretici hücre uygulamasi yoluyla
sinirli bir zaman araligi için inhibe edebilir ve böylelikle hastalik veya yaralanmanin
gelisimini veya gidisatini sinirlayabilir.
Modifiye eksozom/üretici hücre uygulamasini içeren terapi süresinin rölatif olarak kisa
olma ihtimali ve yüksek bir basari olasiligi ihtimali yüksektir. Bazi yapilanmalarda yer
alan profilaktik modifiye edilmis eksozom/üretici hücre uygulamasi, birçok hastalik
veya yaralanma sekli ile baglantili hasar sikligini büyük ölçüde azaltabilir.
Alaninda uzman kisiler tarafindan bilinen modifiye edilmis eksozom/üretici hücre
uygulamasinin herhangi bir uygun yolu kullanilabilir.
Modifiye edilmis eksozomlar/üretici hücreler, hastanin bireysel klinik durumunu,
uygulama yeri ve yöntemini, uygulamanin planlanmasini, hastanin yasini, cinsiyetini,
vücut agirligini ve doktorlar tarafindan bilinen diger faktörleri hesaba katarak tip
pratisyenlerince iyi bilinen tibbi pratiklere göre uygulanir ve dozlanir. Buradaki amaçlar
için "farmasötik olarak etkili miktar", bu nedenle bu alanda bilinen dikkat edilmesi
gereken noktalara göre belirlenir. Miktar, alaninda uzman kisilerce uygun ölçütler
olarak seçilen, hasarin veya yaralanmanin azaltilmasi veya semptomlarin ve diger
göstergelerin iyilestirilmesi veya ortadan kaldirilmasi dahil olmak üzere, ancak sadece
bunlarla sinirli olmaksizin, iyilesmenin ortaya çikmasi için etkili olmalidir.
Modifiye edilmis eksozomlar/üretici hücreler çesitli yollarla uygulanabilir. Bunlar tek
baslarina veya farmasötik açidan kabul edilebilir tasiyicilar, seyrelticiler, adjuvanlar ve
araçlar ile kombinasyon halindeki bir aktif madde olarak uygulanabilirler. Modifiye
eksozomlar/üretici hücreler, intratekal ve infüzyon tekniklerinin yani sira oral olarak,
intravenöz, intraarteriyel, intramüsküler, intraperitoneal ve intranazal uygulama da
dahil olmak üzere subkütan olarak veya parenteral olarak veya lokal uygulama veya
hastaligin veya patolojik durumun gözlendigi bölgeye direkt inokülasyon yoluyla
uygulanabilir. Modifiye eksozomlarin/üretici hücrelerin implantlari da kullanisli olabilir.
Tedavi edilen hasta, sicak kanli bir hayvandir ve özellikle insanlar da dahil olmak üzere
memelilerdir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar, seyrelticiler, yardimci
maddeler ve araçlar ve de implant tasiyicilar genel olarak inert, toksik olmayan kati
veya sivi dolgu maddelerini, seyrelticileri veya aktif maddeler ile reaksiyona girmeyen
enkapsüle edici materyali ifade eder. Modifiye edilmis eksozomlar/üretici hücreler, ilgili
dokulari spesifik olarak hedeflemek için bilinen reseptörlerin hücre yüzey proteinlerine
veya ligandlarina karsi antikorlarin kullanilmasiyla degistirilebilir.
Modifiye edilmis eksozomlarin/üretici hücrelerin uygulanmasinin spesifik olarak evrim,
ekspresyon veya ilgili patolojilerin gelisimini hedeflediginden, bazi durumlarda
insanlardaki tedavinin zamanlamasinin ve süresinin hayvan modeller için belirlenen
oranlara yakin olabilecegi düsünülmektedir. Benzer sekilde, bu tür bilesikleri hayvan
modellerinde veya baska klinik uygulamalarda kullanmak için istenen etkilerin elde
edilmesi için tespit edilen dozlarin bu baglamda da uygulanabilir olmasi beklenebilir.
