CN101291687A - 用于癌症治疗的p53疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗人中的过度增殖性疾病的免疫治疗方法，特别是对治疗抗拒的过度增殖性疾病。更具体而言，在一个实施方案中本发明涉及用于治疗具有过度增殖性疾病的受试者的方法，在所述过度增殖性疾病中自身基因的表达在治疗抗性的过度增殖细胞中是上调的。在另一实施方案中，给治疗抗性过度增殖细胞施用包含自身基因的腺病毒表达构建体，所述自身基因在真核细胞中可操作的启动子的控制下。本发明因此提供了通过减弱针对过度增殖细胞或过量表达例如突变型p53抗原的天然免疫系统的CTL应答用于治疗治疗抗性过度增殖性疾病的免疫疗法。

Description

用于癌症治疗的P53疫苗
本发明要求于2005年5月12日提交的美国临时专利申请序列号60/680,284的优先权，所述美国临时专利申请整体引入本文作为参考。
关于联邦赞助研究或开发的声明
本发明利用来自国立癌症研究所(National Cancer Institute)的准许号CA61242的基金。美国政府可以在本发明中具有某些权利。
发明领域
总的来说本发明涉及至少细胞生物学、免疫学、分子生物学和癌症治疗领域。更特别地，它涉及引发或促进免疫应答的方法，例如针对由过度增殖细胞呈递的自身基因抗原的细胞毒性T淋巴细胞应答，所述过度增殖细胞对至少一种过度增殖性疾病治疗有抗性。
发明背景
正常组织稳态是细胞增殖和细胞死亡的高度调节过程，并且细胞增殖或细胞死亡的失调可以发展成癌性状态(Solyanik等人，1995；Stokke等人，1997；Mumby和Walter，1991；Natoli等人，1998；Magi-Galluzzi等人，1998)。细胞增殖和细胞死亡的维持至少部分由原癌基因调节。原癌基因可以编码诱导细胞增殖的蛋白质(例如sis、erbB、src、ras和myc)，抑制细胞增殖的蛋白质(例如Rb、p53、NF1和WT1)或调节编程性细胞死亡的蛋白质(例如bcl-2)(Ochi等人，1998；Johnson和Hamdy，1998；Liebermann等人，1998)。然而，这些原癌基因的基因重排或突变导致原癌基因转变成潜在的癌症诱导致癌基因。通常单个点突变足以使原癌基因转化成癌基因。例如，p53肿瘤抑制蛋白中的点突变导致野生型p53功能完全丧失并获得“显性”肿瘤促进功能(Vogelstein和Kinzler，1992；Fulchi等人，1998)。
癌症研究中快速展开的领域-免疫疗法是用于治疗某些类型癌症的一种选择。例如，免疫系统将肿瘤细胞鉴定为外源的且因此通过免疫系统靶向破坏。不幸的是，应答一般不足以阻止大多数肿瘤生长。然而，近来免疫疗法领域已集中于开发增加或补充免疫系统的天然防御机制的方法。目前在研究或使用中的免疫疗法的例子是免疫佐剂(例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)，Plasmodium falciparum，二硝基氯苯和芳香族化合物)(美国专利号5,801,005；美国专利号5,739,169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等人，1998)；细胞因子疗法(例如干扰素α、β和γ；IL-1，GM-CSF和TNF)(Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)；基因疗法(例如TNF、IL-1、IL-2、p53)(Qin等人，1998；Austin-Edward和Villaseca，1998；美国专利号5,830,880和美国专利号5,846,945)；以及单克隆抗体(例如抗神经节苷脂GM2、抗HER-2、抗p185)(Pietras等人，1998；Hanibuchi等人，1998；美国专利号5,824,311)。
如上所述，原癌基因在癌症生物学中起重要作用。例如，Rb、p53、NF1和WT1肿瘤抑制物是维持细胞的非肿瘤(tumorogenic)表型所必需的(由Soddu和Sacchi，1998综述)。所有癌症中大约50％已发现与p53基因的突变有关，所述突变导致p53肿瘤抑制物特性丧失(Levine等人，1991；Vogelstein和Kinzler，1992；Hartmann等人，1996a；Hartmann等人，1996b)。p53基因中的突变还导致细胞中的p53半衰期延长和p53蛋白质的过量表达。在正常细胞中，p53由于其高周转率是无法检测的。因此，癌性细胞中的p53过量表达导致可以在免疫疗法中使用的多重免疫原性p53表位。涉及p53基因突变的癌症的高发生率已促使许多研究团体经由基因替代研究p53作为癌症治疗的途径。编码诱导细胞增殖的蛋白质的原癌基因sis、erbB、src、ras和myc以及调节编程性细胞死亡的Bcl-2家族的原癌基因在细胞的非肿瘤表型中也起重要作用。
少数人也已探究p53在免疫疗法中的用途。例如，在体外测定法中，鉴定了能够与HLA-A2.1结合并诱导原发性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的p53突变型肽(Houbiers等人，1993)。在其中在小鼠中筛选合成p53突变型和野生型肽的免疫原性的研究中，观察到只有突变型p53表位能够引发CTL应答(Bertholet等人，1997)。相反，在GM-CSF/IL-4的存在下用骨髓来源的树突细胞(DC)(用H-2Kd结合野生型p53肽(232-240)预脉冲)免疫接种BALB/c小鼠，观察到诱导p53抗肽CTL应答(Ciemik等人，1996；Gabrilovich等人，1996；Yanuck等人，1993；DeLeo，1998；Mayordomo等人，1996)。此外，编码人野生型p53的裸露质粒DNA的皮内和肌内注射以及由重组金丝雀痘载体呈递的人野生型p53的静脉内注射已成功地破坏肿瘤(Hurpin等人，1998)。
使用小鼠模型(Ishida等人，1999；Murakami等人，2004；Espenschied等人，2003；Blaszczyk-Thurin等人，2002；Cicinnati等人，2005)和离体人培养模型(Nikitin等人，2001)的临床前研究已显示抗p53 CTL细胞应答的诱导已选择性杀死肿瘤细胞和多余的正常细胞。此外，抗p53 T细胞已显示存在于癌症患者中(Hoffmann等人，2005；Sirianni等人，2004；van der Burg等人，2003)。
癌症疫苗的另一种关键元素是选择关于TAA的合适载体。这种媒介物应当帮助激活主要免疫应答且在必要时克服对自身蛋白质的耐受性。树突细胞(DC)是最有效的抗原呈递细胞且在癌症免疫疗法中活跃使用(在Gabrilovich，2002中综述)。近年来越来越明确的是：基于DC的免疫疗法的成功依赖于这些细胞的激活状态。腺病毒提供了激活DC的一种示例性有效手段。它诱导DC表面上的MHC II类和共刺激分子的上调，IL-12、Th1和促炎细胞因子的产生(Nikitina等人，2002；Tan等人，2005；Herrera等人，2002)。腺病毒还提供了用于将基因递送到DC内的极佳工具(在Humrich和Jenne，2003中综述；Gamvrellis等人，2004)。
WO 00/54839描述了用野生型自身基因转导的树突细胞用于治疗过度增殖性疾病。
尽管有前文所述，但目前并不存在能够使用野生型自身基因的基于自身基因的免疫治疗方法，以产生对过量表达不同突变型自身蛋白质的各种治疗抗性细胞特异的抗肿瘤免疫应答。这将允许治疗与自身基因表达增加或改变有关的任何癌性或癌前细胞。此外，它将消除鉴定每个患者中的自身基因突变位点的需要，且产生定制的自身基因突变型肽用于免疫疗法。因此，需要能够减弱或增强天然免疫系统CTL应答的免疫疗法，所述CTL应答针对具有突变型自身基因抗原表达增加或改变的过度增殖细胞。
发明概述
显然需要新治疗方法以改善癌症结果，并且疫苗可以代表一种此类方法。尽管近年来进行的某些临床试验证明了鼓舞人心的结果，但大多数试验显示出非常有限的临床应答(Rosenberg等人，2004)。这些试验的结果显露了对成功的癌症免疫疗法的主要挑战。其中最重要的一个是鉴定合适的肿瘤相关抗原(TAA)。理想的TAA不仅将在大部分癌症患者中表达，并且肿瘤细胞的存活将依赖于包含TAA的分子的存在。这将阻止肿瘤细胞通过丢失这些分子逃避免疫识别。肿瘤抑制基因p53具有理想TAA的许多特征且在本发明中仅用作示例性实施方案。
一般而言，本发明涉及与癌症疫苗，特别是用于治疗癌症包括治疗抗性癌症有关的组合物和方法。需要能够增加天然免疫系统CTL应答的免疫疗法，所述CTL应答针对表达改变的自身基因抗原的治疗抗性过度增殖细胞。本发明还提供了引发细胞毒性T淋巴细胞应答的方法，所述应答针对由过度增殖的治疗抗性细胞呈递的p53抗原。在本发明的一个实施方案中，提供了用于治疗具有治疗抗性过度增殖性疾病(hyperproliferative disease)的个体和/或防止个体具有治疗抗性(therapy-resistant)过度增殖性疾病的方法。在具体方面，具有对癌症治疗抗性的至少一种癌症细胞的个体用包含自身基因产物的树突细胞进行治疗，且在另外实施方案中治疗进一步包含另外疗法。另外疗法可以是任何合适种类的癌症治疗，尽管在具体方面另外疗法是化学疗法。在进一步的具体实施方案中，化学疗法上调例如p53和/或死亡受体的表达。
本发明中的过度增殖性疾病的治疗可以包含鉴定具有过度增殖性疾病的个体的步骤，所述过度增殖性疾病的特征在于个体的至少某些过度增殖细胞中的自身基因产物表达改变或增加。然而，在可替代的实施方案中，个体可以先前已鉴定具有过度增殖性疾病，所述过度增殖性疾病的特征在于个体的至少某些过度增殖细胞中的自身基因产物表达改变或增加。鉴定具有过度增殖性疾病的受试者后，给受试者施用包含在真核树突细胞中可操作的启动子控制下的自身基因的表达构建体。在具体方面，自身基因产物由树突细胞表达且呈递给免疫效应细胞，从而刺激抗自身基因产物应答。在可替代的实施方案中，在个体中可能改变或具有增加的表达的自身基因产物并不直接或间接鉴定，然而给受试者例如皮内施用包含在真核树突细胞中可操作的启动子控制下的自身基因的表达构建体。在可替代的实施方案中自身基因产物的选择可以包含如在个体群体中已知在统计上有利的自身基因产物的易感性。例如，已知在具有癌症或对其敏感的个体中经常突变的自身基因产物可以在本发明中使用。具有发展特定癌症的高危险个体包括具有特定改变的基因和/或基因表达，例如关于p53、BRCA1、BRCA2、APC、DPC4、NF-1、NF-2、p16、p27或RB；具有肿瘤发生前状况；个人癌症史；家族癌症史；无保护地暴露于强日照；烟草使用；等等的那些。
在一个实施方案中，自身基因产物包含致癌基因，其中所述致癌基因可以选自肿瘤抑制物、肿瘤相关基因、生长因子、生长因子受体、信号转导物、激素、细胞周期调节物、核因子、转录因子和凋亡因子。在具体实施方案中，肿瘤抑制物选自mda-7、Rb、p53、p16、p19、p21、p73、DCC、APC、NF-1、NF-2、PTEN、FHIT、C-CAM、E-cadherin、MEN-I、MEN-II、ZAC1、VHL、FCC、MCC、PMS1、PMS2、MLH-1、MSH-2、DPC4、BRCA1、BRCA2和WT-1。在优选实施方案中，肿瘤抑制物是p53。在优选实施方案中，生长因子受体选自FMS、ERBB/HER、ERBB-2/NEU/HER-2、ERBA、TGF-β受体、PDGF受体、MET、KIT和TRK。在优选实施方案中，信号转导物选自SRC、AB1、RAS、AKT/PKB、RSK-1、RSK-2、RSK-3、RSK-B、PRAD、LCK和ATM。在优选实施方案中，转录因子或核因子选自JUN、FOS、MYC、BRCA1、BRCA2、ERBA、ETS、EVII、MYB、HMGI-C、HMGI/LIM、SKI、VHL、WT1、CEBP-β、NFKB、IKB、GL1和REL。在优选实施方案中，生长因子选自SIS、HST、INT-1/WT1和INT-2。在优选实施方案中，凋亡因子选自Bax、Bak、Bim、Bik、Bid、Bad、Bcl-2、Harakiri和ICE蛋白酶。在优选实施方案中，肿瘤相关基因选自CEA、mucin、MAGE和GAGE。
表达构建体可以是病毒载体，其中所述病毒载体是腺病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、腺伴随病毒载体、多瘤病毒载体、α病毒载体、或疱疹病毒载体。在具体实施方案中，病毒载体是腺病毒载体。
在某些实施方案中，腺病毒载体是复制缺陷的。在另一实施方案中，复制缺陷是病毒E1区中的缺失。在某些实施方案中，缺失位于病毒的E1B区。在其他实施方案中，缺失包含病毒的整个E1B区。在另一实施方案中，缺失包含病毒的整个E1区。
在本发明的一个实施方案中，在真核细胞中可操作的启动子可以选自CMV IE、dectin-1、dectin-2、人CD11c、F4/80、MHC II类、以及在靶细胞中起作用无论是天然还是合成的其他启动子。在优选实施方案中，启动子是CMV IE。在另一实施方案中，表达载体进一步包含多腺苷酸化信号。
在本发明的一个实施方案中预期过度增殖性疾病是癌症，其中所述癌症可以选自肺、头、颈、乳腺、胰腺、前列腺、肾、骨、睾丸、子宫颈、胃肠、淋巴瘤、脑、结肠、皮肤和膀胱的癌症。在其他实施方案中，过度增殖性疾病是非癌性的，且可以选自例如类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、骨关节炎(OA)、肺中的瘤前病变、和牛皮癣。
在其他实施方案中，对于过度增殖性疾病进行治疗的受试者是人。在其他实施方案中预期给受试者施用选自GM-CSF、IL-4、C-KIT、Steel因子、TGF-β、TNF-α和FLT3配体的至少第一种细胞因子。在再一实施方案中，给受试者施用不同于第一种细胞因子的第二种细胞因子。在另一实施方案中，细胞因子作为由表达构建体编码的多核苷酸进行施用。在其他实施方案中，免疫效应细胞是CTL。
在本发明中还预期的是通过单次注射或多次注射皮内施用表达构建体。在一个实施方案中，注射对过度增殖或肿瘤部位局部进行。在另一实施方案中，注射对过度增殖或肿瘤部位区域性地进行。在再一实施方案中，注射在过度增殖或肿瘤部位远侧进行。进一步预期注射同时、在不同时间或经由连续输注来进行。
在具体方面，本发明包含用于在具有治疗抗性癌症的受试者中诱导指向p53的免疫应答的方法，所述方法包括下列步骤：从受试者获得树突细胞、用包含在真核细胞中可操作的启动子控制下的p53基因的腺病毒载体感染树突细胞，和给受试者施用腺病毒感染的树突细胞，由此树突细胞中表达的p53被呈递给免疫效应细胞，从而刺激抗p53应答。
受试者具有对其可能有抗性癌症的疗法可以是任何种类的，尽管在具体实施方案中疗法可以包含化学疗法、放射或两者。在本发明的某些实施方案中，存在给予或恢复针对受试者中的一种或多种药物和/或放射抗性过度增殖细胞的化学敏感性的方法，其中所述过度增殖性疾病的特征在于自身基因产物改变或增加表达，所述方法包括给受试者提供表达自身基因产物的树突细胞。在具体实施方案中，该方法进一步包括给受试者施用进一步的药物或放射疗法。树突细胞的提供可以包含施用由表达自身基因产物的表达构建体转化的树突细胞，或者它可以包含给受试者中的树突细胞施用表达自身基因产物的表达构建体。在具体实施方案中，过度增殖性疾病包含转移癌，包括治疗抗性转移癌。
因此，在本发明的具体实施方案中，存在给具有治疗抗性过度增殖性疾病的个体提供包含具有自身基因产物的树突细胞的免疫原性组合物的方法，所述自身基因产物优选是表达的。在进一步的实施方案中，个体除免疫原性组合物之外还被提供癌症治疗，并且在某些方面，2种治疗以累加方式或以协同方式起作用以治疗过度增殖性疾病，包括对癌症治疗有抗性的过度增殖细胞。在另外实施方案中，表达自身基因产物的树突细胞被视为包含疫苗。
在本发明的一个实施方案中，存在给予或恢复针对受试者中的一种或多种治疗抗性过度增殖细胞的敏感性的方法，其中所述过度增殖细胞的特征在于自身基因产物改变或增加表达，所述方法包括给所述受试者提供表达所述自身基因产物的树突细胞。在一个具体实施方案中，治疗抗性过度增殖细胞进一步定义为对药物、放射或两者有抗性。在一个进一步的实施方案中，治疗抗性过度增殖细胞进一步定义为对干扰素、白介素、抗体、抑制剂、其混合物或其组合有抗性。在具体实施方案中，抗体进一步定义为单克隆抗体，例如针对Her-2/neu的单克隆抗体，包括Herceptin
Figure A20068002557600131
在具体方面，单克隆抗体进一步定义为针对VEGF的单克隆抗体，例如Avastin。在另外的具体实施方案中，抑制剂进一步定义为VEGF抑制剂。
细胞对其有抗性的药物可以是任何一种或多种药物，尽管在具体方面，药物包含例如泰素、托泊替康、顺铂、卡铂、阿霉素、或泰索帝。药物可以是烷化剂，例如白消安、顺铂、或异磷酰胺。药物可以是蒽环类药物，例如多柔比星或表柔比星。药物可以是抗代谢物，例如氟尿嘧啶或氨甲蝶呤。药物可以是拓扑异构酶抑制剂，例如博来霉素、依托泊苷、或吉西他滨。药物可以是微管抑制剂，例如泰素、泰索帝、或长春碱。药物可以是单克隆抗体，例如曲妥单抗(Herceptin
Figure A20068002557600132
)、贝伐单抗(Avastin
Figure A20068002557600133
)、甲磺酸伊马替尼(Gleevec
Figure A20068002557600134
)、吉非替尼(gefitinib)(Iressa
Figure A20068002557600135
)、埃洛替尼(erlotinib)(Tarceva
Figure A20068002557600136
)、或西妥昔单抗(Erbitux
Figure A20068002557600137
)。药物可以是环磷酰胺。药物可以是烷化剂。药物可以是拓扑异构酶1抑制剂，例如依立替康。
在某些实施方案中，本发明的方法进一步包括给受试者施用另外疗法，例如包含药物、金属、放射、手术、基因疗法、免疫疗法、激素疗法、或其组合的疗法。在具体实施方案中，化学疗法包含上调p53、Fas、死亡受体、或其组合的表达的组合物。在另外的具体实施方案中，树突细胞和另外疗法同时或依次地提供给受试者。特别地，树突细胞可以在进一步疗法之前提供给受试者，例如在树突细胞提供给受试者的约1至12个月内。在某些方面，树突细胞和另外疗法提供超过一次，例如循环提供。在其他具体实施方案中，树突细胞在另外疗法之后提供给受试者，例如在进一步疗法提供给受试者的约1至2个月内。
在本发明的具体方面，存在施用由表达所述自身基因产物例如p53的表达构建体例如腺病毒载体转化的树突细胞。自身基因产物可以是肿瘤抑制物或原癌基因产物。它还可以是在癌细胞中上调的基因产物。在具体方面，自身基因产物包含存活蛋白、Her2/neu、CEA、ras、TERT、NY-ESO、PSA、CEA、MART、MAGE1、MAGE3、gp100、BAGE、GAGE、TRP-1、TRP-2、mda-7、sus1、或PMSA。
在具体实施方案中，本发明中的过度增殖细胞是治疗抗性癌细胞，例如转移癌细胞。在另外的具体实施方案中，癌细胞是小细胞肺癌细胞。过度增殖细胞可以是来自例如肺癌、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、肝癌、脑癌、前列腺癌、肾癌、肉瘤、胰腺癌、淋巴瘤或白血病的细胞。
特别地，可以通过本发明的方法和组合物治疗的过度增殖细胞包括至少来自膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、结肠、食管、胃肠、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌、或子宫的细胞。另外，癌症可以特别是下列非限制性组织学类型：赘生物，恶性；癌；癌，未分化的；巨大和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；组合肝细胞癌和胆管癌；小梁性腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉内腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；细支气管肺泡癌(branchiolo-alveolar adenocarcinoma)；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞腺癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌(endometroid carcinoma)；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘蛋白性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳房的；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌w/鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质肿瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；粒层细胞瘤，恶性；男性细胞瘤，恶性；sertoli细胞癌；莱迪希细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；神经节细胞瘤，恶性；乳房外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑素瘤；无黑色素性恶性黑素瘤；浅表扩展性黑素瘤；巨大色素痣内恶性黑素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；小泡型横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒管混合瘤；肾胚细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间叶瘤，恶性；布伦纳瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺肿，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；成软骨细胞瘤，恶性；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；成胶质细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原发性神经外胚层；小脑肉瘤；成神经节细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑脊膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；何杰金氏病；何杰金氏副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞性；恶性淋巴瘤，大细胞，弥散性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样霉菌病；其他特定的非何杰金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；髓细胞性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸细胞性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞性白血病。
在本发明的具体方面，具有广泛期小细胞肺癌的患者用树突细胞进行疫苗接种，所述树突细胞用包含野生型p53基因的腺病毒载体转导。在许多患者中观察到针对疫苗接种的p53特异性T细胞应答。针对疫苗接种的抗原特异性免疫应答与抗腺病毒抗体滴度中的适度增加正相关，且与未成熟的髓样细胞积聚负相关。在针对疫苗接种的抗原特异性应答与DC和T细胞的存在和功能活性之间没有发现关联。只有1个患者显示针对疫苗接种的客观临床应答，而大多数患者具有疾病进展。然而，这些患者显示在疫苗接种后立即开始的非常高比率的针对化学治疗的客观临床应答。这种临床应答与抗原特异性免疫应答密切相关。在具体实施方案中，本发明涉及癌症免疫疗法中的新范例，其中疫苗接种不是作为单一形式而是与另一种癌症治疗例如化学疗法直接协作是特别有效的。
在本发明的另外实施方案中，存在李弗劳明综合征(Li-Fraumenisyndrome)的治疗和/或预防，例如使用包含p53自身基因的树突细胞。因为ras在例如胰腺和结肠直肠癌中是上调的，所以在这些及其他癌症中，可以通过在这些受试者中使用包含ras多核苷酸的树突细胞来靶向ras。
因此，在本发明的一个实施方案中，存在给予或恢复受试者中的一种或多种治疗抗性过度增殖细胞的敏感性的方法，其中所述过度增殖细胞的特征在于自身基因产物改变或增加表达，所述方法包括给所述受试者提供表达所述自身基因产物的树突细胞。在一个具体实施方案中，治疗抗性过度增殖细胞进一步定义为对药物、放射或两者有抗性。
在一个具体实施方案中，治疗抗性过度增殖细胞进一步定义为对干扰素、白介素、抗体、抑制剂、其混合物或其组合有抗性。抗体可以进一步定义为单克隆抗体，所述单克隆抗体可以进一步定义为针对Her-2/neu的单克隆抗体，例如曲妥单抗(Herceptin
