CN104840952A - 可复制型双质粒抗肾癌dna疫苗及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗及其构建方法与应用。该双质粒DNA疫苗活性成分为pSVK-G250FGB与pSVK-CAVE，其能够诱导小鼠机体产生针对hG250及mVEGFR2抗原特异性的体液免疫和细胞免疫反应，有效抑制肾癌肿瘤的生长和复发转移，延长生存期。本发明为肾癌的综合治疗提供了一种新的药物，应用前景广阔。

Description

可复制型双质粒抗肾癌DNA疫苗及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗及其构建方法与应用。

背景技术

肾细胞癌是成人肾脏肿瘤中最常见的一种类型，大约占到成人恶性肿瘤的3％，占所有肾脏肿瘤的80％，是泌尿系肿瘤中致死率最高一种肿瘤。当肿瘤组织局限在肾实质时，肾细胞癌的预后相对较好，5年生存率为70-80％，对于这类病例，部分或根治性手术是主要的治愈性治疗方式。然而当肿瘤组织发生局部或远处转移，即进展为转移性肾癌时，预后就相对较差。这是因为肾细胞癌是一种”惰性肿瘤”，对一些传统的治疗方式，比如化疗和放疗都不敏感，IFN和IL-2细胞因子治疗后中位生存期也只有13个月，没有获得理想的疗效，预后相对较差。临床上20-30％的肾癌患者在初次诊断时已经发生了转移，并且大约有三分之一的局限性肾癌患者最终进展为转移性肾癌。血管内皮生长因子(VEGF)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路靶向药物的出现，为医生和患者提供了的新治疗选择。然而这些药物的治疗效果也存在一定的局限性，有相当一部分的患者服用这类靶向药物后没有获得相应的临床预期效果。同时，这类药物也存在费用昂贵、有短期和长期毒性等缺点。因此，传统的治疗方法在克服肿瘤复发和转移方面有很大的局限性，成为肿瘤治疗的瓶颈。对于转移性肾细胞癌的治疗仍然是一个棘手的问题，仍然需要进一步的研究。

在Edward Anthony Jenner发现牛痘疫苗一个世纪以后，德国医生Paul Ehrlich(1854-1915)和美国医生William Bradley Coley(1862-1936)最早提出了肿瘤疫苗的概念。二十世纪九十年代中期，治疗性疫苗概念的被正式提出，各种研究和开发工作也广泛开展起来。肿瘤治疗性疫苗目前是治疗性疫苗研发中的“重中之重”。它够激活机体免疫系统，产生特异性抗肿瘤效应，一方面有利于清除外科手术后残留的肿瘤细胞，另一方面能够产生免疫记忆，防止肿瘤复发与转移。

肿瘤疫苗是一种肿瘤主动免疫治疗方式，通过接种使得机体获得一种内源性的抗肿瘤免疫应答反应。这种免疫应答可以是特异性的，针对选定的一些特定肿瘤抗原；也可以是非特异性的，免疫应答并不针对某种特定的抗原，例如全肿瘤细胞疫苗。肿瘤疫苗主要分为肿瘤细胞疫苗、重组蛋白疫苗、肽疫苗和基因疫苗四种类型，基因疫苗根据载体的不同可以分为细菌载体基因疫苗、病毒载体基因疫苗和裸质粒DNA疫苗。

近年来肿瘤DNA疫苗的研究得到了广泛关注，逐渐成为肿瘤免疫治疗领域的研究热点。大量的研究发现，肿瘤DNA疫苗与其它类型肿瘤疫苗相比，具有一定的优势。第一，DNA疫苗免疫机体后与病毒感染过程相似，在宿主细胞内进行转录翻译，表达抗原蛋白，分泌到细胞外，或在细胞内修饰后通过MHCⅠ途径递呈至抗原递呈细胞(APCs)，进一步激活体液和细胞免疫应答。第二，DNA疫苗更加安全且产生的靶抗原特异性更强。与之相比，病毒载体基因疫苗则会引起机体产生针对外源性病毒蛋白的免疫反应，从而产生针对疫苗的排斥，不能多次应用，降低了疫苗的效果。第三，电穿孔技术的应用使DNA疫苗的表达效率的得到了极大地提高。电穿孔使细胞膜在瞬间出现多个孔道，增加了质粒DNA的导入量，使肌肉或真皮内注射的质粒DNA能够更多地被肌肉细胞、角化细胞、单核细胞和树突状细胞(DCs)摄取。第四，DNA疫苗构建更加简单，生产和加工过程更加简便。

DNA疫苗成功的关键是如何打破免疫耐受诱发高效的免疫应答，并且同时避免产生自身免疫损伤。

发明内容

本发明针对恶性肿瘤治疗中的核心难题“免疫耐受”，基于复制子DNA疫苗载体pSVK，开展了系统性的免疫增效策略研究，并成功构建了一种新型的抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗。

本发明的一个目的在于提供一种抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗。其活性成分包括以下组分：

1)以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带复合基因sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7(简称G250FGB)的可复制型DNA疫苗载体pSVK-G250FGB，所述G250FGB复合基因是自5’端至3’端依次由tG250复合抗原基因、人IgG Fc段基因(GenBank号：Z17370)、GPI基因(GenBank号：XM676434)、GM/CSF基因(GenBank号：NM-000758)和B7.1基因(GenBank号：NM-005191)组成的融合基因，G250FGB复合基因的结构如图1A所示；

2)以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤血管复合基因(CAVE)的抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE，所述肿瘤血管复合基因(CAVE)自5’端至3’端依次由小鼠VEGFR2胞外区1-4段(肿瘤血管靶抗原)基因(GenBank号：57923，286-1536bp)、人IgG Fc段基因(GenBank号：Z17370)基因、GPI基因(GenBank号：XM676434)、人IL12A基因(GenBank号：24430218)和人IL12B基因(GenBank号：24497437)构成，肿瘤血管复合基因的结构如图1C所示。

所述复制子DNA疫苗载体pSVK的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

tG250复合抗原基因是异种化嵌合抗原基因，同时含有人肾癌抗原G250、猴和鼠的肾癌抗原CAIX基因，为了打破机体对自身抗原的免疫耐受，采用了分区段异种化抗原嵌合设计，使同源性较高的区段被异种化抗原代替，从而诱导不同种属间的交叉免疫反应。具体来讲，tG250抗原基因中自5’端第1-132、169-183、298-513位碱基分别为猴肾癌抗原CAIX基因(Genebank号：XM001088481)，自5’端第133-168、247-258、514-897、1084-1092位碱基分别为人G250基因，(Genebank号：A J010158),而自5’端第184-246、259-297、898-1083、1093-1131位碱基分别为选取的是鼠肾癌抗原CAIX基因(Genebank号：BC120544)，tG250复合抗原基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

所述tG250复合抗原基因与人IgG Fc段和GPI基因融合，然后与GM/CSF基因和B7.1基因通过IRES序列相连组成G250FGB复合基因，其中，自5’端第70-201、238-252、367-582位碱基分别为猴肾癌抗原CAIX基因，自5’端第202-237、316-327、583-966、1153-1161位碱基分别为人G250基因，自5’端第253-315、328-366、967-1152、1162-1200位碱基分别为鼠肾癌抗原CAIX基因，自5’端第1201-2473位碱基为Fc段基因，自5’端第2474-2600位碱基为GPI基因，自5’端第2622-3246位碱基为IRES序列，自5’端第3253-3684位碱基为GM/CSF基因，自5’端第3709-4497位碱基为B7.1基因,所述G250FGB复合基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

将以pSVK为出发载体构建的携带复合基因sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7(简称G250FGB)的重组可复制型肾癌治疗性DNA疫苗命名为pSVK-G250FGB，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，其中，自5’端第7415-11913位碱基为G250FGB复合基因序列。

所述肿瘤血管复合基因(CAVE)由小鼠VEGFR2胞外区1-4段基因与人IgG Fc段和GPI基因融合，然后与人IL12A和IL12B基因通过IRES序列相连组成，其中人IL12A和IL12B基因之间以Furin2A序列连接。肿瘤血管复合基因(CAVE)的核苷酸序列如序列表中序列5所示，序列5由5143个碱基组成，自5’端第74-1323位碱基为小鼠VEGFR2胞外1-4段基因，自5’端第1330-2596位碱基为人IgG Fc段基因，自5’端第2597-2701位碱基为GPI序列，自5’端第2745-3369位碱基为IRES基因，自5’端第3464-4054位碱基为人IL12A基因，自5’端第4055-4150位碱基为人Furin2A序列，自5’端第4223-5143位碱基为人IL12B序列。

以pSVK为出发载体构建的携带肿瘤血管复合基因(CAVE)的抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE的核苷酸序列如序列表中序列6所示，其中，自5’端第7411-12553位碱基为肿瘤血管复合基因CAVE序列。

含有所述抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗的组合物，如各种药物剂型也属于本发明。

本发明另一目的在于提出所述抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗在制备预防和/或治疗肾癌药物中的应用。

所述肾癌为转移性肾细胞癌。

本发明的抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗可采用电穿孔肌肉内注射的方式进行免疫，免疫方案为：先肌肉注射疫苗，然后进行电穿孔刺激；免疫剂量一般为1-100μg(pSVK-G250FGB 1-100μg，pSVK-CAVE 1-100μg，pSVK-G250FGB与pSVK-CAVE的注射剂量比例为1：1。)/kg；两种质粒混合后一次注射。注射后约5min，用ECM 830电脉冲仪在注射部位进行电穿孔刺激，电穿孔条件为：60V/cm，50ms，1Hz×6次。疗程为1-6个月。免疫剂量和疗程可根据实际情况进行调整。

