JP5502823B2 - Ｂｃｌ−２ファミリ−に属するタンパク質およびそのフラグメント、ならびに癌患者におけるそれらの使用 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、概して、癌の予防と治療の分野に関係する。具体的には、抗癌性免疫応答を誘発することができる単離されたアポトーシス調節タンパク質またはそのペプチドフラグメントが提供される。特に、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するそのようなタンパク質、およびその免疫原性ペプチドフラグメントの、がんの処置、診断、および予後診断における使用が提供される。

（技術的背景および先行技術）
広範囲の種々の化学療法薬に対する癌細胞による耐性発現は、癌の処置の成功への大きな障害となっている。薬剤耐性は、広い範囲の癌細胞のタイプにおいて観察されている。多くの機構が薬剤耐性の原因となっており、これには、薬剤の不活化、細胞膜ポンプによる薬剤の押し出し、薬剤標的の変異、およびアポトーシスを開始できないことが含まれる。アポトーシスの妨げは、ミトコンドリア膜電位の保持、およびサイトカイン刺激を含む種々の状態によって起こり得る。

薬剤耐性の表現型に関与しているタンパク質についての研究は、抗アポトーシス性分子Ｂｃｌ−２に関係している。Ｂｃｌ−２の過剰発現は、白血病や他のアポトーシスの傾向がある腫瘍における薬剤耐性の発現において役割を担っており、結果として、種々のヒトの癌においては、予後は不良となる。Ｂｃｌ−２は１つのタンパク質のファミリーであるＢｃｌ−２ファミリーに属する。これらのメンバーはアポトーシスを調節する。このファミリーには、プロアポトーシス性のメンバーと、抗アポトーシス性のメンバーの両方が含まれている。Ｂｃｌ−２がその抗アポトーシス効果をどのようにして発揮するかについての正確な理解は未だはっきりしないままであるが、これは、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、および乳癌を含む多くの癌、さらには、白血病およびリンパ腫において過剰発現されていることが明らかにされている。

したがって、Ｂｃｌ−２は、そのタンパク質の高い発現レベルが、アポトーシスの刺激に対する抵抗性を与え、それにより、癌の発病と進行に関係しているので、重要な細胞性因子である。

哺乳動物の免疫システムが外因性物質または外来物質を認識してそれと反応するプロセスは、複雑なプロセスである。このシステムの重要な面はＴ細胞応答である。この応答には、Ｔ細胞が、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を構成するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と呼ばれる細胞表面分子とペプチドの複合体を認識してこれと相互作用することが必要である。ペプチドは大きな分子に由来し、これは細胞によってプロセシングされ、順にＨＬＡ／ＭＨＣ分子を提示する。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチドの複合体との相互作用は制限され、ＨＬＡ分子とペプチドの特定の組み合わせについて特異的であるＴ細胞が必要である。特異的Ｔ細胞が存在しなければ、たとえそのパートナーである複合体が存在していてもなお、Ｔ細胞応答は生じない。同様に、特異的複合体が存在していなければ、Ｔ細胞が存在していても応答は生じない。

Ｔ細胞が細胞の異常を認識する機構もまた癌に関係している。例えば、特許文献１においては、ペプチドへとプロセシングされ、次いで、細胞表面で発現され、そして特異的ＣＴＬによる腫瘍細胞の溶解を導くことができる遺伝子のファミリーが開示されている。これらの遺伝子は、ＭＡＧＥファミリーと呼ばれ、「腫瘍拒絶抗原前駆体」、すなわち「ＴＲＡＰ」分子をコードすると言われており、これらに由来するペプチドは、「腫瘍拒絶抗原」、すなわち「ＴＲＡ」と呼ばれている。

特許文献２では、ＨＬＡ−Ａ１分子に結合するノナペプチドが開示されている。この参考文献には、特定のＨＬＡ分子に対する特定のペプチドの既知の特異性を前提とすると、１つの特定のペプチドは１つのＨＬＡ分子に結合するが他の分子には結合しないと予想されるはずであることが開示されている。このことは、種々の個体が異なるＨＬＡ表現型を有しているので、重要である。結果として、特定のＨＬＡ分子についてのパートナーであるとして特定のペプチドを同定することには診断効果および治療効果があるが、これらはその特定のＨＬＡ表現型を有している個体についてのみ関係がある。

したがって、ＭＨＣ分子の状況において、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するペプチドエピトープが細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって抗原として認識され得ることは十分に確立される。しかし、一般的には、全てではないがほとんどの腫瘍が抗原性であると受け入れられているが、ごく一部のものは、腫瘍の進行が免疫系によって容易に制御されるという意味において実際に免疫原性である。

この限界を克服するために、いくつかの免疫療法の研究、例えば、ＴＡＡ由来のペプチドでのワクチン接種が開始されている。それについてのＣＴＬによって定義されるＴＡＡの最大数が特徴とされている腫瘍である黒色腫については、抗原に対する強力なＣＴＬ応答がワクチン接種によって誘導されており、一部の患者については、その疾患の完全な緩解が得られている。しかし、これらのワクチン接種試験に使用されたペプチドエピトープのほとんどは、黒色腫特異的なものであり、これらのペプチドは黒色腫以外を起源とする腫瘍については適用できない。さらに、これらのＴＡＡの発現は、種々の患者に由来する腫瘍の間でも不均一であり、１人の患者から得られた複数の転移の間でさえも異なり得る。しかし、過去２〜３年の間に、多数の種々の癌において発現される多数の腫瘍特異的ペプチド抗原、すなわち、ＨＥＲ−２、Ｍｕｃ−１、およびテロメラーゼが同定されている。

アポトーシスは、細胞の自殺についての遺伝的プログラムであり、アポトーシスの阻害は、トランスフォーミング変異の蓄積を好む細胞の寿命を延ばすことによって、癌の形成に関与している重要な機構であることが示唆されている。サービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）は、最近同定されたアポトーシスタンパク質の阻害因子（ＩＡＰ）のファミリーのメンバーである。約４００万個の転写物についての全体的な遺伝子発現の分析において、サービビンは、多くのタイプの癌において必ずアップレギュレートされているトップクラスの遺伝子の１つとして同定されたが、これは、正常な組織においてはアップレギュレートされていない。サービビンを過剰発現する充実性悪性腫瘍としては、肺癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、および前立腺癌、ならびに造血器悪性腫瘍が挙げられる。さらに、一連の黒色腫、および黒色腫以外の皮膚癌は、必ずサービビンポジティブであることが報告されている。ほとんどのヒトの癌におけるサービビンの過剰発現は、腫瘍の進行におけるアポトーシスの阻害の一般的な役割、結腸直腸癌および膀胱癌、ならびに神経芽細胞種の症例におけるその観察により確認された概念、サービビンの発現が、好ましくない予後を伴うことを示唆している。対照的に、サービビンは、正常な成体組織においては検出することはできない。これらの特徴により、サービビンは、診断目的および治療目的の両方について適切なＴＡＡであるとみなされている。

したがって、最近の１０年間の間に、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）制限様式でＣＴＬによって認識される多数のＴＡＡが同定されている。サービビンは、ほとんどのヒトの癌において過剰に発現されており、その機能の阻害はアポトーシスの増大を生じるので、このタンパク質は、治療的なＣＴＬ応答の標的とできる可能性がある。

サービビンタンパク質、およびその診断的および治療的使用の可能性は、（１）と特許文献３（これは、引用により本明細書中に組み入れられる）に開示されている。サービビンは、ＲＩＮＧフィンガーの代わりに、Ｂ細胞前駆体中に導入されると成長因子（ＩＬ−３）の回収によって誘導されるアポトーシスを阻害する、１つのＢＩＲと高電荷のカルボキシ末端のコイルドコイル領域を含む、１６．５ｋＤａの細胞質タンパク質である。サービビンをコードする遺伝子は、エフェクター細胞プロテアーゼレセプター−１（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１：ＥＰＲ−１）の配列とほぼ同じであるが、反対方向を向いており、したがって、このことは、頭と頭をつきあわせた状態の構造で重複している２つの別の遺伝子が存在することを示唆している。したがって、サービビンは、アンチセンスＥＰＲ−１産物と記載することができる。機能的には、その天然のアンチセンスＥＰＲ−１転写物をアップレギュレートすることによるサービビンの発現の阻害によって大規模なアポトーシスが生じ、細胞増殖が減少する。

特許文献３には、精製されたサービビンの単離が開示されており、これによって、サービビンタンパク質をコードする核酸分子、ならびに、サービビンに結合する抗体および他の分子が提供されている。特許文献３にはまた、サービビンタンパク質の抗アポトーシス活性を有しているフラグメント、ならびに、開示されているサービビン配列のＮ末端もしくはＣ末端に、またはその内部にアミノ酸残基が挿入されているその変異体も開示されている。このようなペプチドはアポトーシスに必要な重要な機能を有している残基、すなわち、６７位のＴｒｐ、７３位のＰｒｏ、および８４位のＣｙｃを含まなければならないことが、具体的に開示されている。

最近の１０年間の間には、多数の臨床試験により、癌患者において抗腫瘍Ｔ細胞応答を誘導するためのペプチド特異的ワクチン接種の実現可能性が示されている。しかし、患者の臨床的な経過は、ほとんどの症例において改善されなかった。この不一致は、多数の症例において、腫瘍細胞の免疫回避機構によって説明されている。癌の増殖において十分ではない役割を担っている抗原を標的化する治療ストラテジーについては、抗原を欠損している癌細胞の選択が、十分に認識されている限界である。

しかし、乳癌患者の場合には、Ｂｃｌ−２タンパク質の矛盾する役割が観察されている。原発性の乳房の腫瘍においては、Ｂｃｌ−２は、悪い臨床結果にネガティブに関係している。さらに、Ｂｃｌ−２タンパク質の過剰発現はＢｃｌ−２遺伝子のプロモーター領域中にあるエストロゲンレセプター応答エレメントによって媒介されるエストロゲンレセプター陽性腫瘍に関係していることが報告されている。エストロゲン陽性腫瘍の予後は、エストロゲンレセプター陰性腫瘍の予後よりもさらに好ましい。これらの一見矛盾する結果についてのいくつかの可能性のある説明が示唆されており、例えば、細胞増殖に対するＢｃｌ−２の阻害作用、Ｂｃｌ−２発現のエストロゲンによる調節、および／またはその細胞防御機能を阻害するＢｃｌ−２アンタゴニストの存在である。
さらに、上記の研究によって、また、乳癌におけるＢｃｌ−２の過剰発現が薬剤耐性に関係していること、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＢｃｌ−２のダウンレギュレーションによってアポトーシスに関係している薬剤感受性が調節されることも示されている。さらに、Ｂｃｌ−２の乳癌細胞株への遺伝子トランスフェクションは、アポトーシスに対する抵抗性の増大を一様に生じる。さらに、乳癌における別のアポトーシス阻害因子であるタンパク質サービビンの存在は、Ｂｃｌ−２の発現と、アポトーシス指数（ＡＩ）の低下、および全体的な低い生存性に強く関係していることが記載されている。サービビンとＢｃｌ−２との間での同様の関連性が、神経芽細胞腫、胃癌、結腸直腸癌、高悪性度の非ホジキンリンパ腫において記載されている。したがって、ほとんどの他のヒトの癌においてそうであるのと同様に乳癌においても、アポトーシスの阻害は一般的な特徴であり、抗アポトーシス性遺伝子、例えば、サービビンおよび／またはＢｃｌ−２遺伝子の発現により、アポトーシス指数の低下において反映されるようなさらに強い抗アポトーシス効果が生じ得る。最近、サービビンが、種々の癌を有している患者において自然に発生するＴ細胞応答の標的であることが示されている。これらの初期の発見は後に確認され、深められた（彼ら自身によって、および他者によって）。

国際公開第９２／２０３５６号パンフレット 国際公開第９４／０５３０４号パンフレット 米国特許第６，２４５，５２３号明細書

（発明の要旨）
本発明は、ＭＨＣクラスＩ制限ペプチドを、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ分子に結合することができ、それによって癌疾患に罹患している患者においてＣＴＬ免疫応答を誘発することができる、サービビン以外の種々のクラスのアポトーシス調節タンパク質、すなわち、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーから導くことができることの発見に基づく。これらの発見は、細胞によってインビボでＴＲＡ機能を有しているペプチドにプロセシングされるＢｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するタンパク質がＴＲＡＰ分子として作用することを示している。これらの発見により、癌疾患の制御に一般的に適応することができる新規の治療アプローチおよび診断アプローチへの道が開かれた。

本発明により、Ｂｃｌ−２は広範な癌疾患に対する免疫療法の適切な標的であることが開示される。Ｂｃｌ−２は重要な細胞因子であり、その発現は腫瘍細胞の生存に重要である。したがって、Ｂｃｌ−２は、このタンパク質の発現のダウンレギュレーションまたは発現の欠損による免疫回避によって持続的な腫瘍の増殖が損なわれるので、ワクチン接種の魅力的な標的である。さらに、本発明に至る研究において、本発明者らは、乳癌患者においてＢｃｌ−２に由来するペプチドに対してＰＢＬ中に自然に生じるＴ細胞反応性について、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して研究し、これを検出した。

したがって、本発明は、第１の態様においては、癌の予防または処置において医薬として使用するための、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属する単離されたタンパク質、またはその免疫原性活性のあるペプチドフラグメントに関する。具体的には、本発明は、癌の予防または処置において医薬として使用するための、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するタンパク質に由来する免疫原性活性のある単離されたペプチドフラグメントに関する。

さらなる態様においては、本発明によって、本発明の上記タンパク質および／またはペプチドフラグメントを含む薬学的組成物が提供される。

癌の予防または処置において医薬として使用するための、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属する単離されたタンパク質またはその免疫原性活性のあるペプチドフラグメント、あるいは、上記タンパク質または上記ペプチドフラグメントをコードする核酸を含むワクチン組成物を提供することもまた、本発明の別の態様である。

なおさらなる態様においては、本発明は、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーと反応するＰＢＬ中または腫瘍組織中のＴ細胞が癌患者の中に存在することの、エキソビボまたはインサイチュでの診断のための診断キットに関する。このキットには、上記で定義された本発明のペプチドフラグメント；本発明のペプチドフラグメントとクラスＩ ＨＬＡ分子またはそのような分子のフラグメントとの複合体が含まれる。

癌患者において、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーメンバー反応性Ｔ細胞の存在を検出する方法を提供することもまた、本発明の目的である。この方法には、腫瘍組織または血液サンプルを上記で定義された本発明の複合体と接触させること、組織または血液細胞に対する複合体の結合を検出することが含まれる。

さらに、本発明のペプチドフラグメントに特異的に結合することができる分子、およびそのような結合をブロックすることができる分子が提供される。

別の態様においては、本発明は、癌疾患を処置する方法に関する。この方法には、有効量の本発明の薬学的組成物、本発明のペプチドフラグメントに特異的に結合することができる本発明の分子、および／またはそのような結合をブロックすることができる本発明の分子を、疾患に罹患している患者に投与することが含まれる。

さらに別の態様においては、本発明により、癌疾患の処置のための医薬を製造することにおける、本明細書中で定義されるタンパク質またはペプチドフラグメントの使用が提供される。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属する単離されたタンパク質もしくはその免疫原性活性のあるペプチドフラグメント、または、該タンパク質もしくは該ペプチドフラグメントをコードする核酸を含む、医薬として使用するためのワクチン組成物。
（項目２）
前記ワクチン組成物は、癌患者に投与される場合、癌疾患に対する免疫応答を誘発し得る、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記ワクチン組成物は、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーが発現される癌患者に投与される場合、癌疾患に対する免疫応答を誘発し得る、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記タンパク質が、Ｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシス性のメンバーからなる群より選択される、項目１〜３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目５）
前記タンパク質が、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ｂｆｌ−１／Ａ１、Ｂｃｌ−ｂ、Ｂｃｌ２−Ｌ−１０、およびＢｃｌ−Ｘ _Ｌ からなる群より選択される、項目１〜３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目６）
前記タンパク質が、Ｂａｘ、Ｂｏｋ／Ｍｔｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ，Ｂｉｄ、Ｈｒｋ／ＤＰ５、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｂｍｆ、およびＰＵＭＡ／ｂｂｃ３からなる群より選択される、項目１〜３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目７）
前記タンパク質がＢｃｌ−２である、項目５に記載のワクチン組成物。
（項目８）
前記タンパク質がＢｃｌ−Ｘ _Ｌ である、項目５に記載のワクチン組成物。
（項目９）
前記タンパク質がＭｃｌ−１である、項目５に記載のワクチン組成物。
（項目１０）
癌の予防または処置において医薬として使用するための、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するタンパク質に由来する単離された免疫原性活性のあるペプチドフラグメント。
（項目１１）
前記タンパク質が、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ｂｆｌ−１／Ａ１、Ｂｃｌ−ｂ、Ｂｃｌ２−Ｌ−１０、およびＢｃｌ−Ｘ _Ｌ からなる群より選択される、項目１０に記載のペプチドフラグメント。
（項目１２）
前記タンパク質が、Ｂａｘ、Ｂｏｋ／Ｍｔｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ、Ｂｉｄ、Ｈｒｋ／ＤＰ５、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｂｍｆ、およびＰＵＭＡ／ｂｂｃ３からなる群より選択される、項目１０に記載のペプチドフラグメント。
（項目１３）
前記タンパク質がＢｃｌ−２である、項目１１に記載のペプチドフラグメント。
（項目１４）
前記タンパク質がＢｃｌ−Ｘ _Ｌ である、項目１１に記載のペプチドフラグメント。
（項目１５）
前記タンパク質がＭｃｌ−１である、項目１１に記載のペプチドフラグメント。
（項目１６）
癌患者において細胞性免疫応答を誘発し得る、項目１０〜１５のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目１７）
以下の特徴：
（ｉ）クラスＩ ＨＬＡ分子の最大回復量の半分を回復し得るペプチドの量（Ｃ _５０ 値）によって測定される親和性で制限される、クラスＩ ＨＬＡ分子に結合する能力、であって、該Ｃ _５０ 値は、本明細書中に記載されるアセンブリ結合アッセイによって決定した場合に、最大５０μＭである、能力
（ｉｉ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した場合に１０ ^４ 個のＰＢＬあたり少なくとも１個の頻度で、癌患者のＰＢＬ集団中にＩＦＮ−γを産生する細胞を誘発する能力、および／または
（ｉｉｉ）エピトープペプチドと反応するＣＴＬを、腫瘍組織中においてインサイチュで検出する能力
のうちの少なくとも１つを有するＭＨＣ クラスＩ制限ペプチドである、項目１０〜１６のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目１８）
最大３０μＭであるＣ _５０ 値を有する、項目１７に記載のペプチドフラグメント。
（項目１９）
最大２０μＭであるＣ _５０ 値を有する、項目１７に記載のペプチドフラグメント。
（項目２０）
ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ａ分子によって制限される、項目１７に記載のペプチドフラグメント。
（項目２１）
ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１、およびＨＬＡ−Ａ２４からなる群より選択されるＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ種によって制限される、項目２０に記載のペプチドフラグメント。
（項目２２）
ＨＬＡ−Ａ２によって制限される、項目１７に記載のペプチドフラグメント。
（項目２３）
ＡＬＶＧＡＣＩＴＬ（配列番号１）、ＡＬＳＰＶＰＰＶＶ（配列番号２）、ＳＬＡＬＶＧＡＣＩ（配列番号３）、ＫＴＬＬＳＬＡＬＶ（配列番号４）、ＬＬＳＬＡＬＶＧＡ（配列番号５）、ＷＬＳＬＫＴＬＬＳＬ（配列番号６）、ＡＡＡＧＰＡＬＳＰＶ（配列番号７）、ＰＬＦＤＦＳＷＬＳＬ（配列番号８）、ＦＴＡＲＧＲＦＡＴＶ（配列番号９）、ＹＬＮＲＨＬＨＴＷＩ（配列番号１０）、ＮＩＡＬＷＭＴＥＹＬ（配列番号１１）からなる群より選択される配列を含む、項目１０〜１１、および１６〜１９のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目２４）
前記ペプチドが、ＴＡＹＱＳＦＥＱＶ（配列番号４３）、ＹＬＮＤＨＬＥＰＷＩ（配列番号４２）、ＲＩＡＡＷＭＡＴＹＬ（配列番号４５）、ＷＭＡＴＹＬＮＤＨＬ（配列番号４６）、ＶＬＶＳＲＩＡＡＷＭ（配列番号４８）およびＶＡＦＦＳＦＧＧＡＬ（配列番号４９）からなる群より選択される配列を含む、項目１０〜１１、および１６〜１９のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目２５）
前記ペプチドが、配列ＲＩＡＡＷＭＡＴＹ（配列番号５０）を含む、項目１０〜１１、および１６〜１９のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目２６）
前記ペプチドが、ＲＬＬＦＦＡＰＴＲ（配列番号５５）およびＲＴＫＲＤＷＬＶＫ（配列番号５６）からなる群より選択される配列を含む、項目１０〜１１、および１６〜１９のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目２７）
前記ペプチドが、ＰＡＥＥＥＥＤＤＬＹ（配列番号５８）およびＱＳＬＥＩＩＳＲＹ（配列番号６０）からなる群より選択される配列を含む、項目１０〜１１、および１６〜１９のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目２８）
前記ペプチドが、ＲＬＫＲＤＷＬＶＫ（配列番号６２）、ＱＳＤＥＩＩＳＲＹ（配列番号６３）、およびＱＳＥＥＩＩＳＲＹ（配列番号６４）からなる群より選択される、項目１０〜１１、および１６〜１９のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目２９）
ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ｂ分子によって制限される、項目１７に記載のペプチドフラグメント。
（項目３０）
ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ２７、およびＨＬＡ−Ｂ５１からなる群より選択されるＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ｂ種によって制限される、項目２９に記載のペプチドフラグメント。
（項目３１）
最大２０個のアミノ酸残基を含む、項目１０〜３０のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目３２）
最大１５個のアミノ酸残基を含む、項目３１に記載のペプチドフラグメント。
（項目３３）
ノナペプチドまたはデカペプチドである、項目３２に記載のペプチドフラグメント。
（項目３４）
哺乳動物種から単離されたかまたは哺乳動物種に由来する天然の配列である、項目１０〜３３のいずれかに記載のタンパク質またはペプチドフラグメント。
（項目３５）
前記タンパク質がヒトタンパク質である、項目１０〜３４のいずれかに記載のタンパク質またはペプチドフラグメント。
（項目３６）
少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、欠失、または付加によって天然のＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーの配列から誘導される、項目１０〜３３のいずれかに記載のタンパク質またはペプチドフラグメント。
（項目３７）
各々の特定のＨＬＡ対立遺伝子について、以下の表に示されるアミノ酸残基のいずれかを含む、項目１０〜３６のいずれかに記載のペプチドフラグメント：

