CN116535491A - 治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因药物技术领域，尤其是涉及治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用。本发明提供的以编码P53蛋白和编码白细胞介素IL‑12p35和p40亚基的核酸分子片段为主要组分的核酸分子或核酸分子混合物，并提供了包含上述核酸分子片段的不同组合形式的核酸分子，所述组合形式包括不同核酸分子片段的融合，和不同核酸分子片段以游离形式形成组合物，经验证，本发明提供的核酸分子片段采用游离形式组合或者制备成融合核酸分子均对实体瘤表现出有效的治疗作用。本发明进一步使用适配载体与上述核酸分子组合物或融合核酸分子复合得到核酸分子药物，并给出了相应的制备方法，以期缓解目前实体瘤治疗对药物的迫切需求。

Description

治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用
本申请要求申请日为2022年05月06日的中国专利申请(申请号：2022104869114，发明名称：治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用)的优先权，该中国专利申请的部分内容通过引用方式整体并入到本申请。
技术领域
本发明涉及基因药物技术领域，尤其是涉及治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用。
背景技术
肿瘤在临床上有实体瘤和非实体瘤之分，实体瘤及有形瘤，可通过临床检查如x线摄片、CT扫描，B超、或触诊扪及到的有形肿块称实体瘤，X线、CT扫描，B超及触诊无法看到或扪及到的肿瘤如血液病中的白血病就属于非实体瘤。
针对实体肿瘤的主流治疗4种方式：外科手术、化学治疗、放射治疗和靶向治疗。这些方法可以移除、毁损、杀伤、破坏肿瘤细胞，使病情缓解。根据肿瘤的种类，可以采用一种治疗方式，或采用多种治疗方式联合治疗。另外肿瘤免疫疗法发展迅速，已逐步发展成为继四种主流肿瘤治疗方式后的另一有效治疗手段；其中因核酸分子的优越特性，基于核酸分子的肿瘤免疫疗法也被提了出来。基于核酸分子的治疗，简单来讲就是利用化学修饰后的核酸分子进入细胞质中，利用细胞质内的自有核苷酸进行转录表达，生成机体所需要的蛋白质。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于，提供一种对实体瘤具有治疗效果的核酸分子或核酸分子混合物，该核酸分子或核酸分子混合物含有的多种核酸分子片段能够突破实体瘤的微环境屏障，对肿瘤细胞实现高效的抑制作用。
本发明的第二个目的在于，提供由上述核酸分子片段的核酸分子组合物或者融合核酸分子，以不同核酸分子片段的组合物形式，或者以不同核酸分子的融合形式用于治疗实体瘤药物治疗中。
本发明的第三个目的在于，提供一种核酸分子药物，所述核酸分子药物包括上述核酸分子组合物和/或融合核酸分子，并将其与适配的载体复合得到能够用于临床的治疗实体瘤的药物。
本发明还有一个目的在于，提供上述核酸分子药物的制备方法，通过将含有上述核酸分子的水相与含有载体组分的有机相混合，得到核酸分子药物，该方法简便易行，适合工业化推广。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供治疗性核酸分子或核酸分子混合物，所述核酸分子包括：核酸分子片段(A)，所述核酸分子片段(A)编码P53蛋白；和核酸分子片段(B)；所述核酸分子片段(B)编码白细胞介素IL-12的p35和p40亚基。
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(A)编码的P53蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.38所示，或，包含与SEQ ID NO.38至少80％同一性的氨基酸序列；
在可选的实施方式中，所述酸分子片段(A)的核苷酸序列选自；SEQ ID NO.22～29和SEQ ID NO.39～41中的至少一种；或，选自与SEQ ID NO.22～29和SEQ ID NO.39～41至少70％同一性的核苷酸序列中的任意一种；
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(B)编码的IL-12的p35亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，或，包含与SEQ ID NO.11至少80％同一性的氨基酸序列；
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(B)编码的IL-12的p40亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，或，包含与SEQ ID NO.12至少80％同一性的氨基酸序列；
在可选的实施方式中，IL-12的p35和p40亚基通过氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示的linker连接；
在可选的实施方式中，所述酸分子片段(B)的核苷酸序列选自；SEQ ID NO.16～21中的至少一种，或，选自与SEQ ID NO.16～21至少70％同一性的核苷酸序列中的任意一种。
在可选的实施方式中，所述核酸分子包括DNA分子和/或RNA分子。
在可选的实施方式中，所述DNA分子包括链状DNA分子和/或环状DNA分子。
在可选的实施方式中，所述RNA分子包括mRNA或环形RNA。
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段的5’端和/或3’端具有修饰基团。
在可选的实施方式中，基于提供的RNA序列，本领域普通技术人员将能得到相应的DNA序列(例如尿嘧啶转换为胸腺嘧啶)。同样地，基于所提供的DNA序列，本领域普通技术人员将得到相应的RNA序列(例如胸腺嘧啶转换为尿嘧啶)。
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段为mRNA片段，所述mRNA片段的5’端修饰基团选自ARCA、m7G(5"")ppp(5"")(2""OMeA)pG、m7G(5"")ppp(5"")(2""OMeG)pG、m7(3""OMeG)(5"")ppp(5"")(2""OMeG)pG、m7(3""OMeG)(5"")ppp(5"")(2""OMeA)pG、mCAP、dmCAP、tmCAP或dmCAP。
在可选的实施方式中，所述mRNA片段的3’端保护性修饰基团为poly(A)，所述poly(A)长度为50～200，优选为80～200。
在可选的实施方式中，所述mRNA片段还含有5’UTR；
在可选的实施方式中，所述5’UTR的长度优选为10～200个核苷酸，优选为15～100个核苷酸；
在可选的实施方式中，所述5’UTR包括KOZAK序列或DNAH2 5’UTR；
在可选的实施方式中，KOZAK序列的核苷酸序列如SEQ ID.NO.15所示；
在可选的实施方式中，DNAH2 5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID.NO.14所示；
在可选的实施方式中，所述mRNA片段还含有3’UTR；
在可选的实施方式中，3’UTR序列如SEQ ID.NO.1～10所示。
在可选的实施方式中，mRNA由5’端至3’端依次包括5’帽子、5’UTR、ORF、3’UTR和3’poly(A)尾端。
第二方面，本发明提供第一治疗性核酸分子组合物，所述第一治疗性核酸分子组合物包括，前述实施方式任一项所述的核酸分子混合物。
在可选的实施方式中，所述第一治疗性核酸分子组合物中每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1～1:10。
第三方面，本发明提供治疗性融合核酸分子，所述治疗性融合核酸分子包括前述实施方式任一项所述的核酸分子，所述核酸分子包括核酸分子片段(A)和核酸分子片段(B)；
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段(A)和核酸分子片段(B)通过linker连接。
在可选的实施方式中，所述治疗性融合核酸分子中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10。
第四方面，本发明提供第二治疗性核酸分子组合物，所述第二治疗性核酸分子组合物包括前述实施方式所述第一治疗性核酸分子组合物和前述实施方式所述治疗性融合核酸分子的组合。
在可选的实施方式中，所述第二治疗性核酸分子组合物中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10。