Figure A20068002557600171
)。单克隆抗体可以进一步定义为针对VEGF的单克隆抗体，所述针对VEGF的单克隆抗体可以进一步定义为贝伐单抗(Avastin
Figure A20068002557600172
)。抑制剂可以进一步定义为VEGF抑制剂。药物可以包含例如泰素、托泊替康、顺铂、卡铂、阿霉素、环磷酰胺、或泰索帝。药物可以是烷化剂，例如白消安、顺铂、或异磷酰胺。药物可以是蒽环类药物，例如多柔比星或表柔比星。药物可以是抗代谢物，例如氟尿嘧啶或氨甲蝶呤。药物可以是拓扑异构酶抑制剂，例如博来霉素、依托泊苷、或吉西他滨。药物可以是微管抑制剂，例如紫杉醇或长春碱。药物可以是单克隆抗体，例如曲妥单抗、贝伐单抗、甲磺酸伊马替尼、吉非替尼、或埃洛替尼。
在某些方面，本发明的方法进一步包括给受试者施用另外疗法，例如药物、金属、放射、手术、基因疗法、免疫疗法、激素疗法、或其组合。在具体实施方案中，另外疗法包含化学疗法，例如包含上调p53、Fas、死亡受体、或其组合的表达的组合物。在另一具体实施方案中，树突细胞和另外疗法同时或依次地提供给受试者。在另外的具体实施方案中，树突细胞可以在进一步疗法之前提供给受试者。另外疗法可以在树突细胞提供给受试者的约1至12个月内提供给受试者，且树突细胞和另外疗法可以提供超过一次。在具体方面，树突细胞和另外疗法循环提供。树突细胞可以在另外疗法之后提供给受试者。树突细胞可以在进一步疗法提供给受试者的约1至2个月内提供给受试者。提供可以包含例如施用由表达所述自身基因产物的表达构建体转化的树突细胞，其中提供包含给受试者中的树突细胞施用表达自身基因产物的表达构建体。
在本发明的具体方面，表达构建体包含腺病毒载体。在某些方面，自身基因产物包含p53。自身基因产物可以包含肿瘤抑制物或原癌基因产物。自身基因产物可以进一步定义为在癌细胞中上调的基因产物。在具体方面，自身基因产物包含存活蛋白、Her2/neu、CEA、ras、TERT、NY-ESO、PSA、CEA、MART、MAGE1、MAGE3、gp100、BAGE、GAGE、TRP-1、TRP-2、或PMSA。
在某些实施方案中本发明的过度增殖细胞是癌细胞，在某些实施方案中包含转移癌细胞。过度增殖细胞可以是小细胞肺癌细胞，或它们可以是来自肺癌、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、肝癌、脑癌、前列腺癌、肾癌、肉瘤、胰腺癌、淋巴瘤或白血病的细胞。
本发明的方法可以进一步包括给受试者递送增强表达自身基因产物的树突细胞活性的试剂，例如抗体，包括单克隆抗体，例如CD40抗体。表达自身基因产物的树突细胞和试剂可以包含在同一组合物中，或它们可以包含在分开的组合物中。在某些实施方案中，表达自身基因产物的树突细胞和试剂同时递送给所述受试者，尽管在可替代的实施方案中表达自身基因产物的树突细胞可以在试剂递送给受试者之前递送给受试者。在具体方面，表达自身基因产物的树突细胞在试剂递送给受试者之后递送给所述受试者。在本发明的具体实施方案中，受试者先前已用化学疗法、放射、或两者进行治疗。
本发明的方法可以进一步包括测定来自受试者的样品中的过度增殖细胞的步骤，并且样品包含活检样品、血液、尿、颊刮屑(cheekscraping)、唾液、脑脊液、粪便、乳头抽吸液(mipple aspirate)、或其组合。样品的测定可以包括测定治疗抗性标记，例如一种或多种过度增殖细胞的一种或多种多核苷酸中的突变，或与同一组织的正常非癌性细胞比较，一种或多种多核苷酸的表达上调或下调。
在本发明的一个进一步的实施方案中，存在治疗受试者中的一种或多种过度增殖细胞的方法，其中所述一种或多种过度增殖细胞对用于过度增殖细胞的临床公认疗法有抗性，或其中所述一种或多种过度增殖细胞在暴露于用于过度增殖细胞的临床公认疗法后将变成有抗性，并且其中所述过度增殖细胞的特征在于自身基因产物改变或增加表达，所述方法包括给所述受试者提供表达所述自身基因产物的树突细胞。在某些方面，在暴露于临床公认疗法后将变成有抗性的过度增殖细胞包含多核苷酸上与抗性有关的一种或多种突变。该方法可以进一步包括给受试者递送增强表达自身基因产物的树突细胞活性的试剂。
此外，本发明可以用于预防治疗抗性癌症。来自对治疗敏感的癌症的治疗抗性癌症的发展可以被本发明的方法停止、中断或延迟。因此，在一个实施方案中存在治疗或预防治疗抗性过度增殖细胞发展的方法，其中所述过度增殖细胞的特征在于自身基因产物改变或增加表达，所述方法包括给所述受试者提供表达所述自身基因产物的树突细胞。
前文已相当广泛地概述了本发明的特征和技术优点，以便随后的本发明的详细描述可以被更好地理解。本发明的另外特征和优点将在下文描述，这构成了本发明权利要求的主题。本领域技术人员应当理解公开的概念和具体实施方案可以容易地用作修改或设计用于执行本发明的相同目的的其他结构。本领域技术人员应当认识到此类等价构建没有背离如附加权利要求中所述的本发明精神和范围。被认为是本发明特有的、关于其组织和操作方法的新型特征，连同进一步的目的和优点由于下列描述与附图结合考虑时将被更好地理解。然而，应当特别理解每个附图仅为了举例说明和描述的目的而提供，并且不希望作为限制本发明的限定。
附图简述
为了更全面地理解本发明，现在参考与附图结合考虑的下列描述，其中：
图1提供了示例性常规SCLC治疗方案。
图2提供了具有广泛SCLC的患者中的示例性Advexin
Figure A20068002557600191
-DC疫苗I/II期试验。
图3显示了示例性Advexin
Figure A20068002557600192
疫苗方案第一线应答。
图4显示了Advexin
Figure A20068002557600193
疫苗方案第二线治疗。
图5显示了在所有患者中对于第二线治疗的应答的Advexin
Figure A20068002557600194
/DC疫苗存活数据。
图6提供了对第二线化学疗法的应答图表。
图7显示了与本发明的那种比较在抗性SCLC中的药物活性。
图8显示了在接受第二线疫苗/CTX的可评估患者中的Advexin/DC疫苗存活数据。
图9提供了具有广泛SCLC的患者中的示例性Advexin
Figure A20068002557600202
-DC疫苗II期试验。
图10A-10B显示由单核细胞产生的DC的特征。DC由单核细胞的冷冻样品制备且如本文中描述的用Adv-p53感染。在第7天，细胞被收集并用FITC缀合的谱系特异性抗体和PerCP缀合的HLA-DR抗体的混合物(图10A-右图)或同种型对照IgG(图10A-左图)进行标记。表面染色细胞被固定、透化、并用同种型对照(图10B-右顶部图)或抗p53抗体(图10B-右底部图)染色。为了举例说明染色的特异性，未感染细胞用同种型对照IgG(图10B-左顶部图)或抗p53抗体(图10B-左底部图)进行标记。Lin-HLA-DR+细胞被门控(gate)并且用p53的染色在这种DC群体内进行分析。
图11A-11C显示对免疫接种的p53特异性免疫应答的例子。在图11A中，2个HLA-A2阴性患者用DC-Adv-p53进行疫苗接种(具有2周间隔的3次疫苗接种)。在免疫接种前、最后一次疫苗后3周和2个月后收集血液。细胞如材料和方法中所述用ALVAC-p53进行刺激。具有“空”载体的ALVAC用作对照(ALVAC-cont)。IFN-γ生产细胞数目在ELISPOT中一式四份地进行评估并根据每2×105个单核细胞进行计算。显示平均值±SD。*-与ALVAC-p53和ALVAC-cont一起孵育的细胞之间的p＜0.05。#-疫苗接种前后样品之间的p＜0.05。图11B显示具有广泛期SCLC的HLA-A2阳性患者用DC-Adv-p53进行疫苗接种。在免疫接种前以及免疫接种后的不同点上收集血液。每2×105个单核细胞的IFN-γ生产细胞数目在ELISPOT中一式四份地进行评估。细胞用HLA-A2匹配的p53衍生肽(LLGRNSFEV；SEQ ID NO：3)，PSA衍生的无关肽(FLTPKKLQCV；SEQ ID NO：2)进行刺激或单独留在培养基中(对照)。显示平均值±SD。*-与p53和PSA肽一起孵育的细胞之间的p＜0.05，#-疫苗接种前后样品之间的p＜0.05。图11C显示免疫接种前后从HLA-A2阳性患者收集的外周血样品。单核细胞用APC缀合的抗CD8抗体和PE缀合的p53四聚体染色。所有CD8+被门控且评估CD8+细胞群体内的四聚体阳性细胞比例。
图12A-12D显示针对疫苗接种的p53特异性应答。呈现了来自所有测试患者的IFN-γ ELISPOT测定结果。非特异性IFN-γ生产(ALVAC-对照或无关肽)的本底水平被扣除。显示了每2×105个细胞的斑点数目。所有测量一式四份地进行。只显示了关于每种样品的平均值。并非所有HLA-A2阳性患者都用ALVAC-p53和p53衍生的肽进行测试。
图13A-13E显示疫苗接种前p53特异性细胞应答、抗腺病毒体液应答和T细胞功能之间的关联。在图13A中，抗腺病毒IgG滴度使用系列稀释测定进行计算。患者分为3组：疫苗接种后抗体滴度中没有增加的患者(11个患者)，抗体滴度中具有适度增加的患者(2-8倍-10个患者)以及疫苗接种后滴度中具有高度增加的患者(＞8倍-12个患者)。在每个组中计算显示细胞p53特异性免疫应答的患者比例。使用曼怀二氏检验(Mann Whitney test)计算P值(双尾)。在图13B中，疫苗接种前的T细胞功能活性。样品在疫苗接种前进行收集。MNC用0.1μg TT(TT-应答)或5μg/ml PHA(PHA应答)一式三份地进行刺激。刺激指数计算为在刺激物和单独的培养基的存在下细胞增殖之间的比率。水平条表示对照组(n＝6)中的最小值。显示了个别结果。在图13C中，患者分为2组：具有针对刺激的正常水平的T细胞应答和减少水平的应答(低于最小对照值)。在每个组中计算具有阳性p53特异性应答的患者比例。在组间没有发现统计学差异(对于2种刺激，费氏精确检验(Fisher’s Exact Test)中的p值超过0.4)。在图13D中，在疫苗接种前和2-3周后收集的MNC用PerCP缀合的抗CD3抗体、PE缀合的抗CD4抗体和FITC缀合的抗CD25抗体进行染色且通过流式细胞术进行分析。计算CD3+CD4+ T细胞群体内的CD25高细胞比例。水平条表示组中值的平均值(在曼怀二氏检验中p值＞0.2)。在图13E中，患者分为2组：具有对照和增加水平的CD4+CD25+T细胞(超过最大对照值)。在每个组中计算具有阳性p53特异性应答的患者比例。在组间没有发现统计学差异(费氏精确检验中p值超过0.3)。
图14A-14K显示针对疫苗接种的p53特异性应答以及DC表型和功能之间的关联。MNC在疫苗接种前从对照供体和SCLC患者中分离。细胞用抗体混合物进行染色且如方法中所述使用多色流式细胞术进行分析。计算DC(Lin-HLA-DR+)(图14A)、成熟DC(Lin-CD83+)(图14B)和ImC(Lin-HLA-DR-CD33+)(图14G)的比例。双尾p值使用曼怀二氏检验进行计算。在图14D中，Lin-细胞中的HLA-DR平均荧光强度(MFI)。在图14E中，MNC如本文所述用作异基因对照T细胞的刺激物。显示了1∶1比率(MNC∶T细胞)的结果。每次实验一式三份地进行。双尾p值使用曼怀二氏检验进行计算。图14C和14F显示在疫苗接种前具有对照和减少水平的DC表型的患者组内计算的具有针对疫苗接种的阳性p53特异性应答(p53应答者)和阴性应答(p53非应答者)的患者百分比。组间差异在统计上不显著(费氏精确检验中双尾p值超过0.3)。图14H显示在疫苗施用前具有对照和升高水平的ImC的患者组内计算的p53应答者和p53非应答者的百分比。显示了费氏精确检验中双尾p值。图14I显示在疫苗接种前和2-3周后收集的单核细胞用藻红蛋白缀合的抗CD3抗体、抗原呈递细胞缀合的抗CD4抗体和FITC缀合的抗CD25抗体进行染色且通过流式细胞术进行分析。计算CD3+CD4+ T细胞群体内的CD25高细胞比例。条，组中值的平均值(在曼-怀二氏检验中p值＞0.2)。在图14J中，患者分为2组：具有对照和增加水平的CD4+CD25+ T细胞(超过最大对照值)。在每个组中计算具有阳性p53特异性应答的患者比例。在组间没有发现统计学差异(费氏精确检验中P＞0.3)。在图14K中，单核细胞在疫苗接种前从对照供体和SCLC患者中分离。细胞用抗体混合物进行染色且使用多色流式细胞术进行分析。评估未成熟髓样细胞(Lin-HLA-DR-CD33+)的比例。
图15A-15D显示针对疫苗接种的临床应答。图15A显示铂抗性患者的存活。13个铂抗性患者从第一次疫苗施用时的存活，所述患者在疫苗接种后接受化学疗法。生存中值为9.3个月。图15B显示了所有患者的存活。用疫苗治疗的所有23个患者从第一次疫苗施用时的存活。生存中值为10个月。图15C显示了针对疫苗接种的p53特异性免疫应答和针对化学疗法的临床应答之间的关系。在疫苗接种后进展且用第二线化学疗法治疗的18个患者根据其针对疫苗的免疫应答分为2组。PD-疾病进展，SD-疾病稳定，PR-部分应答，CR-完全应答(所有都根据RESIST标准)。P使用威斯康星秩和检验(Wilcoxon sum ranktest)进行计算。图15D显示了根据免疫应答的存活。对于抗p53免疫应答可评估的22个患者从第一次疫苗施用起的存活。实线表示具有阳性免疫应答的患者(生存中值，12.1个月)，并且虚线表示没有阳性免疫应答的那些患者(生存中值，7.9个月)。2条存活曲线之间的差异具有0.075的p值。
图16显示针对疫苗的临床应答。顺铂/依托泊苷后2个月在腹膜后淋巴结中具有疾病进展的患者(新，且在PET扫描中阳性)在进展时用3次疫苗治疗。在第一次疫苗施用后6周观察到PR。在左侧，在第一次疫苗前1周进行的腹部CT扫描显示2个肿大的腹膜后淋巴结(有圆圈的，每个直径2cm)。第三次疫苗后2周获得的右侧的CT扫描显示2个病灶尺寸减少超过60％。
图17A-17B涉及针对疫苗接种的免疫和临床应答之间的关联。在图17A中是来自发展针对疫苗接种的p53免疫应答的患者的IFN-γELISPOT测定结果。非特异性IFN-γ生产(无关肽)的本底水平被扣除。显示了每1×105个细胞的斑点数目。所有测量一式四份地进行。显示了关于每种样品的平均值。在图17B中是用第二线化学疗法治疗的患者中的淋巴细胞计数(×109/L)。柱，平均值；条±SD。
发明详述
本发明在主题方面涉及美国专利申请公开号20030045499，所述美国专利申请整体引入本文作为参考。
I.定义
如本文说明书中使用的，“a”或“an”可以指一个(种)或多个(种)。如本文权利要求中使用的，当与单词“包含”结合使用时，单词“a”或“an”可以指一个(种)或超过一个(种)。如本文中使用的，“其它”可以指至少第二个(种)或多个(种)。本发明的某些实施方案可以由本发明的一个(种)或多个(种)元件、方法步骤、和/或方法组成，或基本上由其组成。预期本文中描述的任何方法或组合物可以参考本发明描述的任何其他方法或组合物实现。
如本文使用的，术语“给予或恢复化学敏感性”指致使癌细胞对癌症治疗有应答，其中所述癌细胞目前例如对癌症治疗没有应答，预期对癌症治疗是无应答的，或易于对癌症治疗无应答。更具体而言，不受特定癌症治疗影响的癌细胞的增殖变成受癌症治疗影响。癌细胞可以已来自先前已对癌症治疗敏感的癌症例如肿瘤中，或癌细胞可以已来自对癌症治疗从不敏感的癌症例如肿瘤中。癌细胞可以易于变成对一种或多种癌症治疗有抗性，并且本发明的方法使细胞不会变成对一种或多种癌症治疗有抗性。在某些实施方案中，癌细胞易于变成对治疗有抗性，因为它包含在多核苷酸中的与抗性有关的一种或多种突变，和/或它包含一种或多种多核苷酸的上调或下调，其中所述上调或下调与抗性有关。
如本文使用的，术语“第一线治疗”指个人在被诊断具有癌症后接受的第一种治疗。
如本文使用的，术语“免疫原性组合物”指在个体体内引发免疫应答的组合物。在具体实施方案中，免疫原性组合物包含疫苗，所述疫苗可以定义为在后续攻击后提供免疫性的免疫原性组合物。
如本文使用的，术语“抗性”或“治疗抗性”指包含不能通过一种或多种癌症疗法进行治疗的一种或多种癌细胞的癌症。例如，在对细胞实施治疗后一种或多种癌细胞仍能够增殖。在具体实施方案中，一种或多种细胞对其有抗性的癌症治疗是化学疗法。在其他方面，抗性可以针对一种或多种癌症疗法。在进一步的实施方案中，抗性细胞发展出针对治疗的抗性，而在可替代的实施方案中抗性细胞始终对治疗有抗性，或包含致使其不能对一种或多种癌症治疗敏感的生物学或生理学表型或基因型。
在某些实施方案中，个体可用本发明的方法治疗，其中所述个体先前已用癌症疗法例如化学疗法、放射、或两者进行治疗，尽管在其他实施方案中，个体先前未用癌症疗法进行治疗。在其中个体先前未用癌症疗法进行治疗的方面，个体可以包含在暴露于癌症治疗后将变成有抗性的一种或多种癌细胞。这种抗性的表现可以在细胞将变成对其有抗性的癌症治疗开始后立即或不久发生，或者抗性可以直到治疗开始后数月或数年才表现。对治疗有抗性或将变成有抗性的一种或多种癌细胞可以是或不是转移的。
个体对其具有一种或多种抗性细胞的疗法在通常对于特定癌症的治疗背景中。即，个体对其有抗性的疗法就用于那种特定癌症的常规癌症治疗而言可以是合格的，并且在某些方面本发明可以涉及对用于特定癌症的临床公认疗法有抗性。例如，技术人员认识到对于乳腺癌，常规的临床公认疗法包括至少Herceptin
Figure A20068002557600251
；芳香酶抑制剂(Arimidex
Figure A20068002557600252
[化学名：阿那曲唑]，Aromasin
Figure A20068002557600253
[化学名：依西美坦]，和Femara
Figure A20068002557600254
[化学名：来曲唑])；它莫西芬、雷洛昔芬、托瑞米芬、或Faslodex
Figure A20068002557600255
(化学名：氟维司群)。对于肺癌的示例性临床公认疗法包括至少顺铂、依托泊苷、卡铂、紫杉醇、多西他奇、酒石酸长春瑞滨、多柔比星、硫酸长春新碱、异磷酰胺和/或盐酸吉西他滨。对于前列腺癌的示例性临床公认疗法包括至少多西他赛；促黄体激素-释放激素激动剂，例如亮丙瑞林、戈舍瑞林和布舍瑞林；抗雄激素物质，例如氟他胺和比卡鲁胺；酮康唑；和/或氨鲁米特。本领域技术人员知道对于其他癌症类型的其他常规临床公认疗法。
如本文使用的，术语“第二线治疗”指第一线治疗另外和随后的治疗，且在具体方面不同于第一线治疗。在其中人肿瘤响应(即完全或部分应答)第一线治疗的情况下，肿瘤称为“敏感的”，且如果肿瘤复发，那么第二线治疗可以涉及再次施用相同的第一线活性治疗。然而，例如SCLC是特别有侵略性的癌症且具有非常高频率的肿瘤复发。在其中肿瘤用第一线化学疗法治疗且肿瘤未能响应(即没有消退)或继续生长的情况下，如果肿瘤生长在化学治疗方案完成后90天内发生，那么这些肿瘤视为“有抗性的”。如上所述，对于有抗性的肿瘤，在具体实施方案中，对于后续治疗使用不同的化学疗法。
如本文使用的，术语“敏感的”指包含能够用特定癌症疗法进行治疗的一种或多种癌细胞的癌症。例如，对细胞实施治疗后一种或多种细胞不能增殖。在具体实施方案中，对特定癌症治疗敏感的细胞被治疗杀死。
II.本发明
本发明考虑了治疗抗性过度增殖性疾病的治疗。在具体方面，治疗通过使具有癌症的个体给予或恢复化学敏感性，其中一种或多种癌细胞对治疗有抗性，通过施用在树突细胞中的自身基因产物表达构建体，所述表达构建体随后将加工的自身基因产物抗原呈递给免疫效应细胞。在具体实施方案中，自身基因产物表达构建体包含p53表达构建体。免疫效应细胞随后产生抗自身基因产物应答，例如抗p53应答，导致呈递突变型自身基因产物抗原的过度增殖细胞破坏或裂解，包括治疗抗性过度增殖细胞，例如示例性突变型p53抗原。在具体实施方案中，树突细胞从其中自身基因产物例如p53的表达在过度增殖细胞中上调的患者获得。获得的树突细胞用包含p53基因的腺病毒载体感染，并且给个体施用p53腺病毒感染的树突细胞。预期感染的树突细胞将自身基因抗原呈递给免疫效应细胞，刺激患者中的抗自身基因应答，且导致呈递突变型自身基因抗原的过度增殖细胞破坏或裂解，包括对癌症治疗有抗性的至少一些过度增殖细胞。在具体实施方案中，过度增殖性疾病和/或其对癌症治疗的抗性的特征在于自身基因产物改变或增加表达。
在进一步的实施方案中，本发明包含使过度增殖性疾病的一种或多种细胞敏化，且在具体实施方案中，疾病及其患病细胞对例如药物、放射、或两者有抗性。疾病一般可以通过自身基因产物改变或增加表达来表征和/或疾病对一种或多种特定治疗的抗性一般可以通过自身基因产物改变或增加表达来表征。在具体实施方案中，除给受试者施用用于过度增殖性疾病的进一步治疗例如药物或放射治疗之外，具有疾病的受试者被提供表达自身基因产物的树突细胞。
在另外实施方案中，存在给予或恢复针个体中的一种或多种化学治疗抗性癌细胞的化学敏感性的方法，包括给个体递送治疗有效量的表达自身基因产物的树突细胞和对于癌症的另外治疗。在本发明的某一方面，组合物包含置于树突细胞内的腺病毒载体中的p53。
表达自身基因产物的树突细胞可以视为免疫原性组合物，且在具体实施方案中，本发明包含提供表达自身基因产物的树突细胞以及提供不同于表达自身基因产物的树突细胞的另一种癌症治疗的方法，尽管可以使用表达其他自身基因产物的树突细胞。并非表达自身基因产物的树突细胞的治疗可以包含任何类型的癌症治疗，包括例如化学疗法、放射、基因疗法、手术、免疫疗法、激素疗法等。2种分开疗法可以以任何合适的方案给个体施用，尽管在具体实施方案中免疫原性组合物在其他疗法后递送。树突细胞疗法的部分或全部和第二种疗法可以重复，例如通过循环治疗。
因此，在本发明的具体实施方案中，存在给具有治疗抗性过度增殖性疾病的个体提供包含具有自身基因产物的树突细胞的免疫原性组合物的方法。在进一步的实施方案中，个体除免疫原性组合物之外还被提供癌症治疗，并且在某些方面，2种治疗以累加方式或以协同方式起作用以治疗过度增殖性疾病，包括对癌症治疗有抗性的过度增殖细胞。在另外实施方案中，表达自身基因产物的树突细胞被视为疫苗。
III.Advexin
Figure A20068002557600271
-树突细胞(DC)
尽管包含表达自身基因产物的树突细胞的任何合适组合物都可以在本发明中使用，但在本发明的具体方面使用Advexin
Figure A20068002557600272
-DC组合物。如本文中使用的，Advexin-DC组合物包含在载体上的野生型p53，其中所述载体包含在树突细胞中。在本发明的具体方面，载体可以是任何合适的载体，从而使得它允许p53在树突细胞内表达。载体的示例性实施方案包括腺病毒载体、病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体例如慢病毒载体、疱疹病毒载体、或痘苗病毒载体。
尽管野生型p53对于本领域技术人员是容易获得的，但示例性野生型序列在SEQ ID NO：1中提供(国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)GenBank登记号M14695)。其他p53序列可在国家生物技术中心的GenBank数据库中可获得。
在其他实施方案中，组合物依照美国专利号6,726,907中描述的那些使用，所述美国专利整体引入本文作为参考，所述组合物包括包含例如p53的纯化的腺病毒载体组合物。
I V.方法和组合物的增强
在本发明的某些实施方案中，表达自身基因产物的树突细胞进一步包含增强树突细胞组合物活性的一种或多种部分。该部分可以在树突细胞进行处理以包含自身基因产物前或后加入树突细胞。在本发明的具体方面，对树突细胞实施增强其活性的组合物。
增强表达自身基因产物的树突细胞活性的任何组合物可以在本发明中使用，尽管在具体方面所述部分包含抗体，且在具体实施方案中抗体是单克隆抗体，尽管任选地抗体是多克隆抗体。在具体实施方案中，对树突细胞实施抗CD40抗体(Nikitina等人，2002)处理。用于促进DC分化和激活的可替代方法包括用病原体受体和炎症信号进行处理(参见，例如Munz C，Steinman RM，Fujii S.Dendritic cellmaturation by innate lymphocytes：coordinated stimulation ofinnate and adaptive immunity.J Exp Med.2005 Jul 18；202(2)：203-7)。
关于增强表达自身基因产物的树突细胞活性的任何组合物的递送方法可以是任何合适的种类。在某些实施方案中，例如增强组合物作为多核苷酸、多肽、肽、小分子等等提供，且递送方法是适当匹配的。例如，增强表达自身基因产物的树突细胞活性的小分子、多肽和/或蛋白质可以在脂质体中递送给有此需要的个体。可替代地，可以使用编码增强组合物的多核苷酸。在某些方面，编码增强组合物的多核苷酸与编码自身基因产物的多核苷酸相同或不同。在其中包含编码自身基因产物的序列的相同多核苷酸还包含编码增强组合物的序列的那些实施方案中，2种序列可以编码融合基因产物或可以编码2种分开的基因产物。在进一步的实施方案中，编码自身基因产物的序列和编码增强组合物的序列由不同调节区进行调节，尽管在可替代的实施方案中它们由相同调节区进行调节。在具体实施方案中可以称为启动子的任何调节区可以是例如组织特异型调节区，诱导型调节区，或组成型调节区。
V.用本发明的方法治疗的受试者
任何个体都可以用本发明的方法和组合物进行治疗。在本发明的某些方面，方法和组合物涉及癌症疫苗。在具体实施方案中，个体被施用本发明的疫苗。适合于本发明的方法和组合物的个体可以具有发展一种或多种癌症类型的一种或多种危险因素。危险因素可以定义为增加发展癌症机会的任何事物，并且在这种情况下可以是增加发展治疗抗性癌症机会的任何事物。发展治疗抗性癌症的危险可以在对其已发生抗性的治疗施用之前、之时或之后表现。