。
（項目３８）
１０ ^４ 個のＰＢＬあたり少なくとも１０個の頻度で癌患者のＰＢＬ集団中にＩＮＦ−γを産生する細胞を誘発することができる、項目１０〜３７のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目３９）
Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するタンパク質が発現される癌疾患を有する患者のＰＢＬ集団においてＩＦＮ−γを産生する細胞を誘発し得る、項目１０〜３８のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
（項目４０）
前記癌疾患が、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血器悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、ならびに前立腺癌からなる群より選択される、項目３９に記載のペプチドフラグメント。
（項目４１）
項目１０〜４０のいずれかに記載のペプチドフラグメントを含む、項目１〜９のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目４２）
項目２９に記載のペプチドフラグメントと組み合わせて項目１８に記載のペプチドフラグメントを含む、項目４１に記載のワクチン組成物。
（項目４３）
前記ワクチンが、ワクチン接種した患者において癌細胞に対して細胞傷害性作用を有するエフェクターＴ細胞の産生を誘発する、項目１〜９、および４１〜４２のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目４４）
Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーには属さないか、またはＢｃｌ−２タンパク質ファミリーには由来しないタンパク質またはペプチドフラグメントから選択される免疫原性タンパク質またはペプチドフラグメントをさらに含む、項目１〜９、および４１〜４３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目４５）
前記Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーには属さないかまたはＢｃｌ−２タンパク質ファミリーには由来しないタンパク質またはペプチドフラグメントが、細胞のアポトーシスの調節に関係するタンパク質、またはそれに由来するペプチドフラグメントである、項目４４に記載のワクチン組成物。
（項目４６）
前記Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーには属さないかまたはＢｃｌ−２タンパク質ファミリーには由来しないタンパク質またはペプチドフラグメントから選択される免疫原性タンパク質またはペプチドフラグメントが、サービビンまたはそのペプチドフラグメントである、項目４４に記載のワクチン組成物。
（項目４７）
前記Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーには属さないかまたはＢｃｌ−２タンパク質ファミリーには由来しないタンパク質またはペプチドフラグメントから選択される免疫原性タンパク質またはペプチドフラグメントが、ＭＬ−ＩＡＰまたはそのペプチドフラグメントである、項目４４に記載のワクチン組成物。
（項目４８）
アジュバントを含む、項目１〜９、および４１〜４７のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目４９）
前記アジュバントが、細菌ＤＮＡベースのアジュバント、油／界面活性剤ベースのアジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバント、およびイミダゾキニリンからなる群より選択される、項目４８に記載のワクチン組成物。
（項目５０）
前記ワクチン組成物が、タンパク質もしくはペプチドフラグメントまたは核酸を含む抗原提示細胞を含む、項目１〜９、および４１〜４９のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目５１）
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、項目５０に記載のワクチン組成物。
（項目５２）
前記組成物がリポソームを含む、項目１〜９、および４１〜５１のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目５３）
前記核酸が項目１０〜４０のいずれかに記載のペプチドをコードする、項目１に記載のワクチン組成物。
（項目５４）
前記核酸がベクター中に含まれる、項目１および５３のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目５５）
前記ベクターがウイルスベクターおよび細菌ベクターからなる群より選択される、項目５４に記載のワクチン組成物。
（項目５６）
前記ベクターが、Ｔ細胞刺激ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、項目５４〜５５のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目５７）
前記Ｔ細胞刺激ポリペプチドが、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３からなる群より選択される、項目５６に記載のワクチン組成物。
（項目５８）
項目１〜９、および４１〜５７のいずれかに記載のワクチン組成物と、さらなる抗癌剤とを含む、キット。
（項目５９）
前記抗癌剤が抗体である、項目５８に記載のキット。
（項目６０）
前記抗癌剤がサイトカインである、項目５９に記載のキット。
（項目６１）
癌患者における、ＰＢＬ中または腫瘍組織中でのＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーと反応性のＴ細胞の存在をエキソビボまたはインサイチュで診断するための組成物であって、項目１０〜４０のいずれかに記載のペプチドフラグメントを含む、組成物。
（項目６２）
癌患者における、ＰＢＬ中または腫瘍組織中でのＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーと反応性のＴ細胞の存在をエキソビボまたはインサイチュで診断するための診断キットであって、項目１０〜４０のいずれかに記載のペプチドフラグメントを含む、診断キット。
（項目６３）
項目１０〜４０のいずれかに記載のペプチドフラグメントと、クラスＩ ＨＬＡ分子またはそのような分子のフラグメントとの複合体。
（項目６４）
モノマーである、項目６３に記載の複合体。
（項目６５）
マルチマーである、項目６３に記載の複合体。
（項目６６）
癌患者においてＴ細胞と反応性のＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーの存在を検出する方法であって、該方法は、腫瘍組織または血液サンプルを項目６３に記載の複合体と接触させる工程、および該組織または該血液細胞に対する該複合体の結合を検出する工程を包含する、方法。
（項目６７）
項目１０〜４０のいずれかに記載のペプチドフラグメントに特異的に結合し得る、分子。
（項目６８）
抗体またはそのフラグメントである、項目６７に記載の分子。
（項目６９）
前記分子がＴ細胞レセプターである、項目６７に記載の分子。
（項目７０）
項目６７または６９に記載の分子の結合をブロックし得る、分子。
（項目７１）
癌疾患を処置する方法であって、該方法は、項目１〜９、および４１〜５７のいずれかに記載の組成物、項目６７に記載の分子、または項目７０に記載の分子、あるいは、項目５８〜６０のいずれかに記載のキットの有効量を、該疾患に罹患する患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目７２）
前記処置される疾患が、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーが発現される癌疾患である、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記癌疾患が、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血器悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、ならびに前立腺癌からなる群より選択される、項目７１に記載の方法。
（項目７４）
さらなる癌の処置と併用される、項目７１に記載の方法。
（項目７５）
前記さらなる処置が、化学療法、放射線治療、免疫賦活性物質での処置、遺伝子治療、抗体での処置、および樹状細胞を用いる処置からなる群より選択される、項目７１に記載の方法。
（項目７６）
癌疾患の処置または予防のための医薬の製造における、項目１０〜４０のいずれかに記載のペプチドフラグメント、または項目１〜９および４１〜５７のいずれかに記載のワクチン組成物の使用。
（項目７７）
前記処置される疾患が、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーが発現される癌疾患である、項目７６に記載の使用。
（項目７８）
前記癌疾患が、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血器悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、ならびに前立腺癌からなる群より選択される、項目７６〜７７のいずれかに記載の使用。
（項目７９）
さらなる癌の処置と併用される、項目７６〜７８のいずれかに記載の使用。
（項目８０）
前記さらなる処置が、化学療法、放射線治療、免疫賦活性物質での処置、遺伝子治療、抗体での処置、および樹状細胞を用いる処置からなる群より選択される、項目７９に記載の使用。
（項目８１）
免疫をモニタリングする方法であって、該方法は、以下の工程：
ｉ）個体から血液サンプルを提供する工程、
ｉｉ）Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するタンパク質またはそのペプチドフラグメントを提供する工程、
ｉｉｉ）該血液サンプルが、該タンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体またはＴ細胞レセプターを含むＴ細胞を含むかどうかを決定する工程、
ｉｖ）それによって、該個体において該タンパク質またはペプチドに対する免疫応答が惹起されているかどうかを決定する工程、
を包含する、方法。
（項目８２）
前記ペプチドフラグメントがいずれかの項目に記載のペプチドフラグメントである、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
項目６９に記載のＴ細胞レセプターを含む、単離されたＴ細胞。

図１は、Ｂｃｌ−２由来のＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドの同定を示す。クラスＩＭＨＣ重鎖のバンドを、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒを使用して定量した。安定化させられたＨＬＡ−Ａ２重鎖の量は、添加されたペプチドの結合親和性と直接関係している。ＨＬＡ−Ａ２制限ポジティブ対照ペプチドＨＩＶ Ｐｏｌ_４７６（黒四角）の結合を、ペプチドＢｃｌ_１７２（黒三角）、Ｂｃｌ_１８０（黒丸）、およびＢｃｌ_２００（白丸）と比較した。 図２は、Ｂｃｌ_１７２、Ｂｃｌ_１８０、Ｂｃｌ_２０８、およびＢｃｌ_２１４に対するＴ細胞応答を示す。１５人の乳癌患者に由来するＰＢＬを分析した。Ｔリンパ球をペプチドで１回刺激し、その後、ペプチドをともなわずに、またはペプチドとともにのいずれかで、３連で１ウェルあたり１０^５個の細胞をプレートした。ペプチド特異的スポットの平均の数（ペプチドを添加しなかったスポットを引き算した後）を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ ２．０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ，ＬＬＣ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＵＳ）を使用してそれぞれの患者について計算した。 図３は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定したＢｃｌ−２に対するＴ細胞応答を示す。１０人のＨＬＡ−Ａ２ポジティブＣＬＬ患者、３人のＨＬＡ−Ａ２ポジティブＡＭＬ患者、および２人の膵臓癌患者（ＰＣ）由来のＰＢＬを分析した。ペプチドＢｃｌ_２０８（Ａ）およびＢｃｌ_２１４（Ｂ）を試験した。Ｔリンパ球をペプチドで１回刺激し、その後、ペプチドをともなわずに、またはペプチドとともにのいずれかで、３連で１ウェルあたり１０^５個の細胞をプレートした。ペプチド特異的スポットの平均の数（ペプチドを添加しなかったスポットを引き算した後）を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ ２．０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ，ＬＬＣ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＵＳ）を使用してそれぞれの患者について計算した。応答細胞（１０^５個のリンパ球あたり、＞２５の抗原特異的スポットの平均数±１／２標準偏差と定義した）を、黒四角として印した。一方、応答のない個体は白四角で印した。 図４は、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ＥＬＩＳＰＯＴによるＢｃｌ−２特異的ＣＴＬの検出を示す。４人の別々の後期乳癌患者（ｂ１９、ｂ２０、ｂ２２、ｂ１６）と、健常な対照（ｈ１）に由来するＴリンパ球を、ペプチドで１回刺激し、その後、ペプチドＢｃｌ_２０８（Ａ）またはＢｃｌ_２１４（Ｂ）をともなわずに、あるいはペプチドとともにのいずれかで、３連で１ウェルあたり１０^５個の細胞をプレートした。ペプチド特異的Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂスポットの平均の数（ペプチドを添加しなかったスポットを引き算した後）を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ ２．０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ，ＬＬＣ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＵＳ）を使用してそれぞれの患者について計算した。応答細胞（１０^５個のリンパ球あたり、＞２５の抗原特異的スポットの平均数±１／２標準偏差と定義した）を、黒四角として印した。一方、応答のない個体は白四角で印した。 図５は、Ｂｃｌ−２特異的ＣＴＬ．ｂｃｌ_２０８反応性ＣＴＬの細胞溶解能力を、ＨＬＡ−Ａ２／ｂｃｌ_２０８でコーティングした磁気ビーズを使用して、乳癌患者由来のＰＢＬから単離したことを示す。Ａ）単離したバルクの培養物を、ｂｃｌ_２０８ペプチドを用いて（黒四角）、またはペプチドを伴わずに（白四角）、Ｔ２細胞の特異的溶解について分析した。Ｂ）ＨＬＡ−Ａ２ポジティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２１３（黒丸）およびＨＬＡ−Ａ２ネガティブ乳癌細胞株ＺＲ７５−１（白丸）のｂｃｌ_２０８で単離したＴ細胞による溶解。 図６は、ＩＮＦ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌに対するＨＬＡ−Ａ２制限Ｔ細胞応答を示す。１２人の健常な個体、１８人の乳癌患者（ＢＣ患者）、６人の黒色腫患者、および２人の膵臓癌患者（ＰＣ患者）に由来するＰＢＬを分析した。全ての個体がＨＬＡ−Ａ２ポジティブであった。ペプチドＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１７３−１８２}（ＹＬＮＤＨＬＥＰＷＩ）（配列番号４８）（Ａ）、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１４１−１５０}（ＶＡＦＦＳＦＧＧＡＬ）（配列番号４９）（Ｂ）、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６１−１７０}（ＶＬＶＳＲＩＡＡＷＭ）（配列番号４８）（Ｃ）、およびＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６５−１７４}（ＲＩＡＡＷＭＡＴＹＬ）（配列番号４５）（Ｄ）を試験した。Ｔリンパ球を、ペプチドで１回刺激し、その後、関連するペプチドをともなわずに、あるいはペプチドとともにのいずれかで、３連で１ウェルあたり１０^５個の細胞をプレートした。ペプチド特異的スポットの平均の数（ペプチドを添加しなかったスポットを引き算した後）を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ ２．０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ，ＬＬＣ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＵＳ）を使用してそれぞれの患者について計算した。応答細胞（１０^５個のリンパ球あたり、＞２５の抗原特異的スポットの平均数±１／２標準偏差と定義した）を、黒四角として印した。一方、応答のない個体は白四角で印した。 図７は、ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ＥＬＩＳＰＯＴによるＢｃｌ−Ｘ_Ｌ特異的ＣＴＬの検出を示す。３人の異なる乳癌患者（ＢＣ３５、ＢＣ３６、およびＢＣ１７）に由来するＴリンパ球を、ペプチドで１回刺激し、その後、ペプチドＢｃｌーＸ_{Ｌ１７３−１８２}（ＹＬＮＤＨＬＥＰＷＩ）をともなわずに、あるいはペプチドとともにのいずれかで、３連で１ウェルあたり３×１０^５個の細胞をプレートした。ペプチド特異的Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂスポットの平均の数（ペプチドを添加しなかったスポットを引き算した後）を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ ２．０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ，ＬＬＣ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＵＳ）を使用してそれぞれの患者について計算した。応答細胞（１０^５個のリンパ球あたり、＞２５の抗原特異的スポットの平均数±１／２標準偏差と定義した）を、黒四角として印した。一方、応答のない個体は白四角で印した。 図８は、乳癌患者由来のＰＢＬ中の、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌ特異的ＣＤ８ポジティブ細胞の分析を示す。患者ＢＣ３６由来のＰＢＬを、エキソビボでＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１７３−１８２}で１回刺激し、ＣＤ８＋細胞を分析の前に単離した。抗ＣＤ８抗体および五量体複合体ＨＬＡ−Ａ２／Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１７３−１８２}を用いた培養物のＦＡＣＳ染色により、細胞の９５．５％がＣＤ８ポジティブであり、これらの０．２４％が五量体ポジティブであったことが明らかになった（Ａ）。ＨＬＡ−Ａ２／ＨＩＶ五量体を、ネガティブ対照として使用した（Ｂ）。細胞培養物をＥＬＩＳＰＯＴによってさらに分析した（Ｃ）。 図９は、ＩＮＦ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌに対するＨＬＡ−Ａ２制限Ｔ細胞応答を示す。１２人の健常な個体、１８人の乳癌患者（ＢＣ患者）、６人の黒色腫患者、および２人の膵臓癌患者（ＰＣ患者）に由来するＰＢＬを分析した。全ての個体がＨＬＡ−Ａ２ポジティブであった。ペプチドＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１１８−１２６}（ＴＡＹＱＳＦＥＱＶ）（配列番号４３）（Ａ）およびＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６９−１７８}（ＷＭＡＴＹＬＮＤＨＬ）（配列番号４６）（Ｂ）を試験した。Ｔリンパ球を、ペプチドで１回刺激し、その後、関連するペプチドをともなわずに、あるいはペプチドとともにのいずれかで、３連で１ウェルあたり１０^５個の細胞をプレートした。ペプチド特異的スポットの平均の数（ペプチドを添加しなかったスポットを引き算した後）を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ ２．０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ，ＬＬＣ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＵＳ）を使用してそれぞれの患者について計算した。応答細胞（１０^５個のリンパ球あたり、＞２５の抗原特異的スポットの平均数±１／２標準偏差と定義した）を、黒四角として印した。一方、応答のない個体は白四角で印した。 図１０は、ＩＮＦ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌに対するＨＬＡ−Ａ３制限Ｔ細胞応答を示す。Ｔリンパ球を、ペプチドで１回刺激し、その後、ペプチドＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６５−１７３}（ＲＩＡＡＷＭＡＴＹ）（配列番号５０）をともなわずに、あるいはペプチドとともにのいずれかで、３連で１ウェルあたり１０^５個の細胞をプレートした。７人の健常な個体、５人の乳癌患者、４人の黒色腫患者、２人の膵臓癌患者、および５人の多発性骨髄腫患者に由来するＰＢＬを試験した。全ての患者が、ＨＬＡ−Ａ３ポジティブであった。ペプチド特異的スポットの平均の数（ペプチドを添加しなかったスポットを引き算した後）を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ ２．０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ，ＬＬＣ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＵＳ）を使用してそれぞれの患者について計算した。 図１１は、ＩＮＦ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した、Ｍｃｌ−１に対するＨＬＡ−Ａ３制限Ｔ細胞応答を示す。Ｔリンパ球を、ペプチドで１回刺激し、その後、ペプチドをともなわずに、あるいはペプチドとともにのいずれかで、３連で１ウェルあたり３×１０^５個の細胞をプレートした。１０人の健常な個体、６人の乳癌患者（ＢＣ患者）、２人の膵臓癌（ＰＣ）患者、および６人のＣＬＬ患者に由来するＰＢＬを、Ｍｃｌ−１_{９５−１０３}ペプチド（左）およびＭｃｌ−１_{３００−３０８}ペプチド（右）に対して試験した。全ての個体がＨＬＡ−Ａ３ポジティブであった。ペプチド特異的スポットの平均の数（ペプチドを添加しなかったスポットを引き算した後）を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ ２．０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ，ＬＬＣ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＵＳ）を使用してそれぞれの患者について計算した。応答細胞（１０^５個のリンパ球あたり、＞２５の抗原特異的スポットの平均数±１／２標準偏差と定義した）を、黒四角として印した。一方、応答のない個体は白四角で印した。 図１２は、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した、Ｍｃｌ−１に対するＨＬＡ−Ａ１制限Ｔ細胞応答を示す。Ｔリンパ球を、ペプチドで１回刺激し、その後、ペプチドＭｃｌ−１_{１６６−１７５}またはＭｃｌ−１_{１７７−１８５}をともなわずに、あるいはペプチドとともにのいずれかで、３連で１ウェルあたり３×１０^５個の細胞をプレートした。６人の健常な個体、４人の乳癌患者（ＢＣ患者）、７人の黒色腫患者に由来するＰＢＬを、Ｍｃｌ−１_{９５−１０３}ペプチド（左）およびＭｃｌ−１_{３００−３０８}ペプチド（右）に対して試験した。全ての個体がＨＬＡ−Ａ１ポジティブであった。ペプチド特異的スポットの平均の数（ペプチドを添加しなかったスポットを引き算した後）を、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ ２．０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ，ＬＬＣ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＵＳ）を使用してそれぞれの患者について計算した。応答細胞（１０^５個のリンパ球あたり、＞２５の抗原特異的スポットの平均数±１／２標準偏差と定義した）を、黒四角として印した。一方、応答のない個体は白四角で印した。