第五方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的核酸分子或核酸分子混合物、前述实施方式所述的第一治疗性核酸分子组合物、前述实施方式所述的治疗性融合核酸分子或前述实施方式所述的第二治疗性核酸分子组合物在制备抗实体瘤药物或者实体瘤药物药效评价中的应用。
在可选的实施方式中，所述实体瘤包括上皮肿瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、前列腺瘤、卵巢瘤、肾细胞瘤、胃肠道瘤、肝瘤、结肠直肠瘤、血管瘤、间皮瘤、胰脏瘤、乳房瘤、肉瘤、肺瘤、结肠瘤、脑瘤、黑色素瘤、小细胞肺瘤、神经母细胞瘤、睾丸瘤、癌瘤、腺癌瘤、神经胶质瘤、精细胞癌瘤、视网膜母细胞瘤或骨肉瘤。
第六方面，本发明提供治疗实体瘤的核酸分子药物，所述核酸分子药物包括核酸分子组分和包裹核酸分子组分的载体；
所述核酸分子组分选自前述实施方式任一项所述的治疗性核酸分子或核酸分子混合物、前述实施方式所述的第一治疗性核酸分子组合物、前述实施方式所述的治疗性融合核酸分子或前述实施方式所述的第二治疗性核酸分子组合物。
在可选的实施方式中，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；
在可选的实施方式中，融合核酸分子中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；
在可选的实施方式中，所述载体包括脂质体纳米颗粒；
在可选的实施方式中，所述核酸分子组分中的每一种游离的核酸分子片段或融合核酸分子均被脂质体纳米颗粒独立包裹；
在可选的实施方式中，至少两种游离的核酸分子片段或融合核酸分子均被脂质体纳米颗粒独立包裹；
在可选的实施方式中，至少两种游离的核酸分子片段被脂质体纳米颗粒共同包裹；
在可选的实施方式中，至少一种游离的核酸分子片段和融合核酸分子被脂质体纳米颗粒共同包裹。
在可选的实施方式中，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括20％～50％的Dlin-MC3-DMA、20％～50％的DOPG、5％～20％的胆固醇和1％～5％的PEG-DMG。
在可选的实施方式中，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括50％的Dlin-MC3-DMA、10％的DOPG、38.5％的胆固醇和1.5％的PEG-DMG。
在可选的实施方式中，还包括治疗性蛋白或治疗性化学药用组分。
在可选的实施方式中，所述治疗性蛋白包括阿替利珠单抗。
第七方面，本发明提供前述实施方式任一项所述核酸分子药物的制备方法，将游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子溶解于缓冲液中得到水相，量取脂质体纳米颗粒各脂质组分溶于有机溶剂得到有机相，混合水相和有机相后去除有机相得到核酸分子药物。
在可选的实施方式中，所述水相和有机相的体积比为1：2～4，优选为1:3。
在可选的实施方式中，所述缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液或醋酸钠，优选为柠檬酸盐缓冲液。
在可选的实施方式中，所述缓冲液的pH为3～7，优选为4。
在可选的实施方式中，水相中游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL，优选为0.1mg/mL。
在可选的实施方式中，所述有机溶剂选自C1～C4低碳醇，优选为无水乙醇。
在可选的实施方式中，所述有机相中脂质组分的浓度为5mg/mL～7mg/mL，优选为6mg/mL。
在可选的实施方式中，使用微流控混合水相和有机相，采用切向流过滤有机溶剂。
在可选的实施方式中，所述微流控的流速为>3ml/min，进一步优选为12mL/min。
在可选的实施方式中，混合后还包括浓缩步骤，所述浓缩步骤使游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子的终浓度为50μg/mL～200μg/mL，优选为100μg/mL。
第八方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包括前述实施方式任一项所述的核酸分子药物，或采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的核酸分子药物。
在可选的实施方式中，所述药物组合物还包括蛋白类药物，所述蛋白类药物选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗DC20抗体、抗Her2抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗VEGFR抗体、抗EGFR抗体、抗RANKL抗体、抗CD30抗体、抗VEGFR2抗体、抗GD2抗体、抗CD38抗体、抗CD22抗体和抗CD33抗体中的至少一种。
在可选的实施方式中，所述药物组合物还包括阿替利珠单抗、纳武单抗、帕母单抗、pidilizumab、阿唑单抗、durvalumab、阿曲单抗和伊匹木单抗中的至少一种。
本发明提供的以编码P53蛋白的核酸分子片段，和，编码白细胞介素IL-12p35和p40亚基的核酸分子片段为主要组分的核酸分子或核酸分子混合物，能够全面激活多种免疫细胞活性，实现对实体瘤的有效治疗。
本发明还提供了包含上述核酸分子片段的不同组合形式的核酸分子，所述组合形式包括不同核酸分子片段的融合，和不同核酸分子片段以游离形式形成组合物，经验证，本发明提供的两类核酸分子片段无论是采用游离形式组合，还是制备成融合核酸分子均对实体瘤表现出有效的治疗作用。
本发明还进一步使用适配载体与上述核酸分子组合物或融合核酸分子复合得到核酸分子药物，并给出了相应的制备方法，以期缓解目前实体瘤治疗对药物的迫切需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中各组小鼠实验中肿瘤接种位置示意图；
图2为实施例6得到的各实验组的相对肿瘤抑制率(TGITV)曲线；
图3为实施例6得到的各实验组的肿瘤生长曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在具体的实施方式中，第一方面，本发明提供治疗性核酸分子或核酸分子混合物，所述核酸分子包括：核酸分子片段(A)，所述核酸分子片段(A)编码P53蛋白；和核酸分子片段(B)；所述核酸分子片段(B)编码白细胞介素IL-12的p35和p40亚基。
本文中核酸或核酸分子指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，核酸或核酸分子包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。核酸或核酸分子的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。核酸或核酸分子编码的目的蛋白或多肽可选地为编码正义链或反义链。核酸或核酸分子酸可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。
IL-12主要由B细胞和巨噬细胞产生，其分子是一种异型二聚体，40KD(p40)和35KD(p35)的2个亚基通过二硫键相连接。IL-12主要作用于T细胞和NK细胞，曾被命名为细胞毒性淋巴细胞成熟因子(CLMF)和NK细胞刺激因子(NKsf)。IL-12可刺激活化型T细胞增殖，促进TH0细胞细胞向TH1细胞分化；诱导ctl和NK细胞的细胞毒活性并促进其分泌IFN-γ、TNF-α、GM-CSF等细胞因子；促进NK细胞和IL-2rα、TNF受体及CD56分子的表达，增强对肿瘤细胞的ADCC效应，IL-12对于CD8+T和NK细胞的招募和发挥功能至关重要。因为细胞因子能够增强肿瘤特异性细胞毒性NK细胞和CD8+T细胞，因此，基于细胞因子的免疫治疗可以有效地治疗许多恶性肿瘤。
在可选的实施方式中，核酸分子片段(A)编码的P53蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.38所示，或，所述P53蛋白包含与SEQ ID NO.38至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与SEQ ID NO.38至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在可选的实施方式中，酸分子片段(A)的核苷酸序列选自SEQ ID NO.22～29和SEQID NO.39～41中的至少一种。