通过以上技术方案，本发明采用的新型复制子DNA疫苗载体能够通过抗病毒固有免疫途径有效打破机体针对肿瘤相关抗原的免疫耐受状态，从而增强了疫苗的免疫原性，显著提升了抗原特异性体液免疫和细胞免疫水平，并且没有引起副作用。与传统DNA疫苗相比，复制子DNA疫苗的抗原表达量并没有得到提高，其免疫效应的提升可能与转染细胞发生caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)依赖性细胞凋亡并进一步被树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)摄取有关。

本发明以异种化肾细胞癌特异性抗原G250和小鼠血管内皮生长因子Ⅱ型受体mVEGFR2为抗肿瘤治疗靶点，采用以塞姆利基森林病毒RNA复制子为基础改造的新型可复制型DNA疫苗载体系统pSVK，并融合了人IgG Fc段、GM-CSF和B7.1等免疫分子，成功构建出了肾癌新型可复制型双质粒DNA疫苗pSVK-G250FGB与pSVK-CAVE。本发明的可复制型抗肾癌双质粒DNA疫苗在设计方面具有多项优势，第一，在抗原选择方面：我们选择了大多数肾癌细胞中均有表达的hG250作为靶点，并采用异种化策略，将人肾细胞癌特异性抗原G250(CAIX)主要T细胞表位区域、猴和鼠CAIX部分片段区域融合为异种化抗原tG250，能够明显提高疫苗的抗肿瘤效应；第二，在疫苗免疫增效方面：本发明将tG250抗原与人Igk链前导信号肽(sig)和人IgG Fc段融合，并通过GPI锚定于细胞表面，同时在IRES序列的下游共表达人GM-CSF细胞因子和B7.1共刺激分子，能够有效打破机体免疫耐受和实现免疫增效。本发明还建立了Balb/c荷瘤小鼠模型，用pSVK-G250FGB+pSVK-CAVE双质粒DNA疫苗免疫Balb/c荷瘤小鼠，双质粒DNA疫苗能够诱导小鼠机体产生针对hG250及mVEGFR2抗原特异性的体液免疫和细胞免疫反应，能够有效抑制肾癌肿瘤的生长和复发转移，延长生存期，说明本发明的肾癌可复制型双质粒DNA在小鼠体内能够发挥一定的抑瘤效果。本发明为肾癌的综合治疗提供了一种新的药物和治疗方法，应用前景广阔。

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1A为G250FGB复合基因的结构示意图

图1B为载体pSVK-G250FGB的物理图谱

图1C为肿瘤血管复合基因(CAVE)的结构示意图

图1D为载体pSVK-CAVE的物理图谱

图1E为能够稳定表达人G250蛋白及萤火虫荧光素酶的单克隆细胞系Renca-hG250/Luc的Western Blot鉴定结果

图2为人G250蛋白及萤火虫荧光素酶(hG250/Luc)在Renca-hG250/Luc细胞内表达水平的流式细胞术检测结果(A.对照细胞；B.Renca-hG250/Luc(anti-Luc)；C.Renca-hG250/Luc(anti-hG250))

图3为活体成像检测荧光素酶报告基因(Luc)在Renca-hG250/Luc细胞中的表达水平(横向孔表示依次稀释的细胞浓度，纵向孔表示筛选出的4组单克隆细胞株)

图4为pSVK-tG250质粒(A幅)与CAVE质粒(B幅)的双酶切鉴定结果

图5为Balb/c小鼠免疫策略的流程图

图6为各组免疫小鼠的皮下肿瘤成瘤时间

图7为各组免疫小鼠皮下肿瘤生长情况(肿瘤生长曲线)

图8A为各组小鼠皮下接种肿瘤细胞40天后的肿瘤体积

图8B为各免疫组小鼠皮下肿瘤的肿瘤生长抑制率

图9为各免疫组小鼠皮下肿瘤接种后的存活情况

图10A为各组免疫小鼠血清特异性hG250抗体生成情况

图10B为各组免疫小鼠血清特异性mVEGFR抗体生成情况

图11A为各免疫组小鼠血清hG250特异性IgG1及IgG2a抗体的OD450nm值

图11B为各免疫组小鼠血清hG250特异性抗体IgG1/IgG2a比值分析结果

图12A为ELISPOT检测结果示意图

图12B为hG250抗原特异性ELISPOT检测结果

图12C为mVEGFR2抗原特异性ELISPOT检测结果

图13为CCK-8检测小鼠脾脏淋巴细胞增殖结果

图14为LDH法检测小鼠脾脏淋巴细胞CTL杀伤活性时检测板布局

图15为LDH法检测各免疫组小鼠脾脏淋巴细胞CTL杀伤活性结果

图16A为ELISA法检测小鼠脾脏淋巴细胞Th1类细胞因子IL-2释放浓度

图16B为ELISA法检测小鼠脾脏淋巴细胞Th1类细胞因子IFN-γ释放浓度

具体实施方式

DNA疫苗成功的关键是如何打破免疫耐受诱发高效的免疫应答，并且同时避免产生自身免疫损伤。本发明采用的新型复制子DNA疫苗载体能够通过抗病毒固有免疫途径有效打破机体针对肿瘤相关抗原的免疫耐受状态，从而增强了疫苗的免疫原性，显著提升了抗原特异性体液免疫和细胞免疫水平，并且没有引起副作用。与传统DNA疫苗相比，复制子DNA疫苗的抗原表达量并没有得到提高，其免疫效应的提升可能与转染细胞发生caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)依赖性细胞凋亡并进一步被树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)摄取有关。

靶抗原的选择是DNA疫苗设计中最关键的因素之一。近年来，人类发现了大量的肿瘤抗原，其中有许多被当做肿瘤治疗性疫苗的靶点，在基础研究和临床试验中广泛应用。肿瘤抗原主要分为两大类：肿瘤特异性抗原和肿瘤相关性抗原。肿瘤特异性抗原是由各种物理和化学致癌物导致基因突变而产生的一类特殊的抗原，其仅表达于肿瘤组织中，例如酪氨酸激酶、MART1、gp100等。肿瘤相关抗原同时表达于肿瘤细胞与正常组织当中，典型代表有肿瘤-睾丸抗原、人类上皮生长因子受体2(HER2)/neu蛋白、肿瘤胚胎抗原(CEA)。肿瘤相关抗原在正常组织中的表达量显著低于肿瘤组织，但尽管如此，以这类抗原为靶点的肿瘤疫苗仍然存在自身免疫损伤的风险。因此，理想的肿瘤疫苗是以只表达于肿瘤细胞的肿瘤特异性抗原为靶点，或者以肿瘤相关抗原为靶点，并且同时避免损伤表达该抗原的正常细胞。

G250(CAIX)是一种肿瘤相关抗原，表达于多种恶性肿瘤中，例如宫颈癌、结肠癌、食管癌、肺癌等，近90％的各种类型的肾细胞癌和99％的肾透明细胞癌表达G250(CAIX)。并且，机体正常组织，包括正常肾组织中很少表达。因此，G250(CAIX)可以作为肾癌主动免疫治疗的一个理想作用靶点。

血管内皮生长因子(VEGF)及其Ⅱ型受体(VEGFR2)介导的信号传导是调节血管生成最关键的步骤，对肿瘤的发生发展起至关重要的作用。VEGFR2是典型的跨膜蛋白，它由7个类IgG样结构域组成的胞外区、一个跨膜结构区和胞质内酪氨酸激酶结构区组成，VEGF与胞外区结合后导致VEGFR2二聚化，其胞内段酪氨酸位点发生自磷酸化，激活下游的信号传导通路。只含有胞外区的VEGFR2以可溶形式存在，称为sVEGFR2。sVEGFR2能与VEGF结合，但不能激活下游信号通路，从而有效阻断VEGF的促血管生成作用。此外，Shinkai等研究表明，在VEGFR2的7个胞外IgG样结构域中，第3个结构域对于配受体结合起关键作用，缺失该结构域可导致配受体结合的功能完全丧失；第1、2及4结构域在维持配受体的高结合力上起主要作用；其余结构域对于配体结合到受体后的固定是必须的。Wei等研究表明，异种肿瘤疫苗能打破免疫耐受，诱导有效的抗肿瘤免疫反应。鉴于小鼠与人的VEGFR2在氨基酸水平上的高度同源性，mVEGFR2成为目前抗肿瘤血管生成主动免疫治疗研究中理想的异种化靶抗原。

本发明将通过实施例具体提供一种肾癌可复制型双质粒DNA疫苗及其构建与应用。

实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，MolecularCloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明所涵括的内容不限于下述实施例。

实施例1、构建双质粒抗肾癌可复制型DNA疫苗

本发明抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗的活性成分为可复制型DNA疫苗载体pSVK-G250FGB和pSVK-CAVE。

一、构建构建复制子DNA疫苗载体pSVK

构建复制子DNA疫苗载体pSVK的具体过程见已公开专利文献CN103948943A实施例1之一，或CN103948944A实施例1之一.1，在此不再赘述。

按文献方法构建得到了序列及插入位置均正确的携带卡那霉素抗性基因的可复制型载体pSVK，pSVK的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

二、构建pSVK-G250FGB

以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建携带复合基因sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7(简称G250FGB)的可复制型DNA疫苗载体pSVK-G250FGB。