（発明の詳細な開示）
本発明のおもな目的は、癌の予防または処置において医薬として使用するための、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属する単離されたタンパク質、またはその免疫原性活性のあるペプチドフラグメントを提供することである。
Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーには、アポトーシスを調節するいくつかのタンパク質が含まれる。このファミリーには、プロアポトーシス性のメンバーと抗アポトーシス性のメンバーの両方が含まれている。本明細書中では、このタンパク質ファミリーの、癌における薬学的または診断的活性がある物質としての可能性が、Ｂｃｌ−２タンパク質に具体的に言及して研究されている。さらに、薬学的および診断的活性がある物質としてのＢｃｌ−Ｘ_ＬおよびＭｃｌ−１の可能性が詳細に記載される。しかし、Ｂｃｌ−２タンパク質またはそのフラグメントに対して観察されたものと同様の免疫応答が存在しているか、あるいはそのような免疫応答が、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの他のメンバー、例えば、Ｍｃｌ−１またはＢｃｌ−Ｘ_Ｌのような他の抗アポトーシス性タンパク質（これらは、癌における薬剤耐性および過剰発現にも関係している）に対して癌患者において導入され得る可能性が非常に高いと見られる。したがって、本発明は、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの任意ンメンバーに、好ましくは、癌患者において免疫応答を誘発することができる任意の抗アポトーシス性のメンバーに関する。例えば、タンパク質は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１、Ｂｆｌ−１／Ａ１、Ｂｃｌ−ｂ、Ｂｃｌ２−Ｌ−１０、およびＢｃｌ−Ｘ_Ｌからなる群より選択され、好ましくは、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−ｗ、およびＢｃｌ−Ｘ_Ｌからなる群より選択され、さらに好ましくは、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、およびＢｃｌ−Ｘ_Ｌからなる群より選択される。

Ｂｃｌ−２抗アポトーシス性ファミリーメンバーは、通常は死滅する運命にある細胞のアポトーシスを阻害し、それによってインビボでの細胞の蓄積を促進することによってその発癌作用を発揮する。

Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの全てのメンバーには、Ｂｃｌ−２相同（ＢＨ）ドメイン（ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、およびＢＨ４）として知られている４つの保存されているモチーフのうちの少なくとも１つが含まれている。ＢＨドメインの存在に加えて、好ましい抗アポトーシス性分子は、カルボキシル末端に膜結合ドメイン（ＴＭ）を有している。Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−Ｘ_Ｌのような抗アポトーシス性のメンバーは、膜貫通ドメインとともに、全部で４つのＢＨドメインを含む。ＢａｘおよびＢａｋのような多ドメインプロアポトーシス性タンパク質には、ＢＨ４ドメイン以外の全てが含まれている。「ＢＨ３ドメインのみ」のタンパク質として知られているプロアポトーシス性タンパク質の第２のサブグループ（例えば、ＢａｄおよびＢｉｄ）は、ＢＨ３ドメインのみを含み、他のＢＨドメインを含まない分子から構成される。Ｂｃｌ−Ｘ_ＳおよびＭｃｌ−１Ｓのようなプロアポトーシス性タンパク質は、ｂｃｌ−ｘおよびｍｃｌ−１遺伝子の選択的スプライシングされた形態をそれぞれ示し、ＢＨ１ドメインとＢＨ２ドメインを欠失している。さらに、Ｍｃｌ−１Ｓは、膜貫通ドメインを欠失している。Ｂｃｌ−２ファミリーに属するタンパク質は、例えば、ｒｅｆ．６に記載されている。

Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するタンパク質が抗アポトーシス特性を有していることが好ましいが、Ｂｃｌ−２ファミリーに属するタンパク質がプロアポトーシス性タンパク質であり、例えば、Ｂａｘ、Ｂｏｋ／Ｍｔｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ，Ｂｉｄ、Ｈｒｋ／ＤＰ５、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｂｍｆ、およびＰＵＭＡ／ｂｂｃ３からなる群より選択されるタンパク質であり得る場合もまた、本発明に含まれる。

本発明の１つの好ましい実施形態においては、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するタンパク質はＢｃｌ−２であり、好ましくは、ヒトＢｃｌ−２であり、さらに好ましくは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースの第一登録番号Ｐ１０４１５を有している配列のＢｃｌ−２である。

本発明の別の好ましい実施形態においては、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するタンパク質はＢｃｌ−Ｘ_Ｌであり、好ましくは、ヒトＢｃｌ−Ｘ_Ｌであり、さらに好ましくは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースの第一登録番号Ｑ０７８１７を有している配列のＢｃｌ−Ｘ_Ｌである。

本発明のさらに別の好ましい実施形態においては、Ｂｃｌ−２ファミリーに属するタンパク質はＭｃｌ−１であり、好ましくは、ヒトＭｃｌ−１であり、さらに好ましくは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースの第一登録番号Ｑ０７８２０を有している配列のＭｃｌ−１である。

多数のヒトの癌は高レベルでＢｃｌ−２とＢｃｌ−２ファミリーの他のメンバーを発現するので、これらの抗原に照準を定める免疫療法ストラテジーには広範囲の臨床的用途がある。このようなアプローチの主要な懸案は、自己反応性免疫応答の誘導である。したがって、このタンパク質ファミリーのメンバーベースのワクチン接種についての将来性は、治療効率と、免疫後に生じ得る副作用のタイプの両方に依存する。メラニン形成細胞の分化抗原に由来するペプチドをＩＶ期の黒色腫を有している患者を処置するために最初に使用した場合には、これによって黒色腫の顕著な崩壊が導かれ得ることが想定された。黒色腫の顕著な崩壊は、次いで、例えば、白斑または網膜炎のような臨床症状を発現する。しかし、臨床試験は、ワクチンを接種された患者における白斑の罹患率は、他の形態の治療を受けた患者における黒色腫に関係している低色素沈着の罹患率よりも顕著には高くはない。さらに、自己抗原に対する種々のワクチン接種試験においては、重篤な副作用は報告されていない。

１つの有用な実施形態においては、新規のＭＨＣクラスＩ制限ペプチドフラグメント（本明細書中では「ペプチド」とも呼ばれる）が提供される。これは、いくつかの特徴のうちの少なくとも１つを有していることを特徴とする。これらの特徴のうちの１つは、本明細書中に記載されるアセンブリ結合アッセイによって決定すると、最大で５０μＭである、クラスＩ ＨＬＡ分子の最大回復量の半分を回復させることができるペプチドの量（Ｃ_５０値）によって測定される親和性について制限される、クラスＩ ＨＬＡ分子に結合する能力である。このアセンブリアッセイは、以前に記載されている（２）ように行われ、これは、ペプチド輸送因子欠損細胞株Ｔ２に対するペプチドの負荷の後のＨＬＡ分子の安定化に基づく。次に、正確に折り畳まれた安定なＨＬＡ重鎖が、立体構造依存性抗体を使用して免疫沈降させられ、ペプチドの結合が定量される。

このアッセイにより、上記の親和性で所定のＨＬＡ対立遺伝子分子に結合するそれらの能力について候補のペプチドをスクリーニングする単純な手段が提供される。好ましい実施形態においては、本発明のペプチドフラグメントは、最大で３０μＭであるＣ_５０値を有しているものであり、例えば、最大で１０μＭであるようなＣ_５０値、最大で５μＭであるようなＣ_５０、および最大で２μＭであるようなＣ_５０を含む、最大で２０μＭであるようなＣ_５０値を有しているものである。

しかし、本発明のより好ましいペプチドは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、例えば、実施例１のセクション４において本明細書中で以下に記載されるＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定されるような、特異的Ｔ細胞応答を惹起させることができるペプチドである。高い親和性でＭＨＣに結合することはないいくつかのペプチドはなお、ＥＬＩＳＰＯＴによって決定した場合にはＴ細胞応答を生じる場合がある。高い親和性でＭＨＣに結合することができる他のペプチドもまた、ＥＬＩＳＰＯＴによって決定するとＴ細胞応答を生じる。いずれの種のペプチドも、本発明の好ましいペプチドである。

したがって、本発明の好ましいペプチドは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定した場合に特異的Ｔ細胞応答を惹起させることができるペプチドである。ここでは、１０^８個の細胞あたり５０を越えるペプチド特異的スポット、より好ましくは、１０^７個の細胞あたり５０を越えるペプチド特異的スポット、なおより好ましくは、１０^６個の細胞あたり５０を越えるペプチド特異的スポット、よりさらに好ましくは、１０^５個の細胞あたり５０を越えるペプチド特異的スポット、例えば、１０^４個の細胞あたり５０を越えるペプチド特異的スポットが測定される。

上記のように、ＨＬＡシステムは、ヒトの主要組織適合性（ＭＨＣ）システムを示す。一般的には、ＭＨＣシステムは、複数の特徴の範囲を制御する：移植抗原、胸腺依存性免疫応答、特定の補体因子、および特定の疾患についての素因。さらに具体的には、ＭＨＣは３つの異なるタイプの分子、すなわち、クラスＩ、ＩＩ、およびＩＩＩの分子をコードする。これらは、ＭＨＣのより一般的な特徴を決定する。これらの分子のうち、クラスＩ分子は、いわゆるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ分子であり、これらは、ほとんどの有核細胞および血小板の表面に提示される。

本発明のペプチドは、特定のＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ分子に結合する（それによって制限される）それらの能力によって特徴づけられる。したがって、１つの実施形態においては、ペプチドは、以下を含むＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ａ分子によって制限されるペプチドである：ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ９、ＨＬＡ−Ａ１０、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａｗ１９、ＨＬＡ−Ａ２３（９）、ＨＬＡ−Ａ２４（９）、ＨＬＡ−Ａ２５（１０）、ＨＬＡ−Ａ２６（１０）、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ２９（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａ３０（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａ３１（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａ３２（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａｗ３３（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａｗ３４（１０）、ＨＬＡ−Ａｗ３６、ＨＬＡ−Ａｗ４３、ＨＬＡ−Ａｗ６６（１０）、ＨＬＡ−Ａｗ６８（２８）、ＨＬＡ−Ａ６９（２８）。より簡易な表記もまた、この文献を通じて使用され、ここでは、おもな数字の表記だけが使用され、例えば、ＨＬＡ−Ａｗ１９とＨＬＡ−Ａ２４（４９）の代わりに、ＨＬＡ−Ａ１９またはＨＬＡ−Ａ２４がそれぞれ使用される。特定の実施形態においては、本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１、およびＨＬＡ−Ａ２４からなる群より選択されるＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ種を制限する。

本発明のペプチドは、例えば、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーの既知の配列（３）から導くことができる。本発明の好ましい実施形態においては、ペプチドには、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの上記メンバーの、好ましくは、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて第一登録番号Ｐ１０４１５を有しているＢｃｌ−２、第一登録番号Ｑ０７８２０を有しているＭｃｌ−１、または第一登録番号Ｑ０７８１７を有しているＢｃｌ−Ｘ_Ｌに由来する１つの、最大で２００個の、好ましくは、最大で１００個、より好ましくは、最大で５０個、なおより好ましくは、最大で２５個、なおさらに好ましくは最大で２０個、なおさらに好ましくは、最大で１５個、例えば、最大で１０個、例えば、９個から１０個の範囲の連続しているアミノ酸が含まれる（あるいは、より好ましくは、それらから構成される）。

特定のＨＬＡ分子に結合する能力を有している可能性があるペプチドの選択は、それによってペプチド中の特定の位置の少数の関連するアミノ酸の優位を明らかにするための、特定のＨＬＡ分子に結合する既知の配列のアラインメントによって行うことができる。このような優位なアミノ酸残基はまた、「アンカー残基」、または「アンカー残基モチーフ」と本明細書中で呼ばれる。利用可能なデータベースにおいて見ることができる既知の配列に基づくこのような比較的単純な手順に従うことによって、特定のＨＬＡ分子におそらく結合するであろうペプチドを、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの分子から導くことができる。ＨＬＡ分子の範囲についてのこのような分析の代表的な例が、以下の表に提供される。

^＊１つの実施形態においては、この位置については特異的なアンカー残基は存在していないが、好ましい実施形態においては、アンカー残基はＲまたはＡである。

したがって、一例として、ＨＬＡ−Ａ１に結合する能力を有している可能性のあるノナペプチドは、以下の配列の１つを有する：Ｘａａ−Ｔ−Ｄ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌ−Ｘａａ−Ｙ、Ｘａａ−Ｔ−Ｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌ−Ｘａａ−Ｙ；Ｘａａ−Ｓ−Ｄ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌ−Ｘａａ−ＹまたはＸａａ−Ｓ−Ｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌ−Ｘａａ−Ｙ（Ｘａａは、任意のアミノ酸残基を示す）。同様の様式において、任意の他のＨＬＡ分子に結合する能力を有している可能性がある配列を設計することができる。

当業者であれば、所定のＨＬＡ分子について「アンカー残基モチーフ」をさらに同定することができることは明らかである。

したがって、有用な実施形態においては、本発明のペプチドには、その配列が、表に列挙した特異的ＨＬＡ対立遺伝子のそれぞれについて、表に示したアミノ酸残基のいずれかを含むペプチドが含まれる。

したがって、本発明のペプチドは、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーに由来する連続している配列を含む上記のペプチドのいずれかであり得る。ここでは、１個から１０個の範囲、好ましくは、１個から５個の範囲、より好ましくは、１個から３個の範囲、なおさらに好ましくは、１個から２個の範囲、なおより好ましくは、１個のアミノ酸が、別のアミノ酸で、好ましくは、ペプチドが上記の表に示した所定のＨＬＡ−Ａ特異的ペプチドの１つ以上、好ましくは全てのアンカー残基を含むような様式で、置き換えられている。

所定のＨＬＡ−Ａ特異的ペプチドのアンカー残基を含むＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーのペプチドを調製するための方法の１つの限定的ではない例が、実施例３において「修飾されたペプチド応答」のセクションに記載されている。したがって、本発明の１つの実施形態においては、ペプチドは、最大で２００個、好ましくは、最大で１００個、より好ましくは、最大で５０個、なおより好ましくは、最大で２５個、なおさらに好ましくは、最大で２０個、なおさらに好ましくは、最大で１５個、なおより好ましくは、最大で１０個のアミノ酸から構成され、そしてＲＬＫＲＤＷＬＶＫ（配列番号６２）、ＱＳＤＥＩＩＳＲＹ（配列番号６３）、およびＱＳＥＥＩＩＳＲＹ（配列番号６４）からなる群より選択される、より好ましくは、ＲＬＫＲＤＷＬＶＫ（配列番号６２）からなる群より選択される配列を含む（またはより好ましくは、これらの配列から構成される）任意のペプチドであり得る。

したがって、本発明のペプチドを同定するための簡単なアプローチには、以下の工程が含まれる：特定のＨＬＡ分子、例えば、所定の集団において高い割合で生じるものを選択する工程、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのタンパク質において「アンカー残基モチーフ」を同定するために上記に記載されるアラインメント分析を行う工程、１つ以上の同定されたアンカー残基を含む適切な大きさのペプチドを単離または構築する工程、ならびに、（ｉ）特定のＨＬＡ分子に結合する能力について、本明細書中に記載されるアセンブリアッセイを使用して（ｉｉ）本明細書中に記載されるＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した場合に１０^４個のＰＢＬあたり少なくとも１個の頻度で、癌患者のＰＢＬ集団中にＩＦＮ−γを産生する細胞を誘発するペプチドの能力について、および／または（ｉｉｉ）試験されるエピトープペプチドと反応する腫瘍組織ＣＴＬ中でインサイチュで検出するペプチドの能力について、得られたペプチドを試験する工程。

特定の実施形態においては、本発明のペプチドは、以下から選択される配列を有しているＨＬＡ−Ａ２制限Ｂｃｌ−２由来のペプチドである：ＡＬＶＧＡＣＩＴＬ（配列番号１）、ＡＬＳＰＶＰＰＶＶ（配列番号２）、ＳＬＡＬＶＧＡＣＩ（配列番号３）、ＫＴＬＬＳＬＡＬＶ（配列番号４）、ＬＬＳＬＡＬＶＧＡ（配列番号５）、ＷＬＳＬＫＴＬＬＳＬ（配列番号６）、ＡＡＡＧＰＡＬＳＰＶ（配列番号７）、ＰＬＦＤＦＳＷＬＳＬ（配列番号８）、ＦＴＡＲＧＲＦＡＴＶ（配列番号９）、ＹＬＮＲＨＬＨＴＷＩ（配列番号１０）、ＮＩＡＬＷＭＴＥＹＬ（配列番号１１）。

１つの好ましい実施形態においては、ペプチドは、最大で２００個、好ましくは、最大で１００個、より好ましくは、最大で５０個、なおより好ましくは、最大で２５個、なおさらに好ましくは、最大で２０個、なおさらに好ましくは、最大で１５個、なおより好ましくは、最大で１０個のアミノ酸から構成され、そしてＡＬＶＧＡＣＩＴＬ（配列番号１）、ＡＬＳＰＶＰＰＶＶ（配列番号２）、ＳＬＡＬＶＧＡＣＩ（配列番号３）、ＫＴＬＬＳＬＡＬＶ（配列番号４）、ＬＬＳＬＡＬＶＧＡ（配列番号５）、ＷＬＳＬＫＴＬＬＳＬ（配列番号６）、ＡＡＡＧＰＡＬＳＰＶ（配列番号７）、ＰＬＦＤＦＳＷＬＳＬ（配列番号８）、ＦＴＡＲＧＲＦＡＴＶ（配列番号９）、ＹＬＮＲＨＬＨＴＷＩ（配列番号１０）、ＮＩＡＬＷＭＴＥＹＬ（配列番号１１）からなる群より選択される配列、より好ましくは、ＮＩＡＬＷＭＴＥＹＬ（配列番号１１）、ＹＬＮＲＨＬＨＴＷＩ（配列番号１０）、ＰＬＦＤＦＳＷＬＳＬ（配列番号８）、およびＷＬＳＬＫＴＬＬＳＬ（配列番号６）からなる群より選択される、なおより好ましくは、ＰＬＦＤＦＳＷＬＳＬ（配列番号８）およびＷＬＳＬＫＴＬＬＳＬ（配列番号６）からなる群より選択される配列を含む（またはより好ましくは、これらの配列から構成される）任意のペプチドであり得る。

別の好ましい実施形態においては、ペプチドは、最大で２００個、好ましくは、最大で１００個、より好ましくは、最大で５０個、なおより好ましくは、最大で２５個、なおさらに好ましくは、最大で２０個、なおさらに好ましくは、最大で１５個、なおより好ましくは、最大で１０個のアミノ酸から構成され、そしてＥＭＱＶＬＶＳＲＩ（配列番号４４）、ＴＡＹＱＳＦＥＱＶ（配列番号４３）、ＹＬＮＤＨＬＥＰＷＩ（配列番号４２）、ＲＩＡＡＷＭＡＴＹＬ（配列番号４５）、ＷＭＡＴＹＬＮＤＨＬ（配列番号４６）、ＶＬＶＳＲＩＡＡＷＭ（配列番号４８）、およびＶＡＦＦＳＦＧＧＡＬ（配列番号４９）からなる群より選択される、より好ましくは、ＴＡＹＱＳＦＥＱＶ（配列番号４３）、ＹＬＮＤＨＬＥＰＷＩ（配列番号４２）、ＲＩＡＡＷＭＡＴＹＬ（配列番号４５）、ＷＭＡＴＹＬＮＤＨＬ（配列番号４６）、ＶＬＶＳＲＩＡＡＷＭ（配列番号４８）、およびＶＡＦＦＳＦＧＧＡＬ（配列番号４９）からなる群より選択される、なおより好ましくは、ＴＡＹＱＳＦＥＱＶ（配列番号４３）、ＶＡＦＦＳＦＧＧＡＬ（配列番号４９）、ＶＬＶＳＲＩＡＡＷＭ（配列番号４８）、およびＲＩＡＡＷＭＡＴＹＬ（配列番号４５）からなる群より選択される、あるいはＴＡＹＱＳＦＥＱＶ（配列番号４３）およびＷＭＡＴＹＬＮＤＨＬ（配列番号４６）からなる群より選択される、あるいは、ＹＬＮＤＨＬＥＰＷＩ（配列番号４２）からなる群より選択される配列を含む（またはより好ましくは、これらの配列から構成される）任意のペプチドであり得る。