Genel olarak insanlar burada örnek olarak verilen deneysel hayvanlardan daha uzun
süre tedavi edildigi bilinmelidir, dolayisiyla tedavi, hastalik süreci ve ilaç etkinliginin
uzunluguyla orantili bir uzunluga sahiptir. Dozlar, belirli süreler boyunca tekli dozlar
veya çoklu dozlar olabilir. Tedavi genellikle hastalik sürecinin uzunlugu ve ilaç etkinligi
ve tedavi edilen hasta türleri ile orantilidir.
Modifiye edilmis eksozomlari/üretici hücreleri parenteral olarak uygularken genellikle
tekli dozaj enjektabl formda (çözelti, süspansiyon, emülsiyon) formüle edilecektir.
Enjeksiyon için uygun farmasötik formülasyonlar, steril sulu solüsyonlari veya
dispersiyonlari ve steril enjektabl solüsyonlara veya dispersiyonlara rekonstitüe
edilebilen steril tozlari içerir. Tasiyici, örnek olarak su, etanol, poliol (örnek olarak,
gliserol, propilen glikol, sivi polietilen glikol ve benzeri), bunlarin uygun karisimlari ve
bitkisel yaglari içeren bir çözücü veya dispersiyon ortami olabilir.
Gerektiginde, örnek olarak, lesitin gibi bir kaplama kullanilarak, dispersiyon durumunda
gerekli boyutun sürdürülmesi ile ve sürfaktanlarin kullanilmasi ile, uygun akiskanlik
devam ettirilebilir. Bu tarz modifiye edilmis eksozom/üretici hücre kompozisyonlari için
solvent sistemleri olarak, pamuk tohumu yagi, susam yagi, zeytinyagi, soya yagi,
misirözü yagi, ayçiçegi yagi veya yer fistigi yagi ve izopropil miristat gibi esterler gibi
sulu olmayan araçlar da kullanilabilir. Ek olarak, antimikrobiyal koruyucular,
antioksidanlar, selat yapici ajanlar ve tamponlar dahil olmak üzere kompozisyonlarin
stabilitesini, sterilitesini ve izotonitesini arttiran çesitli aditifler ilave edilebilir.
Mikroorganizmalarin etkisinin önlenmesi, çesitli antibakteriyel ve antifungal ajanlar,
örnek olarak parabenler, klorobütanol, fenol, sorbik asit ve benzerleri ile saglanabilir.
Çogu durumda, izotonik ajanlar, örnek olarak sekerler, sodyum klorür ve benzerlerini
dahil etmek istenebilir. Enjektabl farmasötik formun uzatilmis absorbsiyonu.
absorpsiyonu geciktirici ajanlar, örnek olarak alüminyum monostearat ve jelatin
kullanilarak yapilabilir. Bununla birlikte, kullanilan herhangi bir araç, seyreltici veya
aditif modifiye edilmis eksozomlar/üretici hücreler ile uyumlu olmalidir.
Steril enjektabl çözeltiler, modifiye edilmis eksozomlarin/üretici hücrelerin, arzu edildigi
gibi çesitli diger bilesenler içeren uygun solventlerin gerekli miktarlari ile
birlestirilmesiyle hazirlanabilir.
Bir farmakolojik formülasyon, Çesitli araç, adjuvanlar, aditifler ve seyrelticiler gibi
herhangi bir geçimli tasiyiciyi içeren enjektabl birformülasyonda hastaya uygulanabilir;
veya inhibitör(ler), yavas salinimli subkütan implantlar veya monoklonal antikorlar,
vektörlü verilis, iyonotoforetik, polimer matrisler, lipozomlar ve mikrosferler gibi
hedeflendirilmis verilis sistemleri seklinde parenteral olarak uygulanabilir. Birçok bu
tarz implantlar, verilis sistemleri ve modülleri alaninda uzman kisilerce iyi bilinirler.