所述G250FGB复合基因是自5’端至3’端依次由tG250复合抗原基因、人IgG Fc段基因(GenBank号：Z17370)、GPI基因(GenBank号：XM676434)、GM/CSF基因(GenBank号：NM-000758)和B7.1基因(GenBank号：NM-005191)组成的融合基因，G250FGB复合基因的结构如图1A所示。

tG250复合抗原基因是异种化嵌合抗原基因，同时含有人肾癌抗原G250、猴和鼠的肾癌抗原CAIX基因，为了打破机体对自身抗原的免疫耐受，采用了分区段异种化抗原嵌合设计，使同源性较高的区段被异种化抗原代替，从而诱导不同种属间的交叉免疫反应。具体来讲，tG250抗原基因中自5’端第1-132、169-183、298-513位碱基分别为猴肾癌抗原CAIX基因(Genebank号：XM001088481)，自5’端第133-168、247-258、514-897、1084-1092位碱基分别为人G250基因，(Genebank号：A J010158),而自5’端第184-246、259-297、898-1083、1093-1131位碱基分别为选取的是鼠肾癌抗原CAIX基因(Genebank号：BC120544)，tG250复合抗原基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

所述tG250复合抗原基因与人IgG Fc段和GPI基因融合，然后与GM/CSF基因和B7.1基因通过IRES序列相连组成G250FGB复合基因，其中，自5’端第70-201、238-252、367-582位碱基分别为猴肾癌抗原CAIX基因，自5’端第202-237、316-327、583-966、1153-1161位碱基分别为人G250基因，自5’端第253-315、328-366、967-1152、1162-1200位碱基分别为鼠肾癌抗原CAIX基因，自5’端第1201-2473位碱基为Fc段基因，自5’端第2474-2600位碱基为GPI基因，自5’端第2622-3246位碱基为IRES序列，自5’端第3253-3684位碱基为GM/CSF基因，自5’端第3709-4497位碱基为B7.1基因,所述G250FGB复合基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

将以pSVK为出发载体构建的携带复合基因sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7(简称G250FGB)的重组可复制型肾癌治疗性DNA疫苗命名为pSVK-G250FGB，其物理图谱如图1B所示，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，其中，自5’端第7415-11913位碱基为G250FGB复合基因序列。

pSVK-G250FGB的构建过程见已公开专利文献CN103948943A实施例1之二，在此不再赘述。将pSVK载体与G250FGB融合基因的连接产物转化E.coli.DH5α感受态大肠杆菌,阳性菌经中美泰和公司测序，测序正确的菌液提取质粒即为pSVK-G250FGB。

三、构建pSVK-CAVE

以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤血管复合基因(CAVE)的抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE。

所述肿瘤血管复合基因(CAVE)自5’端至3’端依次由小鼠VEGFR2胞外区1-4段(肿瘤血管靶抗原)基因(GenBank号：57923，286-1536bp)、人IgG Fc段基因(GenBank号：Z17370)基因、GPI基因(GenBank号：XM676434)、人IL12A基因(GenBank号：24430218)和人IL12B基因(GenBank号：24497437)构成，肿瘤血管复合基因的结构如图1C所示。

所述肿瘤血管复合基因(CAVE)由小鼠VEGFR2胞外区1-4段基因与人IgG Fc段和GPI基因融合，然后与人IL12A和IL12B基因通过IRES序列相连组成，其中人IL12A和IL12B基因之间以Furin2A序列连接。肿瘤血管复合基因(CAVE)的核苷酸序列如序列表中序列5所示，序列5由5143个碱基组成，自5’端第74-1323位碱基为小鼠VEGFR2胞外1-4段基因，自5’端第1330-2596位碱基为人IgG Fc段基因，自5’端第2597-2701位碱基为GPI序列，自5’端第2745-3369位碱基为IRES基因，自5’端第3464-4054位碱基为人IL12A基因，自5’端第4055-4150位碱基为人Furin2A序列，自5’端第4223-5143位碱基为人IL12B序列。

以pSVK为出发载体构建的携带肿瘤血管复合基因(CAVE)的抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE的核苷酸序列如序列表中序列6所示，其中，自5’端第7411-12553位碱基为肿瘤血管复合基因CAVE序列。具体构建过程见已公开专利文献CN103948944A之实施例1-二，在此不再赘述。阳性菌经中美泰和公司测序，测序正确的菌液提取质粒即为pSVK-CAVE。

实施例2、稳定表达人G250和荧光素酶报告蛋白的小鼠肾癌细胞系的建立

本实施例的目的是构建可同时稳定表达人G250及荧光素酶(luciferase)报告蛋白的小鼠肾癌细胞系，为下一步在人G250小鼠肾癌模型中评价本发明的双质粒抗肾癌可复制型DNA疫苗的抑瘤效果及探讨免疫学机制奠定基础。

一、实验材料和仪器设备

1、实验材料

1.1菌株和细胞

大肠杆菌E.coli.DH5α购自康为世纪生物科技公司；小鼠Renca细胞来源于美国密歇根大学医学中心。

1.2酶和试剂

限制性内切酶购自New England Biolabs公司，质粒小量提取试剂盒、无内毒素质粒大量提取试剂盒均购自康为世纪有限责任公司，荧光素酶底物LUCK-100购自GOLDB10公司，山羊抗萤火虫荧光素酶多克隆抗体购自Promega公司，HRP标记的兔抗山羊IgG抗体、FITC标记的兔抗山羊IgG抗体均购自中杉金桥生物技术有限公司，细胞膜打孔液购自BD公司，Westernblot超敏发光液(super ECLplus)购自北京普利莱基因技术有限公司，细胞转染试剂Lipofectamine^TM200reagent购自Invitrogen公司，RPMI1640细胞培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自PAA公司，青霉素、链霉素、氨苄霉素和卡那霉素购自博大泰克生物基因有限公司。

2、主要仪器设备

GeneAmp PCR System2400PCR扩增仪	Perkin Elmer公司
		FACS Calibur流式细胞仪	BD公司
自动凝胶成像系统	上海天能科技有限公司
		超净工作台	北京半导体设备厂
Power Pac Basic蛋白电泳仪	Bio-Rad公司
		THZ-95型台式恒温振荡培养箱	北京培英仪器厂
EPC3000恒流恒压电泳仪	北京六一仪器厂
		IVIS 5D imaging system活体成像仪	Xenogen公司
高速台式离心机TGL16B型和16G型	上海安亭科学仪器厂
		GL-21M高速冷冻离心机	湘仪离心机仪器公司
紫外分光光度计2800UV/VIS	尤尼柯仪器有限公司

二、携带荧光素酶报告基因和潮霉素抗性基因的真核表达载体pIRES-Luc-hyg的构建及鉴定

1、构携带荧光素酶报告基因和潮霉素抗性基因的真核表达载体pIRES-Luc-hyg建

根据pGL3-Luc(购自Promega公司)及pIRES-hyg(购自Clontech公司)真核表达载体设计酶切位点；pIRES-hyg3载体采用BsrG I酶切后补平，然后采用NheI酶切产生一平一粘两个末端。pGL3-Luc采用HindⅢ酶切后补平，然后采用Xba I酶切获得一平一粘两个末端的Luc报告基因片段。由于Nhe I和Xba I是一对同尾酶，分别切胶回收载体和片段，经连接酶连接后转化入E.coli.DH5α感受态大肠杆菌，氨苄培养皿筛选，挑取阳性克隆进行PCR鉴定及测序鉴定，分析后证实并命名为pIRES-Luc-hyg。具体构建过程如下：

1.1pIRES-hyg载体的酶切和补平

pGL3-Luc及pIRES-hyg3真核表达载体设计酶切位点；pIRES-hyg3载体采用BsrG I酶切后补平，然后采用Nhe I酶切产生一平一粘两个末端。具体操作为：

⑴首先利用限制性内切酶BsrG I酶切pIRES-hyg质粒，37℃水浴4h，酶切体系如下：

名称	体积(μl)
		pIRES-hyg	30.0
10×NEBuffer2	5.0

BSA	0.5
		BsrG I	1.0
Nhe I	1.0
		ddH2O	12.5
总体积	50.0

⑵酶切产物按照1:3的比例加入片段纯化结合液BD，将混合液体转移至离心柱的吸附柱中，12000rpm离心1min，弃去废液；

⑶加入550μL漂洗液，12000rpm离心1min；

⑷重复步骤⑶后弃废液，12000rpm空离2min，以便尽量出去残留的漂洗液；

⑸将吸附柱移入一个干净的EP管中，在吸附柱中央加入50μL的灭菌水，静置

5min后12000rpm离心1min，收集洗脱液；

⑹接下来用Klenow酶补酶切后的粘性末端，补平体系如下：

名称	体积(μl)
		单切后回收的pIRES-hyg	33.0
10×NEBuffer2	6.0
		dNTP mixture	5
Klenow	1.0
		ddH2O	18
总体积	60

⑺同上片段回收后，采用Nhe I再次酶切线性化后补平的pIRES-hyg3载体，最终获得一平一粘两个末端的pIRES-hyg载体，凝胶电泳分析后-20℃保存。

1.2Luc报告基因片段与pIRES-hyg载体的连接

pGL3-Luc采用HindⅢ酶切后补平，然后采用Xba I酶切获得一平一粘两个末端的Luc报告基因片段(具体步骤参见1.1)。由于Nhe I和Xba I是一对同尾酶，分别切胶回收载体和片段，经连接酶连接后转化入E.coli.DH5α感受态大肠杆菌，氨苄培养皿筛选，挑取阳性克隆进行测序鉴定，分析后证实并命名为pIRES-Luc-hyg。

2、pIRES-Luc-hyg载体转化E.coli.DH5α

将pIRES-Luc-hyg载体转化入E.coli.DH5α感受态大肠杆菌，具体操作步骤如下：

a从-70℃冰箱取1支感受态E.coli.DH5α，置于冰浴中。

b待感受态细胞溶化后加入pIRES-Luc-hyg载体1μl。

c用移液器轻柔混匀后将其放入4℃冰箱，冰浴30min。

d冰浴完成后，42℃热击45秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。

e每个离心管中加入450μl无菌的SOC培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床，150rpm振荡培养45分钟使菌体复苏。

f取转化pIRES-Luc-hyg载体后的菌体均匀涂布于含100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板培养基上，置于37℃培养箱中倒置培养16h。

g培养结束后，挑取单一克隆菌落，接种于含100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB培养基中，置于37℃摇床中振荡培养过夜(14-16小时)。