下列危险因素可能一般适用于发展癌症或特别适用于发展治疗抗性癌症，且因此在具体实施方案中，个体具有发展癌症包括治疗抗性癌症的一种或多种危险因素。尽管不同癌症具有不同危险因素，但某些危险因素适用于超过一种的癌症类型，例如具有肿瘤发生前条件，个人癌症史，家族癌症史，和/或具有改变的基因和/或基因表达，例如对于p53。某些危险因素对一种或多种癌症类型特异，例如具有特定改变的基因和/或基因表达，例如对于乳腺癌的BRCA1或BRCA2；对于皮肤癌无保护地暴露于强日照；对于肺、喉、口、咽喉、食管、肾、膀胱、结肠和几种其他器官癌症的烟草使用；等等。
关于个体发展治疗抗性癌症的危险因素可以是任何种类的，尽管在具体实施方案中，它们包含特定多核苷酸的一种或多种突变和/或表达改变。例子包括例如EGFR突变和非小细胞肺癌对吉非替尼的抗性(Kobayashi等人，2005)；黑素细胞主要调节物MITF(小眼畸形相关转录因子)和对皮肤癌的抗性(Garraway等人，2005)；胃癌细胞中的ZNRD1表达变化(Zhang等人，2003)。用于给予对化学治疗抗性的一般机制是经由上调负责给予mdr(多药抗性)表型的P糖蛋白基因家族(Clarke R，Leonessa F，Trock B.Multidrugresistance/P-glycoprotein and breast cancer：review andmeta-analysis.Semin Oncol.2005 Dec；32(6 Suppl 7)：S9-15.)。与对乳腺癌抗性有关的突变包括它莫西芬抗性乳腺癌中的雌激素受体突变(Karnik等人，1994)；与多柔比星抗性有关的人乳腺癌耐药蛋白(BCRP)中的482(R482)突变(Allen等人，2002)。
具有发展治疗抗性癌症的一种或多种危险因素的个体可以在任何时间施用本发明的方法和组合物，包括在发展治疗抗性癌症之前，发展治疗抗性癌症之后，或两者。
VI.过度增殖性疾病
癌症已成为西方社会的主要死亡原因之一，仅次于心脏病。目前评估反映在美国3个人中有1个将发展癌症，且5个人中有1个将死于癌症。从免疫学观点来看癌症可以视为已丧失正常生长调节机制的改变的自身细胞。
致癌基因是具有引起正常细胞癌变的潜力的多核苷酸。目前有反映其不同活性的3种主要类别的致癌基因。一类致癌基因编码诱导细胞增殖的蛋白质。第二类致癌基因称为肿瘤抑制基因或抑癌基因，作用是抑制过量细胞增殖。第三类致癌基因通过编码调节编程性细胞死亡的蛋白质阻断或诱导凋亡。
在本发明的一个实施方案中，过度增殖性疾病的治疗涉及给树突细胞施用自身基因表达构建体，且在具体实施方案中，施用是皮内的。预期树突细胞将加工的自身基因野生型抗原呈递给免疫效应细胞，所述免疫效应细胞产生抗自身基因应答，导致呈递突变型自身抗原的过度增殖细胞破坏或裂解。3种主要类别的致癌基因在下文讨论且列于表1中。
在具体实施方案中，本发明可以在任何癌症类型的治疗中使用，包括，例如，肺、乳腺、前列腺、结肠、胰腺、脑、皮肤、甲状腺、肝、肾、脾、食管、卵巢、子宫颈、子宫、睾丸、骨、垂体腺、胃、血液、骨髓和淋巴系统。
在具体实施方案中，本发明用于治疗小细胞肺癌。小细胞肺癌(SCLC)构成美国每年可见的大约170,000肺癌新病例的15-20％。SCLC是最具侵略形式的肺癌，5年存活率＜10％。广泛期疾病(ES)的诊断包含大约三分之二的SCLC新病例，且如果未治疗导致仅2-4个月的存活，并且使用攻击性化学治疗方案存活增至6-7个月。局限期和广泛期疾病对第一线化学治疗非常有应答性，通常观察到超过50％的应答率。然而，这些应答几乎总是短暂的且ES患者中的疾病复发经常发生。复发或未能对化学治疗应答后，患者一般在数月内死于疾病(Schiller，2001)。具有复发SCLC患者的治疗特别具有挑战性：如果患者是铂抗性的(即疾病进展在铂方案完成后3个月内发生)，那么生存中值为3.7-4.7个月。对于铂敏感的患者，生存中值为5.8-6.9个月(Eckardt，2005)。
A.细胞增殖诱导物
诱导细胞增殖的蛋白质取决于功能进一步分成各种类别。所有这些蛋白质的共性是其调节细胞增殖的能力。例如，PDGF形式的sis致癌基因是分泌型生长因子。致癌基因很少由编码生长因子的基因产生，且目前sis是唯一已知的天然存在的致癌生长因子。
蛋白质fms、erbA、erbB和neu是生长因子受体。这些受体的突变导致可调节功能丧失。例如，影响nue受体蛋白的跨膜结构域的点突变导致nue致癌基因。erbA致癌基因来源于甲状腺激素的细胞内受体。修饰的致癌erbA受体被认为与内源性甲状腺激素受体竞争，导致不受控制的生长。
最大类的致癌基因是信号转导蛋白(例如src、abl和ras)，是信号转导物。蛋白质src是细胞质蛋白质酪氨酸激酶，且在某些情况下其从原癌基因到致癌基因的转化经由第527位的酪氨酸残基突变产生。相反，在一个例子中GTP酶蛋白质ras从原癌基因到致癌基因的转化由序列中第12位的氨基酸从缬氨酸到甘氨酸的突变产生，减少ras GTP酶活性。
蛋白质jun、fos和myc是作为转录因子直接发挥其对核功能的作用的蛋白质。表1列出了这部分中描述的各种致癌基因以及未描述的那些中的许多。
B.细胞增殖抑制剂
肿瘤抑制致癌基因发挥作用以抑制过量细胞增殖。这些基因的灭活致使破坏其抑制活性，导致不受调节的增殖。肿瘤抑制物p53、p16和C-CAM在下文得到描述。
高水平的突变型p53已在通过化学致癌作用、紫外辐射和几种病毒转化的许多细胞中发现。p53基因是广泛多样的人肿瘤中突变灭活的常见靶且已证明是常见的人癌症中最常突变的基因。它在超过50％的人NSCLC(Hollstein等人，1991)和广谱的其他肿瘤中是突变的。各种癌症已与p53基因的突变相关，所述突变导致p53肿瘤抑制物特性丧失。p53基因中的突变进一步导致发展的所有癌症中的大约50％(Vogelstein和Kinzler，1992；Levine等人，1991)，而这些突变中的大多数是单碱基错义突变(Kovach等人，1996)。已观察到导致p53功能丧失的突变还导致核和细胞质高浓度(即过量表达)的突变型p53蛋白质(Oldstone等人，1992；Finlay等人，1988)。相反，功能性野生型p53蛋白质在细胞中以非常低的水平表达。
细胞高浓度的p53突变蛋白作为癌症免疫治疗的途径最近已受到更多的关注。一般观念是引发针对在细胞表面上呈递与MHC分子结合的突变型p53肽的肿瘤细胞的免疫应答。使用突变型p53肽作为抗原的抗肿瘤应答的产生已在几项研究中得到证明(McCarty等人，1998；Gabrilovich等人，1996；Mayordomo等人，1996；Zitvogel等人，1996)。然而，这种癌症免疫治疗方法具有几个缺陷。例如p53突变可以在蛋白质中的许多不同位点上发生，使得在制备用于p53癌症治疗的特异性突变型肽之前必须鉴定每种蛋白质中的突变位点。此外，并非所有突变都包含在已知与MHC分子结合的蛋白质区域中，且因此不会引发抗肿瘤应答(DeLeo，1998)。
上述缺陷已刺激研究野生型p53序列中绝大多数肿瘤来源的p53蛋白质共有的抗原表位。野生型p53肽特异性细胞毒性T淋巴细胞已从人和鼠类应答淋巴细胞中产生，其中一些在体外和体内识别p53过量表达的肿瘤(Theobald，等人，1995；Ropke等人，1996；Nijman等人，1994；美国专利号5,747,469，特别整体引入本文作为参考)。然而，因为抗原的呈递是受MHC I类限制的，由于MHC I类肽结合位点的多态性质只有某些肽可以成功地在某些患者中施用。此外，鉴定与特定个体MHC分子库结合的所有可能的p53肽是不实际的。另外，的确与患者的MHC I类结合的肽疫苗可能不由MHC II类成功呈递，所述MHC II类是在CD4+ T细胞免疫应答诱导中关键的分子。
研究者已尝试鉴定多重p53表位，它应允许针对肿瘤细胞的更有效的免疫应答，所述肿瘤细胞表达在不同位点上具有突变的多重p53基因。这可以通过用完整的野生型p53免疫细胞来完成以利用大多数人肿瘤中过量表达的整个p53多肽。树突细胞(DC)是最适合于疫苗抗原递送的细胞类型(在本文中进一步描述)，因为它们是最有效的抗原呈递细胞，在初次和二次免疫应答刺激中有效(Steinman，1991；Celluzzi和Falo，1997)。在本发明中预期使用病毒表达构建体用野生型p53蛋白质转导树突细胞将引发对表达不同突变型p53蛋白质的各种细胞特异的有效抗肿瘤免疫应答。此外，因为p53的大多数突变是单碱基错义突变，所以本发明的方法克服了鉴定p53突变位点和后续制备用于免疫治疗的定制突变型肽的缺陷。因此，本发明的方法提供了基于免疫治疗的癌症治疗的简单且新型方法的基础。
野生型p53被公认是许多细胞类型中的重要生长调节物。错义突变是p53基因所共有的且是致癌基因的转化能力所必需的。通过点突变引起的单个遗传改变可以产生致癌p53。然而，与其他致癌基因不同，p53点突变已知在至少30个不同密码子中发生，通常造成在细胞表型中产生变化而不减少纯合性的显性等位基因。另外，这些显性阴性等位基因中的许多似乎在生物中是耐受的且在种系中传递。各种突变体等位基因似乎从最低限度的功能异常到强渗透的显性阴性等位基因(Weinberg，1991)。
另一种细胞增殖抑制剂是p16。真核细胞周期的主要转变由依赖细胞周期蛋白的激酶或CDK触发。一种CDK即依赖细胞周期蛋白的激酶4(CDK4)调节通过G1的过程。这种酶的活性可以是在G1晚期使Rb磷酸化。CDK4的活性受激活亚单位D型细胞周期蛋白控制，并且通过抑制亚单位控制，p16INK4已在生物化学上表征为与CDK4特异性结合且抑制CDK4的蛋白质，且因此可以调节Rb磷酸化(Serrano等人，1993；Serrano等人，1995)。因为p16INK4蛋白质是CDK4抑制剂(Serrano，1993)，所以这种基因的缺失可以增加CDK4的活性，导致Rb蛋白质的高度磷酸化。p16还已知调节CDK6的功能。
p16INK4属于新近描述的CDK抑制蛋白质种类，所述CDK抑制蛋白质还包括p16B、p21WAF1和p27KIP1。p16INK4基因位于9p21(在许多肿瘤类型中经常缺失的染色体区域)。p16INK4基因的纯合缺失和突变在人肿瘤细胞系中很频繁。这种证据暗示p16INK4基因是肿瘤抑制基因。然而，这种解释已受到p16INK4基因改变的频率在原发性未培养的肿瘤中比培养的细胞系中低得多的事实挑战(Caldas等人，1994；Cheng等人，1994；Hussussian等人，1994；Kamb等人，1994；Kamb等人，1994；Mori等人，1994；Okamoto等人，1994；Nobori等人，1995；Orlow等人，1994；Arap等人，1995)。通过用质粒表达载体转染恢复野生型p16INK4功能减少了某些人癌细胞系的集落形成(Okamoto，1994；Arap，1995)。
C-CAM基本上在所有上皮细胞中表达(Odin和Obrink，1987)。表观分子量为105kD的C-CAM最初通过其与中和细胞聚集的特异性抗体反应从大鼠肝细胞的质膜中分离(Obrink，1991)。近期研究指出C-CAM在结构上属于免疫球蛋白(Ig)超家族且其序列与癌胚抗原(CEA)高度同源(Lin和Guidotti，1989)。使用杆状病毒表达系统，Cheung等人，(1993)显示C-CAM的第一个Ig结构域对细胞粘附活性是关键的。
细胞粘附分子或CAM已知涉及调节器官发育和细胞分化的复杂的分子网络相互作用(Edelman，1985)。近期数据指出CAM的异常表达可能涉及几种赘生物的肿瘤发生；例如，在上皮细胞中占优势地表达的E钙粘蛋白的表达减少与几种赘生物的进展有关(Edelman和Crossin，1991；Frixen等人，1991；Bussemakers等人，1992；Matsura等人，1992；Umbas等人，1992)。同样，Giancotti和Ruoslahti(1990)证实通过基因转移增加α5β1整合素的表达可以在体内减少中国仓鼠卵巢细胞的致肿瘤性。C-CAM现在已显示在体外和体内抑制肿瘤生长。
可以根据本发明使用的其他肿瘤抑制物包括RB、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zacl、p73、VHL、MMAC1、FCC和MCC(参见表1)。
C.编程性细胞死亡调节物
凋亡或编程性细胞死亡是对于正常胚胎发育，维持成人组织中的稳态，和抑制致癌作用必需发生的过程(Kerr等人，1972)。Bcl-2蛋白质家族和ICE样蛋白酶已证实是其他系统中的重要的凋亡调节物和效应物。与滤泡性淋巴瘤相联系发现的Bcl-2蛋白质在响应不同凋亡刺激的凋亡控制和细胞存活增强中起显著作用(Bakhshi等人，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等人，1986；Tsujimoto等人，1985；Tsujimoto和Croce，1986)。进化上保守的Bcl-2蛋白质现在已识别为可以归类为死亡激动剂或死亡拮抗剂的关联蛋白家族成员。
在其发现后，显示Bcl-2发挥作用以抑制通过各种刺激触发的细胞死亡。同样，目前显而易见的是存在分享共同结构和序列同源性的Bcl-2细胞死亡调节蛋白家族。这些不同的家族成员已显示具有与Bcl-2类似的功能(例如BclXL、BclW、Mcl-1、A1、Bfl-1)或抵制Bcl-2功能且促进细胞死亡(例如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。
表1：致癌基因
Figure A20068002557600351
Figure A20068002557600361
Figure A20068002557600371
Figure A20068002557600381
Figure A20068002557600391
Figure A20068002557600401
VII.与自身基因致肿瘤性相关的免疫应答
在本发明的一个实施方案中，其中自身基因表达在治疗抗性过度增殖细胞中上调的过度增殖性疾病通过施用能够引发抗自身基因应答的自身基因表达构建体来治疗。自身基因p53在本文中将仅作为示例性实施方案提及。
将p53表达构建体递送至给定抗原呈递细胞后，免疫事件级联必须跟着发生以刺激所需抗p53应答。因此，与p53表达有关的免疫应答，且更一般地过度增殖性疾病中自身基因表达的基本了解是必需的。
A.细胞毒性T淋巴细胞
T淋巴细胞起于骨髓中的造血干细胞，且移动到胸腺成熟。T细胞在其膜上表达独特的抗原结合受体(T细胞受体)，所述受体可以只识别与其他细胞表面上的主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。存在至少2种T细胞群体，称为T辅助细胞和T细胞毒性细胞。T辅助细胞和T细胞毒性细胞主要通过其分别显示的膜结合糖蛋白CD4和CD8来区分。T辅助细胞分泌各种淋巴因子，所述淋巴因子对B细胞、T细胞毒性细胞、巨噬细胞和免疫系统的其他细胞激活是关键的。相反，识别抗原-MHC复合物的T细胞毒性细胞增殖且分化成称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的效应细胞。CTL通过产生导致细胞裂解的物质来消灭展示抗原的机体细胞，例如病毒感染细胞和肿瘤细胞。
本发明的一个重要方面是刺激针对野生型自身基因抗原的CTL应答。已观察到p53基因的突变导致肿瘤细胞中过量表达突变型p53蛋白质(Harris，1996)，而野生型p53在正常细胞以低水平表达。已进一步证实野生型和突变型p53肽可以刺激针对表达p53抗原肽的肿瘤细胞的CTL应答(DeLeo，1998；Mayordomo等人，1996)。在本发明中预期类似的抗自身基因CTL应答将通过用完整野生型自身基因多肽免疫树突细胞得到刺激，且因此可以用作过度增殖性疾病的治疗。
B.抗原呈递细胞
抗原呈递细胞包括巨噬细胞、B淋巴细胞和树突细胞，通过其表达的特定MHC分子来区分。APC使抗原内在化并再表达连同其外细胞膜上的MHC分子一起的那种抗原的部分。
在本发明的一个优选实施方案中，树突细胞是选择用于自身基因递送和抗原呈递的抗原呈递细胞。树突细胞是最有效的抗原呈递细胞用于起始抗原特异性T细胞激活(Arthur等人，1997)。它们还是短期培养和各种基因转移方法(例如，DNA/脂质体复合物、电穿孔、CaPO4沉淀和重组腺病毒)的极佳候选物(Arthur等人，1997)。人和小鼠树突细胞已成功地通过腺病毒基因转移进行修饰(Sonderbye等人，1998)。在本研究中，腺病毒(AdLacZ)用于在树突细胞中表达细胞内β半乳糖苷酶(β-gal)抗原，大约40％用AdLacZ转导的细胞表达高水平的β-gal。此外，用卵白蛋白(OVA)肽皮下免疫接种小鼠树突细胞诱导OVA特异性CD8+CTL应答(Celluzzi和Falo，1997)。
C.主要组织相容性复合物
主要组织相容性复合物(MHC)是具有多重基因座的大遗传复合物。MHC基因座编码2个主要种类的MHC膜分子，称为I类和II类MHC。T辅助淋巴细胞一般识别与MHC II类分子结合的抗原，且T细胞毒性淋巴细胞识别与MHC I类分子结合的抗原。在人中，MHC称为HLA复合物而在小鼠中称为H-2复合物。本发明的一个重要方面是用完整的野生型自身基因免疫接种树突细胞以利用大多数人肿瘤中相对过量表达的整个自身基因分子。在一个实施方案中考虑p53免疫治疗方法以胜过用突变型p53肽作为抗原免疫动物的先前免疫治疗(Gabrilovich等人，1996；Mayordomo等人，1996；Zitgovel等人，1996)。尽管使用突变型p53肽的上述方法在产生抗肿瘤应答方面是有效的，但它们具有几个缺陷。例如，p53突变及其他自身基因在蛋白质中的许多位点上发生，使得在构建用于治疗的定制突变型肽之前必须鉴定每种蛋白质中的突变位点。此外，并非所有突变都包含在已知与MHC分子结合的蛋白质区域中。在使用野生型p53肽的另一项研究中，CTL从人和鼠类应答淋巴细胞中产生，其中一些在体外识别p53过量表达的肿瘤(Theobald，等人，1995；Ropke等人，1996；Nijman等人，1994)。然而，因为抗原的呈递是受MHC I类限制的，由于高度多态的MHC I类肽结合位点只有某些寡肽可以在某些患者中使用。在本发明中预期用完整的野生型自身基因蛋白质免疫树突细胞将产生各种自身基因抗原用于MHC I类呈递，且从而有效刺激细胞溶解性T淋巴细胞应答。
VIII.关于自身基因上调或改变表达的测定法
在本发明的一个实施方案中，具有治疗抗性过度增殖性疾病的患者的鉴定是需要的，在所述过度增殖性疾病中自身基因表达是上调的。在具有治疗抗性过度增殖性疾病的患者中，例如高度增殖组织的样品将用于测定上调。在某些实施方案中，广泛多样的检测方法可以在本发明的某些实施方案中用于检测至少一种治疗抗性细胞的自身基因状态。存在例如针对致癌蛋白质的众多抗体，且因此利用抗体用于检测的任何测定法例如ELISA、蛋白质印迹法、免疫测定技术等预期在本发明中是有用的。可替代地，使用核苷酸探针的测定法可以用于鉴定自身基因的存在，例如DNA印迹法、RNA印迹法或PCRTM技术。所有上述技术是本领域技术人员众所周知的，且无需不适当的实验即可在本发明中使用。
A.ELISA、免疫测定法和免疫组织学测定法。
在本发明的一个具体实施方案中，免疫组织学测定法用于检测在治疗抗性肿瘤样品(例如，组织切片)中自身基因的表达增加或改变。免疫组织化学测定法和免疫荧光测定法的示例性方法先前已得到描述(美国专利号5,858,723；WO94/11514，特别整体引入本文作为参考)。本发明包含的更多免疫测定法包括但不限于美国专利号4,367,110(双单克隆抗体夹心测定法)和美国专利号4,452,901(蛋白质印迹法)中描述的那些。其他测定法包括体外和体内标记配体的免疫沉淀和免疫细胞化学。免疫测定法一般是结合测定法。某些优选免疫测定法是本领域已知的各种类型的酶联免疫吸附测定法(ELISA)和放射免疫测定法(RIA)。
在一种示例性ELISA中，抗自身基因抗体被固定在所选表面上，例如聚苯乙烯微量滴定板的孔、浸渍片或柱载体。随后，将怀疑包含所需抗原的测试组合物例如临床样品加入孔中。结合和洗涤以去除非特异性结合的免疫复合物后，可以检测结合抗原。检测一般通过添加对所需抗原特异的另一种抗体来完成，所述另一种抗体与可检测标记连接。这种类型的ELISA称为“夹心ELISA”。检测还可以通过添加对所需抗原特异的第二种抗体，随后添加对第二种抗体具有结合亲和力的第三种抗体来完成，而所述第三种抗体与可检测标记连接。
B.DNA和RNA印迹技术
DNA和RNA印迹法是分子生物学中的常用技术且完全在本领域技术人员的掌握中。DNA和RNA印迹样品从过度增殖组织获得。来自测试细胞的DNA和RNA在阳离子螯合剂例如EDTA的存在下通过温和细胞破碎来回收。蛋白质和其他细胞碎片通过与饱和苯酚或苯酚/氯仿混合且离心乳状液来去除。DNA和RNA在上层水相中，它是脱去蛋白质的且与乙醇混合。这种溶液允许DNA和RNA沉淀，DNA和RNA随后可以通过离心回收。在RNA提取的情况下，需要RNA酶抑制剂例如DEPC以防止RNA降解。
在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中电泳是分离DNA和RNA分子的最通常方法。DNA印迹法将证实自身基因编码DNA的身份。这通过将DNA从完整凝胶转移到硝化纤维纸上来完成。硝化纤维纸随后在缓冲液中进行洗涤，所述缓冲液具有例如包含与野生型自身基因DNA互补的序列的放射标记cDNA。探针与编码自身基因区域的DNA特异性结合，且可以使用放射自显影术通过使探测的硝化纤维纸与照相胶片接触进行检测。自身基因编码mRNA可以以类似方法通过称为RNA印迹的方法进行检测。关于缓冲液凝胶制备、电泳条件等的更详细描述，技术人员可以参考Sambrook，1989。
C.聚合酶链式反应(PCRTM)
PCRTM是现代分析生物学中的有力工具。设计长度通常为15-35bp的短寡核苷酸序列，与待扩增的自身基因序列任一侧的侧翼区域同源。在缓冲液、酶和游离核苷酸的存在下向来源DNA中加入过量引物。来源DNA在95℃变性且随后冷却至50-60℃以允许引物退火。对于延伸期，温度调整至适合于聚合酶的最佳温度。这个循环重复25-40次。
特别地本发明使用PCRTM检测细胞的自身基因状态。自身基因中的突变首先用单链构象多态性(SSCP)进行检测，所述SSCP基于由点突变诱导的单链DNA分子中的构象变化，或其他形式的轻度核苷酸变化的电泳测定。为了鉴定突变位于自身基因内的什么地方，每个外显子通过PCRTM使用对特定外显子特异的引物分开扩增。扩增后，PCRTM产物被变性且在聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，以检测由于构象变化的迁移率改变，所述构象变化由于基因中的点突变或其他小核苷酸变化而产生。突变导致DNA物理构象中的变化以及分子电荷中的变化。因此在电泳过程中，当对分子施加电荷时，与野生型比较在形状和电荷方面略微不同的DNA将以不同速率移动且因此占据凝胶中的不同位置。测定哪个DNA片段包含突变后，特异性核苷酸变化通过扩增的PCRTM产物的DNA测序进行检测。线状DNA的测序以核苷酸在完整分子中装配的顺序将DNA分子分解成其个别核苷酸。通过在测序胶上电泳分离个别核苷酸允许检测与野生型比较的个别核苷酸变化，且用于测定突变的纯合或杂合性，这通过测序胶中的单一条带或双重条带的出现容易区分。
IX.自身基因递送
许多癌症类型已与致癌基因中的突变相关。这些突变一般导致肿瘤细胞中的突变型自身基因蛋白质过量表达。已进一步显示野生型p53肽特异性细胞毒性T淋巴细胞从人和鼠类应答淋巴细胞中产生，且在体外识别p53过量表达的肿瘤(Theobald，等人，1995；Ropke等人，1996；Nijman等人，1994)。在其他方面，癌症对一种或多种治疗的抗性与自身基因产物的活性和/或表达相关，例如其过量表达。本发明预期通过引发针对在其表面上呈递自身基因抗原的细胞的抗自身基因免疫应答来体内治疗过度增殖性疾病。在本发明的某些实施方案中，包含在真核细胞中可操作的启动子控制下的自身基因的表达构建体被施用并在树突细胞中表达，以便引发针对例如p53的免疫应答。
A.病毒转化
1.腺病毒感染
用于递送重组DNA的一种方法涉及腺病毒表达载体的使用。尽管腺病毒载体已知具有整合到基因组DNA中的低能力，但这个特征被这些载体提供的高效率基因转移弥补。“腺病毒表达载体”意欲包括包含腺病毒序列的那些构建体，所述腺病毒序列足以(a)支持构建体的包装和(b)最终表达已在其中克隆的重组基因构建体。
载体包含遗传改造形式的腺病毒。腺病毒遗传结构的了解-36kb、线性、双链DNA病毒，允许用高达7kb的外源序列替换大片段的腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz，1992)。与逆转录病毒相反，宿主细胞的腺病毒感染不会导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以以游离方式复制而无潜在的遗传毒性。同样，腺病毒在结构上是稳定的，且在广泛扩增后没有检测到基因组重排。