在可选的实施方式中，酸分子片段(A)的核苷酸序列选自与SEQ ID NO.22～29和SEQ ID NO.39～41至少70％、75％、80％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列中的任意一种。
在可选的实施方式中，IL-12的p35亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，或，IL-12的p35亚基包含与SEQ ID NO.11至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与SEQ ID NO.11至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在可选的实施方式中，IL-12的p40亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，或，IL-12的p40亚基包含与SEQ ID NO.12至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与SEQ ID NO.12至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在可选的实施方式中，IL-12的p35和p40亚基通过氨基酸序列为SEQ ID NO.13(GSSGGGGSPGGGSS)所示的linker连接。
在可选的实施方式中，酸分子片段(B)的核苷酸序列选自SEQ ID NO.16～21中的至少一种，其中SEQ ID NO.16～18为DNA序列，SEQ ID NO.19～21为RNA序列。
在可选的实施方式中，酸分子片段(B)的核苷酸序列选自与SEQ ID NO.16～21至少70％、75％、80％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的核苷酸序列中的任意一种。
在可选的实施方式中，核酸分子片段(A)和/或核酸分子片段(B)可以通过序列优化手段优化mRNA序列，改善与体内施用后的表达功效相关的特性：例如提高mRNA稳定性、增加靶组织中的翻译功效、减少表达的截短蛋白的数量、改善表达的蛋白质的折叠或防止其错误折叠、降低表达产物的毒性、减少由表达产物引起的细胞死亡、增加和/或减少蛋白质聚集，得到改善特性的mRNA。序列优化的目的还包括：保持结构和功能完整性的同时优化基于核酸的治疗剂的配制和递送的特征；克服表达的阈值；提高表达率；半衰期和/或蛋白质浓度；优化蛋白质定位；以及避免不利的生物响应如免疫响应和/或降解途径。序列优化手段包括：(1)根据特定器官和/或宿主生物体中的密码子频率进行密码子优化以确保恰当折叠和适当表达；(2)调节G/C含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；(3)使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基串(base runs)最小化；(4)定制转录和翻译控制区；(5)减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。
两个核苷酸序列之间的「序列同一性」指示序列之间相同核苷酸的百分比。两个氨基酸序列之间的「序列同一性」指示序列之间相同氨基酸的百分比。
术语「％同一性」或类似术语是指，在最佳比对下，待比较序列之间相同核苷酸或氨基酸之百分比。该百分比为纯粹统计学的，且两个序列之间的差异可能为(但不一定)随机分布于待比较序列之整个长度上。两个序列之比较通常藉由在最佳比对之后，相对于片段或「比较窗口」比较改等序列而进行，以鉴别对应序列之局部区。
在可选的实施方式中，所述核酸分子包括DNA分子和/或RNA分子。
在可选的实施方式中，所述DNA分子包括链状DNA分子和/或环状DNA分子。
在可选的实施方式中，所述RNA分子包括mRNA或环形RNA。
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段的5’端和/或3’端具有保护性修饰基团。
在可选的实施方式中，所述核酸分子片段为mRNA片段，所述mRNA片段的5’端修饰基团选自ARCA、m7G(5"")ppp(5"")(2""OMeA)pG、m7G(5"")ppp(5"")(2""OMeG)pG、m7(3""OMeG)(5"")ppp(5"")(2""OMeG)pG、m7(3""OMeG)(5"")ppp(5"")(2""OMeA)pG、mCAP、dmCAP、tmCAP或dmCAP。
在可选的实施方式中，所述mRNA片段的3’端保护性修饰基团为poly(A)，所述poly(A)长度为50～200，优选为80～200。
在可选的实施方式中，所述mRNA片段还含有5’UTR；
在可选的实施方式中，所述5’UTR的长度优选为10～200个核苷酸，优选为15～100个核苷酸；
在可选的实施方式中，所述5’UTR包括KOZAK序列或DNAH2 5’UTR；
在可选的实施方式中，KOZAK序列的核苷酸序列如SEQ ID.NO.15所示；
在可选的实施方式中，DNAH2 5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID.NO.14所示；
在可选的实施方式中，所述mRNA片段还含有3’UTR；
在可选的实施方式中，3’UTR序列如SEQ ID.NO.1～10所示。SEQ ID.NO.1来自肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)，SEQ ID.NO.2来自肌红蛋白(Myoglobin)，SEQ ID.NO.3来自肌动蛋白(α-actin)，SEQ ID.NO.4来自白蛋白(Albumin)，SEQ ID.NO.5和7来自组胺球蛋白(a-globin)，SEQ ID.NO.6来自胶原蛋白(Col6a2；collagen,type IV,alpha 2)，SEQID.NO.10来自血红蛋白HBA2。
在可选的实施方式中，mRNA由5’端至3’端依次包括5’帽子、5’UTR、ORF、3’UTR和3’poly(A)尾端。
在可选的实施方式中，基于提供的RNA序列，本领域普通技术人员将能得到相应的DNA序列(例如尿嘧啶转换为胸腺嘧啶)。同样地，基于所提供的DNA序列，本领域普通技术人员将得到相应的RNA序列(例如胸腺嘧啶转换为尿嘧啶)。在可选的实施方式中，基于提供的RNA或DNA序列，本领域普通技术人员将能得到相应的氨基酸序列。
在可选的实施方式中，mRNA中的一个或多个尿苷用修饰核苷进行置换。在一些实施方案中，置换尿苷的修饰核苷为假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
第二方面，本发明提供第一治疗性核酸分子组合物，所述第一治疗性核酸分子组合物包括，前述实施方式任一项所述的核酸分子混合物。
在可选的实施方式中，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。
第三方面，本发明提供治疗性融合核酸分子，所述治疗性融合核酸分子包括前述实施方式任一项所述的核酸分子，所述核酸分子包括核酸分子片段(A)和核酸分子片段(B)。
在可选的实施方式中，核酸分子片段(A)和核酸分子片段(B)通过linker连接。
在可选的实施方式中，融合核酸分子中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。
第四方面，本发明提供第二治疗性核酸分子组合物，所述第二治疗性核酸分子组合物包括前述实施方式所述第一治疗性核酸分子组合物和前述实施方式所述治疗性融合核酸分子的组合。
在可选的实施方式中，所述第二治疗性核酸分子组合物中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。第五方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的核酸分子或核酸分子混合物、前述实施方式所述的第一治疗性核酸分子组合物、前述实施方式所述的治疗性融合核酸分子或前述实施方式所述的第二治疗性核酸分子组合物在制备抗实体瘤药物或者实体瘤药物药效评价中的应用。
在可选的实施方式中，所述核酸分子或核酸分子混合物中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。
在可选的实施方式中，所述实体瘤包括上皮肿瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、前列腺瘤、卵巢瘤、肾细胞瘤、胃肠道瘤、肝瘤、结肠直肠瘤、血管瘤、间皮瘤、胰脏瘤、乳房瘤、肉瘤、肺瘤、结肠瘤、脑瘤、黑色素瘤、小细胞肺瘤、神经母细胞瘤、睾丸瘤、癌瘤、腺癌瘤、神经胶质瘤、精细胞癌瘤、视网膜母细胞瘤或骨肉瘤。