Modifiye edilmis eksozomlar/üretici hücreler baslangiçta kan seviyelerini uygun bir
seviyeye getirmek Için intravenöz enjeksiyonla uygulanabilir. Hastanin seviyeleri daha
sonra oral dozaj form ile devam ettirilebilir, bununla birlikte hastanin durumuna bagli
olarak ve yukarida belirtildigi gibi diger uygulama yollari kullanilabilir. Uygulanacak
miktar ve uygulama zamani, tedavi edilen hasta için degiskenlik gösterebilir.
Ek olarak modifiye edilmis eksozomlar/üretici hücreler, intrenal seviyeleri uygun bir
seviyeye getirmek için iri situ olarak uygulanabilir. Daha sonra hastanin seviyeleri,
hastanin durumuna bagli olarak, uygun uygulama sekilleri ile iyi tibbi uygulama ile
uyumlu olacak sekilde uygun olarak sürdürülebilir. Uygulanacak miktar ve uygulama
zamani, tedavi edilen hasta için degiskenlik gösterebilir.
Açiklama, yukarida bahsedilen tercih edilen ve alternatif yapilanmalara referansla
özellikle gösterilmis ve tarif edilmis olsa da, alaninda uzman kisiler bilmelidir ki burada
açiklanan yapilanmalara yönelik Çesitli alternatiflerin, takip eden istemlerde tanimlanan
bulusun kapsamindan ayrilmaksizin açiklamayi uygulamada kullanilabilir. Asagidaki
istemlerin bulusun kapsamini tanimlamasi amaçlanmistir. Bazi yapilanmalarin bu
açiklamasinin, burada açiklanan tüm yeni ve açik olmayan elementlerin
kombinasyonlarini içerdigi anlasilmalidir ve istemler bu veya daha sonraki bir
basvuruda bu elementlerin herhangi bir yeni ve açik olmayan kombinasyonunda
gösterilebilir. Yukaridaki yapilanmalar örnek niteligindedir ve bu ya da sonraki bir
basvuruda talep edilebilecek olasi tüm kombinasyonlar için tek bir 'özellik ya da
element gerekli degildir. Istemler bunlarin esdegerlerinin "bir" veya "bir ilk" unsur olarak
söylendiginde, bu terimlerin, bir veya daha fazla bu gibi unsurlari barindirdigi, iki veya
daha fazla unsuru ne gerektirmedigi ne de hariç tuttugu anlasilmalidir.
Claims (8)
1. Beyin kanseri olan bir kisinin tedavisinde kullanilmak üzere miR-146b içeren eksozomlar olup, özelligi; burada bahsi geçen eksozomlarin asagidaki basamaklar ile üretilmesidir: i. miR-146b'yi kodlayan bir plazmid ile eksozom üretebilen bir multipotent mezensimal stromal hücre popülasyonunun transfekte edilmesi; ii. transfeksiyondan sonra multipotent mezensimal stromal hücre popülasyonundan veya bunlari içeren ortamdan eksozomlari toplanmasi; ve iii. toplanan eksozomlardan bir veya daha fazlasinda miR-146b varliginin teyit edilmesi.
2. Beyin kanseri olan bir kisinin tedavisinde kullanilmak üzere eksozom üreten modifiye edilmis multipotent mezensimal stromal hücreler olup, özelligi; burada bahsi geçen modifiye edilmis multipotent mezensimal stromal hücrelerin asagidaki basamaklar ile üretilmesidir: i. miR-146b'yi kodlayan bir plazmit ile eksozom üretebilen bir multipotent mezensimal stromal hücre popülasyonunun transfekte edilmesi; ii. transfeksiyondan sonra multipotent mezensimal stromal hücre popülasyonundan hücrelerin toplanmasi; ve iii. toplanan hücrelerin birinde veya daha fazlasinda miR-146b varliginin teyit edilmesi.
3. istem 1ideki kullanim için eksozomlar veya istem 2'deki kullanim için hücreler olup, özelligi; burada kisinin bir insan olmasidir.