因为其中等大小的基因组、易于处理、高滴度、广泛的靶细胞范围和高传染性，所以腺病毒特别适合于用作基因转移载体。病毒基因组的2个末端都包含100-200个碱基对的反向重复(ITR)序列，这是病毒DNA复制和包装所需的顺式元件。基因组的早期(E)和晚期(L)区域包含通过病毒DNA复制开始分开的不同转录单位。E1区(E1A和E1B)编码负责病毒基因组转录调节的蛋白质和少数细胞基因。E2区(E2A和E2B)的表达导致合成用于病毒DNA复制的蛋白质。这些蛋白质涉及DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭(Renan，1990)。晚期基因产物包括大多数病毒衣壳蛋白仅在通过主要晚期启动子(MLP)产生的单一原始转录物显著加工后表达。MLP(位于16.8m.u.)在感染晚期时特别有效，且由这种启动子产生的所有mRNA都具有5′-三联先导(TPL)序列，这使得它们成为用于翻译的优选mRNA。
在目前系统中，重组腺病毒由穿梭载体和前病毒(provirus)载体之间的同源重组产生。由于2种前病毒载体之间的可能重组，野生型腺病毒可以由这个过程产生。因此，从个别斑块分离单个病毒克隆且检查其基因组结构是关键的。
复制缺陷的目前腺病毒载体的产生和繁殖依赖于命名为293的独特辅助细胞系，所述辅助细胞系通过Ad5DNA片段由人胚肾细胞转化，且组成性表达E1蛋白质(Graham等人，1977)。因为E3区对于腺病毒基因组是可有可无的(Jones和Shenk，1978)，所以目前的腺病毒载体在293细胞的帮助下，在E1、D3或2个区域中携带外源DNA(Graham和Prevec，1991)。在自然界中，腺病毒可以包装大约105％的野生型基因组(Ghosh-Choudhury等人，1987)，提供了额外的约2kb DNA的容量。与E1和E3区中可替换的大约5.5kb DNA组合，目前腺病毒载体的最大容量在7.5kb之下，或载体全长的约15％。超过80％的腺病毒基因组保留在载体主链中。
辅助细胞系可以来源于人细胞，例如人胚肾细胞、肌细胞、造血细胞或其他人胚间充质细胞或上皮细胞。可替代地，辅助细胞可以来源于允许人腺病毒的其他哺乳动物种类的细胞。此类细胞包括例如非洲绿猴肾细胞(vero cell)或其他猴胚间充质细胞或上皮细胞。如上所述，优选的辅助细胞系是293。
Racher等人(1995)已公开了用于培养293细胞和繁殖腺病毒的改进方法。在一种形式中，天然细胞集合物通过将个别细胞接种到包含100-200ml培养基的1升硅化处理的转瓶(Techne，Cambridge，UK)中进行培养。在40rpm下搅拌后，细胞存活力用台盼蓝进行评估。在另一种形式中，Fibra-Ce微载体(Bibby Sterlin，Stone，UK)(5g/l)如下使用。向250ml锥形瓶中的载体(50ml)加入在5ml培养基中重悬浮的细胞接种物，且保持稳定1-4小时，偶尔搅动。培养基随后用50ml新鲜培养基替换，且开始振荡。对于病毒生产，细胞被允许生长至约80％汇合，这之后培养基被替换(至25％的最终体积)且以0.05MOI加入腺病毒。培养物静置过夜，随后体积增加至100％且开始振荡另外72小时。
腺病毒载体可以是复制缺陷的，或至少条件缺陷，不认为腺病毒载体的性质对于本发明成功实践是关键的。腺病毒可以是42种不同的已知血清型或亚群A-F中的任何一种。C亚群的5型腺病毒是优选原材料以便获得用于在本发明中使用的条件复制缺陷的腺病毒载体。这是因为5型腺病毒是人腺病毒，关于它的大量生物化学和遗传信息是已知的，并且它在历史上已用于使用腺病毒作为载体的大多数构建体。
如上所述，根据本发明的一般载体是复制缺陷的且将不具有腺病毒E1区。因此，在E1编码序列已从其中去除的位置上引入转化构建体是最方便的。然而，构建体在腺病毒序列内的插入位置对于本发明不是关键的。编码目的基因的多核苷酸也可以如Karlsson等人(1986)所述插入E3置换载体中替代缺失的E3区，或当辅助细胞系或辅助病毒补足E4缺陷时插入E4区中。
腺病毒的生长和处理是本领域技术人员已知的，且显示体外和体内的广泛宿主范围。这群病毒可以以高滴度获得，例如109-1011空斑形成单位/ml，且它们是高度传染性的。腺病毒的生活周期不需要整合到宿主细胞基因组内。由腺病毒载体递送的外源基因是游离的，且因此对宿主细胞具有低遗传毒性。在用野生型腺病毒疫苗接种的研究中没有报道副作用(Couch等人，1963；Top等人，1971)，显示了其作为体内基因转移载体的安全性和治疗可能性。
腺病毒载体已在真核基因表达(Levrero等人，1991；Gomez-Foix等人，1992)和疫苗开发(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)中使用。动物研究已暗示重组腺病毒可以用于基因治疗(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等人，1990；Rich等人，1993)。给不同组织施用重组腺病毒的研究包括气管滴注(Rosenfeld等人，1991；Rosenfeld等人，1992)、肌肉注射(Ragot等人，1993)、外周静脉内注射(Herz和Gerard，1993)和功能区定位接种到脑内(Le Gal LaSalle等人，1993)。
2.逆转录病毒感染
逆转录病毒是单链RNA病毒，其特征在于通过逆转录过程在受感染细胞中将其RNA转换成双链DNA的能力(Coffin，1990)。所得到的DNA随后作为前病毒稳定整合到细胞染色体内且指导病毒蛋白质的合成。整合导致病毒基因序列保留在受体细胞及其后代中。逆转录病毒基因组包含分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分的3种基因gag、pol和env。在gag基因上游发现的序列包含用于将基因组包装成病毒粒子的信号。2个长末端重复(LTR)序列存在于病毒基因组的5′和3′末端。这些包含强启动子和增强子序列且同样是整合到宿主细胞基因组中所需的(Coffin，1990)。
为了构建逆转录病毒载体，将编码目的基因的核酸插入病毒基因组内代替某些病毒序列以产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒粒子，构建包含gag、pol和env基因但不含LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等人，1983)。当包含cDNA连同逆转录病毒LTR和包装序列的重组质粒引入这种细胞系内(通过例如磷酸钙沉淀)时，包装序列允许重组质粒的RNA转录物被包装成病毒颗粒，所述病毒颗粒随后分泌到培养基内(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等人，1983)。随后收集包含重组逆转录病毒的培养基，任选浓缩，且用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染广泛多样的细胞类型。然而，整合和稳定表达要求宿主细胞分裂(Paskind等人，1975)。
对于缺陷型逆转录病毒载体使用的担心是在包装细胞中可能出现野生型可复制病毒。这可以起因于其中来自重组病毒的完整序列插入宿主细胞基因组中整合的gag、pol、env序列上游的重组事件。然而，可以利用应极大减少重组可能性的包装细胞系(Markowitz等人，1988；Hersdorffer等人，1990)。
3.AAV感染
腺伴随病毒(AAV)是用于在本发明中使用的吸引人的载体系统，因为它具有高整合效率并且它可以感染未分裂细胞，从而使得它能够用于将基因递送到组织培养中的哺乳动物细胞内(Muzyczka，1992)。AAV具有用于传染的广泛宿主范围(Tratschin，等人，1984；Laughlin，等人，1986；Lebkowski，等人，1988；McLaughlin，等人，1988)，这意味着它适合与本发明一起使用。关于产生和使用rAAV载体的细节在美国专利号5,139,941和美国专利号4,797,368中描述，所述专利各自引入本文作为参考。
显示AAV在基因递送中的用途的研究包括LaFace等人，(1988)；Zhou等人，(1993)；Flotte等人，(1993)；和Walsh等人，(1994)。重组AAV载体已成功用于标记基因的体外和体内转导(Kaplitt等人，1994；Lebkowski等人，1988；Sarnulski等人，1989；Shelling和Smith，1994；Yoder等人，1994；Zhou等人，1994；Hermonat和Muzyczka，1984；Tratschin等人，1985；McLaughlin等人，1988)和参与人类疾病的基因的体外和体内转导(Flotte等人，1992；Luo等人，1994；Ohi等人，1990；Walsh等人，1994；Wei等人，1994)。近来，AAV载体已批准用于囊性纤维化治疗的I期人试验。
AAV是依赖性细小病毒，因为它需要与另一种病毒(腺病毒或疱疹病毒家族成员)一起共感染以在培养细胞中进行增殖性感染(Muzyczka，1992)。在不存在与辅助病毒共感染的情况下，野生型AAV基因组通过其末端整合到人染色体19内，在其中它作为前病毒以潜伏状态存在(Kotin等人，1990；Samulski等人，1991)。然而，对于整合rAAV并不限制于染色体19，除非AAV Rep蛋白质也表达(Shelling和Smith，1994)。当携带AAV前病毒的细胞用辅助病毒超感染时，AAV基因组从染色体或重组质粒中“被救出”，且建立正常增殖性感染(Samulski等人，1989；McLaughlin等人，1988；Kotin等人，1990；Muzyczka，1992)。
一般地，重组AAV(rAAV)病毒通过共转染包含侧翼为2个AAV末端重复序列的目的基因的质粒(McLaughlin等人，1988；Samulski等人，1989；各自引入本文作为参考)和包含无末端重复序列的野生型AAV编码序列的表达质粒例如pIM45(McCarty等人，1991；引入本文作为参考)进行制备。细胞还用腺病毒或携带AAV辅助功能所需的腺病毒基因的质粒感染或转染。以这种方式制备的rAAV病毒原液用腺病毒污染，所述腺病毒必须与rAAV颗粒物理分开(例如，通过氯化铯密度离心)。可替代地，可以使用包含AAV编码区的腺病毒载体、或包含AAV编码区以及部分或全部腺病毒辅助基因的细胞系(Yang等人，1994a；Clark等人，1995)。也可以使用携带作为整合前病毒的rAAV DNA的细胞系(Flotte等人，1995)。
4.其他病毒载体
其他病毒载体可以在本发明中用作构建体。可以使用来源于病毒例如痘苗病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等人，1988)和疱疹病毒的载体。它们提供了用于各种哺乳动物细胞的几种吸引人的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等人，1988；Horwich等人，1990)。可替代地，可以使用α病毒载体和复制子(Leitner等人，2000；Caley等人，1999)。
委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒的分子克隆株已在遗传上改进为可复制的疫苗载体用于表达异源病毒蛋白质(Davis等人，1996)。研究已证实VEE感染刺激有效的CTL应答且已暗示VEE可能是用于免疫接种的非常有用的载体(Caley等人，1997)。在本发明中预期VEE病毒可以在靶向树突细胞中有用。
对于近期识别的缺陷型乙型肝炎病毒，在不同病毒序列的结构-功能关系中获得新理解。体外研究显示尽管其缺失高达80％的基因组，该病毒仍可保留辅助依赖性包装和逆转录作用的能力(Horwich等人，1990)。这暗示大部分基因组可以用外源遗传材料替换。Chang等人近期将氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因引入鸭乙型肝炎病毒内代替聚合酶、表面和前表面编码序列。它与野生型病毒一起共转染到禽类肝癌细胞系内。包含高滴度重组病毒的培养基用于感染雏鸭原代肝细胞。稳定的CAT基因表达在转染后至少24天检测到(Chang等人，1991)。
在本发明的再进一步的实施方案中，待递送的核酸置于感染性病毒内，所述感染性病毒已改造为表达特异性结合配体。病毒颗粒将因此与靶细胞的相关受体特异性结合且将组分递送给细胞。最近基于逆转录病毒的化学修饰通过给病毒包膜化学添加乳糖残基开发了设计为允许逆转录病毒载体特异性靶向的新型方法。这种修饰可以允许经由唾液酸糖蛋白受体特异性感染肝细胞。
设计了重组逆转录病毒靶向的另一种方法，其中使用针对逆转录病毒包膜蛋白和针对特异性细胞受体的生物素化抗体。抗体经由生物素组分通过使用链霉亲和素偶联(Roux等人，1989)。使用针对主要组织相容性复合物I类和II类抗原的抗体，他们显示用亲嗜性病毒体外感染了携带表面抗原的各种人细胞(Roux等人，1989)。
B.非病毒递送
除了自身基因的病毒递送之外，下列是将重组基因递送至给定宿主细胞的另外方法，且因此在本发明中预期。
1.电穿孔
在本发明的某些优选实施方案中，基因构建体经由电穿孔引入树突细胞内。电穿孔涉及使细胞和DNA的悬浮液暴露于高压放电。
使用电穿孔转染真核细胞已是相当成功的。以这种方式小鼠前B淋巴细胞已用人κ免疫球蛋白基因转染(Potter等人，1984)，且大鼠肝细胞已用氯霉素乙酰转移酶基因转染(Tur-Kaspa等人，1986)。
预期对于来自不同来源的树突细胞的电穿孔条件可以进行优化。可能特别希望优化此类参数如电压、电容、时间和电穿孔介质组成。其他常规调整的实行将是本领域技术人员已知的。
2.粒子轰击
用于将裸露DNA构建体转移到细胞内的本发明的另一实施方案涉及粒子轰击。这种方法依赖于使DNA包被的微粒加速到高速允许它们穿透细胞膜且进入细胞而不是杀死细胞的能力(Klein等人，1987)。使用的微粒已由生物学惰性物质例如钨、铂或金珠组成。
在某些情况下预期DNA沉淀在金属颗粒上不是使用粒子轰击将DNA递送给受体细胞所必需的。预期颗粒可以包含DNA而不是由DNA包被。因此提出DNA包被的颗粒可以增加经由粒子轰击的DNA递送水平，但不是自身和自然所必需的。
用于使小颗粒加速的几种装置已得到开发。一种此类装置依赖高压放电以产生电流，所述电流依次提供动力(Yang等人，1990)。另一种方法涉及使用Biolistic Particle Delivery System，它可以用于通过滤网例如不锈钢或Nytex滤网推进由DNA包被的颗粒，所述滤网在由悬浮液中的细胞覆盖的过滤器表面上。滤网使颗粒分散，从而使得它们不能以大集合物递送给受体细胞。认为发射装置和待轰击细胞之间插入的滤网通过减少经由太大的发射物对受体细胞造成的损害减少发射集合物的大小且可以促成更高的转化频率。
对于轰击，悬浮液中的细胞优选在过滤器上，或可替代地在固体培养基上进行浓缩。待轰击的细胞置于巨粒(macroprojectile)停止板下方合适的距离处。必要时，一个或多个滤网同样置于加速装置和待轰击细胞之间。
在轰击转化中，可以优化轰击前培养条件和轰击参数以得到最大数目的稳定转化体。关于轰击的物理和生物学参数在这种技术中都是重要的。物理因素是涉及DNA/微粒沉淀处理的那些，或影响巨或微粒飞行或速度的那些。生物学因素包括轰击前和后不久细胞处理中涉及的所有步骤，靶细胞的渗透性调整以帮助减轻与轰击有关的创伤，以及转化DNA的性质，例如线性化DNA或完整的超螺旋质粒。认为轰击前处理对于原始生殖细胞的成功转化是特别重要的。
因此，预期可能希望在小规模研究中调整各种轰击参数以充分优化条件。可能特别希望调整物理参数例如间隙距离、飞行距离、组织距离和氦压。还可以通过修改影响受体细胞的生理学状态且因此可以影响转化和整合效率的条件来优化创伤减少因素。例如，渗透状态、组织水合和受体细胞的亚培养阶段或细胞周期可以对于最佳转化进行调整。其他常规调整的实行将是本领域技术人员已知的。
3.磷酸钙共沉淀或DEAE-葡聚糖处理
在本发明的其他实施方案中，转基因构建体使用磷酸钙共沉淀引入细胞中。小鼠原始生殖细胞已用SV40大T抗原转染，结果极佳(Watanabe等人，1997)。人KB细胞已使用这种技术用腺病毒5 DNA(Graham和Van Der Eb，1973)转染。同样以这种方式，小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3和HeLa细胞用新霉素标记基因转染(Chen和Okayama，1987)，并且大鼠肝细胞用各种标记基因转染(Rippe等人，1990)。
在另一实施方案中，表达构建体使用DEAE-葡聚糖随后为聚乙二醇递送到细胞内。以这种方式将报道质粒引入小鼠骨髓瘤和红白血病细胞内(Gopal，1985)。
4.直接显微注射或超声处理装载
本发明的进一步的实施方案包括通过直接显微注射或超声处理装载引入基因构建体。直接显微注射已用于将核酸构建体引入爪蟾卵母细胞内(Harland和Weintraub，1985)，且LTK成纤维细胞已通过超声处理装载用胸苷激酶基因转染(Fechheimer等人，1987)。
5.脂质体介导的转化
在本发明的一个进一步的实施方案中，基因构建体可以包裹在脂质体内。脂质体是特征在于磷脂双层膜和内部水介质的囊泡结构。多层脂质体具有通过水介质分开的多重脂质层。它们在磷脂悬浮于过量水溶液中时自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自身重排且在脂质双层之间包裹水和溶解的溶质(Ghosh和Bachhawat，1991)。还预期的是与Lipofectamine(Gibco BRL)或DOTAP-胆固醇制剂复合的基因构建体。
脂质体介导的核酸递送和外源DNA体外表达已非常成功(Nicolau和Sene，1982；Fraley等人，1979；Nicolau等人，1987)。Wong等人，(1980)指出在培养的鸡胚、HeLa和肝细胞瘤细胞中外源DNA的脂质体介导递送和表达的可行性。
在本发明的某些实施方案中，脂质体可以与血凝病毒(HVJ)复合。这已显示促进与细胞膜融合且促进脂质体包裹DNA的细胞进入(Kaneda等人，1989)。在其他实施方案中，脂质体可以与核非组蛋白染色体蛋白质(HMG-1)复合或与之结合使用(Kato等人，1991)。在再进一步的实施方案中，脂质体可以与HVJ和HMG-1复合或与之结合使用。
C.载体和调节信号
本发明的载体被设计为主要用在调节的真核启动子(即，诱导型、阻抑型、组织特异型)控制下的自身基因转化树突细胞。同样，载体通常将包含可选标记(如果没有其他原因)，以促进其体外生产。然而，可选标记可以在重组细胞生产中起重要作用且因此启动子的讨论在本文中是有用的。下表2和表3分别列举了诱导型启动子元件和增强子元件。
表2-可诱导元件
  元件   诱导物   参考文献
  MT II   佛波酯(TPA)重金属   Palmiter等人，1982；Haslinger和Karin，1985；Searle等人，1985；Stuart等人，1985；Imagawa等人，1987；Karin等人，1987；Angel等人，1987b；McNeall等人，1989
  MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)   糖皮质激素   Huang等人，1981；Lee等人，1981；Majors和Varmus，1983；Yamamoto等人，1983；Lee等人，1984；Ponta等人，1985；Si.e.，i等人，1986
  β-干扰素   聚(rI)X聚(rc)   Tavernier等人，1983
  腺病毒5 E2   Ela   Imperiale和Nevins，1984
  胶原酶   佛波酯(TPA)   Angel等人，1987a
  溶基质素   佛波酯(TPA)   Angel等人，1987b
  SV40   佛波酯(TFA)   Angel等人，1987b
  鼠MX基因   干扰素，新城疫病毒   Hug等人，1988
  GRP78基因   A23187   Resendez等人，1988
  α-2-巨球蛋白   IL-6   Kunz等人，1989
  波形蛋白   血清   Rittling等人，1989
  MHC I类基因H-2κb   干扰素   Blanar等人，1989
  HSP70   Ela，SV40大T抗原   Taylor等人，1989；Taylor和Kingston，1990a，b
  增殖素   佛波酯-TPA   Mordacq和Linzer，1989
  肿瘤坏死因子   PMA   Hensel等人，1989
  促甲状腺激素α基因   甲状腺激素   Chatterjee等人，1989
表3-其他启动子/增强子元件
Figure A20068002557600561
  启动子/增强子   参考文献
  小鼠或I型胶原   Rippe等人，1989
  葡萄糖调节蛋白(GRP94和GRP78)   Chang等人，1989
  大鼠生长激素   Larsen等人，1986
  人血清淀粉样蛋白A(SAA)   Edbrooke等人，1989
  肌钙蛋白I(TN I)   Yutzey等人，1989
  血小板衍生生长因子   Pech等人，1989
  杜氏肌营养不良   Klamut等人，1990
  SV40   Banerji等人，1981；Moreau等人，1981；Sleigh和Lockett，1985；Firak和Subramanian，1986；Herr和Clarke，1986；Imbra和Karin，1986；Kadesch和Berg，1986；Wang和Calame，1986；Ondek等人，1987；Kuhl等人，1987 Schaffner等人，1988
  多瘤   Swartzendruber和Lehman，1975；Vasseur等人，1980；Katinka等人，1980，1981；Tyndell等人，1981；Dandolo等人，1983；Hen等人，1986；Si.e.，i等人，1988；Campbell和Villarreal，1988
  逆转录病毒   Kriegler和Botchan，1983；Kriegler等人，1984a，b；Bosze等人，1986；Miksicek等人，1986；Celander和Haseltine，1987；Thiesen等人，1988；Celander等人，1988；Chol等人，1996；Reisman和Rotter，1989
  乳头状瘤病毒   Campo等人，1983；Lusky等人，1983；Spandidos和Wilkie，1983；Spalholz等人，1985；Lusky和Botchan，1986；Cripe等人，1987；Gloss等人，1987；Hirochika等人，1987，Stephens和Hentschel，1987
  乙型肝炎病毒   Bulla和Siddiqui，1988；Jameel和Siddiqui，1986；Shaul和Ben-Levy，1987；Spandau和Lee，1988
  人免疫缺陷病毒   Muesing等人，1987；Hauber和Cullan，1988；Jakobovits等人，1988；Feng和Holland，1988；Takebe等人，1988；Berkhout等人，1989；Laspia等人，1989；Sharp和Marciniak，1989；Braddock等人，1989
  细胞巨化病毒   Weber等人，1984；Boshart等人，1985；Foecking和Hofstetter，1986
  长臂猿白血病病毒   Holbrook等人，1987；Quinn等人，1989
优选用于在本发明中使用的是细胞巨化病毒(CMV)启动子。这种启动子在载体pcDNAIII中从Invitrogen商购可得，这优选用于在本发明中使用。还预期在本发明中有用的是dectin-1和dectin-2启动子。下文列出了可以与本发明组合使用的其它外病毒启动子、细胞启动子/增强子和诱导型启动子/增强子。另外任何启动子/增强子组合(按照真核启动子数据库(Eukaryotic Promoter Data Base)EPDB)也可以用于驱动编码寡糖加工酶、蛋白质折叠辅助蛋白质、可选标记蛋白质或目的异源蛋白的结构基因的表达。
使用内部核糖体结合位点(IRES)元件用于产生多基因或多顺反子信使。IRES元件能够绕开5′甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模型且在内部位点上开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。来自微小RNA病毒科的2个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及来自哺乳动物信使的IRES(Macejak和Sarnow，1991)已得到描述。IRES元件可以与异源可读框连接。多个可读框可以一起转录，各自由IRES分开，产生多顺反子信使。由于IRES元件，每个可读框易接近核糖体用于有效翻译。多基因使用单个启动子/增强子可以有效表达以转录单个信使。可能证明有用的另一种信号是多腺苷酸化信号(hGH、BGH、SV40)。
如上文讨论的，在本发明的某些实施方案中，细胞可以通过在表达构建体中包括标记在体外或体内进行鉴别和选择。此类标记对细胞给予可鉴别的变化，允许容易鉴别包含表达构建体的细胞。通常，药物选择标记的包含可以帮助克隆和选择转化体，例如给予新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin、四环素和组氨醇抗性的基因是有用的可选标记。可替代地，可以使用酶例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。