第六方面，本发明提供治疗实体瘤的核酸分子药物，所述核酸分子药物包括核酸分子组分和包裹核酸分子组分的载体；
所述核酸分子组分选自前述实施方式任一项所述的治疗性核酸分子或核酸分子混合物、前述实施方式所述的第一治疗性核酸分子组合物、前述实施方式所述的治疗性融合核酸分子或前述实施方式所述的第二治疗性核酸分子组合物。
在可选的实施方式中，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。
在可选的实施方式中，融合核酸分子中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；优选地，融合核酸分子中每种核酸分子片段的质量比为10:1、7:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:7、1:10。
在可选的实施方式中，所述载体包括脂质体纳米颗粒。
在可选的实施方式中，所述核酸分子组分中的每一种游离的核酸分子片段或融合核酸分子均被脂质体纳米颗粒独立包裹。
在可选的实施方式中，至少两种游离的核酸分子片段或融合核酸分子均被脂质体纳米颗粒独立包裹。
在可选的实施方式中，至少两种游离的核酸分子片段被脂质体纳米颗粒共同包裹。
在可选的实施方式中，至少一种游离的核酸分子片段和融合核酸分子被脂质体纳米颗粒共同包裹。
在可选的实施方式中，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括20％～50％的阳离子脂质，例如可以为但不限于为20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％；20％～50％的DOPG，例如可以为但不限于为20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％；5％～20％的胆固醇，例如可以为但不限于为5％、10％、15％或20％；和1％～5％的PEG-DMG，例如可以为但不限于为1％、2％、3％、4％或5％。
在可选的实施方式中，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括50％的Dlin-MC3-DMA、10％的DOPG、38.5％的胆固醇和1.5％的PEG-DMG。
在可选的实施方式中，还包括治疗性蛋白或治疗性化学药用组分。
在可选的实施方式中，所述治疗性蛋白包括阿替利珠单抗。
第七方面，本发明提供前述实施方式任一项所述核酸分子药物的制备方法，将游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子溶解于缓冲液中得到水相，量取脂质体纳米颗粒各脂质组分溶于有机溶剂得到有机相，混合水相和有机相后去除有机相得到核酸分子药物。
在可选的实施方式中，每种游离的核酸分子片段和融合核酸分子质量比为1:1。
在可选的实施方式中，所述水相和有机相的体积比为1：2～4，优选为1:3。
在可选的实施方式中，所述缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液或醋酸钠，优选为柠檬酸盐缓冲液。
在可选的实施方式中，所述缓冲液的pH为3～7，优选为4。
在可选的实施方式中，水相中游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL，优选为0.1mg/mL。
在可选的实施方式中，所述有机溶剂选自C1～C4低碳醇，优选为无水乙醇。
在可选的实施方式中，所述有机相中脂质组分的浓度为5mg/mL～7mg/mL，优选为6mg/mL。
在可选的实施方式中，使用微流控混合水相和有机相，采用切向流过滤有机溶剂；
在可选的实施方式中，所述微流控的流速为>3ml/min，进一步优选为12mL/min。
在可选的实施方式中，混合后还包括浓缩步骤，所述浓缩步骤使游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子的终浓度为50μg/mL～200μg/mL，优选为100μg/mL。
第八方面，本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包括前述实施方式任一项所述的核酸分子药物，或采用前述实施方式任一项所述制备方法制备得到的核酸分子药物。
在可选的实施方式中，所述药物组合物还包括蛋白类药物，所述蛋白类药物选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗DC20抗体、抗Her2抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗VEGFR抗体、抗EGFR抗体、抗RANKL抗体、抗CD30抗体、抗VEGFR2抗体、抗GD2抗体、抗CD38抗体、抗CD22抗体和抗CD33抗体中的至少一种；
在可选的实施方式中，所述药物组合物还包括阿替利珠单抗、纳武单抗、帕母单抗、pidilizumab、阿唑单抗、durvalumab、阿曲单抗和伊匹木单抗中的至少一种。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
为了证明本发明提供的治疗性核酸分子或核酸分子混合物对于实体瘤具有治疗作用，本发明构建了实体瘤治疗作用的评价方法，具体步骤如下：
1、小鼠CT26肿瘤模型的构建
实验动物的选择(1)品系：BALB/c，(2)级别：SPF级，(3)周龄：7.6～8.7周，(4)性别：雌。
肿瘤接种：复苏并传代培养CT26.WT细胞，复苏代次为N+8。收集对数生长期的CT26.WT细胞(接种代次为N+11)，去除培养液并用PBS洗两次后接种，接种量：1×106cells/100μL/只，接种位置如图1所示的1号位。
2、小鼠MDA-MB-231肿瘤模型的构建
实验动物的选择(1)种属：小鼠；(2)品系：huHSC-NCG-hIL15(T038070)；(3)级别：SPF级；(4)周龄：16.7周(接种时周龄)；(5)性别：雌。
人源化小鼠鉴定：huHSC-NCG-hIL15免疫重建后8.7周，小鼠外周血流式细胞学分析如下指标：hCD45+、hCD3+、CD4、CD8、NK(hCD56+、hCD16+)。hCD45+细胞占活细胞平均比例为24.82％，hCD56+/hCD45+平均比例为10.8％，判断人源化模型构建成功；进行细胞扩增。
肿瘤接种：复苏并传代培养MDA-MB-231细胞，复苏代次为N+23。免疫重建后12.5周收集对数生长期的MDA-MB-231细胞(接种代次为N+33)，去除培养液并用PBS洗两次后接种，接种量：5×106cells/100μL/只(基质胶1:1)，接种位置如图1所示3号位。
3、动物安乐
在实验过程中，观测肿瘤大小、称量小鼠体重及临床病理评定。并根据临床观察进行临床分数(体重、小鼠姿态、活动性、毛发、皮肤等方面)评定。若实验小鼠产生如下的指标，将进行动物安乐处理：(1)当单只小鼠肿瘤体积超3000mm3，按单只小鼠进行安乐；(2)持续稀便；(3)活动迟缓(不能进食或饮水)；(4)弓背，侧卧；(5)活动减少，出现肌肉萎缩症状；(6)呼吸困难；(7)进程性体温降低；(8)瘫痪，痉挛；(9)持续流血；(10)由于肿瘤太大或其他原因导致动物不能够正常行动；(11)由于严重的腹水或腹围增大导致动物不能够正常行动。
4、指标计算公式
瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm3)＝0.5×肿瘤长径×肿瘤短径2。
TGITV(相对肿瘤抑制率)计算公式：
Vnt：编号为n的小鼠在第t天的肿瘤体积；
Vπ0：编号为n的小鼠在第0天的肿瘤体积；
RTVR：编号为n的小鼠在第t天的肿瘤相对体积；
mean RTVtreat：给药组RTV平均值；
mean RTVvehicle：Vehicle组RTV平均值；
TGITW(肿瘤重量变化)计算公式：
mean TWtreat:给药组小鼠终点处理时肿瘤重量的平均值；
mean TWvehicle:Vehicle组小鼠终点处理时肿瘤重量的平均值。
5、统计分析
实验结果以平均值±标准误差(Mean±SEM)表示。两组样本之间比较采用独立样本T检验(T-Test)，数据使用SPSS进行分析，P<0.05为具有显著性差异，作图软件为Graphpad prism。
本发明提供了一种含有mRNA脂质纳米颗粒的制备方法，在未特殊说明情况下，以下实施例中注射给药使用的mRNA均采用单独包裹阳离子脂质得到的脂质纳米颗粒的给药方式。
单独包裹阳离子脂质得到的脂质纳米颗粒的制备方法参考实施例4，共同包裹阳离子脂质得到的脂质纳米颗粒的制备方法参考实施例8或9，融合RNA分子参考实施例3，融合RNA分子包裹阳离子脂质得到的脂质纳米颗粒的制备方法参考实施例7。本领域技术人员可以根据核酸分子的种类和数量参考上述制备方法制备脂质纳米颗粒。