3、pIRES-Luc-hyg质粒的小量提取

小量提取阳性克隆菌液的质粒，具体步骤如下：

a取1.5mL过夜培养的菌液加入离心管中，8000rpm离心3分钟收集菌体沉淀，尽量吸弃上清；

b向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl Buffer P1(请先检查是否已加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器充分混匀，悬浮菌体沉淀。

c向离心管中加入250μl Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4-6次，充分混匀使菌体裂解，此时溶液应变得清亮粘稠。

d向离心管中加入350μl Buffer N3，立即温和地上下颠倒混匀4-6次，充分混匀，此时应出现白色絮状沉淀,13,000rpm离心10分钟。

e将步骤4中所得的上清液转移到已装入收集管的吸附柱(Spin Column CM)中，16,200×g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

f向吸附柱中加入750μl Buffer PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，16,200rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

g将吸附柱重新放回收集管中，16,200rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

h将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附膜的中间部位加入50μlBuffer EB，室温放置2-5分钟，16,200rpm离心1分钟，将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存质粒。

4、pIRES-Luc-hyg质粒的酶切鉴定和测序

将pIRES-Luc-hyg质粒用XbaⅠ和NotⅠ-HF进行双酶切鉴定，酶切体系如下：

名称	体积(μl)
		pIRES-Luc-hyg	30.0
10×NEBuffer4	5.0
		BSA	0.5
Xba I	1.0
		NotI-HF	1.0
ddH2O	12.5
		总体积	50.0

酶切条件为37℃水浴4h。

对双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得1943bp的含hyg基因条带和5480bp的pIRES-hyg载体条带，表明获得了连接位置正确的重组质粒，将重组质粒送中美泰和生物公司进行测序，测序结果重组质粒的核苷酸序列如序列表中序列7所示，自5’端第951-2403位碱基为荧光素酶报告基因，自5’端第3604-4635位碱基为潮霉素抗性基因，表明获得了连接位置及序列均正确的携带荧光素酶报告基因和潮霉素抗性基因的真核表达载体，命名为pIRES-Luc-hyg。

5、pIRES-Luc-hyg质粒的大量提取

将鉴定正确的阳性克隆菌液以1:200的比例接种入到200mL含100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，置于37℃培养箱中200rpm振荡培养过夜，然后用康为世纪无内毒素质粒大量提取试剂盒提取pIRES-Luc-hyg质粒，具体操作步骤如下：

a取200mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12000rpm离心2-3min收集细菌，尽量吸弃全部上清。

b向留有菌体沉淀的离心管中加入12mL Buffer P1(先检查是否已加入Rnase A)，使用移液器或漩涡振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。

c向离心管中加入12mL Buffer P2，温和地上下颠倒6-8次，使菌体充分裂解，室温放置3-5min，此时溶液应变得粘稠。

d向离心管中加入12mL Buffer E3，立即上下颠倒混匀6-8次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5min,12000rpm离心10min，将上清全部倒入除内毒素过滤器(Endo-Remover Filter)中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50mL离心管中。

e向滤液中加入11mL异丙醇，上下颠倒混匀。

f柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱(Spin Column CX)中加入2mL Buffer PS，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

g将步骤d中滤液与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱中。

h 12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

i向吸附柱中加入10mL Buffer PW(先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液。

j重复步骤i。

k将吸附柱重新放回收集管中，12000rpm离心5min，倒掉废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

l将吸附柱放置于一个新的收集管中的，向吸附膜的中间部位加入1mLEndo-Free Buffer EB，室温放置2-5min，12000rpm离心5min，将质粒溶液收集到收集管中，-20℃保存质粒。

三、建立稳定表达hG250/Luc的Renca单克隆细胞系

1、构建稳定表达人G250抗原的Renca单克隆细胞系

该细胞系是将Ires-neo-G250质粒转染至小鼠Renca细胞中，并利用G418加压筛选获得的稳定表达人G250抗原的单克隆细胞株，命名为Renca-hG250，其人G250抗原的表达效率高达95％(李云奇,肖毅，董金凯等.稳定表达人G250基因小鼠renca细胞株的建立.解放军医学院学报.2013；37:294-8.)。

2、Renca细胞潮霉素B敏感性筛选试验

不同的细胞对潮霉素B的敏感性不同，因此在筛选细胞系之前先确定出Renca细胞潮霉素B的筛选浓度，方法如下：

a首先复苏稳定表达人G250抗原的Renca单克隆细胞系，传代培养至生长对数期。

b将Renca细胞消化后，以每孔1×10⁴的细胞浓度接种至24孔板中，支付37℃、5％CO₂恒温恒湿培养4h。

c以3个孔为一组，各组孔中加入浓度分别为0、100、200、300、400、500、600、700、800μg/mL的潮霉素B。

d在37℃、5％CO₂的条件下培养7天左右，观察使细胞全部死亡的最低潮霉素B浓度，并将此浓度确定为筛选Renca细胞的浓度。

最终确定Renca细胞潮霉素B的筛选浓度为300μg/mL。

3、pIRES-Luc-hyg质粒瞬时转染Renca细胞

将步骤二获得的无内毒素pIRES-Luc-hyg质粒瞬时转染Renca细胞，具体步骤如下：

a将对数生长期的稳定表达人G250抗原的Renca单克隆细胞传代接种到6孔板中，接种密度为3×10⁵，使24小时后细胞汇合度达到70％-80％进行转染。

b按照Invitrogen公司的转染试剂说明书配制转染复合物：分别用IReduced Serum Medium 250μl溶解稀释4μg pIRES-Luc-hyg质粒和10μl的Lipofectamine^TM2000转染试剂。

c室温孵育5分钟。

d 5分钟后将两种液体混合，用移液器缓慢轻柔混匀，室温孵育30分钟。

e在室温孵育期间，用洗涤前一天分孔培养的Renca细胞2-3次。

f孵育完成后，将转染混合液加入6孔板细胞中，500μl/孔，37℃、5％CO₂恒温恒湿培养。

g转染6h后，更换含10％胎牛血清的RMPI 1640培养基继续培养。

4、pIRES-Luc-hyg质粒瞬时转染Renca细胞后加压筛选

a Renca细胞瞬时转染培养48小时后，向转染孔内加入筛选浓度为300μg/mL的潮霉素B，每3天更换一次培养基，每天在显微镜下观察。加药约5天以后，开始观察到大量细胞死亡，持续筛选直至无细胞大量死亡，并出现团簇形状生长的细胞团，即认为初步获得了阳性细胞；

b继续对阳性细胞进行潮霉素B(300μg/mL)加压筛选，待细胞长到基本铺满6孔板时，将其消化并转移至细胞培养瓶中扩大培养，等到阳性细胞长满得到了混合克隆。

5、稳定转染pIRES-Luc-hyg质粒的Renca细胞的单克隆化

采用有限稀释法对混合克隆细胞进行单克隆化，将混合克隆细胞稀释为1000个/mL的浓度，以每孔100μl有限稀释到96孔板中，之后在倒置显微镜下观察，挑出只含有1个细胞的孔，加入含200μg/mL潮霉素B的培养基进行培养，14天后将单克隆细胞团消化后逐级扩大培养，最终得到单克隆细胞株，命名为Renca-hG250/Luc。

四、稳定表达hG250/Luc的Renca单克隆细胞系的鉴定

1、Western Blot检测hG250/Luc蛋白在Renca-hG250/Luc细胞内的表达水平

1.1蛋白样品制备

a待单克隆细胞在培养瓶中生长达到80-90％融合度时，用PBS将细胞洗2遍。

b用0.25％的胰酶消化后，1000rpm离心5min，收集培养瓶中的细胞。

c用PBS洗涤细胞沉淀。

d向细胞沉淀加入400μl RAPI细胞裂解液，在冰上操作4℃裂解390min。

e 4℃、12000rpm离心10min，吸取上清，加入适量SDS-PAGE Buffer，沸水中加热10min，获得蛋白样品，置于4℃冰箱保存备用。

1.2电泳

a制备10％分离胶和4％浓缩胶，具体组分见表1和表2。

b每个泳道加入30μl步骤1.1中制备的蛋白样品，同时加入预染的蛋白预染Marker。

c 80V恒压至样品到达分离胶时提高电压至120V，至蛋白条带达胶的底部时停止电泳。

表1 10％分离胶(PH8.8)的制备

组分	加入量
		40％丙烯酰胺：双丙烯酰胺	1.87mL
1.0M Tris·Cl pH8.8	3mL
		10％SDS	75μl
ddH2O	2.51mL
		10％APS(过硫酸铵)	37μl
TEMED	5μl
		总体积	7.5mL

表2 4％浓缩胶(PH6.8)的制备

组分	加入量
		40％丙烯酰胺：双丙烯酰胺	550μl
1.0M Tris·Cl pH8.8	630μl
		10％SDS	50μl
ddH2O	3.74mL
		10％APS(过硫酸铵)	25μl
TEMED	5μl
		总体积	5mL