控制蛋白质编码基因在真核细胞中的转录的启动子和增强子由多个遗传元件构成。细胞结构能够聚集且整合由每个元件传达的调节信息，允许不同基因不同进展，通常是复杂模式的转录调节。
术语启动子在本文中将用于指在RNA聚合酶II的起始位点周围成簇的一群转录控制模块。关于启动子如何组织的许多观点来源于几种病毒启动子的分析，包括关于HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单位的那些。由最近工作补充的这些研究已显示启动子由分离的功能模块构成，各自由大约7-20bp DNA组成，且包含关于转录激活蛋白的一个或多个识别位点。
每个启动子中的至少一种模块发挥作用以定位关于RNA合成的起始位点。这个的最为人所知的例子是TATA盒，但在某些启动子中缺乏TATA盒，例如关于哺乳动物末端脱氧核苷酰转移酶基因的启动子和关于SV 40晚期基因的启动子，这种情况下在起始位点上的分散元件帮助固定起始位置。
另外的启动子元件调节转录起始频率。一般地，这些位于起始位点上游30-110bp区域中，尽管众多启动子近期已显示也包含起始位点下游的功能元件。元件之间的间隔是灵活的，从而使得在元件倒置或彼此相对移动时启动子功能被保留。在tk启动子中，在活性开始降低之前元件之间的间隔可以增至相隔50bp。取决于启动子，似乎个别启动子可以合作或独立地发挥作用以激活转录。
增强子最初鉴定为增加来自位于同一DNA分子远离位置上的启动子转录的遗传元件。这种经过长距离起作用的能力在原核转录调节的传统研究中几乎没有先例。后续工作显示具有增强子活性的DNA区域的组织很类似启动子。即，它们由许多个体元件构成，所述元件各自与一种或多种转录蛋白质结合。
增强子和启动子之间的基本区别是操作。增强子区域就整体而言必须能够隔开一定距离刺激转录；这无需适用于启动子区域或其组分元件。另一方面，启动子必须具有指导特定位点处和特定方向上的RNA合成起始的一种或多种元件，而增强子缺乏这些特异性。除了这种操作区别之外，增强子和启动子是非常相似的实体。
启动子和增强子具有在细胞中激活转录的相同一般功能。它们通常是重叠和邻接的，通常看起来具有非常相似的模块结构。总之，这些考虑暗示增强子和启动子是同源实体且与这些序列结合的转录激活蛋白可能以基本上相同的方式与细胞转录结构相互作用。
在任何情况下，应当理解启动子是在功能上位于基因上游时导致那种基因表达的DNA元件。本发明的大多数转基因构建体在功能上位于启动子元件下游。
X.药物组合物和自身基因递送途径
在本发明的一个优选实施方案中，预期了治疗具有其中自身基因表达是增加或改变的过度增殖性疾病受试者的方法，且在具体方面，受试者的一种或多种细胞对过度增殖性疾病的一种或多种治疗有抗性。在本发明中过度增殖性疾病或对最可能被治疗的治疗抗性是起因于自身基因中的突变和抗性过度增殖细胞中的自身基因蛋白质过量表达的那些。预期治疗的过度增殖性疾病的例子是例如肺癌，头与颈癌，乳腺癌，胰腺癌，前列腺癌，肾癌，骨癌，睾丸癌，子宫颈癌，胃肠癌，淋巴瘤，肺、结肠、乳腺和膀胱中的瘤前病变以及涉及自身基因表达的突变和上调的任何其他过度增殖性疾病。这个实施方案的一个重要方面是将自身基因腺病毒载体递送给树突细胞，用于加工和呈递自身基因抗原肽给免疫效应细胞，从而刺激抗自身基因应答。在一个实施方案中，100-300PFU/细胞的自身基因腺病毒浓度转导超过50％的树突细胞。在本发明的某一方面，递送本发明中的自身基因构建体的优选方式是经由腺病毒载体。
在本发明的一个优选实施方案中，预期了治疗具有其中p53表达上调的治疗抗性过度增殖性疾病的受试者的方法。本发明中的过度增殖性疾病及其最可能被治疗的治疗抗性是起因于p53基因中的突变和过度增殖细胞中的p53蛋白质过量表达的那些。预期治疗的过度增殖性疾病的例子是例如肺癌，头与颈癌，乳腺癌，胰腺癌，前列腺癌，肾癌，骨癌，睾丸癌，子宫颈癌，胃肠癌，淋巴瘤，肺、结肠、直肠、乳腺和膀胱中的瘤前病变以及涉及p53表达的突变和上调的任何其他过度增殖性疾病。这个实施方案的一个重要方面是将p53腺病毒载体递送给树突细胞，用于加工和呈递p53抗原肽给免疫效应细胞，从而刺激抗p53应答。在一个实施方案中，100-300PFU/细胞的p53腺病毒浓度转导超过50％的树突细胞。递送本发明中的p53腺病毒载体构建体的优选方式是经由皮内注射树突细胞，尽管其他方式也是预期的。在某些实施方案中，注射部位用趋化因子或细胞因子预处理以引发树突细胞迁移至皮内注射部位并成熟。在进一步的实施方案中，给树突细胞施用自身基因腺病毒载体包含多次皮内注射。例如，某些癌症类型的治疗可能需要3次或更多次免疫接种，每2-4周一次。树突细胞皮内注射可以进一步在肿瘤生长部位局部、区域、或远侧进行，以及例如皮下、腹膜内或注射到引流淋巴结内或附近。树突细胞的鉴定、分离和获得在本文中得到描述。
在某些实施方案中，本发明还涉及制备一种或多种自身基因腺病毒组合物用于给哺乳动物施用，所述组合物转导哺乳动物的树突细胞。对于人中治疗抗性过度增殖性疾病的治疗，预期腺病毒载体是复制缺陷的，包含在真核细胞中可操作的启动子(例如CMV IE、dectin-1、dectin-2)控制下的自身基因。还应当理解必要时本文公开的自身基因组合物可以与其他试剂以及例如各种药学活性试剂组合施用。只要组合物包含至少一种自身基因表达构建体，对于还可以包括的其他组分基本上没有限制，条件是其他组分在与树突细胞接触后不引起明显的不利效应。
佐剂是非特异性增强或加强针对抗原的免疫应答(例如CTL)的物质，且因此考虑在本发明制剂中有用。例如，霍乱毒素局部地充当粘膜佐剂用于在用CTL表位肽鼻内免疫接种树突细胞后诱导肽特异性CTL(Porgador等人，1997；Porgador等人，1998)。对树突细胞特异的几种免疫佐剂(例如MF59)及其制备先前已得到描述(Dupis等人，1998；Allison，1997；Allison，1998)。考虑了此类佐剂在本发明中的使用。在本发明的另一实施方案中，细胞因子与p53表达构建体的递送组合使用。细胞因子是分泌型低分子量蛋白质，它通过对淋巴细胞及其他免疫细胞产生各种影响来调节免疫应答的强度和持续时间。几种细胞因子已与影响树突细胞迁移至淋巴样组织(例如TNF-α)、使树突细胞加速成熟为关于T淋巴细胞的有效的抗原呈递细胞(例如GM-CSF，IL-1和IL-4)(Dupis等人，1998；Allison，1997；Allison，1998；美国专利号5,849,589，特别整体引入本文作为参考)和充当免疫佐剂(例如IL-12)(Gabrilovich等人，1996)直接关联。在本发明中预期了这些及其他细胞因子(例如FLT-3配体，CD 40)。
药学可接受的赋形剂和载体溶液的配制是本领域技术人员众所周知的，因为是开发合适的给药和治疗方案用于以各种治疗方案使用本文描述的具体组合物，包括例如皮内、肠胃外、静脉内、肌内、鼻内、瘤内、膜内、和/或口部施用和制备。
A.可注射的组合物和递送
在本发明中将自身基因腺病毒表达构建体递送给树突细胞的优选方法是经由皮内注射。然而，本文公开的药物组合物可替代地可以如美国专利号5,543,158；美国专利号5,641,515和美国专利号5,399,363(各自特别整体引入本文作为参考)中所述肠胃外、静脉内、肌内、或甚至腹膜内施用。自身基因构建体和转导的树突细胞的注射可以通过注射器或用于溶液注射的任何其他方法递送，条件是表达构建体或转导细胞可以通过注射所需特定规格的针。新型无针注射系统近期已得到描述(美国专利号5,846,233)，它具有限定用于保存溶液的安瓿室的喷嘴和用于将溶液从喷嘴中推出至递送部位的能量装置。用于在基因治疗中使用的注射器系统也已得到描述，它允许以任何深度精确地多次注射预定量的溶液(美国专利号5,846,225)。
作为游离碱或药理学可接受盐的活性化合物的溶液可以在水中与表面活性剂例如羟丙基纤维素适当混合进行制备。分散相还可以在例如甘油、液体聚乙二醇、及其混合物和油中进行制备。在普通的贮存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。适合于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散相以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散相的无菌粉末(美国专利号5,466,468，特别整体引入本文作为参考)。在所有情况下形式必须是无菌的且必须流动至存在容易注射性的程度。它在制备和贮存条件下必须是稳定的且必须针对微生物例如细菌和真菌的污染活动进行防腐。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和/或植物油的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过使用包衣例如卵磷脂、在分散相的情况下通过维持所需颗粒大小、和通过使用表面活性剂来维持。微生物活动的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂产生，例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生。
例如对于在水溶液中的肠胃外施用，必要时溶液应当是适当缓冲的且液体稀释剂首先用足够的盐或葡萄糖变得等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这方面，可以使用的无菌水介质按照本公开内容对于本领域技术人员将是已知的。例如，一个剂量可以溶解于1ml等渗NaCl溶液中且加入1000ml皮下输液中或在计划的输注位点处进行注射，(参见例如“Remington′sPharmaceutical Sciences”，第15版，第1035-1038和1570-1580页)。取决于待治疗受试者的病症，剂量中的某些变化将必然发生。在任何情况下，负责施用的人将决定关于个别受试者的合适剂量。此外，对于人施用，制剂应当满足如FDA生物制品标准办公室(FDA Officeof Biologic sstandards)要求的无菌、致热原性、一般的安全性和纯度标准。
无菌可注射溶液通过在含上文列举的各种其他成分的合适溶剂中掺入所需量的活性化合物，必要时，随后过滤灭菌来制备。一般地，分散相通过将各种已灭菌的活性成分掺入无菌媒介物来制备，所述无菌媒介物包含基本分散介质和来自上文列举那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，它们由其先前无菌过滤溶液产生活性成分加任何另外所需成分的粉末。
本文公开的组合物可以以中性或盐形式进行配制。药学可接受的盐包括酸加成盐(由蛋白质的游离氨基形成)以及由无机酸例如盐酸或磷酸形成的盐，或由此类有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。由游离羧基形成的盐也可以来源于无机碱，例如氢氧化钠、钾、铵、钙、或铁，以及此类有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式和以治疗有效的量进行施用。制剂以各种剂型例如可注射的溶液、药物释放胶囊等容易进行施用。
如本文使用的，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体等。用于药学活性物质的此类介质和试剂的使用是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的使用。补充性活性成分也可以掺入组合物中。
短语“药学可接受的”指当给人施用时不会产生过敏或类似不利反应的分子实体和组合物。包含蛋白质作为活性成分的含水组合物的制备是本领域众所周知的。一般地，此类组合物制备为可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备成在注射之前溶解或悬浮于液体中的固体形式。制剂也可以是乳化的。
B.口服组合物和递送
本文公开的药物组合物可以经由口服施用递送给动物，且像这样，这些组合物可以与惰性稀释剂或与可同化的可食用载体一起配制，或它们可以封装在硬或软壳明胶胶囊中，或它们可以压制成片剂，或它们可以直接与饮食的食物合并。
活性化合物甚至可以与赋形剂合并，且以可摄取片剂、含化片剂(buccal table)、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸等的形式使用(Mathiowitz等人，1997；Hwang等人，1998；美国专利号5,641,515；美国专利号5,580,579和美国专利号5,792,451，各自特别整体引入本文作为参考)。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可以包含下列：结合剂，如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；和甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精，或调味剂，例如薄荷、冬青油或樱桃调味料。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的材料之外它还可以包含液体载体。各种其他材料可以作为包衣存在或以其他方式修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以由虫胶、糖或两者包被。酏剂糖浆可以包含活性化合物，作为甜味剂的蔗糖，作为防腐剂的对羟苯甲酸甲酯和对羟苯甲酸丙酯，染料和调味料例如樱桃或桔子香料。当然，在任何单位剂型制备中使用的任何材料应当是药学纯的且在使用的量上基本上无毒的。此外，活性化合物可以掺入缓释制剂和配方。
一般地，这些制剂可以包含至少约0.1％或更多的活性化合物，尽管活性成分的百分比当然可以改变，且方便地可以是总制剂重量或体积的约1或2％-约60％或70％或更多。当然，每种治疗有用组合物中的活性化合物量可以以这样的方式制备，使得合适剂量将在任何给定的单位剂量的化合物中获得。因素例如溶解性、生物利用度、生物学半衰期、施用途径、产品贮存期、以及其他药理学考虑将由制备此类药物制剂领域的技术人员加以考虑，且像这样，各种剂量和治疗方案可能是希望的。
对于口服使用，本发明的组合物可以可替代地以漱口剂、洁牙剂、含化片剂、口腔喷雾剂、或舌下经口施用制剂的形式与一种或多种赋形剂合并。例如，漱口剂可以在合适溶剂例如硼酸钠溶液(Dobell′s液)中掺入所需量的活性成分来制备。可替代地，活性成分可以掺入口部溶液内例如包含硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的那些，或在洁牙剂中分散，包括：凝胶剂、糊剂、粉剂和膏剂，或以治疗有效量加入糊剂洁牙剂中，所述糊剂洁牙剂可以包括水、结合剂、研磨剂、调味剂、发泡剂、和湿润剂，或可替代地塑造成可以置于舌下或以其他方式在口中溶解的片剂或溶液形式。
C.另外的递送形式
除上述递送方法之外，下列技术也预期作为自身基因递送的可替代方法。超声促渗(sonophoresis)(即超声)作为用于增强药物渗透进入且通过循环系统的比率和功效的装置已得到使用且在美国专利号5,656,016(特别整体引入本文作为参考)中得到描述。预期的其他药物递送可替代方法是骨内注射(美国专利号5,779,708)、微芯片装置(美国专利号5,797,898)、眼制剂(Bourlais等人，1998)、经皮基质(美国专利号5,770,219和美国专利号5,783,208)、直肠递送(美国专利号5,811,128)和反馈控制递送(美国专利号5,697,899)，所述参考文献整体引入本文作为参考。
XI.免疫应答的监控
在本发明的一个实施方案中，自身基因腺病毒载体皮内施用给树突细胞。随后，树突细胞表达且呈递自身基因抗原给免疫效应细胞，从而刺激抗自身基因应答。在另一实施方案中，免疫效应细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。因此，本发明的一个重要方面是监控免疫应答特别是CTL的能力。
A.CTL测定法
细胞毒性T淋巴细胞活性可以在新分离的外周血单核细胞(PBMC)中，在由PBMC建立的植物血凝素刺激的IL-2扩增细胞系中(Bernard等人，1998)，或通过从先前免疫的受试者中分离且用被腺病毒自身基因感染的DC再刺激6天的T细胞中使用标准6小时51Cr释放微量毒性测定法进行测定。已在重定向的细胞毒性测定法中测试结肠T细胞介导穿孔素和Fas配体依赖性杀死的能力(Simpson等人，1998)。结肠细胞毒性T淋巴细胞显示Fas和穿孔素依赖性杀死。近期，已开发了利用新荧光扩增系统的体外脱氢酶释放测定法(Page等人，1998)。这种方法是敏感、快速、可重复的，且可以有利地用于混合淋巴细胞反应(MLR)。它可以容易地进一步自动化用于使用细胞膜完整性的大规模细胞毒性测试，且因此在本发明中加以考虑。在开发用于检测细胞介导的细胞毒性的另一种荧光测定法中，使用的荧光团是无毒的分子阿尔玛蓝(alamar blue)(Nociari等人，1998)。阿尔玛蓝被荧光粹灭(即低量子产量)直至发生线粒体减少，这随后导致阿尔玛蓝荧光强度显著增加(即量子产量增加)。这种测定法被报道是非常敏感、特异的，且需要比标准51Cr释放测定法明显更低数目的效应细胞。
B.抗CTL抗体
在本发明中还预期针对特异性CTL表位的抗体可以用于测定CTL免疫应答。单核白细胞的培养以及用已知激活此类细胞的标准刺激物激活已在美国专利号5,843,689(特别整体引入本文作为参考)中得到描述。培养后，细胞的等分试样与荧光团缀合的、针对特定单核亚类(例如CTL)的抗原决定簇的单克隆抗体一起孵育。孵育的等分试样在流式细胞荧光计上进行分析。预期CTL特异性单克隆抗体和荧光团缀合的单克隆抗体(例如CD8+、FasL、CD4+)的使用作为本发明中的测定法将是特别有用的。
XII.树突细胞的离体制备
在本发明的一个实施方案中，关于受试者中自身基因介导(例如p53介导)的免疫应答的方法由下列至少一种诱导：1)从受试者中获得树突细胞，2)用包含在真核细胞中可操作的启动子控制下的p53基因的腺病毒载体感染树突细胞；和3)给受试者施用p53腺病毒感染的树突细胞。预期受感染的树突细胞将p53抗原呈递给免疫效应细胞且因此刺激受试者中的抗p53应答。因此，本发明的一个重要方面是从受试者获得树突细胞或诱导前体细胞(例如单核细胞)分化成树突细胞用于由p53腺病毒载体感染，用于在过度增殖性疾病的治疗中使用。
已在实验上观察到具有某些癌症类型晚期的患者具有减少的树突细胞的功能(即，有缺陷的抗原呈递)，但这些患者通过干细胞的体外生长和刺激可以产生有功能的树突细胞(Gabrilovich等人，1997)。从癌症患者获得干细胞、通过添加粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子和IL4进行刺激以分化成树突细胞，且观察到引发比从癌症患者获得的成熟树突细胞高得多的CTL应答水平(Gabrilovich等人，1997)。因此在本发明中预期干细胞前体刺激的树突细胞分化用作离体治疗过度增殖性疾病的方法。
培养和诱导单核细胞分化成树突细胞的方法已在美国专利号5,849,589(特别整体引入本文作为参考)中得到描述。单核细胞分化成树突细胞的方法由用GM-CSF、IL-4和TNFα刺激的培养基组成。分离树突细胞的可替代方法已由Cohen等人(美国专利号5,643,786，特别整体引入本文作为参考)描述。这种方法涉及从淘选转子以至少4种流速淘选外周血样品。钙离子载体用于刺激在加工成树突细胞过程中分离的单核细胞，并且还公开了涉及再引入激活的树突细胞的疾病治疗。还可以制备预期在本发明中有用的永生的前体细胞(美国专利号5,830,682；美国专利号5,811,297，各自能别整体引入本文作为参考)。在另一例子中，制备了来源于p53生长抑制基因缺陷动物的未成熟的树突细胞系(美国专利号5,648,219，特别整体引入本文作为参考)。未成熟的树突细胞系可以进行诱导以变成能刺激T细胞增殖的活化的、永生树突细胞系，且因此考虑用于在本发明中使用。用于使用人树突细胞激活T细胞用于针对原发性和转移性前列腺癌的免疫治疗应答的方法和组合物也已得到描述(美国专利号5,788,963，特别整体引入本文作为参考)。使树突细胞在体外暴露于前列腺癌抗原后，给前列腺癌患者施用树突细胞以在体内激活T细胞应答。上述的本发明的一个重要实施方案(美国专利号5,788,963)是通过超低温保存延长人树突细胞的生存期的方法。这种方法在本发明中用于长期贮存p53腺病毒感染的树突细胞可以具有重要效用。
XIII.治疗癌症的药物和方法
在一个具体方面，本发明提供了用于治疗各种治疗抗性过度增殖性疾病的方法。治疗方法将涉及用包含目的自身基因的有效量树突细胞治疗个体。一般地，有效量描述为足够可检测和重复地改善、减少、最小化或限制疾病程度或其症状的量，包括其对一种或多种治疗的抗性。可以应用更严格的定义，包括消除、根除或治愈治疗抗性疾病。
为了杀死细胞、抑制细胞生长、抑制转移、减少肿瘤或组织大小以及以其他方式逆转或降低治疗抗性肿瘤细胞的恶性表型，使用本发明的方法和组合物，一般可以使树突细胞与治疗表达构建体接触。这可以与包含在治疗抗性过度增殖细胞的治疗中有效的其他试剂的组合物组合。这些组合物将以有效杀死或抑制细胞增殖的组合量提供。这个过程可以涉及使细胞与表达构建体和一种或多种试剂或一种或多种因子同时接触。这可以通过使细胞与包括2种试剂的单一组合物或药理学制剂接触，或使细胞与2种不同组合物或制剂同时接触来完成，其中一种组合物包括表达构建体且另一种包括第二种试剂。尽管在具体实施方案中示例性p53构建体在树突细胞中施用，但另外治疗可以在或不在树突细胞内施用，或者在或不在包含示例性p53构建体的树突细胞内施用。
可替代地，树突细胞治疗可以以数分钟至数周的间隔在其他试剂治疗之前或之后进行。在其中其他试剂和表达构建体分开应用于细胞的实施方案中，一般将确保有效时间段在每次递送时间之间不期满，从而使得试剂和表达构建体将仍能够对细胞发挥有利的组合效应。在此类情况下，预期可以使细胞或个体与两种模式在约12-24小时内互相接触，且更优选地，在约6-12小时互相接触。然而在某些情况下，可能希望显著延长用于治疗的时间段，其中在分别的施用之间经过数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
可以使用各种组合，例如下列示例性情况，其中包含自身基因产物的树突细胞是“A”且其他治疗是“B”：
A/B/A    B/A/B    B/B/A    A/A/B    A/B/B    B/A/A    A/B/B/BB/A/B/B    B/B/B/A    B/B/A/B    A/A/B/B    A/B/A/B    A/B/B/AB/B/A/A    B/A/B/A    B/A/A/B    A/A/A/B    B/A/A/A    A/B/A/AA/A/B/A
本发明的治疗表达构建体对患者的施用将遵循用于施用化学疗法的一般方案，考虑任何载体的毒性(如果有)。预期治疗循环在必要时可以重复。还预期各种标准治疗以及手术干预可以与所述树突细胞治疗组合应用。
本发明的含水组合物包含溶解或分散于药学可接受的载体或水介质中的有效量的化合物。此类组合物还可以称为接种物。短语“药学或药理学可接受的”指当给适当的动物或人施用时不会产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文使用的，“药学可接受载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。用于药学活性物质的此类介质和试剂的使用是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的使用。补充性活性成分也可以掺入组合物中。
治疗可以包括各种“单位剂量”。单位剂量定义为包含计算产生与其施用即合适途径和治疗方案相关的所需应答的预定量治疗组合物。待施用的量，以及具体途径和制剂在临床领域技术人员的技术内。同样重要的是待治疗的受试者，特别是受试者的状态和所需保护。单位剂量无需作为单次注射进行施用，还可以包含经过设定时间段的连续输注。本发明的单位剂量可以方便地用病毒构建体的蚀斑形成单位(pfu)进行描述。单位剂量为103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013pfu和更高。
优选地，患者将具有足够的骨髓功能(定义为外周粒细胞绝对计数＞2,000/mm3和血小板计数为100,000/mm3)、足够的肝功能(胆红素＜1.5mg/dl)和足够的肾功能(肌酸酐＜1.5mg/dl)。
A.基因疗法
本发明的一个优选实施方案涉及使用病毒载体将治疗基因递送给树突细胞用于治疗癌症，且这个实施方案可以涉及树突细胞/自身基因产物、其他治疗、或2种治疗。待治疗的抗性癌细胞包括肺、脑、前列腺、肾、肝、卵巢、乳腺、皮肤、胃、食管、头与颈、睾丸、结肠、子宫颈、淋巴系统和血液癌症。特别感兴趣的是非小细胞肺癌包括鳞状上皮细胞癌、腺癌和大细胞未分化癌、肿瘤抑制物、反义致癌基因、和凋亡抑制剂。
根据本发明，可以通过用病毒载体直接注射肿瘤来治疗抗性癌症。可替代地，抗性肿瘤可以使用任何合适的递送装置用载体进行输注或灌注。还考虑了对于肿瘤的局部或区域施用。最后，可以进行全身施用。适当时也可以应用连续施用，例如当肿瘤被切除且瘤床进行处理以消除残留的微观疾病时。经由注射器或导管插入的递送是优选的。此类连续灌注可以在治疗开始后发生约1-2小时至约2-6小时、至约6-12小时、至约12-24小时、至约1-2天、至约1-2周或更长时间段。一般地，经由连续输注的治疗组合物剂量将等于经由输注发生时的时间段调整由单次或多次注射产生的那种。