需要说明的是，下述实施例中使用的含有一个开放阅读框的mRNA的结构为由5’端至3’端依次包括5’帽子、5’UTR、ORF、3’UTR和3’poly(A)尾端。5’帽子为：5’UTR的序列如SEQID NO.38所示，ORF例如选自前述SEQ ID NO.19～29，和SEQ ID NO.39～41中的任意一种，3’UTR序列如SEQ ID NO.10所示，3’poly(A)尾长度为：100A。mRNA序列中的尿苷由全部置换为N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。原位注射给药在本文中为肿瘤内注射给药(肿瘤内注射给药的意思是在肿瘤内部注射给药，也就是接触肿瘤之任何位置处注入治疗剂。)
需要说明的是，在以小鼠CT26肿瘤模型作为实验对象的实施例中，核酸分子中开放阅读框部分的核苷酸序列来源于小鼠，其余实施例中核酸分子中开放阅读框部分的核苷酸序列来源于人。
实施例1
本实施例考察了编码同一多肽片段的不同mRNA序列体外表达能力。
本实施例通过体外转录方法制备了3条IL-12mRNA(序列分别为SEQ ID NO.19、SEQID NO.20和SEQ ID NO.21)分别转染HEK293细胞。首先采用4×105个细胞/ml的密度进行HEK293细胞的铺板，24小时后细胞融合状态大约为80％时进行细胞转染。转染时加入6孔板的1个孔的HEK293细胞中的转染体系中包括2μg mRNA和转染试剂LipofectamineMessagerMAX(ThermoFisher Scientific)，具体转染操作按照转染试剂产品说明书进行。
24小时之后分别收集细胞上清和细胞裂解液，再通过ELISA的方法分别检测mRNA表达的蛋白的高低。
本发明中列举的IL-12mRNA的3段序列，从常用密码子频次、GC含量、基因的mRNA二级结构(如mRNA自由能)、cis-acting mRNA不稳定序列、RNase剪切位点和重复单元等指标方面没有显著的差异，但是从转录的结果可以看出，SEQ ID NO.19的IL-12mRNA序列转染细胞中的IL-12表达量高于SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21的IL-12mRNA序列。
编码IL-12多肽的mRNA序列 相对表达量
SEQ ID NO.19 1.5
SEQ ID NO.20 1
SEQ ID NO.21 0.9
实施例2P53相关
1、序列
在人的基因里面，P53是非常重要的抑癌基因，在正常细胞中低表达，在恶性肿瘤中高表达。P53基因翻译的P53蛋白是细胞生长、增殖和损伤修复的重要调节因子。细胞的DNA受损时，P53蛋白阻止细胞停止于G1/S期，把损伤修复，如不能修复则促进细胞凋亡。
P53多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示。
编码P53多肽的mRNA序列包括但不限于如SEQ ID NO.39所示的核苷酸序列。
2、编辑P53多肽的mRNA在人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人乳腺癌细胞JIMT-1、人舌鳞癌细胞Cal-27及人肝癌细胞Huh-7中的杀伤评价
使用CTG(CELL TITER-GLO，荧光细胞活性)方法检测供试品对MDA-MB-231、JIMT-1、Cal-27及Huh-7细胞的杀伤评价。
实验步骤：
1)细胞转染：提前一周进行细胞复苏，记录复苏代次及转染代次，提前一天铺板，使细胞过夜培养后汇合度达到70～90％，按预实验筛选后的条件转染细胞。
先把脂质体lipo2000加入到5μL无血清的培养基opti-MEM里，混匀静置五分钟；再把mRNA也加入到5μL无血清的培养基opti-MEM中，混匀静置五分钟。然后将mRNA和脂质体工作液充分混合并静置5分钟形成mRNA脂质体复合物，将10μL脂质体复合物加入到细胞内，摇匀放入细胞培养箱培养。
2)转染效率检测：48小时后收集细胞进行qPCR检测，计算转染效率；
3)杀伤检测：剩余6复孔细胞进行CTG杀伤实验，用CTG检测试剂盒检测，在酶标仪上读板，读值达到0.4～1.0均可用以分析。
4)数据分析：杀伤作用裂解的细胞百分比采用以下公式进行计算：
Cell lysis％＝100×(OD样品孔-OD空白孔)/(OD对照孔–OD空白孔)
5)实验结果
对各细胞株的凋亡率为30％左右，高于野生株的凋亡率。
3、序列优化
将通过序列优化手段优化mRNA序列，改善与体内施用后的表达功效相关的特性：例如提高mRNA稳定性、增加靶组织中的翻译功效、减少表达的截短蛋白的数量、改善表达的蛋白质的折叠或防止其错误折叠、降低表达产物的毒性、减少由表达产物引起的细胞死亡、增加和/或减少蛋白质聚集。序列优化的目的还包括：保持结构和功能完整性的同时优化基于核酸的治疗剂的配制和递送的特征；克服表达的阈值；提高表达率；半衰期和/或蛋白质浓度；优化蛋白质定位；以及避免不利的生物响应如免疫响应和/或降解途径。
序列优化手段包括：(1)根据特定器官和/或宿主生物体中的密码子频率进行密码子优化以确保恰当折叠和适当表达；(2)调节G/C含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；(3)使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基串(base runs)最小化；(4)定制转录和翻译控制区；(5)减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。
实施例3融合RNA分子的结构
融合RNA分子包括编码IL-12和P53的部分，除此之外还包括但不限于非翻译区(UTR，如5’UTR或3’UTR)、5’帽区、聚A尾区、起始区、终止区、信号序列区、linker序列以及其组合。
其中linker序列编码的蛋白质切割信号，包含至少一个蛋白质切割位点。编码的蛋白切割信号可以包括但不限于蛋白前体转化酶(或激素前体转化酶)，凝血酶和/或因子Xa蛋白切割信号，例如使用Furin切割位点(furin cleavage site，FCS)(参考US7374930B2)。选择FCS的一个好处是Furin广泛分布在大多数细胞类型中，本发明的融合RNA可以在体内几乎任何类型的细胞中有效表达活性多肽。
Furin切割位点的DNA序列为CGTCAACGTCGT(SEQ ID NO.30)；在融合RNA中Furin切割位点的RNA序列为CGUCAACGUCGU(SEQ ID NO.31)。
以包括编码IL-12和P53多肽的部分的融合RNA的结构为例说明：5帽子’——5’UTR——起始区——编码IL-12的RNA——linker——编码P53的RNA——3’UTR——终止区——3’polyA尾。
Linker可以是例如可切割接头或蛋白酶敏感接头。Linker选可切割接头F2A接头(具有氨基酸序列GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP，SEQ ID NO.32)、P2A接头(具有氨基酸序列GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP，SEQ ID NO.33)、T2A接头(具有氨基酸序列GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP，SEQ ID NO.34)、E2A接头(例如，具有氨基酸序列GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP，SEQ ID NO.35)及其组合组成的组。
自切割肽可以是但不限于2A肽。本领域中已知的2A肽包括例如口蹄疫病毒(FMDV)2A肽、马鼻炎A病毒2A肽、明脉扁刺蛾病毒2A肽和猪捷申病毒-1 2A肽。若干病毒使用2A肽通过核糖体跳跃由一种转录物产生两种蛋白质，使得正常肽键在2A肽序列处削弱，导致由一个翻译事件产生两种不连续的蛋白质。编码2A肽的多核苷酸序列包括但不限于SEQ IDNO.36或SEQ ID NO.37序列(可通过本文所述和/或本领域中已知的方法对2A肽的多核苷酸序列进行修饰或密码子优化)。
下述实施例中治疗性融合核酸分子的结构为：5帽子’——5’UTR——起始区——编码IL-12的RNA——linker——编码P53的RNA——3’UTR——终止区——3’polyA尾；其中5’帽区为m7Gppp(5’)(2’-OMeA)pG(7-甲基鸟苷三磷酸-2-甲氧基单磷酸鸟苷帽类似物；CAP1-GAG)；5’UTR序列为SEQ ID No.14所示；起始区序列为启动子序列，具体为AUG；编码IL-12的RNA如SEQ ID No.19所示；linker的RNA如SEQ ID No.31所示；编码P53的RNA如SEQID No.39所示；3’UTR序列如SEQ ID No.10所示；终止区序列为终止子序列，具体为UAA；聚A尾区也称为poly(A)，长度为100A。