1.3转移印迹

a SDS-PAGE电泳结束后，将凝胶从玻璃板上卸下后浸泡于转膜缓冲液中。

b裁剪合适大小的PVDF膜，在甲醇中浸泡30s使其变为半透明状态，再放至转膜缓冲液平衡20min。

c将滤纸、凝胶、PVDF膜按顺序逐层叠放，尽可能避免出现气泡和褶皱。

d冰水浴下200mA恒流转移2h。

1.4抗体反应

a封闭：将转移完成后的PVDF膜置于封闭液(5％脱脂奶粉溶液)，室温封闭2h。

b洗涤：封闭完成后用PBST洗膜3次，每次10min。

c一抗：加入1:1000稀释的山羊抗萤火虫荧光素酶多克隆抗体(或鼠抗人的G250抗体)，4℃孵育过夜(14-16小时)。

d洗涤：次日赋予完成后用PBST洗膜3次，每次10min。

e二抗：加入1:5000稀释的HRP标记兔抗山羊IgG抗体，室温孵育2h。

f洗涤：孵育结束后用PBST洗膜3次，每次10min。

1.5化学发光、显影

发光及显影步骤如下：在暗室中红色灯光的照明下，将PVDF膜有蛋白的面向上平铺于曝光盒中，取适量普利莱ECL发光试A液和B液各1mL，在EP管中1：1混匀，静置1min后滴加至PVDF膜上，反应1min后在PVDF膜上放感光胶片，根据光带强弱选择合适的曝光时间；将曝光后的胶片浸于显影液中显影，显影时间根据具体情况确定，显影结束后将胶片浸于定影液中定影约3min；将定影后的胶片自来水冲洗晾干，保存实验结果。

Western blot检测结果如图1E(1：Renca-hG250/Luc单克隆细胞；2：Renca-hG250单克隆细胞)所示，表明Renca-hG250/Luc单克隆细胞蛋白与特异性的小鼠抗人G250或山羊抗荧光素酶抗体结合后，经过二抗孵育并发光显影后，可以出现特异性条带，且分子量大小(40kDa)及位置均与预期一致。Western blot检测结果证明了筛选的Renca单克隆细胞系Renca-hG250/Luc能够稳定表达人G250蛋白及萤火虫荧光素酶。

2、流式细胞术检测hG250/Luc蛋白在Renca-hG250/Luc细胞内的表达水平

将Western blot检测阳性的Renca-hG250/Luc单克隆细胞株进行传代培养，待对数生长期且细胞状态较好时，消化并收集细胞，洗涤后用打孔液处理细胞，分别用小鼠抗人G250抗体和山羊抗萤火虫荧光素酶抗体作为一抗孵育，再用FITC标记的二抗孵育后进行流式细胞检测，具体步骤如下：

a收集细胞：培养单克隆细胞至对数生长期时，用0.25％的胰酶消化，冰浴预冷的含有2％新生小牛血清的PBS清洗细胞3遍，收集至2支离心管中，同时收集普通Renca细胞作为阴性对照。

b一抗孵育：1支实验组细胞(Renca-hG250/Luc)和1支对照组细胞(Renca-hG250)用1:200稀释的鼠抗人的G250抗体4℃孵育40min，每隔10min轻柔振荡离心管，使细胞悬浮；另1支实验组细胞和1支对照组细胞用山羊抗荧光素酶抗体4℃孵育40min，每隔10min轻柔震荡离心管，使细胞悬浮。

c洗涤：含2％的新生牛血清的PBS清洗细胞3遍。

d二抗孵育：两组细胞分别加入1:200稀释的FITC标记兔抗小鼠IgG抗体和FITC标记兔抗山羊IgG抗体，4℃孵育40min，每隔10min轻柔振荡离心管，使细胞悬浮。

e洗涤检测：用含2％新生牛血清的PBS清洗细胞3遍后，用1％的多聚甲醛重悬细胞，进行流式细胞术检测。

Renca-hG250/Luc单克隆细胞株的流式细胞术检测结果如图2(A.对照细胞；B.Renca-hG250/Luc(anti-Luc)；C.Renca-hG250/Luc(anti-hG250))所示，人G250阳性表达率为81.87％，Luc阳性表达率为81.03％，说明人G250抗原和Luc荧光素酶在筛选出的Renca-hG250/Luc单克隆细胞株中得到了很好的表达。

3、活体成像技术检测荧光素酶报告基因(Luc)在Renca-hG250/Luc细胞中的表达水平

培养单克隆细胞Renca-hG250/Luc至对数生长期时，用0.25％的胰酶消化、收集并制成细胞悬液；之后向96孔板中接种该细胞，细胞数依次为1×10⁵、5×10⁴、2.5×10⁴、1.25×10⁴、6.25×10³、3.125×10³、1.56×10³、88×10²，每个浓度设置4个复孔；铺好后在细胞培养箱中放置2h，之后每孔加入1:100稀释的荧光素酶底物，反应2min后放入活体成像仪中检测。

检测结果如图3(横向孔表示依次稀释的细胞浓度，纵向孔表示筛选出的4组单克隆细胞株)所示，可以看出，筛选出的Renca-hG250/Luc单克隆细胞系能够稳定表达荧光素酶，且在细胞浓度为3.125×10³即能够与荧光素酶底物反应而显影。

肾细胞癌基因疫苗的研究中还有一个重要的问题就是靶抗原的选择。抗原必须具备一定的特异性，并且在肾细胞癌中广泛表达。G250作为肾细胞癌的一种特异性抗原，在大部分肾癌中都有表达，88％的转移灶也有表达。以G250为靶点的基因疫苗已成为肾细胞癌免疫治疗研究中的一大热点。

为了实现hG250抗原和荧光素酶报告基因(Luc)在肾癌细胞中同时高效表达，本实施例构建了重组表达载体pIRES-Luc-hyg，该载体包含有脑炎心肌炎病毒的内核糖体进入位点，允许一条mRNA有2个开放读码框进行翻译，hyg基因为潮霉素B抗性基因，因此能够使细胞获得抗性而能在含有潮霉素B的选择性培养基中生长，将pIRES-Luc-hyg瞬时转染Renca-hG250细胞系，再通过潮霉素B的加压筛选，得到了同时同时表达hG250和Luc的多克隆细胞，再通过有限稀释法，使单个细胞分散于96孔中，再通过潮霉素B加压培养，就可以得到由单个细胞生长而来的稳定表达hG250和Luc的单克隆细胞系Renca-hG250/Luc。本实施例中采用的筛选方法简单易行，可以减少大量不必要的工作。

本实施例成功筛选出了同时稳定表达hG250和Luc的小鼠肾癌单克隆细胞系Renca-hG250/Luc，利用Western blot、流式细胞术及活体成像技术检测到了hG250和Luc的高效表达，为下一步的动物实验奠定了细胞模型基础。

实施例3、可复制型双质粒抗肾癌DNA疫苗的抑瘤活性及免疫学机制研究

本实施例将肾癌可复制型DNA疫苗pSVK-G250FGB和抗肿瘤血管生成DNA疫苗pSVK-CAVE联合应用，通过免疫Balb/c荷瘤小鼠模型，评价可复制型双质粒抗肾癌DNA疫苗的抑瘤活性，并探讨其可能的免疫学机制。

一、实验材料及仪器设备

1、菌株及实验动物

大肠杆菌E.coli.DH5α购自康为世纪生物科技公司；SPF级6-8周龄雌性Balb/c小鼠购自军事医学科学院动物实验中心。

2、抗体

小鼠抗人G250单克隆抗体、Rabbit anti-human CD31单克隆抗体购自Santa Cruz公司；HRP标记的兔抗小鼠IgG1单克隆抗体、HRP标记的兔抗小鼠IgG2a购自中杉金桥公司。

3、主要试剂及检测用试剂盒

无内毒素质粒大量提取试剂盒购自康购自世纪生物科技有限公司，胎牛血清购自PAA公司，RPMI1640培养基购自Hyclone公司，小鼠淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限公司，磷酸盐缓冲液(PBS)购自solarbio生物科技有限公司，青霉素、链霉素和卡那霉素购自博大泰克生物基因有限公司；小鼠IL-2、IL-4、IL-10、INF-γELISA检测试剂盒均购自欣博盛生物科技有限公司，小鼠预包被INF-γELISPOT检测试剂盒购自深圳达科为生物技术有限公司，非放射性CTL活性检测试剂盒CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司。

4、主要的仪器和设备

二、免疫用无内毒素pSVK-G250FGB与pSVK-CAVE质粒的大量提取及鉴定

使用康为世纪生物科技有限公司的“无内毒素质粒大量提取试剂盒”提取无内毒素超纯pSVK空载体、pSVK-G250FGB与pSVK-CAVE质粒。提取质粒后，用紫外分光光度计测出质粒的浓度，并用双酶切法鉴定pSVK-G250FGB与pSVK-CAVE质粒是否正确，酶切体系分别见表3和表4。

表3 pSVK-G250FGB质粒的NdeⅠ与SmaⅠ双酶切鉴定体系

名称	体积(μl)
		pSVK-G250FGB	30.0
10×NEBuffer4	5.0
		BSA	0.5
NdeⅠ	1.0
		ddH2O	12.5
总体积	50.0

表4 pSVK-CAVE质粒的BSSHⅡ与NotI-HF双酶切鉴定体系

名称	体积(μl)
		pSVK-CAVE	30.0
10×NEBuffer4	5.0
		BSA	0.5
BSSHⅡ	1.0
		NotI-HF	1.0
ddH2O	12.5
		总体积	50.0

酶切条件为37℃水浴4h。

对pSVK-G250FGB与pSVK-CAVE质粒的双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4(A：pSVK-G250FGB质粒双酶切鉴定结果，M：15000marker，1：pSVK-G250FGB质粒，2：pSVK-G250FGB质粒酶切产物；B：pSVK-CAVE双酶切鉴定结果，M：15000marker，1：pSVK-CAVE质粒，2：pSVK-CAVE质粒双酶切产物)所示，pSVK-G250FGB质粒经酶切获得了5400bp和10000bp的两条片段，大小与预期结果一致，表明获得了正确的pSVK-G250FGB质粒，而且质粒的质量较高，可用于下一步的动物实验；pSVK-CAVE质粒经酶切获得了6400bp和9600bp的两条片段，大小与预期结果一致，表明获得了正确的pSVK-CAVE质粒，而且质粒的质量较高，可用于下一步的动物实验。