なお別の好ましい実施形態においては、ペプチドは、最大で２００個、好ましくは、最大で１００個、より好ましくは、最大で５０個、なおより好ましくは、最大で２５個、なおさらに好ましくは、最大で２０個、なおさらに好ましくは、最大で１５個、なおより好ましくは、最大で１０個のアミノ酸から構成され、そしてＲＩＡＡＷＭＡＴＹ（配列番号５０）およびＡＬＣＶＥＳＶＤＫ（配列番号５１）からなる群より選択される、より好ましくは、ＲＩＡＡＷＭＡＴＹ（配列番号５０）からなる群より選択される配列を含む（またはより好ましくは、これらの配列から構成される）任意のペプチドであり得る。

なお別の好ましい実施形態においては、ペプチドは、最大で２００個、好ましくは、最大で１００個、より好ましくは、最大で５０個、なおより好ましくは、最大で２５個、なおさらに好ましくは、最大で２０個、なおさらに好ましくは、最大で１５個、なおより好ましくは、最大で１０個のアミノ酸から構成され、そしてＹＬＲＥＱＡＴＧＡＫ（配列番号５２）、ＳＩＴＤＶＬＶＲＴＫ（配列番号５３）、ＬＩＳＦＧＡＦＶＡＫ（配列番号５４）、ＲＬＬＦＦＡＰＴＲ（配列番号５５）、ＲＴＫＲＤＷＬＶＫ（配列番号５６）、およびＤＩＫＮＥＤＤＶＫ（配列番号５７）からなる群より選択される、より好ましくは、ＲＬＬＦＦＡＰＴＲ（配列番号５５）およびＲＴＫＲＤＷＬＶＫ（配列番号５６）からなる群より選択される配列を含む（またはより好ましくは、これらの配列から構成される）任意のペプチドであり得る。

なお別の好ましい実施形態においては、最大で２００個、好ましくは、最大で１００個、より好ましくは、最大で５０個、なおより好ましくは、最大で２５個、なおさらに好ましくは、最大で２０個、なおさらに好ましくは、最大で１５個、なおより好ましくは、最大で１０個のアミノ酸から構成され、そしてＰＡＥＥＥＥＤＤＬＹ（配列番号５８）、ＳＰＥＥＥＬＤＧＹ（配列番号５９）、ＱＳＬＥＩＩＳＲＹ（配列番号６０）、およびＡＧＶＧＡＧＬＡＹ（配列番号６１）からなる群より選択される、より好ましくは、ＰＡＥＥＥＥＤＤＬＹ（配列番号５８）およびＱＳＬＥＩＩＳＲＹ（配列番号６０）からなる群より選択される配列を含む（またはより好ましくは、これらの配列から構成される）任意のペプチドであり得る。

さらに有用な実施形態においては、本発明のペプチドは、以下のいずれかを含むＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ｂ分子によって制限されるペプチドである：ＨＬＡ−Ｂ５、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１２、ＨＬＡ−Ｂ１３、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ１６、ＨＬＡ−Ｂ１７、ＨＬＡ−Ｂ１８、ＨＬＡ−Ｂ２１、ＨＬＡ−Ｂｗ２２、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ３８、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｂｗ４１、ＨＬＡ−Ｂｗ４２、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ４５、ＨＬＡ−Ｂｗ４６およびＨＬＡ−Ｂｗ４７。特定の実施形態においては、それに対して本発明のペプチドが結合することができるＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ｂ種は、以下から選択される：ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ２７およびＨＬＡ−Ｂ５１。

さらに有用な実施形態においては、本発明のペプチドは、以下のいずれかを含むＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ｃ分子によって制限されるペプチドである：ＨＬＡ−Ｃｗ１、ＨＬＡ−Ｃｗ２、ＨＬＡ−Ｃｗ３、ＨＬＡ−Ｃｗ４、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−Ｃｗ６、ＨＬＡ−Ｃｗ７、およびＨＬＡ−Ｃｗ１。

好ましくは、本発明のペプチドフラグメントは、５０個未満のアミノ酸残基を含み、より好ましくは、本発明のペプチドフラグメントは、最大で２０個のアミノ酸残基を含み、例えば、最大で１０個のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態においては、ペプチドはヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、またはウンデカペプチドである。

本発明のペプチドは、上記のように、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーまたはそのフラグメントから導くことができる。それからペプチドを導くことができるタンパク質は、その中でそのタンパク質が発現される任意の動物種に由来する任意のＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーであり得る。好ましい実施形態においては、出発タンパク質は、齧歯類種（ウサギ）および霊長類種（例えば、ヒト）を含む哺乳動物種に由来する。選択されたタンパク質の配列に基づいて、本発明のペプチドは、上記に示した適切な大きさのペプチドを生じる、タンパク質出発物質の任意の適切な化学的または酵素的処理によって導くことができ、また、本発明のペプチドは、当業者がよく知っている任意の従来のペプチド合成手順によって、合成することもできる。

本発明のペプチドは、それが由来するＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーの天然の配列である配列を有し得る。しかし、任意の所定のＨＬＡ分子に対して高い親和性を有しているペプチドは、例えば、所定のＨＬＡ分子に関するアンカー残基モチーフがそれによって同定される上記に記載された手順に基づいて、少なくとも１つのアミノ酸を置換、欠失、または付加することによって配列を修飾することにより、そのような天然の配列から誘導することができる。

本発明のペプチドの有意な特徴は、ＩＮＦ−γを産生する応答細胞Ｔ細胞、すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を認識または誘発するその能力であり、これは、癌患者のＰＢＬ集団または腫瘍細胞（標的細胞）中の特定のペプチドを特異的に認識する。この活性は、参考文献（４）と以下の実施例に記載されるように、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに患者に由来するＰＢＬまたは腫瘍細胞を供することによって、容易に決定される。アッセイの前に、細胞を試験されるペプチドと接触させることによって、アッセイされるＰＢＬ集団または腫瘍細胞を刺激することが有利であり得る。好ましくは、ペプチドは、本明細書中で使用されるＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した場合に、１０^４個のＰＢＬあたり少なくとも１個の頻度でＩＦＮ−γを産生するＴ細胞を誘発または認識することができる。より好ましくは、頻度は、１０^４個のＰＢＬあたり少なくとも５個であり、最も好ましくは、１０^４個のＰＢＬあたり少なくとも１０個であり、例えば、１０^４個のＰＢＬあたり少なくとも５０個または１００個である。

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、Ｂｃｌ−２ファミリーに由来するペプチド特異的Ｔ細胞応答をモニタリングするための強力なツールを象徴する。しかし、ＥＬＩＳＰＯＴ反応性は多くの場合において標的細胞を溶解させるＣＴＬの能力と相関関係にあることが示されているが、この概念についての決定的な証拠は、直接的にしか提供することができていない。したがって、本明細書中での発見についての重要な意味は、本発明のペプチドが癌細胞上で発現され、ＨＬＡ分子と複合体を形成することである。これにより、これらの癌細胞はＣＴＬによって崩壊させられやすくなり、新生物の増殖を制御するためのＢｃｌ−２ファミリータンパク質での免疫の潜在的有用性が強まる。乳癌患者に由来するＰＢＬ中にＨＬＡ制限Ｂｃｌ−２由来ペプチドエピトープに対する自発的なＣＴＬ応答が存在することは、乳癌患者においてのみこれらの腫瘍抗原の免疫治療の可能性を具体化するのではなく、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーは、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌において、ならびに白血病およびリンパ腫を含む多くの癌において過剰発現されているので、広い範囲の癌疾患においても具体化される。

したがって、別の好ましい実施形態においては、本発明のペプチドは、造血器悪性腫瘍（例えば、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病）、黒色腫、乳癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、および前立腺癌を含む、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーが発現される癌疾患を有している患者のＰＢＬ集団においてＩＮＦ−γを産生する細胞を誘発することができる。

ＰＢＬ集団において免疫応答を誘発するそれらの能力に加えて、本発明のペプチドはインサイチュにおいて、すなわち充実性腫瘍組織中で、細胞溶解性免疫応答を誘発できることもまた想定される。これは、例えば、マルチマー化させられて検出可能な標識とともに提供される、ＨＬＡ−ペプチド複合体を提供し、そして本発明のエピトープペプチドと反応する腫瘍組織ＣＴＬ中で検出するための免疫組織化学的染色においてそのような複合体を使用することによって明らかにされ得る。したがって、本発明のペプチドのさらに重要な特徴は、エピトープペプチドと反応するＣＴＬを腫瘍組織中でのインサイチュで検出することができることである。

本発明のペプチドは、ＨＬＡ分子に結合して、細胞表面上でのＨＬＡとペプチドの複合体（この複合体は、次いで、細胞溶解性Ｔ細胞についてのエピトープまたは標的として作用する）の提示を生じるその能力に加えて、複合体に対する抗体の産生を生じるＢ細胞応答、および／または遅延型過敏（ＤＴＨ）反応のような他のタイプの免疫応答を誘発することもできることもまた想定される。後者のタイプの免疫応答は、本発明のペプチドの注射部位での発赤および触診可能な硬化として同定される。

本発明のワクチン組成物には、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するタンパク質またはそのペプチドフラグメントをコードする核酸が含まれ得る。したがって、上記の核酸は、上記のタンパク質およびペプチドフラグメントのいずれかをコードし得る。核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＰＮＡであり得、好ましくは、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。

本発明の核酸は、任意の適切なベクター、例えば、発現ベクターに含めることができる。多数のベクターが利用可能であり当業者は特定の目的に有用なベクターを選択することができる。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、または人工染色体の形態であり得る。適切な核酸配列は、種々の手順によってベクターに挿入することができる。例えば、ＤＮＡは、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（単数または複数）に、当該分野で周知の技術を使用して挿入することができる。本発明の核酸配列とは別に、ベクターにはさらに、１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列が含まれ得る。ベクターにはまた、さらなる配列が含まれる場合もある。１つ以上のこれらの成分を含む適切なベクターの構築には、当業者に公知である標準的な連結技術が使用される。ベクターは、好ましくは、適切な細胞中でその発現を指示する調節核酸配列に動作可能であるように連結させられた核酸を含む発現ベクターである。本発明の範囲においては、上記調節核酸配列は、一般的には、哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞中で、さらに好ましくは、抗原提示細胞中で発現を指示することができるはずである。

１つの好ましい実施形態においては、ベクターはウイルスベクターである。上記ウイルスベクターには、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーまたはそのペプチドフラグメントをコードする核酸に加えて、Ｔ細胞刺激ポリペプチドをコードする第２の核酸配列が含まれる場合がある。Ｔ細胞刺激ポリペプチドは、好ましくは、Ｂ７．１、ＩＣＡＭ−１、およびＬＦＡ−３からなる群より選択される。

ベクターはまた、細菌ベクター、例えば、弱毒化された細菌ベクターである場合もある。弱毒化された細菌ベクターは、感染部位での持続的な粘膜免疫応答を誘導し、持続させるために使用することができる。種々の組み換え細菌がベクターとして使用される場合もある。例えば、細菌ベクターは、サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびリステリア種（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）からなる群より選択され得る。一般的には、異種抗原ＨＰＶ１６ Ｌ１またはＥ７に対する免疫の誘導は、マウスにおける強いＣＴＬ誘導および腫瘍の退縮を用いて示すことができる。

本発明はまた、
ｉ）本明細書中に記載されるワクチン組成物のいずれか、および／または
ｉｉ）本明細書中に記載されるＢｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するタンパク質のいずれか、および／または
ｉｉｉ）本明細書中に記載されるｉｉ）のタンパク質のペプチドフラグメントのいずれか、および／または
ｉｖ）ｉｉ）のタンパク質またはｉｉｉ）のペプチドをコードする核酸のいずれか、
と、さらなる抗癌剤を含むキットにも関係する。

キットの成分は、好ましくは、個々の組成物に含まれる。しかし、キットの全ての成分が同じ組成物に含まれるものも本発明の範囲に含まれる。したがって、キットの成分は、同時に、または任意の順序で順番に投与され得る。

抗癌剤は、化学療法または遺伝子治療において使用される薬剤、免疫賦活性物質または抗体であり得る。免疫賦活性物質は、例えば、サイトカインであり、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ型ＩＦＮ、インターロイキン１２、およびインターロイキン１５からなる群より選択されるサイトカインである。抗体は、好ましくは、免疫賦活性の抗体であり、例えば、抗ＣＤ４０抗体または抗ＣＴＬＡ−４抗体である。免疫賦活性物質はまた、免疫阻害性細胞（例えば、調節Ｔ細胞）または因子を枯渇させることができる物質である場合もあり、上記の物質は、例えば、Ｅ３ユビキチンリガーゼであり得る。Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ＨＥＣＴ、ＲＩＮＧ、およびＵ−ｂｏｘタンパク質）は、免疫細胞機能の鍵となる分子調節因子と考えられており、それぞれがタンパク質分解的崩壊のために特異的阻害性分子を標的化することによって感染の間の免疫応答の調節に関係し得る。いくつかのＨＥＣＴおよびＲＩＮＧ Ｅ３タンパク質はまた、現在、自己免疫寛容の誘導および維持に関係づけられている：ｃ−Ｃｂｌ、Ｃｂｌ−ｂ、ＧＲＡＩＬ、Ｉｔｃｈ、およびＮｅｄｄ４はそれぞれ、Ｔ細胞増殖因子の産生および増殖をネガティブに調節する。

本発明の知見により、本発明のタンパク質またはペプチドフラグメントの治療適用ならびに診断適用の基礎が提供されることは明らかである。

したがって、さらなる態様においては、本発明により、本発明のタンパク質またはペプチドフラグメントを含む薬学的組成物、具体的には、癌患者に投与された場合に、癌細胞に対する細胞傷害性作用を有しているエフェクターＴ細胞の産生をワクチン接種した患者において誘発することを含む、癌疾患に対する免疫応答を誘発することができる薬学的組成物が提供される。

周知であるように、種々のＨＬＡ分子は、主要なヒトの集団において異なる陽性率で存在しているので、本発明の方法にしたがって処置することができる患者の集団を拡大するために、いくつかのＨＬＡクラスＩ分子に制限されるペプチドエピトープを同定することが必要である。種々のＨＬＡ制限エレメントを有している複数のＢｃｌ−２エピトープの特徴づけにより、２つの重要な方法でこの標的抗原の臨床的な可能性を広げる：（ｉ）Ｂｃｌ−２由来のペプチドに基づく免疫療法にふさわしい患者の数を増大させる。ＨＬＡ−Ａ２抗原は、白人およびアジア人の集団においてはおよそ５０％によって発現されており、ＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ３抗原はいずれも、白人のおよそ２５％、アジア人のおよそ５％によって発現されているが、ＨＬＡ−Ａ１１抗原は、白人のおよそ１５％、アジア人のおよそ３０％によって発現されている。これらの数は同時発現が原因で増大させることはできないが、これらの多様性によって制限されるペプチドの組み合わせは、ほとんどの癌患者を確実に網羅する。（ｉｉ）個々の患者におけるいくつかの制限エレメントをまとめて標的化することは、おそらく、ＨＬＡ−対立遺伝子の欠失による免疫回避のリスクを減少させる。１つのＨＬＡ対立遺伝子の欠失は、癌細胞について記載されているＭＨＣの変化の有意な成分であるが、クラスＩ発現の全ての欠失はむしろ滅多に起こらない事象である。したがって、種々のＨＬＡ対立遺伝子に制限されるＢｃｌ−２エピトープの同定により、対立遺伝子が重複している患者において同時に１つ以上のＨＬＡ分子を標的化することができる。

したがって、高免疫原性多エピトープワクチンを開発することが可能である。好ましくは、このようなワクチンは、本明細書中で以下に記載される他の適切なペプチドおよび／またはアジュバントと状況に応じて組み合わせて、最も適しているＢｃｌ−２由来のペプチドの同時投与を容易にするように設計されるべきである。本発明には、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーには属さないかまたはそれらには由来しないさらなるタンパク質もしくはペプチド、および／または本明細書中で以下に記載されるようなアジュバント、および／または以下に記載されるようなクラスＩＩ−ＭＨＣ制限エピトープと状況に応じて組み合わせて、Ｂｃｌ−２由来のペプチドを含むそのような多エピトープワクチンが含まれる。

その腫瘍が一般的にクラスＩＩ ＭＨＣを発現しないという事実にもかかわらず、腫瘍特異的Ｔヘルパー細胞性免疫を誘発すること、すなわち、クラスＩＩ−ＭＨＣ制限エピトープを用いてワクチン接種することに、注目が集まっている。このことは、ワクチンによって誘導される抗腫瘍応答の誘導および効率には、多くの場合においては、腫瘍特異的ＣＤ４ポジティブＴ_ｈ細胞の連携が必要であるという最近の発見に基づく。したがって、より複雑な組成を有しているワクチンの開発を推進する、例えば、注意深く選択されるＣＴＬおよびＴ_ｈ細胞エピトープのコレクションを含むかまたはそれらをコードするワクチンを設計することによる、複数の腫瘍抗原を標的化するための重要な因子が望まれる。

明らかに、多エピトープワクチンは、癌タンパク質のような有害である可能性のあるタンパク質（をコードする遺伝子）を導入することを必要とはせずに、いくつかの種々の抗原に由来するエピトープに対する免疫性を高める１つの効果的な方法を構成する。このようなワクチンはまた、亜優性である曖昧なＴ細胞エピトープに対する免疫性の選択的な誘導もできる。これは、それについての寛容性が正常な組織において顕著に提示されるエピトープについて存在し得る、腫瘍関連自己抗原の場合に特に重要であり得る。さらに、抗原提示細胞は、抗原提示細胞の免疫プロテアソームとほとんどの腫瘍細胞中に存在する「構成的」プロテアソームとの間の機能的な差が原因で、腫瘍細胞上で発現される特定のエピトープを提示することができない場合がある。ペプチドベースのワクチンの場合には、このようなエピトープは、「ＭＨＣ準備」形態で投与することができ、これは、抗原の取り込みとは無関係な外部負荷、および宿主の抗原提示細胞によるプロセシングを通じた提示が可能である。

本発明のペプチドは比較的小さい分子であるので、このような組成物においては、ペプチドを、ワクチン、免疫原性組成物などを製造するためのアジュバントのような種々の物質と組み合わせることが必要とされ得る。広く定義されているアジュバントは、免疫応答を促進する物質である。多くの場合には、選択されるアジュバントは、フロイトの完全もしくは不完全アジュバント、または、例えば、ミョウバンで沈殿させられた抗原と組み合わせて使用される、死滅させられた百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）生物である。アジュバントについての一般的な議論は、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８６）６１〜６３頁に提供されている。しかし、Ｇｏｄｉｎｇは、目的の抗原が低分子量であるか、または免疫原性が乏しい場合には、免疫原性のキャリアに対してカップリングさせることが望ましいと記載している。このようなキャリア分子の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、およびニワトリ免疫グロブリンが挙げられる。種々のサポニン抽出物もまた、免疫原性組成物においてアジュバントとして有用であることが示唆されている。最近、アジュバントとして、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、周知のサイトカインを使用することが提案されている（ＷＯ９７／２８８１６）。

本発明のワクチン組成物には、アジュバントおよび／またはキャリアが含まれることが好ましい。有用なアジュバントおよびキャリアの例は、本明細書中で以下に提供される。したがって、組成物中に存在するＢｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するタンパク質またはそのペプチドフラグメントは、例えば、タンパク質または抗原提示細胞（例えば、Ｔ細胞に対してＢｃｌ−２タンパク質ファミリーまたはそのペプチドフラグメントを提示することができる樹状細胞（ＤＣ））のようなキャリアと会合させることができる。