对于＞4cm的肿瘤，待施用的体积将是约4-10ml(优选10ml)，而对于＜4cm的肿瘤，将使用约1-3ml的体积(优选3ml)。作为单次剂量递送的多次注射包含约0.1-约0.5ml的体积。病毒颗粒可以有利地通过给肿瘤施用以大约1cm间隔隔开的多次注射来接触。
在某些实施方案中，待治疗的肿瘤至少早期可能不是可切除的。使用治疗病毒构建体的治疗由于边缘处的收缩或通过消除某些特别的侵袭部分可以增加肿瘤的可切除性。治疗后，切除术可以是可能的。切除术后的另外病毒治疗将用于消除肿瘤部位处的微观残留疾病。
关于原发性肿瘤或切除后瘤床的一般疗程将涉及多个剂量。一般的原发性肿瘤治疗涉及经过2周时间段的6次剂量应用。2周方案可以重复1次、2次、3次、4次、5次、6次或更多次。在疗程中，完成计划给药的需要可以重新评估。
B.化学疗法
癌症治疗还包括与基于化学和放射疗法的各种治疗组合。组合化学疗法包括例如顺铂(CDDP)、卡铂、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲(nitrosurea)、更生菌素、道诺红霉素、多柔比星、博来霉素、plicomycin、丝裂霉素、依托泊苷(VP16)、它莫西芬、紫杉醇、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和氨甲蝶呤、或其任何类似物或衍生物变体。
在具体实施方案中，使用上调p53表达的化学疗法。
C.放射疗法
引起DNA损害且已广泛使用的其他因素包括通常称为γ射线、X射线、和/或将放射性同位素定向递送给肿瘤细胞。也考虑了其他形式的DNA损害因子例如微波和UV照射。最可能所有这些因素对DNA、对DNA前体、对DNA复制和修复、且对染色体装配和维持造成广泛范围的损害。关于X射线的剂量范围为关于延长时间段(3至4周)的50-200伦琴日剂量到2000-6000伦琴的单次剂量。关于放射性同位素的剂量范围广泛不同，且取决于同位素的半衰期、发出放射的强度和类型、以及由赘生细胞的吸收。
术语“接触”和“暴露”当应用于细胞时，在本文在用于描述通过其治疗构建体和化学疗法或放射治疗试剂递送给靶细胞或直接与靶细胞并列放置的过程。为了达到细胞杀死或停滞，2种试剂以有效杀死细胞或预防其分裂的组合量递送给细胞。
XIV.化学疗法
在本发明的某些实施方案中，化学疗法与本发明有关。例如，受试者可以是或受试者可以变成对一种或多种特定化学疗法有抗性，和/或化学疗法可以与本发明的方法结合使用。术语“化学疗法”指使用药物治疗癌症。“化疗剂”用于指在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些试剂或药物通过其在细胞内的作用方式进行分类，例如是否对细胞周期产生影响和在哪个阶段产生影响。可替代地，试剂可以基于其直接交联DNA、插入DNA内、或通过影响核酸合成诱导染色体和有丝分裂畸变的能力进行分类。大多数化疗剂包括在下列类别内：烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制物、和亚硝基脲。
化疗剂的例子包括烷化剂例如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯例如白消安、英丙舒凡和嗪消安；氮丙啶例如benzodopa、卡波醌、美妥替哌和uredopa；吖丙啶和甲基蜜胺包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、硫替派和trimethylolomelamine；乙酰精宁(acetogenins)(特别是泡番荔枝辛(bullatacin)和bullatacinone)；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻环肽(cryptophycin)(特别是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵素(spongistatin)；氮芥例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、磷雌氮芥、异磷酰胺、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、氢氧氮芥(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥、曲洛磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲例如卡莫司汀、氯脲菌素、福替目丁、罗莫司丁、尼莫司丁和雷莫司汀；抗生素例如烯二炔(enediyne)抗生素(例如刺孢霉素，特别是刺孢霉素γI和刺孢霉素ΩI1；蒽环类药物，包括蒽环类药物A；二膦酸盐例如氯膦酸盐；埃斯波霉素A(esperamicin)；以及新制癌蛋白发色团和有关色蛋白烯二炔抗生素发色团、aclacinomysins、放射菌素、authrarnycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素、carabicin、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、更生菌素、道诺红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、cyanomorpholino-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、去甲氧正定霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素例如丝裂霉素C、霉酚酸、nogalarnycin、橄榄霉素、派来霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链唑霉素、杀结核菌素、乌苯美司、新制癌素、佐柔比星；抗代谢物例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶酰三谷氨酸、曲美沙特；嘌呤类似物例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如环胞苷、氮杂胞苷、6-氮尿苷、嘧福禄、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素例如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮、表硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充物例如frolinic acid；乙酰葡醛酸内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比山群；依达曲沙；defofamine；地美可辛；地吖醌；elformithine；依利醋铵；epothilone；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；类美坦素(maytansinoids)例如美登素和美登木素；丙米腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基肼；甲基苄肼；PSK多糖复合物)；丙亚胺；根瘤霉素；西佐喃；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素；verracurinA、杆孢菌素和anguidine)；乌拉坦；长春酰胺；氮烯咪胺；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；溴丙哌嗪；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇和多西他赛；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂配位络合物例如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺消灵；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；依立替康(例如CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DFMO)；类视黄醇例如维甲酸；卡培他滨；和上述任何的药学可接受的盐、酸或衍生物。
这个定义中还包括的是用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素试剂例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节物(SERMs)，包括例如它莫西芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟泰米芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬盐酸盐(keoxifene)、LY117018、奥那司酮、和托瑞米芬；抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，所述芳香酶调节肾上腺中的雌激素生产，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、乙酸甲地孕酮、依西美坦、formestanie、法倔唑、伏氯唑、来曲唑、和阿纳托唑；以及抗雄激素例如氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制异常细胞增殖中涉及的信号转导途径的基因表达的那些，例如PKC-α、Ralf和H-Ras；核酶例如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂；疫苗例如基因治疗疫苗和上述任何的药学可接受的盐、酸或衍生物。
FDA批准的肿瘤学药物以及批准适应症和批准日期列表，这可以在美国食品与药物管理局的环球网址上获得：
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XV.疫苗及其他药物组合物和施用
A.疫苗
本发明包括用于预防或改善治疗抗性过度增殖性疾病的方法。像这样，本发明考虑了用于在主动和被动免疫接种实施方案中使用的疫苗。提出适合于用作疫苗的免疫原性组合物可以直接从包含自身基因产物或编码其的多核苷酸的树突细胞最容易地制备，且制备成易于配制到所需媒介物内。
疫苗的制备可以涉及将编码自身基因的核酸引入树突细胞内以用作疫苗。包含树突细胞的疫苗制备作为可注射的液体溶液或悬浮液：也可以制备适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。制剂也可以是乳化的。活性免疫原性成分可以与赋形剂混合，所述赋形剂是药学可接受的且与活性成分相容。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。另外，必要时，疫苗可以包含辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、或增强疫苗效力的佐剂。在具体实施方案中，如美国专利号6,793,923和6,733,754中所述疫苗用物质组合进行配制，所述专利整体引入本文作为参考。
疫苗可以方便地通过注射例如皮下或肌内肠胃外施用。适合于其他施用形式的另外制剂包括栓剂，且在某些情况下为口服制剂。对于栓剂，可以包括一般的结合剂和载体，例如聚烷撑二醇或甘油三酯：此类栓剂可以由包含约0.5％-约10％，优选约1％-约2％的活性成分的混合物形成。口服制剂包括此类常用赋形剂如，例如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、薄膜、漱口剂、缓释制剂或粉末的形式，且包含约10％-约95％，优选约25％-约70％的活性成分。
一般地，疫苗以与剂型相容的方式，且以治疗上有效和免疫原性的此类量施用。待施用的量取决于待治疗的受试者，包括个体免疫系统对组合物反应的能力，和所需保护程度。待施用的所需活性成分的精确量取决于从业者的判断。然而，合适的剂量范围是每次疫苗接种大约数百微克的活性成分。用于最初施用和加强注射的合适方案也是可变的，但一般为最初施用随后为后续接种或其他施用。
应用方式可以广泛不同。用于施用疫苗的任何常规方法都是可应用的。这些被认为包括在固体生理学可接受的基底上的口部施用或在生理学可接受的分散相中通过注射等肠胃外施用。疫苗剂量将取决于施用途径且将依受试者的大小和健康状态而变。
在许多情况下，将希望疫苗的多次施用，通常不超过6次疫苗接种，最通常不超过4次疫苗接种，且优选一次或多次，通常为至少约3次疫苗接种。疫苗接种可以是2-12周的间隔，更通常为3-5周的间隔。间隔为1-5年，通常为3年的定期加强剂量将是希望的以维持抗体的保护水平。免疫接种过程随后可以是对于针对抗原的抗体的测定法，如上文美国专利号3,791,932；4,174,384；和3,949,064中所述的是这些测定法类型的举例说明。
B.载体
给定组合物可以在其免疫原性方面不同。因此通常必须强化宿主免疫系统。示例性和优选载体是钥孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白例如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可以用作载体。用于使多肽与载体蛋白缀合的方法是本领域众所周知的，且包括戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酸(maleimidobencoyl)-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳化二亚胺和双偶氮联苯胺。
C.佐剂
组合物的免疫原性可以通过使用称为佐剂的免疫应答的非特异性刺激物得到加强。合适的佐剂包括所有可接受的免疫刺激化合物，例如细胞因子、毒素、或合成组合物。佐剂可以促进下列中的一种或多种：1)在体内捕捉抗原以引起缓释；2)将免疫应答中涉及的细胞吸引至施用部位；3)诱导免疫系统细胞增殖或活化；或4)改善抗原遍布受试者身体的散布。
佐剂包括但不限于水包油型乳剂、油包水型乳剂、矿物盐、多核苷酸、和天然物质。可以使用的具体佐剂包括IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-干扰素、GMCSP、BCG、氢氧化铝或其他铝化合物、MDP化合物例如thur-MDP和nor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂质A和单磷酰脂质A(MPL)。RIBI包含在2％角鲨烯/吐温80乳剂中的从细菌中提取的3种组分-MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)。甚至可以使用MHC抗原。其他佐剂或方法在美国专利号6,814,971；5,084,269；6,656,462中例示，所述专利各自引入本文作为参考。
达到关于疫苗的佐剂效应的各种方法包括使用试剂例如氢氧化铝或磷酸盐(明矾)，通常作为在磷酸盐缓冲盐水中的约0.05-约0.1％溶液使用，与作为约0.25％溶液使用的糖合成聚合物(Carbopol
Figure A20068002557600991
)混合，通过用约70℃-约101℃的温度分别热处理30秒-2分钟的时间段使疫苗中的蛋白质聚集。通过用针对白蛋白的胃蛋白酶处理的(Fab)抗体再活化聚集；与细菌细胞(例如短小棒状杆菌(C.parvum))、内毒素或革兰氏阴性菌的脂多糖组分混合；在生理学可接受的油媒介物(例如二缩甘露醇单油酸酯(Aracel A))中的乳状液；或含用作封闭替代物的20％全氟碳溶液的乳状液(Fluosol-DA
Figure A20068002557600992
)也可以用于产生佐剂效应。
示例性的通常优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(包含被杀死的结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的免疫应答的非特异性刺激物)、不完全弗氏佐剂、和氢氧化铝。
除佐剂之外，可能希望共施用生物应答调节剂(BRM)以增强免疫应答。BRM已显示上调T细胞免疫或下调抑制性细胞活性。此类BRM包括但不限于西米替丁(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA)；或低剂量环磷酰胺(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead，NJ)和细胞因子例如γ-干扰素、IL-2或IL-12或编码免疫辅助功能中涉及的蛋白质例如B-7的基因。
D.脂质组分和部分
在某些实施方案中，本发明涉及包含与核酸或多核苷酸/多肽结合的一种或多种脂质的组合物或包含其的树突细胞。脂质是不溶于水且可用有机溶剂萃取的物质。除本文具体描述的那些之外的化合物是本领域技术人员了解的脂质，且由本发明的组合物和方法包含。脂质组分和非脂质可以共价或非共价地互相附着。
脂质可以是天然存在的脂质或合成脂质。然而，脂质通常是生物学物质。生物学脂质是本领域众所周知的，且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜、溶血脂质、鞘糖脂、糖脂、硫脂、含醚和酯连接的脂肪酸的脂质和可聚合脂质，及其组合。
在某些实施方案中，组合物可以包含约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％，或其中间的任何范围的特定脂质、脂质类型、或非脂质组分例如佐剂、抗原、肽、多肽、糖、核酸或本文公开的或将是本领域技术人员已知的其他材料。在一个非限制性例子中，组合物可以包含约10％-约20％的中性脂质，和约33％-约34％的脑苷脂、和约1％的胆固醇。在另一非限制性例子中，脂质体可以包含约4％-约12％的萜，其中约1％的胶束特别是番茄红素，剩下约3％-约11％的脂质体包含其他萜；和约10％-约35％的磷脂酰胆碱，和约1％的非脂质组分。因此，预期本发明的组合物可以包含以任何组合或百分比范围的任何脂质、脂质类型或其他组分。
E.体外、离体或体内施用
如本文使用的，术语体外施用指对从动物中取出的细胞或在动物之外进行的处理，包括但不限于培养的细胞。术语离体施用指在体外处理，且随后施用于活动物的细胞。术语体内施用包括在动物内进行的所有处理。
在本发明的某些方面，组合物可以进行体外、离体或体内施用。美国专利4,690,915和5,199,942公开了用于在治疗应用中使用的血单核细胞和骨髓细胞的离体处理方法，所述专利都引入本文作为参考。
XVI.试剂盒
各种试剂盒可以被提供作为本发明的部分。试剂盒可以包含鉴定过度增殖性疾病的组分和/或治疗过度增殖性疾病的组分，且在具体实施方案中，过度增殖性疾病包含对至少一种癌症治疗有抗性的过度增殖性疾病。在具体实施方案中，试剂盒包含用于从需要治疗的个体收集一种或多种树突细胞的装置和/或反应物。试剂盒还可包含用于将表达构建体递送给树突细胞的装置和/或反应物。在进一步的实施方案中，试剂盒除包含自身基因产物表达构建体的树突细胞之外还包含用于治疗例如化学疗法的装置和/或反应物，用于手术的一种或多种工具、用于放射的反应物或装置等等。
当试剂盒的组分在一种或多种液体溶液中提供时，液体溶液优选是水溶液，而无菌水溶液是特别优选的。试剂盒组分还可以以干燥或冷冻干燥的形式提供。当反应物或组分作为干燥形式提供时，重建一般是添加合适溶剂。设想溶剂还可以在另一种容器工具中提供。本发明的试剂盒还可以包括概述与本发明有关的建议治疗的说明书。
本发明的试剂盒一般还将包括用于使小瓶包含在紧密限制中用于商业销售的工具，例如其中保留所需小瓶的注射或吹塑成型的塑料容器。与容器的数目或类型无关，本发明的试剂盒还可以包含器具，或由器具包装，所述器具用于帮助样品收集、评估、治疗施用等。此类器具可以是例如吸入器、注射器、吸液管、镊子、定量匙、滴眼管或任何此类医学上批准的递送媒介物。
XVII.预防实施方案
在本发明的某些方面，本发明的方法和组合物涉及发展治疗抗性过度增殖性疾病的预防。发展治疗抗性过度增殖性疾病的预防可以在例如受试者已诊断具有癌症之前、受试者已诊断具有癌症之后但受试者接受癌症治疗之前，或受试者已接受癌症治疗之后但对治疗的抗性发展之前发生。
“预防”根据其普通和通常的含义用于指“预先发挥作用”或此类动作。在特定疾病或健康相关病症的背景中，那些术语指为了阻断疾病或健康相关病症发作的目的给受试者施用或应用试剂、药物或补救，或对受试者进行的操作或用药程式。在本发明的某些实施方案中，该方法涉及递送表达自身基因产物的树突细胞以预防受试者中的疾病或健康相关病症。适合于预防疾病或病症的药物组合物量是已知或怀疑阻断疾病或健康相关病症发作的量。本发明预期可以给受试者提供表达自身基因产物的树突细胞，以预防治疗抗性癌症的发作或预防对治疗有抗性的癌细胞数目增加。
XVIII.实施例
包括下列实施例以显示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解随后实施例中公开的技术代表在本发明实践中良好运作的由本发明人发现的技术，且因此可以视为构成用于其实践的优选形式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解无需背离本发明的概念、精神和范围即可在公开的具体实施方案中进行许多改变且仍获得相同或相似的结果。更具体而言，显而易见的是化学和生理学相关的某些试剂可以代替本文描述的试剂，同时达到相同或相似的结果。对本领域技术人员显而易见的所有此类相似代替物和修饰视为在权利要求中限定的本发明的概念、精神和范围内。
实施例1
示例性Advexin
Figure A20068002557601021
-树突细胞研究
在具体实施方案中，具有癌症的个体用本发明的方法和组合物进行治疗，例如包含Advexin
Figure A20068002557601022
的树突细胞。癌症对至少一种癌症治疗有抗性。下文说明书仅涉及示例性实施方案，且可以应用于除小细胞肺癌(SCLC)外的癌症。
具有广泛期疾病(已散布超过锁骨上区的转移性疾病)的患者可以用化学疗法(在具体实施方案中为手术、或放射)去肿块(de-bulked)，且随后用由Advexin
Figure A20068002557601031
转导的自体树突细胞进行疫苗接种。疫苗#1-3每2周给予；患者随后进行分级(疫苗#3后2周)，且如果没有疾病进展的证据，则例如以一月的时间段给予另外3次疫苗接种。
24个患者已完成或目前正在接受治疗。大多数患者在第1个疫苗接种疗程时进展(3个患者完成了6次疫苗接种)。因此对疫苗疗法的总应答率是0％。
13个患者接受第二线化学治疗且对于应答是可评估的(n＝9紫杉醇；n＝2 CDDP/CPT11；n＝1托泊替康；n＝1卡铂(carbo)/VP16)。对第二线CTX的应答用评估如下：0个是CR；7个是PR；2个是SD，且4个是PD，而得到的总应答率是54％。
对于这13个可评估的患者，从第一次疫苗时的生存中值是9个月(注-从诊断到疫苗#1的时间是约6个月，即15个月的存活)。对于24个可评估的患者，从疫苗#1的存活＝8个月(注-从诊断到疫苗#1的时间是约6个月，即14个月的存活)。对于具有广泛疾病的患者的预期存活时间是9个月(Kurup和Hanna，2004(生存中值是8-10个月)；Neubauer等人，2004(生存中值是7.2个月)；Thomas等人，2001(生存中值是38周))。
因此看起来好像疫苗是良好耐受的且对具有广泛期疾病的患者提供了显著的生存优势。
对于疫苗研究，参与的总数目是47(直到2004年7月)；22个患者参与且同意但未接受任何研究药物(错误单倍型；迅速死亡等)。在剩下的受试者中，9/24个受试者接受疫苗且已死亡(从疫苗#1的存活是2-12个月)；从疫苗#1的平均值是6.5个月。
对于5个可评估的患者，从参与到死亡的时间＝16；13；10；7；3个月，而平均值是10个月。对初次CTX(n＝24)的应答如下：5个是CR；12个是PR；1个是SD，且6个是PD。初次CTX是75％的患者卡铂/VP16；且25％是CDDP/CPT11(50％的患者在Moffitt进行治疗；50％在社区)。24个患者接受疫苗：n＝3个患者接受6次疫苗；21个接受1-3次疫苗。随后23/24个患者在第1个疗程中或结束时(疫苗1-3)进展。1个患者在3次疫苗接种后是SD且6次疫苗接种后是PD。疫苗#6后的TTP是1个月(n＝3)，且对疫苗的ORR＝0％。在铂抗拒患者中，对第二次CTX的RR是10％，其中13个患者接受第二线CTX；且对第二线CTX的ORR是54％。
实施例2
本发明的示例性小细胞肺癌实施方案
尽管本发明的方法和组合物可应用于各种癌症类型，但在本发明的一个具体和示例性实施方案中，它们用于治疗占所有肺癌20％的小细胞肺癌(SCLC)。SCLC是任何肺肿瘤中最具攻击性的，而5年存活率＜5％。如果没有治疗，从诊断开始的生存中值是2-4个月。