三、实验动物分组方案

采用随机化分组的方法，将6-8周龄的雌性Balb/c小鼠随机分为5组，每组15只，5只进行肿瘤生长形态学观察、5只进行生存率观察、5只进行抑瘤功能的免疫学作用机制检测。5组分别如下：A组为空白对照组；B组为pSVK空载体组；C组为pSVK-G250FGB疫苗组；D组为pSVK-CAVE疫苗组；E组为pSVK-G250FGB+pSVK-CAVE双质粒疫苗组。

四、Balb/c小鼠的免疫策略

如图5所示，Balb/c小鼠在进行Renca-hG250/Luc肾癌细胞皮下接种前每隔1周，连续进行3次免疫接种，免疫方法采用小鼠股四头肌肌肉注射并同时进行电穿孔刺激的方式，A组每只小鼠注射100μl生理盐水，B、C、D组分别注射相应的DNA质粒，免疫剂量均为1μg/100μl/只，E组同时注射两种质粒各1μg/100μl/只；在注射后约5min，用ECM 830电脉冲仪在注射部位进行电穿孔刺激，电穿孔条件为：60V/cm，50ms，1Hz×6次。

五、皮下移植瘤攻击

复苏并培养实施例2获得的小鼠肾癌Renca-hG250/Luc单克隆细胞，至对数生长期时收获并制备细胞悬液，用高压灭菌的PBS清洗后调整细胞浓度为2×10⁶个/mL，各组小鼠于末次免疫后1周(7天)在后背部皮下接种100μl细胞悬液，即2×10⁵个细胞/只。

六、可复制型双质粒抗肾癌DNA疫苗的抑瘤活性观察

1、免疫小鼠肿瘤成瘤时间分析

末次免疫1周(7天)后，向各组Balb/c小鼠进行皮下肿瘤接种(Renca-hG250/Luc)，之后隔天观察各组小鼠皮下肿瘤的生长情况，记录各组小鼠皮下肿瘤生长至可触及时所需要的时间，即成瘤时间。

结果如表5和图6所示，各免疫组之间存在不同程度的差异，空白对照组和pSVK空载体组小鼠皮下肿瘤接种过后成瘤时间最早，接种后10天左右即可触及肿瘤结节形成；单独应用pSVK-tG250和CAVE的两组小鼠成瘤时间无统计学差异(P＞0.05)，pSVK-tG250+CAVE双质粒疫苗组小鼠成瘤所需时间最短，大约18.3±1.2天，与其它4组之间有统计学差异(P＜0.05)。

表5 各组免疫小鼠皮下肿瘤的成瘤时间

分组	平均成瘤时间(天)
		A组空白对照组	9.2±1.1
B组pSVK空载体组	10.2±1.3
		C组pSVK-G250FGB组	15.2±0.8*
D组pSVK-CAVE组	14.4±1.1*
		E组pSVK-G250FGB+pSVK-CAVE双质粒疫苗组	19.4±1.2*

注：^*与对照组比成瘤时间差异显著(P<0.05)。

2、免疫小鼠皮下肿瘤生长情况分析(绘制肿瘤生长曲线)

各组免疫小鼠皮下接种肿瘤细胞，肿瘤可触及后，隔天测量并记录小鼠皮下肿瘤的垂直垂直长径和垂直短径，计算各组小鼠皮下肿瘤的体积，绘制小鼠肿瘤的生长曲线，对每次测量的结果进行统计学分析。小鼠肿瘤体积的计算公式如下：

肿瘤体积(mm³)＝0.5×垂直长径×(垂直短径)²。

肿瘤生长曲线如图7所示，pSVK-tG250+CAVE双质粒疫苗组及pSVK-tG250、CAVE单独应用组与空白对照组和pSVK空载体组相比，小鼠皮下肿瘤体积存在统计学差异(P＜0.05)，双质粒疫苗组肿瘤体积与单独质粒组相比也较小，存在统计学差异(P＜0.05)

3、疫苗对小鼠皮下肿瘤生长的抑制作用分析(肿瘤抑制率分析)

各组免疫小鼠皮下接种肾癌细胞Renca-hG250/Luc后，对皮下肿瘤结节的生长情况进行观察、测量和记录，分别计算各组小鼠肿瘤生长至第40天时的体积，分析各组小鼠肿瘤的生长抑制率，计算公式如下：

肿瘤生长抑制率(％)＝(对照组平均体积-免疫组平均体积)/对照组平均体积×100％。

结果如表6和图8A、图8B所示，空白对照组和pSVK空载体组小鼠的皮下肿瘤体积不存在统计学差异(P＞0.05)，双质粒疫苗组及pSVK-hG250和CAVE单独疫苗组小鼠的平均肿瘤体积均显著低于对照组和pSVK空载体组(P＜0.05)；且与其它四组相比，双质粒疫苗组的小鼠肿瘤体积最小，统计学差异显著(P＜0.05)，肿瘤抑制率可以达到83.9％。

表6 各组免疫小鼠对肿瘤的瘤重以及肿瘤抑制率

分组	肿瘤体积(mm3)	肿瘤抑制率(％)
			A组空白对照组	4067±305.5	—
B组pSVK空载体组	3667±321.5	9.8
			C组pSVK-G250FGB组	1400±233.1*	65.5
D组pSVK-CAVE组	2100±360.6*	48.3
			E组pSVK-G250FGB+pSVK-CAVE双质粒疫苗组	653±135.6*	83.9

注：^*与对照组比成瘤时间差异显著(P<0.05)。

4、各免疫组小鼠皮下肿瘤接种后的存活情况

各免疫组小鼠皮下接种肾癌细胞Renca-hG250/Luc后，各组小鼠的存活情况如图9所示，可以看出，空白对照组和pSVK空载体组小鼠从肿瘤接种29天左右时开始出现死亡，45天时全部死亡；CAVE疫苗组在35天时出现第一只小鼠死亡，pSVK-tG250疫苗组组在39天左右出现第一只死亡，而双质粒疫苗组44天时才出现第一只小鼠死亡，并且在接种肿瘤后的70天时，仍然有2只小鼠保持存活，而其它各组的生存率均降至20％以下，双质粒疫苗组小鼠与其余各组小鼠的存活率具有统计学差异(P＜0.05)。

统计学处理:实验数据采用SPSS17.0软件进行统计分析，各组小鼠成瘤时间和离体肿瘤体积使用单因素方差分析(one way ANOVA)进行比较，两组样本之间的数据差异进行t检验(Student’s t-test)，生存时间曲线采用Kaplan–Meier法进行统计，所有结果以P<0.05作为统计学差异显著性标准。

七、可复制型双质粒抗肾癌DNA疫苗诱导抗肿瘤效应的免疫学机制研究

检测免疫后各组小鼠体内的免疫学指标，对可复制型双质粒抗肾癌DNA疫苗发挥作用的可能机制进行初步探讨与研究。

1、ELISA法检测免疫小鼠血清中的特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体

各免疫组小鼠末次免疫后2周，通过小鼠眼眶静脉取血，分离并吸取血清分装，-70℃保存备用。用经原核表达及纯化的hG250蛋白(氨基酸序列如序列表中序列8所示)包被ELISA板，分别检测免疫小鼠血清中特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体滴度，具体操作方法如下：

a包被酶联板：纯化的hG250蛋白用包被液稀释至终浓度为1.0μg/mL，100μl/孔包被ELISA板，同时用同样浓度的BSA溶液作为阴性对照包被酶联板，4℃静置包被过夜。

b洗涤：用PBST洗涤包被后的酶联板，共洗5次，最后在吸水纸上扣干。

c封闭：加入含5％BSA的封闭液100μl/孔，37℃封闭2h，弃去封闭液，用PBST洗板5次，最后在吸水纸上扣干。

d加入血清：将待测的各组小鼠血清用PBS稀释后依次加入酶联板，100ul/孔，37℃孵育1h。

e二抗标记：PBST洗板5次后吸水纸上扣干，分别加入1：5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG、IgG1和IgG2a，37℃孵育1h。

f显色：PBST洗板5次并扣干，加入TMB显色液100μl，37℃显色15min，加入终止液100μl/孔终止反应。

g上机检测OD值：用酶联仪检测450nm的OD值。

各组小鼠血清中的抗hG250的IgG抗体滴度如图10A所示，可见pSVK-tG250单独疫苗组和pSVK-tG250+CAVE双质粒疫苗组小鼠可产生较高滴度的抗hG250IgG抗体，且其滴度显著高于空白对照组、pSVK空质粒组和CAVE组(P<0.05)。

此外，还以原核表达的mVEGFR抗原(氨基酸序列如序列表中序列9所示)包被酶联板，检测各免疫组小鼠血清中的特异性mVEGFR抗体生成情况。结果如图10B所示，CAVE组和双质粒疫苗组可产生较高滴度的mVEGFR特异性抗体，显著高于空白对照组和pSVK空载体组(P＜0.05)，但两组相互之间没有统计学差异(P＞0.05)。

2、免疫小鼠血清中IgG亚型分析

用hG250蛋白包被ELISA板，取末次免疫后2周的小鼠血清，以1：500稀释后孵板，检测各组小鼠血清IgG抗体亚型IgG1及IgG2a。

由图11A可见，双质粒疫苗组和pSVK-G250FGB单独应用组的IgG1及IgG2a抗体滴度都显著高于其它三组(P<0.05)，但这两组之间的IgG1及IgG2a抗体水平无明显差异(P>0.05)；进一步分析IgG1/IgG2a的比值，由图11B可见，双质粒疫苗组和pSVK-G250FGB组的IgG1/IgG2a比明显倒置，其中双质粒疫苗组的IgG1/IgG2a值又显著低于pSVK-G250FGB组(P<0.05)，表明双质粒疫苗免疫小鼠后诱导产生的免疫反应倾向于Th1型，即细胞免疫应答为主，符合肿瘤DNA疫苗的免疫要求。