4. Kanser tedavisinde kullanim için bir ilaç olup, özelligi; miR-146b içeren modifiye edilmis eksozomlar içermesidir.
5. istem 4iteki ilaç olup, özelligi; beyin kanserinin tedavisinde kullanim için olmasidir.
6. Kanser tedavisinde kullanim için bir ilaç olup, özelligi; miR-146b'yi kodlayan bir veya daha fazla plazmid ile birlikte eksozomlarin üretilmesi için transfekte edilmis multipotent mezensimal stromal hücreleri içermesidir.
7. Istem 6'daki ilaç olup, özelligi; beyin kanserinin tedavisinde kullanim için olmasidir.
8. istem 4 ila 7rnin herhangi birinin kullanimi için ilaç olup, özelligi; buradaki kanser veya beyin kanserinin sirasiyla bir insan kanseri veya bir insan beyin kanseri olmasidir.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161570081P | 2011-12-13 | 2011-12-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201802778T4 true TR201802778T4 (tr) | 2018-03-21 |
Family
ID=47470222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/02778T TR201802778T4 (tr) | 2011-12-13 | 2012-12-13 | Hücre kaynaklı/vezikül bazlı mikrorna verilişi için yöntemler, sistemler ve kompozisyonlar. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9555060B2 (tr) |
| EP (2) | EP3336190B1 (tr) |
| DK (1) | DK2791336T3 (tr) |
| ES (1) | ES2661236T3 (tr) |
| NO (1) | NO2855624T3 (tr) |
| TR (1) | TR201802778T4 (tr) |
| WO (1) | WO2013090523A2 (tr) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10227593B2 (en) | 2011-12-13 | 2019-03-12 | Henry Ford Health System | Methods, systems, and compositions for cell-derived/vesicle-based microRNA delivery |
| US10308959B2 (en) | 2013-01-18 | 2019-06-04 | Henry Ford Health System | Methods, systems, and compositions relating to MiRNA-146a |
| WO2016179417A2 (en) * | 2015-05-06 | 2016-11-10 | The University Of Utah Research Foundation | Exosome delivery of micrornas |
| EP3362073A4 (en) * | 2015-10-13 | 2019-05-08 | Cells For Cells S.A. | ANTIANGIOGENIC THERAPY BASED ON EXOSOMES FROM MENSTRUELLEN STEM CELLS |
| BR112018009891A2 (pt) | 2015-11-18 | 2018-12-26 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | vesículas extracelulares de célula neural |
| US11821036B2 (en) * | 2017-03-16 | 2023-11-21 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Methods for identifying and monitoring pregnant women at risk of preeclampsia |
| WO2018208728A1 (en) | 2017-05-08 | 2018-11-15 | Flagship Pioneering, Inc. | Compositions for facilitating membrane fusion and uses thereof |
| EP4213891A2 (en) | 2020-09-21 | 2023-07-26 | Asklepios Biopharmaceutical, Inc. | Methods for treating neurological disease |
| WO2023240069A1 (en) * | 2022-06-06 | 2023-12-14 | The University Of Vermont And State Agricultural College | Extracellular vesicle micrornas and uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9085778B2 (en) * | 2006-05-03 | 2015-07-21 | VL27, Inc. | Exosome transfer of nucleic acids to cells |
| EP2294196A1 (en) * | 2008-06-06 | 2011-03-16 | Centre National de la Recherche Scientifique - CNRS | Use of endo-lysosomal system and secreted vesicles (exosome-like) in treatments and diagnostics based on small rna and experimental study of small rna |
| WO2010119256A1 (en) * | 2009-04-17 | 2010-10-21 | Isis Innovation Limited | Composition for delivery of genetic material |
-
2012
- 2012-12-13 EP EP17203039.7A patent/EP3336190B1/en active Active
- 2012-12-13 US US14/365,218 patent/US9555060B2/en active Active
- 2012-12-13 DK DK12809048.7T patent/DK2791336T3/en active