与其他类型的肺癌比较，小细胞癌具有更大的趋向在诊断时广泛散布，但对化学疗法和照射更有应答。然而，对治疗的应答一般是短期的，且疾病复发频繁。铂和依托泊苷组合化学疗法仍是SCLC中的护理标准，尽管表柔必星/顺铂显示具有略微减少的毒性的类似活性。考虑增加的相关毒性，三联疗法、剂量增强和维持疗法未显示有意义的存活改善。在具体实施方案中，局限期疾病的治疗例如使用下列中的一种或多种产生16-24个月的生存中值：(依托泊苷(VP16)/顺铂(CDDP)/放射疗法(XRT)/预防性头颅照射(PCI)。
疾病分为2类：33％的患者呈现局限期疾病，其中疾病限制于起源的半胸、纵隔、或锁骨上淋巴结。在局限期疾病中，生存中值是16-24个月。大多数(67％)患者呈现广泛期疾病，所述广泛期疾病分类为已散布超过锁骨上区的肿瘤：这些患者比具有局限期疾病的患者具有更差的预后。生存中值为7-9个月，然而长期无病生存很罕见。2种疾病分类显示在治疗后频繁复发。近期研究已根据对初次治疗的应答持续时间对具有广泛疾病的患者进一步分类：在化学治疗8-12周内无进展的那些视为化学敏感的且可以用同类CTX再治疗。在少于8-12周中复发或进展的那些视为CTX抗性/难治性的且需要用不同类CTX治疗。
广泛期疾病的攻击性治疗产生7-9个月的生存中值，但在化学治疗(CTX)时有进展的患者中对于复发疾病的预后极差，生存中值为2-3个月。
这个实施例对仅作为例子的SCLC应用本发明的方法和组合物。特别地，描述了在具有广泛期小细胞肺癌的患者中的SCLC疫苗I/II期试验综述。包含Advexin处理的树突细胞的新型患者特异性治疗在关于广泛期SCLC的I/II期试验中进行评估。在本发明的具体实施方案中，治疗是良好耐受的。患者子集已接受第二线化学治疗，而在疫苗接种后的生存中值超过9个月(Advexin
Figure A20068002557601052
-DC疫苗接种在初次化学治疗后6-8个月开始)，与历史对照比较显示＞50％的生存优势。
在具体方面，具有广泛期疾病的24个患者已完成或目前正在接受治疗(8个患者自2004年6月以后接受其第一次疫苗)。5个患者显示在第一个疫苗接种周期(3次疫苗注射)时疾病稳定，且其中3个已接受6次疫苗接种。2个另外的患者正在接受第二个疫苗周期。
在这24个可评估的患者中，9个已死亡，因此生存中值仍未达到，尽管从疫苗#1开始的生存中值是8+个月(从诊断到疫苗#1的时间是6-8个月)。在历史上，关于具有广泛SCLC的患者的预期存活时间是7-9个月。因此与标准化学疗法比较这24个患者看起来具有显著改善的存活(＞14个月)。
13个患者的子集接受第二线化学疗法且对于应答是可评估的(n＝9紫杉醇；n＝2 CDDP/CPT11；n＝1托泊替康；n＝1卡铂/VP16)。对第二线CTX的应答评估如下：0个是CR；7个是PR；2个是SD，且4个是PD，而得到的总应答率是54％。对于这13个可评估的患者，从第一次疫苗时的生存中值是8+个月，其中从诊断到疫苗#1的时间是6-8个月，即14+个月的存活。
在本发明的具体实施方案中，疫苗方案在早期疾病阶段的患者中使用，即具有局限期SCLC的那些。
在历史上，关于癌症的疫苗疗法未能显示转化成生存优势的显著功效。这被认为是由于肿块性疾病提供的局部免疫抑制，且因此更近的研究已集中于在去肿块(手术以去除大部分肿瘤，这通常为了另外疗法例如化学疗法和/或放射疗法而进行)后辅助疫苗接种的使用。在这项研究中，对初次化学疗法具有CR应答的5/5个患者仍活着，尽管仍未观察到延长的存活。在对初次化学疗法具有PR的12个患者中，5个已死亡。在第一线化学疗法后具有PD的50％(n＝3)的患者仍活着。因此，在本发明的具体实施方案中，对初次化学疗法应答良好的患者显示通过疫苗接种对第二线化学疗法的加强作用。
近期Provenge III期试验在具有无症状、转移性、非雄激素依赖性前列腺癌的患者中显示统计上显著的存活利益。注意入选标准限制无症状且具有＜7的格里森(Gleason)得分的患者。可能这些患者在疫苗接种后具有低容量疾病。在IIIb期NSCLC中的近期Biomira试验还入选显示稳定疾病或对第一线化学疗法或放射疗法有应答的患者。研究结果不支持在具有IIIB期和IV期疾病的较大的患者群体中统计上改善的存活，进一步暗示最小残留病灶是良好靶。
因此本研究指出疫苗是良好耐受的且对具有广泛期疾病的患者提供了显著的生存优势。在本发明的具体方面，综述了病例表，更新了生存分析，且使p53免疫性与存活利益关联。在另外的实施方案中，受控的多中心II/III期研究用于评估和优化具有广泛疾病的患者中Advexin
Figure A20068002557601061
-DC疫苗接种的利益，所述患者对第一线化学疗法有应答。
图1提供了示例性常规SCLC治疗方案。相反，图2提供了在具有广泛SCLC的患者中的示例性Advexin
Figure A20068002557601062
-DC疫苗I/II期试验。图3显示了示例性Advexin
Figure A20068002557601063
疫苗方案第一线应答，而图4显示Advexin
Figure A20068002557601064
疫苗方案第二线治疗。图5显示在对第二线治疗应答的所有患者中的Advexin
Figure A20068002557601065
/DC疫苗存活数据。
图6提供了对第二线化学疗法的应答表。特别地，13个患者在第二线CTX后是可评估的。在第一线CTX后TTP平均为1.75个月，但TTP＜3个月限定大多数这些患者是“药物抗性的”。对第二线CTX的应答，7个是PR；2个是SD；4个是PD；总应答率(ORR)是54％；生存中值是从疫苗1起9+个月。在历史上，药物抗性患者中的生存中值是3-6个月。例如，紫杉醇显示100天的生存中值，而在20％的患者中有危及生命的毒性(Smit，1998)。
图7显示与本发明的那种比较在抗性SCLC中的药物活性。
图8显示在接受第二线疫苗/CTX的可评估患者中的Advexin/DC疫苗存活数据。从Advexin
Figure A20068002557601072
疫苗起的生存中值大于9个月，这明显长于如Ardizzoni等人(2003)中显示的抗性癌症中6.1个月的生存中值。
图9提供了在具有广泛SCLC的患者中的示例性Advexin
Figure A20068002557601073
-DC疫苗II期试验。
总之，Advexin疗法是良好耐受的且在具有复发疾病的患者中对第二线CTX致敏。特别地，Advexin
Figure A20068002557601075
疫苗疗法在具有广泛和复发SCLC的患者中提供了实质上的生存优势。
实施例3
示例性临床试验概述
在2003年1月和2005年6月之间，对于免疫应答和临床应答完全可评估的29个患者用疫苗进行治疗。所有患者在疫苗接种时具有ES SCLC(17个患者具有新近诊断的ES疾病和12个具有复发疾病；表4)。年龄中值是63岁(范围为39-76)。20个患者在仅有的一次先前化学治疗方案后进行疫苗接种(6个患者在2个方案后，且3个患者在3个方案后)。所有患者已接受先前的铂疗法。患者特征列于表4中。
表4：患者特征
Figure A20068002557601081
DC由外周血单核前体产生且随后如方法中所述用包含野生型p53(ADVEXIN
Figure A20068002557601082
)的腺病毒构建体感染。Ad-p53治疗后细胞表型的一般例子呈现于图10A中。p53阳性DC的数目使用流式细胞术进行评估(图10B)。患者预定接受皮内注射的3次疫苗剂量，间隔为2周。如果患者显示稳定疾病，那么他们被给予另外3次疫苗剂量，每月1次。施用疫苗的总数目为2-6(中值＝3)，而研究自始至终施用了总共82次疫苗。试验I期部分具有从5×106到5×107 p53+DC逐步增加疫苗剂量的初期目标。然而，每次剂量大于5×106 p53+DC的产生难以达到(在少于10％的所有情况下产生＞107p 53+DC)。因此，为了维持试验自始至终的一致性，本发明人决定不将p53+DC的单次剂量逐步增加到大于5×106细胞。平均起来，每次剂量产生7.7×107DC和8.6×106 p53+DC(表5)。
表5.对于疫苗产生的DC数目
  每个疫苗产生的DC总数目   每个疫苗产生的p53+DC数目   每个疫苗注射的p53+DC数目
  中值   2.42×107   4.66×106   4.78×106
  平均值   7.69×107   8.64×106   3.84×106
  最大值   1.59×108   2.7×108   5×106
  最小值   1.47×106   2.4×105   2.4×105
注射的p53+DC数目限于5×106，即使产生了更多的细胞。平均起来每个患者每次疫苗接种接受3.8×106 p53+DC。在5个病例中，由于疫苗生产中的困难患者接受了少于106 p53+DC。
实施例4
针对疫苗的抗原特异性细胞免疫应答
为了评估免疫应答，来自患者的外周血样品在免疫接种前、3轮免疫接种完成后2-3周和2个月后收集。p53特异性免疫应答在IFN-γELISPOT中使用包含野生型p53的金丝雀痘病毒(ALVAC)或对照病毒进行评估。包含全长p53基因的ALVAC的使用允许不管患者的HLA类型评估p53特异性应答。针对p53的免疫应答的发展视为显著的，如果它比针对对照ALVAC的应答高至少2SD。针对疫苗接种的应答视为显著的，如果免疫接种后的p53特异性应答比免疫接种前的p53特异性应答高过2SD，且比针对对照ALVAC的应答高至少2SD。
显示了关于示例性患者1和2的代表性ELISPOT数据(图11A)。尽管针对对照ALVAC和p53的基线免疫反应性在患者2中比患者1中更低，但在2种情况下，疫苗接种后3周产生了针对p53的显著免疫反应性(p＝0.045；图11A)。到疫苗接种后2个月时应答的量级已减少，然而信号仍显著超过疫苗前水平。使用HLA-A2匹配的p53衍生或对照肽，在12个HLA-A2阳性患者子集中进一步评估免疫应答。举例说明性结果显示于图11B中。在这个患者中，疫苗前的免疫反应性对于对照、PSA和p53肽是相同的。疫苗接种后1个月，显著的p53特异性反应性是显而易见的。免疫应答在随后3次每月1次的疫苗治疗中维持，且似乎在最后一次疫苗后3个月回到基线水平(图11B)。没有观察到针对对照PSA肽的免疫反应性的诱导，表明了应答的特异性。针对p53肽的应答允许更精确评估CD8+T细胞特异性应答。在这些患者中，同样评估了抗原特异性CD8+T细胞的存在且使用四聚体染色证实(图11C)。
使用ALVAC-p53在19个患者中的9个中(47.3％)发现，且使用p53衍生肽在12个患者中的7个中(58.3％)发现针对疫苗接种的显著p53特异性应答(图12A和12B)。图12C和12D显示使用ALVAC-p53在25个患者中的13个中(52％)，和使用p53衍生肽在12个患者中的7个中(58.3％)针对疫苗接种的适度但明显的p53特异性T细胞应答。使用p53衍生肽测量对疫苗接种具有显著应答的3个患者由于技术原因未使用ALVAC-p53进行测试。总之，22个测试患者中的12个(54.5％；称为p53应答者)具有针对免疫接种的统计上显著的p53特异性应答。当2种测定法使用同一患者细胞进行测试时，与p53衍生肽比较对ALVAC-p53的应答率没有明显不同(p＞0.1)，然而使用四聚体染色可见更低的应答。11个测试的患者中只有3个(27.2％)在四聚体染色中显示出显著增加(数据未显示)。p53特异性免疫的疫苗接种前水平在对疫苗免疫应答的患者和不应答的那些中是相似的(图12A和12B)。p53特异性免疫应答水平在疫苗接种完成后2个月显著减少。这与第二线化学疗法一致，所述第二线化学疗法在疫苗接种结束后3-4周在大多数患者中开始。
实施例5
在针对疫苗的细胞和体液免疫应答之间的关联
在22个测试患者中的10个中观察到可检测的免疫接种前的抗p53抗体水平，且只有3个患者在免疫接种后显示抗p53抗体水平中的显著增加。有趣的是，所有那些患者具有可检测的疫苗前抗体水平。具有可检测的免疫接种前的抗p53抗体水平的10个患者中的4个(40％)具有针对疫苗接种的阳性p53特异性细胞应答，这与没有预先存在的抗p53水平的患者中的应答率没有统计上不同。
抗腺病毒抗体可能在限制基于腺病毒的癌症疫苗效应中起关键作用。本发明人通过ELISA使用系列稀释的患者血清测量了抗Adv IgG和IgM抗体。大多数患者具有可检测的免疫接种前的抗Adv IgG抗体水平。使用Adv-p53 DC的3轮免疫接种后，抗Adv抗体滴度在23个患者中的12个中(52.1％)增加。在10个患者中观察到适度增加(＞2和＜8倍)，和在2个患者中观察到大量(＞8倍)增加。具有抗腺病毒应答大量增加的2个患者没有发展针对免疫接种的p53特异性细胞应答。在抗Adv抗体滴度有适度增加的10个患者的9个中(90％)，和在抗体滴度没有可检测的增加的11个患者中只有4个(36.3％)观察到针对疫苗接种的p53特异性细胞应答(在费氏精确检验中双尾p值＝0.011)(图13A)。因此，针对免疫接种的抗Adv抗体的适度增加的产生不仅没有阻止针对疫苗接种的细胞p53特异性免疫应答的发展，还与阳性应答相关。在那些患者中检测到的抗腺病毒抗体具有中和滴度中值为1600的中和活性(数据未显示)。
实施例6
针对疫苗接种的免疫应答与疫苗接种前的T细胞水平、DC活性、和未成熟的髓样细胞存在的关联
p53特异性细胞应答的产生可能不仅取决于抗原刺激的质量，还取决于T细胞和宿主抗原呈递细胞特别是DC的功能活性。本发明人表征了影响疫苗接种结果的宿主免疫系统的预存情况。为了解决这个问题，在疫苗接种前从患者中分离的MNC用破伤风类毒素(TT)或PHA进行刺激，且通过3H-胸苷的摄取测量细胞增殖。应答的正常水平使用来自健康志愿者和供体的MNC确定。刺激指数(SI)用于评估响应刺激的T细胞增殖。它计算为在0.1μg TT或5μg/ml PHA存在下和在单独的培养基中的细胞增殖之间的比率。在健康供体中关于TT刺激的SI为15-80，而中值为30.4，而关于PHA刺激的SI为25-90，而中值为53.5。20个测试患者中的9个(45％)具有低于正常样品下限的TT应答，且19个测试患者中的9个(47.3％)具有低于对照范围的PHA应答(图13B)。然而，针对TT或PHA的T细胞应答减少的患者发展针对疫苗接种的p53特异性免疫，速率与具有正常T细胞应答水平的患者相同(图13C)。
近期研究已暗示天然CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)可能在抗肿瘤免疫应答的下调中起重要作用(在Chattopadhyay等人，2005中综述)。对于Treg群体的初期评估，我们计算CD3+CD4+ T细胞总群体内的CD25高细胞的存在。在疫苗接种前或在疫苗接种刚完成后，在健康供体和SCLC患者组间没有发现这些细胞比例的差异(图13D)。本发明人在具有升高水平的CD4+CD25+ T细胞的患者组中表征了针对疫苗接种的p53特异性应答。然而，在疫苗接种前后患者血液中CD3+CD4+CD25+细胞的存在和针对疫苗接种的p53特异性T细胞应答之间没有观察到统计上显著的联系(图13E)。
近期研究已暗示CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)可能在抗肿瘤免疫应答的下调中起重要作用(在Chattophadhyay等人，2005中综述)。作为Treg群体的初期评估，在CD3+CD4+ T细胞总群体内计算CD25高细胞。在疫苗接种前或在疫苗接种完成后2-3周，在健康受试者和具有SCLC的患者组间没有发现这些细胞比例的差异(图14I)。此外，在疫苗接种前后患者血液中这些细胞的存在和针对疫苗接种的p53特异性T细胞应答之间没有发现统计上显著的联系(图14J)。
本发明人表征了疫苗接种前DC的存在和功能活性与针对疫苗接种的抗原特异性应答之间的关联。在SCLC患者中没有发现DC(Lin-HLA-DR+)和其成熟的CD83+子集的比例中统计上显著的减少。大量患者具有减少水平的DC。本发明人比较了在具有减少比例的DC(低于对照组中的最小值)的患者中与具有正常DC水平的那些患者中针对疫苗接种的p53特异性免疫应答水平。没有发现差异(图14C)。来自具有SCLC患者的DC上的HLA-DR表达显著低于健康供体。平均荧光强度从对照组中的50.5±1.9减少为疫苗接种前SCLC中的35.5±4.3(p＝0.03)(图14D)。在异基因混合白细胞反应中可见甚至更大量的减少，功能特别归于DC。应答者的异基因T细胞增殖从通过来自对照组的MNC刺激后的13279±140.7CPM减少为用来自SCLC患者的MNC刺激后的1740±767.4CPM(p＜0.001)(图14E)。然而，针对疫苗接种的免疫应答(p53特异性应答)在具有对照和减少表达的HLA-DR患者组中是相同的(图14F)。对于异基因MLR，此类分析是不可能的，因为所有患者具有减少水平的这种测试。
接下来，本发明人评估了涉及癌症中的免疫抑制活性的未成熟的髓样细胞(ImC)水平(Kusmartsev和Gabrilovich，2002；Gabrilovich，2004)。具有SCLC的患者在疫苗接种前具有升高水平的Lin-HLA-DR+CD33+ ImC(0.47±0.13％，对照中为0.13±0.03％，p＝0.03)。在疫苗接种后，其存在甚至进一步增加至0.70±0.13(p＝0.002)(图14G)。在疫苗接种前具有Lin-HLA-DR-CD33+未成熟的髓样细胞的SCLC患者中，在疫苗接种后，其存在甚至进一步增加(P＝0.002)(图14K)。与具有升高ImC水平的患者只有25.0％比较，在疫苗接种前具有正常ImC水平的所有患者已发展针对疫苗接种的p53特异性免疫应答(100％)(在费氏精确检验中双尾p＝0.06)(图14H)。2个患者在疫苗接种后具有正常ImC水平。与疫苗接种后具有升高的ImC水平的患者的46.1％显示p53特异性免疫应答比较，这2个患者具有p53特异性应答。由于具有正常ImC水平的组的小样本量，疫苗接种后数据的统计分析是不可能的。因此，似乎针对疫苗接种的p53特异性免疫应答与疫苗接种前ImC的增加的存在关联。由于小样本量，疫苗接种后数据的统计分析是不可能的。
实施例7
针对疫苗接种的临床应答及其与抗原特异性免疫应答的关联
与疫苗施用相关的毒性是罕见的且大部分是轻微的。只有2个患者经历由于疫苗施用的2级毒性(1个疲劳，1个关节痛)，且疫苗接种从未由于任何毒性的存在而停止。最常记录的毒性是：1级关节痛/肌痛(9个患者)、疲劳和疫苗接种部位处的红斑(各为5个患者)，以及疫苗接种部位处的疼痛(4个患者)。毒性的出现与先前接受的疫苗数目无关。
迄今为止23个治疗患者对于免疫和临床应答是可评估的。1个患者由于丢失血液样品从免疫应答分析中去除。1个患者在疫苗接种后达到PR，但未包括在临床应答分析中，因为她未完成免疫应答分析。具有可测量的损害的23个完全可评估患者中无一具有响应疫苗的肿瘤消退，但5个具有稳定疾病。所有23个患者中除2个以外最后发展进行性疾病。具有进行性疾病的21个患者中的18个用另外的化学疗法进行治疗(3个患者拒绝)。在这些中，13个是铂抗性的(难治性)(在接受包含铂的方案的90天内进展)。13个患者接受紫杉醇(Taxol)，2个患者接受卡铂/CPT-11，2个患者接受CDDP/CPT-11，且1个患者接受卡铂/VP-16。在具有铂抗性广泛期SCLC患者中对第二线化学疗法的历史上客观应答率为2％-5％，且对于其中＞50％的患者具有难治性疾病(与在我们的患者群体中一样)的研究为6％-16％(Davies等人，2004)。然而，本发明人发现在用第二线化学疗法治疗的所有18个患者中客观临床应答(PR+CR)为66.7％(表6)。在用疫苗治疗的13个铂抗性患者中(当他们在接受疫苗后进展时接受了各种化学治疗方案)，应答率为61.5％(表6)。这些铂抗性患者(n＝13)从第一次疫苗施用时的生存中值为9.3个月，而95％置信区间下限为7.1个月(图15A)。所有23个可评估患者的总存活从第一次疫苗施用时为10个月，而95％置信区间下限为7.1个月(图15B)。
表6.在疫苗接种的患者中对第二线化学疗法的应答
Figure A20068002557601141
本发明人评估了针对免疫接种的免疫应答和针对第二线化学疗法的临床应答之间的关系。与具有无法检测的免疫应答的9个患者中的3个(33.3％)比较，具有针对免疫接种的阳性免疫应答的9个患者中的8个(88.9％)具有针对第二线化学疗法的CR或PR(在费氏精确检验中双尾p＝0.0497)(图15C)。与对疫苗接种没有免疫应答的患者比较(生存中值，7.9个月)，具有针对疫苗接种的阳性免疫应答的患者改善总存活(中值为12.1个月)(图15D)。然而，2条存活曲线之间的差异没有达到统计学显著性(p＝0.075)。
第二线化学疗法的施用在疫苗接种结束后3-4周在大多数患者中开始。为了追踪观察这些患者中的特异性免疫应答状态，我们在最后一次疫苗接种后2个月评估了p53特异性免疫应答。在大多数患者中，存在p53特异性免疫应答的显著减少(图12A，17A)。这种减少与显著的化学疗法诱导的淋巴细胞减少症无关(图17B)。
实施例8
3次疫苗后在1个患者中的临床应答
1个患者未包括在上文的临床分析中，因为她未完成免疫应答分析。这个患者在第3次疫苗施用后达到PR。这个患者在初次诊断后立即接受与胸放射疗法同时发生的4个顺铂和依托泊苷循环。她随后在她的最后一次顺铂剂量后2个月进展，出现几个PET阳性肿大的腹膜后淋巴结。她在那时接受了3次疫苗，且在2周后重新分级。总体RECIST测量显示她的所有可测量损伤尺寸减少60％(图16)。
实施例9
本发明的重要性
本发明涉及皮内施用示例性Ad-p53处理的树突细胞(DC)后产生的免疫应答。因为Adv相关抗原和p53衍生表位都呈递在同一DC上，所以在具体实施方案中，抗Adv免疫的评估可以充当DC功能活性的相关物。然而，由于呈递表位之间的免疫学竞争，非常高水平的抗Adv应答可能是有害的。在第二线化学疗法失败的3个患者中，2个没有抗Adv抗体应答中的可检测增加，且1个具有非常高(＞8倍)的增加，而对化学疗法应答的8个患者中的6个具有适度增加的抗Adv抗体水平，且2个没有这种增加。然而，数据与共享的DC抗原呈递的概念一致，且因此抗Adv免疫可以充当关于p53免疫诱导的代替标记。
为了优化免疫系统的p53特异性应答，本发明人使用装载包含野生型p53基因的腺病毒的DC。腺病毒不仅是用于将基因递送到DC内的极佳工具(在Humrich和Jenne，2003；Gamvrellis等人，2004中综述)，还诱导这些细胞的活化，这表现为DC表面上MHC II类和共刺激分子的上调，IL-12、Th1和促炎细胞因子以及功能效力的产生(Nikitina等人，2002；Tan等人，2005；Herrera等人，2002；Miller等人，2002；Korst等人，2002；Miller等人，2003)。因此，腺病毒提供了将Ag递送和DC活化组合的独特机会，且可以提供对基于DC的癌症免疫疗法的另外利益。
在具体方面，不管细胞的有丝分裂状态，Adv提供对许多细胞类型的高水平的转导效率(Becker等人，1994)。在E1区中具有缺失的复制缺陷Adv在许多临床试验中已直接注射到人内(在Roth和Cristiano，1997中综述)。APC且特别是DC用模型Ags的成功转导已得到报道(Broassart等人，1997；Dietz和vuk-Pavlovic，1998)。转导的DC能够有效呈递重组蛋白质Ags。使用荷瘤鼠类模型的临床前研究结果和评估人p53特异性CTL前体的初期结果已证实Ad-p53转导的DC能够诱导有效的抗肿瘤应答(Nikitina等人，2002)。这种应答识别与不同突变型p53有关的表位，且导致p53相关肿瘤的肿瘤保护以及已建立的肿瘤生长中的显著减少(Nikitina等人，2002；Ishida等人，1999)。因此，p53具有“理想”TAA的许多特征，且是用于在癌症免疫疗法中使用的非常吸引人的候选物。
DC在抗肿瘤免疫应答中起关键作用。当DC用于诱导免疫应答时，肿瘤保护以及有限的疗效被诱导(在Gabrilovich，2002中综述)。因此，DC是作为递送特异性Ags用于诱导免疫的媒介物的理想候选物。许多临床试验已在各种类型的癌症中使用基于DC的疫苗。这些研究显示装载Ag的DC免疫接种在癌症治疗中是安全的且有希望的。它们包括在非何杰金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、前列腺癌、恶性黑素瘤、结肠直肠癌等中的试验。目前看起来基于DC的免疫接种中的关键因素之一是DC的活化状态。未成熟的DC不能刺激有效的免疫应答。此外，它们可能诱导Ag特异性T细胞的抑制(Dhodapkar等人，2001)。腺病毒提供了将Ag递送和DC活化组合的独特机会。使用CD83上调和CD14下调的表型标准，用Adv转导的DC明显变得更成熟。转导的DC还减少IL-10的产生，且转导的DC的子集产生增加水平的IL-12 p70。这种成熟水平优于通过用肿瘤坏死因子-α或干扰素-α处理这些细胞达到的那些，但不如用CD40L三聚体或CD40L加干扰素-γ的组合显著(Schumacher等人，2004)。通过单独的Adv转导的成熟导致使用2种限定的人肿瘤相关Ags即MART-1和AFP有效刺激来自健康供体和具有晚期癌症患者的Ag特异性T细胞(Schumacher等人，2004)。Adv诱导DC成熟/活化的能力已充分确定(Nikitina等人，2002；Miller等人，2003；Miller等人，2002；Korst等人，2002)。这些数据指出腺病毒构建体可以提供对基于DC的癌症免疫疗法的另外利益。