3、ELISPOT法检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞特异性IFN-γ的分泌

3.1分离小鼠脾脏淋巴细胞

用小鼠脾脏淋巴细胞分离试剂盒分离小鼠脾脏淋巴细胞，具体步骤如下：

a在末次免疫后第14天，断颈处死各组免疫后小鼠，浸泡于75％乙醇中2min后放入紫外线照射消毒过的超净台内。

b无菌条件下手术取出小鼠脾脏，将脾脏剪碎后置入研磨器内，加入2mL F液及20％胎牛血清，缓慢研磨至匀浆。

c收集细胞悬液，经200目滤网过滤，800rpm×2min离心沉淀，再用细胞洗涤液洗3次，离心沉淀。

d细胞计数，用脾细胞悬液调整细胞浓度为5×10⁸个/mL，备用。

e取1mL脾脏细胞悬液，小心叠加在C液之页面上(比例为1:1)，1500rpm离心20min。

f此时离心管中由上至下细胞分四层：第一层为稀释液层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。收集第二层细胞放入含细胞洗涤液4-5mL的试管中，充分混匀，1800rpm离心20min。

g沉淀经反复洗涤2次，得到脾脏淋巴细胞。

3.2ELISPOT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞特异INF-γ分泌

在本实验中，我们分别用经原核表达、纯化及保存的hG250抗原和mVEGFR2抗原作为刺激物，以20μg/孔的终浓度加入到铺有各免疫组小鼠脾脏淋巴细胞的ELISPOT实验孔中进行刺激，通过IFN-γ的抗原抗体反应捕获由被特异激活的脾脏淋巴细胞所释放的IFN-γ，再通过酶联显色变成斑点，从而可以计算出被hG250和mVEGFR特异激活的脾脏淋巴细胞的数量。

用达科为公司预包被ELISPOT检测试剂盒测免疫小鼠脾淋巴细胞特异INF-γ分泌，具体步骤如下：

第一天：接种细胞，加入刺激物，无菌培养

a预包被板的活化：每孔加入200μL EZ-Culture^TM无血清培养基，室温静置5-10min后将其扣出。

b加入细胞悬液：将调整好浓度的细胞悬液加入各实验孔，100μL/well，具体如下：

正对照孔：细胞浓度可采用1×10⁵cells/well；

负对照孔：细胞浓度可采用1×10⁵cells/well；

背景负对照：加入重悬细胞用培养基(EZ-CultureTM无血清培养基)；

实验孔：加入5×10⁵cells/well。

c加入刺激物：10μL/well，具体如下：

正对照孔：加入阳性刺激剂工作液；

负对照孔(含背景负对照孔)：加入EZ-CultureTM无血清培养基；

实验孔：加入纯化的hG250抗原，1μg/孔。

d孵育：所有样品和刺激物加完后，盖好板盖，放入37℃、5％CO₂培养箱培养16-20小时。

第二天：培养后操作(不再需要无菌)

e裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基。加冰冷的去离子水，200μL/well，4℃冰箱放置10min低渗裂解细胞。

f洗板：倾倒孔内液体，1×Washing buffer，200μL/well，洗涤5-7次。每次停留30-60s。最后一次，在吸水纸上扣干。

g检测抗体孵育：将稀释好的生物素标记的抗体工作液加入各实验孔，100μL/well,37℃孵育1h。

h洗板：倾倒孔内液体，1×Washing buffer，200μL/well，洗涤5次，每次停留30-60s。最后一次，在吸水纸上扣干。

i酶联亲和素孵育：将稀释好的酶标亲和素工作液加入各实验孔，100μL/well，37℃孵育1h。

j洗板：倾倒孔内液体，1×Washing buffer，200μL/well，洗涤5次，每次停留30-60s。最后一次，在吸水纸上扣干。

k显色：将现配的AEC显色液工作液加入各实验孔，100μL/well，室温避光静置15-45min(在20-25℃显色25min较合适)。

l终止显色：倾倒孔内液体，揭开板底座，用去离子水/自来水洗涤正反面及底座3-5遍，终止显色。将板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座。

m ELISPOT板斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。

ELISPOT检测结果如图12A、图12B及图12C所示：①在hG250抗原刺激条件下，PBS对照组、pSVK空载体组和pSVK-CAVE组小鼠每5×10⁵个脾脏淋巴细胞所显示斑点数分别为46±13、110±18和134±29，三组之间的差异没有统计学意义(P＞0.05)；pSVK-G250FGB组和pSVK-G250FGB+pSVK-CAVE双质粒疫苗组小鼠的脾脏淋巴细胞均可检测到较高的hG250特异性IFN-γ的分泌，每5×10⁵个脾脏淋巴细胞的显示斑点数分别为436±43和405±52，相互没有统计学差异(P＞0.05)，而与其它三组的斑点数相比存在统计学差异(P<0.05)，表明表明双质粒疫苗可以有效的激活小鼠体内针对hG250抗原的细胞免疫应答。②在mVEGFR抗原的刺激下，PBS对照组、pSVK空载体组和pSVK-G250FGB组小鼠每5×10⁵个脾脏淋巴细胞所显示斑点数分别为78±18、85±21和120±20，三组之间的差异没有统计学意义(P＞0.05)；CAVE组和pSVK-G250FGB+pSVK-CAVE双质粒疫苗组小鼠的脾脏淋巴细胞均可检测到较高的mVEGFR2特异性IFN-γ的分泌，每5×10⁵个脾脏淋巴细胞的显示斑点数分别为398±41和453±61，而与其它三组的斑点数相比存在统计学差异(P<0.05)，表明双质粒疫苗可以有效激活小鼠体内针对mVEGFR2抗原的细胞免疫应答。

4、CCK-8法检测小鼠脾脏淋巴细胞的增殖

分离末次免疫后小鼠的脾脏淋巴细胞，在特异性抗原hG250刺激下，检测淋巴细胞的体外增殖活性，选用细胞增殖-毒性检测试剂盒Cell Counting Kit(购自日本DOJINDO)及CCK-8法检测，操作步骤如下：

1)将小鼠脾脏淋巴细胞按实验设计，5×10⁶/100μl/孔接种于96孔板中，加入刺激物hG250特异性抗原,使其终浓度为1ng/ml，然后置于37℃，5％CO₂细胞培养箱培养48h。

2)培养结束后在每孔加入10μl CCK溶液(注意不要在孔中生成气泡，否则会影响OD值的读数)。

3)随后将培养板放入培养箱内孵育1-4小时,酶标仪450nm波长处测定光吸收值。。

结果如图13所示，在hG250刺激下，双质粒疫苗组与其它几组免疫小鼠相比，表现出最强的增殖活性(P＜0.05)，表明双质粒疫苗能够有效促进小鼠淋巴细胞的增殖。

4、免疫小鼠脾脏淋巴细胞CTL杀伤试验

4.1效应细胞的制备

末次免疫后1周处死各组免疫小鼠，无菌制备免疫小鼠脾单细胞悬液，根据步骤3.1获得免疫小鼠的脾脏淋巴细胞悬液，加入终浓度为25μg/mL的表达纯化的hG250抗原刺激物，以及终浓度为20IU/mL IL-2，用含20％胎牛血清的淋巴细胞培养基培养5d，收获淋巴细胞并计数后作为效应细胞备用。

4.2靶细胞的制备

复苏并培养Renca-hG250/Luc单克隆细胞，至对数生长期时收集并计数后制备成细胞悬液，作为靶细胞备用。

4.3乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞的CTL杀伤活性

检测效靶比分别为40:1、20:1和10:1时各组小鼠脾脏淋巴细胞的杀伤活性。用普洛麦格公司的CTL活性检测试剂盒CytoTox 96Non-Radioactive CytotoxicityAssay检测，检测板的布局见图14，具体步骤如下：

a检测板每孔加入靶细胞Renca-hG250/Luc 1×10⁴个，体积分比为50μ。

b设置10:1、20:1、40:1三个效靶比梯度，根据比例加入相应的效应细胞，并用含10％血清的RPMI1640培养基补充使每孔总体积为200μl，每组设立3个附孔。并同时设立靶细胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔、效应细胞自发释放孔、培养基空白对照孔和体积校正孔，同样也设立4个附孔，每孔总体积200μl。

c培养板于室温250rpm离心5min，然后置于5％CO₂恒温细胞培养箱中培养4h。

d培养结束前45min，在靶细胞最大释放孔和体积校正孔中加入10μl裂解液。

e培养结束后，培养板于室温250rpm离心5min，吸取没空上清50μl加入到新的96孔酶标板的相应孔中，加入50μl乳酸脱氢酶反应底物，室温避光反应30min后，加入50μl终止液。

f终止后3min内测量波长为490nm时的OD值并记录。

g CTL计算方法：先计算出各组数据的平均值，再按如下公式计算CTL杀伤活性：

实验组释放＝每一效靶比－培养基背景

靶细胞自发释放＝靶细胞自发释放－培养基背景

效应细胞自发释放＝效应细胞自发释放－培养基背景

靶细胞最大释放＝靶细胞最大释放－体积校正

结果见表7和图15，可以看出，随着效靶比的增加，各组小鼠效应细胞特异性的杀伤靶细胞的能力也逐渐提高，而且双质粒疫苗组的小鼠体内产生了更强的特异性杀伤反应，表明双质粒疫苗组具有最优的细胞杀伤活性。