アジュバントは、そのワクチン組成物への混合によってＢｃｌ−２タンパク質ファミリーまたはそのペプチドフラグメントに対する免疫応答を増大させるか、または別の方法で変更する任意の物質である。キャリアは、それに対してＢｃｌ−２タンパク質ファミリーまたはそのペプチドフラグメントを会合させることができる骨格構造、例えば、ポリペプチドまたは多糖である。

アジュバントは、例えば、以下からなる群より選択することができる：ＡｌＫ（ＳＯ_４）_２、ＡｌＮａ（ＳＯ_４）_２、ＡｌＮＨ_４（ＳＯ_４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）_３Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６８７、ｎｏｒ−ＭＤＰとも呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミウル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニルーＬ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも呼ばれる）、２％のスクワレン／Ｔｗｅｅｎ−８０．Ｒ．Ｔ．Ｍ．エマルジョン中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、リポ多糖およびその種々の誘導体（リピッドＡ（ｌｉｐｉｄ Ａ）を含む）、フロイトの完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイトの不完全アジュバント、Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、ヒト型結核菌由来のｗａｘ Ｄ、コリネバクテリウム・パルバム、百日咳菌、およびブルセラ属のメンバー中に見られる物質、リポソームまたは他の脂質エマルジョン、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、Ｑｕｉｌ Ａ、ＡＬＵＮ（ＵＳ ５８７６７および米国特許第５，５５４，３７２号を参照のこと）、Ｌｉｐｉｄ Ａ誘導体、コレラ毒素誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成のペプチドマトリックスまたはＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、モンタナイドＩＳＡ−５１およびＱＳ−２１。本発明と共に使用される好ましいアジュバントとしては、モンタナイドアジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｂｅｌｇｉｕｍから入手できる）のような、油／界面活性剤ベースのアジュバントであり、好ましくは、モンタナイド ＩＳＡ−５１である。他の好ましいアジュバントは、細菌ＤＮＡベースのアジュバントであり、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を含むアジュバントである。なお他の好ましいアジュバントは、ウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバントであり、例えば、ポリＩ：Ｃである。イミダゾキニリン（Ｉｍｉｄａｚｏｃｈｉｎｉｌｉｎｅ）は、好ましいアジュバントのなお別の例である。さらに、好ましいアジュバントはリポソームである。最も好ましいアジュバントは、ヒトへの使用に適しているアジュバントである。

モンタナイドアジュバント（全てＳｅｐｐｉｃ，Ｂｅｌｇｉｕｍから入手できる）は、モンタナイドＩＳＡ−５１、モンタナイドＩＳＡ−５０、モンタナイドＩＳＡ−７０、モンタナイドＩＳＡ−２０６、モンタナイドＩＳＡ−２５、モンタナイドＩＳＡ−７２０、モンタナイドＩＳＡ−７０８、モンタナイドＩＳＡ−７６３Ａ、モンタナイドＩＳＡ−２０７、モンタナイドＩＳＡ−２６４、モンタナイドＩＳＡ−２７、モンタナイドＩＳＡ−３５、モンタナイドＩＳＡ ５１Ｆ、モンタナイドＩＳＡ ０１６Ｄ、およびモンタナイドＩＭＳからなる群より選択することができ、好ましくは、モンタナイドＩＳＡ−５１、モンタナイドＩＭＳ，およびモンタナイドＩＳＡ−７２０からなる群より選択され、より好ましくは、モンタナイドＩＳＡ−５１からなる群より選択される。モンタナイドＩＳＡ−５１（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｉｎｃ．）は、その中で種々の界面活性剤が、代謝不可能なミネラルオイル、代謝可能なオイル、または２つの混合物のいずれかと結合されている、油／界面活性剤ベースのアジュバントである。これらは、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するタンパク質またはそのペプチドフラグメントを含む水溶液とともにエマルジョンとして使用するために調製される。界面活性剤は、オレイン酸マンナイド（ｍｉｎｎｉｄｅ ｏｌｅａｔｅ）である。ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ；Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）は高度に精製された水溶性サポニンであり、これは、水溶液として取り扱うことができる。ＱＳ−２１およびモンタナイドＩＳＡ−５１アジュバントは、滅菌の使い捨てバイアル中に提供され得る。

アジュバントについての一般的な議論は、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８６）６１〜６３頁に提供されている。しかし、Ｇｏｄｉｎｇは、目的の抗原が低分子量であるか、または免疫原性が乏しい場合には、免疫原性のキャリアに対してカップリングさせることが望ましいと記載している。このようなキャリア分子の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、およびニワトリ免疫グロブリンが挙げられる。種々のサポニン抽出物もまた、免疫原性組成物においてアジュバントとして有用であることが示唆されている。最近、アジュバントとしての周知のサイトカインである顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を使用することが提案されている（ＷＯ９７／２８８１６）。

本発明にしたがって使用することができるアジュバントの好ましい機能は、以下の表に列挙される。

本発明のワクチン組成物には、１つ以上の種々のアジュバントが含まれる場合がある。さらに、本発明には、上記のいずれかを含む任意のアジュバント物質、またはそれらの組み合わせをさらに含む治療用組成物が含まれる。Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するタンパク質またはそのペプチドフラグメントとアジュバントを、任意の適切な順序で別々に投与できることもまた想定される。

キャリアは、アジュバントとは無関係に存在し得る。キャリアの機能は、例えば、その活性または免疫原性を高めること、安定性を付与すること、生物学的活性を高めること、または血清半減期を延長させるために、特にペプチドフラグメントの分子量を大きくすることであり得る。さらに、キャリアは、Ｔ細胞に対してＢｃｌ−２ファミリーに属するタンパク質またはそのペプチドフラグメントを提示することを補助することができる。キャリアは、当業者に公知の任意の適切なキャリアであり得、例えば、タンパク質または抗原提示細胞であり得る。キャリアタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質（例えば、トランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、サイログロブリン、またはオボアルブミン）、免疫グロブリン、あるいは、ホルモン（例えば、インシュリンまたはパルミチン酸）であり得るが、これらに限定されない。ヒトの免疫のためには、キャリアは、ヒトに対して生理学的に許容されるキャリアであり、安全でなければならない。しかし、破傷風毒素および／またはジフテリア毒素は、本発明の１つの実施形態において適切なキャリアである。あるいは、キャリアは、デキストラン、例えば、セファロースであり得る。

したがって、本発明には、上記のいずれかまたはそれらの組み合わせを含むアジュバント物質をさらに含む治療用組成物が含まれる。抗原、すなわち、本発明のペプチドおよびアジュバントを、同時に、または任意の適切な順序で別々に投与できることもまた想定される。

本発明の薬学的組成物中の抗原の選択は、当業者によって決定されるパラメーターに応じて変化する。記載されているように、本発明の種々のペプチドのそれぞれは、特定のＨＬＡ分子により細胞表面上に提示される。このように、処置される被験体がＨＬＡ表現型に関してタイプ分けされている場合は、その特定のＨＬＡ分子に結合することが知られているペプチド（単数または複数）が選択される。

あるいは、目的の抗原は、所定の集団における種々のＨＬＡ表現型の陽性率に基づいて選択される。一例として、ＨＬＡ−Ａ２は白人の集団において最も陽性率が高い表現型であり、したがって、ＨＬＡ−Ａ２に結合するサービビンに由来するペプチドを含む組成物が、この集団の大部分において活性である。しかし、本発明の組成物にはまた、２つ以上のサービビンに由来するペプチドの組み合わせが含まれる場合もある。サービビンに由来するペプチドのそれぞれは、異なるＨＬＡ分子と特異的に相互作用し、その結果、標的集団の大部分をカバーする。したがって、一例として、薬学的組成物には、ＨＬＡ−Ａ分子によって制限されるペプチドと、ＨＬＡ−Ｂ分子によって制限されるペプチドの組み合わせ、例えば、標的集団中のＨＬＡ表現型の陽性率に対応させられたそのようなＨＬＡ−Ａ分子とＨＬＡ−Ｂ分子を含む組み合わせ、例えば、ＨＬＡ−Ａ２とＨＬＡ−Ｂ３５の組み合わせが含まれ得る。さらに、組成物には、ＨＬＡ−Ｃ分子によって制限されるペプチドが含まれる場合もある。

本発明の有用な免疫原性組成物には、本明細書中で定義されるＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーに由来するペプチドに加えて、本明細書中で定義されるもののような免疫学的有効量のＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーまたはその免疫原性のフラグメントが含まれる場合もあることが想定される。

薬学的組成物中の本発明の免疫原性ペプチドの量は、特定の用途に応じて変化し得る。しかし、免疫原の単回用量は、好ましくは、約１０μｇから約５０００μｇまでのいずれかであり、より好ましくは、約５０μｇから約２５００μｇまでのいずれか、例えば、約１００μｇから約１０００μｇまでである。投与の態様としては、皮内、皮下、および静脈内投与、徐放処方物の形態での移植などが挙げられる。当該分野で公知の任意のおよび全ての投与形態が本明細書中で含まれる。注射可能な免疫原性ペプチド組成物の処方に適している当該分野で公知の任意のおよび全ての従来の投与量形態、例えば、必要に応じて、従来の薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、保存剤、アジュバント、緩衝成分などを含む、凍結乾燥形態、および溶液、懸濁液、またはエマルジョンの形態もまた、含まれる。

薬学的組成物は、当業者に公知の任意の従来のプロトコールを使用して調製し、投与することができる。実施例５には、本発明のワクチン組成物の調製について限定的ではない例、ならびにそのようなワクチンの投与についての限定的ではない例が提供される。このプロトコールを、本明細書中に記載されるワクチン組成物の任意のものに容易に適応させることができることは、当業者に明らかである。

本発明のさらなる実施形態においては、本発明の薬学的組成物は、その患者における癌の進行の間に、癌細胞が化学療法的に活性である抗癌剤および／または放射線治療に対する感度の低下を生じる場合に、癌患者の処置に有用である。

本発明の薬学的組成物には、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーには属さないかまたはそれらに由来しないタンパク質またはペプチドフラグメントから選択された、少なくとも１つのさらなる免疫原性タンパク質またはそのペプチドフラグメントが含まれることが有利である場合がある。このようなタンパク質には、細胞のアポトーシスの調節に関係しているタンパク質またはそれに由来するペプチドフラグメントが含まれる。一例としては、そのようなさらなるタンパク質またはペプチドは、上記で定義されたサービビン、またはそのペプチドフラグメントである。特定の実施形態においては、さらなる免疫原性のサービビンに由来するペプチドは、以下から選択される配列を有しているＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドである：ＦＬＫＬＤＲＥＲＡ（サービビン_{１０１−１０９}）（配列番号１２）、ＴＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（サービビン_５−１４）（配列番号１３）、ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（サービビン_{９５−１０４}）（配列番号１４）、ＬＬＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号１５）、およびＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号１６）。（カッコ内の数字は、米国特許第６，２４５，５２３号に開示されているサービビンタンパク質中の残基の位置を示す）。ＬＬＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号１５）は、「Ｌ」でペプチドの２位の「Ｔ」を置換することによって、サービビン_{９６−１０４}から誘導される配列であり、そしてＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号１６）は、「Ｍ」で２位の「Ｔ」を置換することによってサービビン_{９６−１０４}から誘導される。さらに特定の実施形態においては、さらなる免疫原性のサービビンに由来するペプチドは、以下から選択される配列を有しているＨＬＡ−Ｂ３５制限サービビン由来ペプチドである：ＣＰＴＥＮＥＰＤＬ（サービビン_{４６−５４}）（配列番号１７）、ＥＰＤＬＡＱＣＦＦ（サービビン_{５１−５９}）（配列番号１８）、ＣＰＴＥＮＥＰＤＹ（配列番号１９）、およびＥＰＤＬＡＱＣＦＹ（配列番号２０）。（カッコ内の数字は、米国特許第６，２４５，５２３号に開示されているサービビンタンパク質中の残基の位置を示す）。ＣＰＴＥＮＥＰＤＹ（配列番号１９）は、「Ｙ」でペプチドのＣ末端の「Ｌ」を置換することによってサービビン４６−５４から誘導される配列であり、そしてＥＰＤＬＡＱＣＦＹ（配列番号２０）は、「Ｙ」でＣ末端２の「Ｆ」残基を置換することによってサービビン_{５１−５９}から誘導される。

なおさらなる実施形態においては、さらなるペプチドは、以下から選択される配列を有しているＨＬＡ−Ａ１制限ペプチドである：サービビン_{３８−４６}（Ｓｕｒ３８Ｙ９）（Ｐ９でＣがＹに変化させられている、ＭＡＥＡＧＦＩＨＹ）（配列番号２１）、サービビン_{４７−５６}（Ｓｕｒ４７Ｙ１０）（Ｐ１０でＱがＹに変化させられている、ＰＴＥＮＥＰＤＬＡＹ（配列番号２２））、サービビン_{９２−１０１}（Ｓｕｒ９２−１０１）（ＱＦＥＥＬＴＬＧＥＦ）（配列番号２３）、およびサービビン_{９３−１０１}（Ｓｕｒ９３Ｔ２）（Ｐ２でＥがＴに変化させられている、ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号２４））。本発明のペプチドはまた、サービビン_{１８−２４}（Ｓｕｒ１８Ｋ１０）（Ｐ１０でＦがＫに変化させられている、ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号２５））のようなＨＬＡ−Ａ３制限ペプチド、および／またはサービビン_{５３−６２}（Ｓｕｒ５３−６２）（ＤＬＡＱＣＦＦＣＦＫ）（配列番号２６）のようなＨＬＡ−Ａ１１制限ペプチド、および／またはサービビン_{１８−２８}（Ｓｕｒ１８−２８）（ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＦＬ）（配列番号２７）のようなＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドでもある場合もある。

しかし、本発明の１つの好ましい実施形態においては、ワクチン組成物にはサービビンまたはそのフラグメントは含まれない。

他の有用なさらなるペプチドには、既知のアポトーシス阻害因子ポリペプチドＭＬ−ＩＡＰが含まれ、これは、かなり選択的な発現を有しており、黒色腫において検出される。したがって、特異的Ｔ細胞応答、すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞応答またはヘルパーＴ細胞応答を誘発することができるＭＬ−ＩＡＰのフラグメントを、状況に応じて、本発明の組成物に含めることができる。ＭＬ−ＩＡＰの有用なペプチドフラグメントには、特許出願ＷＯ２００４／０８９９８０（これは、引用によりその全体が本明細書中に組み入れられる）に記載されているＭＬ−ＩＡＰフラグメントの任意のものが含まれ、好ましくは、ＭＬ−ＩＡＰ_２４５（ＲＬＱＥＥＲＴＣＫＶ）（配列番号２８）、ＭＬ−ＩＡＰ_２８０（ＱＬＣＰＩＣＲＡＰＶ）（配列番号２９）、ＭＬ−ＩＡＰ_９０（ＲＬＡＳＦＹＤＷＰＬ）（配列番号３０）、ＭＬ−ＩＡＰ_１５４（ＬＬＲＳＫＧＲＤＦＶ）（配列番号３１）、ＭＬ−ＩＡＰ_２３０（ＶＬＥＰＰＧＡＲＤＶ）（配列番号３２）、ＭＬ−ＩＡＰ_９８（ＰＬＴＡＥＶＰＰＥＬ）（配列番号３３）、ＭＬ−ＩＡＰ_３４（ＳＬＧＳＰＶＬＧＬ）（配列番号３４）、ＭＬ−ＩＡＰ_５４（ＱＩＬＧＱＬＲＰＬ）（配列番号３５）、ＭＬ−ＩＡＰ_９９（ＬＴＡＥＶＰＰＥＬ）（配列番号３６）、ＭＬ−ＩＡＰ_８３（ＧＭＧＳＥＥＬＲＬ）（配列番号３７）およびＭＬ−ＩＡＰ_２００（ＥＬＰＴＰＲＲＥＶ）（配列番号３８）。

他の有用なさらなるペプチドとしては、ＴＲＡＧ−３およびそのペプチドフラグメントが挙げられる。ＴＲＡＧ−３は少なくとも２つの選択的スプライシングされた形態で存在し、そしてＴＲＡＧ−３スプライシング形態のペプチドの全てが、さらなるペプチドとして有用である。具体的には、任意のＴＲＡＧ−３スプライシング形態のフラグメント（ここでは、上記のフラグメントは、特異的なＴ細胞応答、すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞応答またはヘルパーＴ細胞応答を誘発することができる）を、状況に応じて本発明の組成物中に含めることができる。

さらに、本発明の組成物は、本明細書中において上記で定義されたクラスＩ制限エピトープとクラスＩＩ制限エピトープを含む、多エピトープワクチンとして提供される場合もある。

本発明の組成物の免疫防御効果は、例えば、ＷＯ９７／２８８１６（前出）に記載されているようないくつかのアプローチを使用して決定することができる。良好な免疫応答は、免疫後のＤＴＨ反応の発生、および／またはワクチン組成物のペプチド（単数または複数）を特異的に認識する抗体の検出によって、決定することもできる。

好ましい実施形態においては、本発明の薬学的組成物はワクチン組成物である。したがって、薬学的組成物は、癌疾患に対する免疫応答を誘発することができる免疫原性組成物またはワクチンであり得る。本明細書中で使用される場合は、表現「免疫原性組成物またはワクチン」は、癌細胞に向けられた少なくとも１つのタイプの免疫応答を誘発する組成物をいう。したがって、このような免疫応答は、上記のタイプのいずれかであり得る：ＣＴＬ応答（ここでは、細胞表面上に提示されるＨＬＡ／ペプチド複合体を認識して、それによって細胞溶解を生じることができるＣＴＬが生じる、すなわち、ワクチン接種された被験体において、癌細胞に対して細胞傷害作用を有しているエフェクターＴ細胞の産生；抗癌抗体の産生を生じるＢ細胞応答；および／またはＤＴＨ型の免疫応答を誘発する。

有用な実施形態においては、癌疾患に対する免疫原性応答は、患者に由来する抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩ分子を負荷することによって、患者からＰＢＬを単離し、患者に細胞を注射によって戻す前にペプチドとともに細胞をインキュベートすることによって、あるいは、患者から前駆体ＡＰＣを単離し、サイトカインと抗原を使用して細胞をＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ＡＰＣに分化させ、その後、細胞を患者に注射によって戻すことによってのいずれかで、本発明のペプチドを投与することによって、誘発される。

したがって、Ｂｃｌ−２ファミリーに属するタンパク質またはそのペプチドフラグメント、あるいは、上記タンパク質または上記ペプチドフラグメントをコードする核酸を含む抗原提示細胞を含むワクチン組成物を提供することが、本発明の１つの態様である。抗原提示細胞は、Ｔ細胞に対して抗原を提示することができる任意の細胞であり得る。好ましい抗原提示細胞は樹状細胞である。樹状細胞（ＤＣ）は、任意の適切なプロトコールにしたがって、例えば、本明細書において以下に記載されるように、調製することができ、治療手順において使用することができる。プロトコールを、種々のＨＬＡタイプおよび種々の疾患を有している患者について使用するために適応させることができることは、当業者に明らかである。

樹状細胞（ＤＣ）は、５０μｇ／ｍｌのＨＬＡ制限ペプチド（ＧＭＰ品質で合成された）で３７℃で１時間パルスされ、ペプチドと５×１０^６個の細胞が、１日目と１４日目、その後４週間おきに皮下投与され、５回のワクチン接種後にさらに白血球搬出法が行われる。臨床的な使用および品質管理のためのＤＣの作成は、本質的には、ｒｅｆ．５に記載されているように行うことができる。

したがって、本発明の１つの実施形態においては、癌患者を処置するための方法は、患者の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対してエキソビボでペプチドを提示すること、その後、処理されたＡＰＣを患者に注射によって戻すことによって、ペプチドが投与される方法である。これを行うための別の方法は少なくとも２つ存在する。１つの別の方法は、癌患者からＡＰＣを単離し、ＭＨＣクラスＩ分子をペプチドと共にインキュベートする（負荷する）ことである。ＭＨＣクラスＩ分子を負荷することは、ＡＰＣをペプチドとともにインキュベートすることを意味し、その結果、ペプチドに特異的なＭＨＣクラスＩ分子を有しているＡＰＣはペプチドに結合し、したがって、Ｔ細胞に対してそれを提示することができる。続いて、ＡＰＣは患者に再度注射される。もう１つの別の方法は、樹状細胞の生物学の分野でなされた最近の発見による。この場合は、単球（樹状細胞前駆体である）が患者から単離され、サイトカインと抗原の使用によってｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ＡＰＣ（または樹状細胞）へとエキソビボで分化させられる。その後、エキソビボで作成されたＤＣがペプチドでパルスされ、患者に注射される。

Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーは一定の範囲の癌の形態において発現されているようであるという事実により、本発明のワクチンは、そのようなタンパク質が発現される任意のタイプの癌疾患を制御するために提供され得る可能性が非常に高い。したがって、例として、本発明のワクチン組成物は、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血器悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、ならびに前立腺癌に対して免疫学的活性がある。

上記から、本発明のタンパク質および／またはペプチドが癌の診断ツールとして有用であることは、当業者に明確に理解される。したがって、本発明のペプチドは、広範囲に適用することができる癌疾患に関する診断手順および予防手順を開発するための基礎を提供する。したがって、他の有用な実施形態においては、本発明の組成物は、例えば、ＰＢＬのうちのＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーに反応するＴ細胞検出に基づいて癌患者の中での、または腫瘍組織の中での、その存在のエキソビボまたはインサイチュでの診断のための組成物である。

したがって、なおさらなる態様においては、本発明の１つ以上のペプチドを含む、ＰＢＬのうちのＢｃｌ−２ファミリーのメンバーに反応するＴ細胞が癌患者の中に、または腫瘍組織の中に存在することの、エキソビボまたはインサイチュでの診断のための診断用キット、ならびに、そのような反応性Ｔ細胞の存在を癌患者において検出する方法が提供される。この方法には、腫瘍組織または血液サンプルを、本発明のペプチドとクラスＩ ＨＬＡ分子またはそのような分子のフラグメントの複合体と接触させて、組織または血液細胞に対する複合体の結合を検出することが含まれる。

別の有用な診断または予防アプローチは、異種動物種において抗体を作成すること、例えば、本発明のヒトＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーに由来するペプチドに対するマウス抗体を作成することに基づく。抗体は次いで、例えば、ペプチドを提示する癌細胞の存在を診断するために使用され得る。このような免疫の目的のためには、ペプチドの量は、上記のようなインビボでの方法において使用されるペプチドの量よりも少なくできる。一般的には、好ましい用量は、約１μｇから約７５０μｇまでのペプチドの範囲であり得る。本発明のペプチドでの免疫に基づいてモノクローナル抗体を産生することもまた可能である。したがって、本発明はまた、本発明のペプチドに対して特異的に結合することができる分子（具体的には、そのフラグメントを含むモノクローナルまたはポリクローナル抗体）、ならびに、そのような結合をブロックすることができる分子（例えば、本発明のペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体に対して惹起させられた抗体）にも関する。本発明はさらに、本発明のペプチドまたはタンパク質に特異的に結合することができる単離されたＴ細胞レセプター、さらには、それをコードする単離された核酸に関する。このようなＴ細胞レセプターは、例えば、当業者に周知の標準的な技術を使用して、タンパク質またはペプチド特異的Ｔ細胞からクローニングすることができる。

１つの態様においては、本発明はまた、本明細書中に記載されるＢｃｌ−２ファミリーに属するタンパク質および／またはそのペプチドフラグメントのいずれかに特異的に結合することができるＴ細胞レセプターを含む単離されたＴ細胞にも関する。単離されたＴ細胞は、好ましくは、エキソビボで増殖させられたＴ細胞である。エキソビボでＴ細胞を増殖させる方法は当業者に周知である。このようなＴ細胞は、特に、適応性の導入または自己細胞の導入による癌の処置において有用であり得る。したがって、本発明はまた、Ｂｃｌ−２ファミリーに属するタンパク質またはそのペプチドフラグメントに特異的に結合することができるＴ細胞レセプターを含むＴ細胞を個体（例えば、癌に罹患しているヒト）に投与することを含む処置方法に関する。本発明はさらに、Ｂｃｌ−２ファミリーに属するタンパク質またはそのペプチドフラグメントに特異的に結合することができるＴ細胞レセプターを含むＴ細胞を、癌の処置のための医薬の調製のために使用することに関する。自己細胞の導入は、本質的には、ｒｅｆ．７に記載されているように行うことができる。

１つの態様においては、本発明により、本発明のペプチドと、クラスＩ ＨＬＡ分子またはそのような分子のフラグメントとの複合体が提供される。これは、上記のような診断試薬として有用である。このような複合体は、モノマーまたはマルチマーであり得る。

本発明により、癌疾患を緩和または治癒させるための手段が提供される。したがって、例えば、以下を含む、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーの発現に関係している癌疾患を処置する方法を提供することが、本発明のさらなる態様である：慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血器悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、および前立腺癌。この方法には、有効量の本発明の薬学的組成物、本発明のペプチドに特異的に結合することができる分子、および／またはそのような分子の結合をブロックすることができる分子を、これらの疾患に罹患している患者に投与することが含まれる。

いくつかの場合には、本発明の処置方法を、化学療法、放射線治療、免疫賦活性物質での処置、遺伝子治療、抗体での処置、および樹状細胞を使用する処置のような、従来の癌の処置と組み合わせることが適切である。腫瘍細胞中でのＢｃｌ−２タンパク質ファミリーのメンバーの高い発現は薬剤耐性に関係しているので、本発明によって開示されるＢｃｌ−２に基づく免疫治療の、細胞傷害性化学療法との組み合わせは、癌を処置するための有効なアプローチである可能性がある。

１つの態様においては、本発明は、免疫をモニタリングする方法に関する。上記方法には以下の工程が含まれる：
ｉ）個体に由来する血液サンプルを提供する工程、
ｉｉ）Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するタンパク質またはそのペプチドフラグメントを提供する工程であって、上記タンパク質またはペプチドは、本明細書中に記載されるタンパク質またはペプチドのいずれかであり得る、工程。

ｉｉｉ）上記血液サンプルが、タンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体またはＴ細胞レセプターを含むＴ細胞を含むかどうかを決定する工程、
ｉｖ）それによって、上記個体において上記タンパク質またはペプチドに対する免疫応答が惹起されているかどうかを決定する工程。

個体は、好ましくはヒトであり、例えば、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するタンパク質またはそのペプチドフラグメント、あるいは上記タンパク質またはペプチドをコードする核酸で免疫されたヒトである。

本発明は、本明細書中の以下の限定的ではない実施例と図面によって、ここで説明される。

（実施例１ 乳癌患者におけるＢｃｌ−２に対する免疫応答）
（材料および方法）
（１．患者）
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を乳癌患者から採取した。ＰＢＬをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ分離器、ＨＬＡ型（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して単離し、１０％のＤＭＳＯを含むＦＣＳ中で凍結させた。いずれの患者にも、採血の前には免疫療法を行わなかった。

（２．ＭＨＣクラスＩ分子に対するペプチドの結合についてのアセンブリアッセイ）
合成のペプチド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）の、［^３５Ｓ］−メチオニンで代謝によって標識したＨＬＡ−Ａ２分子に対する結合親和性を、以前に記載されているように、アセンブリアッセイにおいて測定した。このアッセイは、ＴＡＰ欠損細胞株Ｔ２から細胞溶解の際に放出される、空のＨＬＡ分子のペプチドに媒介される安定化に基づく。安定に折り畳まれたＨＬＡ分子を、ＨＬＡクラスＩ特異的立体構造依存性ｍＡｂ Ｗ６／３２を使用して免疫沈降させ、等電点（ＩＥＦ）ゲル電気泳動によって分離した。ＭＨＣ重鎖のバンドを、ＩｍａｇｅＧａｕｇｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒプログラム（ＦＵＪＩ ｐｈｏｔｏ ｆｉｌｍ Ｃｏ．，Ｃａｒｒｏｌｌｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）を使用して定量した。バンドの強度は、アッセイの間に回復したペプチドが結合したクラスＩ ＭＨＣ複合体の量と直接関係している。したがって、ＨＬＡ−Ａ２の安定性の程度は、添加されたペプチドの結合親和性に直接関係している。ＨＬＡ−Ａ２の回復を、５０、５、０．５、０．０５μＭの関連するペプチドの存在下で測定した。Ｃ_５０値を、最大の安定性の半分に十分なペプチド濃度として、それぞれのペプチドについて計算した。

（３．ＰＢＬの抗原刺激）
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの感度を高めるために、ＰＢＬを、分析の前にエキソビボで一回刺激した。０日目に、ＰＢＬまたは粉砕したリンパ節を融解させ、２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）において２ｍｌ／ウェルで、２×１０^６個の細胞の濃度で、１０μＭのペプチドの存在下でＸ−ｖｉｖｏ培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、５％の熱不活化ヒト血清、および２ｍＭのＬ−グルタミン中にプレートした。２日後、２０ＩＵ／ｍｌの組み換えインターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｒａｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を培養物に添加した。培養細胞を、１２日目に、反応性についてＥＬＩＳＰＯＴにおいて試験した。

（４．ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、以前に記載された（４）ように、ペプチドエピトープ特異的インターフェロン−γ放出エフェクター細胞を定量した。簡単に説明すると、ニトロセルロース膜ボトム９６ウェルプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＭＡＩＰ Ｎ４５，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｈｅｄｅｈｕｓｅｎｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、抗ＩＦＮ−γ抗体（１−Ｄ１Ｋ，Ｍｅｂｔｅｃｈ，Ｎａｃｋａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でコーティングした。ウェルを洗浄し、Ｘ−ｖｉｖｏ培地によってブロックし、細胞を種々の細胞濃度で二連で添加した。その後、ペプチドを各ウェルに添加し、プレートを一晩インキュベートした。翌日、培地を捨て、ウェルを洗浄した後、ビオチニル化二次抗体（７−Ｂ６−１−ビオチン、Ｍａｂｔｅｃｈ）を添加した。プレートを２時間インキュベートし、洗浄し、そしてアビジン−酵素結合体（ＡＰ−アビジン、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、酵素基質であるＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ウェルに添加し、室温で５〜１５分間インキュベートした。反応を、濃い紫色のスポットが突然発生した時点で水道水で洗浄することによって停止させた。スポットをＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ ２．０ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＣＴＬ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ，ＬＬＣ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＵＳ）を使用して数え、ペプチド特異的ＣＴＬの頻度を、スポットを形成する細胞の数から計算した。全てのアッセイを、各ペプチド抗原について三連で行った。

（５．結果）
（ＨＬＡ−Ａ２に対するＢｃｌ−２由来ペプチドの結合）
Ｂｃｌ−２タンパク質のアミノ酸配列を、最も可能性のあるＨＬＡ−Ａ２ノナマーであるペプチドエピトープおよびデカマーであるペプチドエピトープについて、主要なＨＬＡ−Ａ２特異的アンカー残基（２）を使用してスクリーニングした。１３個のＢｃｌ−２由来ペプチドを合成し、ＨＩＶ−１ ｐｏｌ_{４７６−４８４}（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ）（配列番号３９）由来のＨＬＡ−Ａ２高親和性ポジティブ対照エピトープとの比較によって、アセンブリアッセイによりＨＬＡ−Ａ２に対する結合について試験した。アセンブリアッセイは、ＴＡＰ欠損細胞株Ｔ２に対して種々の濃度のペプチドを負荷した後のクラスＩ分子の安定性に基づく。その後、正確に折り畳まれた安定なＭＨＣ重鎖を、立体構造依存性の抗体を使用して免疫沈降させた。クラスＩ ＭＨＣ分子の安定性の程度は、図１に示すように、添加したペプチドの結合親和性に直接関係していた。クラスＩ ＭＨＣ分子の最大回復量の半分の回復に必要なペプチド濃度（Ｃ_５０値）は、ＨＩＶ−１ ｐｏｌ_{４７６−４８４}については０．７μＭであった（表１）。８個のＢｃｌ−２由来ペプチドは、ポジティブ対照とほぼ同じ高い親和性で結合した；Ｂｃｌ_２２４、Ｂｃｌ_８５、Ｂｃｌ_２２２、Ｂｃｌ_２１８、Ｂｃｌ_２２０、Ｂｃｌ_２１４、Ｂｃｌ_１２４、およびＢｃｌ_１７２（それぞれ、Ｃ_５０＝０．７、１、１、２、１、３、１、および２μＭ）（表１）。ペプチドＢｃｌ_８０、Ｂｃｌ_２０８、およびＢｃｌ_１８０は、中程度または弱い親和性でしか結合しなかった（それぞれ、Ｃ_５０＝３６．７、および２０μＭ）。試験したペプチドのうちの２つ（Ｂｃｌ_２１６、Ｂｃｌ_２００）は、ＨＬＡ−Ａ２には全く結合しなかった。この研究に含めたペプチドのリストを表１に示す：

^ａ下付き文字で示した数字の並びは、配列中の最初のアミノ酸の位置を示す。
^ｂＣ_５０値は、ＨＬＡ−Ａ２に対する最大の結合の半分に必要なペプチドの濃度である。

（化学療法で処置した乳癌患者におけるＢＣＬ−２由来ペプチドに対するＣＴＬ応答）
ＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮ−γ分泌アッセイを使用して、本発明者らは、乳癌患者由来の末梢血Ｔ細胞中のＢｃｌ−２由来ペプチドに対する特異的Ｔ細胞応答の存在を試験した。この方法は、癌患者において腫瘍特異的ＣＴＬを同定する場合には、かねてより非常に有効である。

１５人のＨＬＡ−Ａ２ポジティブ乳癌患者由来のＰＢＬを、ＥＬＩＳＰＯＴでの試験の前に１回、エキソビボで刺激した。この手順は、記載されている（４）ように、ＥＬＩＳＰＯＴの感度を高めるために選択した。多くの記載されているＣＴＬエピトープは実際には低親和性ペプチドであるので、本発明者らは、全部で１３個のＢｃｌ−２推定ペプチドを実験の第一選択に含めた。Ｂｃｌ_１７２、Ｂｃｌ_１８０、Ｂｃｌ_２０８、およびＢｃｌ_２１４に対する応答が検出され、これらのペプチドによるデータだけを図２に示す。自発的なＣＴＬ応答は、Ｂｃｌ_１７２に対しては８人の患者に由来するＰＢＬ（５０％）において、そしてＢｃｌ_１８０に対しては４人の患者において（約２５％）検出された（図２）。しかし、最も頻度の高い応答は、Ｂｃｌ_２０８とＢｃｌ_２１４に対して検出された。なぜなら、１２人の患者（約８０％）がＢｃｌ_２０８に対する検出可能なＣＴＬ応答を有しており、１１人の患者（約７５％）がＢｃｌ_２１４応答を有していたからである（図２）。

（実施例２ 癌患者におけるＢｃｌ−２の免疫原性）
（概要）
本明細書中で、本発明者らは、無関係な腫瘍タイプ、すなわち、膵臓癌、ＡＭＬ、およびＣＬＬに罹患している患者由来の末梢血中でのＢｃｌ−２に対する自発的なＴ細胞反応性について記載する。さらに、本発明者らは、これらのＢｃｌ−２反応性Ｔ細胞が実際にペプチド特異的細胞傷害性エフェクター細胞であることを示す。したがって、Ｂｃｌ−２は、抗癌免疫療法ストラテジーについて、例えば、従来の放射線治療および化学療法との組み合わせにおいて、重要な、広く適用できる標的としての役割を担うことができる。

（序論）
Ｂｃｌ−２ファミリーには、アポトーシスの調節におけるいくつかの重要な役割が含まれており、これには、プロアポトーシス性分子、さらには抗アポトーシス性分子が含まれる。Ｂｃｌ−２は、癌の病因および進行に関係している重要な細胞因子である。本研究において、本発明者らは、癌患者におけるＢｃｌ−２の自然界における細胞性の免疫原性について試験した。

（方法）
（患者）
ＰＢＬを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ分離器ＨＬＡ型（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して単離し、１０％のＤＭＳＯを含むＦＣＳ中で凍結させた。いずれの患者にも、採血前には免疫療法は行わなかった。これらの全ての測定の前に患者からインフォームドコンセントを得た。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、第ＩＶ期疾患を定義する遠隔転移を有している進行性疾患を示している１３人のＨＬＡ−Ａ２ポジティブ乳癌患者から採取した。患者の大部分は、１つ以上の腫瘍部位を有していた（８／１３人の患者）。前療法には、化学療法、内分泌療法、および放射線治療が含まれていた。８人の患者は、すでに化学療法によって処置されているが、５人の患者は内分泌療法が行われただけであり、研究に含められる前には化学療法は施されていなかった。さらに、限局性の手術可能な乳癌を有している１２人のＨＬＡ−Ａ２ポジティブ患者を含め、血液サンプルを、最初の外科手術および化学療法の前に採取した。さらに、ＰＢＬを、第ＩＶ期疾患を定義する遠隔転移のある進行性の疾患を示している２人のＨＬＡ−Ａ２ポジティブ膵臓癌患者から採取した。最後に、１０人のＨＬＡ−Ａ２と新たに診断されたＣＬＬ患者、および３人のＡＭＬ患者に由来するＰＢＬを、治療の前に採取した。１２人のＨＬＡ−Ａ２ポジティブである健常な個体に由来するＰＢＬを対照とした。

（Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ ＥＬＩＳＰＯＴ）
Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂ（ＧｒＢ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、記載されているように抗原特異的ＣＴＬ細胞傷害性を測定するために使用した。簡単に説明すると、ニトロセルロースで閉止した９６ウェルプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＭＡＩＰ Ｎ４５，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、ＧｒＢ捕捉抗体（Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒｏｎｄｂｙ，Ｄｅｎｍａｒｋ）でコーティングした。ウェルを洗浄し、５％のヒト血清を含むＸ−ｖｉｖｏ培地によってブロックした。細胞を種々の細胞濃度で添加した。その後、Ｔ２細胞とペプチドを各ウェルに添加し、プレートを４時間インキュベートし、培地を捨て、ウェルを洗浄した後、ＧｒＢ検出抗体（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加した。プレートを２時間インキュベートし、洗浄し、そしてアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、ＡＥＣ基質試薬（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を各ウェルに添加し、室温で５〜１０分間インキュベートした。反応を、赤色のスポットが突然発生した時点で水道水で洗浄することによって停止させた。スポットを数え、ペプチド特異的ＣＴＬの頻度を、ＩＮＦ−γ ＥＬＩＳＰＯＴと同様に計算した。全てのアッセイを、各ペプチド抗原について二連または三連で行った。

（ペプチド特異的Ｔ細胞の単離）
抗原特異的細胞を、Ｂｃｌ_２０８／ＨＬＡ−Ａ２でコーティングした磁気ビーズによって、以前に記載されたように単離した。ビオチニル化されたモノマー（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）をストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０，Ｄｙｎａｌ Ａ／Ｓ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）に対して、２．５μｇのモノマーを５×１０^６個のビーズとともに４０μｌのＰＢＳ中で室温で２０分間インキュベートすることによって結合させた。磁気複合体を、磁場（Ｄｙｎａｌ Ａ／Ｓ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）においてＰＢＳ中で３回洗浄し、その後、５％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：１０の割合で、ＰＢＬと混合し、非常に穏やかに１時間回転させた。磁気複合体と会合している抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞を穏やかに３回洗浄した。単離した細胞を、５％のＨＳを含むＸ−ｖｉｖｏ中に何度も再懸濁させ、２時間インキュベートし、その後、磁気ビーズを遊離させて細胞懸濁物から除去した。この単離した細胞を、４８ウェルプレートにおいて５％のＨＳと、１０^６個の抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３でコーティングした、４−１ＢＢリ癌ド（４−１ＢＢＬ）を発現する人工細胞ベースの抗原提示細胞（Ｋ３２／４１ＢＢＬ）（Ｃａｒｌ Ｈ．Ｊｕｎｅ博士，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａから懇意によって譲り受けた）を含むＸ−ｖｉｖｏ中で培養した。１日後、単離した２０単位／ｍｌのＩＬ−２を添加し、５日目に、標的細胞を死滅させるこれらの細胞の能力を、標準的な^５１Ｃｒ放出アッセイにおいていずれかを試験した。

（限界希釈によるクローニング）
ＣＴＬクローンを、９６ウェルプレート中での限界希釈により、５％のＨＳを含むＸ−ｖｉｖｏ中に、４０ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ−２と１μｇ／ｍｌのＰＨＡの存在下で、フィーダー細胞として放射線照射したＰＢＭＣを使用して、単離した培養物から確立させた。新しい培地とＩＬ−２を、３〜４日おきにクローンに添加した。

（細胞傷害性アッセイ）
ＣＴＬ媒介性細胞傷害性についての従来の［^５１Ｃｒ］放出アッセイを、別の場所に記載したように行った。標的細胞は、関連ペプチドを有しているＴ２細胞、または関連ペプチドを有していないＴ細胞、ＨＬＡ−Ａ２ポジティブ乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、およびＨＬＡ−Ａ２ネガティブ乳癌細胞株ＺＲ７５−１であった。両方の乳癌細胞株は、逆転写ＰＣＲによって試験すると、Ｂｃｌ−２を発現していた（データは示さない）。