具有ES SCLC的患者的选择允许本发明人不仅给具有相对低肿瘤体积(初次化学疗法后)的患者施用疫苗，还提供了评估针对疫苗接种的临床应答的机会。本发明评估了皮内施用Ad-p53处理的DC后产生的免疫应答。IFN-γ ELISPOT目前是针对疫苗接种的免疫应答的最敏感测量之一。在本发明中，本发明人使用这种测试的2种不同变体：一种使用ALVAC p53且另一种使用HLA-A2匹配的肽。ALVAC允许不管患者的HLA类型评估p53特异性应答。然而，它不允许区分CD4+和CD8+T细胞应答。肽允许分析特异性CD8+ T细胞应答，但只能在HLA-A2阳性患者中使用。在本发明人的掌握中，在ALVAC和肽方法之间没有看到应答频率中的差异。总之，54.5％的所有患者显示针对疫苗接种的p53特异性应答。这个比率与用其他基于DC的疫苗治疗的患者中先前报道的免疫应答率一致。本发明人表征了限制针对疫苗接种的p53特异性应答的因素。使用疫苗接种前收集的血液样品，比较疫苗接种前的T细胞水平和DC功能与针对疫苗的抗原特异性应答。尽管外周血中DC的存在只在小部分患者中减少，但许多患者具有减少的T细胞和DC功能。这些数据与先前报道的观察一致(在Gabrilovich，2004中综述；Gabrilovich和Pisarev，2003)。然而，在这些参数和针对疫苗接种的p53特异性应答之间没有发现关联。CD4+CD25+ Treg已涉及癌症相关的免疫缺陷(Zou等人，2005)。这些细胞群体的增加不一定指示Treg的上调，因为大部分CD4+CD25+ T细胞由活化T细胞代表。目前，几种标记可以用于更精确鉴定Treg群体；然而，功能测试仍是测定这些细胞性质的唯一可靠方法(Chattopadhyay等人，2005；Zou等人，2005)。本发明人不能检测T细胞的CD4+CD25高群体存在的大量增加，这使得进一步的分析不必要。数据不一定指出SCLC中缺乏Treg的涉及。患者在分析前6周正好用基于铂的化学疗法治疗。在具体实施方案中，化学疗法可以消除这些细胞中的一些，如同先前对于环磷酰胺报道的(Ghiringhelli等人，2004)。具有ES SCLC的患者具有增加的ImC水平-肿瘤相关的免疫抑制中涉及的细胞(Kusmartsev和Gabrilovich，2002；Gabrilovich，2004；Bronte等人，2001)。重要的是，与具有升高的疫苗前ImC水平的患者只有28.6％比较，具有正常的疫苗前ImC水平的80％患者具有针对疫苗接种的p53特异性应答。尽管这些差异没有达到统计学显著性(p＝0.07)，但它们显示强的倾向且暗示ImC中的增加可能负面影响针对疫苗的抗原特异性应答。疫苗接种后ImC的存在甚至进一步增加，只有2个患者具有正常水平的这些细胞(2个都具有针对疫苗接种的阳性应答)。ImC中的增加可能由下列事实引起：大多数患者在评估时具有进行性疾病。在具体实施方案中，ImC的去除在增强癌症疫苗的效应方面是有利的。
抗腺病毒抗体应答的诱导视为这种载体用于在基因疗法中使用的主要限制因素之一。在这些研究中，23个患者中的12个显示抗腺病毒抗体滴度增加。有趣的是，针对疫苗接种的p53特异性应答主要在具有适度增加的滴度的患者中发现(90％)。没有滴度增加的患者中只有1/3已发展针对疫苗接种的阳性p53特异性应答(p＝0.011)。因为腺病毒和p53衍生的抗原都呈现在同一DC上，所以抗Adv免疫的评估可以充当DC功能活性的相关物。然而，由于呈递表位之间的免疫学竞争，非常高水平的抗Adv应答可能是有害的。发展非常强的抗腺病毒应答的患者不能产生针对疫苗接种的p53特异性应答。这些数据与在动物模型中获得的结果一致，所述动物模型显示在用不同的腺病毒构建体转导的DC免疫接种小鼠后产生的有限抗腺病毒应答不会影响抗原特异性CTL活性(Nikitina等人，2002；Brossart等人，1997)。
尽管在超过一半的患者中诱导抗原特异性免疫应答，但只在1个患者中观察到客观临床应答(4.2％)。重要的是，这类似于先前临床试验中描述的那种(Rosenberg等人，2004)。然而，用第二线化学疗法治疗患者后，大多数疫苗接种的患者具有针对治疗的客观临床应答(CR或PR)。重要的是，针对疫苗接种的临床应答与免疫应答关联。没有针对疫苗接种的p53特异性应答的患者中少于40％对第二线化学疗法临床应答，而几乎90％的p53应答者具有针对疫苗接种的客观临床应答。p53细胞免疫性的诱导与这个不能治愈的患者群中改善的存活关联。这些数据指出疫苗接种在具有SCLC的患者中与化学疗法协同增强。化学疗法最后减弱抗原特异性T细胞应答，因为在化学疗法开始后6-8周它几乎无法检测。在具体方面，免疫疗法和化学疗法的协同效应在治疗开始后的第一个双周时发生。在具体实施方案中，可能使用观察到的效应的下列机制中的一种或多种：化学疗法可能下调肿瘤产生的免疫抑制因子的效应，所述免疫抑制因子阻止CTL杀死肿瘤细胞；化学疗法可以上调肿瘤细胞中的p53，使得它们更易于被CTL识别；化学疗法可能通过上调穿孔素或颗粒酶的表达水平激活CTL；以及颗粒酶的促凋亡效应和化学疗法可能在分子水平上协同增强。
近期已提出癌症免疫疗法和免疫疗法组合可能提供有效的显著利益(Lake和Robinson，2005)。本发明提供了支持在癌症免疫疗法的实际应用中新出现的这种范例的第一种直接临床实证。癌症疫苗与其他治疗方法特别是化学疗法组合得到增强。
总之，本文呈现的数据指出在具有ES或复发SCLC的患者中用示例性Ad-p53处理的DC主动免疫接种是安全的，且在＞50％的患者中产生p53特异性免疫激活诱导。本发明人提供在体液和细胞水平上的p53和Adv免疫诱导的广泛分析。p53细胞免疫性的诱导与这个不能治愈的患者群中改善的存活关联。
实施例10
示例性材料和方法
在本发明中合适的示例性材料和方法在本文中得到描述，尽管本领域技术人员将识别这些在性质上是非限制性的。
免疫激活测定法。简言之，单核细胞用ALVAC-p53或ALVAC-对照感染，且如先前描述(Pisarev等人，2003)使用自动ELISPOT阅读器(CTL)评估IFN-γ生产细胞的数目。如先前描述(Nikitina等人，2001)。所有ELISPOT实验一式四份地进行。抗p53和抗Adv抗体水平使用至少4个系列稀释度在ELISA中进行评估。由制造商提供的内部对照用于建立“截止”水平。
患者合格性。在入选患者前，方案被下列机构检查和批准：FDA(BB-IND 9792)、NIH生物技术活动重组体DNA咨询委员会办公室(OBA#0205-538)，南佛罗里达大学机构审查委员会，和USF机构生物安全委员会。具有广泛期SCLC组织学诊断的年满18或更大的患者对于参与是合格的。需要ECOG体力状态0-2，和足够的器官功能(WBC＞3,000/mm3和ANC＞1500/mm3，血小板＞100,000/mm3，血细胞比容＞25％，胆红素＜2.0mg/dl，和肌酸酐＜2.0mg/dl)。具有预先存在的自身免疫性病症、免疫缺陷病症、严重的进行性感染和不受控制的脑转移的患者是不合格的。
治疗计划。所有患者在接受研究疫苗前用常规细胞毒性化学疗法进行治疗。在化学疗法后具有进行性疾病的患者是合格的，如果他们在其他方面符合所有其他入选标准。在最后一次化学治疗剂量后至少6周，患者经历白细胞清除术。疫苗被生产且通过皮内注射在4个分开位点处进行施用，所述位点被引流至双侧腋窝和腹股沟淋巴结盆。这以3次分开的机会重复，每2周一次。第3组疫苗后2周，患者进行重新分级。在这个点上未显示进行性疾病的那些患者经历第二次白细胞清除术操作，且接受另外3组疫苗，这次每4周一次。在第3次或第6次疫苗后发展进行性疾病的患者提供另外的细胞毒性化学疗法。
疫苗生产。用于DC生产的单核细胞在白细胞清除术后获得且贮存于液氮中。解冻后，细胞以1.3-1.7×106细胞/cm2可用培养表面的浓度置于组织培养烧瓶中的X-VIVO-15培养基(Biowhittaker，Walkersville，MD)中。培养2小时后，非贴壁细胞被去除，且烧瓶再装填补充5ng/ml GM-CSF(Immunex)、5ng/ml IL-4(R & D Systems，Minneapolis，MN)和2％人血清白蛋白的X-VIVO-15培养基。将烧瓶孵育48小时，在这时向烧瓶中加入另外补充细胞因子的培养基。烧瓶随后再孵育72小时。在孵育结束时，非贴壁和松散的贴壁细胞将被收集和用于用Ad-p53感染2小时，病毒颗粒与细胞比率为15,000∶1。测定将产生最高的人p53表达水平和对树突细胞的最小毒性量的腺病毒最佳剂量。在2小时的孵育结束时，加入X-VIVO培养基至106细胞/mL的最终细胞浓度，且细胞在烧瓶中再孵育46小时，这时细胞进行收集和分析。疫苗释放标准包括：(a)革兰氏染色阴性；(b)通过PCR分析支原体测试阴性；(c)最大内毒素浓度5EU/mL；和(d)证据为通过流式细胞术分析的细胞内p53表达的成熟DC表型。为了测定后者，细胞用“固定和透化(fix and perm)”反应物(Caltag)处理。用p53特异性抗体染色，随后用PE标记的抗鼠类抗体染色。洗去过量抗体后，进行使用FITC标记的单克隆抗体对谱系标记(CD3、CD14、CD19、CD20、CD56)，和使用PE标记的单克隆抗体对HLA-DR的表面染色。最终产物在流式细胞术上进行分析。
疫苗施用。在预定的疫苗施用日，将适当测试的DC悬浮于1ml无菌PlasmaLyteA培养基中。将0.25mL的细胞悬浮液皮内注射到包括近侧上肢和下肢的4个分开位点内。在注射后至少1小时监控患者的急性毒性。
简言之，单核细胞用ALVAC-p53或ALVAC-对照感染，且如先前描述(Pisarev等人，2003)如早期所述(Nikitina等人，2001)使用自动ELISPOT阅读器(CTL)评估IFN-γ生产细胞的数目。所有ELISPOT实验一式四份地进行。
抗p53和抗Adv抗体水平使用至少4个系列稀释度在ELISA中进行评估。由制造商提供的内部对照用于建立“截止”水平。
患者评估。监控患者的毒性、特别是关于自身免疫性的证据。关于血液学毒性的CBC监控、关于肾毒性的血清肌酸酐监控，关于肝毒性的LFT监控，和标准临床毒性评估将在免疫接种期间自始至终每隔一周进行一次。另外，医疗史和体格检查将在每月一次的基础上进行。
免疫应答评估。在ELISPOT测定法中进行IFN-γ生产细胞分析。在疫苗接种前、3次疫苗接种完成后2-3周和2个月后从患者中收集外周血单核细胞。样品以等分试样保存在液氮中。来自1个患者的样品被解冻且同时进行分析。包含全长野生型p53的重组金丝雀痘病毒ALVAC-p53从Aventis Pasteur(Toronto，Canada)获得。ALVAC-对照包含空载体。单核细胞在无血清培养基中以4蚀斑形成单位(PFU)/细胞的感染复数(MOI)用ALVAC-p53或ALVAC-对照感染2小时。感染后，将细胞一式四份地接种在用抗IFN-γ抗体预包被的96孔板中的补充IL-2的完全培养基中(2×105细胞/孔)，且孵育36小时。IFN-γ生产细胞数目如先前描述(Nikitina等人，2001；Pisarev等人，2003)使用自动ELISPOT阅读器(CTL)进行评估。
在HLA-A2阳性患者中，MNC与10μg/ml p53衍生的HLA-A2结合肽LLGRNSFEV或对照PSA衍生肽FLTPKKLQCV一起平行孵育36小时。IFN-γ生产细胞数目如先前描述(Pisarev等人，2003)在ELISPOT测定法中进行评估。
四聚体染色。四聚体HLA-A-0201/LLGRNSFEV在耶基斯地区灵长类动物研究中心(Yerkes Regional Primate Research Center)的NIAID MHC四聚体核心机构中进行。MNC细胞用APC缀合的抗CD8抗体和PE缀合的四聚体(1∶100稀释)于4℃染色60分钟。计算CD8+ T细胞群体内的四聚体阳性细胞比例。
人免疫应答的评估。抗p53和抗Adv抗体水平(IgG和IgM)使用至少4个系列稀释度在ELISA中进行评估。由制造商提供的内部对照用于建立“截止”水平。样品始终一式两份地进行测定。吸光度在分光光度计上450nm波长处针对620nm的参考滤光片进行阅读，以便补偿微量滴定板材料的差异。p53-Autoantibody Elisa PLUS kit(Oncogene Research)用于测量人血清样品中针对p53的循环抗体。腺病毒IgG/IgM ELISA试剂盒购自IBL Immuno-BiologicalLaboratories(Hamburg，Germany)。
统计分析。接受至少一次疫苗的所有患者对于从其第一次用Ad-p53 DC疫苗治疗时的毒性是可评估的。接受至少一次疫苗的3个患者具有早期进展且在接受使用3次疫苗的最低限度治疗前从研究中去除，且在最终分析中加以考虑。存活评估使用Kaplan和Meier的方法进行测定，而变量使用Greenwood氏公式进行计算。Log排序测试(log rank test)用于测定2条存活曲线之间的差异显著性。
参考文献
下列参考文献特别引入本文作为参考，参考的程度为它们提供补充本文阐述的那些的示例性操作或其他细节。
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尽管本发明及其优点已得到详细描述，但应当理解无需背离权利要求限定的本发明的精神和范围即可在本文中进行各种变化、替代和改变。此外，本申请的范围不希望限制于说明书中描述的过程、机器、制备、物质组合物、手段、方法和步骤的具体实施方案。如本领域普通技术人员由于本发明的公开内容将容易理解的，基本上执行相同的功能或达到基本上与本文所述相应实施方案相同结果的目前存在或以后开发的过程、机器、制备、物质组合物、手段、方法或步骤可以根据本发明使用。因此，权利要求预期在其范围内包括此类过程、机器、制备、物质组合物、手段、方法或步骤。
序列表
<110>ANTONIA，SCOTT
     GABRILOVICH，DMITRY I.
     CHADA，SUNIL
     MENANDER，KERSTIN B.
<120>用于癌症治疗的p53疫苗
<130>INGN：131WO
<140>UNKNOWN
<141>2006-05-12
<150>60/680,284
<151>2005-05-12
<160>3
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1303
<212>DNA
<213>智人
<400>1
gtccaggagc aggtagctgc tgggctccgg ggacactttg cgttcgggct gggagcgtgc    60
tttccacgac ggtgacacgc ttccctggat tggcagccag actgccttcc gggtcactgc   120
catggaggag ccgcagtcag atcctagcgt cgagccccct ctgagtcagg aaacattttc   180
agacctatgg aaactacttc ctgaaaacaa cgttctgtcc cccttgccgt cccaagcaat   240
ggatgatttg atgctgtccc cggacgatat tgaacaatgg ttcactgaag acccaggtcc   300
agatgaagct cccagaatgc cagaggctgc tccccccgtg gcccctgcac cagcgactcc   360
tacaccggcg gcccctgcac cagccccctc ctggcccctg tcatcttctg tcccttccca   420
gaaaacctac cagggcagct acggtttccg tctgggcttc ttgcattctg ggacagccaa   480
gtctgtgact tgcacgtact cccctgccct caacaagatg ttttgccaac tggccaagac   540
ctgccctgtg cagctgtggg ttgattccac acccccgccc ggcacccgcg tccgcgccat   600
ggccatctac aagcagtcac agcacatgac ggaggttgtg aggcgctgcc cccaccatga   660
gcgctgctca gatagcgatg gtctggcccc tcctcagcat cttatccgag tggaaggaaa   720
tttgcgtgtg gagtatttgg atgacagaaa cacttttcga catagtgtgg tggtgcccta   780
tgagccgcct gaggttggct ctgactgtac caccatccac tacaactaca tgtgtaacag   840
ttcctgcatg ggcggcatga accggaggcc catcctcacc atcatcacac tggaagactc   900
cagtggtaat ctactgggac ggaacagctt tgaggtgcgt gtttgtgcct gtcctgggag   960
agaccggcgc acagaggaag agaatctccg caagaaaggg gagcctcacc acgagctgcc  1020
cccagggagc actaagcgag cactgcccaa caacaccagc tcctctcccc agccaaagaa  1080
gaaaccactg gatggagaat atttcaccct tcagatccgt gggcgtgagc gcttcgagat  1140
gttccgagag ctgaatgagg ccttggaact caaggatgcc caggctggga aggagccagg  1200
ggggagcagg gctcactcca gccacctgaa gtccaaaaag ggtcagtcta cctcccgcca  1260
taaaaaactc atgttcaaga cagaagggcc tgactcagac tga                    1303
<210>2
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<400>2
Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val
  1               5                   10
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成肽
<400>3
Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val
  1               5

Claims (62)

1.一种给予或恢复受试者中一种或多种治疗抗性过度增殖细胞的敏感性的方法，其中所述过度增殖细胞的特征在于自身基因产物的改变或增加表达，所述方法包括给所述受试者提供表达所述自身基因产物的树突细胞。
2.权利要求1的方法，其中所述治疗抗性过度增殖细胞进一步定义为对药物、放射或两者有抗性。
3.权利要求1的方法，其中所述治疗抗性过度增殖细胞进一步定义为对干扰素、白介素、抗体、抑制剂、其混合物或其组合有抗性。
4.权利要求3的方法，其中所述抗体进一步定义为单克隆抗体。
5.权利要求4的方法，其中所述单克隆抗体进一步定义为针对Her-2/neu的单克隆抗体。
6.权利要求5的方法，其中所述针对Her-2/neu的单克隆抗体是曲妥单抗。
7.权利要求4的方法，其中所述单克隆抗体进一步定义为针对VEGF的单克隆抗体。
8.权利要求7的方法，其中所述针对VEGF的抗体进一步定义为Avastin。
9.权利要求3的方法，其中所述抑制剂进一步定义为VEGF抑制剂。
10.权利要求2的方法，其中所述药物包括泰素、托泊替康、顺铂、卡铂、阿霉素、环磷酰胺、或泰索帝。
11.权利要求2的方法，其中所述药物是烷化剂。
12.权利要求11的方法，其中所述烷化剂是白消安、顺铂、或异磷酰胺。
13.权利要求2的方法，其中所述药物是蒽环类药物。
14.权利要求13的方法，其中所述蒽环类药物是多柔比星或表柔比星。
15.权利要求2的方法，其中所述药物是抗代谢物。
16.权利要求15的方法，其中所述抗代谢物是氟尿嘧啶或氨甲蝶呤。
17.权利要求2的方法，其中所述药物是拓扑异构酶抑制剂。
18.权利要求17的方法，其中所述拓扑异构酶抑制剂是博来霉素、依托泊苷、或吉西他滨。
19.权利要求2的方法，其中所述药物是微管抑制剂。
20.权利要求19的方法，其中所述微管抑制剂是紫杉醇或长春碱。
21.权利要求2的方法，其中所述药物是单克隆抗体。
22.权利要求21的方法，其中所述单克隆抗体是曲妥单抗、贝伐单抗、甲磺酸伊马替尼、吉非替尼或埃洛替尼。
23.权利要求1的方法，其进一步包括给所述受试者施用另外疗法。
24.权利要求23的方法，其中所述另外疗法包含药物、金属、放射、手术、基因疗法、免疫疗法、激素疗法、或其组合。
25.权利要求23的方法，其中所述另外疗法包含化学疗法。
26.权利要求25的方法，其中所述化学疗法包含上调p53、Fas、死亡受体或其组合表达的组合物。
27.权利要求23的方法，其中所述树突细胞和所述另外疗法同时或依次地提供给所述受试者。
28.权利要求27的方法，其中所述树突细胞在所述进一步疗法之前提供给所述受试者。
29.权利要求28的方法，其中所述另外疗法在提供所述树突细胞给所述受试者的约1至12个月内提供给所述受试者。
30.权利要求23的方法，其中所述树突细胞和所述另外疗法提供超过一次。
31.权利要求30的方法，其中所述树突细胞和所述另外疗法循环提供。
32.权利要求23的方法，其中所述树突细胞在所述另外疗法之后提供给所述受试者。
33.权利要求32的方法，其中所述树突细胞在提供所述进一步疗法给所述受试者的约1至2个月内提供给所述受试者。
34.权利要求1的方法，其中提供包括施用由表达所述自身基因产物的表达构建体转化的树突细胞。
35.权利要求1的方法，其中提供包括给所述受试者中的树突细胞施用表达所述自身基因产物的表达构建体。
36.权利要求35的方法，其中所述表达构建体包含腺病毒载体。
37.权利要求35的方法，其中所述自身基因产物包含p53。
38.权利要求35的方法，其中所述自身基因产物包含肿瘤抑制物或原癌基因产物。
39.权利要求35的方法，其中所述自身基因产物进一步定义为在癌细胞中上调的基因产物。
40.权利要求35的方法，其中所述自身基因产物包含存活素(survivin)、Her2/neu、CEA、ras、TERT、NY-ESO、PSA、CEA、MART、MAGE1、MAGE3、gp100、BAGE、GAGE、TRP-1、TRP-2、或PMSA。
41.权利要求1的方法，其中所述过度增殖细胞是癌细胞。
42.权利要求41的方法，其中所述癌细胞是转移癌细胞。
43.权利要求1的方法，其中所述过度增殖细胞是小细胞肺癌细胞。
44.权利要求1的方法，其中所述过度增殖细胞是来自肺癌、乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、肝癌、脑癌、前列腺癌、肾癌、肉瘤、胰腺癌、淋巴瘤或白血病的细胞。
45.权利要求1的方法，其进一步包括给所述受试者递送增强表达所述自身基因产物的所述树突细胞活性的试剂。
46.权利要求45的方法，其中所述试剂包含抗体。
47.权利要求45的方法，其中所述试剂包含单克隆抗体。
48.权利要求45的方法，其中所述试剂包含CD40抗体。
49.权利要求45的方法，其中表达所述自身基因产物的所述树突细胞和所述试剂包含在同一组合物中。
50.权利要求45的方法，其中表达所述自身基因产物的所述树突细胞和所述试剂包含在分开的组合物中。
51.权利要求50的方法，其中表达所述自身基因产物的所述树突细胞和所述试剂同时给所述受试者递送。
52.权利要求50的方法，其中表达所述自身基因产物的所述树突细胞在所述试剂递送给所述受试者之前递送给所述受试者。
53.权利要求50的方法，其中表达所述自身基因产物的所述树突细胞在所述试剂递送给所述受试者之后递送给所述受试者。
54.权利要求1的方法，其中所述受试者先前已用化学疗法、放射或两者治疗。
55.权利要求1的方法，其进一步包括测定来自所述受试者的样品中的所述过度增殖细胞的步骤。
56.权利要求55的方法，其中所述样品包含活检样品、血液、尿、颊刮屑、唾液、脑脊液、粪便、乳头抽吸液、或其组合。
57.权利要求55的方法，其进一步定义为测定所述样品的治疗抗性标记。
58.权利要求57的方法，其中所述治疗抗性标记包含一种或多种所述过度增殖细胞的多核苷酸中的突变。
59.一种治疗受试者中的一种或多种过度增殖细胞的方法，其中所述一种或多种过度增殖细胞对用于所述过度增殖细胞的临床公认疗法有抗性，或其中所述一种或多种过度增殖细胞在暴露于用于所述过度增殖细胞的临床公认疗法后将变得有抗性，并且其中所述过度增殖细胞的特征在于自身基因产物的改变或增加表达，所述方法包括给所述受试者提供表达所述自身基因产物的树突细胞。
60.权利要求59的方法，其中在暴露于所述临床公认疗法后将变得有抗性的所述过度增殖细胞包含具有与所述抗性有关的一种或多种突变的多核苷酸。
61.权利要求59的方法，其进一步包括给所述受试者递送增强表达所述自身基因产物的所述树突细胞活性的试剂。
62.一种治疗或预防治疗抗性过度增殖细胞发生的方法，其中所述过度增殖细胞的特征在于自身基因产物的改变或增加表达，所述方法包括给所述受试者提供表达所述自身基因产物的树突细胞。
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