其中在融合RNA分子中，核酸片段(B)(即编码IL-12的RNA)可以在靠近5’端，如上所示；也可以靠近3’端，具体结构为5帽子’——5’UTR——起始区——编码P53的RNA——linker——编码IL-12的RNA——3’UTR——终止区——3’polyA尾。
实施例4
本实施例提供了分别包裹编码两种多肽的mRNA的脂质纳米颗粒的制备方法，所述两种多肽为IL-12p35和p40亚基、P53多肽。所述脂质纳米颗粒的脂质组分按照摩尔百分比计包括Dlin-MC3-DMA 50％、DOPG 10％、胆固醇38.5％和PEG-DMG 1.5％。
具体制备方法如下：
(1)编码IL-12多肽的RNA的脂质纳米颗粒
(a)将编码IL-12p35和p40亚基多肽的mRNA溶解于pH4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml，得到水相。
(b)按照配方量将Dlin-MC3-DMA、DOPG、胆固醇和PEG-DMG按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6mg/mL，得到有机相。
(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12mL/min的流速混合，混合液立刻用pH7.4的PBS溶液稀释100倍，并使用切向流过滤(TFF)除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的mRNA的浓度为100μg/ml，得到包含编码IL-12多肽的RNA的脂质纳米颗粒。
(2)按照本实施例步骤(1)制备编码P53多肽的RNA的脂质纳米颗粒；
(3)将编码两种多肽的RNA脂质纳米颗粒按照质量比1:1混合，得到包含编码IL-12多肽的RNA和编码P53多肽的RNA的脂质纳米颗粒。
实施例5
本实施例提供了药物组合物，包括如下的组分：
序号 核酸分子片段(B) 核酸分子片段(A) 蛋白类药物
113 编码白细胞介素IL-12的p35和p40亚基 编码的P53多肽 抗PD-1抗体
114 编码白细胞介素IL-12的p35和p40亚基 编码的P53多肽 抗PD-L1抗体
115 编码白细胞介素IL-12的p35和p40亚基 编码的P53多肽 抗CTLA-4抗体
本药物组合物中的治疗性核酸分子或核酸分子混合物按照实施例4、8或9的方法制备为脂质纳米颗粒；治疗性核酸分子或核酸分子混合物也可以按照3的方法制备为mRNA形式，再按照实施例7的方法制备为脂质纳米颗粒。
本药物组合物中的治疗性核酸分子或核酸分子混合物按照实施例4的方法制备为脂质纳米颗粒。
本方案中的蛋白药物为能与治疗性核酸分子或核酸分子混合物协同治疗实体瘤的药物，包括但不限于抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、靶向DC20的抗体、靶向Her2的抗体、靶向CD33的抗体、靶向CD52的抗体、靶向VEGFR的抗体、靶向EGFR的抗体、靶向RANKL的抗体、靶向CD30的抗体、靶向VEGFR2的抗体、靶向GD2的抗体、靶向CD38的抗体、靶向CD22的抗体、靶向CD33的抗体等。
抗PD-1的抗体，包括纳武单抗、帕母单抗(pembrolizumab)或pidilizumab等；抗PD-L1的抗体，其包括阿唑单抗、durvalumab或阿曲单抗等；抗CTLA-4抗体包括伊匹木单抗等。
本药物组合物中的蛋白药物按照蛋白特性制备为稳定的制剂，包括但不限于注射剂。
本药物组合物包括将单剂量的治疗性核酸分子或核酸分子混合物与蛋白药物组合施用，该蛋白药物也可以按照其常规(例如，批准的)方案在单次施用或多次施用中给予。在其它实施方案中，本药物组合物包括不超过两次施用治疗性核酸分子或核酸分子混合物、不超过三次施用治疗性核酸分子或核酸分子混合物、不超过四次施用治疗性核酸分子或核酸分子混合物或不超过五次施用治疗性核酸分子或核酸分子混合物，任选地与蛋白药物组合。
实施例6
本实施例对编码不同多肽的mRNA组合对于肿瘤抑制率的影响进行考察。其中G1组、G3组、G5组、G6组和G8组的mRNA混合物按照实施例4制备的方法制备。
以上述小鼠MDA-MB-231肿瘤模型为实验模型进行6组实验，每组小鼠数量为6只，
组1.1(G1)给药为萤光素酶mRNA的混合物，给药剂量为0.48mpk；
组1.2(G2)为Tecentriq(阿替利珠单抗(Roche，货号H0250801))，给药剂量为10mpk；
组1.3(G3)为编码hIL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)的混合物，给药剂量为0.08mpk每只；
组1.4(G5)为编码P53的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示)的混合物，给药剂量为0.40mpk每只；
组1.5(G6)为编码hIL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)和编码P53的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示)组成的混合物，给药剂量为IL-120.08mpk每只+P53 0.40mpk每只；
组1.6(G8)为编码hIL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)和编码萤光素酶的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示)组成的混合物，给药剂量为IL-12 0.08mpk每只+码萤光素酶0.48mpk每只。
mRNA混合物的给药频次为每周一次，给药周期为3周，6组小鼠给药方式均为原位注射给药。分组后33天设置为实验终点，测试六组实验对肿瘤的影响。
经上述计算方法验证，在实验终点，Tecentriq(G2组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为43.88％；hIL-12混合物(G3组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为40.35％；P53混合物(G5组k)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为5.78％；p53+hIL-12(G6组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为83.78％；FLuc+hIL-12(G8组)的相对肿瘤抑制率(TGITV)为29.22％。各实验组的相对肿瘤抑制率(TGITV)曲线如图2所示；各实验组的肿瘤生长曲线如图3所示。
实施例7
本实施例提供一种疗性融合核酸分子的LNP制剂的制备方法，所述融合核酸分子mRNA编码IL-12p35和p40亚基、P53多肽，融合核酸分子mRNA结构如实施例3所述。所述脂质纳米颗粒的脂质组分按照摩尔百分比计包括Dlin-MC3-DMA50％、DOPG 10％、胆固醇38.5％和PEG-DMG 1.5％。
具体制备方法如下：
(a)将治疗性融合核酸分子mRNA溶解于pH4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml，得到水相。
(b)按照配方量将Dlin-MC3-DMA、DOPG、胆固醇和PEG-DMG按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6mg/mL，得到有机相。
(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12mL/min的流速混合，混合液立刻用pH7.4的PBS溶液稀释100倍，并使用切向流过滤(TFF)除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的mRNA的浓度为100μg/ml，得到包含治疗性融合核酸分子mRNA的脂质纳米颗粒。
实施例8
本实施例提供了同时包裹编码两种多肽的DNA的脂质纳米颗粒的制备方法，所述两种多肽为IL-12p35和p40亚基和P53多肽，编码两种多肽的DNA分别被整合在2种不同的质粒中。所述脂质纳米颗粒的脂质组分按照摩尔百分比计包括Dlin-MC3-DMA 50％、DOPG10％、胆固醇38.5％和PEG-DMG 1.5％。
具体制备方法如下：