（結果）
（Ｂｃｌ−２由来ペプチドに対するＣＴＬ応答）
Ｂｃｌ−２特異的Ｔ細胞が白血病患者に由来するＰＢＬ中にも存在するかどうかを試験するために、本発明者らは、１０人のＨＬＡ−Ａ２ポジティブＣＬＬ患者、および３人のＡＭＬ患者に由来するＰＢＬを、２つのペプチドであるｂｃｌ_２０８とｂｃｌ_２１４に対する反応性について試験した。Ｂｃｌ−２応答は、５人のＣＬＬ患者と、２人のＡＭＬ患者に存在していた（図３）。さらに、本発明者らは、２人の膵臓癌患者に由来するＰＢＬを試験し、いずれの患者もｂｃｌ_２０８とｂｃｌ_２１４ペプチドに対するＣＴＬ応答を有していたことを明らかにした（図３）。同様に、１２人の健常なＨＬＡ−Ａ２ポジティブ個体を試験した。驚くべきことに、健常な個体のうちの１人においてｂｃｌ_２０８に対する弱いＣＴＬ応答が検出された（データは示さない）。

（ＰＢＬ中でのＢｃｌ−２特異的Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂの放出）
ＧｒＢ ＥＬＩＳＰＯＴを使用して、本発明者らは、ＰＢＬ中で検出されたｂｃｌ−２特異的Ｔ細胞が細胞傷害機能を示すかどうかを評価した。したがって、３人のｂｃｌ−２反応性乳癌の患者（ｐｔ．ｎｏ．：１９、２０、および２２）に由来するＰＢＬを、２つのエピトープｂｃｌ_２０８とｂｃｌ_２１４に対する反応性について分析した（図４）。３人の患者の全てにおいて、両方のペプチドに対する応答を検出することができ、頻度は、１０^５個のＰＢＬあたり、約５０〜１４０個のペプチド特異的ＣＴＬであった。対照として、本発明者らは、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴにおいてｂｃｌ_１７２に対する応答だけではなく、ｂｃｌ_２０８およびｂｃｌ_２１４に対しての応答も検出できなかった患者（ｐｔ．ｎｏ．：１６）と健常な対照（ｈ１）を含めた。予想したとおり、ｂｃｌ_２０８またはｂｃｌ_２１４に対するＧｒＢの放出は、乳癌患者ｎｏ．１６においても、さらには健常な対照においても、検出されなかった。

（Ｂｃｌ−２反応性ＣＴＬの機能）
Ｂｃｌ−２反応性ＣＴＬの機能をさらに特徴づけるために、これらの細胞を、記載された様に、ＨＬＡ−Ａ２／ｂｃｌ_２０８複合体でコーティングした磁気ビーズによって富化させた。細胞を、単離の前にエキソビボで１回、ペプチドで刺激した。単離した細胞のうちの少数を限界希釈によってクローン化した。増殖しつつある細胞を、ペプチドを伴わずに、またはｂｃｌ_２０８を用いてパルスするかのいずれかによって、ＧｒＢ ＥＬＩＳＰＯＴにおいてＴ２細胞の認識について試験した。これらのクローンのうちのいくつかは、ｂｃｌ_２０８でパルスしたＴ２細胞の特異的な認識を示した（データは示さない）。しかし、残念なことに、本発明者らは、さらなる分析のためにこれらのクローンを拡大させることはできなかった。

１日後、単離したＩＬ−２を残りの細胞に添加し、５日目に、ペプチドを負荷したＴ２細胞を死滅させる細胞の能力を、標準的な^５１Ｃｒ放出アッセイにおいて試験した。この目的のために、負荷していないＴ２細胞またはｂｃｌ_２０８ペプチドを負荷したＴ２細胞のいずれかを標的とした。このアッセイにより、ｂｃｌ_２０８でパルスしたＴ２細胞だけが死滅させられたことが明らかになった（図５ａ）。これらの富化させられ、エキソビボで刺激されたｂｃｌ_２０８反応性Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２ポジティブであるＢｃｌ−２を発現する乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を死滅させる能力について試験するためにさらに使用した。富化させられたＴ細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を効率よく溶解させたが、一方では、対照的に、Ｂｃｌ−２を発現するＨＬＡ−Ａ２ネガティブ乳癌細胞株ＺＲ７５−１に対する細胞傷害性は観察されなかった（図５ｂ）。

（実施例３ 癌患者におけるＢｃｌ−Ｘ（Ｌ）の免疫原性）
（概要）
ここでは、本発明者らは、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌが癌患者においてＴ細胞認識についての標的であることを明らかにする。したがって、本発明者らは、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌに由来するペプチドエピトープに対する自発的に生じるＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ３制限細胞傷害性Ｔ細胞応答を、ＥＬＩＳＰＯＴおよびフローサイトメトリー染色によって記載する。したがって、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質に類似しているアポトーシス阻害因子に対する細胞性免疫応答は、癌において一般的な現象を示すようであり、結果として、タンパク質のこのグループは、抗癌免疫療法についての魅力的な共通の標的タンパク質を示す。さらに、細胞中でのこれらのタンパク質の高い発現は薬剤耐性に関係しているので、免疫療法の細胞傷害性化学療法との組み合わせは、癌を処置するための非常に魅力的な方法である。

（序論）
抗アポトーシス性タンパク質Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌは、ｂｃｌ−ｘ遺伝子の長い選択的スプライシングされた形態から産生されるが、一方、プロアポトーシス性タンパク質Ｂｃｌ−Ｘ_Ｓは、同じ遺伝子の短い選択的スプライシングされた形態に由来する。Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌは従来の形態の治療に対する耐性、および不良な予後に直接関係しているので、癌において重要な役割を果たしている。Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌの機能阻害によりアポトーシスのプロセスは回復し、新生物細胞は化学療法や放射線治療に対して敏感に反応するようになるが、高レベルのＢｃｌ−Ｘ_Ｌを発現するように癌細胞株を操作すると多剤耐性の表現型が生じる。Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌの高い発現は、ＡＭＬおよび多発性骨髄腫、さらには、膀胱癌、乳癌、膵臓癌、および黒色腫などの充実性腫瘍を含む多種多様な悪性腫瘍において報告されている。

免疫療法の理想的な標的は、正常な組織においては静止した状態にあり、癌細胞においては過剰発現され、そして腫瘍細胞の生存および腫瘍の進行に直接関係している遺伝子産物である。

（材料および方法）
（患者）
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、種々の起点の癌に罹患している患者から、および健常な対照から採取し、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ分離器ＨＬＡ型（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して単離し、１０％のＤＭＳＯを含むＦＣＳ中に凍結させた。いずれの患者にも、採血前には免疫療法は行わなかった。これらの全ての測定の前に患者からインフォームドコンセントを得た。

（フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ））
乳癌患者に由来するＰＢＬを、エキソビボで１回、関連するペプチドで刺激し、７日目に、ＣＤ８＋細胞を、Ｄｙｎａｌ ＣＤ８ネガティブ単離キット（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＳＡ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用してＰＢＬから単離した。得られたＣＤ８＋ポジティブＴ細胞培養物をＰＥ ｃｏｕｐｌｅｔ Ｐｒｏ５^ＴＭ ＭＨＣペンタマー（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）で染色し、その後、フルオロクロム結合ｍＡｂ：ＣＤ８−ＡＰＣおよびＣＤ３−ＦＩＴＣ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で抗体染色した。いずれの染色も、ＰＢＳ＋２％のＦＣＳ中で、暗所にて４℃で３０分間行った。使用したＰｒｏ５^ＴＭＭＨＣペンタマー複合体は：ＨＬＡ−Ａ２／Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１７３−１８２}（ＹＬＮＤＨＬＥＰＷＩ）（配列番号４２）およびＨＬＡ−Ａ２／ＨＩＶ−１ ｐｏｌ_{４７６−４８４}（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ）（配列番号３９）であった。サンプルを、ＢＤ ＦＡＣＳ ａｒｉａで、ＤＩＶＡソフトウェア（ＢＤ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して分析した。

（結果）
（Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌ由来ペプチドに対する自発的なＣＴＬ応答）
ｂｃｌ−ｘ遺伝子は選択的スプライシングによって２つのｍＲＮＡに転写される。抗アポトーシス性Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌは、長い選択的スプライシングによって産生され、一方、プロアポトーシス性Ｂｃｌ−Ｘ_Ｓは、この遺伝子の短い選択的スプライシシング形態から誘導される。大きいＢＣＬ−Ｘ_Ｌのタンパク質産物は、挿入されている領域（アミノ酸１２６〜１８８）によってＢｃｌ−Ｘ_Ｓとは異なる。したがって、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌが癌患者においてＴ細胞についての自然界での標的であるかどうかを調べるために、本発明者らは、主要なＨＬＡ−Ａ２特異的アンカー残基を使用して推定のＨＬＡ−Ａ２エピトープについてこの挿入されている領域（それぞれの末端に９個のアミノ酸を含む）を精査した。その後、本発明者らは７個のＢｃｌ−Ｘ_Ｌ推定ペプチド（Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１５８−１６６}（ＥＭＱＶＬＶＳＲＩ）（配列番号４４）、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１１８−１２６}（ＴＡＹＱＳＦＥＱＶ）（配列番号４３）、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１７３−１８２}（ＹＬＮＤＨＬＥＰＷＩ）（配列番号４２）、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６５−１７４}（ＲＩＡＡＷＭＡＴＹＬ）（配列番号４５）、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６９−１７８}（ＷＭＡＴＹＬＮＤＨＬ）（配列番号４６）、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６１−１７０}（ＶＬＶＳＲＩＡＡＷＭ）（配列番号４８）、およびＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１４１−１５０}（ＶＡＦＦＳＦＧＧＡＬ）（配列番号４９））を合成し、種々の起点のＨＬＡ−Ａ２＋癌患者に由来するＰＢＬを、これらのペプチドに対するＥＬＩＳＰＯＴによって精査した。この方法は、癌患者の腫瘍特異的ＣＴＬを同定するために非常に有効であることが以前に示されている。実際、強く頻繁なＣＴＬ応答が、種々の起点の癌患者において試験したペプチドのうちの４つ（Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１７３−１８２}、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１４１−１５０}、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６１−１７０}、およびＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６５−１７４}）に対して検出された（図６）。全体的には、１８人のＨＬＡ−Ａ２＋乳癌患者のうちの１５人が、これらの４個のＢｃｌ−Ｘ_Ｌペプチドのうち少なくとも１つに対して免疫応答を有していた（応答細胞は、１０^５個の細胞あたり＞２５の抗原特異的細胞の平均数±標準偏差と定義する）。同様に、６人の試験した黒色腫患者のうちの４人、および２人の試験した膵臓癌患者のうちの１人は、これらの４つのペプチドの少なくとも１つに対して免疫応答を有していた。したがって、１８人の試験した乳癌患者のうちの９人は、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１７３−１８１}に対する免疫応答を有しており、一方、６人の試験したＨＬＡ−Ａ２＋黒色腫患者のうちの２人はこのペプチドに対する免疫応答を有していた（図６ａ）。１８人の試験した乳癌患者のうちの４人はＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１４１−１５０}に対する免疫応答を有しており、一方、本発明者らは、試験した２人の膵臓癌患者のうちの１人に由来するＰＢＬにおいて応答を検出した。本発明者らは、試験した５人の黒色腫患者のいずれに由来するＰＢＬにおいても、このペプチドに対する応答は検出できなかった（図６ｂ）。同様に、本発明者らは、６人の乳がん患者、および１人の試験した膵臓癌患者に由来するＰＢＬおいて、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６１−１７０}に対する応答を検出した（図６ｃ）。最後に、４人の乳癌患者、２人の黒色腫患者、および１人の膵臓癌患者は、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６５−１７４}に対する応答を有していた（図６ｄ）。対照として、１２人の健常なＨＬＡ−Ａ２＋個体に由来するＰＢＬを試験した。重要なことは、健常な個体のいずれにおいても、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１７３−１８２}、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１４１−１５０}、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６１−１７０}、またはＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６５−１７４}の全てに対する応答は検出されなかったことである（図６）。

（ＰＢＬ中でのＢｃｌ−Ｘ_Ｌ特異的Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ｂの放出）
ＧｒＢ ＥＬＩＳＰＯＴを使用して、本発明者らは、ＰＢＬ中で検出されたＢｃｌ−Ｘ_Ｌ特異的Ｔ細胞が細胞傷害機能を示すかどうかを評価した。したがって、２人のＢｃｌ−Ｘ_Ｌ反応性乳癌の患者（ｐｔ．ｎｏ．：３５および３６）に由来するＰＢＬを、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１７３−１８２}に対する反応性について分析した（図７）。いずれの患者においても、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１７３−１８２}に対する応答を検出することができ、頻度は、３×１０^５個の細胞あたり、約５０〜１００のペプチド特異的ＣＴＬであった。対照として、本発明者らは、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴにおいてＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１４１−１５０}に対する応答だけではなく、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１７３−１８２}に対しての応答も検出できなかった患者（ｐｔ．ｎｏ．：１７）を含めた。予想したとおり、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１７３−１８２}に対するＧｒＢの放出は、乳癌患者ｎｏ．１７においては検出されなかった。

（Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌ特異的Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析）
乳癌患者由来のＰＢＬ中のＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１７３−１８２}特異的ＣＴＬの自発的な発生を、さらにＦＡＣＳ分析およびＰｒｏ５（登録商標）ＭＨＣ Ｐｅｎｔａｍｅｒ染色を使用して評価した。乳癌患者ｎｏ．３６に由来するＰＢＬを、エキソビボで１回、ペプチドで刺激し、ＣＤ８ポジティブ細胞を単離した。この培養物をＨＬＡ−Ａ２／ＢＣＬ−Ｘペンタマー複合体で染色した。ＦＡＣＳ分析により、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の０．２４％を構成するペンタマーポジティブＴ細胞の集団を容易に検出できることが明らかになった（図８ａ）。対照的に、同じＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＥＬＩＳＰＯＴによって分析すると、約１．４％のＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１７３−１８２}特異的、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８^＋Ｔ細胞を示した。

（Ｂｃｌ−Ｘ（Ｌ）に対する別のＨＬＡ−Ａ２制限エピトープ）
本発明者らは、種々の起点のＨＬＡ−Ａ２＋癌患者に由来するＰＢＬを、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１１８−１２６}（ＴＡＹＱＳＦＥＱＶ）（配列番号４３）（図９ａ）およびＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６９−１７８}（ＷＭＡＴＹＬＮＤＨＬ）（配列４６）（図９ｂ）に対して、ＥＬＩＳＰＯＴによって精査して、種々の起点の癌患者において両方のペプチドに対する弱い自発的なＣＴＬ応答を同定した。

（Ｂｃｌ−Ｘ（Ｌ）に対するＨＬＡ−Ａ３制限応答）
さらに、本発明者らは、主要なＨＬＡ−Ａ３特異的アンカー残基を使用して推定のＨＬＡ−Ａ３エピトープについて挿入されている領域（それぞれの末端に９個のアミノ酸を含む）を精査した。その後、本発明者らは２つのペプチド：Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６５−１７３}（ＲＩＡＡＷＭＡＴＹ）（配列番号５０）およびＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１４９−１５７}（ＡＬＣＶＥＳＶＤＫ）（配列番号５１）を合成した。次に、種々の起点のＨＬＡ−Ａ３＋癌患者に由来するＰＢＬを、Ｂｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６５−１７３}（ＲＩＡＡＷＭＡＴＹ）（配列番号５０）およびＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１４９−１５７}（ＡＬＣＶＥＳＶＤＫ）（配列番号５１）ペプチドに対して、ＥＬＩＳＰＯＴによって精査した。この方法は、癌患者の腫瘍特異的ＣＴＬを同定するために非常に有効であることが以前に示されている。実際、強く頻繁なＣＴＬ応答が、種々の起点の癌患者においてＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６５−１７３}（ＲＩＡＡＷＭＡＴＹ）（配列番号５０）に対して検出された。本発明者らは、５人の試験した乳癌患者のうちの４人において、ＨＬＡ−Ａ３＋ＰＢＬ中でＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６５−１７３}に対する応答を検出することができ（応答細胞は、１０^５個の細胞あたり＞２５の抗原特異的細胞の平均数±標準偏差と定義する）、４人の試験した黒色腫患者のうちの４人、および２人の試験した膵臓癌患者のうちの２人、さらには、４人の試験した多発性骨髄腫患者のうちの１人において、ＨＬＡ−Ａ３＋ＰＢＬ中でＢｃｌ−Ｘ_{Ｌ１６５−１７３}に対する応答を検出することができた（図１０）。重要なことは、本発明者らによっては、対照として本発明者らが試験した７人のＨＬＡ−Ａ３＋である健常な個体のいずれにおいても、応答は検出されなかったことである（図１０）。

（実施例４ 癌患者におけるＭｃｌ−１の免疫原性）
（概要）
ここでは、本発明者らは、Ｍｃｌ−１が癌患者においてＴ細胞認識についての標的であることを明らかにする。したがって、本発明者らは、Ｍｃｌ−１に由来するペプチドエピトープに対する自発的に生じるＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ３制限細胞傷害性Ｔ細胞応答を、ＥＬＩＳＰＯＴによって記載する。

（序論）
骨髄性細胞因子−１（Ｍｃｌ−１）は、初期の単球の分化において発現され、そして未熟な骨髄性細胞へのトランスフェクションの際の生存を促進することができる、Ｂｃｌ−２ファミリーの死亡を阻害するメンバーである。トランスジェニックマウスにおいては、Ｍｃｌ−１は広い範囲の造血性の細胞型においては生存性を、そして骨髄性細胞の不死化を促進する。高いレベルのＭｃｌ−１は、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫、乳癌、卵巣癌患者、および子宮頸部癌、さらには、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）を含む多数のヒトの癌について、さらには、ＡＭＬおよびＡＬＬにおいては再発の際に、報告されている。Ｂ−ＣＬＬ患者においては、高いレベルのＭｃｌ−１は単独療法後には完全な緩解を得ることができないことと強く関係している。多発性骨髄腫においては、Ｍｃｌ−１は、悪性細胞の生存において重要な役割を果たしている。これに関しては、その自身のプロモーターの制御下でｍｃｌ−１トランス遺伝子を発現するマウスが、高い頻度でＢ細胞新生組織形成を生じ、これは濾胞性リンパ腫からびまん性大細胞型リンパ腫にまでの範囲に及ぶことが明らかにされている。

（Ｍｃｌ−１に対するＨＬＡ−Ａ３制限応答）
Ｍｃｌ−１が癌患者においてＴ細胞についての自然界での標的であるかどうかを調べるために、本発明者らは、主要なＨＬＡ−Ａ３特異的アンカー残基を使用して、最も可能性の高いＨＬＡ−Ａ３ノナマーのペプチドエピトープおよびデカマーのペプチドエピトープについてのタンパク質配列を試験した。その後、本発明者らは６個のＭｃｌ−１推定ペプチド（Ｍｃｌ−１_{１８５−１９４}（ＹＬＲＥＱＡＴＧＡＫ）（配列番号５２）、Ｍｃｌ−１_{２９３−３０２}（ＳＩＴＤＶＬＶＲＴＫ）（配列番号５３）、Ｍｃｌ−１_{２６７−２７６}（ＬＩＳＦＧＡＦＶＡＫ）（配列番号５４）、Ｍｃｌ−１_{９５−１０３}（ＲＬＬＦＦＡＰＴＲ）（配列番号５５）、Ｍｃｌ−１_{３００−３０８}（ＲＴＫＲＤＷＬＶＫ）（配列番号５６）、Ｍｃｌ−１_{２３６−２４４}（ＤＩＫＮＥＤＤＶＫ）（配列番号５７））を合成し、種々の起点のＨＬＡ−Ａ３＋癌患者に由来するＰＢＬを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを利用して、これらのペプチドに対する反応性について精査した。この方法は、癌患者の腫瘍特異的ＣＴＬを同定するために非常に有効であることが以前に示されている。実際、強く頻繁なＣＴＬ応答が、種々の起点の癌患者において、２つのＭｃｌ−１由来ペプチドに対して検出された（Ｍｃｌ−１_{９５−１０３}およびＭｃｌ−１_{３００−１０８}）（図１１）。全体的には、６人の試験したＨＬＡ−Ａ３＋乳癌患者のうちの５人が、これらの２つのＭｃｌ−１ペプチドのうちの１つに対して免疫応答を有していた。したがって、５人の乳癌患者は、Ｍｃｌ_{９５−１０３}に対する応答を有しており（応答細胞は、１０^５個の細胞あたり＞２５の抗原特異的細胞の平均数±標準偏差と定義する）、３人の患者はＭｃｌ−１_{３００−３０８}に対する応答を有していた（図１１）。さらに、２人の試験したＨＬＡ−Ａ３＋膵臓癌患者のうちの２人は、Ｍｃｌ−１_{９５−１０３}ペプチドに対して免疫応答を有しており、一方、これらのうちの１人は、Ｍｃｌ−１_{３００−３０８}に対しても免疫反応を有していた。さらに、本発明者らは、Ｂ−ＣＬＬに罹患している６人の患者に由来するＰＢＬを試験し、これらの患者のうちの２人においてＭｃｌ−１_{９５−１０３}に対する応答を同定した。対照として、１０人の健常なＨＬＡ−Ａ３＋個体に由来するＰＢＬを試験した。重要なことは、健常なドナーのいずれにおいても、Ｍｃｌ−１_{９５−１０３}またはＭｃｌ−１_{３００−３０８}のいずれに対しても応答は検出されなかったことである（図１１）。同様に、癌患者または健常な対照のいずれにおいても、別の４個のＭｃｌ−１に由来するペプチドのいずれに対する応答も検出されなかった（データは示さない）。