表7 不同效靶比下各免疫组小鼠脾脏淋巴细胞CTL杀伤活性

5、ELISA法检测小鼠脾脏淋巴细胞Th1类细胞因子释放

分离末次免疫后小鼠的脾脏淋巴细胞，用特异性抗原hG250刺激，培养72小时后收集上清，采用ELISA定量检测试剂盒(购自欣博盛生物科技有限公司)分别检测Th1类细胞因子IL-2、IFN-γ和Th2类细胞因子IL-4、IL-10的释放。

结果如图16A和图16B所示，与其它组相比，双质粒疫苗组的淋巴细胞在hG250特异抗原刺激下能有效分泌Th1类细胞因子如IL-2和IFN-γ，且显著高于对照组，说明双质粒DNA疫苗诱导产生的免疫应答偏向于Th1型。

肾细胞癌是成人肾脏肿瘤中最常见的一种类型，大约占到成人恶性肿瘤的3％，占所有肾脏肿瘤的80％，是泌尿系肿瘤中致死率最高一种肿瘤。当肿瘤组织局限在肾实质时，肾细胞癌的预后相对较好，5年生存率为70-80％，对于这类病例，部分或根治性手术是主要的治愈性治疗方式。然而当肿瘤组织发生局部或远处转移，即进展为转移性肾癌时，预后就相对较差。这是因为肾细胞癌是一种”惰性肿瘤”，对一些传统的治疗方式，比如化疗和放疗都不敏感，IFN和IL-2细胞因子治疗后中位生存期也只有13个月，没有获得理想的疗效。

近年来，人们将基因治疗引入到恶性肿瘤的综合治疗方案中，希望能够找到彻底根治肿瘤的办法。肿瘤基因治疗，指通过向患者体内引入某些编码基因片段，其翻译产物能够直接的或间接的杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。肿瘤治疗性疫苗作为防治恶性肿瘤术后复发转移的重要技术手段，近年来发展迅速，然而，治疗性疫苗在设计思路、制备手段和应用技术方面，其复杂程度远远超出传统的预防性疫苗。1990年Wolff等首次报道裸质粒DNA直接注射入小鼠肌肉组织能有效地转染和表达目的基因后，DNA疫苗作为新一代的疫苗形式迅速发展起来，相关研究和应用日益显示出巨大优势。

本发明的可复制型抗肾癌双质粒DNA疫苗在设计方面具有多项优势，在国际及国内同研究领域处于领先地位。第一，在抗原选择方面：选择了大多数肾癌细胞中均有表达的hG250作为靶点，并采用异种化策略，将人肾细胞癌特异性抗原G250(CAIX)主要T细胞表位区域、猴和鼠CAIX部分片段区域融合为异种化抗原tG250，能够明显提高疫苗的抗肿瘤效应；第二，在疫苗免疫增效方面：我们将tG250抗原与人Igk链前导信号肽(sig)和人IgG Fc段融合，并通过GPI锚定于细胞表面，同时在IRES序列的下游共表达人GM-CSF细胞因子和B7.1共刺激分子，能够有效打破机体免疫耐受和实现免疫增效；第三，在递送载体方面：双质粒DNA疫苗pSVK-G250FGB和pSVK-CAVE均采用发明人自主研发的新型可复制型DNA疫苗载体系统，使外源及基因片段在胞浆内高水平复制。

本发明采用pSVK-G250FGB和pSVK-CAVE双质粒DNA疫苗，能够实现抗肿瘤抗血管双重功效。在Balb/c小鼠荷瘤模型中，通过肌肉注射加电穿孔的方式免疫，同时设立了PBS空白对照组、PSVK空载体对照组、pSVK-G250FGB、pSVK-CAVE单独应用组，通过小鼠体内实验观察其抑瘤活性并对其抑瘤机制进行深入探讨。通过各组小鼠的肿瘤形态学观察，发现疫苗免疫组小鼠成瘤时间比对照组晚10天左右，皮下肿瘤的生长明显受到抑制，免疫组小鼠的生存期明显延长，接种肿瘤后40天计算肿瘤生长抑制率达到83.9％，皮下肿瘤接种后70天时双质粒组小鼠生存率为40％，显著高于其他对照组。这些结果说明，经双质粒DNA疫苗免疫能有效地抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的生存期。

通过检测免疫学相关指标，本发明对双质粒DNA疫苗可能的抑瘤机制进行了探讨。ELISA法检测小鼠血清中hG250及mVEGFR2特异性的抗体水平显示，治疗组小鼠体内产生较高浓度的hG250特异性抗体，且其IgG1/IgG2a比值升高，表明小鼠体内免疫反应向Th1型分化，此外在小鼠血清中也检测到了较高滴度的mVEGFR2特异性抗体，结果表明双质粒疫苗能够诱导产生同时针对hG250和mVEGFR2的体液免疫应答；ELISPOT法检测各组小鼠脾细胞抗原特异性IFN-γ分泌情况，结果发现在hG250抗原刺激下，疫苗免疫组特异性的分泌IFN-γ的淋巴细胞达405±52dots/5×10⁵个脾淋巴细胞，在mVEGFR2抗原刺激下这一数值可达453±61dots/5×10⁵个，说明双质粒DNA疫苗可以同时诱导小鼠机体产生针对hG250和mVEGFR2的细胞免疫应答；CCK-8检测表明双质粒疫苗组小鼠的脾脏淋巴细胞具有更强的增值活性；应用B16-hTERT/Luc细胞作为靶细胞，hG250抗原刺激小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞，LDH法检测CTL反应活性，结果发现双质粒疫苗免疫组淋巴细胞与对照组相比对肿瘤细胞的杀伤效率明显增加，在效靶比为40:1、20:1和10:1时，CTL的杀伤率分别为51.12％、39.23％和25.88％；淋巴细胞细胞因子释放检测结果表明，双质粒疫苗组的淋巴细胞在hG250特异抗原刺激下能有效分泌Th1类细胞因子如IL-2和IFN-γ，且显著高于对照组，说明双质粒DNA疫苗诱导产生的免疫应答偏向于Th1型。

在本发明应用pSVK-G250FGB+pSVK-CAVE双质粒DNA疫苗免疫荷瘤小鼠，通过体内外抑瘤实验初步证实了该双质粒疫苗能够诱导小鼠机体产生针对hG250及mVEGFR2抗原特异性的体液免疫和细胞免疫反应，能够有效抑制肿瘤生长，延长生存期，提示该双质粒肾癌DNA疫苗在小鼠体内能够发挥一定的抑瘤效果，为进一步的研究与评价提供了一定的基础。

Claims (10)

1.抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗，其活性成分包括以下组分：

1)以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带复合基因sig-tG250-Fc-GPI-IRES-GM/B7(简称G250FGB)的可复制型DNA疫苗载体pSVK-G250FGB，所述G250FGB复合基因是自5’端至3’端依次由tG250复合抗原基因、人IgG Fc段基因(GenBank号：Z17370)、GPI基因(GenBank号：XM676434)、GM/CSF基因(GenBank号：NM-000758)和B7.1基因(GenBank号：NM-005191)组成的融合基因，G250FGB复合基因的结构如图1A所示；

2)以复制子DNA疫苗载体pSVK为出发载体构建的携带肿瘤血管复合基因(CAVE)的抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE，所述肿瘤血管复合基因(CAVE)自5’端至3’端依次由小鼠VEGFR2胞外区1-4段(肿瘤血管靶抗原)基因(GenBank号：57923，286-1536bp)、人IgG Fc段基因(GenBank号：Z17370)基因、GPI基因(GenBank号：XM676434)、人IL12A基因(GenBank号：24430218)和人IL12B基因(GenBank号：24497437)构成，肿瘤血管复合基因的结构如图1C所示。

2.根据权利要求1所述的抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗，其特征在于：所述复制子DNA疫苗载体pSVK的核苷酸序列如序列表中序列1所示。

3.根据权利要求1或2所述的抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗，其特征在于：所述tG250复合抗原基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示，所述G250FGB复合基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；以pSVK为出发载体构建的携带G250FGB复合基因的重组可复制型肾癌治疗性DNA疫苗pSVK-G250FGB的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

4.根据权利要求1-3任一所述的抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗，其特征在于：所述肿瘤血管复合基因(CAVE)的核苷酸序列如序列表中序列5所示；以pSVK为出发载体构建的携带肿瘤血管复合基因(CAVE)的抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE的核苷酸序列如序列表中序列6所示。

5.根据权利要求1-4任一所述的抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗，其特征在于：所述可复制型DNA疫苗载体pSVK-G250FGB的核苷酸序列如序列表中序列4所示，其中自5’端第7415-11913位碱基为G250FGB复合基因序列；所述抗肿瘤血管复制子DNA疫苗pSVK-CAVE的核苷酸序列如序列表中序列6所示，其中自5’端第7411-12553位碱基为肿瘤血管复合基因CAVE序列。

6.根据权利要求1-5任一所述的抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗，其特征在于：pSVK-G250FGB与pSVK-CAVE混合质量比为1：1。

7.权利要求1-6所述抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗在制备预防和/或治疗肾癌药物中的应用；所述肾癌特别是转移性肾细胞癌。

8.含有权利要求1-6所述抗肾癌双质粒可复制型DNA疫苗的组合物。

9.权利要求8所述组合物在制备预防和/或治疗肾癌药物中的应用。

10.根据权利要求7或9所述应用，使用所述药物采用电穿孔肌肉内注射的方式进行免疫，免疫方案为：先肌肉注射疫苗，然后进行电穿孔刺激；免疫剂量一般为1-100μg(pSVK-G250FGB 1-100μg，pSVK-CAVE 1-100μg，pSVK-G250FGB与pSVK-CAVE的注射剂量比例为1：1)/kg；注射后约5min，用ECM 830电脉冲仪在注射部位进行电穿孔刺激，电穿孔条件为：60V/cm，50ms，1Hz×6次。