(a)将编码IL-12p35和p40亚基多肽的DNA质粒、编码P53多肽的DNA质粒按照质量比1:1溶解于pH4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml，得到水相。
(b)按照配方量将Dlin-MC3-DMA、DOPG、胆固醇和PEG-DMG按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6mg/mL，得到有机相。
(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12mL/min的流速混合，混合液立刻用pH7.4的PBS溶液稀释100倍，并使用切向流过滤(TFF)除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的DNA的浓度为100μg/ml，得到包含编码IL-12多肽的DNA质粒、编码P53多肽的DNA质粒的脂质纳米颗粒。
实施例9
本实施例提供了同时包裹编码两种多肽的mRNA的脂质纳米颗粒的制备方法，所述两种多肽为IL-12p35和p40亚基和P53多肽。所述脂质纳米颗粒的脂质组分按照摩尔百分比计包括Dlin-MC3-DMA 50％、DOPG 10％、胆固醇38.5％和PEG-DMG 1.5％。
具体制备方法如下：
(a)将编码IL-12p35和p40亚基多肽的mRNA和编码P53多肽的mRNA按照质量比1:1溶解于pH4的柠檬酸盐缓冲液，将浓度调整为0.1mg/ml，得到水相。
(b)按照配方量将Dlin-MC3-DMA、DOPG、胆固醇和PEG-DMG按照配方量溶解于无水乙醇，将有机相中的脂质成分的浓度调整至6mg/mL，得到有机相。
(c)将步骤(a)的水相和步骤(b)的有机相按照1:3的体积比，使用微流控设备，按照12mL/min的流速混合，混合液立刻用pH7.4的PBS溶液稀释100倍，并使用切向流过滤(TFF)除去溶液中乙醇成分，然后浓缩至体系中的mRNA的浓度为100μg/ml，得到包含编码IL-12多肽的RNA和编码P53多肽的RNA的脂质纳米颗粒。
实施例10
本实施例对不同工艺制备的编码多肽的mRNA组合的混合物对于肿瘤抑制率的影响进行考察。其中T1组的mRNA混合物按照实施例7制备的方法制备；T2组的mRNA混合物按照实施例9制备的方法制备；T3组的mRNA混合物按照实施例4制备的方法制备。
以上述小鼠MDA-MB-231肿瘤模型为实验模型进行4组实验，每组小鼠数量为6只，
组2.1(T1)为编码hIL-12和P53融合蛋白的mRNA的混合物，其中该mRNA翻译出的P53多肽的量为hIL-12多肽翻译量的5倍，给药剂量为0.08mpk；
组2.2(T2)为编码hIL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)和编码P53的mRNA的混合物，给药剂量为hIL-12mRNA0.08mpk每只，P53 mRNA0.40mpk每只；
组2.3(T3)为编码hIL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)和编码P53的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示)组成的混合物，给药剂量为IL-120.08mpk每只+P53 0.40mpk每只；
组2.4(T4)给药为萤光素酶mRNA的混合物，给药剂量为0.48mpk。
mRNA混合物的给药频次为每周一次，给药周期为3周，6组小鼠给药方式均为原位注射给药。分组后33天设置为实验终点，测试六组实验对肿瘤的影响。
经上述计算方法验证，在实验终点，T1组的相对肿瘤抑制率(TGITV)为68.35％；T2组的相对肿瘤抑制率(TGITV)为72.35％；T3组的相对肿瘤抑制率(TGITV)为83.78％。
实施例11
编码P53多肽的mRNA，经过序列优选得到多条mRNA开放阅读框序列，分别如SEQ IDNO.40、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQ IDNO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.39所示，测试优化后的11组开放阅读框序列不同的mRNA对表达效率的影响，分别记为样品O1-样品O11。
将样品O1-样品O11所示的mRNA转染细胞，检测P53多肽在细胞中的表达，结果如下表所示。
详细方法如下：转染各mRNA24小时后的HEK293细胞进行裂解，按10μg的总蛋白在SDS-PAGE胶上样，用抗P53蛋白抗体(购自武汉菲恩生物科技有限公司)进行免疫印迹，使用羊抗鼠-HRP二抗进行标记，然后显色。蛋白表达量使用内参b-actin进行标化定量，比较不同mRNA转染细胞后表达的蛋白量差异。未转染mRNA的细胞作为阴性对照。P53多肽可以检测到表达。
样品编号 相对表达量 样品编号 相对表达量
O1 1 O7 0.9
O2 0.9 O8 1
O3 1.1 O9 0.9
O4 0.9 O10 1.1
O5 1 O11 1.5
O6 1
本发明中列举的P53 mRNA的11段序列，从常用密码子频次、GC含量、基因的mRNA二级结构(如mRNA自由能)、cis-acting mRNA不稳定序列、RNase剪切位点和重复单元等指标方面没有显著的差异；从转录的结果，其转录量存在差异。
实施例12
本实施例对编码不同多肽的mRNA组合对于肿瘤抑制率的影响进行考察。其中P2组、P3组、P4组和P5组的mRNA混合物按照实施例4制备的方法制备。
以上述小鼠MDA-MB-231肿瘤模型为实验模型进行5组实验，每组小鼠数量为6只。
P1组给药为萤光素酶mRNA的混合物，给药剂量为0.48mpk。
P2组为编码hIL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)和编码P53的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.1-9所示)组成的混合物，给药剂量为IL-120.08mpk每只+P53 0.40mpk每只。
P3组为编码hIL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)和编码P53的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.1-9所示)组成的混合物，给药剂量为IL-120.08mpk每只+P53 0.44mpk每只。
P4组为编码hIL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)和编码P53的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.1-9所示)组成的混合物，给药剂量为IL-120.08mpk每只+P53 0.50mpk每只。
P5组为编码hIL-12p35和p40亚基的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示)和编码P53的mRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示)组成的混合物，给药剂量为IL-12 0.08mpk每只+P53 0.40mpk每只。
mRNA混合物的给药频次为每周一次，给药周期为3周，5组小鼠给药方式均为原位注射给药。分组后33天设置为实验终点，测试五组实验对肿瘤的影响。
经上述计算方法验证，在实验终点，P2组的相对肿瘤抑制率(TGITV)为77.39％；P3组的相对肿瘤抑制率(TGITV)为81.45％；P4组的相对肿瘤抑制率(TGITV)为87.57％；P5组的相对肿瘤抑制率(TGITV)为83.78％。
本发明对IL-12+P53中P53 mRNA的ORF采用P53 mRNA的11段序列中任意一种，在根据各段序列的P53 mRNA表达量进行给药剂量调整时，不影响肿瘤消退、相对肿瘤抑制率(TGITV)等效果；对IL-12+P53中IL-12mRNA的ORF采用IL-12mRNA的3段序列(如SEQ IDNO.19-21所示)中任意一种，在根据各段序列的IL-12表达量进行给药剂量调整时，不影响肿瘤消退、相对肿瘤抑制率(TGITV)等效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.治疗性核酸分子或核酸分子混合物，其特征在于，所述核酸分子包括：核酸分子片段(A)，所述核酸分子片段(A)编码P53蛋白，和核酸分子片段(B)；所述核酸分子片段(B)编码白细胞介素IL-12的p35和p40亚基。