（Ｍｃｌ−１に対するＨＬＡ−Ａ１制限応答）
Ｍｃｌ−１が癌患者においてＴ細胞についての自然界での標的であるかどうかを調べるために、本発明者らは、主要ＨＬＡ−Ａ１特異的アンカー残基を使用して、最も可能性の高いＨＬＡ−Ａ１ノナマーのペプチドおよびデカマーのペプチドエピトープについてのタンパク質配列を試験した。その後、本発明者らは４個のＭｃｌ−１推定ペプチド（Ｍｃｌ−１_{１６６−１７５}（ＰＡＥＥＥＥＤＤＬＹ）（配列番号５８）、Ｍｃｌ−１_{１２１−１２９}（ＳＰＥＥＥＬＤＧＹ）（配列番号５９）、Ｍｃｌ−１_{１７７−１８５}（ＱＳＬＥＩＩＳＲＹ）（配列番号６０）、Ｍｃｌ−１_{３３９−３４７}（ＡＧＶＧＡＧＬＡＹ）（配列番号６１））を合成し、種々の起点のＨＬＡ−Ａ１＋癌患者に由来するＰＢＬを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを利用して、これらのペプチドに対する反応性について精査した。実際、ＣＴＬ応答が、種々の起点の癌患者において、２つのＭｃｌ−１由来ペプチドに対して検出された（Ｍｃｌ−１_{１６６−１７５}およびＭｃｌ−１_{１７７−１８５}）（図１２）。全体的には、４人の試験したＨＬＡ−Ａ１＋乳癌患者のうちの３人が、Ｍｃｌ−１_{１７７−１８５}に対する応答を有しており、そのうちの１人はさらに、Ｍｃｌ−１_{１６６−１７５}に対する応答も有していた（図１２）。さらに、７人の黒色腫患者のうちの１人は、Ｍｃｌ−１_{１７７−１８５}ペプチドに対する免疫応答を有しており、それ以外の患者は、Ｍｃｌ−１_{１６６−１７５}に対する応答を有していた。対照として、６人の健常なＨＬＡ−Ａ１＋個体に由来するＰＢＬを試験した。重要なことは、健常なドナーのいずれにおいても、Ｍｃｌ−１_{１６６−１７５}ペプチドまたはＭｃｌ−１_{１７７−１８５}ペプチドのいずれに対する応答も検出されなかったことである（図１２）。

（修飾されたペプチド応答）
ＨＬＡ−Ａ３制限ペプチドＭｃｌ−１_{３００−３０８}の免疫原性は、より良好なＨＬＡ−Ａ３アンカー残基、すなわちロイシンで２位のスレオニンを置き換えることによって（Ｍｃｌ−１_{３００−３００}Ｌ２（ＲＬＫＲＤＷＬＶＫ）（配列番号６２））高くなった。Ｍｃｌ−１_{３００−３０８}Ｌ２に対する自発的な免疫応答は、２人の乳癌患者において検出された（データは示さない）。同様に、より免疫原性の高いエピトープを作成するために、本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ１制限ペプチドＭｃｌ−１_{１７７−１８５}（ＱＳＬＥＩＩＳＲＹ）（配列番号６０）の３位を修飾して、２つのペプチドＭｃｌ−１_{１７７−１８５}Ｄ３（ＱＳＤＥＩＩＳＲＹ）（配列番号６３）およびＭｃｌ−１_{１７７−１８５}Ｅ３（ＱＳＥＥＩＩＳＲＹ）（配列番号６４）を作成した。

（考察）
ほぼ全ての悪性腫瘍は、アポトーシスの情報伝達の障害によって特徴づけられる。これにより悪性腫瘍細胞は、内因性のアポトーシスの刺激、さらには、外因性の刺激、例えば、化学療法薬および放射線に対して耐性となる。ヒトの癌において見られるアポトーシスの障害は、多くの場合は、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシス性タンパク質、すなわち、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌ、およびＭｃｌ−１、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｆｌ−１Ａ１、Ｂｃｌ−ｂ、およびＢｃｌ２−Ｌ−１０の過剰発現の結果生じる。このようなアポトーシスタンパク質の阻害因子をワクチン接種の目的のために使用することは、免疫回避のいくつかの形態としてのこれらのタンパク質のダウンレギュレーションまたはその発現の欠損が持続的な腫瘍の増殖を損なうので有効である。この理由は、腫瘍細胞の生存にはＢｃｌ−２ファミリーの機能的に活性なメンバーが必要であることである。治療ストラテジーについては、腫瘍細胞の増殖および生存、抗原欠損腫瘍の選択に関係して重要ではない役割を担っている抗原の標的化が、周知の限界である。さらに、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質の細胞中での高い発現が薬剤耐性に関係しているので、Ｂｃｌ−２ファミリーベースの免疫療法の細胞傷害性化学療法との組み合わせは、非常に期待される癌の処置のための新しい方法である。

本発明者らは、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ（Ｌ），およびＭｃｌ−１タンパク質をペプチド結合モチーフの存在についてスキャンし、これらを癌患者の特異的Ｔ細胞応答を検索するために使用した。この目的のため、無関係な腫瘍型、すなわち、膵臓癌、乳癌、黒色腫ＡＭＬおよびＣＬＬに罹患している患者におけるＢｃｌ−２ファミリーの全てのメンバーに対する自発的なＴ細胞反応性を、ＥＬＩＳＰＯＴによって検出した。癌患者に由来するＰＢＬ中にＢｃｌ−Ｘ_Ｌ特異的ＣＤ８＋細胞が存在することを、ＣＤ８／ペンタマーＦＡＣＳ染色によって確認した。まとめると、これらのデータは、ＣＴＬによって定義されるこれらのタンパク質に由来するエピトープは、癌に対する治療用ワクチンにおいて広く適用することができ、したがって、免疫療法において実質的な有用性があることを示している。

さらに、乳癌患者のうちの１１人がＢｃｌ−２特異的ＣＴＬを有しており、これらの患者のうちの８人は少なくとも１つのタイプの化学療法で以前に処置されていた。２人の患者（ｐｔ．ｎｏ．：１４および１７）においては、４つの異なるＢｃｌ−２ペプチドに対するＣＴＬ応答は検出できなかった。いずれの患者も、抗ホルモン療法を以前に施されていたが、化学療法は受けていなかった。同様に、本発明者らは、化学療法の前の原発性の限局性の乳癌を有している患者においてもいずれの応答も検出することはできなかった。したがって、乳癌患者においては、Ｂｃｌ−２応答は、化学療法を施された患者においてしか検出されなかった。腫瘍の負荷は重要な役割を果たしている可能性があるが、これは、免疫応答が、処置によって誘導されたＢｃｌ−２発現の増大の結果として導入されるかまたは増大させられることを示している。これは、Ｂｃｌ−２ファミリーベースの免疫療法の細胞傷害性化学療法との組み合わせによって現在の応答率が相乗的に改善するであろうとのシナリオを指摘している。Ｂｃｌ−Ｘ（Ｌ）およびＭｃｌ−１応答について試験した患者の処置状態は入手できなかった。

本研究においては、本発明者らは、ＣｒＢ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを利用して、患者のＰＢＬ中のＢｃｌ−２またはＢｃｌ−Ｘ（Ｌ）特異的ＣＴＬが実際に細胞傷害性であるエフェクター細胞であることを明らかにした。さらに、この考えを証明するために、本発明者らは患者のＰＢＬに由来するＢｃｌ−２反応性Ｔ細胞を富化させ、得られたＴ細胞株が従来の５１Ｃｒ放出アッセイにおいてペプチドでパルスされたＴ２細胞を溶解させることができることを示した。さらに、このＢｃｌ−２反応性Ｔ細胞株は、ＨＬＡ適合性乳癌細胞株を死滅させることができたが、一方、ＨＬＡ−Ａ２ネガティブ標的細胞は死滅させることはできなかった。これらの発見は、癌細胞が、実際にＨＬＡ−Ａ２分子の状況においてＢｃｌ−２ペプチドをプロセシングして、これを呈することを示している。最後に、本発明者らは、これらの単離された細胞をクローニングすることができ、これらがＢｃｌ−２ペプチドエピトープに対して極めて特異的に反応することを示した。

メラニン形成細胞分化抗原に由来するペプチドを、メラニン形成細胞の崩壊の加速を導くことができると想定される第ＩＶ期の黒色腫（これは、次いで、臨床症状、すなわち、白斑または網膜炎を呈する、）の患者を処置するために最初に使用した。しかし、臨床試験により、ワクチン接種を受けた患者における白斑の発症が、他の形態の治療を受けた患者における黒色腫に伴う低色素沈着の発症よりも明らかに高くはないことが明らかになった。さらに、重症の副作用は、自己抗原に対する種々のワクチン接種試験においては報告されなかった。本発明者らのデータは、まとめると、Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質のグループに対する細胞性の免疫応答が癌の一般的な特徴であることを証明している。免疫療法の効果を最大にするための試みにおいては、処置される特定の疾患、疾患段階において選択される標的の発現プロフィールおよび予後的意義を考慮するための、興味深いストラテジーが存在する。したがって、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、およびＢｃｌ−Ｘ_Ｌの同時発現がいくつかの癌または特定の疾患段階において見られるが、他の癌は１つのタンパク質または他のタンパク質の排他的な発現を示す。したがって、卵巣癌のようないくつかの疾患においてはＭｃｌ−１の発現は、Ｂｃｌ−２とは異なり、進行期に付随し、Ｍｃｌ−１が自己抗原であり得るという理由のために生存性が低く、一方、Ｂｃｌ−２とＭｃｌ−１が同時に過剰発現されるＣＬＬのような疾患においては、両方のタンパク質を同時に標的化することは、いずれかの分子のみを標的化するよりもはるかに有効なストラテジーを示す。同様に、Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，には、乳癌におけるアポトーシスタンパク質の別の阻害因子であるサービビンの存在が、Ｂｃｌ−２の発現と、そしてアポトーシス指数（ＡＩ）の低下、および全体的な低い生存性に強く関係していることが記載されている。サービビンとＢｃｌ−２との間での同様の会合は、神経芽細胞種、胃癌、結腸直腸癌、および高悪性度の非ホジキンリンパ腫において記載されている。癌に対する治療用ワクチンにおけるサービビンに由来するペプチドの安全性と潜在的な効力は、現在、第Ｉ／ＩＩ期の臨床試験において研究されている（Ｊ．Ｂｅｃｋｅｒ，個人的な連絡）。したがって、期待される免疫療法のストラテジーは、特に、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーとサービビンの両方を標的化することであり、その理由は、これらが種々の細胞性の経路を通じて抗アポトーシス性の機能を実行するからである。

（実施例５ ペプチドワクチン）
Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのペプチドは、例えば、合成（例えば、遊離のアミドＮＨ_２末端と遊離酸ＣＯＯＨ末端を用いて、ＵＶＡ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙで）することができる。それぞれは、凍結乾燥させられたペプチドとして提供され、これは次いで、滅菌水中で再構成され、緩衝液としての乳酸加リンガー液（ＬＲ，Ｂａｘｔｅｒ，Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）で、６７〜８０％の最終水中乳酸加リンガー濃度になるように希釈される。これらの溶液は、次いで、滅菌濾過され、ホウケイ酸塩ガラスバイアルに入れられ、ＩＮＤ６４５３に規定されたＦＤＡガイドラインにしたがって、実体、滅菌性、一般的な安全性、および純度の確認を含む一連の品質保証試験について検討される。ペプチドの安定性試験は、これらのペプチドを−２０℃で３年間保存した際には、純度、またはペプチドの濃度の低下は示さなかった。

実際の環境では、患者には、約１００μｇのクラスＩ ＨＬＡ制限ペプチドを、クラスＩＩ ＨＬＡ制限ヘルパーペプチドとともに、またはそれを伴わずに含むワクチンが投与される。患者は、例えば、アジュバント中の約１００μｇのクラスＩ ＨＬＡペプチドのみでワクチン接種されるか、または、例えば、約１００μｇのＨＬＡクラスＩ制限ペプチドと１９０μｇのクラスＩＩ制限ヘルパーペプチドでワクチン接種される。等モル量のヘルパーと細胞傷害性エピトープを提供するためには、高用量のヘルパーペプチドが計算される。さらに、患者に、両方のペプチドのアミノ酸配列を含むより長いペプチドをワクチン接種することもできる。

上記のペプチドは、１ｍｌの水溶液中で、約１００μｇのＱＳ−２１とともに溶液／懸濁液として、または約１ｍｌのモンタナイドＩＳＡ−５１アジュバントとともにエマルジョンとしてのいずれかで、投与することができる。

患者は、例えば、０日目、および１ヶ月目、２ヶ月目、３ヶ月目、６ヶ月目、９ヶ月目、および１２ヶ月目に、ペプチドとアジュバントで、全部で７回の免疫で、免疫することができる。まれな例外を除いて、ワクチン接種は、それぞれのワクチンについて同じ腕に投与される。ペプチドは、好ましくは、ｓ．ｃ．で投与される。

（参考文献）

Claims (30)

1. 医薬として使用するための、単離された免疫原性活性のあるペプチドであって、ＹＬＮＤＨＬＥＰＷＩ（配列番号４２）、ＲＩＡＡＷＭＡＴＹＬ（配列番号４５）、ＶＬＶＳＲＩＡＡＷＭ（配列番号４８）、およびＶＡＦＦＳＦＧＧＡＬ（配列番号４９）からなる群より選択される、ペプチド。
2. 以下の特徴：
   （ｉ）クラスＩ ＨＬＡ分子の最大回復量の半分を回復し得るペプチドの量（Ｃ_５０値）によって測定される親和性で制限される、クラスＩ ＨＬＡ分子に結合する能力、であって、該Ｃ_５０値は、アセンブリ結合アッセイによって決定した場合に、最大５０μＭである、能力
   （ｉｉ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した場合に１０^４個のＰＢＬあたり少なくとも１個の頻度で、癌患者のＰＢＬ集団中にＩＮＦ−γを産生する細胞を誘発する能力、および／または
   （ｉｉｉ）エピトープペプチドと反応するＣＴＬを、腫瘍組織中においてインサイチュで検出する能力
   のうちの少なくとも１つを有するＭＨＣ クラスＩ制限ペプチドである、請求項１に記載のペプチド。
3. 最大３０μＭであるＣ_５０値を有する、請求項２に記載のペプチド。
4. 最大２０μＭであるＣ_５０値を有する、請求項２に記載のペプチド。
5. 最大１０μＭであるＣ_５０値を有する、請求項２に記載のペプチド。
6. 癌患者において細胞性免疫応答を誘発し得る、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド。
7. ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ａ分子またはＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ｂ分子によって制限される、請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド。
8. ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１、およびＨＬＡ−Ａ２４からなる群より選択されるＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ａ種によって制限される、請求項７に記載のペプチド。
9. ＨＬＡ−Ａ２によって制限される、請求項８に記載のペプチド。
10. ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ２７、およびＨＬＡ−Ｂ５１からなる群より選択されるＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ｂ種によって制限される、請求項７に記載のペプチド。
11. １０^４個のＰＢＬあたり少なくとも１０個の頻度で癌患者のＰＢＬ集団中にＩＮＦ−γを産生する細胞を誘発することができる、請求項２〜１０のいずれかに記載のペプチド。
12. Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌタンパク質が発現される癌疾患を有する患者のＰＢＬ集団においてＩＮＦ−γを産生する細胞を誘発し得る、請求項２〜１０のいずれかに記載のペプチド。
13. 前記癌疾患が、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血器悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、ならびに前立腺癌からなる群より選択される、請求項１２に記載のペプチド。
14. 医薬として使用するための、請求項１〜１３のいずれかに記載の単離された免疫原性活性のあるペプチドまたは該ペプチドをコードする核酸を含む、ワクチン組成物であって、該ペプチドが、以下の特徴：
    （ｉ）クラスＩ ＨＬＡ分子の最大回復量の半分を回復し得るペプチドの量（Ｃ_５０値）によって測定される親和性で制限される、クラスＩ ＨＬＡ分子に結合する能力、であって、該Ｃ_５０値は、アセンブリ結合アッセイによって決定した場合に、最大５０μＭである、能力
    （ｉｉ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって決定した場合に１０^４個のＰＢＬあたり少なくとも１個の頻度で、癌患者のＰＢＬ集団中にＩＮＦ−γを産生する細胞を誘発する能力、および／または
    （ｉｉｉ）エピトープペプチドと反応するＣＴＬを、腫瘍組織中においてインサイチュで検出する能力
    のうちの少なくとも１つを有するＭＨＣ クラスＩ制限ペプチドである、ワクチン組成物。
15. 前記ワクチンが、ワクチン接種した患者において癌細胞に対して細胞傷害性作用を有するエフェクターＴ細胞の産生を誘発する、請求項１４に記載のワクチン組成物。
16. アジュバントを含む、請求項１４〜１５のいずれかに記載のワクチン組成物。
17. ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ｂ分子によって制限されるペプチドと組み合わせて、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ−Ａ分子によって制限されるペプチドを含む、請求項１４〜１６のいずれかに記載のワクチン組成物。
18. 前記アジュバントが、細菌ＤＮＡベースのアジュバント、油／界面活性剤ベースのアジュバント、ウイルスｄｓＲＮＡベースのアジュバント、およびイミダゾキニリンからなる群より選択される、請求項１６に記載のワクチン組成物。
19. 請求項１４〜１８のいずれかに記載のワクチン組成物と、さらなる抗癌剤とを含む、キット。
20. 前記抗癌剤が抗体である、請求項１９に記載のキット。
21. 前記抗癌剤がサイトカインである、請求項１９に記載のキット。
22. 癌疾患の処置または予防のための医薬の製造における、請求項１〜１３のいずれかに記載のペプチドまたは請求項１４〜１８のいずれかに記載のワクチン組成物の使用。
23. 前記処置される疾患が、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌタンパク質ファミリーのメンバーが発現される癌疾患である、請求項２２に記載の使用。
24. 前記癌疾患が、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血器悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、ならびに前立腺癌からなる群より選択される、請求項２２〜２３のいずれかに記載の使用。
25. 前記医薬がさらなる癌の処置と併用されることを特徴とする、請求項２３〜２４のいずれかに記載の使用。
26. 前記さらなる処置が、化学療法、放射線治療、免疫賦活性物質での処置、遺伝子治療、抗体での処置、および樹状細胞を用いる処置からなる群より選択される、請求項２５に記載の使用。
27. 癌疾患の処置または予防のための医薬として使用するための、請求項１〜１３のいずれかに記載のペプチドまたは請求項１４〜１８のいずれかに記載のワクチン組成物。
28. 前記癌疾患が、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血器悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、ならびに前立腺癌からなる群より選択される、請求項２７に記載のペプチドまたはワクチン組成物。
29. 前記処置がさらなる癌の処置と併用される、請求項２７に記載のペプチドまたはワクチン組成物。
30. 前記さらなる処置が、化学療法、放射線治療、免疫賦活性物質での処置、遺伝子治療、抗体での処置、および樹状細胞を用いる処置からなる群より選択される、請求項２９に記載のペプチドまたはワクチン組成物。

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