- 2012-12-13 ES ES12809048.7T patent/ES2661236T3/es active Active
- 2012-12-13 EP EP12809048.7A patent/EP2791336B1/en active Active
- 2012-12-13 WO PCT/US2012/069419 patent/WO2013090523A2/en active Application Filing
- 2012-12-13 TR TR2018/02778T patent/TR201802778T4/tr unknown
-
2013
- 2013-05-31 NO NO13728296A patent/NO2855624T3/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20150157666A1 (en) | 2015-06-11 |
| EP2791336B1 (en) | 2017-11-29 |
| WO2013090523A2 (en) | 2013-06-20 |
| EP3336190A1 (en) | 2018-06-20 |
| US9555060B2 (en) | 2017-01-31 |
| NO2855624T3 (tr) | 2018-04-14 |
| EP2791336A2 (en) | 2014-10-22 |
| ES2661236T3 (es) | 2018-03-28 |
| DK2791336T3 (en) | 2018-02-26 |
| EP3336190B1 (en) | 2021-02-24 |
| WO2013090523A3 (en) | 2013-08-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TR201802778T4 (tr) | Hücre kaynaklı/vezikül bazlı mikrorna verilişi için yöntemler, sistemler ve kompozisyonlar. | |
| Hu et al. | Exosome-guided bone targeted delivery of Antagomir-188 as an anabolic therapy for bone loss | |
| Giordano et al. | Therapeutic potential of microRNA in tendon injuries | |
| Bastiancich et al. | Injectable nanomedicine hydrogel for local chemotherapy of glioblastoma after surgical resection | |
| Ding et al. | A self-assembled RNA-triple helix hydrogel drug delivery system targeting triple-negative breast cancer | |
| US20230193275A1 (en) | Peptide nucleic acid complex having endosomal escape capacity, and use thereof | |
| Sui et al. | A novel Lipidoid-MicroRNA formulation promotes calvarial bone regeneration | |
| JP2022519557A (ja) | 脂質ナノ粒子の調製方法 | |
| CN105131067B (zh) | 皮肤与纤维化症候中的rna干扰 | |
| Zhou et al. | Exosomes in osteoarthritis and cartilage injury: advanced development and potential therapeutic strategies | |
| Sun et al. | MiR-21 nanocapsules promote early bone repair of osteoporotic fractures by stimulating the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells | |
| CN107108686A (zh) | 用于恶性肿瘤的rna干扰组合物和方法 | |
| US11904057B2 (en) | Nanoparticle-hydrogel composite for nucleic acid molecule delivery | |
| US11235058B2 (en) | Immunotherapeutic constructs and methods of their use | |
| CA3105394A1 (en) | Targeted delivery of therapeutic agents to human adipocytes | |
| WO2021011496A1 (en) | Immunotherapeutic constructs and methods of their use | |
| EP3750561A1 (en) | Skin-permeating carrier containing nucleic acid complex and use thereof | |
| Tang et al. | A simple self-assembly nanomicelle based on brain tumor-targeting peptide-mediated siRNA delivery for glioma immunotherapy via intranasal administration | |
| Chen et al. | Long acting carmustine loaded natural extracellular matrix hydrogel for inhibition of glioblastoma recurrence after tumor resection | |
| Ma et al. | Nanobubble-mediated co-delivery of Ce6 and miR-195 for synergized sonodynamic and checkpoint blockade combination therapy with elicitation of robust immune response in hepatocellular carcinoma | |
| JP2021534101A (ja) | Ｃｃｒ２及びｃｓｆ１ｒを標的とするためのオリゴヌクレオチド組成物ならびにその使用 | |
| Tang et al. | A blood–brain barrier-and blood–brain tumor barrier-penetrating siRNA delivery system targeting gliomas for brain tumor immunotherapy | |
| US20220056443A1 (en) | Metabolic benefits of short mir-22 mirna antagomir therapies | |
| Keyvani et al. | Insight into RNA-based Therapies for Ovarian Cancer | |
| Fu et al. | A tetrahedral framework nucleic acids-based gene therapeutic nanococktail alleviates cartilage damage and protects against osteoarthritis progression |