2.根据权利要求1所述的核酸分子或核酸分子混合物，其特征在于，所述核酸分子片段(A)编码的P53蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.38所示，或，包含与SEQ ID NO.38至少80％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述核酸分子片段(A)的核苷酸序列选自；SEQ ID NO.22～29和SEQ ID NO.39～41中的至少一种；或，选自与SEQ ID NO.22～29和SEQ ID NO.39～41至少70％同一性的核苷酸序列中的任意一种；
优选地，所述核酸分子片段(B)编码的IL-12的p35亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，或，包含与SEQ ID NO.11至少80％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述核酸分子片段(B)编码的IL-12的p40亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，或，包含与SEQ ID NO.12至少80％同一性的氨基酸序列；
优选地，IL-12的p35和p40亚基通过氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示的linker连接；
优选地，所述酸分子片段(B)的核苷酸序列选自；SEQ ID NO.16～21中的至少一种，或，选自与SEQ ID NO.16～21至少70％同一性的核苷酸序列中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的核酸分子或核酸分子混合物，其特征在于，所述核酸分子包括DNA分子和/或RNA分子；
优选地，所述DNA分子包括链状DNA分子和/或环状DNA分子；
优选地，所述RNA分子包括mRNA或环形RNA；
优选地，所述核酸分子片段的5’端和/或3’端具有修饰基团；
优选地，所述核酸分子片段为mRNA片段，所述mRNA片段的5’端修饰基团选自ARCA、m7G(5”)ppp(5”)(2”OMeA)pG、m7G(5”)ppp(5”)(2”OMeG)pG、m7(3”OMeG)(5”)ppp(5”)(2”OMeG)pG、m7(3”OMeG)(5”)ppp(5”)(2”OMeA)pG、mCAP、dmCAP、tmCAP或dmCAP；
优选地，所述mRNA片段的3’端保护性修饰基团为poly(A)，所述poly(A)长度为50～200，优选为80～200；
优选地，所述mRNA片段还含有5’UTR；
优选地，所述5’UTR的长度优选为10～200个核苷酸，优选为15～100个核苷酸；
优选地，所述5’UTR包括KOZAK序列或DNAH2 5’UTR；
优选地，KOZAK序列的核苷酸序列如SEQ ID.NO.15所示；
优选地，DNAH2 5’UTR的核苷酸序列如SEQ ID.NO.14所示；
优选地，所述mRNA片段还含有3’UTR；
优选地，3’UTR序列如SEQ ID.NO.1～10所示；
优选地，mRNA由5’端至3’端依次包括5’帽子、5’UTR、ORF、3’UTR和3’poly(A)尾端。
4.第一治疗性核酸分子组合物，其特征在于，所述第一治疗性核酸分子组合物包括，权利要求1～3任一项所述的核酸分子混合物；
优选地，所述第一治疗性核酸分子组合物中每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1～1:10。
5.治疗性融合核酸分子，其特征在于，所述治疗性融合核酸分子包括权利要求1～3任一项所述的核酸分子，所述核酸分子包括核酸分子片段(A)和核酸分子片段(B)；
优选地，所述核酸分子片段(A)和核酸分子片段(B)通过linker连接；
优选地，所述治疗性融合核酸分子中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10。
6.第二治疗性核酸分子组合物，其特征在于，所述第二治疗性核酸分子组合物包括权利要求4所述第一治疗性核酸分子组合物和权利要求5所述治疗性融合核酸分子的组合；
优选地，所述第二治疗性核酸分子组合物中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10。
7.权利要求1～3任一项所述的核酸分子或核酸分子混合物、权利要求4所述的第一治疗性核酸分子组合物、权利要求5所述的治疗性融合核酸分子或权利要求6所述的第二治疗性核酸分子组合物在制备抗实体瘤药物或者实体瘤药物药效评价中的应用；
优选地，所述实体瘤包括上皮肿瘤、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、前列腺瘤、卵巢瘤、肾细胞瘤、胃肠道瘤、肝瘤、结肠直肠瘤、血管瘤、间皮瘤、胰脏瘤、乳房瘤、肉瘤、肺瘤、结肠瘤、脑瘤、黑色素瘤、小细胞肺瘤、神经母细胞瘤、睾丸瘤、癌瘤、腺癌瘤、神经胶质瘤、精细胞癌瘤、视网膜母细胞瘤或骨肉瘤。
8.治疗实体瘤的核酸分子药物，其特征在于，所述核酸分子药物包括核酸分子组分和包裹核酸分子组分的载体；
所述核酸分子组分选自权利要求1～3任一项所述的治疗性核酸分子或核酸分子混合物、权利要求4所述的第一治疗性核酸分子组合物、权利要求5所述的治疗性融合核酸分子或权利要求6所述的第二治疗性核酸分子组合物；
优选地，每种游离的核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；
优选地，融合核酸分子中每种核酸分子片段的质量比为10:1～1:10；
优选地，所述载体包括脂质体纳米颗粒；
优选地，所述核酸分子组分中的每一种游离的核酸分子片段或融合核酸分子均被脂质体纳米颗粒独立包裹；
优选地，至少两种游离的核酸分子片段或融合核酸分子均被脂质体纳米颗粒独立包裹；
优选地，至少两种游离的核酸分子片段被脂质体纳米颗粒共同包裹；
优选地，至少一种游离的核酸分子片段和融合核酸分子被脂质体纳米颗粒共同包裹；
优选地，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括20％～50％的阳离子脂质、20％～50％的DOPG、5％～20％的胆固醇和1％～5％的PEG-DMG；
优选地，所述脂质体纳米颗粒按照摩尔百分比计包括50％的Dlin-MC3-DMA、10％的DOPG、38.5％的胆固醇和1.5％的PEG-DMG；
优选地，还包括治疗性蛋白或治疗性化学药用组分；
优选地，所述治疗性蛋白包括阿替利珠单抗。
9.权利要求8所述核酸分子药物的制备方法，其特征在于，将游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子溶解于缓冲液中得到水相，量取包裹载体的各组分溶于有机溶剂得到有机相，混合水相和有机相后去除有机相得到核酸分子药物；
优选地，所述水相和有机相的体积比为1：2～4，进一步优选为1:3；
优选地，所述缓冲液包括柠檬酸盐缓冲液或醋酸钠，进一步优选为柠檬酸盐缓冲液；
优选地，所述缓冲液的pH为3～7，进一步优选为4；
优选地，水相中游离的核酸分子片段或融合核酸分子的浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL，进一步优选为0.1mg/mL；
优选地，所述有机溶剂选自C1～C4低碳醇，进一步优选为无水乙醇；
优选地，所述有机相中脂质组分的浓度为5mg/mL～7mg/mL，进一步优选为6mg/mL；
优选地，使用微流控混合水相和有机相，采用切向流过滤有机溶剂；
优选地，所述微流控的流速为>3ml/min，进一步优选为12mL/min；
优选地，混合后还包括浓缩步骤，所述浓缩步骤使游离的核酸分子片段和/或融合核酸分子的终浓度为50μg/mL～200μg/mL，进一步优选为100μg/mL。
10.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求8所述核酸分子药物或者采用权利要求9所述制备方法制备得到的核酸分子药物；
优选地，所述药物组合物还包括蛋白类药物，所述蛋白类药物选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗DC20抗体、抗Her2抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗VEGFR抗体、抗EGFR抗体、抗RANKL抗体、抗CD30抗体、抗VEGFR2抗体、抗GD2抗体、抗CD38抗体、抗CD22抗体和抗CD33抗体中的至少一种；
优选地，所述药物组合物还包括阿替利珠单抗、纳武单抗、帕母单抗、pidilizumab、阿唑单抗、durvalumab、阿曲单抗和伊匹木单抗中的至少一种。
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